EUCOMM: The European Conditional Mouse Mutagenesis Program

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EUCOMM: The European Conditional Mouse
Mutagenesis Program
Claudia Seisenberger, Cornelia Kaloff, Thomas Floss und Wolfgang Wurst
Institut für Entwicklungsgenetik, GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit, Neuherberg
Die Aufklärung der genomischen
Sequenzen von Maus und Mensch kann als
ein Meilenstein in der Geschichte der
Naturwissenschaften angesehen werden.
Nur durch die Zusammenarbeit mehrerer
Institutionen konnte diese Aufgabe überhaupt verwirklicht werden. Durch die
Sequenzierung des Genoms konnten
sowohl bei der Maus als auch beim
Menschen insgesamt ca. 28.000 Gene und
konservierte, nicht proteinkodierende
Sequenzen identifiziert werden. Großes
Interesse besteht nun daran, die Funktion
und das Zusammenspiel der einzelnen
Gene zu untersuchen. Vorrangiges Ziel ist
es hierbei, die Ursachen genetischer
Erkrankungen des Menschen zu erforschen. Die Untersuchung von Tiermodellen
menschlicher Erkrankungen ist für diese
Ursachenforschung sehr nützlich. So hat
die Großmaßstabsanalyse von Mutanten in
Modellorganismen wie C. elegans, D. melanogaster, Zebrafisch und Maus unser
Verständnis für die Funktion einzelner
Gene maßgeblich gefördert. Die Maus
erweist sich als besonders geeigneter
Modellorganismus, da die Embryonalentwicklung, Anatomie, Physiologie und das
Verhalten von Mensch und Maus hochkonserviert sind. Auch haben 99 % des
menschlichen Genoms direkte Orthologien
in der Maus. All diese Gegebenheiten
erlauben es uns, die Maus als das Modellsystem der Wahl für die Analyse menschlicher Erkrankungen zu verwenden. Einen
weiteren Vorteil bietet die einfache Handhabung embryonaler Stammzellen (ESZellen) der Maus. Diese können einfach
gelagert, bei Bedarf aufgetaut, wieder
zurück in Mäuse überführt und diese
Mäuse dann unaufwändig gezüchtet
werden.
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Abb. 1: Aus der Beschreibung genetisch bedingter Krankheiten kennen wir eine Funktion von lediglich
etwa 2000 humanen Genen (links). Auch nach 15 Jahren Knockout-Technologie sind lediglich etwa 10%
aller Mausgene mindestens einmal mutiert worden (rechts). Nur etwa 100 dieser 2669 Mutanten
tragen konditionale Mutationen, die auch das Studium der Genfunktion zu bestimmten Zeitpunkten
oder in bestimmten Geweben erlauben.
왘 In diese Maus-ES-Zellen können Gen-
mutationen über das Genetrap- oder das
Genetargeting-Verfahren eingeführt und
analysiert werden. Das Genetrap-Verfahren
hat sich, schon bevor das Humangenomprojekt begann, als sehr effizient zur Einführung zufälliger Mutationen ins Mausgenom erwiesen. Auf diese Art und Weise
konnten, wie von den Mitgliedern des International Gene Trap Consortium (IGTC,
www.igtc.org) demonstriert wurde, im Hochdurchsatzverfahren eine Vielzahl von Mutationen in ES-Zellen der Maus eingeführt
werden. Insgesamt wurden bislang beim
IGTC 2000 mutierte Maus-ES-Zellen seitens der Wissenschaftsgemeinschaft angefordert und mehrere hundert dieser Zellen
wiederum in die entsprechenden Mausmutanten überführt. Zusätzlich wurden bislang
ca. 2.800 Knockout-Mäuse mit dem Genetargeting-Verfahren von der Wissenschaftsgemeinschaft und ca. 1.000–1.500 weitere
Knockout-Mäuse durch die Industrie generiert. Das Wissen um und der Zugang zu all
diesen Mausmutanten erweist sich jedoch
oftmals als schwierig.
Des Weiteren können derzeit, laut
OMIM-Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov),
nur ca. 2.000 Genorte (Abb. 1; Stand 2004)
menschlichen Erkankungen zugeordnet
werden. Weitere 3.500 bekannte Krankheiten des Menschen mit mendelschen Erbgängen konnten bislang noch mit keiner genetischen Veränderung assoziiert werden.
