Zusammenfassung der auf dem Symposium gehaltenen Vorträge

Symposium 2012
8. Stendaler Symposium
Diagnostik und Bekämpfung von Tierseuchen und anderen
bedeutenden Infektionskrankheiten bei Rindern
vom 9. bis 11. Mai 2012 in Stendal
Zusammenfassungen
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt,
Fachbereich 4 Veterinärmedizin Stendal
in Zusammenarbeit mit der
Tierärztekammer Sachsen- Anhalt
Herausgeber:
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt
Fachbereich 4 Veterinärmedizin, Haferbreiter Weg 132-135, 39576 Stendal
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Grußwort der Tierärztekammer Sachsen- Anhalt
Liebe Kolleginnen und Kollegen,
in der Altmark, mitten in dem traditionsreichen Rinderzuchtgebiet von Sachsen-Anhalt, findet
nach kurzer Pause wiederum das Stendaler Symposium zur Diagnostik und Bekämpfung
von Tierseuchen und anderer Infektionskrankheiten des Rindes statt. Die Tierärzteschaft
Sachsen-Anhalt verdankt den Stendaler Symposien eine Wissensvermittlung, mit der sie zur
erfolgreichen Bekämpfung von Infektionskrankheiten des Rindes, wie die BHV1 und BVD,
befähigt wurde. Eine Reihe von Erkenntnissen zur Tierseuchendiagnostik und Bekämpfung
beim Rind kommen aus dieser Region und neue fließen ihr wieder zu. Darüber hinaus
erhielten Tierärztinnen und Tierärzte aus zahlreichen Bundesländern Anregungen für ihre
Arbeit, die von diesen Symposien ausgingen. Für 2012 hat der Fachbereich
Veterinärmedizin des Landesamtes für Verbraucherschutz mit einem interessanten
wissenschaftlichen Programm, in das aktuelle Infektionserkrankungen aufgenommen
wurden, eingeladen.
Wir freuen uns auf Ihren Besuch in Stendal und wünschen dem 8. Symposium einen guten
Verlauf.
Ich wünsche Ihnen darüber hinaus anregende Stunden in dieser schönen Stadt.
Dr. Stefan Krippner
Präsident der Tierärztekammer Sachsen-Anhalt
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Grußwort des Fachbereiches Veterinärmedizin
Sehr geehrte Frau Kollegin,
sehr geehrter Herr Kollege,
Sehr geehrte Damen und Herren,
im Namen der Organisatoren des Fachbereiches Veterinärmedizin des Landesamtes für
Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt und der Tierärztekammer Sachsen-Anhalts begrüße ich
die Teilnehmer, Referenten, Industrieaussteller und Gäste aus allen Teilen der
Bundesrepublik Deutschland und aus benachbarten europäischen Staaten herzlich zum
8. Stendaler Symposium mit dem Themenschwerpunkt Bekämpfung bedeutsamer
Infektionskrankheiten des Rindes.
Abweichend vom gewohnten Tagungsintervall haben sich die Organisatoren des
8. Stendaler Symposiums für einen dreijährigen Abstand zum letzten Symposium
entschieden. Hauptgrund dafür war das Inkrafttreten der BVD Bundesverordnung zum
01.01.2011. Die sich daraus ergebende Zeitspanne zum geplanten Termin des
Symposiums im März 2011 war zu kurz um fundiert über Erfahrungen und Probleme die
sich bei der Umsetzung dieser Verordnung ergaben zu diskutieren. Dass wir dann auch noch
den Termin vom März auf den Mai verschoben haben, liegt primär in der Einführung eines
neuen LIMS im Landesamt für Verbraucherschutz begründet. Dass wir Sie dadurch bedingt
in einer schöneren Jahreszeit in der Altmarkmetropole Stendal begrüßen dürfen, ist dabei ein
angenehmer Nebeneffekt.
Vielleicht motiviert das den einen oder anderen, das sich an die Tagung anschließende
Wochenende für touristische Aktivitäten zu nutzen.
Der Blick in das Tagungsprogramm zeigt, dass wir dieses sowohl in der Strukturierung als
auch im Themenspektrum aus gegebener Veranlassung modifiziert haben. Aus dem
traditionellen Mittwochnachmittag-Workshop als Auftaktveranstaltung für speziell
interessierte Labordiagnostiker ist eine Vortragsveranstaltung zu speziellen Problemen bzw.
Methoden der Labordiagnostik geworden. Das Themenspektrum wurde aus aktuellem
Anlass natürlich um die Schmallenbergvirus-Infektion erweitert. Neu ist auch, dass wir dem
Freitag Raum für aus unserer Sicht interessante Beiträge zu bakteriellen Erkrankungen
gegeben haben, und sind auch hoch erfreut darüber, mit einem Beitrag daran erinnern zu
können, dass auch parasitäre Erreger als Gefährdungspotential in den Rinderbeständen
bedacht werden müssen.
Der Zuspruch zu unserer Veranstaltung ist nach Aussage vieler Teilnehmer deshalb so
groß, weil die thematische Schwerpunktsetzung einen unmittelbaren praktischen Bezug im
Auge hat, gewissermaßen die Problempalette der täglichen Arbeit aller Felder
veterinärmedizinischer Tätigkeit, d.h. Praxis, Labordiagnostik, Veterinärverwaltung
widerspiegelt.
Das Echo auf unsere Einladung war wiederum groß, dies nicht nur hinsichtlich der Zahl der
angemeldeten Tagungsteilnehmer, sondern auch hinsichtlich der eingereichten
Vortragsanmeldungen.
Dennoch haben wir unser in der Vergangenheit mehrfach gebrochenes Versprechen, die
Zahl der Vorträge zu reduzieren diesmal eingehalten.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Eine Veranstaltung in der Größenordnung und dem Rahmen wie diese wäre ohne finanzielle
Unterstützung nicht auszurichten.
Für freundliche Unterstützung des 8. Stendaler Symposiums bedanken wir uns bei den in
den Tagungsunterlagen namentlich aufgeführten Firmen. Ein Großteil der genannten Firmen
informiert in den Vorräumen des „Schwarzen Adler“ über die Produktpalette. Wir empfehlen,
von diesem Angebot in den Tagungspausen Gebrauch zu machen.
Ich wünsche dem Symposium einen guten Verlauf.
Dr. Karl-Friedrich Reckling
Leiter des Fachbereiches Veterinärmedizin
des Landesamtes für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Programm Stendaler Symposium 2012
Mittwoch, 09.05.: Themenkomplex „Diagnostik“
Veranstaltungsort: Hotel Schwarzer Adler, großer Festsaal; Kornmarkt 5, 39576 Stendal
Nr.
Referent
Institut/ Ort
Thema
Begrüßung durch den Fachbereichsleiter Dr. Reckling
1.
Wernike
FLI/ Riems
Innovative Tierseuchenüberwachung beim Rind
mittels Multiplex-Realtime-RT-PCR
2.
Reisberg
LAV/ Stendal
Multiplex Real-Time PCR in der Diagnostik von
Pneumonie- und Abortursachen bei Rindern und
kleinen Wiederkäuern
3.
Mitterhuemer
AGES/ Linz
Erfahrungen mit der Milchserologie und der
risikobasierten Überwachung von
Rinderbeständen
4.
Christian
LGL/ Erlangen
BVDV - Kann man Blutproben zwischen dem 8.
und 40. Lebenstag poolen?
5.
Fröhlich
FLI/ Wusterhausen
„Schlechte Diagnostik“ doch ganz brauchbar? Schätzungen von Sensitivität und Spezifität aus
Validierungsproben mit unsicherer Klassifikation
40 min Kaffeepause
6.
7.
8.
Donat
TSK Thüringen/ Jena
Paratuberkulose – Vergleich von Serologie und
Kotkultur
Münster
Georg-AugustUniverstität/
Göttingen
Langzeit-Studie zum Nachweis von
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in
ausgewählten Probenmatrizes zweier
Fleckviehbullen
AGES/ Linz
Molekulare Typisierung von Mycobacterium avium
ssp. paratuberculosis (MAP) Isolaten aus dem
Österreichischen
Paratuberkulosebekämpfungsprogramm
Dünser
9.
Soschinka
FLI/ Jena
Zusammenhang zwischen Immunprofil und
histopathologischen Veränderungen bei
experimenteller Infektion von Ziegen mit
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis
10.
Klingenstein
Qiagen/ Hilden
Parallel processing of various sample types for
detection of RNA ans DNA pathogens in
veterinary diagnostics
Uhrzeit
13.00
13.15
15.00 – 15.40
Ende des ersten Tages
17.00
zwangloses Abendessen im großen Saal des Restaurants
Speisen und Getränke auf eigene Rechnung
ab 19.00
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Donnerstag, 10.05.: Themenkomplex BHV-1
Veranstaltungsort: Hotel Schwarzer Adler, großer Festsaal; Kornmarkt 5, 39576 Stendal
Nr.
Referent
Institut/ Ort
Thema
Uhrzeit
Begrüßung durch einen Vertreter des Ministeriums für
Landwirtschaft und Umwelt Sachsen-Anhalt
11.
HörethBöntgen
FLI/ Wusterhausen
Aktueller Stand der BHV-1-Bekämpfung aus
nationaler Sicht – Eine vergleichende
Datenauswertung von 2005 - 2011
12.
Tyrpe
MLU/ Magdeburg
BHV-1 – Sachsen-Anhalt auf dem Weg zum
Artikel-10-Status
13.
Elschner
TMSFG/ Erfurt
BHV-1-Bekämpfung – Hat Thüringen die
Zielgerade erreicht?
14.
Wienecke
StMELF/ München
Einsatzmöglichkeiten der HIT-Datenbank bei der
Tierseuchenüberwachung (BHV-1)
15.
Goetz
IDEXX/ Ludwigsburg
IBR-Programme in Europa
30 min Kaffeepause
16.
Mars
Animal Health
Service/ Deventer
An overview of the results of IBR programmmes in
the Netherlands
17.
König
FLI/ Riems
Aktuelles aus dem NRL für BHV-1
18.
Böttcher
TGD/ Poing
BoHV-2 neutralisierende Ak erhöhen das Risiko
für BoHV-1-Einzelreagenten in
Milchviehbeständen des Alpenraums –
Konsequenzen für die Überwachung
19.
Tavella
IZSVenezie/ Bozen
Herpesmammillitis-Ausbruch in der Autonomen
Provinz Bozen/ Italien – PCR-Nachweis von
Bovinem Herpesvirus 2
20.
Brackmann
LUFA Nord-West/
Oldenburg
BHV-1 Tankmilchserologie: Aktuelle
Untersuchungsergebnisse, Probleme und
Lösungsansätze
21.
Horner
TLLV/ Bad
Langensalza
BHV-1 gE Untersuchung in der Poolmilch – was
ist möglich?
22.
Steppin
Pfizer/ Berlin
Aktuelle Impfempfehlungen für Rispoval® IBR
Marker
100 min Mittagspause – Poster- und Industrieschau
8.30
8.45
10.40 – 11.10
13.00 – 14.20
Mittagessen wird im Restaurant, im großen Saal und in der Cocktailbar serviert.
Es stehen verschiedene Speisen zur Auswahl, für die man sich bis spätestens 11.00 Uhr
die entsprechende Essensmarke kaufen kann.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Poster
1.
A. Schwarzmaier, C. Sauter-Louis,
G. Seemann, E. Schwedinger,
A. Friedrich, K. Cußler
Bovine neonatale Panzytopenie (BNP) – Vorkommen in BadenWürttemberg und Beziehung zu BVD-Bestandsimpfungen
2.
J. Küpper, H. Brandt, K. Donat,
U. Schau, G. Erhardt
Paratuberkulose: Erblichkeit und Einfluss auf
Milchleistungsparameter bei Dt. Holsteinkühen
3.
N. Kasnitz, H. Köhler, P. Möbius
Einfluss von Kulturmedien und Tierpassage auf die Stabilität
spezifischer Genommarker von Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis
4.
B. Fischer, A. Schliephake, A. Schult
Zum Einfluss von Säurezusätzen in der Tränkmilch auf den
Keimgehalt des Kotes, die Durchfallhäufigkeit und das
Wachstum von Deutschen-Holstein Kälbern während der ersten
14 Lebenstage
5.
K. Kerner, G. Walter, C. Menge,
H. Köhler
Nachweis reaktiver T-Zellen bei experimenteller Infektion von
Ziegen mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
(MAP)
6.
I. Fritsch, J. Kolb, H. Köhler,
D. Hillemann, M. Dünser,
M. M. Wittenbrink, P. Möbius
Untersuchungen zur Langzeitepidemiologie von
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Stämmen aus
Mitteleuropa
7.
W. Murmann, K. Danner, A. Maas
Erfahrungen aus der Paratuberkulosediagnostik am CVUA
Freiburg – Auswertung von Laborergebnissen von 1994 bis
2011
8.
S. Schillinger, P. S. Bridger,
T. Seeger, M. Fischer, C. Menge,
R. Bauerfeind
Erregerspezifische Antikörper als Indikatoren der MAPInfektion bei Kälbern und Jungrindern
9.
M. Schmidt, K. Eulenberger,
R. Pützschel
Erste Ergebnisse des Paratuberkuloseprogramms der
Sächsischen Tierseuchenkasse
K. Hüttner, MAP-Arbeitsgruppe
Sanierungsempfehlungen und MAP-Maßnahmekatalog –
Hinweise für Milchviehhalter
10.
M-V
11.
W.–I. Bock
Serologische und molekularbiologische Untersuchungen zum
Vorkommen des Bluetongue Virus (BTV) und von Pestiviren in
der Wildwiederkäuerpopulation im Freistaat Thüringen (2007 –
2011)
12.
S. Bilk, C. Schulze, M. Fischer,
M. Beer, A. Hlinak, B. Hoffmann
Organverteilung von Schmallenberg Virus RNA in
missgebildeten Neugeborenen
Posterschau mit Anwesenheit der Autoren: Do., 10.05., 19.30 – 20.00 Uhr
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Donnerstag, 10.05.: Themenkomplex BVD
Veranstaltungsort: Hotel Schwarzer Adler, großer Festsaal; Kornmarkt 5, 39576 Stendal
Nr.
Referent
Institut/ Ort
Thema:
23.
Gethmann
FLI/ Wusterhausen
Stand der BVD-Bekämpfung in Deutschland
24.
Linder
LAV/ Stendal
Virus, Verordnung und Vertrauen – Stand der
BVD-Bekämpfung in Sachsen-Anhalt und
Fallbericht einer eindrucksvollen Neuinfektion
25.
Di Labio
BVET/ Bern
BVD: Der Wechsel von der Bekämpfung mittels
Antigennachweis zur serologischen Überwachung
– Erfahrungen aus der Schweiz
26.
Hopp
Veterinärdienst/ Kreis
Soest
Zur Weiterverbreitung des BVD-Virus in
rinderhaltenden Betrieben trotz Merzen der
persistent virämischen Tiere
27.
Klopries
LALLF/ Rostock
BVD-Impfvirusnachweis aus Ohrstanzproben
28.
Weikel
AGES/ Innsbruck
Ungewöhnlicher Verlauf einer Infektion mit
Pestiviren in einem bisher nicht infizierten
Rinderbestand
29.
Lüllmann
Löningen
BVD – eine unterschätzte Krankheit in der
Kälbermast?
40 min Kaffeepause
30.
Amelung
LUFA Nord-West/
Oldenburg
Ein Jahr BVDV-Ohrstanzendiagnostik Ergebnisse aus 16 Landkreisen Niedersachsens
31.
Bange
TLLV/ Bad
Langensalza
BVD – Ein Jahr Pflichtbekämpfung in Thüringen:
Erfahrungen, Probleme und Perspektiven
32.
Haberl
TGD / Poing
Besonderheiten aus einem Jahr BVDPflichtbekämpung in Bayern
33.
Seeger
TSK/ Aulendorf
BVD-Bekämpfung in Baden-Württemberg –
Aktueller Stand aus Sicht des Diagnostikzentrums
und des Rindergesundheitsdienstes
Virbac/ Bad Oldesloe
Epidemiologische Bedeutung des aktiven und
passiven Impfschutzes in BVD-unverdächtig
werdenden Herden: Ergebnisse zur transienten
Infektion mit Virusausscheidung nach Challenge
von Kälbern mit maternalen Impfantikörpern aus
Bovidec-geimpften Muttertieren
34.
Teich
Uhrzeit
14.20
16.10 – 16.50
Ende des zweiten Tages
ca. 18.10
Posterausstellung mit Autoren
19.30 – 20.00
Abendessen im Festsaal
ab 20.00
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Freitag, 11.05.: Themenkomplex verschiedenes und Paratuberkulose
Veranstaltungsort: Hotel Schwarzer Adler, großer Festsaal; Kornmarkt 5, 39576 Stendal
Nr.
Referent
Institut/ Ort
Thema:
Poster und Industrieausstellung
35.
Probst
FLI/ Wusterhausen
Zehn Jahre BSE – eine Abschätzung der
entstandenen Kosten
36.
Gethmann
FLI/ Wusterhausen
Blauzungenkrankheit in Deutschland – Ein
(Rück-) Blick – Teil 1: Epidemiologie und
finanzielle Auswirkungen
37.
Hoffmann
FLI/ Riems
Blauzungenkrankheit in Deutschland – Ein
(Rück-) Blick – Teil 2: Diagnostik und
Patrhogenese
38.
Holsteg
TGD/ Bonn
Untersuchung zum Vorkommen von Antikörpern
gegen BTV-8 bei Rotwild, Rehwild, Damwild und
Muffelwild in den Jahren 2008 - 2012 für das
Bundesland Nordrhein-Westfalen
39.
Holsteg
TGD/ Bonn
Das Schmallenberg-Virus – Erfolg für das
Tierseuchenfrühwarnsystem in NRW
40.
Beer
FLI/ Riems
Aktuelle Informationen zum Infektionsgeschehen
mit dem Schmallenberg-Virus
41.
Klewer
ID-Vet
Erste Validierungsdaten für den ID Screen®
Schmallenberg Virus Indirect ELISA
42.
Conraths
FLI/ Wusterhausen
Epidemiologische Untersuchungen zur
Verbreitung von Fasciola hepatica- und
Dictyocaulus viviparus-Infektionen bei
Milchrindern in Deutschland
43.
Klindworth
RinderGD/
Bremervörde
Clostridium perfringens Typ A als Verursacher
schwerster Puerperalstörungen bei der
Milchkuh? – ein Fallbericht
30 min Kaffeepause
44.
Van der
Grinten
LAV/ Stendal
Akute Pasteurellose bei Rindern,
Wildwiederkäuern und Schweinen
45.
Domogalla
LGL/
Oberschleißheim
Molekularer Nachweis von Mycobacterium spp.
bei Rind und Rotwild in Bayern
46.
Menge
FLI/ Jena
Zelluläre Immunreaktionen gegen
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
beim Kalb – Vergleich zwischen experimenteller
Infektion und Exposition unter Feldbedingungen
47.
Komorowski
Bad Doberan
Praktikabilität und Aufwand der Map-Sanierung
in großen Milchbetrieben – Ergebnisse einer
Langzeitstudie in M-V
48.
SöllnerDonat
TSK/ Jena
Paratuberkulose: Thüringer Bekämpfungsprogramm – eine Fünf-Jahres-Bilanz
49.
Pearse
IDEXX/ Westbrooke
A voluntary programme for the risk-based
management of paratuberculosis in UK dairy
herds
Ende der Tagung
- 11 -
Uhrzeit
ab 8.00
8.30
11.00 – 11.30
ca. 13.30
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Innovative Tierseuchenüberwachung beim Rind mittels
Multiplex-Real-time-RT-PCR
Kerstin Wernike, Bernd Hoffmann, Martin Beer
Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit
Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
Verschiedenste Krankheitserreger können sehr ähnliche klinische Bilder hervorrufen. Die zur
Differentialdiagnostik eingesetzten, molekularbiologischen Testverfahren werden derzeit
meist in Einzeltestungen durchgeführt, was einen erheblichen Zeit- und Kostenaufwand
verursacht. Diesem Fakt Rechnung tragend wurde eine Real-time-RT-PCR (RT-qPCR) zum
simultanen Genomnachweis des Virus der Blauzungenkrankheit (BTV) und der Bovinen
Virusdiarrhoe/Mucosal Disease (BVDV), kombiniert mit einer Extraktions- und
Amplifikationskontrolle basierend auf dem beta-Aktin-Gen, entwickelt. Klinische
Erscheinungen, die eine BTV- oder BVDV-Infektion vermuten lassen, sich aber
molekulardiagnostisch nicht bestätigen, sollten differentialdiagnostisch weiter abgeklärt
werden.
Die Epizootische Hämorrhagie der Hirsche (EHD), das Rift-Valley-Fieber (RVF) und die
Maul- und Klauenseuche (MKS) wurden bisher in Deutschland noch nicht bzw. für längere
Zeit nicht nachgewiesen. Untersuchungen auf solch selten bzw. gar nicht vorkommende
Erreger werden zurzeit nur in sehr begrenztem Maße durchgeführt. Eine mögliche Folge ist
der verzögerte diagnostische Nachweis dieser Tierseuchen, was große wirtschaftliche
Verluste zur Folge haben kann. Um eine Einschleppung von MKSV, EHDV oder RVFV
frühzeitig zu erkennen, wurde ein „Frühwarnsystem“ für diese Erreger in die neu entwickelte
Multiplex RT-qPCR integriert. Die Nachweissysteme für BTV und BVDV wurden mit
RT-qPCR Assays für EHDV, RVFV und MKSV kombiniert, wobei die Genomdetektion dieser
Viren im identischen Farbkanal erfolgt. Somit kann jedes real-time Gerät verwendet werden,
das die parallele Messung in vier Farbkanälen ermöglicht. Die neu entwickelte Multiplex
RT-qPCR gibt einen Hinweis auf das Auftreten von MKSV, EHDV oder RVFV ohne
zusätzlichen Zeit- und Kostenaufwand verglichen mit der alleinigen Testung auf BTV und
BVDV. Wird ein positives Signal generiert, muss in einer sich anschließenden, zweiten
RT-qPCR die weitere Differenzierung erfolgen.
Mittels log10 Verdünnungsreihen entsprechender Standard RNA wurde für jedes System im
Multiplex-Ansatz eine analytische Sensitivität von mindestens 100 Genomkopien pro
Reaktion ermittelt. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurde anhand definierten
Materials validiert. Die zahlreichen getesteten Referenzproben wurden im Multiplex-Ansatz
korrekt detektiert, und dies mit hoher Übereinstimmung hinsichtlich quantification cycle
(Cq-)Werten zu den entsprechenden Assays im Einzelansatz. Bei der Testung von
negativem Probenmaterial wurden keinerlei unspezifische Reaktionen beobachtet.
Die RT-qPCR Systeme zum Nachweis von EHDV, RVFV und MKSV wurden durch die
zeitgleiche Amplifikation hoher BTV- und BVDV-Genomlasten kaum beeinflusst. Folglich
erlaubt die neu entwickelte Multiplex RT-qPCR die zuverlässige Detektion dieser Erreger in
erkrankten Tieren, selbst wenn eine zusätzliche Infektion mit BTV und/oder BVDV vorliegt.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
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Multiplex Real-Time PCR in der Diagnostik von Pneumonie- und
Abortursachen bei Rindern und kleinen Wiederkäuern
Kerstin Reisberg, Abdelfattah Monged Selim, Wolfgang Gaede
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin,
Haferbreiter Weg 132, 39576 Stendal
Die Diagnostik von mit klassischen Methoden schwer oder aufwändig nachweisbaren
Erregern
basierte
in
unserem
Hause
bisher
fast
ausschließlich
auf
Einzelparameteruntersuchungen mittels PCR. Um diese Untersuchungen kostengünstiger
und vor allem zeitsparender durchzuführen, entwickeln wir verschiedene Real-time Multiplex
PCR-Ansätze für jeweils drei Erreger plus eine Interne Kontrolle. Dazu werden umfassend
validierte und veröffentlichte PCR-Protokolle zu einer gemeinsamen PCR zusammengeführt.
Aborterregerdiagnostik beim Rind
Vertreter der Familie Chlamydiaceae sowie Coxiella burnetii und Neospora caninum zählen
in Deutschland zu den häufigsten infektiösen Ursachen von Aborten und anderen
Reproduktionsstörungen bei Wiederkäuern. Folgende veröffentlichte PCR-Protokolle wurden
zusammengeführt:
Chlamydiaceae: FLI- Protokoll, s. auch Ehricht et al. (2006)
Coxiella burnetii: Klee et al. (2006):
Neospora caninum: Großmann, pers. Mitteilung 2005, s. auch Sörgel et al. (2009)
Pneumonieerregerdiagnostik beim Rind
Zum Routinespektrum in der Pneumoniediagnostik beim Rind gehört die Untersuchung auf
Chlamydiaceae, Mycoplasma bovis und Bovines Herpesvirus 1 (BHV-1). Wobei in SachsenAnhalt in der BHV-1 Diagnostik lediglich die Untersuchung auf gB erfolgt.
Für die Pneumoniediagnostik wurden folgende veröffentlichte PCR-Protokolle
zusammengeführt:
Chlamydiaceae: FLI- Protokoll, s. auch Ehricht et al. (2006)
BHV-1: FLI-Protokoll, B. Hoffmann (2006)
Mycoplasma bovis: Sachse et al. (2010)
Ein Primer-Sondenpaar für das ß-Actin Gen (Toussaint et al., 2007 modifiziert nach
Hoffmann, FLI) wurde bei beiden Multiplex-PCR Reaktionen integriert, um die erfolgreiche
DNA-Extraktion aus dem Probenmaterial sowie insbesondere bei Tupfern eine korrekte
Beprobung zu bestätigen.
Für die PCR-Reaktionen wurde der Quantitect Multiplex-PCR Kit (no ROX) von Qiagen
verwendet. Die Real-time Multiplex-PCR wurde auf einem MX3005 der Fa. Stratagene
durchgeführt.
Die analytische Sensitivität wurde durch Titration von spezifischen Plasmiden (Aborterreger)
bzw. bekannten Proben (Pneumonieerreger) untersucht. Die Plasmide für die oben
genannten Erreger wurden von der Firma GeneExpress in Auftragssynthese hergestellt.
Falsch-negative Ergebnisse infolge kompetitiven Quenchings konnten in weiteren Versuchen
ausgeschlossen werden. Anhand der Titration von schwach-positiven Feldproben wurde die
gleichwertige Sensitivität der Real-Time Multiplex-PCR im Vergleich zu den bisherigen im
eigenen Labor verwendeten Prüfverfahren festgestellt [Chlamydien: real-time PCR lt. FLIProtokoll, s. auch Ehricht et al. (2006); Coxiella burnetii: konventionelle PCR nach Edingloh
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
et al. (1999); Neospora caninum: semi-nested PCR nach Baszler et al. (1999); Mycoplasma
bovis: Sachse et al. (2010); BHV-1: Hoffmann (2007, pers. Mitteilung)].
Die Inklusivität der verschiedenen Spezies, Subtypen etc. wurde im Wesentlichen als durch
die Publikationen gesichert angesehen. Bei der exemplarischen Prüfung der analytischen
Spezifität (Exklusivität) wurden gegen tierartspezifische Matrizes sowie wesentliche
differentialdiagnostisch relevante Erreger keine Kreuzreaktionen festgestellt.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der simultane Nachweis von
Chlamydiaceae, Coxiella burnetii und Neospora caninum mittels Real-Time Multiplex-PCR
zur Diagnostik von Reproduktionsstörungen sowie von Chlamydiaceae, Mycoplasma bovis
und BHV-1 zur Diagnostik von Pneumonien bei Wiederkäuern geeignet ist und sowohl die
Zeit als auch die Kosten für den Nachweis dieser Erreger erheblich senken kann.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erfahrungen mit der Milchserologie und der risikobasierten
Überwachung von Rinderbeständen
Simone Mitterhuemer und Michael Dünser
Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz, AGES,
Kudlichstraße 27, 4021 Linz, Österreich
Einleitung
Die Aufrechterhaltung der Brucellose, Leukose und BHV-1 Freiheit in Österreich erfordert
eine regelmäßige Untersuchung der Rinderbestände. Bis zum Jahr 2008 erfolgte die
Überwachung ausschließlich über die serologische Untersuchung von Blutproben, wobei
jährlich 20% der Bestände auf Rinderbrucellose sowie Enzootische Rinderleukose beprobt
wurden. Die Sicherstellung der BHV-1 Freiheit wurde gemäß den Bestimmungen des Artikels
10 der RL64/432/EWG in der Fassung der RL97/12/EG durchgeführt. Die Zielsetzungen für
eine Neuausrichtung des Überwachungsprogrammes bestanden darin, eine kostengünstige
und zugleich effiziente Überwachung der Rinderbestände zu erreichen.
Material und Methoden
Der österreichische Rinderbestand umfasst ca. 2 Millionen Rinder, die in etwa 71.000
Betrieben gehalten werden. Die Überwachung der milchliefernden Betriebe wurde im Zuge
der Neuausrichtung des Programmes auf die Untersuchung von Bestandsmilchproben
umgestellt, wobei die Probenahme im Rahmen der Milchqualitätskontrolluntersuchungen
durchgeführt wird. Die übrigen Betriebe werden nach einem jährlich ausgearbeiteten
risikobasierten Kontrollplan über Blutprobenentnahmen untersucht. Zur labordiagnostischen
Untersuchungen der Milch- und Blutproben kommen kommerzielle ELISA-Testsysteme zur
Anwendung. Aufgrund interner Validierungsstudien wurde die Anzahl an laktierenden
Rindern wurde mit maximal 50 Tieren pro Tankmilchprobe festgelegt.
Ergebnisse
Bedingt durch die in Österreich verhältnismäßig geringen Bestandsgrößen lassen sich ca.
95% der Milchkühe und 99% der milchliefernden Betriebe mit einer Sammelmilchprobe
untersuchen. Der Anteil an nicht-negativen Tankmilchproben lag im Zeitraum 2008-2010 bei
0,17-0,23%, wodurch jährlich etwa ca. 4.000-5.000 Rinder eine blutserologischen
Abklärungsuntersuchung unterzogen werden mussten. Während die Untersuchungen auf
Brucellose und Leukose ausschließlich negative Ergebnisse erbracht haben, konnten im
betreffenden Zeitraum 2008-2010 insgesamt 3 Tiere mit BHV-1 Impfantikörpern ermittelt
werden.
Diskussion
Durch die Einführung der kombinierten jährlichen Tankmilchuntersuchung der
milchliefernden Betriebe und die risikobasierten Untersuchung der nichtmilchliefernden
Betriebe konnten die Kosten des Überwachungsprogrammes bei gleichzeitiger Steigerung
der Untersuchungsfrequenz erheblich reduziert werden. Die Nutzung der Probenlogistik über
die Milchkontrolllaboratorien der Molkereien stellt eine kostengünstige und effiziente
Möglichkeit zur flächendeckenden Überwachung aller milchliefernden Betriebe dar. Durch
die Berücksichtigung epidemiologisch bedeutsamer Faktoren wie Zukauf aus Drittstaaten
bzw. innergemeinschaftlicher Handel sowie Weidhaltung werden gezielt Risikobetriebe
ausgewählt, um etwaige Infektionsherde frühzeitig erfassen zu können.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Sämtliche Untersuchungsdaten werden elektronisch an das Verbrauchergesundheitsinformationssystem (VIS) übermittelt, um den Veterinärbehörden eine rasche und effiziente
Auswertung der Untersuchungsergebnisse zu ermöglichen.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
BVDV- Kann man Blutproben zwischen dem 8. und
40. Lebenstag poolen?
Jürgen Christian, Anne Kupča und Karl-Heinz Bogner
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit,
Eggenreuther Weg 43, 91058 Erlangen
Einleitung:
Laut Amtlicher Methodensammlung ist ein Poolen von Blutproben zur BVDV-Diagnostik in
der PCR mit Probenahme im Zeitraum vom 8. bis zum 40. Lebenstag nicht zulässig. Diese
Einschränkung beruht auf Untersuchungen (Beer und Hoffmann, 2004; Wolf, 2004; Fux
2007), die zeigten, dass in diesem Zeitraum die Viruslast häufig deutlich absinkt, so dass
einzelne PI-Tiere in Pooluntersuchungen ggf. falsch negative Ergebnisse liefern würden. Da
diese Einschätzung vorrangig auf Untersuchungen von Leukozyten beruht, sollte an einer
Reihe von PI-Tieren mit einer Real-time BVD-PCR-Methode (Hoffmann et al., 2006; Fux,
2007) an Serum- und EDTA-Blutproben eruiert werden, ob auch hier ein derartiger Effekt
auftritt.
Material und Methode:
Verwendet wurden Blutproben von Kälbern, deren Ohrgewebe-Untersuchung auf BVDV
positiv verlief. Der Landwirt wurde nach Vorliegen des positiven Erstergebnisses um sein
Einverständnis für weitere Untersuchungen gebeten. Die Blutproben wurden nachfolgend bis
zum endgültigen Nachuntersuchungstermin jeweils einmal pro Kalenderwoche durch den
jeweiligen Hoftierarzt entnommen. Dabei wurden EDTA- und Serumproben angefordert und
vergleichend in der PCR untersucht, um mögliche durch die Probenart bedingte
Schwankungen auszuschließen. Zunächst wurden die Blutproben einzeln nach Aufreinigung
(QIAamp® Viral RNA Mini Kit, Fa. Qiagen) in der PCR untersucht. Zusätzlich wurden
Blutpools aus je 10 Proben untersucht, die sich jeweils aus einer Probe eines positiven
Kalbes und neun negativen Proben bzw. neun Teilen derselben negativen Probe
zusammensetzten. Insgesamt wurden 13 Kälber über einen Zeitraum von etwa sechs
Wochen bis zur endgültigen Nachuntersuchung (42 Tage nach der initialen Beprobung
mittels Ohrstanze) wöchentlich beprobt.
Ergebnisse:
Alle untersuchten Blutproben zeigten sowohl in der Einzel- als auch in der Pool-PCR
jederzeit ein BVDV-positives Ergebnis, wobei sich jedes untersuchte Tier letztendlich als PITier erwies. Es traten jedoch bei mehreren Tieren Ct-Wert-Schwankungen auf, insbesondere
innerhalb der ersten drei Lebenswochen wurden vergleichsweise höhere Werte gemessen
als in der initialen Ohrstanzprobe oder in nachfolgenden Blutproben. Dabei lagen die Werte
der Einzelblut-Untersuchungen aber immer unter einem Ct-Wert von 35, so dass bei einer
Einzel-PCR keine Gefahr bestand, ein PI-Tier zu "übersehen". Hierbei ergaben sich für die
parallele Untersuchung der zeitgleich entnommenen EDTA- und Serum-Proben eines Tieres
nahezu identische Werte, weswegen für die nachfolgende Pool-Untersuchung jeweils nur
eine Probenart (i. d. R. Serum-Proben) verwendet wurde. In der Pool-PCR spiegelten sich
die Schwankungen der Ct-Werte aus der Einzel-PCR wieder. Die Ct-Werte fielen hier
erwartungsgemäß durch den Verdünnungsfaktor bedingt schwächer aus (im Mittel um 4,1
Ct-Werte höher als in der Einzel-PCR). Bei vier Tieren wurden dabei auch einzelne Ct-Werte
nahe der Nachweisgrenze gemessen (bis hin zu 41,4 bei einer Probe). Eine Inhibition der
PCR-Reaktion als Ursache für diese schwachen Ct-Werte konnte aufgrund der internen
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8. Stendaler Symposium
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Kontrollen ausgeschlossen werden. Die Werte nahe der Nachweisgrenze wurden
insbesondere bei einem Probenahme-Alter von bis zu 29 Tagen gemessen. Bei der
Interpretation der Ergebnisse ist zu beachten, dass Proben nur in etwa wöchentlichen
Abständen genommen werden konnten, eine idealerweise täglich durchzuführende
Untersuchung war nicht möglich. Hierdurch entstanden z. T. relativ große Zeiträume
zwischen den Probenahmen, insbesondere auch zwischen der initialen Ohrstanzprobe und
der ersten Blutuntersuchung (zwischen 6 und 14 Tagen). Es kann daher nicht
ausgeschlossen werden, dass ggf. an einem anderen Probenahmetag der BVDV-Nachweis
in der Pool-PCR tatsächlich negativ ausgefallen wäre.
Tier B
Untersuchung von gepoolten Proben
40
45
35
40
30
EDTA
25
Serum
20
Ohrstanze
15
10
1
12
19
27
35
Ct-Wert BVDV
Ct-Wert B VDV
Tier B
Untersuchung von Einzelproben
35
30
Serum-P o ol
25
20
15
10
49
1
Probenahme (Lebenstag)
12
19
27
35
49
Probenahme (Lebenstag)
Abbildung
Beispielhafte Darstellung der wöchentlichen Blutuntersuchungen eines BVDV-positiven Kalbes, bei
dem Schwankungen der Ct-Werte im BVDV-Nachweis sowohl in der Einzel- als auch in der PoolUntersuchung beobachtet wurden, wobei bei der Pooluntersuchung einzelne Werte nahe der
Nachweisgrenze lagen. Erläuterungen siehe Text.
Schlussfolgerung:
Legt man größere Pools zugrunde, die nach der Methodensammlung (für ältere Tiere)
möglich wären, so wäre schon bei unseren wenigen PI-Tieren mindestens eines unentdeckt
geblieben. Vor diesem Hintergrund erscheint eine Freigabe von zwischen dem 8. bis 40.
Lebenstag entnommenen Blutproben für eine Pooluntersuchung für fragwürdig bis gewagt.
Eine mögliche Verkürzung des momentan gültigen Zeitraums, in dem eine Pool-PCR aus
Blutproben auf BVDV nicht durchgeführt werden darf, ist aus unserer Sicht aufgrund des
vorliegenden Versuches ebenfalls nicht sinnvoll, da hier bei Probenahmen bis zum 29.
Lebenstag schwache Ct-Werte aufgetreten sind und die Einbeziehung eines zusätzlichen
Zeitpuffers von 10 Tagen die Sicherheit weiter erhöht. Über Blutuntersuchungen in der PoolPCR mit Probenahme in den ersten Lebenstagen kann mit diesem Versuch keine Aussage
getroffen werden, da organisatorisch bedingt die Blutproben i. d. R. erst nach dem
10. Lebenstag entnommen wurden.
Literatur:
Beer M., Hoffmann B., 2004. BVDV real-time RT-PCR: Diagnostische Möglichkeiten und
Standardisierung. Präsentation, AVID-Tagung, Banz, 15.–17.09.2004.
Fux R. G., 2007. Entwicklung und Prüfung von Verfahren zum Nachweis des Virus der
Bovinen Virusdiarrhoe in getrockneten Ohrgewebeproben mittels Antigen-ELISA und real
time RT-PCR. [Dissertation] Veterinärmedizinische Fakultät der LMU München.
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Hoffmann B., Depner K., Schirrmeier H., Beer M., 2006. A universal heterologous internal
control system for duplex real-time RT-PCR assays used in a detection system for
pestiviruses. J Virol Methods, 136: 200-209.
Wolf G., 2004. Diagnostik von BVDV-PI-Kälbern in der kolostralen Phase: quantitative
Virusisolierung, Erns und NS2/3-ELISAs, NS2/3-IFT (FACS) und RT-PCR aus Blutproben.
Präsentation, AVID-Tagung, Banz, 15.-17.09.2004.
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"Schlechte Diagnostik" doch ganz brauchbar? Schätzungen von Sensitivität und Spezifität aus
Validierungsproben mit unsicherer Klassifikation
Andreas Fröhlich
Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit,
Institut für Epidemiologie, Seestraße 55, 16868 Wusterhausen
Einleitung:
Epidemiologische Parameter werden in aller Regel mit Hilfe stochastischer Modelle ermittelt.
Hierbei wird stets unterstellt, dass die in die Modelle einfließenden Messergebnisse den
tatsächlichen Gegebenheiten exakt entsprechen. In der Praxis lässt sich diese strikte
Forderung im Allgemeinen nicht einhalten, insbesondere dann, wenn, wie für die
Epidemiologie oft zwingend erforderlich, komplizierte diagnostische Messmethoden
angewendet werden und mit diesen große Mengen an Messwerten produziert werden. In
dieser Situation lassen sich naturgemäß Messfehler nicht ausschließen, die durch eine
Vielzahl nicht näher beschreibbarer Unsicherheiten, die den komplexen diagnostischen
Messmethoden innewohnen, verursacht werden.
Für korrekte Aussagen, die auf vorliegenden Messergebnissen basieren, ist es innerhalb
eines vorgegebenen Kontextes unerlässlich, die Fehlerhäufigkeit dieser Messmethoden zu
kennen und zu quantifizieren. Damit ist gleichzeitig die Leistungsfähigkeit einer
diagnostischen Messmethode hinsichtlich des Wahrheitsgehaltes ihrer Messergebnisse
eindeutig charakterisiert.
