enzymkinetik - AECC Chemie

ENZYMKINETIK
Das Michaelis-Menten-Gesetz an
ausgewählten Beispielen
Fachbereichsarbeit im Fach Chemie
Verfasst von Bernhard Seyer
Betreuer: OStR. Prof. Mag. Dr. Manfred Kerschbaumer
Albertus Magnus Gymnasium
Vorgelegt im Februar 2009
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Inhaltsverzeichnis
1
DANKSAGUNG ..................................................................................................................................... 4
2
VORWORT ............................................................................................................................................ 5
3
ORGANISCHE GRUNDLAGEN .......................................................................................................... 6
3.1
VON DER AMINOSÄURE ZUM PROTEIN ................................................................................................... 6
3.1.1 Einführung in die Chemie der Aminosäuren ..................................................................................... 6
3.1.2 Bindungen zwischen Aminosäuren .................................................................................................... 8
3.1.3 Peptide und Proteine ....................................................................................................................... 10
3.1.4 Die Struktur der Proteine ................................................................................................................ 11
3.1.4.1
Die Primärstruktur .................................................................................................................................. 11
3.1.4.2
Die Sekundärstruktur .............................................................................................................................. 12
3.1.4.2.1 Die α-Helix ........................................................................................................................................ 13
3.1.4.2.2 Das β-Faltblatt ................................................................................................................................... 15
3.1.4.2.3 Die β-Kehre und die Ω-Schleife ........................................................................................................ 18
3.1.4.3
Die Tertiärstruktur .................................................................................................................................. 19
3.1.4.4
Die Quartärstruktur ................................................................................................................................. 21
4
PHYSIKALISCH-CHEMISCHE GRUNDLAGEN ............................................................................ 23
4.1
KATALYSE ............................................................................................................................................ 23
4.1.1 Einführung in die Katalyse .............................................................................................................. 23
4.1.2 Die Enzymkatalyse .......................................................................................................................... 24
4.1.2.1
4.1.2.2
4.1.2.3
Das aktive Zentrum ................................................................................................................................ 25
Das Schlüssel-Schloss-Prinzip................................................................................................................ 26
Das Induced-fit-Modell .......................................................................................................................... 27
4.2
KINETIK................................................................................................................................................ 27
4.2.1 Einführung in die Kinetik ................................................................................................................ 27
4.2.1.1
4.2.1.2
4.2.1.3
4.2.2
Definition der Reaktionsgeschwindigkeit ............................................................................................... 27
Die Reaktionsordnung ............................................................................................................................ 28
Quasistationarität .................................................................................................................................... 29
Die Michaelis-Menten-Kinetik ........................................................................................................ 30
4.2.2.1
4.2.2.2
4.2.2.3
Michaelis-Menten-Mechanismus............................................................................................................ 30
Michaelis-Menten-Gleichung ................................................................................................................. 31
Lineweaver-Burk-Diagramm .................................................................................................................. 33
4.3
HEMMUNG............................................................................................................................................ 34
4.3.1 Kompetitive Hemmung .................................................................................................................... 35
4.3.2 Nichtkompetitive Hemmung ............................................................................................................ 36
4.3.3 Unkompetitive Hemmung ................................................................................................................ 37
5
ANALYTISCH-CHEMISCHE GRUNDLAGEN ................................................................................ 39
5.1
INSTRUMENTELLE ANALYTIK ............................................................................................................... 39
5.1.1 Einführung in die Photometrie ........................................................................................................ 39
5.1.1.1
5.1.1.2
5.1.1.3
5.1.1.4
6
Apparativer Aufbau eines Photometers .................................................................................................. 39
Prinzip der Messung ............................................................................................................................... 40
Transmission und Extinktion .................................................................................................................. 40
Lambert-Beer„sches Gestetz ................................................................................................................... 41
EIGENE EXPERIMENTE .................................................................................................................. 43
6.1
VORBEREITUNGEN ............................................................................................................................... 43
2
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6.1.1 Synthese von Cystin aus Cystein ..................................................................................................... 43
6.1.2 Herstellung des Britton-Robinson-Puffers ...................................................................................... 45
6.1.3 Herstellung des Phosphat-Puffers ................................................................................................... 46
6.1.4 Reinigung von Guajakol durch Vakuumdestillation ........................................................................ 47
6.2
CHARAKTERISIERUNG DER MEERRETTICHPEROXIDASE ........................................................................ 49
6.2.1 Thereotische Einführung ................................................................................................................. 49
6.2.1.1
6.2.1.2
6.2.1.3
6.2.2
Organische-chemische Charakteristika des Enzyms ............................................................................... 49
Isolierung des Enzyms aus Kren ............................................................................................................. 51
Lagerfähigkeit und Reinheitszahl ........................................................................................................... 51
Eigene Versuche .............................................................................................................................. 52
6.2.2.1
6.2.2.2
6.2.2.3
Überprüfung der Reinheitszahl ............................................................................................................... 52
Aktivitätsbestimmung mit Guajakol als Elektronendonator ................................................................... 53
Überprüfung der Temperaturempfindlichkeit ......................................................................................... 55
6.3
MESSUNG DER MICHAELIS-MENTEN-KINETIK ..................................................................................... 57
6.3.1 Messung mit ABTS als Elektronendonator ...................................................................................... 57
6.3.2 Bestimmung der Hemmung durch Cystin und Cadmium auf ABTS................................................. 59
6.3.3 Messung mit p-Phenylendiamin als Elektronendonator .................................................................. 61
7
ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................................... 65
8
SUMMARY .......................................................................................................................................... 65
9
ANHANG.............................................................................................................................................. 66
9.1
9.2
9.3
9.4
9.5
9.6
9.7
VERWENDETE LITERATUTR .................................................................................................................. 66
VERWENDETE ZEITSCHRIFTENBEITRÄGE.............................................................................................. 67
VERWENDETE INTERNETSEITEN ........................................................................................................... 67
E-MAILS ............................................................................................................................................... 68
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ................................................................................................................... 68
PROTOKOLL.......................................................................................................................................... 70
ERKLÄRUNG ......................................................................................................................................... 73
3
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1
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Danksagung
Zu Beginn meiner Fachbereichsarbeit möchte ich all jenen danken, die mich beim Verfassen
dieser unterstützt und begleitet haben. An erster Stelle ist hier mein Chemieprofessor und
Betreuer Prof. Dr. Manfred Kerschbaumer zu nennen. Dieser hat mich nicht nur durch
Beratung unterstützt, sondern ist sogar an Wochenenden und in den Ferien in die Schule
gekommen, um mir das praktische Arbeiten zu ermöglichen. Doch auch durch die
Unterstützung von Dir. Mag. Christian Köhler, welcher den Ankauf von Chemikalien
bewilligt hat, ist diese Fachbereichsarbeit erst möglich geworden.
Mein besonderer Dank gilt Ao. Univ. Prof. Mag. Dr. Christian Obinger. Dieser hat mir eine
detaillierte Arbeitsanleitung für die Extraktion von Meerrettichperoxidase aus Kren und die
Charakterisierung derselben übermittelt, welche teilweise theoretisch und teilweise praktisch
Eingang in meine Fachbereichsarbeit gefunden hat.
Weiters gilt mein Dank Univ. Prof. Dipl.-Ing. Dr. Paul Kosma für die Übermittlung einer
Arbeitsanleitung für die Messung der Michaelis-Menten-Kinetik von Meerrettichperoxidase
mit o-Phenylendiamin als Elektronendonator. Diese hat mir den Denkanstoß gegeben eine
Messung mit p-Phenylendiamin durchzuführen.
4
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2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Vorwort
Diese Fachbereichsarbeit widmet sich vorwiegend der Enzymkinetik und somit dem
Michaelis-Menten-Gesetz. Dabei soll jedoch die Universalität dieses Themas nicht in den
Hintergrund geraten.
So wird im ersten Kapitel die organische Chemie in den Mittelpunkt gestellt. Im Hinblick auf
den Aufbau von Enzymen werden hier Aminosäuren, Peptide, Proteine und deren
Eigenschaften näher betrachtet.
Das darauf folgende Kapitel beschäftigt sich mit den mathematischen und physikalischchemischen Grundlagen, um so die Basis für die Auswertung der nachfolgenden Messungen
zu legen. Nach einer kurzen allgemeinen Einführung in die Kinetik wird die MichaelisMenten-Kinetik hergeleitet und schließlich die Hemmung von Enzymen betrachtet.
Das vorletzte Kapitel steht im Zeichen der instrumentellen Analytik und geht besonders auf
die Messung von Absorptionsänderungen mittels Photometrie ein, da diese die von mir
verwendete Messmethode zur Bestimmung der Enzymkinetik ist.
Im abschließenden Kapitel werden die praktischen Messungen dokumentiert, wobei zu
Beginn
eine
theoretische
Meerrettichperoxidase
Einführung
herangezogen,
steht.
wobei
Für
diese
die
zuerst
kinetische
Messung
charakterisiert
wird
wird
und
anschließend mit verschiedenen Elektronendonatoren und Inhibitoren photometrische
Messungen durchgeführt werden.
5
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3
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Organische Grundlagen
3.1 Von der Aminosäure zum Protein
3.1.1
Einführung in die Chemie der Aminosäuren
Die Grundbausteine der Proteine (und somit auch der Enzyme) sind Aminosäuren 1. „Obwohl
es mehr als fünfhundert natürlich vorkommende Aminosäuren gibt, bestehen die Proteine
aller Organismen, von den Bakterien bis zum Menschen, zum überwiegenden Teil aus nur
zwanzig verschiedenen Aminosäuren.“2 Im Laufe der Evolutionsgeschichte haben sich also
nur wenige Arten aus der großen Bandbreite der vielfältigen Aminosäuren herauskristallisiert
(siehe Abb. 1).
Abb. 1: Die zwanzig biochemisch bedeutendsten Aminosäuren
1
2
Genauer: Aminocarbonsäure; veraltet auch Amidosäure
Vollhardt; Schore, 2005, S. 1372
6
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Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Weshalb eben diese Aminosäuren evolutionär begünstigt wurden, ist nicht vollkommen
geklärt, jedoch wird davon ausgegangen, dass dies mehrere Gründe hat. Sowohl die
vielfältigen funktionellen Gruppen in den Seitenketten und somit auch mannigfaltigen
chemischen Eigenschaften als auch ihre große Reaktivität dürften ausschlaggebend gewesen
sein. „Ihre strukturellen und chemischen Eigenschaften decken ein weites Spektrum ab und
befähigen Proteine, eine große Bandbreite an Funktionen wahrzunehmen.“3 Des Weiteren ist
es auch wahrscheinlich, dass sie im Laufe der präbiotischen Evolution zufällig entstanden
sind und somit für die biochemische Evolution verfügbar waren.
Den im Folgenden erwähnten Aminosäuren ist gleich, dass sie ein (in der Regel chirales)
zentrales Kohlenstoffatom (C, α-Kohlenstoff) mit einer Säuregruppe (–COOH), einer
Aminogruppe (–NH2), einem Wasserstoff und einer Seitenkette (R für „Rest“) besitzen. Man
spricht von α-Aminosäuren. Da bis auf Glycin (R = H) alle Aminosäuren chiral sind, kann
zwischen L- und D-Aminosäuren unterschieden werden (siehe Abb. 2), wobei das L-Isomer
zumeist der R-Konfiguration und das D-Isomer zumeist der S-Konfiguration entspricht (siehe
Abb. 3). In der Natur kommen aus unbekannten Gründen jedoch nur L-Isomere vor.
Abb. 2: Die dreidimensionale Konfiguration der L- und D-Isomere
Abb. 3: Dreidimensionale
Darstellung der S-Konfiguration
„Aminosäuren liegen in Lösung bei neutralem pH-Wert vorwiegend als dipolare Ionen (oder
Zwitterionen) vor.“4 Das heißt, dass die Aminogruppe protoniert (–NH3+) und die
Carboxylgruppe deprotoniert ist (–COO-). Der pH-Wert, bei dem die Zahl der protonierten
Aminogruppen und der deprotonierten Carboxylgruppen gleich ist, wird isoelektrischer Punkt
genannt. In elektrischen Feldern bewegen sich Aminosäuren nicht mehr und ihre Löslichkeit
hat ein Minimum erreicht. In sauren Lösungen, ist die Aminogruppe protoniert und die
Carboxylgruppe noch nicht dissoziiert, in basischen Lösungen ist die Aminogruppe nicht
protoniert und die Carboxylgruppe dissoziiert (siehe Abb. 4).
3
4
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 36
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 29
7
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Abb. 4: Ionisierungsgrad einer Aminosäure in Abhängigkeit zum pH-Wert
Die Beschaffenheit der Seitenketten entscheidet maßgeblich über die Eigenschaften der
Aminosäuren. Lange, aliphatische Seitenketten sind hydrophob und daher auch weniger gut
wasserlöslich. Polare Seitenketten sind hydrophil und fördern somit die Wasserlöslichkeit der
Aminosäure.
Aminosäuren werden, um die Sequenz in Proteinen widerzugeben, meist durch drei
Buchstaben abgekürzt (z.B. Ala für Alanin, Leu für Leucin, etc.).
3.1.2
Bindungen zwischen Aminosäuren
Aminosäuren können unverzweigte, lineare Polymere bilden. Dabei bindet sich eine
α- Aminogruppe einer Aminosäure an die α-Carboxylgruppe einer anderen Aminosäure unter
Wasserabspaltung. Das Gleichgewicht dieses Prozesses liegt links, daher ist für die
Biosynthese dieser Polymere Energie notwendig. Man bezeichnet die resultierenden
Verbindungen als Peptide, beziehungsweise Proteine. Diese Art der Bindung wird daher
Peptid- oder Amidbindung genannt (siehe Abb. 5).
