E. coli - Alfred-Nissle

M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller E. coli – Bedeutung in Forschung und Medizin
ISBN 3-9811198-4-3
Ums E.coli_Bedeutung in_d.indd 1
E. coli
Bedeutung
in
Forschung
und
Medizin
3., überarbeitete Auflage
M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller
26.05.15 12:54
M. Schiemann, U. Sonnenborn,
J. Schulze, H. Müller
E. coli
Bedeutung
in
Forschung
und
Medizin
3., überarbeitete Auflage
Fotohinweis zum Titelblatt (von oben nach unten):
Wachstum von E. coli auf McConkey-Agar
(Aufnahme T. Grela, U. Sonnenborn, Herdecke)
Adhäsion von E. coli Stamm Nissle 1917 an das Darmepithel
(Aufnahme J. Schulze, A. Lorenz, Potsdam-Rehbrücke)
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von E. coli Stamm Nissle 1917
(Aufnahme H. J. Jacob, Bochum)
Im Fokus dieser Broschüre
steht der weltweit am besten untersuchte
Autoren:
Dipl.-Biol. Martina Schiemann
Dr. rer. nat. Ulrich Sonnenborn
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. habil. Jürgen Schulze
Dr. med. Hilke Müller
Herausgeber:
Alfred-Nissle-Gesellschaft
Internationale Vereinigung zur Förderung
der mikroökologischen Forschung
und mikrobiologischen Therapie e. V.
­Mikroorganismus, das Bakterium
Escherichia coli (E. coli),
mit seiner Bedeutung für Gesundheit
und Krankheit sowie für die medizinische,
mikrobiologische, biochemische und
molekularbiologische Forschung
des 20sten und 21sten Jahrhunderts.
Vorsitzender:
Prof. Dr. med. dent. Dr. med. Dieter Loew
An der Residenz 5
55270 Sörgenloch
[email protected]
www.a-nissle-ges.de
3., überarbeitete Auflage
Alle Rechte, insbesondere das Recht der Vervielfältigung und Verbreitung sowie der Übersetzung in fremde Sprachen vorbehalten. Kein Teil des Werkes darf in irgendeiner Form
(Fotokopie, Mikrofilm oder ein anderes Verfahren) ohne schriftliche Genehmigung reproduziert werden.
© 2015 Alfred-Nissle-Gesellschaft e. V. · Deutschland
ISBN 3-9811198-4-3
2
3
Inhaltsverzeichnis
Seite
Theodor Escherich – Erstbeschreiber des „Bacterium coli commune“7
Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli 11
E. coli K-12: Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker
13
E. coli in der Biotechnologie
15
„E. coli is the first to come, and the last to go“
17
Intra- und extraintestinal pathogene E. coli -Varianten19
Alfred Nissles Entdeckung des Coli-Antagonismus
und sein „neues Heilprinzip“
25
Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden Mikroorganismen
29
E. coli Stamm Nissle 1917:
der weltweit am besten untersuchte probiotische E. coli -Stamm32
Wirkungen und Wirkmechanismen von E. coli Stamm Nissle 1917
34
– Mikrobielle Kommunikation und Interaktionen („Cross Talk“)
im Gastrointestinaltrakt
34
– Bildung von Biofilmen und Mikrokolonien im Darm
35
– Die Stärkung der intestinalen Barrierefunktion
38
1. Der Anti-Invasionseffekt am Darmepithel
38
2. Der Induktionseffekt auf die Synthese antimikrobieller Peptide
des Darmepithels
44
3. Die Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands
47
– Immunmodulierende Wirkungen
55
– Antimutagenität
64
Indikationsspektrum für E. coli Stamm Nissle 1917 (Mutaflor®)
und konfirmatorische klinische Studien
67
Ausblick78
Literatur81
Sachverzeichnis95
4
5
Theodor Escherich –
Erstbeschreiber des „Bacterium coli commune“
Am 14. Juli des Jahres 1885 hielt der damals 27-jährige Theodor ­Escherich*
vor der Gesellschaft für Morphologie und Physiologie in München einen
­Vortrag mit dem Titel „Die Darmbacterien des Neugeborenen und Säug­
lings“ ­
(Escherich, 1885) [Abb. 1]. Escherich, zu der Zeit Assistent am
Dr. von Hauner­schen ­Kinderspital, berichtete über
seine Forschungs­ergebnisse und trug dem Auditorium vor, dass das Mekonium des Neugeborenen
steril sei, aber innerhalb der ersten ­Lebensstunden
von Mikroorganismen besiedelt werde. Weil er fest
davon überzeugt war, dass es „für die Pathologie
und Therapie der myco­tischen Darmerkrankungen
unentbehrlich sei“, versuchte er, „die scheinbar
ganz regellose und von tausend Zufällig­keiten abhängige Menge der im ­normalen Stuhl- und Darmkanal vorkommenden Bacterien zu e
­ ntwirren.“ Dazu
entwickelte er s­ pezielle ­Kultivierungsmethoden mit
flüssigen und festen Nährmedien, die im Prinzip
noch heute zum klassischen Handwerkszeug eines Prof. Dr. med. Theodor Escherich
(1857 – 1911)
mikrobio­­logi­schen Labors gehören.
Nach eineinhalbjähriger intensiver Forschung präsentierte er diese und
weitere Ergebnisse in seiner umfangreichen Habilitationsschrift „Die Darmbakterien des Säuglings und ihre Beziehungen zur Physiologie der Verdauung“, die 1886 im Verlag von Ferdinand Enke, Stuttgart, abgedruckt
wurde (Escherich, 1886). Hier teilte er u. a. minutiös seine ­Erkenntnisse
zum ­
Vorkommen, zur Gestalt und zu den Eigenschaften der von ihm
­beobachteten Bakterien mit, die er – je nach ­Häufigkeit und Menge – in obligate und fakultative D
­ armbakterien einteilte. Im Säuglingsstuhl fielen ihm
hauptsächlich zwei B
­ akterientypen auf, die er als „obligate ­Milchkotharten“
bezeichnete. Eine davon war – wie bereits in ­seinem 1885 publizierten
­Vortrag dargestellt – besonders häufig in den unteren Darmabschnitten
­anzutreffen, weshalb Theodor Escherich sie als typische „­ Colonbacterien“
bezeichnete und ihnen den Artnamen „Bacterium coli commune“, das
­allgemeine Dickdarmbakte­rium, gab [Abb. 2]. „Dasselbe findet sich so* Weiteres über Leben und Arbeit von Theodor Escherich kann der Monographie von
B.A. Oberbauer „Theodor Escherich – Leben und Werk“, Paul-Ehrlich-Gesellschaft für
Chemotherapie (Hrsg.), Futuramed Verlag München, 1992, entnommen werden.
6
7
wohl im Mekoniumkothe als bei Milch-,
Fleischdiät und gemischter Kost und
kann insofern als ein diesen verschiedenen Kotharten „gemeinsamer“ Spalt­pilz
bezeichnet werden, während die Bakterienvegetation der­
selben im ­
Übrigen
große Verschiedenheiten darbietet...“.
Später fand er das B
­acterium coli
commune auch als obligates Darmbakterium in den Fäzes ­Erwachsener.
Neben der Erstbeschreibung w
­ eiterer
Darmbakterien
(z. B.
Klebsiella,
Cam­
Abb. 2
b
acter)
ist
es
ein
weiteres
großes
pylo­
Die erste Abbildung vom
Verdienst Escherichs, auch auf mikro­
Bacterium coli commune. Dauerpräparat
von Th. Escherich, 1886: angefärbt mit
ökologische Zusammenhänge im Darm
Gentiana­violett in wässrigem Anilin.
hingewiesen zu haben (der Begriff
In: Die Darmbakterien des Säuglings und ihre
„Mikroökologie“ wurde allerdings erst
Beziehungen zur Physiologie der Verdauung.
1960 von Helmut Haenel eingeführt).
Verlag von Ferdinand Enke, Stuttgart.
Im Stuhl von gestillten Kindern stellte
er eine auf­fällige Verminderung oder sogar das Fehlen von gelatineverflüssigenden ­Keimen, von Eiweißspalt­produkten und von fäkalem Geruch
1885 Erstbeschreibung (Th. Escherich):
Bacterium coli commune
(später: Bacterium coli)
1919Systematisierung (A. Castellani, A. J. Chalmers):
Vorschlag zur Umbenennung in
Escherichia coli
1930Internationaler Mikrobiologenkongress, Paris:
offizielle Umbenennung in
Escherichia coli
1953Internationaler Mikrobiologenkongress, Rom:
Streichung der Bezeichnung
zugunsten von
Bacterium coli
Escherichia coli
1958Judicial Commission:
„Conservation of the Enterobacteriacea, ...“
verbindliche Veröffentlichung zur Bezeichnung
Abb. 1 Titelseite der Arbeit, in der Escherich erstmals das Bacterium coli commune beschrieb.
8
Escherichia coli
Abb. 3 Von der Erstbeschreibung als Bacterium coli commune zur heute gültigen Bezeichnung
Escherichia coli.
9
fest, was später als antiputrider Effekt der Muttermilch beschrieben wurde.
Nach seinen Befunden bezeichnete Escherich die B
­ esiedlung der oberen
Darmabschnitte als monoton und ­spärlich, und stellte fest, dass die Zahl
der Bakterien jenseits der Ileozäkalklappe im Dickdarm sprunghaft ansteigt. Er vermutete, dass die Vermehrung der Bakterien unabhängig von
der Nahrungs­zufuhr sei und dass die Bakterien ihren Nah­rungs­­bedarf aus
der Verstoffwechselung von Darmsekreten decken würden.
Mikrobiologische Kurzcharakteristik von E. coli
Die Art Escherichia coli (E. coli) gehört zur Familie der ­Enterobacteriaceae
und steht in enger verwandt­schaftlicher Nachbarschaft zur Gattung ­Shigella
und in naher Verwandtschaft zu den Gattungen Citrobacter und ­Salmonella.
Ent­ferntere Verwandte sind die Gattungen Enterobacter und Klebsiella [Abb. 4].
Trotz aller Weitsicht konnte Theodor Escherich nicht ahnen, dass das von
ihm entdeckte Bacterium coli und die später nach ihm benannte S
­ pezies
Escherichia coli [Abb. 3] zum weltberühmten Modellobjekt der natur­
wissenschaftlichen und medizinischen Mikrobiologen, Mikroökologen s­ owie
der Biochemiker und Molekulargenetiker aufsteigen sollte.
Abb. 4 Stammbaum und Verwandtschaftsbeziehungen der Familie Enterobacteriaceae
(nach Brenner, 1984).
Das E. coli-Bakterium ist ein gramnegatives Stäbchen von etwa 1,1 – 1,5 µm
x 2,0 – 6,0 µm Größe. Es wächst unter aeroben und anaeroben ­Bedingungen
(fakultativ anaerob), weil es zwei verschiedene Redoxsysteme besitzt
(Mena­chinon und Ubichinon), die eine Energiegewinnung aus dem katabolen Stoffwechsel sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen ermöglichen. Unter optimalen Wachstumsbedingungen ist die
Zellteilungsgeschwindigkeit der Coli-Bakterien rasant: Alle 20 Minuten
­
kann sich die Zahl der Bakterienzellen verdoppeln. Allerdings werden diese
für die Populationsdynamik idealen Zustände nur unter Laborbedingungen, nicht aber im natürlichen Umfeld der Bakterien erreicht. Midtvedt
(1998) berichtete von einer Verdoppelung der E. coli-Zellen im Zäkum der
­Ratte nach etwa 100 Minuten, im menschlichen Darm kann es 30 ­Stunden
10
11
­ auern und in wässrigen Biotopen im Freien bis zu mehreren Tagen (­ Hecker,
d
1998). ­
Bereits Escherich beobachtete die morphologische Vielfalt der
Kolonie­
formen dieser Bakterien bei Wachs­
tum auf festen Nährböden.
Noch zahlreicher sind die serologischen V
­ arianten. In der medizinischen
­Mikrobiologie dient die Serologie seit langem zur Keim­differen­zierung. Die
serologische Einteilung der unterschied­lichen E. coli-Stämme wird durch
die Sero­typisierung ihrer O-, K- und H-Antigene möglich. O-Antigene stellen dabei hitzestabile Bestandteile des Lipo­
poly­
saccha­
rid-­
Komplexes
(LPS) der ­äußeren Zellmembran, K-Antigene Poly­saccha­ride der Kapsel
und H-Antigene Geißel- oder Flagellenantigene dar [Abb. 5].
Abb. 5 Schematischer Längsschnitt und Zellwandaufbau einer gramnegativen E. coli-Zelle.
Serologisch werden E. coli-Stämme anhand ihrer unterschiedlichen O-, K- und H-Antigene
­differenziert, z. B. E. coli Nissle 1917 = Serotyp O6 : K5 : H1.
In der Natur können rund 50.000 unterschiedliche Serovare von E. coli
­vorkommen, die sich aus der Kombination verschiedener Antigenstruk­
turen ergeben (Hacker & Kruis, 1998). Bisher sind 200 Oberflächen-(O-),
80 Kapsel-(K-) und 60 Geißel-(H-)Antigene bei E. coli bekannt. Zudem gibt
es noch mehr als 100 serologisch unterscheidbare Fimbrien-Varianten, die
als Adhäsine verschiedene Rezeptoren erkennen.
12
E. coli K-12:
Das beliebteste „Versuchstier“ der Molekulargenetiker
(Arber, 1982)
Es war reiner Zufall, dass 1922 aus dem Stuhl eines an Diphtherie erkrankten Patienten eine E. coli-Variante isoliert wurde, die wegen ihrer völligen
Harmlosigkeit auffiel und mit der Laborbezeichnung „K-12“ e
­ inen Platz in
der bakteriologischen Stammsammlung der Medical School der Stanford-­
University in Kalifornien fand. Bereits im zweiten Drittel des vergangenen
Jahr­hunderts suchten Genforscher nach geeigneten Studien­objekten, um
die Frage zu beantworten: „Wie funktionieren Gene und wie kontrollieren
sie spezifische Merkmale?“. Diese Versuchsobjekte sollten leicht, schnell
und in unbegrenzter Menge zu züchten, und zudem in der Lage sein,
­genetische Veränderungen anhand phäno­typischer ­Ausprägungen offenFlagellen
Fimbrien
(H-Serotyp)
zulegen. So fand die K-12-­Variante von
E. coli das besondere ­Interesse
eines amerikanischen Forscherteams um J. Lederberg und E.L. Tatum
Kapsel
(K-Serotyp)
(1946). Als dann bei diesem ­E. coli K-12 para­sexuelle Vorgänge – d. h.
die
Fähigkeit des Austauschs genetischen Materials zwischen zwei Bakterienzellen – entdeckt wurden, war die Basis für die Durchführbarkeit der gezielten Übertragung von Genen gegeben, und E. coli K-12 avancierte zum
Ribosomen
Standardobjekt der Genetiker und Moleku­lar­biologen.
Ähnlich wie die klassischen Tier- und Pflanzenzüchter suchten auch die
Chromosom
Mikrobiologen bei ihrem „Haustier“ E. coli nach neuen Stämmen. Mit ­Hilfe
von Röntgen- und UV-Strahlen führten sie verschiedene Mutationen in
den K-12-„Wildstamm“ ein. Sehr bald wurde mit dem Ausgangsstamm
Plasmid
und den daraus hergestellten Varianten in vielen Laboratorien weltweit
gearbeitet. Die ­Varianten von E. coli Cytoplasma
K-12 weisen Veränderungen in den
­verschiedensten Genen auf, sie tragen z. B. Merkmale für Auxotrophien
(Stämme mit zusätzlichen Nährstoffbedürfnissen), Resistenzen und andere
Mutationen. Als Sicherheitsmaßnahme wurden diese Mutantenstämme so
verändert, dass sie
– keine Adhäsionsorganellen (Fimbrien) haben, um den Darm zu besiedeln,
– fremde Plasmide ohne die Möglichkeit der Weitergabe an artfremde
­Zellen zuverlässig aufnehmen können,
– in der freien Natur nicht überleben können,
– UV- und Chemikalien-empfindlich sind.
13
Zellw
Periplasma
innere
Membran
Unterdessen sind weit mehr als 3000 verschiedene Mutanten von E. coli
K-12 bekannt, mit deren Hilfe grundlegende Erkenntnisse zur ­Biochemie
und Zellphysiologie, zur Genregulation und zum Gentransfer gewonnen wurden. Einer der ersten Bakterienstämme, dessen Genom voll­
ständig sequenziert wurde, war folgerichtig ein E. coli K-12-Stamm
(MG 1655) (Blattner et al., 1997). Die erste genetische Karte des E. coli
K-12-Genoms wurde bereits im Jahr 1964 u. a. mit Hilfe von Restriktionsenzymen, die ­
Stränge der DNA an spezifischen Basensequen­ homann, 1964). Während auf ihr 99
zen schneiden, erstellt (­Taylor & T
Gene vermerkt waren, wies die G
­ enkarte aus dem Jahr 1990 schon
1403 Gene auf (Bachmann, 1990). Die 1997 ver­öffentlichte v­ ollständige
Genomsequenz des E. coli K-12-Stamms ergab etwa 4300 Gene (­Blattner
et al., 1997) [Abb. 6]. Mit ­einer Größe von 4,7 x 106 ­Basenpaaren ist das
Genom von E. coli K-12 um den Faktor 1000 kleiner als das mensch­liche
Genom, das infolge des „­ Human Genome Projects“ ebenfalls voll­
ständig
sequenziert ist. Ein Forschungsschwerpunkt der modernen Molekulargenetik ist die Analyse der Genome ganzer Mikrobengemeinschaften
wie z. B. der mensch­
lichen Darm­
mikrobiota. Seit einiger Zeit wird die
Gesamtheit aller Mikroorganismen
im Magen-Darm-Trakt als intestinale
Mikrobiota bzw. Darmmikrobiota bezeichnet. Intestinale Mikrobiota oder
Darmmikrobiota ersetzen in der heuti­
gen Fachliteratur den klassischen Begriff Darmflora. Die Gesamtheit ­
aller Abb. 6 Genom von E. coli K-12 (MG1655),
Genome der Darmmikrobiota wird als
Größe 4,7 x 106 Basenpaare
(Blum-Oehler, 2001).
„Mikro­biom“ bezeichnet.
Die Bedeutung von Escherichia coli für den internationalen Wissenschaftsfortschritt wird auch dadurch unter­strichen, dass in den letzten Jahr­
zehnten eine Reihe von Nobelpreisen für Arbeiten an und mit E. coli ver­
geben wurden.
14
E. coli in der Biotechnologie
Im Laufe der immer genaueren Charakterisierung des Genoms von E. coli
erschlossen sich mit gentechnisch veränderten E. coli-Bakterien ­vielfältige
Anwendungsgebiete. Bereits 1973 wurde gezeigt, wie man menschliches
Insulin mit Hilfe eines gentechnisch veränderten E. coli-Stammes ­herstellen
kann (Cohen et al., 1973). Mit Hilfe der modernen Gen- und Biotechnologie
gelang es nun, rekombinante Arzneimittel herzustellen. Dabei wird das Gen
für ein menschliches Protein in das Erbgut der Bakterien eingeschleust, die
anschließend dieses Eiweiß herstellen [Abb. 7].
Abb. 7 Aus einer menschlichen Zelle wird die DNA isoliert. Mit Restriktions­enzymen („molekulare
­Scheren“) wird ein DNA-Fragment mit dem gesuchten Gen ausgeschnitten und mit Hilfe von
­Ligasen in einen ebenfalls aufgeschnittenen DNA-Plasmidring von E. coli eingeführt. Nach
Einschleusung dieses ­Konstrukts in die E. coli-Zelle enthält das Bakteriengenom nun z. B. die
genetische Information für das m
­ enschliche Hormon Insulin. Artfremde Proteine, die in ­Bakterien
exprimiert werden, nennt man rekombinante Proteine.
15
Als erstes rekombinantes Medikament wurde 1982 das Hormon Human­
insulin in den Markt eingeführt. Danach wurden Gene für weitere Proteine
menschlicher, tierischer, pflanzlicher und bakterieller Herkunft erfolgreich
in das E. coli-Genom integriert [Abb. 8].
Von E. coli exprimierte Pharmaproteine:
• Humaninsulin
• Wachstumshormone (Somatostatin, Somatotropin)
• Immunmodulatoren (Interferone, Interleukine, TNFα)
• Wachstumsfaktoren (G-CSF, EGF)
• Blutfaktoren, Gerinnungshemmer (t-PA, Staphylokinase)
• Enzyme
„E. coli is the first to come, and the last to go”
(Midtvedt, 1998)
Bis zur Geburt entwickelt sich der Fötus im Mutterleib unter keimfreien
Bedingungen. Die Beobachtung Escherichs, dass sich bereits wenige
­
Stunden nach der Geburt „Colonbacterien“ im Mekonium nachweisen
lassen, hat auch heute noch Bestand. Die sich ansiedelnden Keime
­
­stammen aus der Mikrobiota der Mutter oder aus der Umgebung und
­werden während der Geburt bzw. der ersten Lebensstunden erworben
(Sonnenborn et al., 1990). Fakultativ anaerobe Keime, allen voran E. coli,
sind die ­klassischen Erstbesiedler des menschlichen Gastro­intestinaltrakts
(Hoogkamp-Korstanje et al., 1979) [Abb. 9].
Abb. 8 Beispiele für von gentechnisch veränderten E. coli produzierte, pharmazeutisch verwendete
Proteine und Peptide.
Keimzahl (log/g Fäzes)
10
8
6
4
14 15 17 20 1 8 11 14 16 3 8 16 6 1 12 6 8 21 8 12 14 3 12 24 6 10 18 Stunden
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Tage
Aerobier:
E. coli
Lactobacillus
Anaerobier:
Bacteroides
Bifidobacterium
Enterococcus
Abb. 9 Sequenzielle mikrobielle Besiedlung des Neugeborenendarms durch aerobe und anaerobe
Bakterien (nach Hoogkamp-Korstanje et al., 1979).
Sie betreiben im zunächst noch sauerstoffhaltigen Dickdarm einen regen
Stoffwechsel und senken dadurch den O2-Gehalt und das Redox­potential
im Darmlumen so weit herab, dass sich nachfolgend anaerobe Darmbakterien – wie Bacteroides-Keime, Bifidobakterien u. a. – ansiedeln können
(Schulze et al., 2008). Den Verbrauch von Sauerstoff durch die Colonbakterien hatte bereits Escherich beobachtet. Da über die Nahrung durch Abschlucken, aber auch über die Darmwand ständig neuer Sauerstoff in das
Darmlumen eingebracht wird, bleibt diese Aufgabe der „Milieubereitung“
für E. coli während des gesamten Lebens des Wirtsorganismus erhalten.
16
17
Die mikrobielle Besiedlungsdichte des Magen-Darmtrakts nimmt von proximal nach distal zu [Abb. 10]. Die durch­schnitt­liche Keimkonzentration von
E. coli im Dickdarm unterliegt interindi­viduell aber auch intraindividuell großen Schwankungen und beträgt beim gesunden Erwachsenen z­ wischen 105
und 109 Kolonie-bildende Einheiten pro Gramm Fäzes (KBE/g). Da der über
die Dickdarmwand ins Darmlumen ­diffundierende Sauerstoff für die Coli-­
Bakterien als chemotaktischer Reiz wirkt, sind diese auch an der M
­ ucosa,
genauer gesagt an der aufliegenden Schleimschicht in großer Zahl zu finden.
Durch diese „Anreicherung“ von E. coli an der Darmschleimhaut erhöht sich
der Gehalt der sog. wandständigen Mikrobiota an aeroben Keimen.
Magen und Duodenum
(101 - 103 KBE*/ml)
Laktobazillen
Streptokokken
Hefen (Candida albicans)
Helicobacter pylori
Jejunum und Ileum
(104 - 108 KBE*/ml)
Laktobazillen
E. coli u.a. Enterobakterien
Strepto- und Enterokokken
Bacteroides-Arten
Bifidobakterien
Fusobakterien
Colon
(1010 - 1012 KBE*/g)
*KBE = Kolonie-bildende Einheiten
(syn. für Lebendkeime)
Bacteroides-Arten
Bifidobakterien
Peptostreptokokken
Eubakterien
Fusobakterien
Clostridien
Veillonellen
E. coli u.a. Enterobakterien
(Enterobacter, Proteus, etc.)