Die bekannten Größen Sensitivität und Spezifität stellen als Wahrscheinlichkeitswerte die
allgemein geforderte notwendige theoretisch Charakterisierung dar. Grundsätzlich sind beide
Größen voneinander unabhängig, da sie auf den disjunkten Mengen der Infizierten bzw. der
Nicht-Infizierten definiert sind. Weiterhin nehmen beide Größen einen gewissen
unveränderlichen Wert an. Andererseits ist eine praktische Bestimmung von Sensitivität und
Spezifität einer diagnostischen Messmethode nur mit Hilfe von Stichproben möglich,
wodurch die so ermittelten Werte zwangsläufig mit Unsicherheiten behaftet sind, die sich in
der Tatsache widerspiegeln, dass die praktisch ermittelten Werte von den tatsächlichen
Werten mehr oder minder abweichen können. Ein weiteres, sehr viel schwerwiegenderes
Problem bei der praktischen Bestimmung von Sensitivität und Spezifität, lässt sich
folgendermaßen beschreiben:
Problembeschreibung und Konsequenzen:
Unter dem Postulat einer binären Logik (infiziert, nicht-infiziert) ist eine Bestimmung von
Sensitivität und Spezifität einer diagnostischen Messmethode durchzuführen. Hierfür werden
jeweils entsprechende Evaluierungsstichproben benötigt, die die Kenntnis der Zugehörigkeit
der Evaluierungsstichprobenelemente entweder zu der Menge der Infizierten (zur
Bestimmung der Sensitivität) oder zu der Menge der nicht Infizierten (zur Bestimmung der
Spezifität) voraussetzt. Für gewisse Erkrankungen existiert aus verschiedensten Gründen
diese notwendige Vorkenntnis nicht sicher, was Folgendes zur Konsequenz hat:
Die Bestimmungen (Schätzungen) von Sensitivität und Spezifität stehen hinsichtlich der fixen
Beobachtung aus dem getesteten Evaluierungsprobensatz im funktionalen Zusammenhang.
Allgemein stellt sich zunächst die Frage nach der konkreten Anhängigkeit bei der
Bestimmung (Schätzung) der Parameter unter den beschriebenen Bedingungen.
Weiterhin folgt, dass sich die Vertrauensbereiche bei der Bestimmung der Parameter
wesentlich von denjenigen unterscheidet, für die in gewissem Umfang Zusatzwissen über
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den Wahrheitsgehalt der Klassifikation der Evaluierungsproben existiert und dieses als
gesicherte Erkenntnis in eine Schätzung einfließen kann.
Vortragsinhalt - Darstellung:
Anhand konkreter Daten wird ein aus der Praxis entlehntes Beispiel vorgestellt, wobei
folgende Sachverhalte erläutert und dargestellt werden:
1. Vertrauensbereiche bei Schätzungen von Sensitivität und Spezifität
2. Es wird der Frage nachgegangen, in wie fern sich die Unsicherheit bei der
Klassifikation von Evaluierungsproben auf die Vertrauensbereiche der zu
schätzenden Parameter Sensitivität und Spezifität auswirkt und welche Bedeutung
zusätzlicher Kenntnis hierbei zukommt.
3. „schlechte diagnostische Methoden“ – was diese ihrer Charakteristik entsprechend
eingesetzt leisten können.
Zusammenfassung:
Praktische Evaluierungen von Sensitivität und Spezifität mit echten Teilpopulationen ergeben
mit oder ohne zusätzliches Wissen grundsätzlich Vertrauensbereiche, so dass der jeweils
andere Parameter innerhalb eines gewissen Intervalls variiert werden kann, wenn ein
Parameter fixiert wird. Häufig kommen jedoch Punktschätzwerte in Anwendung, die
insbesondere dann hinsichtlich ihrer Aussagekraft kritisch hinterfragt werden sollten, wenn
hiernach perfekte diagnostische Methoden deklariert werden.
Dennoch können unter gewissen Bedingungen angeblich „schlechte diagnostische
Methoden“ sehr effektiv eingesetzt werden und zur angestrebten Erkenntnis beitragen.
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Paratuberkulose – Vergleich von Serologie und Kotkultur
Karsten Donat1, Ute Schau1, Heike Köhler2
1
Thüringer Tierseuchenkasse, Victor-Goerttler-Straße 4, 07745 Jena
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese,
Naumburger Straße 96 a, 07743 Jena
Einleitung
Die Paratuberkulose wird durch den Erreger Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis
(MAP) verursacht und führt nach einer Periode der Latenz und einer langen subklinischen
Erkrankungsphase zu wässrigen, unstillbaren Durchfällen, Ödembildung und dem Abmagern
der Tiere. Die Bildung von Antikörpern gegen MAP hängt vom Infektionsstadium ab und ist
im Stadium der klinischen Erkrankung häufiger als im Zeitraum der Latenz. Diese
Besonderheiten der Antikörperbildung bedingen eine im Vergleich zu anderen
Infektionskrankheiten begrenzte Sensitivität der serologischen Nachweismethoden. Die
Literaturangaben zur Nachweisrate serologischer Tests bei klinisch inapparent infizierten
Rindern unterscheiden sich erheblich und sind auf Grund voneinander abweichender
Referenzmethoden, der sich in unterschiedlichen Erkrankungsstadien befindlichen
untersuchten Tiere und der Unterschiede im Anteil klinisch erkrankter Rinder in der
Referenzpopulation kaum vergleichbar.
Ziel dieser Untersuchung war es, die diagnostische Sensitivität und Spezifität der in
Deutschland verfügbaren serologischen Tests anhand von Feldproben aus der Thüringer
Rinderpopulation relativ zur Kotkultur auf Festnährböden zu bestimmen.
Material und Methoden
Aus 23 Beständen, die am „Programm zur Bekämpfung der Paratuberkulose in den
Rinderbeständen in Thüringen“ teilnahmen und die Kühe ihres Bestandes einmal jährlich
kulturell untersuchten, wurden insgesamt 804 Tiere ausgewählt. Dabei stammten 344
kulturell negativ getestete Rinder aus sieben „historisch freien“ Herden (kein MAP-Nachweis
seit Beginn der Untersuchungen), wobei jeweils ca. 50 Rinder für die serologische
Untersuchung herangezogen wurden. Aus 16 positiven Herden wurden Blutproben von 460
Rindern, von denen jeweils ein positives Kulturergebnis vorlag, für den Antikörper-Nachweis
entnommen. Die kulturelle Untersuchung der Einzeltierkotproben erfolgte entsprechend der
in der amtlichen Methodensammlung des Friedrich-Loeffler-Instituts (FLI), Stand April 2010,
veröffentlichten Methode des kulturellen Nachweises.
Die Bestimmung der MAP-Antikörper fand mit vier verschiedenen kommerziellen ELISATestkits statt, die zum Zeitpunkt unserer serologischen Untersuchungen in Deutschland
zugelassen waren. Es handelte sich dabei um die Testsysteme
− CATTLETYPE® MAP Ab (LDL – Labordiagnostik GmbH Leipzig, Leipzig, D),
− POURQUIER® ELISA Paratuberculosis serum and milk (Institut Pourquier SAS,
Montpellier, F),
− ID Screen® Paratuberculosis Indirect ELISA kit (ID Vet, Montpellier, F)
− PARACHEK® 2 (Prionics Deutschland GmbH, Planegg-Martinsried, D).
Die
Probenbearbeitung
und
Testauswertung
erfolgte
entsprechend
den
Anwendungsvorschriften
der
Testhersteller.
Für
die
Berechnungen
der
Validierungsparameter standen die Programme WIN EPISCOPE 2.0 und SPSS 11.5 für
Windows zur Verfügung. Die diagnostischen Sensitivitäten und Spezifitäten der einzelnen
Testkits einschließlich der jeweiligen 95%igen Konfidenzintervalle (CI) wurden relativ zu den
Ergebnissen der kulturellen Untersuchung der Einzeltierkotproben ermittelt. Rinder, die nach
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den Herstellerangaben als verdächtig einzustufen waren, wurden für die
Spezifitätsberechnung als positiv und für die Sensitivitätsberechnung als negativ betrachtet.
Für die Kalkulation der Stichprobengrößen zum Nachweis der Freiheit eines Bestandes von
der MAP-Infektion wurde die Software Freecalc 2.0 genutzt, wobei eine erwartete
Einzeltierprävalenz innerhalb der Herde von 10 % MAP-Ausscheidern mit einer
Mindestsicherheitswahrscheinlichkeit von p < 0,05 detektiert werden sollte. Die
Testsensitivitäten und –spezifitäten gingen jeweils mit den unteren Grenzen ihrer 95%igen CI
in die Berechnung ein.
Ergebnisse und Diskussion
Die Häufigkeiten der positiven, verdächtigen und negativen Antikörpernachweise mithilfe der
ELISA-Systeme A bis D in Bezug zum Ergebnis der Kotkultur, getrennt nach Beständen mit
positivem und negativem Status sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1: Ergebnishäufigkeiten von vier verschiedenen ELISA-Testsystemen
Kultureller MAP-Status
positiv
negativ
untersuchte Rinder (n)
ELISA
Ergebnis
A
negativ
verdächtig
positiv
B
negativ
verdächtig
positiv
C
negativ
verdächtig
positiv
D
negativ
positiv
460
n
342
11
107
307
5
148
312
5
143
321
139
344
%
74,3
2,4
23,3
66,7
1,1
32,2
67,8
1,1
31,1
69,8
30,2
n
335
–
9
339
0
5
336
2
6
333
11
%
97,4
–
2,6
98,5
0,0
1,5
97,7
0,6
1,7
96,8
3,2
Die relativ zu den Ergebnissen der Kotkultur ermittelten Testeigenschaften bei Einsatz zur
Einzeltierdiagnostik sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Diagnostische Sensitivität und Spezifität der ELISA-Testsysteme
Test
Sensitivität %
Spezifität %
Mittelwert
95 % CI
Mittelwert
95 % CI
A
23,3
19,4–27,1
97,4
95,7–99,1
B
32,2
27,9–36,4
98,6
97,3–99,9
C
31,1
26,9–35,3
97,7
96,1–99,3
D
30,2
26,0–34,4
96,8
94,9–98,7
Die hier berechneten Sensitivitäten von 32,2 % für Test B und 30,2 % für Test D entsprechen
in etwa denen, die Collins et al. (2005) für die ELISA-Testsysteme B und D und Clark et al.
(2008) für Testkit D relativ zur Kotkultur erzielen konnten. Höhere Sensitivitäten für Kit B mit
53,6 % und C mit 58,2 % bestimmten Köhler et al. (2008a); bei separater Betrachtung
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klinisch inapparent infizierter und MAP ausscheidender Rinder errechneten die Autoren eine
Sensitivität von 33,9 % (CI: 22,1–45,7 %) für Test B beziehungsweise 41,9 %
(CI: 29,7–54,3 %) für Test C. In den meisten bisher veröffentlichten Studien lagen die
Spezifitäten für die hier untersuchten ELISA’s über 99,0 %. Lediglich Clark et al. (2008)
ermittelten für Kit D eine Spezifität von 97,8 %, die mit der hier für diesen Test berechneten
vergleichbar ist.
Die unter Berücksichtigung der Testeigenschaften mindestens notwendige Stichprobengröße
zum Nachweis der Freiheit eines Bestandes von Paratuberkulose mit serologischen
Untersuchungen ist für die ELISA-Tests B und C in Tabelle 3 angeben, für Test A und D war
unter den gegebenen Voraussetzungen eine Kalkulation einer Stichprobengröße nicht
möglich.
Tabelle 3: Mindestens notwendige Stichprobengröße zum Nachweis der ParatuberkuloseFreiheit eines Bestandes mittels ELISA
Stichprobenmögliche falsch positive
HerdenELISA-Test
größe/Herde
Rinder (n)
größe (n)
(n)
Test B
700
610
23
Test C
1000
935
46
Schlussfolgerungen
Die diagnostischen Eigenschaften der ELISA-Testsysteme sind untereinander vergleichbar,
weisen jedoch im Vergleich zur Kotkultur eine deutlich verminderte Sensitivität und Spezifität
auf. Im Ergebnis ist festzustellen, dass die zurzeit zugelassenen serologischen Testsysteme
für die Feststellung des MAP-Status von sehr großen Rinderherden bedingt geeignet sind.
Beschränkungen ergeben sich aus der notwendigen Stichprobengröße und aus der
Bewertung der positiven Testergebnisse. Für die Beurteilung von kleineren Herden sind die
diagnostischen Sensitivitäten und Spezifitäten der ELISA-Tests nicht ausreichend.
(Literatur bei den Verfassern)
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Langzeit-Studie zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp.
paratuberculosis in ausgewählten Probenmatrizes zweier
Fleckviehbullen
Pia Münster, Inger Völkel, Wilhelm Wemheuer, Simone Urstadt, Daniel Schwarz,
Claus-Peter Czerny
Department für Nutztierwissenschaften, Georg-August-Universität Göttingen
Burckhardtweg 2, 37077 Göttingen
ZUSAMMENFASSUNG
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose, auch
Johne’sche Krankheit genannt, die überwiegend adulte Haus- und Wildwiederkäuer befällt.
Zum besseren Verständnis des Ausscheidungsverhaltens von MAP in Sperma, Blut und Kot
wurden zwei subklinisch natürlich mit MAP infizierte Fleckviehbullen (Bos primigenius taurus)
in einer Langzeitstudie untersucht. Insgesamt wurden 101 Beprobungstage über einen
Zeitraum von 4 Jahren (Juni 2007 – November 2011) ausgewählt. Mittels qualitativer IS900
semi-nested PCR konnte der Erreger in allen untersuchten Matrices intermittierend mit MAP
freien Intervallen von 5 bis 18 Wochen nachgewiesen werden. Auch wenn kein signifikanter
Unterschied zwischen dem Verteilungsmuster von MAP im Kot und Blut festgestellt wurde,
konnte eine Signifikanz zwischen dem Nachweis von MAP in Sperma und Blut gezeigt
werden (r = 0,57; p < 0,001; n = 65). Mittels quantitativer IS900 real-time PCR wurden
102-106 MAP/g Kot und 102-105 MAP/ml Sperma bzw. Blut ermittelt.
Diese Studie trägt zu einem besseren Verständnis der MAP-Verteilung in Kot, Sperma und
Blut bei und verdeutlicht den Bedarf an erweiterten Überwachungs- und
Hygienemaßnahmen zur Prävention der Infektion mittels Sperma. Aufgrund der potentiellen
venerischen Übertragung von MAP sind weitere Untersuchungen zur vertikalen Infektion
empfehlenswert.
EINLEITUNG
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) ist der Erreger der Paratuberkulose
(Johne’sche Krankheit), einer chronischen progressiven, mit Auszehrung einhergehenden
Enteritis, die überwiegend adulte Haus- und Wildwiederkäuer befällt. Die Paratuberkulose
tritt weltweit auf. Wegen zum Teil gravierender wirtschaftlicher Verluste in der Milch- und
Fleischindustrie, wird ihr immer mehr Beachtung geschenkt. Der vielfach diskutierte
ätiologische Zusammenhang mit Morbus Crohn des Menschen ist nach wie vor ungeklärt.
Die Infektion des Erregers erfolgt vor allem auf neugeborene Kälber horizontal durch fäkalorale Übertragung des Erregers mit dem Kolostrum oder über kotverschmierte Zitzen.
Besonders bei klinisch erkrankten Müttern wurde zudem von einer vertikalen Übertragung
auf das Kalb berichtet (Whittington and Windsor, 2009). Auch wurde der MAP-Erreger
bereits im Sperma von Bullen nachgewiesen (Edmondson et al., 1948; Khol et al., 2010;
Ayele et al., 2004), wobei Bakterien mit dem Ejakulat ausgeschieden werden und eine
mögliche Übertragung auf weibliche Rinder besteht. Gegenwärtig ist jedoch noch nicht
geklärt, ob infizierte Besamungsbullen mitverantwortlich für die Verbreitung von MAP in der
Population sind. Obwohl bereits diskutiert wurde, dass der Erreger im Sperma
ausgeschieden wird und den Prozess der Flüssigkonservierung von Sperma überleben kann,
wurden keine weiteren Studien bezüglich des Ausscheidungsverhalten bzw.
Überlebensfähigkeit von MAP-Erregern in Sperma nachgegangen.
Daher war Ziel dieser Studie, die Klärung des Ausscheidungsmusters in einer Langzeitstudie
von MAP in Kot, Sperma und Blut zweier subklinisch mit MAP infizierter Fleckviehbullen (Bos
primigenius taurus).
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MATERIAL UND METHODEN
Zwei subklinisch mit MAP infizierte Fleckviehbullen (Bos primigenius taurus), welche im
Großtier-Isolierstall des Departments für Nutztierwissenschaften gehalten wurden, wurden in
einer Langzeitstudie auf MAP in Kot, Sperma und Blut untersucht.
DNA Extraktion. Die DNA der verschiedenen Matrizes (Kot, Sperma und Blut) wurden mit
Hilfe des QIAamp Blood Kit (Quiagen, Hilden, Germany) extrahiert.
Polymerase Ketten Reaktion. Zum Nachweis und zur Quantifizierung wurde eine bereits
entwickelte IS900 semi-nested PCR (snPCR) und quantitative real-time PCR (rtPCR)
verwendet (Münster et al., 2011).
Sequenzierung. Die IS900-spezifischen PCR-Amplifikate wurden zur Sequenzierung in den
Vektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert. Die für die Amplifikate ermittelten DNASequenzen wurden anschließend mit dem MAP-K10-Referenzstamm verglichen.
Enzyme-linked immunosorbent assay. Im Jahre 2007 und 2008 wurden jeweils 35 Seren
mittels Idexx-ELISA (IDEXX GmbH, Woerrstadt, Germany) getestet. Seit 2009, war der
Idexx-ELISA nicht mehr verfügbar und wurde mit dem Pourquier-ELISA (Institut Pourquier
SAS, Montpellier, France) ersetzt. Insgesamt wurden jeweils 66 Seren im Jahre 2009, 2010
und 2011 mit diesem ELISA untersucht.
Statistische Analyse. Zur Beschreibung des Zusammenhangs zwischen dem MAPNachweis in Kot, Sperma und Blut wurde der Spearmans Rangkorrelationskoeffizient (r)
berechnet. Alle Analysen wurden mittels Microsoft Office Excel 2003 und Minitab Version
15.0 (Minitab Inc., State College, PA, USA) durchgeführt.
ERGEBNISSE
Während der gesamten Langzeitstudie befanden sich beide Bullen in einer guten
körperlichen Verfassung. Klinisch deuteten keine Symptome auf eine MAP-Infektion hin,
allerdings fiel ein reduziertes Wachstumsverhalten bei beiden Bullen auf.
Insgesamt wurden 101 Beprobungstage über einen Zeitraum von 4 Jahren (Juni 2007 –
November 2011) ausgewählt. Bereits im Alter von 10 und 18 Monaten konnte MAP im Kot
sowie Sperma der beiden Bullen nachgewiesen werden. Mittels snPCR wurde der Erreger in
allen untersuchten Matrices intermittierend mit MAP freien Intervallen von 5 bis 18 Wochen
detektiert. Die Anzahl der positiv getesteten Sperma- und Kotproben war im Durchschnitt
höher als die Anzahl der positiv getesteten Blutproben. Auch wenn kein signifikanter
Unterschied zwischen dem Verteilungsmuster von MAP im Kot und Blut festgestellt wurde,
konnte eine Signifikanz zwischen dem Ausscheidungsverhaltens von MAP in Sperma und
Blut gezeigt werden (r = 0,57; p < 0,001; n = 65). Beim ersten Bullen wurde an siebzehn
Tagen MAP gleichzeitig in Kot und Sperma nachgewiesen, wobei MAP elfmal ausschließlich
in Sperma und neunmal ausschließlich in Kot detektiert wurde. Beim zweiten Bullen wurde
MAP lediglich einmal synchron in Sperma und Kot und sechsmal zugleich in Blut und
Sperma detektiert. Mittels quantitativer rtPCR wurden 102-106 MAP/g Kot und 102-105
MAP/ml Sperma bzw. Blut ermittelt. Obgleich MAP in Sperma nachgewiesen wurde, konnte
für beide Fleckviehbullen eine gute Spermaqualität mit Volumen von 3 bis 10,5 ml
dokumentiert werden. Morphologisch normale Spermien variierten von 85 bis 92%, Dichte
von 0,4 bis 1,6 Millionen/μl, und Beweglichkeit von 65 bis 70%. Serologische
Untersuchungen wurden 2007 und 2008 mit dem Idexx-ELISA und 2009, 2010 und 2011 mit
dem Pourquier-ELISA durchgeführt. Mittels Idexx-ELISA wurde in 11/35 (32%) Serumproben
Antikörper gegen MAP nachgewiesen werden. Der Pourquier-ELISA belegte hingegen
während der drei Jahre bei keinen der beiden Bullen eine Immunantwort. Die
Antikörperspiegel im Serum der Bullen verliefen über Monate auf konstantem Niveau.
Zusätzlich wurden IS900-spezifische PCR-Amplifikate zur Sequenzierung kloniert und mit
DNA-Sequenzen von MAP-Referenzstämmen verglichen. Die IS900-Sequenzen der
Amplifikate stimmten mit der publizierten MAP K-10 Sequenz (GenBank: AE16958) zu 100%
überein.
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DISKUSSION
Paratuberkulose ist eine weltweit auftretende Erkrankung von Wiederkäuern, welche zu
gravierenden wirtschaftlichen Verlusten in der Landwirtschaft führt. Die künstliche Besamung
von Kühen mit flüssigkonserviertem Sperma hat weitestgehend den Natursprung abgelöst
und damit eine effiziente Rinderproduktion ermöglicht. Es wurde jedoch bereits berichtet,
dass MAP den Prozess der Flüssigkonservierung überlebt (Larsen et al., 1981). Daher ist es
nicht auszuschließen, dass MAP über Sperma übertragen wird und eine mögliche Rolle bei
der Verbreitung von MAP in der Population spielt. Für zukünftige Sanierungsprogramme,
welche Besamungsstationen in Hygienemaßnahmen einbeziehen, sind Erkenntnisse über
MAP in Sperma notwendig. Ziel dieser Arbeit war es den Status der quantitativen und
qualitativen Erregersituation im Sperma anhand zweier repräsentativer subklinisch an MAP
infizierter Bullen zu ermitteln. Über den gesamten Zeitraum dieser Studie wurde der Erreger
bei beiden Bullen intermittierend mit langen MAP-freien Perioden detektiert. MAP wurde
auch im Blut nachgewiesen, was darauf schließen lässt, dass sich lebensfähige Erreger über
die Blutlaufbahn im Körper verteilen. Diese Theorie wird zusätzlich durch eine statistisch
signifikante Korrelation zwischen MAP-Nachweis in Sperma und Blut unterstützt. Auch wenn
die eingesetzten PCR-Techniken zum direkten DNA-Nachweis keine endgültige
Differenzierung zwischen toten und lebenden Erregern erlauben, könnten 103-105 MAP/ml
Sperma ein potentielles Risiko für eine vertikale Übertragung darstellen. In der Literatur wird
davon ausgegangen, dass infizierte Tiere für mindestens zwei Jahre eine subklinische Phase
durchlaufen, ohne den Erreger auszuscheiden. Unsere Ergebnisse belegen, dass im Kot
sowie Sperma der beiden Bullen bereits im Alter von 18 Monaten MAP mittels PCR
nachweisbar ist. Dies mag für den heutigen Wissensstand ein ungewöhnliches Ereignis sein,
jedoch konnten in einer kürzlich publizierten Studie Rinder vor dem zweiten Lebensjahr als
MAP-Ausscheider identifiziert werden (Weber et al., 2010). Die Theorie, dass Rinder in
jungen Jahren nicht infektiös sind, sollte neu überdacht werden.
In dieser Studie wurden Erkenntnisse über das MAP-Ausscheidungsverhalten in Kot,
Sperma und Blut von Bullen erarbeitet. Diese Ergebnisse verdeutlichen den Bedarf an
erweiterten Überwachungs- und Hygienemaßnahmen und sollten bei der Prävention von
Infektionserkrankungen mittels Sperma berücksichtigt werden. Aufgrund der potentiellen
venerischen Übertragung von MAP sind weitere Untersuchungen zur vertikalen Infektion
empfehlenswert. Zudem sollte eine Resistenzprüfung von MAP im Sperma erfolgen, um die
Wirksamkeit der aktuell verwendeten Antibiotikum-Zusätze beurteilen zu können.
LITERATURANGABEN
Ayele WY, Bartos M, Svastova P, Pavlik I: Distribution of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in organs
of a naturally infected bull-calves and breeding bulls. Vet. Microbiol. 2004. 103 (3-4), 209-217.
Edmonson JE, Tallmonn KL, Herman HA: A study of the types of bacteria in bovine semen and their effect up on
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Khol JL, Kralik P, Slana I, Beran V, Aurich C, Baumgartner W, Pavlik I: Consecutive excretion of Mycobacterium
avium subspecies paratuberculosis in semen of a breeding bull compared to the distribution in feces, tissue and
blood by IS900 anf F57 quantitative real-time PCR and culture examinations. J. Vet. Med. Sci. 2010. 72 (10),
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Larsen AB, Stalheim OH, Hughes DE, Appell LH, Richards WD, Himes EM: Mycobacterium paratuberculosis in
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Münster P, Völkel I, Wemheuer W, Schwarz D, Döring S, Czerny CP: A longitudinal study to characterize the
distribution patterns of Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis in semen, blood and feces of a naturally
infected bull by IS900 semi-nested and quantitative real-time PCR. 2012. Transbound. Emerg. Dis. (under
Review).
Weber MF, Kogut J, de Bree J, van Schaik G, Nielen M: Age at which dairy cattle become Mycobacterium avium
subsp. paratuberculosis faecal culture positive. Prev. Vet. Med. 2010. 97 (1), 29-36.
Whittington RJ, Windsor PA: In utero infection of cattle with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis: a
critical review and meta-analysis. Vet. J. 2009. 179, 60-69.
- 30 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
- 31 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Molekulare Typisierung von Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (MAP) Isolaten aus dem Österreichischen
Paratuberkulosebekämpfungsprogramm
M. Dünser1, M. Altmann1, E. Sodoma1, P. Möbius2
1
Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz, AGES,
Kudlichstraße 27, 4021 Linz, Österreich
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese,
Naumburger Straße 96 a, 07743 Jena, Deutschland
Einleitung
Seit 2006 wird in Österreich ein Programm zur Bekämpfung der Klinischen Paratuberkulose
bei Rindern, Schafen, Ziegen und Wildwiederkäuern in Gatterhaltung per Verordnung
durchgeführt. Es besteht Anzeigepflicht für Wiederkäuer, die aufgrund der klinischen
Symptomatik als Paratuberkulose verdächtig eingestuft werden. Die labordiagnostische
Abklärung der klinischen Verdachtsfälle erfolgt zentral am AGES-Institut für
Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz, zugleich Nationales Referenzlabor für
Paratuberkulose. Erstmalig wurden MAP-Isolate aus dem gesamten Bundesgebiet einer
molekularbiologischen Typisierung unterzogen, um Informationen über das Auftreten und die
Verbreitung verschiedener Stämme zu erhalten.
Material und Methode
165 MAP-Feldstämme, die im Zeitraum 2006 bis 2011 von 164 klinisch an Paratuberkulose
erkrankten Wiederkäuern isoliert wurden, sind in die Typisierung einbezogen worden. Die
molekularbiologische Typisierung aller Isolate erfolgte mittels IS900 RFLP unter Verwendung
zweier Restriktionsenzyme (BstEII, PstI) sowie mittels MIRU-VNTR von 8 verschiedenen
genomischen Loci (MIRU 292, X3; VNTR 25, 47, 3, 7,10, 32) in Anlehnung an MÖBIUS et al.
(2008) und THIBAULT et al. (2007). Insgesamt gelangten 141 Rinderisolate aus 73
Betrieben und unterschiedlichen Rassen (Angus, Aquitaine Blonde, Braunvieh, Fleckvieh,
Tiroler Grauvieh, Holstein Schwarzbunte, Jersey, Limousin, Murbodner, Piemonteser,
Holstein Rotbunte, Dänische Melkrasse) sowie 19 Ziegenisolate aus einem Betrieb und 4
Isolate vom Rotwild zur Untersuchung.
Ergebnisse
Aufgrund der Kombination von RFLP und MIRU-VNTR konnten die 165 MAP Feldstämme in
insgesamt 18 verschiedenen Typen unterschieden werden, die als AT1 bis AT18 klassifiziert
wurden. Die Ergebnisse der Typisierungen sowie die Anzahl der Tiere bzw. Herden sind in
Tabelle 1 dargestellt. Das Vorkommen der MAP-Typen in den einzelnen Rinderrassen sowie
bei Ziegen und Wildwiederkäuern ist in Tabelle 2 dargestellt.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Tab.1: Molekulare Typisierung der 165 MAP-Feldstämme von Rindern, Ziegen (Z) und
Rotwild (RW)
AT
1
RFLP
Profile
C1-P1
INMV*
Typen
1
2
C1-P1
2
3
3
C18PnewIII
C1-P1
C18PnewII
C1-PnewV
C1-P7
C1-P1
C18PnewIII
C1-P1
CnewIPnewIII
C18-P1
C28PnewI
C18-PI
C1PnewIV
C1-P1
CnewIIIPnewIV
C14PnewIII
2
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
MIRU
292
X3
4
2
25
3
47
3
VNTR
3
7
2
2
2
3
3
2
2
2
8
58
3
2
3
3
2
2
2
8
18
Herden
8
1RW
31
3RW
6
17
2
3
3
1
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
8
8
8
4
6
3
2
1
5
1
3
4
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
8
8
4
2
3
3
2
2
2
8
9
1
2
15
5
1
2
9
new
2
2
3
2
2
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
6
8
1
1
1
1
17
1
3
4
1
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
8
8
1
1
1
1
2
2
3
3
2
2
3
3
3
3
2
2
2
2
2
2
8
8
5
1
2
1
12
2
2
3
2
2
5
3
2
3
2
2
2
2
2
2
8
8
3
19
1
1Z
2
3
2
3
3
2
2
2
8
1
1
*INMV: INRA-Nouzilly MIRU-VNTR
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Σ
10
2
32
8
Tiere
16
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9.-11. Mai 2012
Tab.2: Das Vorkommen der MAP Typen AT1-18 bei verschiedenen Rinderrassen, Ziegen
und Rotwild aus freier Wildbahn
Rasse
Tierart
Angus
Aquitaine
Blonde
Braunvieh
Fleckvieh
Grauvih
Holstein
Schwarzbunte
Jersey
Limousin
Murbodner
Piemonteser
Holstein
Rotbunte
Dänische
Melkrasse
Ziegen
Rotwild
1
2
3
4
5
6
2
3
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
3
1
2
2
1
3
10
9
5
3
25
1
1
5
1
1
3
12
1
2
3
3
1
3
1
15
1
1
5
1
1
4
2
1
1
1
1
1
19
1
3
Diskussion
Obwohl 18 verschiedene MAP-Typen in einer relativ großen Anzahl untersuchter Isolate
verschiedener Provenienz ermittelt werden konnten, wurde der MAP Typ AT2 (RFLP C1P1,
INMV 2) in 42% der Herden nachgewiesen. Der MAP Typ AT2 konnten in 8 von 12 der
betroffenen Rinderrassen sowie bei 3 von 4 untersuchten Rotwildisolaten nachgewiesen
werden und stellt somit den vorherrschenden MAP-Typ in Österreich dar. 9 RFLP Profile
sowie 1 INMV Profil konnten erstmalig beschrieben werden. Einzelnen MAP-Typen sind
ausschließlich bei bestimmten Rinderrassen gefunden worden, ebenso wie die von Ziegen
untersuchten Isolate. Die molekularbiologische Typisierung von Isolaten im Rahmen eines
Paratuberkulose Bekämpfungsprogrammes kann in Verbindung mit der Auswertung von
Tierbewegungen (Zu-/Verkäufe) zusätzliche Informationen über die Verbreitung dieser
Infektionskrankheit geben.
Literatur
MÖBIUS, P., LUYVEN, G., HOTZEL, H., KÖHLER, H. (2008): High Genetic Diversity among
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Strains from German Cattle Herds Shown by
Combination of IS900 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis and
Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit Variable Number Tandem Repeat Typing. J. Clin.
Microbiology, 46, 972-980
THIBAULT, V., GRAYON, M., BOSCHIROLI, M. L., HUBBANS, C., OVERDUIN, P.,
STEVENSON, K., GUTIERREZ, M.C., SUPPLY, P., BIET, F. (2007): New Variable Number
Tandem Repeat Markers for Typing Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and M.
avium Strains: Comparison with IS900 and IS1245 Restriction Fragment Length
Polymorphism Typing. J. Clin. Microbiology, 45, 2404-2410
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Zusammenhang zwischen Immunprofil und histopathologischen
Veränderungen bei experimenteller Infektion von Ziegen mit
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
Anneka Soschinka, Michaela Meyer, Elisabeth M. Liebler-Tenorio, Heike Köhler
Institut für molekulare Pathogenese, Friedrich-Loeffler-Institut, Naumburger Straße 96a, 07743 Jena
Einleitung
Die Paratuberkulose ist eine entzündliche Erkrankung des Magen-Darmtraktes der
Wiederkäuer, die in Deutschland hohe wirtschaftliche Verluste hervorruft. Während Tiere in
fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mittels Kultivierung des Erregers Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis (MAP) aus dem Kot bzw. durch den Antikörpernachweis im
Blutserum identifizierbar sind, ist die Diagnostik in der latenten Erkrankungsphase schwierig.
Dies liegt u. a. an der erst spät im Erkrankungsverlauf einsetzenden Erregerausscheidung
und Antikörperbildung. Aktuelle Ansätze zur Verbesserung der Diagnostik zielen auf eine
Erhöhung der Sensitivität und Spezifität in frühen Infektionsstadien. Hierbei konzentriert man
sich aufgrund der Immunbiologie der Mykobakterieninfektionen auf den Nachweis der
zellulären Immunantwort.
Eine frühe proinflammatorische Immunreaktion (Th1-Antwort) erleichtert bei der Paratuberkulose dem Wirt die Kontrolle der Erregervermehrung im Gewebe. Es ist bislang nicht
bekannt, ob diese adaptive Immunantwort auch zu einer vollständigen Eliminierung von MAP
aus dem Wirt führen könnte.
Interferon-gamma (IFN-γ) stellt einen spezifischen Marker der Th1-Antwort dar, der sowohl in
Vollblut als auch in Kulturüberständen isolierter Blutzellen (PBMC) nach einer Stimulation mit
Johnin messbar ist. Zwar gilt der IFN-γ-Assay als viel versprechender Test zur Verbesserung
der Frühdiagnostik der Paratuberkulose, es ist jedoch kein valides Testsystem erhältlich.
Dies liegt daran, dass
a) die derzeit zur Zellstimulation eingesetzten Antigene nicht spezifisch genug
sind, um falsch-positive Reaktionen auszuschließen und
b) unbekannt ist, ob exponierte, aber nicht (mehr) infizierte Tiere eine IFN-γReaktion ausbilden. Damit ist unklar, welche Informationen bezüglich des
Infektionsstatus aus den Testergebnissen abzuleiten sind.
Um letzteres Problem zu untersuchen, war das Ziel der vorliegenden Studie herauszufinden,
ob eine frühe IFN-γ-Reaktion nicht nur mit einer MAP-Infektion, sondern auch mit einer
Erregereliminierung korreliert. Da die Eliminierung schwer nachweisbar ist, sollten ergänzend
zur Kotkultur der kulturelle MAP-Nachweis im Gewebe und die histologische Beurteilung von
Gewebeveränderungen zur Bewertung des Infektionsstatus herangezogen werden.
Material und Methoden
Siebenundzwanzig Thüringer Wald Ziegen wurden in vier Versuchsgruppen (A – D,
n = 6 bis 7) eingeteilt. Je eine Gruppe wurde ab dem dritten bzw. 42. Lebenstag zehn Mal im
Abstand von zwei bis drei Tagen (d) mit 2 x oder 4 x 109 KbE/Tier/d oral inokuliert.
Altersgleiche Kontrollgruppen (n = 6) wurden scheininokuliert. Anschließend erfolgte
monatlich eine Blut- und Kotprobenentnahme. Aus dem Vollblut isolierte PBMC wurden
spezifisch mit Johnin restimuliert und mittels in-house-ELISA die IFN-γ- sowie Interleukin-10Konzentration (IL-10) in den Zellkulturüberständen gemessen. Für die qualitative und
quantitative Bestimmung der Antikörperreaktion gegen MAP kam ein kommerziell erhältlicher
ELISA-Tests (Fa. ID-Vet) zum Einsatz. Die Anzüchtung des Erregers aus dem Kot erfolgte
auf Festmedium. Die Beurteilung der Kulturen fand in 14-tägigem Abstand statt. Erfasst
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
wurden der Zeitpunkt des Auftretens erster positiver Befunde und die Kolonieanzahl
(semiquantitativ). Anschließend fand eine Subspeziesdifferenzierung mittels IS900- und
IS1245-PCR statt.
Zweiundfünfzig Wochen post inoculationem (p. i.) wurden die Ziegen euthanasiert und eine
Sektion durchgeführt. Neben der makroskopischen Beurteilung vorhandener Veränderungen
erfolgte die Entnahme zahlreicher Organproben aus dem Magen-Darmtrakt und den
zugehörigen Lymphknoten für die kulturelle Erregeranzüchtung und histologische sowie
immunhistochemische Untersuchungen. Veränderungen wurden in HE-gefärbten Paraffinschnitten beurteilt. Das Vorhandensein von MAP wurde immunhistochemisch unter
Verwendung eines mykobakterienspezifischen Antikörpers nachgewiesen (siehe Dissertation
Meyer, 2011). Für die Korrelation mit dem Immunprofil erfolgte eine Klassifizierung der Tiere
zum einen aufgrund der Befunde am Darm und zum anderen aufgrund der Befunde an den
Darmlymphknoten (Tabelle 1). Hierbei wurde im Darm die Verteilung der granulomatösen
Veränderungen entlang des Darms und in der Darmwand, sowie die Menge der nachgewiesenen Erreger in den Läsionen einbezogen. In den Darmlymphknoten wurde zwischen
dem Vorliegen granulomatöser Infiltrate und Granulomen mit ausgedehnten Nekrosen
unterschieden.
Tabelle 1: Klassifizierung der Tiere aufgrund der Befunde im Darm und an den
Darmlymphknoten
Score
Befund
n
Darm
0
alle Lokalisationen ohne besonderen Befund
7
Veränderungen an den Peyerschen Platten im Jejunum und maximal zwei
1
weiteren Lokalisationen, vorwiegend fokal bis multifokal und pauzibazillär
13
Veränderungen an den Peyerschen Platten im Jejunum und mehr als zwei
2
weiteren Lokalisationen, vorwiegend multifokal bis diffus und multibazillär
7
Darmlymphknoten
0
1
2
alle beprobten Lymphknoten ohne besonderen Befund
4
ausschließlich granulomatöse Veränderungen, pauzibazillär
1
Granulom(e) mit ausgedehnten Nekrosen, pauzi- oder multibazillär
22
Da Unterschiede infolge der Inokulationsdosis und des Inokulationszeitpunktes statistisch
ausgeschlossen werden konnten, wurden die Tiere entsprechend dieser Klassifizierung neu
gruppiert und Unterschiede in der IFN-γ-, IL-10- und Antikörperreaktion mit dem U-Test nach
Mann und Whitney ermittelt.
Ergebnisse
Die IFN-γ-Reaktion der Versuchsgruppen war ab der 12. Woche p. i. im Vergleich zu den
Kontrollgruppen signifikant erhöht. Sie erreichte 28 Wochen p. i. ihren Höhepunkt, fiel
anschließend ab, um 48 Wochen p. i. erneut anzusteigen. Unabhängig von der Inokulation
war eine frühe IL-10-Reaktion bis zu einem Alter der Tiere von etwa 24 Wochen
nachweisbar.
Positive Antikörperreaktionen waren in den Versuchsgruppen ab der 16. Woche p. i.
messbar, wobei der Reaktionsverlauf dem der IFN-γ-Reaktion entsprach. Drei Versuchstiere
zeigten keine positive Antikörperreaktion.
- 37 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Eine Erregerausscheidung mit dem Kot zu mehr als zwei Beprobungszeitpunkten ab der 8.
Woche p. i. wurde für 89 % der Versuchstiere nachgewiesen. Zum Sektionszeitpunkt wiesen
neun von 27 Versuchstieren ein positives Kulturergebnis im Kot, 20 im Darm und 23 in
Lymphknoten auf. Bei vier inokulierten Tieren konnte in den untersuchten Gewebeproben
MAP kulturell nicht nachgewiesen werden, es traten jedoch deutliche Lymphknotenveränderungen (Score 2) auf.
Wenn die Tiere entsprechend der Befunde im Lymphknoten gruppiert wurden, variierten die
IFN-γ-Reaktionen quantitativ weniger stark als nach Gruppierung der Tiere entsprechend
ihrer Darmveränderungen. Ziegen, die zum Zeitpunkt der Sektion keine Veränderungen in
den Lymphknoten aufwiesen, zeigten im Vergleich zu Tieren mit stärker ausgeprägten
Läsionen das Maximum der IFN-γ-Reaktion deutlich früher (16. bis 20. Woche p. i. versus
28. Woche p. i.). Bei drei dieser vier Tiere war der Erreger kulturell im Lymphknoten
nachweisbar, eines dieser Tiere wies eine geringe Ausscheidung mit dem Kot auf. Bei der
vierten Ziege war MAP weder aus dem Kot noch aus Lymphknoten oder Darm isolierbar.
Das Auftreten starker Läsionen sowohl im Lymphknoten als auch im Darm schien mit einer
stärkeren IFN-γ-Sekretion der PBMC in der zweiten Versuchshälfte assoziiert zu sein.
Die Antikörperreaktion von Lämmern die zum Versuchsende ausgeprägte Lymphknotenbzw. Darmläsionen aufwiesen, lag bereits ab 20 Wochen p. i. über der von Tieren ohne bzw.
mit geringen Gewebeveränderungen.
Schlussfolgerungen
Die frühe Antikörperreaktion entspricht nicht dem etablierten Modell der Immunantwort
gegenüber MAP. In dem hier verwendeten Modell einer experimentellen Infektion von Ziegen
ist sie möglicherweise auf die hohen Inokulationsdosen zurückzuführen.
