Das elektrochemische Ungleichgewicht der lebenden

1
2
3
4
5
6
7
Einführung, Organisatorisches, Wurzeln der Biophysik
Gimsa
9
10
4.4.
11.4.
16.4.
18.4.
23.4.
25.4.
Datum
7.5.
9.5.
11
14.5.
12
16.5.
Gimsa
Gimsa
Wachner
Mol. Struktur biol. Syst. (MSBS): Elektrostatik, Atommodelle, Orbitale, Bindungen, chem. & elektr. Potentiale
MSBS: molekulare & ionale Wechselwirkung, Wasserstruktur, Entropie, Molekülbewegung
VL Grundlagen der Biophysik
MSBS: Aktivierungsenergie, Debye-Hückel, Inter- & intramolekulare Wechselwirkungen
Thermodynamik (TD): Grundlagen (Rekapitulation Physik &Chemie)
Wachner
TD: Elektrodeneigenschaften, Wasser- und Ionengleichgewicht, Osmotischer Druck
Wachner
TD: Donnan-Gleichgewicht, Nernst-Gleichung, Goldmann-Gleichung,
Name
Thema
Gimsa
Passive elektrische Eigenschaften (PEE): elektrische Zellstruktur, Oberflächenpotential, Elektrokinetik
Baumann
Membran als Grenzfläche: Grenzflächenspannung, Rastermikroskopietechniken
Baumann
Aktive elektrische Eigenschaften: Transmembranpotential, Nervenerregung, Patch-Clamp
G8 Alternativveranstaltungen
Seminar/Fragestunde und TESTAT
13
21.5.
Gimsa
14
23.5.
Gimsa
30.5.
PEE: Feldverlauf um Zellen, Impedanz, induziertes Transmembranpotential
PEE: elektrisch induzierte Kräfte, Elektrodeformation, Dielektrophorese, Elektrorotation
Reserve (Pfingstwoche=Projektwoche)
15
4.6.
Baumann
16
17
6.6.
11.6.
Baumann
Baumann
BM: Skelett, Rheologie, Blutkreislauf
BM: Strömungen, Schwimmen und Fliegen
18
13.6.
Kuznetsov
BM: Zytomechanik
19
18.6.
Wachner
Physikal. Umweltfaktoren: ionisierende Strahlung, Einführung in die Radioökologie
20
20.6.
Haberland
Physikal. Umweltfaktoren: nichtionisierende Strahlen
21
25.6.
Sakowski
Grundlagen der Systemtheorie: Kinetik, Stoffwechsel- und Austauschsysteme
22
27.6.
Sakowski
Grundlagen der Systemtheorie: Modelle zur Vermehrung, Populationskinetik
23
2.7.
Biomechanik (BM): Ähnlichkeitsanalyse, Allometrie, Elastizität
Pufferzeit bzw. Molekülstrukturaufklärung, Moleküldynamik (NMR/ESR)
Baumann
24
4.7.
25
9.7.
Seminar/Fragestunde
26
11.7.
KLAUSUR
Moderne Entwicklungen: biologische Anwendungen der Mikrosystemtechnik
1
Aktive elektrische
30.5.07, 20Uhr, Uni Rostock,
2
Ulmenstr. 69; Attac Diskussion
http://www.g8-alternative-summit.org/de/
Transmembranpotential
Eigenschaften
Transmembranpotential
Auftretende Potentiale
Nervenerregung
Wiederholung Diffusion/Flux/..
Patch Clamp
Goldmann-Gleichung
Nernst-Potential
Diffusionspotential
3
Messung des Membranpotentials
4
Messung des Membranpotentials
