Titel der Arbeit

I
Aus der Klinik und Poliklinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Peter Mallmann
Quantitative Untersuchung der Proteinkinase AKT am Ovarialkarzinom
Inaugural- Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
Vorgelegt von
Ines Kristin Middel
aus Mainz
promoviert am 16. Dezember 2009
II
Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. P. Mallmann
2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. A. Engert
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige
Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt
habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als
solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
-
Dr. Markus Hoopmann
Priv.- Doz. Dr. Dr. Thomas Schöndorf
Frau Martina Becker
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch
genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 17.03.2009
III
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir mit Unterstützung
von Herrn Privatdozent Priv.- Doz. Dr. Dr. Th. Schöndorf und der medizinischtechnischen Assistentin Frau M. Becker durchgeführt worden.
Die Proben wurden durch Frau Dr. Gunhild Rot vorbehandelt und eingefroren.
Die Krankengeschichten wurden von mir selbst ausgewertet.
IV
Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. med. Peter Mallmann für die Möglichkeit, die Arbeit an
seiner Klinik zu erstellen.
Mein besonderer Dank geht an Dr. med. Markus Hoopmann, der mit viel Geduld alle
Korrekturen der Arbeit vornahm und immer für Fragen ansprechbar war.
Frau Martina Becker als MTA war eine große Hilfe zur Erstellung der Daten, ebenfalls
Priv.- Doz. Dr. Dr. Thomas Schöndorf als damaliger Leiter des Labors. Vielen Dank
für die Zusammenarbeit.
Mein Dank gilt dem Institut für medizinische Statistik, Informatik und Epidemiologie
der Universität zu Köln, welches Hilfestellung bei der Auswertung der Daten leistete.
Und zuletzt danke ich meiner Familie, welche immer die größte Unterstützung für mich
war.
V
Inhaltsverzeichnis
0.
1.
1.1.
1.2.
1.3.
Abkürzungsverzeichnis ..............................................................................
Einleitung ....................................................................................................
Ovarialkarzinom .........................................................................................
Das Protein AKT/PKB ...............................................................................
Fragestellung ..............................................................................................
1
2
2
13
22
2.
2.1.
2.1.1.
2.1.2.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
Material und Methoden ..............................................................................
Geräte und Chemikalien .............................................................................
Verwendete Geräte .....................................................................................
Verwendete Reagenzien .............................................................................
Isolation der Tumorzellen und Protein-Extraktion .....................................
Proteingehaltbestimmung ...........................................................................
Western Blots .............................................................................................
Statistische Methoden ................................................................................
23
23
23
23
24
25
26
27
3.
3.1.
Ergebnisse ...................................................................................................
Beschreibung des Patientinnenkollektivs und der untersuchten Gewebeproben .........................................................................................................
Tumorhistologie, Grading, FIGO-Stadium der Gewebeproben .................
AKT- und P-AKT-Konzentration ...............................................................
Korrelation zwischen den Proteinkonzentrationen von AKT und P-AKT
mit verschiedenen Krankheitsparametern ..................................................
AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zum FIGO-Stadium ...........
AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zum Grading ......................
AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zur Platinsensibilität ..........
Korrelation der AKT-Konzentration mit der prä- und postoperativen
Ca-125-Konzentration ................................................................................
Korrelation der P-AKT-Konzentration mit der prä- und postoperativen
Ca-125-Konzentration ................................................................................
Korrelation der AKT- und der PAKT-Konzentration mit der rezidivfreien postoperativen Überlebenszeit .........................................................
Korrelation der AKT- und der P-AKT-Konzentration mit dem postoperativen progessionsfreien Überleben ....................................................
29
4.
Diskussion ..................................................................................................
48
5.
Zusammenfassung ......................................................................................
59
6.
Literaturverzeichnis ....................................................................................
61
3.2.
3.3.
3.4.
3.4.1.
3.4.2.
3.4.3.
3.4.4.
3.4.5.
3.4.6.
3.4.7.
29
31
35
36
36
38
40
42
44
45
46
1
0. Abkürzungsverzeichnis
Abbildung
Aktivierte Proteinkinase
Area under the curve
Arbeitsgemeinschaft
der
Wissenschaftlichen
Medizinischen
Fachgesellschaften
B-Zell-Lymphom/Leukämie-2(-Gen)
BCL2
BReast CAncer
BRCA
Computertumographie
CT
Desoxyribonucleic Acid
DNA
Enhanced Chemoluminescence
ECL
und Mitarbeiter (Mitautoren)
et al.
Firma
Fa.