Die Korrelation einer späten IFN-γ-Reaktion mit starken histologischen Veränderungen zeigt,
dass sich diese Tiere zum Zeitpunkt der Sektion noch in der Phase der aktiven
Auseinandersetzung mit dem Erreger befanden. Die vorliegenden Daten deuten darauf hin,
dass eine frühe IFN-γ-Reaktion zu einer effektiven Kontrolle, jedoch nicht zur Elimination von
MAP führt. Positive Tiere im IFN-γ-Test wären demnach als infiziert anzusehen. In diesem
Fall würde sich der IFN-γ-Assay zur Einzeltierdiagnostik auch innerhalb von Bekämpfungsprogrammen eignen.
Bei einem Tier war jedoch eine Infektion nicht nachweisbar. Es konnte retrospektiv nicht
festgestellt werden, ob dieses Tier nicht infiziert war oder MAP eliminieren konnte. Unter der
Annahme, dass eine Erregerelimination stattfindet, wären Test-positive Tiere nicht zwingend
infiziert. In diesem Fall würde der Einsatz zur Einzeltierdiagnostik im Rahmen von
Sanierungsprogrammen ggf. zur Merzung der Tiere führen, die in der Lage sind, eine sterile
Immunität zu entwickeln. Dennoch wäre der Test für die Herdendiagnostik geeignet, da er
auch exponierte Tiere erkennt. Insbesondere in niedrig prävalenten Beständen und für
solche, in die die Paratuberkulose erst kürzlich eingetragen wurde, könnte sich dies als
Vorteil erweisen.
Michaela Meyer: Klinische und pathologische Befunde nach experimenteller Infektion von
Ziegenlämmern mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis. Diss. Stiftung TIHO, 2011.
http://elib.tiho-hannover.de/dissertations/meyerm_ws11.pdf
Teilweise gefördert durch die Tierseuchenkassen Thüringen, Hessen, MecklenburgVorpommern, Niedersachsen, Rheinland-Pfalz und Baden-Württemberg.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Parallel processing of various sample types for detection of RNA
and DNA pathogens in veterinary diagnostics
Ralf Klingenstein, Lillian Roth, Denis Flügge, Sandy Leifholz
QIAGEN GmbH, QIAGEN Straße 1, 40724 Hilden
Veterinary pathogen detection by real-time PCR and RT-PCR is widely replacing classical
culture based methods due to higher sensitivity and speed. A key factor for successful
amplification and detection of pathogen nucleic acids is an effective and robust sample
preparation method providing reliable purification and maximum recovery of DNA and RNA.
This applies particularly for many animal derived sample materials typically used for
veterinary pathogen detection due to complex and variable matrix characteristics which can
pose high demands on sample preparation. For most sample types, dedicated solutions for
nucleic acid isolation are available. But sequential analysis of varying sample types using
specialized methods costs hands-on time, and handling differences between different
protocols increase the risk of errors. Veterinary pathogen detection workflows can be
streamlined by parallel processing of different samples which vary in regard to pathogen type
and sample material.
Localization of pathogens or workflow demands may require pathogen nucleic acid isolation
from whole blood samples. The composition of animal whole blood can lead to clogging of
silica membranes in current spin column based sample preparation kits. This can result in
lower purification efficiency and carry-over of inhibitory substances into the eluate, leading to
impaired downstream performance of the samples.
The new QIAamp cador Pathogen Mini Kit uses proven silica membrane based spin-column
nucleic acid amplification and allows for co-purification of RNA and DNA pathogens from a
broad range of veterinary sample types. Furthermore, undiluted animal whole blood can be
processed with greatly reduced risk of silica membrane clogging. Viral RNA and DNA and
bacterial DNA are efficiently extracted from whole blood samples.
Efficiency and reliability of pathogen detection can be further increased by automation of
sample preparation and PCR set-up, and by use of universal real-time PCR cycling
protocols.
We demonstrate how the QIAamp cador Pathogen Mini Kit can be applied for parallel
processing of various sample types and for reliable processing of animal whole blood
samples. We describe an automated workflow for efficient nucleic acid isolation and
detection from animal samples.
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Aktueller Stand der BHV1 Bekämpfung aus nationaler Sicht
Eine vergleichende Datenauswertung von 2005 – 2011
Detlef Höreth-Böntgen und Doris Kämer
Friedrich-Loeffler Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit,
Institut für Epidemiologie, Seestraße 55, D-16868 Wusterhausen / Dosse
Mit der Anpassungsentscheidung der EU Kommission zu 2004/558/EG vom 12. Oktober
2011, die Freiheit von Infektiöser Boviner Rhinotracheitis (IBR) in bestimmten
Verwaltungsgebieten Deutschlands betreffend, sind die langjährigen Bemühungen (seit
1998) des Bundeslandes Bayerns zur Erlangung des „Artikel 10 Freiheit Status“ bestätigt
und durch entsprechende Änderung im „Annex II“ der Richtlinie 64/432/EWG bekannt
gemacht worden. Die Gesamtkosten des Bekämpfungsprogramms beliefen sich nach
bayerischen Angaben auf ca. 37 Mio. €.
Für alle übrigen Bundesländer gilt weiterhin der Status nach „Artikel 9“. Mit Ausnahme von
Bayern bleibt Deutschland entsprechend im „Annex I“ der Richtlinie gelistet.
Der Vortrag gibt einen Überblick über den aktuellen Stand der BHV-1-Bekämpfung und
beleuchtet den Entwicklungsverlauf seit der letzten Novellierung der nationalen BHV1Verordnung in der Fassung der Bekanntmachung vom 20. Dezember 2005, veröffentlicht im
Bundesgesetzblatt 2005 am 23. Dezember (BGBL. I S. 3520).
Die BHV-1-Situation und -Bekämpfung in anderen europäischen Mitgliedsstaaten wird
dargestellt und in den Kontext mit der deutschen Situation, auf der Basis der für Deutschland
gesammelten Daten aus den Jahresmeldungen von 2005 bis 2011, gestellt. Dieser Zeitraum
wurde wegen der bereits erwähnten Novellierung der nationalen BHV1-Verordnung gewählt,
da ab diesem Zeitpunkt, durch die damit einhergehende Einführung begleitender
Unterstützungsmaßnahmen der Tierseuchenkassen der Länder, deutlich erkennbare
Fortschritte zu verzeichnen sind.
Rechnet man die Gesamtfreiheit von Bayern im Jahr 2011 mit ein, so hat der Anteil
ungeimpfter BHV1-freier Zucht-Bestände in Deutschland inzwischen fast die 90% Marke
erreicht, gegenüber den 76 Prozent im Jahre 2005. Für die übrigen Bundesländer wird der
erreichte Bekämpfungsstand vom 31. Dezember 2011 im Einzelnen ausführlich dargelegt.
Nicht nur für den Zuchtbereich, sondern auch für den Mastbereich wird der aktuell erreichte
Zustand dargestellt. Der Vortrag beleuchtet die Schwankungsbreite freier ungeimpfter
Zuchtbestände bei Flächenländern und bei den 3 Stadtstaaten, sowie auch die
vergleichbaren Schwankungen bei den ungeimpften Zuchttieren. Es werden die aktuellen
Zahlen mit Ablauf des Jahres 2011 in die Betrachtung miteinbezogen.
Die Bekämpfung der Bovinen Herpesvirus Infektionen vom Typ 1 (BHV1) oder IBR in den
Rinderbeständen in Deutschland ist nicht einheitlich verlaufen. Dies liegt zum Einen an der
unterschiedlichen Landwirtschaftsstruktur der verschiedenen Bundesländer, auch an
historischen Entwicklungen und Erfahrungen bei der Anwendung unterschiedlicher
Bekämpfungsstrategien und an den verschieden Betriebsformen (Mast, Zucht oder deren
Kombinationsformen). Bedeutend in diesem Zusammenhang sind die verschiedenen
angewandten
Bekämpfungsverfahren,
wie
z.
B.
Gesamtbestandsimpfung,
Reagentenimpfung oder Reagenten Selektion mit zeitnaher Entfernung aus dem Bestand
ohne Impfung.
- 42 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Bereits bestehende innerdeutsche Handelsbeschränkungen zwischen BHV1-freien und nicht
freien Regionen und damit verbundene Quarantänemaßnahmen und Statuszertifizierungen
haben sich durch den „Artikel 10 Status“ von Bayern weiter verschärft und führen zu neuen
Problemen im Tierverkehr mit benachbarten Bundesländern.
- 43 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
BHV 1 - Sachsen-Anhalt auf dem Weg zum Artikel-10-Status
Andreas Tyrpe
Ministerium für Landwirtschaft und Umwelt des Landes Sachsen-Anhalt,
Leipziger Straße 58, 39112 Magdeburg
Das verpflichtende BHV 1-Tilgungsverfahren in Sachsen-Anhalt geht bereits in das 17. Jahr.
Eine epidemiologische Auswertung der Daten des Verfahrens ab 1996 hat ergeben, dass der
Verlauf der Tilgung zunächst als nahezu ideal zu bezeichnen war. Jedoch muss
selbstkritisch konstatiert werden, dass die zeitliche Stagnation des Verfahrens, wenn auch
auf hohem Niveau, nicht zufriedenstellend ist.
Um die Tilgung der BHV 1 in Sachsen-Anhalts Rinderbeständen in absehbarer Zeit zu
erreichen und damit auch den Status eines anerkannt freien Gebietes nach Artikel 10 der
Richtlinie 64/432/EWG, mussten und müssen weitere Maßnahmen ergriffen werden.
Zu den Rahmenbedingungen für eine Artikel 10-Anerkennung eines Gebietes mit ehemals
flächendeckender BHV 1-Markerimpfung wurde bereits auf dem sechsten Stendaler
Symposium berichtet.
Bereits umgesetzte und noch vorgesehene Maßnahmen und Aktivitäten zur Erreichung des
vorgenannten Zieles sollen nachfolgend stichpunktartig aufgeführt werden:
-
Regelung zum Umgang mit vereinzelt reaktiven Befunden in BHV 1-freien Betrieben,
Regelung zur beschleunigten Reagentenselektion in den restlichen Tilgungsbeständen,
Umsetzung eines flächendeckenden Impfverbotes ab 1. April 2012,
aktive Mitwirkung in der Bund-Länder-Arbeitsgruppe zur Anpassung der BHV 1Verordnung mit dem Ziel, Regelungen für Regionen, die sich in der Endphase des
Tilgungsverfahrens befinden, aufzunehmen (Impfausstieg, Überwachung, Umgang mit
Mastrinderbeständen).
Insbesondere durch den flächendeckenden Impfausstieg in diesem Jahr soll der Startpunkt
für den Beginn der Dreijahresfrist ohne Impfung gesetzt werden, die nach dem O.I.E. Standard Voraussetzung für ein BHV 1-freies Gebiet und letztlich auch für eine Anerkennung
nach Artikel 10 der bereits zitierten Richtlinie ist.
Parallel dazu ergibt sich die Möglichkeit, die Überwachungsdiagnostik auf einen VollantigenELISA umzustellen und damit noch sicherer zu machen.
Am Ende wird auch entscheidend sein, ob es gelingt, die Tilgungsanstrengungen in den
anderen Bundesländern in einem annähernd gleichen Zeitraum zum Abschluss zu bringen.
Nur so können handelsbedingte Risiken und Handelshemmnisse bezüglich der BHV 1Infektion weiter minimiert werden.
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BHV1-Bekämpfung – Hat Thüringen die Zielgerade erreicht?
Michael Elschner
Thüringer Ministerium für Soziales, Familie und Gesundheit
Werner-Seelenbinder-Straße 6, 99096 Erfurt
Der Stand der Bovinen Herpesvirus1 (BHV1)-Bekämpfung in Thüringen und deren
Sanierungsfortschritt unter besonderer Betrachtung der Jahre 2009 bis 2011 werden
dargestellt. Das Ziel der BHV-1-Bekämpfung ist das Erreichen und die Anerkennung als
BHV1-freie Region gemäß Artikel 10 der Richtlinie 64/432/EWG.
Thüringen hat in den letzten drei Jahren deutliche Fortschritte bei der Sanierung der
Rinderbestände vom BHV1 erzielt. Bis Ende des ersten Quartals 2012 erreichten 93 % der
Rinder haltenden Betriebe, in denen 76 % der Rinder gehalten werden, den Status „BHV1frei“. Das bedeutet gegenüber dem Vorjahr nur einen sehr geringen Zuwachs um + 0,6 % bei
den Betrieben (Vorjahr: 5,3%) und 3,6 % bei den Tieren (Vorjahr: 10,1%). Aktuell gibt es
noch 39 Betriebe, in denen insgesamt noch 1.200 BHV1-infizierte Tiere stehen. Diese
grundsätzlich guten Sanierungserfolge sind das Ergebnis des engagierten, erfolgreichen
Zusammenwirkens von Landwirten, Tierärzten und Veterinärbehörden.
Der konsequenten Entfernung der BHV1-positiven Tiere (Reagenten) aus den Beständen
muss oberste Priorität eingeräumt werden, um die kontinuierliche Zunahme BHV1-freier
Bestände sowie den Schutz bereits freier Bestände vor Neuinfektionen zu sichern.
Landwirtschaftliche Verbände, Veterinärbehörden und Tierseuchenkasse erklären als Ziel,
dass spätestens bis zum 31.12.2012 alle Reagenten entfernt/geschlachtet werden sollen.
Alle Rinder haltenden Betriebe in Thüringen sollten den Eintritt in das Anerkennungsverfahren anstreben und somit den Status der BHV1-Freiheit möglichst zeitnah erlangen.
Derzeit wird versucht, den kontrollierten Impfausstieg in Beständen mit BHV1-freiem Status
zu forcieren. Dabei wird zuerst die Impfung bei den nachwachsenden Kälbern beendet und
mit der frühzeitigen serologischen Kontrolle der freien Nachzucht abgesichert. Ein generelles
Treibe- und Weideverbot für BHV1-positive Rinder ab Mitte 2012 sowie grundsätzliches
Impfverbot ab 2013 mit Ausnahmen in begründeten Fällen sollen die Bekämpfungsaktivitäten
verstärken.
In der Endphase der BHV1-Sanierung wird es zunehmend schwieriger, den in der
Vergangenheit erreichten Fortschritt kontinuierlich fortzuführen. Das wird zum Beispiel daran
erkennbar, dass im vergangenen Jahr im Vergleich zum Vorjahr 2010 ein deutlich geringerer
Bekämpfungsfortschritt erreicht wurde. Auch Neu- bzw. Reinfektionen wurden in Betrieben
beobachtet, die bereits „BHV1-frei“ waren. Die Ursachen dafür sollten durch Veterinäramt,
Hoftierarzt und Tiergesundheitsdienst gemeinsam mit dem Landwirt analysiert und
bestandsspezifische Maßnahmen zur Verhinderung zukünftiger Rückfälle getroffen werden.
Für jeden Betrieb, der noch Reagenten in der Herde hat, ist aus wirtschaftlichen Gründen
eine erfolgreiche BHV1-Sanierung unumgänglich. Nicht ausgesonderte Reagenten stellen für
die übrigen Tiere der Herde regelrechte „Zeitbomben“ dar. Neben dem beeinträchtigten
Gesundheitsstatus
der
Herde
führen
Handelsbeschränkungen,
aufwändigere
Blutprobenentnahmen und höhere Tierseuchenkassenbeiträge für nicht anerkannt BHV1freie Haltungen zu erheblichen zusätzlichen Kosten.
Die Aktivitäten der beteiligten Landwirte, Tierärzte und Veterinärbehörden müssen in dieser
schwierigen Endphase der Sanierung – sozusagen auf der Zielgeraden der BHV1–
Sanierung in Thüringen - gemeinsam bis zur erfolgreichen Tilgung dieser Tierseuche
konsequent fortgeführt werden.
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8. Stendaler Symposium
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Einsatzmöglichkeiten der HIT-Datenbank bei der
Tierseuchenüberwachung (BHV-1)
Andrea Wienecke
HIT/ ZID-Datenbank im Bayerischen Staatsministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten,
Ludwigstraße 2, 80539 München
Das Herkunftssicherungs- und Informationssystem für Tiere (HIT) hat sich zu einer zentralen
Plattform für die Erfassung von Einzeltier bezogenen Gesundheitsdaten im Rahmen der
Seuchenbekämpfung entwickelt. Seit 2005 besteht die Möglichkeit für die Labore und
Veterinärämter BHV1-Befunde in HIT zu dokumentieren. Die Erfassungsmöglichkeit für
weitere Tierseuchen wie Leukose, Brucellose und BVD folgte. Mit Ausbruch der
Blauzungenkrankheit wurde die Datenbank im Jahr 2007 um die Eingabemöglichkeit von
Impfungen erweitert.
BHV1-Einzeltierstatus
Um eine hohe Datenqualität zu gewährleisten, erfolgen bei der Übermittlung der
Untersuchungsdaten umfangreiche Plausibilitätsprüfungen auf Seiten der Datenbank.
Auf Basis der gespeicherten Untersuchungsergebnisse und Impfdaten erfolgt in HIT
unmittelbar nach deren Meldung die automatische Berechnung eines aktuellen BHV-1-Status
für jedes Rind.
Bei widersprüchlichen BHV-1- Gesundheitsdaten erhalten die Tiere einen speziellen Status,
der auf diesen Sachverhalt hinweist. Bei der Erstellung von Untersuchungsanträgen in HIT
kann unter anderem der BHV1-Status als Selektionskriterium angegeben werden; so sind
betroffene Rinder für eine abklärende Untersuchung in HIT schnell auswählbar.
Um sich einen Überblick über die Gesundheitsdaten zu verschaffen oder im laufenden
Sanierungsverfahren Bestände mit BHV-1 Reagenten zu ermitteln, stehen in der Datenbank
spezielle Abfrage- und Auswertungsmöglichkeiten und Statistiken zur Verfügung. Darüber
hinaus liefert das „Bestandsregister mit Gesundheitsdaten“ wichtige Informationen zum
jeweiligen Betrieb.
BHV-1 Betriebsstatus
Auf Grundlage der Erfahrungen bei der Umsetzung der Berechnung des BVD-Betriebsstatus
wird nun auch die Berechnung des BHV1-Betriebsstatus in HIT umgesetzt.
Basierend auf den rechtlichen Vorgaben der BHV1-VO wurde hierfür zusammen mit
Fachvertretern der Länder ein Konzept entwickelt.
Für die Ermittlung des BHV1-Betriebsstatus erfolgt zunächst die Berechnung des
Bestandsregisters für die zur Berechnung ausgewählten Betriebe ab einem frei wählbaren
Zeitpunkt bis heute. Auf der Grundlage dieses Bestandsregisters werden die Altersgruppen
und der Kuhanteil für jeden einzelnen Tag ermittelt. Fehlende Informationen in der HIT, wie
die, ob es sich um einen Milchvieh-, Mutterkuh oder Mastbetrieb handelt, die aufgrund des
Verordnungstextes für die Einstufung des Betriebes erforderlich sind, können vom
Veterinäramt geliefert werden. Stehen solche Zusatzangaben zum Zeitpunkt der
Statusberechnung nicht zur Verfügung, greift immer das strengste Berechnungsregime. Die
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8. Stendaler Symposium
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Berechnung des BHV1-Betriebsstatus erfolgt für die in Abschnitt I der Verordnung
vorgegebene Basisuntersuchung und die Kontrolluntersuchungen nach Abschnitt II.
Für BHV1-freie Betriebe, die bereits in der Phase der Aufrechterhaltung sind, besteht die
Möglichkeit, nur die Bedingungen der Kontrolluntersuchungen überprüfen zu lassen.
Mit dem errechneten Betriebsstatus erhält die Veterinärverwaltung ein effizientes Instrument
bei den täglichen Überwachungsaufgaben in der Tierseuchenbekämpfung!
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8. Stendaler Symposium
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IBR-Programme in Europa
Christoph Goetz1, Christoph Egli2, Werner Biermayer1, Hannah Pearse3
1
2
IDEXX GmbH Deutschland, Mörikestrasse 28/3, 71636 Ludwigsburg
IDEXX Switzerland AG, Stationsstrasse 12, 3097 Liebefeld-Bern, Schweiz
3
IDEXX, Grange House, Sandbeck Way, Wetherby, United Kingdom
Einleitung
Die IBR ist eine virusbedingte Infektionskrankheit, die durch das weltweit vorkommende
Bovine Herpesvirus 1 (BHV-1) ausgelöst wird und hohe wirtschaftliche Verluste bei Rindern
verursacht. Die klinischen Symptome sind unter anderem Inappetenz, Milchrückgang, hohes
Fieber (42 °C), Nasen- und Tränenfluss sowie starkes Speicheln. Husten, aber auch starke
Dyspnoe können vorkommen. IBR-bedingte Aborte erfolgen meist im letzten Drittel der
Trächtigkeit, zum Teil einige Wochen bis Monate nach klinischer IBR.
Da die klinischen Symptome nicht pathognomonisch sind, und das Virus im infizierten Rind
nur schwer detektierbar ist, bietet sich die IBR Antikörper Diagnostik als ideales Werkzeug
zum Nachweis einer IBR-Infektion beim Einzeltier oder in einer Herde an.
Aufgrund der hohen wirtschaftlichen Verluste, die durch die IBR verursacht werden, haben
viele Länder zum Teil seit mehreren Jahren Kontroll- und Eradikationsprogramme etabliert.
Dabei nimmt die Diagnostik einen äusserst wichtigen Platz ein. Dieser Vortrag gibt eine
Übersicht zu IBR-Programmen in Europa.
Situation in Europa
Einige Länder in Europa wie die Schweiz, Österreich und die skandinavischen Länder1)
haben die IBR bereits erfolgreich bekämpft. Die IBR-Freiheit wird mittels jährlichen
Stichproben-untersuchungen überwacht. Dabei werden Tankmilch- und Einzelblutproben
untersucht. Diese Länder besitzen den Status „BHV-1 frei“ entsprechend des Artikels 10 der
EU-Richtlinie 64/432/EWG.
Seit dem 25. November 1997 wird die Bekämpfung der IBR auch in Deutschland in Form der
BHV-1-Verordnung gesetzlich geregelt. Die IBR wurde in der Bundesrepublik damit zu einer
der anzeigepflichtigen Tierseuchen. Wichtige Bekämpfungserfolge wurden seither erzielt.
Ganz Bayern ist zum Beispiel seit September 2011 IBR-freies Gebiet nach Artikel 10.
In Spanien gibt es freiwillige lokale Programme, vor allem im Norden des Landes. Dabei
werden auch gE-Markerimpfstoffe eingesetzt.
Frankreich klassifiziert Rinderherden, indem Serumpools von bis zu 10 Seren untersucht
werden. Positive Pools werden aufgelöst und die Einzelproben untersucht. Die Tankmilchdiagnostik nimmt einen eher kleinen Platz ein. Es wird kaum geimpft.
In Holland gibt es ein freiwilliges IBR-Programm. Betriebe können über Tank- oder Blutuntersuchungen ein IBR-Freiheitszertifikat bekommen.
In Grossbritannien und Irland kommt die IBR in Rinderherden endemisch vor.
Schätzungsweise 50% der Herden sind infiziert. Es werden konventionelle Impfstoffe aber
auch Markerimpfstoffe eingesetzt. In Irland werden nur Markerimpfstoffe verwendet. Es gibt
keine nationalen oder offiziellen Kontrollprogramme. Einzig in Bullenstationen wird die IBR
kontrolliert, um Import- und Exportregelungen zu erfüllen. Einige Labore bieten freiwillige,
sogenannte CHECS (Cattle Health Certification Standards) IBR Programme an.
In Italien hat einzig das Südtirol ein obligatorisches IBR Programm. In einigen anderen
Provinzen gibt es Herdenqualifikationsprogramme. In den übrigen Regionen gibt es
freiwillige Programme.
In Belgien wurde 2011 ein IBR Eradikationsprogramm gestartet.
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8. Stendaler Symposium
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Diskussion
Verschiedene Programme werden näher beschrieben (Probenarten, Testfrequenz, Tests,
Organisation der Probensammlung und der Auswertung). Die Anwendung des gEMarkerkonzepts, welches die Differenzierung von gesunden, geimpften Rindern von
infizierten Rindern mittels gE-Antikörper ELISA ermöglicht wird anhand der verschiedenen
länderspezifischen Programme gezeigt.
Referenzen
1. Åkerstedt J, Tarpai A, Mørk T. The surveillance and control programme for infectious
bovine rhinotracheitis (IBR) and infectious pustular vulvovaginitis (IPV) in Norway. In:
Sviland S, Hellberg H (editors). Surveillance and control programmes for terrestrial
and aquatic animals in Norway. Annual report 2010. Oslo: Norwegian Veterinary
Institute; 2011. ISSN 1503-1454.
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An overview of the results of IBR programmes in the Netherlands
MH Mars and JJ Hage
Animal Health Service, Arnsbergstr 7, Postbox 9, 7400 AA Deventer, the Netherlands
In the Netherlands, IBR programmes have been implemented since 1998. After an initial
obligatory programme, which lasted one year, only voluntary programmes have been used.
Vaccination is not a part of official programmes, but DIVA vaccines are used in the
Netherlands. The use laboratory tests, epidemiology, and risk analysis will be presented.
Results of the programmes, and characteristics of participating herds will be presented.
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
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Aktuelles aus dem NRL für BHV-1
Patricia König, Birgit Goerl, Martin Beer
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems
Ringtest 2012
Im Mittelpunkt des Vortrages steht die Auswertung der Ergebnisse des BHV-1Ringvergleiches, der im März dieses Jahres vom NRL verschickt wurde. Es wurde ein Panel
von 10 Serumproben zusammengestellt, das von den Teilnehmern mit allen zur Verfügung
stehenden Testsystemen untersucht werden sollte. 34 diagnostische Laboratorien aus
Deutschland haben teilgenommen. Erfreulicherweise war auch ein reges Interesse aus dem
Ausland zu verzeichnen. 18 Untersuchungseinrichtungen aus anderen europäischen
Ländern haben sich beteiligt. Dies erlaubt uns nicht nur, einen internationalen Vergleich der
Qualität der Diagnostik zu ziehen, sondern ermöglicht zudem auch Einblicke in die
Leistungsfähigkeit von Diagnostika, die in Deutschland bisher nicht eingesetzt wurden.
BHV-1 gE-Diagnostik
Die Einführung des von Idexx neu entwickelten Probenpuffers der 3. Generation scheint eine
deutliche Entspannung der diagnostischen Problematik im Bereich der gE-Markerdiagnostik
bewirkt zu haben. Die Erfahrungen des NRL mit dem neuen Testsystem werden kurz
skizziert. Das Forum soll jedoch an dieser Stelle insbesondere für einen multilateralen
Erfahrungsaustausch genutzt werden. Hierbei erscheinen uns speziell die Entwicklungen der
Ergebnisse aus Beständen relevant, die in der Vergangenheit immer wieder durch
unplausible gE-Ergebnisse aufgefallen waren.
Konventionelle BHV-1-Diagnostik
In der Endphase der BHV-1 Sanierung wird mit steigendem Anteil ungeimpfter, BHV-1-freier
Bestände ein Auftreten unplausibler Ergebnisse bei Einzeltieren auffällig. Unspezifische
Reaktionen oder mögliche Kreuzreaktionen mit anderen Wiederkäuerherpesviren können zu
den sogenannten „Pseudoimpflingen“ führen. Die Interpretation solcher Ergebnisse ist meist
schwierig und die zunehmende BHV-1-Freiheit führt zudem aufgrund des veränderten
prädiktiven Wertes zu einer erhöhten Zahl falsch positiver Testergebnisse. In vielen Fällen
kann dabei dennoch durch die Kombination von verschiedenen Testverfahren sowie durch
die Überprüfung der epidemiologischen Plausibilität eine klare Entscheidung erreicht werden.
Am NRL wurden zur Unterstützung von Lösungsansätzen Hyperimmunseren in Rindern
nach Verabreichung inaktivierter ruminanter Herpesviren generiert. Spezifische
Reaktionsmuster wurden in Kreuzneutralisationstesten und in unterschiedlichen PrototypELISA Testsystemen ermittelt.
Neuentwicklungen auf dem diagnostischen Sektor
Abschließend werden Neuzulassungen und Neuentwicklungen auf dem Gebiet der BHV-1
Diagnostik vorgestellt.
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BoHV2-neutralisierende Antikörper erhöhen das Risiko für BoHV1Einzelreagenten in Milchviehbeständen des Alpenraums –
Konsequenzen für die Überwachung
Jens Böttcher1, Jennifer Boje2, Britta Janowetz1, Michaela Alex1, Patricia König3, Maria
Hagg1, Franz Götz2, Konrad Renner2, Christian Otterbein2, Johann Mages2, Nobert Meier1,
Gerhard Wittkowski1
1
2
Tiergesundheitsdienst Bayern e.V., Senator-Gerauer-Str. 23, 85586 Poing
Veterinäramt in 87700 Memmingen, 87616 Marktoberdorf, 82362 Weilheim/Obb,
83043 Bad Aibling, und 87527 Sonthofen
3
Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems
Bayern wurde am 12.10.2011 nach Artikel 10 64/432/EEC als BoHV1-frei anerkannt. Die
Überwachung freier Herden erfolgt derzeit noch mittels einer vierteljährlichen
Tankmilchuntersuchung. Nicht-negative Tankmilchproben werden über die Blutuntersuchung
abgeklärt. Im Südwesten Bayerns wurde eine erhöhte Rate an Beständen mit nichtnegativem Tankmilchergebnis vorgefunden. Die Blutuntersuchung ergab epidemiologisch
ungeklärte BoHV1-Einzelreagenten.
Neunzehn Fallbestände (734 Tiere) mit Einzelreagenten, die mindestens zwei Jahre nach
der Anerkennung der BoHV1-Freiheit geboren wurden, 23 BoHV1-negative Bestände aus
der gleichen Region (NCI: 321 Tiere), 11 Bestände (NCII: 423 Tiere) aus einer BoHV1-freien
Region (Oberfranken) und zwei BoHV1-infizierte Bestände (264 Tiere) wurden im BoHV1-,
BoHV2- und FeHV1-Neutralisationstest (NT), dem CHEKIT Trachitest 2nd Gen. für Milch bzw.
Serum, dem Herdchek gB- und –gE-ELISA untersucht. Der Anteil BoHV2-positiver Tiere war
in den Fall-Beständen im Vergleich zu NCI/II signifikant erhöht. Die Reaktion als auch das
Risiko einer positiven Reaktion im Herdchek gB-ELISA und im CHEKIT Trachitest 2nd Gen.
war für Tiere mit BoHV2-neutralisierenden Antikörpern im Vergleich zu BoHV2-negativen
Tieren signifikant erhöht.
Einzelreagenten waren im gE-ELISA stets negativ, die S/N-Werte lagen über 0.95. Es konnte
anhand von BoHV2-negativen Seren jeweils aus BoHV1-infizierten bzw. negativen
Beständen gezeigt werden, dass der gE- und der gB-ELISA bei diesem Grenzwert eine
vergleichbare Sensitivität haben. Der gE-Test mit einem Grenzwert von 0.95 wird in Bayern
als modifizierter gE-Test bezeichnet.
Die Bestandsmilchuntersuchung ist auf den Nachweis eines schwach-positiven Einzeltieres
in einem Kuhbestand ausgerichtet. Damit werden Bestände mit Einzelreagenten bewusst
vorselektiert. Ca. 0.7% der Tankmilchproben reagieren nicht-negativ. Bestände mit nichtnegativem Bestandsmilchergebnis, die sich im Blut nicht bestätigen oder im mod. gE-Test
negativ sind, können nicht mehr über die Tankmilch kontrolliert werden, sie müssen jährlich
blutserologisch untersucht werden. Die Zunahme der blutserologisch kontrollierten Bestände
verteuert – trotz Artikel 10-Freiheit! - die BHV1-Kontrolle. Mit der Artikel-10-Anerkennung
Bayerns bedarf die Freiheitskontrolle einer neuen Ausrichtung: Es sollten infizierte Bestände
mit hoher Sicherheit aufgespürt werden, während Bestände mit BoHV2-induzierten
Einzelreagenten irrelevant sind, da Tierimporte nach Bayern durch die Artikel 10-Garantien
abgesichert werden. Der Eintrag von nicht latentem BHV1 in eine freie Herde führt zu einer
hohen Seroprävalenz. Die Milchkontrolle sollte auf die frühzeitige Erkennung derartiger
Ausbruchsbestände ausgerichtet werden. Vergleichende Titrationen von Einzelmilchproben
BoHV1-infizierter Tiere und von BoHV2-induzierten Einzelreagenten in negativer Milch
ergaben deutlich unterschiedliche Titrationskurven für beide Gruppen. Dieser Unterschied
wird durch eine höhere Prävalenz von BoHV1-Reagenten in Ausbruchsbeständen (70-80%)
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8. Stendaler Symposium
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zusätzlich verstärkt. Ein höherer Cut-off (z.B. Verdopplung der Grenzwerte) für die
Bestandsmilchuntersuchung gewährleistet daher die Erkennung von Ausbruchsbeständen
und reduziert die derzeitigen Kosten - bei einer viermaligen Bestandsmilchuntersuchung um 75%. Diese Vorgehensweise ist daher aus ökonomischer Sicht günstiger als der
Wechsel von der viertel- auf eine halbjährliche Beprobung bei Beibehaltung der derzeitigen
Grenzwerte. Unabhängig bleibt die Möglichkeit, das Zeitintervall der Beprobung zu
verlängern, erhalten. Außerdem bietet sich der Vorteil, die Bestandsobergrenze von derzeit
50 laktierenden Kühen auf 100 oder 200 Kühen zu erweitern.
Danksagung:
Diese Arbeit wurde durch den Freistaat Bayern und die Bayerische Tierseuchenkasse
finanziell gefördert.
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Herpesmammillitis-Ausbruch in der Autonomen Provinz
Bozen/Italien - PCR Nachweis von Bovinem Herpesvirus 2
Alexander Tavella1, Letizia Ceglie2, Franz Gögele3, Eva Robatscher1
1
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, SCT-6, Bozen
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, SC5, Legnaro
3
Betrieblicher Tierärztlicher Dienst, Gesundheitsbezirk Meran (in Ruhestand)
2
Einleitung:
Die Herpesmammillitis ist eine sporadisch auftretende ulcerative Erkrankung der Zitzen- und
der Euterhaut, die durch das bovine Herpesvirus 2 (BHV-2) verursacht wird. Die Übertragung
des Virus erfolgt mit dem Melkzeug (Winter, 2009); die Verschleppung des Erregers über
Stechfliegen wird vermutet (Grunert et al., 1996; Gründer, 2002; Imai et al., 2005). Diese
Infektionskrankheit tritt vor allem bei erstlaktierenden Kühen auf, wobei die Morbidität
zwischen 20 und 90% liegen kann (Grunert et al., 1996; Gründer, 2002; Torres et al., 2009).
Stresssituationen (Geburt, Futterwechsel, Transport) gelten als Auslöser des klinischen
Ausbruches einer latenten Infektion.
Kurzbericht:
In diesem Kurzbeitrag wird über den Ausbruch von boviner Herpesmammilitis Ende August
bis Mitte Oktober 2010 in fünf Rinder haltenden Betrieben in Südtirol (Italien) berichtet.
In den erwähnten Betrieben waren vor allem jene Kühe betroffen, die während des Sommers
auf Almweiden gehalten wurden und engen Kontakt mit Tieren aus fremden Betrieben
hatten. Die klinischen Symptome traten zunächst bei einzelnen Tieren auf, breiteten sich
jedoch innerhalb kürzester Zeit auf die anderen Rinder im Stall aus. Die Morbidität erreichte
in den betroffenen Betrieben 80%. Nicht nur erstlaktierende, sondern auch ältere Kühe
waren betroffen. Die Übertragung des Erregers mit dem Melkzeug wurde angenommen.
Symptomatik:
Die Tierhalter berichteten zunächst über eine schmerzhafte Ödemisierung der Zitzen und
des Euters mit bläulicher Verfärbung der Haut und Bläschenbildung. Die Vesikeln platzten in
der Regel bereits nach 24 Stunden auf und es entwickelten sich rasch feuerrote ulzerierende
Läsionen, die schwarze Krusten bildeten. Die Hautläsionen wurden vorwiegend an den
Zitzen und an der Euterhaut festgestellt, in den meisten Fällen erstreckten sich die
Hautveränderungen aber auch auf den Euterspiegel und auf das Perineum aus. Bei einem
einzigen Rind waren außer Zitzen- und Euterhaut auch die Haut an Rumpf, Gliedmaßen,
Hals und Kopf von zahlreichen Läsionen betroffen. Die generalisierte Form der Infektion
durch BHV-2 wird auch als „Pseudo-Lumpy skin disease“ beschrieben und tritt vorwiegend in
wärmeren Zonen auf (Gründer, 2002).
Labordiagnostik:
Material:
In den betroffenen Betrieben wurde von den zuständigen Tierärzten Krustenmaterial für die
Laboruntersuchung entnommen. In drei Betrieben wurden weiters Blutproben für die
Untersuchung auf Virus-DNA (PCR) gezogen.
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8. Stendaler Symposium
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PCR:
23 Serumproben sowie 15 Proben aus Krustenmaterial wurden mittels konventioneller PCR
und nachfolgender Restriktionsanalyse, wie von De-Giuli et al. (2002) beschrieben,
untersucht. Die DNA-Extraktion erfolgte unter Verwendung des kommerziellen High Pure
PCR Template Preparation Kits (Roche Diagnostics)). Der Nachweis des DNA Polymerase
Gens (UL30) erfolgte mithilfe eines für BHV2 und BHV4 spezifischen forward primers und
einem degenerierten reverse primer. Das Amplifikat wurde anschließend unter Verwendung
des Restriktionsenzyms DdeI gespalten. Für die Auftrennung der PCR-Produkte wurde ein
7% Polyacrylamid-Gel (silver stain) verwendet. Zur Bestätigung der Ergebnisse wurden
einige ausgewählte PCR-Produkte durch Sequenzierung zusätzlich abgesichert.
Virusisolierung:
Für die Virusisolierung wurde das Krustenmaterial 1:5 verdünnt und auf REB-Zellsuspension
(primary bovine kidney embryonic cells) in einem CO2-Brutschrank bei 37°C inokuliert.
Nachdem nach 7 Tagen noch kein zytopathischer Effekt auftrat, erfolgte nach zwei GefrierAuftau-Zyklen eine weitere Inokulation auf REB-Zellen.
Elektronenmikroskopie:
Fünf Krustenmaterialproben wurden auch mittels Elektronenmikroskopie untersucht, es
konnte jedoch kein Virus nachgewiesen werden. Es sei jedoch erwähnt, dass nur
oberflächliche Krustenanteile entnommen wurden.
Ergebnisse:
Eine von insgesamt 23 Serumproben und 8 von 15 Krusten ergaben das für BHV-2 erwartete
Amplifikationsprodukt von 278bp. Die anschließende Verdauung durch das
Restriktionsenzym DdeI ließ DNA-Banden von 142bp und 124bp erkennen. Somit konnten
die Proben als BHV-2 identifiziert werden. Die anschließende Sequenzierung des
Amplifikationsproduktes bestätigte das Ergebnis, indem es die erhaltene Sequenz eindeutig
dem BHV-2 DNA Polymerase Gen zuwies (GenBank accession nr. AF181249).
Die Isolierung des BHV-2 Virus gelang nicht, dies könnte vermutlich auf das mehrmaligen
Einfrieren und Auftauen der Proben zurückzuführen sein. Weiters ist die Tatsache zu
berücksichtigen, dass in vielen Fällen die Virusisolierung nicht möglich ist, da die
Hautläsionen oft erst nach der erfolgten Serokonversion erscheinen und die Antikörper die
Isolierung des Virus hemmen können.
Literatur:
De-Giuli L., Magnino S., Vigo PG, Labalestra I., Fabbi M. (2002): Development of a
polymerase chain reaction and restriction typing assay for the diagnosis of bovine
herpesvirus 1, bovine herpes virus 2 and bovine herpesvirus 4 infections. J Vet Diagn Invest
14, 353-356.
Gründer H.-D. (2002): Krankheiten von Haarkleid, Haut, Unterhaut und Hörnern. In: Innere
Medizin und Chirurgie des Rindes, 4., vollständig neu bearbeitete Auflage. Parey
Buchverlag, 53
Grunert E., Hoedemaker M., Weigt U. (1996): Euterkrankheiten. In: Buiatrik Band I,
Euterkrankheiten, Geburtshilfe und Gynäkologie, Andrologie und Besamung. Verlag M. & H.
Schaper, 28
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Imai K., Ishihara R., Nishimori T. (2005): First demonstration of Bovine Herpesvirus 2
infection among cattle by neutralization test in Japan. J Vet Med Sci 67, 317-320
Kemp R., Holliman A., Nettleton P.F. (2008): Atypical bovine herpes mammillitis affecting
cows and calves. Vet Rec 163, 119-121
Torres F.D., Almeida S.R., Silva M.S., Weiblen R., Flores E.F. (2009): Distribution of latent
bovine herpesvirus 2 DNA in tissues of experimentally infected sheep. Res Vet Sci 87, 161166
Winter P. (2009): Klinik der Zitzenerkrankungen, Infektiöse Ursachen. In: Praktischer
Leitfaden Mastitis, Vorgehen beim Einzeltier und im Bestand. Parey Verlag, 113
Adresse des korrespondierenden Autors:
Dr. Alexander Tavella
Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie
Institut für Tierseuchenbekämpfung
Via Laura Conti Weg, 4
I-39100 Bozen – Italien
[email protected]
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BHV-1 Tankmilchserologie: Aktuelle Untersuchungsergebnisse,
Probleme und Lösungsansätze
Jens Brackmann
LUFA Nord-West, Ammerländer Heerstrasse 123, 26129 Oldenburg,
[email protected]
Einleitung
Die Untersuchung von Tankmilchproben auf BHV-1-Antikörper ist ein wichtiger Bestandteil
der Überwachung der BHV-1-Freiheit in niedersächsischen Rinderbeständen. Im Jahr 2011
wurden in unserem Institut ca. 21.000 Tankmilcheinsendungen aus ca. 7.000
niedersächsischen Betrieben auf BHV-1-Antikörper untersucht. Der größte Teil der Proben
wurde im Rahmen der Milchkontrolle genommen, ein geringerer Teil von den Hoftierärzten.