intrazelluläre Messung
optisch
(voltage sens.
dyes)
• Messung durch Einstechen einer
Glasmikroelektrode
dif
Mo
• Messung gegen Referenzelektrode
über ein Voltmeter
rom
ft f
dra
ied
I
NM
© Adam, Läuger, Stark: "Physikalische
Chemie und Biophysik"
5
6
Nernst-Potential I
Auftretende Potentiale
(Membran nur für eine Ionensorte durchlässig)
VMes sin tr . = (ϕ E1 − ϕ i ) + (ϕ i − ϕ a ) + (ϕ a − ϕ E 2 )
Diffusionspotential
Elektrode 1
Membran
-potential
Diffusionspotential
Elektrode 2
µ iel (1) = µ i0 + k BT ⋅ ln ci (1) + zi eψ (1)
µ iel (2) = µ i0 + k BT ⋅ ln ci (2) + zi eψ ( 2)
Bezeichnung
Eigenschaften/Verwendung
Nernstpotential
Gleichgewichtspotential, wenn Membran nur für eine
Ionensorte permeabel
Goldmann-Gleichung
Membran für mehrere Ionensorten permeabel
Diffusionspotential
Unterschiedliche Diffusionskoeffizienten der durch die
Membran der Glasmesselektrode tretenden Ionen
Donnanpotential
Membran für einfache Ionen permeabel und für eine
geladene Proteinsorte nicht permeabel
Wiederholung für
Fluxberechnung
Membran
Thermodynamische Berechnung
c i (1)
c i (2)
ψ(1)
ψ(2)
µeli (2) = µiel (1)
µ i0 + k BT ⋅ ln ci (1) + zi eψ (1) = µ i0 + k BT ⋅ ln ci (2) + zi eψ (2)
zi e(ψ (2 ) −ψ (1)) = −k BT (ln ci (2 ) − ln ci (1))
k BT ci (2 )
ln
zi e
ci (1)
RT ci (2 )
VM = ∆ψ = ψ (2 ) − ψ (1) = −
ln
zi F ci (1)
kB = R / N L
∆ψ = ψ (2 ) −ψ (1) = −
7
F = e NL
8
Wiederholung für
Fluxberechnung
Was ist Diffusion?
Brownsche Molekularbewegung
unregelmäßige Teilchenverschiebung
Materietransport
Zufallsbewegung
Konzentrationsunterschiede
mit der Temperatur zunehmend
Brownsche Molekularbewegung
ungeordnete Wärmebewegung
durch thermisch bedingte Zusammenstöße
vom Botaniker Brown an Sporen entdeckt
© Adam, Läuger, Stark:
"Physikalische Chemie und
Biophysik"
9
Wiederholung für
Fluxberechnung
10
Wiederholung für
Fluxberechnung
1. Ficksches Gesetz
Elektrolytflux I
Flux eines geladenen Teilchens (i) :
r
cw
cw
J i = − i i gradµ~i = − i i grad ( µi0 + RT ln ci + zi Fψ )
NL
NL
⇒ Flux als Funktion des Konzentrationsgradienten
⇒ ungeladene Teilchen
⇒ stationäre Bedingungen, d.h. der Konzentrationsgradient
ist räumlich und zeitlich konstant
mit Diffusionskoeffizienten Di:
r
J i = − wi kTgradci = − Di gradci
wi = Beweglichkeit
[Di ] = m
ci = Konzentration
s
Ji = −
[J i ] = mol2
sm
Di
= Beweglichkeit
kT
ci wi d
( µ i0 + RT ln ci + zi Fψ )
N L dx
bei isobarer sowie isothermen Bedingungen:
Flux nur in Raumrichtung x:
dc
J i = − Di i
dx
wi =
bei Flux nur in x-Richtung:
2
Ji = −
11
ci wi dµ~i
cw
=− i i
N dx
N
 RT dci
dψ