Fédération Internationale de Gynécologie et d‘Obstétrique
FIGO
HER/NEU Human Epidermal Growth Factor Receptor
HNPCC
Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer (Syndrom)
HMFG
Human Milk Fat Globulin
ICD-10
International Classification of Diseases, 10th Revision
kDa
kiloDalton
K-RAS
GTP-bindende Protein K-RAS
mM
milliMolar
mg
Milligramm
ml
Milliliter
MRT
Magnetresonanztomographie
MYC
Myelocytomatosis viral oncogene homologue
µg
Mikrogramm
nm
Nanometer
PET
Positronen-Emissions-Tomographie
PTEN
Protein- und Phosphoinositid-Phosphatase
rpm
rounds per minute; Umdrehungen pro Minute
TGFb
Transforming Growth Factor beta
TNM
Tumorklassifikation (T = lokales Wachstum, N = noduläres Wachstum; M =
Metastasenbildung)
v.a.
vor allem
Abb.
AKT
AUC
AWMF
2
1. Einleitung
1.1. Ovarialkarzinom
Das Ovarialkarzinom ist eine der häufigsten Ursachen für Frauen in der westlichen
Welt (v.a. West-Europa und die weiße Bevölkerung der USA) an Krebs zu sterben und
rangiert auf Platz fünf der häufigsten weiblichen Tumore. Es erkranken etwa 15 - 20
von 100000 Frauen jährlich neu an einem Ovarialkarzinom. In Deutschland erkranken
jährlich etwa 8.000 Frauen daran (Robert Koch Institut 2006) - siehe Abb. 1 und 2.
Abbildung 1: Altersspezifische Inzidenz des Ovarialkarzinoms in Deutschland
(www.rki.de)
Im Jahr 2007 lag die absolute Inzidenz des Ovarialkarzinoms bei 9.950 Personen, was
23,5 Erkrankungsfällen pro 100.000 Einwohnern entspricht (Beckmann et al. 2007). In
den Vereinigten Staaten von Amerika wurden im Jahr 2006 durch das Ovarialkarzinom
3
15.310 Todesfälle verursacht (Birrer 2006). In westlichen Industrienationen erkranken
jährlich 15 von 100.000 Frauen neu an Ovarialkarzinom, weltweit geht man von einer
jährlichen Zahl von Neuerkrankungen in einer Höhe von 205.000 Fällen aus, wobei
weltweit jährlich 125.000 Frauen an Ovarialkarzinomen sterben (Tropé und Kaern
2007, IARC 2002). Das Risiko einer Frau im Laufe ihres Lebens an einem
Ovarialkarzinom zu erkranken, beträgt 1,5% und das Risiko, an diesem Karzinom zu
sterben, erreicht 1%. Die größte Inzidenz bösartiger Ovarialkarzinome findet man bei
Frauen im 6. und 7. Lebensjahrzehnt (Robert Koch Institut 2005, Beckmann et al.
2007) (s. Abb. 1 und 2).
Abbildung 2: Altersstandardisierte Inzidenz und Mortalität des Ovarialkarzinoms in
Deutschland (www.rki.de)
Das Ovarialkarzinom gehört zu den gefürchtetsten Krebserkrankungen. 33% aller
Malignome der Adnexe und des Uterus sind Ovarialkarzinome. Sein Anteil an Todesfällen durch Genitalkarcinome beträgt fast 75%. Das Ovarialkarzinom stellt damit nach
dem Mammakarzinom die Haupttodesursache unter den gynäkologischen Tumoren in
Europa und den Vereinigten Staaten dar (Auersbergs et al. 2001, Arbeitsgemeinschaft
bevölkerungsbezogene Krebsregister in Deutschland 1997, Chaudhuri et al. 2007,
Hashiguchi et al. 2006, Pfleiderer et al. 2001, Sanseverino et al. 2005, Weir et al. 2007,
4
Xia et al. 2006, Yan et al. 2006). Rassenzugehörigkeit, unterschiedliche Lebensgewohnheiten und genetische Determination sind ätiologisch relevant (Martin 2006,
Kolasa et al. 2006, Sanseverino et al. 2005). Als protektive Faktoren gelten
Schwangerschaften, lange Stillperioden, orale Kontrazeptiva, Hysterektomie und
Sterilisation (Chaudhuri et al. 2007). Man geht davon aus, dass jede Ovulation und
anschließende Proliferation im Keimepithels des Ovars Bedeutung für das spätere
Auftreten eines Ovarialkarzinoms haben kann (Brinton 2007).
