Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung Acidovorax

Aus dem Institut für Phytomedizin
Universität Hohenheim
Fachgebiet Phytomedizin
Privatdozent Dr. Jan Hinrichs-Berger
In Zusammenarbeit mit dem
Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum – Rheinpfalz
Abteilung Gartenbau
Neustadt an der Weinstraße
Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung
Acidovorax valerianellae an Feldsalat
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors
„Doktor der Agrarwissenschaften“
(Dr.sc.agr./ Ph.D. in Agricultural Sciences)
vorgelegt
der Fakultät Agrarwissenschaften
von
Inga Braje
aus Wilhelmshaven
2012
2
Die vorliegende Arbeit wurde am 16.03.2012 von der Fakultät Agrarwissenschaften
der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors
der Agrarwissenschaften“ angenommen.
Tag der mündlichen Prüfung:
16.04.2012
1. Prodekan:
Prof. Dr. A. Fangmeier
1. Prüfer:
Dr. J. Hinrichs-Berger
2. Prüfer:
Prof. Dr. W. Claupein
Prüfer:
Prof. Dr. M. Kruse
3
Die Arbeit wurde unter dem Titel „Untersuchungen zur Biologie und Entwicklung
praxis-relevanter Nachweismethoden für bakterielle Erkrankungen an Feldsalat
[Valerianella locusta (L.)] als Grundlage für die Selektion von Resistenzquellen
gegen den Erreger von Blattflecken (Acidovorax valerianellae sp. nov.)“ vom
Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie über die AiF als
Forschungsvorhaben AiF-Nr. 15235 BG/2 der Forschungsvereinigung Gemeinschaft
zur Förderung der privaten deutschen Pflanzenzüchtung e.V. (GFP) im Programm
zur Förderung der „Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF)“ finanziell
gefördert.
DANKSAGUNG
4
DANKSAGUNG
Herrn Prof. Dr. H. Buchenauer, Herrn Prof. Dr. R. Blaich und Herrn Dr. J. HinrichsBerger möchte ich an dieser Stelle für die Überlassung des Themas, für die
zahlreichen Diskussionen und die hilfreiche Kritik bei der Abfassung der Arbeit
sowie für die Unterstützung als Betreuungsteam im Promotionsstudiengang
Agrarwissenschaften herzlich danken.
Herrn Dr. J. Hinrichs-Berger, Herrn Prof. Dr. W. Claupein und Herrn Prof. Dr.
M. Kruse danke ich neben Herrn Prof. Dr. A. Fangmeier für die Übernahme der
Gutachten dieser Dissertation und die Begleitung im Promotionsverfahren.
Ganz besonders möchte ich mich beim Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum –
Rheinpfalz für die Bereitstellung der Arbeitsplätze, die Hilfsbereitschaft bei der
Versuchsgestaltung, -durchführung und -auswertung und für das stets freundliche
Arbeitsklima bedanken. Insbesondere gilt mein Dank Herrn Dr. N. Laun und allen
„Queckis“ des Lehr- und Versuchsbetriebes Gemüsebau Queckbrunnerhof und Herrn
Dr. H.-J. Krauthausen und den „Phytos“ der Abteilung Phytomedizin sowie Herrn
M. Jutzi.
Ein bedeutender Teil der Arbeiten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Julius KühnInstitut in Quedlinburg. Herrn Dr. F. Rabenstein und Frau K. Thiele danke ich für die
stete Bereitschaft zur kollegialen und fairen Zusammenarbeit sowie für ein stets
offenes Ohr für meine Fragen und die Unterstützung beim Erlernen der TAS-ELISAgestützten Untersuchungsmethode.
Danken möchte ich auch Frau A. Schieder, Frau U. Miersch, Frau J. Oosterhof,
Herrn G. Hiddink stellvertretend für die Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan für die
Bereitstellung von Saatgut und für die vielfältige Unterstützung der Arbeit. Ebenso
gilt den Firmen Clause Tézier und Nunhems/Hild mein aufrichtiger Dank.
DANKSAGUNG
5
Ein Dankeschön gehört auch Frau Dr. E. Moltmann, Landwirtschaftliches
Technologiezentrum Augustenberg, sowie der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig für die freundliche Überlassung
von A. valerianellae-Isolaten.
Schließlich möchte ich mich bei Herrn P. Krämer für die aktive Mitarbeit bedanken,
die er im Rahmen seines Berufpraktischen Projektes geleistet hat.
Ein herzliches Dankeschön für die Korrekturarbeiten und die vielfach fachliche,
moralische und private Unterstützung an Jan, Dr. Crus, Dr. Arnold, Dr. Örschel,
Dr. Börger und Dr. E sowie an Gabi, Usanne, Elke, Ewald, Pit, Stephan, inKa,
Adelinde, Christof, Lothar, Angela, Tino, Isabelle, Janine, Matthias, Jörg, Suse, NO,
Frank, Sabine, Saschi-Spatz, Marco, Patte, Basti und Mama Ki. - Ihr seid die Besten.
Die Anfertigung der vorliegenden Arbeit wäre nicht ohne finanzielle Unterstützung
der Universität Hohenheim, der Gemeinschaft zur Förderung der privaten deutschen
Pflanzenzüchtung e.V. (GFP), der Arbeitsgemeinschaft industrieller
Forschungsvereinigungen e.V. (AiF) und den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan
möglich gewesen. Ihnen gilt deshalb mein besonderer Dank!
Nicht zuletzt möchte ich mich an dieser Stelle bei meinen Eltern bedanken, die mir
die gewünschte Ausbildung ermöglichten und mich während meiner Zeit als
Doktorandin unterstützten.
INHALTSVERZEICHNIS
6
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .......................................................... I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..........................................................IV
TABELLENVERZEICHNIS...............................................................IX
1
Einleitung..................................................................................................... 1
2
Material und Methoden.............................................................................. 7
2.1
Chemikalien ............................................................................................ 7
2.1.1
Nährmedien ..................................................................................... 7
2.1.1.1
Kings medium B (King-Agar B)................................................. 7
2.1.1.2
Tryptic Soy Agar (TSA-Agar) .................................................... 7
2.1.2
Natriumchlorid-Lösung................................................................... 8
2.1.3
Pflanzenschutzmittel ....................................................................... 8
2.2
Versuchssteuerung .................................................................................. 8
2.2.1
Gewächshaus................................................................................... 8
2.2.2
Klimaschränke und Klimakammern ............................................... 9
2.3
Isolierung und Charakterisierung von Acidovorax valerianellaeBakterien .................................................................................................. 9
2.3.1
Fluoreszenz ................................................................................... 10
2.3.2
Gramreaktions-Test (nach SUSLOW et al., 1982) ......................... 10
2.3.3
Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test (nach KOVACS, 1956).. 10
2.3.4
Hypersensitivitätsreaktion (nach GARDAN et al., 2003)............... 11
2.3.5
Indirekter ELISA (TAS Triple antibody sandwich)...................... 12
2.4
Verwendete Acidovorax valerianellae-Stämme ................................... 15
2.5
Verwendetes Valerianella locusta (L.) – Saatgut ................................. 16
2.6
Keimfähigkeit........................................................................................ 19
2.7
Aussaat von Feldsalatpflanzen.............................................................. 19
2.8
Herstellung von A. valerianellae - Inokulum........................................ 20
2.9
Inokulation der Feldsalatpflanzen ......................................................... 21
2.10
Bonitur von Feldsalatpflanzen .......................................................... 23
2.11
Statistische Auswertung der Daten ................................................... 23
2.12
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen von Acidovorax
valerianellae....................................................................................... 24
2.12.1
Einfluss der Temperatur auf die Infektion in vivo .................... 24
2.12.2
Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die
Infektion………………………………… …………………….24
2.12.3
Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion
beziehungsweise die Symptomentwicklung .............................. 25
2.12.3.1 Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung..... 25
2.12.3.2 Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation 27
2.12.4
Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion.......................... 28
2.13
Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit............................................. 29
2.13.1
Einfluss der Sorte auf die Infektion .......................................... 29
2.13.2
Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion................ 29
INHALTSVERZEICHNIS
7
2.13.3
Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion ... 30
2.14
Versuche zum Übertragungsweg von Acidovorax valerianellae...... 31
2.14.1
Boden ........................................................................................ 31
2.14.2
Alternative Wirtspflanzen ......................................................... 33
2.14.2.1 Alternative Wirtspflanzen I....................................................... 34
2.14.2.2 Alternative Wirtspflanzen II ..................................................... 37
2.14.2.3 Alternative Wirtspflanzen III .................................................... 39
2.14.3
Saatgut....................................................................................... 40
2.15
Saatgutuntersuchungen ..................................................................... 47
2.15.1
Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut 47
2.15.1.1 Sweatbox-Test in der Klimakammer ........................................ 47
2.15.1.2 Aufwuchstest im Gewächshaus................................................ 48
2.15.1.3 Ankeimmethode auf Papier...................................................... 49
2.15.1.4 Bestimmungen durch Fremdfirmen ......................................... 49
2.15.2
Dekontaminationsmaßnahmen (Warmwasserbehandlung und
Dampfdesinfektion).................................................................... 50
3
Ergebnisse.................................................................................................. 52
3.1
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen.......................................... 52
3.1.1
Einfluss der Temperatur auf die Infektion (in vivo) ..................... 52
3.1.2
Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die Infektion59
3.1.3
Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion beziehungsweise
die Symptomausprägung.............................................................. 63
3.1.3.1
Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung..... 63
3.1.3.2
Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation 67
3.1.4
Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion.............................. 72
3.2
Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit................................................. 75
3.2.1
Einfluss der Sorte auf die Infektion .............................................. 75
3.2.2
Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion.................... 77
3.2.3
Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion ....... 84
3.3
Infektionsversuche von Acidovorax valerianellae zu
Übertragungswegen................................................................................ 87
3.3.1
Boden ............................................................................................ 87
3.3.2
Alternative Wirtspflanzen ............................................................. 92
3.3.2.1
Alternative Wirtspflanzen I....................................................... 92
3.3.2.2
Alternative Wirtspflanzen II ..................................................... 95
3.3.2.3
Alternative Wirtspflanzen III .................................................... 97
3.3.3
Saatgut......................................................................................... 102
3.4
Saatgutuntersuchungen ....................................................................... 105
3.4.1
Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut.. 105
3.4.1.1
Sweatbox-Test in der Klimakammer und Aufwuchstest im
Gewächshaus............................................................................ 105
3.4.1.2
Ankeimmethode auf Papier..................................................... 109
3.4.1.3
Bestimmungen durch Fremdfirmen ........................................ 112
3.4.2
Dekontaminationsmaßnahmen.................................................... 115
3.4.2.1
Überprüfungen einer Warmwasserbehandlung....................... 115
3.4.2.2
Überprüfungen einer Dampfdesinfektion ............................... 122
3.4.2.3
Überprüfungen einer weiteren Dekontaminationsmaßnahme. 128
INHALTSVERZEICHNIS
8
4
Diskussion ................................................................................................ 131
4.1
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen........................................ 131
4.2
Sortenanfälligkeit ................................................................................ 139
4.3
Übertragungswege............................................................................... 140
4.3.1
Boden .......................................................................................... 140
4.3.2
Alternative Wirtspflanzen ........................................................... 142
4.3.3
Saatgut......................................................................................... 145
4.4
Dekontamination von Saatgut ............................................................. 152
5
Zusammenfassung................................................................................... 158
6
Summary.................................................................................................. 160
7
Literaturverzeichnis ............................................................................... 162
8
Anhang ..................................................................................................... 167
8.1
Publikationen ...................................................................................... 167
8.2
Lebenslauf ........................................................................................... 168
8.3
Versicherung ....................................................................................... 169
8.4
Erklärung............................................................................................. 169
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
%
Prozent
®
registered trademark (gesetzlich geschützte Marke)
°C
Grad Celsius
µl
Mikroliter
Abb.
Abbildung
ad.
auffüllen auf
Aqua dest. / dest.
aqua destillata (lateinisch), Destilliertes Wasser
ca.
circa (lateinisch), in etwa
cfu
colony forming unit (Koloniebildende Einheit)
dpi
days past inoculation (Tage nach Inokulation)
ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al.
et alia (lateinisch), und andere
g
Gramm
GmbH
Gesellschaft mit beschränkter Haftung
GmbH & Co. KG
Gesellschaft mit beschränkter Haftung & Compagnie
Kommanditgesellschaft
H2O
Chemische Summenformel für Wasser
ha
Hektar
HCl
Chemische Summenformel für Salzsäure
IgG
Immunglobulin G
k.A.
keine Angabe
KB
King-Agar B (Kings medium B)
I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
KCl
Kaliumchlorid
KH2HPO4 * 2 H2O
Chemische Summenformel für Kaliumdihydrogenphosphat
Dihydrat
KOH
Chemische Summenformel für Kaliumhydroxid
mAK
Monoklonaler Antikörper
mg
Milligramm
min.
Minute
ml
Milliliter
mm
Millimeter
n
Pflanzenanzahl
Na2CO3
Chemische Summenformel für Dinatriumcarbonat
NaCl
Chemische Summenformel für Natriumchlorid
NaHCO3
Chemische Summenformel für Natriumhydrogencarbonat
NaOH
Chemische Summenformel für Natronlauge
nm
Nanometer
OD-Wert
Wert der optischen Dichte am ELISA-Meßgerät
PCR
Polymerase Chain-Reaction (Polymerase Kettenreaktion)
pH-Wert
pondus Hydrogenii (lateinisch), Maß für eine saure oder
alkalische Reaktion einer wässrigen Lösung
pv.
Pathovar von patho (griechisch) und varia (griechisch),
Krankheitserreger
RLF (rel. Luftf.)
Relative Luftfeuchte
rpm
rounds per minute (Umdrehung pro Minute)
sp. nov.
species nova (latein), neue Art
subsp.
subspecies (latein), Unterart
ssp.
weitere Bezeichnung für die Abkürzung subsp.
II
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
Tab.
Tabelle
TAS-ELISA
triple antibody sandwich ELISA
var.
varia (latein), Variation
well
Vertiefung auf der ELISA-Mikrotiter-Platte
III
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abbildung 1.1: Bildung schwarzer Blattflecken nach Inokulation von Feldsalat mit
A. valerianellae. ........................................................................................................... 4
Abbildung 1.2: A. valerianellae-Symptome in einem Feldsalatbestand .................... 4
Abbildung 2.1: Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test zum Nachweis Oxidasepositiver A. valerianellae-Bakterien anhand eines Farbumschlages auf dem
Teststäbchen............................................................................................................... 11
Abbildung 2.2: Schwache Hypersensitivitätsreaktion an Tabak im Bereich der
Infiltrationsstellen (innerhalb der Kreise) am Beispiel des A. valerianellae-Isolates
6.1.a (Infiltration mit einer Konzentration von 108 cfu/ml). ...................................... 12
Abbildung 2.3: Gekeimte und nicht gekeimte Feldsalatsamen auf angefeuchtetem
Filterpapier zur Überprüfung der Keimfähigkeit. ...................................................... 19
Abbildung 2.4: Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae. (A):
Verwendung eines Feinzerstäubers. (B): Sprühfilm zerstäubter A. valerianellaeSuspension auf der Oberseite von Feldsalatblättern. ................................................. 22
Abbildung 2.5: Container mit kontaminiertem und nicht kontaminiertem Boden
(durch Einarbeitung von nicht-infiziertem und infiziertem Blattmaterial) für
sukzessive Probenentnahme (einmal pro Monat) über einen Zeitraum von bis zu
einem Jahr (Standort Schifferstadt, Deutschland)...................................................... 32
Abbildung 2.6: Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte Favor) in mit A. valerianellae
kontaminierten und nicht-kontaminierten Boden (durch Einarbeitung von nichtinfiziertem und infiziertem Blattmaterial) zur Überprüfung der Überdauerung von
A. valerianellae-Bakterien im Boden. Die Abdeckung der Samen erfolgte mit
Perlitte. ....................................................................................................................... 33
Abbildung 2.7: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (rechts)
und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (links) mit Aussaat im Jahr 2007 im
Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über
Kopf. .......................................................................................................................... 43
Abbildung 2.8: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (links)
und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr 2007 im
Freiland in Frankreich. ............................................................................................... 44
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
V
Abbildung 2.9: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (links)
und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr 2008 im
Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über
Kopf. .......................................................................................................................... 44
Abbildung 2.10: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem und mit
A. valerianellae-infiziertem Saatgut mit Aussaat im Jahr 2009 im gleichen Schiff
eines Gewächshauses, Abgrenzung durch Folienzäune. (A): Wasserversorgung
mittels Kreisregner, gesundes Saatgut rechts, kontaminiertes Saatgut links. (B):
Wasserversorgung mittels Tropfbewässerung, gesundes Saatgut links, kontaminiertes
Saatgut rechts. ............................................................................................................ 45
Abbildung 2.11: Benennung der gewonnenen Saatgutpartien aus der gesunden
Feldsalat-Saatgutpartie (AV-60, Ausgangssaatgut) und einer kontaminierten
Feldsalat-Saatgutpartie (AV-75, Ausgangssaatgut) mit Aussaaten in verschiedenen
Jahren (2007 bis 2009). Die Vermehrung des Ausgangssaatguts fand mit Aussaat im
Jahr 2007 in Deutschland und Frankreich statt, mit Aussaat im Jahr 2008 in
Deutschland. Mit der Aussaat im Jahr 2009 wurde das Ausgangssaatgut gebeizt
verwendet, die Bewässerung erfolgte über das Tröpfchenverfahren und über Kopf
mit Kreisregnern......................................................................................................... 46
Abbildung 2.12: Sweatbox zum Nachweismethode von A. valerianellae am
Saatgut........................................................................................................................ 48
Abbildung 2.13: Aufwuchstest im Gewächshaus zum Nachweis von
A. valerianellae am Saatgut. ...................................................................................... 49
Abbildung 3.1: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an
Feldsalatpflanzen 4, 6, 10 und 12 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae
(Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 55
Abbildung 3.2: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an
Feldsalatpflanzen nach 10, 14, 19 und 25 Tage Inokulation (dpi) mit A. valerianellae
(Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 56
Abbildung 3.3: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an
Feldsalatpflanzen 4, 8, 10 und 14 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae
(Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 57
Abbildung 3.4: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an
Feldsalatpflanzen 4, 6, 10, 12 und 17 Tage nach Inokulation (dpi) mit
A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .......................................... 58
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VI
Abbildung 3.5: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen
5 und 35 dpi (A) beziehungsweise zwischen 4 und 32 dpi (B) mit A. valerianellae
(Isolat 709/2, 106 cfu/ml) im Keimblattstadium (A) beziehungsweise
Laubblattstadium (B) in Abhängigkeit der Blattnässedauer (einmalig, wöchentlich,
dauerhaft). .................................................................................................................. 60
Abbildung 3.6: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) sowie
der Anteil befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) zwischen 7 und
34 dpi mit einem A. valerianellae-Gemisch (105 cfu/ml) von Pflanzen im
Laubblattstadium bei dauerhafter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte........... 62
Abbildung 3.7: Auswirkungen auf die Befallsstärke (in %) unterschiedlicher
Kultivierungsphasen unter trockenen und feuchten Bedingungen nach Inokulation
mit A. valerianellae.................................................................................................... 64
Abbildung 3.8: Befallsstärke (%) zwischen Tag 9 und Tag 27 nach der Inokulation
(dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml) unter
dauerhafter Kultivierung bei gesättigten Luftfeuchten. Die Pflanzen wurden entweder
sofort Wechseltemperaturen (15 °C Nacht, 20 °C Tag) ausgesetzt beziehungsweise
für die ersten 96 Stunden nach der Inokulation bei konstant 20 °C kultiviert. .......... 69
Abbildung 3.9: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei
gesättigter Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null
und 72 Stunden plus 5 Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei
Feldsalat. Versuch A. ................................................................................................. 70
Abbildung 3.10: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei
gesättigter Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null
und 72 Stunden plus 5 Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei
Feldsalat. Versuch B. ................................................................................................. 71
Abbildung 3.11: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %)
zwischen Tag fünf und Tag 19 nach der Inokulation (dpi) mit sechs verschiedenen
Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml des A. valerianellae-Isolates
6.1.a (A), 16619 (B), 552 (C)..................................................................................... 74
Abbildung 3.12: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche je Pflanze) von
unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellaeGemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C
(1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt................................. 76
Abbildung 3.13: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) bei
unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellaeGemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C
(1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt................................. 77
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VII
Abbildung 3.14: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten (AV-1, AV-5, AV-3) und der Wildart AV-13 16 Tage nach
Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von
104 cfu/ml bei Kultur unter gesättigter Luftfeuchte. .................................................. 80
Abbildung 3.15: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier
A. valerianellae-Isolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und
Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte................................................................. 82
Abbildung 3.16: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von
drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier
A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von
105 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte. ....................................... 83
Abbildung 3.17: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier
A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von
105 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte. ....................................... 84
Abbildung 3.18: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von
zwei verschiedenen Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 neun Tage nach
Inokulation eines A. valerianellae-Isolategemisches mit fünf verschiedenen
Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 106 cfu/ml............................................... 85
Abbildung 3.19: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von
zwei verschiedenen Feldsalatsorten (AV-1 und AV-5) und der Wildart AV-13
zwischen Tag sieben und Tag 20 nach Inokulation (dpi) eines A. valerianellaeIsolategemisches mit einer Konzentrationen von 106 cfu/ml..................................... 86
Abbildung 3.20: Verteilung von A. valerianellae-Symptome tragende Pflanzen (mit
x gekennzeichnet) aus A. valerianellae-infiziertem Saatgut, 40 Tage nach der
Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland, in drei jeweils 1 m² großen abgesteckten
Parzellen, die aus je neun Aussaatreihen bestanden, in denen zwischen 18 und 26
Pflanzen wuchsen (grau hinterlegte Fläche). ......................................................... 1170
103
Abbildung 3.21: Feldsalatpflanzen aus infiziertem Saatgut 69 Tage (A) und
135 Tage (B) nach der Aussaat im Jahr 2008 in einem Folienhaus......................... 104
Abbildung 3.22: Sichtbare typische A. valerianellae-Symptome 25 Tage nach der
Aussaat in Vermiculit (Sweatbox-Test) bei Kultivierung unter gesättigter
Luftfeuchte .............................................................................................................. 106
Abbildung 3.23: Keimfähigkeit von warmwasserbehandelten Samen aus dem
119
Jahr 2009. . ............................................................................................................... 120
Abbildung 3.24: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach 0, 4, 9 und
14 Tagen Inkubation in der Ankeimmethode auf Papier von warmwasserbehandelten
Samen der A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B). .. 121
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VIII
Abbildung 3.25: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei
verschiedener Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei (A) 66 °C für 90
beziehungsweise 105 Sekunden und bei (B) 64 °C für 120 beziehungsweise 150
Sekunden im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. ............................................ 126
Abbildung 3.26: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach
Homogenisierung von dampfbehandelten Samen der A. valerianellae-kontaminierten
Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) (Ankeimmethode auf Papier).......................... 127
Abbildung 3.27: Keimfähigkeit (in % 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener
Feldsalatsorten nach Behandlung durch einen Dienstleister im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle. ......................................................................................... 129
Abbildung 3.28: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) der mit
A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) zwischen Tag
null und Tag 14 nach Aussaat auf angefeuchtetem Filterpapier und Inkubation bei
Raumtemperatur (Ankeimmethode auf Papier). Die Samen waren unbehandelt
beziehungsweise durch einen Dienstleister behandelt worden. ............................... 130
TABELLENVERZEICHNIS
IX
TABELLENVERZEICHNIS
Tabelle 2.1: Verwendetes Saatgut für die Versuche zur Sortenanfälligkeit. ............ 18
Tabelle 2.2: Verwendete Pflanzen aus elf Familien zur Überprüfung ihrer Eignung
als alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Infiltration und
Sprühinokulation. ....................................................................................................... 35
Tabelle 2.3: Verwendete Pflanzen aus sieben Familien zur Überprüfung der
Eignung als Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Sprühinokulation. ................. 38
Tabelle 2.4: Verwendete Pflanzen aus sechs Familien zur Überprüfung ihrer
Eignung als alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Stichinokulation.. 40
Tabelle 2.5: Verwendete Temperaturen (°C) und Inkubationszeiten (Minuten) bei
einer Warmwasserbehandlung von Feldsalatsaatgut. ................................................ 51
Tabelle 3.1: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 9, 16, 23, 30 und 37 Tage
nach Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration
108 cfu/ml). Bis 9 dpi erfolgte die Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, anschließend
ohne erhöhte Luftfeuchtigkeit.. .................................................................................. 66
Tabelle 3.2: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 38, 43 und 51 Tage nach
Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml).
Einer zu Beginn neuntägigen Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte folgten
Phasen unterschiedlicher Dauer unter normal vorherrschenden Luftfeuchten
(zwischen 7 und 28 Tagen), bevor sich eine erneute Kultur unter gesättigter
Luftfeuchte anschloss................................................................................................. 67
Tabelle 3.3: Auftreten erster Symptome (in Tagen) nach Inokulation einzelner
A. valerianellae-Isolate in Abhängigkeit von der Konzentration. ............................. 73
Tabelle 3.4: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier
A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei
Kultur unter gesättigter Luftfeuchte........................................................................... 79
Tabelle 3.5: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke (BS) in %) von
drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier
A. valerianellae-Isolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und
Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte................................................................. 81
Tabelle 3.6: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von
A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu
verschiedenen Zeiten (über ein Jahr) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem
A. valerianellae-Pflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort
Schifferstadt). ............................................................................................................. 89
TABELLENVERZEICHNIS
X
Tabelle 3.7: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von
A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu
verschiedenen Zeiten (über acht Monate) in zuvor durch Einarbeitung von
befallenem A. valerianellae-Pflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort
Quedlinburg). ............................................................................................................. 90
Tabelle 3.8: Temperaturwerte (in 2 Meter Höhe) und Niederschlagswerte im
Monatsmittel im Zeitraum von September 2009 bis September 2010 in Schifferstadt
und von März 2010 bis November 2010 in Quedlinburg. ......................................... 91
Tabelle 3.9: Krankheitssymptome nach Infiltration und Sprühinokulation mit
A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) 7, 13 und 20 dpi bei verschiedenen
Pflanzenarten.............................................................................................................. 93
Tabelle 3.10: Krankheitssymptome nach Sprühinokulation mit A. valerianellae
(Konzentration 108 cfu/ml) 10, 25 und 30 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten....... 96
Tabelle 3.11: Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle bei
verschiedenen Pflanzenarten nach Stichinokulation mit A. valerianellae
(Konzentration 108 cfu/ml) an unterschiedlichen Tagen nach der Inokulation (dpi).
.................................................................................................................................. 100
Tabelle 3.12: Nachweis von lebensfähigen A. valerianellae-Bakterien in injizierten
und nicht-injizierten Blatthälften verschiedener Pflanzenarten 12, 19, 26 und 33 dpi.
.................................................................................................................................. 101
Tabelle 3.13: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im SweatboxTest und im Aufwuchstest. Der Nachweis erfolgte durch klassisches Isolieren und
mittels TAS-ELISA in Pflanzen mit verdächtigen A. valerianellae-Symptomen.. . 107
Tabelle 3.14: OD-Wert von Proben verschiedener Saatgutpartien im TAS-ELISA
bei der Ankeimmethode auf Papier.......................................................................... 110
Tabelle 3.15: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im SweatboxTest in Kombination mit einer PCR bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan...
.................................................................................................................................. 113
Tabelle 3.16: Keimfähigkeit (in % bei 20 °C und 12 Stunden Licht pro Tag) drei
verschiedener Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei 66 °C für 90
beziehungsweise 105 Sekunden und bei 64 °C für 120 beziehungsweise 150
Sekunden im Vergleich zur nicht-behandelten Kontrolle........................................ 125
EINLEITUNG
1
1
EINLEITUNG
Die Ursprünge des heutigen Feldsalates [Valerianella locusta (L.)] - Gemeiner
Feldsalat - gehen auf eine in Mitteleuropa wildwachsende Form zurück. Mit dem
aufkommenden Ackerbau siedelte sich der Feldsalat als Unkraut in Wintergetreide
und in Weinbergen an und wurde als Wildpflanze geerntet. Er wurde erstmals im
Mittelalter in Kultur genommen und eine erste Eignung als Blattgemüse wird
beschrieben. Seit Anfang des 19. Jahrhunderts mit der Einführung der mineralischen
Düngung wird Feldsalat erwerbsmäßig angebaut (MEYER-REBENTISCH, 2011). Seit
Ende der 1990er Jahre hat Feldsalat einen starken Anbauzuwachs erfahren, wobei
vor allem vorverpackter und gewaschener Feldsalat hoch im Kurs liegt, da er den
Konsumentenwunsch nach einfacher Zubereitung und langer Haltbarkeit, verbunden
mit gutem Geschmack und hohem Gesundheitswert erfüllt (persönliche Mitteilung
N. Laun, Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum - Rheinpfalz). Wilden Feldsalat
findet man heutzutage kaum noch.
Der Beginn des kommerziellen Feldsalatanbaus lag in Frankreich, wo auch heute
noch die Hauptanbaugebiete liegen. Von Frankreich aus kam der Feldsalat über die
Schweiz nach Deutschland. Der Anbau konzentriert sich in Deutschland im
Wesentlichen auf zwei Bundesländer: Rheinland-Pfalz und hier schwerpunktmäßig
die Pfalz, die als größtes zusammenhängendes Anbaugebiet Deutschlands gilt, sowie
Baden-Württemberg mit Schwerpunkten im Stuttgarter Raum und in Südbaden.
Aus der Literatur sind unterschiedliche Angaben zu den Anbauflächen und dem
Produktionswert, auf denen Feldsalat kultiviert wird, zu entnehmen. So beschreiben
SCHLAGHECKEN (2010) und BEHR (2009), dass in der franzözischen Region um
Nantes (Loire Atlantique und Vendée) auf einer Fläche von 6000 ha rund 75 % der
Weltproduktion und 85 % der französischen Erzeugung an Feldsalat angebaut
werden. Nach RAMPOLD (2004) betrug die Anbaufläche in Deutschland im Jahr
2003 rund 1590 ha und 270 ha in Unterglasanlagen (davon 705 ha in Rheinland-Pfalz
und 660 ha in Baden-Württemberg). Der Produktionswert der europäischen
Feldsalaterzeugung betrug ca. 118 Millionen Euro auf einer 6750 ha großen
Anbaufläche (Stand: Oktober 2004). Im Jahr 2008 lag der deutsche Produktionswert
EINLEITUNG
2
bei knapp 24.000 Tonnen, wovon circa 10 % aus Unterglasanbau stammen. Die
französische Produktion lag bei 32.300 Tonnen (BEHR, 2009).
Feldsalat gehört zu der Familie der Valerianaceae und ist eine winterannuelle
Pflanze, die Temperaturen von bis zu -15 °C bis -20 °C aushält. Er ist eine klassische
Winterkultur und wird vorwiegend im Herbst ausgesät beziehungsweise gepflanzt.
Gut 85 % des Feldsalatkonsums im Jahr konzentrieren sich in Deutschland und
Frankreich auf die Monate Oktober bis April (BEHR, 2009). Ein ganzjähriger Anbau
ist jedoch möglich, unter anderem durch die Verwendung von Schattierungsnetzen
(in den Sommermonaten), die ein Schießen der Pflanzen verhindern. In der
französischen Region um Nantes begann die Sommerproduktion im Jahr 1985
(PÉRON und REES, 1998).
Je nach Jahreszeit steht für den Anbau die Direktsaat mittels Saatgut oder das
Pflanzen von Jungpflanzen im Vordergrund. Feldsalat-Direktsaat erfolgt ab Mitte
August bis Anfang Oktober, während von März bis Juli in der Regel gepflanzt wird.
Die Anzuchtdauer für die Jungpflanzen beträgt zwischen vier und sechs Wochen.
Der Vorzug einer Pflanzung ist, dass Jungpflanzen in Einzeltöpfen bereits größer und
weniger anfällig sind und so eine sicherere Produktion ermöglichen, des Weiteren
kann die Ernte besser terminiert werden. Zudem wird ein deutlicher Unterschied
zwischen den verwendeten Sorten für die Direktsaat und für die Pflanzung gemacht.
Das wichtigste Kriterium ist für den Sommeranbau die Produktion „kurzstieliger“
Sorten, die zudem langsam wachsen sollten.
In der Produktionstechnik von Feldsalat wurden in den letzten Jahren offene Fragen
bezüglich der Unkrautkontrolle und der Pflanzenernährung geklärt. Ungelöst ist
bisher dagegen die Frage, wie Schäden durch Acidovorax valerianellae sp. nov., den
Erreger bakterieller Blattflecken bei Feldsalat, vermieden werden können.
Das Bakterium Acidovorax valerianellae an Feldsalat wurde in Frankreich
(Feldsalatanbaugebiet um Nantes) zum ersten Mal 1990 diagnostiziert und zunächst
als nicht-fluoreszierende Pseudomonas-Art beschrieben (RAT und GARDAN, 1993).
WILLEMS et al. (1992) transferierten einige Pseudomonas-Arten in die Gattung
Acidovorax. Die neue Artbezeichnung Acidovorax valerianellae sp. nov. erfolgte
EINLEITUNG
3
durch GARDAN et al. (2003). 1998 wurde A. valerianellae in Belgien identifiziert
(GRONDEAU et al., 2001), ein Nachweis für Deutschland erfolgte erstmals 1999 an
Feldsalatproben aus der Pfalz (BARCHEND, 2003, MOLTMANN et al., 2000).
A. valerianellae gehört zu der Gruppe der Gram- und Arginin-negativen, Oxidase-,
Catalase- und Urease-positiven, aeroben Pseudomonaden. Die Bakterien besitzen
eine Geißel, fluoreszieren nicht und bilden kein Levan auf saccharosehaltigen
Nährmedien. Die Bakterien wachsen auf Nährböden langsam und erreichen nach vier
Tagen einen Durchmesser von zwei Millimeter. Unter 4 °C und über 41 °C findet
kein Wachstum der Zellen statt. Das Wachstumsoptimum liegt bei einer Temperatur
von 28 °C. Aufgrund ihres langsamen Wachstums in vitro werden sie leicht von
saprophytischen Bakterien überwachsen (BRAJE, 2005, JASU, 2004).
Die Symptome einer A. valerianellae-Infektion von Feldsalat äußern sich zunächst
als sehr kleine Punkte von dunkelgrüner Färbung, die im Gegenlicht wässrig bis ölig
durchscheinen (Abb. 1.1). Bei Fortschreiten des Befalls werden die Flecken größer
und können einen Durchmesser von bis zu 4 mm erreichen, sie färben sich dabei
schwarz und sind etwa drei bis vier Tage nach der Infektion gut sichtbar. Zunächst
weisen die Flecken keinen Hof auf. Im Verlauf der Krankheit kann sich aber ein
chlorotischer Hof um die dunklen Flecken bilden. Die über die Blattspreite verteilten
oder am Blattrand lokalisierten Flecken sind unregelmäßig geformt bis rund und
scharf zum gesunden Gewebe abgegrenzt. Es können Blätter jeglichen Alters
infiziert werden, das heißt sowohl die Keimblätter als auch Blätter erntereifer
Pflanzen. Werden die Blätter sehr früh in der Blattentfaltung infiziert, so
verkrümmen sie sich oft bei fortschreitendem Wachstum (BRAJE, 2005, MOLTMANN,
1999).
Eine Infektion mit A. valerianellae führt nicht zum Absterben der Feldsalatpflanzen,
tritt aber insbesondere bei feuchter Witterung vor allem an den unteren Blättern auf
und führt zu massiven qualitativen Schäden (Abb. 1.2). Der Umbruch ganzer
Feldsalatanbauflächen kann die Folge sein (GRONDEAU et al., 2007). Auch schwach
befallene Ware ist für eine Vermarktung ungeeignet, da der Befall sich in den oft
folienumhüllten Verkaufsgebinden weiterentwickelt und im fortgeschrittenen
Stadium in Fäulnis übergehen kann.
EINLEITUNG
4
Abbildung 1.1: Bildung schwarzer Blattflecken nach Inokulation
von Feldsalat mit A. valerianellae.
Abbildung
1.2:
A.
valerianellae-Symptome
in
einem
Feldsalatbestand
Als Infektionsquellen werden der Boden und das Saatgut diskutiert. So überdauert
A. valerianellae, laut HINRICHS-BERGER et al. (2005), eine gewisse Zeit im Boden.
Untersuchungen, bei denen Feldsalat in kontaminiertem Boden ausgesät wurde,
führen mit jeder Kultur zu einem Anstieg an Symptom tragenden Pflanzen. Die
Ausbreitung erfolgt dabei zunächst in der Reihe, sobald sich die Blätter benachbarter
EINLEITUNG
Pflanzen
5
berühren.
Eine
Ausbreitung
über
Saatreihen
hinweg
ist
nach
Bestandesschluss festzustellen. Blattkontakt und Wasserspritzer sind vermutlich für
diese Übertragung verantwortlich. GRONDEAU et al. (2007) berichten, dass
A. valerianellae-Bakterien bis zu 39 Tage nach der Ernte von infizierten Pflanzen an
deren Pflanzenresten im Boden nachweisbar sind und der Boden somit eine
Inokulumquelle für weitere Aussaaten darstellt.
Feldsalatsaatgut ist zunächst, laut RAT und GARDAN (1993), keine Inokulumquelle
von A. valerianellae. Die Isolierung des Bakteriums aus kommerziellem Saatgut
gelingt nicht, während der Nachweis nach künstlicher Saatgutinfektion funktioniert
(BARCHEND, 2003 und 2004). Im Jahr 2006 wird, nach Untersuchungen von sechs
Saatgutpartien,
eine
Saatgutbelastung
mit
A. valerianellae
nachgewiesen
(GRONDEAU und SAMSON, 2009) und die Saatgutübertragung erscheint möglich.