+ zi F
dx
 ci dx



12
Wiederholung für
Fluxberechnung
Nernst-Potential II
Elektrolytflux II
Bedingungen:
als Spezialfall der
Nernst-Planck-Gleichung
c w dµ~i
c w  RT dci
dψ 

Ji = − i i
= − i i 
+ zi F
N dx
N  ci dx
dx 
cI = konstant bis xI
cII = konstant ab xII
 dc z Fc dψ 
J i = − Di  i + i i

RT dx 
 dx
∆c/ ∆ x = konstant
zwischen xI und xII
mit Di = wi kT erhält man :
Gleichgewicht =>
 dc z Fc dψ 
J i = − Di  i + i i

RT dx 
 dx
z Fc
 dc z Fc dψ 
J i = 0 = − Di  i + i i
 = dci + i i dψ
RT dx 
RT
 dx
Nernst-Planck-Gleichung
∆ψ = ψ I −ψ II = −
Integration =>
RT ciI
ln
zi F c iII
NernstPotential
13
14
Φ
Goldman-Gleichung
Herleitung
innen
ci
z Fc dψ 
 dc
jυ = − Dυ  υ + υ υ

RT dx 
 dx
=> Membran nur für eine Ionensorte (z.B. K) permeabel
Nernst-PlankGleichung
Vm
Vm< 0
Analytische Lösung der Differentialgleichung mit
folgenden Randbedingungen möglich:
I
K
II
K
RT c
ln
F
c
Die elektrische Feldstärke in der Membran ist konstant
z Fc dψ
 dc
jυ = − Dυ  υ + υ υ
RT dx
 dx
In der Realität: => Membran für mehrere Ionensorten permeabel
c aK c aNa cCli
≠
≠
c iK c iNa cCla
GoldmanGleichung III
Φ
Herleitung
innen
ci
Menbran
aussen
ca
I = ∑ zυ jυ = 0
aussen
ca
Vm
jK + jNa − jCl = 0
Vm
) ⋅ Dυ zυ eVm
zυ e⋅Vm
k B ⋅T
)
Vm< 0
PK ⋅
x
d
ci
ca
mit : gυ = υ = υ
cυ (0) cυ (d )
(Verteilungskoeffizient)
zυ e⋅Vm
z eV (ca − ci ⋅e k B ⋅T )
jυ = Pυ υ m υ υ zυ e⋅Vm
kB T
(1 − e k B ⋅T )
Vm< 0
0
0
k BTd ⋅ (1 − e
Menbran
0
υ
e ⋅V m
k B ⋅T
e⋅Vm
k B ⋅T
d
e⋅Vm
k B ⋅T
eVm (c aK − c iK ⋅ e )
eV (c a − c iNa ⋅ e )
eV (c a − ciCl ⋅ e )
+ PNa ⋅ m Na
− PCl ⋅ m Cl
=0
e ⋅V m
e⋅Vm
e ⋅Vm
k BT
kB T
k BT
k B ⋅T
k B ⋅T
(1 − e )
(1 − e )
(1 − e k B ⋅T )
Lösung der Differentialgleichung mit obigen Randbedingungen:
gυ ⋅ (cυ − cυ ⋅ e
innen
ci
!
!
 ∂c
z e ⋅V 
jυ = − Dυ  υ − cυ ⋅ υ m 
 ∂x
k B ⋅T ⋅d 
jυ =
16
ortsunabhängigen Diffusionskoeffizienten und sie wandern unabhängig durch die Membran
0
zυ e⋅Vm
k B ⋅T
dψ
V
=E= m
dx
d
• Membran wird als homogene Phase aufgefasst, d.h. jede Ionensorte hat einen
15
Differentialgleichung:
i
e = F / NL
kB = R / NL
ist die Innenkonzentration ebenfalls konstant
Φ
Goldman-Gleichung II
a
mit :
 ∂c
z e ⋅Vm 


= − Dυ  υ − cυ ⋅ υ
k B ⋅ T ⋅ d 

 ∂x
• Membran ist in stationärem Zustand, d.h. bei konstanter Außenkonzentration
=> Goldman-Gleichung als Lösung der Nernst-Plank-Gleichung
erforderlich
Herleitung
x
d
0
(gute Näherung bei kleiner Ionenkonzentration in der Membran)
=> kein echtes Gleichgewicht
mehr möglich weil
aussen
ca
Menbran
0
Einfacher Fall beim Nernstpotential (Gleichgewichtszustand):
∆ψ = ψ I − ψ II = −
Goldman-Gleichung I
a
i
PK (cK − cK ⋅ e
e⋅Vm
k B ⋅T
a
a
i
) + PNa (c Na − c Na ⋅ e
a
a
e ⋅Vm
k B ⋅T
a
i
) − PCl (cCl − cCl ⋅ e
i
i
i
e ⋅Vm
k B ⋅T
PK cK + PNa c Na − PCl cCl = (PK cK + PNa cNa − PClcCl ) ⋅ e
)=0
e ⋅V m
k B ⋅T
Goldmann-Gleichung
g ⋅D
mit : Pυ ≡ υ υ
d
(Permeabilitätskoeffizient)
17
a
a
R ⋅ T  PK cKa + PNa c Na
+ PCl cCli
k B ⋅ T  PK cKa + PNa c Na
− PCl cCla 
 = Vm =
ln
ln
i
i
i 
i
i
a
F
e
 PK cK + PNa c Na + PCl cCl
 PK cK + PNa c Na − PCl cCl 