Es kommen Tankmilchproben zur Untersuchung, die Gemelke von maximal 50 Tieren
enthalten. Die Proben werden im Chekit BHV1-Tank Milk ELISA der Fa. IDEXX untersucht
und nach dem vorgegebenen Schema in Abhängigkeit von der Anzahl der gemolkenen Tiere
ausgewertet.
Dieses Verfahren ist sehr sensitiv, da es gewährleisten soll, dass ein Neuausbruch sowie
das Einbringen geimpfter Tiere in ungeimpft negative Bestände frühzeitig erkannt wird. Ein
gewisser Anteil an unspezifischen Reaktionen wird dabei in Kauf genommen. Um die
Qualität der Tankmilchdiagnostik in unserem Labor konstant zu halten wird jede Charge des
Testes einer Chargenprüfung unterzogen und auf jeder Platte eine BHV-1 positive
Tankmilchprobe in einer schwach positiven Verdünnungsstufe mitgeführt.
Im vergangenen Jahr war im Vergleich zum Vorjahr ein Anstieg des Anteils an fraglichen und
positiven Untersuchungsergebnissen zu beobachten. Immer wieder traten Fälle auf, in denen
Tankmilchproben wiederholt fraglich wurden, durch eine Blutuntersuchung jedoch kein
BHV-1 positives Tier im Bestand nachzuweisen war.
Die Feststellung des tatsächlichen Anteils an falsch fraglichen und positiven TankmilchUntersuchungsergebnissen durch Matrixeffekte ist mitunter schwierig. Nachuntersuchungen
werden in Abhängigkeit vom verantwortlichen Landkreis oder vom Tierhalter nicht einheitlich
durchgeführt und sind daher für uns teilweise schwer nachvollziehbar. Ewas
aufschlussreicher ist die Auswertung von positiven Einzelmilchproben, die im Rahmen von
Abklärungsuntersuchungen anfallen und im gleichen ELISA-Test untersucht werden. Für 60
in der Einzelmilch auffällige Tiere konnten wir ein Blutuntersuchungsergebnis im BHV-1-gBELISA ermitteln. Von diesen 60 Tieren wurden nur 17 BHV-1 positiv bestätigt, die Blutproben
der restlichen 43 Tiere waren negativ.
Im Vortrag werden detaillierte Auswertungen der in unserem Institut durchgeführten
Untersuchungen dargestellt, um Rückschlüsse auf die tatsächliche Spezifität der BHV-1Tankmilchdiagnostik in unserem Hause zu ermöglichen. Außerdem soll geprüft werden, ob
wir von Laborseite das Auftreten unspezifischer Reaktionen ohne Sensitivitätsverlust
minimieren bzw. fragliche und positive Tankmilchergebnisse mit der Tankmilchprobe weiter
abklären können.
Lösungsansätze:
• Durch eine Vorbehandlung von Tankmilchproben wurde versucht unspezifische MatrixEffekte zu beseitigen.
• Es wurde geprüft, ob zwei gB-ELISAs (Herdcheck IBR gB (IDEXX) und Cattletype
BHV-1 gB (LDL)) die in Deutschland nur für die Untersuchung von Einzelmilchproben
zugelassen sind, durch eine Konzentrierung der Antikörper in der Tankmilchprobe auf
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Milchpools und Tankmilchproben anwendbar sind. Die Konzentrierung wurde mit
Hilfe des Cattletype Milk Prep Kit (LDL) durchgeführt. Zur Untersuchung kamen unter
anderem Verdünnungsreihen von stark und schwach positiven Einzelmilchproben in
negativer Milch.
• In Zusammenarbeit mit ausgewählten Landkreisen wird, versucht den tatsächlichen
Anteil an unspezifischen Reaktionen zu ermitteln.
Ergebnisse:
Erste Auswertungen haben ergeben, dass der Anteil an fraglichen und positiven
Untersuchungsergebnissen nicht in allen Landkreisen gleichermaßen gestiegen ist. Die
Ursache für das vermehrte Auftreten fraglicher und positiver Untersuchungsergebnisse ist
also nicht nur in der Diagnostik zu suchen. Möglicherweise sind in einigen Landkreisen
häufiger Bestände mit Impftieren eingesendet worden bzw. Impftiere in bisher negative
Bestände gelangt. Da uns aber zahlreiche Fälle ohne nachgewiesene Impftiere oder BHV-1Reagenten vorlagen, wurden verschiedene Versuche im Labor durchgeführt.
Als erster und für das Labor leicht umzusetzender Lösungsansatz wurden zunächst 166
auffällige Tankmilchproben mit Labferment versetzt und durch eine Inkubation bei 37°C und
anschließender Zentrifugation das Milchserum gewonnen. Das Milchserum wurde direkt im
Chekit BHV-1 Tank Milk ELISA eingesetzt. Durch das Auslaben der Proben konnten
unspezifische Matrixeffekte allerdings nicht beseitigt werden.
Im nächsten Ansatz wurden negative und auffällige Tankmilchproben aus bekannten
Beständen ohne BHV-1-Impftiere unter Verwendung des Cattletype Milk Prep Kit
aufkonzentriert und die Eluate im Chekit BHV1-Tank Milk ELISA untersucht. Die
aufkonzentrierten Tankmilchproben waren in unseren Händen nicht für eine Untersuchung in
diesem ELISA geeignet, da es immer zu unspezifischen Reaktionen kam.
Im nächsten Schritt wurden Verdünnungsreihen von BHV-1 positiven Milchproben in
negativer Milch erstellt, mit dem Cattletype Milk Prep Kit aufkonzentriert und in den
genannten BHV-1-gB-ELISAs untersucht.
Erste Ergebnisse zeigen, dass die Sensitivität der verwendeten BHV-1-gB-ELISAs durch die
Anreicherung der Antikörper aus Milchpools mit dem Cattletype Milk Prep Kit deutlich erhöht
werden kann und dass eine Abklärung von fraglichen und positiven Tankmilchproben mit
diesem Verfahren möglich erscheint.
Bei diesen Versuchen wies der gB-ELISA der Fa. LDL gegenüber dem gB-ELISA der Fa.
IDEXX eine etwas höhere Sensitivität auf. Die Ergebnisse zur Bestimmung der Sensitivität
der Kombination Cattletype-gB und Cattletype Milk Prep Kit im Vergleich zur Untersuchung
nativer Tankmilchproben im Chekit BHV1-Tank Milk ELISA werden im Vortrag dargestellt
und Möglichkeiten zur Einbindungen dieses Verfahrens in die Routine-Untersuchung
diskutiert. Für die Anwendung eines solchen Abklärungsverfahrens sind möglicherweise
Modifikationen wie z.B. Verringerung der Gemelke in einer Tankmilchprobe oder
Veränderungen des Cut-off-Wertes des ELISA erforderlich.
Die Vorbehandlung der Proben stellt im Vergleich zur Untersuchung von nativen
Tankmilchproben ohne Vorbehandlung einen erheblichen Mehraufwand für das Labor dar,
der allerdings gerechtfertigt erscheint, wenn dadurch aufwändige Nachuntersuchungen von
Einzelblut- oder Einzelmilchproben in einigen Fällen entfallen können. Außerdem würde es
die Akzeptanz des Verfahrens bei den Landwirten fördern. Es wäre natürlich wünschenswert,
wenn die Spezifität des verfügbaren Tankmilch-ELISAs noch weiter optimiert werden könnte.
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8. Stendaler Symposium
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BHV1 gE-Untersuchung in der Pool-Milch – was ist möglich?
Steffen Horner
Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz, Abteilung
Veterinäruntersuchung, 99947 Bad Langensalza, Tennstedter Str. 8/9
In Deutschland werden im Wesentlichen 2 Strategien bei der BHV1 Bekämpfung
unterschieden. Strategie 1 arbeitet ohne BHV1 Impfung und Strategie 2 setzt eine BHV1
Markervakzine in den Beständen ein. Für die Diagnostik bedeutet dies, dass derzeit in
Deutschland bei geimpften Beständen nur ein BHV1gE Elisa Testsystem eingesetzt werden
kann. Aufgrund der geringeren Sensitivität wird dieses Testsystem in Deutschland bisher
nicht für Poolmilchuntersuchungen verwendet. Dieser Umstand ist für geimpft freie Betriebe
ein großer wirtschaftlicher Nachteil.
Durch Anwendung entsprechender Konzentrierungsverfahren ist es möglich, die Sensitivität
des BHV1 gE Elisa für Poolmilchuntersuchungen erheblich zu verbessern.
Ziel der hier vorgestellten Studie war es, zu prüfen, ob der kommerziell erhältliche
Aufkonzentrierungskit CATTLETYPE Milk Prep der Firma Labordiagnostk GmbH Leipzig
(LDL) generell im Routinelabor einsetzbar ist und ob dieser Kit in Kombination mit dem
Herdcheck IBR gE Elisa der Firma IDEXX Laboratories, Inc. (IDEXX) geeignet ist, bei
geimpft freien Betrieben die BHV1gE Blutuntersuchung zu ersetzen.
Für die Untersuchung wurden zwei BHV1 geimpft freie Betriebe, ein Betrieb im
Anerkennungsverfahren und ein Betrieb mit ca. 5 % Reagenten ausgewählt. Als
Kontrolluntersuchung dienten die jährlichen BHV1 Bestandblutuntersuchungen. Von
November 2009 bis Oktober 2010 wurden von diesen Betrieben monatlich ca. 1200
Milchproben gepoolt. Die Milchpoole wurden mit dem Aufkonzentrierungskit CATTLETYPE
Milk Prep (LDL) bearbeitet und anschließend der Herdcheck IBR gE Elisa (IDEXX) nach
Herstellerangaben
durchgeführt.
Vergleichsuntersuchungen
mit
unterschiedlichen
Poolgrößen und zwischen Milchpoolen mit Aufkonzentrierung und ohne wurden jeweils bei
einem Teil der Proben durchgeführt.
Die Milchpoole der geimpft freien Herden wurden in allen Monaten und Poolgrößen negativ
getestet. Der Betrieb im Anerkennungsverfahren wurde in den ersten Untersuchungen
negativ getestet, in der zweiten Hälfte der Studie konnten durch die Milchuntersuchung neue
Reagenten noch vor der Blutuntersuchung identifiziert werden.
Im 4. Betrieb wurde bis zum Ausscheiden des letzten Reagenten in jedem Monat mindestens
ein positiver Milchpool ermittelt.
Bei den Vergleichsuntersuchungen mit und ohne Aufkonzentrierung konnte die Steigerung
der Sensitivität des verwendeten BHV1 gE Elisa durch die vorangestellte Durchführung des
Konzentrierungsverfahrens unter den Bedingungen eines Routinelabors bestätigt werden.
Zusammenfassend
können
wir
feststellen,
dass
das
vorgestellte
Aufkonzentrierungsverfahren im Routinelabor leicht anwendbar und bei größeren
Probenzahlen automatisierbar ist.
Das Gesamtverfahren bestehend aus Aufkonzentrierung und BHV1 gE Elisa ist als Ersatz für
die Blutuntersuchung bei geimpft freien Beständen geeignet. Durch die mindestens
halbjährliche Milchuntersuchung wird die Überwachung dieser Bestände intensiviert. BHV1
Reinfektionen in den geimpft freien Beständen werden früher erkannt. Die BHV1 gE
Milchpooluntersuchung bietet zudem ökonomische Vorteile für die Tierhalter (keine
Blutentnahme, kein temporärer Milchrückgang) und die Untersuchungseinrichtungen
(weniger Verbrauchsmaterial).
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Aktuelle Impfempfehlungen für Rispoval® IBR Marker
Torsten Steppin
Pfizer GmbH, Linkstraße 10, 10785 Berlin
Die Impfung als integraler Bestandteil der BHV1 Bekämpfung in Deutschland
Seit den ersten Anfängen der BHV1-Bekämpfung in Deutschland spielen Impfungen eine
wesentliche Rolle in den Sanierungsprogrammen. Dabei wurden und werden sowohl
Lebendimpfstoffe als auch inaktivierte Vakzinen eingesetzt. Durch die Impfung sollen die
klinischen Symptome der Krankheit reduziert werden, die Virusreaktivierung und –
ausscheidung vermindert werden und das Ansteckungsrisiko für BHV1 freie Rinder gesenkt
werden. Die Zulassung und der Einsatz gE deletierter Markerimpfstoffe seit 1995 bot durch
die entsprechenden Testsysteme die Möglichkeit, geimpfte Rinder von BHV1-infizierten
Tieren zu unterscheiden.
Verschiedene Impfstrategien kamen in Deutschland zum Einsatz. In einigen Bundesländern
wurden überwiegend Impfungen der gesamten Bestände durchgeführt, in anderen
Bundesländern wurden überwiegend nur die BHV1-Reagenten geimpft. Für diese
Teilbestandsimpfungen wurden meistens inaktivierte Vakzinen eingesetzt.
Unterschiedliche Impfprotokolle kamen je nach Zulassung des eingesetzten Impfstoffes zum
Einsatz. Dabei wurde sowohl nur ein Impfstoff verwendet als auch ein Wechsel der
Impfstoffart integriert.
Je nach Alter und Antikörperstatus kann die Grundimmunisierung mit einer einmaligen Dosis
erfolgen oder es ist eine Doppelimpfung nötig. Regelmäßige Wiederholungsimpfungen
schließen sich an.
Durch die Anforderungen der BHV1-Verordnung und die damit verbundenen Konsequenzen
für die reagentenhaltenden Betriebe sind auch die Anforderungen an die gE deletierten
Impfstoffe und die dazu passenden Diagnostiksysteme gestiegen.
Von den Anwendern wird von den Impfstoffen ein nahezu vollständiger Infektionsschutz
sowie eine sichere Unterdrückung der Virusreaktivierung und Ausscheidung erwartet. Ein
Anspruch, der sich von den Zulassungskriterien unterscheidet.
Neben der Impfung der BHV1-Reagenten oder aller Tiere des Bestandes sind
schnellstmögliches Entfernen der Reagenten sowie Herdentrennung zwischen BHV1positiven und negativen Rindern und weitere Betriebsmanagementmaßnahmen notwendig,
um die BHV1-Sanierung erfolgreich fortsetzen zu können.
®
Neue Empfehlungen zum Einsatz von Rispoval IBR Marker vivum
Bei Impfung von Kälbern von 2 Wochen bis 3 Monate Lebensalter gilt generell die
Empfehlung einer einmaligen intranasalen Impfung und einer zweiten intramuskulären
Impfung im Alter von 3 Monaten. Für die Grundimmunisierung von Rindern älter 3 Monate
wird eine intramuskuläre Impfung verabreicht. Zur Vermeidung BHV1 assoziierter Aborte
benötigen weibliche Rinder eine Grundimmunisierung mit 2 intramuskulären Dosen.
Zusätzliche Impfempfehlungen bestehen für Tiere mit maternalen Antikörpern und Rinder,
die einem hohen Infektionsdruck ausgesetzt sind.
®
®
Wiederholungsimpfungen können mit Rispoval IBR Marker vivum oder Rispoval IBR
Marker inactivatum durchgeführt werden. Dabei sind unterschiedliche Impfintervalle möglich.
Zusammenfassung
Die BHV1-Impfung mit markierten Impfstoffen hat auch bei der bereits
vorangeschrittenen Sanierung in Deutschland weiterhin eine große Bedeutung.
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In reagentenhaltenden Betrieben stellt sie oft einen wesentlichen Bestandteil der
Bekämpfungsmaßnahmen dar. Bei hohem Infektionsdruck bzw. unmittelbar einem IBRRisiko ausgesetzten Rindern sollte eine Grundimmunisierung aus zwei Impfungen bestehen,
um den bestmöglichen Erfolg zu gewährleisten.
In Impfbetrieben sollten die Impfungen bis zur BHV1-freien Anerkennung fortgesetzt werden
um keine zusätzlichen Risiken im Anerkennungsverfahren einzugehen.
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Stand der BVD-Bekämpfung in Deutschland
Jörn Gethmann1, Horst Schirrmeier2, Martin Beer2, Franz J. Conraths1
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Seestr. 55, 16868 Wusterhausen / Dosse
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
Mit der inzwischen mehrfach geänderten „Verordnung zum Schutz der Rinder vor einer
Infektion mit dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus (BVDV-Verordnung)“ vom 11.12.2008 wurde
ein bundeseinheitliches Bekämpfungsprogramm gegen die BVD etabliert.
Kernpunkte der Verordnung sind das Entdecken und Entfernen aller persistent infizierten
Tiere (PI-Tiere). Dazu müssen (1) alle neugeborenen Kälber bis zu ihrem 6. Lebensmonat,
(2) alle Rinder vor dem Verbringen in andere Bestände und (3) alle Rinder, bei denen
klinische Anzeichen vorliegen, die darauf schließen lassen, dass sie an Mucosal Disease
erkrankt sind, seit dem 01.01.2011 auf BVD untersucht werden. Ausnahmen von der
Untersuchungspflicht gelten für Kühe, deren Kalb mit negativem Ergebnis auf BVDV
untersucht wurde. Diese Kühe erhalten den Status eines unverdächtigen Rindes
(abgeleiteter Status). Eine weitere wesentliche Säule der BVD-Bekämpfung sind
Handelsrestriktionen. So dürfen nur noch Tiere verbracht werden, die als BVD-unverdächtig
gelten. Ausnahmen von dieser Regelung gelten beispielsweise für Schlachttiere.
Die Impfung gegen BVD zum Schutz von trächtigen Tieren vor einer BVDV-Infektion ist
grundsätzlich möglich.
Die Untersuchungsergebnisse und die Impfungen werden im Herkunftssicherungs- und
Informationssystem für Tiere (HI-Tier) erfasst, in dem auch der Status eines Tieres ermittelt
wird. Von Januar bis Dezember 2011 wurden 17.410 Rinder als PI-Tiere klassifiziert. Das
entspricht einem Anteil von 0,14% der Rinderpopulation oder 0,36% der in 2011 geborenen
Rinder. Berücksichtigt man auch die Jahre davor, in denen die BVD-Bekämpfung auf
Länderebene geregelt war, wurden bis Dezember 2011 für ca. 16,8 Millionen Tiere Status
ermittelt. Insgesamt wurden dabei ca. 55.000 persistent infizierte Tiere entdeckt, das
entspricht einem Anteil von ca. 0,44% der untersuchten Tiere. Etwa 16,6 Mio. Rinder haben
den Status „BVDV unverdächtiges Rind“ erhalten, davon ca. 4,8 Mio. in Form des
abgeleiteten Status.
Im Jahre 2011 wurden in TSN wurden 8.337 Ausbrüche von BVD gemeldet (Stand:
06.03.2012).
In der Mehrzahl der Bundesländer vollzieht sich die BVD-Bekämpfung als Kombination von
PI-Elimination und Schutz vor Neuinfektionen durch Impfung. So wurden gemäß den in HITier hinterlegten Daten im Jahr 2011 ca. 170.000 Tiere geimpft.
Die Entdeckung von etwa 55 000 PI-Tieren seit Beginn der BVD.Bekämpfung und etwa
17.500 PI-Tieren in 2011 in Deutschland ist als Erfolg des Programms zu werten und
entspricht dem ausgewiesenen Ziel der BVDV-Verordnung, der Reduzierung der
kursierenden Virusmenge und damit der Senkung der Gefahr von Neuinfektionen. Auf der
anderen Seite erhöht sich in einer naiven Population das Risiko, dass durch einen
Neueintrag viele frühträchtige Tiere infiziert und auch vermehrt PI-Kälber geboren werden.
Dies sollte im weiteren Verlauf der Eradikation der BVD und bei der Entscheidung zu impfen
berücksichtigt werden.
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Virus, Verordnung und Vertrauen:
Stand der BVD-Bekämpfung in Sachsen-Anhalt und
Fallbericht einer eindrucksvollen Neuinfektion
Miriam Linder1, Wolfgang Gaede1, Friedrich-Wilhelm Oßwald2
1
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin,
Haferbreiter Weg 132, 39576 Stendal
2
Veterinär- und Lebensmittelüberwachungsamt des Altmarkkreises Salzwedel,
Karl-Marx-Str. 32, 29410 Salzwedel
Stand der BVD-Tilgung in Sachsen-Anhalt
Sachsen-Anhalt führte auf der Basis der Landesverordnung vom 20.2.2004 als erstes
deutsches Bundesland ein staatliches BVD-Tilgungsprogramm durch. BVDV-infizierte Rinder
wurden durch anfängliche virologische Untersuchungen aller Zuchtrinder eines Bestandes
und nachfolgend fortgesetzte virologische Untersuchungen der weiblichen Zutreter zwischen
dem 3. und 9. Lebensmonat identifiziert.
Auf dieser Grundlage waren Ende 2010 bereits 97,8% der Rinderbestände mit 93,7% der
unter das Tilgungsprogramm fallenden Rinder amtlich als BVDV-unverdächtig anerkannt.
Die Bilanz nach einem Jahr Bundes-VO fällt gemischt aus. Zwar ist die Zahl der amtlich
anerkannten BVDV-unverdächtigen Bestände um 15,5% auf 2883 gestiegen, durch die
Ausweitung der Bekämpfungspflicht auf alle Rinderbestände ist der Anteil unverdächtiger
Bestände aber mit 94,5% leicht rückläufig. Dieser statische Rückgang ist in erster Linie auf
die mit 102 (=3,3%) vervielfachte Zahl von Beständen mit unbekanntem Status
zurückzuführen.
Daneben wurden in 26 Beständen BVD-Virämiker festgestellt. Von diesen Beständen wurde
nur in 11 Beständen die Infektion mit BVDV in 2010 und/ oder den Vorjahren festgestellt.
In 13 Beständen wurde das Virus vorher noch nie nachgewiesen, obwohl regelmäßige
Untersuchungen teilweise seit 2002 nachweisbar sind. Ein besonders drastischer Fall einer
Neuinfektion wird im zweiten Teil des Vortrags beschrieben.
Untersuchungsmethodik beim Landesamt für Verbraucherschutz (LAV)
Für die Ohrstanzdiagnostik als neues Standardverfahren zum Nachweis von BVDV-PI
werden in Abhängigkeit vom BVD-Bestandsstatus alternative Untersuchungsmethoden
eingesetzt. Proben aus unverdächtigen Beständen werden zu 96 Gewebeproben je Pool in
der Pool-PCR angesetzt.
Proben aus nicht unverdächtigen Betrieben werden grundsätzlich gleich einzeln mit dem
Ag-ELISA untersucht.
Die Abklärung verdächtiger oder schwach positiver Reaktionen sowie die Bestätigung für
Neu- und Neuinfektionen erfolgt mit Dummy-Ohrmarken und dem alternativen Testsystem
und/ oder mit Blutproben für die PCR.
Die Kosten Ohrstanzendiagnostik werden von der Tierseuchenkasse direkt an das LAV
erstattet.
Fallbeispiel:
Betriebscharakteristik: Ein Mutterkuhbetrieb mit ca. 1500 Rindern (Stand 2011) führt in der
Weidesaison ca. 30 Herden mit je max. 50 Tieren. In der Stallsaison sind die Tiere in Ställen
zu je ca. 200 Tieren untergebracht.
Der Betrieb ist seit 2003 amtlich BVD-unverdächtig, seitdem werden zusätzlich regelmäßig
(amtlich angeordnete) serologische Jungtierfenster-Untersuchungen durchgeführt. Die
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Remontierung erfolgt aus eigener Nachzucht. Lediglich Deckbullen werden regelmäßig
zugekauft. Bei Zukäufen achtet der Betrieb streng auf die amtlichen attestierte BHV-1Freiheit und BVD-Unverdächtigkeit des Herkunftsbetriebs und verlangt vor dem Kauf eine
Einzeltieruntersuchung noch im Herkunftsbetrieb.
Der Fall: Im Herbst 2010 wurden dem Betrieb telefonisch fünf Jungbullen aus einem reinen
Zuchtbetrieb angeboten. Auf Nachfrage versicherte der Viehhändler, dass der
Herkunftsbetrieb den gleichen Seuchenstatus habe wie der eigene Betrieb.
Von der Arbeitsintensität des Weideabtriebs abgelenkt, wurde der Kauf beschlossen, ohne
auf die Einzeltieruntersuchung auf BHV-1 und BVDV zu bestehen. Man vertraute dem
Viehhändler, mit dem seit Jahren ein gutes geschäftliches Verhältnis bestand, und verließ
sich auf das Attest des zuständigen Veterinäramts, das dem Herkunftsbetrieb die BHV-1Freiheit und BVD-Unverdächtigkeit bescheinigte. Letztere stützte sich auf die BVD-Leitlinien
des Bundesministeriums für Ernährung, Landwirtschaft und Forsten (26. Januar 1998). Im
Gegensatz zu der bis Ende 2010 gültigen Landes-VO Sachsen-Anhalts (s.o.) wird nach
diesen Leitlinien die BVDV-Unverdächtigkeit aufrecht erhalten, wenn zweimal jährlich eine
repräsentative Stichprobe von ungeimpften Tieren je Stallabteil negativ auf BVD-Antikörper
getestet wird (Jungtierfenster).
Nach einer Quarantänephase von vier Wochen kamen die Jungbullen in eine Bucht am
Rande eines Stalls, der mit 200 überwiegend frühtragenden Kühen belegt war. Die
Blutuntersuchungen und andere tierärztliche Maßnahmen werden in dem Betrieb immer im
Januar durchgeführt. Im Januar 2011 wurden die fünf Jungbullen mitbeprobt, um
nachträglich den BVD-Einzeltierstatus zu ermitteln.
Einer der zugekauften Bullen erwies sich als persistierender Virämiker (PI-Tier). Es folgten
erste Gespräche mit dem zuständigen Amtstierarzt und entsprechende amtliche Auflagen
(Impfanordnung, Aberkennung des Status „BVD-unverdächtig“, unverzügliche Entfernung
virologisch positiver Neugeborener).
Bilanz: In der Abkalbesaison 2011 waren von den ca. 180 neugeborenen Kälbern, die von
Kühen stammten, die den Winter über gemeinsam mit dem PI-Tier im Stall verbracht hatten,
120 Kälber BVDV-positiv. In den anderen Ställen wurden keine BVDV-positiven Tiere
geboren.
Wirtschaftliche Verluste entstanden durch fehlende Absatzerträge, fehlende Tiere für die
Nachzucht, Impfkosten, deutlich erhöhter Arbeitsaufwand und einen erhöhten Beitragssatz
bei der Tierseuchenkasse. Der Betrieb schätzt den Gesamtverlust durch die BVDNeuinfektion auf 80.000 bis 100.000 €.
Nach betriebseigenen Angaben war die Ohrstanzdiagnostik, also die frühe Erkennung der
BVDV-positiven Tiere, sehr vorteilhaft, denn ansonsten hätten sich mit großer
Wahrscheinlichkeit in der nächsten Stallperiode noch weitere Herden des Betriebs infiziert
und der Schaden wäre noch größer geworden.
Fazit und Schlussfolgerungen
• Die schnelle Erkennung von Virämikern durch die Ohrstanzdiagnostik in den ersten
Lebenstagen eines Kalbes schützt nicht nur andere Betriebe vor der Einschleppung des
Virus, sondern ist auch gut geeignet zur Verhinderung der Verbreitung innerhalb der
eigenen Herde.
• Je weiter die BVD-Tilgung in Deutschland fortschreitet, desto wachsamer müssen Rinder
haltende Betriebe und Überwachungsbehörden bei Tierhandel und Zukäufen sein.
• Selbst wenn das Einzeltier den Status „BVD-unverdächtig“ hat, so sind doch Handel und
Zukauf von Tieren die größten Risikofaktoren für die Einschleppung des Erregers in
Bestände.
• In diesem Zusammenhang ist die Erkennung von Trojanern und transient infizierten
Rindern als Quelle für Neuinfektionen nicht hinreichend gelöst.
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8. Stendaler Symposium
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BVD: Der Wechsel von der Bekämpfung mittels Antigennachweis
zur serologischen Überwachung – Erfahrungen aus der Schweiz
Elena Di Labio, Heinz P. Schwermer, Lukas Perler
Bundesamt für Veterinärwesen BVET, Schwarzenburgstrasse 155, CH-3003 Bern
Seit Oktober 2008 läuft in der Schweiz ein obligatorisches nationales Ausrottungsprogramm
gegen die Bovine Virus Diarrhoe (BVD). Das Programm basiert auf der Identifikation und
Elimination von persistent-infizierten (PI-)Tieren mittels Antigen-Testen aller Rinder und
neugeborenen Kälbern, einem Impfverbot gegen die BVD und Sperren im Tierverkehr.
Das Programm verläuft sehr erfolgreich. In nur 3 Jahren konnte die PI-Prävalenz bei den
neugeborenen Kälbern von knapp 1.4% auf weniger als 0.06% reduziert werden. Über 99%
der Schweizer Rindviehhaltungen sind mittlerweile BVD-frei.
Der bisher erreichte Erfolg in der Bekämpfung der BVD soll zukünftig mit einer hochwertigen
Überwachung gefestigt und gesichert werden. 2012 erfolgt ein Systemwechsel, bei dem von
der flächendeckenden Untersuchung aller neugeborenen Kälber auf das BVD-Virus auf eine
langfristige Überwachung mittels der Untersuchung von Tankmilch und Blut weniger junger
Rinder (Rindergruppe) auf Antikörper übergegangen wird. Die serologische Überwachung
der BVD wird risikobasiert durchgeführt. Betriebe mit höherem Risiko für das Auftreten von
PI-Tieren werden intensiv, unauffällige Betriebe kostengünstig überwacht. Es wird zwischen
milchliefernden und nicht-milchliefernden Betrieben unterschieden. In beiden Betriebstypen
ist zudem entscheidend, ob in den zurückliegenden 24 Monaten bereits ein PI-Tier auf dem
Betrieb entdeckt wurde. Betriebe mit einem PI-Tier in diesem Zeitraum haben ein größeres
Risiko für weitere PI-Tiere und werden enger überwacht. Rindviehhaltungen, bei denen
aufgrund eines zu kleinen Rinderbestandes bzw. einer speziellen Betriebsstruktur eine
aussagekräftige serologische Untersuchung nicht möglich ist, werden weiterhin mittels der
virologischen Untersuchung alle neugeborenen Kälber überwacht. Tab. 1 zeigt das
festgelegte Untersuchungsschema für die Überwachung der fünf Betriebsgruppen.
Milchliefernde Betriebe
ohne PI-Tier mit
PI-Tier
seit 24 Mt.
seit 24 Mt.
TankmilchRindergruppe
untersuchung (jährlich)
(halbjährlich)
Nicht-milchliefernde Betriebe
ohne PI-Tier mit PI-Tier seit
seit 24 Mt.
24 Mt.
Stichprobe der Rindergruppe
(jährlich)
Betriebe:
Rindergruppe
(jährlich)
1.
Nachuntersuchung
Rindergruppe
virologische
Bestandesuntersuchung
2.
Nachuntersuchung
virologische
Bestandesuntersuchung
Auftreten von
PI-Tieren
Kontrolluntersuchung
virologische
Bestandesuntersuchung
Betriebe mit ≤ 10
Rd. bzw. spez.
Betriebsstruktur
virologische
Untersuchung aller
neugeborenen
Kälbern
(kontinuierlich)
virologische
Bestandesuntersuchung
Tabelle 1: Untersuchungsschema für die Überwachung von BVD-freien Betrieben in der
Schweiz. Rindergruppe: serologische Untersuchung von 10% der Rinder eines Bestandes,
mindestens aber 5 Rindern im Alter von 6 bis 24 Monaten, die sich ausschliesslich im
Bestand aufgehalten oder diesen nur zur Sömmerung verlassen haben.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Die
Probennahmen
und
-untersuchungen
für
das
serologische
BVDUntersuchungsprogramm haben im Februar 2012 begonnen. Aufgrund bestehender
Unsicherheiten bei der Umstellung auf ein serologisches Untersuchungsprogramm –
diskutiert wurden hier etwa die möglicherweise mangelnde Sensitivität und die Nichteignung
des Systems für bestimmte Betriebstypen - wurde entschieden, mit der flächendeckenden
virologischen Untersuchung aller neugeborenen Kälbern (Kälberbeprobung) bis Ende 2012
weiterzufahren. Zudem konnte bis zum Zeitpunkt dieser Entscheidung nicht gezeigt werden,
dass schon ein Rückgang in der Antikörper-Prävalenz in der Kuhpopulation eingesetzt hatte.
Parallel zur Kälberbeprobung werden 2012 die Komponenten des serologischen
Untersuchungsprogramms aufgebaut und auf ihre Praxistauglichkeit in der Schweiz getestet.
Die vorläufigen Ergebnisse aus dem serologischen BVD-Untersuchungsprogramm und die
gemachten Erfahrungen bei der Umstellung auf das neue BVD-Überwachungssystem in der
Schweiz werden präsentiert.
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8. Stendaler Symposium
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Zur Weiterverbreitung des BVD-Virus in Rinder haltenden Betrieben
trotz Merzen der persistent virämischen Tiere
Wilfried Hopp1 und Tobias Kirschner2
1
2
Veterinärdienst des Kreises Soest, Hoher Weg 1-3, 59494 Soest
Fachbereich Gesundheit und Verbraucherschutz, Veterinärwesen und Lebensmittelüberwachung
des Kreises Unna, Platanenallee 16, 59425 Unna
Zur Vorbereitung auf das Inkrafttreten der BVDV-Verordnung am 1. Januar 2011 wurden in
Nordrhein-Westfalen Leitlinien des Landes für den Schutz der Rinder vor einer Infektion mit
dem Bovinen Virusdiarrhoe-Virus konzipiert. Diese Leitlinien traten am 01.10.2009 in Kraft,
um den Rinderhaltern in NRW eine frühzeitige BVD-Sanierung ihres Rinderbestandes zu
ermöglichen. Ziel der Leitlinien war die Identifizierung und Merzung der im Bestand
möglicherweise vorhandenen persistent infizierten (PI)- Tiere und die Schaffung eines BVDunverdächtigen Rinderbestandes noch vor dem Inkrafttreten der Verordnung.
Der Tierhalter trat dem Verfahren durch Unterschreiben einer Verpflichtungserklärung bei
und versicherte damit, die Bedingungen des Verfahrens korrekt einzuhalten. Zu Beginn der
Sanierung wurde der Gesamtbestand mittels Blutproben auf das Vorhandensein von BVDVirus untersucht. In dem sich anschließenden 12-monatigen Beobachtungszeitraum wurden
alle neu in dem Bestand geborenen Kälber mittels einfacher Ohrstanzprobe oder auch
mittels Blutprobe untersucht. Nach Vorliegen der entsprechenden Voraussetzungen wurden
die Rinderbestände als BVDV-unverdächtig eingestuft.
Die HI-Tier-Datenbank diente sowohl zur Erstellung der Untersuchungsanträge als auch zur
Dokumentation von Untersuchungsergebnissen und durchgeführten Impfungen. Durch die
verpflichtende Nutzung der Datenbank ist es gelungen, eine nahezu lückenlose
Untersuchung der in NRW gehaltenen Rinder zu gewährleisten. Dabei konnten vorhandene
PI-Tiere schnellstmöglich erkannt und gemerzt werden.
Die Tierseuchenkasse NRW gewährte eine Beihilfe für die entfernten Virämiker. Nach
Entfernung von PI-Tieren sollten zur Verhinderung neuerlicher fetaler Infektionen die
weiblichen Tiere der betroffenen Betriebe geimpft werden. Die Leitlinie enthielt jedoch keine
Impfverpflichtung.
Diesem Verfahren schlossen sich über 90% der in Nordrhein- Westfalen ansässigen Rinder
haltenden Zuchtbetriebe an. Derart flächendeckende Untersuchungen auf das BVD-Virus hat
es in Deutschland bisher nicht gegeben.
Die nachgewiesene Prävalenz der Infektion lag deutlich unter 1 % und damit in einem
vergleichsweise niedrigen Bereich.
Selten lagen klinische Erscheinungen bei den PI-Tieren vor. In einzelnen Fällen wurde
vermindertes Wachstum und Kümmern als einziges auffälliges Merkmal nachgewiesen.
Trotz Impfempfehlung wurde auch nach dem Auftreten von PI-Tieren in den Betrieben in der
Regel nicht geimpft, da eine Notwendigkeit aufgrund fehlender klinischer Erscheinungen und
fehlender Bestandsprobleme für den Betriebsleiter nicht einsehbar war.
Aufgrund der länger währenden, mittlerweile über 2½ Jahren dauernden laufenden
Untersuchung der Bestände, die ab dem 1.1.2011 nach den Vorgaben der BVDVVerordnung erfolgte, wurde in einzelnen Beständen das Auftreten mehrerer Virämiker in
regelmäßigen zeitlichen Abständen und unterschiedlicher Häufigkeit festgestellt. Es ließ sich
ein Abstand von 5 – 8 Monaten zwischen dem Auftreten von PI-Tieren ermitteln, wobei
deutlich wurde, dass die Anwesenheit eines PI-Tieres im Bestand selbst bei nur kurzer
Verweildauer bereits eine weitere Ansteckung niedertragender Tiere verursachen kann.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
In der vorliegenden Arbeit werden die Zusammenhänge zwischen der Verweildauer von PITieren im Bestand und dem erneuten Auftreten von Virämikern durch die Auswertung
mehrerer BVD-infizierter Betriebe dargestellt. Dabei werden die Betriebsstrukturen und evtl.
durchgeführte Impfmaßnahmen berücksichtigt.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
BVD-Impfvirusnachweis aus Ohrstanzproben
Marlis Klopries
Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern,
Thierfelderstraße 18, 18059 Rostock
Im Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei (LALLF) M-V werden
Untersuchungen nach der BVD-VO an Blut- und Ohrstanzproben durchgeführt.
Routinemäßig wird für beide Probenmaterialien die Pool-PCR eingesetzt. Die Poolgröße
beträgt 50 bei Blutproben und 10 bei Ohrstanzproben. Der BVD-Antigen-ELISA wird nur
vereinzelt für Nachproben bzw. spezielle Fragestellungen eingesetzt.
Bei positiven Ohrstanzproben wird anhand des ct-Wertes abgeschätzt, ob es sich vermutlich
um ein PI- oder NPI-Tier handelt. Dies wird dem zuständigen Veterinäramt und dem TGD
mitgeteilt. Der Anteil an vermutlichen NPI-Tieren lag im Jahr 2011 bei etwa 50%.
In einem Betrieb wurde im Juli 2011 ein Virämiker über eine Ohrstanzprobe entdeckt. Im
Laufe des Jahres traten in diesem Bestand ausschließlich Ohrstanzproben mit hohen ctWerten auf, ohne dass ein weiterer Virämiker nachgewiesen wurde. In diesem Bestand
wurden nach Auftreten des einen Virämikers alle Tiere unabhängig vom Trächtigkeitsstatus
mit BVD-Lebendimpfstoff geimpft. Dieses Verfahren scheint sich in der Praxis bewährt zu
haben, der Impfstoff besitzt aber hierfür keine Zulassung. Proben dieses Betriebes
(Virämiker und weitere Proben) wurden zur Sequenzierung an das Referenzlabor am FLI,
Insel Riems versandt. Dort konnte - neben Feldvirus in der Probe des Virämikers - aus
Proben mit hohen ct-Werten Impfvirus nachgewiesen werden. Nachuntersuchungen dieser
Tiere im ELISA verliefen negativ.
Proben weiterer Betriebe, in denen tragende Tiere mit Lebendimpfstoff geimpft wurden,
wurden zur Sequenzierung versandt. Die Untersuchungen dauern noch an.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Ungewöhnlicher Verlauf einer Infektion mit Pestiviren in einem
bisher nicht infizierten Rinderbestand in Tirol
Joachim Weikel
AGES Institut für veterinärmedizinische Untersuchungen, Technikerstraße 70,
6020 Innsbruck, Österrreich
Fallbeschreibung
Im August 2011 wurde in der Ohrstanze eines neugeborenen Kalbes mittels IDEXX-BVDAntigen-ELISA ein positives Ergebnis erzielt. Da der Herkunftsbestand bis zu diesem
Zeitpunkt als BVD-frei galt, wurden vom Kalb und von der Mutter Blutproben für eine
Abklärungsuntersuchung entnommen. Im Antigen-ELISA gab es wieder eine positive
Reaktion aus dem Blut des Kalbes, in der RT-qPCR wurde der Befund mit einem Ct-Wert
von 22 bestätigt und daraus der Schluss gezogen, dass das Kalb persistent virämisch ist. Im
Blut der Mutter waren weder Antikörper noch Antigen von BVD-Virus nachweisbar, auch das
Kalb war serologisch negativ.
Da die Geburt eines PI-Tieres durch ein Muttertier, das keine Antikörper gebildet hatte,
zunächst nicht plausibel erschien, eine Verwechslung der Proben jedoch sicher
ausgeschlossen werden konnte, wurde das Blut des Kalbes zur Sequenzierung an das
nationale Referenzlabor nach Mödling weitergeleitet. Dort wurde das Genom als zum Border
Disease Virus (BDV) gehörend identifiziert.
Sechs Wochen nach der Geburt des Kalbes wurden, nachdem die restlichen Tiere vom
sommerlichen Almaufenthalt wieder zurück im Stall waren, von allen 26 Rindern des
Bestandes Blutproben auf Antigen und Antikörper gegen Pestiviren untersucht. Bei 13
Tieren, darunter die Mutter des zwischenzeitlich getöteten Kalbes, wurden Antikörper gegen
Pestiviren mit dem IDEXX-BVD-Antikörper-ELISA nachgewiesen. Der Antigennachweis
mittels ELISA war bei allen Rindern negativ.