Verstärkt tritt die Krankheit in den französischen beziehungsweise süddeutschen
Anbaugebieten auf (MOLTMANN et al., 2000, PERON und REES, 1998), wo die
Hauptanbaugebiete von Feldsalat liegen. Die Krankheit stellt zurzeit die wichtigste
und gefährlichste Erkrankung an Feldsalat in Frankreich dar (GRONDEAU et al.,
2007) und Bekämpfungsmöglichkeiten sind rar. Die französischen Feldsalatanbauer
verhindern derzeit eine Bodenübertragung durch eine Desinfektion des Bodens mit
Metam-Natrium. Diese Entseuchungsmaßnahme erfordert einen hohen Aufwand in
Form von Spezialgeräten und garantiert lediglich eine Befallsminderung aber keine
Befallsfreiheit (persönliche Mitteilung, T. Weinheimer, BOLAP GmbH). Gegen
diese Krankheit sind in Deutschland bisher keine chemischen Pflanzenschutzmittel
zugelassen, noch kann damit gerechnet werden, dass Antibiotika zur Bekämpfung
zugelassen werden.
Erste Hinweise auf eine mögliche Saatgutübertragung liegen vor (HINRICHS-BERGER
et al., 2005, GRIMAULT et al., 2006, GRONDEAU und SAMSON, 2009) und eine
weitere Ausdehnung der Befallsfläche auf diesem Weg wird befürchtet. Dieser
Ausbreitungsweg
bedroht
eine
wirtschaftliche
Saatgutproduktion
und
die
Feldsalatzüchtung.
Eine sinnvolle Bekämpfungsstrategie von A. valerianellae beruht auf Kenntnis der
Epidemiologie
des
Bakteriums
(HINRICHS-BERGER
et
al.,
2005).
Als
Regulierungsmöglichkeiten bieten sich vor allem pflanzenbauliche Maßnahmen an.
EINLEITUNG
6
So sollte nach FRANKENBERG (2005) zunächst gesundes Saatgut verwendet werden.
Auf einen Anbau in der wärmeren Jahreszeit sollte bei Bakterienbefall weitestgehend
verzichtet werden, ebenso wie auf Beregnungen in den Abendstunden. Treten
infizierte Feldsalatpflanzen auf, sollte eine Anbaupause von zwei Jahren für Feldsalat
angestrebt werden. Nach GRONDEAU et al. (2003, 2006) überdauert das Bakterium
nämlich im Boden und kann erneute Aussaaten schädigen.
.
TOMIHAMA et al. (2006) beschreiben braune Flecken an Teeblättern in Japan, die
von A. valerianellae verursacht werden. Ebenfalls durch A. valerianellae verursachte
Blattflecken kommen an der Gartenhortensie (Hydrangea macrophylla) vor (IKEDA
et al., 2009).
Neben A. valerianellae an Feldsalat, Teeblättern und Gartenhortsensie gibt es noch
weitere phytopathogene Acidovorax-Arten, die an verschiedenen Wirtspflanzen
vorkommen. Nach WILLEMS et al. (1992) kommen Acidovorax avenae subsp.
cattleyae-Bakterien an Orchideen vor, wo sie braune Flecken hervorrufen, während
Acidovorax konjaci-Bakterien an der Konjakknolle vorkommen. Acidovorax avenae
subsp. avenae und Acidovorax avenae subsp. citrulli verursachen an Cucurbitaceae
bakteriellen Flecken an Blättern und Früchten.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Aufklärung biologischer und
epidemiologischer Grundlagen von A. valerianellae an Feldsalat. Vor allem die
Erregeransprüche an Temperatur, Blattalter, Inokulumdichte, Feldsalatsorte und
Blattnässedauer sollten geklärt werden, um dabei kritische Infektionsbedingungen
charakterisieren zu können und darauf aufbauend geeignete Maßnahmen zur
Vermeidung von Schäden zu entwickeln. Die einzelnen Übertragungswege waren zu
bewerten, insbesondere die Bedeutung und das Ausmaß der Saatgutübertragung in
Abgrenzung zu befallenen Boden oder alternativen Wirtspflanzen. Verschiedene
Saatgutbehandlungen wurden in ihrer Dekontaminationswirkung geprüft. Die
gewonnenen Erkenntnisse dienen der Erarbeitung praxisorientierter Lösungsansätze
zur Vermeidung und Bekämpfung der Blattfleckenkrankheit an Feldsalat.
MATERIAL UND METHODEN
2
MATERIAL UND METHODEN
2.1
Chemikalien
2.1.1
Nährmedien
2.1.1.1
Kings medium B (King-Agar B)
7
Zum Herstellen von King-Agar B (KB)-Platten wurden 16,5 g Fertig-Agar der Firma
Sigma-Aldrich Chemie GmbH laut Anweisung mit 500 ml destilliertem Wasser
gemischt und zunächst in der Mikrowelle vorgewärmt. Nachdem das Pulver
vollständig gelöst war, wurden 6,5 g Glycerin der Firma neoLab Migge LaborbedarfVertriebs GmbH zugesetzt. Das Medium wurde anschließend bei 121 °C für
20 Minuten autoklaviert. Sobald es auf ca. 60 °C abgekühlt war, wurde es unter
sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen (etwa 10 ml je Schale).
Bei KB-Agar-Schalen mit fungiziden Antibiotikum, wurde dem 60 °C warmen
Medium (500 ml) 1 ml Cycloheximid (1 g Cycloheximid gelöst in 10 ml 75 %-igem
Methanol, steril filtriert) zugesetzt und unter sterilen Bedingungen in Petrischalen
gegossen (etwa 10 ml je Schale). Die fertigen Schalen wurden bei 4 °C bis zur
Verwendung gelagert.
2.1.1.2
Tryptic Soy Agar (TSA-Agar)
Zum Herstellen von TSA-Agar-Platten wurden 20 g Fertig-Agar der Firma BD
Diagnostic Systems laut Anweisung mit 500 ml destilliertem Wasser gemischt und
zunächst in der Mikrowelle vorgewärmt. Das Medium wurde anschließend bei
121 °C für 20 Minuten autoklaviert. Sobald es auf ca. 60 °C abgekühlt war, wurde es
unter sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen (etwa 10 ml je Schale).
MATERIAL UND METHODEN
2.1.2
8
Natriumchlorid-Lösung
Zur Herstellung der A. valerianellae-Suspension wurde in allen Versuchen eine
0,85 %-ige Natriumchlorid (NaCl)-Lösung verwendet.
2.1.3
Pflanzenschutzmittel
Auftretender Mehltau der Gattung Erysiphe wurde mit den Mitteln „Euparen M WG“
(Wirkstoff Tolylfluanid) der Firma Bayer oder „Bayfidan“ (Wirkstoff Triadimenol)
der Firma Bayer behandelt. Als Breitbandfungizide gegen Botrytis cinerea und
Rhizoctonia solani wurden die Mittel „Signum WG“ (Wirkstoffe F 500
(Pyraclostrobin) und Boscalid) und „Rovral WP“ (Wirkstoff Iprodion) der Firma
BASF
im
Wechsel
verwendet.
Auftretender
Befall
mit
freifressenden
Schmetterlingsraupen wurde mit dem Mittel „Steward WG“ (Wirkstoff Indoxacarb)
der Firma DuPont behandelt. Der Einsatz der Pflanzenschutzmittel erfolgte jeweils
nach den Anwendungshinweisen des Herstellers.
2.2
Versuchssteuerung
2.2.1
Gewächshaus
Die Feldsalatpflanzen wurden für die Dauer der Anzucht, das heißt nach dem
Ankeimen bis zur Verwendung für Versuche, im Gewächshaus kultiviert. Eine
Bewässerung wurde manuell bei Bedarf durchgeführt, ebenso wie die Verwendung
eines Energieschirmes und die Ausbringung von Pflanzenschutzmitteln. In den
Wintermonaten wurde zusätzlich ein Kunstlicht eingesetzt.
Versuche zu Untersuchungen der Sortenanfälligkeit (Kapitel 2.13) wurden im
Gewächshaus durchgeführt.
MATERIAL UND METHODEN
2.2.2
9
Klimaschränke und Klimakammern
Soweit nicht anders erwähnt, wurden alle Versuche in Klimaschränken
beziehungsweise Klimakammern durchgeführt, wobei die Temperatur- sowie
Lichteinstellung je nach Versuch variierten. Die Bewässerung erfolgte manuell bei
Bedarf. Verwendet wurden dabei eine geräumige, begehbare Klimakammer des Typs
VEKZ 05/440 der Firma Vötsch Industrietechnik GmbH, Balingen, Deutschland, ein
Pflanzenwachstumsschrank des Typs KBWF 720 der Firma Binder GmbH,
Tuttlingen, Deutschland und Klimaschränke der Firma Rubarth Apparate GmbH,
Laatzen, Deutschland. Des Weiteren wurde ein Kühlbrutschrank der Marke Friocell
von der Firma IUL Instruments GmbH, Königswinter, Deutschland verwendet.
2.3
Isolierung und Charakterisierung von Acidovorax
valerianellae-Bakterien
Bei Auftreten von Blattsymptomen, die durch das Bakterium A. valerianellae
verursacht sein könnten, wurde versucht, die Bakterien aus diesen Blattbereichen zu
isolieren. Dafür wurden die Symptom tragenden Blätter zunächst mit 70 %-igem
Alkohol und danach mit destilliertem Wasser abgespült und so von anhaftenden
Schmutzpartikeln und möglicherweise vorkommenden Epiphyten befreit und
oberflächendesinfiziert. Die Blätter wurden anschließend mit Zellstoff getrocknet
und dann in einem Mörser mit 1 ml 0,85 %-iger NaCl-Lösung homogenisiert. Das
Homogenat wurde 1:100 und 1:1000 verdünnt. Jeweils 20 µl des unverdünnten
Homogenats sowie der beiden Verdünnungen wurden auf eine KB-Agar-Schale mit
Cycloheximid in dreifacher Wiederholung aufgetragen und mittels Drigalskispatel
gleichmäßig verteilt. Nach ein- bis dreitägigem Wachstum bei 20 °C wurden
Verdünnungsausstriche mit Hilfe einer sterilen Impföse angefertigt, um reine
Bakterienkulturen auf KB-Agar-Schalen zu erzeugen. Dieser Schritt wurde bei
Bedarf mehrmals wiederholt. Anschließend wurden die Bakterienkolonien näher
charakterisiert
Oxidase-Test,
(Fluoreszenz,
Gramreaktions-Test,
Hypersensitivitätsreaktion,
Mikrobiologie
indirekter
Bactident®
ELISA).
A. valerianellae besitzt einen typischen Geruch, der darüber hinaus die
Identifizierung unterstützte.
MATERIAL UND METHODEN
2.3.1
10
Fluoreszenz
Zur Prüfung der Fluoreszenz wurden die auf KB-Agar-Platten wachsenden Kolonien
unter eine Schwarzlichtlampe gehalten. Handelt es sich bei den zu testenden
Kolonien um A. valerianellae-Bakterien, so fluoreszieren sie nicht. Sie sind daher
deutlich von den fluoreszierenden Pseudomonaden zu unterscheiden.
2.3.2
Gramreaktions-Test (nach SUSLOW et al., 1982)
Zum Test der Gramreaktion wurden zu testende Einzelkolonien beziehungsweise
Reinkulturen auf einer Impföse in einen Tropfen 1 %-iger Kaliumhydroxid (KOH)Lösung auf einem Objektträger verrieben. Handelt es sich um A. valerianellaeBakterien, so bildet sich aufgrund der Zellwandzusammensetzung des Gramnegativen Bakteriums ein Faden, wenn man die Impföse langsam aus dem Tropfen
hebt.
2.3.3
Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test (nach KOVACS,
1956)
Zum Test der Oxidase-Tätigkeit, wobei es sich um einen Nachweis der
Cytochromoxidase
in
Mikroorganismen
handelt,
werden
Einzelkolonien
beziehungsweise Reinkulturen auf einer Impföse auf die Reaktionszone eines
Teststäbchens aufgetragen und verrieben. Die Teststäbchen stammen von der Firma
Merck KGaA aus Darmstadt. Nach 20 bis 60 Sekunden wird die Reaktion mit einer
Farbskala verglichen (Abb. 2.1). In Anwesenheit molekularen Sauerstoffs kann das
Cytochromoxidase/Cytochrom c-System eine ganze Reihe von organischen
Substanzen reduzieren, unter anderem das sogenannte NaDi-Reagenz (1-Naphthol +
Dimethyl-paraphenylendiamin)
unter
Bildung
des
Kondensationsmoleküls
Indophenolblau. Diese Reaktion wird zur Klassifizierung und Identifizierung von
Bakterien verwendet. Handelt es sich bei der zu testenden Kultur um
A. valerianellae-Bakterien, so färbt sich die Reaktionszone blau bis blauviolett und
die Kultur gilt als Oxidase-positiv.
MATERIAL UND METHODEN
11
Abbildung 2.1: Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test zum
Nachweis
Oxidase-positiver
A. valerianellae-Bakterien
anhand eines Farbumschlages auf dem Teststäbchen.
2.3.4
Hypersensitivitätsreaktion (nach GARDAN et al., 2003)
Bei Prüfung der Hypersensitivitätsreaktion wird die zu testende Bakteriensuspension
mit einer Konzentration von 108 cfu/ml (Herstellung in Kapitel 2.8 beschrieben) in
Tabakblätter (Nicotiana tabacum) der Sorte Samsun infiltriert. Handelt es sich bei
der zu testenden Bakterienlösung um eine Suspension von A. valerianellae, so ist
nach
zwei
bis
drei
Hypersensitivitätsreaktion
(Abb. 2.2).
Tagen
im
eine
Bereich
der
sehr
schwache
bis
schwache
Infiltrationsstelle zu beobachten
MATERIAL UND METHODEN
12
Abbildung 2.2: Schwache Hypersensitivitätsreaktion an Tabak
im Bereich der Infiltrationsstellen (innerhalb der Kreise) am
Beispiel des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (Infiltration mit einer
Konzentration von 108 cfu/ml).
2.3.5
Indirekter ELISA (TAS Triple antibody sandwich)
Der TAS-ELISA wurde 2009 von Frau K. Thiele, Institut für Epidemiologie und
Pathogendiagnostik des Julius Kühn-Instituts, Quedlinburg, entwickelt und
freundlicherweise für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Hierzu gehörte das
polyklonale Immuglobulin G (IgG) 44 und der monoklonale Antikörper 7C10ESB10
aus dem Hybridomüberstand. Das Serum (IgG 44) und der monoklonale Antikörper
wurden gegen das A. valerianellae-Isolat 16619 der Deutschen Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig entwickelt.
Die zu beschichtenden Maxisorpplatten mit 96 Vertiefungen (442404, F96 Maxisorp,
Nunc-Immuno-Plate, Lot. 111276) stammen von der Firma Thermo Fisher Scientific,
Dänemark. Das verwendete Ziege-Anti-Maus-Anti-Körper (ZAMAK) - Konjugat
wurde unter dem Namen Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat AntiMouse IgG + IgM (H+L) (Code: 115-055-044, Lot: 81251) von der Firma Jackson
ImmunoResearch Europe Ltd, Suffolk CB8 1JX bezogen. Als Substrat diente
4-Nitrophenyl
phosphate-disodium
salt
(p-NPP)
C 180506) der Firma LOEWE Biochemica GmbH, Deutschland.
(No.
00130/025,
MATERIAL UND METHODEN
13
Die für den TAS-ELISA verwendeten Puffer wurden wie folgt selbst hergestellt:
Coatingpuffer:
1,59 g Na2CO3
2,93 g NaHCO3
ad. 1000 ml H2O dest.
pH-Wert 9,6 wurde eingestellt mit NaOH/HCl
Waschpuffer (PBS):
8 g NaCl
0,2 g KH2PO4
1,46 g Na2HPO4 * 2 H2O
0,2 g KCl
0,5 ml Tween 20
ad. 1000 ml H2O dest.
pH-Wert 7,4 wurde eingestellt mit NaOH/HCl
Extraktionspuffer:
20 g Polyvinylpyrrolidinone 25
2 g Trockenmilch
ad. 1000 ml Waschpuffer
Der für den letzten Schritt verwendete Substratpuffer (Substrate Buffer 5 *,
No. 07602/025) stammte von der Firma LOEWE Biochemica GmbH, Deutschland
und wurde vor Verwendung 5-fach mit Aqua dest. verdünnt.
Der TAS-ELISA wurde folgendermaßen durchgeführt:
1.
Coating:
Polyklonales Immunglobulin G (IgG) 44 wurde 1:100 in Coatingpuffer
verdünnt und 100 µl wurden in je eine Vertiefung aufgetragen. Die folgende
Inkubation wurde für zwei Stunden bei 37 °C durchgeführt. Vor dem
nächsten Schritt wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer (PBS)
gewaschen.
MATERIAL UND METHODEN
2.
14
Blockierung:
200 µl Waschpuffer (PBS) mit 1 % Trockenmilch (TM) wurden in jede
Vertiefung pipettiert. Die Platten wurden anschließend für eine Stunde bei
37 °C inkubiert. Für den folgenden Schritt wurden die Platten nicht
gewaschen, sondern nur Blockierungspuffer entfernt.
3.
Pflanzensaft beziehungsweise Probe:
Die zu untersuchenden Pflanzenblätter oder gewachsenen Bakterienkolonien
wurden 1:10 oder 1:20 (je nach Materialmenge) in Extraktionspuffer
homogenisiert und entweder direkt verwendet oder eingefroren. 100 µl der
Probe (frisch oder aufgetaut) wurde in je eine Vertiefung gefüllt, wobei jede
Probe als Doppelbestimmung aufgetragen worden ist. Die Inkubation
erfolgte bei 4 °C über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurden die Platten
viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.
4.
monoklonaler Antikörper:
100 µl des 1:2000 in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnten
monoklonalen Antikörpers 7C10ESB10 wurde in jede Vertiefung pipettiert.
Die Platten wurden anschließend bei 37 °C inkubiert. Nach zwei Stunden
wurden die Platten viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.
5.
Konjugat (Ziege Anti Maus-Anti-Körper (ZAMAK):
Für diesen Schritt wurde das verwendete Konjugat im Verhältnis von 1:2000
in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnt. Die Inkubation von 100 µl
pro Vertiefung wurde für eine Stunde bei 37 °C durchgeführt. Danach wurden
die Platten viermal mit Waschpuffer gewaschen.
6.
Substrat:
200 µl 1 mg p-Nitrophenyldihydrogenphosphat je 1 ml Substratpuffer wurde
pro Vertiefung aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde bei
Raumtemperatur
unter
Lichtausschluss.
Am
ELISA-Reader
wurden
Messungen bei 405 nm und 490 nm Wellenlänge durchgeführt.
Nicht-inokulierte, symptomlose Blätter wurden als Negativkontrolle und inokulierte,
Symptom tragende Blätter als Positivkontrolle 1:50 in Extraktionspuffer verdünnt
und in die erste Spalte (gesund) und in die letzte verwendete Spalte (infiziert) auf der
Platte aufgetragen, um ein Verschleppen während des Auftragens beziehungsweise
MATERIAL UND METHODEN
15
Waschens zu verhindern. Jeweils die Hälfte der aufgetragenen Kontroll-Spalten
(Vierfachbestimmung) wurde mit monoklonalem Antikörper befüllt (Negativbeziehungsweise Positivkontrolle), die andere Hälfte nur mit Waschpuffer plus 1 %
Trockenmilch (sogenannte Blindwerte, Schritt 4). Der Mittelwert der Blindwerte
wurde von allen Messwerten abgezogen. Der Mittelwert der Negativkontrollen
zuzüglich des zweifachen Wertes der Standardabweichung dieser Messwerte
(mean + 2 * s) wurde für jede ELISA-Platte als Schwellenwert festgelegt.
Mehrfachbestimmungen
derselben
Probe
wurden
gemittelt
und
mit
dem
Schwellenwert verglichen.
Als A. valerianellae-positive Proben galten alle, deren gemittelte Messwerte
abzüglich des Blindwertes oberhalb des Schwellenwertes einer Maxisorpplatte lagen.
2.4
Verwendete Acidovorax valerianellae-Stämme
Für die Versuche wurde, wenn nicht anders benannt, ein Isolategemisch aus den
Isolaten 6.1.a, 16619, 709/2, 552 und IV2 verwendet. Das Isolat 6.1.a stammt aus der
Gegend um Karlsruhe, Deutschland. Dieses wurde freundlicherweise von Frau Dr.
Esther Moltmann von dem Landwirtschaftlichen Technologiezentrum Augustenberg,
Außenstelle Stuttgart, Deutschland zur Verfügung gestellt. Das Isolat 16619 stammt
aus der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,
Braunschweig, Deutschland und wurde dort unter der DSM-Nummer 16619
beziehungsweise CFBP 4730, NCPPB 4283 bestellt. Das Isolat 709/2 stammt aus
dem Raum Neustadt an der Weinstraße, Deutschland und wurde dankenswerterweise
von Herrn Dr. Hermann-Josef Krauthausen von dem Dienstleistungszentrum
Ländlicher Raum Rheinpfalz, Neustadt an der Weinstraße, Deutschland zur
Verfügung gestellt. Die Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande war so
freundlich die Isolate 552 und 553 zur Verfügung zu stellen, während das Isolat IV2
von der Firma Rijk Zwaan, Frasem, Frankreich freundlicherweise bereit gestellt
wurde.
Die Isolate wurden bei -75 °C in einer CryobankTM, einem Stammhaltungssystem zur
Langzeitlagerung für Mikroorganismen der Firma Mast Diagnostica Laboratoriums-
MATERIAL UND METHODEN
16
Präparate GmbH, Reinfeld, Deutschland aufbewahrt und je nach Bedarf auf KBAgar-Schalen rekultiviert.
2.5
Verwendetes Valerianella locusta (L.) – Saatgut
Für alle Feldsalatversuche mit Ausnahme der Sortenversuche, den Versuchen zur
Saatgutübertragung, den Versuchen von Nachweismethoden von A. valerianellae am
Saatgut
und
den
Dekontaminationsmaßnahmen
wurde
die
Sorte
AV-1
(Kalibergröße 2,00-2,25, 2006) der Firma Enza Zaden Deutschland GmbH & Co.
KG, Dannstadt-Schauernheim, verwendet.
Das Saatgut der Sorten und der Wildart V. rimosa (AV-13) für die Versuche zur
Sortenanfälligkeit (Tab. 2.1) wurde sowohl von der Firma Enza Zaden, der Firma
Clause (Nickerson Zwaan), Edemissen, Deutschland, der Firma Nunhems/Hild,
Marbach/Neckar, Deutschland als auch von der Firma Rijk Zwaan De Lier,
Niederlande zur Verfügung gestellt. Das Saatgut für diese Versuche wurde vor der
Aussaat einer Warmwasserbeize unterzogen. Hierbei wurde das Saatgut für
20 Minuten in ein 42 °C bis 45 °C warmes Wasserbad gelegt (persönliche
Mitteilung, A. Schieder, Enza Zaden). Anschließend wurde das Saatgut auf
Filterpapier bei einer Temperatur von 27 °C für 24 bis 48 Stunden zurückgetrocknet.
Für die Versuche zur Saatgutübertragung mit Aussaat in den Jahren 2007 und 2008
wurden die nicht-infizierte, gesunde Sorte AV-60 (2006, Kalibergröße 2,00-2,25)
und die infizierte Sorte AV-75 (2005, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Enza
Zaden, Enkhuizen, Niederlande zur Verfügung gestellt. Für den Folgeversuch zur
Saatgutübertragung mit Aussaat im Jahr 2009 wurden die gleichen Sorten eingesetzt,
allerdings waren beide Sorten mit Thiram, Metalaxyl und Iprodion gebeizt.
Für die Versuche von Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut
(Kapitel 2.15.1) wurden sowohl die Ausgangssaatgutpartien als auch die
selbstproduzierten Partien aus den Versuchen zur Saatgutübertragung herangezogen.
Für die Dekontaminationsmaßnahmen (Kapitel 2.15.2) wurden zwei Sorten
verschiedener Züchterhäuser benutzt. Als Vergleichssorte wurde die Sorte AV-220
(2009, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande
MATERIAL UND METHODEN
17
verwendet. Als kontaminierte Sorten wurden die Sorten AV-219 (2009, Kalibergröße
2,00-2,25) von der Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande und die Sorte AV-17
(2009, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Rijk Zwaan De Lier, Niederlande
verwendet.
MATERIAL UND METHODEN
18
Tabelle 2.1: Verwendetes Saatgut für die Versuche zur Sortenanfälligkeit.
k.A.: keine Angabe
Sorte
Züchter
AV-2
Kalibrierung
2,25-2,5
Rijk Zwaan
Beizung
Thiram, Carbendazim,
Metalaxyl-M
AV-3
2,00-2,25
-
AV-4
2,25-2,5
-
1,75-2,00
-
AV-6
2,50-2,75
-
AV-7
2,25-2,50
-
AV-8
1,75-2,00
-
AV-9
2,00-2,25
-
AV-10
2,00-2,25
AV-11
2,00-2,25
AV-5
Clause
Nunhems/Hild
AV-12
AV-13
Enza Zaden
2,00-2,25
Thiram, Iprodion,
Metalaxyl-M
Thiram, Iprodion+,
Metalaxyl-M
k.A.
-
AV-14
k.A.
-
AV-15
k.A.
-
V. rimosa
MATERIAL UND METHODEN
2.6
19
Keimfähigkeit
Zur Überprüfung der Keimfähigkeit wurden 4 * 100 Samen je Saatgutpartie auf
gefaltetem, mit Leitungswasser angefeuchtetem Filterpapier ausgelegt und unter
kühlen, dunklen Bedingungen (4 °C, Kühlschrank) inkubiert (Abb. 2.3). Die Samen
wurden mehrmals auf ihre Keimung hin überprüft (innerhalb von vier Wochen),
wobei jeweils die Anzahl an gekeimten Samen festgestellt wurde. Der Endwert der
Keimfähigkeit (nach 28 Tagen) je Partie wurde aus vier Wiederholungen gemittelt.
Abbildung 2.3: Gekeimte und nicht gekeimte Feldsalatsamen auf
angefeuchtetem Filterpapier zur Überprüfung der Keimfähigkeit.
(Foto: P. Krämer)
2.7
Aussaat von Feldsalatpflanzen
Die Aussaat des Feldsalates für die Gewächshaus- und Klimakammerversuche
erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, in 4-er beziehungsweise 5-er Erdpresstöpfe, die
aus einem Anzuchtsubstrat mit organischer Aufdüngung für Gemüsejungpflanzen
(KKS Bio Potgrond) der Firma Klasmann-Deilmann GmbH, Geeste, Deutschland
hergestellt wurden. Die Erdpresstöpfe wurden mittels einer Erdpresstopfmaschine
MATERIAL UND METHODEN
20
der Firma Unger, Landmaschinen, Heidelberg-Dossenheim, Deutschland hergestellt
und in Aussaatkisten abgelegt. Bis zur weiteren Verwendung wurden fertige Kisten
im Kühlhaus gelagert. Die Aussaat des Feldsalates erfolgte entweder von Hand um
eine definierte Kornablage zu gewährleisten (für die Versuche zur Sortenanfälligkeit)
beziehungsweise über ein Handsähgerät, mit dem bei jeder Betätigung drei bis fünf
Körner in den Topf abgelegt wurden. Um ein Austrocknen der Töpfe zu verhindern
und eine gleichmäßige Befeuchtung zu gewährleisten wurden die Töpfe abschließend
mit Sand abgestreut. Fertig ausgesäte Kisten wurden für die ersten fünf bis sechs
Tage zum Ankeimen bei konstanten Temperaturen von 15 °C gelagert. Nach dem
Ankeimen wurden die Feldsalatpflanzen im Gewächshaus weiterkultiviert. Eine
Bewässerung erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, über Kopf nach Bedarf. Vor einer
weiteren Verwendung der Feldsalatpflanzen wurde jeder Erdpresstopf auf eine gut
entwickelte Pflanze vereinzelt.
2.8
Herstellung von A. valerianellae - Inokulum
Zur Herstellung einer A. valerianellae-Suspension wurden Bakterienzellen von zwei
bis drei Tage alten Kulturen von KB-Agar-Platten abgenommen und in eine
Natriumchloridlösung (0,85 %) suspendiert. Die optische Dichte wurde dabei anhand
des Standards für Gram-negative Bakterien des BIOLOG-Verfahrens (GN-NENT)
mittels Turbidimeter auf eine Bakterienkonzentration von ungefähr 3*108 cfu/ml
eingestellt. Da die Konzentrationseinstellung über diesen Weg nicht genauer
bestimmt werden konnte, war ein zusätzliches Ausplattieren der Bakteriensuspension
unerlässlich. Zunächst wurde die Konzentration auf einen Wert von in etwa
103 cfu/ml verdünnt und anschließend auf acht bis zehn KB-Agar-Platten zu je 20 µl
ausplattiert. Die Schalen wurden für drei bis vier Tage bei 20 °C beziehungsweise für
zwei bis drei Tage bei 25 °C inkubiert und abschließend fand ein Auszählen der
Kolonien statt und die Umrechnung auf Bakterienanzahl pro Milliliter in der
Ausgangssuspension.
Ausgehend von einer A. valerianellae-Konzentration von ungefähr 108 cfu/ml
(Einstellung über das Turbidimeter des BIOLOG-Verfahrens) wurden die
Konzentrationen 102 cfu/ml, 103 cfu/ml, 104 cfu/ml, 105 cfu/ml, 106 cfu/ml,
107 cfu/ml für die Verdünnungsreihe mit 0,85 %-iger NaCl-Lösung eingestellt. Die
MATERIAL UND METHODEN
21
Suspension mit der höchsten Konzentration von 108 cfu/ml wurde dabei zunächst in
einem Verhältnis von 1:10 verdünnt. Das so entstandene Inokulum mit der
Konzentration von 107 cfu/ml wiederum als Ausgangssuspension zur Herstellung der
Konzentration von 106 cfu/ml verwendet, wobei die Suspension im Verhältnis von
1:10 verdünnt wurde. Die Bakteriensuspensionen für die anderen Konzentrationen
wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt.
2.9
Inokulation der Feldsalatpflanzen
Das Bakterium A. valerianellae wurde, wenn nicht anders erwähnt, in allen
Versuchen als Suspension eines Isolategemisches (aus den Isolaten 6.1.a, 16619,
IV2, 552 und 709/2) und mit einer Konzentration von 108 cfu/ml verwendet. Die
Inokulation erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, durch Sprühinokulation auf die
nicht
verletzte,
trockene
Pflanzenoberfläche
mittels
Feinzerstäuber.
Die
Bakteriensuspension wurde bis zum Ablaufen des Sprühfilms auf die Pflanzen
ausgebracht (Abb. 2.4).
Nach der Inokulation wurden die Pflanzen unter einer Haube beziehungsweise Folie
bei annähernd gesättigter Luftfeuchtigkeit weiterkultiviert. Die Dauer der Abdeckung
war je nach Versuchsfrage unterschiedlich.
MATERIAL UND METHODEN
A
B
Abbildung 2.4: Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae.
(A): Verwendung eines Feinzerstäubers. (B): Sprühfilm zerstäubter
A. valerianellae-Suspension auf der Oberseite von Feldsalatblättern.
(Foto (A): G. Hörner, Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz)
22
MATERIAL UND METHODEN
2.10
23
Bonitur von Feldsalatpflanzen
Die Bonitur von Feldsalatpflanzen wurde, wenn nicht anders erwähnt, mehrmals zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation bis Versuchende vorgenommen. Es
wurden sowohl die Anzahl von Symptom tragenden Pflanzen (Befallshäufigkeit
in %) ermittelt als auch der Anteil nekrotischer Blattfläche je Einzelpflanze
(Befallsstärke in %) geschätzt.
Bei der Bonitur der Pflanzen im Bodenüberdauerungsversuch wurden sowohl die
Gesamtanzahl der aufgelaufenen Feldsalatpflanzen als auch die Zahl der Symptom
tragenden Pflanzen beurteilt und in Prozent angegeben (Befallshäufigkeit in %).
Bei der Bonitur der Pflanzen des Ausgangssaatgutes bei der Saatgutproduktion (mit
Aussaat in den Jahren 2007 bis 2009) wurden zunächst Symptom tragende Pflanzen
mit einem Holzstab markiert und anschließend wurde die Gesamtanzahl an Symptom
tragenden Pflanzen geschätzt.
2.11
Statistische Auswertung der Daten
Die Daten wurden mit dem Statistikpaket XLSTAT von MS Excel, Version 6,
ausgewertet. Mit allen Daten wurde eine Varianzanalyse durchgeführt, vorausgehend
wurden die Residuen mit dem Shapiro Wilk Test auf Normalverteilung geprüft. Die
Unterschiede zwischen normalverteilten Behandlungen wurden mit dem Tukey`s
HSD-Test auf Signifikanz bei p < 0,05 geprüft (und sind nachfolgend in den
Abbildungen nochmals gesondert beschriftet). Nicht normalverteilte Stichproben
wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verglichen und auf
Signifikanz bei p < 0,05 nachgerechnet. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind
nicht signifikant voneinander verschieden.
MATERIAL UND METHODEN
2.12
24
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen von
Acidovorax valerianellae
2.12.1
Einfluss der Temperatur auf die Infektion in vivo
Die Versuche wurden in Klimaschränken bei konstanten Temperaturen von 10 °C,
15 °C, 20 °C, 25 °C und 30 °C im 12 Stunden Tag- (mit Beleuchtung) und
12 Stunden Nachtrhythmus (ohne Beleuchtung) durchgeführt. Feldsalatpflanzen im
2- bis 4-Blattstadium wurden direkt nach der Inokulation mit einem A. valerianellaeGemisch (siehe Kapitel 2.4) in einer Konzentration von 109 cfu/ml bei genannten
Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchte aufgestellt und bis Versuchende
mehrmals
bonitiert.
Die
Bewässerung
der
Pflanzen
erfolgte
über
das
Anstauverfahren, um eine Ausbreitung des Erregers über Spritzwasser zu vermeiden.
Bonitiert wurde der Anteil an befallener Blattfläche (Befallsstärke in %) und die
Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen (Befallshäufigkeit in %).
2.12.2
Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die
Infektion
Für diesen Versuch wurden Feldsalatpflanzen (n=20) in verschiedenen Stadien
(Keim- und Laubblattstadium) mit dem Isolat 709/2 mit einer Konzentration von
106 cfu/ml inokuliert und anschließend unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Die
Dauer der Abdeckung zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit wurde variiert. In der ersten
Variante wurden die Pflanzen unmittelbar nach der Inokulation einmalig für
48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert (einmalige Abdeckung). In der
zweiten Variante wurden die Pflanzen direkt nach der Inokulation für 48 Stunden bei
gesättigter Luftfeuchte und nach einer jeweils fünftägigen Phase ohne Abdeckung
erneut für 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Das erfolgte im
wöchentlichen Abstand, so dass über 35 Tage jeweils an zwei von sieben Tagen
gesättigte Luftfeuchtigkeiten herrschten. In Variante drei wurden die Pflanzen bis
Versuchende, 35 Tage nach der Inokulation, dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte
MATERIAL UND METHODEN
25
gehalten (dauerhafte Abdeckung). Die Klimakammerführung wurde auf 20 °C und
18 °C im 12-Stundenwechsel mit 16 Stunden Licht eingestellt.
An verschiedenen Tagen nach der Inokulation wurden Bonituren vorgenommen, bei
denen ermittelt wurde, wie viele Pflanzen von den 20 inokulierten Pflanzen
Symptome zeigten. Begonnen wurde am vierten Tag nach der Inokulation, während
die letzte Bonitur nach 35 Tagen stattfand.
In einer Versuchswiederholung wurden Pflanzen im Laubblattstadium mit einem
Isolategemisch (Konzentration 105 cfu/ml) inokuliert und anschließend, wie oben
beschrieben kultiviert.
2.12.3
Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion
beziehungsweise die Symptomentwicklung
Um zu testen, ob die Dauer der Blattnässe beziehungsweise die Dauer des
Vorhandenseins einer hohen (gesättigten) Luftfeuchte einen Einfluss auf eine
Infektion von A. valerianellae besitzt, wurden mehrere Versuche angelegt. Bei allen
Versuchen zum Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion erfolgte die
Inokulation von Pflanzen im 2- bis 4-Blattstadium mit einer A. valerianellaeSuspension aus einem Isolategemisch mit einer Konzentration von 108 cfu/ml, wenn
nicht anders erwähnt. Die Bewässerung erfolgte über das Anstauverfahren, um eine
Erregerausbreitung durch Spritzwasser zu vermeiden. Erfasst wurden Befallsstärke
und Befallshäufigkeit an verschiedenen Tagen nach der Inokulation bis Versuchende.
2.12.3.1
Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung
In einem ersten Versuchsansatz unter Klimakammerbedingungen bei Temperaturen
von 25 °C für 12 Stunden und 18 °C für 12 Stunden bei 16 Stunden Licht wurde der
Einfluss einer zwischengeschalteten Trockenphase von sieben beziehungsweise acht
Tagen auf die Symptomausprägung bereits befallener Feldsalatpflanzen untersucht.
Nach der Inokulation wurden alle Versuchspflanzen bei gesättigter Luftfeuchte
kultiviert, um zunächst einen 100 %-igen Befall zu erreichen. Dies geschah an Tag
sieben nach der Inokulation. Diese erste Phase unter gesättigten Luftfeuchten wurde,
den Versuchsgliedern entsprechend, bis zum Tag 18 nach Inokulation ausgeweitet.
MATERIAL UND METHODEN
26
Nach einer jeweils zwischengeschalteten Trockenphase von sieben beziehungsweise
acht Tagen bei normal vorherrschenden Luftfeuchten von 88 % relativer Luftfeuchte,
wurde die Pflanzenanzahl je Versuchsglied halbiert. Eine Hälfte der Pflanzen wurde
weiterhin „trocken“ (bei normal vorherrschender Luftfeuchte) und die andere Hälfte
erneut „feucht“ (bei gesättigter Luftfeuchte) kultiviert.
Pflanzen des Versuchsgliedes 08/15 wurden demnach wie folgt behandelt: die ersten
acht Tage nach der Inokulation wurden die Pflanzen unter gesättigter Luftfeuchte
kultiviert, dann folgte eine siebentägige Kultivierung bis Tag 15 nach Inokulation
unter normal vorherrschender Luftfeuchte und ab Tag 15 erfolgte eine Zweiteilung
der Versuchspflanzen. Das heißt, die Versuchspflanzen wurden bis Versuchende
(32 Tage nach der Inokulation) entweder weiterhin bei normal vorherrschender
Luftfeuchte „trocken“ beziehungsweise unter gesättigter Luftfeuchte „feucht“
kultiviert.