Enterokokken
Laktobazillen
Staphylokokken
Pseudomonaden
Hefen (Candida albicans)
Protozoen (z.B. Entamoeba)
Intra- und extraintestinal pathogene E. coli-Varianten
Escherich war anfangs überzeugt, dass es sich bei dem Bacterium coli
commune um einen „harmlosen Schmarotzer“ handelt. Sicher hatte er damit
recht, weil die meisten der oben erwähnten rund 50.000 Serovare zu den
kommensalen Darmkeimen zu zählen sind. Allerdings berichtete ­Escherich
bereits 1894 in einem publizierten Vortrag „über Cystitis bei Kindern
hervorgerufen durch das Bacterium coli commune“ (Escherich, 1894).
Er vermutete, dass die Darmbakterien als Quelle für Harnwegsinfektionen
(Blasen- und Niereninfektionen) in Frage kämen. Diese frühe Hypothese,
dass u. U. harnwegspathogene E. coli im Darm symptomlos persistieren
und aus verschiedenen Gründen in die harnableitenden Organe gelangen
und dort Ent­zündungen verursachen könnten, ist unterdessen mit modernen
bio­­­
­
chemischen und molekularbiologischen Methoden bestätigt worden
(Blum et al., 1995; Hacker et al., 1983; Plos et al., 1995).
Über die wirtsspezifische pathogene Potenz verschiedener E
­ . coli-­Varianten
[Abb. 11] gibt es mittlerweile eine enorm umfangreiche Sammlung von
­Publikationen.
Darminfektionen
Harnwegsinfektionen
Sepsis
Meningitis
Diarrhö
Sepsis
Mastitis
Abb. 10 Unterschiede in Keimgehalt und Keimspektrum in verschiedenen Abschnitten des Gastro­
intestinaltrakts (nach Sonnenborn & Greinwald, 1991).
Obwohl sich in den letzten Jahren Laborbefunde mehren, dass Neugeborene in den hoch­industrialisierten Ländern immer später mit E. coli besiedelt werden, und dass die Keimzahlen von E. coli in Stuhlproben von
Patienten (vornehmlich von Allergikern) reduziert sind, bzw. sich manchmal sogar keine Coli-Bakterien nachweisen lassen (Adlerberth et al., 2006;
­Nowrouzian et al., 2003; Sepp et al., 2000), gilt auch heute noch die Aussage von Escherich: „Die Keime der Colonbacterien, die eine sehr große
Verbreitung zu besitzen scheinen, … finden sich regelmäßig schon im Mekonium und bleiben von da bis zum Tode des Wirthes und darüber hinaus
ständige Bewohner des Darmkanals.“
18
Diarrhö
Ödemkrankheiten
Harnwegsinfektionen
Diarrhö
Sepsis
Sepsis
Abb. 11 Wirtsspektrum und Krankheitsbilder intestinaler und extraintestinaler pathogener E. coli.
19
In Abhängigkeit von der Schädigungsstrategie werden pathogene E. coli
in sog. „Pathotypen“ eingeteilt (Hacker & Heesemann, 2000) [Abb. 12].
Pathogene E. coli-Varianten sind durch das Vorkommen von diversen
­Virulenzfaktoren, wie z. B. verschiedenen Toxinen, besonderen Fimbrien-­
Adhäsinen, Invasinen oder Sekretionssystemen, gekennzeichnet [Abb. 13].
Sie können sowohl plasmid- oder phagen- als auch chromosomal ­codiert
im Bakteriengenom vorliegen.
Darmpathogene E. coli werden aufgrund ihrer in den letzten Jahren aufgedeckten Virulenzfaktoren in derzeit 6 Klassen unterteilt, die Durchfall­
erkrankungen mit unterschiedlichen klinischen Erscheinungsformen verursachen (Kaper et al., 2004). Dabei werden die klinische Symptomatik sowie
die von den Stämmen gebildeten Virulenzmerkmale, die Adhäsionsfaktoren
und T
­ oxine, als Einteilungskriterien verwendet. Die in früheren Jahren vor
allem angewandte Serotypisierung zur Identifizierung und Klassifizierung
klinischer Isolate wird heute immer mehr durch den molekulargenetischen
Nachweis der jetzt bekannten bakteriellen Virulenz- und Pathogenitätsgene
ersetzt, unterstützt durch den Nachweis spezifischer pathogener Merkmale.
Virulenzmerkmale
• Adhäsine (CFA I/II-, P-, M-, S-Fimbrien)
• Toxine
(CNF, Hämolysin, hitzestabile und hitzelabile Toxine, Shiga-Toxine)
• Invasine
• Typ-III-Sekretionsapparat (biologische „Injektionsspritze“)
Abb. 13 Beispiele für Virulenzfaktoren pathogener E. coli-Stämme.
­ imbrien-Adhäsine ­
F
(bundle-forming pili) und injizieren über ein Typ-III-­
Sekretionssystem bakterielle Signalproteine in die Epithelzelle, was zu
Veränderungen des Aktingerüsts führt und letztlich zu einer Destruktion
der Mikrovilli. Sie gelten heute vor allem in Entwicklungsländern als Verursacher von wässrigen Durchfall­erkrankungen mit Fieber und Erbrechen bei
Säuglingen und Kleinkindern unter 2 Jahren (Cravioto et al., 1991; Levine &
Edelmann, 1984). EPEC sind auch für Tiere pathogen und verursachen z. B.
beim Kaninchen große Verluste in der Jungtieraufzucht.
Abb. 12 Pathotypen und Pathogenitätsmechanismen humanpathogener E. coli
(nach Hacker & Heesemann, 2000).
Infektionen durch enterohämorrhagische E. coli (EHEC) traten erstmals
1982 in den USA auf. Sie sind im Gegensatz zu anderen darmpathogenen
E. coli-Stämmen, die sich nur beim Menschen finden und deren Übertragung durch fäkal kontaminiertes Gemüse oder durch Schmierinfektionen
erfolgt, eher als Zoonoseerreger einzustufen (Baljer & Wieler, 1999; Karch
2011). Sie repräsentieren eine Untergruppe der auch als Shiga-Toxin-produzierende (STEC) bzw. Vero-Toxin-produzierende (VTEC) bezeichneten E. coli
und kommen in der Natur relativ häufig vor. E. coli dieses Typs sind Auslöser
meist blutiger Diarrhöen (MacDonald et al., 1988). Bei 10 – 20 % der Erkrankten entwickelt sich als schwere Verlaufsform eine hämorrhagische Colitis.
Enterohämorrhagische E. coli schleusen nach der Anheftung Enterohämolysin und weitere Toxine in die Mucosazelle ein, was zu blutigen Läsionen im
Darm führen kann. Da die Toxine auch in andere Organe gelangen können,
kommt es u.U. zu irrever­siblen Schäden im Nierengewebe (Hämolytisch-urämisches Syndrom, HUS) sowie zur Thrombotisch-Thrombozytopenischen
­Purpura (TTP) (Karch 2011; Karmali, 1989; ­MacDonald et al., 1988). Nach
heutiger Kenntnis sind landwirtschaft­liche Nutztiere in Massentierhaltung,
vor allem Rinder, die wichtigsten Erreger­reservoire für Infektionen des Menschen (Beutin et al., 1995).
Enteropathogene E. coli (EPEC) wurden erstmals in den 40er Jahren
des vergangenen Jahrhunderts als Erreger der Säuglingsenteritis während ­eines massiven Ausbruchs in Großbritannien isoliert. Enteropathogene E. coli nutzen zum Andocken an die Darmschleimhaut spezifische
Durch enterotoxische E. coli (ETEC) bedingte Infektionen sind eine weit
verbreitete Ursache von Darmerkrankungen bei Kleinkindern sowie bei
Reisen­den in tropischen und subtropischen Ländern (Reisediarrhö). ETEC
besitzen typische Adhäsine und schädigen die Enterozyten über zwei ­Toxine
EPEC
EHEC
Toxinbildung
Toxinbildung
Toxinbildung
ETEC
EAggEC
SEPEC
MENEC
Toxinbildung
EIEC
20
UPEC
21
(hitzelabiles und/oder hitzestabiles Enterotoxin). ETEC-­Infektionen äußern
sich in einem Cholera-ähnlichen Krankheitsbild. Es kommt zu ­wässrigen
Durchfällen, abdominalen Krämpfen, Fieber und Erbrechen (Levine, 1987).
Beim Tier sind vor allem neugeborene Lämmer, Kälber und Ferkel betroffen
(Kennan & Monckton, 1990; Tzipori et al., 1981).
Enteroaggregative E. coli (EAggEC) wurden bisher vor allem bei Kindern
als Infektionserreger nachgewiesen und verursachen wässrige, oft persistierende Durchfälle. EAggEC haften an den Enterozyten des Dünndarms
und lagern sich in typischer Weise zu Aggregaten zusammen, die an gestapelte Ziegelsteine erinnern (Nataro & Kaper, 1998). Sie schädigen die
Epithelzellen durch Bildung eines besonderen Toxins (EAST I), das dem
­hitzestabilen Enterotoxin der ETEC ähnelt.
Enteroinvasive E. coli (EIEC) besitzen die Fähigkeit, in die Darmwand
einzudringen. Sie sind bezüglich ihrer pathogenen Eigenschaften den
Ruhr­bakterien (Shigellen) vergleichbar und verursachen beim Menschen
Ruhr­-ähnliche S
­ ymptome, wie anhaltende Bauchkrämpfe (Tenesmen) und
breiige, blutige und blutig-schleimige Diarrhöen (Formal, 1983). Es kommt
zu lokalen E
­ ntzündungen mit Bildung von Geschwüren durch Einwandern
der Erreger in die Dickdarmwand. Eine Tierpathogenität ist nicht bekannt.
Diffus adhärente E. coli (DAEC) wurden als Infektionsauslöser vor allem
bei Kindern mit wässrigen Durchfällen nachgewiesen (Nataro & Kaper,
1998). Über ihre Pathogenitätsmechanismen ist noch wenig bekannt.
Nekrotoxische E. coli (NTEC) zeichnen sich durch die Bildung spezieller
­Toxine, die sog. „Cytonekrose-Faktoren (CNF)“ aus (De Rycke et al., 1990).
CNF1-­bildende NTEC sind vor allem beim Menschen mit extra­intestinalen
Coli-Infektionen nachgewiesen worden, während CNF2-bildende NTEC bei
Kälbern sowohl mit Durchfall als auch mit Septikämien in Verbindung gebracht werden (Caprioli et al., 1987).
Extraintestinale Infektionen entstehen durch das Vordringen von Coli-Bakterien, die sich z. T. aus der eigenen Darmmikrobiota rekrutieren, in ansonsten sterile oder spärlich besiedelte Bereiche des Organismus, in denen
eine Vermehrung begünstigt wird. Bei extraintestinalen Infektionen spielt
E. coli vor allem als Erreger von Harnwegsinfekten (UPEC = uropathogene
E. coli) eine wich­tige Rolle (Johnson & Stamm, 1989). Uropathogene E. coli
heften sich mit ­spezifischen Adhäsinen (z. B. P-Fimbrien, S-Fimbrien) an
uroepi­theliale Zellen und setzen zur Schädigung des Epithels ein zytolytisch wirkendes Toxin (α-Hämolysin) ein. Gleichzeitig entziehen sie sich
den Attacken der Immunabwehr durch Kapselbildung. UPEC können die
Harnwege von Menschen, Affen und Hunden infizieren.
22
Ein wesentlich selteneres Krankheitsbild ist die Sepsis oder Meningitis bei
Neugeborenen, die durch Sepsis/Meningitis-assoziierte E. coli (SEPEC,
MENEC) hervorgerufen werden kann (Dawson et al., 1999). Sepsisaus­
lösende E. coli nutzen ähnliche Pathogenitätsfaktoren wie die UPEC. Durch
E. coli ausgelöste Sepsis kommt bei Mensch, Rind, Schaf, Schwein und
Geflügel vor. SEPEC schützen sich vor der Attacke durch das Komplementsystem durch den Besitz bestimmter Kapseltypen und langkettiger
Lipopolysaccharide. Dies ermöglicht ihnen, längerfristig im Blutserum zu
überleben. SEPEC werden daher als „serumresistent“ bezeichnet. Meningitis-assoziierte E. coli (MENEC) sind ­E. coli-Varianten, die auch Harnwegs­
infektionen verursachen können. Sie werden beim Menschen während
der Geburt von der Mutter auf das Neugeborene übertragen, bei dem
sie eine Meningitis auslösen können. MENEC schützen sich ebenfalls
durch Bildung einer Kapsel (oft vom K1-Serotyp). Sie docken mit patho­
genen S-Fimbrien-Adhäsinen an Epithel- und Endothelzellen an und können
diese Gewebsbarrieren durchdringen.
Nach der vollständigen Genom-Sequenzierung des E. coli K-12-Stammes
MG 1655 (Blattner et al., 1997) folgte die Entschlüsselung weiterer Genome
von ­apathogenen wie auch pathogenen Varianten der Spezies Escherichia
coli. Durch Vergleiche der jeweiligen DNA-Sequenzen konnten Unterschiede in der genetischen Organisation aufgezeigt und Hinweise auf die phylogenetische Entwicklung von Bakterienstämmen gegeben werden (Dobrindt
et al., 2010). Die Analyse der Sequenzdaten hat zu der Erkenntnis geführt,
dass bakterielle Genome aus einem Kern­genom bestehen, aber daneben
zusätzliche Gene vorhanden sind, die für stammtypische Eigenschaften
codieren und ­möglicherweise über horizontalen Gentransfer in das Genom
integriert w
­ urden [Abb. 14].
Kerngenom
Phagen
Plasmide
Genom-Inseln
Pathogenität
Resistenz
Sekretion
Metabolismus
Degradation
Symbiose
Abb. 14 Genomstruktur von Bakterien (nach Hacker et al., 2001).
23
Hierbei trägt die Integration von Fremd-DNA über mobile genetische
­Elemente (z. B. Plasmide, Bakteriophagen, Transposons), Mutationen und
intragenomische Umlagerungen wesentlich zur Ausbildung eines flexi­
blen ­Genpools bei (Dobrindt et al., 2004; Hacker & Kaper, 2000). Bei der
Ent­
­
stehung von pathogenen Varianten durch horizontalen Gentransfer
[Abb. 15] spielen auch die sog. „Pathogenitätsinseln“ (große chromo­
somale DNA-Regionen mit DNA-Sequenzen, die sich in ihrer Zusammen­
setzung stark vom Kern-Genom unterscheiden), eine besondere Rolle
(Hacker et al., 1997). Hier sind gehäuft Gene für die Expression von bestimmten ­Virulenz- bzw. Fitnessfaktoren lokalisiert. Patho­gene und apathogene E. coli-Stämme unterscheiden sich durch das Vorhandensein oder
Fehlen solcher Virulenzgene (Dobrindt, 2005; Grozdanov et al., 2004).
Bakterien tauschen ihre
DNA aus
Die der Pathogenität zu Grunde
liegenden Virulenzgene befinden
sich häufig auf übertragbaren
DNA-Elementen. Es wird vermutet, dass die Entstehung der
EHEC-Stämme durch horizon­
talen Gentransfer via Plasmide
und Bakteriophagen erfolgte.
Während z. B. die evolutionäre
Trennung der Spezies E. coli und
Salmonella ssp. auf die Zeit vor
ca. 160 Millionen Jahren datiert
wird, liegt die Entstehung von
: H7 nur wenige
EHEC O157 Jahrzehnte zurück (Armstrong
et al., 1996). Wahrscheinlich
wurden u. a. durch Phagen die
­
Toxin-­Deter­minanten von ­Shigella
dys­enteriae auf E. coli O55 übertragen, der dadurch zu einem
neuen Stamm E. coli EHEC
O157 : H7 mutierte, dem Auslöser
der enterohämorrhagischen Colitis (Lathem et al., 2003).
24
Transposon Pathogenitätsinsel
Bakteriophage Plasmid
Kommensale E. coli
Bakterienruhr (EIEC)
Meningitis (MENEC)
Diarrhöen
(EPEC, EHEC, ETEC,
EAggEC, DAEC)
Harnwegsinfekte
(UPEC)
Hämolytisch-Urämisches
Syndrom (EHEC)
Abb. 15 M
obile genetische Elemente in der Evolution
pathogener E. coli. Enteropathogene (EPEC),
enterohämorrhagische (EHEC), enteroinvasive
(EIEC), enteroaggregative (EAggEC), diffus
adhärente (DAEC), uropathogene (UPEC),
­Meningitis-assoziierte (MENEC) E. coli
(nach Kaper et al., 2004).
Alfred Nissles Entdeckung des Coli-Antagonismus
und sein „neues Heilprinzip“
Gegen Ende des 19. Jahrhunderts erlebte die mikrobiologische Forschung,
insbesondere die Medizinische Mikrobiologie, einen enormen Aufschwung,
vor allem durch die bahnbrechenden Entdeckungen von Louis Pasteur,
­Robert Koch, Theodor Escherich, Paul Ehrlich, Ilja Metchnikoff u.v.a. ­Indes
blieb die Frage, ob die Darmmikrobiota als Ganzes oder aber b
­ estimmte
Darmkeime einen eher positiven oder mehr negativen Einfluss auf den
Wirt haben, ebenso unbeantwortet wie die Frage nach den regulierenden
Mechanismen im Zusammenleben der Bakterien im Gastrointestinaltrakt
untereinander. Verschiedene Forschergruppen versuchten bereits damals,
diesen Geheimnissen auf die Spur zu kommen.
So war es nicht verwunderlich, dass sich der Freiburger Hygieniker und Bakteriologe Alfred Nissle
auf Grund seiner Untersuchungen an Darmkeimen
im „Routine-Labor“ weitere Fragen stellte, nämlich: „Warum und wie beeinflussen sich Bakterien
in einer Mischkultur, wie im Darm vorhanden, gegenseitig in ihrem Wachstum?“ oder „Warum bleiben bei epidemie­
artigen Durchfallerkrankungen
einige wenige Menschen darmgesund?“ Nachdem sich Nissle etwa 4 Jahre mit diesen Fragen
experimentell auseinandergesetzt hatte, präsentierte er 1916 vor der Freiburger Medizinischen
Gesellschaft seine Ergebnisse in einem Vortrag
Prof. Dr. med. Alfred Nissle
mit dem Titel „Über die Grundlagen einer neuen
(1874 – 1965)
ursächlichen Bekämpfung der pathologischen
Darmflora“ (Nissle, 1916) [Abb. 16]. Die metho­dische Grundlage bildete ein
von Nissle entwickelter und im Prinzip noch heute v­ erwendeter Testansatz
zur In-vitro-Bestimmung bakterieller Interferenz („Antagonismus-Test“)
­ einkulturen eines Infektions­erregers mit Reinkultu[Abb. 17]. Dabei werden R
ren eines Bakterienstamms aus der physiologischen Darmmikrobiota (poten­
zieller Antagonist) gemeinsam in ­Flüssigkultur gezüchtet. Nach bestimmter
Zeit, meist nach Übernacht-Kultur, werden Proben entnom­men und auf
geeigneten Festnährböden die Keimzahlen der co-kultivierten ­Bakterien
bestimmt. Kann der physiologische Darmkeim das Hochwachsen des
Infektionserregers behindern oder unterbinden, so gibt das Ausmaß der
Wachstums­hemmung die Stärke der antagonistischen Aktivität wieder.
25
Nissle hatte für die Kennzeichnung solcher Darmkeime einen „Antagonis­
tischen Index“ e
­ ntwickelt und fand unter den von ihm isolierten Coli-Stämmen
aus dem menschlichen Intestinaltrakt solche mit starker oder schwacher
antagonistischer Wirkung. Er nutzte diese Methode auch für die Bestimmung der wechselseitigen antagonistischen Aktivität zwischen verschiedenen Coli-Stämmen. E. coli mit besonders starker Hemmwirkung fand er
während des Ersten Weltkrieges bei zwei Patienten im Freiburger Verwundeten-Lazarett, die „niemals Neigung zu Darmerkrankungen gezeigt hatten
und speziell auch dann nicht an infektiösen Darmprozessen erkrankt waren,
als ein größerer Teil ihrer Umgebung daran erkrankte und sie infolge des
engen Zusammen­lebens mit bereits Erkrankten der Gelegenheit zur Infektion
in reichlichstem Maße ausgesetzt waren“ (Nissle, 1916). Diese Stämme, die
auch unter Labor­bedingungen ihre antagonistische Wirksamkeit behielten,
wurden von Nissle zuerst im Selbstversuch und an gesunden Personen getestet, um ihre Unschädlichkeit beim Menschen nach oraler Verabreichung
festzustellen. Anschließend therapierte er versuchsweise Patienten, zuerst
solche mit i­nfektiösen Diarrhöen, Paratyphus B, Shigellen-Ruhr und Salmonellen-Dauerausscheider und später Patienten mit post-dysenterischen
Darmfunktionsstörungen („Colon irritabile“, heute „Reizdarm-Syndrom“)
oder ­chronischer habitueller Obstipation (Nissle, 1916, 1918). Obwohl es
sich ­hierbei um Einzel­­fall­beobachtungen handelte, war Nissle von der klinischen Wirksamkeit ­seiner Coli-Kulturen überzeugt und dehnte die Untersuchungen auch auf w
­ eitere Darmerkrankungen, wie z. B. Colitis ulcerosa und
dyspep­tische Beschwerden, aus (Nissle, 1918, 1925).
Abb. 16 Titelseite der Arbeit, in der Nissle erstmals über den E. coli-Antagonismus berichtete.
26
Ein weiteres E. coli-Isolat von besonderer „antagonistischer Stärke“ gewann Nissle 1917 aus den Fäzes eines Soldaten, der während des Balkanfeldzugs im Ersten Weltkrieg in der Region Dobrudscha stationiert
war und der „im Gegensatz zur großen Mehrzahl seiner Kameraden weder an Ruhr noch anderen Darmkrankheiten gelitten hat“ (Nissle, 1925).
Nissle ­züchtete, von der asservierten Stammkultur ausgehend, die Keime
auf Festagar­platten und füllte die frisch abgeernteten Bakterienkulturen
in Hartgela­tinekapseln. Damit schuf er die Grundlage für ein Arzneimittel, das als Wirkstoff lebende Coli-Bakterien enthält. Nissle meldete für
­dieses Arzneimittel den Namen „MUTAFLOR“ beim Reichspatentamt an,
der am 1. März 1917 als Waren­zeichen geschützt wurde. Später erhielt der
im Mutaflor® enthaltene E. coli-Stamm, im Gedenken an Alfred Nissle, die
Stammbezeichnung „E. coli Nissle 1917“, abgekürzt „EcN“. Der gegen verschiedene pathogene E. coli-Stämme sowie gegen Salmonellen, Shigellen,
27
Relative Keimzahl (%)
Cholera-Vibrionen, Proteus und Candida in vitro gefundene ­Antago­nismus
von E. coli Nissle 1917 [Abb. 17] wurde später auch in vivo bei gnotobio­
tischen Ferkeln [Abb. 18] und Ratten nachgewiesen. Selbst bei Neu­gebore­
nen ist der antimikrobielle Effekt nachweisbar, worauf nachfolgend noch
eingegangen wird.
Antagonismus von EcN,
Co-Kultivierung mit:
100
50
0
12 3 45 6
EcN
Testorganismen
1 Salmonella enteritidis
2 Shigella dysenteriae
3 E. coli O112 ab (EPEC)
4 E. coli O6 : K15 : H31 (UPEC)
5 Proteus vulgaris
6 Candida albicans
Abb. 17 Antagonismus von E. coli Nissle 1917 (EcN) gegen verschiedene Mikro­organismen.
EcN hemmt in vitro signifikant das Wachstum pathogener Bakterien und Pilze
(nach Sonnenborn & Greinwald, 1991).
