Institut für Pathologie und Rechtsmedizin
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Institut für Pathologie und Rechtsmedizin Abteilung Pathologie Universität Ulm Ärztlicher Direktor: Professor Dr. med. Peter Möller Inzidenz von Simian-Virus-40-ähnlichen Sequenzen in ependymalen Tumoren Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Frank Joachim Reuther Annaberg-Buchholz 2004 2 Amtierender Dekan: Professor Dr. med. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Professor Dr. med. Peter Möller 2. Berichterstatter: Professor Dr. med. Erich Miltner Tag der Promotion: 11.02.2005 3 Meinen Eltern 4 Inhaltsverzeichnis 1 Abkürzungsverzeichnis 5 2 Einleitung 6 3 Material und Methodik 8 3.1 Tumorgewebeproben 8 3.2 DNA-Extraktion 14 3.3 PCR-Amplifikation 14 3.4 Klonieren und Sequenzieren der PCR-Produkte 18 3.5 Immunhistochemie 19 4 Ergebnisse 20 4.1 SV40-Sequenzen 20 4.2 Immunhistochemie 23 5 Diskussion 24 6 Zusammenfassung 31 7 Literaturverzeichnis 32 8 Danksagung 40 9 Lebenslauf 41 5 1 Abkürzungsverzeichnis bp Basenpaare DNA Desoxyribonukleinsäure ds-DNA Doppelstrang- Desoxyribonukleinsäure EMBL European Molecular Biology Laboratory EPP Ependymom-Probe HCl Salzsäure IPTG Isopropyl-Bd-thiogalactopyranosid JCV JC-Virus kbp kilo-Basenpaare KCl Kaliumchlorid LB Luria-Bertoni MgCl2 Magnesiumchlorid mmol Millimol ng Nanogramm p53 Tumorsuppressorgen p53 PCR polymerase chain reaction pmol Pikomol PNET primitiver neuroektodermaler Tumor pRb Tumorsuppressorgen (Retinoblastomgen) RB Retinoblastom SDS sodium dodecyl sulfate (Natriumdodekylsulfat) SV40 Simian Virus 40 T-Antigen Tumor-Antigen TUF target unmasking fluid WHO World Health Organization µl Mikroliter 6 2 Einleitung Das Simian Virus 40 (SV40) ist ein kleines Virus, das 5 kbp in einer Doppelhelix ds-DNA enthält. Es ist ein Polyomavirus, das zu den Papovaviridae gehört. Das SV40 wurde 1960 entdeckt. Nierenzellen von Rhesusaffen, auf denen Poliomyelitisviren zur Impfstoffherstellung vermehrt wurden, waren mit SV40 kontaminiert. Millionen von Menschen in Nordamerika und Europa wurde deshalb SV40-infizierter Poliomyelitis-Impfstoff verabreicht. Dies wäre dann von enormer Bedeutung, wenn sich eine Humanpathogenität des SV40 nachweisen ließe [6]. Kurz nach seiner Entdeckung gelang der Nachweis der Onkogenität des SV40 an neugeborenen Hamstern. Es konnte an Zellkulturen von menschlichen sowie Mäusezellen gezeigt werden, dass SV40 diese Zellen immortalisieren und transformieren kann. Das SV40 wurde deshalb zu einem Forschungsschwerpunkt. Es wird als Modell in der experimentellen Forschung der viralen Onkogenese genutzt [3, 6, 16]. In neuerer Zeit wurde das Zusammenspiel des SV40-Onkoproteins des large-TAntigens und zellulärer Tumorsuppressorgene, insbesondere p53 und pRb, zu einem viel diskutierten Thema der onkologisch Forschenden. Viele Studien wurden iniziiert, um das Virus in verschiedenen humanen Neubildungen nachzuweisen. Insbesondere wurden hohe Expressionsraten von genomischen Sequenzen und Polypeptid-Determinanten in Ependymomen festgestellt, wobei die Mehrzahl der Tumoren (56 – 90 %) positiv getestet wurden [2, 21, 24, 27, 28]. Es gab aber auch Gegensätzliches demonstrierende Daten mit viel niedrigeren Nachweisraten (7,4 %) [45] oder gar negativen Ergebnissen [13, 23, 29]. SV40ähnliche Sequenzen wurden auch in anderen als Hirntumoren entdeckt, in Mesotheliomen, Bronchialkarzinomen und Knochentumoren, wie Osteosarkomen und in Knochen-Riesenzelltumoren [17], Hypophysentumoren und einigen papillären Schilddrüsenkarzinomen [Literatur in 3]. 7 Insgesamt betrachtet, weisen diese Daten darauf hin, dass es beim Menschen SV40-assoziierte Tumoren geben könnte. Die Publikation deutscher Autoren einer relativ niedrigen Inzidenz von zwei positiven Ependymomen von 27 (7,4 %) gab den Anlass, unsere Serie von 62 ependymalen Tumoren zu untersuchen. Dies dürfte bis heute die größte Gruppe sein, die auf das Vorliegen von SV40-ähnlichen DNA-Sequenzen untersucht worden ist. Soweit es SV40-positive ependymale Tumoren betrifft, werden auch grundlegende Fragen, wie die Altersverteilung der SV40-Expression und die Prävalenz von histologischen Subtypen, noch unbeantwortet bleiben. Insbesondere sei auf die bis heute kontroverse Diskussion in der wissenschaftlichen Literatur hingewiesen. 