Pflanzen des Versuchsgliedes 10/18 wurden für die ersten zehn Tage unter
gesättigten Bedingungen kultiviert. Es folgte eine Kultivierung unter normal
vorherrschender
Luftfeuchte
(Trockenphase)
von
acht
Tagen
Dauer,
mit
anschließender Weiterkultivierung (ab Tag 18) entweder unter trockenen
beziehungsweise gesättigten Luftfeuchten, bis zum 32. Tag nach der Inokulation.
Entsprechendes gilt für die anderen Versuchglieder (12/19, 14/22 und 18/25). Die
erste Zahl steht für die erste Phase der Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte, die
zweite Zahl benennt den Tag nach Inokulation, ab dem die Versuchspflanzen
zweigeteilt wurden und entweder weiterhin „trocken“ beziehungsweise erneut
„feucht“ kultiviert wurden.
In einem weiteren Versuch unter Klimakammerbedingungen (20 °C für 14 Stunden
und 15 °C für zehn Stunden bei 16 Stunden Licht) wurden inokulierte
Feldsalatpflanzen bis zum sichtbaren Befall an allen Pflanzen (neun Tage nach
Inokulation) bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert. In der daran anschließenden
Trockenphase wurden alle Pflanzen der Versuchsglieder bei 88 % relativer
Luftfeuchte kultiviert und die darauffolgende, erneute Kultivierung der Pflanzen
unter gesättigter beziehungsweise normal vorherrschender Luftfeuchte (bei jeweils
der Hälfte der Pflanzen) wurde im wöchentlichen Abstand bis Tag 37 nach der
Inokulation ausgeweitet. Das heißt befallene, Symptom tragende Pflanzen wurden
MATERIAL UND METHODEN
27
bis 16, 23, 30 und 37 Tage nach Inokulation bei trockenen Bedingungen kultiviert.
Daran anschließend wurden die Hälfte der Pflanzen weiterhin trocken und die andere
Hälfte erneut unter gesättigten Luftfeuchten kultiviert (wie oben bereits beschrieben)
und zu verschiedenen Tagen nach der Inokulation bonitiert.
2.12.3.2
Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation
In einem zweiten Versuchsansatz wurde die Dauer der vorherrschenden Luftfeuchte
in der Klimakammer nach der Inokulation variiert. Die Klimakammer wurde dabei
auf Temperaturen von 20 °C für 14 Stunden und 15 °C für 10 Stunden bei
16 Stunden Licht eingestellt. Die Pflanzen wurden 0, 6, 9, 12, 24, 48 und 72 Stunden
nach der Inokulation unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Nach jeweils sieben
Tagen „Trockenheit“ bei 85 % relativer Luftfeuchte wurde die Hälfte der Pflanzen
der jeweiligen Versuchsglieder bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert.
Die Pflanzen wurden ab dem neunten Tag nach der Inokulation bonitiert. Bonitiert
wurden dabei sowohl die Pflanzen, die nach einer Trockenphase erneut bei
gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden, als auch die Pflanzen, die bis Versuchende
bei normal vorherrschender Luftfeuchte wuchsen. Die Bonitur von Pflanzen, die
zunächst für 48 und 72 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden, wurde
am neunten Tag nach der Inokulation lediglich an Pflanzen innerhalb der
Trockenperiode vorgenommen. Ab der zweiten Bonitur (13 dpi) wurden die Pflanzen
aus allen Varianten entweder als trocken oder feucht weiterkultiviert und bonitiert.
Dieser Versuch wurde ebenfalls bei einer konstanten Temperatur von 20 °C mit
12 Stunden Licht am Tag für die ersten 96 Stunden nach der Inokulation und danach
mit einem Tag/Nacht-Rhythmus von 20 °C Tag und 15 °C Nacht durchgeführt.
Als Vergleich zu beiden Temperaturvarianten wurden inokulierte Pflanzen, die über
die gesamte Zeit des Versuches dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert
wurden, ebenfalls hinsichtlich der Befallsstärke bonitiert.
MATERIAL UND METHODEN
2.12.4
Es
wurden
28
Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion
Feldsalatpflanzen
im
Laubblattstadium
mit
einzelnen
A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 16619, 552) in verschiedenen Konzentrationen
inokuliert und in der Klimakammer unter gesättigter Luftfeuchte aufgestellt. Die
Konzentration der Isolate lag dabei zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml. Zwischen
dem 5. und dem 19. Tag nach der Inokulation wurde die Anzahl an Symptom
tragenden Pflanzen ermittelt. Die Bewässerung erfolgte über das Anstauverfahren.
MATERIAL UND METHODEN
2.13
Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit
2.13.1
Einfluss der Sorte auf die Infektion
29
Es wurden für diesen Versuch die Sorten AV-2, AV-3, AV-4, AV-5, AV-6, AV-7,
AV-8, AV-9, AV-10, AV-11, AV-12, AV-14 und AV-15 der Züchterhäuser Clause
Tézier, Enza Zaden, Rijk Zwaan und Nunhems untersucht. Des Weiteren war die
Wildform V. rimosa (AV-13) Gegenstand der Untersuchungen zum Einfluss der
Sorte auf die Infektion. Die Aussaat fand am 16.11.2007 (erste Wiederholung) und
am 14.01.2008 (zweite Wiederholung) statt. Am 31. (1. Wiederholung)
beziehungsweise 35. (2. Wiederholung) Tag nach der Aussaat wurden die Pflanzen
im Laubblattstadium inokuliert. Für die Sprühinokulation wurde ein Isolategemisch
mit einer Konzentration von 106 cfu/ml verwendet. Die Pflanzen wurden für 18 Tage
bei gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus randomisiert kultiviert (zwischen 13 °C
und 24 °C bei 12 Stunden Kunstlicht im ersten Versuch, höhere Temperaturen
zwischen 20 °C bis 29 °C bei 12 Stunden Kunstlicht im zweiten Versuch) und
abschließend bezüglich Befallstärke und Befallshäufigkeit ausgewertet.
2.13.2
Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion
Um zu testen, ob einzelne Isolate unterschiedlicher Herkunft bei verschiedenen
Feldsalatsorten zu unterschiedlichen Symptomausprägungen führen, wurden drei
Sorten (AV-1, AV-5, AV-3) und eine Wildart V. rimosa (AV-13) im
Laubblattstadium mit jeweils vier Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) inokuliert. Nach
der Sprühinokulation (am 10.03.2009 in der ersten Wiederholung und am 30.03.2009
in der zweiten Wiederholung) wurden die Pflanzen in einer randomisierten
Blockanlage unter Gewächshausbedingungen (zwischen 9 °C und 34 °C in der ersten
Wiederholung beziehungsweise zwischen 2 °C und 45 °C in der zweiten
Wiederholung) bis Versuchende dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert.
Die Konzentration der am 10.03.2009 verwendeten Isolate belief sich auf 104 cfu/ml
(Isolate 16619, IV2) und 106 cfu/ml (Isolate: 6.1.a, 553). Bei der Inokulation 20 Tage
später wurde eine Konzentration von 105 cfu/ml für alle Isolate verwendet. Die
MATERIAL UND METHODEN
30
Endbonitur von Befallsstärke und Befallshäufigkeit fand für beide Wiederholungen
16 Tage nach der Inokulation statt.
2.13.3
Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion
In einem Versuch zum Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion
wurden Feldsalatpflanzen zweier unterschiedlicher Sorten (AV-9 und AV-5) und die
Wildart V. rimosa (AV-13) im Laubblattstadium mit einem Isolategemisch (aus
6.1.a, 16619, IV2, 553) inokuliert und anschließend unter gesättigter Luftfeuchte im
Gewächshaus aufgestellt. Die Konzentrationen der Inokula lagen dabei zwischen
102 cfu/ml und 106 cfu/ml. Es wurde an drei Boniturterminen (zwischen Tag sieben
und Tag 20) die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen ermittelt. Die Pflanzen
wurden über das Anstauverfahren bewässert.
MATERIAL UND METHODEN
2.14
31
Versuche zum Übertragungsweg von Acidovorax
valerianellae
2.14.1
Boden
Bei der Überprüfung, wie lange das Bakterium im Boden überdauern kann, wurden
am 09.09.2009 nicht-infiziertes und infiziertes Blattmaterial mit A. valerianellae
jeweils in Boden (Schifferstadt, Pfalz, Deutschland) eingemischt. Die Böden wurden
anschließend in Containern im Erdreich eingesenkt (Abb. 2.5). Damit sollten die
natürlichen Bodenverhältnisse in Abhängigkeit der bodenbiologischen Aktivität und
Umsetzung mit der gegebenen Witterung nachgeahmt werden. Der Nachweis
erfolgte im monatlichen Abstand durch die Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte
AV-1) in Proben dieser Böden (Abb. 2.6), die jeweils in Einheiten von ca. 800 g
Boden entnommen wurden. In vier Reihen wurden jeweils 15 Samen abgelegt und
mit Perlitte abgedeckt. Die sich entwickelnden Pflanzen wurden in der Klimakammer
bei 20 °C Tag- und 15 °C Nachttemperatur bei 16 Stunden Licht unter gesättigten
Luftfeuchten bis Versuchende (etwa 12 Wochen nach der jeweiligen Aussaat)
inkubiert. Die Pflanzen wurden bei Bedarf gegossen, so dass es teilweise zum
Hochspritzen von Bewässerungstropfen und Bodenpartikeln kommen konnte.
Blattbereiche mit für A. valerianellae typischen Symptomen wurden mittels TASELISA auf einen A. valerianellae-Befall untersucht.
Dieser Versuchsansatz wurde mit Boden vom Julius Kühn-Institut, Quedlinburg,
Deutschland freundlicherweise von Frau Katja Thiele im März 2010 für die Dauer
von acht Monaten wiederholt.
MATERIAL UND METHODEN
32
Abbildung 2.5: Container mit kontaminiertem und nicht
kontaminiertem
infiziertem
und
Boden
(durch
infiziertem
Einarbeitung
Blattmaterial)
für
von
nicht-
sukzessive
Probenentnahme (einmal pro Monat) über einen Zeitraum von
bis zu einem Jahr (Standort Schifferstadt, Deutschland).
MATERIAL UND METHODEN
33
Abbildung 2.6: Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte Favor) in mit
A. valerianellae kontaminierten und nicht-kontaminierten Boden (durch
Einarbeitung
von nicht-infiziertem und infiziertem Blattmaterial)
zur
Überprüfung der Überdauerung von A. valerianellae-Bakterien im Boden. Die
Abdeckung der Samen erfolgte mit Perlitte.
2.14.2
Um
Alternative Wirtspflanzen
den
Wirtspflanzenkreis
von
A. valerianellae
einzugrenzen,
wurden
Infektionsversuche mit verschiedenen Pflanzenarten durchgeführt. Als mögliche
Wirtspflanzen von A. valerianellae wurden Gemüse- und Ackerbaukulturen, die in
einem unter Praxisbedingungen vorkommenden Fruchtwechsel mit Feldsalat
angebaut werden, sowie verschiedene Unkräuter geprüft. Der Befall potentieller
alternativer Wirtspflanzen wurde zunächst visuell und später mittels TAS-ELISA
geprüft.
MATERIAL UND METHODEN
2.14.2.1
34
Alternative Wirtspflanzen I
In einem ersten Versuch wurde bei einem breiten Artenspektrum (Tab. 2.2) und
Feldsalat als anfälligem Standard in einzelne Blätter die A. valerianellae-Suspension
eines Isolategemisches mit einer Konzentration von 108 cfu/ml infiltriert und auf die
gesamte Pflanze gesprüht. Anschießend erfolgte die Kultivierung der Pflanzen bei
gesättigter Luftfeuchte in der Klimakammer (20 °C Tag-, 15 °C Nachttemperatur bei
16 Stunden Licht). Zwischen dem 1. Tag und 20. Tag nach Infiltration
beziehungsweise Sprühinokulation wurden die Pflanzen auf eine Veränderung der
Blattstrukturen im Vergleich zur Kontrolle (Infiltration und Sprühinokulation mit
0,85 %-iger Natriumchloridlösung) visuell überprüft. Die Überprüfung erfolgte dabei
sowohl an infiltrierten Blattbereichen als auch an Blattbereichen, die durch Sprühen
inokuliert wurden.
MATERIAL UND METHODEN
35
Tab 2.2: Verwendete Pflanzen aus elf Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als alternative
Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Infiltration und Sprühinokulation.
1
diese Pflanzen konnten aufgrund der kleinen Blattfläche nicht in einzelne Blätter infiltriert
werden.
Familie
Art
Valerianaceae
Valerianella locusta (L.)
(Baldriangewächse)
(Feldsalat)
Amaranthus retroflexus (L.)
(Zurückgekrümmter Fuchsschwanz)
Amaranthaceae
Chenopodium hybridum (L.)
(Fuchsschwanzgewächse)
(Bastard-Gänsefuß)
Chenopodium album (L.)
(Weißer Gänsefuß)
Lactuca sativa (L.)
(Batavia-Salat)
Lactuca sativa (L.)
Asteraceae
(Eissalat)
(Korbblütler)
Matricaria chamomilla (L.)1
(Kamille)
Senecio vulgaris (L.)
(Gemeines Kreuzkraut)
Brassica rapa ssp. pekinensis (Lour.) Hanelt
Brassicaceae
(Chinakohl)
(Kreuzblütengewächse)
Capsella bursa-pastoris (L.) Medik.
(Hirtentäschel)
Caryophyllaceae
Stellaria media (L.) Vill.
(Nelkengewächse)
(Vogelmiere)
Phaseolus vulgaris (L.)
Fabaceae
(Buschbohne)
(Hülsenfrüchtler)
Pisum sativum (L.)
(Markerbse)
MATERIAL UND METHODEN
36
Tab 2.2 – Fortsetzung:
Familie
Art
Hydrophylloideae
Phacelia tanacetifolia (Juss.)1
(Wasserblattgewächse)
(Rainfarn-Phacelie)
Lamiaceae
Lamium album (L.)
(Lippenblütler)
(weiße Taubnessel)
Plantago major (L.)
Plantaginaceae
(Breitwegerich)
(Wegerichgewächse)
Veronica persica (Poir.)
(Persischer Ehrenpreis)
Poaceae
Eleusine coracana (L.) Gaertn.
(Süßgräser)
(Fingerhirse)
Portulaceae
Portulaca oleracea (L.)
(Portulakgewächse)
(Portulak)
MATERIAL UND METHODEN
2.14.2.2
37
Alternative Wirtspflanzen II
In einem zweiten Versuch wurden Pflanzen aus sechs Familien (Tab. 2.3) und
Feldsalat
als
anfälligem
Standard
mittels
Sprühinokulation
mit
einer
A. valerianellae-Suspension eines Isolategemisches mit einer Konzentration von
108 cfu/ml inokuliert. Für die ersten 48 Stunden sowie 28 bis 30 Tage nach
Inokulation wurden die Pflanzen bei gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus
kultiviert. Am 10. Tag nach der Inokulation sowie am 25. und 30. Tag nach der
Inokulation wurden die Pflanzen visuell auf eine Veränderung in der Blattstruktur
bonitiert.
Als
Vergleich
wurden
entsprechende
mit
Natriumchloridlösung inokulierte Kontrollpflanzen herangezogen.
0,85
%-iger
MATERIAL UND METHODEN
38
Tab 2.3: Verwendete Pflanzen aus sieben Familien zur Überprüfung der Eignung als
Wirtspflanzen von A. valerianellae (Alternative Wirtspflanzen II) nach Sprühinokulation.
Familie
Art
Valerianaceae
Valerianella locusta (L.)
(Baldriangewächse)
(Feldsalat)
Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.)
Amaranthaceae
(Rote Bete)
Spinacia oleracea (L.)
(Fuchsschwanzgewächse)
(Spinat)
Foeniculum vulgare (L.) Mill.
Apiaceae
(Doldenblütler)
(Fenchel)
Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Schübl. et G.
Martens (Möhre)
Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill
(Petersilie, glatt und kraus)
Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.)
(Ölrettich)
Raphanus sativus subsp. sativus (L.)
Brassicaceae
(Kreuzblütengewächse)
(Radies)
Raphanus sativus (L.)
(Rettich)
Eruca sativa (L.)
(Rucola)
Phaseolus vulgaris (L.)
Fabaceae
(Hülsenfrüchtler)
(Buschbohne)
Pisum sativum (L.)
Poaceae
(Markerbse)
Zea mays (L.)
(Süßgräser)
Solanaceae
(Mais)
Capsicum annuum (L.)
(Nachtschattengewächse)
(Paprika)
MATERIAL UND METHODEN
2.14.2.3
39
Alternative Wirtspflanzen III
In einem dritten Versuchsansatz wurde geprüft, wie lange das Bakterium in sieben
Pflanzenarten aus fünf Familien (Tab. 2.4) lebensfähig ist und ob diese Pflanzen als
potentielle Wirte für das Bakterium geeignet sind. Dazu wurde in jeweils acht Blätter
jeder Versuchspflanze sowie Feldsalat als anfälligem Standard eine A. valerianellaeSuspension aus einem Isolategemisch mit der Konzentration von 108 cfu/ml injiziert.
Die Injektion erfolgte über Nadelstiche nur auf einer Blatthälfte. Als Kontrolle wurde
0,85 %-ige Natriumchloridlösung in Blatthälften weiterer Versuchspflanzen infiziert.
Die Pflanzen wurden insgesamt fünf Wochen auf Veränderungen im Vergleich zur
Kontrolle untersucht. Die ersten 12 Tage nach der Inokulation wurden die Pflanzen
bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert, um den Bakterien eine optimale Umgebung zu
bieten. Danach erfolgte die Kultur bei der im Gewächshaus vorherrschenden
Luftfeuchtigkeit. Nach 12 Tagen unter gesättigten Bedingungen erfolgte eine erste
Untersuchung der inokulierten Blätter. Der Nachweis lebensfähiger Bakterien
erfolgte über Ausplattieren von Pflanzensaftproben von den mit 70 %-igem Alkohol
oberflächendesinfizierten, injizierten und den nicht-injizierten Blatthälften auf KBAgarschalen
(plus
Cycloheximid).
Gewachsene
Bakterienkolonien
wurden
anschließend näher charakterisiert (Fluoreszenz, Gramreaktions-Test, Mikrobiologie
Bactident® Oxidase-Test, Hypersensitivitätsreaktion, indirekter TAS-ELISA).
Die Pflanzen wurden über die Dauer des Versuches so gegossen, dass die injizierten
Blattbereiche weder berührt noch feucht wurden.
MATERIAL UND METHODEN
40
Tab. 2.4: Verwendete Pflanzen aus sechs Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als
alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Stichinokulation.
Familie
Art
Valerianaceae
Valerianella locusta (L.)
(Baldriangewächse)
(Feldsalat)
Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.)
Amaranthaceae
(Rote Bete)
(Fuchsschwanzgewächse)
Spinacia oleracea (L.)
(Spinat)
Apiaceae
Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill
(Doldenblütler)
(Petersilie, kraus)
Asteraceae
Lactuca sativa (L.)
(Korbblütler)
(Eissalat)
Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.)
(Ölrettich)
Brassicaceae
Raphanus sativus subsp. sativus (L.)
(Kreuzblütengewächse)
(Radies)
Raphanus sativus (L.)
(Rettich)
Phaseolus vulgaris (L.)
Fabaceae
(Buschbohne)
(Hülsenfrüchtler)
Pisum sativum (L.)
(Markerbse)
2.14.3
Saatgut
Um zu überprüfen, ob es bei der Saatgutproduktion von mit A. valerianellaeinfiziertem Saatgut der Sorte AV-75 zu einer Übertragung des Bakteriums auf die
Tochtergeneration kommt, wurde je ein Versuch in den Jahren 2007, 2008 und 2009
angelegt. Im Vergleich dazu wurde jedes Mal eine nicht-infizierte Saatgutpartie der
Sorte AV-60 ausgesät und ebenfalls bis zur Saatgutproduktion kultiviert.
MATERIAL UND METHODEN
41
Die Aussaat des Feldsalates erfolgte sowohl im Jahr 2007 als auch im Jahr 2008 im
Monat Mai in einem Folienhaus mittels Feldsaatmaschine Type Miniair S der Firma
Accord-Landmaschinen H. Weiste & Co. GmbH, Soest, Deutschland. Jede
Saatgutpartie wurde in einem Abstand von 4,2 cm in der Reihe und 12,5 cm
zwischen den Reihen ausgesät (10 Reihen je Saatgutpartie), wobei zuerst die nichtinfizierte Partie in die Erde abgelegt wurde, um ein Verschleppen bei der Aussaat zu
verhindern. Um eine Übertragung von A. valerianellae mittels Spritzwasser bei der
Beregnung (Gießwagen) zu vermeiden wurden zwischen den infizierten und nichtinfizierten Saatgutpartien Folienzäune in Höhe von einem Meter aufgebaut
(Abb. 2.7, Abb. 2.9).
Der Versuch zur Saatgutproduktion mit Aussaat im Jahr 2007 wurde zusätzlich in
Frankreich im Freiland durchgeführt. Die Fläche wurde von der Firma Enza Zaden,
Allonnes, Frankreich zur Verfügung gestellt. Die Versuchsdurchführung (Aussaat,
Beregnung, Bonitur, Ernte) wurde freundlicherweise von den dort ansässigen
Mitarbeitern durchgeführt. Die Beregnung erfolgte zusätzlich zu natürlichem Regen
über Kreisregner. Ein Folienzaun wurde nicht aufgebaut (Abb. 2.8).
Die Aussaat für die Saatgutproduktion 2009 erfolgte im November 2009 mittels einer
Handsämaschine HS der Firma Sembdner Maschinenbau GmbH, Germering,
Deutschland in einem Gewächshaus, wobei die Kornablage wie in den Aussaatjahren
zuvor erfolgte (4,2 cm in der Reihe, 12,5 cm zwischen den Reihen). Begonnen wurde
auch hier mit der Aussaat der nicht-infizierten Saatgutpartie. Beide Saatgutpartien
wurden gebeizt verwendet (Beize aus Thiram, Metalaxyl und Iprodion). Die
Wasserversorgung der Pflanzen erfolgte zum einen über Kopf mit Kreisregnern
(das heißt plus Spritzwasser) zum anderen über Tropfbewässerung (das heißt ohne
Spritzwasser). Um eine Übertragung von A. valerianellae mittels Spritzwasser zu
vermeiden,
wurde
sowohl
zwischen
der
infizierten
und
nicht-infizierten
Saatgutpartie, die über Kopf beregnet wurde, ein ein Meter hoher Folienzaun
aufgebaut
als
auch
zwischen
den
Varianten
Kopfberegnung
und
Tropfschlauchbewässerung (die Zaunhöhe entsprach hier der Gewächshaushöhe,
Abb. 2.10).
MATERIAL UND METHODEN
42
Die Feldsalatpflanzen wurden für die Dauer der Saatgutproduktion auf einen
A. valerianellae-Befall hin visuell überprüft und die Befallshäufigkeit (%) gezählt
(Aussaat im Jahr 2007, Deutschland und Frankreich) beziehungsweise geschätzt
(Aussaat in den Jahren 2008 und 2009, Deutschland).
Die Ernte der Samen fand in den Jahren nach der Aussaat im Mai beziehungsweise
Juni statt. Das Saatgut wurde nach der Trocknung zunächst für vier bis acht Wochen
bei 4 °C gelagert, anschließend gereinigt und bis zur weiteren Verwendung bei
Raumtemperatur aufbewahrt. Die Saatgutpartien (Abb. 2.11) wurden mit
verschiedenen Verfahren (siehe 2.15.1) auf Kontamination beziehungsweise
Befallsfreiheit geprüft. Parallel wurden bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan
die dort etablierten Routineprüfungen (Sweatbox-Test, anschließend Nachweis mit
PCR) auf A. valerianellae-Befall durchgeführt (siehe 2.15.1.4).
Die Bodenart in den Häusern war ein sandiger Lehm.
MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 2.7: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus
gesundem (rechts) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut
(links) mit Aussaat im Jahr 2007 im Folienhaus in Deutschland.
Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über Kopf.
43
MATERIAL UND METHODEN
Abbildung 2.8: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem
(links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr
2007 im Freiland in Frankreich. (Foto: A. Schieder, Enza Zaden)
Abbildung 2.9: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem
(links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im
Jahr 2008 im Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen
Folienzaun. Beregnung über Kopf.
44
MATERIAL UND METHODEN
45
A
B
Abbildung 2.10: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem
und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut mit Aussaat im Jahr 2009 im
gleichen Schiff eines Gewächshauses, Abgrenzung durch Folienzäune. (A):
Wasserversorgung
kontaminiertes
mittels
Saatgut
Kreisregner,
links.
(B):
gesundes
Saatgut
Wasserversorgung
rechts,
mittels
Tropfbewässerung, gesundes Saatgut links, kontaminiertes Saatgut rechts.
MATERIAL UND METHODEN
46
Ausgangssaatgut
AV-60 (gesund)
Aussaatjahr
2007
AV-61
(Deutschland)
AV-63
(Frankreich)
AV-76
(Deutschland)
AV-78
(Frankreich)
aus AV-60
aus AV-60
aus AV-75
aus AV-75
Aussaatjahr
2008
Aussaatjahr
2009
(Verwendung
von gebeiztem
Saatgut)
Ausgangssaatgut
AV-75 (kontaminiert)
AV-62
AV-77
aus AV-60
aus AV-75
AV-64
(Tröpfchen)
AV-65
(Regner)
AV-79
(Tröpfchen)
AV-80
(Regner)
aus AV-60
(gebeizt)
aus AV-60
(gebeizt)
aus AV-75
(gebeizt)
aus AV-75
(gebeizt)
Abbildung 2.11: Benennung der gewonnenen Saatgutpartien aus der gesunden FeldsalatSaatgutpartie (AV-60, Ausgangssaatgut) und einer kontaminierten Feldsalat-Saatgutpartie
(AV-75, Ausgangssaatgut) mit Aussaaten in verschiedenen Jahren (2007 bis 2009). Die
Vermehrung des Ausgangssaatguts fand mit Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland und
Frankreich statt, mit Aussaat im Jahr 2008 in Deutschland. Mit der Aussaat im Jahr 2009
wurde das Ausgangssaatgut gebeizt verwendet, die Bewässerung erfolgte über das
Tröpfchenverfahren und über Kopf mit Kreisregnern.
MATERIAL UND METHODEN
47
2.15
Saatgutuntersuchungen
2.15.1
Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut
Alle verwendeten Saatgutpartien sowie die neu gewonnenen Partien aus der
Saatgutproduktion (siehe 2.14.3) wurden mittels verschiedener Methoden auf eine
A. valerianellae-Kontamination hin untersucht.
2.15.1.1
Sweatbox-Test in der Klimakammer
Für den Sweatbox-Test wurden in geschlossenen Kunststoff-Schalen zwei Liter
Vermiculit ausgebracht und mit 1000 ml Wasser befeuchtet (Abb. 2.12). 5000 Samen
je Saatgutpartie und Schale wurden großflächig ausgebreitet und abschließend mit
einer Vermiculit-Schicht von einem Liter bedeckt. Die Schalen wurden bei nahezu
100 % rel. Luftfeuchte bei 18 °C Nacht- (12 Stunden) und 25 °C Tagtemperaturen
(12 Stunden, mit Licht) für bis zu 28 Tage aufgestellt. Nach dem Auflaufen wurde
eine erste Befallshäufigkeit je Schale geschätzt. Bis Versuchende (28 Tage) nach
Aussaat erfolgten weitere Bonituren der Befallshäufigkeit. Pflanzen mit verdächtigen
Symptomen wurden im indirekten TAS-ELISA geprüft.
MATERIAL UND METHODEN
48
Abbildung 2.12: Sweatbox zum Nachweis von A. valerianellae am Saatgut.
(Foto: P. Krämer)
2.15.1.2
Aufwuchstest im Gewächshaus
Das auf einen A. valerianellae Befall zu überprüfende Saatgut wurde in
Erdpresstöpfe ausgesät. Mit Beginn des sich entwickelnden Laubblatts (ca. drei bis
vier Wochen nach der Aussaat) wurden die Pflanzen für bis zu 55 Tage bei
gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus kultiviert. Die Pflanzen wurden visuell auf
einen Befall mit A. valerianellae-Symptomen hin begutachtet (Abb. 2.13). Die
Beobachtung der Befallshäufigkeit wurde bis zum Versuchende fortgeführt.
Auffällige Pflanzen wurden mittels indirekten TAS-ELISA untersucht.
MATERIAL UND METHODEN
49
Abbildung 2.13: Aufwuchstest im Gewächshaus zum Nachweis von
A. valerianellae am Saatgut.
2.15.1.3
Ankeimmethode auf Papier
0,2 g der auf A. valerianellae-Befall zu untersuchenden Saatgutpartien wurden mit
0,3 ml Probenpuffer homogenisiert (Tag null) und eingefroren. Am gleichen Tag
wurden die Samen (zu je 0,2 g) in jeweils drei Petrischalen, die zuvor mit
Leitungswasser angefeuchtetem Filterpapier auslegt worden waren, ausgesät und bei
Raumtemperatur (zwischen 20 °C und 22 °C) inkubiert. Nach vier, neun und
14 Tagen nach der Aussaat wurden diese Samen beziehungsweise Keimlinge mit
jeweils 0,3 ml Probenpuffer homogenisiert und ebenfalls eingefroren. Eine
Untersuchung der gewonnenen Proben wurde zum gleichen Zeitpunkt mittels
indirektem TAS-ELISA durchgeführt, indem Proben als Zweifachbestimmung
aufgetragen, gemessen und gemittelt wurden (siehe Kapitel 2.3.5).
2.15.1.4
Bestimmungen durch Fremdfirmen
Die Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan untersuchten dankenswerterweise das
Saatgut aus der Saatgutproduktion mittels dort etablierter Routineprüfungen auf
einen A. valerianellae-Befall (Sweatbox-Test mit anschließender PCR verdächtiger
MATERIAL UND METHODEN
50
Pflanzen mit A. valerianellae-Symptomen). Über genauere Informationen zur
Methode geben die Firmen Auskunft.
2.15.2
Dekontaminationsmaßnahmen (Warmwasserbehandlung
und Dampfdesinfektion)
Zur Prüfung von Dekontaminationsmaßnahmen am Saatgut wurden die Samen der
Sorten AV-220 (gesund), AV-17 (kontaminiert) und AV-219 (kontaminiert) bei einer
Warmwasserbehandlung in einen Teebeutel verpackt und in einem Wasserbad für
eine bestimmte Zeit mit einer definierten Temperatur eingetaucht (Tab. 2.5). Nach
dem Tauchen wurden die Samen zunächst zwischen eine Lage Handtücher gelegt,
um überschüssiges Wasser zu entfernen. Anschließend wurden die Samen bei 27 °C
und ca. 30 % rel. Luftfeuchte für 24 bis 48 Stunden zurückgetrocknet.
Alle Samen wurden nach erfolgter Behandlung auf ihre Keimfähigkeit hin überprüft
sowie mit der Ankeimmethode auf Papier und anschließendem TAS-ELISA auf eine
Reduktion
beziehungsweise
Eliminierung
der
A. valerianellae-Kontamination
untersucht (siehe Kapitel 2.15.1.3).
Die Interpretation der OD-ELISA-Werte wurde wie folgt durchgeführt: die
Mittelwerte der Tage null der jeweiligen Behandlung wurden als Schwellenwerte für
die nachfolgenden Mittelwerte der Tage vier, neun und vierzehn jeder Behandlung
herangezogen. Einzelne Probenwerte (unabhängig vom Aussaattermins), die deutlich
über diesem Schwellenwert lagen, galten als weiterhin A. valerianellae-positive
Werte und die Probe war noch immer mit A. valerianellae belastet und nicht
dekontaminiert.
Des Weiteren konnte dankenswerterweise auf zwei andere Arbeitsweisen
zurückgegriffen werden. Bei der ersten Methode handelte es sich um eine
Dampfdesinfektionsmaßnahme des Eidgenössischen Volkswirtschaftsdepartement
EVD, Forschungsanstalt Agroscope Changins-Wädenswil ACW, bei der die Samen
der Sorten AV-220, AV-17 und AV-219 einer Applikationstemperatur von 66 °C für
90 beziehungsweise 105 Sekunden oder bei 64 °C für 120 beziehungsweise
150 Sekunden ausgesetzt waren. Anschließend wurden die Samen bei 25 - 28 °C für
36 Stunden rückgetrocknet.
MATERIAL UND METHODEN
51
Die zweite Methode wurde von einer für Saatgut spezialisierten Firma durchgeführt.
Zu der Methode können allerdings keine weiteren Angaben gemacht werden, da sie
ein Betriebsgeheimnis der Firma ist.
Abschließend fanden auch hier eine Überprüfung der Keimfähigkeit sowie die
dekontaminierende Wirkung der Methode mittels Ankeimmethode auf Papier und
TAS-ELISA statt.
Tabelle 2.5: Verwendete Temperaturen (°C) und Inkubationszeiten (Minuten) bei einer
Warmwasserbehandlung von Feldsalatsaatgut.
Warmwasserbehandlung
Temperatur (°C)
Zeit (Minuten)
43
20
47
45
50
10
50
20
55
10
55
20
60
5
ERGEBNISSE
52
3
ERGEBNISSE
3.1
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen
3.1.1
Einfluss der Temperatur auf die Infektion (in vivo)
Bei den Untersuchungen wurden Feldsalatpflanzen am vierten, sechsten, zehnten und
zwölften Tag nach Inokulation (dpi) bonitiert, um den Einfluss der Temperatur auf
die Infektion zu erfassen (Kapitel 2.12.1). Sowohl Befallsstärke als auch
Befallshäufigkeit stiegen im zeitlichen Verlauf in allen drei Temperaturvarianten an.
Dabei
stiegen
die
Befallsstärke
sowie
Befallshäufigkeit
mit
der
Inkubationstemperatur an. Pflanzen, die bei 10 °C kultiviert wurden, erreichten zwölf
Tage nach der Inokulation eine maximale Befallstärke von 3,3 % und eine
Befallshäufigkeit von 60 %, während Pflanzen, die bei 20 °C kultiviert wurden, eine
Befallstärke von 13,8 % und eine Befallshäufigkeit von 98,3 % erreichten. Zwölf
Tage nach der Inokulation konnten Pflanzen, die bei 30 °C wuchsen, nicht mehr
ausgewertet werden, da diese den hohen Temperaturen bei gesättigter Luftfeuchte
nicht standhielten. Zehn Tage nach der Inokulation fand bei der 30 °C-Variante die
letzte Bonitur statt, bei der die Pflanzen eine maximale Befallsstärke von 18,2 % und
Befallshäufigkeit von 96,7 % erreichten (Abb. 3.1).
In einer zweiten Wiederholung wurden lediglich die Pflanzen, die bei Temperaturen
von 10 °C und 20 °C wuchsen, bonitiert. Die Pflanzen, die bei 30 °C kultiviert
wurden, brachen bereits vor der ersten Bonitur zusammen und konnten somit nicht
zur Auswertung herangezogen werden. Die Bonituren fanden nach zehn, 14, 19 und
25 Tagen statt. 25 dpi war bei Pflanzen, die bei 20 °C kultiviert wurden, eine
Schätzung der Befallsstärke nicht mehr möglich, da sie stark mit Echtem Mehltau
befallen waren. Die Befallsstärke stieg bei Pflanzen, die bei 10 °C inkubiert wurden,
von 0,3 % am zehnten Tag nach der Inokulation auf 5,5 % am 25. Tag nach der
Inokulation konstant an. Ebenso stieg der Wert der Symptom tragenden Blattfläche
bei Pflanzen, die bei 20 °C inkubiert wurden, an. Der Anteil an Symptom tragenden
Pflanzen betrug am zehnten Tag nach der Inokulation 18,3 % und stieg über die
Dauer des Versuches an, wobei die Pflanzen aus dieser Gruppe an einzelnen
Boniturtagen eine etwas höhere Anzahl an infizierten Pflanzen aufwiesen als die
ERGEBNISSE
53
Pflanzen aus der Gruppe, die bei 10 °C inkubiert wurden (Abb. 3.2). Tendenziell
verhielten sich die Ergebnisse aus der ersten und der zweiten Wiederholung gleich:
Bei höheren Temperaturen waren sowohl Befallsstärken als auch Befallshäufigkeiten
höher, allerdings war der Befall in der zweiten Wiederholung zeitlich deutlich
verzögert gegenüber der ersten Wiederholung. Erste Symptome waren hier nicht wie
bei der ersten Wiederholung bereits nach vier Tagen nach der Inokulation sichtbar,
sondern erst 10 dpi. Des Weiteren war der Befall in der zweiten Wiederholung
deutlich vermindert.
Um zu überprüfen, wie der Einfluss von Temperaturen von 15 °C und 25 °C
hinsichtlich Befallsstärke und Befallshäufigkeit auf die Infektion war, wurden
Feldsalatpflanzen mit einem Isolategemisch (Konzentration 109 cfu/ml) inokuliert
und bei den genannten Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. In der
ersten Wiederholung wurden die Pflanzen zwischen Tag vier und Tag 14 nach der
Inokulation bonitiert. Die Befallsstärke und die Befallshäufigkeit stiegen bei beiden
Inkubationstemperaturen mit zunehmender Dauer unter gesättigter Luftfeuchte an,
wobei erste Symptome bei Pflanzen, die bei 25 °C kultiviert wurden, vier Tage
früher sichtbar waren als bei Pflanzen, die bei 15 °C kultiviert wurden. Zudem
erreichten sowohl Befallsstärke als auch Befallshäufigkeit von inokulierten Pflanzen,
die bei höheren Temperaturen kultiviert wurden, höhere Werte. So wurden bereits
10 dpi eine Befallsstärke von 19,7 % und eine Befallshäufigkeit von 96,7 % erreicht,
im
Vergleich
zu
5,6 %
beziehungsweise
70 %
bei
der
niedrigeren
Inkubationstemperatur von 15 °C. 14 Tage nach der Inokulation wurden lediglich die
Pflanzen, die bei einer niedrigeren Temperatur kultiviert wurden, zur Auswertung
herangezogen. Pflanzen, die bei 25 °C kultiviert wurden, waren 14 dpi zu stark mit
Echtem Mehltau befallen und konnten nicht bonitiert werden (Abb. 3.3).
