Kurstag 10
Werbung
Kurstag 10 Aminosäuren und Kohlenhydrate Stichworte zur Vorbereitung Biogene Aminosäuren, Peptidbindung, Säure/Base-Eigenschaften von Aminosäuren, Stereochemie der Aminosäuren. Sesselform der Zucker, Halbacetale, Vollacetale, reduzierende Eigenschaften von Zuckern. Ziel des Versuchstags Einführung in die grundsätzlichen Reaktionsmöglichkeiten der Kohlenhydrate und Amiosäuren, zweier wichtiger biologischer Stoffklassen. Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Theorie Aminosäuren Aminosäuren sind als Bausteine der Proteine von grundlegender biochemischer Bedeutung. Struktur der Aminosäuren Aminosäuren enthalten, wie der Name schon sagt, eine saure Carboxylgruppe und eine Aminogruppe. Die Aminogruppe kann im Prinzip beliebig weit entfernt von der Carboxylgruppe sitzen: α–Aminobuttersäure β-Aminobuttersäure γ-Aminobuttersäure Unter allen denkbaren Aminocarbonsäuren haben jedoch die α-Aminocarbonsäuren die weitaus größte Bedeutung, weil in der Natur nahezu ausschließlich αAminocarbonsäuren vorkommen: Der eingerahmte Teil des Moleküls ist allen Aminosäuren gemeinsam, die insgesamt 20 in der Natur vorkommenden biogenen Aminosäuren unterscheiden sich lediglich im Rest R. Stereochemie der Aminosäuren Mit Ausnahme von Glycin (R =H) ist das α-C-Atom aller biogenen Aminosäuren chiral, es trägt vier verschiedene Substituenten. Es existieren daher für jede Aminosäure 2 zueinander spiegelbildliche Formen, die man mit D- bzw. L-Form bezeichnet. In der Natur findet man jedoch praktisch ausschließlich die L-Form: D-Form L-Form Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 1 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate D- bzw. L-Form haben völlig gleiche chemische Eigenschaften, unterscheiden sich jedoch in einigen physikalischen Eigenschaften: Sie drehen z.B. die Ebene von polarisiertem Licht in verschiedene Richtungen. Ein Gemisch der D- und L- Form im Verhältnis 1:1 bezeichnet man als Racemat. Zwitterion Aminosäuren enthalten im gleichen Molekül eine saure Gruppierung, die Carboxylgruppe und eine basische Aminogruppe. In wässriger neutraler Lösung gibt die saure Carboxylgruppe ein H+-Ion ab. Dieses wird von der basischen Aminogruppe übernommen: ungeladene Form Zwitterion Das Gleichgewicht liegt in neutraler wässriger Lösung praktisch ausschließlich auf der Seite des so genannten Zwitterions. Gibt man zu dieser Zwitterionenform H+Ionen (starke Säure), so nimmt das Zwitterion ein H+-Ion auf: In saurer Lösung liegt die Aminosäure als am Stickstoff einfach positiv geladenes Ion vor. Versetzt man das Zwitterion jedoch mit NaOH, dann gibt das Zwitterion ein H+Ion ab: In alkalischer Lösung liegt die Aminosäure in der an der Carboxylgruppe einfach negativ geladenen Form vor. Versetzt man die saure Form der Aminosäure mit NaOH, gibt sie schrittweise 2 H+-Ionen ab: sauer neutral Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen alkalisch 2 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Eine Aminosäure in saurer Form verhält sich also wie eine schwache zweiprotonige Säure. Versetzt man die saure Form der Aminosäure schrittweise mit NaOH, erhält man ein Titrationsdiagramm, das dem Titrationsdiagramm einer schwachen zweiprotonigen Säure entspricht: 2 Äquivalenzpunkte, 2 pK-Werte, 2 Pufferbereiche A = pKCOOH = 2,4 B = pKNH2 = 9,8 Das obige Titrationsdiagramm ist etwas idealisiert gezeichnet. Tatsächlich erhält man nur den ersten Teil der Kurve der Theorie entsprechend, während der 2. Teil der Kurve gegen Ende etwas abflacht. Isoelektrischer Punkt Als isoelektrischer Punkt IP einer Aminosäure oder eines Proteins wird derjenige pHWert bezeichnet, bei dem die Aminosäure bzw. das Protein nach außen hin ungeladen erscheint, also zu 100% als Zwitterion vorliegt. An diesem Punkt ist die Löslichkeit einer Aminosäure bzw. des Proteins in Wasser am geringsten (Warum?). Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 3 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate alkalisch IP sauer Der IP ist eine für jede Aminosäure charakteristische Konstante, die von den pKWerten der funktionellen Gruppen abhängt. Er liegt für die neutralen Aminosäuren zwischen pH 6 und 7, für saure Aminosäuren (Glu, Asp) im schwach Sauren, für basische Aminosäuren (Arg, Lys) im Alkalischen. Der IP lässt sich für neutrale Aminosäuren aus dem arithmetischen Mittel der beiden pK-Werte ermitteln: Glycin: pK1= 2,4 pK2 = 9,8 IP = 6,1 Dünnschichtchromatographische Trennung von Aminosäuren Auf das Prinzip der Trennung wurde bereits an Kurstag 7 ausführlich eingegangen. In diesem Fall wird Butanol als mobile Phase verwendet und nimmt die Aminosäuren entsprechend ihrer Löslichkeit mit. Gut butanollösliche (hydrophobe) Aminosäuren werden weiter wandern als gut wasserlösliche (hydrophile) Aminosäuren. Die Wasserlöslichkeit nimmt in der Reihenfolge Lysin-HCl, Glycin, Valin, Leucin ab, die Butanollöslichkeit zu. Leucin wandert daher am weitesten, gefolgt von Valin, Glycin und Lysin-HCl. Lysin-HCl ist infolge seiner doppelten Salzstruktur am besten wasserlöslich: Lysin·HCl Glycin Valin Leucin Ninhydrinreaktion Ninhydrin (2,2-Dihydroxy-indan-1,3-dion) reagiert in einer sehr komplizierten und sehr empfindlichen Reaktion mit Aminogruppen zu einem rotvioletten Farbstoff: Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 4 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Im ersten Reaktionsschritt kondensiert Nihydrin mit der Aminosäure unter Abspaltung von 2 Mol Wasser zur so genannten Schiff’schen Base: Die Schiff‘sche Base spaltet CO2 ab, anschließend bildet sich ein Tautomeriegleichgewicht aus: Letztere Verbindung stellt eine Schiff‘sche Base eines Aldehyds dar, der daraus durch Hydrolyse neben 2-Amino-indan-1‚3-dion entsteht: 2-Amino-indan-1,3-dion Aldehyd Anschließend reagiert das 2-Amino-indan-1,3-dion mit einem weiteren Molekül Ninhydrin zum Farbstoff: Peptidbindung Zwei Aminosäuren lassen sich zu einem Dipeptid verknüpfen, indem die Carboxylgruppe der einen Aminosäure mit der Aminogruppe der zweiten Aminosäure unter Wasserabspaltung reagiert. Die dabei entstehende Säureamidgruppierung -CO-NH- bezeichnet man als Peptidbindung. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 5 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Dipeptid Wie bei anderen Säureamiden ist durch die elektronenanziehende Wirkung der benachbarten Carbonylgruppe die Basizität des Amid-N sehr stark vermindert. Dies lässt sich durch folgende mesomere Grenzstruktur leicht erklären: Durch weitere Kondensation von Aminosäuren entstehen zunächst Peptide, dann Polypeptide und schließlich Proteine. Kohlenhydrate Kohlenhydrate sind Polyhydroxycarbonylverbindungen. Sie werden in Pflanzen durch Photosynthese aus CO2 und H2O unter Freisetzung von O2 aufgebaut. Für diese enzymatische Synthese wird Lichtenergie benötigt, die durch das Chlorophyll (Strukturformel siehe Kurstag 7) absorbiert wird. Kohlenhydrate werden in Form von Polysacchariden wie z.B. Stärke (Pflanze) und Glykogen (Tier) gespeichert. Durch den Abbau der Glucose bei der Atmung wird Energie, CO2 und H2O frei. Photosynthese 6 CO2 + 6 H2O + Energie 6 (CH2O)6 + 6 O2 Atmung Einteilung der Kohlenhydrate Kohlenhydrate enthalten neben mehreren Hydroxylgruppen eine Aldehyd- oder Ketofunktion und werden entsprechend als Aldosen oder Ketosen bezeichnet. Die Aldehydgruppe sitzt am C1, die Ketogruppe häufig am C2 (Fructose). Je nach Zahl der C-Atome in der Kette werden Aldosen und Ketosen als Triosen, Tetrosen, Pentosen und Hexosen bezeichnet. Die Aldose Glucose C6O6H12 ist also eine Hexose (genauer eine Aldohexose), die Ketose Fructose C6O6H12 ist ebenfalls eine Hexose, speziell eine Ketohexose. Die kleinste Aldose ist der D-Glycerinaldehyd und die kleinste Ketose 1,3-Dihydroxyaceton. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 6 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Memotechnische Hilfe für Glucose: die Stellung der OH-Gruppen in FischerProjektion ist von oben nach unten durch tatütata einprägbar, wobei ta = rechts, tü = links. Die Zugehörigkeit zur D- bzw. L-Reihe gibt die OH-Gruppe (an einem chiralen C) an, die am weitesten von der Carbonylgruppe entfernt ist (OH rechts = D-Zucker, OH links = L-Zucker). Aldo-Triose Aldo-Hexose D-(+)-Glycerinaldehyd D-(+)-Glucose Keto-Hexose D-Fructose Keto-Triose 1,3-Dihydroxyaceton D-Zucker Weitere wichtige Hexosen sind die D-Mannose und die D-Galactose. Sie unterscheiden sich von D-Glucose in der Konfiguration an einem C-Atom. Zucker, die sich nur durch die Konfiguration an einem C-Atom unterscheiden, bezeichnet man als epimere Zucker. D-Mannose D-Galactose Einteilung der Kohlenhydrate nach Zahl der Bausteine Monosaccharide: freie Aldosen und Ketosen, z.B. Glucose und Fructose Oligosaccharide: 2-10 Zuckerbausteine, z.B. Saccharose, Maltose Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 7 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Polysacchride: Kohlenhydratkette mit 10 bis zu mehreren Tausend Zuckerbausteinen; z.B. Cellulose, Stärke, Inulin Reaktionen von Kohlenhydraten Monosaccharide sind durch die vielen Hydroxylgruppen im Molekül gut wasserlöslich. Aldosen sind an der Aldehydgruppe oxidierbar. Diese Reaktion führt bei Glucose zu Gluconsäure. Die wichtigsten Nachweisreaktionen für Aldosen sind die Fehling-Reaktion und das Tollens-Reagens (Silberspiegelreaktion). Fehling-Reaktion Glucose kann nur in alkalischer Lösung oxidiert werden. Unter diesen Bedingungen fällt aber das Oxidationsmittel Cu2+ als Cu(OH)2 aus, was man durch Zugabe des Komplexbildners K-Na-Tartrat verhindert. Das Reagens wird aus den zwei Lösungen Fehling I (7g CuSO4 in 100ml Wasser) und Fehling II (34,5g K-Na-Tartrat und 12g NaOH in 100ml Wasser) vor Gebrauch gemischt. Reaktionsgleichung: 2 Cu2+ + R – CHO + 4 OHCu2O↓ + R – COOH + 2 H2O Dabei fällt Cu2O als roter Niederschlag aus der Lösung aus. Tollens-Reaktion Analog verläuft die Reaktion mit Ag+-Ionen. 2 Ag+ + R – CHO + H2O Ag↓ + R – COOH + 2 H+ Die reduzierende Wirkung von Glucose auf Silberionen wird zur Verspiegelung von Glasoberflächen eingesetzt. Anmerkung Aldosen, die am C1 oxidiert sind, heißen Onsäuren (aus Glucose entsteht Gluconsäure); Aldosen, welche unter Erhalt der Carbonylgruppe an C1, an C6 oxidiert sind heißen Uronsäuren (z.B. Glucuronsäure, wichtig im Zellstoffwechsel zur Entgiftung). Liegen sowohl C1 als auch C6 oxidiert vor, so entstehen Aldarsäuren (Glucarsäure). Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 8 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Reduzierende Wirkung von Fructose Fructose wirkt im Alkalischen ebenfalls reduzierend, obwohl sie keine Aldehydgruppe enthält. Die Erklärung liegt darin, dass Fructose im Alkalischen mit Glucose über ein Endiol im Gleichgewicht steht (Keto-Enol-Tautomerie): D-Fructose Endiol D-Glucose Fructosebestimmung nach Seliwanow Die meisten Farbreaktionen der Kohlenhydrate haben nur noch historische Bedeutung. Die Reaktion nach Seliwanow eignet sich jedoch zu einem sehr spezifischen Nachweis für Fructose. Die Reaktion beruht auf der Tatsache, dass Pentosen und Hexosen beim Erhitzen mit konz. HCl Wasser