Ein von der Europäischen Union (EU) gefördertes internationales wissenschaftliches
Konsortium – EUCOMM: The European
Conditional Mouse Mutagenesis Program[1]
– wurde nun ins Leben gerufen, das es sich
zur Aufgabe gemacht hat, innerhalb von 3–
5 Jahren bis zu 20.000 Mausgene durch zufällige oder gezielte konditionale Mutationen in ES-Zellen zu inaktivieren und diese
der Wissenschaftsgemeinschaft frei zur Verfügung zu stellen. Diese Anzahl entspricht
etwa 70 % der Gene des Mausgenoms. Nur
durch die intensive Zusammenarbeit hochrangiger Forschungsteams kann dieses ehrgeizige Ziel erreicht werden. Das GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit in München und das Sanger Institute in
Hinxton, Cambridge, Großbritannien übernehmen hierbei die führende Rolle. Beide
Institutionen sind zudem die europäischen
Partner des IGTC. Weitere Mitglieder des
IGTC, die nordamerikanischen Partner in
Manitoba (Geoff Hicks) und Toronto (Janet
Rossant), werden ein komplementäres Verbundprojekt (NorKOMM) durchführen. Die
Koordination des europäischen EUCOMM-
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Abb. 2 Darstellung der Zentren des EUCOMMKonsortiums, der derzeit weltweit größten Plattform für die Genfunktionsanalyse im Maussystem.
Projektes, für das die EU insgesamt 13 Mio.
Euro zur Verfügung stellt, übernimmt Prof.
Dr. Wolfgang Wurst, Direktor des GSFInstitutes für Entwicklungsgenetik. Das
EUCOMM-Konsortium ist ein Zusammenschluss von insgesamt 11 Instituten aus vier
europäischen Ländern (Abb. 2).
Das EUCOMM-Projekt ist die derzeit
weltweit größte Plattform zur Mutagenese
des Mausgenoms. Die Hauptziele dieses
Projektes sind:
• Die Etablierung und Verteilung von bis
zu 20.000 konditionalen Genetrap- und
konditionalen Genetargeting-Mutationen
in Maus ES-Zellen, einschließlich mit
menschlichen Krankheiten assoziierter
Mutationen.
• Die Etablierung und Archivierung von bis
zu 300 mutanten Mauslinien.
• Sammlung existierender, nützlicher Creexprimierender Mauslinien für die Archivierung und Verteilung.
• Etablierung von bis zu 20 Liganden-induzierbaren, Cre-Rekombinase exprimierenden transgenen Mauslinien mit
unterschiedlichen Expressionscharakteristika.
• Etablierung einer online-Datenbank, um
das EUCOMM-Material der Wissenschaftsgemeinschaft weltweit zugänglich
zu machen.
• Integration der EUCOMM-Datenbank
mit anderen bioinformatischen Ressourcen.
• Enge Zusammenarbeit von EUCOMM
mit anderen, thematisch geeigneten EUKonsortien.
Um die Mutagenese der ES-Zellen in
EUCOMM im Hochdurchsatzverfahren
durchführen zu können, werden Vektoren
verwendet, die universell eingesetzt werden
können. Die für den Genetrap-Ansatz verwendeten Fliprosabetageo-Kassetten besitzen ein promotorloses Reportergen (LacZ)
und /oder eine Kombination aus Reportergen und Selektionsmarker (Betageo mit
Neomycinresistenz), die im 5’-Bereich von
einem Spleißakzeptor und im 3’-Bereich von
einer Terminationssequenz flankiert sind.
Bei einer Insertion in das Intron eines exprimierten Gens wird die Genetrap-Kassette über den endogenen Promotor transkribiert und, falls die Kassette im gleichen Leserahmen mit dem endogenen Translationsprodukt ist, wird ein Fusionsprotein zwischen endogenem Protein und Selektionsmarker bzw. Reporter gebildet. Durch die
Terminationssequenz der Genetrapkassette
wird das endogene Transkript vorzeitig beendet, und das prozessierte Fusionstranskript kodiert für eine verkürzte nichtfunk-
tionsfähige Version des endogenen Transkriptes. Da Gene, die für sezernierte oder
Transmembranproteine kodieren, mit den o.