In der zweiten Wiederholung wurden diese Ergebnisse weitestgehend bestätigt:
Pflanzen, die bei höheren Inkubationstemperaturen kultiviert wurden, zeigten höhere
Befallsstärken und Befallshäufigkeiten als Pflanzen, die bei 15 °C inkubiert wurden.
Zudem lagen die Werte in dieser zweiten Wiederholung insgesamt über denen, die
bei der ersten Wiederholung erreicht wurden.
ERGEBNISSE
54
Vier Tage nach der Inokulation waren bei 25 °C Inkubationstemperatur auch hier die
ersten Symptome sichtbar und somit zwei Tage früher als bei Pflanzen, die einer
Temperatur von 15 °C ausgesetzt waren. 17 Tage nach der Inokulation waren alle
Pflanzen bei einer Inkubationstemperatur von 25 °C infiziert und zeigten knapp 30 %
Symptome auf der Blattfläche, während Pflanzen, die bei 15 °C kultiviert wurden,
lediglich eine Befallsstärke von 15 % und eine Befallshäufigkeit von 95 % zeigten
(Abb. 3.4).
Die Temperatur besaß einen Einfluss auf die Infektion. Je höher die Temperatur war,
bei der inokulierte Pflanzen kultiviert wurden, desto höher waren auch Befallsstärken
und Befallshäufigkeiten. Beide Parameter nahmen innerhalb jeder gewählten
Temperaturstufe, mit fortschreitender Dauer nach der Inokulation, zu.
Es waren bei allen Temperaturstufen zwischen 10 °C und 30 °C nach der Inokulation
Symptome an Feldsalatpflanzen sichtbar, eine Infektion demnach möglich.
ERGEBNISSE
Befallsstärke in %
A
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
55
b
b
b
ab
b
ab
ab
ab
a
a
a
10 °C
20 °C
30 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
B
6 dpi
b
100
Befallshäufigkeit in %
90
12 dpi
b
b
b
80
70
ab
ab
ab
60
50
40
10 dpi
a
ab
a
a
30
20
10
0
10 °C
20 °C
30 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
6 dpi
10 dpi
12 dpi
Abbildung 3.1: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6, 10
und 12 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml).
Bei 30 °C konnte keine Bonitur nach zwölf Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen
abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben (Boniturtage) sind nicht
signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns
Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
Befallsstärke in %
A
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
56
bc
c
b
ab
ab
a
a
10 °C
20 °C
Inkubationstemperatur
10 dpi
B
19 dpi
25 dpi
c
100
90
Befallshäufigkeit in %
14 dpi
80
70
a
b
a
60
a
50
40
a
a
30
20
10
0
10 °C
20 °C
Inkubationstemperatur
10 dpi
14 dpi
19 dpi
25 dpi
Abbildung 3.2: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 10,
14, 19 und 25 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration
109 cfu/ml).
Bei 20 °C konnte keine Bonitur nach 25 Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen
abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant
voneinander verschieden. Die Daten der Inkubationstemperatur von 20 °C wurden mit dem
Kruskal-Wallis-Test
(Dunns
Prozedur)
verrechnet
(p
<
0,05).
Die
Daten
der
Inkubationstemperatur von 10 °C wurden mit dem Tukey`s HSD-Test verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
A
57
35
30
Befallsstärke in %
b
25
ab
20
b
15
ab
b
10
a
5
a
0
15 °C
25 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
B
10 dpi
14 dpi
b
100
ab
b
b
90
Befallshäufigkeit in %
8 dpi
a
80
ab
70
60
50
40
30
20
10
a
0
15 °C
25 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
8 dpi
10 dpi
14 dpi
Abbildung 3.3: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4,
8, 10 und 14 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration
109 cfu/ml).
Bei 25 °C konnte keine Bonitur nach 14 Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen
abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant
voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns
Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
A
58
b
35
30
Befallsstärke in %
ab
25
ab
20
c
15
ab
bc
abc
10
5
a
ab
a
0
15 °C
25 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
B
b
Befallshäufigkeit in %
100
90
6 dpi
b
10 dpi
b
12 dpi
a
17 dpi
a
a
a
a
80
70
60
50
40
ab
30
20
10
a
0
15 °C
25 °C
Inkubationstemperatur
4 dpi
6 dpi
10 dpi
12 dpi
17 dpi
Abbildung 3.4: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von
A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6,
10, 12 und 17 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration
109 cfu/ml).
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
3.1.2
59
Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die
Infektion
Der Einfluss des Balttalters sowie der Blattnässedauer auf die Ausprägung von
Symptomen nach Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae wurde in
den hier vorgestellten Untersuchungen geprüft (Kapitel 2.12.2).
Bei der einmaligen Kultur für 48 Stunden nach Inokulation unter gesättigter
Luftfeuchte waren weder an den Keimblättern noch an den Laubblättern
A. valerianellae typische Symptome erkennbar (Abb. 3.5).
Bei einer wöchentlich wiederkehrenden Kultur unter gesättigter Luftfeuchte von
48 Stunden zeigten viele der inokulierten Pflanzen im Laubblattstadium Symptome.
Bereits neun Tage nach der Inokulation waren 16 Pflanzen befallen und zeigten
Symptome (Abb. 3.5 B). Bei Pflanzen, die im Keimblattstadium inokuliert wurden,
zeigten sich 16 Tage nach der Inokulation die ersten Symptome (an zwei Pflanzen).
Ein Wert von maximal vier Symptom tragenden Pflanzen wurde aber über die Dauer
von 35 Tagen nicht überschritten (Abb. 3.5 A). Die Befallshäufigkeit nahm sowohl
bei Pflanzen im Keimblattstadium als auch bei Pflanzen im Laubblattstadium nach
21 dpi ab und stieg bei Pflanzen im Laubblattstadium bis zu Versuchende leicht
wieder an.
Eine dauerhafte Abdeckung unter gesättigter Luftfeuchte hatte den größten Einfluss
auf die Symptomausprägung. Pflanzen, die im Keimblattstadium inokuliert wurden,
zeigten bereits nach fünf Tagen erste Symptome, wobei der Anteil an Symptom
tragenden Pflanzen 12 dpi stark anstieg, 23 dpi waren alle Pflanzen befallen und
zeigten Symptome (Abb. 3.5 A). Bei Pflanzen, die im Laubblattstadium inokuliert
wurden, zeigten sich erste Symptome bereits nach vier Tagen und alle Pflanzen
wiesen 11 dpi typische Krankheitssymptome auf (Abb. 3.5 B).
ERGEBNISSE
60
A 100
b
b
b
b
b
b
b
b
b
b
Befallshäufigkeit in %
90
80
70
b
60
50
40
30
20
10
ab
b
a
bb
b
ab
a
b
b
b
a
a
b
a
b
a
b
a
b
a
a
b
a
b
a
0
5
8
12
14
16
19
21
23
26
28
30
33
35
bb
bb
bb
Tage nach Inokulation
einmalig
b
B 100
b
Befallshäufigkeit in %
90
b
b
b
b
b
wöchentlich
dauerhaft
b
b
b
b
b
b
b
80
70
60
b
50
40
30
20
10
ab
b
a
b
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
0
4
6
9
11
14
16
18
21
23
25
28
32
Tage nach Inokulation
einmalig
wöchentlich
dauerhaft
Abbildung 3.5: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen 5 und
35 dpi (A) beziehungsweise zwischen 4 und 32 dpi (B) mit A. valerianellae (Isolat
709/2, 106cfu/ml) im Keimblattstadium (A) beziehungsweise Laubblattstadium (B) in
Abhängigkeit der Blattnässedauer (einmalig, wöchentlich, dauerhaft).
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander
verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur)
verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
61
Auch das Ergebnis aus der Versuchswiederholung zeigte bei dauerhafter Inkubation
unter gesättigter Luftfeuchte einen charakteristischen Verlauf von Befallsstärke und
Befallshäufigkeit. So waren nach zehn Tagen bereits 70 % der Pflanzen befallen und
zeigten Symptome, 2,7 % der Blattfläche einzelner Pflanzen waren dabei mit
Symptomen bedeckt. Nach 19 Tagen unter dauerhaft feuchter Kultivierung waren
bereits 95 % der Pflanzen Symptom tragend, während sich die Befallsstärke
vervierfacht (10,6 %) hatte. Zu Versuchende (34 dpi) waren 100 % der Pflanzen
infiziert und zeigte auf 1/5 der Blattfläche (20,4 %) Symptome (Abb. 3.6).
Pflanzen, die nach der Inokulation im wöchentlichen Abstand unter gesättigter
Luftfeuchte kultiviert wurden, zeigten über die Dauer des Versuches (bis Tag 34
nach Inokulation) keine Symptome (Daten nicht gezeigt).
Die Versuche zeigten, dass sowohl das Blattalter als auch die Dauer der Blattnässe
einen Einfluss auf die Infektion haben. Pflanzen im Keim- und im Laubblattstadium
wiesen nach erfolgter Inokulation keine Symptome auf, wenn die Blätter lediglich
einmalig 48 Stunden nass waren. Waren die Blätter hingegen in wöchentlichem
Abstand für 48 Stunden nass, so waren Symptome an Pflanzen sichtbar. Bei im
Keimblattstadium inokulierten Pflanzen war dies zu einem späteren Zeitpunkt nach
der Inokulation der Fall als bei Pflanzen, die im Laubblattstadium inokuliert worden
waren. Die Befallshäufigkeit lag bei im Keimblattstadium inokulierten Pflanzen über
die Dauer des Versuches auf einem niedrigeren Niveau als bei Pflanzen, die im
Laubblattstadium inokuliert worden waren. Eine dauerhafte Kultivierung bei
gesättigten Luftfeuchten führte bei allen inokulierten Pflanzen, unabhängig vom
Blattalter, zu Symptomen. Der Zeitpunkt, zu dem alle Pflanzen Symptome zeigten,
war jedoch bei Pflanzen im Laubblattstadium früher erreicht.
ERGEBNISSE
62
ab
100
ab
b
ab
30
80
25
ab
ab
70
AB 20
60
B
50
40
AB
30
10
AB
20
10
15
AB
a
5
AB
A
0
7
Befallsstärke in %
Befallshäufigkeit in %
90
0
10
13
19
21
26
34
Tage nach Inokulation
Befallshäufigkeit in %
Befallsstärke in %
Abbildung 3.6: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) sowie der
Anteil befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) zwischen 7 und 34 dpi mit
einem A. valerianellae-Gemisch (105 cfu/ml) von Pflanzen im Laubblattstadium bei
dauerhafter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
3.1.3
63
Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion
beziehungsweise die Symptomentwicklung
3.1.3.1
Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung
Die Prüfung des Einflusses der Blattnässedauer auf die Infektion wurde mit
inokulierten Feldsalatpflanzen durchgeführt (Kapitel 2.12.3.1). Je länger die erste
Phase unter gesättigten Luftfeuchten dauerte, desto höher war die Befallsstärke zu
Beginn der trockenen Phase von sieben Tagen (Abb. 3.7). So lag nach acht Tagen
unter gesättigten Luftfeuchten die Befallsstärke bei 12,4 % (Versuchsglied 08/15;
Abb. 3.7 A), während dieser Wert innerhalb von vier Tagen auf bis zu 25,1 % anstieg
(nach zwölf Tagen, Versuchsglied 12/19; Abb. 3.7 C). Nach weiteren sechs Tagen
(Tag 18, Versuchsglied 18/25, Abb. 3.7 E) fiel die Befallsstärke wieder auf 16,3 %
zurück, war aber immer noch deutlich höher als zu Beginn nach acht Tagen nach der
Inokulation. Die Werte waren zu diesen Zeitpunkten signifikant voneinander
verschieden.
Innerhalb der siebentägigen Phase unter trockenen Luftfeuchten blieb der Wert der
Befallsstärke entweder annähernd konstant (Versuchsglied 08/15; Abb. 3.7 A) oder
fiel immer schneller ab, je länger die erste Phase der Kultivierung unter gesättigter
Luftfeuchte war (Abb. 3.7 B-E). Bei einer anschließenden Kultivierung unter
gesättigten Luftfeuchten stiegen die Werte der Befallsstärke deutlich an, bei
Versuchsglied 08/15 sogar dreimal so hoch wie zum Ende der Trockenphase. Der
Anfangswert der Befallstärke wurde in den drei Versuchsgliedern 12/19, 14/22 und
18/25 trotz erneuter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte nicht erneut erreicht
(Abb. 3.7).
Auch hier waren die Werte zu diesen Zeitpunkten signifikant voneinander
verschieden, ebenso wie die Werte des Versuchsglieds 10/18 (ohne Tabelle).
ERGEBNISSE
64
B
Ve rsuchsglie d 08/15
Ve rsuchsglie d 10/18
40
40
35
35
30
30
Befallsstärke in %
Befallsstärke in %
A
25
20
15
10
25
20
15
10
5
5
0
0
8
10
12
14
15
18
22
25
28
32
10
12
14
trocken
22
trocken
feucht
D
Ve rsuchsglied 12/19
25
28
32
40
35
35
30
30
25
20
15
10
5
feucht
Ve rsuchsglied 14/22
40
Befallsstärke in %
Befallsstärke in %
C
18
Tage nach Inokulation
Tage nach Inokulation
25
20
15
10
5
0
0
12
14
18
19
22
25
28
32
14
18
22
Tage nach Inokulation
trocken
25
28
32
Tage nach Inokulation
feucht
trocken
E
feucht
Ve rsuchsglied 18/25
40
35
Befallsstärke in %
30
25
20
15
10
5
0
18
22
25
28
32
Tage nach Inokulation
trocken
Abbildung
3.7:
Auswirkungen
auf
die
feucht
Befallsstärke
(in
%)
unterschiedlicher
Kultivierungsphasen unter trockenen und feuchten Bedingungen nach Inokulation mit
A. valerianellae.
Die Pflanzen wurden bis 8 (A), 10 (B), 12 (C), 14 (D), und 18 (E) dpi feucht kultiviert, ab
15 (A), 18 (B), 19 (C), 22 (D), und 25 (E) dpi wurde die Hälfte der Pflanzen trocken, die
andere Hälfte feucht weiterkultiviert.
ERGEBNISSE
65
In dem zweiten Versuchsansatz waren 9 dpi an allen Pflanzen Symptome sichtbar.
Die Anfangsbefallstärke lag dabei bei 1,6 %. Über die Dauer von 37 Tagen nach der
Inokulation (davon neun Tage unter gesättigter Luftfeuchte) nahm die Befallsstärke
lediglich um 1 % auf 2,6 % zu (Tab. 3.1). Wurde eine Hälfte der Pflanzen erneut bei
gesättigter Luftfeuchte kultiviert, so stieg die Befallsstärke wieder an. Der Anstieg
war umso höher, je länger die zweite Phase der Kultur bei gesättigter Luftfeuchte
dauerte, mit Ausnahme der Pflanzen, bei denen eine kurze trockene Phase von sieben
Tagen Dauer, dazwischen geschalten wurde. Auffallend war, dass selbst nach einer
28-tägigen Kultivierung unter trockenen Bedingungen die Befallsstärke anstieg. So
wurde am 38. Tag nach der Inokulation eine Befallsstärke von 3,5 % beobachtet, die
innerhalb von 13 Tagen (51 dpi) auf einen Wert von 4,7 % zunahm (Tab. 3.2).
Eine, nach erfolgter Inokulation von Feldsalatpflanzen, erste Kultivierungsphase
unter gesättigten Luftfeuchten führte mit zunehmender Dauer zu höheren
Befallsstärken und bestätigte vorangegangene Ergebnisse. In einer sich daran
anschließenden Phase, bei der die Pflanzen bei normal vorherrschender Luftfeuchte
kultiviert wurden, blieb der Wert der Befallsstärke entweder auf dem Niveau
bestehen oder fiel ab, das heißt die Schwere der Symptome war rückläufig. Bei einer
sich an diese Trockenperiode anschließenden erneuten Kultivierung unter gesättigten
Luftfeuchten stiegen die Werte der Befallsstärke erneut an.
Deutlich sichtbare und typische A. valerianellae-Symptome an Feldsalatpflanzen
wurden durch für Bakterien ungünstige, kurzfristige Bedingungen (normal
vorherrschende Luftfeuchte) nicht vollständig eliminiert. Traten anschließend erneut
günstige Bedingungen (gesättigte Luftfeuchte) für A. valerianellae auf, so führte dies
zu einem sich fortsetzenden Krankheitsverlauf und die Befallsstärke nahm zu.
Trockenperioden von bis zu 28 Tagen überlebte das Bakterium somit in
Feldsalatpflanzen.
ERGEBNISSE
66
Tabelle 3.1: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 9, 16, 23, 30 und 37 Tage nach
Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Bis 9 dpi
erfolgte die Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, anschließend ohne erhöhte Luftfeuchtigkeit.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
Tage nach Inokulation
Befallsstärke in %
Signifikanz (p < 0,05)
9
1,6
a
16
2,1
a
23
1,9
a
30
2,5
a
37
2,6
a
(dpi)
ERGEBNISSE
67
Tabelle 3.2: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 38, 43 und 51 Tage nach Inokulation (dpi)
mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Einer zu Beginn neuntägigen
Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte folgten Phasen unterschiedlicher Dauer unter
normal vorherrschenden Luftfeuchten (zwischen 7 und 28 Tagen), bevor sich eine erneute
Kultur unter gesättigter Luftfeuchte anschloss.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten wurden mit dem Tukey`s HSD-Test verrechnet (p < 0,05).
Tage nach
Inokulation
Davon Tage
(dpi), davon 9
unter
Tage unter
normaler
gesättigter
Luftfeuchte
Davon Tage
Luftfeuchte
38
43
51
3.1.3.2
unter
erneuter
gesättigter
Befallsstärke
Signifikanz
in %
(p < 0,05)
Luftfeuchte
7
22
9,2
ab
14
15
10,8
b
21
8
4,1
a
28
1
3,5
a
7
27
8,3
ab
14
20
11,3
b
21
13
5,9
a
28
6
4,5
a
7
35
9,2
ab
14
28
12,1
b
21
21
8,6
ab
28
14
4,7
a
Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation
Inokulierte Feldsalatpflanzen wurden mit einer Blattnässedauer von bis zu 72
Stunden kultiviert (Kapitel 2.12.3.2).
Die Antrocknungsdauer des Bakteriensprühnebels nach der Inokulation betrug in
etwa fünf Stunden.
ERGEBNISSE
68
Bei Pflanzen, die nach der Inokulation dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte
kultiviert wurden, zeigte sich eine kontinuierlich ansteigende Befallsstärke zwischen
dem neunten und 27. Tag nach der Inokulation (Abb. 3.8). So stieg diese von einem
Anfangsbefall von 0,4 % (konstante Temperaturen für die ersten 96 Stunden)
beziehungsweise 1,4 % (Wechseltemperaturen) auf 21 % beziehungsweise 29,9 %
an. Pflanzen, die sofort nach der Inokulation unter gesättigter Luftfeuchte bei
Wechseltemperaturen kultiviert wurden, zeigten eine höhere Befallsstärke, wobei der
Wert sogar drei bis vier Tage früher erreicht wurde als bei Pflanzen, die zunächst bei
einer konstanten Temperatur von 20 °C kultiviert wurden. So wurde beispielsweise
eine Befallsstärke von 5,3 % (unter Wechseltemperaturen) am 13. Tag nach der
Inokulation erreicht, während sie bei zunächst unter konstanten Temperaturen
kultivierten Pflanzen erst nach 16 Tagen (5,2 %) erreicht wurde.
Bei Pflanzen, die nach der Inokulation für bis zu 72 Stunden bei gesättigter
Luftfeuchte kultiviert wurden und anschließend unter trockenen Bedingungen
wuchsen, zeigten sich in keinem Fall Symptome (Abb. 3.9 und 3.10). Pflanzen, die
nach einer jeweils wöchentlichen Trockenperiode erneut dauerhaft bei gesättigter
Luftfeuchte
kultiviert
wurden,
zeigten,
unabhängig
von
der
ersten
Temperaturführung während der ersten 96 Stunden, ein einheitliches Bild: alle
Pflanzen zeigten zwischen dem 20. und 27. Tag nach der Inokulation Symptome.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Temperaturführung einen gewissen Einfluss auf den
zeitlichen
Krankheitsverlauf
inokulierter
Pflanzen
besaß.
So
wurde
eine
Befallshäufigkeit von 100 % unter Wechseltemperaturen schneller erreicht als bei
Pflanzen,
die
erst
nach
96
Stunden
bei
konstanten
Temperaturen
den
Wechseltemperaturen ausgesetzt waren. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von
Pflanzen, die dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden. Die Variante
ohne zusätzliche feuchte Abdeckung bei konstant 20 °C bildete hier allerdings eine
Ausnahme, hier waren am Tag 20 nach der Inokulation lediglich knapp 85 % der
Pflanzen Symptom tragend. Dieser Wert ging innerhalb von weiteren sieben Tagen
unter gesättigter Luftfeuchte sogar auf 82 % zurück (Abb. 3.10).
Aus den Ergebnissen wurde deutlich, dass eine Blattnässedauer unter gesättigter
Luftfeuchte
einen
großen
Einfluss
auf
inokulierte
Pflanzen
und
deren
Befallsausprägung besitzt, wobei bereits eine Dauer von ca. 5 Stunden für das
ERGEBNISSE
69
Antrocknen des Sprühfilms nach Inokulation für eine Infektion ausreichend war und
die Infektion nicht durch eine siebentägige Trockenperiode gestoppt wurde.
c
27 dpi
c
bc
Tage nach Inokulation
23 dpi
bc
abc
20 dpi
abc
abc
16 dpi
abc
ab
13 dpi
ab
a
9 dpi
a
0
10
20
30
40
Befallsstärke in %
Wechseltemperaturen
konstante Temperaturen für die ersten 96 Stunden
Abbildung 3.8: Befallsstärke (%) zwischen Tag 9 und Tag 27 nach der Inokulation (dpi)
mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml) unter dauerhafter
Kultivierung bei gesättigten Luftfeuchten. Die Pflanzen wurden entweder sofort
Wechseltemperaturen (15 °C Nacht, 20 °C Tag) ausgesetzt beziehungsweise für die
ersten 96 Stunden nach der Inokulation bei konstant 20 °C kultiviert.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet
(p < 0,05).
ERGEBNISSE
70
Befallshäufigkeit in %
ohne zusätzliche feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
a
23
27
a
a
9
13
16
20
Tage nach Inokulation
trocken
a
a
9
13
9 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
a
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
6 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
feucht
16
20
23
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
27
a
9
13
Tage nach Inokulation
trocken
feucht
trocken
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
13
16
20
23
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
27
9
13
16
20
Befallshäufigkeit in %
20
23
a
27
23
27
feucht
72 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
a
a
9
Tage nach Inokulation
trocken
16
trocken
Befallshäufigkeit in %
13
feucht
a
feucht
a
9
27
Tage nach Inokulation
48 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
23
a
Tage nach Inokulation
trocken
20
24 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
a
9
16
Tage nach Inokulation
12 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
feucht
13
16
20
23
27
Tage nach Inokulation
trocken
feucht
Abbildung 3.9: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter
Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5
Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei Feldsalat. Versuch A.
Nach einer sich an die Inokulation jeweils anschließenden Trockenphase von 7 Tagen wurde die
Befallshäufigkeit (in %) ab dem neunten Tag bis zum 27. Tag nach der Inokulation unter
gesättigten Luftfeuchte-Bedingungen („feucht“) und normalen Luftfeuchte-Bedingungen
(„trocken“) erhoben. Die Kultivierung der Pflanzen erfolgte in der Klimakammer bei
Wechseltemperaturen (20 °C Tag, 15 °C Nacht) mit 16 Stunden Licht. Behandlungen mit
gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem
Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
71
Befallshäufigkeit in %
ohne zusätzliche feuchte Inkubation nach Inokulation
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
a
a
a
a
9
13
16
20
23
27
Tage nach Inokulation
trocken
a
9
13
16
20
9 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
a
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
6 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
feucht
23
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
27
a
9
13
16
Tage nach Inokulation
trocken
feucht
trocken
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
13
16
20
23
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
13
20
23
27
23
feucht
72 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
27
a
a
a
9
13
16
Tage nach Inokulation
trocken
20
trocken
a
16
16
feucht
a
13
a
Tage nach Inokulation
48 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
9
feucht
a
9
27
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
27
a
Tage nach Inokulation
trocken
23
24 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
a
9
20
Tage nach Inokulation
12 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation
a
a
a
a
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
20
23
27
Tage nach Inokulation
feucht
trocken
feucht
Abbildung 3.10: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter
Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5
Stunden Antrocknungsdauer)
auf
die Befallsentwicklung
bei Feldsalat.
Versuch B.
Nach einer sich daran jeweils anschließenden Trockenphase von 7 Tagen wurde die
Befallshäufigkeit (in %) ab dem neunten Tag bis zum 27. Tag nach der Inokulation unter
gesättigten Luftfeuchte-Bedingungen („feucht“) und normalen Luftfeuchte-Bedingungen
(„trocken“) erhoben. Die Kultivierung der Pflanzen erfolgte in der Klimakammer bei
Wechseltemperaturen (20 °C Tag, 15 °C Nacht) mit 16 Stunden Licht, wobei die erste
Kultivierungsphase (96 Stunden nach der Inokulation) bei konstant 20 °C erfolgte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten
wurden
(p < 0,05).
mit
dem
Kruskal-Wallis-Test
(Dunns
Prozedur)
verrechnet
ERGEBNISSE
3.1.4
72
Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion
Die Versuche zum Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion sollten zeigen, ob
eine Infektion auch bei schwachen Inokulumkonzentrationen möglich ist und wann
erste Symptome auftreten (Kapitel 2.12.4).
Das Auftreten erster Symptome war sowohl vom verwendeten Isolat als auch von der
Konzentration der Isolate abhängig (Tab. 3.3). Mit kleinen Abweichungen waren
generell bei höheren Konzentrationen Symptome eher sichtbar als bei niedrigeren
Konzentrationen. Das Isolat 16619 zeigte bei einer Konzentration von 107 cfu/ml
eine schwächere Aggressivität als die Isolate 6.1.a und 552, da hier nicht bereits nach
fünf Tagen Symptome sichtbar waren, sondern erst nach sieben Tagen. Sichtbare
Symptome waren allerdings bei einer Konzentration von 104 cfu/ml bereits nach fünf
Tagen vorhanden. Bei niedrigeren Konzentration von 102 cfu/ml war das Isolat 552
aggressiver (12 Tage nach Inokulation erste Symptome) als die Isolate 6.1.a und
16619 (19 Tage nach Inokulation erste Symptome).
Das Ergebnis des Einflusses der Inokulumdichte auf die Infektion zeigte einen für
Inokulumdichten typischen Gradienten in Hinblick auf den Anteil an befallenen
Pflanzen. Dies gilt für alle drei verwendeten Isolate (Abb. 3.11). Die Häufigkeit der
Symptomausprägung war, mit kleinen Abweichungen, umso höher, je höher die
Konzentration des A. valerianellae-Inokulms war. So zeigten bei der geringen
Inokulumkonzentration von 102 cfu/ml zwischen 15 % und 35 % der Pflanzen
Symptome
(19
Tage
nach
der
Inokulation),
während
bei
der
hohen
7
Inokulumkonzentration von 10 cfu/ml zum gleichen Zeitpunkt 85 % bis 100 % der
Pflanzen Symptome aufwiesen.
Mit zunehmender Zeit nach der Inokulation waren mehr Symptom tragende Pflanzen
auch bei kleineren Konzentrationen vorhanden, was sich durch die Vermehrung von
A. valerianellae in der Pflanze beziehungsweise der Ausbreitung zwischen den
Pflanzen eines Versuchsglieds erklären lässt.
ERGEBNISSE
73
Tabelle 3.3: Auftreten erster Symptome (in Tagen) nach Inokulation einzelner A. valerianellaeIsolate in Abhängigkeit von der Konzentration.
Erste sichtbare Symptome (in Tagen) nach Inokulation in Abhängigkeit der
verwendeten Konzentration
102
103
104
105
106
107
cfu/ml
cfu/ml
cfu/ml
cfu/ml
cfu/ml
cfu/ml
6.1.a
19
7
7
7
12
5
16619
19
12
5
7
7
7
552
12
12
7
7
5
5
Isolat
ERGEBNISSE
74
A
b
b
b
b
B
80
b
b
b
70
60
50
ab
ab
ab
40
30
a
20
10
a a a
ab
a
a
ab
ab
ab
a
a
103
70
5 dpi
7 dpi
12 dpi
b
60
ab
50
106
a
20
107
ab
a a a
0
a a
102
103
b b
b
a
80
ab
a
104
105
Verdünnungsstufe in cfu/ml
7 dpi
12 dpi
a
106
a
107
19 dpi
b b
ab
b
70
a
ab
90
Befallshäufigkeit in %
a
5 dpi
100
ab
30
19 dpi
C
ab
ab
40
10
a a
104
105
Verdünnungsstufe in cfu/ml
b
b
80
0
102
b b
90
Befallshäufigkeit in %
Befallshäufigkeit in %
90
ab b
100
ERGEBNISSE
100
60
50
a
40
a
ab
a
30
ab
20
10
a a
a
a a
a
ab
a
a
a
0
2
10
3
10
4
10
105
Verdünnungsstufe in cfu/ml
5 dpi
7 dpi
12 dpi
106
107
19 dpi
Abbildung 3.11: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen Tag fünf und Tag 19 nach der Inokulation (dpi) mit sechs
verschiedenen Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (A), 16619 (B), 552 (C). Behandlungen mit gleichen
Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
74
ERGEBNISSE
75
3.2
Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit
3.2.1
Einfluss der Sorte auf die Infektion
In den Untersuchungen zum Einfluss der Sorte auf die Infektion wurden elf Sorten
unterschiedlicher Züchter sowie zwei Hobbyanbausorten und die resistente Wildart
V. rimosa (AV-13) auf ihre Anfälligkeit gegenüber A. valerianellae untersucht
(Kapitel 2.13.1).
Alle Sorten zeigten in der ersten Wiederholung bei Temperaturen zwischen 13 °C
und 24 °C einen deutlichen Befall und wiesen charakteristische Symptome mit 3 %
bis 10 % befallener Blattfläche auf (Abb. 3.12). Die Befallshäufigkeiten lagen
zwischen 70 % und 98 % (Abb. 3.13). Sowohl die Befallsstärken als auch die
Befallshäufigkeiten wiesen dabei signifikante Sortenunterschiede auf. So waren die
Sorten AV-3, AV-5, AV-6, AV-14, AV-4, AV-2, AV-7, AV-9 und AV-8 bezüglich
der Befallsstärke deutlich von den stärker befallenen Sorten AV-12, AV-11, AV-10
und AV-15 zu unterscheiden. Die Sorten AV-3 und AV-5 waren bezüglich der
Befallshäufigkeit signifikant zu den übrigen Sorten unterschiedlich. Alle Sorten
waren jedoch anfällig für A. valerianellae. Lediglich die Wildform AV-13 zeigte
keine Symptome.
Die Ergebnisse aus der ersten Wiederholung wurden in einem zweiten Versuch bei
etwas höheren Temperaturen von 20 °C bis 29 °C bestätigt. Die Befallsstärken
(zwischen 2 % und 9 %) und Befallshäufigkeiten (zwischen 38 % und 91 %) lagen
etwas niedriger als im ersten Versuchsansatz. Sortenunterschiede waren wiederum
sichtbar und die Wildform AV-13 zeigte auch hier wieder keine sichtbaren
Symptome. Deutlich signifikante Unterschiede in der Befallsstärke und der
Befallshäufigkeit zeigten, wie bereits in der ersten Wiederholung, die Sorten AV-3,
AV-5, AV-14 und AV-4 im Gegensatz zu der anfälligen Sorte AV-15 (Abb. 3.12 und
Abb. 3.13).
ERGEBNISSE
76
20
18
Befallsstärke in %
16
14
aa
12
10
bc
8
6
cd
4
2
bc
bcabc bc
bc
ab ab
bc
abc
bc bc
ab
abc bc
abc
abc
ab
abc
bc
abc
bc
c
dd
A
V13
A
V3
A
V5
A
V6
A
V14
A
V4
A
V2
A
V7
A
V9
A
V8
A
V12
A
V11
A
V10
A
V15
0
Sorte
1. Versuch, 13 °C - 24 °C
2. Versuch, 20 °C - 29 °C
Abbildung 3.12: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche je Pflanze) von
unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellaeGemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C
(1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander
verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur)
verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
77
100
bc
90
c
bc
80
Befallshäufigkeit in %
abc abc
abc
abc
abc ababc ab ab
abc a a
ab
abc ab
ababc
ab
abc
abc
bc
70
bc
60
c
50
40
30
20
10
dd
A
V13
A
V3
A
V5
A
V6
A
V14
A
V4
A
V2
A
V7
A
V9
A
V8
A
V12
A
V11
A
V10
A
V15
0
Sorte
1. Versuch, 13 °C - 24 °C
Abbildung
3.13:
Anteil
an
befallenen
2. Versuch, 20 °C - 29 °C
Pflanzen
(Befallshäufigkeit
in
%)
bei
unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellaeGemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C (1. Versuch)
und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
3.2.2
Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion
Es wurden die Interaktionen zwischen A. valerianellae-Isolaten verschiedener
Herkünfte einerseits und andererseits zwischen zweier Sorten und einer Wildart
(V. rimosa) bezüglich der Symptomausprägung geprüft (Kapitel 2.13.2).
V. rimosa konnte wie in den Versuchen zum Einfluss der Inokulumdichte auf die
Infektion (Kapitel 3.1.4) und zum Einfluss der Sorte auf die Infektion (Kapitel 3.2.1)
nicht infiziert werden (Tab. 3.4, Abb. 3.14, Tab. 3.5, Abb. 3.15, Abb. 3.16,
Abb. 3.17), so dass sie als resistent gelten kann.
Die Isolate 16619 und IV2 wurden dabei mit einer niedrigen Konzentration von
104 cfu/ml aufgesprüht und führten insgesamt zu sehr geringen Befallsstärken
zwischen 0,1 % (Isolat IV2) und 0,3 % (Isolat 16619) an den drei Feldsalatsorten
AV-1, AV-5 und AV-3 (Tab. 3.4). Bei der Sorte AV-3 waren nach Inokulation mit
ERGEBNISSE
78
dem Isolat IV2 zudem keine sichtbaren Symptome vorhanden (Tab. 3.5). Die
Befallshäufigkeiten lagen zwischen 2 % und 22 % (Abb. 3.14). Aufgrund eines
starken Befalls mit Echtem Mehltau konnte nur eine sehr kleine Pflanzenmenge
bonitiert werden. Dies erklärt das Fehlen der statistischen Auswertung für die Isolate
16619 und IV2 mit der geringeren Konzentration von 104 cfu/ml.
Nach Inokulation mit einer Konzentration von 106 cfu/ml (Isolate: 6.1.a, 553) lag der
Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze zwischen 0,8 % und 4 % (Tab. 3.5), die
Befallshäufigkeiten lagen zwischen 50 % und 92 % (Abb. 3.15).
Mit steigender Konzentration der Bakterienisolate 6.1.a und 553 war die Sorte AV-3
weniger anfällig in Bezug auf Befallsstärke und Befallshäufigkeit als die Sorten
AV-1 und AV-5.
Die Ergebnisse wurden in einem zweiten Versuch bei einer weiter auseinander
liegenden Temperaturspanne zwischen 2 °C bis 45 °C weitestgehend bestätigt,
obwohl die Isolate mit einer höheren (Isolate 16619 und IV2) beziehungsweise
niedrigeren Konzentration (Isolate 6.1.a und 553) von 105 cfu/ml inokuliert wurden.
Auch hier zeigte sich die Sorte AV-3 als etwas weniger anfällig gegenüber
A. valerianellae und eine maximale Befallsstärke von 9 % (Isolat IV2) wurde nicht
überschritten (Abb. 3.16). Die Befallsstärken der Sorten AV-1 und AV-5 lagen
zwischen knapp 3 % und 19 %, während die Befallshäufigkeiten zwischen 79 % und
100 % lagen (Abb. 3.17). Vermutlich aufgrund der höheren Temperaturen im
zweiten Versuch lagen auch die Befallsstärke und Befallshäufigkeit deutlich höher
als im ersten Versuchsansatz.
Die
Isolate
variierten
in
der
Virulenz.
Nach
Inokulation
geringerer
4
Bakterienkonzentrationen (10 cfu/ml) war das Isolat 16619 aggressiver als das Isolat
IV2, während sich die Aggressivität bei höheren Bakterienkonzentrationen
(105 cfu/ml) umkehrte. Die höhere Aggressivität des Isolates 553 bestätigte sich
sowohl nach Inokulation mit einer Konzentration von 106 cfu/ml als auch bei etwas
geringeren Konzentrationen (105 cfu/ml). Die Versuche zeigten, dass eine Infektion
mit sichtbaren Symptomen an Feldsalatpflanzen nicht ausschließlich von der
verwendeten Isolatkonzentration abhängig war, sondern auch vom verwendeten
ERGEBNISSE
79
Isolat selber, so dass die Verwendung eine Isolategemisches zur Inokulation zur
Vermeidung von Isolat-Sorten-Interaktionen von Vorteil ist.
Tabelle 3.4: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate
(16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei Kultur unter gesättigter Luftfeuchte.
Befallsstärke (in %)
Sorte
Isolat 16619
Isolat IV2
AV-1
0,34
0,08
AV-5
0,31
0,02
AV-3
0,28
0
AV-13
0
0
ERGEBNISSE
80
100
Befallshäufigkeit in %
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
16619
AV
IV2 2
Isolat
AV-1
AV-5
AV-3
AV-13
Abbildung 3.14: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten (AV-1, AV-5, AV-3) und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation
zweier A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei
Kultur unter gesättigter Luftfeuchte.