abspalten und substituierte Furane bilden. Das aus Fructose entstehende Furanderivat reagiert mit Phenolen (Resorcin = 1,3-Dihydroxybenzol) sehr spezifisch zu einem nicht genau definierten roten Farbstoff: Bildung cyclischer Halbacetale Aldehyde und Ketone bilden bekanntlich mit Alkoholen Halbacetale bzw. Halbketale (siehe Kurstag 9). Bei Glucose kann nun die OH-Gruppe am C5 intramolekular mit der Carbonylgruppe am C1 reagieren. Es bildet sich ein cyclisches Halbacetal. Der entstandene 6-Ring besitzt das Grundgerüst des Tetrahydropyrans. Solche Saccharide werden daher als Pyranosen bezeichnet. Die Bildung eines cyclischen Halbacetals bedeutet ein Gewinn an freier Energie gegenüber der offenkettigen Form. Daher liegt Glucose in wässriger Lösung nur zu ca. 0,003% in der freien Aldehydform vor. Durch die Halbacetal- bzw. Halbketalbildung entsteht ein neues Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 9 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Chiralitätszentrum. Liegt in der Haworth-Formel eine neue OH-Gruppe oberhalb der Ringebene und zeigt in die gleiche Richtung wie das CH2OH-Gruppe am C5, so liegt die β-Form vor, zeigt die OH-Gruppe nach unten, liegt die α-Form vor. Aus der offenkettigen D-Glucose bildet sich in wässriger Lösung α-D- und β-DGlucopyranose. Die beiden Formen stehen dabei miteinander im Gleichgewicht (α:β 36% liegen in α-Form vor, 64%liegen in β-Form vor). Man bezeichnet die beiden Formen als anomere Zucker. α-D-Glucopyranose D-Glucose β-D-Glucopyranose Haworth-Schreibweise α-D-Glucopyranose offenkettig β-D-Glucopyranose Auch die Ketohexose Fructose liegt in Lösung als Furanose (Ringschluss an C2 und C5) und zum Teil auch als Pyranose (Ringschluss an C2 und C6) vor. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 10 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Fischer-Projektion α-D-Fructopyranose D-Fructose β-D-Fructopyranose Haworth-Schreibweise Sesselform der Pyranose Besser als die Haworth-Formeln, welche die Pyranosen nur unvollständig beschreiben, da sie nur Konstitution und Konfiguration zeigen, kann die Sesselformschreibweise die räumliche Anordnung (Konformation) der Substituenten angeben: α-D-Glucopyranose β-D-Glucopyranose Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 11 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Bei β-D-Glucopyranose stehen allen Substituenten äquatorial (e), im α-Anomeren steht die OH-Gruppe am C1 axial (a). Bei β-D-Glucopyranosen stehen jeweils benachbarte Substituenten trans zueinander (beachte: e,e-Anordnung = trans). Glucose ist daher das energieärmste Modell der Aldohexosen (Verbreitung in der Natur!). Der Pyranosering wird so gezeichnet, dass der Ringsauerstoff rechts hinten steht und C4 oben und C1 unten steht. Die Konformation wird auch als 4C1Konformation bezeichnet. Glycoside Werden die Halbacetal- bzw. Halbketal-Funktionen von Pyranosen und Furanosen mit Alkoholen umgesetzt, so erhält man die entsprechenden Vollacetale bzw. Vollketale. Acetale und Ketale von Monosacchariden werden als Glycoside (exakt OGlykoside) bezeichnet. Eine glykosidische Bindung ist also eine Bindung, die durch Reaktion einer halbacetalischen OH-Gruppe am anomeren C-Atom mit einem Alkohol unter Wasserabspaltung entstanden ist. Anmerkung: Die Glykoside haben große biochemische Bedeutung und kommen in verschiedenen Naturstoffen (z.B. Amygdalin) vor. Den zuckerfremden Anteil des Glycosids bezeichnet man als Aglycon. bzw. Methyl-α-D-Glucopyranosid (SmT 166°C, [ αD] = +158°) bzw. Methyl-β-D-Glucopyranosid (SmT 107°C, [ αD] = -33°) Eine glykosidische Bindung liegt auch bei Di- bzw. Polypeptiden vor. Glykosidische Bindungen zeigen formal Ähnlichkeit mit einer