Abb. 5: Ausbildung einer Peptidbindung
8
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Nach ihrer Länge werden Peptide als Di-, Tri-, Tetra,… bis Polypeptide bezeichnet, wobei
kurzkettige auch als Oligopeptide oder nur Peptide bezeichnet werden. „Ein Polypeptid
besteht aus sich regelmäßig wiederholenden Einheiten, welche die Hauptkette oder das
Rückgrat bilden und einem variablen Anteil, den einzelnen Seitenketten.“5 (siehe Abb. 6).
Abb. 6: Aufbau einer Polypeptidkette, die Seitenketten sind grün eingezeichnet
Natürliche Polypeptideketten besitzen 50 bis 2 000 Aminosäurereste und werden allgemein
Proteine genannt. Eines der größten bekannten Proteine, das Muskelprotein Titin (siehe
Abb. 7), besteht aus über 27 000 Aminosäuren. Da die durchschnittliche Molekülmasse einer
Aminosäure 110 g mol-1 beträgt, liegen die Molmassen der Proteine zwischen 5 500 und
220 000 g mol-1. Statt der Einheit g mol-1 kann auch die Einheit Dalton verwendet werden,
welche einem u (= 1,660 538 782 (83) · 10−27 kg) entspricht.
B
A
Abb. 7: Titin. A: Bänderdiagramm; B: Kugel-Stab-Modell. Zur besseren Übersicht wurden einzelne
Strukturelemente eingefärbt
Zwischen Aminosäuren innerhalb einer Kette können Wasserstoffbrückenbindungen
hergestellt werden. Dabei dienen die Cabonylgrupen (C=O) als Wasserstoffakzeptoren und
die NH-Gruppen als Wasserstoffdonatoren (einzig Prolin bildet aufgrund ihres Aufbaus keine
NH-Gruppen aus, sondern besitzt nur ein an drei Kohlenstoffatome gebundenes N-Atom).
Diese Gruppen interagieren nicht nur untereinander, sondern auch mit Gruppen aus den
Seitenketten.
5
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 37
9
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Eine weitere Bindungsmöglichkeit ist die Ausbildung von Querbrücken innerhalb der
Polypeptidketten. Die häufigste Möglichkeit dafür ist eine Disulfidbrücke (–S–S–). Die
Bildung dieser Brücke erfolgt durch Oxidation zweier Moleküle Cystein zu einem Molekül
Cystin (siehe Abb. 8). „Extrazelluläre Proteine verfügen oftmals über mehrere
Disulfidbrücken, während diese in intrazellulären Proteinen in der Regel fehlen“6
Abb. 8: Bildung von Cystin aus Cystein durch Ausbildung einer Disulfidbrücke
3.1.3
Peptide und Proteine
Polypeptidketten sind polar, da sie verschiedene Enden (eine α- Amino- und eine
α-Carboxylgruppe) besitzen. Einer vereinbarten Regel folgend wird die Aminosäurensequenz
so aufgezählt, dass bei dem aminoständigen Rest begonnen wird. Bei der A-Kette des
Rinderinsulins (siehe Abb. 9), welches das erste vollkommen sequenzierte Protein war, ist
demnach Glycin der aminoterminale (N-terminale) und Asparagin der carboxyterminale
(C-terminale) Rest.
Abb. 9: Die Aminosäuresequenz des Rinderinsulins
6
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 38
10
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Die Eigenschaften der Peptide sind durch ihre Aminosäuren bestimmt. Aminosäuren mit
hydrophoben Seitenketten helfen dabei, die Struktur der Peptide auch in wässriger Lösung zu
erhalten, diverse andere schaffen die Grundlagen für die Reaktivität der Peptide und Proteine.
3.1.4
Die Struktur der Proteine
Die Struktur der Proteine kann auf vier Ebenen betrachtet werden: der Ebene der Primär-, der
Sekundär-, der Tertiär- und der Quartärstruktur.
3.1.4.1
Die Primärstruktur
Die Primärstruktur eines Proteins entspricht dessen Aminosäuresequenz. Diese beruht folglich
nur auf der Abfolge der Aminosäuren. Die Sequenz an sich kann somit als quasi
eindimensional betrachtet werden, der molekulare Aufbau dieser Kette nimmt jedoch
erheblichen Einfluss auf die dreidimensionale Gestalt des Proteins.
Die Kenntnis der Primärstruktur (heute sind die Sequenzen von über 100 000 Proteinen
bekannt) ist für das Wissen über Eigenschaften und Reaktivität eines Proteins beinahe
unerlässlich. Dies zeigt sich besonders im Zusammenhang mit Enzymen und bei der
Betrachtung ihrer aktiven Zentren. „Überdies lassen sich Proteine mit neuartigen
Eigenschaften erzeugen, indem man Sequenzen bekannter Proteine variiert.“7
Bei der Untersuchung der Struktur des Grundgerüstes lässt sich leicht erkennen, dass die
Peptidbindung prinzipiell planar ist, es liegen sowohl die α-Kohlenstoffe beider Aminosäuren
als auch die CO- und die NH-Gruppe in einer Ebene. Dies rührt daher, dass die Peptidbindung
über einen Doppelbindungscharakter verfügt. Es gibt somit zwei Resonanzstrukturen: eine,
bei der sich die Doppelbindung zwischen C und O befindet und eine, bei der sich die
Doppelbindung zwischen C und N befindet. Eine Drehung um die erwähnte Bindung wird
durch diesen Doppelbindungscharakter verhindert. „Dieser
wird auch an der kleinen
Bindungslänge deutlich, die mit 132 pm zwischen der einer reinen C–N-Einfachbindung
(147 pm) und der einer C–N-Doppelbindung (127 pm) liegt.“8 (siehe Abb. 10)
7
8
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 39
Vollhardt; Schore, 2005, S. 1385
11
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Abb. 10: Charakteristische Bindungslängen einer Peptidbindung
Durch diese Eigenschaft existieren zwei mögliche Konfigurationen, die cis- und die transKonfigurationen (siehe Abb. 11). Die trans-Konfiguration ist gegenüber der cis-Konfiguration
jedoch deutlich bevorzugt, sodass fast alle Peptidbindungen in trans-Konfiguration geknüpft
sind. „Diese Bevorzugung von trans gegenüber cis lässt sich dadurch erklären, dass eine cisVerknüpfung durch sterische Kollisionen zwischen den Gruppen am α-Kohlenstoff gestört
würde, was bei der trans-Konfiguration nicht der Fall ist.“9 Einzig zwischen Prolin und einer
beliebigen Aminosäure ist die Bindung cis-geknüpft. Dies hat den Grund, dass durch den
cyclischen Aufbau des Prolin bei beiden Konfigurationen mit sterischer Hinderung zu rechnen
ist, jedoch ist diese bei cis-Konfiguration schwächer.
Abb. 11:Trans- (links) und cis-Isomere
Die Bindung zwischen dem α-Kohlenstoff und der Amino-, beziehungsweise Carbonylgruppe
besitzt reinen Einfachbindungscharakter. Somit kann um diese Bindung frei gedreht werden
und es kann zu einer Faltung des Proteins kommen.
3.1.4.2
Die Sekundärstruktur
„Die Sekundärstruktur kommt teilweise durch Disulfidbrücken, hauptsächlich jedoch
aufgrund der Starrheit der Amidbindung und der Maximierung der Wasserstoffbrücken und
9
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 40
12
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anderen nichtkovalenten Bindungen entlang der Kette(n) zustande.“10 Auf Basis dieses
Wissens
postulierten
Linus
Pauling
und
Robert
Corey
1951
zwei
periodische
Polipeptidstrukturen, die α-Helix und das β-Faltblatt. Später wurden diese beiden Strukturen
mittels Röntgenstrukturanalyse nachgewiesen und noch weitere Elemente wie Kehren und
Schleifen, welche jedoch keinen periodischen Aufbau besitzen, entdeckt. Diese Strukturen
werden meist durch Wasserstoffbrücken zwischen den C=O- und den N–H-Gruppen der
Aminosäuren gebildet. Allgemein werden solche Abschnitte Sekundärstruktur genannt.
3.1.4.2.1
Die α-Helix
Die erste von Pauling und Corey entdeckte Struktur war die annähernd stabförmige α-Helix11.
Das Rückgrat der Aminosäuresequenz ist dabei schraubenförmig aufgerollt, die Reste weisen
stachelartig nach außen (siehe Abb. 12).
Abb. 12: Aufsicht einer α -Helix, die stachelartig abstehenden Reste (grün) sind besonders gut zu erkennen
α-Helices werden durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der CO- und der NHGruppe gebildet, wobei jede CO-Gruppe an die vier Reste entfernte NH-Gruppe bindet.
„Folglich sind außer bei den Aminosäuren am Ende der α-Helices alle CO- und NH-Gruppen
der Hauptkette an den Wasserstoffbrücken beteiligt. Jeder Rest ist gegen den nächsten um
0,15 nm entlang der Helixachse verschoben, auch Translation genannt, und um 100° verdreht,
sodass eine volle Umdrehung der Helix 3,6 Aminosäurenresten entspricht.“12 Die Ganghöhe
10
Vollhardt; Schore, 2005, S. 1389
α, da es sich um die als erstes entdeckte Struktur handelt
12
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 44
11
13
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der Helix (das Produkt aus Schiebung und Windung) beträgt also 0,54. Grundsätzlich kann
der Drehsinn einer Helix nach rechts oder links weisen, beide Konformationen sind erlaubt,
jedoch ist aus sterischen Gründen die rechtsgängige Konformation energetisch günstiger und
daher in fast allen Fällen gegenüber der linksgängigen bevorzugt. Diese zunächst nur
theoretisch vorhergesagte Struktur wurde sechs Jahre später mittels Röntgenstrukturanalyse
an der Myoglobinstruktur (siehe Abb. 13) tatsächlich bestätigt.
Abb. 13: Dreidimensionale Struktur des Myoglobin.
A) Bänderdiagramm
B) Kalottenmodell. Eine Helix wurde zur besseren Vergleichbarkeit der beiden Darstellungen blau gefärbt
Diese und die Struktur des Hämoglobins wurden 1960 von dem Österreicher Max Ferdinand
Perutz und dem Briten John Cowdery Kendrew aufgeklärt. Für eben diese Leistung erhielten
die beiden Chemiker 1962 den Nobelpreis für Chemie.
Der Anteil der α-Helices an der Gesamtstruktur eines Proteins kann von beinahe null bis
annähernd 100 Prozent gehen, wobei eine einzelne α-Helix selten länger als 4,5 nm ist. Des
Weiteren bestehen 25 Prozent aller in Wasser löslichen Proteine aus α-Helices, welche durch
Kehren und Schleifen verbunden sind (siehe Abb. 14).
Abb. 14: Ein größtenteils α-helicales Protein
14
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Bei der schematischen Darstellung werden α-Helices als gedrehte Bänder dargestellt, wobei
auch eine Darstellung als Stab möglich ist (siehe Abb. 15). In manchen, seltenen Fällen
werden die Seitenketten der α-Helix zusätzlich zu dem Bänderdiagramm herausgehoben und
eingezeichnet, um gewisse stereochemische oder für Reaktionen relevante Eigenschaften zu
verdeutlichen.
Abb. 15: Darstellung einer α-Helix.
A) Kugel-Stab-Modell
B) Bänderdiagramm
C) Zylindrische Darstellung
3.1.4.2.2
Das β-Faltblatt
Bei β-Faltblättern13 (β-sheet, β-pleated sheet) liegt die Polypeptidkette, in diesem Fall als βStrang bezeichnet, nicht aufgerollt, sondern beinahe vollkommen ausgestreckt vor, wobei die
Seitenketten benachbarter Aminosäuren in entgegengesetzte Richtungen weisen (siehe Abb.
16). Der Abstand zwischen zwei benachbarten Aminosäuren beträgt 0,35 nm, also um 0,2 nm
mehr als bei der α-Helix.
13
β, da es sich um die als zweites entdeckte Struktur handelt
15
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Abb. 16: Struktur eines β-Stranges
Durch diese Gegebenheiten wird ein breites Spektrum an flächigen Strukturen möglich. Sie
sind in ihrer Struktur vielfältiger als α-Helices und trotz ihres flächigen Aufbaus meist leicht
in sich gedreht (siehe Abb. 17).
Abb. 17: In sich gedrehte β-Stränge.
A) Kugel-Stab-Modell,
B) Darstellung als Pfeile
C) um 90° gedrehte Darstellung von B)
Innerhalb eines β-Faltblattes können sich zwei β-Stränge durch Wasserstoffbrücken
miteinander verbinden. Dies geschieht entweder parallel, das heißt, dass beide Stränge
dieselbe Richtung aufweisen (siehe Abb. 18), oder antiparallel, das heißt, dass die Stränge
entgegengesetzte Richtungen haben (siehe Abb. 19). Verbinden sich drei β-Stränge zu einem
16
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β-Faltblatt, wobei sich zwei Stränge zueinander parallel und zwei zu einander antiparallel
verhalten, spricht man von einem gemischten β-Faltblatt (siehe Abb. 20). β-Faltblätter
besitzen vor allem bei Fettsäure bindenden Proteinen große Bedeutung.
Abb. 18: Ein paralleles β-Faltblatt
Abb. 19: Ein antiparalleles β-Faltblatt
Abb. 20: Ein gemischtes β-Faltblatt
Bei der schematischen Darstellung werden β-Stränge zumeist als breite Pfeile dargestellt,
wobei ihre Spitzen in Richtung des carboxyterminalen Endes weisen. Dadurch kann der Typ
des Faltblattes (parallel/antiparallel/gemischt) angezeigt werden (siehe Abb. 21).