Besprechung
Der BVD Antigen-ELISA der Firma IDEXX, der das Hüllprotein Erns von BVD-Viren nachweist,
ist für beim Rind vorkommende Pestiviren geeignet, zu denen sowohl das Virus der bovinen
Virusdiarrhoe als auch das Border Disease Virus gehören. Letzteres ist als
Krankheitserreger von kleinen Wiederkäuern bekannt, kann aber auch auf Rinder übertragen
werden und bei Infektion in einem bestimmten Zeitraum der Trächtigkeit wie BVDV zur
Geburt von persistent virämischen Nachkommen führen. Auffallend bei der Infektion des
Rindes mit Border Disease Virus ist, dass die Bildung von Antikörpern sehr stark verzögert
sein kann.
Geht man von einer Virusaufnahme des Muttertieres im späten ersten Drittel der Trächtigkeit
aus, erfolgte die Serokonversion im hier vorgestellten Fall erst mehr als 200 Tage nach der
Infektion.
In dem Bestand wurde bis jetzt kein weiteres PI-Kalb geboren, der Betriebsstatus blieb auf
„BVD-frei“.
Ungeklärt blieb, woher das Border Disease Virus stammte. Der Betrieb selbst hält keine
kleinen Wiederkäuer, der Kontakt zu dem BDV muss jedoch noch vor dem Almauftrieb
erfolgt sein. Ansonsten käme auch eine Übertragung des Virus beim Kontakt mit
Wildwiederkäuern in Betracht. So ist zumindest für Südtirol die Infektion von Rindern durch
Gämsen, die mit BDV infiziert waren, beschrieben worden. Nach unserem Kenntnisstand
und eigenen Untersuchungen wurde jedoch bisher kein Border Disease Virus in der
Gamspopulation in den Tiroler Alpen nachgewiesen.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
BVD - Eine unterschätzte Krankheit in der Kälbermast?
Stefan Lüllmann
Tierarztpraxis Stefan Lüllmann, Allensteiner Straße 449624 Löningen
Vorbericht
In einen Fresseraufzuchtbestand wurden ca. 240 Braunviehkälber aufgestallt, die von
2 Händlern über einen Markt in Süddeutschland bezogen wurden. Die Tiere hatten bei
Ankunft im Bestand einen guten Gesundheitszustand und wurden in einen gereinigten und
desinfizierten Stall eingestallt.
Zwei Tage nach Aufstallung wurden die Kälber mit Rispoval® RS+PI3 IntraNasal geimpft.
Gegen die umstallungsbedingten Krankheiten (Diarrhoe, respiratorische Erkrankungen)
wurden Antibiotika eingesetzt.
Etwa 3-4 Wochen nach Einstallung der Kälber wurde eine zunehmende respiratorische Klinik
diagnostiziert, die sich durch den gesamten Stall ausbreitete. Die Kälber zeigten wässrigen
Nasenausfluss, trockenen Husten und schwere Atmung.
Es wurden Nasentupfer genommen und zum Untersuchungsamt eingeschickt.
Behandlungsversuche mit hochwirksamen Antibiotika brachten keinen Erfolg. Erst eine
Notimpfung mit Rispoval® RS+PI3 IntraNasal brachte eine deutliche Besserung des
Geschehens.
Im Verlauf der Erkrankung verendeten 2 Tiere und 2 weitere schwerst erkrankte Kälber
wurden euthanasiert und zur pathologischen Untersuchung gebracht.
Diagnostische Ergebnisse
In den Nasentupfern wurden BRSV und Mycoplasma bovis nachgewiesen, andere Viren, wie
PI3, BVDV und BHV1 waren in der PCR negativ. Im Sektionsgut war ebenfalls M. bovis
nachweisbar.
Können diese Erreger für dieses Krankheitsgeschehen allein ursächlich sein?
Nach den Erfahrungen der Tierarztpraxis schützt die intranasale Impfung mehrere Wochen
gut vor klinischen BRSV-Erkrankungen. M. bovis-Infektionen sind mit Makrolidantibiotika
oder Fluorchinolonen in der Regel gut therapierbar.
Die Kälber kamen aus einer BHV1-freien Region, so dass auch diese Krankheit
ausgeschlossen werden kann. Da seit dem 01.01.2011 alle in den Handel kommenden
Rinder mit negativem Ergebnis auf BVDV untersucht sein müssen, sollte auch diese
Krankheitsursache ausgeschlossen sein.
Da die Kälber bereits 3-4 Monate alt waren, entschloss sich die Tierarztpraxis ca. 4 Wochen
nach Beginn der klinischen Symptome Blutproben erkrankter Kälber serologisch auf
Antikörper gegen verschiedene Erreger untersuchen zu lassen. Die maternalen Antikörper
sollten in diesem Alter nur zu geringen Nachweisen führen, wogegen aktiv in Folge einer
Infektion erworbene Antikörper zu einer deutlichen Reaktion führen sollten.
In 6 von 10 eingesandten Blutproben wurden sehr hohe Antikörpertiter gegen BVDV
ermittelt. Alle zugekauften Tiere hatten laut HIT Recherche den Status N10 (mit negativem
Ergebnis auf BVDV untersucht). Über den genauen Zeitpunkt der Infektion können keine
Aussagen getroffen werden, eine transiente BVDV Infektion ist wahrscheinlich. Alle Kälber
wurden mit negativem Ergebnis auf BHV1 – Antikörper getestet.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Diskussion
Mögliche Ursachen und Zeitpunkte der BVDV-Infektion sowie weitere prädisponierende
Faktoren der respiratorischen Krankheit werden im Vortrag diskutiert.
Trotz Anforderungen der BVDV-VO werden weiterhin Tiere ohne Untersuchungsergebnis
verbracht, was durch die Zahl der notwendigen Nachuntersuchungen nach dem Verbringen
bestätigt wird. Bei diagnostischen Untersuchungen gefundene Hinweise auf BVDVInfektionen (Virusnachweise (transiente oder persistente Infektionen), hohe Antikörpertiter)
stehen oft in Zusammenhang mit schwer therapierbaren Krankheiten in Kälberbeständen.
Die immunsuppressiven Effekte einer BVDV-Infektion haben dabei als prädisponierende
Faktoren für andere Erkrankungen oder unzureichende Impferfolge wahrscheinlich eine
besondere Bedeutung.
Es werden Empfehlungen gegeben, wie sich zukaufende Betriebe bestmöglich gegen
klinische Folgen einer eventuellen BVDV-Infektion schützen können und welche Faktoren im
Rahmen epidemiologischer Untersuchungen nach BVDV-Nachweisen beachtet werden
sollten.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Ein Jahr BVDV-Ohrstanzendiagnostik
Ergebnisse aus 16 Landkreisen Niedersachsens
Silke Amelung¹, Jens Brackmann¹, Ludwig Haas², Lothar Kreienbrock³
¹ LUFA Nord-West, Institut für Tiergesundheit, Ammerländer Heerstrasse 123, 26129 Oldenburg
² Institut für Virologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bünteweg 17, 30559 Hannover
³ Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung,
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Bünteweg 2, 30559 Hannover
Seit dem 01.01.2011 gilt in Deutschland die neue BVD-VO. In Niedersachsen ist bereits seit
dem 01.06.2010 die landesweite Nds.BVD-VO gültig. Diese besagt, dass alle Kälber
innerhalb von sieben Tagen nach der Geburt in einer von der zuständigen Behörde
bestimmten Untersuchungseinrichtung auf eine Infektion mit dem Bovinen VirusdiarrhoeVirus untersucht werden müssen. Dieses geschieht zum größten Teil über die Untersuchung
von Ohrstanzproben.
In Niedersachsen sind ca. 2,6 Mio. Rinder gemeldet (TSK: Stand 11.2011). Das hohe
Probenaufkommen wird in Niedersachsen von insgesamt vier Instituten bearbeitet. Im Institut
für Tiergesundheit der LUFA Nord-West werden werktäglich zwischen 1.000 und 2.000
Kälberohrstanzproben aus 16 Landkreisen untersucht (ca.1,1 Mio. Rinder gemeldet). Die
Untersuchungen werden mittels ERNS Antigen-ELISA (Herdcheck-IDEXX) durchgeführt. Für
Abklärungsuntersuchungen wird das Adiavet-BVD Realtime PCR-Kit (AES) und das CADOR
BVD RT-PCR Kit (Qiagen) verwendet. Diese werden durchgeführt, wenn die Untersuchung
im BVD-Antigen-ELISA zu keinem eindeutigen Ergebnis führt und machen ca. 0,03% des
gesamten Probenaufkommens aus.
Im Zeitraum vom 01.06.2010 bis zum 31.12.2011 wurden 389.008 Ohrstanzproben
eingesendet. Davon wurden 2.206 Proben positiv befundet (PI-Tiere). Die Prävalenz liegt
somit insgesamt bei 0,57 %. Diese PI-Tiere stammen aus 691 Betrieben. Das entspricht ca.
9% der einsendenden Betriebe. Im Durchschnitt wurden 3,2 positive Kälber pro positiven
Betrieb nachgewiesen. Dabei treten starke regionale Schwankungen auf. In den
rinderdichten Gebieten im Westen Niedersachsens (LK Aurich, Emden, Leer, Emsland,
Cloppenburg, Grafschaft Bentheim) mit einem sehr hohen Viehbesatz befinden sich mit
durchschnittlich 12,5% die meisten positiven Betriebe mit den höchsten
Einzeltierprävalenzen von 0,68% (mit monatlichen Schwankungen von 0,2% bis 1,51%).
Demgegenüber stehen im östlichen Niedersachsen (LK Uelzen, Lüchow-Dannenberg,
Gifhorn und Hannover) in Landkreisen mit nur geringer Viehdichte 4,5 % positive Betrieben
und Einzeltierprävalenzen von 0,28%. Aus der „Mitte“ Niedersachsens (LK Diepholz,
Harburg, Heidekreis, Celle und Osterholz) wurden 0,44% der eingesandten Ohrstanzproben
positiv untersucht. Diese stammen aus 6,5% der Betriebe.
Im April 2012 soll mit Unterstützung der TSK Hannover und der VIT Verden eine
Befragungsaktion der einsendenden Landwirte beginnen, um mehr epidemiologische
Informationen für die zu erwartenden Fortschritten (Senkung der Prävalenzen) zu
generieren.
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
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BVD - Ein Jahr Pflichtbekämpfung in Thüringen,
Erfahrungen, Probleme und Perspektiven
Ulrike Bange1, Anja Höfig2, Stefan Schulze1, Wulf-Iwo Bock1
1
Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (TLLV),
Tennstedter Str. 8/9, 99947 Bad Langensalza
2
Landratsamt des Unstrut-Hainich-Kreises, Lindenbühl 28/29, 99974 Mühlhausen
Aufbauend auf einem freiwilligen BVD-Bekämpfungsprogramm der Thüringer
Tierseuchenkasse ab Mitte der 90er Jahre und einem Landesprogramm in den Jahren 2009
und 2010, begann die Pflichtbekämpfung mit In-Kraft-Treten der Verordnung zum 01. Januar
2011. Seit diesem Zeitpunkt werden alle Kälber in der ersten Lebenswoche mittels
Ohrstanze (ggf. Blutprobe) beprobt und am Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit
und Verbraucherschutz ausschließlich mittels qRT-PCR untersucht. Bei positivem Ergebnis
erfolgt im Falle der nicht sofortigen Merzung eine Zweituntersuchung (Blut) nach längstens
60 Tagen.
Es werden jedem Einzeltier zwei Ohrstanzgewebe-Ohrmarken der Firma Allflex eingezogen
und beide Gewebeproben im antragslosen Verfahren zur Untersuchung in das TLLV
eingesandt. Die Zweitproben werden bei fehlenden oder leeren Erstproben, zu wenig
Material in der Erstprobe, defekten Gefäßen bzw. Stanzen oder zur Absicherung der
Untersuchungsergebnisse herangezogen. Die Untersuchungsergebnisse werden innerhalb
von max. 5 Werktagen durch das TLLV einzeltierbezogen an die Datenbank der HI-Tier
übermittelt.
Im Rahmen des Vortrags wird der Stand der Untersuchungen anhand konkreter
Untersuchungszahlen zum Ende des I. Quartals 2012, sowie die daraus abgeleiteten
Schlussfolgerungen hinsichtlich Prävalenz und Sanierungsstand dargelegt.
Wenn BVDV-positive Tiere diagnostiziert werden, erfolgt die Information der Veterinärämter
vorrangig durch HI-Tier-Veterinär-Vorgänge. Die gemäß Verordnung notwendigen
epidemiologischen Ermittlungen werden durch die zuständigen Veterinärämter in
Zusammenarbeit mit dem Rindergesundheitsdienst der Thüringer Tierseuchenkasse
durchgeführt. Die Einbindung der betroffenen Tierhalter erfolgt durch ein „Programm zur
Bekämpfung der Infektion mit dem Virus der BVD“ der Tierseuchenkasse, mittels
betrieblicher Maßnahmenpläne.
Die in Thüringen von einer BVDV-Infektion betroffenen Bestände sind zum Großteil
Milchviehbetriebe und deren zugehörigen Aufzuchtsbetriebe, zum geringeren Teil auch
Mutterkuhhaltungen. Nach derzeitiger Einschätzung erweisen sich besonders Großbetriebe
mit i.d.R. mehr als einem Standort als problematisch bei der Sanierung. Im Vortrag wird
beispielhaft auf epidemiologische Erkenntnisse im Rahmen eines BVD- Ausbruchs in einem
Thüringer Milchviehbetrieb mit eigener Jungrinderaufzucht in den Niederlanden
eingegangen. Anhand dieses Fallbeispiels werden konkrete Probleme, die sich u.a. aus der
gemäß Verordnung möglichen Verbringung von Tieren in andere Mitgliedsstaaten ergeben
können, dargelegt.
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
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Besonderheiten aus einem Jahr BVD-Pflichtbekämpfung in Bayern
Stephanie Haberl, Michaela Alex, Armin Gangl, Corinna Pfahler, Jens Böttcher,
Norbert Meier, Gerhard Wittkowski
Tiergesundheitsdienst Bayern e. V., Senator-Gerauer-Straße 23, 85586 Poing
In Bayern wurde für die Umsetzung der BVD-Pflichtbekämpfung die „Arbeitsgemeinschaft
BVD-Virusdauerausscheider freies Bayern“ (ARGE BVD) gegründet, die auf einer engen
Zusammenarbeit zwischen dem Tiergesundheitsdienst (TGD) Bayern e. V., dem Landeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung (LKV) und dem Milchprüfring (MPR)
beruht. Hierdurch konnte u. a. eine individuelle Logistikschiene (Probentransport über die
Milchsammelwagenfahrer) etabliert werden.
Seit 01.01.2011 wurden mehr als 1 Mio. Proben aus über 40.000 Beständen untersucht. Der
überwiegende Anteil der Untersuchungen (ca. 85 % der Proben) wurde mittels ERNS-ELISA
(HerdCheck BVDV Ag/Serum Plus, IDEXX) durchgeführt. Für etwa 15 % der Proben und
Abklärungsuntersuchungen bei fraglichen Ergebnissen wurde die Real Time RT-PCR
(Virotype® BVDV, LDL) eingesetzt. In 6,7 % der Bestände konnte mindestens ein BVDVReagent gefunden werden. Die BVDV-Herdeninzidenz betrug 6,0 %.
Hinsichtlich der Prävalenz primär positiver BVDV-Reagenten konnte unabhängig von der
Testmethode sowohl auf Einzeltier-, als auch auf Bestandsebene ein Rückgang verzeichnet
werden. Bei der Untersuchung mittels Ag-ELISA sank die Prävalenz auf Einzeltier- bzw.
Bestandsebene von 0,7 % auf 0,4 % bzw. von 1,6 % auf 0,9 %. Eine im Verlauf ähnliche
Tendenz konnte bei der Untersuchung mittels PCR beobachtet werden. Die Prävalenz sank
von 1, 5 % auf 0,7 % bzw. von 1,9 % auf 1,1 %.
Aufgrund der hohen Probenzahlen konnten für den Erfolg des Verfahrens relevante
Besonderheiten in der Routinediagnostik festgestellt werden:
Abweichende Virusstämme und PCR-Eignung
In zwei Beständen aus den Regierungsbezirken Oberpfalz und Niederbayern wurde BVDVirusgenom mit der routinemäßig angewandten PCR nur unzureichend detektiert.
Nach erfolgreicher Virusanzucht wurden die Virusisolate an das NRL für BVD/MD am
Friedrich-Loeffler-Institut versandt. Bisher wurde ein Virusisolat (BVDV-1 MA7111)
sequenziert. Hierbei wurde eine Mutation im Bindungsbereich der Sonde festgestellt.
Wiederholt grenzbereichswertige ELISA-Proben mit hoher Genomlast
In einigen Beständen konnte beobachtet werden, dass sowohl die erste Ohrgewebeprobe als
auch die zur Abklärung eingesandte Wiederholungsprobe im ELISA reproduzierbare
grenzbereichswertige Resultate ergaben. In diesen Fällen wurden Blutproben in der PCR
nachuntersucht. Die hierbei ermittelten Ct-Werte sprachen in allen Fällen mit hoher
Wahrscheinlichkeit für das Vorliegen einer persistenten Infektion.
Wiederholt „hochnegative“ ELISA-Proben mit hoher Genomlast
131 Proben, die wiederholt „hochnegativ“ im ELISA reagierten, wurden zusätzlich mittels
PCR untersucht. In 43 Fällen wurden niedrige Ct-Werte ermittelt, die Hinweis auf das
Vorliegen persistent infizierter Tiere geben.
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Schlussfolgerung
Die Untersuchungen von über 1 Mio. Proben innerhalb eines Jahres zeigten, dass beide
Testsysteme geeignet sind, ein Tierseuchenbekämpfungsverfahren auch im Hochdurchsatz
durchzuführen. Die Beobachtungen zeigen, dass sich nur durch eine Kombination beider
Methoden und unter Einbeziehung einer Zweitprobe die individuelle, sofortige Abklärung
nicht eindeutiger Ergebnisse erzielen lässt.
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BVD-Bekämpfung in Baden-Württemberg
Aktueller Stand aus Sicht des Diagnostikzentrums und des
Rindergesundheitsdienstes
Hans-Jürgen Seeger1, Albrecht Schwarzmaier2, Thomas Miller3
1
Rindergesundheitsdienst der Tierseuchenkasse Baden-Württ., Talstr. 17, 88326 Aulendorf
Rindergesundheitsdienst der Tierseuchenkasse Baden-Württ., Am Moosweiher 2, 79108 Freiburg
3
Staatl. Tierärztl. Untersuchungsamt – Diagnostikzentrum, Löwenbreitestr. 18/20, 88326 Aulendorf
2
Bekämpfungsverfahren in Baden-Württemberg
Der Start in die verpflichtende BVD-Bekämpfung ist in Baden-Württemberg weitgehend
reibungslos gelungen. Die frühzeitige landesweite Einführung der Ohrstanzmarken ab April
2010
durch
den
Landeskontrollverband,
die
weitgehende
Übernahme
der
Untersuchungskosten durch das Land und die Gewährung einer Merzungsbeihilfe durch die
Tierseuchenkasse haben ganz wesentlich zur hohen Akzeptanz des Bekämpfungverfahrens
beigetragen. Von April 2010 bis Januar 2011 war ein linearer Anstieg der Ohrstanzproben zu
verzeichnen. Insgesamt wurden bisher ca. 525.000 Ohrstanzproben am Staatlichen
Untersuchungsamt Aulendorf – Diagnostikzentrum untersucht. Über 99 % der Proben
enthielten untersuchungsfähiges Material. In weniger als 1 % mussten Nachproben
angefordert werden.
Ergebnisse
Von April 2010 bis Dezember 2011 wurden mit Hilfe der Ohrstanzproben 2.407 BVDV
positive Kälber in 743 Beständen diagnostiziert. Das entspricht einer Inzidenz der persistent
infizierten Kälber (PI-Kälber) von 0,49 %, die sich auf 4,9 % aller Bestände verteilen.
Innerhalb von Baden-Württemberg gibt es erhebliche regionale Unterschiede. Der Anteil der
PI-Kälber schwankt je nach Landkreis zwischen 0 und 1,2 %. Viehdichte Regionen und
insbesondere Regionen in denen Gemeinschaftsweiden verbreitet sind haben die höchste
Inzidenz.
Bei positiven Kälbern ist die Beprobung der Mutter von großer Bedeutung, da 6 bis 7 % der
PI-Kälber bereits von einer persistent infizierten Mutter abstammen. Dabei handelt es sich
bei nahezu drei Vierteln um erstkalbende Muttertiere.
Eine Auswertung in 50 betroffenen Beständen ergab, dass - bezogen auf die Anzahl
Geburten pro Jahr - in diesen Beständen durchschnittlich 18 % PI-Kälber geboren wurden.
Dabei sind PI-Tiere, die durch Beprobung der noch statuslosen Jungrinder detektiert wurden,
miteinberechnet.
Merzung
Die BVD-Verordnung gibt vor, dass nur noch Tiere mit negativem BVD-Status gehandelt
werden dürfen und dass PI-Tiere unverzüglich zu töten sind. Die Tierseuchenkasse BadenWürttemberg gewährt für BVDV positive Kälber eine Merzungsbeihilfe in Höhe von max.
120 €. Seit Ende 2010 wird diese Beihilfe bereits nach einem positiven BVDV-Ergebnis
gewährt, da sich nur in 2 % der Nachuntersuchungen negative Ergebnisse ergaben und
damit der Anteil von transient infizierten Tieren bei erstpositiven Ohrstanzproben sehr gering
ist.
Das Verschleppungsrisiko hat seit Beginn der Pflichtbekämpfung stark abgenommen. Erste
Bekämpfungserfolge sind bereits sichtbar. Im letzten Quartal des Jahres 2011 konnte ein
Rückgang der Inzidenz der PI-Kälber auf 0,31 % registriert werden.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Ganz entscheidend für eine erfolgreiche BVD-Bekämpfung ist die schnelle Merzung der PITiere. Einer Auswertung der HIT-Daten zufolge haben im Jahr 2011 15 % der
diagnostizierten PI-Tiere den Bestand nicht innerhalb von 14 Tagen verlassen. Doch selbst
bei frühzeitiger Merzung der BVDV positiven Kälber kann eine BVD-Ausbreitung innerhalb
des Bestandes keinesfalls ausgeschlossen werden. Insbesondere in Beständen mit geringer
Durchseuchung besteht somit die Gefahr, dass durch jedes neue PI-Kalb weitere
frühträchtige Muttertiere infiziert und damit weitere PI-Kälber geboren werden. Seit der
Pflichtbekämpfung wird daher nicht selten eine Durchseuchung auf Raten beobachtet. Mit
Hilfe von Impfmaßnahmen kann dieses Risiko minimiert werden.
Impfprophylaxe
Seit einiger Zeit kontaktiert der Rindergesundheitsdienst der Tierseuchenkasse BadenWürttemberg in Absprache mit den zuständigen Veterinärämtern alle Betriebe, in denen das
erste BVDV-positive Kalb diagnostiziert wurde. Neben allgemeinen Informationen zu BVD
und der Empfehlung zur umgehenden Merzung des positiven Kalbes, wird diesen Beständen
auch die Feststellung der Bestandsdurchseuchung mittels serologischer Kontrolle einer
repräsentativen Stichprobe angeboten. Ergibt sich dabei eine Bestandsdurchseuchung von
unter 75 % erhält der Bestand eine Impfempfehlung. Liegt eine Impfempfehlung vor,
übernimmt die Tierseuchenkasse die Impfstoffkosten für die Grundimmunisierung.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Untersuchungen zum Vorkommen von Pestiviren bei Schalenwild
Wolfgang Gaede, Bernd Gehrmann, Susanne Kenklies, Nicolai Denzin
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin
Haferbreiter Weg 132 – 135, 39576 Stendal
Seit 2004 existiert in Sachsen-Anhalt ein verbindliches Programm zur Bekämpfung der BVDInfektion. Mittlerweile sind über 96 % der sachsen-anhaltinischen Rinderherden BVDunverdächtig. Nicht ganz geklärt ist ein möglicher Eintragsweg von BVDV über
Wildwiederkäuer. Um diesen Aspekt näher zu beleuchten, konnten 1485 Seren von
Wildwiederkäuern (Rehe, Rothirsche, Damhirsche, Mufflons) aus dem BTV-Monitoring von
2007 bis 2010 genutzt und mit einem BVD-Antikörper-ELISA (IDEXX) untersucht werden.
Die Verteilung der ELISA-positiven Ergebnisse variierte je nach Tierart und Herkunftsort.
Die räumliche Häufung von ELISA-positiven Wildtieren in der Harz-Region und im westlichen
Teil Sachsen-Anhalts korrelierte nicht mit der räumlichen Verteilung der PI-Tiere in den
Rinderbeständen, welche öfter im östlichen Teil Sachsen-Anhalts auftraten.
Dieses Ergebnis deutet nicht auf einen Zusammenhang von PI-Rindern und möglichen
Pestivirus-Infektionen bei Wildwiederkäuern hin.
Um die Ergebnisse des ELISAs zu bestätigen und eventuell einen Hinweis auf die Identität
des unter den Wildwiederkäuern kursierenden Pestivirus’ zu finden, wurden einige der
Proben im Virusneutralisationstest untersucht.
Nach Rücksprache mit dem FLI wurden zunächst zwei verschiedene Border-Disease-Viren
(BDV-2 und BDV-3) als Testvirus verwendet. Nachdem gegen diese Viren keine Antikörper
gefunden werden konnten, wurden BVD NADL und zwei aktuelle BVD-Isolate aus SachsenAnhalt getestet.
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8. Stendaler Symposium
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Epidemiologische Bedeutung des aktiven und passiven
Impfschutzes in BVD-unverdächtig werdenden Herden:
Ergebnisse zur transienten Infektion mit Virusausscheidung nach
Challenge von Kälbern mit maternalen Impfantikörpern aus
Bovidec-geimpften Muttertieren.
Klaus Teich1, Judith Johanna Friedrich1, Joe Brownlie2
1
Virbac Tierarzneimittel GmbH, Bad Oldesloe (DE)
2
The Royal Veterinary College, London (UK)
Die PI-Tier-Diagnostik an Ohrstanzproben hat sich als sicher und effektiv in der
Früherkennung von BVDV-Dauerausscheidern erwiesen. Dennoch werden bis zur PI-KalbEliminierung, auch wenn keine Bestätigungsuntersuchung nach 28 Tagen erfolgt, neue
transiente Infektionen bei den Stallgefährten unter den Saugkälbern gesetzt. Neben
wirtschaftlichen Schäden durch die immunsuppressiven Eigenschaften des BVDV bei
infizierten Tieren (Respiratorische und Magendarm-Erkrankungen), kommt es zur
Amplifizierung und Ausscheidung des BVDV durch die transient infizierten Stallgefährten.
Die zeitlich begrenzte Ausscheidung und die geringen Ag-Mengen lassen betroffene
Tiergruppen nicht einheitlich durchseuchen. Es kommt zu einer schrittweisen aber
kontinuierlichen Weitergabe des Virus von Tier zu Tier, wodurch gerade in den größer
werdenden Einheiten, unabhängig vom Vorhandensein eines PI-Tieres, BVDV über lange
Zeit in den Betrieben vagabundieren kann. Je nach Aufstallungsform kann es dabei auch zur
Rückübertragung in den Kuhbestand kommen. Die Gefahr der Rückübertragung für den
eigenen Bestand wächst, "je freier" ein Bestand wird, d.h. mit Abstand zur letzten PITiermerzung. Je nach Remontierungsrate wächst mangels erneuten Ag-Kontakts eine BVDnaive Tierpopulation nach, die ohne die natürlich erworbenen Antikörper die Weitergabe
transienter Infektionen begünstigt. Da die gezielte Cut-Off-Anhebung der Ohrstanzdiagnostik
bewusst das Erkennen transienter Infektionen verhindert, können Betriebe per definitionem
lange Zeit BVD-unverdächtig bleiben und doch transiente BVDV-Infektionen im Bestand
zirkulieren. Neben dem Risiko erneuter PI-Entstehung und wirtschaftlicher Verluste durch
Immunsuppressionen, wird ein solcher Betrieb nicht BVD-frei werden. Transient infizierte
Tiere stellen durch den Tierkontakt innerhalb des Bestandes, aber epidemiologisch viel
bedeutsamer, auch zwischen den Beständen ein stetes Risiko für eine Ansteckung und
Übertragung dar.
BVD-Impfmaßnahmen sollen einen fetalen Schutz vermitteln, d.h. im Falle der akzidentellen
Infektion eines tragenden Muttertieres die vertikale intrauterine Infektion des Fetus
verhindern. Daneben gewinnt die generelle Herabsetzung der Empfänglichkeit der Herden
für transiente Infektionen im Verlauf des BVD-Bekämpfungsprogrammes zunehmend an
Bedeutung (s.o.). Bovidec (Fa. Virbac) ist der einzige BVD-Inaktivat-Impfstoff der bereits eine
frühe Impfung der Jungtiere ab dem 3. Lebensmonat zu diesem Zwecke erlaubt.
Vakzinationen vor der 12. Lebenswoche interferieren mit möglichen maternalen Antikörpern
und bauen daher nicht immer verlässlich eine Grundimmunität auf, die sich später durch
einfache Jahresimpfungen boostern lässt.
Allerdings stellt sich die Frage, ob diese maternalen Antikörper qualitativ wie quantitativ in
der Lage sind, Kälbern aus Bovidec-geimpften Kühen auch einen passiven Schutz vor einer
Belastungsinfektion zu vermitteln und damit die Weitergabe von transienten Infektionen aus
epidemiologischem Gesichtpunkt heraus einzudämmen vermag.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
In der vorliegenden Studie wurden dazu zwei Gruppen von BVDV-seronegativen tragenden
Färsen gebildet. Während die Impfgruppe 8 und 5 Wochen vor der Abkalbung mit der 4 ml
Standarddosis Bovidec (Virbac) s.c. geimpft wurde, verblieb die 2. Färsengruppe ungeimpft
(Kontrolle). Die Kälber beider Gruppe erhielten die Möglichkeit innerhalb von 24 Stunden
nach ihrer Geburt Kollostrum ihrer eigenen Mutter aufzunehmen. Spätestens am 32.
Lebenstag wurden alle Kälber mit einem zum Impfstoff heterologen Challenge-BVDV
intranasal belastungsinfiziert. Alle Kälber wurden klinisch, hämatologisch, serologisch und
virologisch in einem Beobachtungszeitraum von bis zu 28 Tage beobachtet und untersucht.
Es werden die Titerverläufe bei Müttern und Kälbern gezeigt und in Bezug auf die anderen
Parameter diskutiert. Die Immunsuppression (Leukopenie) und Fieber waren bei den
Kontrollkälbern im Vergleich zur Bovidec-Gruppe sehr viel deutlicher ausgeprägt. Die
Virämie und die BVDV-Ausscheidung über die Nasenschleimhaut waren signifikant kürzer
und geringgradiger ausgeprägt bei Kälbern Bovidec-geimpfter Mütter als in der
Kontrollgruppe. Das Virusausscheidungspotenzial (Anzahl Ausscheider x Ausscheidungstage) wurde durch die Bovidec-Mutterschutzimpfung in der Hochträchtigkeit um mehr als
80 % reduziert.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Zehn Jahre BSE – eine Abschätzung der entstandenen Kosten
Carolina Probst1, Jörn Gethmann1, Rolf Heuser2, Harald Niemann3,
Franz J. Conraths1
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, 16868 Wusterhausen
Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz, 53123 Bonn
3
Servicegesellschaft Tierische Nebenprodukte mbH, 53113 Bonn
In Deutschland wurde der erste Fall von Boviner Spongiformer Enzephalopathie (BSE) bei
einem im Inland geborenen und aufgezogenen Rind am 26.11.2000 festgestellt. Seitdem
sind in Deutschland 413 BSE-Fälle aufgetreten. Insbesondere die Sorge, dass der BSEErreger auch die neue Variante der Creutzfeld-Jakob-Krankheit verursacht, führte zur
Etablierung einer Reihe von präventiven Maßnahmen in nationalen und EU-weiten
Rechtsvorschriften. Diese reichten von der Einführung der Untersuchungspflicht und des
Systems zur Kennzeichnung und Registrierung von Rindern bis hin zur Unterbrechung eines
seit Jahrzehnten praktizierten Nährstoffkreislaufs.
Ziel dieser Studie ist die Abschätzung der Kosten, die in Deutschland zwischen November
2000 bis Dezember 2010 durch die Maßnahmen zur BSE-Bekämpfung und -Vorbeugung
entstanden sind. Im Vortrag wird insbesondere auf die durch folgende Maßnahmen
verursachten Kosten eingegangen:
• die aktive BSE-Überwachung von Schlachtrindern und Risikotieren mittels Schnelltest
sowie
• die Maßnahmen im Schlachthof und im Herkunftsbetrieb nach Bestätigung eines BSE
Falles (Vernichtung potentiell kontaminierter Schlachtkörper derselben Schlachtlinie;
Epidemiologische Untersuchungen sowie Tötung und Entsorgung von
Kohortentieren).
Ersten Abschätzungen zufolge beliefen sich die Kosten für die aktive BSE-Überwachung auf
ungefähr 600 Millionen Euro. Für die Tötung und Entschädigung der 17.265 Rinder, die im
Rahmen der BSE-Tilgung gekeult wurden, hatten die Tierseuchenkassen Ausgaben von
insgesamt rund 22 Millionen Euro. Die Kosten für die Vernichtung von Schlachtkörpern der
betroffenen Schlachtcharge betrugen ca. 3 Millionen Euro und der Aufwand für die
epidemiologischen Untersuchungen in den Herkunftsbetrieben etwa 1 Million Euro.
Weitere BSE bedingte Kosten ergaben sich durch das Verbot der Verfütterung von tierischen
Proteinen (und bis Juli 2009 auch von Fetten) an zur Lebensmittelerzeugung gehaltene
Tiere, die obligatorische Entfernung des Spezifizierten Risikomaterials von für den
menschlichen Verzehr geschlachteten Rindern, die unschädliche Entsorgung von Kategorie
1 Material, die Einführung der obligatorischen Etikettierung von Rindfleisch, die Anpassung
und Überwachung der Einhaltung von BSE bedingten Rechtsvorschriften, die Förderung der
BSE-Forschung und nicht zuletzt die in den Jahren 2001/2002 durchgeführte Aufkaufaktion
von Rindern im Alter über 30 Monate.
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8. Stendaler Symposium
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Blauzungenkrankheit in Deutschland – Ein (Rück-) Blick – Teil 1:
Epidemiologie und finanzielle Auswirkungen
Jörn Gethmann1, Bernd Hoffmann2, Carolina Probst1, Martin Beer2,
Franz J. Conraths1
1
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Seestr. 55, 16868 Wusterhausen / Dosse
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
Am 21. August 2006 wurde in Deutschland der erste Fall von Blauzungenkrankheit amtlich
festgestellt. Der Ausbruch wurde durch ein BTV vom Serotyp 8 (BTV-8) verursacht. Bis Ende
des Jahres 2006 wurden 890 Ausbrüche gemeldet. Die Bekämpfungsmaßnahmen
konzentrierten sich dabei auf die Einrichtung von Restriktionsgebieten in Verbindung mit
Verbringungsbeschränkungen und den Schutz von Rindern und Schafen vor den Vektoren.
Trotz umfangreicher Untersuchungen, konnte die Einschleppungsursache bisher nicht
ermittelt werden.
Im Mai 2007 trat die Krankheit wieder auf und breitete sich bis Ende des Jahres mit
insgesamt 20.811 in TSN gemeldeten Ausbrüchen über fast ganz Deutschland aus.
Besonders bei Schafen führte die Blauzungenkrankheit zu hohen Verlusten. So wurden laut
Auskunft der Tierseuchenkassen der Länder für das Jahr 2007 Entschädigungsanträge für
etwa 10 240 Rinder und 33 323 Schafe gestellt.
Wegen der hohen Anzahl an erkrankten und gestorbenen Tieren sowie den dadurch
verursachten wirtschaftlichen Schäden wurde Anfang 2008 auf europäischer Ebene
beschlossen, gegen BTV-8 zu impfen. Nachdem eine in Mecklenburg-Vorpommern
durchgeführte Studie die Sicherheit und Wirksamkeit der inaktivierten Impfstoffe gezeigt
hatte, wurde ab Mai 2008 verpflichtend geimpft. Dabei mussten grundsätzlich alle Rinder,
Schafe und Ziegen gegen BTV-8 immunisiert werden.
Insgesamt breitete sich die Blauzungenkrankheit im Jahr 2008 langsamer aus als 2007,
dennoch wurden von Mai bis Dezember 3.067 BTV-8 Ausbrüche bei Rindern, Schafen und
Ziegen gemeldet.
Im Jahr 2009 ging die Anzahl der in TSN gemeldeten Ausbrüche weiter zurück; so wurden
von Januar bis April 2009 133 Ausbrüche festgestellt und von Mai bis Dezember nur noch
zwölf. Der letzte Ausbruch von BTV-8 wurde am 17. November 2009 gemeldet.
In den Jahren 2009 und 2010 mehrten sich Berichte über Impfschäden durch die
Blauzungenkrankheit, wie Fertilitätsprobleme, Milchrückgang und weiteren Symptomen, die
an eine Infektion mit der Blauzungenkrankheit erinnern. In einer Studie konnte jedoch nicht
nachgewiesen werden, dass sich diese Symptome auf die Impfungen zurückführen lassen.
Ab 2010 wurde die Pflichtimpfung auf eine freiwillige Impfung umgestellt. Dies führte zu einer
deutlichen Reduzierung der Anzahl von geimpften Tieren.
Da die serologischen und virologischen Monitoring-Untersuchungen in den Jahren 2010 und
2011 weder bei Haus- noch bei Wildwiederkäuern einen Hinweis auf eine Viruszirkulation
ergaben, erklärte sich Deutschland in Übereinstimmung mit Artikel 6 Absatz 2 der
Verordnung (EG) Nr. 1266/2007 mit Wirkung vom 15. Februar 2012 als frei von
Blauzungenkrankheit. Die Restriktionszone für BTV-8 wurde mit gleichem Datum
aufgehoben.
Insgesamt hat die Blauzungenkrankheit Bekämpfungskosten von mehr als 200 Millionen
Euro verursacht. Dabei waren die beiden größten Kostenfaktoren die durch die Infektion
verursachten Schäden sowie die Aufwendungen im Zusammenhang mit der Impfung.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
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Blauzungenkrankheit in Deutschland – Ein (Rück-) Blick Teil 2:
Diagnostik und Pathogenese
Bernd Hoffmann1, Jörn Gethmann2, Michael Eschbaumer1, Franz J. Conraths2,
Martin Beer1
1
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Virusdiagnostik, Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Seestr. 55, 16868 Wusterhausen / Dosse
Zur sicheren Labordiagnostik der Blauzungenkrankheit stehen geeignete serologische und
molekulare Untersuchungsverfahren zur Verfügung. Nach Einführung der verpflichtenden
BTV-8-Impfung im Jahre 2008 wurden serologische Nachweisverfahren in der
Routinediagnostik nur noch begrenzt eingesetzt, obwohl sich diese durch hervorragende
Sensitivitäts- und Spezifitätswerte auszeichnen. Es wurden kompetitive und Doppel-AntigenELISA zum Nachweis von BTV-AK im Serum und Plasma sowie ein indirekter BTV-ELISA
zum Nachweis von entsprechenden AK in der Milch zugelassen. Durch die Verminderung
des Anteils von feldinfizierten- und geimpften Tieren in der Gesamtpopulation wird die
serologische BTV-Untersuchung in den kommenden Jahren wieder mehr an Bedeutung
gewinnen.
Im Gegensatz dazu wurden die molekulargenetischen BTV-Untersuchungstechniken
besonders in der Zeit der aktiven BTV-Ausbrüche angewendet, da aufgrund der langen
Virämiephase von bis zu 200 Tagen eine akute Infektion mittels PCR detektierbar ist. Das
NRL-BT hat verschiedene real-time RT-PCR-Systeme (RT-qPCR) und RT-PCR-Verfahren
zur Erkennung und Charakterisierung aller 26 Serotypen von BTV entwickelt bzw. etabliert.
Den regionalen Untersuchungsämtern stehen zugelassene RT-qPCR kits zur Verfügung, die
alle etablierten BTV-Serotypen sehr sensitiv und spezifisch erkennen.
Nach Ausbruch der Blauzungenkrankheit vom Serotyp 8 in Europa wurden umfangreiche
Forschungsergebnisse generiert, die zusammen mit den BTV-Erfahrungen weltweit neue
Erkenntnisse und Einblicke auf dem Gebiet der Orbiviren erbracht haben. Dies beinhaltet
insbesondere Erkenntnisse zur Wirksamkeit und Sicherheit von inaktivierten BTV-Vakzinen
und Methoden zur Identifizierung und Charakterisierung von Orbiviren und deren Antikörper.
Darüber hinaus wurden die in Europa zur Verbreitung von BTV verantwortlichen Vektoren
erfasst, mögliche Überwinterungsstrategien des Blauzungenvirus in Europa identifiziert und
neue Erkenntnisse zur Pathogenese der Erkrankung gewonnen. Die Forschungsergebnisse
des FLI und anderer Institutionen werden vorgestellt und diskutiert.