Als Risikofaktoren gelten zunehmendes Lebensalter, familiäres Vorkommen, Nulliparität/Infertilität, frühe Menarche, späte Menopause und häufiger Wohnortwechsel
innerhalb Nordeuropa, Westeuropa und Nordamerika (Chaudhuri et al. 2007, Brinton
2007, Schulz et al. 2007). 90% der Ovarialkarzinome gelten als „sporadisch“, im
Gegensatz zu den genetisch fixierten familiär-erblichen Ovarialkarzinomen, die eher
jüngere Frauen betreffen. Die meisten dieser letztgenannten Patientinnen tragen das
BRCA 1-Gen (Mutation auf Chromosom 17q21) bzw. BRCA 2-Gen (auf Chromosom
13q12-13). Dabei handelt es sich um Tumorsuppressor-Gene, welche mit dem BreastOvarian-Cancer-Syndrom assoziiert sind. Die Häufigkeit dieser Mutation beträgt zwischen 1:8000 bis 1:16000. Bei Trägerinnen dieser Mutation beträgt die Wahrscheinlichkeit, an einem Ovarialkarzinom zu erkranken, 87% bzw. 63%. Seltener ist das
Ovarialkarzinom mit einem HNPCC-Syndrom (Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer
Syndrom) assoziiert (Holinski-Feder et al. 1998, Meden 1996, Pfleiderer et al. 2001,
Stratton et al. 1997, Wang-Y et al. 2005, Woenckhaus et al. 2007).
Abhängig von Typ und Malignitätsgrad werden auch Veränderungen der Tumorsupressor- bzw. Onkogene KRAS, PTEN, BCL2/HER/NEU, p53, MYC und TGFβ beobachtet (Bell 2005, Wang-HQ et al. 2005b, Woenckhaus et al. 2007).
So kann man beobachten, dass 5-7% der Patientinnen mit einem Ovarialkarzinom von
einem weiteren Fall in der Familie berichten können. Sind zwei oder mehrere
Familienmitglieder betroffen, steigt das persönliche Risiko auch ein Ovarialkarzinom
zu entwickeln von 1% auf 40% an. 85-90% der bösartigen Neoplasien des Ovars leiten
sich von der undifferenzierten Oberfläche des Ovars ab, dem sogenannten Keimepithel.
Man unterscheidet papillär-seröse, muzinöse, endometrioide, hellzellige und undifferenzierte Ovarialkarzinome (Staebler und Diebold 2007) - siehe auch Abbildung 3).
5
Abbildung 3: Histologische Beispiele für Ovarialkarzinome (Nunez et al. 2005).
A-C: seröse Ovarialkarzinome
E-F: endometroide Ovarialkarzinome
J-L: mucinöse Ovarialkarzinome
3
Außerdem gibt es Neoplasien, die aus dem sexuell differenzierten Gonadenmesenchym
hervorgehen (z.B. Granulosazelltumore) und solche, die aus den Keimzellen hervor-
6
gehen (z.B. Dysgerminom, Dottersacktumor). Man kann Ovarialkarzinome auch aufgrund ihrer Lokalisation einteilen in Karzinome, die innerhalb des Ovarialstromas unter
Einstülpung des Oberflächenepithels entstehen und erst nach Durchbruch durch die
Tumorkapsel zur peritonealen Aussaat führen sowie Karzinomen, die an der Oberfläche
des Ovars entstehen und so primär zu einer peritonealen Streuung führen, auch wenn
nur ein mikroskopischer Tumornachweis gelingt. Schließlich kann man noch
Ovarialkarzinome abgrenzen, die mit primärer Lokalisation außerhalb des Ovars auftreten, histologisch aber einem Ovarialkarzinom entsprechen und eine ausgedehnte
Peritonealkarzinose bewirken (Pfleiderer et al. 2001).
Die Früherkennung des Ovarialkarzinoms ist eines der Hauptprobleme. Im Gegensatz
zu anderen humanen epithelialen Tumoren ist das Ovarialkarzinom dadurch charakterisiert, dass die lokale Tumormasse ohne typische Symptome wächst und bei Diagnosestellung bereits in das Peritoneum metastasiert hat (Aletti et al. 2007, Reddy et al.
2004). Wenn Symptome auftreten, sind diese meistens unspezifisch und treten häufig
erst dann auf, wenn bereits eine Metastasierung eingesetzt hat. Solche Symptome sind
abdominelle Schmerzen, Völlegefühl, Veränderungen der Darmtätigkeit, frühes Sättigungsgefühl und Dyspepsie. In weit fortgeschrittenem Stadium kann es zu Aszites und
tastbaren abdominellen Tumoren kommen. Auch eine Beteiligung der Pleura ist dann
möglich. Eventuell können bei der Palpation auch vergrößerte inguinale, supraclaviculäre und axilläre Lymphknoten getastet werden. Paraneoplastische Symptome sind
selten, z.B. zerebelläre Degeneration, oberflächliche Thrombophlebitis, Dermatomyositis oder Polyarthritis ( Alletti et al. 2007, Martin 2006).