Abb. 21: Ein größtenteils aus β-Faltblättern bestehendes Protein
17
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3.1.4.2.3
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Die β-Kehre und die Ω-Schleife
Die β-Kehre, oft auch Haarnadelkehre genannt (reverse, β-turn, hairpin bend), ermöglicht eine
abrupte Richtungsänderung innerhalb eines Polypeptidstranges. Dabei ist eine CO-Gruppe
einer Aminosäure mit der NH-Gruppe der in der Kette dritten nachfolgenden Aminosäure
verknüpft (siehe Abb. 22).
Abb. 22: Struktur einer Kehre, die Wasserstoffbrückenbindung ist grün strichliert eingezeichnet
Kompliziertere Strukturen, welche einen Richtungswechsel der Polypeptidkette ermöglichen,
sind Schleifen, oft auch wegen ihrer Struktur als Ω-Schleifen (Ω-loops) bezeichnet. Kehren
und Schleifen sind ihm Gegensatz zu α-Helices und β-Faltblättern keine periodischen, aber
definierte Strukturen. Sie liegen immer an der Proteinoberfläche und sind oft an Interaktionen
des Proteins beteiligt (siehe Abb. 23).
Abb. 23: Schleifen an der Oberfläche eines Proteins (rot eingezeichnet)
18
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3.1.4.3
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Die Tertiärstruktur
„Die Gesamtanordnung der Polypeptidkette eines Proteins wird als Tertiärstruktur
bezeichnet.“14 Der Aufbau der Tertiärstruktur, also die Abfolge und Lage der soeben
vorgestellten Sekundärstrukturen, ist zumeist komplex und nicht symmetrisch.
Die Verteilung von polaren und unpolaren Gruppen sagt viel über die Eigenschaften eines
Proteins aus. Myoglobin, der Sauerstoffträger im Muskel, zum Beispiel besitzt in seinem
Inneren außer zweier Histine, welche für die Bindung von Eisen und Sauerstoff
verantwortlich sind, nur unpolare Reste. Das Äußere hingegen besitzt sowohl polare als auch
unpolare Areale (siehe Abb. 24).
Abb. 24: Verteilung der Aminosäuren im Myoglobin. A) Kalottenmodell des Myoglobins: hydrophobe Aminosäuren
sind gelb, hydrophile blau und andere weiß eingezeichnet B) Durch einen Querschnitt wird ersichtlich, dass der
Großteil der hydrophoben Aminosäuren im Inneren des Proteins liegen
In wässrigem Milieu werden sich hydrophobe Reste allgemein nach innen kehren, um dem
Wasser auszuweichen, hydrophile werden außen bleiben. Es kommt in wässriger Lösung also
zu einer spontanen Faltung der Polypeptidkette. α-Helices und β-Stränge sind meist
amphipatisch, dass heißt sie besitzen sowohl einen hydrophoben Anteil, welcher in der Regel
im Inneren des Proteins verbleiben wird, als auch einen hydrophilen Anteil, welcher der
Außenseite des Proteins zugewandt sein wird. Auch nehmen ungepaarte CO- und NHGruppen Einfluss auf die Struktur. „Eine ungepaarte NH- oder CO-Gruppe der Peptidbindung
zieht Wasser einem unpolaren Medium vor.“15 Besitzen sie jedoch hydrophobe Seitenketten
14
15
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 50
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 51
19
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und werden über Wasserbrücken (z.B. zu α-Helices oder β-Faltblättern) gepaart, so sind auch
sie in hydrophober Umgebung stabil. Ein weiterer Effekt, der die Teritiärstruktur eines
Proteins beeinflusst sind die Van-der-Waals-Kräfte, welche zwischen den eng aneinander
liegenden Polypeptidketten herrschen.
Wenn es die Funktion des Proteins erfordert, kann jedoch auch gegen die oben genannten
Regeln verstoßen werden. Es liegt also der hydrophile Bereich im Proteininneren und der
hydrophobe außen. Dies ist zum Beispiel bei Porinen, Molekülen in der Membran von
Bakterien, welche Kanäle in der durch vor allem Alkane geprägten Permiabilitätsbarrieren
bilden, der Fall. Der hydrophobe, aliphatische Teil der Porine interagiert mit dieser, das polare
Innere ist mit Wasser gefüllt und stellt somit einen Kanal dar (siehe Abb. 25).
Abb. 25: Struktur des Porin
Gewisse Kombinationen von Sekundärstrukturen, wie zum Beispiel das Helix-Kehre-Helix
Motiv, sind sehr häufig zu finden. Solche Einheiten werden Strukturmotive oder
Supersekundärstrukturen genannt. Auch falten sich einige Polypeptidketten zu Strukturen,
welche wie Perlen auf einer Kette wirken. Diese kompakten Einheiten, die Domänen, welche
die Perlen darstellen und durch flexible Polypetidsequenzen miteinander verbunden sind,
bestehen aus 30 bis 400 Aminosäuren.
20
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Durch das große Repertoire an Eigenschaften, welche die 20 Aminosäuren bilden, ist es so
möglich das Innere eines Proteins unter bester Ausnützung der Van-der-Waals-Kräfte
möglichst gut auszufüllen, die definierte, fixe Form eines Proteins sicherzustellen und diesem
dabei gewünschte Funktionen und Eigenschaften zu verleihen.
Eine Zerstörung der Tertiärstruktur, nicht aber der Primär- und Sekundärstruktur, wird
Denaturierung genannt. Sie kann als Umkehrung der spontanen Faltung von Proteinen
betrachtet werden (siehe Abb. 26). Dabei kann das Protein seine Eigenschaften verändern und
somit seine Wirkung verlieren.
Abb. 26: Spontane Faltung eines Proteins
3.1.4.4
Die Quartärstruktur
Viele Proteine verfügen über mehr als nur eine Polypeptidkette, welche auch als Untereinheit
bezeichnet
wird.
Die
räumliche
Anordnung
all
dieser
Untereinheiten
und
die
Wechselwirkungen innerhalb dieser wird als Quartärstruktur bezeichnet. Besteht die
Quartärstruktur aus zwei identischen Ketten, so wird diese als Dimer bezeichnet. Doch dies ist
nur selten der Fall. Meist ist die Quartärstruktur weitaus komplexer und enthält viele
verschiedene Untereinheiten. Das menschliche Hämoglobin zum Beispiel besteht aus je zwei
identen Untereinheiten, den α- und den β-Ketten (siehe Abb. 27).
21
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 27: Das α2β2-Tetramer des menschlichen Hämoglobins. A) Bänderdiagramm B)
Kalottenmodell
In diesem Fall spricht man von einem α2β2-Tetramer. Oft bilden auch viele Kopien derselben
Art eines Proteins Untereinheiten, welche mit Untereinheiten anderer Proteinspezies
komplexere Strukturen wie zum Beispiel Hüllen von Viren bilden (siehe Abb. 28).
Abb. 28: Hülle des menschlichen Rhinovirus, die Untereinheiten sind in verschiedenen Farben dargestellt
22
Albertus Magnus Gymnasium
4
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Physikalisch-chemische Grundlagen
4.1 Katalyse
4.1.1
Einführung in die Katalyse
„Als Katalysator16 bezeichnet man eine Substanz, deren Anwesenheit eine Reaktion
beschleunigt, ohne dass sie selbst eine (Netto)reaktion eingeht.“17 Hierbei senkt der
Katalysator die Aktivierungsenergie, indem er einen energetisch günstigeren Reaktionsweg
ermöglicht. Der Energieunterschied ΔG‡ des Übergangszustandes X‡, wobei G die GibbsEnergie (auch freie Enthalpie)18, ein thermodynamisches Potential ist, X für einen beliebigen
Zustand steht und das Symbol ‡ kurzlebige Zustände oder Produkte markiert (siehe Abb. 29).
Allgemein wird zwischen homogener, heterogener und Enzymkatalyse unterschieden. Bei der
homogenen Katalyse befinden sich Katalysator und Reaktionsmischung in der gleichen Phase,
bei der heterogenen in verschiedenen. Die dritte Art der Katalyse, auf welche im Folgenden
näher eingegangen wird, besitzt sowohl Charakteristika der homogenen Katalyse als auch der
heterogenen Katalyse: die Enzymkatalyse.
Abb. 29: Vergleich des Reaktionsverlaufs zwischen einer katalysierten und einer unkatalysierten Reaktion
16
Griech. Καταλύειν, sich auflösen, losbinden, aufheben
Atkins; Paula, 2006, S. 930
18
Nach Eyring ist die freie Enthalpie, also nicht lediglich nur die Enthalpie, sondern auch die Entropie bei
Reaktionen allgemein und so auch bei katalysierten Reaktionen bedeutend
17
23
Albertus Magnus Gymnasium
4.1.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Die Enzymkatalyse
Ein Großteil aller biochemischen Prozesse wird durch Enzyme beschleunigt, gesteuert, oder
sogar erst ermöglicht. Enzyme sind spezialisierte Proteine, welche in großer Varietät in fast
allen natürlichen Matrizes vorhanden sind. Ist eine katalytische Wirkung durch RNAMoleküle gegeben, so spricht man von Ribozymen. RNA ist eines der ersten biochemisch
bedeutenden Moleküle. Sie dürfte neben der Speicherung von Informationen auch
katalytische Aufgaben übernommen haben und kann somit als „Urenzym“ angesehen werden.
„In einer eleganten Versuchsreihe wies die Arbeitsgruppe um Thomas Cech nach, dass sich
die RNA in dieser [Anm.: Bezug auf die Entfernung eines Introns] Reaktion selbst spleißt und
das Intron herrausschneidet.“19
Da jedes Enzymen nur in der Lage ist eine bestimmte Menge an Substratmolekülen zu binden,
stehen bei enzymkatalysierten Reaktion nur eine begrenzte Anzahl an Bindungsstellen zur
Verfügung, was dazu führt, dass sich bei gleichbleibender Enzymkonzentration und
wachsender
Substratkonzentration
die
Reaktionsgeschwindigkeit
einer
maximalen
Geschwindigkeit annähert, welche dann erreicht ist, wenn alle Bindungsstellen der Enzyme
besetzt sind (siehe Abb. 30). Dieses Charakteristikum hat die Ezymkatalyse mit der
heterogenen Katalyse gemein.
Abb. 30: Reaktionsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der Substratkonzentration.
19
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S.948
24
Albertus Magnus Gymnasium
4.1.2.1
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Das aktive Zentrum
Enzyme besitzen ein aktives Zentrum, welches Bindungen mit Substraten eingehen kann
(Enzym-Substrat-Komplex) und diese dort zu den Produkten umsetzt. Dieses muss nicht nur
aus Aminosäuren bestehen, sondern kann auch Cofaktoren besitzen. Diese können kleine
organische Moleküle (Coenzyme) oder Metalle bzw. Metallionen sein. Ist ein Coenzym an
das zugehörige Enzym fest gebunden, so nennt man dies prosthetische Gruppe. „Ein Enzym
ohne Cofaktor wird als Apoenzym bezeichnet; das vollständige katalytisch aktive Enzym
heißt Holoenzym.“20 In Tabelle 1 sind einige Enzyme mit ihren Coenzymen bzw. ihren
Metallen aufgelistet.
Enzym
Cofaktor
Coenzym
Acetyl-CoA-Carboxylase
Coenzym A (CoA)
Glycogen-Phosphorylase
Pyridoxalphosphat
Lactat-Dehydrogenase
Nicotinamidadenindinucleotid (NAD+)
Monoamin-Oxidase
Flavinadeninnucleotid
Pyruvat-Carboxylase
Biotin
Pyruvat-Dehydrogenase
Thiaminpyrophosphat
Metall
Carboanhydrase
Zn2+
Gluthation-Peroxidase
Se
Hexokinase
Ni2+
Nitrat-Reduktase
Mo
Propionyl-CoA-Carboxylase
K+
Superoxid-Dismutase
Mn2+
Urease
Mg2+
Tab. 1: Enzyme mit ihren Cofaktoren
20
Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S.230
25
Albertus Magnus Gymnasium
4.1.2.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Das Schlüssel-Schloss-Prinzip
Enzyme sind hochspezifisch, ihre aktive Position ist auf das umzusetzende Substrat und die
Art der Reaktion abgestimmt. Das Substrat bildet mit dem aktiven Zentrum des Enzyms
Wechselwirkungen wie Van-der-Waals-Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen aus. Der
so resultierende Komplex wird Enzym-Substrat-Komplex (kurz ES-Komplex) genannt (siehe
Abb. 31). Das Schlüssel-Schloss-Prinzip versucht diesen Vorgang zu erklären, in dem es die
dreidimensionalen Strukturen des Enzyms und des Substrats mit einem Schlüssel bzw.
Schloss vergleicht, welche ideal ineinander passen, ohne dass dazu strukturelle Anpassungen
vorgenommen werden müssen (siehe Abb. 32). Experimentelle Untersuchungen haben jedoch
gezeigt, dass dies nicht vollkommen der Wahrheit entspricht und das Induced-fit-Modell die
Realität eher beschreibt.
Abb. 31: Ein Enzym-Substrat-Komplex (bei Cytochrom-P450-Oxidase)
Abb. 32: Schema des Schlüssel-Schloss-Prinzips
26
Albertus Magnus Gymnasium
4.1.2.3
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Das Induced-fit-Modell
Das Induced-fit-Modell oder auch Anpassungsmodell erklärt den Katalyseprozess, indem es
davon ausgeht, dass durch die Bindung des Substrats die Konformation, also die tatsächliche
und absolute räumliche Anordnung der Atome, im aktiven Zentrum geändert wird, um eine
optimale Bindung ausbilden zu können (siehe Abb. 33).
