Bakterielle Klasse III Adenylatzyklasen

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Bakterielle Klasse III Adenylatzyklasen
Joachim E. Schultz, Ivo Tews* und Jürgen U. Linder
Pharmazeutisches Institut, Abt. Pharmazeutische Biochemie, Eberhard-Karls-Universität, Tübingen,
* Biochemiezentrum der Universität Heidelberg (BZH)
Adenylatzyklasen (ACn) synthetisieren aus
ATP den prototypischen second messenger
3’, 5’zyklisches AMP. Bald nach seiner
Entdeckung durch Sutherland 1962 wurde
die universelle Bedeutung von cAMP als
Signalvermittler erkannt. Die Regulation
der cAMP-Biosynthese ist daher von
großem Interesse. Hier bestehen zwischen
Pro- und Eukaryoten grundlegende Unterschiede. Im Tier ist die Aktivierung eines
G-Protein-gekoppelten Rezeptors durch
einen first messenger Voraussetzung für
die Regulation der membranständigen
ACn. In Bakterien gibt es keine G-Proteine
und die ACn werden unmittelbar über
regulatorische Domänen kontrolliert, die
integrale Bestandteile von AC-Proteinen
sind.
Abb. 1: Domänenvielfalt und Organisation bakterieller Klasse III Adenylatzyklasen. AC: catalytic
adenylyl cyclase domain; senkrechte Balken: transmembrane regions; HAMP-Domäne: benannt nach
Vorkommen u. a. in Histidine kinases, Adenylyl cyclases, Methyl-accepting chemotaxis proteins and
Phosphatases; GAF, benannt nach der Entdeckung u. a. in cGMP Phosphodiesterases, Adenylyl cyclases
and Formate-hydrolase transcription activator; PAS, benannt nach Vorkommen u. a. in Period clock
protein, Aryl hydrocarbon receptor and Single-minded protein; Rec: receiver domain; HisK, histidine
kinase; AAA, AAA-ATPase; pH, pH-sensor domain; HTH: helix-turn-helix motif; TPR: tetratricopeptide
repeat; 2Fe-2S, iron/sulfur cluster domain.
왘 In den letzten Jahren haben Genomprojekte viel Licht in das Panoptikum der bakteriellen ACn gebracht. Es gibt drei eigenständige Hauptklassen. Klasse I ACn werden in γ-Proteobakterien wie E. coli gefunden. Klasse II ACn sind extrazelluläre Toxine, z. B. aus Bordetella pertussis oder Bacillus
anthracis. Intrazelluläre Funktionen für das
Bakterium sind unbekannt[1]. Die meisten
bakteriellen ACn (und alle eukaryontischen
ACn) gehören in die Klasse III[2]. Generell
wird hier das katalytische Zentrum an der
Dimerisierungsfläche zwischen zwei katalytischen AC-Einheiten ausgebildet. Als rotationssymmetrische Homodimere besitzen
alle bakteriellen ACn zumindest pro forma
zwei katalytische Zentren, wobei überwiegend sechs kanonische Aminosäurereste für
die Katalyse verantwortlich gemacht werden.
Tierische Klasse III ACn sind dagegen asymmetrisch. Zwei unterschiedliche Monomere
sind in einer Proteinkette miteinander verBIOspektrum · 3/06 · 12. Jahrgang
knüpft und bilden in einem antiparallelen
Dimer ein katalytisches Zentrum.
Domänenstruktur bakterieller
Adenylatzyklasen
Die katalytischen Domänen bakterieller
Klasse III ACn (ca. 25 kDa) sind meistens
direkt mit regulatorischen Untereinheiten
verbunden. Die Domänenvielfalt spiegelt
die Palette der Reize wieder, die intrazellulär in ein cAMP-Signal münden können. Neben Membrandomänen, die wahrscheinlich
eine Rezeptorfunktion haben, gibt es GAFund PAS-Domänen als Small Molecule-Binding Domains, einen pH Sensor, Receiver-,
HAMP- und Histidinkinasedomänen mit
Bezug zu Chemotaxis, Transkriptionsfaktoren, Eisen/Schwefel-Cluster und AAA-ATPasen (Abb. 1 und 2). Die Vielfalt der wahrnehmbaren Signale und die Regulationsmechanismen sind nur vereinzelt geklärt.