Durch den symptomarmen Verlauf und die sehr frühe peritoneale Metastasierung
werden 70% der Fälle erst im FIGO Stadium III oder IV erkannt. Hier beträgt die 5Jahres-Überlebensrate bei unter 60jährigen Patientinnen 42% und bei älteren Patientinnen 13%. Es besteht deshalb dringender Bedarf an Methoden der Früherkennung bzw.
eines Screenings, um die Prognose verbessern zu können. Hier auf molekularer Ebene
einen Ansatz zu finden, wäre ein Schritt von größter Bedeutung.
Zur Früherkennung stehen zur Zeit die bimanuelle gynäkologische Untersuchung und
der transvaginale Ultraschall zur Verfügung. Beide tragen zur Erkennung eines
fortgeschrittenen Ovariakkarzinoms bei, führen aber zu keiner signifikanten Senkung
7
von Mortalität oder Morbidität. Bei prämenopausalen Patientinnen ist eine Aussage zur
Dignität vor allem durch funktionelle gutartige Veränderungen am Ovar erschwert.
Tumormanifestationen im kleinen Becken, im Bereich des Diaphragmas und der
Leberoberfläche sind im MRT sowie im modernen Mehrzeilen-CT teilweise erkennbar. Allerdings kann eine Peritonealkarzinose, die oft den Erstbefund darstellt, häufig
erst ab einer Tumorgröße von einigen Zentimetern dargestellt werden. Ein CT sollte bei
Verdacht auf ein FIGO IV-Karzinom im Bereich des Thorax und Abdomens erfolgen.
Der Tumormarker CA-125 ist bei nur 50% der Patientinnen im Stadium I und II erhöht,
bei 80% der Patientinnen im Stadium III und IV. Ab einem Wert von 35 U/ml gilt der
CA-125 als erhöht und ein Wert ab 65 U/ml gilt als Hinweis auf ein Ovarialkarzinom.
Allerdings besitzt der Tumormarker eine zu geringe Sensitivität, um im Rahmen eines
Tumorscreening eingesetzt zu werden. Die Tumormarker CA 72-4 und CA 19-9 sind
beim muzinösen Ovarialkarzinom dem CA 125 an Sensitivität überlegen. Bei Patientinnen mit familiärer Belastung ist eine jährliche rektovaginale Untersuchung und ein
transvaginaler Ultraschall anzuraten sowie eine nachfolgende CA125 Bestimmung bei
diagnostischen Auffälligkeiten (AWMF online 2002, Deutsche Krebsgesellschaft 2000,
Pfleiderer et al. 2001).
Die Stadieneinteilung gemäß FIGO/TNM-Klassifikation erfolgt ausschließlich nach
pathologisch-anatomischen Gesichtspunkten (siehe Tabelle 1).
8
Tabelle 1: Klinische Stadieneinteilung (FIGO) (AWMF online 2002, Deutsche
Krebsgesellschaft 2000)
FIGO-Stadium Ausbreitung
FIGO I
Tumor begrenzt auf Ovarien
Ia
Tumor auf ein Ovar begrenzt; Kapsel intakt; kein Tumor auf der
Oberfläche des Ovars
Ib
Tumor auf beide Ovarien begrenzt; Kapsel intakt, kein Tumor auf der
Oberfläche beider Ovarien
Ic
Tumor begrenzt auf ein oder beide Ovarien mit Kapselruptur, Tumor
an Ovaroberfläche oder maligne Zellen im Aszites oder bei Peritonealspülung
FIGO II
Tumor befällt ein/beide Ovarien und breitet sich im Becken aus
IIa
Ausbreitung auf und/oder Implantate an Uterus und/oder Tube(n)
IIb
Ausbreitung auf andere Beckengewebe
IIc
Ausbreitung im Becken (2a oder 2b) und maligne Zellen im Aszites
oder bei Peritonealspülung
FIGO III
Tumor befällt ein oder beide Ovarien, oder N1 mit histologisch
nachgewiesenen Peritonealmetastasen außerhalb des Beckens
und/oder regionären Lymphknotenmetastasen
IIIa
mikroskopische Peritonealmetastasen jenseits des Beckens
IIIb
makroskopische Peritonealmetastasen jenseits des Beckens, größte
Ausdehnung < 2cm
IIIc
Peritonealmetastasen jenseits des Beckens, oder N1 größte Ausdehnung > 2 cm, und/oder regionäre Lymphknotenmetastasen
FIGO IV
Fernmetastasen; ein Pleuraerguss muss zytologisch positiv sein,
parenchymale Lebermetastasen.