ERGEBNISSE
81
Tabelle 3.5: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke (BS) in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate
(6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter
Luftfeuchte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
Isolat 6.1.a
Isolat 553
Sorte
BS (%)
Signifikanz
(p < 0,05)
BS (%)
Signifikanz
(p < 0,05)
AV-1
1,35
b
3,95
c
AV-5
1,51
b
2,52
bc
AV-3
0,79
a
1,74
b
AV-13
0
a
0
a
ERGEBNISSE
82
100
b
Befallshäufigkeit in %
90
80
b
b
b
b
70
b
60
50
40
30
20
10
a
a
0
6.1.a
553
Isolat
AV-1
AV-5
AV-3
AV-13
Abbildung 3.15: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellaeIsolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter
gesättigter Luftfeuchte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet
(p < 0,05).
Befallsstärke in %
ERGEBNISSE
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
83
c
c
b
bc
b
b
c
b
b
a a
b
a
6.1.a
a
a
553
16619
a
AV2
IV2
Isolat
AV-1
AV-5
AV-3
AV-13
Abbildung 3.16: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier
A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml
und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet
(p < 0,05).
ERGEBNISSE
100
Befallshäufigkeit in %
90
84
c
b b b
bc
b
b b b
b
b
b
80
70
60
50
40
30
20
10
a
a
a
a
0
6.1.a
553
16619
IV2
AV2
Isolat
AV-1
AV-5
AV-3
AV-13
Abbildung 3.17: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei
Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier A. valerianellaeIsolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml und Kultivierung
unter gesättigter Luftfeuchte.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die
Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
3.2.3
Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion
In Versuchen zum Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion
(Kapitel 2.13.3) konnte aufgrund eines starken Befalls mit Echtem Mehltau nur eine
sehr kleine Pflanzenmenge bonitiert werden. Dies erklärt das Fehlen der statistischen
Auswertung.
Das Ergebnis zeigte 9 dpi einen für Inokulumdichten typischen Gradienten in
Hinblick auf die Befallshäufigkeit. Die Häufigkeit der Symptomausprägung war, mit
kleinen Abweichungen, umso höher, je höher die verwendete Konzentration des
A. valerianellae-Inokulums war. Die Wildart AV-13 zeigte, auch nach Inokulation
mit einer hohen Bakterienkonzentration, keine Symptome (Abb. 3.18).
Nach Inokulation mit der höchsten Konzentration von 106 cfu/ml zeigten sich
lediglich am ersten und am zweiten Boniturtermin (7 dpi und 9 dpi) Unterschiede in
ERGEBNISSE
85
der Befallshäufigkeit. 13 und 20 Tagen nach der Inokulation zeigten alle Pflanzen
der Sorten Symptome. Zwischen den Feldsalatsorten AV-1 und AV-5 waren keine
großen Sortenunterschiede zu erkennen (Abb. 3.19).
100
90
Befallshäufigkeit in %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
102
103
104
105
106
Verdünnungsstufe in cfu/ml
AV-13
AV-1
AV-5
Abbildung 3.18: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei
verschiedenen Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 neun Tage nach Inokulation eines
A. valerianellae-Isolategemisches mit fünf verschiedenen Konzentrationen zwischen
102 cfu/ml und 106 cfu/ml.
ERGEBNISSE
86
100
Befallshäufigkeit in %
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
AV-13
AV-1
AV-5
Sorte
7 dpi
9 dpi
13 dpi
20 dpi
Abbildung 3.19: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei
verschiedenen Feldsalatsorten (AV-1 und AV-5) und der Wildart AV-13 zwischen Tag
sieben und Tag 20 nach Inokulation (dpi) eines A. valerianellae-Isolategemisches mit einer
Konzentrationen von 106 cfu/ml.
ERGEBNISSE
3.3
87
Infektionsversuche von Acidovorax valerianellae zu
Übertragungswegen
3.3.1
Boden
Ziel des Versuches war es herauszufinden, ob das Bakterium A. valerianellae im
Boden überdauern kann und wie lange es infektiös ist. Durch die Einarbeitung
gesunder und mit A. valerianellae-infizierter Feldsalatblätter in den Boden und die
anschließende Einsenkung ins Erdreich (Freiland) erfolgte unter annähernd
natürlichen Bodenverhältnissen die Umsetzung beziehungsweise der Abbau von
Pflanzenmaterial (siehe Kapitel 2.14.1).
Nach Aussaat von gesundem Saatgut in Proben von Böden, in die zuvor gesundes
Feldsalat-Blattmaterial eingearbeitet wurde, zeigten sich über die Dauer des
einjährigen (Schifferstadt) beziehungsweise achtmonatigen (Quedlinburg) Versuches
keine A. valerianellae-Symptome an Feldsalatpflanzen (nicht dargestellt).
In der ersten Zeit nach Beginn der monatlichen Probennahme von mit
A. valerianellae-infizierten
Feldsalat-Blattmaterial
durchmischten
Böden
und
anschließender Aussaat von gesundem Saatgut in diese Böden wurde ein
A. valerianellae-Befall sowohl in Schifferstadt als auch in Quedlinburg festgestellt.
Die Symptome zu Beginn der Untersuchungen waren in beiden Fällen mit 28,3 % an
Symptom tragenden Pflanzen im Monat September 2009 (Tab. 3.6) und 100 % im
Monat März 2010 (Tab. 3.7) am höchsten und nahmen innerhalb von drei Monaten
nahezu konstant ab.
So zeigten sich am Standort Schifferstadt einen Monat nach Versuchsbeginn mit
28,3 % genauso viele Symptom tragende Pflanzen wie direkt nach der Einarbeitung
von infiziertem Blattmaterial in den Boden (September 2009) mit anschließender
Aussaat. Bei Pflanzen, die zwei Monate nach Versuchbeginn ausgesät wurden, zeigte
sich ein Befall an einem Fünftel aller Pflanzen (20,2 % Symptom tragende Pflanzen),
während einen Monat später (3. Monat nach Kontamination) nur noch 8,4 % der
Pflanzen
A. valerianellae-Symptome
aufwiesen.
Aussaaten
nach
vier
beziehungsweise fünf Monaten zeigten zunächst bei 1,6 % der Pflanzen
A. valerianellae-verdächtige
Symptome,
ein
A. valerianellae-Befall
konnte
ERGEBNISSE
88
allerdings im anschließenden TAS-ELISA nicht bestätigt werden (Tab. 3.6). Ebenso
verhielt es sich bei Pflanzen mit verdächtigen Symptomen (11,1 %), die im 9. Monat
nach Kontamination ausgesät worden waren. Auch hier wurde A. valerianellae an
den verdächtigen Pflanzen nicht nachgewiesen. Pflanzen aus dem 10. Monat zeigten
keine Symptome, während im 11. Monat an 4,5 % der gewachsenen Pflanzen
untypische A. valerianellae-Symptome vorhanden waren, die sich nach TAS-ELISAUntersuchung als positiv erwiesen. Zu Versuchende (September 2010) waren keine
Symptome an Pflanzen sichtbar.
Am Standort Quedlinburg konnte zu Beginn der Untersuchungen im März 2010
lediglich eine Pflanze beobachtet und näher untersucht werden. A. valerianellae
wurde an dieser Pflanze visuell ermittelt und im TAS-ELISA bestätigt. Pflanzen, die
ein, zwei und drei Monate nach Kontamination des Bodens ausgesät wurden, zeigten
einen Befall von 60 % (1. Monat), 41,6 % (2. Monat) und 50 % (3. Monat), der im
TAS-ELISA
bestätigt
wurde.
Pflanzen,
die
in
den
Bodenproben
sechs
beziehungsweise sieben Monate nach Kontamination ausgesät worden waren, zeigten
untypische A. valerianellae-Symptome und ein A. valerianellae-Befall wurde nicht
nachgewiesen (Tab. 3.7). Zu Versuchende (November 2010) waren hier keine
Symptome an Pflanzen sichtbar.
An beiden Standorten herrschten zum Zeitpunkt der Versuche unterschiedliche
Klimabedingungen. In Schifferstadt wurde der Versuch im September 2009
begonnen, in Quedlinburg im März 2010, so dass unterschiedliche Temperatur- und
Niederschlagswerte vorlagen (Tab. 3.8).
A. valerianellae konnte in diesen Versuchen bis zu elf Monate im Boden überdauern
und eine neue Feldsalatkultur befallen.
ERGEBNISSE
89
Tabelle 3.6: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von
A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten
(über ein Jahr) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellae-Pflanzenmaterial
kontaminierten Boden gesät (Standort Schifferstadt).
Zeit nach Einarbeitung
Symptom tragende
Pflanzen in %
TAS-ELISA-Nachweis
von A. valerianellae
Start (September 2009)
28,3
positiv
1. Monat
28,3
positiv
2. Monat
20,2
positiv
3. Monat
8,4
positiv
4. Monat
1,6 (untypisch)
negativ
5. Monat
1,6 (untypisch)
negativ
6. Monat
0
negativ
7. Monat
0
negativ
8. Monat
0
negativ
9. Monat
11,1 (untypisch)
negativ
10. Monat
0
negativ
11. Monat
4,5 (untypisch)
positiv
Ende (September 2010)
0
negativ
ERGEBNISSE
90
Tabelle 3.7: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von
A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten
(über acht Monate) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellaePflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort Quedlinburg).
Zeit nach Einarbeitung
Symptom tragende
Pflanzen in %
TAS-ELISA-Nachweis
von A. valerianellae
Start (März 2010)
100
(eine gewachsene Pflanze)
positiv
1. Monat
60
positiv
2. Monat
41,6
positiv
3. Monat
50
positiv
4. Monat
53,8
positiv
5. Monat
26,6
positiv
6. Monat
7,7 (untypisch)
negativ
7. Monat
4 (untypisch)
negativ
Ende (November 2010)
0
negativ
ERGEBNISSE
91
Tabelle 3.8: Temperaturwerte (in 2 Meter Höhe) und Niederschlagswerte im Monatsmittel im
Zeitraum von September 2009 bis September 2010 in Schifferstadt und von März 2010 bis
November 2010 in Quedlinburg.
Quelle
Schifferstadt:
Dienstleistungszentren
Ländlicher
Raum
Rheinland
Pfalz,
Agrarmeteorologie
Quelle Quedlinburg: Julius Kühn-Institut
Standort Schifferstadt
Jahr
2009
2010
Monat
Standort Quedlinburg
Temperatur
Niederschlag
Temperatur
Niederschlag
(°C)
(mm)
(°C)
(mm)
September
17
30,3
Oktober
10,8
42,7
November
9,2
56,2
Dezember
2,9
84,8
Januar
-0,8
21,7
Februar
2,6
28,5
März
6,9
25,1
4,9
26,4
April
11,9
30,1
8,6
24,2
Mai
13,1
123,1
10,3
142,2
Juni
19,4
68,2
16,2
35,6
Juli
22,5
48,3
20,6
60,8
August
18,7
125,3
17,5
104
September
14,1
54
13,1
127,8
Oktober
9
25,8
November
5
93,1
ERGEBNISSE
92
3.3.2
Alternative Wirtspflanzen
3.3.2.1
Alternative Wirtspflanzen I
Die Untersuchungen wurden mit Pflanzen aus zehn Familien (Amaranthaceae,
Asteraceae,
Brassicaceae,
Caryophyllaceae,
Fabaceae,
Hydrophylloideae,
Lamiaceae, Plantaginaceae, Poaceae und Potulaceae) und Feldsalat als anfälligem
Standard durchgeführt. Zur Inokulation dieser Pflanzen wurden verschiedene
Verfahren (Infiltration und Sprühinokulation) eingesetzt (siehe Kapitel 2.14.2).
Bei den Kontrollpflanzen waren über die Dauer des Versuches keinerlei
Veränderungen an den Pflanzen durch die Inokulation zu erkennen (nicht
dargestellt).
Nach Infiltration mit einer A. valerianellae-Suspension in einzelne Blätter zeigten
mehrere Blattbereiche 20 Tage nach Inokulation (dpi) unterschiedliche Reaktionen
im Vergleich zur Kontrolle in Form von feuchten, aufgehellten oder nekrotischen
Blattveränderungen. Feldsalatpflanzen zeigten dabei die für A. valerianellae
typischen Symptome. Diese Veränderungen waren bei Amaranthus retroflexus (L.),
Chenopodium album (L.), Lactuca sativa (L.) (Batavia-Salat und Eissalat), Senecio
vulgaris (L.), Brassica rapa ssp. pekinensis (Lour.) Hanelt, Capsella bursa-pastoris
(L.) Medik., Stellaria media (L.) Vill., Lamium album (L.), Plantago major (L.) und
Veronica persica (Poir.) sichtbar. Keine sichtbaren Veränderungen an infiltrierten
Blattbereichen waren zum gleichen Zeitpunkt (20 dpi) bei Chenopodium hybridum
(L.), Phaseolus vulgaris (L.), Pisum sativum (L.), Eleusine coracana (L.) Gaertn.
und Portulaca oleracea (L.) vorhanden.
Auch nach Sprühinokulation kam es zu Veränderungen im Blattgewebe. Behandelte
Pflanzen zeigten an besprühten Blattbereichen nach sieben Tagen bereits
Auffälligkeiten durch diese Inokulation. Bei Chenopodium album (L.) und Lactuca
sativa (L.) (Batavia-Salat und Eissalat) waren dunkle Verfärbungen auf der
Blattspreite zu erkennen, die teilweise mit schwarzen Rändern zum gesunden
Gewebe abgegrenzt waren. Außerdem waren bei Matricaria chamomilla (L.) und
Senecio vulgaris (L.) aufgehellte Blattbereiche 13 dpi sichtbar. Die Pflanzen mit
auffälligen Blattbereichen waren vor allem nach Sprühinokulation zu finden und
besonders bei Arten aus der Familie der Asteraceae (Tab. 3.9).
ERGEBNISSE
93
Tabelle 3.9: Krankheitssymptome nach Infiltration und Sprühinokulation mit A. valerianellae
(Konzentration 108 cfu/ml) sieben, 13 und 20 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten.
+ = feuchte, aufgehellte oder nekrotische Blattveränderungen
- = keine Krankheitssymptome erkennbar
Inokulierte Pflanze
Familie
Valerianaceae
Art
Valerianella
locusta (L.)
Amaranthus
retroflexus (L.)
Amaranthaceae
Chenopodium
hybridum (L.)
Chenopodium
album (L.)
Lactuca sativa (L.)
(Batavia-Salat)
Lactuca sativa (L.)
(Eissalat)
Krankheitssymptome nach
Inokulation an Blättern
Infiltration
Sprühinokulation
(20 dpi)
(7 und 13 dpi)
+
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
nicht infiltriert
+
+
+
+
-
+
-
+
-
Asteraceae
Matricaria
chamomilla (L.)
Senecio
vulgaris (L.)
Brassica rapa ssp.
pekinensis (Lour.)
Brassicaceae
Hanelt
Capsella bursapastoris (L.) Medik.
Caryophylloideae
Stellaria media (L.)
Vill.
ERGEBNISSE
94
Fortsetzung Tab. 3.9
Inokulierte Pflanze
Familie
Art
Phaseolus
vulgaris (L.)
Krankheitssymptome nach
Inokulation an Blättern
Infiltration
Sprühinokulation
(20 dpi)
(7 und 13 dpi)
-
-
-
-
nicht infiltriert
-
+
-
+
-
+
-
-
-
-
-
Fabaceae
Pisum sativum (L.)
Phacelia
Hydrophylloideae
tanacetifolia
(Juss.)
Lamiaceae
Lamium album
(L.)
Plantago major
(L.)
Plantaginaceae
Veronica persica
(Poir.)
Poaceae
Portulaceae
Eleusine coracana
(L.) Gaertn.
Portulaca
oleracea (L.)
ERGEBNISSE
3.3.2.2
Pflanzen
95
Alternative Wirtspflanzen II
aus
sieben
verschiedenen
Pflanzenfamilien
wurden
inokuliert
(Sprühinokulation) und für die ersten 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte und
danach bis Versuchende bei normal vorherrschenden Luftfeuchten im Gewächshaus
kultiviert. Eine visuelle Bonitur auf eine Veränderung an den Blättern erfolgte 10, 25
und 30 dpi. Zu keinen auffälligen Veränderungen im Blattgewebe kam es nach
Inokulation mit 0,85 %-iger Natriumchloridlösung. Ebenso waren keinerlei
Veränderungen nach Inokulation von A. valerianellae bei Beta vulgaris subsp.
vulgaris var. conditiva (L.), Spinacia oleracea (L.), Foeniculum vulgare (L.) Mill.,
Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (kraus), Eruca sativa (L.), Pisum
sativum (L.) und Capsicum annuum (L.) zu beobachten (nicht dargestellt).
Pflanzen aus den Familien Apiaceae (Möhre), Brassicaceae (Radies), Fabaceae
(Buschbohne) und Poaceae (Mais) zeigten am zehnten Tag nach der Inokulation mit
A. valerianellae
Auffälligkeiten
gegenüber
mit
Kochsalzlösung
inokulierten
Pflanzen, die allerdings an späteren Terminen (25 und 30 dpi) nicht mehr sichtbar
waren. Ebenso wurden auffällige Blattbereiche an Ölrettich (Brassicaceae) 25 dpi
beobachtet. Durch eine erneute Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, die für das
Bakterium A. valerianellae eine optimale Bedingung für eine Infektion darstellt,
veränderten sich die Symptome.
An Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (glatt) wurden zu allen drei
Beobachtungsterminen Blätter mit gelblichen Aufhellungen beobachtet, bei
Raphanus sativus (L.) wurden Blattränder mit schwarzen Punkten sichtbar
(Tab. 3.10). Feldsalatpflanzen zeigten über die Dauer des Versuches die für
A. valerianellae typischen Symptome.
ERGEBNISSE
96
Tabelle 3.10: Krankheitssymptome nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (Konzentration
108 cfu/ml) 10, 25 und 30 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten.
- = keine sichtbaren Krankheitssymptome erkennbar
Inokulierte
Pflanze
Valerianella
locusta (L.)
Krankheitssymptome nach Sprühinokulation an Blättern
Nach 10 Tagen
Nach 25 Tagen
Nach 30 Tagen
typische
typische
typische
A. valerianellae-
A. valerianellae-
A. valerianellae-
Symptome
Symptome
Symptome
-
-
Blätter mit
Blätter mit
Blätter mit
gelblichen
gelblichen
gelblichen
Aufhellungen
Aufhellungen
Aufhellungen
ein Blatt mit einem
Daucus carota
schwarzen Punkt;
subsp. sativus
mehrere
(Hoffm.) Schübl.
pergamentartige
et G. Martens
Stellen mit
dunklen Punkten
Petroselium
crispum (Mill.)
Nyman & A.W.
Hill (glatt)
Blattrand eines
Raphanus sativus
subsp. oleiformes
(L.)
-
Blattes mit
schwarzen
Punkten
-
ERGEBNISSE
97
Fortsetzung Tab. 3.10
Inokulierte
Pflanze
Raphanus sativus
subsp. sativus
(L.)
Raphanus sativus
(L.)
Krankheitssymptome nach Sprühinokulation an Blättern
Nach 10 Tagen
2 Blätter mit
schwarzen Rändern
-
Phaseolus
pergamentartige
vulgaris (L.)
Flecken
Zea mays (L.)
Ränder an Blattenden
teilweise gelb
Nach 25 Tagen
Nach 30 Tagen
-
-
Blattränder mit
Blattränder mit
schwarzen
schwarzen
Punkten
Punkten
-
-
-
-
ERGEBNISSE
3.3.2.3
98
Alternative Wirtspflanzen III
Der Versuch wurde mit Pflanzenarten aus fünf Familien und Feldsalat durchgeführt.
Es sollte nach Stichinokulation auf einer Blatthälfte der Pflanzen überprüft werden,
ob und wie lange das Bakterium A. valerianellae lebensfähig war (siehe Kapitel
2.14.2.3).
Pflanzen, die lediglich mit einer 0,85 %-igen Natriumchloridlösung inokuliert
wurden, zeigten über die Dauer des gesamten Versuches, außer einer Verletzung
durch die Nadel, keine visuellen Veränderungen im Aussehen der Blätter um die
Einstichstelle. Zudem wurde die Befallsfreiheit von diesen Pflanzensaftproben
mittels Ausplattierung auf KB-Agar und Untersuchung im TAS-ELISA bestätigt
(nicht dargestellt).
Ab dem 12. Tag nach der Stichinokulation mit A. valerianellae wurden erste
Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle beobachtet (Tab. 3.11). An
Feldsalatpflanzen waren über die fünfwöchige Dauer des Versuches (bis Tag 33 nach
der Inokulation, 33 dpi) typische A. valerianellae-Symptome in Form von schwarzen
Flecken sichtbar. Bei Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.) und
Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (kraus) waren lediglich
Verletzungen zu erkennen, während bei Raphanus sativus subsp. sativus (L.),
Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Phaseolus vulgaris (L.), Pisum sativum (L.)
und Raphanus sativus (L.) der Bereich um die Einstichstelle schwarz verfärbt war.
Lediglich anfänglich sichtbare Verletzungen entwickelten sich bei Spinatpflanzen ab
dem 19. Tag nach der Inokulation zu wässrigen dunklen Läsionen. Bei
Eissalatpflanzen waren wässrige dunkle Läsionen bereits zu Anfang der
Untersuchungen (12 dpi) erkennbar.
Lebensfähige Bakterien aus injizierten Blattbereichen wurden am 12. Tag nach der
Stichinokulation
in
Radies-,
Ölrettich-,
Buschbohne-,
Rettich-
und
Eissalatsaftproben nach Ausplattierung auf KB-Agarschalen nachgewiesen und
mittels TAS-ELISA als A. valerianellae identifiziert. In Feldsalatproben wurden
lebensfähige Bakterien sowohl nach 12, 26 und 33 Tage nach der Stichinokulation
ERGEBNISSE
99
auf KB-Agarschalen detektiert und mittels TAS-ELISA als A. valerianellae
diagnostiziert.
Lebensfähige Bakterien aus nicht-injizierten, aber den injizierten Blatthälften
benachbarten Blattbereichen, wuchsen 12 Tage nach Stichinokulation auf
KB-Agarschalen sowohl bei Feldsalat als auch bei Petersilie. Nach 19 Tagen
wuchsen Bakterien aus Proben von Markerbse und Petersilie, nach 26 Tagen bei
Feldsalat, Buschbohne und Markerbse und nach 33 Tagen lediglich bei Markerbse
(Tab. 3.12). Alle Bakterienkolonien wurden abschließend mittels TAS-ELISA als
A. valerianellae-Bakterien identifiziert.
Das Bakterium A. valerianellae war über die Dauer von bis zu 33 Tagen in
inokulierten Pflanzen lebensfähig und nachweisbar. Diese befallenen Pflanzen
wiesen auch Krankheitssymptome auf.
ERGEBNISSE
100
Tabelle 3.11: Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle bei verschiedenen
Pflanzenarten nach Stichinokulation mit A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) an
unterschiedlichen Tagen nach der Inokulation (dpi).
Veränderungen nach Stichinokulation an Blättern
Inokulierte Pflanze
12 dpi
Valerianella locusta (L.)
19 dpi, 26 dpi, 33 dpi
typische A. valerianellae-Symptome
Beta vulgaris subsp.
vulgaris var. conditiva
Verletzung sichtbar
(L.)
Spinacia oleracea (L.)
Verletzung sichtbar
wässrige dunkle Läsionen
Petroselium crispum
(Mill.) Nyman & A.W.
Verletzung sichtbar
Hill (kraus)
Lactuca sativa (L.)
Raphanus sativus subsp.
oleiformes (L.)
Raphanus sativus subsp.
sativus (L.)
wässrige dunkle Läsionen
Bereich um Einstichstellen schwarz
Bereich um Einstichstellen schwarz
Raphanus sativus (L.)
Bereich um Einstichstellen schwarz
Phaseolus vulgaris (L.)
Bereich um Einstichstellen schwarz
Pisum sativum (L.)
Bereich um Einstichstellen schwarz
ERGEBNISSE
101
Tabelle 3.12: Nachweis von lebensfähigen A. valerianellae-Bakterien in injizierten und nichtinjizierten Blatthälften verschiedener Pflanzenarten 12, 19, 26 und 33 dpi.
Nachweis von A. valerianellae (+) beziehungsweise kein Nachweis von A. valerianellae (-) in
inokulierten und nicht-inokulierten Blatthälften.
dpi
Injizierte
Nicht-injizierte
Blatthälfte
Blatthälfte
+
+
+
-
+
-
+
-
+
-
Raphanus sativus (L.)
+
-
Phaseolus vulgaris (L.)
+
-
+
-
Pisum sativum (L.)
+
-
Valerianella locusta (L.)
+
+
Phaseolus vulgaris (L.)
+
-
Pisum sativum (L.)
+
-
Valerianella locusta (L.)
+
-
Pisum sativum (L.)
+
-
Potentieller Wirt
Valerianella locusta (L.)
Petroselium crispum (Mill.)
Nyman & A.W. Hill
Lactuca sativa (L.)
12
Raphanus sativus subsp.
oleiformes (L.)
Raphanus sativus subsp.
sativus (L.)
Petroselium crispum (Mill.)
19
26
Nyman & A.W. Hill
33
ERGEBNISSE
3.3.3
102
Saatgut
Die Versuche zum Übertragungsweg Saatgut wurden mit einer gesunden und einer
mit A. valerianellae-kontaminierten Saatgutpartie und deren Tochtergenerationen in
verschiedenen Jahren durchgeführt. Es sollte gezeigt werden, ob eine Übertragung
von A. valerianellae über das Saatgut auf die Tochtergeneration möglich ist.
Weiterhin wurde geprüft, ob die verwendete Bewässerungsstrategie einen Einfluss
auf die Kontamination der Samen hat. Die Pflanzen wurden in allen Aussaatjahren
visuell
bis
zur
Samenernte
auf
einen
A. valerianellae-Befall
untersucht.
Abschließend erfolgte, nach Samenreifung und dem Bruch der Dormanz, die
Untersuchung der Saatgutpartien auf Befall mit A. valerianellae (siehe Kapitel
3.4.1).
A. valerianellae-Schadsymptome traten im Jahr 2007 nur sporadisch zu Kulturbeginn
und ausschließlich an den Pflanzen aus infiziertem Saatgut auf. Der Anteil Symptom
tragender Pflanzen lag bei den in Deutschland kultivierten Pflanzen 40 Tage nach der
Aussaat bei 4,7 % und war gleichmäßig im Bestand verteilt (Abb. 3.20). In
Frankreich waren lediglich an 1,1 % der Pflanzen sichtbare Symptome nach sechs
Monaten nach der Aussaat vorhanden (nicht dargestellt).
Pflanzen, die im Oktober 2008 ausgesät wurden, zeigten 69 Tage nach der Aussaat
von infiziertem Saatgut einen geschätzten Befallswert von 10 % (Abb. 3.21 A).
Dieser Schätzwert erhöhte sich innerhalb von einem Monat auf 15 % (103 Tage nach
der Aussaat). 135 Tagen nach der Aussaat lag der Befallswert bei 30 % bis 35 %
(Abb. 3.21 B).
An Pflanzen, die im Jahr 2009 ausgesät wurden, war zu keiner Zeit der
Kulturführung beziehungsweise Saatgutproduktion ein Befall sichtbar.
Die Befallswerte schwankten zwischen den einzelnen Jahren stark, obwohl immer
die gleiche kontaminierte Saatgutpartie ausgesät wurde. Allerdings erfolgte die
Aussaat an verschiedenen Standorten unter verschiedenen Kulturbedingungen
(Gewächshaus, Folienhaus, Freiland) und zu verschiedenen Jahreszeiten.
ERGEBNISSE
2
3
4
5
6
x
7
8
9
11
12
Pflanze
13 14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
x
x
Reihe
x
x
x
x
x
x
x
2
3
4
x
5
6
7
x
8
9
10
x
x
11
12
13
x
x
x
14
x
15
16
17
18
19
20
21
x
x
20
21
x
22
x
23
24
25
26
22
23
24
25
26
x
x
x
Reihe
Reihe
10
ERGEBNISSE
Parzelle 1 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Parzelle 2 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Parzelle 3 1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
x
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
x
13
14
15
16
17
18
19
x
x
x
Abbildung 3.20: Verteilung von A. valerianellae-Symptome tragende Pflanzen (mit x gekennzeichnet) aus A. valerianellae-infiziertem
Saatgut, 40 Tage nach der Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland, in drei jeweils 1 m² großen abgesteckten Parzellen, die aus je neun
103
Aussaatreihen bestanden, in denen zwischen 18 und 26 Pflanzen wuchsen (grau hinterlegte Fläche).
ERGEBNISSE
104
A
B
Abbildung 3.21: Feldsalatpflanzen aus infiziertem Saatgut
69 Tage (A) und 135 Tage (B) nach Aussaat im Jahr 2008 in
einem Folienhaus. Pflanzen mit A. valerianellae-Symptomen
wurden mit einem Stab gekennzeichnet.
ERGEBNISSE
105
3.4
Saatgutuntersuchungen
3.4.1
Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut
Die Saatgutpartien stammten aus den Versuchen zum Übertragungsweg Saatgut
(Kapitel 2.13.3). Sowohl das gesunde und infizierte Ausgangssaatgut sowie die
daraus gewonnenen zehn Partien aus verschiedenen Jahren wurden auf einen Befall
mit A. valerianellae überprüft.
3.4.1.1
Sweatbox-Test in der Klimakammer und Aufwuchstest im
Gewächshaus
Samen
aus
verschiedenen
Versuchsvarianten
zur
Saatgutübertragung
von
A. valerianellae wurden für den Sweatbox-Test in Vermiculit (5000 Samen pro zwei
Liter Vermiculit) und für den Aufwuchstest in Erde ausgesät. Die Kultur erfolgte für
den Sweatbox-Test ab Aussaat und für den Aufwuchstest mit Beginn des sich
entwickelnden Laubblattstadiums der Pflanzen unter gesättigter Luftfeuchte.
Aufgelaufene Pflanzen wurden auf einen Befall von A. valerianellae an
verschiedenen Terminen visuell bonitiert (Abb. 3.22). Die Befallshäufigkeit wurde
an mehreren Tagen erfasst. Die Endbonitur fand bei Pflanzen im Sweatbox-Test
28 Tage nach der Aussaat statt und für die Pflanzen im Aufwuchstest nach 28 Tagen
unter gesättigter Luftfeuchte. Von Pflanzen mit verdächtigen oder typischen
Symptomen wurden Bakterien isoliert und mittels TAS-ELISA näher bestimmt.
Die gesunde Ausgangspartie (AV-60) war sowohl nach dem Sweatbox-Test als auch
nach dem Aufwuchstest im Gewächshaus als frei von Acidovorax anzusehen. Das
wurde auch durch die Überprüfung mittels TAS-ELISA bestätigt. In der infizierten
Ausgangspartie (AV-75) wurden sowohl im Sweatbox-Test als auch im
Aufwuchstest
Pflanzen mit typischen A. valerianellae-Symptomen bonitiert.
A. valerianellae-Bakterien wurden in diesen Symptom zeigenden Pflanzen
nachgewiesen.
Die in den Folgejahren aus der gesunden Ausgangspartie produzierten Saatgutpartien
(mit Aussaaten in den Jahren 2007 bis 2009) zeigten weder im Sweatbox-Test noch
ERGEBNISSE
106
im Aufwuchstest Symptome und ein Befall mit A. valerianellae wurde nicht
nachgewiesen.
Die Saatgutpartien aus der infizierten Ausgangspartie zeigten hingegen nach Aussaat
im Jahr 2007 in Deutschland (AV-76) und nach Aussaat im Jahr 2008 (AV-77)
typische Symptome. Ein eindeutiger Nachweis von A. valerianellae-Bakterien
erfolgte mittels TAS-ELISA. Pflanzen aus Saatgutpartien, die in Frankreich und in
Deutschland produziert wurden (AV-78 (Frankreich), AV-79 (Tröpfchen), AV-80
(Regner)), zeigten keinen nachweisbaren Befall (Tab. 3.13).
Demnach lieferte eine infizierte Ausgangspartie, die Symptome sowohl im
Sweatbox-Test als im Aufwuchstest zeigt, nicht zwangsläufig A. valerianellae
kontaminiertes Saatgut. Aus einer gesunden symptomlosen Ausgangspartie entstand
wiederum gesundes Saatgut.
Abbildung 3.22: Sichtbare typische A. valerianellae-Symptome 25 Tage nach der
Aussaat in Vermiculit (Sweatbox-Test) bei Kultivierung unter gesättigter
Luftfeuchte.
ERGEBNISSE
107
Tabelle 3.13: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test und im
Aufwuchstest. Der Nachweis erfolgte durch klassisches Isolieren und mittels TAS-ELISA in
Pflanzen mit verdächtigen Symptomen.
Nachweis von A. valerianellae
Saatgutpartie
AV-60
Ausgangssaatgut
(gesund)
(ungebeizt)
AV-75
(kontaminiert)
AV-60
Ausgangssaatgut
(gesund)
(gebeizt)
AV-75
(kontaminiert)
Sweatbox-Test
Aufwuchstest
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
AV-61,
Deutschland
(gesund)
AV-76,
Deutschland
Aussaat 2007
(kontaminiert)
AV-63,
Frankreich
(gesund)
AV-78,
Frankreich
(kontaminiert)
ERGEBNISSE
108
Fortsetzung Tab. 3.13
Nachweis von A. valerianellae
Saatgutpartie
AV-62
(gesund)
Sweatbox-Test
Aufwuchstest
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
Aussaat 2008
AV-77
(kontaminiert)
AV-64,
Tröpfchen
(gesund)
AV-65,
Regner
Aussaat 2009
(gesund)
AV-79,
Tröpfchen
(kontaminiert)
AV-80,
Regner
(kontaminiert)
ERGEBNISSE
3.4.1.2
109
Ankeimmethode auf Papier
Mit der Ankeimmethode auf Papier wurden Saatgutpartien auf eine Belastung mit
A. valerianellae untersucht.
Die Nachweisgrenzen lagen bei diesen Untersuchungen bei einem OD-Wert von
0,076 für die Beurteilung des Ausgangssaatgutes sowie für die Saatgutpartien mit
Aussaat 2007 beziehungsweise bei einem OD-Wert von 0,098 für die Saatgutpartien,
die im Jahr 2008 und 2009 ausgesät wurden.
Die OD-Werte der gesunden Ausgangspartie (AV-60) lagen zu allen Zeitpunkten
nach der Aussaat unterhalb der Nachweisgrenze von 0,076. Die infizierte, ungebeizte
Ausgangspartie (AV-75) erreichte am Tag null der Untersuchung einen OD-Wert
von 0,15 und war somit mit A. valerianellae belastet. Beide Saatgutpartien keimten
jedoch nicht, so dass eine Befallsfreiheit beziehungsweise Kontamination mit
A. valerianellae nicht im Keimverlauf nachgewiesen wurde.
Bei der Untersuchung aller anderen Saatgutpartien wurden ab dem vierten Tag
Keimlinge zur Untersuchung herangezogen. So lagen, mit Ausnahme der
Saatgutpartie „AV-76 (Deutschland, kontaminiert)“ und „AV-64 (Tröpfchen,
gesund)“
alle
Saatgutpartien
zu
allen
vier
Zeitpunkten
unterhalb
der
Nachweisgrenzen. Die beiden Saatgutpartien “AV-76 (Deutschland)“ und „AV-64
(Tröpfchen)“ lagen am vierzehnten Tag nach der Aussaat mit OD-Werten von 1,765
beziehungsweise
2,094
deutlich
beziehungsweise 0,098 (Tab. 3.14).
über
den
Nachweisgrenzen
von
0,076
ERGEBNISSE
110
Tabelle 3.14: OD-Wert von Proben verschiedener Saatgutpartien im TAS-ELISA bei der
Ankeimmethode auf Papier.
OD-Werte
über
einer
Nachweisgrenze
von
0,076
(Ausgangssaatgut,
Aussaat
2007)
beziehungsweise 0,098 (Aussaat 2008, Aussaat 2009) galten als A. valerianellae-positiv
(gekennzeichnet durch ein +).
OD-Wert (TAS-ELISA) nach
feuchter Inkubation der Samen für
Aussaat 2007
Ausgangssaatgut
Ausgangssaatgut
Saatgutpartie
verschiedene Tage nach Aussaat
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
AV-60 (gesund, ungebeizt)
0
0
0
0
AV-60 (gesund, gebeizt)
0,01
0
0
0
AV-60 (gesund, entbeizt)
0
0
0
0
AV-75 (kontaminiert, ungebeizt)
0,15+
0
0
0
AV-75 (kontaminiert, gebeizt)
0,03
0
0
0,03
AV-75 (kontaminiert, entbeizt)
0,04
0,01
0,01
0,04
AV-61, Deutschland (gesund)
0
0
0
0,02
0,03
0
0,03
1,76+
0
0
0
0,01
0
0
0
0,01
AV-76, Deutschland
(kontaminiert)
AV-63, Frankreich (gesund)
AV-78, Frankreich
(kontaminiert)
ERGEBNISSE
111
Fortsetzung Tab. 3.14
OD-Wert (TAS-ELISA) nach
feuchter Inkubation der Samen für
Aussaat 2008
Saatgutpartie
verschiedene Tage nach Aussaat
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
AV-62 (gesund)
0
0
0
0
AV-77 (kontaminiert)
0
0,03
0
0
0
0
0
2,09+
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
AV-64, Tröpfchen
Aussaat 2009
(gesund)
AV-79, Tröpfchen
(kontaminiert)
AV-65, Regner
(gesund)
AV-80, Regner
(kontaminiert)
ERGEBNISSE
3.4.1.3
112
Bestimmungen durch Fremdfirmen
Freundlicherweise wurden Saatgutpartien aus dem Versuch zum Übertragungsweg
Saatgut von zwei Fremdfirmen auf ihre Kontamination mit A. valerianellae
untersucht.
So wurde das Saatgut bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan im Sweatbox-Test
in Kombination mit einer PCR-Methode auf eine A. valerianellae-Belastung
untersucht. Beide Firmen bonitierten das nicht-infizierte Ausgangssaatgut (AV-60)
als nicht-symptomzeigend und entnommene Pflanzenproben waren PCR-negativ.
Pflanzen aus der kontaminierten Partie (AV-75) zeigten Symptome und im PCRVerfahren war A. valerianellae nachweisbar.