8 3 Material und Methodik 3.1 Tumorgewebeproben Insgesamt wurden Gewebeproben von 62 ependymalen Tumoren untersucht, die in folgenden Einrichtungen archiviert waren: • Institut für Neuropathologie der Universität Göttingen • Klinik für Neurochirurgie der Universität Kiel • Institut für Pathologie des Klinikums Nürnberg • Abteilung Pathologie des Universitätsklinikums Ulm Die Fälle wurden anonymisiert und ihnen eine nach dem Zufallsprinzip generierte EPP-Nummer von 000 – 999 zugewiesen. Die Tumoren wurden histologisch nach der Klassifikation der Weltgesundheitsorganisation als • Myxopapilläres Ependymom (WHO-Grad I, 12 Fälle) • Subependymom (WHO-Grad I, 1 Fall) • Klassisches Ependymom (WHO-Grad II, 24 Fälle) • Anaplastisches Ependymom (WHO-Grad III, 20 Fälle) und • Ependymoblastom/primitiver neuroektodermaler Tumor (WHO-Grad IV, 5 Fälle) eingeteilt. 21 Patienten waren von 1920 bis 1960 geboren. 17 Tumoren wurden in Form von Gefriergewebe und 57 nach Formalinfixation und Paraffineinbettung untersucht. In 12 Fällen langen beide Asservationsarten vor. In den nachfolgenden beiden Tabellen finden sich detaillierte klinische und histopathologische Angaben zu den Tumoren. 9 Tabelle 1 Klinische und histopathologische Angaben zu allen untersuchten ependymalen Tumoren Codierung Diagnose Lokalisation m/w EPP003 E 4. Ventrikel EPP005 aE EPP010 Rezidiv OP-Jahr Geb.-Jahr w 1992 1990 2 parietodorsal w 1997 1995 2 E intramedullär m 1997 1983 14 EPP035 E Kleinhirn m 1991 1983 8 EPP042 E 4. Ventrikel w 1994 1992 2 EPP057 aE rechts temporal bis 3. Ventrikel w 1995 1992 3 EPP061 myE spinal, intradural m 1998 1972 26 EPP065 E linker Seitenventrikel m 1993 1963 30 EPP093 E 4. Ventrikel w 1997 1989 8 EPP111 E spinal, L3 – S1 w 1996 1971 25 EPP120 aE rechtes Trigonum w 1990 1952 38 EPP123 E supratentoriell m 1996 1968 28 EPP135 E intramedullär, Th3/4 m 1996 1960 36 EPP157 aE 4. Ventrikel m 1994 1990 4 EPP192 E intramedullär, Th12/L1 m 1996 1935 61 EPP211 Ebl 4. Ventrikel w 1991 1987 4 ja Alter (Jahre) 10 Codierung Diagnose Lokalisation m/w EPP224 E intradural, L1/2 EPP248 aE EPP255 Rezidiv OP-Jahr Geb.-Jahr w 1996 1934 62 4. Ventrikel w 1995 1993 2 aE Hirnstamm m 1994 1991 3 EPP277 aE Kleinhirn/Hirnstamm w 1997 1996 1 EPP283 E 3. Ventrikel w 1998 1980 18 EPP297 E intramedullär, C5 m 1994 1955 39 EPP299 myE Conus medullaris m 1998 1972 26 EPP300 aE 3. Ventrikel m 1998 1998 0,5 EPP303 E 4. Ventrikel w ja 1994 1987 7 EPP320 aE Kleinhirn w ja 1999 1997 2 EPP344 myE Filum terminale w 1993 1943 50 EPP357 E links temporal w 1993 1952 41 EPP391 myE Filum terminale m 1993 1953 40 EPP398 aE spinal w 1996 1929 67 EPP402 Ebl infratentoriell m 1996 1995 EPP427 E intramedullär, Th7 w 1998 1925 73 EPP437 myE Filum terminale m 1994 1955 39 EPP441 E Hirnstamm m 1999 1995 4 ja ja ja Alter (Jahre) 0,9 11 Codierung Diagnose Lokalisation m/w EPP455 myE intramedullär, Th11 – L1 m EPP476 E L4-S1-Rezidiv w EPP487 aE rechte hintere Schädelgrube EPP499 myE EPP533 Rezidiv OP-Jahr Geb.-Jahr 1991 1944 47 1992 1952 40 w 1994 1963 31 Filum terminale m 1995 1980 15 aE links frontal w 1996 1945 51 EPP545 E L2-S1-Rezidiv w 1993 1952 41 EPP561 aE infratentoriell w 1996 1994 2 EPP579 E intramedullär, Th8 – L2 w 1993 1960 33 EPP589 E zentral, supratentoriell m 1998 1984 14 EPP635 aE spinal m 1996 1993 3 EPP647 aE rechts parietozentral w 1994 1988 6 EPP651 Ebl rechts parietookzipital w 1997 1994 3 EPP654 aE Hirnstamm m 1996 1991 5 EPP682 myE Cauda equina m 1994 1967 27 EPP708 aE 3. Ventrikel m 1995 1953 42 EPP710 myE Cauda equina m 1997 1980 17 EPP737 SE supratentoriell m 1995 1932 63 EPP753 E Kleinhirn w 1991 1921 70 ja ja ja ja Alter (Jahre) 12 Codierung Diagnose Lokalisation m/w EPP777 E Cauda equina m EPP800 aE hintere Schädelgrube w EPP807 myE Conus medullaris EPP842 myE EPP864 Rezidiv OP-Jahr Geb.