N-Stadien
Nx
regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
keine regionären Lymphknotenmetastasen
N1
regionäre Lymphknotenmetastasen
Die Prognose des Ovarialkarzinoms hat sich in den letzten Jahrzehnten nur
unwesentlich verändert. Sie ist abhängig von der Ausdehnung/Staging, dem Differenzierungsgrad/Grading, dem postoperativen Tumorrest, dem Lymphknotenstatus, einer
Aszitesbildung und dem histologischen Typ (Noske et al. 2007). Auch das Alter und
der Allgemeinzustand (z.B. Karnofsky-Index) der Patientinnen muss vor allem unter
dem Aspekt der Operabilität berücksichtigt werden, da bei jüngeren Patientinnen in
gutem Allgemeinzustand die Möglichkeit eines aggressiveren therapeutischen Vor-
9
gehens besteht (AWMF online 2002, Deutsche Krebsgesellschaft 2000, Stratton et al.
2001).
Die Bedeutung des Östrogen/Progesteronrezeptorgehaltes ist nicht sicher einzustufen.
In einigen Arbeiten wurde eine prognostische Bedeutung der palliativen endokrinen
Therapie beschrieben. Insgesamt ist dieser Effekt eher von geringer Bedeutung
(AWMF online 2002, Kommoss et al. 1991).
Prognosefaktoren wie DNA-Euploidie, Wachstumsfaktoren, Onkogene, Tumorsuppressorgene und -Rezeptoren (beispielsweise KRAS, PTEN, BCL2/HER/NEU, p53,
MYC und DGFβ) sind noch nicht hinreichend geklärt und Gegenstand zahlreicher
Studien.
Die Therapie des Ovarialkarzinoms besteht zunächst in der operativen Entfernung und
sollte in spezialisierten Zentren erfolgen (Fader und Rose 2007, Cadron et al. 2007,
Gershenson 2007, Colombo et al. 2007, Martin 2006).
Die Primäroperation sollte als „Staging-Laparotomie“ vorgenommen werden. Sie umfasst Abdominallängsschnitt, Hysterektomie, Adnexektomie beidseits (mit hoher
Resektion der Ovarialgefäßbündel), infragastrische Omentektomie, Appendektomie,
Entnahme von Peritonealbiopsien (ggf. mit Entnahme von Douglas- und Blasenperitoneum), Entnahme von zytologischen subdiaphragmatischen Abstrichen und
peritonealer Spülzytologie sowie die Entfernung allen suspekten Tumorgewebes.
Bei Befall des Mittel- und Oberbauchs können zusätzliche Darmresektionen sowie
oberbauchchirurgische Eingriffe die Rate der postoperativen Tumorfreiheit und somit
die Prognose verbessern.
Da der postoperativ verbleibende Tumorrest bei Patientinnen mit fortgeschrittenem
Ovarialkarzinom den entscheidenden Prognosefaktor darstellt, ist das Ziel des operativen Vorgehens die komplette Tumorresektion, oder zumindest eine Tumorreduktion
auf eine Größe unter 1 cm. Hierbei ist für die Größenangabe bei mehreren verbleibenden Tumorherden der größte Durchmesser des Residualtumors maßgeblich (Cadron
et al. 2007).
Auch bei ausgedehnten Tumormassen und bedeutsamen Stenosen bei inoperablen
Tumoren sollte eine Reduktion des Tumors erfolgen, das sogenannte „Debulking“. Es
10
dient palliativen Zwecken und der Verbesserung des Ansprechens auf die
Chemotherapie. Bei Patientinnen mit Tumoren im Stadium IV wird eine Prognoseverbesserung diskutiert, die bis heute aber noch fraglich erscheint. Im Stadium FIGO Ia
GI ist bei jungen Patientinnen nach diagnostischer Laparotomie eine fertilitätserhaltende
Operation unter Erhaltung des Uterus und der kontralateralen Adnexe
möglich (Fader und Rose 2007, Colombo et al. 2007).
Die pelvine und paraaortale Lymphadenektomie ist bisher eher von diagnostischem als
von therapeutischem Nutzen. Sie gilt als umstritten, wird allerdings bei fortgeschrittenen Karzinomen aufgrund des häufigen Lymphknotenbefalls gelegentlich
durchgeführt, da dieser Eingriff möglicherweise einen positiven Einfluss auf die Überlebensrate hat (de Poncheville et al. 2001).
Die Lymphadenektomie wird in drei Gruppen unterteilt, nämlich die Biopsie palpabler
Knoten, die radikale Lymphadenektomie und das selektive Sammeln von
Lymphknoten. Das Hauptproblem der Biopsie ist, dass 55% der LymphknotenMetastasen kleiner als 2 mm sind (Petru et al. 1994, Stratton et al. 2001, Wu et al.