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Abb. 2: Strukturen der
katalytischen Dimere der
mykobakteriellen ACn
Rv1900c (oben) und
Rv1264 (unten). Die rotationssymmetrischen
Monomere sind grün und
blau kodiert. Bei der
Bindung des Substratanalogons AMPCPP in
Rv1900c erfolgt eine
Drehung (16,6°) und
Verschiebung (11,4 Å) der
Monomere[5]. Die Bewegungen bei der Aktivierung von Rv1264 sind in
Abb. 3: dargestellt. Die
katalytischen Aminosäuren sind als Stabmodelle eingezeichnet (Asp
rot, Arg und Lys blau, Asn
orange). Zwei Aspartate
aus dem einen Monomer
positionieren zwei Metallionen, das andere
Monomer spezifiziert über
ein Lysin-Aspartat-Paar
das Substrat ATP und
stabilisiert durch je ein
Arginin und Asparagin
den Übergangszustand. In
Rv1900c sind nur die
Metall-bindenden Aspartate und das Arginin
eingezeichnet, da nur sie
für die Katalyse
notwendig sind.
Dazu kommt, dass manche Bakterien mehr
als 20 verschiedene AC-Gene besitzen, d. h.
einen breiten sensorischen AC-Fächer. Allein in Mycobacterium tuberculosis wurden 15
Klasse III AC-Gene identifiziert[3]. Biochemische und strukturelle Untersuchungen
mykobakterieller ACn haben nun einen gewissen Einblick in die Mechanismen der Katalyse und Regulation ermöglicht[4–6].
Ursprung der Asymmetrie von Klasse III
Adenylatzyklasen
Als Bindeglied zwischen bakteriellen ACn
mit zwei Katalysezentren und den tierischen
ACn mit nur einem wurde die mykobakterielle AC Rv1900c identifiziert[5]. Nur ein
Molekül des Substratanalogons α,β-Methylen-ATP ist in einem asymmetrischen Homodimer gebunden (Abb. 2), während der
Zugang zum zweiten katalytischen Zentrum
blockiert ist. Die Asymmetrie von Rv1900c
könnte damit eine Vorstufe der ausgeprägten Domänenasymmetrie tierischer ACn
sein, deren zweite Substratbindungsstelle
vollständig degeneriert ist. Darüber hinaus
besitzt Rv1900c andere Mechanismen der
Substratselektion und Katalyse, denn es werden nur drei der sechs kanonischen Aminosäuren benötigt, zwei metallbindende Aspartate und das den Übergangszustand stabilisierende Arginin (Abb. 2). Die drei anderen kanonischen Aminosäuren lassen sich
folgenlos gegen Alanin austauschen und haben in der Kristallstruktur keinen Kontakt
zum Substratanalogon. Es erscheint daher
fraglich, dass alle Klasse III ACn denselben
Katalysemechanismus besitzen.
Struktur einer bakteriellen Adenylatzyklase
mit regulatorischer Domäne
Abb. 3: Strukturen der
mykobakteriellen Adenylatzyklase Rv1264 im inhibierten (oben) und
aktiven Zustand (unten).
Die Monomere sind grün
und blau kodiert, die
Sequenz der α-N10-Schalthelix ist rot. Beim Übergang vom inhibierten in
den aktiven Zustand
rotiert die katalytische
Domäne um 55° (bei einer
Translation von 6 Å) mit
Bezug zur regulatorischen
Domäne, die jeweils
unten ist.
Mit der Strukturaufklärung der mykobakteriellen AC Rv1264 konnte die Interaktion
zwischen regulatorischer und katalytischer
Domäne etabliert werden[6]. Mit etwas
Glück wurden zwei Kristallformen des Holoenzyms erhalten, die sich als pH-aktivierter (pH 6) bzw. gehemmter (pH 8) Zustand
des AC-Homodimers herausstellten (Abb. 3).
Im gehemmten Zustand werden die katalytischen Hälften durch eine prominente 5spiralige α-Helix (αN10-switch Helix) auseinander gespreizt. Die sechs katalytischen
Aminosäureseitenketten sind bis zu 40 Å
weit voneinander entfernt und eine Katalyse ist ausgeschlossen. Beim Übergang in die
aktivierte Form schmilzt die αN10-switch
Helix, die katalytischen Domänen rotieren
um 55°, die katalytischen Reste aus beiden
Domänen bewegen sich um bis zu 25 Å aufeinander zu und bilden in der Dimerisierungsoberfläche zwei katalytische Zentren
(Abb. 2 und 3). Das Resultat ist eine 40-fache
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Joachim Erdmann
Schultz
Studium der Pharmazie
in Erlangen; 1965–1968
Doktorarbeit am MaxPlanck-Institut für Zellchemie, München;
Abb. 4: Überlagerung der katalytischen Zentren von Rv1264 (farbige Reste) und einer Chimere aus den
tierischen Adenylatzyklasen Typ II (katalytische Schleife II) und Typ V (katalytische Schleife I; graue
Reste[7]. Die mittlere Abweichung der Cα-Positionen (rmsd) ist 0,69 Å. Die Kugeln symbolisieren die
beiden koordinierten zweiwertigen Metallionen.