Abb. 18 Beispiel für die antagonistische Wirkung von E. coli Nissle 1917 (EcN) im gnotobiotischen
Ferkel. Die orale Gabe von EcN bekämpft Infektionen mit enteropathogenen E. coli
(nach Schulze et al., 1992).
Nissle selbst, aber auch andere Autoren, veröffentlichten in den Folgejahren
zahlreiche Kasuistiken und Fallsammlungen, die wichtige Hinweise für die
therapeutische Anwendbarkeit des antagonistisch aktiven E. ­coli-Stamms
­Nissle 1917 lieferten.
28
Das „Auf und Ab“ der Therapie mit lebenden
Mikroorganismen
Nissle war zu seiner Zeit nicht der alleinige Protagonist einer Therapie mit
lebenden Mikroorganismen. Die zunehmende Kenntnis über Infektionen
des Darms und die damit im Zusammenhang stehenden Erkrankungen
sowie die Erfahrungen über die Möglichkeit, Immunitäten dagegen zu ent­
wickeln, ließen auch bei anderen Forschern die Idee reifen, zur Bekämpfung von Infektions­erregern „harmlose Bakterien“ aus der körpereigenen
Mikrobiota zu ­nutzen. Bereits um das Jahr 1900 und später wurden vor
allem Laktobazillen­
­
kulturen gezielt zur Therapie eingesetzt (Brudzinski,
1900; ­Distaso & ­Schiller, 1914; Rettger & Cheplin, 1921; u. a.), nicht zuletzt
auch ausgelöst durch ­
Metchnikoffs Bestseller „The prolongation of life“
(­Metchnikoff, 1907). ­Nissle war aber jahrzehntelang der Einzige, der durch
den Einsatz des von ihm ­isolierten lebenden E. coli-Stamms in Form des
Präparats Mutaflor® therapeu­tische Erfolge erzielte.
Dennoch ebbte das allgemeine Interesse an dieser Therapiestrategie gegen
Mitte des vergangenen Jahrhunderts ab. Hauptgrund war der Beginn des
„Antibiotika-Zeitalters“. 1928 hatte Alexander Fleming aus dem Schimmelpilz Penicillium notatum eine antibakteriell wirkende Substanz isoliert, die
KBE [log/g kam
Kot] (Penicillin). In der Folge­
ab 1940 zur therapeutischen Anwendung
zeit
12
­wurde eine Fülle weiterer Antibiotika entwickelt, mit dem Ergebnis einer
10 Infektionskeimen aus Entzündungs­äußerst erfolgreichen Eliminierung von
herden. Das Ziel, alle Infektionskrankheiten
mit diesen antimikrobiellen Sub8
stanzen zu beherrschen, schien erreichbar zu sein (Muniesa et al., 2012).
6
Je näher man sich aber dem Ziel glaubte, umso häufiger wurden therapeutische Misserfolge dokumentiert und 4umso intensiver wurde entweder nach
2
neuen wirksamen Antibiotika oder nach
solchen mit einem noch breiteren
Wirkungs­spektrum gesucht. Schätzungsweise sind es heute 50.000 Tonnen
2
6
8
10 und 12
an Antibiotika, die weltweit jährlich von0Mensch
und4 Tier aufgenommen
z. T. unverändert in die Umwelt wieder ausgeschieden werden. Ohne diese
Antibiotika wäre in den zivilisierten Ländern der heutige Gesundheits- und
Lebensstandard nur schwer vorstellbar.
Allerdings können Antibiotika auch krank machen: Übelkeit, Durchfälle,
Erschöpfung, Psychosen, Leber- und Nieren­
­
schä­
den, Allergien, anaphylak­
tischer Schock sind nur einige der vielfach dokumen­
tierten Nebenwir­
kungen. Hinzu kommt, dass Mikroorganismen in der Lage sind, sich schnell
und ­effektiv an veränderte Umweltbedingungen anzupassen. So können sie
auf verschiedenen Wegen Resistenzen ausbilden und sich so der ­Wirkung
29
der ­Anti­biotika entziehen. In Biotopen mit hoher Antibiotikakonzentration –
z. B. ist der Gastrointestinaltrakt eines Patienten im Krankenhaus solch ein
Biotop – ist die residente Mikrobiota einem zunehmenden Selektionsdruck
durch anti­mikrobiell wirkende Substanzen ausgesetzt. Das Ergebnis ist eine
Häufung multiresistenter Keime im Hospitalmilieu und ein Anstieg von noso­
komialen I­nfektionen mit multiresistenten Erregern weltweit. Diese Entwicklung
und das langsam zunehmende Bewusstsein bei Therapeuten und P
­ atienten,
mit der Anwendung von Antibiotika kritischer umzugehen sowie zusätzlich oder alternativ bewährte und positiv evaluierte Methoden einzusetzen,
­haben in den letzten Jahren zu einer Renaissance der Therapie mit lebenden
Mikro­organismen geführt. Übereinstimmend mit der internationalen Literatur
bezeichnet man diese Therapie heute auch als „probiotische Therapie“ und
die dabei eingesetzten Mikroorganismen als „Probiotika“. Probiotika sind
­definitionsgemäß apatho­gene lebende Mikroorganismen, die, wenn sie in genügend hoher Zahl lebensfähig in den Gastrointestinaltrakt gelangen, ­einen
positiven Effekt auf die Gesundheit des Wirtsorganismus ausüben (FAO/
WHO, 2001). Ein Probiotikum, das als Arzneimittel zugelassen werden soll,
muss hohe Anforderungen erfüllen [Abb. 19]. Im Gegensatz zu Nahrungs­
ergänzungsmitteln ­müssen hier der Nachweis der ­klinischen Wirksamkeit bei
­ edizinischen Indikationen und Belege zu Wirkungen und Wirk­
­definierten m
mechanismen erbracht ­werden. Außerdem muss die Einhaltung spezieller Kriterien zur P
­ roduktqualität und Unbedenklichkeit (u. a. mikrobiologische Reinheit
und ­definierter Lebendkeimgehalt sowie Apathogenität und genetische Stabilität des ­therapeutisch eingesetzten Mikroorganismus) garantiert sein [Abb. 19].
Der Nachweis der Apathogenität oder Avirulenz ist bei der Überprüfung von
E. coli-Stämmen, die als Probiotika therapeutisch eingesetzt werden s­ ollen,
von besonderer Bedeutung, da – wie bereits beschrieben – die Spezies
Escherichia coli eine Reihe von pathogenen Varianten beinhaltet. Aus diesem
Grunde wurde die Verwendung von Präparaten mit lebenden E. coli-Bakterien
von einigen Autoren noch bis Mitte der 90er Jahre des letzten Jahrhunderts
pauschal abgelehnt (Expert’s Opinion Poll – Marget et al., 1995). Diese pauschale Ablehnung ist mittlerweile einer differenzierteren Betrachtungs­weise
gewichen, was nicht zuletzt der Weiterentwicklung molekular­­­
genetischer
Differenzierungs- und Identifizierungsmethoden zu verdanken ist. Mit Hilfe
dieser Techniken ist es möglich, pathogene E. coli-Varianten eindeutig von
apathogenen Stämmen zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen apatho­
gene Stämme, wie E. coli Nissle 1917, im Gegensatz zu virulenten E. coli-­
Varianten in toxikologischen Untersuchungen sowohl an konventionell als
auch an keimfrei gehaltenen Tieren keinerlei schädliche Wirkungen.
30
Wirksamkeit
● Durch kontrollierte klinische Studien
nachgewiesene Wirksamkeit
bei definierten Indikationen
Produktqualität
● Mikrobiologische Reinheit
● Definierter Lebendkeimgehalt
● Exakte Identifizierung und
Abgrenzung von nahe
verwandten Mikroorganismen
● Lebensfähigkeit im GI-Trakt
Unbedenklichkeit
● Apathogenität
● Genetische Stabilität
Wirkmechanismen
● Unterdrückung von Wachstum
und Kolonisation unerwünschter
Mikroorganismen
● Beitrag zur Optimierung des
intestinalen Milieus und zum
luminalen Stoffwechsel
● Kommunikation mit Darmepithel
und Immunsystem
● Kolonisationsfähigkeit
Abb. 19 Anforderungen an probiotische Arzneimittel: Nachweis der Wirksamkeit und Unbedenklichkeit,
Erkenntnisse zu den Wirkmecha­nismen, nachgewiesene und reproduzierbare Produktqualität.
Wirksamkeit
● Durch kontrollierte klinische Studien
nachgewiesene Wirksamkeit
bei definierten Indikationen
Produktqualität
● Mikrobiologische Reinheit
● Definierter Lebendkeimgehalt
● Exakte Identifizierung und
Abgrenzung von nahe
verwandten Mikroorganismen
● Lebensfähigkeit im GI-Trakt
Unbedenklichkeit
● Apathogenität
● Genetische Stabilität
Wirkmechanismen
● Unterdrückung von Wachstum
und Kolonisation unerwünschter
Mikroorganismen
● Beitrag zur Optimierung des
intestinalen Milieus und zum
luminalen Stoffwechsel
● Kommunikation mit Darmepithel
und Immunsystem
31
E. coli Stamm Nissle 1917: der weltweit am besten
­untersuchte probiotische E. coli-Stamm
Alle in Abb. 19 aufgelisteten Anforderungen an ein probiotisches Arznei­mittel
werden von E. coli Nissle 1917 (EcN), der „Wirksubstanz“ von Mutaflor®, vollständig erfüllt (Sonnenborn & Schulze, 2009). Die Aufklärung der Genomstruktur (Grozdanov et al., 2004; Hancock, Vejborg et al., 2010; Sun et al.,
2005) wie auch die vollständige Genom-Sequenzierung (Cress et al., 2013;
Reister et al., 2014) hat gezeigt, dass das Fehlen von Pathogenitätsfaktoren
(z. B. von ­Enterotoxinen, Hämolysinen, Zytotoxinen, Invasinen, pathogenspezifischen F
­ imbrien) [Abb. 20], kombiniert mit dem Vorhandensein von
sog. Fitness-­
Faktoren (z. B. Mikrocinen, multiplen Eisenaufnahmesys­
temen, typischen Adhäsinen, Flagellen) [Abb. 21], die das Überleben und
die ­
Kolonisierung im Darm ermöglichen, zu den probiotischen Eigen­
schaften von EcN beitragen (Blum-Oehler et al., 2001; Deriu et al., 2013;
Dobrindt, 2005; Grosse et al., 2006; ­Jacobi & Malfertheiner, 2011; Lasaro
et al., 2009; Patzer et al., 2003; Schlee et al., 2007; ­Valdebenito et al., 2006,
­Vassiliadis et al., 2010).
• Apathogener E. coli-Stamm (Serotyp O6 : K5 : H1)
• Genetische Stabilität
Keine
 Enterotoxin-Produktion
 Zytotoxin-Produktion
 Hämolysin-Produktion
 Pathogenen Adhäsionsfaktoren
 Invasivität
 Immuntoxizität
 Serumresistenz (keine Sepsisgefahr)
 Uropathogenität
 Toxizität in keimfreien und konventionell
gehaltenen Tieren
Stamm zwar immunmodulatorisch wirksam, zeigt aber keine immuntoxi­schen
Wirkungen (Grozdanov et al., 2002). ­
­
Serologisch-diagnostisch ist das
EcN-Lipopolysaccharid als Oberflächenantigen (O-Antigen) vom Typ O6 anzusprechen. Ein zweites Set von Strukturelementen mit signalvermittelnder
Wirkung sind die drei verschiedenen, in ihrer Kombination EcN-­typischen
Fimbrien (F1A-, F1C- und „Curli“- Fimbrien). Diese sind zum einen wichtig
für die Biofilmbildung, zu der EcN im Gegensatz zu anderen Coli-Bakterien
auch bei der physiologischen Körpertemperatur von 37 °C in der Lage ist
(Lasaro et al., 2009). Zum anderen können die ­
Fimbrien aufgrund ihrer
Adhäsions­eigenschaften auch den Kontakt zur Epithelzelle bzw. zum Darmschleim vermitteln. Ein drittes Strukturelement mit signalvermittelnden
­Eigenschaften sind die Geißeln (Flagellen), die den EcN-Stamm primär in
die Lage versetzen, sich im zähflüssigen Darmschleim aktiv f­ortzubewegen.
Daneben sind die Flagellen von EcN verantwortlich für die Induktion der Synthese anti­mikrobieller Peptide (Defensine u. a.) im Darm­epithel, eine Fähig­
keit, die ­unter anderem für die therapeutische Effektivität des Keims bei
Colitis ulcerosa von Bedeutung ist (Schlee et al., 2007). Auch die Kapsel
vom Serotyp K5 ist wichtig bei der Interaktion zwischen EcN und den Darm­
epithelzellen (Hafez et al., 2009, 2010).
Gencluster des Chromosoms, die für die phäno­typischen Merkmale
von E. coli Nissle 1917 codieren
7 verschiedene Eisen­­­
auf­nahme-­Systeme als
­wichtige Fitness­faktoren
2 antagonistisch
aktive Mikrocine
Chromosom
keine
­Pathogenitätsfaktoren
Fimbrien
3 verschiedene Typen von
Fimbrien ermöglichen Adhärenz
und ­Biofilm­bildung
Flagellen (H1-Serotyp)
sorgen für aktive
Fortbewegung
Abb. 20 Sicherheitsaspekte von E. coli Nissle 1917.
Neben den Syntheseleistungen (Produktion von löslichen Signalstoffen), die
das Vorhandensein der lebenden Bakterienzelle voraussetzen, sind auch
­bakterielle Strukturelemente, die für das Wirtsgewebe Signalfunktion haben, für die Interaktionen zwischen E. coli Nissle 1917 (EcN) und dem Darm­
epithel von Bedeutung (Behnsen et al., 2013). Zu diesen Struktur­elementen
zählt das besondere stammtypische ­Lipopolysaccharid (LPS), das aufgrund
der stark ver­kürzten Oligosaccharid-Seitenkette dafür verantwortlich ist,
dass EcN nicht in der Lage ist, eine S
­ epsis zu verursachen. So ist der EcN32
2 stammtypische Plasmide ohne AntibiotikaResistenz-Gene, nicht übertragbar
Kapsel (K5)
Spezielle immunmodulatorische LPS-Variante vom Serotyp O6 ,
bisher bei keinem anderen Stamm nachgewiesen
Serotyp O6 : K5 : H1
Abb. 21 Phänotypische Charakteristika von E. coli Nissle 1917 (EcN) und ihre Genloci auf dem
Bakterien­chromosom. Die wichtigsten Strukturkomponenten von E. coli Nissle 1917 mit signal­
vermittelnden Eigenschaften sind rot umkreist: O6-Antigen, adhäsive Fimbrien (F1A-, F1Cund „Curli“-Fimbrien), Kapsel-Komponenten und Flagellen (H1-Antigen).
33
Wirkungen und Wirkmechanismen von
E. coli Stamm Nissle 1917
Mikrobielle Kommunikation und Interaktionen („Cross Talk“) im
Gastrointestinaltrakt
Mikroorganismen im Gastrointestinaltrakt kommunizieren über lösliche oder
strukturgebundene Signalmoleküle mit der Darmschleimhaut des W
­ irtes.
Diese Interaktion nennt man „Cross Talk“ [Abb. 22] (Köhler et al., 2003;
­Lebeer et al., 2010; Sekirov et al., 2010).
Darmkeime
Pathogene
Kommensale
Probiotische Mikroorganismen
Signalmoleküle
Darmlumen
Tight Junctions,
Adherence Junctions
und Desmosomen
Mucinschicht
Darmepithelzellen
Basalmembran
Abb. 22 Mikrobielle Kommunikation und Interaktion im Gastrointestinaltrakt.
Kommensale Darmkeime (blau) und probiotische Mikroorganismen (grün) ­produzieren
­verschiedene, sich gegenseitig beeinflussende und auch auf die Darmepithelzellen
­einwirkende Signalmoleküle (blaue und grüne Kügelchen). Durch die Produktion von
Bakteriocinen (rote Blitze) hemmen bestimmte Darmbakterien, wie E. coli Nissle 1917,
­pathogene Mikroorganismen und hindern diese an der Kolonisierung des Intestinaltrakts.
Auch untereinander tauschen Darmbakterien Informationen aus, was zumeist durch lösliche Signalstoffe vermittelt wird. Zu diesen Signalstoffen
gehören die N-Acylhomoserinlaktone (AHSL) gramnegativer Bakterien und
die modi­fizier­ten Peptidmoleküle grampositiver Bakterien, die beim sog.
„Quorum Sensing“ von Bedeutung sind (Kaper & Sperandio, 2005; S
­ hiner
et al., 2005). Darunter versteht man die Fähigkeit der Darmbakterien, die
Zelldichte ihrer Populationen zu messen und entsprechend zu agieren. Mit
anderen löslichen Faktoren, den chemisch heterogenen Bakteriocinen,
34
die vielfältige anti­mikrobielle Wirkungen haben, halten bestimmte Darmbakterien Infektionskeime fern – eine Eigenschaft, die auch für uns als Wirtsorganismen von N
­ utzen ist (Gillor et al., 2008; K
­ irkup, 2006) [Abb. 22]. So produziert z. B. E. coli ­Nissle 1917 (EcN) zwei verschiedene antibakteriell ­wirkende
Substanzen, Mikrocin M (M von Mutaflor®) und Mikrocin H47 ­(Patzer et al.,
2003). Die Mikrocine bilden eine Untergruppe der Bakteriocine und wirken
hauptsächlich auf nahe verwandte Keime des Produ­
zentenstamms, bei
EcN vor allem auf andere gramnegative Entero­bakterien.
Bildung von Biofilmen und Mikrokolonien im Darm
Als strukturgebundene Signalmoleküle sind insbesondere die von E. coli
­Nissle 1917 (EcN) gebildeten Fimbrien und Geißeln (Flagellen) von Bedeutung, die die interbakterielle Vernetzung und die Biofilmbildung des Keims
an der Darmschleimhaut, genauer gesagt an der dem Darmepithel lumenseitig aufliegenden Mucinschicht, vermitteln (Troge et al., 2012). Die schematische Darstellung der ­Entste­hung eines Biofilms ist in Abb. 23 gezeigt
­(Jenkinson & ­Lappin-Scott, 2001). Wie Untersuchungen mit keimfreien Ratten gezeigt haben, deren Intestinaltrakt nach oraler Verabreichung (Mono­
assoziation) mit EcN besiedelt wurde, haben die probiotischen Coli-Bakterien eine ­starke Affinität zum Darmschleim, wo sie Mikrokolonien oder
➤O
berflächenenergie
des Substrats
äumliche Nähe
➤ R
„propinquity“
➤ Physiko-chemische Faktoren
➤ Nährstoffangebot
➤ K
ommemsalismus
➤ M
utualismus
➤ H
ydrodynamische
Scherkräfte
➤ P
hänotypische
Veränderungen
Strömungsrichtung
Adhäsion ➜
Kolonisation ➜
Akkumulation ➜
Verbandsbildung ➜
Ablösung
„climax community“
Abb. 23 Schematische Darstellung der Ausbildung eines Biofilms an der Darmschleimhaut
(nach Jenkinson & Lappin-Scott, 2001).
35
Bio­filme a
­ usbilden [Abb. 24]. Für den Menschen als Patient bedeutet die
Fähigkeit von EcN zur Biofilmbildung, dass eine im Verhältnis zur gesamten
Darm­mikrobiota (ca. 1014 Keime) relativ geringe Menge an probiotischen
Bakterien (ca. 1010 lebende Zellen/Einzeldosis) sich nach der Freisetzung aus der magensaftresistenten Mutaflor®-Kapsel nicht nur im Dickdarm lokal verteilt, sondern auch nach Assoziation an den Darmschleim
­dreidimensional vernetzen kann. Dies hat zur Folge, dass die Verweilzeit
der verabreichten Keime am Ziel­ort, dem Colon, verlängert wird.
(­Joeres-Nguyen-Xuan et al., 2010). Die Fähigkeit von EcN zur Biofilmbildung zeigte sich in dieser Studie dadurch, dass eine Elimination des Keims
aus dem Darm nach Absetzen der Medikation stark verzögert verlief. So
war EcN nach 2 Wochen noch bei knapp 50 % der Probanden nachweisbar, nach 12 Wochen noch bei ca. 25 %. [Abb. 25]. Die Lebens­fähigkeit der
EcN-­Bakterien im Darm wurde durch die antibakterielle Wirkung von Mesa­
lazin nicht signifikant beeinflusst. Die Feststellung, dass Mesalazin keine
negativen Auswirkungen auf die Vitalität von EcN hat, eröffnet die Möglichkeit einer Co-Medikation bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen.
Die bei E. coli Nissle 1917 (EcN) besonders stark ausgeprägte Fähigkeit zur
­Adhäsion verhindert, dass die oral verabfolgten EcN-Bakterien nach der
Magen-Darm-­Passage schnell wieder ausgeschieden werden und verlängert ihre Persistenz im Intestinaltrakt.
Probanden [%] mit positivem Nachweis von E. coli Nissle 1917 im Stuhl
100
E. coli Nissle 1917 + Mesalazin
E. coli Nissle 1917 + Placebo
80
60
Abb. 24 Besiedlung des Darmschleims durch E. coli Nissle 1917 nach oraler Verabreichung an keimfreie
Ratten. Die Pfeile zeigen auf schleimumhüllte Bakterienzellen (rasterelektronenmikroskopische
Aufnahme: A. Lorenz, J. Schulze, Potsdam-Rehbrücke).
Eine experimentelle Untersuchung zur Entstehung von Biofilmen zeigte für
pathogenen (EPEC),
E. coli Nissle 1917 (EcN) eine im Vergleich zu entero­
entero­toxischen (ETEC) und entero­hämorrhagischen E. coli-­Stämmen (EHEC)
deutlich bessere Fähigkeit zur Biofilmbildung. Auch scheint EcN in der Lage
zu sein, die pathogenen E. coli-Stämme während der Biofilmbildung zu ver­
drängen ­(Hancock, Dahl et al., 2010). Die Biofilmbildung beruht u. a. darauf,
dass EcN C
­ ellulose produzieren kann, die in Biofilmen als extrazelluläre Matrix
dient (Monteiro et al., 2009). Für die Ausbildung von Biofilmen sind die F1C-­
Fimbrien von EcN von besonderer Bedeutung (Lasaro et al., 2009).
In einer placebokontrollierten, randomisierten doppelblinden Studie ­erhielten
48 gesunde Probanden 2 x täglich 2,5 – 25 x 109 E. coli Nissle 1917 (EcN)/Kapsel
+ 1500 mg Mesalazin oder 2,5 – 25 x 109 EcN-Bakterien/Kapsel + ­Placebo
36
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
16
24
32
40
48
Wochen
Abb. 25 Nach oraler Verabreichung an Probanden persistiert E. coli Nissle 1917 noch über Wochen im
Darm einiger Testpersonen. Die Überlebensfähigkeit von E. coli Nissle 1917 im Darm wird durch
Mesalazin nicht signifikant beeinflusst (nach Joeres-Nguyen-Xuan et al., 2010).
Als Konsequenz für die klinische Praxis kann festgestellt werden, dass die
Biofilmbildung von E. coli Nissle 1917 die Kolonisationsfähigkeit des Probio­
tikums verbessert und die Persistenz der Keime im Intestinaltrakt verlängert.