1986). Die radikale Lymphadenektomie birgt hohe Komplikationsraten, und sollte nicht
durchgeführt werden, solange nicht von einem eindeutigen Benefit dieser Maßnahme
auszugehen ist (Stratton et al. 2001, 43). Das selektive Sammeln der Lymphknoten ist
für das Staging wichtig, z.B. um die Indikation zur Chemotherapie in Frühstadien
abzuwägen. (Burghardt et al. 1991, Stratton et al. 2001).
Die „Second-Look“ Operation wird nur noch innerhalb von Studien durchgeführt. Sie
dient dem Nachweis des Chemotherapieerfolges und hat keinen Einfluß auf die
Prognose. Bei Spätrezidiven (rezidivfreies Intervall nach Beendigung der Primärtherapie > 12 Monate) kann eine Überlebenszeitverlängerung durch eine Rezidivoperation mit Verringerung der Tumormasse erreicht werden. Allerdings bringt dies nur
bei Patientinnen mit initial frühem Tumorstadium, makroskopischer Entfernung des
Primärtumors und gutem Ansprechen auf die Chemotherapie bei möglichst langem
Abstand zur Primäroperation einen Vorteil. Die Sekundäroperation sollte nur durchgeführt werden, wenn man auf eine makroskopische Tumorentfernung hoffen kann. Bei
Frührezidiven oder Fernmetastasen wird keine sekundäre Operation empfohlen (Allen
et al. 1995, AWMF online 2002, Deutsche Krebsgesellschaft 2000, Le et al. 1998,
Onda et al. 1998, Spirtos et al. 1995, Stratton et al. 2001, Vergote et al. 1993).
11
Die Festlegung der postoperativen systemischen Therapie wird durch das Ergebnis der
Laparatomie bestimmt.
Die Chemotherapie erfolgt nach therapeutischen Standards: bei Patientinnen im FIGO
Stadium I profitieren `Low Risk´-Patientinnen (Stadium Ia/Ib bei G1) nicht von einer
Chemotherapie. Ihre 5-Jahres-Überlebensrate beträgt bei adäquatem Staging und
chirurgischer Primärtherapie mehr als 90%. Eine adjuvante Chemotherapie wird
allerdings bei High Risk Patientinnen (Stadium Ia/Ib bei G3, Ic, ausgeprägter Aszites,
klarzelliger Subtyp) empfohlen. Hier ist eine Absenkung des Rezidivrisikos zu
erwarten, eine Verlängerung der Überlebenszeit ist möglich.
Die Chemotherapie in den Stadien II bis IV erfolgt nach Primäroperation mit einer
Chemotherapie bestehend aus Carboplatin/Paclitaxel (Trapé und Kaern 2007, Kim et al.
2007, Weir et al. 2007, Yang et al. 2006). Die Standarddosis beträgt bei Cisplatin 5075 mg/m² und bei Carboplatin AUC 4-5 mg/m². Sie wird jeweils im Abstand von drei
Wochen über 5-6 Zyklen verabreicht. Eine weitere Dosissteigerung oder längere
Behandlungsdauer konnte keine Ergebnisverbesserung erzielen. Ein Ansprechen auf die
Chemotherapie erfolgt in 90% der Fälle (Verschwinden des Aszites), Komplettremissionen sind in 30% der Fälle zu beobachten. Neben den allgemeinen Nebenwirkungen (Alopezie, Nausea, Knochenmarkdepression) ist bei Cisplatin auf die
Neurotoxizität sowie Nephrotoxizität (ab einer kumulativen Dosis von 300 mg/m²) zu
achten. Bei Chemotherapie zur Tumorreduktion erfolgt ein Staging nach 3 Zyklen mit
Sonographie, CT, Zysto- und Rektoskopie. Bei Chemotherapie nach kompletter Operation mit einem Tumorrest < 2cm intraperitoneal erfolgt das apparative Staging und
Tumormarkerkontrolle nach 6 Zyklen (AWMF online 2002, Bella et al. 1994, Bolis et
al. 1997, Decker et al. 1982, De Oliveira et al. 1990, Gadducci et al. 1996, Goerke et al.
2003, Trope et al. 1997, Young 1995, Young 1998).
Liegt ein Tumorrezidiv vor, so muss der Einsatz einer weiteren Chemotherapie im Hinblick auf die Sicherung der Lebensqualität der Patientin abgewogen werden, da in diesem Fall keine Aussicht auf einen kurativen Erfolg mehr besteht.
Patientinnen mit Platin-sensiblen Tumoren (Ansprechen auf platinhaltige Substanzen in
der Primärtherapie, nachfolgend rezidivfreies Intervall von mehr als 12 Monaten
Dauer) werden allerdings auch in einer Rezidivsituation auf eine platinhaltige Reduk-
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tionstherapie ansprechen und zwar desto besser, je länger das rezidivfreie Intervall
andauerte.