g. Vektoren nur sehr schwierig oder gar nicht
zu mutagenisieren sind, werden für diese
Klasse von Proteinen spezielle Vektoren verwendet, welche nach dem Spleißakzeptor eine zusätzliche Typ II-Membrandomäne besitzen, die an den N-Terminus des Betageo
fusioniert ist[4]. Die Analyse der getrappten
Gene erfolgt, wie auch derzeit für das
GGTC, über 5’-RACE oder linker-mediierte PCR (Splinkerette). Da ca. 20–30 % der
Gene für die Entwicklung eines Organismus
verantwortlich sind, führt die Mutagenese
dieser Gene oftmals zu einem embryonal letalen Phänotyp. Eine weiterführende Untersuchung der Mutationen in einem adulten
Tier ist somit nicht mehr möglich. Um die
Untersuchung einer Mutation auch zu einem
späteren Zeitpunkt der Entwicklung zu
ermöglichen, werden die in EUCOMM verwendeten, so genannten konditionalen
Vektoren so konstruiert, dass eine Vielzahl
genetischer Veränderungen im Zielgen möglich sind. Hierzu eignen sich die flp excision
(Flex)-Vektoren[2] besonders gut. Diese
Vektoren verfügen über zwei spezifische
Rekombinationssysteme. Das erste Rekombinationsereignis, das zumeist über das
Flp/frt Rekombinasesystem erfolgt und in
Zellkultur durchgeführt wird, führt zu eiBIOspektrum · 1/06 · 12. Jahrgang
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Das EUCOMM-Konsortium:
(1) GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit
München/Neuherberg, Deutschland
Prof. Dr. Wolfgang Wurst
(Koordinator)
Prof. Dr. Martin Hrabé de Angelis
(2) Wellcome Trust Sanger Institute,
Hinxton, UK
Prof. Dr. Allan Bradley
(Ko-Koordinator),
Dr. Wiliam Skarnes, Dr. Pentao Liu,
Dr. Tony Cox
(3) Klinikum der J.W. Goethe-Universität, Frankfurt/Main, Deutschland,
Prof. Dr. Harald von Melchner
(4) Charité Universitätsmedizin Berlin,
Deutschland,
Prof. Dr. Patricia Ruiz
(5) Technische Universität Dresden,
Deutschland,
Prof. Dr. Francis Stewart
(6) Gene Bridges GmbH, Heidelberg,
Deutschland,
Dr. Gary Stevens
(7) Institut Clinique de la Souris, Strasbourg, Frankreich,
Prof. Dr. Pierre Chambon,
Prof. Dr. Johan Auwerx
(8) European Molecular Biology Laboratory (EMBL),
Monterotondo/Rom, Italien,
Prof. Dr. Nadia Rosenthal
(9) Medical Research Council, MGU,
Harwell, UK,
Prof. Dr. Steve Brown
(10) Consiglio Nazionale Delle Ricerche,
Monterotondo/Rom, Italien
Prof. Dr. Glauco Tocchini-Valentini
(11) Deutsches Ressourcenzentrum für
Genomforschung GmbH (RZPD)
Berlin, Deutschland,
Dr. Bernhard Korn
ner Drehung des inserierten Vektors und damit zur Wiederherstellung des Wildtyp-Zustandes. Eine erneute Drehung in vivo
mittels zeit- und gewebespezifisch exprimierter Cre Rekombinase kann dann zu jedem beliebigen Zeitpunkt in jedem
beliebigen Gewebe den mutagenen Zustand wiederherstellen (Abb. 3a). Die durch
zwei Drehungen entstandene Vektorkassette kann nun weiterhin für einen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch
(RMCE) oder für „Chromosome-Engineering“ eingesetzt werden. Da das GenetrapVerfahren nur für ca. 50 % aller Gene kosteneffizient einsetzbar ist, sollen Gene, die über
das Genetrap-Verfahren nicht mutagenisiert
werden konnten, mittels konditionalem Genetargeting (Abb. 3b und c) mutiert werden.
Über Microarray-Analyse können Gene bestimmt werden, die in ES-Zellen exprimiert
werden. Für die Genetargeting- und die Targeted Trapping- Experimente (Abb. 3b und
c) sollen zunächst solche Gene ausgewählt
werden, die mit menschlichen Erkrankungen ursächlich in Zusammenhang gebracht
werden können und die über das Genetrap- 왘왘
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Verfahren nicht mutagenisiert werden können. Gründe hierfür können sein, dass diese Gene zu klein sind oder zu schwach exprimiert werden. Weiterhin sollen schwerpunktmäßig Gene inaktiviert werden, die eine entscheidende Rolle in der Weiterleitung
zellulärer Signale und bei Zell-Zell-Interaktionen spielen, da deren Genprodukte Zielproteine für die Entwicklung neuer Medikamente darstellen können. Eine Bioinformatik-Arbeitsgruppe wird diejenigen Gene
identifizieren, die als Zielgene mutiert werden sollen. Letztendlich werden alle Gene
systematisch inaktiviert werden.