18
x
Ruhemembranpotential & Goldmann-Gleichung
Vm =
Vm =

 ∑ Pυ cυa + ∑ Pµ cµi
R ⋅ T  Kationen
Anionen
ln

F
i
a
 ∑ Pυ cυ + ∑ Pµ cµ
Anionen
 Kationen






Auftretende Potentiale
Verallgemeinerte
Goldmann-Gleichung
VMes sin tr . = (ϕ E1 − ϕ i ) + (ϕ i − ϕ a ) + (ϕ a − ϕ E 2 )
Diffusionspotential
Elektrode 1
a
R ⋅ T  PK cKa + PNa cNa
+ PCl cCli 

ln
i
i
a 
F
 PK cK + PNa cNa + PCl cCl 
Einfluss einer bestimmten Ionenart um so stärker, je
a) größer das Konzentrationsgefälle
b) höher die Permeabilität
Membranpotential
Membran
-potential
Vm =
Diffusionspotential
Elektrode 2
a
R ⋅ T  PK cKa + PNa cNa
+ PCl cCli 

ln
i
i
a 
F
P
c
P
c
+
Na Na + PCl cCl 
 K K
Ruhezustand: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45
19
Einleitung zum
Diffusionspotential I
mit : c+ ( x ) ≈ c− (x ) = c(x )
Flüsse beider Ionen schließlich gleich groß
sowie : z+ = 1 und z− = −1
Auftreten in flüssiger Phase und Phasen,
die von einer Membran getrennt sind
Aus Grundbedingungen der Elektroneutralität zu berechnen
dψ
D − D− RT 1 dc
=− +
dx
D+ + D− F c dx
Integration über Membrandicke
bzw. Kapillarlänge d
VDiff = ψ (0) −ψ (d ) =
D+ − D− RT c(d )
ln
D+ + D− F
c(0)
21
22
Welches Ion bestimmt das Membranpotenzial?
Auftretende Potenziale
Ion
VMes sin tr . = (ϕ E1 − ϕ i ) + (ϕ i − ϕ a ) + (ϕ a − ϕ E 2 )
Membranpotenzial
z Fc dψ 
z Fc dψ 
 dc
 dc
D+  + + + +
 = D−  − + − −

RT dx 
RT dx 
 dx
 dx
Einsetzen der Nernst-PlankFluxgleichungen
Elektrisches Feld behindert Diffusion
des „schnelleren“ Ions und beschleunigt
das Gegenion
© Adam, Läuger, Stark:
"Physikalische Chemie und
Biophysik"
j + = j−
Positiver und negativer Fluß ist gleich
Aufgebaute Spannung = Diffusionspotential
Diffusionspotenzial
Elektrode 1
Diffusionspotentials II
Berechnung des
Elektrische Potentialdifferenz durch
unterschiedliche Beweglichkeit der
Ionen eines Salzes in einem
Konzentrationsgradienten
D+ > D−
20
Membran
-potenzial
Vm =
Diffusionspotenzial VDiff =
Diffusionspotenzial
Elektrode 2
Konzen tration
im Bl ut
ca
(m Mo l/l )
Ne rns t-P oten tial
(m V )
V0
K+
400
20
-75
Na +
Cl -
50
440
+102
40 ....150
Vm =
a
R ⋅ T  PK cKa + PNa cNa
+ PCl cCli 