37
Die Stärkung der intestinalen Barrierefunktion
Präklinische In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen haben zu der Erkenntnis
geführt, dass die klinische Wirksamkeit von bestimmten Probiotika, darunter auch von E. coli Nissle 1917 (EcN), zumindest teilweise, wenn nicht
sogar über­wiegend, auf eine intensive Kommunikation („Cross Talk“) der
verabreichten nützlichen Mikroorganismen mit dem Darmepithel zurückzuführen ist. Dabei resultiert diese Kommunikation zwischen Probiotikum
und Wirtsorganismus in einer generellen Stärkung der Barrierefunktion der
Darmschleimhaut. Für EcN ­wurden bisher drei grundlegende Wirkmechanismen entdeckt, die in ihrer Gesamtheit eine Verbesserung der intestinalen
Barrierefunktion zur Folge haben:
1. ein Anti-Invasionseffekt (Hemmung der Invasion von pathogenen
entero­invasiven Mikroorganismen in die Darmepithelzellen),
2. ein Induktionseffekt auf die Synthese von antimikrobiell wirkenden
­körpereigenen Peptiden (Defensinen u. a. Wirkstoffen) durch die Darm­
epithelzellen,
3. eine Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands
durch die Beeinflussung bestimmter Zell-Kitt-Proteine (Zonula-occludens-Proteine) der sog. „Tight Junctions“.
1. Der Anti-Invasionseffekt am Darmepithel: Bestimmte pathogene Durchfall­
erreger sind in der Lage, in die Epithelzellen der Darmschleimhaut ­einzudringen.
Man spricht hier von sog. enteroinvasiven Mikroorganismen. Zu diesen gehören beispielsweise die Ruhr-Bazillen (Shigellen), Salmonellen, Yersinien u. a.
Die invasive Aktivität dieser Mikroorganismen kann man im mikrobio­logischen
Labor durch spezielle Invasionstests mit menschlichen epithelialen Zellkulturen nachweisen [Abb. 26]. Die Infektion des Darmepithels mit entero­invasiven
pathogenen Keimen initiiert profuse Diarrhöen, die bei stärkerem Befall der
Schleimhaut auch zum Absetzen blutiger oder blutig-schleimiger Stühle führen können. Dies beruht darauf, dass die enteroinvasiven Keime letztendlich
die Darmepithelzellen zerstören und z. T. großflächige Ulzerationen bewirken
können. Die gegen solche Infektionserreger gerichtete Aktivität von Probio­
tika kann prinzipiell durch drei Wirkmechanismen zustande kommen:
a) ein direkter antagonistischer Effekt gegen die patho­­­
genen Erreger
(Hemmung der Zellvermehrung bzw. Abtötung der Durchfallkeime),
b) eine Besetzung von Rezeptoren an der Zellmembran der Darmepithelzelle oder in der aufliegenden Mucinschicht, so dass die pathogenen
Keime k
­ eine „Andock­stellen“ finden, und/oder
c) eine stabilisierende Wirkung auf die Darmepithelzelle, so dass diese
dem Angriff der invasiven Erreger besser standhalten kann.
38
A
B
HeLa-Kontrolle
C
HeLa- + EIEC
HeLa + S. typhimurium
(ohne Mikroorganismen)
D
HeLa + S. typhimurium
E
HeLa + E. coli Nissle 1917
Abb. 26 In-vitro-Invasionstests von enteroinvasiven und apathogenen Enterobakterien mit HeLa-Zellen in der
Zellkultur. EIEC: Enteroinvasive Escherichia coli-Bakterien, S. typhimurium: Salmonella typhimurium.
Nach gemeinsamer Inkubation von enteroinva­siven Keimen und Epithelzellen sind Erstere bald im
Inneren der Epithelzelle zu finden, wo sie sich rasch v­ ermehren können (B, C, D). Demgegenüber
ist der nicht-invasive E. coli Stamm Nissle 1917 nach Co-Inkubation mit den Epithelzellen nicht im
Inneren der Epithelzelle zu ­finden, sondern adhäriert außen an der Zellmembran (E). (Fluoreszenz­
mikroskopische Darstellung; Aufnahmen: A. Fahsbender, U. Sonnenborn, Herdecke).
Ein direkter antagonistischer Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN) gegen patho­
gene Erreger ist seit langem bekannt und wurde durch aktuelle Untersuchungen bestätigt [Abb. 27] (Kandasamy et al., 2014; Kleta et al., 2014; L
­ eatham
et al., 2009; Schinner et al., 2015; Schroeder et al., 2006; ­Sonnenborn &
­Schulze, 2009; Storm et al., 2011). Es hat sich herausgestellt, dass EcN
auch in der Lage ist, die Toxinproduktion pathogener Keime zu unterbinden.
So reduziert EcN in Co-Kultivierung mit Shiga-Toxin produzierenden E. coliStämmen (EHEC) signifikant deren Wachstum, die stx-Genexpression
und die Shiga-Toxin-Produktion (Mohsin et al., 2015; Reissbrodt et al.,
2009; Rund et al., 2013). Während ein kürzlich von einer Forschergruppe
E. coli-Stamm ähnliche
des Robert-Koch-Instituts isolierter kommensaler ­
­Wirkun­gen auf EHEC-Stämme wie EcN aufweist, z­eigen andere kommen­
sale ­
E. ­coli-Stämme und probiotische Bakterienstämme keine oder nur
­ eimen
­geringe Hemmwirkung [Abb. 28]. Eine Verdrängung von pathogenen K
am Darm­epithel beruht u. a. auf der Fähigkeit von EcN, Biofilme zu bilden
­(Hancock, Dahl et al., 2010, s. oben „Bildung von Biofilmen“). Die Biofilmbildung geht einher mit einer Stimulierung der intestinalen Mucinsynthese
(Hafez et al., 2012). EcN reduziert auch die Salmonellenadhäsion an Darm­
epithelzellen bei Schweinen (Schierack et al., 2011).
39
log KBE/g Fäzes
10
9
9
8
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
EHEC (E. coli EDL933)
E. coli MG1655
2
1
Untersuchungen am Institut für Mikrobiologie der Tschechischen A
­ kademie
der Wissenschaften in Novy Hradek haben darüber hinaus gezeigt, dass
eine Besiedlung keimfreier Schweinchen mit E. coli Nissle 1917 die Translokation nachfolgend verabreichter Salmonella Thyphimurium-­Bakterien über
die Darmschleimhaut in die mesenterialen Lymphknoten und die w
­ eitere
Streuung über den Blutkreislauf verhinderte (Splichalova et al., 2011).
Demgegenüber konnte für Bifidobacterium choerinum, einen schweine­
spezifischen Darmkeim, kein prophylaktischer Effekt gezeigt werden.
log KBE/g Fäzes
10
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22
Zeit (d)
EHEC (E. coli EDL933)
E. coli Nissle 1917
2
1
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22
Zeit (d)
Abb. 27 Mit Streptomycin behandelte CD-1 Mäuse wurden prophylaktisch mit kommensalen E. coliStämmen (E. coli MG1655, E. coli Nissle 1917) besiedelt. Nur E. coli Nissle 1917 hemmt die
An­siedlung des nach 10 Tagen verabreichten enterohämorrhagischen E. coli (EHEC EDL933) im
­Mäusedarm. KBE = Kolonie-bildende Einheiten (nach Leatham et al., 2009).
Abb. 28 Stamm-spezifische Wirkung von probiotischen Bakterien auf die Konzentration von ShigaToxinen nach Co-Kultivierung mit Shiga-Toxin produzierenden E. coli (EHEC-Stämme).
E. coli N
­ issle 1917 reduziert signifikant die Shiga-Toxin-Konzentration (nach Reissbrodt et al., 2009).
40
Untersuchungen am Institut für Molekulare Infektionsbiologie der Universität
Würzburg mit der intestinalen Zelllinie INT407 haben ergeben, dass der anti-invasive Wirkmechanismus von E. coli Nissle 1917 (EcN) durch eine d
­ irekte
Einwirkung des ­pro­biotischen Coli-Bakteriums auf die Darmepithelzelle zustande kommt (Altenhoefer et al., 2004; Oelschlaeger et al., 2001). Bei CoKulti­vierungen von INT407-Zellen mit EcN oder dem apathogenen Kontrollstamm E. coli K-12 wurden keine Bakterien in den Epithelzellen gefunden,
d. h. beide Escherichia coli-Stämme haben keine invasiven Fähigkeiten.
Im Gegensatz dazu kommt es bei Co-Kultivierung der Epithelzellen mit
den Salmonella typhimurium-Stämmen C17 bzw. LT2 zum Eindringen
der invasiven Bakterien in die Darmzellen. Nach Co-Inkubation kann man
mehr als 40 % des verabreichten Inokulums des virulenteren Salmonellenstamms (C17) in den Epithelzellen wiederfinden. Bei dem schwächer viru­
­ almonellenstamm (LT2) beträgt die Invasionsrate gut 10 %. Führt
lenten S
man nun eine dreifache Co-Kultivierung mit Epithelzellen, Salmonellen und
­E. ­coli-Bakterien durch, so wird die Invasivität der Salmonellen nur im Falle
der Co-Kultivierung mit E. coli Nissle 1917 deutlich reduziert. Im Vergleich
dazu zeigt der Kontrollstamm E. coli K-12 keinen anti-invasiven Effekt.
Zur Klärung der Frage, wie der anti-invasive Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN)
zustande kommt, wurden verschiedene Versuchsansätze in der Zellkultur
durchgeführt. Bei Inkubationen der Epithelzellen mit S. typhimurium C17 und
EcN ließ sich der Anti-Invasionseffekt von EcN gegenüber S. typhimurium C17
gut reproduzieren. Dabei kam es zu keiner Abnahme der Salmonellen-Zellzahlen in den Versuchs­ansätzen, was vermuten lässt, dass der durch EcN bewirkte
Anti-Invasions­effekt nicht durch die Ausschüttung der antimikrobiell wirkenden
Mikrocine zustande kommt. Auch mit einer Mikrocin-negativen Mutante von
EcN (Stamm H5445) war der anti-invasive Effekt noch in vollem Umfang vorhanden. Das beweist, dass dieser Wirkmechanismus des EcN-Stamms nicht
mit seiner Fähigkeit verknüpft ist, antimikrobielle Substanzen zu produzieren.
Ebenso kommt eine Besetzung von Haftstellen für die invasiven Salmonellen
an der Zellmembran der Epithelzellen durch EcN nicht als Wirkmechanismus
41
in Frage. Diese Möglichkeit konnte man ausschließen durch eine Versuchs­
anordnung, bei der die probiotischen EcN-Bakterien durch Einbringen in ­einen
Filtereinsatz von den pathogenen Salmonellen wie auch von den E
­ pithelzellen
getrennt wurden. Bei diesem sog. „Transwell-System“ handelt es sich um
einen Filtereinsatz, dessen Bodenfläche mit einer semipermeablen Membran bestückt ist, die zwar durchlässig ist für Moleküle, nicht aber für ganze
­Bakterienzellen. Trotz der räumlichen Trennung von EcN und den anderen Testkomponenten blieb der Anti-Invasionseffekt von EcN erhalten. Dieser Befund
spricht – in Zusammenhang mit den anderen Ergebnissen – ­dafür, dass der
anti-invasive Effekt von EcN auf der Synthese d
­ iffusibler Signal­moleküle
beruht, die auf die Epithelzellen in einer Art und Weise einwirken, dass
diese unempfindlicher werden gegenüber den Invasions­mechanismen des
virulenten Salmonellenstamms. Welche Signalsubstanzen von EcN diesen
Effekt bewirken und welche Gene dafür verantwortlich sind, ist zur Zeit
Gegenstand intensiver Forschung.
Neuere Untersuchungen auf zellbiologischer Ebene haben ergeben, dass E. coli
Nissle 1917 die Aktivität des Invasionsapparats von Salmonellen r­eduziert
(Schierack et al., 2011). Dies führt dazu, dass die ersten Invasions­schritte
­ rreger, wie die Epithelzelladhäsion, unterdrückt werden.
der pathogenen E
50
Monoinkubation
Co-Inkubation mit E. coli K-12 DH5α
Co-Inkubation mit E. coli Nissle 1917
Invasionseffizienz [%]
40
30
20
10
0
Salmonella enterica
Serovar Typhimurium
Stamm C17
Stamm SL 1344
Yersinia enterocolitica
Stamm WA-C
Stamm WA314
Shigella flexneri
Stamm M90T
Abb. 29 Nachweis der Anti-Invasionswirkung von E. coli Nissle 1917 gegen die Salmonella Typhimurium-­
Stämme C17 und SL1344, die Yersinia enterocolitica-Stämme WA-C und WA314 und den
­Shigella flexneri-Stamm M90T in vitro. Für den Nachweis wurden Co-Inkubationen von E. coli
Nissle 1917 mit den o. g. pathogenen Bakterienstämmen in Zellkulturversuchen mit INT407-­
Zellen durchgeführt (nach Altenhoefer et al., 2004).
42
Erfreulicherweise funktioniert die Anti-Invasionswirkung von E. coli Nissle
1917 (EcN) nicht nur mit Salmonellen, sondern auch mit verschiedenen
­anderen invasiven Infek­tions­erregern (Altenhoefer et al., 2004; Huebner et
al., 2011). So konnten Altenhoefer et al. (2004) in Zellkulturver­suchen mit
der INT407-Zelllinie auch die Hemm­wirkung von EcN auf das Invasionsver­
mögen von Yersinia enterocolitica und Shigella flexneri [Abb. 29] sowie von
Listeria monocytogenes und Legionella pneumophila nachweisen. Dies
ist um so interessanter, da die verschiedenen invasiven Keime über völlig unterschied­liche Invasionsmechanismen verfügen, ein weiterer Hinweis
­darauf, dass die Anti-Invasionswirkung von EcN auf einer direkten Beeinflussung grundlegender Signalvorgänge in der Epithelzelle selbst beruht. Desweiteren konnten die Infektionsbiologen bestätigen, dass die beobachtete
Hemmung der Z
­ ellinvasion der darmpathogenen Erreger durch EcN nicht
auf der M
­ ikrocin-Produktion beruht, keines direkten Kontakts zwischen EcN
und den invasiven Bakterien bzw. z­ wischen EcN und den Epithelzellen bedarf und auch nicht vom ­Vorhandensein der F1A- bzw. F1C-Fimbrien abhängig ist. Eine mögliche Bedeutung von ­plasmidcodierten Genprodukten
für den Anti-Invasionseffekt konnte ebenfalls nicht gefunden werden, da
ein plasmidfreies EcN-Derivat dieselbe Anti-­In­vasionswirkung zeigte wie
der Originalstamm. Dies bedeutet, dass auch die EcN-typischen kleinen
Plasmide pMUT1 und pMUT2 [s. Abb. 21] für den invasions­­hemmenden
Effekt von EcN nicht erforderlich sind, die Erb­information für die Anti-In­
vasionswirkung also chromosomal codiert sein muss. Welche Gene auf
dem EcN-Chromosom den anti-invasiven ­Effekt bewirken, ist Thema aktueller molekulargenetischer Untersuchungen.
Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass E. coli Nissle 1917 (EcN) bisher noch unbekannte Signalmoleküle sezerniert, die direkt auf die Darm­
epithelzellen einwirken, wodurch deren Funktion als Infektionsbarriere
gegen entero­invasive Keime deutlich verbessert wird. Diese anti-invasive
Aktivität r­ epräsentiert einen Aspekt des Cross Talk von EcN mit dem Darm­
epithel, der für die klinische Wirksamkeit bei bestimmten gastroenterologischen Indikationen von Bedeutung sein dürfte.
Als Konsequenz für die klinische Praxis kann festgehalten werden,
dass der anti-invasive Effekt von E. coli Nissle 1917 nicht nur wichtig ist
bei Durchfallerkrankungen als Folge einer Infektion mit enteroin­vasiven
Er­
regern, sondern auch bei der Behandlung von Patienten mit C
­ olitis
ulcerosa, bei denen bekanntlich eine Infektion mit enteropathogenen
­
­Keimen einen akuten Entzündungsschub auslösen kann.
43
2. Der Induktionseffekt auf die Synthese antimikrobieller Peptide
des Darmepithels: Die Barrierefunktion der Darmschleimhaut gegenüber
den im Darmlumen vorhandenen kommensalen Mikroorganismen wie auch
gegenüber Infektionskeimen ist gekennzeichnet durch die Fähigkeit der
­Enterozyten, auf einen mikrobiellen Reiz hin besondere Peptidmoleküle
und Proteine zu s­ ynthetisieren und auszuschütten, die sich durch breite
anti­mikro­bielle Wirkungen auszeichnen. Zu den in den letzten Jahren intensiv untersuchten körper­eigenen Schutzsubstanzen gehören die humanen
α- und β-Defensine und die Cathelicidine als niedermolekulare antimikrobielle Peptide, wie auch das vergleichsweise höhermolekulare Calprotectin
und funktionell verwandte ­Proteine. Diese evolutionsbiologisch sehr alten
Schutzsubstanzen der Epithelien sind Komponenten der sog. natürlichen
oder angeborenen Immunität und werden nicht durch das spezifische
­adaptive Immunsystem reguliert.
Bei bestimmten Darmerkrankungen, z. B. Colitis ulcerosa und Morbus
Crohn, ist die Synthese dieser Schutzstoffe vermindert (Wehkamp et al.,
2005). Als Folge findet man bei den betroffenen Patienten im Gegensatz
zu gesunden Personen eine dichte Besiedlung der Mucinschicht und der
Darmepithelzellschicht mit kommensalen, z. T. auch mit pathogenen Darmkeimen (Swidsinski et al., 2002). Eine mögliche Stimulierung der krankheitsbedingt brach liegen­den Produktion dieser körpereigenen antimikrobiellen
Schutzstoffe durch P
­ robiotika wäre daher eine neue Wirkqualität dieser
Lebendkeimpräparate. Die ersten experi­
mentellen Untersuchungen zur
Wirkung verschiedener physio­logischer wie auch pathogener Darmkeime,
darunter auch E. coli Nissle 1917 (EcN), auf die intestinale Defensin-Produktion wurden von Jan Wehkamp und K
­ ollegen am Robert-Bosch-Krankenhaus in Stuttgart vorgenommen (Wehkamp et al., 2002, 2004). Hierbei zeigte
sich in In-vitro-Untersuchungen mit Zell­kulturen von Dickdarmepithelzellen
(Caco-2-Zellen), dass der EcN-Stamm im Vergleich zu mehr als 40 anderen
getesteten E. coli-Stämmen eine außer­gewöhnlich starke Stimulierung der
Genexpression des induzierbaren Schutzfaktors humanes β-Defensin-2
(HBD-2) bewirkte [Abb. 30]. Weiterfüh­rende Untersuchungen zeigten, dass
nicht nur die Genexpression von HBD-2 durch EcN dosis- und zeitabhängig stimuliert wurde, sondern dass die erhöhte ­Genexpression auch mit
­einer vermehrten Synthese des HBD-2-Peptids einherging (Wehkamp et
al., 2004). Damit war ein neues Wirkprinzip von EcN entdeckt, das vermutlich für die klinische Wirksamkeit bei Patienten mit C
­ olitis ulcerosa von
­großer Bedeutung ist. Weitere Unter­suchungen zur Aufklärung des molekularen Wirkprinzips führten zu der Erkenntnis, dass die HBD-2-stimulierende
Aktivität auf dem ­Vorhandensein von zwei Komponenten des EcN-Stamms
beruht, und zwar dem EcN-eigenen Flagellenapparat (Schlee et al., 2007)
sowie dem Modulatorprotein tcpC (Menz et al., 2011). Experimente mit
Relative Genexpression / mg RNA
20
44
HD-5
HBD-2
HD-6
15
10
5
0
Abb. 30 Wirkung veschiedener pathogener und apathogener E. coli-Stämme auf die Induktion der antimikrobiellen Peptide HBD-1, HBD-2, HD-5 und HD-6 : E. coli Nissle 1917 (EcN) zeigt die stärkste
Induktion von HBD-2 in humanen CaCo-2 Epithelzellen (Wehkamp et al., 2002, 2004).
HBD-1
Kontrolle
EcN
EPEC
E. coli K-12
UPEC
E. coli PZ915
Abb. 31 Aufbau des Geißel(Flagellen)apparates von E. coli. Als ein Induktor der HBD-2-Synthese in
Colonepithelzellen durch E. coli Nissle 1917 wurde das Strukturprotein Flagellin identifiziert, aus
dem sich das Geißelfilament zusammensetzt.
45
verschiedenen Defektmutanten von EcN ergaben, dass nur E
­ cN-Keime,
die ein intaktes Flagellum synthetisieren konnten, in der Lage waren, die
HBD-2-Produktion in den Colonepithelzellen zu stimulieren. Als wirk­
same Komponente wurde das Geißel-Strukturprotein Flagellin iden­tifiziert,
aus dem die eigentliche Geißel, das sog. Flagellenfilament, aufgebaut ist
[Abb. 31]. Weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene sollen zeigen,
­welches die Besonderheiten des EcN-Flagellins sind, die den ungewöhnlich starken HBD-2-induzierenden Effekt bewirken. EcN induziert nicht nur
die Expression von humanem β-Defensin-2 (HBD-2) und von Cathelicidin
LL37 in humanen Colonepithelzellen in vitro [Abb. 30] (Wehkamp et al.,
2004), sondern auch die Synthese von Calprotectin im Darm gnotobio­
tischer Ferkel in vivo (Splichal et al., 2005).
Als Konsequenz für die klinische Praxis bedeutet die Induktion von
körpereigenen Abwehrstoffen der angeborenen Immunität durch E. coli
­
Nissle 1917 eine generelle Stärkung der antimikrobiellen Abwehrkraft der
Darmschleimhaut. Dies ist von besonderer Bedeutung für bestimmte gastro­
enterologische Erkrankungen, wie die chronisch entzündlichen Darm­
erkrankungen, bei denen die Synthese antimikrobieller Peptide durch die
Mucosa krankheitsbedingt darniederliegt.
3. Die Stärkung des Zusammenhalts des epithelialen Zellverbands:
Im gesunden Zustand ist die Translokationsrate (Übertrittfrequenz) von großmolekularen antigenen Nahrungsbestandteilen oder korpuskulären Teilchen,
wie Bakterien, Viren und Pilzen, vom Darm ins Körperinnere sehr niedrig und
strikt reguliert (Arrieta et al., 2006; Turner, 2009). Dabei wird nur soviel an
Translokation erlaubt, wie benötigt wird, um eine gewisse Basisaktivierung
(„Hab-acht-Stellung“) des Immunsystems zu gewährleisten. Beim gesunden
Menschen gibt es kein überschießendes Wachstum der luminalen Darm­
mikrobiota, die Permeabilität des Darmepithels für größere Partikel ist stark
reduziert und das darmassoziierte Immunsystem verfügt über genügend
Makrophagen, regulatorische T-Zellen, IgA-produzierende Plasmazellen
und andere Lymphozyten, um einzelne, über das Darmepithel t­ranslozierte
Mikro­
organismen abzufangen. Unter bestimmten pathophysiologischen
Bedingungen erfolgt jedoch ein erhöhter Transfer luminaler Antigene ins
Körper­innere. Dies kann verschiedene Ursachen haben [Abb. 32]:
– ­eine überschießende Vermehrung von Darmkeimen oder von pathogenen Erregern im Darm bzw. eine reduzierte intraluminale Abtötung/Verdauung von Mikroorganismen und Nahrungsbestandteilen,
– eine beschädigte Darmschleimhaut mit erhöhter Permeabilität für groß­
molekulare Antigene und ganze Mikrobenzellen („Leaky Gut“),
– eine reduzierte Abwehrleistung des darmassoziierten Immunsystems,
z. B. durch einen Mangel an Antikörper-produzierenden Plasmazellen
(IgA, IgM) in der Lamina propria.
In der Praxis ist das Vorkommen eines „Leaky Gut“ mit erhöhter Permea­
bilität der Darmschleimhaut wesentlich häufiger anzutreffen als etwa eine
überschießende Vermehrung von Darmmikrobiota-Komponenten oder eine
drastische Reduzierung der Aktivität des darmassoziierten Immunsystems.