Der überwiegende Teil der Genetargeting-Experimente wird voraussichtlich mit
einer Trapping-Kassette[3] als so genanntes
b
c
Abb. 3a: Das FLEX System bietet die Möglichkeit
zur konditionalen Mutagenese. A: Zwei mutagene Kassetten werden von einer Kombination
von mutierten und Wildtyp Rekombinase-Erkennungs-Sites flankiert. Die FLPe Rekombinase
wird jeweils nur zwischen den homologen Erkennungsstellen rekombinieren (hier: grün und grün
bzw. gelb und gelb). B. Weil aber die Orientierung der Erkennungsstellen gegenläufig ist, wird
die Rekombinase die Kassette jeweils nur
zwischen grün oder gelb umdrehen. Dies sind
jeweils transiente, reversible Zustände (hier
gezeigt für Rekombination zwischen den gelben
Sites). Dabei kommt jedoch immer eine gelbe
bzw. eine grüne Site auf die andere Seite der
Kassette und ist nunmehr mit der jeweils
anderen kompatiblen Site gleich orientiert. In
diesem Fall wird die Rekombinase zwischen
diesen beiden Stellen rekombinieren und dabei
die nicht-kompatible Erkennungsstelle dazwischen ausschneiden (step 1). Das Ergebnis ist in
jedem Fall das gleiche: die mutagene Kassette ist
irreversibel in eine nicht-mutagene Richtung
gedreht und nunmehr von zwei inkompatiblen frt
Stellen flankiert. Nutzt man zwei unterschiedliche
Rekombinasen (hier zusätzlich Cre Rekombinase
und rote bzw. pinkfarbene loxP Sites), so kann
man auf diese Weise Kassetten auch in
bestimmten Geweben oder aber zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Entwicklung mutagen
wirken lassen, um z. B. frühe Letalität zu
umgehen[2].
Abb. 3b: Beim Targeted Trapping werden promotorlose konditionale Genetrap-Vektoren mithilfe
der homologen Rekombination in das erste
Intron von Genen gebracht, welche in ES Zellen
zwar exprimiert aber aus unterschiedlichen
Gründen bislang nicht getrappt wurden (A). Dort
funktionieren sie genau wie konventionelle Gene
Trap Kassetten (B). Diese promotorlosen
Konstrukte haben eine ungewöhnlich hohe
Rekombinationsrate (Friedel et al., 2005).
Abb. 3c: Beim Gene Targeting werden Selektionskassetten mit eigenen Promotoren benutzt,
welche nach der Drehung durch FLPe eliminiert
werden können, weil sie zwischen zwei frt sites
lokalisiert sind. Auch dieser Ansatz wird eine
Insertions Mutagenese sein. Durch die Einbringung einer zweiten loxP site in den Lokus können
jedoch auch Cre-mediierte Deletionen induziert
werden.
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Targeted Trapping durchgeführt werden.
Diejenigen Gene, die in ES-Zellen nicht exprimiert werden, müssen über einen Genetargeting-Ansatz mutiert werden (Abb. 3c).
Alle Insertionsstellen für die GenetargetingExperimente sollten, wenn möglich, im ersten Intron nach dem Translationsstart liegen oder, falls alternatives Spleißen erfolgt
oder ein weiterer Promotor bekannt ist, im
ersten Intron 3’ nach dem ersten allgemeinen Exon ausgewählt werden.
Die im Rahmen von EUCOMM anfallenden Zellkulturarbeiten werden im
Hochdurchsatzverfahren roboterunterstützt
durchgeführt. Nach der Transfektion der
Zellen mit den geeigneten Vektoren wird die
Zellkulturarbeit an der GSF mithilfe eines
komplexen Liquid Handling Roboters und
eines Clone-Pickers durchgeführt.
Unter Einsatz dieser Technologien wird
das EUCOMM-Konsortium die weltweit
größte Ressource mutierter embryonaler
Stammzellen der Maus erzeugen und sie der
Wissenschaftsgemeinschaft frei zur Verfügung stellen.
Literatur
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Gene targeting using a promoterless gene trap vector
(„targeted trapping“) is an efficient method to mutate a
large fraction of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
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[4] De-Zolt, S., Schnütgen, F., Seisenberger, C.,
Hansen, J., Hollatz, M., Floss, T., Ruiz, P., Wurst,
W., von Melchner, H. (2006): High throughput trapping of secretory pathway genes in mouse embryonic
stem cells. Nucleic Acids Res. online NAR-02785-F-2005.
R1
Danksagung
Die grundlegenden Arbeiten zur Ermöglichung des EUCOMM-Projektes wurden
wesentlich im Rahmen des German Gene
Trap Consortium (GGTC) durchgeführt.
Das GGTC wurde und wird seitens des
Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) gefördert, derzeit im Rahmen des NGFN-2 (FKZ-01GR0430 für die
GSF).
Korrespondenzadresse:
Dr. Cornelia Kaloff
Project Manager EUCOMM
GSF-Forschungszentrum für Umwelt und
Gesundheit
Institut für Entwicklungsgenetik
Ingolstädter Landstr. 1
D-85764 Neuherberg
Tel.: 089-3187-2601
[email protected]