Etherbindung, chemisch sind sie jedoch stark verschieden. Glykosidische Bindungen werden im Gegensatz zur Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 12 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Etherbindung in wässrig saurem Medium leicht gespalten. Glycoside zeigen keine reduzierenden Eigenschaften. Disaccharide Monosaccharide können mit einem weiteren Monosaccharidmolekül unter Abspaltung von Wasser ein Disaccharid bilden. Dabei ergeben sich zwei Möglichkeiten: 1. Die glykosidische Bindung entsteht durch Reaktion der halbacetalischen OHGruppe an C1 (anomeres C-Atom) des ersten Monosaccharids mit einer alkoholischen OH-Gruppe (z.B. C4) des zweiten Monosaccharids. Es entsteht z.B. eine 1,4-Verknüpfung. Die reduzierenden Eigenschaften bleiben durch die Halbacetalform des zweiten Zuckermoleküls erhalten. Typ I (reduzierend): Maltose, Cellobiose, Lactose 2. Beide Monosaccharide reagieren mit den halbacetalischen OH-Gruppen an C1 miteinander. Beide Moleküle werden zu Acetalen. Das Disaccharid zeigt keine reduzierenden Eigenschaften mehr. Die Bindung kann jedoch wieder säuerkatalytisch gespalten werden, eine nachfolgende Reduktionsprobe verläuft dann positiv. Typ II (nicht reduzierend): Maltose, Cellobiose, Lactose Reduzierende Disaccharide: Maltose 2 D-Glucose Malzzucker: Baustein in Stärke und Glykogen, reduzierend, 1,4-α-glykosidische Bindung. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 13 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Die Pyranosesessel bilden einen Winkel, den die α-glykosidische Bindung verursacht. Cellobiose 2 D-Glucose Aus Cellulose, reduzierend, 1,4-β-glykosidische Bindung. Die Pyranosesessel liegen in einer Ebene. Das Molekül ist gestreckt gebaut. Lactose D-Galactose + D-Glucose Milchzucker: reduzierend, 1,4-β-glykosidische Bindung. Nichtreduzierende Disaccharide: Trehalose 2 D-Glucose Insektenzucker, auch aus Mikroorganismen, nicht reduzierend, 1,1-α-glykosidische Bindung. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 14 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Saccharose D-Fructose + D-Glucose Rohrzucker, Rübenzucker, nicht reduzierend, 1,2-β-glykosidische Bindung. Saccharose in Fischer-Projektion Aus den Formeln ist ersichtlich, dass bei der Saccharose die beiden reduzierenden Gruppen (in D-Glucose am C1 und in der D-Fructose am C2) glykosidisch verknüpft sind. Daher fehlen bei der Saccharose die reduzierenden Eigenschaften. Polysaccharide Die wichtigsten Polysaccharide sind Stärke, Glykogen und Cellulose, die sich alle aus D-Glucosemolekülen aufbauen. Es findet stets eine Verknüpfung der Hydroxylgruppe an C1 der einen mit der alkoholischen Hydroxylgruppe an C4 des nächstfolgenden Glucosemoleküls unter Wasserabspaltung statt. Dabei kommt es zur Ausbildung von Makromolekülen. Diese hochpolymeren Zucker zeigen daher andere physikalische und chemische Eigenschaften als Mono- oder Disaccharide zumal die glykosidische Bindung in gerader Kette oder verzweigt erfolgen kann. Polysaccharide sind in Wasser meist schlecht löslich. Stärke Stärke ist das Assimilationsprodukt der grünen Pflanzenzellen. Stärkekörner bestehen meist zu ca. 80% aus Amylopektin (Hüllsubstanz) und zu 20% aus Amylose (im Korn). Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 15 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Amylose besteht aus unverzweigten Ketten von Glucosemolekülen, die α-(1,4)glykosidisch miteinander verknüpft sind. Amylose bildet schraubenförmige Ketten mit etwa 100-1000 Glucoseeinheiten pro Kette. Amylopektin besteht aus D-Glucoseketten, die nach je 20-25 Glucosemolekülen über eine α-(1,6)-glykosidische Bindung miteinander vernetzt sind. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 16 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Eigenschaften: Stärke bildet mit Iod-Iodkali-Lösung eine intensiv blaue Einschlussverbindung. Diese Iod-Stärke-Reaktion ist sehr empfindlich. In der Wärme verschwindet die Färbung wieder. Cellulose Cellulose bildet die Gerüstsubstanz der pflanzlichen Zellwände und ist das am häufigsten vorkommende Kohlenhydrat. Im Vergleich zu Stärke ist Cellulose aus β(1,4)-glykosidisch verknüpften Glucoseeinheiten aufgebaut. Der Polymerisationsgrad ist wesentlich höher als der der Stärke (ca. 10000 Glucoseeinheiten). Cellulose ist in Wasser unlöslich. Glykogen Glykogen ist im Gegensatz zu Stärke, die ausschließlich von Pflanzen erzeugt wird, das Reservekohlenhydrat des tierischen Organismus. Es wird nach Umformen eines Teils der Kohlenhydratnahrung besonders in der Leber sowie in den Muskeln gespeichert. In seinem chemischen Aufbau ähnelt Glykogen dem Amylopektin, nur sind die Ketten noch stärker verzweigt. Der Polymerisationsgrad liegt bei 500-50000 Glucoseeinheiten. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 17 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Inulin Inulin, eine Polyfructose, ist ein in Wasser relativ gut lösliches Reservepolysaccharid vieler Pflanzen. Es besteht aus Ketten von ca. 30 Fruktofuranoseresten mit β-(1,2)Verknüpfung. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 18 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Vorfragen 1. Warum sind Aminosäuren, wenn sie als Zwitterionen vorliegen, nicht oder nur schwer löslich? 2. Welche Form der Isomerie liegt bei Fructose und Glucose vor? 3. Zeigen Polysaccharide reduzierende Eigenschaften? 4. Warum verschwindet beim Erhitzen von Iod-Stärke-Lösung die blaue Färbung? 5. Warum reagiert Fructose in alkalischer Lösung reduzierend? 6. Nennen Sie die beiden wichtigsten Sekundärstrukturen von Polypeptidketten. 7. Was sind Anomere? Übungsaufgaben 1. Formulieren Sie die Reaktion von Valin mit Leucin. 2. Zeichnen Sie α-, β-, γ-Aminobuttersäure. Welche Form der Isomerie liegt vor? 3. Formulieren Sie die Decarboxylierung von Histidin. Welches Produkt entsteht, in welchem Zusammenhang spielt dieser Stoff eine Rolle? 4. Formulieren Sie die Reaktion von D-Glucose mit Ethanol. Was entsteht? 5. Zeichen Sie ein beliebiges 1,4-verknüpftes und ein beliebiges 1,2-verknüpftes Disaccharid. Besitzen beide Disaccharide reduzierende Eigenschaften? Begründen Sie ihre Aussage. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 19 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Durchführung 1. Aufgabe Amphoteres Verhalten, isoelektrischer Punkt Bei schwerlöslichen Aminosäuren (Tyrosin) kann das amphotere Verhalten an der pH-Abhängigkeit der Löslichkeit demonstriert werden: Tyrosin ist in Wasser kaum löslich, löst sich jedoch im Alkalischen und im Sauren. Beim Neutralpunkt fällt es wieder aus (isoelektrischer Punkt IP). Das Zwitterion ist demnach schwer löslich. Eine linsengroße Probe von Tyrosin wird in ca. 2 ml Wasser suspendiert. Unter Umschütteln gibt man langsam tropfenweise 2 N NaOH zu, bis eine klare Lösung entstanden ist. Diese wird wieder unter Umschütteln langsam tropfenweise mit 2 N HC1 versetzt. Zunächst fällt Tyrosin aus (IP), das sich bei weiterer Zugabe wieder löst. Erklären Sie das Verhalten anhand von Reaktionsgleichungen. 2. Aufgabe Aufnahme eines Titrationsdiagramms von Glycinhydrochlorid, Bestimmung der pKWerte von Glycin (Gruppenversuch) Aufgrund des amphoteren Verhaltens nimmt die Zwitterion-Form der Aminosäure in saurer Lösung ein H+-Ion auf und gibt in alkalischer Lösung ein Proton ab (siehe theoretische Erläuterungen). Die saure Form einer Aminosäure gibt daher beim Versetzen mit NaOH schrittweise zwei H+-Ionen ab, verhält sich also wie eine schwache zweiprotonige Säure. Bei Titration der sauren Form der Aminosäure erhält man analog zur Titration einer schwachen zweiprotonigen Säure ein Titrationsdiagramm mit zwei Äquivalenzpunkten und zwei Pufferbereichen. Aus dem Diagramm lassen sich die pK-Werte der Carboxylgruppe und der Aminogruppe ermitteln. 