-Jahr 1996 1920 76 1998 1989 9 m 1996 1961 35 Cauda equina m 1998 1975 23 Ebl links frontal w 1991 1986 4 EPP875 Ebl infratentoriell w ja 1995 1987 7 EPP901 aE supratentoriell w ja 1997 1995 2 EPP902 E intramedullär m 1995 1929 66 EPP923 aE infratentoriell m 1995 1991 4 EPP973 myE Filum terminale m 1993 1951 41 ja ja Alter (Jahre) EPP – Ependymom-Probe myE – myxopapilläres Ependymom C – zervikales Rückenmarksegment m – männlich SE – Subependymom Th – thorakales Rückenmarksegment w – weiblich E – klassisches Ependymom L – lumbales Rückenmarksegment OP-Jahr – Jahr der Operation aE – anaplastisches Ependymom S – sakrales Rückenmarksegment Geb.-Jahr – Geburtsjahr Ebl – Ependymoblastom 13 Tabelle 2 Zusammenfassung der klinischen und histopathologischen Angaben der untersuchten ependymalen Tumoren Diagnose WHO-Grad Kind/erwachsen männlich/weiblich Ausgangsependym Myxopapilläres Ependymom I 2/10 11/1 Subependymom I 0/1 1/0 Seitenventrikel Klassisches Ependymom II 9/15 3/1 Seitenventrikel 0/1 3. Ventrikel 1/4 4. Ventrikel 7/7 spinal 0/4 Seitenventrikel 2/1 3. Ventrikel 4/6 4. Ventrikel 1/2 spinal 0/2 Seitenventrikel 1/2 4. Ventrikel Anaplastisches Ependymom Ependymoblastom III IV 15/5 5/0 spinal 14 Als Positivkontrolle für die Amplifikation der SV40-Sequenzen wurden Formalin fixierte und Paraffin eingebettete SV40-infizierte COS-7-Zellen verwendet (ATCC, Manassas, Virginia, USA), die uns freundlicherweise von Frau Beate Reinhardt von der Abteilung Virologie des Universitätsklinikums Ulm zur Verfügung gestellt wurden. 3.2 DNA-Extraktion Die DNA wurde aus 60 µm dicken Paraffin- bzw. 50 µm dicken Gefrierschnitten unter Verwendung des Cleanmix-Kits (Talent, Italien) nach Angaben des Herstellers präpariert. Wenigstens 90 % der eingesetzten Proben bestanden aus Tumorgewebe. Die Extraktionen wurden in einer sauberen, staubfreien Umgebung mit sterilem Einmalmaterial durchgeführt. 3.3 Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die PCR’s wurden in einem Endvolumen von 50 µl, das 100 – 200 ng DNA, 10 pmol von jedem Primer, 10 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 8,3), 50 mmol KClLösung, 1,5 mmol MgCl2 und 200 mmol von jedem Nucleotid enthielt, in einem Thermocycler (Primus 96 plus, MWG-Biotech) durchgeführt. Nach Bergsagel et al. [2] und Lednicky et al. [24] wurden SV.for3/SV.rev und RA1/RA2, ausgewählt: Die Oligonucleotide SV.for3 (Abschnitt 4476 – 4453) 5‘-TGA GGC TAC TGC TGA CTC TCA ACA-3‘ und zwei Primerpaare, nämlich 15 SV.rev (Abschnitt 4399 – 4372) 5‘-GCA TGA CTC CAA AAC TTA GCA ATT CTG-3‘ repräsentieren eine aminoproximale, 105 bp große, SV40-spezifische T-AntigenSequenz, unmittelbar an der RB-Bindungsstelle [31]. Die Oligonucleotide RA1 (Abschnitt 266 – 245) 5‘-AAT GTG TGT CAG TTA GGG TGT G-3‘ und RA2 (Abschnitt 5195 – 5218) 5‘-TCC AAA AAA GCC TCC TCA CTA CTT-3‘ wurden verwendet, um ein 242 bp großes DNA-Produkt der Enhancer-/RegulatorRegion zu analysieren und amplifizieren. Diese kann 72 bp große Insertionen aufweisen. Dieses Primerpaar erlaubt eine Unterscheidung zwischen „archetypischer“ und „nicht-archetypischer“ Anordnung der Sequenzen [25, 31]. Von besonderer Bedeutung ist, dass diese Primer nicht mit Sequenzen anderer Arten der Polyomavirus-Gattung reagieren. Die nachfolgenden Abbildungen zeigen die strukturelle Organisation des SV40-Genoms und die Position der Oligonucleotid-Primer, die für die PCR-Amplifikation verwendet wurden. 16 5153 4915 Intron 4571 2963 T-Antigen T-Antigen SV.rev SV.for3 Abb. 1 Schematische Darstellung der Primer SV.for3/Svrev (modifiziert nach Wang et al. [43]) Die Pfeile zeigen die Relativpositionen und Richtungen der Primer von 5‘ nach 3‘ bei der Amplifikation der T-Antigen-Genregion. Das Primerpaar SV.for3 und SV.rev wurde verwendet, um eine 105 bp große, aminoproximale T-AntigenSequenz zu amplifizieren, die sich unmittelbar an der RB-Bindungsstelle befindet. 