Abb. 33: Schema des Induced-fit-Modells
4.2 Kinetik
4.2.1
Einführung in die Kinetik
Das Gebiet der Kinetik beschäftigt sich mit den Geschwindigkeiten chemischer Reaktionen
und deren Gesetzmäßigkeiten. Dabei ist es grundlegend notwendig die Stöchiometrie der
Reaktion und mögliche Nebenreaktionen zu identifizieren. Dies geschieht im ersten Schritt
empirisch, wobei sich aus experimentellen Ergebnissen das Verhältnis der Konzentrationen
der Produkte und Edukte ermitteln lässt, welche schließlich zu allgemein gültigen
Differenzialgleichungen führen, aus denen sich bestimmte Parameter ausdrücken und ableiten
lassen.
4.2.1.1
Definition der Reaktionsgeschwindigkeit
Allgemein ist die Geschwindigkeit einer Reaktion als Anzahl der umgesetzten Teilchen pro
Zeiteinheit definiert. Für eine Reaktion A → B + C gilt also für die Hinreaktion:
27
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
𝜈=−
𝑑𝐴
𝑑𝑡
(1)
Das negative Vorzeichen rührt daher, dass die Abnahme der Konzentration von A, also –[A]
betrachtet wird. Dies wäre aber äquivalent mit den Ausdrücken:
𝜈=
4.2.1.2
𝑑𝐵
𝑑𝑡
und 𝜈 =
𝑑𝐶
𝑑𝑡
(2), (3)
Die Reaktionsordnung
In den meisten Fällen stellt sich jedoch heraus, dass die Reaktionsgeschwindigkeiten
proportional zu einer experimentell bestimmbaren Potenz der Stoffkonzentrationen sind. Für
eine beliebige Reaktion gilt also:
𝜈 = 𝑘[𝐴]𝑎 [𝐵]𝑏 …
(4)
„Die Potenz, in der die Konzentration eines bestimmten Teilchens im Geschwindigkeitsgesetz
einer Reaktion erscheint, ist die Ordnung der Reaktion im Bezug auf dieses Teilchen.“21 Für
a = 1 würde also gelten, dass die Reaktion im Bezug auf den Stoff A erster Ordnung ist.
Die Addition aller Exponenten gibt die Gesamtordnung einer Reaktion an. Sind zwei Stoffe
beteiligt, deren Exponenten beide 1 sind, so ist das Geschwindigkeitsgesetz also gesamt
zweiter Ordnung.
Bei manchen Reaktionen kann auch ein Geschwindigkeitsgesetz nullter Ordnung auftreten.
Diese Reaktionsgeschwindigkeiten sind also unabhängig von jeglicher Teilchenkonzentration.
Für sie gilt:
𝜈=𝑘
(5)
Das Geschwindigkeitsgesetz kann für jede Reaktion experimentell ermittelt werden, wobei
jeder Reaktionsordnung ein allgemein gültiges differentielles Geschwindigkeitsgesetz
zugeordnet werden kann.
21
Atkins; Paula, 2006, S. 880
28
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Oft wird für die Ermittlung dieser auf Vereinfachungen zurückgegriffen, wie die des
Geschwindigkeitsgetzes pseudo-erster Ordnung. Ist ein Geschwindigkeitsgesetz von den
Reaktanten A und B abhängig, so kann beispielsweise B in so großem Überschuss zugesetzt
werden, sodass annäherungsweise [B] = [B] 0 während des gesamten Reaktionsverlaufes gilt,
dass sich die Konzentration von B nicht merklich ändert. Werden bei einer Reaktion, an der
mehrere Stoffe beteiligt sind, alle Stoffe bis auf einen im Überschuss zugesetzt, so kann die
Reaktionsordnung in Bezug auf diesen festgestellt werden. Man spricht von der
Isoliermethode.
4.2.1.3
Quasistationarität
Bei mehrstufigen Reaktionen, das heißt Reaktionen, die über mehrere Zwischenstufen laufen,
steigt der mathematische Rechenaufwand von Zwischenstufe zu Zwischenstufe stark an. „Ein
aus zahlreichen Schritten bestehender Mechanismus ist analytisch nahezu nicht mehr nicht
[sic!] beschreibbar, sodass wir nach anderen Lösungsmethoden suchen müssen.“22 Um eine
Möglichkeit zu finden, dennoch zu auswertbaren Gesetzmäßigkeiten zu kommen, bedient
man sich der Näherung des quasistationären Zustandes. Bei diesem wird angenommen, dass
die Konzentration der Intermediate, also der kurzlebigen Zwischenprodukte (X), die sich im
Laufe einer Reaktion bilden, erst in einer Induktionsperiode von null ausgehend ansteigt, sich
im weiteren Verlauf jedoch nicht relevant ändert. Damit gilt:
𝑑[𝑋]
≈0
𝑑𝑡
(6)
Dies führt in weiterer Folge zu einer grundlegenden Vereinfachung vieler mathematischer
Schritte, die für die kinetische Betrachtung komplexerer Reaktionen relevant sind. Hier sind
als typische Intermediate Radikale oder Enzym-Substrat-Komplexe zu nennen.
22
Atkins; Paula, 2006, S. 899
29
Albertus Magnus Gymnasium
4.2.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Die Michaelis-Menten-Kinetik
Für enzymkatalysierte Reaktionen gelten bestimmte Bedingungen und Gesetzmäßigkeiten,
welche von der kanadischen Medizinerin Maud Menten und dem deutsch-US-amerikanischen
Biochemiker und Mediziner Leonor Michaelis 1913 in der nach ihnen benannten MichealisMenten-Theorie formuliert wurden.
4.2.2.1
Um
Michaelis-Menten-Mechanismus
die
Kinetik
einer
enzymatischen
Reaktion
zu
untersuchen,
wird
die
Anfangsgeschwindigkeit der durch geringe Mengen eines Enzyms beschleunigten
Produktbildung in einer Lösung gemessen. Die hohe Effizienz des Enzyms zeigt sich unter
anderem dadurch, dass selbst, wenn die Konzentration des Enzyms drei Größenordnungen
unter der des Substrats liegt noch eine merkliche Beschleunigung feststellbar ist.
„Die grundlegenden Merkmale enzymatischer Reaktionen sind:
1. Bei
gegebener
Anfangskonzentration
[S]0
des
Substrats
ist
die
Anfangsgeschwindigkeit der Produktbildung proportional zur Gesamtkonzentration
des Enzyms, [E] 0.
2. Bei gegebenem [E] 0 und niedrigen Werten von [S] 0 ist die Geschwindigkeit der
Produktbildung proportional zu [S] 0.
3. Bei gegebenen Werten von [E] 0 und hohen Werten von [S] 0 wird die Geschwindigkeit
der Produktbildung unabhängig von [S] 0 und erreicht einen Höchstwert, die
Maximalgeschwindigkeit νmax.“23
Diese Grundlagen werden im Michaelis-Menten-Mechanismus wiedergegeben. Dabei wird im
ersten Schritt reversibel ein Enzym-Substrat-Komplex gebildet. Im zweiten Schritt setzt das
Enzym das Produkt frei und ist damit entweder unverändert oder modifiziert (Induced-fitModell) für die Bildung eines Enzym-Substratkomplexes wieder frei. Diesen Schritten
werden die Geschwindigkeitskonstanten ka der Bildung des Enzym-Substrat-Komplexes, bzw.
ka‘ für die Rückreaktion und kb der Produktbildung zugeordnet:
23
Atkins; Paula, 2006, S. 932
30
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
𝐸+𝑆
ka
𝐸𝑆 𝑘𝑎 , 𝑘𝑎′
(7)
𝑘𝑎′
𝑘𝑏
𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃
(8)
𝑘𝑏
Zwischen den beiden oben genannten Schritten liegt noch ein Zwischenschritt, in dem das
Produkt an das Enzym gebunden ist, der Enzym-Produkt-Komplex. Dieser ist jedoch für
weitere Berechnungen vernachlässigbar.
4.2.2.2
Michaelis-Menten-Gleichung
Wenn die in 4.2.1.2 definierte Beziehung nun angewandt wird und dabei die in 4.2.2.1
festgelegten Eigenschaften der enzymatischen Reaktionen berücksichtigt werden, erhält man
für die Geschwindigkeit der Produktbildung:
𝜈 = 𝑘𝑏 [𝐸𝑆]
(9)
Die Bildungsgeschwindigkeit des Enzym-Substrat-Komplexes ergibt sich analog dazu als:
𝜈 = 𝑘𝑎 𝐸 [𝑆]
Die
Zerfallsgeschwindigkeit
des
Enzym-Substrat-Komplexes
(10)
ergibt
sich
aus
der
Geschwindigkeit der Rückreaktion und der Produktbildungsgeschwindigkeit und ist demnach:
𝜈 = 𝑘𝑎′ 𝐸𝑆 + 𝑘𝑏 [𝐸𝑆]
(11)
Werden nun die Bildungs- und die Zerfallsgeschwindigkeit kombiniert und das Prinzip der
Quasistationarität herangezogen und der Enzym-Substrat-Komplex als Intermediat betrachtet,
so ergibt sich für die Konzentration des Enzymsubstratkomplexes:
𝑑[𝐸𝑆]
= 𝑘𝑎 𝐸 𝑆 − 𝑘𝑎′ 𝐸𝑆 − 𝑘𝑏 𝐸𝑆 = 0
𝑑𝑡
(12)
31
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Durch Umformung folgt:
𝐸𝑆 =
𝑘𝑎′
𝑘𝑎
+ 𝑘𝑏
(13)
𝐸 [𝑆]
Dabei sind [E] und [S] die Konzentrationen des freien Enzyms und des freien Substrats. Aus
der obigen Beziehung lässt sich nun die so genannte Michaelis-Konstante KM definieren:
𝑘𝑎′ + 𝑘𝑏
𝐸 [𝑆]
𝐾𝑀 =
=
𝑘𝑎
[𝐸𝑆]
(14)
Daraus ist ersichtlich, dass die Einheit der Michaelis-Konstante eine molare Konzentration ist.
Um nun ein von den Ausgangskonzentrationen des Enzyms [E] 0 und des Substrats [S] 0
abhängiges Geschwindigkeitsgesetz zu finden, müssen zwei Überlegungen angestellt werden:
Erstens gilt, dass sich die Ausgangskonzentration des Enzyms aus der Summe der
Konzentration des freien Enzyms und der Konzentration des Enzym-Substrat-Komplexes
ergibt:
[𝐸]0 = 𝐸 + [𝐸𝑆]
(15)
Zweitens ist, da das Substrat relativ zum Enzym im Überschuss vorliegt, die Konzentration
des freien Substrats näherungsweise die Anfangskonzentration des Substrats:
𝑆 ≈ [𝑆]0
(16)
Daraus ergibt sich durch Umformen und Einsetzen in die Gleichung der Michaelis-Konstante:
𝐸𝑆 =
[𝐸]0 − [𝐸𝑆] [𝑆]0
𝐾𝑚
(17)
Löst man nach [ES] auf, erhält man:
𝐸𝑆 = [𝐸]0
[𝑆]0
[𝑆]0 + 𝐾𝑀
(18)
32
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Das Einsetzen in die Gleichung für die Geschwindigkeit der Produktbildung führt zu:
𝜈 = 𝑘𝑏 [𝐸]0
[𝑆]0
[𝑆]0 + 𝐾𝑀
(19)
Die Maximalgeschwindigkeit ist dann erreicht, wenn alle Enzyme durch Substrate gesättigt
sind, also [ES] = [E] 0 erfüllt ist. Somit gilt:
𝜈𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑏 [𝐸]0
(20)
Einsetzen der Gleichung 20 in die Gleichung 19 liefert die Michaelis-Menten-Gleichung:
𝝂=
4.2.2.3
𝒗𝒎𝒂𝒙 [𝑺]𝟎
𝑲𝒎 + 𝑺𝟎
(21)
Lineweaver-Burk-Diagramm
Es gibt die Möglichkeit, die Michaelis-Menten-Gleichung in eine Form zu bringen, welche
für die Datenauswertung durch lineare Regression geeignet ist:
𝟏
𝟏
𝑲𝑴
=
+
𝝂 𝝂𝒎𝒂𝒙
𝝂𝒎𝒂𝒙
𝟏
𝑺𝟎
(22)
Trägt man nun 1 / ν gegen 1 / [S] 0 in einem Diagramm auf, erhält man eine Gerade mit der
Steigung KM / νmax, dem y-Achsenabschnitt 1 / νmax und dem x-Achsenabschnitt -1 / KM. Des
Weiteren lässt sich kb aus den so erhaltenen Daten berechnen. Dieses Diagramm wird als
Lineweaver-Burk-Diagramm bezeichnet (siehe Abb. 34).
33
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 34: Linweaver-Burk-Diagramm
4.3 Hemmung
Es gibt Stoffe, welche die Fähigkeit aufweisen, ein Enzym zu hemmen (inhibieren) und so
seine Wirkung zu schwächen. Diese Hemmung kann reversibel oder irreversibel sein. Handelt
es sich um eine irreversible Hemmung, führt dies zu einer permanenten Inhibierung, wobei
das Enzym seine Wirkung verliert.
Nach der Enzymform (freies Enzym, Enzym-Substrat-Komplex) werden drei Arten von
Hemmungen unterschieden: die kompetitive, die nichtkompetitive und die unkompetitive
Hemmung (siehe Abb. 35). Auch bei zu hohen Substratkonzentrationen kann es zu einer
Hemmung kommen. „Je nachdem, an welche Enzymform (E, ES, EP usw. im katalytischen
Kreisprozess) sich der Inhibitor anlagert, resultiert in der Darstellung nach Lineweaver und
Burk eine Änderung der Steigung der Geraden oder des Ordinatenabschnittes oder von
beiden…“24
24
Wollenberger; Renneberg; Bier; Scheller, 2003, S. 28
34
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 35: Schematische Darstellung der drei Hemmtypen im Vergleich zu einem ungehemmten Enzym-SubstratKomplex
4.3.1
Kompetitive Hemmung
Bei der kompetitiven Hemmung konkurriert der Inhibitor mit dem Substrat um die
Bindungsstelle im aktiven Zentrum des Moleküls. Es findet also nicht nur eine Reaktion
zwischen Enzym und Substrat statt, sondern auch eine Reaktion zwischen Inhibitor und
Substrat, welche zur Bildung eines Enzym-Inhibitor-Komplexes führt, der ebenfalls mit dem
Substrat reagieren kann (siehe Abb. 36).