Ein großes Problem der Therapie des Ovarialkarzinoms ist die Resistenz auf die
Chemotherapeutika (Sabbatini und Odunsi 2007, Schöndorf et al. 2003, Selvendiran et
al. 2007, Shaw und van der Hyden 2007, Yan et al. 2006, Yang et al. 2006). Es kommt
häufig relativ früh zu Rezidiven (Delord et al. 2005).
Bei platin-resistenten Patientinnen (rezidivfreies Intervall < 6 Monate oder Tumorprogression unter der Chemotherapie) wird keine kombinierte Chemotherapie mehr
empfohlen, da sie keine Verbesserung der Protnose verspricht. Nur etwa 20% der
Patientinnen sprechen auf eine Monotherapie z.B. mit Etoposid, Topotectan, Paclitaxel
und einigen andere Substanzen an (AWMF online 2002).
Die Strahlentherapie ist heute weitgehend durch die Chemotherapie verdrängt worden.
Eine Indikation besteht lediglich für einzelne inoperable Herde, Tumorrezidive sowie
palliativ zur Analgesie von Knochenmetastasen. Eine Strahlentherapie kann außerdem
eine Option für Patientinnen sein, die aus internistischen Gründen (z.B. Nierenschäden,
Kardiomyopathie) keine Chemotherapie erhalten können. Primär sind lediglich Dysgerminome und Granulosazelltumore strahlensensibel (Goerke et al. 2003).
Alternative Therapiemodelle sind beim Ovarialkarzinom limitiert. Zu nennen wäre vor
allem die Hormontherapie etwa mit Progesteron, Tamoxifen oder GnRH-Analoga.
Diese gewinnt unter anderem bei platin-resistenten Tumoren an Bedeutung, insbesondere wenn wegen der hohen Toxizität auf eine weitere Chemotherapie verzichtet
werden muss. Auch bei den genannten Hormonen liegen die Ansprechraten bei unter
20%,
sie haben jedoch einen positiven Effekt vor allem auf die tumorinduzierte
Anorexie und Kachexie (AWMF online 2002, Emons und Kavanagh 1999, Williams
1998).
Weitere Möglichkeiten, die sich im Moment noch in klinischer Erprobung befinden,
sind die Gentherapie und die Immuntherapie.
Das Prinzip der Immuntherapie umfasst die Erzeugung einer Interaktion zwischen
Tumorzellen und Abwehrsystem. Derzeit steht der Einsatz monoklonaler Antikörper
aufgrund ihrer Effektivität und der weniger komplizierten Applikationsweise (CA 125,
Her2-neu, HMFG-1, Anti-Idiotypen-Antikörper) im Vordergrund. Obgleich die
beschriebenen imunologischen Ansätze Erfolg versprechend erscheinen, stehen Ergeb-
13
nisse größerer randomisierter Studien zur Überführung in die klinische Routine zur Zeit
noch aus.
Ähnlich verhält es sich mit Studien der Gentherapie. Sie umschreibt das Einbringen
eines Fremdgens in somatische oder Keimzellbahnen, um die Funktion eines mutierten
oder fehlenden Gens zu rekonstruieren oder eine neue genetische Eigenschaft hervorzurufen. Die Hauptzielsetzung konzentriert sich auf eine erhöhte Zellempfindlichkeit
gegenüber Zytostatika durch Integration von Fremdgenen (u.a. p53), bzw. die Toleranz
der hämatopoetischen Stammzelle gegenüber Zytostatika durch Transfer der MultiDrug-Resistance-Genen zu erhöhen oder auf
Prodrug-Aktivierung (AWMF online
2002, Deutsche Krebsgesellschaft 2000).
Die Nachsorge des Ovarialkarzinoms erfolgt individuell. Das Ziel ist die Erkennung der
Rezidiverkrankung, die Erkennung und Behandlung therapieassoziierter Nebenwirkungen (gastrointestinale Morbidität, Parästhesien, sekundäre Malignome, Hormonausfallserscheinungen), die psychosoziale Betreuung sowie die Verbesserung der
Lebensqualität. Während einer Langzeitchemotherapie ergeben sich zwangsläufig
kurze Intervalle von einer bis vier Wochen. Bei ausgedehnten Tumoren sollte bis zum
zweiten Jahr post operationem alle drei Monate, danach alle fünf Monate eine Kontrolluntersuchung erfolgen. Bei jeder Untersuchung erfolgt eine Spiegeleinstellung
(Scheidenstumpfrezidiv), Kolposkopie, Zytologie-Entnahme, vaginale und rektale
Palpation, Palpation des gesamten Bauchraumes, inklusive der Leber, Inspektion und
Palpation der Mammae. Einmal jährlich wird eine Mammographie empfohlen. Bei
Rezidivverdacht ist die Kolposkopie, Zystoskopie, i.v.-Pyelographie, evtl. CT, MRT,
PET indiziert (AWMF online 2002, Goerke et al. 2003).