10 ml der ausstehenden 0,1 N Glycin-hydrochloridlösung werden in einem 100 ml Becherglas mit soviel Wasser verdünnt, dass das Diaphragma der Glaselektrode gerade in die Lösung eintaucht. Dann wird unter Rühren mit dem Magnetrührer am pH-Meter in 1 ml Portionen (zwischen 8 ml und 12 ml Zugabe in 0,5 ml Portionen) mit 0,1 N NaOH titriert bis ungefähr pH 12 erreicht ist. Die jeweils nach Zugabe von 1 bzw. 0,5 ml 0,1 N NaOH gemessenen pH-Werte und der NaOH-Verbrauch werden in einer Tabelle notiert und anschließend in ein Diagramm eingetragen (pH-Wert gegen Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 20 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate NaOH-Verbrauch). Aus dem Diagramm werden die pK-Werte, die beiden Pufferbereiche und der isoelektrische Punkt von Glycin bestimmt. 3. Aufgabe Bestimmung der Empfindlichkeit der Ninhydrinreaktion Aminosäuren reagieren mit ihrer Aminogruppe mit Ninhydrin zu einem violetten Farbstoff. Diese Farbreaktion der Aminosäuren ist sehr empfindlich und lässt sich unter anderem zur Sichtbarmachung von Aminosäuren auf einem Chromatogramm ausnutzen (siehe Aufgabe 5). Auf einem der ausliegenden Streifen (Alufolie beschichtet mit SiO2) werden nacheinander in möglichst gleichen Volumina mit Hilfe einer Kapillare aufgetragen: 1. ausstehende 0,5%ige Glycinlösung (w/v) 2. diese Lösung 1: 10 mit Wasser verdünnt 3. diese Lösung 1:100 mit Wasser verdünnt 4. diese Lösung 1:1000 mit Wasser verdünnt Der Streifen wird getrocknet, mit Ninhydrin besprüht (Abzug! Dann im Trockenschrank 5-10 min bei 100°C trocknen lassen.) und die Konzentration an Glycin bestimmt, die gerade noch als violetter Fleck sichtbar ist. Aus dem Auftragsvolumen (ca. 5 µl) und der Konzentration der Glycinlösung wird die Menge Glycin in mg bzw. µg bestimmt, die eben noch mit der Ninhydrinreaktion nachweisbar ist. 4. Aufgabe Trennung eines Aminosäuregemisches, Identifizierung einer unbekannten Aminosäure mittels Dünnschichtchromatographie (Gruppenversuch) Auf eine der ausliegenden DC-Platten (Alufolie beschichtet mit SiO2) werden nebeneinander mit Hilfe einer Kapillare möglichst gleiche Volumina der Lösungen von Lysin-Hydrochlorid, Glycin, Valin, Leucin, eines Gemisches und der Analyse aufgetragen (genaues Vorgehen und Theorie siehe Kurstag 7). Anschließend wird das Chromatogramm in ein 250ml Becherglas gestellt, in das zuvor 10ml Laufmittel (Butanol : Eisessig : Wasser = 4 : 1 : 1) eingefüllt wurde, und das Becherglas mit Alufolie bedeckt. Das Laufmittel wandert nun im Laufe von ca. 30 Minuten über das Chromatogramm und nimmt die verschiedenen Aminosäuren verschieden weit mit. Hat die Laufmittelfront das obere Ende des Chromatogramms Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 21 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate erreicht, wird es aus dem Becherglas entnommen, getrocknet (Abzug!), mit Ninhydrinlösung besprüht und wieder getrocknet (Abzug! Dann im Trockenschrank 510 min bei 100°C trocknen lassen.). Die Aminosäuren werden als blauviolette Flecken sichtbar. 5. Aufgabe Reduzierende Wirkung von Glucose auf Cu2+-Ionen Je 2ml Fehling I und Fehling II werden gemischt. Dazu gibt man 1ml verdünnte Glucoselösung (0,5% in Wasser) und kocht kurz im Wasserbad auf. Was passiert? 