ln
i
i
a 
F
P
c
P
c
+
Na Na + PCl cCl 
 K K
D+ − D− RT cElektr.
ln
D+ + D− F
cMedium
Konzen tration
im Axon
ci
(m Mo l/l )
560
-68. ...-33
R ⋅T  P c + P c + P c 

ln
F
P c +P c +P c 
a
K K
i
K K
a
Na Na
i
Na Na
i
Cl Cl
a
Cl Cl
Ruhezustand: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45
Bei KCL ist
D+ ≈ D−
Bei Gliazellen entspricht Ruhepotenzial dem Kaliumpotential
Bei Neuronen meist geringer (-55 bis – 65 mV) => geöffnete Natriumkanäle
Für Gesamtbetrachtung zusätzlich Elektrodenpotenziale beachten!
23
24
Nervenerregung
Neuronen auf Sensorchip
Funktion Ionenkanal
Verlauf Aktionspotenzial
Auslösung des Aktionspotenzials
Neuronen auf Elektroden
DAB gefärbte Zellen auf Neurochip
(nach 3 Tagen auf dem Chip)
(nach 4 Wochen auf dem Chip)
25
26
(REM Bild vom EM Zentrum Universität Rostock)
(DAB Bild von Simone Stüwe)
Substanzspezifische Antwort
Messung Aktionspotenziale
Native Aktivität
Blockade des GABAA
Receptors
Nur NMDA-Rezeptor
modulierte Aktivität
Parallele Messung an verschiedenen
Elektroden auf dem Neurosensorchip.
27
28
Grundlage der Erregbarkeit
Gewebespez. Dosis-Wirkungs-Kurve
Lipiddoppelschicht undurchlässig für geladene Teilchen
Ungleiche Verteilung von Ionen: Kalium, Natrium, Chlorid
100
Verteilung durch Transporter aufrechterhalten
Rückenmark
Auditory Cortex
90
80
Mit ATPase pro ATP 3 Na+ nach außen und 2 K+ nach innen
70
Aufbau von Konzentrationsgradienten
60
50
40
30
Ion
20
10
0
0.1
1
10
Konzen tration
im Axon
ci
(m Mo l/l )
Konzen tration
im Bl ut
ca
(m Mo l/l )
Ne rns t-P oten tial
V0
(m V )
100
TMTC Konzentration [µM]
29
K+
400
20
-75
Na +
Cl -
50
440
+102
40 ....150
560
-68. ...-33
30
Die Natrium-Kalium ATPase
Funktionsweise eines Ionenkanals
pro ATP 3 Na+ nach außen und 2 K+ nach innen
Membranintegrale Proteine als
hydrophile Pore:
o selektiv für Ionen
o i. d. R. regulierbar
Bindungsstellen und Energiemaxima
für spezifisches Ion
o Bindungsstellen erleichtern den Durchtritt
o Energiemaxima oszillieren beim Durchtritt
des Ions
In Nervenzellen muss Na+ von einer Konzentration von 143mM auf
14mM (im Zytosol) und K+ von 4 auf 157mM gebracht werden.
© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"
31
Aufbau Ionenkanal
32
Modell eines Natriumkanals
Spannungsabhängige Kanäle mit
ähnlicher Struktur
o gleicher genetischer Ursprung
Ionenkanäle aus mehreren Domänen:
o 4 hydrophobe Domänen verankern
den Kanal in der Membran
o 4 hydrophile Sequenzen bilden
hydrophile Pore (H5)
o Sequenz A4 in der hydrophoben
Domäne besitzt ATP-Bindungsstelle
o Intrazelluläre Domänen
Kaliumkanal aus vier identischen
Untereinheiten
© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"
33
34
Wie kommt die Ionenselektivität zustande?
Struktur der K-Kanals
Chloridionen durch Ladung selektiert:
o Pore mit positiven Bindungsstellen
Kalium im hydratisierten Zustand klein
o Durchtritt nur mit Hydrathülle
Natrium im unhydratisierten Zustand
klein
o Trennung von der Hydrathülle beim
Durchgang
© Kandel, Jessell, Schwartz. "Principles of neuroscience"