Bei den nach Aussaat im Jahr 2007 produzierten und 2008 geernteten Partien in
Deutschland und Frankreich war bei Enza Zaden keine Untersuchung der Samen
möglich. Zum einen keimte das Saatgut aus Deutschland (AV-61 (gesund) und
AV-76 (kontaminiert)) nicht, zum anderen wurde das gekeimte Saatgut aus
Frankreich (AV-63 (gesund) und AV-78 (kontaminiert)) zu schnell von Pilzen
überwachsen. Bei Rijk Zwaan war ebenfalls keine Untersuchung der Saatgutpartien,
die in Deutschland produziert wurden, möglich. Die Saatgutpartien, die in Frankreich
produziert wurden, wurden von Rijk Zwaan als nicht befallen (AV-63 (gesund))
beziehungsweis als befallen (AV-78 (kontaminiert)) identifiziert.
Die nach Aussaat im Jahr 2008 im Folgejahr geernteten Saatgutpartien (AV-62
(gesund) und AV-77 (kontaminiert)) waren nach Untersuchung von Enza Zaden mit
A. valerianellae
belastet,
während
die
Saatgutpartie,
die
aus
gesundem
Ausgangssaatgut produziert wurde, laut Rijk Zwaan gesund und die, die aus
infiziertem Saatgut produziert wurde, infiziert war.
Die im Jahr 2010 geernteten vier Saatgutpartien (Aussaat 2009) waren laut
Untersuchung von Enza Zaden alle negativ. Die Untersuchung derselben
Saatgutpartien bei Rijk Zwaan erbrachte keine Ergebnisse, da die Proben zu stark mit
Pilzen kontaminiert waren (Tab. 3.15).
ERGEBNISSE
113
Tabelle 3.15: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test in
Kombination mit einer PCR bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan.
1
keine Keimung des Saatgutes, daher keine visuelle Bonitur und Probenahme möglich
2
gekeimtes Saatgut stark von Pilzen überwachsen, keine Auswertung möglich
Nachweis von A. valerianellae
Saatgutpartie
AV-60
Ausgangssaatgut
(gesund)
(ungebeizt)
AV-75
(kontaminiert)
Enza Zaden
Rijk Zwaan
-
-
+
+
1
1
AV-61,
Deutschland
(gesund)
AV-76,
Deutschland
Aussaat 2007
(kontaminiert)
AV-63,
Frankreich
(gesund)
2
AV-78,
+
Frankreich
(kontaminiert)
AV-62
Aussaat 2008
(gesund)
AV-77
(kontaminiert)
+
-
+
+
ERGEBNISSE
114
Fortsetzung Tab 3.15
Nachweis von A. valerianellae
Saatgutpartie
Enza Zaden
Rijk Zwaan
AV-64,
Tröpfchen
-
(gesund)
AV-65,
Regner
Aussaat 2009
-
(gesund)
2
AV-79,
Tröpfchen
-
(kontaminiert)
AV-80,
Regner
(kontaminiert)
-
ERGEBNISSE
115
3.4.2
Dekontaminationsmaßnahmen
3.4.2.1
Überprüfungen einer Warmwasserbehandlung
In den Jahren von 2006 bis 2009 wurden zunächst an gesundem Saatgut der Sorte
AV-1 (Kalibrierung 2,00-2,25) Behandlungen mittels Warmwasserbeize und deren
Wirkungen auf die Keimfähigkeit überprüft, um Grenzwerte zu ermitteln, ab denen
ein nicht tolerierbarer Keimfähigkeitsverlust auftrat. So wurden Behandlungen bei
30 °C für 120 Minuten, 35 °C für 90 Minuten, 40 °C für 60 Minuten, 50 °C für
40 Minuten, 55 °C für 30 und 40 Minuten und bei 60 °C für 10 und 20 Minuten
durchgeführt, die sich aufgrund hoher Verluste in der Keimfähigkeit als ungeeignet
erwiesen (Ergebnisse nicht dargestellt). Außerdem war der mit den Jahren natürliche
Verlust an Keimfähigkeit durch die Lagerung der Samen zu erkennen. Erstaunlich
war, dass ein und dieselbe Behandlung (gleiche Temperatur und Einwirkzeit) in
verschiedenen Jahren einen unterschiedlichen Einfluss auf die Keimfähigkeit hatte
(Ergebnisse nicht dargestellt). Grundsätzlich nahm die Keimfähigkeit mit steigenden
Temperaturen und steigenden Einwirkzeiten tendenziell ab.
Behandlungen bei 43 °C für 20 Minuten, 47 °C für 45 Minuten, 50 °C und 55 °C für
jeweils 10 und 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten erwiesen sich hingegen als
tolerierbar in Bezug auf die Keimfähigkeit. So kam es bei der Warmwasserbeizung
bei 55 °C für 20 Minuten zu einer Abnahme der Keimfähigkeit von 20 %, die
Keimfähigkeiten der Samen der anderen Warmwasserbehandlungen reduzierten sich
lediglich um 3,2 % (Abb. 3.23 A).
Dieses Ergebnis wurde mit den Saatgutsorten AV-220 (Kalibergröße 2,00-2,25),
AV-17 (Kalibergröße 2,00-2,25) und AV-219 (Kalibergröße 2,00-2,25) überprüft. So
war die Keimfähigkeit der Samen der Sorte AV-220 nach Behandlung bei 55 °C für
20 Minuten lediglich um 2,5 % in ihrer Keimfähigkeit (89,8 %) in Bezug auf die
unbehandelte Variante (Kontrolle, Keimfähigkeit 92,3 %) reduziert, während die
Keimfähigkeit durch die anderen sechs Behandlungen teilweise auf 98,3 %
(Behandlung für 20 Minuten bei 43 °C) gesteigert wurde (Abb. 3.23 B). Das gleiche
Bild zeigte sich nach entsprechender Behandlung der Samen bei der Sorte AV-17.
Eine deutliche Reduzierung der Keimfähigkeit zeigte sich auch hier nur bei den
ERGEBNISSE
116
Samen, die bei 55 °C für 20 Minuten warmwasserbehandelt wurden. So keimten
78 % dieser Samen gegenüber gekeimten Samen in der Kontrolle (93 %). Andere
warmwasserbehandelte Samen zeigten eine Steigerung der Keimfähigkeit. Bei den
Behandlungen bei 50 °C für 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten steigerte sich
die Keimfähigkeit auf 98 % (Abb. 3.23 C). Die Keimfähigkeit der Samen der Sorte
AV-219 wurde nach 20-minütiger Behandlung bei 43 °C minimal gesteigert (von
97,3 % in der Kontrolle auf 98,8 %). Die Behandlungen bei höheren Temperaturen
führten insgesamt zur Reduzierung der Keimfähigkeit. Nach einer Behandlung bei
47 °C für 45 Minuten keimten 49,5 % der Samen. Eine Behandlung bei 50 °C für
20 Minuten (62,3 %) sowie bei 55 °C für 10 (58 %) und 20 Minuten Behandlungszeit
(33 %) und bei 60 °C für 5 Minuten (69,5 %) führte zu Keimfähigkeitsreduzierungen
(Abb. 3.23 D).
Ebenso
wurden
diese
Warmwasserbehandlungen
auf
ihre
Eignung
als
Dekontaminationsmaßnahme an den infizierten Sorten AV-17 (2009, Kalibergröße
2,00-2,25)
und
AV-219
(2009,
Kalibergröße
2,00-2,25)
überprüft.
Die
Dekontaminationswirkung wurde mittels Ankeimmethode auf Papier und TASELISA geprüft. Die Samen beziehungsweise Keimlinge wurden an den Tagen null,
vier, neun und 14 nach der Aussaat mit Extraktionspuffer homogenisiert (je 0,2 g
Samen plus 3 ml Puffer) und im ELISA analysiert. Als kontaminiert galten die
Saatgutproben von Keimlingen, die nach vier, neun oder 14 Tagen höhere OD-Werte
als zum Zeitpunkt null erreichten, da steigende OD-Werte auf eine Vermehrung von
A. valerianellae deuten.
Unbehandelte Samen der Sorte AV-17 erreichten einen OD-Wert von 0,132 am Tag
null, vier Tage nach der Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,091 gemessen, während
die Werte für den neunten (OD-Wert 0,807) und 14. Tag (OD-Wert 2,88) nach
Aussaat deutlich oberhalb des ursprünglichen Wertes von 0,132 lagen. Samen, die
für 20 Minuten bei 43 °C warmwasserbehandelt wurden, zeigten einen Anfangs-ODWert von 0,224. Am Tag vier reduzierte sich der OD-Wert auf 0,068, um am neunten
Tag deutlich anzusteigen (OD-Wert 1,498) und erneut auf einen OD-Wert von 0,193
am Tag 14 zurückzufallen. Ebenso reagierten die Samen, die für 45 Minuten bei
47 °C behandelt wurden. Auch hier fiel der OD-Wert von zunächst 0,046 (Tag null)
ERGEBNISSE
117
auf 0,032 (Tag vier) ab, stieg auf einen OD-Wert von 0,213 (Tag neun) an und fiel
erneut ab (OD-Wert 0,099, Tag 14). Nach einer Behandlung bei 50 °C für
10 Minuten lagen die OD-Werte bei 0,153 (Tag null), 0,11 (Tag vier), 0,735 (Tag
neun) und 0,324 (Tag 14). Nach 20-minütiger Behandlung bei 50 °C stiegen die ODWerte kontinuierlich von 0,132 (Tag null) auf 0,363 (Tag 14) an. Eine 10-minütige
Behandlung bei 55 °C lieferte ebenfalls eine Zunahme der OD-Werte von Beginn
0,068 (Tag null) auf 0,257 am 14. Tag. OD-Werte von Samen, die für 20 Minuten in
55 °C warmem Wasser behandelt wurden, lagen anfangs bei 0,353, fielen auf über
die Hälfte auf 0,148 (Tag vier) ab, stiegen deutlich auf 0,392 (Tag neun) an und
fielen erneut auf 0,184 (Tag 14). Bei 60 °C für 5 Minuten behandelte Samen lieferten
einen kontinuierlichen Anstieg der OD-Werte von Tag null zu Tag 14 von 0,073 auf
0,932 (Abb. 3.24 A).
Alle OD-Werte behandelter Samen, mit Ausnahme der für 20 Minuten bei 55 °C
durchgeführten Behandlung, waren an mindestens einem Termin zwischen Tag vier
und 14 im Vergleich zu Tag null eindeutig angestiegen und galten somit als
A. valerianellae belastet.
OD-Werte
unbehandelter
Samenproben
der
Sorte
AV-219
zeigten
einen
kontinuierlichen und eindeutigen Anstieg von Tag null (OD-Wert 0,118) auf Tag 14
(OD-Wert 1,585). Samen, die für 20 Minuten bei 43 °C warmwasserbehandelt
wurden, wiesen einen kurzfristigen Anstieg der OD-Werte von 0,013 (Tag null) auf
0,092 (Tag vier) und 0,079 am neunten Tag auf, während der OD-Wert am vierten
Auswertungstag auf 0,013 abfiel (Tag 14). Innerhalb der vierzehntägigen
Untersuchungsdauer stiegen die OD-Werte von Samen, die für 45 Minuten bei 47 °C
behandelt wurden, von 0,063 (Tag null) über 0,068 (Tag neun) auf 0,394 (Tag 14)
an. Nach Behandlung bei 50 °C für eine 10-minütige Dauer lag der OD-Wert zu
Beginn bei 0,044, fiel etwas innerhalb von vier Tagen auf 0,033 (Tag vier) ab und
stieg am neunten und 14. Tag auf OD-Werte von 0,964 und 1,785 an. Nach einer 20minütigen Behandlungszeit bei 50 °C stieg der OD-Wert ebenfalls an, von anfänglich
0,108 (Tag null) auf 1,356 (Tag 14). Nach einer Behandlung bei 55 °C für 10 und 20
Minuten
stiegen
die
OD-Werte
ebenso
innerhalb
der
vierzehntägigen
Untersuchungsdauer an. Anfängliche OD-Werte von 0,013 (55 °C, 10 Minuten)
beziehungsweise 0,094 (55 °C, 20 Minuten) stiegen auf 1,469 (Tag 14 nach
ERGEBNISSE
118
10-minütiger Behandlung) beziehungsweise 0,833 (Tag neun nach 20-minütiger
Behandlung) an. Die 5-minütige Samenbehandlung bei 60 °C führte zu geringen ODWerten. Am ersten Untersuchungstag (Tag null) wurde ein OD-Wert von 0,03
gemessen, am Tag vier ein OD-Wert von 0,015, am Tag neun ein OD-Wert von
0,004 und 14 Tage nach Untersuchungsbeginn ein OD-Wert von 0,056. Alle ODWerte behandelter Samen, mit Ausnahme der für 20 Minuten bei 43 °C und für
5 Minuten bei 60 °C durchgeführten Behandlungen, waren an mindestens einem der
drei Untersuchungstage zwischen Tag vier und 14 im Vergleich zu Tag null
eindeutig angestiegen. Die entsprechenden Saatgutpartien waren demzufolge
weiterhin als mit A. valerianellae anzusehen (Abb. 3.24 B).
Warmwasserbehandlungen haben somit einen Einfluss auf gesundes und mit
A. valerianellae kontaminiertes Saatgut in Bezug auf die Keimfähigkeit und den
A. valerianellae-Befall. Die Keimfähigkeiten nahmen mit steigenden Temperaturen
und
Einwirkzeiten
grundsätzlich
ab,
dennoch
reagierten
die
behandelten
Saatgutpartien der Sorten unterschiedlich. Die Untersuchungen im TAS-ELISA
lieferten in der Regel geringere OD-Werte als die unbehandelte Kontrolle. Das deutet
auf
Befallsreduzierungen
durch
die
Warmwasserbehandlungen
befallsreduzierende Effekt war sortenabhängig.
hin.
Der
ERGEBNISSE
A
119
100
a
a
a
a
a
a
a
a
90
Keimfähigkeit in %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
20 Min.
45 Min.
10 Min.
20 Min.
10 Min.
20 Min.
5 Min.
43 °C
47 °C
50 °C
50 °C
55 °C
55 °C
60 °C
Behandlung
B
100
ab
b
ab
ab
20 Min.
45 Min.
43 °C
47 °C
b
ab
ab
10 Min.
20 Min.
10 Min.
20 Min.
5 Min.
50 °C
50 °C
55 °C
55 °C
60 °C
a
90
Keimfähigkeit in %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
Behandlung
Abbildung 3.23: Keimfähigkeit von warmwasserbehandelten Samen aus dem Jahr
2009. (A): Sorte AV-1, gesund, 2006, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (B): Sorte AV-220,
gesund, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (C): Sorte AV-17, kontaminiert mit
A. valerianellae, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (D): Sorte AV-219, kontaminiert
mit A. valerianellae, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander
verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur)
verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
C
120
100
ab
ab
ab
ab
b
b
ab
a
90
Keimfähigkeit in %
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrolle
20 Min.
45 Min.
10 Min.
20 Min.
10 Min.
20 Min.
5 Min.
43 °C
47 °C
50 °C
50 °C
55 °C
55 °C
60 °C
Behandlung
D
100
bc
c
abc
90
abc
Keimfähigkeit in %
80
abc
70
60
abc
ab
50
a
40
30
20
10
0
Kontrolle
20 Min.
45 Min.
10 Min.
20 Min.
10 Min.
20 Min.
5 Min.
43 °C
47 °C
50 °C
50 °C
55 °C
55 °C
60 °C
Behandlung
Fortsetzung Abbildung 3.23:
ERGEBNISSE
121
2,88
A
1,5
OD-Wert
1
0,5
0
Tag
0 0
Tag
4 4
Tag
9 9
Tag
1414
feuchte Inkubation
Inkubationsdauer
(Tage)
unbehandelt
43 °C 20 Min.
47 °C 45 Min.
50 °C 10 Min.
50 °C 20 Min.
55 °C 10 Min.
55 °C 20 Min.
60 °C 5 Min.
1,785
1,5
B
1,585
OD-Wert
1
0,5
0
0 0
Tag
4 4
Tag
99
Tag
Tag1414
Inkubationsdauer
(Tage)
feuchte Inkubation
unbehandelt
43 °C 20 Min.
47 °C 45 Min.
50 °C 10 Min.
50 °C 20 Min.
55 °C 10 Min.
55 °C 20 Min.
60 °C 5 Min.
Abbildung 3.24: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach 0, 4, 9 und 14 Tagen
Inkubation in der Ankeimmethode auf Papier von warmwasserbehandelten Samen der
A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B).
ERGEBNISSE
3.4.2.2
122
Überprüfungen einer Dampfdesinfektion
Dankenswerterweise wurde das gesunde Saatgut (AV-220, 2009) und das mit
A. valerianellae kontaminierte Saatgut (AV-17, 2009 und AV-219, 2009) durch das
Eidgenössische Volkswirtschaftsdepartement EVD, Forschungsanstalt Agroscope
Changins-Wädenswil
ACW
mit
der
Dampfdesinfektion
behandelt.
Die
Dampfdesinfektionsmaßnahme wurde sowohl bei 66 °C für 90 und für 105 Sekunden
(am 13.07.2010) als auch bei 64 °C für 120 und 150 Sekunden (am 14.09.2010)
durchgeführt. Nach der Rücktrocknung wurde die Keimfähigkeit (auf Wasseragar bei
20 °C) und die A. valerianellae-Kontamination des Saatguts untersucht.
Diese
Dampfdesinfektionen
beeinflussten
die
Keimfähigkeit
der
Samen
weitestgehend positiv (Tab. 3.16 und Abb. 3.25). So betrug der Wert der
Keimfähigkeit der gesunden Saatgutpartie (AV-220) vor der Dampfdesinfektion
98 %, während er nach Desinfektion bei 66 °C leicht verringert (94 % nach
90-sekündiger Behandlung) beziehungsweise erhöht (100 % nach 105-sekündiger
Desinfektion) war. Die Keimfähigkeit der kontaminierten Sorte AV-219 wurde nicht
(94 % vor und nach Behandlung bei 66 °C für 90 Sekunden) oder nur geringfügig
abgeschwächt (88 % nach Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden), während die
Keimfähigkeit der Sorte AV-17 nach jeder Behandlung erhöht war. So wurde die
Ausgangskeimfähigkeit von 86 % auf 94 % (90-sekündige Behandlung)
beziehungsweise 100 % (105-sekündige Behandlung) erhöht.
Durch die Dampfdesinfektion bei 64 °C wurden Keimfähigkeiten reduziert. So
wurde bei der Sorte AV-220 eine Ausgangskeimfähigkeit von 92 % ermittelt, bei der
Sorte AV-219 keimten 84 % und bei der Sorte AV-17 88 %. Nach 120-sekündiger
Behandlung mit 64 °C heißem Dampf keimten 96 % (nach 120-sekündiger
Behandlung) der Samen der Sorte AV-220, während nach 150-sekündiger
Behandlung 90 % der Samen keimten. Die Samen der Sorte AV-219 erreichten durch
beide Dampfdesinfektionen nicht den Keimfähigkeitswert vor der Behandlung. Nach
120 Sekunden keimten 80 %, nach 150 Sekunden 74 % der Samen. Die
Keimfähigkeit der Samen der Sorte AV-17 wurde erhöht (auf 96 % nach
120-sekündiger Behandlung und auf 98 % nach 150-sekündiger Desinfektion).
Nach beiden Dampfdesinfektionen wurde beobachtet, dass der Befall mit
anhaftenden Pilzen (Phoma, Cladosporium, Stemphylium, Rhizopus) rückläufig war.
ERGEBNISSE
123
Sie waren nach der Behandlung kaum beziehungsweise gar nicht mehr vorhanden
(nicht dargestellt).
Eine Überprüfung der Keimfähigkeit dampfbehandelter Samen auf Filterpapier und
bei kühlen, dunklen Bedingungen (wie in Kapitel 2.6 beschrieben) lieferte ein
ähnliches Ergebnis (Abb. 3.25). Die Keimfähigkeit der Sorte AV-220 betrug vor der
Behandlung 92 %, die durch die Dampfdesinfektion bei 66 °C sowohl für 90 als auch
für 105 Sekunden auf 96 % (90 Sekunden) beziehungsweise 93 % (105 Sekunden)
gesteigert werden konnte. Eine Dampfdesinfektion bei 64 °C (bei 120- und
150-sekündiger Behandlung) hatte eine Reduzierung der Keimfähigkeit auf 87 % zu
Folge. Die Keimfähigkeit der Sorte AV-219 wurde sowohl nach Behandlung bei
66 °C als auch nach Behandlung bei 64 °C reduziert. Bei beiden Temperaturen
wurde
jeweils
eine
geringere
Keimfähigkeit
bei
länger
einwirkender
Desinfektionsphase erzielt. Stärkste Einbußen waren nach Behandlung bei 64 °C für
150 Sekunden (auf 79 %) sichtbar.
Die Keimfähigkeit der Sorte AV-17 wurde durch eine Dampfdesinfektion in allen
Fällen gesteigert. Vor der Behandlung betrug die Keimfähigkeit 90 %, nach der
Behandlung bei 66 °C hingegen 98 % beziehungsweise nach Behandlung bei 64 °C
97 % (120 Sekunden) oder 93 % (nach 150 Sekunden).
Die Dekontaminationswirkung der Dampfdesinfektion wurde ebenso wie die
Warmwasserbehandlung an den Sorten AV-17 und AV-219 mittels Ankeimmethode
auf Papier im Vergleich zu unbehandelten Samen kontrolliert.
OD-Werte der Tage null bei jeder Dampfbehandlung wurden als Schwellenwerte für
die jeweilig erzielten OD-Werte der Behandlungen für den vierzehntägigen
Versuchszeitraum für die Ankeimmethode auf Papier herangezogen. Unbehandelte
Samen der Sorte AV-17 erreichten am Tag null einen OD-Wert von 0,904. Dieser
hohe Wert verringerte sich zunächst am vierten Tag auf einen OD-Wert von 0,362,
steigerte sich jedoch auf einen OD-Wert von 3,279 (Tag neun) und auf 3,317
(Tag 14). Dampfbehandelte Samen, die für 90 Sekunden bei 65 °C behandelt wurden
zeigten zu Beginn einen OD-Wert von 0,468 (Tag null), vom vierten über den
neunten bis zum 14. Tag verringerten sich jedoch die OD-Werte von 0,741 über
0,315 auf 0,105. Die Behandlung, die ebenfalls bei 65 °C und für 105 Sekunden
ERGEBNISSE
124
durchgeführt wurde, zeigte einen kontinuierlichen Anstieg der OD-Werte von
anfänglich 0,625 (Tag null) auf 2,566 (Tag 14). Nach einer Dampfbehandlung bei
64 °C für 120 Sekunden wurde am Tag null ein OD-Wert von 0,361 erreicht, der
dann auf 0,243 (Tag vier) abfiel, um nach neun beziehungsweise 14 Tagen auf einen
OD-Wert von 0,72 und 2,851 anstieg. Nach einer Behandlung bei 64 °C für
150 Sekunden ergab sich zu Beginn ein OD-Wert von 0,628. Nach vier Tagen fiel
der OD-Wert auf 0,577, um nach neun Tagen auf 1,055 anzusteigen und nach
14 Tagen erneut auf einen OD-Wert von 0,061 abzufallen (Abb. 3.26 A).
Bei der Untersuchung von Keimlingen beziehungsweise Pflanzen aus unbehandelten
Samen der Sorte AV-219 zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei der Sorte AV-17.
OD-Werte unbehandelter Samen der Sorte AV-219 stiegen über den vierzehntägigen
Zeitraum der Untersuchung für die Ankeimmethode auf Papier nahezu kontinuierlich
an. Zu Beginn wurde ein OD-Wert von 0,497 (Tag 0) gemessen, der sich auf einen
hohen OD-Wert von 3,143 (Tag 14) steigerte. Samen, die nach einer
Dampfbehandlung bei 66 °C für 90 Sekunden untersucht wurden, erreichten
geringere OD-Werte. Zum Zeitpunkt null wurde dabei ein anfänglicher OD-Wert von
0,117 gemessen, am vierten Tag nach Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,069
gemessen. Zum neunten Tag nach Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,266 ermittelt
während am Tag 14 lediglich ein OD-Wert von 0,007 erzielt wurde. Nach einer
Dampfbehandlung für 105 Sekunden (bei 66 °C) wurde zunächst ein OD-Wert von
0,191 (Tag 0) gemessen, nach vier Tagen von 0,077, nach neun Tagen von 0,031 und
abschließend (Tag 14) von 0,175. OD-Werte nach einer 120-sekündigen Behandlung
bei 64 °C lagen bei 0,188 (Tag 0), 0,437 (Tag 4), 0,027 (Tag 9) und bei 0,0003 (Tag
14). Nach einer 150-sekündigen Behandlung bei 64 °C stiegen die OD-Werte von
0,081 (Tag 0) kontinuierlich auf 2,658 (Tag 14) an (Abb. 3.26 B).
Die Behandlung mit Dampf hatte bezüglich Keimfähigkeit und Dekontamination
einen Einfluss auf die Samen. Die Keimfähigkeit war nach Dampfbehandlung
lediglich bei der Sorte AV-219 signifikant von den unbehandelten Samen
verschieden und führte zu verminderten Keimfähigkeiten. Nach Durchführung der
Ankeimmethode auf Papier wurden bei der Sorte AV-17 keine durchgängigen
Verringerungen der OD-Werte erzielt, während bei der Sorte AV-219 die
ERGEBNISSE
125
Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden einen positiven, dekontaminierenden
Einfluss zu haben schien.
Tabelle 3.16: Keimfähigkeit (in % bei 20 °C und 12 Stunden Licht pro Tag) drei verschiedener
Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei 66 °C für 90 beziehungsweise 105 Sekunden
und bei 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich zur nicht-behandelten
Kontrolle.
Keimfähigkeit (%)
Dampfdesinfektion
unbehandelt
(vor Behandlung bei 66 °C)
66 °C,
90 Sekunden
66 °C,
105 Sekunden
unbehandelt
(vor Behandlung bei 64 °C)
64 °C,
120 Sekunden
64 °C,
150 Sekunden
AV-17,
AV-219,
AV-220,
kontaminiert
kontaminiert
gesund
86
94
98
94
94
94
100
88
100
88
84
92
96
80
96
98
74
90
ERGEBNISSE
a
AV-219
a
a
66 °C, 105
Sekunden
unbehandelt
a
66 °C, 90
Sekunden
66 °C, 105
Sekunden
AV-17
ab
unbehandelt
b
66 °C, 105
Sekunden
a
66 °C, 90
Sekunden
a
66 °C, 90
Sekunden
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
a
unbehandelt
Keimfähigkeit in %
A 100
126
AV-220
b
a
AV-17
64 °C, 120
Sekunden
unbehandelt
64 °C, 150
Sekunden
ab
AV-219
a
a
a
64 °C, 150
Sekunden
a
unbehandelt
a
64 °C, 150
Sekunden
a
64 °C, 120
Sekunden
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
unbehandelt
Keimfähigkeit in %
B
64 °C, 120
Sekunden
Sorte
AV-220
Sorte
Abbildung 3.25: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener
Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei (A) 66 °C für 90 beziehungsweise
105 Sekunden und bei (B) 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich
zur unbehandelten Kontrolle.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet
(p < 0,05).
ERGEBNISSE
A
127
2,851
3,317
2
2,566
OD-Wert
1,5
1
0,5
0
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
feuchte Inkubation
unbehandelt
64 °C 120 Sek.
B
66 °C 90 Sek.
64 °C 150 Sek.
3,143
2
66 °C 105 Sek.
2,658
OD-Wert
1,5
1
0,5
0
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
feuchte Inkubation
unbehandelt
64 °C 120 Sek.
66 °C 90 Sek.
64 °C 150 Sek.
66 °C 105 Sek.
Abbildung 3.26: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach Homogenisierung von
dampfbehandelten Samen der A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und
AV-219 (B) (Ankeimmethode auf Papier).
ERGEBNISSE
3.4.2.3
128
Überprüfungen einer weiteren Dekontaminationsmaßnahme
Das Saatgut der drei Sorten AV-220, AV-219 und AV-17 wurden von einer für
Saatgutbehandlungen spezialisierten Firma behandelt. Zur Firma und zu der
Methodik der Behandlung dürfen keine Angaben gemacht werden.
Die Keimfähigkeiten der drei Sorten lagen vor der Behandlung über einem Wert von
90 %, während die Keimfähigkeiten nach Behandlung etwas erhöht (Sorte AV-220
und Sorte AV-17) beziehungsweise erniedrigt (Sorte AV-219) waren. So war bei der
Sorte AV-220 ein um 2 Prozentpunkte erhöhter Wert in der Keimfähigkeit auf 94 %
vorhanden, während bei der Sorte AV-17 die Keimfähigkeit von 90 % auf 97 %
gesteigert wurde. Die Sorte AV-219 zeigte durch die Behandlung eine
Keimfähigkeitsreduzierung von 98 % auf 95 %. Diese Behandlung führte jedoch bei
allen drei Sorten zu keinen signifikanten Unterschieden in der Keimfähigkeit
(Abb. 3.27).
Eine Überprüfung der Dekontaminationswirkung durch diese Maßnahme erfolgte
mittels Ankeimmethode auf Papier im Vergleich zur unbehandelten Variante.
Vor einer Behandlung wurden bei der Sorte AV-17 hohe OD-Werte von 0,904 zum
Zeitpunkt null und nach 14 Tagen von 3,317 gemessen. Nach einer Behandlung
durch den Dienstleister stiegen die OD-Werte von 0,645 (Tag null) auf 2,898
(Tag neun) und auf 3,075 am 14. Tag nach Aussaat (Abb. 3.28 A).
Die mittels TAS-ELISA erzielten Ergebnisse lieferten über den vierzehntägigen
Zeitraum bei den unbehandelten Samen der Sorte AV-219 einen Anfangs-OD-Wert
von 0,497 (Tag null), der sich kontinuierlich auf 3,143 (Tag 14) steigerte. OD-Werte
behandelter Samen lagen an Tag null bei 0,108, nach vier Tagen bei einem OD-Wert
von 0,048 und stiegen dann ebenfalls kontinuierlich auf 3,016 (Tag 14) an
(Abb. 3.28 B).
Die Saatgutbehandlung durch den Dienstleister führte im Gegensatz zu
Warmwasserbehandlungen und Dampfbehandlungen lediglich zu geringen Effekten.
ERGEBNISSE
129
So kam es zu einer zu vernachlässigbaren Veränderung in der Keimfähigkeit. Aber
AV-17
a
AV-219
Behandlung
Dienstleister
a
a
unbehandelt
a
Behandlung
Dienstleister
a
unbehandelt
a
Behandlung
Dienstleister
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
unbehandelt
Keimfähigkeit in %
auch eine Dekontaminationswirkung war nicht festzustellen.
AV-220
Sorte
Abbildung 3.27: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener
Feldsalatsorten
nach
Behandlung
durch
einen
Dienstleister
im
Vergleich
zur
unbehandelten Kontrolle.
Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.
Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).
ERGEBNISSE
A
130
4
3,5
OD-Wert
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
feuchte Inkubation
unbehandelt
B
Behandlung Dienstleister
4
3,5
OD-Wert
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Tag 0
Tag 4
Tag 9
Tag 14
feuchte Inkubation
unbehandelt
Behandlung Dienstleister
Abbildung 3.28: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) der mit A. valerianellaekontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) zwischen Tag null und Tag 14 nach
Aussaat auf angefeuchtetem Filterpapier und Inkubation bei Raumtemperatur
(Ankeimmethode auf Papier).
Die Samen waren unbehandelt beziehungsweise durch einen Dienstleister behandelt
worden.
DISKUSSION
4
131
DISKUSSION
Mit den durchgeführten Untersuchungen zu Acidovorax valerianellae an Feldsalat
wurden Erkenntnisse im Bereich der Erregerbiologie und Epidemiologie sowie des
Einflusses von Infektionsbedingungen auf den Krankheitsverlauf gewonnen. Zudem
wurden
grundlegende
Erkenntnisse
zu
Übertragungswegen
und
zu
Bekämpfungsstrategien von A. valerianellae gewonnen.
4.1
Untersuchungen zu Infektionsbedingungen
In den Untersuchungen zu den Infektionsbedingungen des Bakteriums wurden die
Einflüsse von Temperatur, Blattalter, Blattnässedauer und Inokulumdichte erforscht.
Nach GARDAN et al. (2003) und HINRICHS-BERGER et al. (2004) kann das Bakterium
A. valerianellae Pflanzen sowohl im Keimblattstadium als auch Pflanzen im
Laubblattstadium infizieren und zu Symptomen führen. Dies bestätigte sich in den
Versuchen, in denen Pflanzen unterschiedlichen Blattalters inokuliert wurden
(Kapitel 3.1.2). Der Befall an Feldsalatpflanzen war zudem innerhalb der
Infektionsversuche
sehr
von
den
vorherrschenden
Luftfeuchtigkeiten
beziehungsweise der Blattnässedauer abhängig. Die Versuchspflanzen wurden
einmalig für 48 Stunden, wöchentlich wiederkehrend (jeweils von 48-stündiger
Dauer) oder dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert (Kapitel 2.12.2).
Allgemein fiel ein starker Unterschied zwischen der Symptomatik inokulierter
Pflanzen auf, sobald sie weitestgehend trocken kultiviert beziehungsweise bei nahezu
100 % relativer Luftfeuchte mit lang andauernder Blattnässe kultiviert wurden.
Gerade bei feuchter Witterung traten vermehrt Symptome auf. GRONDEAU und
SAMSON (2009) fanden heraus, dass ein sichtbarer A. valerianellae-Befall stark von
einem für 90 Stunden andauernden Wert von über 85 % relativer Luftfeuchtigkeit
gefördert wird. Daher sollten Feldsalatbestände möglichst trocken gehalten werden,
um einen Befall mit A. valerianellae zu vermeiden beziehungsweise zu vermindern
(MOLTMANN et al., 2000). Alle Pflanzen, die bei eigenen Versuchen nach der
Inokulation lediglich für die ersten 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert
DISKUSSION
132
wurden, zeigten keine Symptome. Alle Pflanzen, die dauerhaft bei gesättigter
Luftfeuchte kultiviert wurden, waren zu Versuchende Symptom tragend. Bei
Pflanzen, die im wöchentlichen Abstand bei hoher Luftfeuchtigkeit (das heißt für die
ersten 48 Stunden erfolgte die Kultivierung nach der Inokulation bei gesättigter
Luftfeuchte, dann fünf Tage bei normal vorherrschender Luftfeuchte, danach erneut
für 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte und so fort) kultiviert wurden, zeigten sich
ebenfalls Symptome. Eine 100 %-ige Befallshäufigkeit wurde dabei aber nicht
erreicht. Es war ein deutlicher Unterschied zwischen den im Keimblatt und den im
Laubblatt inokulierten Pflanzen sichtbar, was mit einer unterschiedlichen
Blattoberfläche und -masse zusammenhing. Je weniger Blattmasse vorhanden war,
desto schneller trockneten die Blätter ab. Die Feuchtigkeit ist für die Bakterien von
enormer Wichtigkeit. So überstanden sie eine fünftägige Zeitspanne bei trockenen
Bedingungen ohne Blattnässe (wöchentlicher Abstand), wohl aber nicht eine
Trockenperiode von 30 Tagen beziehungsweise 33 Tagen bei einmaliger Kultur für
48 Stunden unter gesättigten Luftfeuchten nach der Inokulation, da zu Versuchende
keine Symptome sichtbar waren (Abb. 3.5).
Aus den Versuchen, wie sie in Kapitel 3.1.3 beschrieben sind, wird diese
Abhängigkeit
zwischen
Blattnässe
beziehungsweise
einer
hohen
relativen
Luftfeuchte und Symptomatik an inokulierten Feldsalatpflanzen deutlich. Nach einer
28-tägigen Kultivierung unter trockenen Bedingungen führte eine Weiterkultur bei
gesättigter Luftfeuchte zwischen 38 dpi und 51 dpi zu einer leichten Zunahme der
Befallsstärke von 3,5 % auf 4,7 % (Tab. 3.2). Ebenfalls wurde gezeigt, dass die
Bakterien innerhalb von fünf Stunden in die Pflanze eindringen und mindestens
sieben Tage unter ungünstigen, trockenen Bedingungen überleben, bevor sie bei
gesättigter Luftfeuchte zu Symptomen führen (Abb. 3.9 und Abb 3.10). Die
Bakterien lebten bei trockener Kultur der inokulierten Pflanzen nicht epiphytisch auf
der Blattoberfläche, da Symptome bereits neun Tage nach Inokulation sichtbar
waren. Wären die Bakterien erst innerhalb von zwei Tagen (ab 7 dpi) bei für sie
günstigen, feuchten Bedingungen in das Blatt eingedrungen, so wären Symptome
frühestens nach vier Tagen nach Wiederbefeuchtung beziehungsweise 11 dpi
sichtbar gewesen. Die Ergebnisse in den Abbildungen 3.1, 3.3, 3.4 und 3.5 B
belegen, dass sichtbare Symptome frühestens 4 dpi, bei Kultur unter gesättigter
DISKUSSION
133
Luftfeuchte, an Pflanzen vorhanden sind. MOLTMANN (1999) beschrieb hingegen,
dass Xanthomonas campestris pv. vitians Kopf- und Eissalatpflanzen sowie viele
Unkrautarten
epiphytisch
besiedelt.
So
kann
sich
diese
bakterielle
Blattfleckenkrankheit so lange ohne Symptome auf der Pflanzenoberfläche halten,
wie die Witterungsbedingungen für sie zunächst ungünstig sind. Erst nach längeren
Regenperioden
oder
häufiger,
starker
Taubildung
kommt
es
zu
einem
Befallsausbruch.
Zu erkennen waren zwei grundsätzliche Ergebnisse: Der sichtbare Befall an Pflanzen
war stark von der Blattnässedauer beziehungsweise der relativen Luftfeuchte
abhängig. Ist keine für Bakterien günstige, annähernd gesättigte Luftfeuchte
vorhanden, so führt eine Inokulation nicht zu einem sichtbaren Befall an Pflanzen
(Abb. 3.5, 3.9, 3.10).