Der „Leaky Gut“ ist durch eine pathologisch veränderte epitheliale Barriere
mit erhöhter Durchlässigkeit für antigenes Material aus dem Gastrointestinal­
trakt gekennzeichnet. Dieser Zustand beruht in vielen Fällen auf einer Reduzierung der Zahl der Zell-Kitt-Proteine in den sog. „Tight Junctions“ (auf
deutsch „feste Verbindungen“), und damit einer Lockerung des intestinalen
Zellverbands. Der „Leaky Gut“ kann nach Schädigung des Darmepithels
durch pathogene Erreger und deren Toxine, durch bestimmte Arzneimittel
und andere das Epithel schädigende Substanzen sowie durch Bestrahlungen entstehen. Eine erhöhte Permeabilität des Darmepithels kann aber auch
Begleiterscheinung bestimmter intestinaler Erkrankungen sein und lässt
­ achweisen.
sich beispielsweise bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn n
46
47
➋
Lymphsystem
IgA
IgM
IgA
IgM
➌
IgM
IgA
Lumen Mucosa
Lymphsystem
Submucosa
➊
Lumen Mucosa
Submucosa
➊ reduzierte intraluminale Verdauung / überschießende mikrobielle Vermehrung
➋ beschädigte Schleimhaut-Barriere, erhöhte Permeabilität („Leaky Gut“)
➌ Abnahme der IgA- und IgM-produzierenden Plasmazellen in der Lamina propria
Abb. 32 Regulierte und restriktive Aufnahme von großmolekularen Antigenen und Mikroorganismen
aus dem Darmlumen ins Körperinnere (Translokation) unter physiologischen Bedingungen
(linkes Bild) und erhöhter Transfer unter pathologischen Bedingungen verschiedener Ursache
(rechtes Bild).
Die erhöhte Durchlässigkeit der Darmschleimhaut („Leaky Gut“), die Zunahme der bakte­riellen Trans­lokation und in der Folge erhöhte Endotoxinspiegel
im Blut werden auch für die progrediente Leberschädigung bei der Alkohol-induzierten Leberzirrhose verantwortlich gemacht. E. coli Nissle 1917
(EcN) kann durch Modulation der gestörten Darmmikrobiota, durch Stärkung
der Darmbarriere und Senkung der Infektanfälligkeit, die ­klinischen Symptome bei Zirrhose-Patienten („Child ­Pugh Score“) deutlich bessern. Die dafür
ursächlichen molekularen Wirkmechanismen sind noch zu entschlüsseln,
um das Infektions­risiko bei Zirrhose-Patienten gezielt zu senken und die protektive Wirkung von EcN optimal zu nutzen (Lata et al., 2007).
Die zuvor angesprochenen Tight Junctions, die auf der apikalen Seite
der Darmepithelzelle die sog. Zonula occludens des Interzellularraums
bilden, repräsentieren einen Typ von speziellen Verbindungen zwischen
den Epithelzellen. Zu den Interzellularverbindungen gehören verschiedene
membran­stän­dige Multiprotein-Komplexe, die eine Bindung zwischen den
Zellmembranen benachbarter Epithelzellen der Darmschleimhaut vermitteln. Die interzellu­lären Verbindungen sorgen dafür, dass die Epithelzellen
48
dicht aneinander liegen und dass das Darmgewebe zusammengehalten
wird. ­
Weitere Verbindungen mit Haltefunktion sind die Desmosomen,
­wobei man zyto­logisch zwischen Belt-Desmosomen (Zonula adhaerens)
und Spot-Desmosomen (Macula adhaerens) unterscheidet. Sogenannte
„Adherence Junctions“ folgen auf die apikal ­lokalisierten Tight Junctions
und stellen einen besonderen Typ an Desmosomen dar, der die Epithelzellen bandartig umgibt. Funktionell dienen alle Arten von Desmosomen
in erster Linie der mechanischen Festigkeit des epithelialen Zellverbands.
Besondere Interzellularverbindungen sind die Gap Junctions (Nexus), die
­direkte plasmatische Verbindungen ­zwischen den Epithelzellen darstellen
und ­daher vor allem kommunikative Aufgaben haben.
Der kompliziert aufgebaute Tight Junctional Complex (TJC) gehört zu
den Interzellularverbindungen, die räumlich gesehen dem Darmlumen am
nächsten sind, da sie sich auf der apikalen Seite der Epithelzellschicht befinden. Der TJC enthält mehrere „Klammer“- oder „Kitt“-Proteine, die als
Zonula occludens-Proteine bezeichnet werden (abgekürzt ZO-1, ZO-2 und
ZO-3) [Abb. 33]. Diese „Kitt“-Proteine sorgen für den festen Zusammenhalt
des Zellverbands und die Dichtigkeit der Interzellularspalten zwischen den
Epithelzellen, daher die lateinische Bezeichnung „Zonula occludens“. Die
Zahl der „Kitt“-Proteine vor Ort bestimmt die Dichtigkeit des Interzellular­
spalts und damit die Un­
durch­
lässigkeit des epithelialen Zellverbands.
Apikale Membran
Tight Junction
Adherence Junction
F- Aktin
Desmosom
Occludin
ZO-1
Claudin
ZO-2
JAM
ZO-3
Nectin
Protein X
Afadin
Adherence
Junction
Matrix
E-Cadherin
Protein Y
α-Catenin
IgA
– pathologisch –
β-Catenin
– normal –
Basalmembran
Abb. 33 Bild links: Schematische Darstellung der Interzellularverbindungen von Darmepithelzellen
(Tight Junctions, Adherence Junctions, Desmosomen).
Bild rechts: Aufbau des Tight Junctional Complex (TJC) auf der apikalen Seite der Darmepithel­
zellen. Die wichtigsten „Kitt“-Proteine, die den Interzellularspalt aktiv öffnen oder schließen
können, sind dargestellt (nach Miyoshi & Takai, 2005).
49
Ihre Verteilung innerhalb
der Epithelzelle (zytoplasmatische oder mem­­bran­
ständige Lokalisierung wird
durch ein Netzwerk komplexer Signalkaskaden reguliert, wobei Sub­
typen
der Proteinkinase C (PKC)
von besonderer Be­deutung
sind (Hering et al., 2014;
Zyrek et al., 2007).
Im Gegensatz zu den
­Ad­h erence Junctions bzw.
mosomen haben die
Tight Junction Zonula adhaerens Macula adhaerens Des­
Tight ­
Junctions dynamiAbb. 34 Elektronenmikroskopische Aufnahme:
sche
Funktionen
zu erfüllen
Benachbarte Darmepithelzellen mit Interzellular­spalt,
[Abb.
34].
Ihre
„Tightness“
Tight Junction und Desmosomen.
reguliert den Einstrom von
Elektrolyten und korpuskulären P
­ artikeln, wie Bakte­rien, Viren oder ­Pilze,
ins Körperinnere. Im g
­ esunden Zustand sind die Tight Junctions völlig dicht
und es findet so gut wie kein Austausch von Substanzen oder Organismen
über den Interzellularspalt statt. Bestimmte Durchfallerreger, wie entero­
pathogene E. coli-Stämme (EPEC), sind in der Lage, durch die Ausschüttung
von Toxinen oder Signalstoffen die Festigkeit der Tight Junctions zu lockern
und sich so eine Zugangspforte in den menschlichen Körper zu öffnen.
Interessanterweise ist E. coli Nissle 1917 (EcN) in der Lage, die durch den
Angriff enteropathogener Erreger gelockerten Tight Junction-Verbindun­ ieder zu festigen und damit die Integrität des Darmepithels wieder
gen w
­herzustellen (Trebichavsky et al., 2010). Wie M. Alexander Schmidt und Mitarbeiter am Institut für Infektiologie des Universitätsklinikums Münster unter
Verwendung der sog. DNA-Microarray-Technik zeigen konnten (Cichon et al.,
2004; Zyrek et al., 2007), bewirkt eine Co-Inkubation von Darmepithel­
­ enexpression
zellen (T84-Zellen) mit EcN eine zeitabhängige Induktion der G
für Proteine, die an Aufbau und Zusammenhalt von Tight ­Junctions bzw.
­Desmosomen beteiligt sind. Insgesamt führt der Kontakt der ­Epithelzellen
mit EcN zu einer Veränderung der Expression von über 300 ­Genen, wobei
sowohl Herauf- als auch Herunter­regu­lierungen der Gen­aktivität verschiedener epithelialer Erbfaktoren fest­
gestellt wurden. In den verwendeten
T84-Zellen wurde eine erhöhte ­Genexpression für die Tight Junction- bzw.
Desmosomen-Proteine ZO-2 und Pinin nach­gewiesen, die nach 120 Minuten
50
Inkubationszeit ein Maximum erreichte (Cichon et al., 2004). Weiterführende Untersuchungen derselben Arbeitsgruppe (Zyrek et al., 2007), die sich
mit der molekularen Regulation der ZO-2-Expression in den Epithelzellen
befassten, konnten mit hochauf­lösenden mikroskopischen Techniken unter
Verwendung von spezifischen F
­ luoreszenz-markierten Antikörpern [Abb. 35]
und proteinchemischen Analysen nachweisen, dass EcN eine durch die Infektion mit enteropathogenen E. coli (EPEC) geschädigte epitheliale B
­ arriere
wieder restaurieren kann. Dabei kommt es zu einer Umverteilung des ZO2-Proteins vom Zytoplasma an die Zellmembran der Epithelzelle. Dieser
stabilisierende Effekt von EcN konnte in verschiedenen Zellkulturversuchen
sowohl für eine prophylaktische als auch für eine therapeutische Gabe gezeigt werden.
In T84 Epithelzellen kann die durch E. coli Nissle 1917 bewirkte Ver­besserung
einer gestörten Barrierefunktion auch durch die Transfektion der ­Zellen
mit bestimmten regulatorischen microRNAs (miRNAs) induziert werden
(Veltman et al., 2012).
Abb. 35 Darstellung der Induktion der ZO-2-Genexpression in T84-Epithelzellen und der Einlagerung
des ZO-2-Proteins in die Tight Junctions. Die Anfärbung mit ZO-2-spezifischen fluoreszie­ren­­
den Antikörpern zeigt (Kontrolle ohne Bakterien), dass das ZO-2-Protein sich überwiegend in
den Membranen der Epithelzellen befindet. Dies wird sichtbar durch die starke hellrote Färbung
der Zellumrisse. Eine 120-minütige Inkubation mit EcN (E. coli Nissle 1917) führte zu keiner
Veränderung der Distribution des ZO-2-Proteins. Eine 120-minütige Inkubation mit entero­
pathogenen E. coli (EPEC) führte demgegenüber zu einer Umverteilung von ZO-2 und einer Reduzierung der Dichtigkeit der Tight Junctions. Bei gleichzeitiger Inkubation von EPEC und EcN
konnten die EPEC-Bakterien ihre schädliche Wirkung nicht entfalten (nach Zyrek et al., 2007).
51
In weiteren Zellkulturversuchen konnten Prisciandaro und Kollegen
­(Prisciandaro et al., 2012) sowie Howarth und Mitarbeiter (Wang et al.,
2014) nachweisen, dass die durch den Antitumorwirkstoff 5
­ -Fluorouracil
(5-FU) beschädigte epitheliale Barriere von Faktoren, die E. coli Nissle
1917 (EcN) in den Kulturüberstand sezerniert, wieder restauriert werden
kann. In Zellkulturversuchen mit Caco2-Zellen, bei denen der Zusammenhalt des Zellverbands durch die Verwendung calciumfreien Mediums gelockert war, konnte die Barrierefunktion des Epithelzell-Monolayers durch
Kultur­überstände von EcN sowie durch gereinigtes EcN-Lipopoly­saccharid
­wieder hergestellt werden (Stetinova et al., 2010).
Untersuchungen von Wissenschaftlern des Braunschweiger HelmholtzZentrums für Infektionsforschung (Ukena et al., 2007) konnten den die
Tight Junctions stabilisierenden Effekt von E. coli Nissle 1917 (EcN) auch
in Experimenten mit keimfrei gehaltenen Mäusen nachweisen. Mit Hilfe
fluores­
zenzmikroskopischer und proteinchemischer Methoden konnten
die Wissenschaftler zeigen, dass auch in vivo die Barrierefunktion des
Darm­epithels durch eine gezielte Besiedlung des Gastrointestinaltrakts der
keimfreien Tiere mit EcN verbessert wird. In den gnotobiotischen Mäusen
hatte die EcN-Verabreichung unter anderem eine erhöhte Expression des
Tight Junction-Proteins ZO-1 zur Folge.
spricht die durch die Entzündung verminderte Natrium-Transportaktivität
nicht mehr auf Forskolin an. Die orale Verabreichung von E. coli Nissle 1917
(EcN) bewirkt eine deutliche Wieder­herstellung der Natrium-Absorptionskapazität über die Membran und stellt gleichzeitig die Ansprechbarkeit der
Epithelzelle auf Forskolin wieder her. Diese Ergebnisse zeigen, dass die antiinflammato­rische Wirkung von EcN auch zu einer Restaurierung geschädigter funktioneller Aktivitäten der Darm­epithelzellen beiträgt.
Ähnliche Mechanismen könnten auch die festgestellte Wirksamkeit von
E. coli Nissle 1917 (EcN) bei akuten Stress-induzierten Schleimhautläsionen
(Gastritis) des Magens erklären. Konturek und Kollegen konnten im Mausmodell eine ­anti-inflammatorische, durchblutungsfördernde Wirkung und
vermehrte ­Bildung von Zellschutzproteinen wie Hsp70 (sog. „Hitzeschutzprotein“) unter EcN-Gabe nachweisen (Konturek et al., 2009). Gleichzeitig
reduzierte ­EcN die unter Stressbedingungen erhöhte Gen­expression mucosaler Entzündungsmediatoren und die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuclear Factor κB (NF-κB).
Das Ausmaß der mucosalen Permeabilität für Nahrungsantigene oder Mikro­
organismen kann durch die Messung der Aufnahme des Farbstoffs „Evans
Blue“ festgestellt werden (Bestimmung der Absorption bei 620 nm).
Bei Mäusen, bei denen durch Verabreichung von Dextransodiumsulfat
(DSS) eine Dickdarmentzündung (Colitis) induziert wurde, war im Vergleich zu ge­sun­den Kontrollmäusen das Niveau der Expression des Tight
­Junction-Proteins ZO-1 drastisch reduziert. Dies bestätigt die bereits von
­anderen Arbeitsgruppen gewonnene Erkenntnis, dass Darmentzündungen
mit einer Verschlechterung der Barrierefunktion der Darmschleimhaut einhergehen, wie hier an der DSS-induzierten Reduzierung des ZO-1-Gehalts
der Zellmembranen der Enterozyten abgelesen werden kann. Interessanter­
weise erhöht die orale Verab­reichung von E. coli Nissle 1917 die Expression des Tight Junction-Proteins ZO-1 wieder, wenn auch das Niveau der
gesunden Tiere nicht ganz erreicht wird.
Außer der oben gezeigten Lockerung des Zellverbands der Darmschleimhaut, was den Übertritt von großmolekularen Antigenen wie auch ganzen
Mikrobenzellen in den Körper begünstigt, hat die DSS-induzierte Colitis
­
auch Auswirkungen auf wichtige Transportfunktionen der Darmepithelzellen.
So ist die Aktivität der membranständigen Natrium-Pumpe nach ­Etablierung
der Colitis im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren drastisch abgesenkt. Bei
gesunden Tieren kann die Aktivität dieses Transportproteins durch das Pharmakon ­Forskolin gehemmt werden. Bei Tieren mit DSS-induzierter C
­ olitis
52
0
0
0
0
0
0
Abb. 36 Eine durch Dextransodiumsulfat (DSS) provozierte Colitis erhöht die Durchlässigkeit der Darmschleimhaut für den Farbstoff „Evans Blue“ auf fast das Fünffache und zeigt eine geschädigte
Darmbarriere an. Die Behandlung der DSS-Colitis-Mäuse mit E. coli Nissle 1917 führt die mucosale Permeabilität beinahe wieder auf den Normalwert zurück (nach Ukena et al., 2007).
53
Bei gesunden Mäusen ist die mucosale Durchlässigkeit für den Farbstoff
„Evans Blue“ sehr gering. Wird bei den Versuchstieren eine Colitis ausgelöst,
so erhöht sich die mucosale Permeabilität auf fast das Fünffache. Dies ist
ein weiterer Hinweis für die entzündungsbedingte Abnahme der Barrierefunktion der Darmschleimhaut. Die orale Applikation von E. coli Nissle 1917
(EcN) bewirkt eine deutliche Verbesserung der Barrierefunktion, wie man
an der Absenkung der mucosalen Permeabilität erkennen kann, die nach
EcN-Behandlung von DSS-Colitis-Mäusen fast auf den Normalwert zurückgeführt wird [Abb. 36]. EcN verhindert somit die Entstehung eines „Leaky
Gut“-­Phänomens bei den mit DSS behandelten Tieren (Ukena et al., 2007).
Als Konsequenz für die klinische Praxis ergibt sich aus diesen experimentellen Befunden, dass die Fähigkeit von E. coli Nissle 1917 zur Stärkung
und Regeneration der Darmbarrierefunktion einen neuen Wirkmechanismus
darstellt. Dies ist von zentraler Bedeutung für die Wirksamkeit von E. coli
Nissle 1917 bei verschiedenen gastroenterologischen, hepatologischen,
aber auch allergologisch-immunologischen Erkrankungen, die mit „Leaky
Gut“-­Phänomenen einhergehen oder durch eine erhöhte Durchlässigkeit der
Darmschleimhaut initiiert werden.
Immunmodulierende Wirkungen
Nach der Geburt verläuft die Entwicklung des darmassoziierten Immunsystems parallel zur Entwicklung der Darmmikrobiota (Hooper & Gordon, 2001;
Fink et al., 2012). Während der ersten Lebensmonate muss das lokale Immunsystem nicht nur lernen, Infektionserreger zu bekämpfen, sondern muss
auch gegenüber der sich etablierenden Darmmikrobiota Toleranz entwickeln.
Diese immunologische Toleranzentwicklung geht einher mit einer abgeschwächten Synthese proinflammatorischer Chemokine (Fink et al., 2012).
Präklinische Untersuchungen verschiedener wissenschaftlicher Arbeits­
gruppen haben zu der Erkenntnis geführt, dass die biologischen Wirkungen
von E. coli Nissle 1917 (EcN) auf Epithel- und Immunzellen auf der ­molekularen
­Ebene zumindest partiell durch das Ansprechen von sog. Toll-like-­Rezeptoren
(TLR-2, TLR-4, TLR-5) vermittelt wird, die sich als Membran­komplexe auf
der Außenhülle der Zielzellen befinden und als Musterer­kennungsrezeptoren
dienen [Abb. 37]. Die Toll-like-Rezeptoren können Mikro­organismen-typische
Strukturen und Bestandteile erkennen und diese Information ins Zellinnere
weiter­leiten. Die Interaktion zwischen EcN und den verschiedenen Toll-­likeRezeptoren führt in der Zelle zum Anstoßen unterschiedlicher Signalkaskaden, die u. a. die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren im Zellkern nach
sich ­ziehen (Grabig et al., 2006; Schlee et al., 2007; Sturm et al., 2005). Diese
Transkriptions­faktoren aktivieren nun bestimmte Gene, deren Expression die
spezifische Antwort der Zelle auf den Kontakt mit EcN darstellt (­Wehkamp
et al., 2004). Die Epithelzellen, die nach neuesten ­Erkenntnissen als integraler Bestandteil des darmassoziierten Immunsystems anzusehen sind,
da sie wichtige Sensorfunktionen beim Erkennen und U
­ nterscheiden von
pathogenen und apathogenen Mikroorganismen ausüben, verfü­
gen über
Toll-like-Rezeptoren: (TLRs)
mit der Zytoplasmamembran der Epithelzelle assoziierte Rezeptoren (TLR 1 – 11)
zur „Muster-Erkennung“ von verschiedenen für Mikroorganismen charakteristischen
Stukturen und Molekülen
(Lipopeptide, MDP, LPS, Flagellin, bakterielle und virale DNA und RNA, CpG-Motive)
NOD-Rezeptoren: (Nucleotide Oligomerisation Domain)
intrazelluläre Rezeptoren für die Erkennung von Zellwand­bestandteilen
(Peptidoglycanen) gramnegativer (NOD1) und grampositiver (NOD2) Bakterien
Abb. 37 Mustererkennungsrezeptoren (engl. Pattern Recognition Receptors) der Epithelzellen des
Gastrointestinaltrakts erkennen hochspezifisch für Mikroorganismen typische Strukturen und
Moleküle. Mustererkennungsrezeptoren sind als Toll-like-Rezeptoren in der Zellmembran der
Epithelzelle lokalisiert. Als NOD-Rezeptoren befinden sie sich im Zytoplasma der Enterozyten.
54
55
eine ganze Reihe von Mustererkennungsrezeptoren. Neben den membran­
ständigen Toll-like-Rezeptoren haben die Epithelzellen auch ­­intrazellulär
­ rreger
lokalisierte Erkennungsproteine, die in die Zelle eingedrungene E
­
detektieren können und die Epithelzelle ebenfalls zum Ausschütten
­
bestimmter Signalmoleküle (z. ­
B. Interleukin-8, IL-8) veranlassen, die
wieder­
um dem hinter der Darmschleimhaut befindlichen Immunsystem
die Anwesen­
heit von Bakterien, Viren und Pilzen signalisieren. Diese
­intrazellulären Mustererkennungsrezeptoren werden als NOD-Rezeptoren
bezeichnet [Abb. 37].
Bisher sind in der Fachliteratur für die Maus elf Toll-­like-Rezeptoren beschrieben worden, für den Menschen sind neun TLR bekannt. Dabei
haben die e
­inzelnen TLR eine ausgeprägte Ligandenspezifität für die
verschiedensten mikrobiellen Strukturen und Moleküle. So erkennt der
­
TLR-2, z. T. im Zusammen­
wirken mit TLR-1, Peptidoglycan-Strukturen
­grampositiver Bakterien wie auch Lipoproteine der äußeren Zellmembran
gramnegativer Bakterien. TLR-4 ist spezialisiert auf das Erkennen des für
gramnegative Mikro­organismen ­typischen Lipopolysaccharids (LPS), eine
der stärksten in der Natur vorkommenden immunogenen Substanzen.
TLR-5 erkennt das für bewegliche Bakte­rien typische Strukturprotein ­ihres
Geißelapparats, das Flagellin. Alle hier genannten Toll-like-Rezeptoren
sind an der Erkennung von E. coli Nissle 1917 durch die Darmepithel- und
­Immunzellen beteiligt. Durch die Kombination der angesprochenen Muster­
erkennungsrezeptoren sind die Zellen der Darmschleimhaut in der Lage,
zwischen pathogenen und apathogenen Mikroorganismen zu differenzieren [Abb. 38]. Dabei werden verschiedene Signaltransduktionswege in der
Epithelzelle genutzt. Die Mustererkennungsrezeptoren sind maßgeb­
lich
daran beteiligt, dass das Darmimmunsystem eingedrungene pathogene
Erreger effektiv bekämpfen kann und gleichzeitig Toleranz ausübt gegenüber der großen Zahl kommensaler Mikroorganismen im Intestinaltrakt.
Der Darm und die bakterielle intestinale Besiedlung spielen eine Schlüssel­
rolle bei der Entwicklung des Immunsystems. Um die ­intestinale Homöo­
stase ­aufrecht zu erhalten, muss ein austariertes Gleichgewicht zwischen
immunologischer Abwehr zum Schutz vor Infektionen und ­Immuntoleranz
zur ­
Verhinderung von überschießenden oder ­
fehlregulierten Immun­
reaktionen (z. B. Darmentzündungen oder Allergien) aufrecht erhalten
werden (Artis, 2008). Ist der „Dialog“ zwischen Darmbakterien und
­
Darm­epithel gestört, kommt es zu überschießenden Reaktionen mit der
Gefahr der chronischen Entzündung und der Entwicklung von Allergien (Clavel & ­Haller, 2007). Abhängig von dem Auslöser der Immunantwort wird eine s­ pezifische Immun­reaktion angestoßen, vermittelt über
56
Abb. 38 Registrierung und Unterscheidung kommensaler, intrazellulär pathogener und extrazellulär
pathogener Bakterien und Mechanismen zur Erkennung von Mikroorganismen
(nach De Gregorio & Rappuoli, 2004).
Boten­stoffe – die sog. Interleukine. Be­stimmte Interleukine, wie z. B. IL-8,
werden auch von den Darmepithelzellen gebildet und dienen der Kommunikation mit dem dahinterliegenden d
­ armassoziierten Immunsystem.