250 72 bp 5192 72 bp 21 bp ORI RA2 RA1 Abb. 2 Schematische Darstellung der Primer RA1/RA2 (modifiziert nach Wang et al. [43]) Die Pfeile zeigen die Relativpositionen und Richtungen der Primer von 5‘ nach 3‘ bei der Amplifikation der Enhancer-/Anfangs-Region. Das Primerpaar RA1 und RA2 wurde verwendet, um ein 242 bp großes DNA-Produkt der Enhancer/Regulator-Region des SV40 zu amplifizieren, die 72 bp große Insertionen aufweisen kann. (ORI – origin of replication initiation) 17 Als interne Kontrolle für die DNA-Qualität verwendeten wir das Primerpaar E1/E2, das in allen Fällen ein 236 bp großes Fragment des Tumorsuppressorgens TP53 lieferte. Zusätzlich wurde die DNA der Fälle mit SV40-C-terminalen Sequenzinsertionen mit dem Primerpaar D1/D2 untersucht, was ein 325 bp großes Fragment der Exons 5 und 6 von TP53 lieferte [19]. Bei allen Primerpaaren wurde eine Hot-start-PCR mit folgenden Zyklen durchgeführt: Tabelle 3 PCR-Zyklen Anzahl der Zyklen Temperatur Dauer in Minuten 1 95 °C 5 2 95 °C 1 62 °C 1 72 °C 1 95 °C 1 60 °C 1 72 °C 1 95 °C 1 58 °C 1 72 °C 1 95 °C 1 56 °C 1 72 °C 1 72 °C 10 2 2 30 1 initiale Denaturierung finale Extension 18 Mit jeder PCR wurden zwei Negativkontrollen, eine ohne DNA und eine mit DNA eines humanen, SV40-negativen Blasenkarzinoms mitgeführt. Alle Amplifikationen wurden doppelt ausgeführt. Positive Ergebnisse wurden mindestens dreimal bestätigt. 3.4 Klonieren und Sequenzieren der PCR-Produkte Um die SV40-Identität der PCR-Produkte zu bestätigen und sicherzustellen, dass keine nicht-Papovavirus-Sequenzen amplifiziert wurden, wurde eine DNASequenzierung durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in Bezug auf ihre Größe auf einem 1,5%igen Agarose-Gel aufgetrennt und die spezifischen Banden aus dem Gel ausgeschnitten. Die DNA wurde mittels Gel-Chromatographie (QIA-quick Gel-Extraktions-Kit, Quiagen GmbH, Hilden) isoliert und gereinigt, in einen PCRklonierenden Vektor (pGEM-T-Vector-System, Promega, Mannheim) in einem molaren Verhältnis zum Vektor von 3 : 1 eingebracht und dann in kompetente JM 109 Bakterien transformiert. Die Bakterien wurden auf LB-Agar-Platten aufgebracht, die Ampicillin, X-Gal und IPTG in Konzentrationen enthielten, wie vom Hersteller empfohlen, und über Nacht bei 37 °C angezüchtet. Die weißen Kolonien wurden isoliert und das Auftreten einer Insertion mittels Restriktionsenzymanalyse mit SacI und ApaI bestätigt. Die Plasmid-DNA wurde nach einem etablierten alkalischen Lysis-Protokoll präpariert. Die Sequenzierung wurde mit dem Alf Express Sequencer (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) unter Verwendung des Auto Cycle Kit (Amersham Pharmacia Biotech) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die so erhaltenen DNA-Sequenzen wurden mit der GeneBank/EMBL-Datenbank mit der Advance BLAST software, die über das Internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi?Jform =1) verfügbar ist, verglichen. 19 3.5 Immunhistochemie Die immunhistochemische Anfärbung des großen SV40 Tumor-Antigens (large TAntigen) wurde an Paraffin- und Gefrierschnitten der Tumorgewebsproben durchgeführt, um mit Hilfe einer immunenzymatischen Dreischritt-Methode festzustellen, ob diese positiv oder negativ für virale Sequenzen sind. Vor der Antikörper-Inkubation wurden die entparaffinierten Schnitte mit einem kommerziellen Target Unmasking Fluid (TUF, Dianova, Hamburg) in der Mikrowelle behandelt. Danach wurden sie über Nacht mit einem 1 : 10.000 verdünnten polyklonalen Kaninchen-Antiserum (R15anti-SDS-T) inkubiert. Dieses Antiserum eignet sich für die immunhistochemische Anfärbung von Paraffin eingebetteten Geweben [33] und ist monospezifisch für das SV40-T-Antigen, das größere transformierende Protein, das von der vorderen Genom-Region kodiert wird. Der spezifisch gebundene primäre Antikörper wurde mit einem kommerziellen Kit, der auf der Biotin-Streptavidin-Technologie basiert (Super Sensitive Detection System, BioGenex, San Ramon, Kalifornien, USA), detektiert. Die Enzymaktivität wurde mit Naphthol-AS-BI-Phosphat in Kombination mit hexazotiertem Triaminotritolylmethanchlorid (Neufuchsin – DAKO Diagnostika, Hamburg) dargestellt. Als Kontrollen wurden natives Kaninchen-Serum und Schnitte von Gewebe eines humanen Mammakarzinoms verwendet. 