Die starke Abhängigkeit zwischen Feuchtigkeit in Form von Blattnässe und
Krankheitssymptomen wurde bei vielen Pflanzenpathogenen beschrieben. So zeigt
der
Forschungsauftrag
des
LANDWIRTSCHAFT UND FORSTEN
BUNDESMINISTERIUM
FÜR
ERNÄHRUNG,
(2001), dass die Krankheitsentwicklung des Pilzes
Septoria petroselini an Petersilieblättern stark von der relativen Luftfeuchtigkeit
abhängig ist. Bei einer relativen Luftfeuchte von 65 % kommt es zu einer geringen
Krankheitsentwicklung, während der Befall bei einer Erhöhung der Luftfeuchte auf
85 % deutlich ansteigt. Förderlich für den Befall ist zudem eine zeitlich direkt auf die
Inokulation folgende hohe Luftfeuchtigkeit. Aber auch nach einer längeren
Trockenphase von bis zu 72 Stunden nach der Inokulation werden hohe
Befallsstärken erzielt, wenn danach wieder feuchte Bedingungen herrschen.
LEBEN (1988) berichtet, dass sich an inokulierten Gurkenknospen keine
Pseudomonas syringae pv. lachrymans- und P. syringae pv. syringae-Bakterien
isolieren lassen, sobald die Pflanzen nach der Inokulation bei relativen Luftfeuchten
zwischen 30 % und 50 % kultiviert werden. Werden sie im Tag-/Nachtrhythmus bei
unterschiedlichen Luftfeuchten zwischen 50 % bis 60 % und 90 % kultiviert, so ist
der Nachweis intermediär. Nach Kultivierung zwischen 80 % und 90 % relativer
Luftfeuchte lassen sich jedoch aus nahezu allen Knospen Bakterien isolieren.
Eine starke Abhängigkeit zwischen dem Befall von Xanthomonas smithii ssp. citri an
Zitrusgewächsen und der Blattnässedauer wird ebenfalls berichtet. So reichen vier
DISKUSSION
134
Stunden Blattnässe aus, um bei optimalen Temperaturen zwischen 25 °C und 35 °C,
einen 100 %-igen Befall an Pflanzen hervorzurufen (PRIA et al., 2006)
Diese Ergebnisse lassen sich auf die hier vorgestellten Ergebnisse übertragen. Die
Feldsalatpflanzen zeigten, trotz zeitweiliger Verringerung der Luftfeuchtigkeit, eine
teilweise starke Erhöhung der Krankheitsentwicklung bezüglich Befallsstärke und
Befallshäufigkeit, sobald anschließend wieder feuchte Bedingungen herrschten
(Abb. 3.5, 3.7, 3.9, 3.10, Tab. 3.2). Dieser Anstieg des Kranheitsverlaufs bei erneuter
Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchtigkeit war jedoch von der Dauer der ersten
Phase unter gesättigter Luftfeuchtigkeit abhängig. Dies wird aus den Ergebnissen der
Abbildung 3.7 deutlich. Je länger die erste Phase unter feuchten Bedingungen
andauerte, desto geringer war der Anstieg der Befallsstärke nach Wiederbefeuchten
der Feldsalatpflanzen. Inokulierte Pflanzen, die in der ersten Phase 14 Tage
beziehungsweise 18 Tage feucht inkubiert wurden (Abb. 3.7, Versuchsglieder D und
E), zeigten nach siebentägiger Kultivierung unter trockenen Bedingungen bei
Wiederbefeuchtung nur eine sehr schwache oder keine Zunahme der Befallsstärke.
Normalerweise sind geschwächte Pflanzen anfälliger gegenüber Pathogenen und
zeigen mehr Symptome. Dies trifft in diesem Fall jedoch nicht zu. Auf welchen
Grund dieses Ergebnis zurückzuführen war, konnte abschließend nicht geklärt
werden.
CAVALCANTI et al. (2005) beschreiben, dass Acidovorax avenae subsp. citrulliBakterien zwischen 1 °C und 42 °C wachsen, wobei ihr Optimum bei 32 °C liegt.
A. valerianellae-Bakterien
weisen
hingegen
auf
Nährmedium
ein
Wachstumsoptimum bei 28 °C auf, während unter einer Minimumtemperatur von
4 °C und über einer Maximumtemperatur von 41 °C kein Wachstum stattfindet
(GARDAN et al., 2003, JASU, 2004). Aus vorherigen Versuchen war bekannt, dass
Infektionsversuche im Bereich zwischen 10 °C bis 25 °C (GRONDEAU und SAMSON,
2009), 15 ° C (BARCHEND, 2006) und 18 °C (BRAJE, 2005) erfolgreich waren. Um
den Temperatureinfluss in vivo zu ermitteln, wurden inokulierte Feldsalatpflanzen
bei Temperaturen zwischen 10 °C und 30 °C bei gesättigten Luftfeuchten kultiviert
und hinsichtlich Befallsstärke und Befallshäufigkeit bonitiert (Kapitel 3.1.1). Da in
den letzten Jahren die Züchtung von Sommersorten zugenommen hat und somit ein
ganzjähriger Anbau möglich ist, waren diese Untersuchungen innerhalb dieser
DISKUSSION
135
Temperaturspanne sinnvoll. Im Feldsalatanbau werden durchaus tiefere (vor allem
im Winter im Freiland) beziehungsweise höhere (vor allem im Sommer bei Anbau
im Gewächshaus) Temperaturen erzielt.
Unter den getesteten Temperaturen gab es keine, bei der die inokulierten Pflanzen
keine A. valerianellae-Symptome zeigten. Eine Kultivierung der Pflanzen führte bei
allen Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchtigkeit zu einem sichtbaren Befall. Es
waren jedoch in der Symptomausprägung und in der Symptomhäufigkeit
Unterschiede zwischen den einzelnen Temperaturstufen während der Inkubation
festzustellen. So nahmen beide Parameter mit zunehmender Temperatur während des
Versuches zu. Innerhalb einer Inkubationstemperaturstufe nahmen die Werte mit
zunehmender Dauer der Kultivierung ebenfalls zu. Eine Korrelation zwischen Befall
und Temperatur war deutlich zu erkennen. Je höher die Temperatur desto höher war
der sichtbare Befall an Feldsalatpflanzen (Abb. 3.1 und 3.2). Dies bestätigen auch
GRONDEAU und SAMSON (2009), die zeigten, dass die Anzahl befallener
Feldsalatpflanzen zunimmt, wenn die Temperatur steigt und die Phase mit
Luftfeuchten über 85 % länger als 90 Stunden andauert.
Weiterhin war in eigenen Versuchen zu erkennen, dass bei höheren Temperaturen
und gesättigter Luftfeuchte das Pflanzenwachstum nicht optimal war. Die Pflanzen
wuchsen zum einen bei höheren Temperaturen schneller, zum anderen waren sie
durch den sich weiterentwickelnden Befall geschwächt und konnten daher zur
Bonitur teilweise nicht herangezogen werden (Abb. 3.1, 30 °C, 12 dpi und Abb. 3.2,
20 °C, 25 dpi). Eine Überprüfung des Einflusses von Temperaturen zwischen 15 °C
und 25 °C auf die Infektion von Feldsalat mit A. valerianellae lieferte ein
entsprechendes Ergebnis: Befallsstärken und Befallshäufigkeiten waren umso höher,
je höher die Inkubationstemperatur lag (Abb. 3.3 und 3.4). Diese Beobachtung lässt
sich auch in anderen Wirt-Parasit-Systemen machen. So beschreiben FUKUI et al.
(1999) eine lineare Beziehung zwischen höherer Temperatur (zwischen 19 °C und
35 °C) und der in Prozent befallenen Blattfläche an Anthurium andraeanum nach
Inokulation mit Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. LATORRE et al.
(2002 b) berichten von einer signifikant positiven Beziehung zwischen der
Temperatur (innerhalb von 5 °C und 20 °C) und dem Auftreten des Brand-Befalls an
Birnenblüten durch Pseudomonas syringae pv. syringae.
DISKUSSION
136
Die Ergebnisse, die bei Versuchen zum Einfluss auf die Infektion mit
A. valerianellae
in
Abhängigkeit
der
Temperatur,
dem
Blattalter
von
Feldsalatpflanzen, der Blattnässedauer und der Inokulumkonzentration (Kapitel 3.1.4
und 3.2.3) erzielt wurden, waren wie erwartet. Generell waren bei höheren
Konzentrationen
der
verwendeten
Einzel-Isolate
beziehungsweise
des
Isolategemisches mehr Pflanzen sichtbar erkrankt als bei geringeren Konzentrationen
(Tab. 3.3 und Abb. 3.11). Das gilt auch für die Feldsalatsorten AV-1 und AV-5
(Abb. 3.18). Die Symptome waren zudem nach Inokulation mit höheren
Inokulumdichten
schneller
sichtbar
als
nach
Inokulation
mit
niedrigen
Konzentrationen (Tab. 3.3). Das Ergebnis zeigte einen für Inokulumdichten
typischen Gradienten. Da die inokulierten Pflanzen dauerhaft bei gesättigten
Luftfeuchten kultiviert wurden, scheint das Ergebnis nicht weiter verwunderlich. So
wurden schon mit einer geringen Konzentration von 102 cfu/ml Feldsalatpflanzen
inokuliert und zeigten sichtbare Symptome. Mit zunehmender Zeit nach der
Inokulation gleicht sich der Befall, wie er nach Inokulation mit niedrigen
Isolatkonzentrationen erreicht wurde, mehr und mehr dem Befall nach Inokulation
mit höheren Isolatkonzentrationen an (Abb. 3.11). Durch das stetige Wachstum aller
Versuchspflanzen während der Versuche kam es vermehrt zu Berührungen zwischen
einzelnen Symptom tragenden Blättern mit zunächst symptomlosen Blättern
benachbarter Pflanzen. Eine sekundäre Ausbreitung war vermutlich die Folge.
LESSL et al. (2007) beschreiben ebenfalls einen positiven Zusammenhang zwischen
einer höheren Inokulumkonzentration und der Besiedlung von Wassermelonenblüten
durch Acidovorax avenae ssp. citrulli. Durch Bonitur des A. valerianellae-Befalls
nach Inokulation mittels verschiedener Methoden (Infiltration, Sprühinokulation,
Bodeninokulation und Stichinokulation) durch JASU (2004) wird auch ein für
Inokulumdichten typischer Gradient beobachtet. BRAJE (2005) berichtet, dass höhere
Konzentrationen nach Bodeninokulation vermehrt zu sichtbarem Befall an
Feldsalatpflanzen führen: so wiesen 75 % der Pflanzen nach Inokulation mit einer
Konzentration von 108 cfu/ml Symptome auf gegenüber 3 % befallene Pflanzen bei
102 cfu/ml.
Über den positiven Einfluss von Inokulumkonzentrationen in Abhängigkeit von der
Temperatur auf einen Befall berichteten LATORRE et al. (2002 a). Es kommt
vermehrt zu Frucht- und Zweiginfektionen an Süßkirsche durch Pseudomonas
DISKUSSION
137
syringae pv. syringae, sobald die Bakterienkonzentration einen Wert von mindestens
103 cfu/ml übersteigt und gleichzeitig Temperaturen von mindestens 5 °C
(Zweiginfektionen) beziehungsweise 10 °C (Fruchtinfektionen) herrschen. Weiterhin
zeigen sie, dass der Befall an Früchten und Zweigen stark von der Dauer einer
gesättigten Luftfeuchtigkeit abhängig ist. Je länger die Phase mit erhöhter
Luftfeuchte andauert, desto mehr Frucht- und Zweigbefall ist bei geringeren
Temperaturen von 5 °C und gleichzeitig erhöhten Inokulumkonzentrationen
(107 cfu/ml) vorhanden. Temperatur und hohe Luftfeuchtigkeiten stellen die
kritischen Faktoren für ein Überleben und die Krankheitsentwicklung dar, wobei die
Temperatur bei P. syringae pv. syringae an Kirsche das größere Gewicht hat. Bei
A. valerianellae stellte hingegen die Luftfeuchtigkeit den größten Einfluss auf die
Infektion dar.
Auch bei anderen Bakterienarten wie zum Beispiel Xanthomonas campestris pv.
campestris an Brassica werden sowohl die Keimlinge als auch Pflanzen im Blühoder Fruchtstadium befallen. Zudem können hier Samen, Früchte, Blätter oder die
Sprossachsen Symptome zeigen. Normalerweise zeigen infizierte Pflanzen erst ab
einer Konzentration von mindestens 105 cfu/ml Symptome. Die optimale
Wachstumstemperatur liegt bei 25 °C bis 30 °C, bei der nach sieben bis 14 Tagen
Symptome sichtbar werden. Bei Temperaturen unter 18 °C bis 20 °C entwickeln sich
keine sichtbaren Symptome an Kohlpflanzen (ANONYM, 2001).
Die
Ergebnisse
A. valerianellae
tragen
dazu
besser
zu
bei,
die
verstehen.
Infektionsbiologie
Grundsätzlich
des
Bakteriums
entsprachen
die
Versuchsergebnisse den Erwartungen, insbesondere bei der Frage nach den
Infektionstemperaturen, dem Blattalter und der Inokulumdichte. Die Ergebnisse des
Einflusses der Blattnässedauer überraschten allerdings. Hier entsprachen die
Ergebnisse der Erwartung, dass eine längere Blattnässedauer zu einem höheren
Befall in Form von sichtbaren Symptomen führt, nur zum Teil. Aus den Ergebnissen
wie sie in Kapitel 3.1.2 und 3.1.3 dargestellt wurden, ließ sich ein neues Phänomen
in der Symptomatik erkennen. Es kam teilweise zu einem Rückgang in der
Symptomausprägung an einzelnen Pflanzen und Blättern (siehe Abb. 3.5 und
Abb. 3.7). Die Erklärung hierfür lieferte eine Betrachtung des Symptomverlaufs in
Vorversuchen (zuvor nicht dargestellt). Es wurden Feldsalatpflanzen mit
DISKUSSION
138
A. valerianellae-Suspension
inokuliert
und
bei
wechselfeuchten
(an
zwei
aufeinanderfolgenden von sieben Tagen in der Woche war die Luftfeuchtigkeit
regelmäßig gesättigt) und dauerhaft bei feuchten (nahezu 100 % Luftfeuchtigkeit)
Bedingungen kultiviert. Die entstandenen Symptome wurden für jede Blattetage (von
den Keimblättern bis zum zweiten Laubblattpaar) über die Dauer des Versuches in
ihrem Aussehen und ihrer Anzahl ausgewertet. Die Symptome waren zunächst als
wässrige, ölige, dunkelgrüne Flecken zu erkennen und konnten lediglich in dieser
Stufe wieder verschwinden (Stufe 1). Die Flecken verfärbten sich nach und nach
dunkler bis sie eine schwarze Farbe annahmen (Stufe 2). Bei fortschreitendem Befall
wurden die schwarzen Flecken in einem weiteren Entwicklungsschritt nekrotisch und
es entstand eine bräunliche Verfärbung mit chlorotischen Höfen (Stufe 3).
Dies beschrieben neben MOLTMANN et al. (2000) auch GRONDEAU et al. (2007) und
FRANKENBERG (2005). Die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen nahm bei
Kultur unter gesättigter Luftfeuchte bis zum Versuchende kontinuierlich zu. Die
Anzahl der Symptom tragenden Pflanzen, die unter wechselfeuchten Bedingungen
kultiviert wurden, nahm grundsätzlich ebenfalls zu, es wurde jedoch auch ein
partieller Rückgang der Anzahl befallener Pflanzen beobachtet. Sobald die
Luftfeuchtebedingungen
nicht
mehr
den
für
das
Bakterium
optimalen
Infektionsbedingungen entsprachen, konnten Symptome, die sich in der ersten
Entwicklungsstufe (Stufe 1) befanden, wieder verschwinden. Bei Wiederauftreten
von gesättigten Luftfeuchten entwickelten sich die Bakterien im Blattgewebe jedoch
weiter und der Befall war in Form von Symptomen erneut sichtbar. Haben sich die
Bakterien schon so weit entwickelt, dass die Symptome die erste Entwicklungsstufe
überschritten haben, so ist ein Verschwinden der Symptome nicht mehr möglich,
auch wenn ungünstige Bedingungen herrschen. Der Befall bleibt sichtbar.
DISKUSSION
4.2
139
Sortenanfälligkeit
Bei einem Vergleich von verschiedenen Feldsalatsorten zeigte sich, dass alle
getesteten Sorten nach Inokulation typische A. valerianellae-Symptome aufwiesen
und keine Sorte eine vollständige Resistenz zeigte (Kapitel 3.2). Dies deckt sich mit
Beobachtungen aus dem Feld (persönliche Mitteilung T. Brand, Nützlingseinsatz
Baden e.V.). Signifikante Unterschiede gab es jedoch in der Befallsstärke und
Befallshäufigkeit inokulierter Pflanzen verschiedener Sorten (Abb. 3.12 und 3.13).
Die getestete Wildform V. rimosa (AV-13) war hingegen in allen Versuchen
befallsfrei und damit hoch resistent gegen A. valerianellae (Abb. 3.12 und 3.13). Bei
der Verwendung von einzelnen Isolaten und Inokulumdichten (Kapitel 3.2.2 und
3.2.3) wurde ebenfalls kein Befall an diesen Pflanzen hervorgerufen (Abb. 3.14,
3.15, 3.16, 3.17, 3.18 und 3.19, Tab. 3.4 und 3.5). Auch BRAJE (2005) berichtet, dass
alle acht getesteten Sorten nach Bodeninokulation ohne signifikante Unterschiede
anfällig für A. valerianellae waren.
Die Ergebnisse der Resistenzprüfung von Feldsalat gegen A. valerianellae bestätigen
ebenfalls eine Resistenz der Wildformen (BARCHEND 2006): V. rimosa und
V. dentata erweisen sich als nicht infizierbar, während alle 15 getesteten Sorten aus
dem Sortiment des Jahres 2002 anfällig waren.
Für die zukünftige Züchtung von resistenten Sorten erscheint daher ein Rückgriff auf
diese Wildarten zum Einkreuzen am vielversprechendsten.
DISKUSSION
140
4.3
Übertragungswege
4.3.1
Boden
GRONDEAU et al. (2003) berichten, dass das Bakterium A. valerianellae als
bodenübertragbar gilt und den Wirt (Feldsalat) in einem frühen Wachstumsstadium
infiziert. Weiterhin berichten sie von einer Befallszunahme bei erneuter
Feldsalataussaat je mehr A. valerianellae-Inokulum anfangs im Boden vorhanden ist
und dass Metam Sodium bei hoher Dosierung signifikant die Anzahl an Symptom
tragenden Pflanzen im Vergleich zum unbehandelten Boden reduziert. In
aufeinanderfolgenden
Feldsalataussaaten
nimmt
mit
jeder
Aussaat
die
Befallshäufigkeit zu, wenn die infizierten Pflanzen in den Boden eingearbeitet
werden. Ein direkter Nachweis des Inokulumanstiegs im Boden wurde durch
Ausplattieren von Bodenproben auf semiselektivem Medium (nach GRONDEAU
et al., 2007) geführt. Auch HINRICHS-BERGER et al. (2004) bestätigten eine Zunahme
an infizierten, Symptom tragenden Pflanzen mit jeder Kultur, die unmittelbar
nacheinander auf derselben zuvor kontaminierten Fläche erfolgte.
Untersuchungen von BRAJE (2005) bestätigen die Überdauerung ebenfalls. Nach
Einarbeitung von Ernterückständen befallener Feldsalatpflanzen und erneuter
Aussaat von gesundem Feldsalatsaatgut zeigen dort gewachsene Pflanzen bereits im
Keimblattstadium typische A. valerianellae-Symptome. Der gesamte Bestand zeigt
acht Wochen nach der Aussaat an allen Pflanzen Symptome. Eine Kalkstickstoffgabe
und eine Hitzeeinwirkung durch Abflammen des Oberbodens haben A. valerianellae
nicht eliminiert.
Die eigenen Versuche des Bodenüberdauerungsversuches über einen Zeitraum von
acht beziehungsweise zwölf Monaten an zwei Standorten ergaben, dass die
Befallshäufigkeiten in den ersten Monaten nach Einarbeitung von infiziertem
Feldsalatblattmaterial in die Böden und nachfolgender Aussaat von gesundem
Saatgut in diese Böden höher waren als mit längerem zeitlichem Abstand zur
Einarbeitung (Tab. 3.6 und 3.7). Diese Beobachtung der Symptomatik wurde mittels
TAS-ELISA-Ergebnisse bestätigt. Am Standort Quedlinburg wurden fünf Monate
nach Kontamination an neuen Feldsalataussaaten sichtbare A. valerianellaeSymptome festgestellt und auch der Nachweis im TAS-ELISA an den Pflanzen war
DISKUSSION
141
positiv. Am Standort Schifferstadt wurden zunächst über einen Zeitraum von drei
Monaten nach Kontamination positive Nachweise geführt. Nach elf Monaten wurden
jedoch erneut an 4,5 % der Pflanzen untypische A. valerianellae-Symptome im TASELISA als positiv detektiert. Eine Überdauerung über einen Zeitraum von
mindestens elf Monaten scheint somit wahrscheinlich. Aufgrund unterschiedlicher
Rottebedingungen kam es vermutlich zu einer ungleichmäßigen Verteilung des
Inokulums im Boden und neue Aussaaten wurden befallen.
Neben A. valerianellae sind noch andere Bakterienarten bodenübertragbar. So
berichtet HSU (1991) davon, dass Pseudomonas solanacearum umso länger im
Boden überdauert, je nasser dieser ist. Eine Infektion von Nachtschattengewächsen
ist dabei umso höher, je höher die Inokulumdichte im Boden ist. Xanthomonas
campestris pv. campestris überdauert ebenfalls im Boden. KOCKS et al. (1998)
beschreiben eine dreijährig durchgeführte Studie, bei der Erntereste von infizierten
Kohlbeständen in den Boden eingearbeitet wurden. Bakterien aus dem Boden
wurden anschließend isoliert und in Kohlpflanzen infiltriert (Koch`sche Postulate).
Die Wiederfindungsrate lag bei 58 %, wobei das Verschwinden der Bakterien aus
dem Boden von dem Rottegrad abhängig ist und durch höhere Temperaturen
(> 5 °C) gefördert wird. Ein kontinuierlicher Kohlanbau von Jahr zu Jahr wäre
aufgrund der zeitlichen Abnahme des Bodeninokulums und dem völligen
Verschwinden nach dem Winter möglich. Aus der Literatur sind unterschiedliche
Angaben zu der Dauer des Überlebens von Xanthomonas campestris pv. campestris
im Boden zu entnehmen. So wird von ANONYM (2001) berichtet, dass das Bakterium
so lange im Boden überdauert wie unverrottete Pflanzenreste vorhanden sind, ohne
Wirt bis zu 14 Tage im Sommer und bis zu 42 Tage im Winter. Nach SCHAAD und
WHITE (1974) überdauert das Bakterium allerdings bis zu 244 Tage, während
STRANDBERG (1973) sogar einen Zeitraum von zwei Jahren in kühlen Klimaten
angibt.
Die Infektionskette von Xanthomonas campestris pv. vitians an Salat kann durch
eine möglichst schnelle und vollständige Verrottung der Pflanzenreste unterbrochen
werden (MOLTMANN, 1999). WÖLK und SARKAR (1994) beschreiben, dass
Xanthomonas campestris pv. pelargonii in Komposterde bis zu 26 Monate
DISKUSSION
überdauert
142
und
der
Bakteriengehalt
mit
zunehmender
Zersetzung
der
Pelargoniestücke abnimmt.
Die Literatur zeigt, dass eine Überdauerung von Pathogenen oft nur so lange
nachweisbar ist, wie sich Wirte oder befallene Pflanzenreste im Boden vorfinden.
Die Umsetzung der Pflanzenreste ist stark von den klimatischen Gegebenheiten und
somit vom Standort abhängig. Der Standort hat somit auch einen wesentlichen
Einfluss auf die Überdauerung von A. valerianellae im Boden.
Für Feldsalat ist aufgrund des kleineren Habitus und dem weicheren Gewebe eine
kürzere Verrottungszeit anzunehmen als bei Kohl. Die Überdauerungszeit von
A. valerianellae im Boden beträgt mindestens elf Monate, abhängig von Inokulum
und Standort. Dass der Standort auf den Zersetzungsgrad einen großen Einfluss hat,
zeigten die Nachweise, die über elf (Schifferstadt) beziehungsweise fünf Monate
(Quedlinburg)
durchgeführt
wurden.
Zudem
wurden
die
Versuche
zu
unterschiedlichen Zeitpunkten im Jahr angelegt. In Schifferstadt erfolgte die
Einarbeitung im Herbst (September), in Quedlinburg im Frühjahr (März). Aufgrund
der klimatischen Unterschiede an den beiden Standorten (Tab. 3.8) und der
Unterschiede in der biologischen Bodenaktivität, die vom Bodenleben abhängig ist,
erscheint es nicht verwunderlich, dass Pflanzenreste schneller oder langsamer
abgebaut wurden. Niederschlag, Temperatur und Bodenaktivität stellten die
kritischen Faktoren für das Überleben der Bakterien beziehungsweise für den
Fortschritt der Zersetzung dar, wobei der Niederschlag und die Bodenaktivität hier
die größeren Einflussfaktoren waren.
4.3.2
Als
Alternative Wirtspflanzen
weitere
potentielle
Wirtspflanzen
neben
Feldsalat
wurden
insgesamt
30 Pflanzenarten aus zwölf Familien geprüft (Kapitel 3.3.2). Alle Pflanzen wurden
dazu durch Infiltrieren, Sprühen oder Stichverletzungen inokuliert. Die Auswertung
erfolgte zum einen durch visuelle Bonituren (bei zwei Versuchsansätzen), zum
anderen zusätzlich zu den visuellen Bonituren mittels Isolationen und anschließender
Durchführung des TAS-ELISA (dritter Versuchansatz). Eine Schwierigkeit bei der
Frage
nach
alternativen
Wirtspflanzen
war
die
methodische
Umsetzung.
DISKUSSION
143
A. valerianellae blieb im TAS-ELISA nachweisbar, auch wenn die entsprechenden
Blattabschnitte zuvor mit 70 %-igem Alkohol oberflächendesinfiziert wurden. Somit
ließ sich zwar durch TAS-ELISA feststellen, dass die Inokulation erfolgt war und
dass es sich um A. valerianellae-Bakterien handelte, nicht aber, ob eine Infektion
oder sogar eine Vermehrung der Bakterien im alternativen Wirtspflanzengewebe
stattfand und diese Pflanzen Wirtspflanzen von A. valerianellae sein könnten.
Die Ergebnisse basierten daher bei zwei Versuchsansätzen ausschließlich auf
visueller
Bonitur
(Kapitel
3.3.2.1
und
3.3.2.2).
Dass
es
zu
sichtbaren
Blattveränderungen durch die Infiltration bei verschiedenen Pflanzenarten kam,
erschien nicht weiter verwunderlich, da massiv in das Pflanzengewebe eingegriffen
wurde. Die Bonitur sprühinokulierter intakter Blattbereiche erschien dagegen
aufschlussreicher zu sein. So zeigten Pflanzen der Familien Amaranthaceae
(Chenopodium album (L.)), Apiaceae (Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Schübl
et. G. Martens., Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A. W. Hill), Fabaceae
(Phaseolus vulgaris (L.)) und Poaceae (Zea mays (L.)) nach Sprühinokulation
Krankheitssymptome wie auch Pflanzen, die aus den Familien Asteraceae (Lactuca
sativa (L.), Matricaria chamomilla (L.), Senecio vulgaris (L.)) und Brassicaceae
(Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Raphanus sativus subsp. sativus (L.),
Raphanus sativus (L.)) stammten. Da die bonitierten Krankheitssymptome den
typischen A. valerianellae-Symptomen an Feldsalat aber nicht in Form und Farbe
glichen, wurde die Frage nach einer potentiellen Wirtspflanzeneignung nicht
abschließend beantwortet. Es wurde weder bestätigt noch entkräftet, dass die
sichtbaren Veränderungen von A. valerianellae verursacht wurden und dass es zu
einer Anreicherung des Pathogens im alternativen Pflanzengewebe kam. Es muss
daher davon ausgegangen werden, dass die untersuchten Pflanzen als Wirtspflanzen
deutlich weniger geeignet waren als der Feldsalat oder keine Wirtspflanzen von
A. valerianellae waren.
Da sich bei der methodischen Umsetzung und der Probenaufbereitung in den ersten
beiden Versuchsansätzen Schwierigkeiten ergaben, wurde ein dritter Versuchsansatz
durchgeführt (Kaitel 3.3.2.3). Hier wurden lediglich einzelne Blatthälften von
Pflanzen aus fünf Familien und Feldsalat mit A. valerianellae-Suspension inokuliert
(Stichinokulation). Nachweise wurden sowohl durch visuelle Veränderungen im
DISKUSSION
144
Blattgewebe als auch durch die Isolation von Bakterien aus diesen Bereichen geführt.
Die Bakterienkolonien wurden anschließend im TAS-ELISA als A. valerianellaepositiv
oder
-negativ
bestimmt.
In
den
inokulierten
Blatthälften
von
Feldsalatpflanzen waren lebensfähige Bakterien nach zwölf, 26 und 33 Tagen
nachweisbar. Nach Isolationen aus den gegenüberliegenden nicht inokulierten
Blatthälften von Feldsalat wurden ebenfalls nach zwölf und 26 Tagen lebensfähige
A. valerianellae-Bakterien nachgewiesen. Das heißt, dass Bakterium hat sich in den
nicht-inokulierten Blattbereich ausgebreitet.
Zwölf bis 26 Tage nach der Stichinokulation waren an Pflanzenblättern der Familien
Asteraceae (Lactuca sativa (L.)), Apiaceae (Petroselium crispum (Mill.) Nyman &
A.W. Hill), Brassicaceae (Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Raphanus
sativus subsp. sativus (L.), Raphanus sativus (L.)) und Fabaceae (Phaseolus vulgaris
(L.), Pisum sativum (L.)) Veränderungen sichtbar, aus denen zudem lebensfähige
Bakterien isoliert wurden. Ein Nachweis lebensfähiger Bakterien war somit an allen
untersuchten Pflanzen, mit Ausnahme der Pflanzen der Familie Amaranthaceae,
möglich. Da sich das Bakterium bei diesen Pflanzen aber nicht in den nichtinokulierten Blattbereich ausgebreitet hatte, wie es bei Feldsalatpflanzen der Fall
war, muss davon ausgegangen werden, dass keine der untersuchten Pflanzen
Wirtspflanzen von A. valerianellae waren.
Bei den untersuchten Pflanzen handelte es sich sowohl um weitverbreitete Unkräuter
als auch um Gemüsepflanzen. Im Pfälzer Anbaugebiet kommt es zu einer
wechselnden Bewirtschaftung gleicher Flächen durch verschiedene Anbauer. Somit
kann Feldsalat im Fruchtfolgewechsel eine Vor- oder Nachfrucht von Möhre-,
Petersilie-, Erbse-, Zuckermais-, Eissalat-, Bataviasalat-, Radies-, Rettich- und
anderen Beständen sein (persönliche Mitteilung J. Kreiselmaier, DLR Rheinpfalz).
Ein Anbau von Feldsalat auf der gleichen Fläche wird von den Anbauern in der
Regel in einem Abstand von zwei Jahren durchgeführt (persönliche Mitteilung
J. Geil, Pfälzer Anbauer). Eine Eignung dieser Pflanzen als potentielle Wirte wäre
somit theoretisch denkbar, wurde aber in diesen Versuchen nicht nachgewiesen.
Als Bekämpfungsmaßnahme wären eine weite und abwechselnde Fruchtfolge zu
nennen, wie sie auch MOLTMANN (1999) als Bekämpfungsmaßnahme von
DISKUSSION
145
Xanthomonas campestris pv. vitians an Salat rät. Weiterhin rät sie zu einer
sorgfältigen
Unkrautbekämpfung.
Die
Adernschwärze,
verursacht
durch
Xanthomonas campestris pv. campestris, kann an vielen Arten der Brassica-Familie
vorkommen, zu denen auch Unkräuter gehören. So können Symptome an
Hirtentäschelkraut
(Capsella
bursa-pastoris),
Acker-Rettich
(Raphanus
raphanistrum) und Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana) vorkommen. Das
Pathogen sitzt dabei an Früchten, Blättern, Wurzeln, Sprossachsen und Samen
(ANONYM, 2001).
Da A. valerianellae vermutlich in Feldsalatpflanzen und Rückständen von
Feldsalatpflanzen überdauert, erscheint eine Unkrautbekämpfung zur Unterbindung
der Ausbreitung von A. valerianellae nicht unbedingt erforderlich. Es sei denn,
Feldsalatpflanzen kommen in der Fruchtfolge oder zusätzlich in bestehender
Feldsalatkultur als Unkräuter und somit als Inokulumquelle vor.
4.3.3
Saatgut
Um Feldsalatsaatgut auf eine Kontamination mit A. valerianellae zu untersuchen und
in diesem Zusammenhang die Frage nach einer möglichen Saatgutübertragung zu
beantworten, standen verschiedene Methoden zur Verfügung. So wurden die zu
untersuchenden Samen entweder in Vermiculit (Sweatbox-Test, Kapitel 2.15.1.1), in
Erde (Aufwuchstest im Gewächshaus, Kapitel 2.15.1.2) oder auf Papier
(Ankeimmethode auf Papier, Kapitel 2.15.1.3) ausgesät und an verschiedenen Tagen
nach Aussaat bonitiert, wobei die Ankeimmethode auf Papier im November 2010
von Frau K. Thiele (Julius Kühn-Institut) bereitgestellt wurde.
Die drei verwendeten Nachweisverfahren besaßen zwei Gemeinsamkeiten: die
Notwendigkeit einer hohen Luftfeuchtigkeit nach Aussaat der Samen und eine
Untersuchung von Keimlingen beziehungsweise Pflanzen im TAS-ELISA.
Unterschiedlich waren hingegen die für die Keimlinge verfügbaren Nährstoffe und
somit auch ihre Entwicklung und Widerstandsfähigkeit gegenüber A. valerianellae
und anderen Pathogenen wie beispielsweise Pilzen.
Die Durchführung und Handhabung des Aufwuchstests im Gewächshaus war
einfach. So wurde eine geringe, nicht abgezählte Samenanzahl in Erde ausgesät und
nach Kultivierung bei gesättigter Luftfeuchte wurden die Symptome an den
DISKUSSION
146
aufgelaufenen Pflanzen bonitiert. Von Pflanzen mit sichtbaren Symptomen wurden
Pflanzensaftproben
im
TAS-ELISA
überprüft.
Diese
Methode
wurde
zu
unterschiedlichen Jahreszeiten und bei unterschiedlichen Temperaturbedingungen im
Gewächshaus durchgeführt und war nicht standardisierbar, so dass die Ergebnisse
kaum reproduzierbar waren. Sie eignet sich daher nicht für eine im Routineverfahren
eingesetzte Nachweismethode, zumal das gesamte Nachweisverfahren nahezu zwei
Monate dauern würde. Zudem fehlte die Nachweissicherheit. Kontaminierte
Saatgutpartien, die zuvor in verschiedenen Versuchen nach Aussaat A. valerianellaeSymptome an Pflanzen zeigten, wurden im Aufwuchstest im Gewächshaus als nichtkontaminiert ausgewiesen.
Besser geeignet erschien hingegen der Sweatbox-Test, der unter standardisierten
Bedingungen in der Klimakammer durchgeführt wurde. Diese Nachweismethode
wird derzeit als Routineverfahren bei Saatgutzüchtern eingesetzt. Die Pflanzen
werden dabei visuell auf einen A. valerianellae-Befall untersucht und bei
verdächtigen beziehungsweise typischen Symptomen werden diese mittels PCRUntersuchung näher geprüft. Sobald eine Saatgutbelastung detektiert wird, wird diese
Saatgutpartie nicht für den weiteren Vertrieb zugelassen (persönliche Mitteilung,
A. Schieder, Enza Zaden). Die Kultivierung der Pflanzen wurde in eigenen
Versuchen in Vermiculit durchgeführt. Nach Aussaat von 5000 Samen wurde der
Test für maximal 28 Tage durchgeführt, was nur der Hälfte der Zeit gegenüber dem
Aufwuchstest im Gewächshaus entspricht. Teilweise wurden die Pflanzen sehr stark
von Pilzen überwachsen, so dass eine Bonitur nicht mehr durchzuführen war.
Kontaminierte Saatgutpartien zeigten im Sweatbox-Test zudem nicht immer einen
Befall an Pflanzen.
Für die Ankeimmethode auf Papier mit anschließendem TAS-ELISA wurden zu
untersuchende Samen als Einzelproben für bis zu 14 Tage auf feuchtem Filterpapier
ausgelegt und zu vier verschiedenen Zeitpunkten für die ELISA-Untersuchung
herangezogen. Dies entspricht der Hälfte der Zeit gegenüber dem Sweatbox-Test und
dem Viertel der Zeit gegenüber dem Aufwuchstest im Gewächshaus. Ein leichter
Rückgang der OD-Werte innerhalb des vierzehntägigen Untersuchungszeitraumes
war aufgrund des Schwankungsbereichs der Probennahme (Einzelansätze) erklärbar.
Nach Berechnung des Kontaminationsschwellenwertes (mean + 2 * s) jeder
Maxisorpplatte gab der gemessene OD-Wert der zu untersuchenden Saatgutprobe
DISKUSSION
147
Aufschlüsse über die Kontamination beziehungsweise über eine Befallsfreiheit. Das
Verfahren war schnell, einfach durchzuführen, nachweissicher und reproduzierbar.
Zudem konnte auch bei hoher Pilzbelastung ein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt
werden. Diese Methode eignet sich daher für ein Routineverfahren.
Eine Keimlingsentwicklung war für diese Untersuchung unerlässlich. Nach
persönlicher Mitteilung von K. Thiele (Julius Kühn-Institut) erreicht eine schwach
belastete Partie nach neun bis dreizehn Tagen ihren maximalen OD-Wert im TASELISA, während der OD-Wert bei einer stark belasteten Partie nach fünf bis sieben
Tagen am höchsten sei. Nach neuesten Untersuchungen am Julius Kühn-Institut ist
für einen Saatgutnachweis eine Homogenisierung angekeimter Samen nach sieben
Tagen ausreichend. Bei geringer Pathogenlast ergibt eine weitere Messung nach zehn
Tagen weiterhin Aufschluss über die Befallsfreiheit beziehungsweise Kontamination
des zu testenden Saatgutes. Die Untersuchung am Tag null ist für eine
Routinetestung nicht nötig.