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8. Stendaler Symposium
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Untersuchung zum Vorkommen von Antikörpern gegen BTV-8 bei
Rotwild, Rehwild, Damwild und Muffelwild in den Jahren
2008 – 2012 für das Bundesland Nordrhein-Westfalen
Mark Holsteg1, Walburga Lutz2, Ralf Jungblut3, Birgit Jahn4, Arno Piontkowski5
1
Tiergesundheitsdienst der Landwirtschaftskammer NRW,
Siebengebirgsstraße 200, 53229 Bonn
2
Forschungsstelle für Jagdkunde und Wildschadensverhütung,
Pützchens Chaussee 228, 53229 Bonn
3
Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Arnsberg, Zur Taubeneiche 10 -12, 59821 Arnsberg
4
5
Landesamt für Natur, Umwelt- und Verbraucherschutz NRW, Leibnizstr. 10, 45659 Recklinghausen
Ministerium für Klima-, Umwelt, Landwirtschaft und Natur- und Verbraucherschutz des Landes NRW,
Schwannstr. 3, 40476 Düsseldorf
Einleitung:
Die Blauzungenkrankheit hat in den Nutztierbeständen in NRW im Jahre 2006/2007 zu
erheblichen Leiden geführt und in den betroffenen Betrieben große wirtschaftliche Schäden
verursacht. Aus diesem Grund ist im Jahr 2008 eine flächendeckende Impfung der
Hauswiederkäuer durchgeführt worden. Durch die Impfung wurde die Möglichkeit der
Überwachung von BTV-8 über eine serologische Untersuchung der Nutztierbestände stark
eingeschränkt. Um trotzdem eine Aussage über die Verbreitung und das Vorkommen von
BTV-8 machen zu können, wurde vom FLI ein Wildtiermonitoring empfohlen. In NRW werden
seit dem Jagdjahr 2008/09 Blutproben von Wildwiederkäuern untersucht. Die
Probenentnahme erfolgte auf den Drückjagden direkt beim Aufbrechen der Tiere durch
Förster des Landesbetriebes Wald und Holz NRW. Die Untersuchung der Blutproben erfolgte
durch das staatliche Veterinäruntersuchungsamt Arnsberg.
Die im Rahmen dieser Untersuchung erhobenen Ergebnisse zum Vorkommen von BTV-8 bei
Wildwiederkäuer haben auch dazu beigetragen, dass Deutschland seit dem 15.02.2012
wieder BTV-8 frei ist.
Material und Methoden:
Im Zeitraum der Jagdjahre 2008-2012 wurden insgesamt 759 EDTA-Proben aus den
fünf Regierungsbezirken von Nordrhein Westfalen eingeschickt und auf Antikörper gegen
BTV-8 untersucht. Im Jagdjahr 2012 wurden insgesamt 230 EDTA-Blutproben eingeschickt.
Die Untersuchung der Proben erfolgte am staatlichen Veterinär Untersuchungsamt Arnsberg.
Die Feststellung der BTV-8-Antikörper (AK) erfolgte mittels ELISA (VMRD).
Ergebnisse:
BTV-8 Jagdjahre 2008-2012:
Das Vorkommen von BTV-8 Antikörpern unter den in NRW vorkommenden
Wildwiederkäuern ist inhomogen. Während das Rehwild mit zwei AK-positiven Tieren von
313 getesteten Proben nur sehr selten eine Serokonversion zeigt, ist das Rotwild als mit
16% seropositiven Tieren im Jahr 2008/09 deutlich empfänglicher. Die Seroprävalenz beim
Rotwild ist seit Beginn der Untersuchung kontinuierlich zurückgegangen und liegt aktuell bei
3% der Gesamtstrecke aus dem Jagdjahr 2011/12. Die Wildarten Muffelwild und Damwild
sind aufgrund der geringen Streckenzahlen nicht sehr aussagekräftig. Aber der Anteil
seropositiver Tiere ist ähnlich dem von Rotwild (siehe Tabelle). Die höchste Seroprävalenz
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
von 55% in einer Altersgruppe trat beim Rotwild im Jahr 2008/09 bei den Tieren auf, die zum
Zeitpunkt der Erlegung zwei Jahre oder älter waren.
Diskussion:
Die Ergebnisse des Monitorings auf BTV-8 zeigen, dass die Anzahl seropositiver Tiere
kontinuierlich abnimmt. Das Auftreten von Antikörpern bei Kälbern und Lämmern ist
wahrscheinlich auf den Nachweis von Kolostralen-AK zurück zuführen. Die Neuinfektionsrate
kann anhand der Seroprävalenz bei den einjährigen Stücken am sichersten abgelesen
werden. Hier zeigt sich, dass nur Tiere aus dem Geburtsjahrgang 2007 Antikörper gegen
BTV-8 aufwiesen. In den Folgejahren war diese Altersgruppe negativ. Betrachtet man die
Seroprävalenz beim Rehwild, zeigt sich, dass Rehwild für ein BTV-8 Monitoring ungeeignet
ist. Dies könnte mit der heimlichen Lebensweise des Rehwildes in kleinen Gruppen und der
Vorliebe der Gnitzen für bestimmte Tierarten (Bartsch et al., 2009) zusammen hängen. Eine
Zunahme der Todesfälle beim Rehwild durch eine BTV-8 Infektion, wie aus der Praxis immer
wieder berichtet wurde, kann anhand der unveränderten Anzahl geschossener und verendet
aufgefundener Rehe in den Jagdjahren 2005/06 bis 2008/09 nicht bestätigt werden (NRW
Fallwildberichte 2005 -2009).
Fazit:
Die Ergebnisse des BTV-8 Wildwiederkäuermonitorings zeigen, dass der Anteil seropositiver
Tiere kontinuierlich abnimmt. Dies kann auch auf die verpflichtende Impfung der
Hauswiederkäuer ab dem Jahr 2008 zurückgeführt werden. Die im Rahmen dieser
Untersuchung erhobenen Ergebnisse zum Vorkommen von BTV-8 bei Wildwiederkäuern
haben dazu beigetragen, dass Deutschland seit dem 15.02.2012 wieder BTV-8 frei ist.
Dr. Mark Holsteg
Landwirtschaftskammer Nordrhein-Westfalen
Referat 34 - Tiergesundheitsdienst
Siebengebirgsstraße 200
53229 Bonn
E-Mail: [email protected]
www.landwirtschaftskammer.de
Literatur beim Verfasser
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Das Schmallenberg-Virus
Erfolg für das Tierseuchenfrühwarnsystem in NRW
Mark Holsteg, Cordula Köß, Peter Heimberg
Tiergesundheitsdienst, Landwirtschaftskammer Nordrhein Westfalen,
Siebengebirgsstraße 200, 53229 Bonn
Einleitung:
Im Herbst 2011 häuften sich beim Rindergesundheitsdienst der Landwirtschaftskammer
Nordrhein-Westfalen zahlreiche Anfragen und Hinweise durch Milchviehhalter und Tierärzte
aus den Kreisen Wesel und Kleve in Nordrhein-Westfalen auf eine Erkrankung bei
Milchkühen, die mit starkem Milchverlust und Fieber einhergeht. Gleichzeitig wurden
ähnliche Beobachtungen in den Niederlanden gemacht, wobei dort eine wässrige Diarrhöe
im Vordergrund stand. Im Rahmen des TSK-finanzierten Tierseuchen-Frühwarnsystems in
NRW wurden Betriebe mit akuter Symptomatik durch den Rindergesundheitsdienst besucht
und Blutproben von betroffenen Tieren entnommen. Durch das Friedrich-Loeffler-Institut
konnten Infektionen mit Pestiviren, Blauzungen-Virus, Bovines Herspes Virus Typ 1, Maulund Klauenseuche, Enzootische Hämorrhagie der Hirsche, Rifttal-Fieber und bovinem
Ephemaral Fieber ausgeschlossen werden. Im weiteren Verlauf wurde durch das FLI ein
Orthobunyavirus aus dem Blut erkrankter Kühe isoliert (Hoffmann et al., 2011) und nach
Herkunft des Probenmaterials vorläufig Schmallenberg-Virus (SBV) genannt.
Klinik bei erwachsenen Rindern
Es wurden im betreffenden Zeitraum 5 Herden besucht und insgesamt 20 Blutproben
gezogen. Durch das FLI konnte bei 7 Tieren aus 4 Herden das Schmallenberg-Virus mittels
PCR nachgewiesen werden. Leitsymptome in diesen Herden waren starker
Milchleistungseinbruch um 50-80% und Fieber bei Einzeltieren bis zu 41°C über 3-5 Tage.
Die Herden waren inaktiv und einzelne Tiere stark abgeschlagen. Die Futteraufnahme der
gesamten Herde war unverändert. Diarrhöe konnte nur bei Einzeltieren festgestellt werden.
Die Kühe waren laut Besitzer nach 3-5 Tage wieder „fit“. Anhand der Milchleistungsdaten
aus zwei Betreiben mit AMS lässt sich eine Milchleistungsdepression von 12 – 17 Tagen
feststellen. Aufgefallene Tiere zeigen auch nach der Genesung eine verminderte
Milchleistung bzw. wurden vorzeitig trockengestellt. Erste serologische Tests zeigen, dass in
zwei der betroffenen Herden die Durchseuchung ca. 80% beträgt.
Klinik bei Kälbern
Hydranenzephalie (HA), Silly calve, dummy calve
Für Viren aus dem AKABANE-Komplex ist bekannt, dass bei einer Infektion zwischen dem
ca. 100 und 180. Trächtigkeitstag vermehrt Kälber mit Missbildungen des Gehirns oder
Verhaltensauffälligkeiten geboren werden. Am Niederrhein wurden von Dezember bis Ende
Februar nur vereinzelt Fälle von Verhaltensauffälligkeiten dem TGD gemeldet. Bei zwei von
zwölf untersuchten Tieren konnte SBV nachgewiesen werden.
Arthrogrypose (AG), Curly calves
Bei einer Infektion zwischen dem 70 – 100. Tag werden für AKABANE Arthrogryposen und
Hirnmissbildungen beschrieben. Die Geburt des ersten Kalbes mit AG war am 14.12.2011;
der totgeborene Zwilling zu diesem Kalb wurde im Bauchhöhlenpunktat positiv auf SBV
getestet. Danach wurden erst wieder Mitte Februar weitere Kälber mit AG geboren, wovon
bis zum 8. März 40% positiv getestet wurden. Die Variationen der Missbildungen sind sehr
vielfältig und mit denen des Schafes vergleichbar (sieh dort).
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Klinik bei Schafen
Seit Mitte Dezember 2011 wurde in NRW vermehrt über die Geburt von missgebildeten
Lämmern berichtet. Etwa 20 – 40 % der geborenen Lämmer in betroffenen Betrieben zeigten
verschiedene Ausprägungen des Arthrogrypose-Hydranenzephalie-Syndroms, d.h.
Versteifungen einzelner Gelenke an Vorder- und Hintergliedmaßen, Verkürzungen und
Deformationen der Gliedmaßen und der Wirbelsäule, Torticollis, Schädelverformungen,
Missbildungen am Hirn mit Hydrocephalus internus und evtl. Augenmißbildungen.
Die Tiere waren zum größten Teil bei der Geburt vollständig entwickelt, aber tot. Einige
lebten, zeigten jedoch Veränderungen an einzelnen Gelenken und neurologische Störungen
wie ataktischen Gang, Koordinationsstörungen und Orientierungslosigkeit. Solche Tiere
verendeten selbst bei intensiver Pflege nach spätestens sechs Wochen.
Bei den Müttern der Tiere waren keine oder nur milde Symptome wie unspezifische
Mattigkeit oder Durchfall während der akuten Infektionen im Herbst sichtbar. Bei der Geburt
hatten die Mütter solcher Tiere jedoch Probleme, die Lämmer zur Welt zu bringen, mitunter
kam es zu gravierenden uterinen und vaginalen Verletzungen bis hin zu Uterusperforationen,
die in der Folge zum Exitus führten. U.U. war es notwendig, Fetotomien oder Sectiones
caesareae durchzuführen.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Aktuelle Informationen zum Infektionsgeschehen mit dem
Schmallenberg-Virus
Martin Beer1, Horst Schirrmeier1, Dirk Hoeper1, Kerstin Wernike1, Mark Holsteg2, Ralf
Jungblut3, Michael Eschbaumer1, Franz J. Conraths4, Bernd Hoffmann1
1
Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems
2
Landwirtschaftskammer Nordrhein-Westfalen, Siebengebirgsstraße 200, 53229 Bonn
3
Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Arnsberg, Zur Taubeneiche 10 -12, 59821 Arnsberg
4
Institut für Epidemiologie, Friedrich-Loeffler-Institut, Seestraße 55, 16868 Wusterhausen
Im Sommer und Herbst 2011 wurden vermehrt Proben von Milchkühen an das Institut für
Virusdiagnostik am Friedrich-Loeffler-Institut (FLI), Insel Riems, gesandt. Hoftierärzte und
betroffene Landwirte vermuteten die Rückkehr der Blauzungenkrankheit. Nachdem eine
ganze Reihe von Erregern ausgeschlossen werden konnte, gelang der Nachweis eines
neuen Virus aus der Familie der Bunyaviridae aus Blutproben von drei Milchkühen aus
einem Bestand nahe der Stadt Schmallenberg.
Der als „Schmallenberg-Virus“ benannte Erreger gehört zur sogenannten Simbu-Serogruppe
innerhalb des Genus Orthobunyavirus. Seine Verwandtschaft zu dieser Serogruppe, zu der
neben mehr als 20 anderen Viren auch das ausgeprägt teratogen wirkende Akabane-Virus
gehört, ließ befürchten, dass die eigentliche Auswirkung der Infektionswelle des Sommers
und Herbstes 2011 erst noch bevorsteht.
Seit Dezember 2011 werden auch missgebildete Lämmer und Kälber beobachtet, die meist
die typischen Veränderungen des Arthrogrypose-Hydranencephalie-Syndroms zeigen.
Solche Fälle wurden auch aus Holland, Belgien, Frankreich, Großbritannien, Spanien, Italien
und Luxemburg gemeldet. Seit März 2012 ist die Erkrankung in Deutschland meldepflichtig,
und bisher wurden bereits mehr als 1200 Fälle erfasst. Die Übertragung des SchmallenbergVirus erfolgt durch Insekten-Vektoren, wobei Gnitzen eine besondere Rolle zukommt.
In den bisherigen Untersuchungen des Erregers am Friedrich-Loeffler-Institut wurden
beispielsweise die Gesamtgenomsequenz erstellt und mit anderen Sequenzen verwandter
Viren verglichen, erste Infektionsversuche an Rindern durchgeführt, Gnitzen aus dem Jahr
2011 analysiert und serologische Untersuchungen zur Prävalenz der Infektion durchgeführt.
Ergebnisse daraus sollen ebenso wie die bisherigen Erkenntnisse zur Verbreitung und Klinik
zusammenfassend vorgestellt und diskutiert werden.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erste Validierungsdaten für den
ID Screen® Schmallenberg Virus Indirect ELISA
Loic Comtet1, Kristine Klewer1, Horst Schirrmeier2, Martin Beer2, Philippe Pourquier1
1
2
IDvet, 167 rue Mehdi Ben Barka, 34070 Montpellier, France
Friedrich-Loeffler Institut, Inst. f. Virusdiagnostik, Am Südufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems
Einleitung
Schmallenberg Virus (SBV) ist der vorläufige Name eines neuen Vektor-übertragenen
Orthobunyavirus, das im November 2011 erstmals vom Friedrich-Loeffler-Institut identifiziert
wurde. Dieses Virus verursacht zunächst eine relativ milde Klinik (Durchfälle, Fieber,
Rückgang der Milchleistung, kann aber bei trächtigen Tieren zu erheblichen kongenitalen
Missbildungen, Frühgeburten und Störungen im Fruchtbarkeitsgeschehen führen. Betroffen
sind vor allem Wiederkäuer.
Das Virus wurde seitdem in mehreren europäischen Ländern festgestellt (Niederlande,
Belgien, Frankreich, England, Luxemburg, Italien, Spanien, ...) und scheint sich rasant
ausgebreitet zu haben.
Serologische Tests sind von grosser Bedeutung, um die Ausbreitung dieser neuen Krankheit
untersuchen und kontrollieren zu können.
Spezifische Antikörper gegen das SBV können mittels Serumneutralisationstests (SNT) und
indirekter Immunofluoreszenz (IF) nachgewiesen werden, aber diese Methoden sind
zeitaufwendig und schwer standardisierbar.
Material und Methoden
ID Vet bietet seit März 2012 den ersten SBV Antikörper ELISA an, den ID Screen®
Schmallenberg virus Indirect ELISA. Dieser Test erlaubt den Nachweis von Antikörpern in
Serum und Plasma von Wiederkäuern und ermöglicht mit Hilfe der Automatisierung die
Untersuchung einer grossen Probenanzahl.
Ergebnisse
In ersten Validierungsuntersuchungen zeigte der ELISA ein exzellente Spezifät und eine
sehr gute Korrelation mit SNT und IF.
Folgenden Daten werden vorgestellt :
•
•
•
Daten zur Korrelation mit anderen serologischen Methoden
Daten zur Spezifität an Proben, die vor 2010 genommen wurden
Daten zur Serokonversion an experimentell infizierten Tieren
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Epidemiologische Untersuchungen zur Verbreitung von
Fasciola hepatica- und Dictyocaulus viviparus-Infektionen
bei Milchrindern in Deutschland
B. Kürpick1, A.-M. Schunn1, C. Strube1, T. Schnieder1, C. Staubach2, F. J. Conraths2
1
Tierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Parasitologie, Bünteweg 17, 30559 Hannover
2
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für Epidemiologie, Seestr. 55, 16868 Wusterhausen
Im Jahre 2008 wurden 19944 Tankmilchproben von Rindern aus verschiedenen Regionen
Deutschlands auf Antikörper gegen Fasciola hepatica und Dictyocaulus viviparus untersucht.
Die Ergebnisse wurden genutzt, um die Betriebe, aus denen die Proben stammten, als
infiziert oder nicht einzustufen. Die Betriebe selbst blieben anonym, lediglich die Postleitzahl
des Betriebssitzes stand für geografische Analysen zur Verfügung.
Im Rahmen der epidemiologischen Analyse der Daten wurde die Seroprävalenz basierend
auf den Ergebnissen der Tankmilchuntersuchungen für die Postleitzahlenbezirke geschätzt,
aus denen Untersuchungsergebnisse vorlagen. Mögliche Einflüsse von Landnutzung (Anteil
von Grün- und Ackerland, Wald und Wasserflächen je Postleitzahlenbezirk), Witterung
(Temperatur, Niederschlag) und Rinderdichte sowie die Wechselwirkung der beiden
Parasiten wurden zunächst durch bivariates Testen und dann durch schrittweises Eliminieren
von Variablen in einem Generalized Linear Mixed Model statistisch analysiert.
Die Ergebnisse der Untersuchungen zeigen, dass sowohl F. hepatica- als auch D. viviparusInfektionen bei Milchrindern in Deutschland weit verbreitet sind. Besonders stark betroffen
sind der Nordwesten Niedersachsens und Schleswig Holstein. F. hepatica-positive Betriebe
fanden sich beispielsweise auch in Gebieten, die in der ehemaligen DDR als saniert galten.
Als statistisch signifikante Einflussfaktoren auf die F. hepatica- und D. viviparusSeropositivität in der Tankmilch erwiesen sich in dem endgültigen Generalized Linear Mixed
Modell die Variablen Grünland- und Wasseranteil an der Fläche des Postleitzahlenbezirks.
Im Ergebnis ist festzuhalten, dass F. hepatica- und D. viviparus-Infektionen bei Milchrindern
im Untersuchungsgebiet, das große Teile Deutschland umfasste, nahezu überall vorkamen,
wenn auch in sehr unterschiedlicher Prävalenz. Maßnahmen zum Schutz der Tiere vor
Infektionen wurden offenbar nicht mehr ergriffen oder zeigten keine hinreichende Wirkung.
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8. Stendaler Symposium
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Clostridium perfringens Typ A als Verursacher schwerster
Puerperalstörungen bei der Milchkuh? – ein Fallbericht
Hans-Peter Klindworth
Rindergesundheitsdienst Niedersachsen, Bezirksstelle Bremervörde, Landwirtschaftskammer
Niedersachsen, Albrecht-Thaer-Str. 6a, 27432 Bremervörde
Die Beteiligung von Clostridium perfringens Typ A an verschiedenen Infektionsgeschehen
wird schon seit längerem diskutiert (Rose u. Edgar, 1936; Macrae et al., 1943; Niilo, 1980;
Ferrarezi et al., 2008). Im Vordergrund stehen dabei Gasödem- bzw. gangränbildung,
Lebensmittelvergiftungen beim Menschen und gastrointestinale Erkrankungen. Seit der
Erstbeschreibung von Anderson (1991) haben sich Berichte über das Vorkommen einer
speziellen Darmerkrankung, dem „Hemorrhagic bowel syndrom“, gehäuft (Rademacher et
al., 2002; Abutarbush u. Radostis, 2005; Forsberg u. Wang, 2006; Hacker u. Schwagerick,
2009). Laut Ceci et al (2006) sind an der Entstehung der Erkrankung maßgeblich Cl. perf.
Typ A, β2-positiv, und der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus beteiligt.
Bislang liegen, soweit den Autoren bekannt, keine Berichte über die eindeutige Beteiligung
von Cl. perf. Typ A bei Genitalinfektionen des Rindes vor. Recht wenige postulieren
überhaupt eine Beteiligung von nicht näher typisierten Cl. perf. So beschrieben
Alessandreşcu et al. (2009) Cl. perf. und E. coli als Verursacher letaler septischer Schocks
nach stümperhaft induzierten Aborten beim Menschen; eine emphysematöse Pyometra mit
befundeten Cl. perf. bei einem Hund wurden durch Hernandez et al. (2003) erwähnt. Als
einzige Autoren haben Drillich et al. (2001) beim Rind den Fund von Cl. perf. bei toxischen
Endometritiden beschrieben. Aus der Gießener Klinik für Geburtshilfe (Direktor Prof. H.
Bostedt) liegt die erstmalige Beschreibung einer Vestibulovaginitis mit Myometritis beim
graviden Schaf vor (Klein et al. 2007). Die Autoren geben als Hauptverursacher Cl.
perfringens Typ A, β2-negativ, an.
Der hier beschriebene Betrieb wird seit über 10 Jahren durch den RGD Niedersachsen
bestandsbetreut. Vor dem Auftreten der spezifischen Krankheitserscheinungen zeichnete
sich der Betrieb durch überdurchschnittliche Leistungskennziffern aus. Haltung und
Fütterung waren zu keiner Zeit wesentlich zu beanstanden. Ab dem 11.2.2010 zeigten
jedoch plötzlich alle Tiere nach der Abkalbung einen recht einheitlichen und typischen
Krankheitsverlauf. Nach zunächst unauffälliger Geburt und i. d. R. unproblematischem
Abgang der Eihäute fielen etwa 2-3 Tage p.p. plötzlich Milchleistung und Fresslust rapide ab.
Ausnahmslos alle Kalbinnen wiesen gleichzeitig eine hochgradige jauchig-stinkige
Lochiometra mit toxämisch gestörtem Allgemeinbefinden auf, die therapeutisch nur schwer
zu beeinflussen war. Lediglich durch wiederholte hochdosierte Gaben (20-40 g) von
Tetracyclinstäben und intrauteriner Spülungen mit Streptomycin/Penicillin (100 ml Mastipen
comp.) gelang eine den Umständen entsprechende zufriedenstellende Stabilisierung. Nach
dem Einsatz einer stallspezifischen Vakzine traten, zumindest bei den Mehrkalbskühen,
deutlich geringer ausgeprägte Symptome auf. Die Färsen wurden daher zusätzlich,
unmittelbar nach stattgefundener Kalbung, 4-5 Tage unter allgemeiner Antibiose (Amoxicillin)
gehalten, so daß auch hier nur noch abgeschwächte Symptomatik zu sehen war. Vom
Haustierarzt wurden zudem bei einigen Tieren gastrointestinale Störungen mit Aufgasungen
im Darmbereich diagnostiziert. Es traten mehrere perakute Todesfälle auf, zahlreiche Tiere
wurden eingeschläfert. Von fünf erkrankten Tieren sind sowohl Einzelkot- als auch
Cervixtupferproben im RIPAC-Labor, Potsdam, untersucht worden. In allen fünf Kotproben
gelang der Nachweis von Cl. perf. Typ A, β2-negativ, sowie von nicht weiter differenzierten
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Schimmelpilzen. Zudem wurden in jeweils drei Proben pathogene E. coli-Stämme und A.
pyogenes nachgewiesen. Aus der Cervix gelang bei jeweils drei Tieren der Nachweis der
gleichen Clostridien wie aus den Kotproben und von A. pyogenes. Desweiteren wurde eine
uneinheitliche Mischflora gefunden (v. a. Clostridium sporogenes, Bacillus spp., Strepto/Mikrokokken), die zum Teil auch in der Cervix nachgewiesen wurden.
Ebenfalls auffällig waren Durchfallerkrankungen am 2-3 Lebenstag im Kälberbereich mit
einer hohen Mortalitäts- und Letalitätsrate. Dem Krankheitsgeschehen vorgeschaltet
gewesen war ein etwa ein Jahr andauernder subtiler Abfall der Milchleistung und ein Anstieg
der Zellzahlen. Im weiteren Laktationsverlauf ist eine ungewöhnlich starke Häufung eitriger
Arthritiden,
insbesondere
an
den
Sprunggelenken,
aber
auch
vermehrte
Gewebeabszeßbildung aufgefallen.
Clostridium
perfringens
Typ
A
ist
als
(Mit-)
Verursacher
schwerster
Gebärmutterentzündungen
und
Puerperalstörungen
zu
berücksichtigen.
Ein
Infektionsgeschehen mit diesem Erreger kann in landwirtschaflichen Betrieben schnell
existenzbedrohende Ausmaße erreichen.
Autor:
Dr. Hans-Peter Klindworth, RGD der LWK Niedersachsen,
Email: [email protected]
Literatur:
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http://www.dvg.net/avid/methoden/clostridium%20perfringens-iii-1994.pdf (Stand: 03/2011)
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Alessandrescu, D zitiert von Biris, M, Moldovan, M, Pascut, D und Motoc, A, 2009, Uteroadnexal damage in septic abortion. Histopathological study on 91 cases.
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Carelli, G, 2006, Haemorrhagic bowel syndrome in dairy cattle: Possible role of Clostridium
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Ferrarezi, MC, Cardoso, TC und Dutra, IS, 2008, Genotyping of Clostridium perfringens
isolated from calves with neonatal diarrhea. Anaerobe 14, 328–331
Forsberg, NE und Wang, Y, 2006, Nutrition and immunity in dairy cattle: Implications to
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Hernandez, JL, Besso, JG, Rault, DN, Cohen, AH, Guionnet, A, Begon, D und Ruel, Y,
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Klein C, Wehrend, A, Weiss, R und Bostedt, H, 2007, Eitrig-ulzerierende Vestibulovaginitis
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Rademacher, G, Lorenz, I und Hänichen, T, 2002, Jejunumanschoppung mit koaguliertem
Blut infolge blutender Darmulzera bei Kühen. Tierärztl Umschau 57, 399-411
Rose, AL und Edgar, G, 1936, Enterotoxemic jaundice of sheep and cattle.
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Akute Pasteurellose bei Rindern, Wildwiederkäuern und Schweinen
Elisabeth van der Grinten
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin,
Haferbreiter Weg 132, 39576 Stendal
Im Sommer 2010 kam es in Sachsen-Anhalt und Brandenburg zu einer Serie von zeitlich und
räumlich eng beieinander liegenden, perakuten Todesfällen bei Damwild, Rindern und
Schweinen. Es handelte sich in allen Fällen um eine akute Pasteurellose, hervorgerufen
durch Pasteurella multocida vom Kapseltyp B, dem Erreger der hämorrhagischen
Septikämie. Diese Krankheit war jahrzehntelang nicht mehr in Deutschland aufgetreten und
ist heute überwiegend in tropischen Gebieten endemisch. Das klinische und pathologische
Bild variierte zwischen den Spezies, wurde aber in den meisten Fällen von fehlender
Symptomatik mit Ausbildung einer hämorrhagischen Diathese geprägt. Unter den Rindern
waren Jungrinder in extensiver Haltung betroffen, die Kontakt zu infiziertem Damwild hatten.
Epidemiologische Betrachtungen auf Basis der Untersuchungsergebnisse von verendeten
Tieren und Tupferproben klinisch gesunder Rinder und Wildwiederkäuer im Krankheitsgebiet
und darüber hinaus, ergaben schlussfolgernd, dass Carriertiere innerhalb der Dam- und
Rehwildpopulation als Erregerreservoir in Frage kommen und der Ausbruch u. a. durch
anhaltend trockene Hitze des Sommers ausgelöst wurde.
Die Krankheit wurde erfolgreich durch antibiotische Therapie bekämpft.
Der Vortrag stellt den Verlauf der Krankheit unter Berücksichtigung epidemiologischer
Überlegungen dar.
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Molekularer Nachweis von Mycobacterium spp. bei Rind und
Rotwild in Bayern
J. Domogalla, E. M. Gerstmair, F. Sedlmaier, S. Gellert, M. Müller,
R. Straubinger, M. Büttner
Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL),
Veterinärstr. 2, 85764 Oberschleißheim
Der molekularbiologische Nachweis von DNA Präsenz der Erreger aus dem Mycobakterien
Tuberculosis Komplex (MTC) im Gewebe in Form einer real-time PCR ist die einzig schnelle
Diagnostikmöglichkeit bei der amtlichen Fleischuntersuchung, da ein MycobakterienIsolierungsversuch in Kultur erst nach 8 Wochen als negativ abgeschlossen werden darf.
Allerdings bleibt die Kultivierung weiterhin der aktuell sensitivste Nachweis in der
Tuberkulosediagnostik. Die empfohlene quantitative real-time PCR des Nationalen
Referenzzentrums detektiert alle MTC Spezies durch dualen Nachweis der hypothetischen
Helikase (Heli) und des Insertionselements (IS 1081). Ein Vergleich dieser PCR mit einem
kommerziellen real-time PCR Kit (artus M. tuberculosis TM PCR Kit, Qiagen) wurde nach
einem Lymphknoten Spike-Experiment durchgeführt. Es wurden keine Unterschiede in der
DNA Nachweisbarkeit festgestellt. Die Mykobakterien-Kultur bestätigte die Ergebnisse
weitgehend. Darüber hinaus wurde eine konventionelle PCR eingesetzt, die die Präsenz des
Gyrase (gyrB)-Gens spezifisch für den MTC nachweist und ein 1020bp langes PCR
Fragment für die Sequenzierung liefert.
Das Hauptproblem in der Tuberkulosediagnostik ist die heterogene Verteilung der
Mycobakterien im Gewebe und damit die Trefferwahrscheinlichkeit bei der Entnahme
geringer Gewebemengen für die DNA-Extraktion. Um die Wahrscheinlichkeit des
Nachweises zu erhöhen, muss möglichst viel Probenmaterial für die Anzucht und DNAExtraktion verwendet werden. Zur optimalen Homogenisierung größerer Gewebestücke, z.B.
ganzer Lymphknoten, wurde ein ULTRA-TURRAX® (IKA) erprobt.
Nach unseren Erfahrungen ist bezüglich der Tuberkuloseinfektionen der Rinder mit M. bovis
oder M. caprae ein deutliches Nord-Süd-Gefälle zu erkennen. Im Süden Deutschlands
überwiegen die durch M. caprae hervorgerufenen Fälle nicht nur beim Rind sondern auch
beim Rotwild. In einer 2009 bis 2010 durchgeführten Studie am LGL wurden insgesamt 332
Rothirsche aus zwei Jagdsaisonen von Oktober 2009 bis Dezember 2010 in den
Landkreisen Oberallgäu, Ostallgäu und Bad Tölz-Wolfratshausen untersucht. Bei zwei Tieren
aus dem Landkreis Oberallgäu und bei einem aus dem Landkreis Bad Tölz-Wolfratshausen
konnte M. caprae nachgewiesen werden. Interessant war, dass auch aus makroskopisch
völlig unverändertem Gewebe (non visible lesion, NVL) bei einem Tier M. caprae DNA
nachgewiesen wurde und ein Isolat aus der Kultur gewonnen werden konnte. Die
Differenzierung der Mycobakterien-Spezies in der Routinediagnostik wird am LGL aus
Flüssigkulturmaterial mit dem GenoType MTBC Assay (Hain Lifescience) durchgeführt. Im
Rahmen eines EU-Projekts (http://tb-alpine-wildlife.org) wird seit Mai 2011 zusammen mit
den Alpenländern Österreich, Italien und Schweiz am LGL die Verbreitung der Tuberkulose,
u. a. bei Rotwild, in der Alpenregion weiter untersucht.
Bisher isolierte M. caprae Stämme wurden durch Spoligotyping (Prof. Prodinger, Innsbruck)
in einen Karwendel-, einen Allgäu- und einen Lechtal-Typ (Tirol) gruppiert. Begonnene
Sequenzierarbeiten am Genzentrum der LMU sollen weiteren Aufschluss zur Identität und
Epidemiologie der bayerischen M. caprae Isolate geben.
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Zelluläre Immunreaktionen gegen Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis beim Kalb – Vergleich zwischen experimenteller
Infektion und Exposition unter Feldbedingungen
Christian Menge1,2, Philip S. Bridger1, Hakan Bulun1, Simone Schillinger1,
Rolf Bauerfeind1
1
2
Institut für Hygiene & Infektionskrankheiten der Tiere, Frankfurter Str. 85-89, 35392 Gießen
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese, Naumburger Str. 96a, 07743 Jena
Einleitung
Die Erkennung von Rindern, die mit Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP)
infiziert sind, ist in der frühen Phase der Infektion bislang schwierig. Aufgrund der Pathobiologie der MAP-Infektion kann man vermuten, dass der Nachweis zellulärer Immunreaktionen eine frühere Diagnosestellung ermöglicht als andere Verfahren der direkten oder
indirekten Infektionsdiagnostik. Als fakultativ intrazellulärer Erreger induziert MAP zunächst
vor allem eine zellvermittelte Immunreaktion, die durch die Expansion von eine Zunahme an
MAP-spezifischen T-Zellen gekennzeichnet ist. Erreger-spezifische CD4+ T-Zellen
sezernieren bei erneutem Antigenkontakt (z. B. in vitro) Interferon-gamma (IFN-γ). Der
Nachweis von IFN-γ im Überstand von in vitro-stimulierten Blutproben (Interferon-γ release
assay; INRA) ist prinzipiell dazu geeignet, positive Tiere ab dem 2. Lebensjahr zu
identifizieren. Die Spezifität dieses Tests wird aber bei Jungtieren durch starke individuelle
Unterschiede und die unspezifische Bildung von IFN-γ durch andere Immunzellen erheblich
eingeschränkt. Der Nachweis der IFN-γ-Bildung auf Einzelzellebene verbunden mit einer
Typisierung der reagierenden Zellen lässt daher eine Steigerung der Spezifität und
Sensitivität erwarten. Alternativ könnten MAP-spezifische T-Zellen auch an oberflächlichen
Aktivierungsmarkern (z. B. CD25) zu erkennen sein.
In einem vom BMELV geförderten Forschungsverbund (Förderkennzeichen 28-1-32.006-06)
wurden neue Verfahren erprobt, die eine sensitive und spezifische Diagnostik von MAPInfektionen möglichst schon im Kälberalter ermöglichen sollten. Dabei wurden drei auf der
Durchflusszytometrie (DFZM) basierende Tests zum Nachweis MAP-spezifischer T-Zellen
entwickelt und auf ihre Eignung geprüft:
• DFZM-IFN-γ-Test zur Detektion MAP-spezifischer IFN-γ-bildender CD4+ T-Zellen
• DFZM-CD25-Test zur Detektion MAP-spezifischer CD4+/CD45RO+ T-Gedächtniszellen
• Kombinierter DFZM-IFN-γ/CD25-Test zur Detektion MAP-spezifischer CD4+ T-Zellen
Studiendesign
Zunächst erfolgte die Validierung der Methoden an experimentell mit MAP infizierten Kälbern
(Longitudinalstudien). Hierzu wurden 20 Holstein-Friesen-Kälber aus vier MAP-unverdächtigen Herden bezogen. In diesen waren zuvor alle weiblichen Rinder im Alter über 24
Monate serologisch und bakteriologisch (PCR und Kultur) mit negativem Ergebnis getestet
worden. Sieben Kälber dienten als Kontrolltiere, 13 Kälber wurden zu zwei Infektionsgruppen
zusammengestellt. Die Versuche wurden konsekutiv, beginnend mit der Kontrollgruppe
(Longitudinalstudie 1, LS 1), durchgeführt. Am 10., 12. und 14. Lebenstag wurden die Kälber
der Infektionsgruppen (LS 2 und LS 3) mit insgesamt 1 x 109 KbE/Tier des MAP-Stammes
K10 oral inokuliert. Die Kälber der Kontrollgruppe wurden scheininokuliert. Positive Befunde
bei den regelmäßig durchgeführten PCR-Tests und kulturellen Untersuchungen von intra
vitam gewonnenen Bioptaten aus ileozaekalen und jejunalen Lymphknoten bestätigten, dass
die Inokulationen zu Infektionen geführt hatten. Zur Analyse der zellulären Immunreaktion
wurden Blutproben in 4- bis 8-wöchigen Abständen gewonnen. Schließlich wurden die neuen
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Tests in Form einer Querschnittstudie (QS) im Feld getestet. Dazu wurden 32 Kälber in
8 MAP-positiven und 15 Kälber in 3 MAP-negativen Betrieben am 100. ± 10 Lebenstag und
am 200. ± 30 Lebenstag beprobt. Aus den Blutproben wurden mononukleäre Leukozyten
(PBMC) isoliert und in vitro über sechs Tage mit Ganzzelllysaten aus MAP bzw. M. phlei
(MP) restimuliert. Danach wurden die intrazelluläre IFN-γ-Produktion in CD4+ T-Zellen oder
die Expression von CD25 auf der Oberfläche von CD4+/CD45RO+, CD8+/CD45RO+, γδ-TZellen und NK-Zellen quantifiziert. Antigenspezifische Reaktionstiter wurden auf die mit MP
induzierten Reaktionstiter der Probe normalisiert. Cut-Off-Werte für die Unterscheidung
zwischen negativ und fraglich sowie zwischen fraglich und positiv wurden anhand des
95 %igen bzw. 99 %igen Quantils aus den Werten der Kontrolltiere (LS 1) berechnet.
Vollblutproben wurden regelmäßig auch im INRA (BOVIGAM®-Test) gemäß den Vorgaben
des Herstellers untersucht. Bei der Auswertung wurde jedoch die Reaktion auf M. bovis-PPD
als Kalibrator benutzt.
Einsatz der Methodik bei experimentell infizierten Kälbern
DFZM-IFN-γ-Test
In der Kontrollgruppe (LS 1) reagierte ein Kalb in fünf Proben (12., 16., 20., 28. und 52.
Woche post infectionem [W. p. i.]) falsch-positiv bzw. falsch-fraglich. In der ersten
Infektionsgruppe (LS 2) erzielten insgesamt 74,6 % aller Proben ab der 16. W.p.i. positive
oder fragliche Ergebnisse. In der 28., 32., 40. und 52. W. p. i. reagierten alle infizierten Tiere
positiv oder fraglich. In der zweiten Infektionsgruppe (LS 3) reagierten nur in der 16. W. p. i.
alle sechs infizierten Kälber positiv oder fraglich, damit aber 12 Wochen früher als in LS 2.
Insgesamt wurden 46,7 % aller Proben ab der 16. W. p. i. als positiv oder fraglich erkannt. Im
INRA reagierten 72,2 % aller Proben der LS 2 und 58,3 % aller Proben der LS 3 ab der
16. W.p.i. positiv oder fraglich. Allerdings wurden in demselben Zeitraum auch 25,4 % aller
Proben der Kälber aus der LS 1 falsch-positiv oder falsch-fraglich getestet. Im DFZM-IFN-γTest war dies bei weniger als 5,0 % (entspricht dem 95 %igem Quantil) der Proben der Fall.
DFZM-CD25-Test
Anhand der CD25-Expression auf CD4+/CD45RO+ T-Zellen wurden in LS 2 ab der
16. W. p. i. 97 % der Blutproben als positiv oder fraglich erkannt. Bereits ab der 12. W. p. i.
reagierten drei von fünf Kälbern positiv. Die Reaktionstiter fielen zum Ende der
Untersuchungsperiode ab, dennoch blieb die Mehrzahl der Werte im positiven Bereich. In
der LS 3 wurden 61,7 % aller Proben ab der 16. W. p. i. positiv getestet. In der 12., 16., 20.,
28. und 52. W. p. i. war die Nachweisquote am höchsten (jeweils 5/6 infizierten Kälbern).
Kombinierter DFZM-IFN-γ/CD25-Test
In der LS 3 reagierten 60,0 % bzw. 61,7 % aller Proben ab der 16. W. p. i. bezüglich der IFNγ-Bildung bzw. der CD25-Expression bei CD4+ Zellen positiv oder fraglich. In der 12., 16.,
20., 32. und 48. W. p. i. reagierten Proben von jeweils 5/6 Kälbern positiv oder fraglich.
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Einsatz der Methodik im Feld (Querschnittstudie)
In der Querschnittstudie wurden der DFZM-CD25-Test und der kombinierte DFZM-IFNγ/CD25-Test evaluiert. Bei der Untersuchung der Kälber in MAP-positiven Betrieben mit dem
DFZM-CD25-Test reagierten in der 1. Beprobung (ca. 100. Lebenstag) alle Kälber negativ
und in der 2. Beprobung (ca. 200. Lebenstag) drei Tiere (10 %) fraglich. Die Tiere aus den
MAP-negativen Betrieben waren zu beiden Zeitpunkten testnegativ. MAP-spezifische
Immunantworten waren auch nicht in den MAP-positiven Betrieben nachweisbar, wenn die
Kälber zum 100. Lebenstag auf IFN-γ-bildende CD4+ T-Zellen untersucht wurden. In der
zweiten Probe reagierten drei von diesen Tieren (10 %) positiv bzw. fraglich, aber auch ein
Jungrind (6,6 %) in den MAP-negativen Betrieben. Wurde die CD25-Expression auf CD4+
Zellen als Marker herangezogen, reagierten in der ersten Probe ein Tier der MAP-positiven
Betriebe positiv sowie jeweils ein Kalb in den MAP-negativen Betrieben positiv und fraglich.