20 4 Ergebnisse 4.1 SV-40-Sequenzen Wir verwendeten zuerst das Primerpaar SV.for3/SV.rev, um die Tumor-DNA zu untersuchen. Hiermit wird ein 105 bp großes Fragment der aminoproximalen Region des SV40 amplifiziert. Diese Primer haben sich als sehr geeignet erwiesen, um DNA aus Formalin fixiertem, Paraffin eingebettetem Gewebe zu testen, die auch fragmentierte Anteile enthält [31]. Unter Verwendung dieser Primer fanden wir SV40-ähnliche Sequenzen in 5 % (3/62) unserer Serie von ependymalen Tumoren. Das sind 7 % (3/44) der Ependymome vom WHO-Grad II und III. Tabelle 4 SV40-positive Fälle Codierung Diagnose m/w Rezidiv WHO-Grad EPP005 anaplastisches Geburtsjahr w nein Ependymom, III EPP111 klassisches Ependymom klassisches Ependymom II m – männlich w – weiblich 1997 1995 w ja II EPP441 OP-Jahr 1996 1971 m nein 1999 1995 21 Abb. 3 Elektrophorese der PCR-Produkte auf einem 1,5%igen Agarose-Gel 1 – SV.for3/SVrev, EPP005 (anaplastisches Ependymom, WHO-Grad III) 2 – SV.for3/SVrev, EPP111 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 3 – SV.for3/SVrev, EPP441 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 4 – SV.for3/SVrev, SV40-infizierte COS-7-Zellen 5 – SV.for3/SVrev, Negativkontrolle, SV40-negatives Blasenkarzinom 6 – SV.for3/SVrev, Negativkontrolle ohne DNA 7 – RA1/RA2, EPP005 (anaplastisches Ependymom, WHO-Grad III) 8 – RA1/RA2, EPP111 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 9 – RA1/RA2, EPP441 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 10 – RA1/RA2, SV40-infizierte COS-7-Zellen 11 – RA1/RA2, Negativkontrolle, SV40-negatives Blasenkarzinom 12 – RA1/RA2, Negativkontrolle ohne DNA 13 – E1/E2, EPP005 (anaplastisches Ependymom, WHO-Grad III) 14 – E1/E2, EPP111 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 15 – E1/E2, EPP441 (klassisches Ependymom, WHO-Grad II) 16 – E1/E2, SV40-infizierte COS-7-Zellen 17 – E1/E2, Negativkontrolle, SV40-negatives Blasenkarzinom 18 – E1/E2, Negativkontrolle ohne DNA vor 1 und nach 18 – 100 bp Leiter 22 Keine der drei positiven Proben enthielt nichttransformiertes Gewebe. In einem zweiten PCR-Experiment wurden die drei positiven Fälle mit dem PCR-Primerpaar RA1/RA2 untersucht, aber keiner der ependymalen Tumoren zeigte das korrespondierende Fragment der Sequenz der SV40-Enhancer-/RegulatorRegion. Dieses Fragment wurde jedenfalls klar in den SV40-infizierten COS-7Zellen mit einer einzelnen 72-bp-Insertion detektiert. Die Tumorproben, in denen das gewünschte PCR-Produkt wiederholt nachgewiesen werden konnte, wurden als positiv für SV40-ähnliche Sequenzen gewertet. Somit wurden SV40-ähnliche Sequenzen in 6,5 % (2/31) der Ependymome im Kindesalter • Fall EPP005, bei OP 2 Jahre alt, geboren 1995 • Fall EPP441, bei OP 4 Jahre alt, geboren 1995 und einer bei einem jungen Erwachsenen • Fall EPP111, bei OP 25 Jahre alt, geboren 1971 nachgewiesen. Der letztere war ein Rezidiv eines Ependymoms, das bereits vier Jahre zuvor operiert worden war. Nach histopathologischen Kriterien waren • 8,3 % (2/24) der klassischen Ependymome und • 5,0 % (1/20) der anaplastischen Ependymome positiv für SV40-ähnliche Sequenzen. Die DNA-Sequenzierung zeigte identische Sequenzen in den Fällen EPP005, EPP111 und EPP441 mit dem Referenzgenom der SV40-infizierten COS-7-Zellen, 23 womit der Nachweis authentischer viraler Sequenzen in den Tumorgewebsproben erbracht ist. Die 12 myxopapillären Ependymome, das Subependymom und die fünf Ependymoblastome erbrachten alle negative Ergebnisse. 4.2 Immunhistochemie Obwohl SV40-ähnliche DNA-Sequenzen in drei der 62 Fälle nachgewiesen werden konnten, zeigte die immunhistochemische Analyse in diesen drei Fällen und auch zusätzlich an drei negativen Ependymomen keine nukleäre Immunreaktivität zu dem korrespondierenden T-Antigen-Protein, weder in den Tumor-, noch in den nichtneoplastischen Zellen. 24 5 Diskussion Der Poliomyelitis-Impfstoff, der in den Vereinigten Staaten, Kanada und Europa von 1955 bis 1963 verwendet wurde, war größtenteils mit SV40 kontaminiert, einem Makaken-Polyomavirus, der Tumoren bei Nagern erzeugen und in vitro humane Zellen immortalisieren kann [4]. Humane Polyomaviren mit Sequenzhomologien zu SV40 sind das BK- und JC-Virus [4, 10]. Ihre Beteiligung an der Pathogenese von humanen Tumoren wird immer noch kontrovers diskutiert. Es ist bekannt, dass das JCV bei immunsupprimierten Patienten eine progressive multifokale Leukenzephalopathie verursachen kann. In verschiedenen Studien wurde die vermutete Beziehung zwischen der Entstehung von Hirntumoren und einer SV40-Infektion untersucht. Die meisten wurden in den Vereinigten Staaten, Schweden und in der früheren Deutschen Demokratischen Republik durchgeführt [15, 18, 30, 34, 37]. In diesem Kontext waren ependymale Tumoren von besonderem