35
36
Was ist ein Aktionspotenzial?
Verlauf des Aktionspotenzials
Informationsvermittelndes Signal
Zusammenbruch des Ruhepotenzials bis
zu positiven Werten von ca. +40 mV
=> Depolarisierung; in ca. 500 µs
Depolarisierung bis zum Schwellenpotenzial
Beim Schwellenpotenzial Öffnung
spannungsabhängiger Na+-Kanäle
Natriumeinstrom => Depolarisierung
Rückkehr zum Ruhepotenzial mit
Hyperpolarisierung
=> Repolarisierung, in ca. 500 µs
Deaktivierung der Natriumkanäle
beendet Einstrom
Alles-oder-Nichts-Vorgang
Depolarisierung verstärkt
Kaliumausstrom => Repolarisierung
absolute Refraktärzeit von 2 ms
(keine Erregbarkeit)
Inaktivierung des Natriumkanals
=> Refraktärzeit
37
38
Aktionspotenzial Auslösung
Ströme beim Aktionspotenzial
Aktionspotenzial von spannungsabhängigen
Natriumkanälen getragen
Aktionspotenzial mit verschiedenen
Stromkomponenten Natriumeinstrom
und Kaliumausstrom
Anstieg zum Schwellenpotenzial aus verschiedenen
Gründen:
o Potenzialänderung durch präsynaptische Zelle
bei elektrischen Synapsen
Isolierung der Ströme durch selektive
Blockade
o Rezeptorpotenziale bei Sinneszellen
o Natrium => Tetrodoxin, TTX
o Neurotransmitterbindung an ligandengesteuerten
Ionenkanälen
o Kalium => Triethylamin, TEA
Nachweis der Spannungsabhängigkeit
o Second-messenger-Bindung z. B. Ca2+, cAMP,
DAG
Beschreibung mit Kanalleitfähigkeiten
(Hogdgin-Huxley)
© Kandel, Jessell, Schwartz.
"Principles of neuroscience"
Depolarisierung zum Schwellenpotenzial immer
durch Natrium- oder Calciumeinstrom
39
Kanäle können unterschiedlich getriggert werden
40
Aktionspotenzial Ausbreitung
Ausbreitung der Aktionpotenziale
über lange Strecken an Axonen
Passive Ausbreitung läßt Signal an
Widerständen versiegen
Aktionspotenzial treibt benachbarte
Membran über das Schwellenpotenzial
Aktive Fortleitung durch fortgesetzte
Auslösung => „Zündschnureffekt“
Inaktivierung der Natriumkanäle
verhindert Zurücklaufen des
Aktionspotenzials
© Dudel, Menzel, Schmidt: "Neurowissenschaften"
41
42
Nervenzellen Signalleitung
Signal direction
Ausbreitung des Aktionspotentials
Dendrites
AP-Ausbreitungsgeschwindigkeiten in Nervenfasern (aus C.L.Schauf et al.)
Cell body
Cell
body
Nerv
Durchmesser
Myelin
v
Riesenaxon
500µm
nein
25m/s
großer motorischer Nerv,
Beinmuskel
20µm
ja
120m/s
Nerven von Druckrezeptoren der Haut
10µm
ja
50m/s
Nerven von
Schmerzrezeptoren
1µm
nein
2m/s
Node of Ranvier
Myelin sheath
Signal
pathway
Axon
Schwann cell
Nucleus
Nucleus
Nodes of
Ranvier
Myelin sheath
Schwann cell
Synaptic knobs
Copyright © 2003 Pearson Education, Inc. publishing as Benjamin Cummings
43
44
Prinzip der Patch-Clamp-Technik
von Neher und Sakmann Ende der
70er erfunden (Nobelpreis 1991)
Zelle wird mit Glaselektrode angesaugt
=> Gigaseal, d. h. mit > 1 GΩ
PatchClampTechnik
Danach entweder Herausreißen der
Membran oder Öffnen der Membran
unter der Elektrode
Im Membranfleck optimal nur ein
Ionenkanal von jeder Sorte
=> Einzelkanalaufnahmen
Prinzip der Patch-Clamp-Technik
Bei Öffnen der Membran:
Whole-Cell-Aufnahmen
Patch-Clamp Mess-Modi
Beispiele Patch-on-Chip Systeme
© Kandel, Jessell, Schwartz.
"Principles of neuroscience"
45
Messapparatur von Neher/Sakmann
46
Messung I
Deutsches
Museum
Bonn
47
Universität Karlsruhe
48
Mess-Schaltung
Messaufbau
Operationsverstärker
49
Patch-Clamp Mess-Modi
Charite, Berlin
50
Einzelkanal-Aufnahmen
Whole-Cell:
Im inside-out oder outside-out Modus
Membrandurchbruch in Pipettenöffnung;
Summe vieler Ionenkanäle
Einzelne Kanalöffnungen messbar
Gequantelter Charakter der Kanalöffnungen
sichtbar
On-Cell:
Ströme zeigen immer die volle Amplitude
Einsaugen Zellmembranfleck ohne die
Zelle zu zerstören; Einzelkanalmessungen
Kanäle können nur ganz geöffnet oder
geschlossen sein
o z. B. Kaliumstrom im Inside-out-Modus
o kleine Amplitude ≈ 2 pA
Excised (inside-out):
Zellmembraninnenseite weist nach außen;
komplizierte Herstellung, Einzelkanalmessungen
© Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik"
51
Whole-Cell-Aufnahmen
52
Ersatzschaltbild der Zelle im Patch-Clamp
Summe aller Öffnungen eines Kanaltypen
können gemessen werden
Zellwiderstand R ≈ 1 GΩ
Gesamtstrom über der Zellmembran
Zellkapazität C ≈ 1-10 pF
große Amplituden ≈ 800 pA
Pipettenwiderstand RS ≈ 10 MΩ
(„rohe“ Elektroden mit 2 - 5 MΩ =>
Zellkomponenten erhöhen Widerstand)
ER: Haltepotential
VP: Pipettenpotential (VP wird vom
Verstärker angelegt bzw. gemessen, dabei
muss RS überwunden werden)
© Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik"
© Numberger, Darguhn: "Patch-Clamp-Technik"
53
© Neher, Sakmann: "Single-channel-recording"
54
Funktion Spannungsklemme (Voltage-Clamp)
Current-Clamp-Technik
Umkehrung der Spannungsklemme
von Cole und Curtis in den 30er
Jahren entwickelt
Strom wird vorgegeben und
resultierende Spannung gemessen.
Prinzip: Spannung konstant =>
Messung des Kompensationsstroms
Gleicher Schaltkreis wie bei
Voltage-Clamp mit zusätzlicher
Rückkopplung
Es wird ein Kompensationsstrom
erzeugt, der genauso groß ist wie
der Strom der durch die Membran
fließt
55
Patch-on-Chip Systeme
56
Realisierungsbeispiel AVIVA
57
Realisierungsbeispiel Cytocentrics
58
Patch-on-Chip Gesamtsystem
© Taylor & Francis
59
Cytocentrics AG, Rostock
60
Literatur
Einsatzgebiete
Adam – Läuger – Stark (2003), Physikalische Chemie und Biophysik , Springer Verlag
Erwin Neher und Bert Sakmann, Die Erforschung von Zellsignalen mit der Patch-Clamp Technik,
Spektrum der Wissenschaft (Mai 1992)
Vorteile Patch-on-Chip Systeme:
geringer apparativer Aufwand (Platz, Kosten, ..)
NMI Natural and Medical Sciences Institute at University of Tuebingen, Germany
Bedienung auch durch ungeübtes Personal
www.uni.kiel.de/zbm/forschung/patch.html
leichte Parallelisierbarkeit => hoher Durchsatz an Messungen
www.charite.de/gastroenterologie/Forschung/patbeisp.de
www.biologie.de/biowiki/Patch-Clamp-Technik
Einsatzgebiete:
Biomedizinische Forschung
www.
www. Itb.uni
Itb.uni--karlsruhe.de
karlsruhe.de
Medikamentenentwicklung
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