In der zweiten Probe hatten ein Tier (3,3 %) der MAP-positiven Betriebe einen positiven und
alle Tiere der MAP-negativen Betriebe negative Befunde. Im INRA reagierten bei der 1.
Beprobung nur ein Tier aus den MAP-positiven Betrieben positiv und alle Kälber aus den
MAP-negativen Betrieben negativ. Bei der zweiten Beprobung wurden neun testpositive
Kälber (30 %) in den MAP-positiven Betrieben festgestellt. Ein Kalb (6,6 %) in einem MAPunverdächtigen Betrieb reagierte ebenfalls positiv.
Schlussfolgerungen
Die Untersuchungen bestätigen, dass die immunologische Auseinandersetzung des Rindes
mit oral aufgenommenen MAP-Bakterien selbst mit modernsten Methoden erst Monate nach
der Infizierung messbar wird. Im Gegensatz zur Serologie, die erst ab 24 Lebensmonaten
zufriedenstellende Ergebnisse erbringt, lassen sich, zumindest unter experimentellen
Bedingungen, mit DFZM-basierten Methoden MAP-spezifische T-Zellen sensitiv und
spezifisch bereits 16 Wochen nach der Infektion nachweisen. Der Nachweis zellulärer
Immunreaktionen mit dem technisch weniger aufwändigen DFZM-CD25-Test war sensitiver
als der Nachweis der IFN-γ-Bildung auf Einzelzellebene. Beide Tests waren dabei
spezifischer als der INRA. Unter Feldbedingungen konnten mit den DFZM-basierten
Methoden nur wenige Reagenten detektiert werden. Dies galt besonders für die Beprobung
am 100. Lebenstag. Am 200. Lebenstag präsentierte sich der INRA zwar als sensitivster
Test, doch belegen die Ergebnisse der experimentellen MAP-Infektion und auch die
publizierten Daten anderer Autoren seine unbefriedigende Spezifität. Dagegen ermöglichen
es die DFZM-basierten Methoden, MAP-Infektionen auch bei Tieren unter 24 Monaten
spezifisch zu detektieren. Weitere Entwicklungsarbeit ist allerdings erforderlich, um ihre
Sensitivität dieser Methoden zu verbessern. Die Kombination der bereits vorhandenen MAPDiagnostik mit den neuen DFZM-basierten Tests könnte zukünftig die Grundlage für ein
effizienteres Diagnoseschema zur Bekämpfung der bovinen Paratuberkulose sein.
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Praktikabilität und Aufwand der Map-Sanierung in großen
Milchbetrieben – Ergebnisse einer Langzeitstudie in M-V
Christine Komorowski1, Klim Hüttner2, Frank Rehbock4, Ulrike Hacker3, Heidemarie
Heyne5, Kerstin Müller6
1
Landkreis Rostock, Regionalstandort Bad Doberan, VLA, August-Bebel-Str. 3, 18209 Bad Doberan.
2
Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern,
Epidemiologischer Dienst, Thierfelder Str. 19, 18059 Rostock.
3
Tierseuchenkasse M-V, RGD, Neustrelitzer Straße 120, Block C, 17033 Neubrandenburg
4
Landesforschungsanstalt für Landwirtschaft & Fischerei, ITP,
18196 Dummerstorf/ Kessin, Kirchweg 3
5
Min. für Landwirtschaft, Umwelt und Verbraucherschutz M-V, Tierseuchenreferat, 19048 Schwerin
6
Freie Universität Berlin, FB Veterinärmedizin, Klinik für Klauentiere, Königsweg 65, 14163 Berlin
Hintergrund der Map-Langzeitstudie
Mit der Aufnahme durch das OIE in die Liste B der Erkrankungen mit sozio-ökonomischer
Bedeutung erhielt die Bekämpfung der Paratuberkulose einen neuen Stellenwert.
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (Map) stellt demnach nicht nur eine
Gefahr für Rinder und andere Wiederkäuer dar, sondern kann als Zoonoseerreger nicht
sicher ausgeschlossen werden. Die Infektion ist in ihrer Kombination eines anfänglich schwer
erkennbaren Krankheitsverlaufes, einer unzureichenden Labordiagnostik und einer
fehlenden Therapie am erkrankten Tier einzigartig.
Seitens des Landes wurde hinterfragt, inwiefern eine Map-Sanierung in Rinderbeständen ab
20% serologischer Einzeltierprävalenz inkl. des Auftretens klinischer Map-Fälle praktikabel
und effektiv ist. In der Konsequenz wurde ein Langzeitversuch im Rahmen einer klinischen
Studie in vier großen Milchbetrieben auf den Weg gebracht.
In diesem Zusammenhang wurden zwischen Januar 2003 und Dezember 2009 14.222 Kühe
aus diesen Betrieben einbezogen. In die Statistik gingen die Untersuchungsergebnisse von
Tieren ein, die zwischen dem 01.01.2000 und dem 31.12.2006 geboren wurden.
Mehrfachbefunde bildeten die Basis für graduell unterschiedlich definierte Statusvarianten
(V1-V4ök), innerhalb derer die Tiere als Map-positiv, fraglich oder negativ klassifiziert wurden.
Die Milchbetriebe erfuhren eine spezielle Beratung und wurden regelmäßig besucht, um die
Umsetzung eines definierten Maßnahmekataloges (siehe Poster) abzusichern. Die Kosten
für den diagnostischen Aufwand wurden durch den Betrieb, die Tierseuchenkasse und das
Land zu je einem Drittel übernommen.
Wichtige Ergebnisse
Prävalenzentwicklung
Zu Versuchsbeginn lag der Anteil Map-positiv und Map-fraglich zugeordneter Tiere des
Geburtsjahrgangs 2000 zwischen 54% und 74%. Zum Ende des Versuchs liegen diese
Anteile für Tiere des Jahrgangs 2006 zwischen 12% und 50%. Je nach Map-Statusvariante
bedeutet dies eine Steigerung des Anteils negativer Tiere über den Versuchszeitraum für alle
Betriebe von 41,4% (V1) bzw. 23,5% (V3).
Map-Nachkommenstatus
Die Senkung der Map-Muttertierprävalenz führte über ein definiertes Kolostrummanagement
auch bei den Nachkommen zur Verminderung der Anzahl Map-positiver Befunde. Betrug der
Anteil, der als Map-positiv eingestuften Nachkommen von positiven Müttern des
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Geburtsjahrgangs 2003 noch 4,7%, so sank dieser Anteil bis zum Geburtsjahrgang 2006 auf
1,4%. Dagegen stieg der Anteil Map-negativer Kälber aus positiven Müttern analog von 7,0%
auf 16,6%. In der subjektiven Wahrnehmung der Betriebsleiter sank im selben Zeitraum die
Zahl klinisch auffälliger Tiere.
Map-Leistungsassoziation
In der statistischen Analyse konnte der Nachweis signifikanter Unterschiede zwischen MapBefundstatus und Leistung erbracht werden. Bei Map-negativen Tieren liegen in der
stringenten Statusvariante V3 der Laktationswert und der BSK-Wert als standardisierte
Milchleistungsparameter höher als die Map-positiver bzw. -fraglicher Tiere. In der univariaten
Analyse zeigen Map-negative Tiere verglichen mit positiven bzw. fraglichen Tieren signifikant
höhere durchschnittliche Gesamtmilchleistungen in der Statusvariante V3. Altersabhängige
Vorteile Map-negativer Tiere zeigen sich analog bei der durchschnittlichen Laktations-, als
auch Fett- und Eiweißleistung.
Eine Verzerrung von Leistungsdaten erfolgt jedoch dadurch, dass in allen Betrieben Mappositive Tiere häufig bereits bei Verdacht zügig aus dem Bestand verbracht werden.
Andererseits werden viele der als Map-positiv eingestuften Tiere nicht klinisch krank bzw.
zeigen häufig trotz dieses Status eine hohe Leistung und gute Kondition, was den Haltern die
Entscheidung schwer macht, solche Tiere zu merzen.
Grundsätzlich werden bei den einzelnen Parametern teils widersprüchliche Ergebnisse
deutlich, welche durch die Charakteristik der diagnostischen Methoden und schließlich durch
eine generell sehr hohe Datenstreuung geprägt waren. Auch die darauf basierende
betriebswirtschaftliche Analyse aller Tiere mit einer abgeschlossenen Lebensleistung
erbrachte keine eindeutigen ökonomischen Vorteile Map-negativer gegenüber Map-positiven
Tieren. Diese Beobachtung steht auch im Zusammenhang mit der geringen
durchschnittlichen Lebensdauer der Kühe von weniger als drei Laktationen, welche durch
frühzeitige Merzung aufgrund von Euterentzündungen, Fruchtbarkeitsstörungen und
Lahmheiten bedingt ist. Sollten die Bemühungen um eine höhere Nutzungsdauer von
Hochleistungsmilchkühen Früchte tragen, ist zu erwarten, dass die Paratuberkulose als
Wirtschaftsfaktor zukünftig eine größere Rolle spielen wird, da die Tiere dann ein Alter
erreichen, bei dem die Klinik deutlicher in Erscheinung tritt.
Fazit
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass der Erfolg von Sanierungsmaßnahmen in hohem
Maße davon abhängt, ob der Katalog von Hygiene- und Managementmaßnahmen
diszipliniert und fortdauernd erfüllt wurde oder nicht.
Nachweisbare Map-Prävalenzsenkungen sind frühestens nach zwei Kuhgenerationen zu
erwarten. Aufgrund der hohen Abgangsraten aus anderen Gründen zögerten die Landwirte,
klinisch unauffällige Map-infizierte Tiere aus dem Bestand zu entfernen. Darüber hinaus stellt
der Preisdruck in der Milchviehhaltung, im Verbindung mit einem durchweg knapp
bemessenen Personal in den Betrieben einen begrenzenden Faktor dar.
Landesweite Sanierungsprogramme lassen sich effektiv nur umsetzen, wenn in den
einzelnen Betrieben eine regelmäßige und qualifizierte Beratung durch geschulte Tierärzte
unter Einbindung aller Betriebsmitarbeiter angeboten wird.
Der Bericht des Map-Landesprogramms M-V steht in Form einer Dissertation im Internet unter
http://www.diss.fu-berlin.de/diss/receive/FUDISS_thesis_000000025734 zur Verfügung.
Korrespondenz bitte über [email protected].
- 123 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Paratuberkulose: Thüringer Bekämpfungsprogramm –
eine Fünf-Jahres-Bilanz
Stefanie Söllner-Donat und Karsten Donat
Thüringer Tierseuchenkasse, Victor-Goerttler-Straße 4, 07745 Jena
Im Frühjahr 2008 wurde mit der mit der Neufassung des „Programms zur Bekämpfung der
Paratuberkulose in den Rinderbeständen in Thüringen vom 26. März 2008 (ThürStAnz Nr.
16/2008 S.556)“ eine neue Etappe in der Bekämpfung dieser endemischen und chronisch
verlaufenden Rinderkrankheit begonnen.
Kernpunkte des Programms sind:
• Verhinderung der Infektion von Jungtieren
• Senkung des Infektionsdrucks in infizierten Herden
• Verbringungsregeln
• Statusdefinition
Die Etablierung von Hygienemaßnahmen zur Verhinderung der Infektion von Jungtieren ist
Schwerpunkt der Beratungstätigkeit der Tierärzte des Rindergesundheitsdienstes. Die
Betriebe werden nach einer strukturierten Erfassung des Hygienestatus in ihrem Bestand
individuell beraten, um die Hygieneregime und Bekämpfungspläne betriebsspezifisch
auszurichten.
Dabei
liegt
das
Bestreben
darin,
gemeinsam
mit
dem
Landwirt und seinem betreuenden Tierarzt solche Maßnahmen festzulegen, die einerseits
die hygienische Situation in Bezug auf die Bekämpfung der Paratuberkulose verbessern und
andererseits in der Arbeitsroutine des Herdenmanagements eingehalten werden.
Schwerpunkte sind:
• Abkalbehygiene
− saubere Abkalbeplätze für alle Kühe
− getrennte Abkalbeplätze für MAP-positive Kühe
− schnellstmögliche Trennung von Kuh und Kalb
• Tränke- und Fütterungshygiene
− Kälber mit sauber gewonnenem Erstkolostrum der eigenen Mutter versorgen, soweit
nicht MAP-Ausscheider
− Mischmilchen ausreichend erhitzen
− kein Grobfutter von beweidetem Dauergrünland an Kälber füttern
• Haltungshygiene
− bestmögliche räumliche Trennung des Kälberbereiches vom Kuhbereich
− hohe Personalhygiene der Kälberbetreuer
− gesonderte Arbeitsgeräte im Kälberstall (kein Kuhkot)
Wesentliches Element der Bekämpfungsstrategie ist die Senkung des Infektionsdrucks in
der Herde insgesamt. Zum einen sinkt damit das Risiko der Erregerübertragung von den
Kühen auf die Kälber und zum zweiten ist bei genügend hohem Infektionsdruck auch eine
Infektion älterer Tiere möglich. Zur Erkennung der Ausscheider wird in Thüringen von jeder
Kuh des Bestandes einmal jährlich eine Kotprobe kulturell auf Mycobacterium avium ssp.
paratuberculosis (MAP) untersucht. Die Untersuchungszahlen und Befunde der Jahre 2007
bis 2011 sind in Tabelle 1 angegeben. MAP-positive Tiere sind schnellstmöglich zu merzen,
in der Regel innerhalb von 4 Wochen nach Zugang des Befundes. Für die meisten der
beteiligten Herden ist das zu leisten, lediglich in Herden mit einer hohen Inzidenz
- 124 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
MAP-positiver Rinder (>10 %) werden gesonderte Vereinbarungen getroffen, um die
Reproduktion des Bestandes nicht zu gefährden (in der Regel Besamungsstopp und
Abmelken).
Tabelle 1: Anzahl untersuchter Proben auf MAP in den Jahren 2007 bis 2011
Jahr
Probenanzahl [n]
positiv
[n]
positiv
[%]
negativ
[n]
n. a.
[n]
2007
19.203
1.069
5,6
17.623
510
2008
33.359
1.768
5,3
30.729
1.268
2009
28.337
1.247
4,4
25.787
1.303
2010
29.318
1.055
3,6
27.266
997
2011
30.063*
960
3,9
22.817
576
*Gesamtzahl der eingesandten Proben, 5.707 Proben noch in Arbeit
Da im Tierhandel eine Untersuchung auf Paratuberkulose wegen der Besonderheiten der
Pathogenese (lange Phase der Latenz, zu Beginn der Ausscheidungsphase intermittierende
Ausscheidung, Antikörperbildung erst in späteren Krankheitsstadien) am Einzeltier mit den
gegenwärtigen Methoden der Diagnostik intra vitam nicht zielführend ist, kann lediglich der
Bestandsstatus des Herkunftsbestandes bei zu handelnden Tieren eine gewisse Sicherheit
bezüglich des MAP-Infektionsstaud gewährleisten. Daher ist die Identifizierung und
Schaffung Paratuberkulose-unverdächtiger Rinderbestände eines der wesentlichen Ziele des
Thüringer Bekämpfungsprogramms. Die Anforderungen daran sind:
• jährliche kulturelle Untersuchung der Kühe und Zuchtbullen auf MAP
• keine MAP-positiven Befunde
• Überwachungszeitraum: mindestens 3 Jahre
• Einhaltung der Regeln zum Tierverkehr
In den letzten fünf Jahren konnten 19 Bestände diesen Status erreichen. Naturgemäß
können das nur solche Herden sein, in denen bisher kein MAP-Eintrag stattfand. Ehemals
MAP-positive Herden konnten bisher nicht diesen Status erreichen. Die Überwachung der
bisher anerkannten Herden erfolgt durch Weiterführung der kulturellen Untersuchung der
Kühe und Zuchtbullen auf MAP im Abstand von zwei Jahren. Alternative Verfahren sind
gegenwärtig in Erprobung. Im Zuge der Überwachungsuntersuchungen konnte kein
Erregereintrag in diese Herden festgestellt werden.
Problematisch für die Sanierungsbestände – und in viel stärkerem Maße für die
Paratuberkulose-unverdächtigen Bestände – ist die Einhaltung der Regeln zum
Tierverkehr. Im Programm ist festgelegt, dass nur Tiere aus Beständen mit gleichem oder
höherem Bestandsstatus in den Bestand verbracht werden dürfen, also z. B. in
Sanierungsbestände nur MAP-negative Tiere aus Sanierungsbeständen. Für die
Paratuberkulose-unverdächtigen Bestände bestehen daher nur sehr eingeschränkte
Möglichkeiten zum Tierzukauf. Insbesondere beim Zukauf von Deckbullen für
Mutterkuhherden seltenerer Rassen mussten daher Ausnahmen von dieser Regel gemacht
werden. Voraussetzung war jedoch, dass diese Bullen zweimal jährlich kulturell untersucht
werden.
- 125 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Für zahlreiche Rinderhalter kann die Erlangung des Status eines Paratuberkuloseunverdächtigen Bestandes nicht als mittelfristig erreichbares Ziel formuliert werden. Für
diese Betriebe geht es darum, die Inzidenz (neu MAP-positive Tiere im Verlauf eines Jahres)
im Bestand zu senken und somit die durch Paratuberkulose verursachten Verluste zu
minimieren. Von 22 Sanierungsbeständen, die seit 2008 regelmäßig untersuchen, konnte in
der überwiegenden Zahl der Bestände eine Senkung der Inzidenz erreicht werden (Tabelle
2).
Tabelle 2: Senkung der Inzidenz MAP-positiver Rinder im Verlauf der Jahre 2008 bis 2011
nach Klassen
Reduktion der Inzidenz
um mehr als 50 %
um 25 % bis 50 %
um weniger als 25 %
Anstieg der Inzidenz
Anzahl Bestände
7
7
4
4
Anteil Bestände
31,8 %
31,8 %
18,2 %
18,2 %
Damit konnte belegt werden, dass in mehr als der Hälfte der Herden im Verlauf einer
Rindergeneration die Neuerkrankungsrate um mehr als 25 % abnahm. Ursachen für die
Unterschiede zwischen den Herden werden gegenwärtig untersucht.
Schlussfolgerungen
Im Verlauf der letzten fünf Jahre war eine gute Akzeptanz des Thüringer Programms zur
Bekämpfung der Paratuberkulose erkennbar. Das Programm wird sowohl von den
Landwirten als auch den Landwirtschaftsverbänden mitgetragen.
Die betriebsspezifische Gestaltung der Hygienekonzeption als auch die Diagnostik auf der
Basis der kulturellen Untersuchung haben sich bewährt. Die Definition des Bestandsstatus
Paratuberkulose-unverdächtiger Rinderbestand nach dem Thüringer Programm wird
akzeptiert und birgt nach erster Einschätzung ausreichende Sicherheit. Es konnten bisher 19
unverdächtige Bestände identifiziert werden.
Mit den Bekämpfungsmaßnahmen ist in den meisten Beständen im Verlauf einer
Rindergeneration eine Senkung der Neuerkrankungsrate zu erreichen.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
A Voluntary Programme for the Risk-Based Management of
Paratuberculosis in UK Dairy Herds
Hannah L. Pearse
IDEXX Inc, One IDEXX Drive, Westbrook, Maine 04092, USA
This presentation describes a paratuberculosis engagement and management program in
milk recorded herds in the UK dairy industry commencing in 2008. The aim of the
programme is to encourage famers to understand their paratuberculosis risks and disease
status through completion of a disease risk assessment and to manage these risks to reduce
disease prevalence in the herd.
Utilising milk samples from routine herd recording and a commercial ELISA test (IDEXX) for
the detection of antibodies against Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis
(MAP), a paratuberculosis risk-based management programme was developed.
Milk samples are tested every three months during routine herd recording and storage of
consecutive lab results in the herd recording database along with traffic light scoring of cows
allows farmers to prioritise herd management protocols with the aim of reducing disease
prevalence. Herd status allows farmers to clearly understand likely future prevalence of
paratuberculosis if these risks are not managed effectively.
Farmers receive a consistent education program coordinated by DairyCo (farmer levy board
and the milk recording organisations, and delivered through industry partners using trained
consultant veterinarians.
The engagement program has progressed to more effective, veterinary led control plans
being applied in the UK. By using routine herd recording samples and regular testing as the
basis of the paratuberculosis control programme producers have access to a hassle-free and
cost effective system for the management of paratuberculosis leading to significant increase
in disease awareness and uptake in paratuberculosis control programmes in the UK dairy
industry.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Posterbeiträge
1.
A. Schwarzmaier, C. Sauter-Louis,
G. Seemann, E. Schwedinger,
A. Friedrich, K. Cußler
Bovine neonatale Panzytopenie (BNP) – Vorkommen in
Baden-Württemberg und Beziehung zu BVDBestandsimpfungen
2.
J. Küpper, H. Brandt, K. Donat,
U. Schau, G. Erhardt
Paratuberkulose: Erblichkeit und Einfluss auf
Milchleistungsparameter bei Dt. Holsteinkühen
3.
N. Kasnitz, H. Köhler, P. Möbius
Einfluss von Kulturmedien und Tierpassage auf die
Stabilität spezifischer Genommarker von Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis
4.
B. Fischer, A. Schliephake,
A. Schult
Zum Einfluss von Säurezusätzen in der Tränkmilch auf
den Keimgehalt des Kotes, die Durchfallhäufigkeit und
das Wachstum von Deutschen-Holstein Kälbern während
der ersten 14 Lebenstage
5.
K. Kerner, G. Walter, C. Menge,
H. Köhler
Nachweis reaktiver T-Zellen bei experimenteller Infektion
von Ziegen mit Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis (MAP)
6.
I. Fritsch, J. Kolb, H. Köhler,
D. Hillemann, M. Dünser,
M. M. Wittenbrink, P. Möbius
Untersuchungen zur Langzeitepidemiologie von
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Stämmen
aus Mitteleuropa
7.
W. Murmann, K. Danner, A. Maas
Erfahrungen aus der Paratuberkulosediagnostik am
CVUA Freiburg – Auswertung von Laborergebnissen von
1994 bis 2011
8.
S. Schillinger, P. S. Bridger,
T. Seeger, M. Fischer, C. Menge,
R. Bauerfeind
Erregerspezifische Antikörper als Indikatoren der MAPInfektion bei Kälbern und Jungrindern
9.
M. Schmidt, K. Eulenberger,
R. Pützschel
Erste Ergebnisse des Paratuberkuloseprogramms der
Sächsischen Tierseuchenkasse
10.
K. Hüttner, MAP-Arbeitsgruppe
Sanierungsempfehlungen und MAP-Maßnahmekatalog –
Hinweise für Milchviehhalter
M-V
11.
W.–I. Bock
Serologische und molekularbiologische Untersuchungen
zum Vorkommen des Bluetongue Virus (BTV) und von
Pestiviren in der Wildwiederkäuerpopulation im Freistaat
Thüringen (2007 – 2011)
12.
S. Bilk, C. Schulz, M. Fischer,
M. Beer, A. Hlinak, B. Hoffmann
Organverteilung von Schmallenberg Virus RNA in
missgebildeten Neugeborenen
Posterschau mit Anwesenheit der Autoren: Do., 10.05., 19.30 – 20.00 Uhr
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Bovine neonatale Panzytopenie (BNP) –
Vorkommen in Baden-Württemberg und Beziehung zu
BVD-Bestandsimpfungen
Albrecht Schwarzmaier1, Carola Sauter-Louis2, Gerd Seemann1
Elke Schwedinger3, Annette Friedrich2, Klaus Cußler3
1
Tierseuchenkasse Baden-Württemberg, Tiergesundheitsdienste,
Am Moosweiher 2, 79108 Freiburg und Schaflandstr. 3/3, 70736 Fellbach
2
LMU München, Klinik für Wiederkäuer, Sonnenstr. 16, 85764 Oberschleißheim
3
Paul-Ehrlich-Institut, Paul-Ehrlich-Str. 51-59, 63225 Langen
In Baden-Württemberg sind seit 2007 in insgesamt 47 Betrieben BNP-Fälle aufgetreten mit
einem Umfang von einem bis zu 18 erkrankten Kälbern im Betrieb. Die regionale Verteilung
der betroffenen Betriebe im Land ist sehr ungleichmäßig. In zwei Landkreisen im Nordosten
findet sich eine besondere Konzentration der Betriebe. Auch die regionale Verteilung der
PregSure®BVD -Impfbetriebe ist sehr unterschiedlich und weist zwei Schwerpunkte auf. Der
eine ist auffällig deckungsgleich mit dem BNP-Gebiet im Nordosten, der andere liegt
insbesondere in zwei Landkreisen im Südosten.
Aus 483 Betrieben, die zwischen 2004 und 2008 den Impfstoff PregSure®BVD eingesetzt
haben, sind von 45 Betrieben BNP-Fälle bekannt geworden. In den restlichen 11.535 Milchviehbetrieben des Landes, die ausschließlich andere BVD-Impfstoffe eingesetzt oder gar
nicht geimpft hatten, wurden nur aus 2 Betrieben klinische Fälle gemeldet. Dieser
Unterschied ist hochsignifikant.
Innerhalb der PregSure®BVD-Impfbetriebe haben die von der BNP betroffenen Betriebe im
Verhältnis deutlich mehr Impfungen (Grundimmunisierung plus Boosterimpfungen) durchgeführt - gemessen als Verhältnis der eingesetzten Impfdosen in Bezug auf die Zahl der
Rinder des Bestandes - als in den Nicht-BNP-Betrieben. Eine Bedeutung der Anzahl der
Impfungen bei den Muttertieren für das Auftreten von BNP-Kälbern ergibt sich auch bei der
Auswertung der Dauer der Bestandsimpfungen. Die betroffenen PregSure®BVD-Betriebe
haben mit durchschnittlich 3,5 Jahren signifikant länger geimpft als die nicht betroffenen mit
durchschnittlich 2,5 Jahren. Das geringere Vorkommen der BNP im südlichen Impfgebiet
scheint durch die im Mittel geringeren Jahre des Impfstoffeinsatzes im Süden (mit-)bedingt
zu sein.
- 131 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Paratuberkulose: Erblichkeit und Einfluss auf
Milchleistungsparameter bei Dt. Holsteinkühen
Julia Küpper1, Horst Brandt1, Karsten Donat2, Ute Schau2, Georg Erhardt1
1
Institut für Tierzucht und Haustiergenetik, Justus-Liebig-Universität, Ludwigstr. 21b, 35390 Gießen
2
Thüringer Tierseuchenkasse, Victor-Goerttler-Straße 4, 07745 Jena
Einleitung
Paratuberkulose erfolgreich zu bekämpfen erfordert eine komplexe Einflussnahme auf
krankheitsauslösende und krankheitsfördernde Faktoren. Neben der Identifizierung und
Merzung infizierter Tiere, sowie der Einwirkung auf das Herdenmanagement wird seit
längerem auch über die züchterische Beeinflussung der Paratuberkulose diskutiert. Dieses
wird jedoch nur dann möglich sein, wenn das Merkmal kostengünstig und möglichst sicher
erfassbar wird und vor allem eine Erblichkeit des Merkmals vorliegt. Daher war es das Ziel
der Untersuchungen Heritabilitäten für das Auftreten von Paratuberkulose bei Dt.
Holsteinkühen auf Basis der Kotkultur zu schätzen. Da die Einbußen in Verbindung mit
dieser Erkrankung sehr hoch sein können, bestand ein weiteres Ziel darin, die
wirtschaftlichen Auswirkungen der Paratuberkulose auf Milchleistungsparameter zu
quantifizieren.
Material und Methoden
Es wurden Daten von 11.185 Herdbuchkühen der Rasse Dt. Holstein in Thüringen
ausgewertet. Der MAP-Status der Tiere wurde in 2008 und 2009 mithilfe von Kotkulturen im
Rahmen des Sanierungsprogrammes der Thüringer Tierseuchenkasse ermittelt. Von diesen
11.185 Tieren wurden 1.218 Tiere als positiv und 10.067 Tiere als negativ getestet. Anhand
dieser Daten wurden mit dem Programm ASREML (Gilmour et al. 2009) Heritabilitäten
mittels Tiermodell geschätzt. Als fixe Effekte wurden der Betrieb und die Laktationsnummer
(1, 2, 3, 4, 5, ≥6) im Modell berücksichtigt. Zusätzlich wurde an einer Stichprobe von 316
positiven Tieren und 554 negativen Vergleichstieren der Einfluss des Paratuberkulosestatus
auf die Milchleistungsmerkmale (100 Tage Leistung und Gesamt Laktation 305 Tage)
geschätzt.
Ergebnisse
Die geschätzte Heritabilität des Merkmals des MAP-Status liegt bei 15,7%.
Abbildung 1 zeigt die Häufigkeiten der MAP-positiv getesteten Tiere nach Betrieb (1A) bzw.
Laktationsnummer (1B). Beide fixen Effekte haben einen statistisch hoch signifikanten
Einfluss auf den MAP Status.
- 132 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Laktationsnumme
r
Betrieb
(A)
(B)
Abb. 1 : Frequenz mittels Kotkultur ermittelter MAP positiver Kühe in Abhängigkeit vom
Betrieb (A) und Laktationsnummer (B).
Die Ergebnisse zu den verschiedenen Milchleistungsparametern und den Kot-positiven, bzw.
Kot-negativen Tieren sind in Tabelle 1 dargestellt. Sowohl für die Milchleistung wie auch für
die Proteinmenge und die gesamte Fettmenge konnten Signifikanzen gefunden werden.
Abbildung 2 zeigt, dass bei allen drei Merkmalen eine statistisch signifikant geringere
Leistung bei den positiven Tieren ermittelt wurde.
(A)
(B)
(C)
Abb. 2: Einfluss des MAP Status ermittelt durch Kotkultur auf verschiedene Milchleistungsmerkmale der gesamten Laktation in kg (A = Milch, B = Protein, C = Fett)
- 133 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Tab. 1: Geschätzten Signifikanzen der untersuchten Effekte auf die verschiedenen Milchleistungsparameter
MKG100
MKG
Fett kg
Fett kg
Fett %
100
Prot kg
Prot kg
Prot %
100
Betrieb
***
***
***
***
***
***
***
***
Laktationsnummer
***
***
***
***
***
***
***
***
MAP Status (Kotkultur)
*
**
n.s.
*
n.s.
*
**
n.s.
*= p≤0,05; ** = p ≤0,01; *** = p≤0,001
Diskussion
Die geschätzte Erblichkeit von 0,157 deckt sich mit den Ergebnissen von Gonda et al.
(2006), die in einer Studie an Amerikanischen Holsteins eine Heritabilität von 0,153 für die
MAP Empfänglichkeit basierend auf Kotuntersuchungen, für die Antikörperantwort
gegenüber MAP zwischen 0,091 und 0,159 und basierend auf beiden Tests von 0,102
schätzten. Auf der Basis serologischer Untersuchungen schätzten Hinger et al. (2008) bei Dt.
Holsteins mittels verschiedener Modelle Heritabilitäten von 0,052 bis 0,140, während
Mortensen et al. (2004) aufgrund von serologischen Milchuntersuchungen bei 11.525
Dänisch Holsteinkühen Heritabilitäten zwischen 0,09 und 0,10 schätzten. Auch wenn die
geschätzten Erblichkeiten in den einzelnen Studien aufgrund der unterschiedlichen
Schätzmethoden und der Unterschiede in der Merkmalserfassung nicht direkt vergleichbar
sind, liegen sie auf vergleichbaren Niveau und weisen auf einen additiven Geneffekt hin.
Die signifikanten Unterschiede in der Fett- und Proteinmenge zwischen den Kotkulturpositiven und negativen Tieren sind hauptsächlich auf den Unterschied in der Milchleistung
zurückzuführen, denn im Fett- und Proteingehalt gibt es keine signifikanten Unterschiede.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Erblichkeit gegenüber der Empfänglichkeit von MAP auf
Basis von Kotkulturen im mittleren Bereich liegt und somit höher ist als die auf der Basis
serologischer Untersuchungen. Damit stellt die Erregerdiagnostik in der Kotkultur ein geeignetes Merkmal für weitergehende tierzüchterische Maßnahmen dar, mit denen die
Empfänglichkeit gegenüber Paratuberkulose beeinflusst werden kann. Des Weiteren konnte
gezeigt werden, dass es bei Paratuberkulose positiven Tieren zu einer deutlichen
Reduzierung der Milchleistung kommt, was wiederum mit wirtschaftlichen Einbußen
verbunden ist.
Danksagung
Die Autoren danken besonders den Mitarbeitern der beteiligten Milchviehbetriebe aus Thüringen für die Hilfe bei
den Probenahmen und für die Bereitstellung der Abstammungsdatendaten der untersuchten Kühe, sowie den
Mitarbeitern der Thüringer Tierseuchenkasse und des Instituts für Tierzucht und Haustiergenetik für die
Unterstützung bei der Gewinnung und Untersuchung des Probenmaterials.
Literatur
Gilmour, A.R., Gogel, B.J., Cullis, B.R. & Thompson, R (2009): ASReml User Guide Release 3.0. VSN
International Ltd., Hemel Hempstead, UK.
Gonda, M.G., Chang, Y.M., Shook, G.E., Collins, M.T. & Kirkpatrick, B.W. (2006): Genetic variation of
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Infection in US Holsteins. J. Dairy Sci. 89: 1804-1812.
Hinger, M., Brandt, H. & Erhardt, G. (2008): Heritability Estimates for Antibody Response to Mycobacterium avium
subspecies paratuberculosis in German Holstein Cattle. J. Dairy Sci. 91: 3237-3244.
Mortensen, H., Nielsen, S.S. & Berg, P. (2004): Genetic variation and Heritability of the Antibody Response to
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis in Danish Holsteins Cows. J. Dairy Sci. 87: 2108-2113.
- 134 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Einfluss von Kulturmedien und Tierpassage auf die Stabilität
spezifischer Genommarker
von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis
Nadine Kasnitz, Heike Köhler, Petra Möbius
Friedrich-Loeffler-Institut, NRL für Paratuberkulose, Naumburger Str. 96a, 07743 Jena
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) ist ein phylogenetisch junger Erreger
mit
geringer
genetischer
Heterogenität.
Nur
durch
Kombination
mehrerer
Genotypisierungsmethoden können MAP-Stämme ausreichend charakterisiert und
epidemiologisch untersucht werden. Der Bestimmung des Genotyps dient die variierende
Anzahl spezifischer Sequenzen (Genommarker) an definierten Genomorten (Short
Sequence Repeat [SSR]- und Variable-Number Tandem-Repeat [VNTR]- Sequenzen), sowie
bestimmte RFLP-Muster des Insertionssegments IS900 (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse). Um Fehlinterpretationen bei epidemiologischen Untersuchungen zu
vermeiden, müssen die detektierten Genotypen über eine bestimmte Zeit und innerhalb einer
Infektionskette stabil sein. Auch dürfen sie sich bei der kulturellen Anzüchtung nicht
verändern. Eine Änderung an den untersuchten Genommarkern der VNTR- oder SSRAnalyse bzw. der IS900-RFLP-Muster würde zu falschen Schlussfolgerungen bezüglich
möglicher Übertragungswege führen. Ziel dieser Studie war es, die Stabilität der Genotypen
nach Kultivierung in verschiedenen Medien und nach Erreger-Wirt-Interaktion zu
untersuchen.
Fünfzehn bovine MAP-Typ-II-Stämme (8 Genotypen) wurden zweifach auf Para-LöwensteinJensen- [PLJ], Para-Stonebrink- [PSt], Herrolds-Egg-Yolk- [HEYM], Middlebrook- [MM] bzw.
Watson-Reid-Medium [WR] subkultiviert. Dabei wurde die Wachstumsintensität
dokumentiert, die DNS bei ausreichendem Bakterienwachstum (geschlossener Zellrasen)
isoliert und die Konzentration spektrophotometrisch bestimmt. Außerdem wurde der
Inokulationsstamm (JII-1961, MAP-Typ-II, boviner Herkunft) eines Infektionsversuches mit
Ziegen aus dem Ileum und regionärem Lymphknoten von drei Tieren reisoliert und einmalig
auf PLJ subkultiviert. Die Genotypisierung erfolgte mittels VNTR- und IS900-RFLP-Analyse
und für die 15 nur in vitro untersuchten Stämme zusätzlich anhand der SSR-Sequenzen.
Die Kultivierungsdauer der MAP-Stämme variierte zwischen den Stämmen und den Medien.
Auf HEYM wuchsen die Stämme am einheitlichsten und schnellsten, gefolgt von MM und
WR. Auf PSt dauerte die Kultivierung im Durchschnitt am längsten und variierte am meisten
auf PLJ. Nach Wachstum in WR konnte im Vergleich zu HEYM, MM und PLJ mehr als
doppelt soviel DNS aus den Kulturen isoliert werden.
Die Anzahl der Marker an den untersuchten SSR-Loci 8 und 9, sowie den VNTR-Loci 292,
X3, 25, 47, 7 blieb für alle Stämme in vitro unverändert. Bei drei Stämmen wurden nach
Kultivierung Veränderungen im IS900-RFLP-Muster detektiert. Diese traten bei zwei
Stämmen auf allen 5 Medien (Cnew2 zu Cnew und C1, C5 zu Cnew1), bei einem Stamm nur
nach Wachstum auf MM (C1 zu C5) auf. Nach der Tierpassage blieben die IS900-RFLPMuster und die VNTR-Marker des Stammes JII-1961 stabil.
Für die Kultivierung verschiedener MAP-Typ-II-Stämme ist HEYM am besten geeignet. Eine
einmalige Tierpassage – als Modell für eine Infektionsübertragung - zeigte keinen Einfluss
auf den Genotyp. Die ausgewählten SSR- und VNTR- Genommarker sind auch unabhängig
von den verwendeten Kulturmedien stabil. Um den RFLP-Genotyp von Feldisolaten
- 135 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
standardisiert detektieren zu können, ist jedoch die Kultivierung in einem einheitlichen
Medium und eine höchstens einmalige Subkultivierung erforderlich. Nur dann sind
epidemiologische Schlussfolgerungen auf Grundlage der verwendeten Genotypisierungsmethoden möglich.
- 136 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Zum Einfluss von Säurezusätzen in der Tränkmilch auf den
Keimgehalt des Kotes, die Durchfallhäufigkeit und das Wachstum
von Deutschen-Holstein Kälbern während der ersten 14 Lebenstage
Bernd Fischer1, Annette Schliephake2, Annika Schult3
1
Landesanstalt für Landwirtschaft, Forsten und Gartenbau Sachsen-Anhalt, Zentrum für
Tierproduktion und Technik Iden, Lindenstraße 18, 39606 Iden
2
Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin,
Haferbreiter Weg 132, 39576 Stendal
3
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Institut für Tierernährung und Stoffwechselphysiologie,
Agrar- und Ernährungswissenschaftliche Fakultät, Herrmann-Rodewald-Straße 9, 24118 Kiel
Einleitung und Zielstellung
In der Kälberaufzucht treten in Deutschland seit Jahren Verluste an lebend geborenen
Kälbern in Höhe von 6 bis 8 % in den ersten vier Lebenswochen auf. Mehrere Autoren
(SPRINGER, 2003; GIRNUS, 2004; KASKE, 2007) führen Diarrhoe als Hauptursache der
Verendungen in den ersten zwei Lebenswochen an. Zudem sind aus Sicht der
Betriebswirtschaft und des Tierschutzes Bewirtschaftungsmaßnahmen notwendig, die auf
eine Verringerung des Verlustgeschehens ausgerichtet sind. Das Ansäuern der Tränkmilch
ist eine Möglichkeit, Verdauungsabläufe in Labmagen und Dünndarm zu unterstützen,
Diarrhoe durch bakterielle Erreger zu verringern und damit begünstigend auf die
Kälbergesundheit zu wirken. (ROY, 1980; SUNDRUM, 1987; HEITING, 2000)
Das Ziel der Untersuchung bestand darin, zu prüfen, ob durch den Zusatz von
futtermittelrechtlich zugelassenen organischen Säuren Durchfall auslösende Mikroorganismen im Verdauungstrakt der Kälber gehemmt und dadurch Gesundheit und
Wachstum verbessert werden können.
Material und Methoden
Als Säurezusatz wurden in die Vollmilchtränke der Fütterungsgruppe A (Ameisensäure, pHWert der Tränke 4,6-4,8; n=21 Kälber), in die der Fütterungsgruppe E das handelsübliche
Säurepulver EUROCID® (Säuregemisch aus kurzkettigen, organischen Säuren; nach
Einsatzempfehlung pH-Wert der Tränke 6,0; n=20 Kälber) eingesetzt. Die Referenzgruppe
erhielt Vollmilch (n= 21 Kälber) ohne Zusatz. Die Kälber wurden täglich zweimal mit frischer
Vollmilch unmittelbar nach dem Melken bis zu einem Tagesvolumen von 6l mit einer
Tränktemperatur von 38° C getränkt. Die Säuren sind vor dem Tränken der Vollmilch
zugesetzt worden. Der Versuch wurde von September bis November 2009 unter
Außenklimabedingungen durchgeführt. Alle Kälber wurden sofort nach der Geburt in ein Iglu
verbracht, unter einheitlichen Bedingungen mit Kolostrum versorgt und in der dritten
Lebenswoche in die Gruppe umgesetzt. Die Versuchsfütterung umfasste den 2. bis 15.