Interesse [Literatur in 3]. In Schweden konnte bei Kindern, die gegen Kinderlähmung geimpft worden waren, unter Verwendung epidemiologischer Methoden keine erhöhte Inzidenz von Ependymomen oder irgendeinem anderen Tumor beobachtet werden [30]. Eine Studie von 1999 aus den Vereinigten Staaten [15] zeigte jedoch eine erhöhte Inzidenz von 37 % bei Ependymomen und Tumoren des Plexus choroideus in der exponierten Geburtskohorte (Jahre 1955 – 1959) verglichen mit der nichtexponierten Kontrollgruppe mit den Geburtsjahren 1963 – 1967. Es ist immer noch unklar, ob es eine schlüssige Kausalkette zwischen dem generell erhöhten Krebsrisiko in Populationen, die SV40-kontaminierten Impfstoffen gegenüber exponiert waren, wie von Fisher et al. [15] auf der Grundlage epidemiologischer Ergebnisse berichtet wurde, und der wiederholt publizierten hohen Frequenz (56 – 91 %) von SV40-ähnlichen Sequenzen in Ependymomen gibt [2, 21, 24, 27, 28]. Im Gegensatz zu den zuvor erwähnten Publikationen hat eine deutsche Gruppe im Jahr 2000 eine Studie mit einer 25 vergleichsweise niedrigen Inzidenz von ependymalen Tumoren, die SV40Sequenzen enthielten (7,4 %), durchgeführt [45]. Deren positive Gewebsproben waren von einem Ependymom und einem Subependymom. Keines von beiden zeigte bei der immunhistochemischen Untersuchung eine positive Immunreaktivität der korrespondierenden viralen Polypeptiddeterminanten. In unserer Studie untersuchten wir die bislang größte Serie von ependymalen Tumoren auf SV40-spezifische Genomsequenzen und bestätigten die Ergebnisse von Weggen et al. [45]. Neben den beiden Tumoren im Kindesalter fanden wir einen SV40-positiven ependymalen Tumor von einer zum Operationszeitpunkt 25 Jahre alten Frau, der das erste Rezidiv nach initialer Operation im Alter von 21 Jahren darstellte (Material von der ersten Operation war leider nicht verfügbar). In allen drei Proben konnten wir authentische, SV40-spezifische, 105 bp große Fragmente der aminoproximalen Region des viralen Genoms darstellen. Die DNASequenzierung erbrachte identische Sequenzen in den Fällen EPP005, EPP111 und EPP441 sowie im Referenzgenom der SV40-infizierten COS-7-Zellen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen von Lednicky et al. [24] enthielt keine der positiven Tumorproben das SV40-spezifische Fragment der Enhancer-/Regulator-Region. Anders als von anderen berichtet wurde [2], wurde in unseren Tumorproben kein virusspezifisches Antigen festgestellt. Ob der Nachweis von lediglich subgenomischen Regionen des SV40 von pathogenetischer Relevanz ist, bleibt ungeklärt. Interessanterweise waren Ependymoblastome, die wie primitive neuroektodermale Tumoren (PNET’s) embryonale Tumoren darstellen, in unserer Studie negativ. Das war entgegen der Erwartungen, da im experimentellen Setting der retroviral vermittelte Transfer des SV40-large-T-Antigens in neurale Transplantate zu gehäufter Entwicklung von PNET’s (57 %) führte [12, 44], die morphologisch und immunhistochemisch humanen Medulloblastomen ähnlich sind. Auch haben epidemiologische Studien in den Vereinigten Staaten bezüglich humaner Medulloblastome [37] keine höhere Inzidenzrate bei Kindern gezeigt, die 26 gegenüber SV40-kontaminierten Poliomyelitis-Impfstoffen exponiert waren, verglichen mit nichtexponierten Kindern gleichen Alters. Wie können wir nun die offensichtlichen quantitativen Differenzen in der Prävalenz der Tumor assoziierten SV40-Sequenzen, die in den Vereinigten Staaten [2, 24], Italien [27, 28] und Schweiz [24] hoch, nicht nachweisbar in Österreich [23], Finnland [29] und Indien [13] und vergleichsweise niedrig in Westdeutschland [45 und vorliegende Arbeit] war, erklären? 