Abb. 36: Bei einer kompetitiven Hemmung stattfindende Reaktionen
In einem Lineweaver-Burk-Diagramm kann man diesen Hemmungstyp daran erkennen, dass
vmax unverändert ist, also der Schnittpunkt mit der Ordinate gleich ist, jedoch Km und somit
die Steigung deutlich erhöht ist (siehe Abb. 37).
35
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 37: Lineweaver-Burk-Diagramm einer kompetitiven Hemmung
Eine kompetitive Hemmung kann durch eine höhere Substratkonzentration ausgeglichen
werden, da die Stärke der Hemmung nur vom Verhältnis der Substratkonzentration zur
Inhibitorkonzentration abhängig ist.
4.3.2
Nichtkompetitive Hemmung
Nichtkompetitiv hemmende Inhibitoren können sowohl an das freie Enzym als auch an den
Enzym-Substrat-Komplex binden. Der Inhibitor bindet dabei nicht an das aktive Zentrum,
sondern an eine andere Stelle am Enzym und hindert das Substrat dabei sich an das Enzym
anzulagern. Bindet der Inhibitor an einen Enzym-Substrat-Komplex, kann es nicht zu einer
Umwandlung des Substrates und somit nicht zu einer Freisetzung des Produktes kommen
(siehe Abb. 38).
Abb. 38: Bei einer nichtkompetitiven Hemmung stattfindende Reaktionen
36
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
In einem Lineweaver-Burk-Diagramm kann eine nichtkompetitive Hemmung daran erkannt
werden, dass KM und somit der Schnittpunkt mit der Abszisse unverändert bleibt, jedoch vmax
erniedrigt und somit die Steigung erhöht wird (siehe Abb. 39).
Abb. 39: Lineweaver-Burk Diagramm einer nichtkompetitiven Hemmung
In der Regel kommt es zu der Beeinträchtigung der Wirkung durch eine Deformierung der
räumlichen Struktur des aktiven Zentrums. Die relative Hemmwirkung hängt dabei nicht von
der Konzentration des Substrates ab.
4.3.3
Unkompetitive Hemmung
Im Fall einer unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor nur an den Enzym-SubstratKomplex. Auch hier erfolgt die Bindung nicht an die aktive Position, kann jedoch nur bei
Vorhandensein eines an das Enzym gebundenen Substrates erfolgen, wodurch es zur
Ausbildung eines Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplexes kommt. Dieser ist nicht in der Lage
ein Produkt freizusetzen (siehe Abb. 40).
Abb. 40: Bei einer unkompetitiven Hemmung stattfindende Reaktionen
37
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
In einem Lineweaver-Burk-Diagramm wirkt sich die unkompetitive Hemmung in der Form
aus, dass KM und vmax um den gleichen Betrag vermindert werden, die Steigung also gleich
bleibt, sich jedoch die Schnittpunkte mit Abszisse und Ordinate verändern (siehe Abb.41).
Abb. 41: Lineweaver-Burk Diagramm einer unkompetitiven Hemmung
38
Albertus Magnus Gymnasium
5
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Analytisch-chemische Grundlagen
5.1 Instrumentelle Analytik
Um eine Messung der Konzentrationsänderung eines Substrates abhängig von der Zeit
durchzuführen, bedient man sich analytischer Verfahren, welche auf verschiedenen
Grundlagen basieren können. Dies kann zum Beispiel durch optische Dedektion erreicht
werden, jedoch stehen auch nasschemische Methoden wie Titration, Biosensoren oder
elektrochemische Methoden wie Voltammetrie oder Chronoamperometrie zur Verfügung.
Dabei hat jedes dieser Verfahren Nachteile und ist nur eingeschränkt nutzbar.
Elektrochemische Methoden sind nur bei elektrochemisch aktiven Substanzen wie
Reduktions- oder Oxidationsmitteln durchführbar, Methoden, die auf optischen Messungen
beruhen nur bei Substanzen, welche durch die Umsetzung durch das Enzym ihre Farbe
ändern. Zweitgenannte Methode kommt aufgrund mehrerer Vorteile, wie die Möglichkeit,
Echtzeitmessungen durzuführen, dort wo es möglich ist, oft zur Anwendung. Im Hinblick auf
den praktischen Teil dieser Arbeit wird im Folgenden eine dieser optischen Methoden, die
Photometrie, näher erläutert.
5.1.1
Einführung in die Photometrie
In der Photometrie, welche ein Teilbereich der Spektroskopie ist, wird die Absorption (in
seltenen Fällen auch die Emission) des sichtbaren Lichts meistens in Lösung gemessen.
Daraus kann dann auf die Konzentration des untersuchten Stoffes geschlossen werden. Das
Gerät mit dem solche Messungen durchgeführt werden, wird Photometer genannt.
5.1.1.1
Apparativer Aufbau eines Photometers
Im Prinzip sind Photometer aus einer Strahlungsquelle, welche meist eine Wolframbandlampe
ist, aber in letzter Zeit auch durch Halogenlampen ersetzt wird, einem Probenraum, einem
Monochromator, welcher aus dem Licht der Strahlungsquelle Licht mit nur einer Wellenlänge
erzeugt, einem Empfänger und einer Register- und Auswerteeinheit aufgebaut. Das System
wird zumeist auch durch Blendensysteme erweitert. Die flüssige Probe befindet sich dabei in
einer Glas- oder Kunststoffküvette im Probenraum. (siehe Abb. 42)
39
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 42: Schematischer Aufbau eines Photometers
5.1.1.2
Prinzip der Messung
Beim Durchgang des monochromatischen Lichtes durch die Probe erfährt dieses aus mehreren
Gründen eine Intensitätsschwächung. Zum einen durch Absorption und Streuung der
Strahlung durch die Probe, zum anderen aber auch durch Reflexion und Absorption durch das
Küvettenmaterial. Streulicht, Reflexion und Küvettenabsorption werden jedoch durch eine
Küvette, welche nur das Lösungsmittel, jedoch nicht die Probe enthält, korrigiert. Man spricht
von einem Blindwert beziehungsweise dem „Blank“.
5.1.1.3
Transmission und Extinktion
Die Absorptionsintensität kann durch die Transmission und die Extinktion (auch Absorption)
charakterisiert werden. Dabei ist die Transmission (T) ein Maß für das Verhältnis der
durchgelassen Strahlungsintensität (I) zur einfallenden (I0) und kann daher folgendermaßen
berechnet werden:
𝑇=
𝐼
𝐼0
(23)
Auch eine prozentuelle Auswertung ist möglich:
𝑇[%] =
𝐼
100
𝐼0
(24)
40
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Die Extinktion (E) berechnet sich über den dekadischen Logarithmus des Kehrwertes der
Transmission, also folgt:
𝐸 = 𝑙𝑜𝑔
𝐼0
𝐼
(25)
Statt der Variablen E ist auch die Variable A für Adsorption gebräuchlich.
Wird die Absorption bzw. die Emission in Abhängigkeit von der Wellenlänge gemessen, so
ergibt sich ein Absorptions- bzw. Emissionsspektrum, aus dem sich das für Messungen und
Berechnungen oft notwendige Absorptions- bzw. Emissionsmaximum ablesen lässt.
5.1.1.4
Lambert-Beer‘sches Gestetz
„Untersuchungen von BOUGUER (1698 bis 1758) und LAMBERT (1728 bis 1777) zeigten,
daß [sic!] die Extinktion von der Schichtdicke der Küvette abhängt. Die Abhängigkeit der
Extinktion von der molaren Konzentration wurde von BEER (1825-1863) gefunden. Die
Kombination beider Gesetzmäßigkeiten führt zum Gesetz von BOUGUER, LAMBERT und
BEER oder einfach nur LAMBERT-BEERsches Gesetz …“25
Das Lambert-Beer‟sche Gesetz erlaubt es, die Strahlungsschwächung in Abhängigkeit vom
zurückgelegten Weg zu berechnen:
𝐼 = 𝐼0 10−𝜀𝑐𝑑
(26)
Dabei sind ε der Extinktionskoeffizient, eine empirisch ermittelte Stoffkonstante, c die
Konzentration des absorbierenden Stoffes und d die Schichtdicke der Probe.
„Die Abnahme dI der Intensität I, die eintritt, wenn die Strahlung die Strecke dl26 zurücklegt,
die die Konzentration [J]27 der absorbierenden Teilchen J enthält, muss proportional zur
Länge des Weges, der Konzentration der Teilchen und der Intensität des Lichtstrahls sein.“28
25
Otto, 2006, S. 285
Anm.: in meiner Fachbereichsarbeit als d bezeichnet
27
Entspricht c
28
Atkins, Paula; 2006, S. 485 f.
26
41
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Wenn man diesen Proportionalitätsfaktor als κ definiert, ergibt sich also:
𝑑𝐼 = − 𝜅 𝑐 𝐼 𝑑
(27)
𝑑𝐼
=−𝜅𝑐𝑑
𝐼
(28)
Durch Umformung erhält man:
„Dieser Ausdruck gilt für jede unendlich dünne Schicht, durch die der Strahl hindurchtritt.“29
Für eine endlich dicke Probe mit der Länge d muss also die Summe aller unendlich dünnen
Schichten gebildet werden, um die Abnahme der Intensität I0 zu berechnen. Dies führt zu
einem bestimmten Integral:
𝐼
𝐼0
𝑑𝐼
=−𝜅
𝐼
𝐼
(29)
𝑐𝑑
𝐼0
Bleibt die Konzentration c überall in der Probe gleich groß, so ergibt sich als Lösung des
Integrals:
𝑙𝑛
𝐼
=−𝜅𝑐𝑑
𝐼𝑂
(30)
Durch Umwandlung des natürlichen in den dekadischen Logarithmus nach ln(x) = (ln10)
log(x) und Ersetzen von κ durch ε ln10 erhält man das Lambert-Beer‟sche-Gesetz:
𝐸= 𝜀𝑐 𝑑
29
(31)
Atkins; Paula, 2006, S. 486
42
Albertus Magnus Gymnasium
6
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Eigene Experimente
Um die Michaelis-Menten-Kinetik nachzuvollziehen und zu messen wurden anhand eines
Enzyms
einige
Experimente
und
Messungen
durchgeführt.
Dabei
diente
Meerrettichperoxidase30 als Enzym, als Substrat Wasserstoffperoxid (H2O2) und als
Elektronendonatoren drei verschiedene Substanzen. Diese waren: ABTS31 (siehe Abb. 43),
Guajakol32 (siehe Abb. 44) und Para-Phenylendiamin33 (siehe Abb. 45).
Abb. 43: ABTS
Abb. 45: pPhenylendiamin
Abb. 44: Guajakol
6.1 Vorbereitungen
6.1.1
Synthese von Cystin aus Cystein
Verwendete Chemikalien
L-Cystein (kristallin)
Verwendete Geräte
Magnetrührer „IKA-WERKE RCTB“
(siehe Abb. 46)
KI-Lösung (10%)
I2 (kristallin)
30
Auch Krenperoxidase, horseradish peroxidase, HRP (im Weiteren auch meist mit dieser Abkürzung
bezeichnet)
31
Nach IUPAC 2,2‘-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz
32
Auch Guajacol, nach IUPAC 2-Methoxy-phenol
33
Auch p-Phenylendiamin, PPD, nach IUPAC 1,4-Diaminobenzen
43
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 46: Magnetrührer IKA-WERKE RCTB
Das bereits im theoretischen Teil erwähnte Cystin ist einer der möglichen Inhibitoren für
HRP. Es lässt sich leicht aus Cystein durch Oxidation mit einem milden Oxidationsmittel
gewinnen. Ein mögliches Oxidationsmittel hierfür ist Iod. Ein Mol Iod (I2) wird zu zwei Mol
Iodid (I-) reduziert und oxidiert dabei zwei Mol Cystein zu einem Mol Cystin (siehe 3.1.2,
Abb. 8). Im Gegensatz zu Cystein ist Cystin schlecht in Wasser löslich und lässt sich daher
leicht abfiltrieren.
L-Cystein wurde gelöst und mit KI-Lösung versetzt. Unter ständigem Rühren mit einem
Magnetrührer wurden I2-Kristalle zugegeben. Dabei konnte eine Entfärbung des gelösten Iods
beobachtet werden, was auf dessen Reduktion zu Iodid schließen ließ. Es fielen weiße CystinKristalle aus, welche durch eine Glasfritte abfiltriert, mehrmals gewaschen, getrocknet und
zur weiteren Verwendung aufbewahrt wurden (siehe Abb. 47).
Abb. 47: Das synthetisierte Cystin
44
Albertus Magnus Gymnasium
6.1.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Herstellung des Britton-Robinson-Puffers
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
Phosphorsäure (85%)
Magnetrührer „IKA-WERKE RCTB“
Essigsäure (98%)
pH-Meter „WTW pH 315i“ (siehe Abb.48)
Borsäure (kristallin)
NaOH, 2 mol/L (8 g L-1)
Abb. 48: pH-Meter „WTW pH 315i“
2,73 mL Phosphorsäure, 2,40 mL Essigsäure und 2,472 g Borsäure wurden mit Deionat auf
einen Liter aufgefüllt und danach mit NaOH auf pH 5,0 eingestellt, wobei der pH-Wert
kontinuierlich mit einem pH-Meter kontrolliert wurde (Abb. 49).