6. Aufgabe Reduzierende Wirkung von Glucose auf Ag+-Ionen (Tollens Reagens) 3ml 10%ige Silbernitratlösung werden in ein sauberes (!) Reagenzglas gegeben. Anschließend fügt man so viel 2M NH3 hinzu, bis sich der gebildete Niederschlag gerade auflöst (schütteln). Nun fügt man 5ml 0,5%ige Glucoselösung hinzu und erwärmt im Wasserbad auf 100°C (nicht schütteln!). 7. Aufgabe Fructosebestimmung nach Seliwanow 2ml einer 0,5%igen Fructoselösung werden mit 1ml konz. Salzsäure (Vorsicht!) versetzt. Nun werden wenige Tropfen einer Lösung von Resorcin (0,5g/100ml 20%ige HCl) zugefügt und zum Sieden gebracht. 8. Aufgabe Säurespaltung von Saccharose 1. Überprüfung auf reduzierende Eigenschaften: Eine Spatelspitze Saccharose wird in 4ml Wasser gelöst und mit der Fehling Reaktion auf reduzierende Eigenschaften geprüft. 2. Eine Spatelspitze Saccharose wird in 4ml 2M HCl gelöst und im Wasserbad 1 Minute zum Sieden gebracht (Was passiert dabei?). 1ml des erkalteten Hydrolysats wird mit 2M NaOH (1ml) annährend neutralisiert und mit der Fehling Probe auf reduzierende Eigenschaften überprüft. 3. 2ml des Hydrolysats werden mit 1ml konz. HCl versetzt und mit Seliwanow auf Fructose untersucht. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 22 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate 9. Aufgabe Säurespaltung von Inulin 1 Spatelspitze Inulin wird in 4ml 2M HCl suspendiert und 2 Minuten gekocht (Schutzbrille!). Die erkaltete Lösung wird auf Fructose untersucht. 10. Aufgabe Iod-Stärke Reaktion 1 Spatelspitze Stärke wird in 3ml Wasser suspendiert und einige Minuten im Wasserbad gekocht. Die erkaltete Lösung wird filtriert, das Filtrat mit einigen Tropfen Iod-Iodkali-Lösung versetzt. Was passiert? Erklären Sie die Beobachtung. 11. Aufgabe Identifizierung eines unbekannten Saccharids (Gruppenanalyse) Man lasse sich vom Assistenten ein unbekanntes Saccharid geben. Diese Substanz kann sein: Cellulose, Fructose, Trehalose, Saccharose, Stärke, Inulin, Lactose. Nachfolgendes Schema soll die Identifizierung Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen erleichtern: 23 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Optional Der Blue Bottle-Versuch: Das ist ein typischer „Schauversuch“ und dennoch lässt sich einiges an Chemie dabei lernen. In einen 100 ml Erlenmeyerkolben gibt man 30 ml destilliertes Wasser und 5 ml Natronlauge. Man löst in dieser Mischung 5 g Glucose. Anschließend gibt man soviel Methylenblaulösung zu, bis die Lösung deutlich tiefblau gefärbt ist. Man lässt die Lösung stehen; sie entfärbt sich nach einigen Minuten. Anschließend schüttelt man die Lösung stark durch (Schutzbrille!). Die Lösung färbt sich wieder tiefblau. Nach Stehenlassen entfärbt sie sich wieder (usw.). Nur an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit bleibt die blaue Farbe erhalten. Wenn man einen Stopfen zum Verschließen genommen hat: Nach einigen Zyklen stellt man fest, dass sich der Stopfen des Erlenmeyers nicht mehr einfach öffnen lässt: Der Verbrauch an Luftsauerstoff hat ein Vakuum zur Folge. Der Redoxfarbstoff Methylenblau wird durch die alkalische Glucoselösung zu farblosem Leukomethylenblau reduziert. Als Reduktionsmittel fungiert dabei die Glucose, welche zu Gluconat oxidiert wird. Beim Schütteln diffundiert der Luftsauerstoff in die Lösung und reoxidiert das farblose Leukomethylenblau zu blauem Methylenblau. Überschüssige Glucose reduziert dann erneut das Methylenblau etc. Diese reversible Reaktion läuft so lange ab, bis alle GlucoseMoleküle zu Gluconat oxidiert sind oder der Sauerstoff verbraucht ist. Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 24 Kurstag 10: Aminosäuren und Kohlenhydrate Viel Spass! Chemisches Praktikum für Mediziner Interfakultäres Institut für Biochemie, Universität Tübingen 25