Die Befallsfreiheit der gesunden Ausgangssaatgutpartie „AV-60“ und die
Kontamination der infizierten Ausgangssaatgutpartie „AV-75“ wurden mit allen drei
Methoden (Sweatbox-Test, Aufwuchstest im Gewächshaus, Ankeimmethode auf
Papier) bestätigt. Da die Samen der beiden Ausgangspartien, egal ob ungebeizt,
gebeizt oder mit entfernter Beize, mit der Ankeimmethode auf Papier zu einem
späteren Zeitpunkt (ab November 2010) untersucht wurden, keimten diese kaum
noch (> 5 %) oder gar nicht mehr. Im Fall der untersuchten Ausgangssaatgutpartien
ähneln daher die Auswertungstage vier, neun und 14 dem Ergebnis der am Tag null
durchgeführten Untersuchung und lassen keinen sicheren Nachweis zu, aber eine
Tendenz erkennen (Tab 3.18 und 3.19).
Da bei der Ankeimmethode auf Papier für jeden der vier Auswertungstage eine
gesonderte Menge des zu untersuchenden Saatgutes untersucht wurde (vier
Einzelansätze) und die Probenmenge von 0,2 g gering war, wurde schwach
kontaminiertes Saatgut nicht immer sicher nachgewiesen. So konnten die durch Rijk
Zwaan nachgewiesene Kontamination des Partie „AV-78 (Frankreich)“ und durch
Enza Zaden nachgewiesene Kontamination der Partie „AV-62“ (Tab. 3.15) weder
mit dem Aufwuchstest im Gewächshaus, dem Sweatbox-Test noch mit der
Ankeimmethode auf Papier bestätigt werden. Die im Sweatbox-Test und im
Aufwuchstest im Gewächshaus nachgewiesene Kontamination der Partie „AV-76
DISKUSSION
148
(Deutschland)“ wurde lediglich am vierten Untersuchungstag (Tag 14) durch die
Ankeimmethode auf Papier und dem TAS-ELISA bestätigt (Tab. 3.14).
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Saatgutübertragung von A. valerianellae möglich
war und auch mit verschiedenen Nachweismethoden diagnostiziert wurde.
GRIMAULT et al. (2006) sowie GRONDEAU und SAMSON (2009) bestätigen ebenfalls
eine Saatgutübertragung von A. valerianellae bei Feldsalatsaatgut. Zu untersuchende
Saatgutpartien werden hier nach einem Nachweisverfahren, das von GRIMAULT
et al. (2006) entwickelt wurde, entweder auf Papier (8 * 450 Samen) ausgelegt oder
in Substrat (jeweils 4 * 250 Samen) ausgesät. Die Kulturführung der Substratvariante
war unterschiedlich. Die Hälfte der Kisten wird bei normalen Bedingungen
kultiviert, die übrigen bei gesättigter Luftfeuchte. Alle Methoden ergeben einen
sichtbaren Befall mit A. valerianellae, wobei mehr Pflanzen sichtbar befallen sind,
wenn sie auf Papier ausgelegt werden. Für Saatgutpartien mit hoher saprophytischer
Belastung ist eine Aussaat in Substrat von Vorteil. GRONDEAU und SAMSON (2009)
beschreiben eine qualitative Untersuchung von Feldsalatsaatgut. Dafür werden die zu
untersuchenden Samen in Wasser geschüttelt (eine Stunde bei 4 °C). Der Überstand
der Schüttelkultur wird auf Nährmedium ausplattiert. Die sich entwickelnden
Bakterien werden danach näher bestimmt.
Ob Feldsalatpflanzen, die sich aus kontaminiertem Saatgut entwickelt haben, das
Bakterium an die Folgegeneration weitergeben, scheint von mehreren Faktoren
abhängig zu sein. Zum einen trägt der entsprechende Standort, an dem die Pflanzen
das Folgesaatgut produzieren, wesentlich zu einer Übertragung bei, da an jedem
Standort unterschiedliche klimatische Bedingungen vorherrschen. So unterschieden
sich die Standorte Deutschland und Frankreich deutlich voneinander. Zum anderen
tragen das verwendete Saatgut und seine Kontamination wesentlich zu einer
Saatgutübertragung bei. Es wurde in diesen Versuchen sowohl ungebeiztes als auch
gebeiztes Saatgut einer Sorte eingesetzt. Im Allgemeinen wird eine Saatgutbeize
gegen
pilzliche
samenübertragbare
Krankheitserreger
eingesetzt
und
kann
Ertragsausfälle und Qualitätseinbußen minimieren.
Weiterhin
lässt
sich
ein
Zusammenhang
zwischen
der
A. valerianellae-
Befallshäufigkeit im Saatgutproduktionsbestand und der Nachweishäufigkeit im
DISKUSSION
Saatgut
149
erkennen.
Sind
an
vielen
Pflanzen
des
Produktionsbestandes
A. valerianellae-Symptome sichtbar, dann weisen auch die Einzelergebnisse
verschiedener Methoden auf eine höhere Belastung des produzierten Saatguts hin.
So wurde die Saatgutpartie „AV-76 (Deutschland)“ mit allen drei Methoden
(Sweatbox-Test, Aufwuchstest im Gewächshaus, Ankeimmethode auf Papier) als
kontaminiert ausgewiesen (Tab. 3.13 und 3.14), im Produktionsbestand zeigten
4,7 % der Pflanzen A. valerianellae-Symptome (Abb. 3.20). Die Saatgutpartie „AV78 (Frankreich)“ wurde nur in der Untersuchung der Firma Rijk Zwaan als belastet
eingestuft, im Produktionsbestand wiesen 1,1 % der Pflanzen Symptome auf. Eine
sekundäre Ausbreitung als Ursache für die Befallsrate der beiden Saatgutpartien
(„AV-76
(Deutschland)“
und
„AV-78
(Frankreich)“)
erscheint
jedoch
unwahrscheinlich, da die befallenen Pflanzen gleichmäßig im Bestand verteilt
auftraten und keine Ausbreitungsherde zu beobachten waren.
Nach Aussaat der kontaminierten Ausgangspartie im Jahr 2008 wurde ein
zunehmender A. valerianellae-Befall (bis 35 %) innerhalb von 66 Tagen an Pflanzen
bonitiert (Abb. 3.21). Eine sekundäre Ausbreitung war hierfür die Ursache und
Ausbreitungsherde wurden beobachtet. Die produzierte Saatgutpartie „AV-77“
wurde lediglich mit dem Sweatbox-Test und dem Aufwuchstest im Gewächshaus als
kontaminiert nachgewiesen (Tab. 3.13), mit der Ankeimmethode auf Papier war die
Saatgutpartie befallsfrei (Tab. 3.14).
Ob eine Saatgutpartie kontaminiert wird und ob die Kontamination schwach oder
stark
ist,
hängt
somit
von
der
im
Produktionsbestand
vorkommenden
Befallshäufigkeit ab. Ein hoher Befall scheint eine hohe Kontaminationsrate des
Tochtersaatguts zur Folge zu haben.
Ob es aber auch zu einer Übertragung kommt, wenn im Produktionsbestand kein
Befall sichtbar war, ließ sich weder bestätigen noch ausschließen. Bei der
samenübertragbaren Krankheit Xanthomonas campestris pv. campestris an Kohl
können auch symptomlose Pflanzen infizierte Samen produzieren (ANONYM, 2001).
WALCOTT et al. (2003) berichten ebenfalls, dass es ohne sichtbaren Befall zu einer
Saatgutübertragung von Acidovorax avenae ssp. citrulli an Wassermelonen kommt.
Nach WALKER (1952) findet die Saatgutkontamination vor allem bei hoher
Luftfeuchtigkeit und Beregnung statt, weniger durch vaskulären Transport.
DISKUSSION
150
In elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit Goldpartikelmarkierung, die am
Julius Kühn-Institut von mit A. valerianellae-kontaminierten Feldsalatsamen
durchgeführt wurden, waren vermehrt Bakterien am äußeren Rand eines
Saatgutkornes zu finden und nur sehr vereinzelt im Inneren des Kornes lokalisiert
(persönliche Mitteilung K. Thiele, Julius Kühn-Institut). Dies deutet darauf hin, dass
die Saatgutkontamination durch A. valerianellae vermehrt durch äußere Einflüsse als
durch vaskulären Transport geschieht. Durch die im Jahr 2009 durchgeführte Aussaat
der
gebeizten
Ausgangssaatgutpartien
sollte
vor
allem
ein
Einfluss
der
Bewässerungsstrategie auf die Saatgutübertragung von A. valerianellae ermittelt
werden. Verwendet wurde hier gebeiztes Saatgut, da das ungebeizte Saatgut nicht
mehr im ausreichenden Maße zur Verfügung stand. Die Bestände wurden zum einen
mittels Tröpfchenbewässerung gewässert, zum anderen durch eine Beregnung über
Kopf, wie sie auch in den Vorjahren stattfand. Die Vermutung, dass eine
Saatgutübertragung nur dann zustande kommt, wenn es über die Bewässerung zu
einem Hochspritzen von Bakterien aus Symptom tragenden Blättern in die Blüte und
somit von außen an das Saatgut kommt, konnte jedoch auf Basis der Ergebnisse nicht
bestätigt werden.
Alle untersuchten Saatgutpartien waren gesund, mit Ausnahme der Saatgutpartie
„AV-64 (Tröpfchen)“. Diese war nach Untersuchung mittels Sweatbox-Test und
Aufwuchstest im Gewächshaus frei von A. valerianellae (Tab. 3.13), während sie
nach Durchführung der Ankeimmethode auf Papier als kontaminiert ausgewiesen
wurde (Tab. 3.14). Bewässerungsunabhängig traten im Produktionsbestand keine
A. valerianellae-Symptome auf, weder bei Pflanzen der gesunden Ausgangspartie
noch bei Pflanzen der kontaminierten Ausgangspartie, so dass das Ergebnis der
Ankeimmethode auf Papier als falsch-positiv zu bewerten ist.
Verantwortlich für dieses Ergebnis scheint dennoch weder das Aussaatjahr noch die
Bewässerung zu sein, sondern die Beize des Saatguts. Eine chemische Saatgutbeize
kann einen A. valerianellae-Befall mindern. So bestätigten Untersuchungen der
gebeizten Ausgangssaatgutpartien im Sweatbox-Test eine Befallsfreiheit (Tab. 3.13).
Nach persönlicher Mitteilung von G. Hiddink (Enza Zaden) kann eine Beizung mit
Thiram, Metalaxyl und Iprodion einen bakteriellen A. valerianellae-Befall an
Pflanzen überraschend abschwächen. Ergebnisse eigener Vorversuche (Ergebnisse
nicht dargestellt) konnten dies ebenso bestätigen. Aus der Literatur ist bekannt, dass
DISKUSSION
151
eine Samenbehandlung mit Thiram die Vermehrung von schnell-wachsenden
Bakterien verhindern und zum Tod von langsam-wachsenden Bakterien führen kann
und so den Ertrag von Sojabohnen steigert (TIL’BA et al., 2011, Abstract).
Um den Einfluss der Bewässerungstechnik auf eine Saatgutübertragung eindeutig zu
untersuchen und damit auch die Frage nach der Lokalisierung von A. valerianellae
am oder im Samen zu beantworten, müsste dieser Versuch mit ungebeiztem Saatgut
einer stark kontaminierten Saatgutpartie wiederholt werden.
DISKUSSION
4.4
152
Dekontamination von Saatgut
Die eigenen Ergebnisse und die Ergebnisse aus der Literatur zeigen, dass es sich bei
A. valerianellae um eine saatgutübertragbare Krankheit an Feldsalat handelt. Eine
Strategie für die Produktion gesunden Saatguts ist daher von enormer Wichtigkeit.
Um eine solche Strategie für gesundes Saatgut zu realisieren, müssen laut ROBERTS
(2009) folgende Maßnahmen beachtet werden: Die Saatgutproduktion muss zunächst
in Gebieten stattfinden, die frei von bestimmten Pathogenen sind. Saatgutpartien
sollen mittels Saatguttests auf ihre Pathogenbelastung untersucht werden.
Möglicherweise müssen die Partien, bei positivem Befund, verworfen oder mittels
Dekontaminationsmethode behandelt werden. Eine weitere Maßnahme wäre,
unabhängig vom gesundheitlichen Status, eine generelle Saatgutbehandlung mit dem
Ziel das Pathogen im Saatgut zu eliminieren beziehungsweise das Inokulum auf ein
nicht schädliches Niveau zu reduzieren. Dabei sollte die Keimfähigkeit und
Lebensfähigkeit der Samen nicht reduziert werden. Die Behandlung sollte darüber
hinaus für Mensch und Tier sowie Umwelt unschädlich sein.
Mit Blick auf diese Punkte wurden zwei kontaminierte Partien (AV-219 und AV-17)
für die Untersuchungen herangezogen (Kapitel 3.4.2). Es sollte eine geeignete
Dekontaminationsmaßnahme
für
mit
A. valerianellae-kontaminiertes
Saatgut
ermittelt werden.
Die Ausgangsbelastung des unbehandelten Saatguts wurde zunächst mit der
Ankeimmethode auf Papier und anschließendem TAS-ELISA überprüft. Das
kontaminierte
Ausgangssaatgut
wurde
sicher
nachgewiesen,
wobei
die
Nachweisgrenze bei < 10 % infizierter Samen lag. Die Nachweisgrenze wurde nach
Untersuchung von gesunden und kontaminierten Saatgutpartien unterschiedlicher
Belastung in Form eines Ringtests durch verschiedene Labore bestätigt (Ergebnis
nicht dargestellt).
Über drei Strategien (Warmwasserbehandlungen, Dampfbehandlungen und eine
unbekannte Behandlung durch einen Dienstleister) wurde versucht, diese Belastung
zu verringern oder sogar zu eliminieren. Das Saatgut wurde vor und nach einer
DISKUSSION
153
Behandlung zudem auf seine Keimfähigkeit überprüft. Eine gute Keimfähigkeit ist
mit über 90 % gegeben (persönliche Mitteilung A. Schieder, Enza Zaden).
Aus den Ergebnissen der Dekontaminationswirkungen und mit Blick auf die
erzielten Keimfähigkeiten war ersichtlich, dass die Behandlungen unterschiedliche
Einflüsse auf das zu dekontaminierende Feldsalatsaatgut hatten.
OD-Werte unbehandelter, kontaminierter Feldsalatsamen stiegen normalerweise über
die Dauer der Kultivierung an und lagen spätestens ab dem dritten Auswertungstag
(Tag neun nach Aussaat) deutlich oberhalb des errechneten ELISA-Grenzwertes
(mean + 2 * s). Für den ersten Untersuchungstag (Tag null) wurde das Saatgut ohne
vorheriges Ankeimen für den TAS-ELISA aufgearbeitet und gemessen. Für die
Untersuchungstage vier, neun und 14 wurde das Saatgut entsprechend vier, neun und
14 Tage lang auf feuchtem Filterpapier angekeimt, bevor es für den TAS-ELISA
aufgearbeitet wurde.
In dieser Arbeit wurde für die Ankeimmethode auf Papier eine Probenmenge von
0,2 g je Auswertungstag eingesetzt, was sich als ausreichend erwies. Die Sorten
AV-17 und AV-219 wiesen nämlich eine A. valerianellae-Ausgangskontaminationen
von 17 % beziehungsweise 10 % auf. Bei einer zu untersuchenden schwächer
kontaminierten Partie könnte sich diese Probenmenge als zu gering erweisen. Es
sollten daher mindestens 0,5 g, was
je nach Korngewicht 215 bis 430 Samen
entspricht, ausgelegt werden. Die Gefahr, dass nur gesunde Samen ausgelegt und das
Ergebnis
verfälschen
würden,
wäre
umso
höher,
je
geringer
die
Ausgangskontamination und die eingesetzte Probenmenge ist.
Für die Frage, ob es durch eine Behandlung (Warmwasser, Dampf und
Dienstleisterbehandlung) zu einer Dekontamination der Samen kam, wurde eine
andere Interpretation der Messergebnisse vorgenommen. Die Inanspruchnahme einer
berechneten Nachweisgrenze (mean + 2 * s), ab welcher höhere OD-Werte eindeutig
A. valerianellae-positiv und niedrigere OD-Werte eindeutig A. valerianellae-negativ
waren, erfolgte hier nicht. Grund dafür waren die Schwankungen der Kontamination
mit A. valerianellae bei einzelnen Saatgutkörnern. Ausschlaggebend für eine
Interpretation
der
Ergebnisse
waren
daher
OD-Werte,
die
am
ersten
DISKUSSION
154
Untersuchungstag nach Dekontamination (Tag null, ohne Ankeimen der Samen)
erzielt und als Schwellenwerte herangezogen wurden. Eine Dekontamination wurde
angenommen, wenn die OD-Werte der Tage vier, neun und 14 nach dem Ankeimen
alle unterhalb des Schwellenwertes beziehungsweise am Schwellenwert (um 0,01
Messwerte verschieden) lagen. Die Dekontamination war unzureichend, wenn
mindestens einer der OD-Werte der Tage vier, neun oder 14 deutlich oberhalb des
Schwellenwertes (mindestens doppelter Messwert) lag. Aufgrund des getrennten
Ankeimens der Samen für die Tage vier, neun und 14 kam es vor, dass lediglich ein
Messergebnis angekeimter Samen über dem Schwellenwert lag und eine
unzureichende Dekontamination auswies.
Eine alleinige Betrachtung vor und nach Behandlung einer kontaminierten
Saatgutpartie jeweils zum Zeitpunkt des ersten Untersuchungstages ohne Ankeimen
(Tag null) reicht nicht aus, um einen Dekontaminationserfolg der Methode zu
ermitteln, da der A. valerianellae-Befall möglicherweise unter der Nachweisgrenze
liegt. Durch eine Aussaat und Kultur unter feuchten Bedingungen vermehrt sich das
möglicherweise nicht abgetötete Bakterium und wird so nachweisbar.
Die Behandlung durch einen Dienstleister führte an Samen zu keinen
Keimfähigkeitsverlusten (AV-17: 97 %, AV-219: 95 %) und erfüllte damit eine
positive Erwartung (Abb. 3.27). Im Hinblick auf die Dekontamination zeigte sich
jedoch keine zufriedenstellende Wirkung. Proben beider Saatgutpartien erreichten
hohe OD-Werte, die dem Verlauf der unbehandelten kontaminierten Samen nahezu
identisch
folgten
(Abb.
3.28).
Somit
ergab
sich
eine
mangelnde
Dekontaminationswirkung der Behandlung und eine solche Behandlung ist eindeutig
als nicht sinnvoll einzustufen.
Nach Dampfbehandlung waren bei der Sorte AV-219 Keimfähigkeitsverluste auf bis
zu 80 % (64 °C, 150 Sekunden) zu verzeichnen, während die Sorte AV-17 positiv in
ihrer Keimfähigkeit beeinflusst wurde (Abb. 3.25 und Tab. 3.16). Nach
Durchführung der Ankeimmethode auf Papier wurde ersichtlich, dass lediglich die
Sorte AV-219 nach einer Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden tendenziell gute
Erfolge erzielte, nicht jedoch nach einer Behandlung bei 64 °C für 150 Sekunden
(Abb. 3.26 B). Die Sorte AV-17 wurde durch keine Dampfbehandlung ausreichend
DISKUSSION
155
dekontaminiert (Abb. 3.26 A). Die Erforschung und Weiterentwicklung einer
Dampfbehandlung als Dekontaminationsmaßnahme verspricht im Allgemeinen
dennoch gute Erfolge. So beschreiben KOCH et al. (2010), dass bei der Untersuchung
von Karottensamen unterschiedlicher Sorte und Saatgutpartie, die mit Alternaria
dauci
und
A. radicina
befallen
sind,
eine
Dampfbehandlung die besten
Wirkungsergebnisse erzielt. Auch SCHMITT et al. (2009) beschreiben höchste
Wirksamkeiten mit bis zu 90 % an Reduktion des Ausgangsbefalls von Phoma
valerianellae an Feldsalat durch Behandlungen mit Heißluft.
Nach Durchführung der Warmwasserbehandlungen bei verschiedenen Temperaturen
und Einwirkzeiten wurde ersichtlich, dass einzelne Sorten auf gleiche Behandlungen
deutlich unterschiedlich in ihrer Keimfähigkeit reagierten, wobei die Sorte AV-17
weniger stark als die Sorte AV-219 reagierte (Abb. 3.23). Beide Sorten wurden
jedoch von der Behandlung bei 55 °C für 20 Minuten deutlich in ihrer Keimfähigkeit
geschwächt (AV-17: 78 %, AV-219: 33 %). Bei beiden Sorten wurde jedoch keine
Warmwasserbehandlung
mit
komplettem
Wirkungserfolg
in
Form
einer
Dekontamination erzielt. So beschreibt dies auch ROBERTS (2009) bei der
Untersuchung von mit Xanthomonas campestris pv. campestris belastetem
Kohlsaatgut. Eine Reduzierung durch Heißwasser wird erzielt, nicht aber eine
vollständige Elimination.
Bei der Sorte AV-17 stellte sich die Behandlung bei 55 °C für 20 Minuten als am
vielversprechendsten heraus, während es bei der Sorte AV-219 die Behandlungen bei
43 °C für 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten waren (Abb. 3.24).
Bei der Untersuchung von Feldsalatsamen unterschiedlicher Sorte und Saatgutpartie,
die mit Phoma valerianellae befallen sind, führt eine Behandlung mit Heißwasser bei
50 °C für 20 Minuten und bei 53 °C für 10 Minuten zu den höchsten
Wirkungsergebnissen zwischen 19 % und 40 %
(SCHMITT et al., 2009). Die
Erforschung und Weiterentwicklung einer Warmwasserbehandlung erscheint
demnach auch hier sinnvoll.
Aus den Keimfähigkeitsergebnissen nach Durchführung der drei Behandlungen war
ersichtlich, dass jede Saatgutpartie anders reagierte. Die Sorte AV-17 reagierte mit
geringeren
Keimfähigkeitseinbußen
als
die
Sorte
AV-219.
Am
stärksten
DISKUSSION
beeinträchtigt
156
war
die
Warmwasserbehandlungen
bei
Keimfähigkeit
höheren
nach
Durchführung
Wassertemperaturen
und
der
längeren
Einwirkzeiten (55 °C, 20 Minuten), weniger durch Dampfdesinfektion und durch die
unbekannte Behandlung eines Dienstleisters. Dies deutet darauf hin, dass die
Warmwasserbehandlung auch tiefere Samenschichten erfasste und den Keimling
schädigte. Das Saatgut scheint bei der Dauer der Behandlung aufgequollener zu sein,
je mehr Wasser es umgeben hat. Der Keimvorgang wurde dadurch vermutlich
schneller eingeleitet als durch Dampfbehandlung und durch die Behandlung eines
Dienstleisters. Die Wärmebelastung am Saatgut war dadurch höher, so dass das
Saatgut empfindlicher reagierte und schlechter keimte.
Dass eine Behandlung mit heißem Dampf beziehungsweise heißer Luft zu weniger
Keimfähigkeitseinbußen führt als eine Warmwasserbehandlung, ist auch aus der
Literatur bei anderen Samenarten bekannt. So beschreiben GRONDEAU et al. (1992)
einen höheren Keimfähigkeitsverlust bei Erbsensamen durch eine Behandlung mit
Heißwasser als mit Heißluft. Die Behandlungen für 72 Stunden bei 65 °C (Heißluft)
beziehungsweise 15 Minuten bei 55 °C Wassertemperatur führen zu 5 % bis 20 % an
Keimfähigkeitsverlusten im Gegensatz zu unbehandelten Erbsensamen. Eine
Heißwasserbehandlung für 15 Minuten bei 60 °C führt sogar zu 20 % bis 45 % an
Keimfähigkeitsverlusten. Eine Befallsminderung von Pseudomonas syringae pv. pisi
wird durch beide Behandlungen erzielt, wobei die Behandlung mit Heißwasser die
Bakterienwerte an Erbsensamen einer schwach kontaminierten Partie stärker
reduziert, teilweise unterhalb der Nachweisgrenze. Bei einer stark kontaminierten
Erbsenpartie führt die Heißwasserbehandlung nur zu einer Halbierung der
Ausgangskontamination.
Die bei GRONDEAU et al. (1992) beschriebene Befallsminderung durch eine
Warmwasserbehandlung, im Gegensatz zu einer Heißluftbehandlung, scheint von der
vermehrten Auswaschung des Pathogens abhängig zu sein. Pathogene an der äußeren
Samenschale werden abgewaschen und im Inneren lokalisierte Pathogene werden
vermutlich durch die Einwirkung des heißen Wassers geschädigt. Bei den durch
heiße Luft behandelten Samen wurde eine geringere Befallsminderung festgestellt,
was darauf schließen lässt, dass diese Behandlung zwar Pathogene an der
Samenoberfläche mindert, die Pathogene im Inneren des Samens jedoch nicht
DISKUSSION
157
vollständig gehemmt wurden. Beim Quellprozess nach der Aussaat konnten sich
diese Pathogene vermehren und zu einem stärkeren Befall führen.
Die
nachgewiesene
Befallsminderung
von
A. valerianellae
mittels
Dampfdesinfektion und Warmwasserbehandlung waren erste Erfolge dieser
Dekontaminationsmaßnahmen, eine vollständige Dekontamination wurde aber nicht
erreicht.
Aus der Literatur sind neben physikalischen Desinfektionsmethoden (Heißwasser,
Dampf,
Elektronenbehandlung)
auch
reine
Oberflächensterilisationen
(Natriumhypochlorit, verschiedene Öle und Säuren) bekannt, die gute Erfolge bei
samenbürtigen Pathogenen besitzen. Da die Lokalisierung von A. valerianellae am
oder im Saatgut unklar ist, sollten Kombinationen aus Behandlungen, die Pathogene
innerhalb des Samens und Behandlungen, die vermehrt die Samenoberfläche
angreifen, für zukünftige Untersuchungen ebenso berücksichtigt werden wie
Einzelbehandlungen.
Für den Feldsalatanbau sind keine Bakterizide zugelassen, daher sollte die
Ausbreitung von A. valerianellae in Beständen mit pflanzenbaulichen Maßnahmen
kontrolliert werden. Dazu gehört, dass zunächst gesundes Saatgut ausgesät wird.
Resistente Feldsalatsorten sind derzeit nicht vorhanden. Des Weiteren soll darauf
geachtet werden, dass Feldsalat in einer Fruchtfolge angebaut wird, bei der auf
gleicher Fläche Feldsalat nicht direkt auf Feldsalat folgt, sondern mit mindestens
einjährigem Abstand, um einer Bodenüberdauerung entgegenzuwirken. Die
Feldsalatkultur soll zudem entsprechend der Erregeransprüche so trocken wie
möglich geführt werden, um eine Infektion zu vermeiden. Das heißt, dass man auf
ein rasches Abtrocknen der Blätter achten muss, indem der Bestand gut durchlüftet
wird. Beregnungen in den Abendstunden sind nach Möglichkeit nicht durchzuführen.
Da die Vermehrung von A. valerianellae bei höheren Temperaturen umso schneller
erfolgt, kann ein Feldsalatanbau in der wärmeren Jahreszeit nicht befallsreduzierend
wirken (HINRICHS-BERGER et al., 2005, MOLTMANN et al., 2000).
ZUSAMMENFASSUNG
5
158
ZUSAMMENFASSUNG
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der Epidemiologie
des
phytopathogenen
[Valerianella
locusta
Bakteriums
(L.)]
zu
Infektionsbedingungen,
zur
Saatgutuntersuchungen
durchgeführt
Acidovorax
leisten,
Sortenanfälligkeit,
wurden.
valerianellae
indem
zum
an
Feldsalat
Untersuchungen
zu
Übertragungsweg
und
Darauf
aufbauend
sollten
Bekämpfungsmöglichkeiten aufgezeigt werden.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zu den Infektionsbedingungen zeigten, dass die
Infektion
von
A. valerianellae von
der Temperatur,
dem
Blattalter,
der
Inokulumdichte und der Blattnässedauer abhängig war. Eine Inokulation war bei
Temperaturen zwischen 10 °C und 30 °C erfolgreich. Infizierbar waren sowohl
Keim- als auch Laubblätter. Zudem war die Infektion unabhängig von der
Inokulumdichte
zwischen
102
cfu/ml
und
107
cfu/ml
möglich.
Die
Infektionsgeschwindigkeit und Symptomausprägung nahmen dabei zu, je höher die
Temperatur, je älter die Blätter und je konzentrierter das Inokulum waren. Die
Blattnässedauer beziehungsweise die relative Luftfeuchtigkeit waren für die
Infektion von enormer Wichtigkeit. Bei ausschließlich trockenen Bedingungen
wurde kein Befall an inokulierten Feldsalatpflanzen hervorgerufen. Ein Auftreten
beziehungsweise Wiederauftreten feuchter Bedingungen nach der Inokulation
förderte hingegen den Befall maßgeblich. Für eine Infektion waren fünf Stunden
Blattnässedauer ausreichend. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass eine gezielte
Kulturführung mit kurzen Blattnässezeiten eine Möglichkeit zur Kontrolle des
Schaderregers A. valerianellae darstellt.
Alle der 13 getesteten kommerziellen Feldsalatsorten waren anfällig, die Resistenz
der Wildart V. rimosa wurde hingegen bestätigt. Ein Rückgriff auf diese Wildart zum
Einkreuzen mit kommerziellen Sorten erscheint geboten.
A. valerianellae überdauerte einen Zeitraum von bis zu elf Monaten im Boden.
Feldsalatkulturen, die unmittelbar beziehungsweise ein bis elf Monate nach
infiziertem Feldsalat angebaut wurden, waren teilweise in erheblichen Umfang
ZUSAMMENFASSUNG
159
befallen. Die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen war mit zunehmender
Verrottung von infiziertem Feldsalatmaterial abnehmend. Eine Anbaupause von
mindestens zwölf Monaten und ein Fruchtfolgewechsel stellen somit eine geeignete
Methode zur Eliminierung von A. valerianellae aus dem Boden dar.
Alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae wurden neben Feldsalat in den
vorgestellten Untersuchungen nicht gefunden und sind in der Literatur auch nicht
beschrieben.
A. valerianellae ist saatgutübertragbar. Um eine weitere Ausbreitung dieser
gefährlichen Krankheit des Feldsalats auf neue Flächen zu unterbinden, ist ein
besonderes Gewicht auf den Einsatz gesunden Saatgutes zu legen.
Die Ergebnisse der Dekontaminationsmaßnahmen zeigten, dass die A. valerianellaeBelastung von Saatgut durch eine Warmwasser- (43 °C für 20 Minuten, 55 °C für
20 Minuten, 60 °C für 5 Minuten) oder Dampfbehandlung (66 °C für 105 Sekunden)
reduziert wurde. Eine vollständige Elimination des Bakteriums wurde allerdings
nicht erreicht.
Auf
Grundlage
der
vorliegenden
Arbeit
ergeben
sich
folgende
Bekämpfungsmöglichkeiten: Durch die Aussaat von gesundem Saatgut auf Flächen,
auf denen mindestens zwölf Monate zuvor kein infizierter Feldsalat stand und durch
eine trockene Kulturführung kann der A. valerianellae-Befall von Feldsalat reduziert
werden.
SUMMARY
6
160
SUMMARY
The aim of this study was to contribute to clarifying the epidemiology of the
phytopathogenic bacterium Acidovorax valerianellae on corn salad [Valerianella
locusta (L.)]. To this end, research was conducted on infection conditions, cultivar
sensitivities, transmission paths and seeds. Based on these results, control strategies
shall be demonstrated.
The tests performed under infectious conditions revealed that the infection of
A. valerianellae is dependent on temperature, leaf age, inoculum concentration and
leaf moisture, as well as the relative humidity. Inoculation was possible at
temperatures between 10 °C and 30 °C. It was possible for leaves of any age to be
infected. Moreover, infection was independent of the inoculum concentration, and
occurred between 102 and 107 cfu/ml. The speed of infection and the characteristics
of the symptoms increased with increasing temperature, leaf age and inoculum
concentration. Both the duration of leaf moisture and the relative humidity played a
crucial role in the infection process. Under dry conditions, inoculated corn salad
plants developed no symptoms. However, infestation increased significantly under
humid conditions or during humid periods. Five hours of leaf moisture sufficed for
an infection to occur.
It was demonstrated that targeted dry growth conditions with short leaf moisture
periods constitute an option for controlling A. valerianellae.
All 13 tested commercial corn salad cultivars were prone to A. valerianellae.
However, the resistance of the wild type V. rimosa was confirmed.
For this reason, it seems advisable to cross the wild type with commercial cultivars.
A. valerianellae endured for up to eleven months in the soil. Some of the corn salad
cultivars cultivated immediately (and one up to eleven months, respectively) after
infected plants were severely infected. The number of infected plants decreased in
line with increased rotting of infected old plant material.
A cultivation break of at least twelve months and the rotation of crops therefore
appear to be appropriate ways to eliminate A. valerianellae from the soil.
SUMMARY
161
No alternative hosts were detected in the experiments or in the literature.
In addition, this study revealed that A. valerianellae is transmitted via seeds.
It is therefore important to focus on healthy seeds to prevent the further
dissemination of this hazardous disease to uncontaminated crop land.
Seeds with natural A. valerianellae contamination were tested using a variety of
decontamination methods. Warm water treatment (43 °C for 20 minutes, 55 °C for
20 minutes, 60 °C for 5 minutes) or hot steam treatment (66 °C for 105 seconds)
managed to reduce the contamination rate. However, it was not possible to
completely eliminate the bacterium.
In summary, sowing healthy seeds after a cultivation break of at least twelve months
and under dry growth conditions may reduce the infestation of corn salad with
A. valerianellae.
LITERATURVERZEICHNIS
7
162
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ANHANG
167
8
ANHANG
8.1
Publikationen
THIELE, K., BRAJE, I., RABENSTEIN, F., LAUN, N., SMALLA, K. (2011):
Untersuchungen zur Biologie und Entwicklung praxis-relevanter
Nachweismethoden für bakterielle Erkrankungen am Feldsalat [Valerianella
locusta (L.)] als Grundlage für die Selektion von Resistenzquellen gegen den
Erreger von Blattflecken (Acidovorax valerianellae sp. nov), 18.
Innovationstag Mittelstand des Bundesministeriums für Wirtschaft und
Technologie in Berlin, Posterbeitrag.
THIELE, K., SMALLA, K., BRAJE, I., RABENSTEIN, F. (2010): Nachweis und
molekulare Charakterisierung von Acidovorax valerianellae, dem Erreger von
bakteriellen Blattflecken an Feldsalat (Valerianella locusta (L.) Laterr., 57.
Deutsche Pflanzenschutztagung in Berlin, Posterbeitrag.
BRAJE, I., ALBRECHT, A., LAUN, N., KRAUTHAUSEN, H.-J., BARCHEND, G.,
FELGENTREU, D., RABENSTEIN, F. (2008): Acidovorax valerianellae als Erreger
bakterieller Blattflecken an Feldsalat, 56. Deutsche Pflanzenschutztagung in
Kiel, Posterbeitrag.
LEINHOS, G., BRAJE, I., HÖRENER, G., KRAUTHAUSEN, H.-J. (2006): Falscher
Mehltau an Petersilie: Vorkommen, Biologie und Kontrollstrategien, 55.
Deutsche Pflanzenschutztagung in Göttingen, Posterbeitrag.
BRAJE, I. (2005): Untersuchungen zur Epidemiologie des phytopathogenen
Bakteriums Acidovorax valerianellae an Feldsalat [Valerianella locusta (L.)],
Diplomarbeit, Universität Hohenheim, Deutschland.
HINRICHS-BERGER, J., BRAJE, I., BERGER, S., JASU, H., BUCHENAUER, H. (2005):
Neues über diesen bakteriellen Schaderreger: Acidovorax – ernstes Problem bei
Feldsalat, Gemüse, 3, 32-34.
HINRICHS-BERGER, J., BERGER, S., BRAJE, I., JASU, H., BUCHENAUER, H. (2004):
Zur Epidemiologie des phytopathogenen Bakteriums Acidovorax valerianellae
an Feldsalat, 54. Deutsche Pflanzenschutztagung in Hamburg, 73-74.
.
ANHANG
8.2
168
Lebenslauf
Name
Inga Braje
Geburtsdatum
16.07.1979
Geburtsort
Wilhelmshaven
Schulausbildung
1986 – 1990
Grundschule Voslapp, Wilhelmshaven
1990 - 1992
Orientierungsstufe Nogatstrasse, Wilhelmshaven
1992 – 1999
Gymnasium Käthe-Kollwitz-Schule, Wilhelmshaven
Abschluß: Abitur
Universität
10/2000 – 03/2005
Agrarbiologie, Universität Hohenheim
Abschluß: Diplom (Dipl. Agr.-Biol.)
seit 04/2006
Promotion, Universität Hohenheim, Fachgebiet Phytomedizin
(extern am Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum
Rheinpfalz, Neustadt an der Weinstrasse)
Berufstätigkeit
04/2005 – 12/2005
Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz,
Queckbrunnerhof, Schifferstadt
01/2006 – 03/2006
Enza Zaden Deutschland, Dannstadt-Schauernheim
Praktika
08/1999 – 08/2000
Freiwilliges Ökologisches Jahr, Verein Umwelterziehung
Iffens e.V., Butjadingen
08/2002 – 09/2002
Demeter-Hof Friedhard Bühler, Murr
08/2003 – 09/2003
Nitratlabor Heidelberg und Betreuungsdienst Nützlingseinsatz
Nordbaden e. V., Heidelberg
___________________
Inga Braje
ANHANG
8.3
169
Versicherung
Hiermit versichere ich, Inga Braje, dass ich nicht bereits früher oder gleichzeitig
einen Antrag auf Eröffnung eines Promotionsverfahrens unter Vorlage der hier
eingereichten Dissertation gestellt habe.
Böhl-Iggelheim, 24.10.2011
___________________
Inga Braje
8.4
Erklärung
Hiermit erkläre ich, Inga Braje, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig
angefertigt und nur die angegebenen Quellen als Hilfsmittel benutzt habe. Wörtlich
und inhaltlich übernommene Stellen sind als solche in der Arbeit gekennzeichnet.
Böhl-Iggelheim, 24.10.2011
___________________
Inga Braje