45
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 49: Einstellen des Britton-Robinson-Puffers
6.1.3
Herstellung des Phosphat-Puffers
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
KH2PO4 (kristallin)
Magnetrührer „IKA-WERKE RCTB“
Na2HPO4 (kristallin)
pH-Meter „WTW pH 315i“
NaOH, 2 mol/L (8 g L-1)
Nach der Henderson-Hasselbalch-Gleichung lässt sich das Konzentrationsverhältnis zwischen
Säure und Base in einem konjungierten Puffer bei gewünschtem pH-Wert berechnen:
𝑝𝐻 = 𝑝𝐾𝑆 − 𝑙𝑔
𝑆ä𝑢𝑟𝑒
𝐵𝑎𝑠𝑒
(31)
46
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
In diesem speziellen Fall ist der gewünschte pH-Wert 7, die Säure H2PO4-, die konjugierte
Base Na2HPO4 und somit der pKs (von H2PO4-) 7,21. Setzt man nun die Konzentration der
Base willkürlich 1 mol/L, so erhält man:
7 = 7,21 − 𝑙𝑔 𝑆ä𝑢𝑟𝑒
(32)
Durch Umformung erhält man für die Säurekonzentration 1,6 mol/L. Das Verhältnis von
Säure zu Base, also von KH2PO4 zu Na2HPO4, müsste also 1,6 zu 1 (8:5) betragen.
Es wurde eine der Stoffmenge äquivalente Masse der beiden Substanzen im oben genannten
Verhältnis eingewogen und in Deionat gelöst. Der geringfügig von 7,0 abweichende pH-Wert
wurde wie in 6.1.2 beschrieben mit NaOH korrigiert.
6.1.4
Reinigung von Guajakol durch Vakuumdestillation
Guajakol ist ein für die Aktivitätsbestimmung von HRP gut geeigneter Elektronendonator.
Einer der Nachteile ist jedoch, dass es nach einiger Zeit an der Luft oxidiert und sich dabei
von farblos nach braunviolett färbt. Da nun eine durch Oxidation verunreinigte Substanz
vorlag, ergab sich die Notwendigkeit der Reinigung eben dieser. Die Methode der
Umkristallisation war aufgrund des Schmelzpunktes, welcher bei Normaldruck (760 Torr34)
zwischen 28°C und 32°C liegt, jedoch auszuschließen.
So war eine Destillation der nächste Gedanke. Aufgrund des Siedepunktes, welcher bei
Normaldruck 205°C beträgt, ergab sich die Notwendigkeit einer Vakuumdestillation.
Aus Baukastenteilen wurde daher eine Vakuumdestillationsapparatur aufgebaut (siehe Abb.
50).
34
760 Torr = 760 mmHg = 1 atm (Atmosphäre) = 101 325 Pa (Pascal) = 1,01325 bar
47
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
D
H
C
I
F
E
B
A
J
G
Abb. 50: Vakuumdestillationsapparatur
Diese bestand aus einem Zweihalskolben (siehe Abb. 50, A), in dem sich das verunreinigte
Guajakol befand, einer Kapillare35 (siehe Abb. 50, B), einem einfachen Destillationsaufsatz
(siehe Abb. 50, C), einem Thermometer (siehe Abb. 50, D), einem Liebig-Kühler
(siehe Abb. 50, E), einer Spinne mit drei Kolben (siehe Abb. 50, F) und einer Woulfeschen
Flasche36 (siehe Abb. 50, G) mit Manometer (siehe Abb. 50, H). Das Vakuum wurde mittels
Wasserstrahlpumpe (siehe Abb. 50, I) erzeugt, geheizt wurde mit einer Heizhaube (siehe
Abb. 50, J). Da durch den niedrigen Schmelzpunkt des Destillats jedoch ein Festkörper im
Kühler entstehen würde, wurde dieser mit Warmwasser beschickt.
Die Destillation wurde bei 88°C und einem Druck von 12 Torr durchgeführt. Nach der
Clausius-Claperyon‟schen Gleichung für den Phasenübergang flüssig/gasförmig kann der
Dampfdruck in Abhängigkeit von der Temperatur oder der Siedepunkt in Abhängigkeit von
dem Druck berechnet werden. Sie lautet:
35
Kapillaren dienen bei Vakuumdestillationen zur Vermeidung von Siedeverzügen
Woulfesche Flaschen dienen bei Erzeugen eines Vakuums mittels Wasserstrahlpumpe als
Sicherheitsflaschen, um ein Zurückschlagen des Wassers in die Apparatur zu verhindern
36
48
Albertus Magnus Gymnasium
𝑙𝑛
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
𝑝1
∆𝑉 𝐻 1
1
=
−
𝑝2
𝑅 𝑇2 𝑇1
(33)
Hierbei sind p1 und p2 die Dampfdrücke des Stoffes bei den Temperaturen T1 und T2 (bzw.
sind T1 und T2 die Siedepunkte bei den Drücken p1 und p2), ∆𝑉 𝐻 die Verdampfungsenthalpie
des Stoffes und R die Gaskonstante (= 8,31447 J K-1 mol-1 = 62,3637 dm3 Torr K-1 mol-1).
Im Fall von Guajakol beträgt die Siedetemperatur bei 760 Torr 205°C, wobei in die
Gleichung jedoch K37 statt °C eingesetzt werden muss. Die Verdampfungsenthalpie von
Guajakol beträgt 45,92 kJ mol-1 (= 45 920 J mol-1). Möchte man nun bei einer Temperatur
von 90°C destillieren und setzt die oben genannten Werte in die Gleichung ein, so erhält man
den Druck, auf den man herabsenken muss, um dies zu ermöglichen. Dieser beträgt 19,6 Torr.
Für 88°C würde er 18,0 Torr betragen. Es wäre theoretisch also ein weniger stark reduzierter
Druck notwendig gewesen als in der Praxis, der Siedepunkt liegt also höher (theoretisch
müsste der Siedepunkt bei 12 Torr bei rund 79°C liegen). Diese Siedepunkterhöhung ist
vermutlich auf die Verunreinigung des Guajakols durch die Oxidationsprodukte, aber auch
durch andere Substanzen wie Wasser zurückzuführen.
Das Destillat, welches vermutlich durch eine leichte Verunreinigung mit Wasser nicht
auskristallisierte, wurde in eine braune Flasche abgefüllt und für die weitere Verwendung
aufbewahrt.
6.2 Charakterisierung der Meerrettichperoxidase
6.2.1
6.2.1.1
Thereotische Einführung
Organische-chemische Charakteristika des Enzyms
Meerrettichperoxidase38, eine Oxireduktase, katalysiert die Oxidation organischer Substanzen
unter Verwendung von H2O2 als Substrat. Dabei findet allgemein folgende Reaktion statt:
𝐻2 𝑂2 + 𝐸𝑙𝑒𝑘𝑡𝑟𝑜𝑛𝑒𝑛𝑑𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜𝑟 2 𝑒 − + 2 𝐻 +
37
38
HRP
2 𝐻2 𝑂 + 𝐸𝑙𝑒𝑘𝑡𝑟𝑜𝑛𝑒𝑛𝑑𝑜𝑛𝑎𝑡𝑜𝑟 2+ (34)
Kelvin, K = °C + 273,15
Auch Krenperoxidase, horseradish peroxidase, HRP
49
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Es sind jedoch auch Donatoren denkbar, welche nur ein oder mehr als zwei Elektronen
abgeben können. Dementsprechend müssten die stöchiometrischen Koeffizienten angepasst
werden. Als Donatoren kommen organische Moleküle wie Guajakol, ABTS, Luminol,
Pyrogallol oder o-Phenylendiamin in Frage.
Meerrettichperoxidase ist ein aus 308 Aminosäuren bestehendes Polymer mit einer Masse von
ca. 44 000 Dalton. Als Cofaktor besitzt das Protein ein Häm b-Molekül. Neben der
Polypeptidkette sind des Weiteren noch zwei Ca2+ und mehrere Kohlenhydrat-Moleküle
enthalten (siehe Abb. 51).
Abb. 51: Struktur der Meerrettichperoxidase, Ca2+-Atome grün, Fe2+ orange eingezeichnet
Eine Hemmung des Moleküls kann sowohl durch einige organische als auch durch mehrere
anorganische Verbindungen auftreten. Beispiele für organische Inhibitoren sind Cystin,
p-Aminobenzoesäure
oder
Harnstoff.
Beispiele
für
anorganische
Inhibitoren
sind
Hydroxylamin, Vanadate, aber auch Schwermetallionen wie Pb2+, Cd2+, Cu2+ oder Fe3+ (das
Zentralatom des Cofaktors des Enzyms, das Häm b, ist Fe2+).
50
Albertus Magnus Gymnasium
6.2.1.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Isolierung des Enzyms aus Kren
Eine labortechnisch oft angewandte Methode, um Meerrettichperoxidase zu gewinnen ist
deren Extraktion aus Kren. Dabei müssen mehrere Wurzeln ca. 2 Tage lang durch ständiges
Berieseln mit Wasser gequollen werden. Danach wird die gequollene Wurzel gerieben und
über einige Stunden mit Wasser extrahiert.
Nach Sättigung mit Ammonsulfat wird nun das Rohextrakt zentrifugiert. Das so erhaltene
Produkt wird nun zweimal einer Dialyse unterworfen und danach abermals zentrifugiert.
Durch Kationentausch wird schließlich das isolierte Enzym erhalten.
Diese Prozedur wurde jedoch nicht praktisch durchgeführt, da die Vorrichtungen für das
Zentrifugieren und die Dialyse nicht vorhanden waren und das Verfahren auf Grund seines
großen Aufwandes den Rahmen einer Fachbereichsarbeit sprengen würde.
6.2.1.3
Lagerfähigkeit und Reinheitszahl
Meerrettichperoxidase ist gegenüber höheren Temperaturen und besonders hohen und
niedrigen pH-Werten sensibel. So verliert eine Enzymlösung bereits binnen weniger Tage
einen größeren Teil (bis zu 20 %) seiner Aktivität, wenn es bei einem zu hohen pH-Wert
gelagert wird. Erhitzt man es über einen kurzen Zeitraum auf höhere Temperatur, so verliert
es schon in wenigen Minuten einen Großteil seiner Aktivität, bei hohen Temperaturen
(zwischen 90°C und 100°C) ist das Enzym binnen kürzester Zeit vollkommen denaturiert.
Am stabilsten ist eine HRP-Lösung im pH-Bereich von 5 bis 9, wobei das pH-Optimum bei 6
bis 6,5 liegt.
Die Reinheitszahl gibt Auskunft über den Häm b – Gehalt der Peroxidase, jedoch nicht über
seine Aktivität. Die Reinheitszahl ist das Verhältnis der Absorption bei den Wellenlängen
275 nm und 403 nm. Dies rührt daher, dass Häme bei 403 nm und das Trägerprotein bei
275 nm absorbieren.
51
Albertus Magnus Gymnasium
6.2.2
6.2.2.1
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Eigene Versuche
Überprüfung der Reinheitszahl
Verwendete Chemikalien
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Verwendete Geräte
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
(siehe Abb. 52)
Notebook „HP EliteBook 8530w“
Abb. 52: Photometer „Thermo Genesys 10-S“
Um die Reinheitszahl des erworbenen Enzyms (siehe Abb. 53) zu überprüfen, wurde eine
photometrische Messung einer Lösung desselben (siehe Abb. 54) bei den Wellenlängen
275 nm und 403 nm durchgeführt. Dabei wurde ein Notebook an das Photometer
angeschlossen, über das dieses mittels der Software VISIONlite 2.1 bedient werden konnte.
Als Blindwert diente eine mit Deionat gefüllte Küvette. Laut Herstellerangabe sollte diese ca.
3 betragen, der Mittelwert mehrmaliger Messungen ergab eine Reinheitszahl von 3,048.
Nach einigen Wochen Lagerung der HRP-Lösung bei 4°C wurde abermals eine Messung der
Reinheitszahl durchgeführte, welche zu dem Wert 2,117 führte. Die Abnahme ist vermutlich
auf die lange Lagerungszeit zurückzuführen.
52
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 54: Meerrettichperoxidase in
Deionat gelöst
Abb. 53: Meerrettichperoxidase im ungelöstem Zustand
6.2.2.2
Aktivitätsbestimmung mit Guajakol als Elektronendonator
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Magnetrührer „IKA-WERKE RCTB“
Phosphat-Puffer, pH 7,0
pH-Meter „WTW pH 315i“
Guajakol
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
H2O2, 30%
Notebook „HP EliteBook 8530w“
Die Aktivität eines Enzyms ist ein beliebig definierter Wert U (unit). Ein U steht hierbei für
die Zunahme der Absorption um 0,01 pro Minute bei einer bestimmen Enzymkonzentration
und unter bestimmten Bedingungen. Häufig wird die Aktivität auch als U / ml Enzym
angegeben. Für die
Bestimmung derselben kommen oft Pyrogallol oder Guajakol als
Elektronendonatoren zum Einsatz.
53
Albertus Magnus Gymnasium
Zum Zwecke einer Aktivitätsbestimmung wurde eine
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Lösung von Guajakol mit einer
Konzentration von 20 mmol/L in einer Phosphatpufferlösung hergestellt. Die 30%ige
H2O2-Lösung wurde mit Deionat auf 12 mmol/L verdünnt. Um solch geringe Mengen
qualitativ überführen zu können, mussten Mikropipetten verwendet werden (siehe Abb. 55).
Abb. 55: Mikropipetten mit selbstkonstruierter Pipettierhilfe
Es wurden 3 Teile Puffer-Lösung mit je einem Teil Guajakol- und WasserstoffperoxidLösung gemischt und bei 470 nm der Blindwert mit dieser Lösung gemessen. Danach wurde
diese mit der HRP-Lösung versetzt und photometrisch über einen Zeitraum von 1 Minute die
Absorptionsänderung bestimmt. Guajakol färbt sich dabei von farblos zu rostbraun (siehe
Abb. 56). Mit dem resultierenden Wert, welcher 0,0057 dA/min betrug, ergab sich demnach
eine Aktivität von 0,57 U.