Der Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF-α) spielt eine zentrale Rolle im
­Entzündungsgeschehen an der Darmschleimhaut. Sein Kontakt mit Epi­
thelzellen bewirkt eine deutlich gesteigerte Sekretion von IL-8, wodurch
das Immunsystem alarmiert wird. Interessanterweise kann ­E. coli ­Nissle
1917 (EcN) die TNF-induzierte IL-8-Sekretion dosis- und zeitabhängig
hemmen [Abb. 39, links]. Für diese Wirkung sind lebende EcN-Zellen notwendig [Abb. 39, rechts]. Abgetötete Bakterien oder die bakterielle DNA
zeigen k
­ einen Anti-TNF-Effekt (Kamada et al., 2008). Der antientzündliche
Effekt von EcN beruht auf der Sekretion eines ­bisher noch unbekannten
löslichen Faktors. Ein direkter Kontakt zwischen EcN und den Epithelzellen
ist für den Anti-TNF-Effekt nicht notwendig.
Für die Interaktion von E. coli Nissle 1917 mit den Darmepithelzellen scheint
auch das Vorhandensein der Kapsel (K5-Antigen) von Bedeutung zu sein
(Hafez et al., 2009; Nzakizwanayo et al., 2015). Dabei erfolgt die Informationsvermittlung über die Toll-like-Rezeptoren TLR-4 und TLR-5, wodurch
bestimmte intrazelluläre Signal­kaskaden aktiviert werden (Hafez et al., 2010).
57
IL-8 Expression
IL-8 Expression
***
1400
2000
1200
1500
1000
800
400
0
N.S.
**
1000
600
200
N.S.
500
1,0
1,08
Kontrolle
EcN
TNF-α
TNF-α
+EcN
0
Kontrolle
EcN
durch Hitze
abgetötete
EcN-Zellen
EcNDNA
Signalmolekül, das für die Infektabwehr von Wichtig­
keit und mit der
­ ytokinproduktion gekoppelt ist. Für die iNOS-Aktivierung ist das Lipopoly­
Z
saccharid (LPS) von EcN von entscheidender Bedeutung, da gereinigtes
EcN-LPS dieselben aktivierenden Effekte zeigt. Die R
­ egulation der Zytokinsynthese wie auch der oben angesprochenen E
­ nzymaktivitäten durch
EcN erfolgt bereits auf der genetischen Ebene, was durch die M
­ essung der
Genexpression von für die Immunregulation wichtigen Boten­stoffen an präund postnatalen Darmzellen der Maus gezeigt werden konnte (Zeuthen et
al., 2010). Desweiteren induzierte EcN ein rasches Abschalten der Gene für
Toll-like-­Rezeptor-4 (TLR-4) und ein Anschalten der Gene für Toll-like-Rezeptor-2 (TLR-2). Die Einwirkung von EcN auf die Genaktivität intestinaler
Epithelzellen (schnelle Aktivierung von Zytokin-Genen und Inaktivierung
von TLR-4-Genen) kann als Induktion der immuno­logischen Toleranz gegenüber gramnegativen Bakterien gedeutet werden.
Abb. 39 E. coli Nissle 1917 (EcN) in lebender Form unterdrückt die TNF-α-induzierte Transkription von IL-8.
Linkes Bild: HCT15-Zellen wurden mit EcN (1x 105 Bakterien/ml) für die Dauer von vier Stunden
vorbehandelt und anschließend mit 20 ng/ml TNF-α stimuliert. Nach 30-minütiger Stimulation
wurde die Expression von IL-8 mRNA mit real-time PCR bestimmt.
Rechtes Bild: HCT15-Zellen wurden entweder mit lebenden EcN-Bakterien (1x 105 Bakterien/ml),
mit durch Hitze abgetöteten EcN-Bakterien (1x 108 Bakterien/ml) oder mit der genomischen DNA
des Stamms (10 μg/ml) für vier Stunden vorbehandelt und anschließend mit 20 ng/ml TNF-α für
30 Minuten stimuliert. Die Expression von IL-8 mRNA wurde mit real-time PCR bestimmt. Die
angegebenen Werte sind dargestellt als relative Expression (gegen β-Aktin mRNA). Angegeben
sind die Mittelwerte (± Standardabweichung) von fünf einzelnen Experimenten. Signifikante
Unterschiede wurden bestimmt durch Vergleich mit den Werten der TNF-α-induzierten IL-8-Sekretion in den nicht mit E. coli behandelten Versuchsansätzen.
N.S., nicht signifikant; **, p < 0,01; ***, p < 0,001 (nach Kamada et al., 2008).
Auf der anderen Seite werden Darmbakterien wie auch in den Gastroin­
testinaltrakt gelangende Probiotika durch das infolge einer Colitis veränderte Milieu beeinflusst. So konnten Forscher des Deutschen Instituts für
Ernährung (DIfE) in Potsdam in einem gnotobiotischen Mausmodell ­zeigen,
dass die Colitis-induzierende Substanz Dextransodiumsulfat (DSS) die Expression bestimmter Proteine verschiedener E. coli-Stämme in unterschiedlicher Weise modulierte (Schumann et al., 2012). In dieser ­Studie zeigte
E. coli Nissle 1917 eine vier- bis achtfach höhere Konzentration bestimmter
Antistressproteine als andere E. coli, außerdem eine vier- bis siebenfach
höhere Produktion des antientzündlich wirkenden Stoff­wechselprodukts
Indol.
Epithelzellen reagieren auf proinflammatorische Signale wie Gastrin, Interleukin-1b oder TNF-α, als Folge einer Aktivierung der induzierbaren
­Cyclooxygenase-2 (COX-2), mit vermehrter Produktion von Prostaglandin
E2 (PGE2). Diese entzündungsfördernde Enzymaktivität wird durch Kontakt
der Epithelzellen mit E. coli Nissle 1917 (EcN) unterbunden, wobei sowohl
die lebenden ­Bakterien als auch bakterienfreie Kulturüberstände wirksam
sind (Otte et al., 2009). Auch Untersuchungen zur Aktivierung des sogenannten Inflammasoms in Darmepithelzellen ergaben, dass EcN im Vergleich zu anderen E. coli nur eine schwache Wirkung auf diesen Entzündungskomplex zeigte (Becker et al., 2014). Der Kontakt von EcN mit in
Kultur gehaltenen Peritonealzellen führt gleichsinnig zu einer Aktivierung
der induzierbaren Stickoxidsynthase (engl. inducible Nitric Oxide ­Synthase,
iNOS) (Zidek et al., 2010). Stickoxid (NO) ist ein gasförmiges endo­genes
In einer Vergleichsstudie zur direkten Wirkung von E. coli Nissle 1917
schiedenen L
(EcN), ver­
­actobacillus- und Bifidobacterium-Stämmen auf
­mononukleäre Zellen aus menschlichem Blut zeigte sich, dass die Wirkung
auf die Synthese der einzel­nen Zytokine stammspezifisch ist (Helwig et al.,
2006). So wiesen v­ erschiedene Bifidobacterium-Stämme unterschiedlich
große Aktivierungen des antientzündlichen Zytokins Interleukin-10 auf.
Im Vergleich zu den getes­teten Lacto­bacillus-Stämmen wurde bei EcN
eine sehr starke Aktivierung der Synthese von IL-10 beobachtet [Abb.
40]. Im Gegensatz dazu zeigten die v­erschiedenen BifidobacteriumStämme gleichzeitig eine starke Aktivierung der Produktion des pro­
inflammatorischen Zytokins TNF-α. EcN, wie auch die verschiedenen
Lactobacillus-Stämme ­
stimulierten demgegenüber die TNF-α-Synthese
nur sehr gering. ­Diese ­Effekte auf die Zytokinfreisetzung wurden durch die
Verwendung von Z
­ elltrümmern ultra­schallbehandelter ­Bakterien erzielt.
58
59
Dies lässt darauf schließen, dass für die beschriebenen immunmodulierenden Aktivitäten der Bakterienstämme strukturgebundene Elemente von
Wichtigkeit sind.
Zellfragmente
Zellfragmente
IL-10 Expression
TNF-α-Sekretion
[pg/ml] Fläche unter der Kurve
[pg/ml] Fläche unter der Kurve
1600
9000
1400
8000
1200
7000
1000
6000
5000
800
4000
600
3000
400
2000
200
1000
0 Bifidobacterium- LactobacillusStämme
Stämme
E. coli
Nissle 1917
0 Bifidobacterium- LactobacillusStämme
Stämme
E. coli
Nissle 1917
Abb. 40 Wirkung von probiotischen Bakterien auf die Synthese entzündungshemmender (IL-10) bzw.
entzündungsfördernder (TNF-α) Zytokine in mononukleären Zellen des menschlichen Blutes.
Zellfragmente von E. coli Nissle 1917 bewirken eine erhöhte Sekretion von IL-10 und eine verminderte Sekretion des Entzündungsverstärkers TNF-α (nach Helwig et al., 2006).
Neben mononukleären Blutzellen werden auch andere immunkompetente Lymphozyten wie dendritische Zellen, Makrophagen und regulatorische
­T-Zellen durch E. coli Nissle 1917 (EcN) beeinflusst (Gad et al., 2011). So
induzierte EcN in einer V
­ergleichsstudie mit Bifidobacterium longum und
­Lactobacillus ­acidophilus ein stammspe­zi­fi­sches Reifungsmuster in primären
dendri­tischen Zellen der Peyer’schen Plaques (Fink & Frokiaer, 2008). Ein weiteres wichtiges Ergebnis dieser Untersuchung ist die Erkenntnis, dass probio­
tische Bakterien bei der Entwicklung des Darm­immunsystems stammspezifische ­Wirkungen haben, die sich von denen unterscheiden, die die Keime bei
direktem Kontakt mit dem systemischen Immunsystem haben würden.
Untersuchungen von Hockertz (1991) an isolierten Makrophagen der
Maus hatten bereits gezeigt, dass E. coli Nissle 1917 (EcN) über deutliche
immunmodulie­ren­de Wirkungen verfügt. So konnte nachgewiesen werden,
dass die Produk­tion von mikrobiziden Sauerstoffradikalen sowie die direkte
Tumorzellabtötung durch EcN signifikant aktiviert wurden (Hockertz, 1991).
60
In-vitro-Versuche mit menschlichen T-Lymphozyten haben gezeigt, dass
EcN in peripheren T-Zellen Zellzyklus und Zellvermehrung hemmt, nicht jedoch in mucosalen T-Zellen (Sturm et al., 2005). Dabei spricht EcN nur die
γ/δ-T-Zellen, nicht jedoch die α/β-T-Zellen an. In den γ/δ-T-Zellen hemmt
EcN die Sekretion von TNF-α und fördert die Synthese von IL-6 und CXCL8
(Guzy et al., 2008). Diese differenzielle Wirkung auf die verschiedenen
T-Zell-Subtypen kann als anti-inflammatorischer Effekt inter­pretiert ­werden
und könnte für die in T
­iermodellen für chronisch entzündliche Darm­
erkrankungen gezeigte Entzündungshemmung mit verantwortlich sein
­(Arribas et al., 2009; Garrido-Mesa et al., 2011; Grabig et al., 2006; Hudcovic
et al., 2007; Kamada et al., 2005; Kokesova et al., 2006; Schultz et al., 2004;
Sha et al., 2014). Die antientzündliche Wirkung von EcN konnte sowohl bei
­chemisch induzierten als auch bei immunologisch provozierten Colitiden
(durch T-Zell-Transfer induzierte Colitis) bei immundefizienten Versuchs­
­ erden. Dabei war die Wirkung bei chronischen
tieren nachgewiesen w
stärker als bei akuten Darm­entzündungen.
Interessanterweise konnte die antientzündliche Wirkung von E. coli ­Nissle
1917 (EcN) nicht nur bei Darmentzündungen sondern auch bei systemischen Entzündungs­reaktionen, die durch die i.v.-Verabreichung von LPS
provoziert wurden, ­nachgewiesen werden (Arribas et al., 2009). Hier wurde
eine ­reduzierte Ausschüttung des proinflammatorischen Zytokins TNF-α
sowohl im Darm von Ratten mit chemisch induzierter Colitis als auch in
­Plasma und Lunge von LPS-behandelten Mäusen festgestellt [Abb. 41].
Dieser systemische Effekt einer oralen Verabreichung von EcN ging desweiteren einher mit einer Hemmung der Produktion von T-Zell-Zytokinen und
einer reduzierten Freisetzung von IgG durch B-Zellen aus der Milz.
Eine veränderte Immunitätslage liegt auch bei Allergien vor, deren
­rasante Zunahme in den letzten Jahrzehnten in den hochindustrialisierten
­Ländern Anlass zur Besorgnis gibt. Allergien sind durch eine proinflamma­
torische T-Helfer-2-Zell(TH2)-dominierte Immunreaktion mit starker Interleukin(IL)-4-Expression gekennzeichnet. Da für E. coli Nissle 1917 (EcN)
sowohl intestinale als auch systemische immunmodulierende Wirkungen
nachgewiesen wurden, untersuchten Rasche und Kollegen (Rasche et al.,
2007) in einer klinischen Vergleichsstudie, ob EcN bei Pollenallergikern eine
Verschiebung der allergischen TH-2-dominierten Immunantwort hin zu einer protektiven TH-1-dominierten Immun­antwort induziert. Dabei w
­ urde an
isolierten T-Lymphozyten festgestellt, dass EcN die anti-­inflammatorische
IFN-γ-Bildung bei allergischen Patienten besonders deutlich erhöht und
sich den zum Vergleich mitgeführten probiotischen Milchsäurebakterien
überlegen zeigte [Abb. 42].
61
In einem Mausmodell für Hausstaubmilbenallergie konnte gezeigt werden,
dass E. coli Nissle 1917 (EcN) über antiallergisches Potential verfügt. Der
anti­allergische Effekt wurde von einer Steigerung der allergenspezifischen
IgG2a-Antwort begleitet (Adam et al, 2010). In einem weiteren Mausmodell verhinderte die orale Verabreichung von EcN dosisabhängig eine Allergen-induzierte Dermatitis (Weise et al., 2011). Weitere In-vitro- und In-vivo-Studien sollen nun den für EcN-spezifischen Wirkmechanismus klären.
Eine klinische Pilotstudie mit Graspollenallergikern bestätigte die gute
V
­ erträglichkeit von E. coli Nissle 1917 (Dölle et al., 2014). Eine s­ ignifikante
Verbesserung der saisonbedingten Pollenallergien wurde allerdings nicht
beobachtet.
% CD69+ T-Lymphozyten (TH1 Response)
40
Allergiker
Nicht-Allergiker
35
30
25
20
15
10
Allergiker
Nicht-Allergiker
5
0
TNF-α
[pg/ml-1]
600
Plasma
Lunge
500
400
300
200
100
IL-2
[pg/ml-1]
4000
3000
150
2000
100
1000
50
0
0
IgG
[pg/ml-1]
100
IL-10
[pg/ml-1]
2000
Plasma
80
Lunge
Milz
IL-5
[pg/ml-1]
200
Allergen = Graspollenextrakt
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus acidophilus + Allergen
E. coli Nissle 1917
E. coli Nissle 1917
+ Allergen
Abb. 42 E. coli Nissle 1917 und L. acidophilus induzieren eine erhöhte Expression des Oberflächen­
markers CD69 auf T-Lymphozyten. Eine erhöhte Expression von CD69 kennzeichnet eine TH1dominierte Immunantwort. Sowohl Allergiker als auch Nicht-Allergiker zeigen unter E. coli Nissle
1917, mit oder ohne Co-Inkubation des Allergens, eine signifikant stärkere TH-1-Zellproliferation
als unter L. acidophilus [nach Rasche et al., 2007).
Milz
1500
60
1000
40
20
500
0
0
Gesunde Mäuse
LPS-induzierte Sepsis
LPS-induzierte Sepsis + E. coli Nissle 1917
Abb. 41 Wirkung von E. coli Nissle 1917 auf pro- und antientzündliche Immunreaktionen bei der LPS-induzierten Sepsis der Maus. Untersucht wurden die Sekretion von TNF-α, der T-Zell-Zytokine
IL-2, IL-5 und IL-10 sowie die IgG-Sekretion der B-Zellen. Die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine in Plasma, Milz und Lunge wurde durch E. coli Nissle 1917 deutlich gehemmt
(nach Arribas et al., 2009).
62
63
Antimutagenität
Comet Score
In randomisierten klinischen Studien hat sich E. coli Nissle 1917 (EcN,
Mutaflor®) bei der Behandlung der Colitis ulcerosa in Remission als ebenso
wirksam wie der Entzündungshemmer Mesalazin (5-Aminosalicylsäure) erwiesen (Schultz, 2008). Retrospektive Fall-Kohorten-Studien haben gezeigt,
dass Mesalazin darüber hinaus antimutagene Wirkungen hat und das bei
­Colitis-ulcerosa-Patienten erhöhte Risiko, an Dickdarmkrebs zu erkranken,
senkt. Es stellte sich daher die Frage, ob E. coli Nissle 1917 (EcN) ebenfalls anti­mutagene Eigenschaften besitzt. Mit Hilfe standardisierter Mutagenitätstests (Ames-Test, Comet-Assay) konnte der Nachweis erbracht
werden, dass EcN, im Gegensatz zu den bekannten mutagenen Testsubstanzen 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO), Benz(a)pyren (BP) und H2O2, kein
mutagenes Potential hat (Sonnenborn et al., 2009) [Abb. 43]. Die Co-Inkubation von EcN mit den ­mutagenen Stoffen führte zu einer dosisabhängigen Ab­nahme der mutagenen Wirkung der Testsubstanzen [Abb. 44]. Die
Ergebnisse belegen, dass EcN anti­mutagene Wirkung gegenüber muta­
genen Substanzen wie NQO, BP und H2O2 aufweist.
Comet Score
300
250
200
150
100
50
0
CaCo-2-Zellen
(Kontrolle)
CaCo-2-Zellen
+ NQO
CaCo-2-Zellen
+ E. coli Nissle 1917
Abb. 43 Vergleich der Mutagenität von E. coli Nissle 1917 gegenüber der mutagenen Substanz 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO) im Comet-Assay. E. coli Nissle 1917 zeigt keine mutagene Wirkung
(nach Sonnenborn et al., 2009).
64
300
250
200
150
100
50
0 NQO Kontrolle
2x 1010
1010
4x 109
2x 109
109
[KBE/ml]
E. coli Nissle 1917 + 4-Nitroquinolin-1-Oxid (NQO)
Abb. 44 Dosisabhängigkeit der antimutagenen Wirkung von E. coli Nissle 1917 gegenüber 4-Nitroquinolin-1-oxid (NQO) im Comet-Assay. Für die antimutagene Wirkung sind lebende Bakterienzellen
notwendig. KBE = Kolonie-bildende Einheiten (nach Sonnenborn et al., 2009).
Fazit: Bereits seit über 100 Jahren ist bekannt, dass nützliche Darmbakterien, die heute als Probiotika bezeichnet werden, in der Lage sind, pathogene Mikroorganismen an der Vermehrung zu hemmen und sie u. U.
sogar abzutöten. Einer der ersten Forscher, der diese Hemmwirkung kommensaler Keime auf Infektionserreger näher untersuchte, war Alfred Nissle.
Bereits 1916 ­publizierte er seine grundlegende Arbeit zur antagonistischen
Wirkung physio­logischer E. coli-Bakterien gegen darmpathogene Salmonellen. Aus diesem Grunde gilt Nissle als „Urvater“ der antimikrobiell wirkenden Bakteriocine, eine Substanzklasse, die erst seit den 30er Jahren
des vergangenen Jahr­hunderts chemisch näher untersucht wurde. Es ist
das Verdienst von Alfred Nissle, die antagonistische Wirkung nützlicher
son­
dere von kommensalen E. coli-Stämmen, erkannt
Darmkeime, insbe­
und als Erster als ­Therapie­option in die Medizin eingeführt zu haben. Erst
in den letzten Jahren hat man erkannt, dass gesundheitsfördernde bzw.
auch therapeutische Wirkungen von Probiotika nicht nur auf den direkten Antagonismus gegen pathogene Keime zurückzuführen sind, sondern
in noch viel größerem Ausmaß durch Kommunikation der probiotischen
Mikroorganismen mit der Darmschleimhaut zustande kommen. Die Beeinflussung von Funktionen der Darmschleim­haut bzw. des darmassoziierten
Immunsystems durch mikro­bielle (probiotische) Signalstoffe wird als „Host
Cell Signaling“ oder auch als „Bacterial-Epithelial Cross Talk“ bezeichnet.
65
Die probiotische Signal­wirkung ist dabei stammspezifisch [Abb. 45] und
kann nicht per Analogieschluss ungeprüft von einem Bakterienstamm
(z. B. E. coli Nissle 1917) auf einen anderen Stamm übertragen werden.
So, wie die therapeutischen Effekte eines jeden Arzneimittels an die Eigenschaften der wirksamen Substanz gebunden sind, bilden die hier keineswegs vollständig dargestellten Eigenschaften von E. coli Nissle 1917 die
Basis für seine vielfältigen Wirkungen und liefern die Erklärung für seine
Wirksamkeit bei verschiedenen Indikationen.
Indikationsspektrum für E. coli Stamm Nissle 1917
(Mutaflor®) und konfirmatorische klinische Studien
Nissle und andere hatten bereits in diversen Erfahrungsberichten ein erstaunlich breites Indikationsspektrum für den Einsatz von E. coli Nissle 1917
(EcN) mitgeteilt. In einer prospektiven Anwendungsbeobachtung zum Einsatz von Mutaflor® bei 3.807 Patienten in 446 Prüfzentren (Krammer et al.,
2006) konnten die verschiedenen Einsatzgebiete bestätigt werden [Abb. 46].
E. coli Nissle 1917
direkte antagonistische Aktivit t
Ho
st cell signaling
¥ Mucin- und Defensin-,
Cathelicidin-, CalprotectinProduktion
¥ Invasionshemmung
(Salmonella, EIEC, AIEC,
Shigella, Yersinia, Listeria,
Candida)
¥ Wachstumshemm
¥ Abt tung pathoge
Bakterien und Pil
¥ Immunmodulation,
z.B. IL-10-Induktion
¥ Anti-entz ndliche Effekte
(Hemmung von IL-5, IL-6,
IFN-γ, TNFα-Wirkung
auf IL-8)
Abb. 46 Haupteinsatzgebiete von Mutaflor® nach einer prospektiven Anwendungsbeobachtung
Darmepithel
(AWB) an 3807 Patienten (nach Krammer et al., 2006).
Abb. 45 Wirkungen und Interaktionen von E. coli Nissle 1917 im Darm und an den Epithelzellen der
Darmschleimhaut (IL = Interleukin, IFN = Interferon, TNF = Tumornekrosefaktor,
EIEC = enteroinvasive E. coli, AIEC = adhärent-invasive E. coli).
66
Nahezu die Hälfte der Patienten (n = 1.746; 47,1 %) wurde wegen protrahierter (n = 339) oder chronisch ­rezidivierender Diarrhöen (n = 728) bzw.
­ iarrhö
eines Reizdarm-Syndroms (n = 679) mit Mutaflor® behandelt. Die D
war bei 209 Patienten nach einer Magen-Darm-Infektion und bei 252 nach
Antibiotika-/Sulfonamid-Behandlung, also nach „klassischen“ Ursachen
­
von Darmmikrobiota-Störungen, aufgetreten. Patienten mit chronisch
entzündlichen Darm­erkrankungen (n = 415), Obstipation (n = 253) und
­Mykosen des Gastrointestinaltraktes (n = 281) folgten in der Häufigkeit der
Indikationsstellung. Weiterhin behandelt wurden Patienten mit Divertiku­
lose, Kollagener Colitis, Neurodermitis, Nahrungsmittelunverträglichkeit
und Infektanfälligkeit, darunter auch Harnwegsinfekte. Die Wirksamkeit
von Mutaflor® über alle Indikationen wurde von 78 % der Patienten und
von 82 % der ­Therapeuten mit gut bis sehr gut bewertet, womit auch die
Erfahrungen von Alfred Nissle bestätigt wurden.