Aktivierung. Zerstörung der αN10-switch
Helix durch Punktmutationen bestätigen
diese funktionelle Aufgabenzuordnung[6].
Da diese Aktivierung zwischen pH 6 und 8
erfolgt und die pH-Abhängigkeit spezifisch
durch die N-terminale Domäne vermittelt
wird, kann man Rv1264 als zelluläres pHMeter bezeichnen.
Wieweit sind die Befunde an bakteriellen
Klasse III ACn auf die tierischen Klasse III
ACn übertragbar? Die Antwort lautet: hervorragend, denn eine strukturelle Überlagerung der katalytischen Zentren der mykobakteriellen AC Rv1264 und des aktiven
Heterodimers der tierischen ACn II und V
zeigt eine fast vollkommene Übereinstimmung (Abb. 4). Die Schlussfolgerung liegt nahe, dass die Regulation der Klasse III ACn
durch Reorientierung der katalytischen Domänen trotz aller Vielfalt im Detail mechanistische Gemeinsamkeiten aufweisen wird.
Dabei kann das Reservoir bakterieller Klasse III ACn helfen, strukturelle und proteinbiochemische Fragen der AC-Regulation zu
adressieren, die gegenwärtig mit den tierischen Isoformen nur schwer in Angriff genommen werden können.
BIOspektrum · 3/06 · 12. Jahrgang
1969/70 Postdoc am
Biochem. Institut Univ.
Lund, Schweden;
1971/72, Postdoc am
Natl. Inst. of Health, Bethesda, USA; 1973–
1976 wiss. Ass. am Inst.
für Toxikologie der Univ.
Tübingen; 1975 Habilitation für Biochemische
Pharmakologie; seit
1976 Prof. für Pharmazeutische Chemie, Abt.
Pharmazeutische Biochemie, Univ. Tübingen.
1985–1990 Studium der
Biologie, Univ. Heidelberg; 1991 Diplomar-
beit bei W. Kühlbrandt,
EMBL Heidelberg;
1992–1996 Doktorarbeit am EMBL, bei K.
Wilson, über die Struktur Chitin-abbauender
Enzyme; 1999–2000
PostDoc am Natl. Inst.
Med. Res., London
(U.K.) bei S. Gamblin;
ab 2000 PostDoc, dann
Wiss. Ass. bei I. Sinning,
BZH, Univ. Heidelberg.
Jürgen Linder
Geboren 1968; Studium
der Chemie in Konstanz, sowie der Biochemie in Rochester, USA;
1997 Promotion in
Pharmazeutischer Chemie in Tübingen; seit
1997 wiss. Ass. am Pharm. Institut der Uni.
Tübingen; 2002 Habilitation an der Univ.
Tübingen für Pharm.
Chemie.
Ivo Tews
Literatur
[1] Ladant, D, Ullmann, A (1999): Bordetella pertussis
adenylate cyclase: a toxin with multiple talents. Trends
Microbiol 7: 172–176
[2] Linder, J. U., Schultz, J.E. (2003): The class III
adenylyl cyclases: multi-purpose signalling modules.
Cellular Signalling 15: 1081–1089.
[3] Cole, ST, et al. (1998): Deciphering the biology of
Mycobacterium tuberculosis from the complete genome
sequence. Nature 393: 537–534.
[4] Guo, Y., Seebacher, T., Kurz, U., Linder, J.U.,
Schultz, J.E. (2001): Adenylyl cyclase Rv1625c of My-
cobacterium tuberculosis: a progenitor of mammalian
adenylyl cyclases. EMBO J. 20: 3667–3675.
[5] Sinha, S.C., Wetterer, M., Sprang, S.R.,
Schultz, J.E., Linder, J.U. (2005): Origin of the asym-
metry in homodimeric adenylyl cyclases: Structures of
Mycobacterium tuberculosis Rv1900c. EMBO J. 24:
663–673.
[6] Tews, I., Findeisen, F., Sinning, I., Schultz, A.,
Schultz, J.E., Linder, J.U. (2005): The structure of a pH
sensing mycobacterial adenylyl cyclase holoenzyme.
Science 308: 1020–1023.
[7] Tesmer, J. J. G., Sunahara, R. K., Johnson, R.
A., Gilman, A. G., Sprang, S. R. (1999): Two metal
ion catalysis in adenylyl cyclase. Science 285: 756–760.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Joachim E. Schultz
Pharmazeutisches Institut, Abt. Pharmazeutische
Biochemie
Eberhard-Karls-Universität Tübingen
Morgenstelle 8
D-72076 Tübingen
Tel.: 07071-2972475
Fax: 07071-295952
[email protected]