Lebenstag. Die Konsistenz des Kotes wurde täglich jeweils zur Tränkung (0=normal; 1= noch
breiig, 2=dünnflüssig, 3=wässrig) bonitiert. Ebenso wurde täglich die Tränkemenge und der
Kraftfutterverzehr ab der 2. Lebenswoche individuell erfasst. Ab dem 3. bis zum 15.
Lebenstag wurden zweitägig von allen Kälbern rektal Kotproben entnommen. Der Kot
wurden
im
LAV
Stendal,
Abteilung
Morphologische
und
mikrobiologische
Tierseuchendiagnostik, nach den in Klammern stehenden Prüfmethoden untersucht und
semiquantitativ bewertet. Nachgewiesen wurden: Kryptosporidien (50-0067-02), Escherichia
coli (50-0054-02), Campylobacter (50-0056-02), Clostridien (50-0046-02), Rotaviren,
Caliciviren und Parvoviren (50-0035-02). Calci- und Parvoviren wurden nur vereinzelt
nachgewiesen, daher wurden sie hier nicht in die Auswertung einbezogen.
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Statistikprogrammes SPSS 8.0. Der
Versuch wurde mittels der Prozedur GLM – Allgemein mehrfaktoriell ausgewertet.
- 137 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Kovariablen wurden im Modell berücksichtigt.
Ergebnisse
In Tabelle 1 ist die Häufigkeit der Kälber dargestellt, bei denen mindestens einmal der
jeweilige Erreger nachgewiesen wurde. Dabei ist bei allen Kälbern während des Versuches
mindestens ein Erreger nachgewiesen worden. Am häufigsten, und zwar bei 92,7 % der
Kälber, wurden Kryptosporidien nachgewiesen.
Tabelle 1:Anteil Kälber in denen der Erreger min. einmal nachgewiesen wurde
Erreger
Kryptosporidien E.coli
Campylobacter Clostridien
Rotaviren
Nachweis
92,7%
53,6%
5,5%
58,2%
58,2%
Ein Trend der reduzierten Ausscheidung von Campylobacter, E.coli und Clostridien ist bei
Kälbern, die mit Ameisensäure und EUROCID® zugesetzte Vollmilch erhielten, in Tabelle 2
gegenüber der Referenzgruppe zu erkennen. Möglicherweise ist das auf die antimikrobielle
Wirkung der Säuren zurückzuführen. Jedoch ließ sich ein statistischer Nachweis nicht
ermitteln. In der Fütterungsgruppe A konnte ein gesteigerter und in der Fütterungsgruppe E
ein niedrigerer Anteil positiver Rotavirenbefunde gegenüber der Referenzgruppe ermittelt
werden. Von der Fütterungsgruppe unbeeinflusst war die Ausscheidung der Kryptosporidien.
Tabelle 2:Verteilung der positiven Befunde zwischen den Fütterungsgruppen und den
Geschlechtern in %
Fütterungsgruppe
Geschlecht
Erreger
A (AmeisenE
Referenz
Weiblich
Männlich
säure)
(EUROCID®) (Unbehandelt)
auswertbare
18
19
18
21
34
Kälber
Kryptosporidien 94,4
89,5
94,4
85,7
97,1
E.coli
50,0
52,6
61,1
71,4
44,1
Campylobacter 0
5,3
11,1
9,5
2,9
Clostridien
44,4
68,4
61,1
66,7
52,9
Rotaviren
72,2
42,1
61,1
66,7
52,9
p=0,063; p=0,002
In der Untersuchung konnte ein signifikanter Einfluss des Geschlechtes des Kalbes auf die
Ausscheidung von E.coli und Rotaviren nachgewiesen werden. Von den weiblichen Kälbern
waren 71,4 % und von den männlichen Kälbern 44,1% der Proben E.coli positiv. Auch von
Rotaviren waren weibliche Kälber stärker betroffen als männliche (Tabelle 2).
An den Untersuchungstagen mit Kotprobenentnahme ließen sich signifikante Unterschiede
im Verlauf der Ausscheidung von Kryptosporidien, E.coli und Rotaviren nachweisen. Das
zeigt die besondere Charakteristik der Erregerinfektionen im Bestand an. Im Verlauf der
Kryptosporidienausscheidung waren ein Anstieg nach dem 7. Lebenstag und ein Höhepunkt
der Ausscheidung am 13. Lebenstag typisch. In ähnlicher Weise verliefen die Ausscheidung
der Rotaviren und die der E.coli-Bakterien. Diese Erreger scheinen gemeinsam eine
unheilvolle Allianz zu bilden, die sich in Parallelität und Intensität bei der Infektion bzw.
Reinfektion, der Ausscheidung und dem Durchfallgeschehen der Kälber abbildete.
Während eindeutige Zusammenhänge des zeitlichen Verlaufs der Infektionen nachgewiesen
werden konnten, zeigen die dargestellten Irrtumswahrscheinlichkeiten in den Abbildungen 1
bis 3 an, dass zwischen den Fütterungsgruppen kein Einfluss im Verlauf der Darmpathogene
bestand. Der Verlauf der Rotavirenausscheidung kommt zwar einer statistischen
Irrtumswahrscheinlichkeit von p=0,05 nahe, dennoch ist nicht davon auszugehen, dass die
Futterzusätze eine nachhaltige Wirkung auf den untersuchten Darmkeimbesatz während der
ersten 14 Lebenstage ausübten.
- 138 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Die Abbildung 4 reflektiert den Verlauf des Durchfallgeschehens. Es kann ein eindeutiger
Zusammenhang zwischen Erregerverlauf (Abb. 1 bis 3) und Durchfallhäufigkeit
nachgewiesen werden, der nicht wesentlich von der Fütterungsgruppe beeinflusst war.
Weder Ameisensäure noch EUROCID® konnten ihre positive Wirkung auf den Verlauf des
Durchfallgeschehens entfalten (Abbildung 4).
Die Durchfalltage (Boniturnote ≥ 2) verringerten die Zunahmen der Kälber. Ein Tag mit
Durchfall senkte die Zunahme im Versuchszeitraum im Mittel um etwa 0,5 kg. Die mittlere
Durchfalldauer betrug in der Fütterungsgruppe A 3,8 Tage, in der Fütterungsgruppe E 5,3
Tage und in der Referenzgruppe 4,0 Tage. Die Irrtumswahrscheinlichkeit des Einflusses der
Fütterungsvariante auf die Dauer des Durchfalls war p=0,084.
Der 14-tägige Zuwachs kann für alle Fütterungsvarianten als niedrig beurteilt werden. Es
konnte kein signifikanter Einfluss (p=0,343) der Fütterungsgruppe auf die täglichen
Lebendmassezunahmen der ersten 14 Lebenstage nachgewiesen werden. 254g/d nahm die
Referenzgruppe, 180g/d die EUROCID® -Gruppe und 174g/d die Ameisensäure-Fütterungsgruppe zu.
In der zweiten Lebenswoche war die Festfutteraufnahme aus einer Trocken-TMR von der
Fütterungsgruppe nicht signifikant beeinflusst (p=0,680). Kälber der Fütterungsgruppe A
verzehrten 29g/d, Kälber der EUROCID® - und der Referenzgruppe nahmen jeweils 36g/d
Futter auf.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Abb.2: Rotaviren
Verlauf p=0,065
60
Vollmilch
Positive Befunde %
Postive Befunde %
Abb.1: Kryptosporidien
Verlauf p=0,166
Eurocid
Ameisensäure
Vollmilch
50
Eurocid
Ameisensäure
40
30
20
10
0
3
5
7
9
11
13
3
15
5
7
Abb.3: E. coli
Verlauf p=0,730
45
11
13
15
Abb.4: Durchfallhäufigkeit
Verlauf p=0,221
80
40
70
35
Vollmilch
30
Eurocid
25
Ameisensäure
Vollmilch
60
Anteil in %
Positive Befunde %
9
Lebenstag
Lebenstag
20
15
Ameisensäure
40
30
10
20
5
10
0
Eurocid
50
0
3
5
7
9
11
13
15
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Lebenstag
Lebenstag
Fazit:
In der vorliegenden Untersuchung konnte die positive Wirkung von kurzkettigen, organischen
Säuren mit den verwendeten Futterzusätzen bei Vollmilchtränke auf das Vorkommen von
Darmpathogenen im Kot, auf die Inzidenz von Durchfällen, auf das Wachstum und auf die
Festfutteraufnahme der Kälber in den ersten 14 Tagen der Igluhaltung statistisch nicht
nachgewiesen werden.
Das Literaturverzeichnis liegt beim Erstautor vor.
- 139 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Nachweis reaktiver T-Zellen bei experimenteller Infektion von
Ziegen mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP)
Katharina Kerner, Gudrun Walter, Christian Menge, Heike Köhler
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese, Naumburger Str. 96a, 07743 Jena
Einleitung
Die Frühdiagnostik MAP-infizierter Wiederkäuer stellt eine besondere Herausforderung dar.
Aufgrund der erst spät einsetzenden Antikörperentwicklung bzw. der MAP-Ausscheidung
über den Kot ist eine Bestimmung der latent infizierten Tiere mittels ELISA bzw. Kotkultur
(Goldstandard) nicht möglich. Eine zellvermittelte Immunreaktion wird dagegen schon früh
während der Infektion hervorgerufen.
Der Interferon-γ release assay (INRA) als Maß für die Zahl MAP-spezifischer T-Zellen im
peripheren Blut ist prinzipiell geeignet positive Rinder ab dem 2. Lebensjahr zu identifizieren.
Die Spezifität dieses Tests wird bei Kälbern aber durch starke individuelle Unterschiede und
die unspezifische Bildung von IFN-γ durch andere Immunzellen erheblich eingeschränkt.
Eine alternative Möglichkeit, MAP-spezifische T-Zellen zu erkennen, ist der Nachweis von
Antigenen auf der Zelloberfläche, die nur von aktivierten Lymphozyten exprimiert werden
(Aktivierungsmarker). Dies ist auf Einzelzellebene mit Hilfe der Durchflußzytometrie möglich.
Nach experimenteller Inokulation von Kälbern erwies sich die Quantifizierung der Expression
der Aktivierungsmarker CD25 und CD26 auf T-Zellen nach in vitro-Restimulation mit MAPAntigen als spezifischerer Indikator einer Infektion als der INRA. Eine sichere
Unterscheidung infizierter von nicht-infizierten Kälbern war mit dieser Methode bereits ab der
16. Woche post inoculationem (W. p. i.) möglich.
Kleine Wiederkäuer besitzen in der Epidemiologie der Paratuberkulose eine nicht zu
unterschätzende Bedeutung. Bislang verfügbare diagnostische Tests sind jedoch meist für
die Anwendung an Schafen und Ziegen nicht validiert. Ziegen sind andererseits geeignete
Modelltiere für Untersuchungen zur Pathogenese der Paratuberkulose und zur Entwicklung
von MAP-Impfstoffen.
In dieser Studie sollte deshalb untersucht werden, ob anhand von Blutproben zelluläre
Immunreaktionen nach experimenteller Infektion neugeborener Ziegen nachweisbar sind, ab
welchem Zeitpunkt post infectionem dies möglich ist und welcher methodische Ansatz dafür
am besten geeignet ist.
Methodik
Thüringer Wald-Ziegen (n = 26) wurden im Alter von 12 Tagen alle 2 - 3 Tage insgesamt 10mal mit 10 mg Bakterienfeuchtmasse des MAP-Stammes JII-1961 (MAP-Typ-II, boviner
Herkunft) inokuliert und nach Abschluss der Inokulation über einen Zeitraum von 42 Wochen
alle 4 Wochen beprobt. Sechzehn weitere Tiere dienten als nicht-infizierte Kontrolltiere. Ab
der 3. W. p. i. wurden zur Durchführung des INRA periphere mononukleäre Zellen (PBMC)
gewonnen und in vitro 24 h mit Concanavalin A (ConA; Stimulationskontrolle) oder mit
Johnin purified protein derivative (jPPD) inkubiert. IFN-γ wurde mit einem hauseigenen
ELISA quantifiziert. Ab der 11. W. p. i. wurden PBMC auch für 6 Tage mit ConA oder jPPD
inkubiert. Anschließend wurde die CD25- oder CD26-Expression auf T-Helfer-Zellen (CD4positive Zellen) und zytotoxischen T-Zellen (CD8-positiven T-Zellen) in der Durchflusszytometrie quantifiziert. Eine dreifache Immunmarkierung erlaubte zusätzlich die
Eingrenzung der zu untersuchenden Zellen jeweils auf T-Gedächtniszellen anhand des
Nachweises der CD45RO-Expression.
- 140 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Ergebnisse
Im Überstand von jPPD-stimulierten PBMC MAP-infizierter Tiere konnten ab der 3. W. p. i.
(entsprechend 9. Lebenswoche) signifikant größere Mengen an IFN-γ nachgewiesen werden
als in dem von unstimulierten PBMC dieser Tiere. Die freigesetzte Menge IFN-γ erreichte in
der 18. W. p. i. maximale Werte und fiel danach wieder ab. Trotzdem sezernierten PBMC
infizierter Tiere nach Restimulation mit jPPD bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes
(42. W. p. i. entsprechend 48. Lebenswoche) signifikant mehr IFN-γ als die PBMC der
Kontrolltiere. Zu den meisten Zeitpunkten war mit dem INRA eine Unterscheidung MAPinfizierter von Kontrolltieren auch auf Einzeltierebene möglich.
Ausreichende Blutprobenvolumina für die Zellisolierung zur Durchführung der durchflusszytometrischen Tests konnten erst ab der 11. W. p. i. (entsprechend 17. Lebenswoche)
gewonnen werden.
Bereits bei der ersten Anwendung dieses Verfahrens löste die Inkubation mit jPPD bei den
PBMC von MAP-infizierten Tieren eine stärkere Expression von CD25 auf CD4+ TGedächtniszellen (CD45RO+) aus als bei unstimulierten PBMC. Bei PBMC nicht-infizierter
Kontrolltiere war die Stärke der jPPD-induzierten CD25-Expression niedriger, schwankte
jedoch stark im Verlauf des Beobachtungszeitraumes. Eine sichere Unterscheidung von
infizierten und nicht-infizierten Tieren auf Einzeltierebene war nicht zu jedem Zeitpunkt
möglich.
Eine verstärkte CD25-Expression nach Inkubation mit jPPD konnte ebenfalls bei den
CD8+(CD45RO+) Zellen von MAP-infizierten Tieren ab der 11. W. p. i. beobachtet werden.
PBMC der Kontrolltiere reagierten auf Inkubation mit jPPD mit einer nur geringfügig
gesteigerten CD25-Expression. Die Unterschiede in der Reaktion der CD8+(CD45RO+)
Zellen zwischen infizierten und Kontrolltieren waren in der ersten Hälfte des Beobachtungszeitraumes geringer als die Reaktion der CD4+(CD45RO+) Zellen. In der zweiten Hälfte des
Beobachtungszeitraumes waren dagegen deutlichere Unterschiede zwischen den
Tiergruppen bei den CD8+(CD45RO+) Zellen nachweisbar. Eine Unterscheidung von
Einzeltieren nach Infektionsstatus war nicht zu jedem Zeitpunkt p. i. möglich.
Im Gegensatz zur CD25-Expression unterschied sich die jPPD-induzierte Expression von
CD26 auf CD4+(CD45RO+) Zellen und auf CD8+(CD45RO+) Zellen zunächst nicht zwischen
den Tiergruppen. Erst zu einem späten Zeitpunkt (27. W. p. i., 33. Lebenswoche) traten
Unterschiede zwischen beiden Tiergruppen auf.
Schlussfolgerung
Unter experimentellen Bedingungen sind zelluläre Immunreaktionen bei Ziegen bereits in der
Frühphase der Infektion mit verschiedenen Methoden nachweisbar.
Der INRA erwies sich als sensitiv und spezifisch. Er ist materiell und zeitlich weniger
aufwändig. Aufgrund der geringeren benötigten Blutmenge erlaubt der INRA den
Infektionsnachweis schon bei jüngeren Tieren.
Der Nachweis MAP-spezifischer Immunzellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie ermöglicht
dagegen die Zuordnung zellulärer Immunreaktion zu bestimmten T-Zell-Populationen. So
zeigen in der Frühphase der Infektion zunächst CD4+(CD45RO+) Zellen eine stärkere
Reaktion auf MAP-Antigen, in der späteren Phase CD8+(CD45RO+) Zellen. Während MAPspezifische T-Zellen in der Frühphase durch die Expression von CD25 charakterisiert sind,
treten später zunehmend Zellen auf, die CD26 als Indikator einer Aktivierung exprimieren.
Für Untersuchungen zur Pathogenese der Paratuberkulose und zur Entwicklung von MAPImpfstoffen ist der Test damit dem INRA in seiner Aussagekraft überlegen.
Die mit den verschiedenen Testverfahren quantifizierten zellulären Immunreaktionen
unterschieden sich in Stärke und Kinetik. Diese Parameter können sich zwischen
experimentellen Studien und der Anwendung bei natürlich infizierten Tieren unterscheiden.
- 141 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erst nach Überprüfung der Verfahren anhand von Feldproben können die Vorteile und
Nachteile der Methoden im Hinblick auf eine Anwendung in der Diagnostik bewertet werden.
Teilweise gefördert durch die Tierseuchenkassen Thüringen, Hessen, Mecklenburg-Vorpommern,
Niedersachsen, Rheinland-Pfalz und Baden-Württemberg.
- 142 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Untersuchungen zur Langzeitepidemiologie von Mycobacterium
avium subsp. paratuberculosis Stämmen aus Mitteleuropa
Isabel Fritsch1, Janina Kolb2, Heike Köhler1, Doris Hillemann2, Michael Dünser3, Max
M. Wittenbrink4, Petra Möbius1
1
Friedrich-Loeffler-Institut, NRL für Paratuberkulose, Naumburger Str. 96a, 07743 Jena,
Deutschland
2
Nationales Referenzzentrum für Mycobakterien, Wissenschaftszentrum Borstel,
Parkallee 18, 23845 Borstel, Deutschland
3
Institut für Veterinärmedizinische Untersuchungen Linz, Österreichische Agentur für
Gesundheit und
Ernährungssicherheit GmbH, Kudlichstraße 27, 4021 Linz, Österreich
4
Institut für Veterinärbakteriologie, Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich,
Winterthurerstrasse 270, 8057 Zürich, Schweiz
Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) - der Erreger der Paratuberkulose - ist
phylogenetisch jung und weltweit verbreitet. MAP besitzt eine relativ geringe genetische
Heterogenität. Um MAP typisieren zu können, werden verschiedene Methoden und
unterschiedliche Zielsequenzen verwendet. Für die Untersuchung von Infektketten innerhalb
eines bestimmten Gebietes wird eine hohe Differenzierungskraft der Genotypisierung
benötigt, was durch die Kombination der Ergebnisse mehrerer Methoden erreicht werden
kann. Dabei wird bei der Variable-Number of Tandem- Repeat (VNTR)- und der ShortSequence-Repeat (SSR)-Analyse die unterschiedliche Anzahl von sich wiederholenden
Sequenzabschnitten bzw. Einzelbasen oder Tripletts an bestimmten Orten im MAP-Genom,
nicht in Gensequenzen, untersucht. Mit der Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
(RFLP)- Analyse werden Bandenmuster, basierend auf der Verteilung des IS900 im Genom,
miteinander verglichen. Um die Ähnlichkeit von Isolaten innerhalb der Spezies
Mycobacterium avium aus unterschiedlichen Ländern der Welt zu ermitteln, wurde die
Multilocus-Sequence-Analyse (MLSA) verwendet. Die MLSA ist eine Nukleotid-basierte
Methode, bei der Sequenzvariationen in Form von „small nucleotide polymorphisms“ (SNPs)
innerhalb von zehn Genen, die bestimmte Enzyme kodieren, bestimmt werden. Für jedes
Isolat wird ein entsprechendes Allelprofil bzw. ein Sequenztyp benannt.
Ziel der Studie war es, eine Auswahl von MAP-Stämmen aus Mitteleuropa mit Hilfe der
MLSA hinsichtlich ihrer Verwandtschaft zu Stämmen aus Regionen der Welt zu untersuchen,
in die domestizierte Wiederkäuer in den letzten Jahrhunderten eingeführt wurden.
Sechsunddreißig MAP Isolate vom Rind (n=25), Rotwild (n=2), Schaf (n=4), Ziege (n=3),
Mensch (n=1) und Esel (n=1) aus Deutschland wurden für die MLSA ausgewählt. Sie
repräsentierten 35 Genotypen, charakterisiert durch die Kombination der Typisierungsergebnisse von IS900-RFLP-, VNTR- und MLSSR-Analyse. Zwei dieser Isolate (vom Schaf)
gehörten zum MAP-Typ-III, alle anderen zum MAP-Typ-II, einschließlich des Typstammes
ATCC 19698 und des Referenzstammes DSM44135. Zusätzlich wurden neun bovine MAPTyp-II-Isolate aus Österreich und der Schweiz (9 Genotypen, 4 davon nur dort detektiert)
untersucht. Die MLSA wurde nach der Methode von Turenne et al. (2008) durchgeführt. Die
ermittelten MLSA-Typen wurden mit publizierten Daten für Stämme aus USA, Kanada,
Neuseeland, UK, Island, Australien und den Färöer verglichen.
- 143 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Mit Hilfe der MLSA wurden vier Sequenztypen (ST) gefunden: ST 30 und ST 32 für die MAPTyp-II- Isolate aus Deutschland, Österreich und der Schweiz und ST 35 and 36 für die MAPTyp-III-Isolate aus Deutschland.
In der Arbeit von Turenne et al. wurden drei ST für 13 MAP-Typ-II-Isolate beschrieben, wobei
bis auf ein Isolat alle dem ST 30 und 32 entsprachen. Bei den untersuchten Isolaten aus
Deutschland, Österreich und der Schweiz konnten jeweils auch diese beiden ST detektiert
werden, wobei 31 der 34 untersuchten MAP-Typ-II-Isolate den ST 32 aufwiesen. Dazu
gehörten auch die Rotwildisolate, der humane Stamm, der Typ- und der Referenzstamm. Bei
Turenne et al. wurden noch weitere vier Sequenztypen für MAP-Typ I/III beschrieben. In der
vorliegenden Studie konnten zwei dieser ST bei den zwei untersuchten intermediären (TypIII) Schafstämmen gefunden werden. Für den Schafstamm JIII-386 wurde der ST 35
detektiert, übereinstimmend mit den in der Literatur beschriebenen intermediären Stämmen
vom Schaf (86-45) und Schwein (LN20) aus Kanada. Der Schafstamm JIII-1311 besitzt den
ST 36, wie der bei Turenne et al. beschriebene intermediäre Schafstamm (P465) aus Island.
Damit wurden zwei von drei publizierten Sequenztypen für MAP-Typ-II-Isolate bzw. zwei von
insgesamt vier publizierten Sequenztypen für MAP-Typ-I/III-Isolate schon allein in
Deutschland gefunden.
Die MLSA-Typen der untersuchten Isolate aus Deutschland, Österreich und der Schweiz
stimmen mit denen aus historischen Importländern für Rinder und Schafe – und damit der
Paratuberkulose – überein. Die Untersuchungsergebnisse sprechen für eine Eignung der
MLSA für langzeitepidmiologische Studien bei MAP.
Referenz: C.Y.Turenne et al., Journal of Bacteriology (2008) 190: 2479-2487.
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung,
ZooMAP, Förderkennzeichen 01KI 0755.
- 144 -
8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erfahrungen aus der Paratuberkulosediagnostik am CVUA Freiburg
Auswertung von Laborergebnissen von 1994 bis 2011
Wybke Murmann, Klaus Danner, Alexander Maas
Chemisches- und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg, Am Moosweiher 2, 79108 Freiburg
Zusammenfassung
Es werden die Ergebnisse der bakteriologischen Untersuchungen auf Paratuberkulose der
vergangenen 18 Jahre vorgestellt und unter Berücksichtigung verschiedener
Untersuchungsmethoden ausgewertet. Besondere Beachtung finden hierbei die
Praktikabilität und Wirtschaftlichkeit der Untersuchungsmethoden.
Aufgrund der über diesen Zeitraum gewonnenen Erfahrungen empfiehlt es sich aus Sicht
unseres Untersuchungsamtes, die Kotproben nach folgendem Schema auf Paratuberkulose
zu untersuchen:
- Direkt PCR möglichst schnell nach Probeneingang,
- Mikroskopische Beurteilung des Ziehl-Neelsen gefärbten Kotausstriches nach
Reinigung und Aufkonzentration (s. Avid)
- Kulturdoppelansatz auf HEYM Nährböden mit Mycobactin nach Reinigung und
Aufkonzentration (s. Avid)
- bei Wachstum mykobakterienverdächtiger Kolonien ist eine Differenzierungs PCR
durchzuführen, wenn die Direkt PCR negativ verlaufen ist.
- Endbeurteilung eines nicht vorhandenen Kulturwachstums frühestens nach 2
Monaten bei wöchentlicher Kontrolle, bei besonderen Fragestellungen erst nach 4
Monaten
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erregerspezifische Antikörper als Indikatoren der MAP-Infektion
bei Kälbern und Jungrindern
Simone Schillinger1, Philip.S. Bridger1, Torsten Seeger2, Marta Fischer3, Christian Menge1,4,
Rolf Bauerfeind1
1
Institut für Hygiene & Infektionskrankheiten der Tiere, Frankfurter Str. 85-89, 35392 Gießen
2
Klinik für Wiederkäuer und Schweine, Frankfurter Str. 110, 35392 Gießen
3
Institut für Tierärztliche Nahrungsmittelkunde, Frankfurter Str. 92, 35392 Gießen
4
Friedrich-Loeffler-Institut, Institut für molekulare Pathogenese, Naumburger Str. 96a, 07743 Jena
Bei den in der Routinediagnostik angewendeten serologischen Tests zum Nachweis der
Infektion des Rindes mit Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) handelt es
sich fast ausschließlich um Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISAs). Allerdings
sind deren Sensitivitäten oder Spezifitäten niedrig (Nielsen und Toft, 2006). Außerdem sind
diese Tests erst bei Rindern im Alter von mehr als 24 Monaten hinreichend aussagekräftig.
Ziel der vorliegenden Studie war es, die Eignung eines auf der Durchflusszytometrie
basierenden serologischen Verfahrens (DFZM-Ak-Test) zum Nachweis von MAP-Infektionen
bei Kälbern und Jungrindern zu prüfen. Dabei sollte auch die Abnahme von MAPspezifischen Antikörpern kolostralen Ursprungs in Kälbern untersucht werden, um
denjenigen Zeitpunkt zu bestimmen, ab dem vorhandene Antikörper auf der Eigenproduktion
von Immunglobulinen beruhen.
Der DFZM-Ak-Test wurde an Kälbern (12 experimentell mit MAP infizierte Kälber sowie
6 Kontrollkälber; monatlicher Beprobungsrhythmus über ein Jahr) sowie an Jungrindern (24
Tiere aus einem Paratuberkulose-Problembetrieb, 10 Tiere aus einem MAP-unverdächtigen
Betrieb, 3-monatiger Beprobungsrhythmus über ein Jahr) evaluiert. Zur Bestimmung der
Titerdynamik von Antikörpern kolostralen Ursprungs wurden Serumproben von jeweils fünf
Kälbern aus Muttertieren, welche im DFZM-Ak-Test positiv bzw. negativ reagiert hatten,
untersucht (4- bis 6-wöchiger Beprobungsrhythmus bis zu einem Alter von mindestens 6
Lebensmonaten).
Bei zwei von 12 experimentell mit MAP-infizierten Kälbern (16,6 %) konnte im DFZM-Ak-Test
ein Titeranstieg des MAP-spezifischen IgG und IgG1 erstmals 43 bzw. 45 Wochen post
infectionem (W.p.i.) nachgewiesen werden. Mit dem kommerziell erhältlichen Pourquier®ELISA war eine (schwache) Serokonversion nur bei einem einzigen MAP-infizierten Kalb 50
W.p.i. festzustellen. Von den 24 Jungrindern eines MAP-Problembetriebes reagierten bei
Betrachtung des MAP-spezifischen IgG sechs Tiere im Laufe des Beprobungszeitraumes
mindestens einmal positiv, drei Tiere wiesen sogar in zwei aufeinanderfolgenden
Untersuchungen im Alter von zehn, 14 bzw. 15 Lebensmonaten positive Messwerte auf. Bis
auf ein Tier mit fraglichem Testergebnis, reagierten alle Jungrinder im Pourquier®-ELISA
negativ. MAP-spezifische Antikörper kolostralen Ursprungs waren in Kälbern aus DFZMpositiven Muttertieren längstens bis zum 121. Lebenstag nachweisbar.
Nach diesen Ergebnissen ist der DFZM-Ak-Test bei der serologischen Untersuchung von
Jungtieren sensitiver als der Pourquier®-ELISA. Allerdings sind wegen der bei MAPInfektionen nur langsam einsetzenden Immunantwort wiederholte Untersuchungen
erforderlich (z.B. alle 2 Monate ab dem 10. Lebensmonat), um MAP-infizierte Tiere auf diese
Weise bereits in den ersten zwei Lebensjahren zu entdecken.
Nielsen, S. S. and N. Toft (2006). Age-specific characteristics of ELISA and fecal culture for
purpose-specific testing for paratuberculosis. J Dairy Sci 89(2): 569-79.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Erste Ergebnisse des Paratuberkuloseprogramms der Sächsischen
Tierseuchenkasse
Mandy Schmidt, Karin Eulenberger, René Pützschel
Sächsische Tierseuchenkasse, Löwenstr. 7a, 01099 Dresden
Die Sächsische Tierseuchenkasse hat bereits 2005 ein Programm zur Paratuberkulose
aufgelegt mit dem Ziel, die Verbreitung der Krankheit in Sachsen zu erkennen und in
betroffenen Beständen die Krankheit mit Hilfe von Hygiene- und Managementmaßnahmen
einzudämmen. Stand in den Jahren 2006 bis 2009 die Serologie im Mittelpunkt der
Diagnostik, wurde das Programm ab 2010 um Kotuntersuchungen in ausgewählten
Beständen erweitert. Für diesen Zweck schließt der Betrieb mit der TSK ein spezielles
betriebliches Programm ab. Besonderes Interesse besteht an Beständen, die aufgrund von
serologischen Untersuchungen und der Untersuchung von Kotproben aller Rinder die
Voraussetzung für die Einstufung als Paratuberkulose-unverdächtiger Bestand erlangen.
Schwerpunkte des Paratuberkulose-Programms
- Abklärung klinischer Verdachtsfälle über Blut‐ und Kotprobe, ggf. auch Sektion - serologische Untersuchungen aller Rinder über 24 Monate einmal jährlich als Herdenuntersuchung - ab 2010: zusätzlich in ausgewählten Programmbetrieben einmal jährlich Untersuchung von Kotproben aller Rinder über 24 Monate über einen Zeitraum von 3 Jahren Die labordiagnostischen Untersuchungen werden durch den Rindergesundheitsdienst
ergänzt durch die Erfassung von Hygienestatus, Haltungsbedingungen und
Managementfaktoren auf Basis einer Checkliste. Umgebungskotproben nach einer
abgestimmten Vorgehensweise ergänzen die diagnostischen Maßnahmen.
Aktuell beteiligen sich 33 Milchviehbetriebe mit ca. 12 000 Kühen und 6 Mutterkuhhalter mit
ca. 1 000 Kühen an den erweiterten Untersuchungen über Kotproben.
Ergebnisse
Serologische Untersuchungen:
Im Jahr 2011 wurden insgesamt 73.433 Blut- und Milchproben auf Antikörper gegen
Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis an der Landesuntersuchungsanstalt für das
Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen untersucht (jährliche Herdenuntersuchungen).
Die Anzahl der Untersuchungen ist zwischen 2006 und 2011 nahezu konstant.
Die Ergebnisse der Serologie sind der Tabelle 1 zu entnehmen. Der Anteil serologisch
positiver Proben schwankt nur geringfügig und liegt in diesem Zeitraum unter 5 Prozent. Der
Anteil der Bestände, in denen serologisch positive Befunde erhoben wurden, ist
demgegenüber mit ca. 40 Prozent als hoch einzuschätzen und gibt Hinweise auf die
Verbreitung der Paratuberkulose in Sachsen. Der Anteil positiver Proben pro Bestand und
der Grund für die Untersuchung (Abklärung klinischer Verdacht, Stichprobenuntersuchung
oder Bestandsuntersuchung) sind in dieser Übersicht unberücksichtigt geblieben.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Tabelle 1: Anteil serologisch positiver Proben (unabhängig vom
Untersuchungsgrund) und Anteil serologisch positiver Bestände (unabhängig von der
Anzahl der Proben pro Bestand)
2006
Anteil positiver Proben 3,50%
Anteil positiver
Bestände
32,00%
2007
4,30%
2008
2,10%
2009
2,95%
2010
3,70%
2011
3,80%
38,00%
39,00%
36,00%
42,00%
40,68%
Untersuchung von Kotproben:
In den ausgewählten Programmbetrieben wurden 2010 ca. 7700 und 2011 ca. 10100
Kotproben kulturell und mittels PCR untersucht. In ca. 1 Drittel der Bestände konnte der
Erreger nachgewiesen werden. Der Anteil kotpositiver Proben insgesamt lag 2011 bei 2,5 %,
streut innerhalb der Herden jedoch erheblich.
Weiteres Vorgehen
Die Prävalenzverläufe für die einzelnen Bestände werden ermittelt und sollen zu den
Kriterien der Hygieneanalyse in Beziehung gesetzt werden. Die Spezifik der Krankheit
beansprucht lange Auswertungszeiträume, um eine Wichtung der Einflussfaktoren
vornehmen zu können. Besondere Beachtung findet die durchschnittliche Verweildauer eines
kotpositiven Tieres im Bestand (Tage zwischen Befunderhebung und Merzung des Tieres).
Beispielhaft werden einige Prävalenzverläufe dargestellt.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Sanierungsempfehlungen und Map-Maßnahmekatalog
Hinweise für Milchviehhalter
Map-Arbeitsgruppe M-V
LALLF M-V, Epidemiologischer Dienst, Thierfelder Str. 19, 18059 Rostock (www.LALLF.de)
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Serologische und molekularbiologische Untersuchungen zum
Vorkommen des Bluetongue Virus (BTV) und von Pestiviren in der
Wildwiederkäuerpopulation im Freistaat Thüringen (2007-2011)
Wulf-Iwo Bock
Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz (TLLV),
Tennstedter Str. 8/9, 99947 Bad Langensalza
Die virologischen Untersuchungen von Wildwiederkäuern beschränkten sich in den Jahren
bis 2007 hauptsächlich auf sporadische Untersuchungen von gefallenem (Fallwild) oder
erlegtem Wild. Hierbei spielten vor allem klassische Methoden, wie zum Beispiel die
Virusanzüchtung, eine wichtige eine Rolle.
Mit dem erstmaligen Auftreten des Bluetongue Virus (BTV) in Deutschland und seiner
raschen Ausbreitung über das gesamte Bundesgebiet, wurde ab dem Jahr 2008 in
Thüringen ein Wildwiederkäuermonitoring zum BTV-Nachweis durchgeführt. Im Rahmen
dieses Monitorings wurden hauptsächlich EDTA-Blutproben und Muskelfleischproben
eingesandt und molekularbiologisch (qRT-PCR) und serologisch (ELISA) untersucht.
Serologisch konnten Antikörper gegen das BTV im Blut und im Fleischsaft, bei
Einsendungen aus ganz Thüringen nachgewiesen werden. In keiner der untersuchten
Proben konnte BTV-Virusgenom nachgewiesen.
Im Vorfeld der ab 2011 in ganz Deutschland durchzuführenden BVD-Pflichtbekämpfung,
wurde in Thüringen bereits ein freiwilliges BVD-Bekämpfungsprogramm ab Mitte der 90er
Jahre durchgeführt. Immer wieder wurde in diesem Zusammenhang, gerade bei
epidemiologisch „unklarem Eintrag“ von Bovine Virus Diarrhoe Virus (BVDV) in die
Bestände, das Wild als Virusreservoir für BVDV ins Spiel gebracht. Es ist bekannt, dass
Wildwiederkäuer für Pestiviren (BVDV und Border Disease Virus (BDV)) empfänglich sind,
dies wurde in Europa und Amerika in verschiedenen Studien, mit direkten und indirekten
Verfahren zum Erregernachweis festgestellt. Der Frage, ob die Wildwiederkäuer ein potentes
Erregerreservoir für Pestiviren darstellen, sollte mit Untersuchungen der aus dem BTVMonitoring vorliegenden EDTA-Blutproben nachgegangen werden. Bei allen untersuchten
Proben konnten keine pestivirusspezifischen Genomsequenzen, mittels qRT-PCR
nachgewiesen werden, was den Schluss nahelegt, dass diese Viren momentan in der
Wildwiederkäuerpopulation nicht zirkulieren und wenn überhaupt nur sehr selten zu
persistenten Infektionen führen. Ein Eintrag von BVDV und BDV durch Wildwiederkäuer in
Rinderbestände, erscheint anhand der vorliegenden Daten für Thüringen als sehr
unwahrscheinlich.
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8. Stendaler Symposium
9.-11. Mai 2012
Organverteilung von Schmallenberg Virus RNA in
missgebildeten Neugeborenen
Sabine Bilk1, Christoph Schulze1, Melina Fischer2, Martin Beer2, Andreas Hlinak1,
Bernd Hoffmann2
1
2
Landeslabor Berlin Brandenburg, Gerhard-Neumann-Straße 2/3, 15236 Frankfurt (Oder),
Institut für Virusdiagnostik, Friedrich-Loeffler-Institut, Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems
Im Herbst 2011 wurde bei Milchkühen in Deutschland ein neues Orthobunyavirus
identifiziert, das in Anlehnung an den Ort des Erstnachweises als Schmallenberg Virus
(SBV) bezeichnet wurde. SBV konnte in der darauffolgenden Zeit in Organen von
missgebildeten Schaf- und Ziegenlämmern sowie Kälbern in den Niederlanden, Deutschland,
Belgien, Frankreich, Italien, Großbritannien, Luxemburg und Spanien nachgewiesen werden.
Am Friedrich-Loeffler-Institut wurde zum molekularbiologischen Nachweis von SBV eine RTqPCR entwickelt, die ein 88bp großes Fragment des S-Segmentes erkennt. Diese RT-qPCR
wurde den staatlichen veterinärmedizinischen Untersuchungseinrichtungen zur Verfügung
gestellt.
Ein entscheidendes Kriterium für die richtige Auswahl des Untersuchungsmaterials bei der
Infektionserregerdiagnostik ist die Kenntnis über die Lokalisation des Erregers im zu
untersuchenden Tier. Hier ist für SBV aufgrund des Fehlens von entsprechenden Studien
und experimentellen Daten nur sehr wenig bekannt. Am 19.01.2012 wurde das erste
Schaflamm mit SBV-verdächtigen pathomorphologischen Veränderungen (Arthrogrypose,
Hydrancephalie, Brachygnathia inferior, Torticollis) an das Landeslabor Berlin Brandenburg
(LLBB) gesandt. Zur Sicherstellung einer adäquaten und möglichst kostengünstigen
Diagnostik wurden hier verschiedene Organe und Körperflüssigkeiten von 15 Schaflämmern
und vier Kälbern mit SBV-verdächtigen pathomorphologischen Veränderungen auf das
Vorhandensein von SBV RNA untersucht (Milz, Gehirn, Mekonium, Rückenmark, Knorpel,
Nabelschnur, Fruchtwasser aus dem Magen, und externes Fruchtwasser, gewonnen aus
dem Fell). Die Proben wurden im Doppelansatz unter Verwendung des TissueLysers
homogenisiert, eine Nukleinsäureextraktion mittels des High Pure Viral RNA Kit (Roche)
durchgeführt und im Anschluss in der RT-qPCR untersucht.
SBV RNA wurde bei allen Tieren im externen Fruchtwasser, bei allen außer einem Lamm in
der Nabelschnur und bei allen außer einem Lamm und einem Kalb in Gehirn und
Rückenmark nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl externes Fruchtwasser als
auch Nabelschnur, neben Gehirn und Rückenmark, geeignetes Material für den Nachweis
von SBV RNA darstellen. Dies ermöglicht unter entsprechenden Voraussetzungen die
Probenahme direkt im Bestand ohne die Notwendigkeit der Sektion. Im LLBB wurde
aufgrund der ermittelten Ergebnisse folgende Untersuchungsstrategie festgelegt: Von Tieren
mit SBV-verdächtigen pathomorpholgischen Veränderungen (Feststellung durch erfahrene
Veterinärpathologen zur weitgehenden Abgrenzung anderer spontaner oder genetischer
Missbildungen) wird zunächst ein Pool aus externem Fruchtwasser und Nabelschnur
untersucht. Nur im Falle eines negativen PCR-Ergebnisses bei Vorliegen von SBVverdächtigen pathomorphologischen Veränderungen bzw. bei Tieren ohne typische
Missbildungen, bei denen ein SBV-Ausschluss explizit durch den Einsender gefordert wird,
werden zusätzlich weitere Organe (Gehirn, Rückenmark) zum Ausschluss eines möglichen,
falsch negativen PCR-Ergebnisses untersucht. Mit diesem Verfahren konnte bislang bei allen
pathomorphologisch SBV-verdächtigen Schaflämmern und Kälbern auch SBV-RNA im
Fruchtwasser/Nabelschnur-Pool nachgewiesen werden. Tiere ohne Missbildungen bzw.
Tiere mit nicht SBV-typischen Missbildungen waren in der PCR jeweils negativ.
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8. Stendaler Symposium
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Lageplan
Industrieausstellung
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