67
¥ St rken
auf die
Permea
¥ Verhind
Leaky-G
gest rte
¥ Verbess
Transpo
Darmze
Unabhängig von dem enormen Erfahrungsschatz, der sich während der
jahrzehntelangen Anwendung des Präparates Mutaflor® angesammelt
hat, ist es eine berechtigte Forderung, die postulierten Wirksamkeiten in
konfirma­to­ri­schen klinischen Studien nachzuweisen. Sie sind heute ein
fester Bestandteil der „Evidence-Based Medicine“ und wurden für das Präparat Mutaflor® indika­tions­bezogen durchgeführt. Einige Beispiele werden
im Folgenden kurz besprochen.
Diarrhö: Die akute infektiöse Diarrhö wird landläufig als eine selbstlimitierende Erkrankung innerhalb der ersten 7 Tage angesehen. Es gibt aber in
der Literatur zu dieser Erkrankung auch Angaben, dass zwischen 12 und
30 % der Patienten in der Folgezeit (bis zu einem Jahr nach der Durchfallepisode) einen Reizdarm oder chronisch rezidivierende Diarrhöen entwickeln können. Auf Grund der Kenntnis präklinischer Untersuchungen,
­ armbarriere
wonach E. coli Nissle 1917 sich an der Stabilisierung der D
beteiligt, wurden Studien zur akuten und zur protrahierten (seit max.
2 Wochen andauernden) Diarrhö durchgeführt. Ein besonderes Interesse
bestand, die klinischen Untersuchungen bei Säuglingen, Kleinkindern und
Kindern vorzunehmen, weil die Folgen von Diarrhöen bei jungen Patienten
gravierend sein können.
113 Patienten (2 – 46 Monate alt) mit akuter Diarrhö erhielten nach Rando­
misierung und im doppelblinden Verfahren je nach Alter täglich 1 x 1 ml
(Säuglinge), 2 x 1 ml (1 – 3 Jahre alt) oder 3 x 1 ml (3 – 4 Jahre alt) Mutaflor®
­Suspension (mit 108 KBE/ml) oder Placebo. Unter Verum reduzierte sich
die Durchfalldauer drastisch auf 2,5 Tage, während für die Placebo-Gruppe
eine mittlere Durchfalldauer von 4,8 Tagen gemessen wurde (p = 0,0007)
[Abb. 47]. Nur 3 (5,5 %) der Verumpatienten, aber 19 (32,8 %) der Placebo­
Patienten litten auch am 10. Tag noch an Diarrhö (Henker et al., 2007).
68
Akute Diarrhö
Zeitgewinn:
2,3 Tage
Mutaflor ® Suspension
p = 0,0007
Placebo
0
1
Behandlungstage
2
3
4
2,5 Tage
5
4,8 Tage
Abb. 47 Mutaflor® Suspension reduziert bei der akuten Diarrhö die Durchfalldauer um 2,3 Tage
(nach Henker et al., 2007).
In einer weiteren, ebenfalls placebokontrollierten, randomisierten
p = 0,0007
pdoppel­
= 0,0001
blinden Studie wurden 151 Patienten (1 – Zeitgewinn:
47 MonateZeitgewinn:
alt) mit protrahierter
2,3 Tage
3,3 Tage
oder der Placebo-Gruppe
zugeordnet. Zu
­Diarrhö entweder der
Verum®
®
Mutaflor
Suspension
Mittlere
Mutaflor
Suspension
Beginn erfolgte
eine
einmalige
orale
Rehydratation.
Die
Studienmedika­
tion
KrankheitsdauerArt und Menge derjenigen, die auch für die Behandlung
entsprach nach
vor Therapie:
der akuten ­Diarrhö verwendet wurde (s.o.). Die mittlere Durchfalldauer vor
Placebo
5,8 Tage
­Therapie­beginn lag fürPlacebo
die Verum- wie für die Placebo-Gruppe bei 5,8 Tagen.
Auch bei dieser konfirmatorischen Studie offenbarte sich die Effektivität
®
einer Mutaflor
-Behandlung.
Ab
Studienbeginn
dauerte der 5Durchfall unter
0
10
12
23
3 4
4
5
®
Mutaflor Behandlungstage
­SuspensionBehandlungstage
2,4 Tage, unter
Placebo
5,7 Tage
(p = 0,0001)
[Abb.
48].
2,5 Tage 2,4 Tage
4,8 Tage
5,7 Tage
Die Erfolgsrate nach 21 Tagen betrug unter Verum 99 % (74/75) und unter
­Placebo 72 % (55/76) (Henker, Laass et al., 2008).
Akute Diarrhö
Aufschluss über Wirksamkeit und Verträglichkeit der Mutaflor®-Therapie in der
Pädiatrie gab ein Patientenkollektiv innerhalb dieser Anwendungsbeobachtung aus 660 Neugeborenen, Säuglingen und Kindern bis 12 Jahre. Die verschiedenen Formen der Diarrhö (n = 298) sowie die chronische Obstipation
(n = 75) waren die meistgenannten Indikationen neben dem Reizdarm-Syndrom,
Mykosen des Verdauungsstrakts, Nahrungsmittelunverträg­
lichkeiten, Antibiotika-assoziierte-/pseudomembranöse Colitis, Neurodermitis und Infektan­
fälligkeit. Die Wirksamkeit der Therapie mit Mutaflor® wurde bei 84 % und die
Verträglichkeit bei 96 % der Kinder als gut bis sehr gut bewertet (Röhrenbach
et al., 2007). Der Therapieerfolg bei den insgesamt 298 Kindern, die wegen
protrahierter bzw. chronisch rezidivierender Diarrhö behandelt wurden, ­konnte
durch zwei doppelblinde, randomisierte und placebokontrollierte Studien mit
Mutaflor® bestätigt werden (Henker et al., 2007; Henker, Laass et al., 2008).
Mittlere
Krankheitsdauer
vor Therapie:
5,8 Tage
p = 0,0001
Zeitgewinn:
3,3 Tage
Mutaflor ® Suspension
Placebo
2,5 Tage
0
1
Behandlungstage
2
3
2,4 Tage
4,8 Tage
4
5
5,7 Tage
Abb. 48 Mutaflor® Suspension reduziert bei der protrahierten Diarrhö die Durchfalldauer um 3,3 Tage
(nach Henker, Laass et al., 2008).
69
Fazit: Die enorme Verkürzung der Durchfallzeit um 2,3 bzw. 3,3 Tage sowie die
hohe Ansprechrate in beiden Studien beweisen die Wirksamkeit von Mutaflor®
bei akuter und protrahierter Diarrhö und belegen einen hohen E
­ videnzgrad.
Chronisch entzündliche Darmerkrankungen: In Deutschland leiden ca.
300.000 Menschen an chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED),
etwa zu gleichen Teilen an Colitis ulcerosa und Morbus Crohn. Die Ursachen für diese Erkrankungen sind nach wie vor unklar, obwohl sicher
ist, dass es sich um einen wie auch immer gearteten Barrieredefekt der
Darmschleimhaut handelt. Viele Gründe werden diskutiert und experimentell verfolgt. Im letzten Jahrzehnt des vergangenen Jahrhunderts sind zellvermittelte Reaktionen des Immunsystems und der Einfluss der gebildeten
Botenstoffe eingehend untersucht worden, was zu einem enormen, kaum
noch zu überschauenden ­Wissenszuwachs über die komplexen Zusammenhänge bei der Entstehung der CED führte. Bei der Fokussierung auf
die Erhaltung oder Reparatur der Darmbarriere sind vornehmlich drei Komplexe in den Mittelpunkt der Betrachtungen gerückt:
1. die Darmmikrobiota, die sich zwar an der Aufrechterhaltung der Darm­
barriere beteiligt, aber in diversen Tiermodellen für CED auch
proinflamma­torische Effekte zeigt,
2. genetische Defekte, die zur Beeinträchtigung der Barrierefunktion der
Darmschleimhaut führen können (z. B. NOD-2-Polymorphismen),
3. der Mangel an die Barriere erhaltenden Bestandteilen/Substanzen
(z. B. Defensine, Cathelicidine, Mucine) und deren Induktions- oder
Substitutions­möglichkeiten.
Vor diesem Hintergrund ist der Einsatz von Probiotika zur Therapie von
­chronisch entzündlichen Darmerkrankungen eine logische Konsequenz, vor
allem dann, wenn wie im Falle von E. coli Nissle 1917 (EcN) Wirkmechanismen bekannt sind, die helfen, die Barriere zu stabilisieren. Für Mutaflor® liegen
­heute 3 g
­ roße doppelblinde klinische Vergleichsstudien und eine Vergleichs­ olitis ulcerostudie mit ­jugendlichen Patienten zur Remissionserhaltung der C
sa vor. In diesen Studien hat sich E. coli Nissle 1917 als gleichwertig zur Therapie mit Mesalazin erwiesen (Do et al., 2010; Sang et al., 2010; Schultz, 2008).
Die erste an 103 Patienten über einen Zeitraum von 3 Monaten durch­geführte
Doppelblind-Studie brachte die Erkenntnis, dass Mutaflor® (1 x 2 Kapseln
täglich), gemessen am Verlauf des klinischen Aktivitätsindex, die gleiche
Wirksamkeit bei der Aufrechterhaltung der Remission hat wie die Standardmedikation mit dem Entzündungshemmer Mesalazin ­(5-Amino­salicylsäure,
1,5 g täglich). Auch die Rezidivraten waren nicht unterschiedlich, was
jedoch bei der relativen kurzen Beobachtungszeit zu erwarten war (Kruis
et al., 1997).
70
In einer zweiten in Großbritannien durchgeführten ebenfalls ­doppelblinden
­ olitis
randomisierten Vergleichsstudie wurden Patienten mit einer aktiven C
ulcerosa (n = 116) eingeschlossen. Für die vergleichende Beobachtung über
ein Jahr wurden aber nur die Patienten einbezogen, bei denen unter der
Standardmedikation mit Prednisolon zuzüglich einer initialen e
­ inwöchigen
Gentamicinbehandlung eine Remission erreicht w
­ orden war. Entsprechend
britischer Standards wurde die tägliche Gabe von 3 x 400 mg Mesalazin mit
1 x 2 Kapseln Mutaflor® verglichen. Im Verlauf der Beobachtungszeit von
1 Jahr erlitten in der Mesalazingruppe 32/44 Patienten (73 %) und in der
Mutaflor®-Gruppe 26/39 (67 %) ein Rezidiv. Zwischen den beiden Behandlungsarmen war kein signifikanter Unterschied festzustellen, was sich auch
anhand des Krankheitsverlaufs (Kaplan-Meier-Analysen) belegen lässt
(Rembacken et al., 1999). Die in dieser Studie sehr eng gefasste Definition
eines akuten Schubs erklärt die hier beobachtete relativ hohe Rezidivrate.
In der dritten großen klinischen Studie, die in zehn europäischen L
­ ändern
durchgeführt wurde, konnten 327 Patienten mit Colitis ulcerosa in der
Remission in die Studie aufgenommen werden und erhielten entweder
­
1,5 g Mesalazin oder 1 x 2 Kapseln Mutaflor® täglich für die Dauer von 1 Jahr.
222 Patienten (112 Patienten mit Mesalazin, 110 Patienten mit Mutaflor®)
schlossen die Studie protokollgerecht ab. In der ­Mesalazingruppe erlitten
38/112 Patienten (33,9 %) und in der Mutaflor®-Gruppe 40/110 Patienten
(36,4 %) ein Rezidiv [Abb. 49]. Die Äquivalenz zwischen beiden Medikamenten konnte mit der großen Wahrscheinlichkeit von p = 0,003 statistisch
gesichert werden, mithin sind beide Präparate gleich wirksam (Kruis, Fri č
et al., 2004).
Rezidivrate innerhalb eines Jahres
Per-Protokoll-Analyse (N = 222)
100%
80%
60%
Äquivalenz signifikant
mit p = 0,003
36,4 %
33,9 %
40%
20%
0%
Mutaflor®
Mesalazin
Abb. 49
Multizentrische randomisierte Doppelblindstudie
Mutaflor® vs. Mesalazin zur Remissions­erhaltung
bei Colitis ulcerosa. Rezidivrate innerhalb eines
Jahres anhand der Per-Protokoll-Analyse von
222 Patienten (nach Kruis, Frič et al., 2004).
71
In einer weiteren klinischen Colitis-ulcerosa-Studie über 1 Jahr Beobachtungszeit, die mit 36 Kindern und Jugendlichen im Alter zwischen 11 und
18 Jahren durchgeführt wurde, zeigte sich ebenfalls die gleiche Wirksamkeit von Mesalazin und Mutaflor® bei der Remissionserhaltung. Hier erlitten
6/24 ­Patienten (25 %) der Mutaflor®-Gruppe und 3/10 (30 %) der Mesalazin-Gruppe ein Rezidiv innerhalb eines Jahres (Henker, Müller et al., 2008).
Die bisherigen erfolgreichen Anwendungen von Mutaflor® bei der Behandlung von Patienten mit Colitis ulcerosa in der Remissionsphase wurden
mit der oralen Verabreichung magensaftresistenter Kapseln erzielt. Durch
diese D
­
­ arreichungsform ist es gewährleistet, dass der Wirkstoff E. coli
­Nissle 1917 unbeschadet seinen Wirkort, den Dickdarm, erreicht. Eine
­weitere klinische Studie zeigte, dass Patienten mit akuter distaler Colitis
auch durch die r­ ektale Anwendung von Mutaflor® Suspension, verabreicht
als Klysma, in Remission gebracht werden können (Matthes et al., 2010).
In der placebokontrollierten, doppelblinden Studie an 90 Patienten mit
leicht bis mittel­gradig aktiver d
­ istaler Colitis ulcerosa wurden 10, 20 und
40 ml Klysmen mit 108 KBE/ml E. coli Nissle 1917 oder Placebo einmal
täglich über mindestens 4 Wochen verabreicht. In der Mutaflor®-Gruppe
zeigte sich eine deutliche Dosis­abhängigkeit bei der Einleitung der Remission. Die Remission erreichten in der Placebo-Gruppe 2/11 Patienten,
in der Mutaflor®-Gruppe mit 10 ml 3/11, mit 20 ml 8/18 und mit 40 ml
9/17 ­Patienten [Abb. 50]. Damit ist Mutaflor® eine gut verträgliche Alter­
native zum topischen Einsatz von Aminosalizylaten oder Glukokortikoiden.
Remissionsrate in Abhängigkeit von der Dosierung
60%
50%
Rangfolgentest
p = 0,0446
52,9%
44,4%
40%
27,3%
30%
20%
18,2%
10%
0%
Placebo
10 ml
20 ml
40 ml
Mutaflor®-Klysmen
Abb. 50 Dosisabhängige Remissionsrate beim Einsatz von Mutaflor®-Klysmen bei leichten bis
­mittelschweren Schüben einer distalen Colitis ulcerosa (Per-Protokollanalyse n = 57)
(nach Matthes et al., 2010).
72
In einer Kurzzeitstudie (7 Wochen) wurde untersucht, ob E. coli Nissle 1917
oder Ciprofloxacin bzw. Kombinationen beider Wirkstoffe, Colitis ulcerosa
Patienten aus einem akuten Entzündungsschub in die Remissionsphase
führen konnten (Petersen et al., 2014). E. coli Nissle 1917 war in dieser
Zeitspanne nicht in der Lage, Patienten in die Remission zu bringen.
In einer doppelblind angelegten Pilotstudie zur Erhaltung der R
­ emission
bei 28 Morbus-Crohn-Patienten durch Mutaflor® wurden Patienten mit
ausschließ­lichem Dickdarmbefall und einem Crohns Disease Activity Index
(CDAI) von > 150 randomisiert auf zwei Gruppen verteilt. 16 Patienten erhielten Prednisolon plus Mutaflor®, 12 Patienten Prednisolon plus Placebo für
die Dauer von 1 Jahr. In der Mutaflor®-Gruppe erlitten in dieser Zeit 33,3 %
und in der ­Placebo-Gruppe 63,6 % der Patienten ein Rezidiv. Darüber hinaus wurde in der Verumgruppe ein Prednisolon-Einspareffekt beobachtet
(Malchow, 1997). Dieser mit einer kleinen Zahl von Patienten erhaltene Hinweis auf eine mögliche remissionserhaltende Wirksamkeit bei Morbus Crohn
konnte bisher nicht in konfirmatorischen klinischen Studien bestätigt werden.
Fazit: Mutaflor® ist bei Patienten mit Colitis ulcerosa zur Aufrechterhaltung der Remission gleich gut wirksam wie Mesalazin und zudem neben­
wirkungs­arm. E. coli Nissle 1917 wurde in nationalen Leitlinien (Dignass et
al., 2011; Fuchssteiner et al., 2014) sowie in der europäischen ECCO-Leitlinie (Travis et al., 2008) als probio­tischer Wirkstoff zur Remissionserhaltung
der Colitis ulcerosa an­erkannt. Wie zu erwarten war, ist E. coli Nissle 1917
zur Behandlung eines akuten Schubes eher nicht geeignet (Petersen et al.,
2014).
Obstipation: Die chronische Obstipation ist wie die chronische Diarrhö sehr
stark mit dem Reizdarm v­erwoben. Die Ergebnisse weniger kon­
trollierter
­Studien weisen darauf hin, dass bestimmte probiotische Arznei­mittel Symptome einer chronischen Obstipation lindern oder dauerhaft be­heben können
(Chmielewska & Szajewska, 2010). In welchem Ausmaß Mutaflor® hier einzugreifen vermag, war Gegenstand kontrollierter klinischer Studien.
In einer vergleichenden randomisierten Untersuchung (Mutaflor®, täglich 3 x
1 Kapsel vs. Laktulose, 2 x 15 ml) an 108 ambulanten Patienten mit chronischer
Obstipation, die seit mindestens einem Jahr vorliegen musste, erhöhte sich
die wöchentliche Stuhlzahl in beiden Gruppen nach insgesamt 14-wöchiger
Behandlung. Hierbei war die Steigerung der wöchentlichen ­Stuhlfrequenz
(Mutaflor® 6,3 vs. Laktulose 5,5) signifikant unterschiedlich (p < 0,026) zugunsten des E. coli-Präparats (Bruckschen & Horosiewicz, 1994). Unerwünschte Arzneimittelwirkungen (vor allem Blähungen) traten unter der Laktulose-Behandlung dreimal häufiger auf als unter der Mutaflor®-Behandlung.
73
In einer zweiten randomisierten klinischen Studie wurde Mutaflor® gegen
ein Placebo getestet bei Patienten, die ebenfalls seit mindestens 1 Jahr
obstipiert waren. Der eigentlichen Studie wurde eine einwöchige Periode
(„Run-in-Phase“) vorangestellt, bei der alle Patienten ein Placebo bekamen.
Von ursprünglich 134 Patienten konnten danach 64 nicht in die Therapie­
studie aufgenommen werden, weil sich ihr Problem bereits mit der Placebo-Gabe lösen ließ. Anschließend wurden die verbliebenen 70 Patienten
(wöchentliche Stuhlzahl ≤ 2) randomisiert in einem doppelblinden D
­ esign
der Verum- oder der Placebo-Gruppe zugeordnet. Zu Beginn erhielten
die ­Patienten zum Abführen einmalig 10 mg Bisacodyl, um vergleichbare Ausgangs­verhältnisse zu schaffen, danach zuerst 3 x 2 Mutaflor®- oder
Placebo-Kapseln täglich und ab dem 3. Tag 1 x 4 Kapseln für den Rest
der Studiendauer. Nach 4 Wochen hatten die Patienten der V
­ erumgruppe
eine wöchentliche Stuhlzahl von 4,9. Nach weiteren 4 Wochen erhöhte sich
bei den Patienten der Verumgruppe die wöchentliche Stuhlzahl auf 6,0
[Abb. 51]. In der Placebo-Gruppe zeigte sich nach 4 Wochen ein leichter
Anstieg der Stuhlfrequenz, der aber nach 8 Wochen wieder zurückging auf < 2
Stühle/Woche. Beim Wechsel der Studien­medika­tion nach 4-wöchiger Behandlung waren es bei den zuvor mit Verum behandel­ten Patienten insgesamt nur zwei, die auf Mutaflor® nicht mit einer signifikanten Steigerung der
wöchentlichen Stuhlzahl reagiert hatten, und die nach weiteren 4 ­Wochen
unter Placebo ebenfalls keine Besserung zeigten. Dagegen verbesserte sich die wöchentliche Stuhlzahl bei 13 Patienten, die wegen Unwirksamkeit der Placebo-Behandlung in die Verumgruppe wechselten, in den
­folgenden 4 Wochen auf 5,2 pro Woche (Möllenbrink & Bruckschen, 1994).
Stuhlfrequenz / Woche
10
8
Placebo
Mutaflor¤
p < 0,001
6
p < 0,001
4
2
0
0
4
8
Wochen
Abb. 51 E insatz von Mutaflor® bei chronisch obstipierten Patienten. Randomisierte Doppelblindstudie
Mutaflor® vs. Placebo über 8 Wochen. Mutaflor® führt zu einer signifikanten Erhöhung der
wöchent­lichen Stuhl­frequenz (nach Möllenbrink & Bruckschen, 1994).
74
Die Wirksamkeit von Mutaflor® bei der chronischen O
­ bstipation scheint auf der
Fähigkeit von E. coli Nissle 1917 zu beruhen, in erhöhtem Maße Essig­säure zu
bilden. Die Essigsäure hat einen stimulierenden Effekt auf die Darmmotilität,
indem sie die Ringmuskulatur des Dickdarms direkt anregt (Bär et al., 2009).
Auswirkungen der Mutaflor®-Gabe auf die intestinale Gasbildung konnten
in einer ­doppelblinden randomisierten Studie mit 30 gesunden F
­ reiwilligen
dagegen nicht festgestellt werden. Die tägliche Verabreichung von 2 x
1 Kapsel Mutaflor® zeigte keine signifikante Wirkung auf die intestinale Gasdynamik (Hernando-Harder et al., 2008).
Fazit: Die Gabe von Mutaflor® steigert bei langfristig obstipierten Personen
die wöchentliche Stuhlzahl auf die physiologischen Normalwerte. Dies ist
von besonderer Be­deutung für Patienten mit Laxantienabhängigkeit sowie
für Schwangere und Stillende.
Kolonisationsprophylaxe bei Neugeborenen: Bereits Escherich hatte
sich über die „Constanz der im Säuglingsdarm gefundenen Arten“ ­Gedanken
gemacht und „eine auffällige Reinheit in Bezug auf die bakteriologischen
Verhältnisse und ein merkwürdiges Bestreben ... dieselbe ungetrübt zu
erhalten“ bemerkt. 30 Jahre später berichtete Nissle über den Coli-­
Antagonismus, den Escherich vielleicht ahnen, aber noch nicht erkennen
konnte, als ein Wirk­
mecha­
nis­­
mus zur Stabilisierung mikroökologischer
­Verhältnisse im Intes­tinal­trakt.
Weitere 80 Jahre später wurde in kontrollierten klinischen S
­ tudien an Neu­
geborenen nachgewiesen, dass bereits eine kurzzeitige tägliche orale
Gabe von 1 ml Mutaflor® Suspension mit 108 KBE/ml während der ­ersten
fünf ­
Lebenstage im Vergleich zu einer nichtbehandelten Kontrollgruppe
(Schröder, 1992) bzw. zu Placebo (Lodinová-Žádníková & Sonnenborn,
­
1997) eine deutliche Reduzierung der Ansiedlung pathogener und potenziell
pathogener Keime im Säuglingsdarm bewirkt [Abb. 52 + 53]. Das „Zufalls­
produkt Darmmikrobiota“ kann so in physiologische Bahnen gelenkt werden.
Grampositive Isolate
Gramnegative Isolate
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus aureus
Staphylococcus haemolyticus
Streptococcus agalactiae
andere hämolysierende
Streptokokken
Acinetobacter spp.