Abb. 56: Guajakol vor (links) und nach (rechts) der Umsetzung mit HRP
54
Albertus Magnus Gymnasium
6.2.2.3
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Überprüfung der Temperaturempfindlichkeit
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
Britton-Robinson-Puffer, 0,04 mol/L,
pH 7,0
Notebook „HP EliteBook 8530w“
ABTS
H2O2, 10 mmol/L
Um die Tempertaturempfindlichkeit der Peroxidase zeigen zu können, wurde ein Teil einer
Enzymlösung über einen Zeitraum von 15 min konstant auf 50°C gehalten. Mit einem
anderen Teil derselben Lösung wurde eine Aktivitätsbestimmung im Bezug auf ABTS
durchgeführt. Dabei wurden 27,4 mg ABTS (siehe Abb. 57) in 10 mL Britton-RobinsonPuffer gelöst, sodass sich eine Lösung mit der Konzentration 5 mmol/L ergab (siehe Abb. 58).
Abb. 57: ABTS, ungelöst
Abb. 58: ABTS, gelöst in Britton-Robinson-Puffer
2,9 mL von dieser wurden mit 50 μL HRP-Lösung, welche nicht hohen Temperaturen
ausgesetzt war, und 100 μL H2O2-Lösung versetzt und nach einiger Inkubationszeit ein
Spektrum im Bereich von 400 nm bis 800 nm aufgenommen (siehe Abb. 59), woraus sich ein
Absorptionsmaximum bei 420 nm ablesen ließ. Als Blindwert diente eine Küvette mit reinem
Britton-Robinson-Puffer.
55
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 59: Spektrum des ABTS
Weitere 2,9 mL wurden ebenfalls mit 50 μL HRP-Lösung versetzt. Von dieser wurde der
Blindwert gemessen. Danach wurden 100 μL H2O2-Lösung
zugesetzt und eine
photometrische Bestimmung bei 420 nm durchgeführt. Es ergab sich eine Aktivität von
11,91 U. Mit der den höheren Temperaturen ausgesetzten Lösung wurde ebenfalls eine
Bestimmung der Aktivität durchgeführt. Hier ergab sich eine Aktivität von 1,89 U. Damit
wurde ein Aktivitätsverlust von 84,13 % bestimmt.
Auch eine Erhitzung auf knapp 100°C wurde durchgeführt. Eine Messung ergab dabei einen
100 %igen Aktivitätsverlust.
Es wurde also nachgewiesen, dass Meerrettichperoxidase gegen hohe Tempertaturen sehr
empfindlich ist und bereits nach wenigen Minuten bei 50°C zum Großteil und bei 100°C
vollkommen denaturiert ist.
56
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
6.3 Messung der Michaelis-Menten-Kinetik
6.3.1
Messung mit ABTS als Elektronendonator
Verwendete Reagenzien:
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
Britton-Robinson-Puffer, 0,04 mol/L,
pH 7,0
Notebook „HP EliteBook 8530w“
ABTS
H2O2, 10 mmol/L
ABTS reagiert unter Einwirkung von HRP und H2O2 unter Abgabe eines Elektrons zu einem
grünen Farbstoff, wobei pro Mol H2O2 2 Mol ABTS umgesetzt werden. Es findet also
folgende Reaktion statt:
Abb. 60: Reaktion von ABTS mit HRP und H2O2
Die ABTS-Lösung wurde mit Britton-Robinson-Puffer hergestellt. Aus dieser Stammlösung
mit der Konzentration 10 mmol/Lwurden durch Verdünnung mit Britton-Robinson-Puffer
Lösungen verschieden hoher Konzentrationen (5 mmol/L, 1 mmol/L, 0,5 mmol/L,
0,1 mmol/L, 0,05 mmol/L) gewonnen (siehe Abb. 61).
Abb. 61: ABTS in verschieden hoher Konzentration. V.l.n.r.: 10 mmol/L, 5 mmol/L, 1 mmol/L, 0,5 mmol/L,
0,1 mmol/L, 0,05 mmol/L, reiner Britton-Robinson-Puffer.
57
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Danach wurden Stammlösungen und die verdünnten Lösungen mit 100 μL H2O2- und 50 μL
HRP-Lösung versetzt und die Absorption eine Minute lang jede Sekunde gemessen (siehe
Tab. 2). Dabei diente immer die mit HRP-Lösung versetzte Probe als Blindwert.
[ABTS] (mmol/L)
10
5
1
0,5
0,1
0,05
dA/min
0,6060
0,3485
0,0812
0,0415
0,0083
0,0042
Tab. 2: Messwerte der Umsetzung von ABTS
Daraus konnte mittels Lambert-Beer‟schem Gesetz dank bekanntem Extinktionskoeffizienten
(ε420 = 43,2∙103 [L mol-1 cm-1]) die Geschwindigkeit in d[ABTS]/min und das LineweaverBurk-Diagramm (siehe Abb. 62) errechnet und durch die doppeltreziproke Darstellung die
Michaelis-Menten-Konstante und die Maximalgeschwindigkeit berechnet werden. Für KM
ergab sich 24,47 mmol dm-3 und für vmax 0,0478 mmol dm-3 min-1.
12
10
1 / v (1 / mmol dm-3 min-1)
8
-1
6
ABTS
4
Regressionsgerade
2
0
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
2,5
-2
-4
1 / [ABTS]
(1 / mmol1 dm-3)
Abb. 62: Lineweaver-Burk-Diagramm der Umsetzung von ABTS
58
Albertus Magnus Gymnasium
6.3.2
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Bestimmung der Hemmung durch Cystin und Cadmium auf ABTS
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
Britton-Robinson-Puffer, 0,04 mol/L,
pH 7,0
Notebook „HP EliteBook 8530w“
ABTS
Cystin
Cd(NO3)2
H2O2, 10 mmol/L
Zur Bestimmung der Hemmung von HRP wurden zwei Lösungen der Inhibitoren Cystin und
Cadmium (Cd2+) hergestellt. Als Problem ergab sich dabei die schlechte Wasserlöslichkeit
des Cystins. Es wurde daher eine übersättigte Lösung hergestellt, von dieser ein
festkörperfreier Teil entnommen und mit den in 6.3.1 genannten Substratlösungen gemischt.
Nach der in 6.3.1 erwähnten Methode wurde die Reaktionsgeschwindigkeit mit dem Inhibitor
bestimmt. Die Prozedur wurde mit einer Cd2+-haltigen Lösung wiederholt. Es ergaben sich
dadurch verringerte Geschwindigkeiten (siehe Tab. 3).
ABTS ungehemmt
Hemmung durch Cadmium
Hemmung durch Cystin
[ABTS] (mmol/L)
dA/min
[ABTS] (mmol/L)
dA/min
[ABTS] (mmol/L)
dA/min
10
0,6060
10
0,1857
10
0,1801
5
0,3485
5
0,1153
5
0,1513
1
0,0812
1
0,0265
1
0,0619
0,5
0,0415
0,5
0,0134
0,5
0,0357
0,1
0,0083
0,1
0,0028
0,1
0,0081
0,05
0,0042
0,05
0,0014
0,05
0,0042
Tab. 3: Messwerte der Umsetzung von ABTS ohne und mit Inhibitoren
59
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Die Daten wurden umgerechnet und in ein Lineweaver-Burk-Diagramm übertragen, wodurch
festgestellt wurde, dass es sich bei der Hemmung der HRP bei Cystin um eine unkompetitive
und bei Cd2+ um eine nichtkompetitive Hemmung handelt (siehe Abb. 63).
35
30
1 / v (1 / mmol dm-3 min-1)
25
-1
y = 15,592x + 0,7018
ABTS
ungehemmt
20
15
Hemmung
durch
Cadmium
Hemmung
durch Cystin
y = 5,1134x + 1,8623
10
y = 5,1122x + 0,2089
5
Regressionsgerade
0
-0,5
-5
0
0,5
-10
1
1 / [ABTS]
1,5
2
2,5
(1 / mmol1 dm-3)
Abb. 63: Lineweaver-Burk-Diagramm der Umsetzung von ABTS, zur besseren Erkennbarkeit wurde der Bereich um
die Nullstelle vergrößert
Sowohl die Messung ohne Inhibitoren als auch die Messungen mit den beiden Inhibitoren
lieferten sehr eindeutige und gut verwertbare Ergebnisse. Bei beiden Inhibitoren ließ sich die
Art der Hemmung problemlos feststellen, wobei die sehr starke Aktivitätsverringerung durch
Cadmium auffällt. Es scheint einen Teil der Proteinstruktur zu zerstören. Dabei dürfte es mit
Seitenketten von Aminosäuren so interagieren, dass sich eine neue Faltung ergibt, wodurch
das Enzym einen Teil seiner Wirkung einbüßt. Cystin hingegen scheint nur in der Lage zu
sein, mit dem Enzym-Substrat-Komplex in Wechselwirkung zu treten, wobei nur ein geringer
Aktivitätsverlust festzustellen ist.
60
Albertus Magnus Gymnasium
6.3.3
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Messung mit p-Phenylendiamin als Elektronendonator
Verwendete Chemikalien
Verwendete Geräte
HRP-Lösung, 0,25 g/L
Photometer „Thermo Genesys 10-S“
p-Phenylendiamin, kristallin
Notebook „HP EliteBook 8530w“
H2O2, 10 mmol/L
p-Phenylendiamin, nach IUPAC 1,4-Diaminobenzen, ist ein farbloser, giftiger Festkörper. Es
ist an der Luft leicht oxidabel und nimmt dabei eine bräunliche Farbe an (siehe Abb 64).
Abb. 64: Oxidiertes, kristallines p-Phenylendiamin
Auch hier wurde nach dem gleichen Verfahren wie in 4.2.1 vorgegangen. Um die
Adsorptionsveränderung und somit die Geschwindigkeit besser messen zu können, mussten
die Substratkonzentrationen jedoch erhöht werden (Tab. 4).
[PPD] (mmol/L)
200
80
40
20
10
5
2
1
dA / min
0,0142
0,0110
0,0153
0,0549
0,0459
0,0365
0,0227
0,0137
Tab. 4: Messwerte der Umsetzung von p-Phenylendiamin
61
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Es wurde ein Lineweaver-Burk-Diagramm gezeichnet (siehe Abb. 65), wobei auffiel dass bei
zu hohen Konzentrationen eine Hemmung durch Substratüberschuss auftrat. Aus den
verwertbaren Ergebnissen, also die, bei denen die Substratkonzentration unter 20 mmol/L
betrug, wurde abermals ein Lineweaver-Burk-Diagramm
(Abb. 66) aufgestellt. Die
Michaelis-Menten-Konstante wurde mit 3,65 mmol dm-3 berechnet. Die errechnete
Maximalgeschwindigkeit beträgt 0,0636 dA min-1.
100
90
80
1 / v (1 / dA min-1)
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,02
0,04
0,06
0,08
1 / [PPD] (1 / mmol1 dm-3)
0,1
0,12
Abb. 65: Lineweaver-Burk-Diagramm der Umsetzung von p-Phenylendiamin, die Hemmung durch
Substratüberschuss ist gut erkennbar
80
70
60
1 / v (1 / dA min-1)
50
40
30
20
10
0
-0,6
-0,4
-0,2 -10 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
-20
1 / [PPD]
(1 / mmol1 dm-3)
Abb. 66: Lineweaver-Burk-Diagramm der Umsetzung von p-Phenylendiamin
62
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Die Messwerte waren trotz der sehr leichten Oxidierbarkeit von p-Phenylendiamin
überraschend genau und sehr zufriedenstellend. Es ist im Gegensatz zu ABTS kein
Extinktionskoeffizient bekannt gewesen, wodurch nur die Geschwindigkeit in Bezug auf die
Absorptionsänderung und nicht auf die Stoffmengenänderung gemessen und berechnet
werden konnte.
Ein Problem, das bei der Untersuchung mit p-Phenylendiamin als Elektronendonator jedoch
auftrat, war, dass keine Information aus der Literatur vorhanden und somit der Mechanismus
und die Stöchiometrie der Reaktion gänzlich unbekannt waren. Es konnte einzig auf eine
Arbeitsanleitung, welche das o-Isomere des Phenylendiamins verwendet. Im Falle von diesen
reagieren jedoch zwei Moleküle zu einem (siehe Abb. 67), was bei para-Stellung nicht
möglich ist, wodurch sich ein vollkommen anderer Reaktionsmechanismus ergibt.
Abb. 67: Reaktion des o-Phenylendiamins mit HRP und H2O2
Durch den Einsatz von Pb2+ als Inhibitor konnte ein Intermediat wahrscheinlich gemacht
werden und somit auf einen zweistufigen Reaktionsmechanismus geschlossen werden (siehe
Abb. 68).
Abb. 68: Reaktion von p-Phenylendiamin. Es ist eine grünliche Zwischenstufe zu erkennen, welche allmählich zum bräunlichen
Endprodukt übergeht (das Endprodukt ist dunkelbraun)
Daher gehe ich davon aus, dass im ersten Schritt dem Elektronenpaar eines Stickstoffatoms
ein Elektron entzogen wird und dieses eine H+-Ion abgibt. Dieses Radikal ist bedingt stabil
und reagiert sehr schnell weiter. Im zweiten Schritt wird das andere Stickstoffatom auf
63
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
gleiche Weise oxidiert und gibt ebenfalls ein H+-Ion ab. Durch die neue Elektronenverteilung
wird nun die Ausbildung des stabilen p-Chinondiimins ermöglicht (siehe Abb. 69).