27 Tabelle 5 Geographische Differenzen bezüglich der Häufigkeit von SV40-positiven Ependymomen SV40-positive prozentual Land Ependymome/ SV40-spezifische Fragmentlänge PCR-Primer (bp) PCR-Zyklen Literatur Gesamtfälle 10/11 91 % USA SV.for3/SV.rev 105 45 – 60 [2] 3/3 100 % USA RA1/RA2 242 45 – 60 [24] 8/11 73 % Italien PYV.for/PYV.rev 172 35 [27, 28] 9/16 56 % Schweiz SVTAGP1/SVTAGP2 156 45 [21] SVTAGP1/SVTAGP3 126 SV.for3/SV.rev 105 40 [45] LA1/LA2 294 SVO.for/SVO.rev 490 45 – 60 [23] SV.for3/SV.rev 105 SVTAGP1/SVTAGP2 156 45 [29] SVTAGP1/SVTAGP3 126 2/27 0/10 0/10 7,4 % 0% 0% Deutschland Österreich Finnland 0/33 0% Indien SV.for3/SV.rev 105 50 [13] 3/62 5% Deutschland SV.for3/SV.rev 105 36 vorliegende RA1/RA2 242 Arbeit 28 Ist es möglich, dass diese Unterschiede die regionale Variation in der Exposition der betroffenen Population gegenüber SV40-kontaminierten Impfstoffen widerspiegelt? In Finnland wurde SV40-kontaminierter Poliomyelitis-Impfstoff nie verwendet [29]. In Schweden hat der Hersteller behauptet, dass nicht eine einzige Charge seines Poliomyelitis-Impfstoffs jemals eine Spur von SV40 aufwies [30]. In Westdeutschland wurden Tests auf SV40 Anfang der 1960er Jahre eingeführt, so dass der Poliomyelitis-Impfstoff spätestens ab 1961 SV40-frei war [35], während dies in anderen Ländern noch bis 1963 nicht so war [3, 4, 34, 36], wie auch in Ostdeutschland [18] und den Vereinigten Staaten [34]. Es kann auch angenommen werden, dass Unterschiede in der Impfhäufigkeit in den einzelnen Ländern existieren, obwohl vergleichbare Daten nicht verfügbar sind. Unabhängig von geographischen Unterschieden zeigen unsere Ergebnisse, wie auch die von anderen [1, 9, 23, 29, 42, 45], dass für Mehrzahl der Fälle eine direkte Verbindung zwischen der SV40-Exposition und der Entstehung von Tumoren nicht wahrscheinlich ist. Keiner der 21 von 1920 bis 1960 geborenen Patienten zeigte SV40-ähnliche Sequenzen. Bergsagel et al. [2] zeigten, dass keiner ihrer Patienten alt genug war, um mit dem kontaminierten Impfstoff immunisiert worden zu sein. Weggen et al. [45] fand einen positiven Fall eines Patienten, der 1914 geboren war. Das Risiko der Exposition von von 1901 bis 1920 Geborenen gegenüber SV40 ist niedrig [3]. Dass von einigen Forschungsgruppen gänzlich negative Befunde für SV40ähnliche Sequenzen berichtet wurden, führte zu der Diskussion, dass diese möglicherweise von zu wenig sensitiven Methoden herrühren könnten. Andererseits könnten auch die positiven Befunde durch Laborkontamination bedingt sein [7, 22 ,26]. Nunmehr ist jedoch anerkannt, dass die entsprechenden Ergebnisse, sowohl hohe Positivität als auch gänzliche Negativität der Fälle, als valide anzusehen sind [8, 20]. 29 Der Nachweis von SV40 in humanen Tumoren gibt einen Hinweis auf dessen Onkogenität, die bei Nagern im Laborversuch bewiesen ist. Zur Abklärung haben Engels et al. [14] eine Studie unter Einbezug von 54.796 Kindern in den Vereinigten Staaten durchgeführt. 52 von ihnen von Müttern, die von 1959 bis 1966 gegen Kinderlähmung geimpft worden waren, hatten bis zu ihrem 18. Lebensjahr Tumoren entwickelt, hiervon waren wiederum 22,5 % von Müttern, die den Impfstoff bis 1963 erhalten hatten. Bei diesen war eine erhöhte Inzidenz an Hirntumoren festzustellen. Da jedoch nur sechs der Mütter seropositiv gegenüber SV40 waren, schlussfolgerten die Autoren, dass die erhöhte Inzidenz in keinem kausalen Zusammenhang mit einer SV40-Infektion steht. Rollison et al. [32] stellten nach einer Untersuchung von Veteranen der Armee der Vereinigten Staaten, die gegenüber SV40-infizierten Poliomyelitis-Impfstoffen exponiert waren, keinen Zusammenhang einer möglichen Infektion mit Tumorentstehung fest. Auch Dang-Tan et al. [11] konnten keine konkreten Hinweise für eine durch SV40-Infektion bedingte erhöhte Tumorinzidenz oder -mortalität finden. Von anderen Autoren, insbesondere denen, die in erhöhtem Maße SV40-ähnliche Sequenzen in Tumoren festgestellt haben, wird eine Onkogenität des SV40 auch beim Menschen nach wie vor als sehr wahrscheinlich angenommen [5, 38, 39, 40, 41]. Ohne Zweifel ist der Nachweis von SV40-Determinanten in Tumorgeweben verschiedener Art ein sehr interessantes Phänomen und kein Artefakt. Zu den noch ungelösten Fragen gehören [5]: • der Grund der Verursachung der offensichtlich stummen SV40-Infektionen beim Menschen • die Wege der Übertragung von SV40 30 • die Verteilung des Virus im Gewebe • geographische Unterschiede in der Prävalenz von SV40-Infektionen • prädisponierende Faktoren, die die Aufnahmebereitschaft von SV40 beeinflussen • biologische Effekte unterschiedlicher Virusvarianten • die Bedeutung von SV40-Genomfragmenten in Tumorzellen • die Expression viraler Gene während der Onkogenese und • ob SV40 ein onkogenes Potenzial beim Menschen hat oder nicht oder es eine Rolle als Kofaktor bei der Tumorentstehung spielt Ungeachtet wachsender Datenmengen sind wir weit entfernt, die Rolle, die SV40Sequenzen bei der Entstehung von humanen Neubildungen, wie auch ependymalen Tumoren spielen mögen, zu verstehen. 