Citrobacter freundii
Enterobacter cloacae
und andere
Escherichia coli,
hämolysierend
Klebsiella pneumoniae,
diverse Subspezies
Kluyvera ascorbata
Proteus mirabilis
Providencia
alcalifaciens
Serratia liquefaciens
Yersinia enterocolitica
Abb. 52 Pathogene und potenziell pathogene Keime im Neugeborenendarm (nach Lodinová-Žádníková &
Sonnenborn, 1997; Sonnenborn et al., 1990; Schröder, 1992).
75
Prozent der Kinder mit pathogenen Keimen
Neben dem kolonisationsprophylaktischen Effekt der gezielten Besiedlung
des Säuglingsdarms mit E. coli Nissle 1917 hat die Verabreichung dieses
probiotischen E. coli-Stamms einen deutlichen stimulierenden Einfluss
auf die Entwicklung des lokalen Darmimmunsystems und die Antikörper­
bildung im Blutserum (Lodinová-Žádníková et al., 1992). Die Verabreichung
von Mutaflor® ­Suspension führte bei 34 Frühchen in einer verblindeten,
randomisierten, p
­ lacebokontrollierten klinischen Studie im Vergleich zur
Kontrolle zu einem signifikanten Anstieg der Proliferation von Blutlymphozyten bei Ex-vivo-Kontakt mit bakte­riellen Bestandteilen von E. coli Nissle
1917 wie auch einem anderen nichtverwandten E. coli-Stamm (Cukrowska
et al., 2002). Im Blut der mit E. coli Nissle 1917 kolonisierten Frühchen wurden im Vergleich zur Kontrolle sowohl signifikant höhere IgA-Anti­körper­
spiegel festgestellt, die gegen den oral verabreichten E. coli-Stamm gerichtet waren, als auch eine starke Erhöhung des Spiegels an unspezi­fischen
polyklonalen IgM-Antikörpern. L
­ etzteres zeigt, dass die Darmbesiedlung
mit E. coli Nissle 1917 neben der ­Stimulierung spezifischer zellulärer wie
humoraler Immun­ant­worten gleich­zeitig zu einer Aktivierung der unspezifischen natürlichen ­Immunität führt.
100
80
Fazit: Eine Reihe von klinischen Studien mit Mutaflor® Suspension zur gezielten Kolonisierung des Darms bei frühgeborenen und ausgetragenen
Kindern hat gezeigt, dass die Gefahr einer frühen Besiedlung des Gastro­
intestinaltrakts mit pathogenen und potenziell pathogenen Keimen durch
die Gabe von E. coli Nissle 1917 deutlich reduziert wird. Dies ist von besonderer Bedeutung, da Neugeborene in den ersten Lebenswochen nur
unvollständig geschützt sind gegen Fehlbesiedlungen und nosokomiale
Infektionen, z. B. mit multiresistenten Hospitalkeimen.
Weitere Indikationen: Es liegen publizierte Daten von P
­ ilotuntersuchungen
und Kasuistiken vor, die das eingangs erwähnte breite Anwendungsspektrum von Mutaflor® untermauern [Abb. 54].
Weitere intestinale und extraintestinale Indikationen
lt. klinischen Studien
lt. Erfahrungsberichten/Kasuistiken
– Morbus Crohn
– Non-Ulcer-Dyspepsie / Reizmagen
– Pouchitis
– Nahrungsmittelunverträglichkeiten /
Malabsorptionen
– Kollagene Colitis
kolonisierte Kinder
placebobehandelte Kinder
60
– Antibiotika-assoziierte Colitis/
pseudomembranöse Colitis
– Halitosis
– Reizdarm-Syndrom
– Mykosen des Orogastrointestinal-Trakts
– Divertikulose
– Andere: z. B.
Neurodermitis, reaktive Arthritis, Strahlen­
enteritis, Harnwegsinfekte, ... – Leberzirrhose
40
– Polymorphe Lichtdermatosen
20
0
1. Tag
2. Tag
3. Tag
5. Tag
21. Tag
6. Monat
Studiendauer
– Infektanfälligkeit
Abb. 54 Weitere Indikationen für Mutaflor® (nach Goerg, 2001, 2008; Goerg & Schlörer, 1998;
Frič & Zavoral, 2003; Henker et al., 2001; Kruis, Chrubasik et al., 2004; Lata et al., 2007;
Plassmann & Schulte-Witte, 2007; Tromm et al., 2004; Wurzel, 1999)
Abb. 53 Randomisierte Doppelblindstudie zur gezielten Kolonisierung des Darms neugeborener Kinder
mit E. coli Nissle 1917. Die Verabreichung von Mutaflor® bewirkt eine signifikante Kolonisations­
prophylaxe gegenüber der Ansiedlung pathogener und potenziell pathogener Mikroorganismen
(nach Lodinová-Žádníková & Sonnenborn, 1997).
76
77
Ausblick
Seit seiner Entdeckung 1885 hat Escherichia coli wie kein anderes Bakterium die Aufmerksamkeit der Mediziner, B
­ akteriologen und Infektiologen, aber auch die der Biochemiker, Molekularbiologen und Genetiker auf
sich gelenkt. Grundlegende Erkenntnisse, beispielsweise zur Genetik, zur
Stoffwechsel­regulation, zum Gentransfer, zur Antibiotika-Resistenz sowie
zu den molekularbiologischen Prinzipien der Pathogenese von Infektions­
erkrankungen, sind an diesem außergewöhnlichen Mikroorganismus, der
in der Natur in ­vielen tausend Varianten vorkommt, erforscht worden. Die
mikro­ökologische Bedeutung von E. coli im Gastrointestinaltrakt – erstmals beschrieben von Escherich (1885) – wurde durch Nissles Entdeckung des C
­ oli-Antagonismus untermauert (Nissle, 1916) und findet seitdem erfolgreich thera­peutische Anwendung durch Verwendung von E. coli
­Nissle 1917 (EcN) als Wirkstoff des Präparats Mutaflor®. Als Isolat aus der
­Darmmikrobiota ­(„E. coli-Wildtyp“) besitzt der EcN-Stamm ­Eigenschaften,
vor allem hinsichtlich seiner Apathogenität, kombiniert mit Fitness und
Kolonisa­
­ahren für Genetiker und
tions­
fähigkeit, die ihn in den letzten J
Molekular­biologen, Infektionsbiologen, Mediziner und andere Forscher zu
einem weiteren „beliebten Versuchstier“ unter den Coli-Bakterien gemacht
haben. So wird dieser besondere E. coli-Stamm in der wissenschaft­
lichen Grundlagen­
for­
schung gern als Referenzstamm für die verschiedensten Untersuchungen und als Modellorganismus für die Unter­suchung
des „Cross Talk“ zwischen den Darmbakterien und den Epithelzellen des
­ enutzt (Altenhoefer et al., 2004; Brader et al., 2008; Hafez et al.,
­Wirtes g
2012; Mundy et al., 2006; Schierack et al., 2011; Stritzker et al., 2007).
Die moderne molekulare Gentechnik erlaubt die schnelle und gezielte Beeinflussung der genetischen Ausstattung von Bakterien. Damit könnten
maßgeschneiderte Bakterienstämme, z. B. gentechnisch veränderte E. coli,
mögliche neue therapeutische Ansätze für die Behandlung einer Reihe von
Erkrankungen darstellen, wie etwa chronisch entzündliche Darmerkrankungen, bakteriell verursachte Durchfallerkrankungen oder Darmfunktionsstörungen. Weiterhin gibt es erste Versuche zur Prävention von HIV-Infektionen durch genetisch modifizierte Coli-Bakterien.
E. coli Nissle 1917 ist prinzipiell in der Lage, den Darm zu besiedeln, besitzt
keine Virulenzfaktoren und ist apathogen. Der Stamm könnte so als „Transportvehikel“ für die Synthese rekombinanter Therapeutika im Darm ver­
wendet werden (Buddenborg et al., 2008; Duan et al., 2008; Duan & March,
2008; Loessner et al., 2009; Remer et al., 2009 ; Whelan et al., 2014).
78
Möglich wäre eine gezielte therapeutische Beeinflussung des bei den
­ hronisch entzündlichen Darm­­­erkrankungen gestörten mucosalen Immun­
c
systems durch den Einsatz von E. coli Nissle 1917 als rekombinanter
­Träger für immunmodula­torische Moleküle, wie anti-inflamma­torische Zytokine oder antimikrobiell wirkende Defensine (Seo et al., 2012). Neben
einer lokalen Immunmodulation durch gezielte ­
Wirkstofffreisetzung im
Darm ließe sich möglicherweise auch eine systemische Beeinflussung von
Autoimmun­erkrankungen erzielen.
Eine mögliche Prävention von HIV-Infektionen könnte der Schutz der
Schleimhäute von Darm und Vagina, den häufigsten Übertragungswegen
für AIDS-Viren, mit Hilfe antiviraler Medikamente sein. Eine ­amerikanische
Forschergruppe an den National Institutes of Health in Bethesda hat
­untersucht, ob E. coli Nissle 1917 als Vehikel für antiviral wirksame Peptide
(fusionshemmende Wirkstoffe) verwendet werden kann (Rao et al., 2005).
Die Fusionshemmer lagern sich an einer für das Eindringen des Erregers in
den menschlichen ­Körper wichtigen Stelle auf der Oberfläche von HIV an
und blockieren das Eindringen des Virus in die Wirtszelle. In-vitro-Versuche
mit Fusionshemmern an mononukleären Blutzellen zeigten, dass die Hemmung einer HIV-Infektion konzentrationsabhängig erfolgte. E
­rste Tier­
versuche an Mäusen ergaben eine erfolgreiche Kolonisation unterer Darm­
abschnitte und in geringen Konzentrationen auch der Vagina [Abb. 55].
Durch eine stabile Besiedlung der Schleimhäute mit einem so genmodifizierten E. coli Nissle 1917 könnte in der Zukunft ein längerfristiger Schutz
vor AIDS erreicht werden.
Auf der Basis eines E. coli-Trägersystems wird auch an der Entwicklung und
Herstellung von rekombinanten Lebendimpfstoffen gearbeitet (­Paton et al.,
2005; Rosenthal et al., 2014). Im Gegensatz zu den klassischen Lebend­
impfstoffen ­
(Lebendvakzine), die auf abgeschwächten Erregern beruhen,
müssen ­Keime des E. coli ­Stamms Nissle 1917 nicht erst attenuiert (infek­
tionsmäßig abgeschwächt) werden, da sie keine Virulenzfaktoren besitzen und
apathogen sind. Ziel ist es, lebende, apathogene, genetisch modifizierte Darmbakterien zur mucosalen Immunisierung als mögliches Trägersystem für oral
applizierbare heterologe Antigene zu nutzen. Eine mucosale ­Immunisierung
würde zu einer Aktivierung des Immunsystems der Schleimhäute führen und
somit Schutz vor Pathogenen, wie z. B. Durchfallerregern (EHEC, ETEC) oder
den Erregern der Legionärs­krankheit und Chlamydien bieten.
Mit Hilfe gentechnischer Verfahren lassen sich EcN-Zellen schonend
„entkernen“ (Langemann et al., 2010). Diese von allen intrazellulären
Komponenten (DNA, RNA, Protein u.s.w.) befreiten Bakterienhüllen, sog.
79
„­ bacterial ghosts“, können in vielfältiger Art und Weise verwendet werden
(Langemann et al., 2010), so z.B. als Trägersystem von Wirksubstanzen für
ophthalmologische Erkrankungen (Stein et al., 2013).
Colon
Anus
Duodenum
Ileum
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Rectum
Magen
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Duodenum
Jejunum
Ileum
Caecum
Colon
Rectum
Vagina
Abb. 55 Nachweis eines rekombinanten Derivats von E. coli Nissle 1917 (EcN) in verschiedenen Darmabschnitten bei Mäusen nach oraler (grüne Balken) bzw. rektaler Verabreichung (gelbe Balken) von
5 x 108 lebenden Zellen. Der EcN-Stamm wurde so modifiziert, dass er ein antiviral wirkendes
Anti-HIV-Peptid sezernierte. Dies führte im Mausmodell zum Schutz vor einer Infektion mit
einem HIV-verwandten, mäusepathogenen Virus (Rao et al., 2005).
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Fazit:
Escherichs Wunsch „Mögen die hier gewonnenen Anschauungen nicht
ohne Nutzen und praktische Verwerthung bleiben …“ ist in Erfüllung ge­
gan­gen, wie die Ausführungen im vorliegenden Text aufzeigen konnten. Die
von Escherich bereits bei der Entdeckung des Bakteriums gestellte Frage
nach dem „inneren Zusammenhang, … nach der ­Constanz in dem Vorkommen gewisser Arten und wodurch dieselbe bedingt ist“, ist auch heute noch
nicht vollständig beantwortet und bedarf weiterer intensiver Forschungen.
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Sachverzeichnis
Acinetobacter75
Adhäsine
– pathogene
12, 32
20 - 23
Allergien
– Graspollen
– Hausstaubmilben
61- 63
61- 63
62
Antagonismus
– bakterieller
– Anti-Invasionseffekt /
Anti-Invasionswirkung
– Test
Antigene
– bakterielle
– luminale
– Nahrungsantigene
25 - 28, 75 - 77
38 - 43
25
12, 33
47, 48
47, 53
Arthritis77
Arzneimittel
– mikrobielle
– probiotische
– rekombinante
27, 30 - 32, 78 - 80
31
15 - 16, 78 - 80
B
Bacterial Ghosts
79 - 80
7 - 10, 19
Bacteroides
17, 18
Bakteriophagen
23, 24
Bakteriocine
Bifidobacterium
17, 18
Biofilm
– Bildung
33, 35 - 37, 39
C
Calprotectin
44, 46, 66
Campylobacter9
Candida albicans
Antibiotika
29, 30
–N
ebenwirkungen
29
– – Allergien
–F
olgen
– – Antibiotika-assoziierte Colitis / 67, 68, 77
pseudomembranöse Colitis
– Resistenzen
29 - 30
Bacterium coli commune
94
Bifidobakterien
A
34, 35, 65
17, 41, 59 - 60
18, 28, 66
Cathelicidine
CED
44, 46, 66, 70
s. Darmerkrankungen,
chronisch entzündliche
Chromosoms. Escherichia coli,
Chromosom
Citrobacter
11, 75
Clostridien18
Colitis
– akute
– – Therapie
72
– Antibiotika-assoziierte /
68, 77
pseudomembranöse
– DSS-induzierte
52 - 54, 59
– durch T-Zell-Transfer induzierte
61
21, 24
– hämorrhagische
– kollagene
67, 77
Colitis ulcerosa
– Pathogenese
– Therapie
Colon
– mikrobielle Besiedlung
Cross Talk Cyclooxygenase-2 (COX-2)
44 - 46, 47, 70
43, 64, 70 - 73
17 - 18
34, 38, 43, 65, 66
58
D
Darm
– Darmschleim
33, 35 - 37, 44
– Immunsystem 31, 44 - 46, 47, 55 - 63, 76
95
– Keimspektrum
18
– mikrobielle Besiedlung 7 - 10, 17 - 18,
34 - 37, 56 - 57, 75 - 77
– Milieu
17
– Neugeborene 7 - 10, 17 - 18, 75 - 77
Darmepithel – Barrierefunktion
34 - 37, 38 - 39, 41,
43 - 46, 47 - 54, 55 - 63
38, 44, 47 - 54
Darmschleimhaut
– Barrierefunktion
– Permeabilität≠
18, 34, 38, 41, 44, 46,
47 - 54, 55 - 63, 65, 66
38, 44, 47 - 54, 55 - 63
47 - 48, 53 - 54
Darmerkrankungen 19-24, 67-77, 78 - 79
–C
hronisch entzündliche 44 - 46, 61, 67,
70 - 73, 78 - 79
– Therapie
– – Probiotika
30, 31, 32, 67 - 77
Darmflora14
Darmmikrobiota14
– Bakteriocine
34, 35
– Entwicklung
17, 18
– Infektionsbarriere
34, 35
Defensine
– HBD-1
– HBD-2
– HD-5
– HD-6
33, 38, 44 - 46, 70, 79
44
44 - 46
44
44
Dendritische Zellen
Dermatitis
– Allergen-induzierte
Desmosomen
60
62
49 - 50
Diarrhö
19 - 22, 27, 38, 67, 68 - 70
68, 69
– akute
– chronisch rezidivierende
67
– infektiöse
19 - 22, 68
– protrahierte
67, 69 - 70
– Therapie
67 - 70
Divertikulose
Duodenum
– mikrobielle Besiedlung
96
67, 77
18
Dyspepsie / Reizmagen
67, 77
E
EcN32
Entamoeba18
Enterobacter
Enterobacteriaceae
Enterobakterien
11, 18, 75
9, 11
18, 35
Enterococcus17
Enterokokken18
Escherich, Theodor
7 - 10, 75, 80
Escherichia coli (E. coli)
9 - 12,
17, 18, 23 - 24
– Chromosom
12, 33
– Genom
14, 15 - 16, 23 - 24
– hämolysierend
75
– K-12
13 - 14, 23
– – Genom
14, 23
– Nissle 1917
27 - 28, 32 - 33
– – Adhäsion
33, 37
– – Antagonismus 27, 28, 38 - 40, 66, 75
nti-invasiver Effekt /
– – a
anti-invasive Wirkung
38 - 43
– – antimutagene Wirkung
64 - 65
– – Biofilmbildung
35 - 37
– – Chromosom
33
– – Fimbrien
33, 35, 36
– – Fitnessfaktoren 32, 33
– – Flagellen 32, 33, 35, 45, 46, 56
– – Flagellin 45, 46
– – Genom
32, 33
– – Indikationsspektrum
67 - 77
– – Kapsel
33, 57
– – Persistenz
37
– – Phänotyp
33
33, 43
– – Plasmide
– – Sicherheit / Unbedenklichkeit 32, 33
– – Trägersystem
79 - 80
– – W
27, 28, 34 - 54,
irkungen und Wirkmechanismen 55 - 63, 64 - 66
–p
athogene 19-24
– – AIEC
66
– – DAEC
22, 24
– – EAggEC
20, 22, 24
– – EHEC
20, 21, 24, 39, 40
– – EIEC
20, 22, 24, 66
20, 21, 24, 28, 51
– – EPEC
– – ETEC
20, 21, 22, 24
– – NTEC
22
– – SEPEC/MENEC
20, 23, 24
– – UPEC
20, 22, 24
– Plasmide
12, 13, 15, 23, 24
– rekombinante
16, 78, 80
– Serologie
12
– Serotypen / Serovare
12, 19, 20,
23, 32, 33
– Zelle
12
– Zellwandaufbau
12
– Eubakterien
18
F
Fimbrien
12, 21, 22, 23, 33, 35, 36
Flagellen
12, 32, 33, 35, 45, 46, 55, 56
Flagellin
45, 46, 55, 56
I
Infektanfälligkeit
Interferon
– IFN-γ
48, 67, 68, 77
16, 66
61, 66
IgA
47, 48, 76
IgG
61, 62
Ileum
– mikrobielle Besiedlung
18
Immunsystem
– Darm-assoziiertes
s. Darm,
Immunsystem
Interleukine
– 1b
– IL-2
– IL-4
– IL-5
– IL-6
– IL-8
– IL-10
Fusobakterien18
J
G
Jejunum
– mikrobielle Besiedlung
58
62
61
62, 66
61, 66
56, 57, 58, 66
59, 60, 62, 66
18
Gastritis53
K
Genom
– menschliches
– Inseln
14
23
Gentransfer
– horizontaler
23, 24, 78
Hämolytisch-urämisches
Syndrom (HUS)
Hefen
HIV
36, 72
23
9, 11, 75
Kluyvera75
Halitosis77
Helicobacter pylori
Kerngenom
– bakterielles
Klebsiella
H
Harnwegsinfektionen
Kapsel
– magensaftresistente
21, 24
Kolonisation
– mikrobielle
35 - 37
Kolonisationsprophylaxe
75 - 77
19, 22 - 24, 77
s. Candida albicans
L
18
Lactobacillus
17, 59, 60, 63
79, 80
Laktobazillen
18, 29
97
Leaky Gut
47 - 54
Lebendimpfstoffe
– rekombinante
79
Leberzirrhose
48, 77
Legionella43
Lipopolysaccharid (LPS)
12, 32, 33,
55 - 57, 59, 61, 62
Listeria
43, 66
O
Serotypisierungs. Escherichia coli,
Serologie
Obstipation
– chronische
– – Therapie
Serratia75
67, 68, 73 - 75
Shigella
P
Pathogenitätsfaktoren 23, 32, 33
Pathogenitätsinseln24
Peptide, antimikrobielle 33, 38, 44-46, 79
M
Peptostreptokokken18
Magen
– mikrobielle Besiedlung
Phagen
Makrophagen
Mesalazin
(5-Aminosalicylsäure)
18
47, 60
36 - 37, 64, 70 - 73
s. Bakteriophagen
Pinin50
Plasmazellen
47, 48
Mucosa
Mucin
44 - 46, 47, 70
73, 77
s. Darmschleimhaut
38, 39, 66, 70
Mutaflor® 27, 29, 32, 35, 36, 64, 67 - 77, 78
68 - 70, 72, 75 - 77
– Suspension
Mutagenitätstest
Mykosen
64 - 65
67, 68, 77
Nahrungsmittel-
unverträglichkeiten
67, 68, 77
Neurodermitis
67, 68, 77
Nitric Oxide Synthase
– induzierbare (iNOS)
NOD-Rezeptoren
98
Proteus
15 - 16
18, 28, 75
38, 48, 49
49, 52
49 - 51
49
Zytokine
59 - 62, 79
Staphylokokken18
Strahlenenteritis77
Streptococcus75
Streptokokken
18, 75
stx-Genexpression39
Thrombotisch-Thrombozytopenische
­Purpura (TTP)
Tight Junctions
21
34, 38, 47-52
T-Helfer-Zellen61-63
– TH-1-dominierte Immunantwort 61, 63
– TH-2-dominierte Immunantwort
61
47, 60 - 63
Providencia75
T-Zellen
47, 60 - 63
Pseudomonaden18
Toll-like-Rezeptoren (TLR)
55-57, 59
Q
Transkriptionsfaktoren55
– NF-κB53
34
Reizdarm-Syndrom
Salmonella
Translokation
41, 47, 48
Tumornekrosefaktor-α
(TNF-α)
67, 68, 77
S
16, 57 - 62, 66
V
Veillonellen18
11, 24, 27, 28, 38, 39, 41, 42
25 - 28
Salmonellen
58 - 59
Sepsis
– LPS-induzierte
55 - 57, 70
49, 50
Zonula occludens
– ZO-1-Protein
– ZO-2-Protein
– ZO-3-Protein
T-Lymphozyten Quorum Sensing
Z
Zonula adhaerens
Protozoen18
R
N
Nissle, Alfred
Proteine
– rekombinante
42, 43, 66, 75
Yersininien38
Staphylococcus75
tcpC-Modulatorprotein45
Probiotika
30 - 31, 38, 45, 59, 65, 70
– Sicherheit / Unbedenklichkeit 30 - 31, 32
Yersinia
22, 27, 38
T
77
Mikrobiota14
Morbus Crohn
– Pathogenese
– Therapie
Shigellen
Polymorphe Lichtdermatosen
Pouchitis77
32, 33, 35, 41, 43
21, 39, 40
11, 24, 28, 42, 43, 66
Plasmides. Escherichia coli, Plasmide
Mikrobiom14
Mikrocine Shiga-Toxin
Y
27, 38, 39, 41 - 43, 65
19, 23, 32
62
Vibrionen28
Virulenzfaktoren /
-merkmale
20, 21, 24, 57, 78, 79
Virulenzgene24
Septikämie22
99
M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller E. coli – Bedeutung in Forschung und Medizin
ISBN 3-9811198-4-3
Ums E.coli_Bedeutung in_d.indd 1
E. coli
Bedeutung
in
Forschung
und
Medizin
3., überarbeitete Auflage
M. Schiemann, U. Sonnenborn, J. Schulze, H. Müller
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