Abb. 69: Vermutete Reaktion von p-Phenylendiamin mit HRP und H2O2
64
Albertus Magnus Gymnasium
7
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Zusammenfassung
In meiner Fachbereichsarbeit, in welcher die Kinetik enzymkatalysierter Reaktionen, deren
Messung und mathematische Auswertung im Mittelpunkt steht, beschäftigte ich mich zuerst
mit der Betrachtung der Aminosäuren aus dem Blickwinkel der organischen Chemie. Von den
Eigenschaften der Aminosäuren beginnend wurde ein roter Faden bis hin zu komplexen
Proteinen verfolgt. In den weiteren Kapiteln fand eine Auseinandersetzung mit den
mathematischen, physikalischen und schließlich den analytischen Grundlagen statt. Dies
beinhaltete die Herleitung der Michaelis-Menten-Kinetik und eine kurze Einführung in die
Photometrie. Nachdem die theoretischen Grundlagen gelegt worden waren, widmete sich das
abschließende Kapitel der praktischen Messung der Enzymkinetik und einer mathematischen
Auswertung der Messergebnisse. Dabei kam es zu sehr zufriedenstellenden Ergebnissen,
wobei die Messung mit ABTS als Elektronendonator den Hauptanteil ausmachte, jedoch auch
p-Phenylendiamin als Substrat im Mittelpunkt des Interesses stand. Ich entdeckte zufällig,
dass sich diese Substanz auch mit HRP umsetzen lässt, konnte mich jedoch nicht auf Fakten
aus der Literatur stützen. Daher musste ich den Reaktionsmechanismus und alle mit diesem
Substrat in Verbindung stehenden Ergebnisse mehr durch Spekulation als durch belegbare
Fakten erklären.
8
Summary
At the beginning of my “Fachbereichsarbeit” that centres on the kinetics of enzyme-catalyzed
reactions, their measurement and mathematical analysis are taking center stage, I dealt with
the examination of amino acids from the perspective of organic chemistry. Starting with the
properties of amino acids a route up to complex proteins has been followed.
In the following chapters there was a study of mathematical, physical and ultimately
analytical basic principles. This included the derivation of the Michaelis-Menten kinetics and
a brief introduction to photometry. Having laid the theoretical foundations I devoted the final
chapter to practical measurements of enzyme kinetics and its mathematical analysis. This led
to very satisfactory results, whereby measurement with ABTS as electron donor had the major
share. However, p-Phenylenediamine was also in the center of interest. Only by chance I
found out that this substance can react with HRP too, but I could not verify that in the
available literature. Therefore, I had to explain the reaction mechanism and all results related
to this substrate more on the basis of speculation than of verifiable facts.
65
Albertus Magnus Gymnasium
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Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Anhang
9.1 Verwendete Literatutr
Atkins, Peter W.; Paula, Julio de: Physikalische Chemie. Vierte, vollständig überarbeitete
Auflage. – Weinheim: WILEY-VCH, 2006.
Becker, Heinz G. O. et al.: Organikum. Organisch-chemisches Grundpraktikum. 22.,
vollständig überarbeitete und aktualisierte Auflage. – Weinheim: WILEY-VCH, 2005.
Berg, Jeremy M.; Tymoczko, John L.; Stryer, Lubert: Biochemie. 6. Auflage. – Heidelberg:
Spektrum Akademischer Verlag, 2007.
Beyer, Hans; Walter, Wolfgang; Francke, Wittko: Lehrbuch der Organischen Chemie. 24.
Auflage. – Stuttgart: S. Hirzel Verlag, 2004.
D‟Ans, Jean; Lax, Ellen: Taschenbuch für Chemiker und Physiker. 3. Auflage. Bd. 2.– Berlin,
Göttingen, Heidelberg: Springer – Verlag, 1964
Jeromin, Günter E.; Bertau, Martin: Bioorganikum. Praktikum der Bioanalyse. – Weinheim:
WILEY-VCH, 2005.
Otto, Mathias: Analytische Chemie. Dritte, vollständig überarbeitete und erweiterte Auflage.
– Weinheim: WILEY-VCH, 2006.
Vollhardt, K. Peter C.; Schore, Neil E.; Butenschön, Holger (Übersetzungs-Herausgeber):
Organische Chemie. Vierte Auflage. – Weinheim: WILEY-VCH, 2005.
Wollenberger, Ulla; Renneberg, Reinhard; Bier, Frank F.; Scheller, Frieder W.: Analytische
Biochemie. Eine praktische Einführung in das Messen mit Biomolekülen. – Weinheim:
WILEY-VCH, 2003.
66
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
9.2 Verwendete Zeitschriftenbeiträge
Hamilton, T. M.; Dobie-Galuska, A. A.; Wietstock, S. M.: The o-PhenylenediamineHorseradish Peroxidase System: Enzyme Kinetics in the General Chemistry Laboratory. In:
Journal of Chemical Education, Vol. 76, No. 5, 1999, S. 642 ff. - Bellmawr, NJ: Division of
Chemical Education of the American Chemical Society.
9.3 Verwendete Internetseiten
Enzyme Explorer: Peroxidase Enzymes. http://www.sigmaaldrich.com/lifescience/metabolomics/enzyme-explorer/analytical-enzymes/peroxidase-enzymes.html,
20. 11. 2008.
Giffhorn: Biologie Grundpraktikum für Bioinformatiker. http://www.unisaarland.de/fak8/heinzle/de/teaching/GrundPraktikum_Bioinf/V5_Giffhorn_Kinetik_2007.pdf,
16. 10. 2008.
Information on EC 1.11.1.7 – peroxidase: http://www.brendaenzymes.org/php/result_flat.php4?ecno=1.11.1.7, 20. 1. 2009.
Inherent properties, identifiers and references (für Guajakol):
http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.447.html, 1. 2. 2009.
Max Ferdinand Perutz: http://de.wikipedia.org/wiki/Max_Ferdinand_Perutz, 28. 11. 2008.
Meerrettichperoxidase: http://de.wikipedia.org/wiki/Meerrettichperoxidase, 10. 11. 2008.
Morawski, Birgit; Lin, Zahnglin; Cirino, Pat; Joo, Hyun; Bandara, Geethani; Arnold, Frances
H.: Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia
pastoris, http://peds.oxfordjournals.org/cgi/content/full/13/5/377, 1. 2. 2009-
Peroxidase Substrates. http://www.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemicalproducts.html?TablePage=15845077, 20. 11. 2008.
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Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
9.4 E-Mails
Kosma, Paul: Kren-Peroxidase. [email protected], 11. 12. 2008.
9.5 Abbildungsverzeichnis
Titelbild: Struktur der Meerrettichperoxidase, http://www.tifr.res.in/~shyamal/research.html;
Adsorptionsspektrum, Screenshot aus VISIONlite; Geschwindigkeitsmessung; Screenshot aus
VISIONlite; Lineweaver-Burk-Diagramm, erstellt mit Microsoft Excel 2007; MichaelisMenten-Gleichung
Abb. 1: http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/general_data/amino_acid_structures.asp
Abb. 2: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 29
Abb. 3: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S.29
Abb. 4: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S.30
Abb. 5: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 6: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 38
Abb. 7: Bernhard Seyer, Zeichnung nach 1TIT. ppd (http://www.rcsb.org), erstellt mit jmol, 2009
Abb. 8: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 38
Abb. 9: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 10: Stryer, Biochemie S. 41
Abb. 11: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1 und jmol, 2009
Abb. 12: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 43
Abb. 13: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 50
Abb. 14: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 45
Abb. 15: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 44
Abb. 16: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 45
Abb. 17: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S.47
Abb. 18: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 46
Abb. 19: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 46
Abb. 20: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 46
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Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 21: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 47
Abb. 22: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 47
Abb. 23: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 48
Abb. 24: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 51
Abb. 25: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 52
Abb. 26: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 61
Abb. 27: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 53
Abb. 28: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 53
Abb. 29: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 236
Abb. 30: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 237
Abb. 31: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 237
Abb. 32: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 239
Abb. 33: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 240
Abb. 34: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 245
Abb. 35: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 251
Abb. 36: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 253
Abb. 37: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 254
Abb. 38: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 254
Abb. 39: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 255
Abb. 40: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 253
Abb. 41: Berg; Tymoczko; Stryer, 2007, S. 255
Abb. 42: http://de.wikipedia.org/wiki/Fotometrie
Abb. 43: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 44: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 45: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 46: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 47: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 48: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 49: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
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Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
Abb. 50: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 51: Bernhard Seyer, Zeichnung nach 6ATJ. ppd (http://www.rcsb.org), erstellt mit jmol, 2009
Abb. 52: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 53: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 54: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 55: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 56: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 57: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 58: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 59: Screenshot aus VISIONlite, 2008
Abb. 60: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 61: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 62: Bernhard Seyer, erstellt mit Microsoft Excel 2007, 2008
Abb. 64: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 65: Bernhard Seyer, erstellt mit Microsoft Excel 2007, 2008
Abb. 66: Bernhard Seyer, erstellt mit Microsoft Excel 2007, 2008
Abb. 67: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
Abb. 68: Bernhard Seyer, Wien, Jänner 2008
Abb. 69: Bernhard Seyer, erstellt mit Symyx Draw 3.1, 2008
9.6 Protokoll
3. Juli 2008
1. Besprechung: Möglichkeiten für Themen, Einigung auf
Enzymkinetik
10. Juli 2008
2. Besprechung: Literaturinformationen
12. Juli 2008
Besorgung von fehlender Literatur
26. August 2008
3. Besprechung: Grobdisposition der Arbeit (Titel, Enzyme als Stoffe,
Enzyme als Katalysatoren, physikalische Chemie)
70
Albertus Magnus Gymnasium
29. August 2008
11. September 2008
12. September 2008
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
4. Besprechung: Arbeit und Überlegungen in Richtung Enzymkinetik
und Photometrie
5. Besprechung: Festlegung und Einreichung des Titels und der
Grobdisposition
Erstellung eines Inhaltsverzeichnisses
6. Besprechung: Konkrete Besprechung des Katalyse-Experimentes,
25. September 2008
Rechercheauftrag für eine Arbeitsvorschrift für die Extraktion von
Peroxidase aus Kren, Rohfassung für das 1. Kapitel (Aminosäuren,
Proteine), Vorlage des Inhaltsverzeichnisses
6. Oktober 2008
18. Oktober 2008
23. Oktober 2008
6. November 2008
Kontaktaufnahme zu Universität Wien und Universität für Bodenkultur
bezüglich oben genannter Arbeitsvorschrift
7. Besprechung: Besprechung des 1. schriftlichen Teils, Hinweis auf
Copyright-Problematik, Weiterarbeit in Richtung Proteinstruktur
8. Besprechung: Erste Versuche mit Photometer, Kombination
Photometer-Laptop
9. Besprechung: Installation der Software für Photometer, Aufnahme
der Spektren von Farbstoffen
8. November 2008
10. Besprechung: Herstellung von Lösungen
17. November 2008
11. Besprechung: Erste Versuche zur Michaelis-Menten Kinetik
12. Besprechung: Messung der Kinetik von HRP mit ABTS als
20. November 2008
Elektronendonor, Besprechung der Arbeitsanleitung von
o-Phenylendiamin, Auftrag zur Recherche von Reaktion mit
p-Phenylendiamin
20. - 25. November
2008
27. November 2008
29. November 2008
30. November 2008
4. Dezember 2008
Eingehende Recherchen zu PPD, keine Literatur bezüglich Reaktion
mit HRP gefunden
13. Besprechung: Weitere Messungen, Mitteilung über
Recherchenergebnisse, Recherche bezüglich Inhibitoren
14. Besprechung: Abschluss der Messungen mit ABTS als
Elektronendonor ohne Inhibitoren
Herstellung von Cystin aus Cystein
15. Bersprechung: Erste Versuche mit PPD, Hinweis auf zweistufigen
Prozess
71
Albertus Magnus Gymnasium
6. Dezember 2008
11. Dezember 2008
12. Dezember 2008
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
16. Besprechung: Messungen der Michaelis-Menten Kinetik mit PPD,
Vorlage weiterer Teile der theoretischen Kapitel
Erhalt der Arbeitsvorschrift zu Extraktion von Peroxidase
17. Besprechung: Besprechung der Arbeitsvorschrift, Feststellung der
Undurchführbarkeit, theoretische Behandlung
16. Dezember 2008
Kontaktaufnahme mit Spektrum-Verlag bezüglich Copyright
30. Dezember 2008
Messungen mit PPD und ABTs (Hemmung durch Cystin)
10. Jänner 2009
14. + 15. Jänner 2009
Charakterisierung des Enzyms, Vorlage des physikalisch-chemischen
und analytisch-chemischen Kapitels
Vakuumdestillation von Guajakol
Erneute Kontaktaufnahme mit Springer-Verlag bezüglich Rechte,
15. Jänner 2009
Weiterleitung zu W.H. Freeman & Co. Verlag, Kontaktaufnahme mit
W.H. Freeman & Co, Erlaubnis zur Verwendung
17. Jänner 2009
23. Jänner 2009
29. Jänner 2009
Messung der Aktivität von HRP mit Guajakol, vorlage des praktischen
Teils
Messungen mit ABTS und Cadmium als Inhibitor
18. Besprechung: Besprechung des theoretischen und des praktischen
Teils
9. Februar 2009
19. Besprechung: Besprechung letzter organisatorischer Punkte
13. Februar 2009
Abgabe der Fachbereichsarbeit
72
Albertus Magnus Gymnasium
Bernhard Seyer / Enzymkinetik
9.7 Erklärung
Ich erkläre, dass ich diese Fachbereichsarbeit
selbst verfasst und ausschließlich die angegebene
Literatur verwendet habe
Ort und Datum
Unterschrift des Schülers
73