31 4 Zusammenfassung Von 1955 bis 1963 erhielten Millionen von Kindern und Erwachsenen mit SimianVirus-40-kontaminierten Impfstoff zur Poliomyelitis-Immunisierung. Das onkogene Potenzial dieses Polyomavirus wurde entdeckt, nachdem neugeborene Hamster nach intrazerebraler Inokulation mit dem Simian Virus 40 Ependymome und Papillome des Plexus choroideus entwickelten. Danach wurden Simian-Virus-40ähnliche Sequenzen wiederholt in humanen Ependymomen mit breit gestreuten Inzidenzraten von 7 – 90 % festgestellt. Gleichwohl zeigten die meisten epidemiologischen Studien kein vermehrtes Auftreten von Ependymomen. Um diese Kontroverse zu erhellen, wurden 62 archivierte ependymale Tumoren von 31 Kindern und 31 Erwachsenen, die von 1990 – 1999 hieran operiert wurden, untersucht. In nur drei (5 %) dieser Tumoren – davon 24 klassische, 20 anaplastische und 12 myxopapilläre Ependymome, ein Subependymom und fünf Ependymoblastome – konnten subgenomische Simian-Virus-40-Sequenzen nachgewiesen werden. Keines der Ependymome der 21 Patienten, die von 1920 bis 1960 geboren waren, enthielt derartige Sequenzen. Die positiven Tumoren repräsentieren 7 % der Ependymome vom Grad II und III (zwei Tumoren von Kindern und einer eines Erwachsenen). Die DNA-Sequenzierung (Desoxyribonucleinsäure-Sequenzierung) der PCR-Produkte (polymerase-chainreaction-Produkte) erbrachte identische Sequenzen des Simian Virus 40 in den positiven Tumoren und der Positivkontrolle. Verglichen mit den publizierten Ergebnissen anderer Länder ist diese Inzidenzrate relativ niedrig. Bezüglich der Prävalenz von Simian-Virus-40-positiven Ependymomen gibt es offensichtlich erhebliche Unterschiede zwischen einzelnen Ländern, die möglicherweise den unterschiedlichen Grad der Exposition gegenüber widerspiegeln. Simian-Virus-40-kontaminierten Poliomyelitis-Impfstoffen 32 5 Literaturverzeichnis 1) Arthur RR, Grossman SA, Ronnett BM, Bigner SH, Vogelstein B, Shah KV: Lack of assocation of human polyomaviruses with human brain tumors. 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Insbesondere erwies sie außergewöhnliche Geduld, da sich die schriftliche Abfassung zeitlich etwas streckte. Herr Dr. Ingo Melzner wies mich in die Techniken der Molekulargenetik ein und half mit seiner großen wissenschaftlichen und praktischen Erfahrung, wenn Probleme auftraten. Herr Dr. Frank Leithäuser leistete Hilfestellung bei der Sequenzierung. Dank sei auch Frau Carola Dorsch, Frau Yvonne Sauter und Frau Simone Westenfelder für ihre technische Assistenz. Meinem Abteilungsdirektor, Herrn Professor Dr. Erich Miltner, danke ich für die über halbjährige fast vollständige Freistellung von den Routineaufgaben, um die umfänglichen Laborarbeiten durchführen zu können. Nicht zuletzt hat auch der Ansporn durch meine Partnerin, Frau Dr. Annett Höse, dazu beigetragen, die Arbeit nunmehr schriftlich abzufassen. 41 7 Lebenslauf Name Frank Joachim Reuther geboren 10. Oktober 1971 in Annaberg-Buchholz/Sachsen Schulausbildung 1978 – 1988 Zehnklassige allgemeinbildende polytechnische Oberschule in Geyer, Abschluss: Mittlere Reife 1988 – 1990 Erweiterte allgemeinbildende polytechnische Oberschule in Annaberg-Buchholz, Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Zivildienst 1990 – 1991 Institut für Pathologie, Klinikum Chemnitz Studium der Medizin 1991 – 1997 Vorklinik: Universität Leipzig Klinik: Friedrich-Schiller-Universität Jena in Erfurt Oktober 1997: 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung Berufstätigkeit Friedrich-Schiller-Universität Jena als Arzt im Praktikum November 1997 – November 1998 Klinik für Psychiatrie November 1998 – Mai 1999 Institut für Pathologie Mai 1999 – Approbation als Arzt Institut für Pathologie und Rechtsmedizin Universität Ulm Mai 1999 – Februar 2000 Abteilung Pathologie seit Februar 2000 Abteilung Rechtsmedizin Dezember 2004 – Facharzt für Rechtsmedizin Ulm, 11.02.2005