1.2. Das Protein AKT/PKB
Da aufgrund der schlechten Prognose des Ovarialkarzinoms auf der Basis von
Chemotherapieresistenz und später Diagnose erheblicher Forschungsbedarf besteht,
versucht man, die Chemosensilbilität vo Ovarialkarzinomen zu erhöhen. Einen möglichen Ansatz stellen Signaltransduktionswege der Proteinkinase AKT dar. Während der
Entwicklung eines Tumors durchläuft die Zelle eine Reihe phenotypischer
14
Charakteristika, welche ihr vor allem ermöglicht schnell und unlimitiert zu proliferieren, in die Umgebung einzuwandern, ohne ihr natürliches Umfeld zu überleben und
in andere Gewebe zu metastasieren.
Diese Entwicklung ist meist das Resultat wachsender genomischer Instabilität, welche
zu einer Hochregulierung (Up-Regulation) der Onkogene, bzw. Hinunterregulierung
(Down-Regulation) der Tumor Suppressor Gene führt.
In den letzten Jahren sind wichtige Entwicklungsstufen der Tumorgenese mit ihren
vielfältigen Signaltransduktionswegen, welche zu unregulierten Prozessen wie
Proliferation und Überleben führen, entschlüsselt worden.
Die Serin/Threonin Protein Kinase AKT/PKB (Protein Kinase B) hat sich als wichtiger
Regulator von
unterschiedlichen Prozessen wie Apoptose, Proliferation, Differen-
zierung und Metabolisation in der Tumorzelle herausgestellt. Die Unterbrechung der
normalen AKT Regulation ist eine in einigen menschlichen Tumoren übliche
Erscheinung. Das Enzym spielt anscheinend eine erhebliche Rolle in der Tumorentstehung und der Tumorprogression.
Zuerst wurden 1977 zwei Gene (AKT1 und AKT2) isoliert, welche Homologe des
viralen Onkogens v-AKT sind. Sie befinden sich am Genlokus 19q13.1-q13.2 und
erzeugen eine Form von Leukämie bei Mäusen (Brasil und Hemmings 2001, Staal
1987). V-AKT und seine Homologen kodieren die Proteinkinase B (PKB). Die drei
Mitglieder die aus dieser Familie 1991 isoliert werden konnten werden PKBa (AKT1),
PKBb (AKT2) und PKBg (AKT3) genannt. Jede Isoform exprimiert eine N-terminale
Pleckstrin homologe Domäne (PH) mit ca. 100 Aminosäuren, welche ahnlich wie
andere signalisierende Moleküle 3-Phosphoinositid binden. Dies weist darauf hin, dass
diese PH Domäne die Bindung von AKT mit 3-Phosphoinositiden ermöglicht. Außerdem befindet sich in dieser Region ein Threonin Rest (Thr308) dessen Phosphorylierung für die Aktivierung von AKT maßgeblich ist. Dieser Region folgt ein
hydrophobes C-terminales Ende, ein Serin Rest (Ser473), welcher den zweiten
phosphorylierbaren Regulator des Proteins darstellt. Thr308 und Ser473 werden durch
Wachstumsfaktoren und andere extrazelluläre Stimuli indirekt phosphoryliert Dies ist
der essentielle Schritt, um AKT zu aktivieren (Andelkovic et al. 1999, Alessi et al.
1996, Nicholson und Anderson 2002).
15
Die zelluläre Aktivierung von AKT erfolgt durch eine phosphorylierende Kaskade
über das Enzym Phosphoinositide 3-Kinase (PI-3K) welches durch verschiedene
Stimuli (insbesonders Insulin, IGF-I, IGF-II, TNFa, PDGF), die an der Plasmamembran
binden, selber aktiviert wird. Es phosphoryliert direkt Phosohatidylinositol-4,5biphosphate (PIP2) an dessen 3-OH Gruppe und wandelt es dadurch in die aktive Form
PIP3 um, welches AKT an die Plasmamembran bindet und dessen Konfiguration
ändert. Dadurch wird indirekt eine Phosphorylierung von AKT ermöglicht. PIP3 wird
nicht nur durch die Proteinkinase PI-3K reguliert, sondern auch durch andere Phosphatasen wie PTEN, SHIP oder den Inhibitor LY294002, welche PIP3 durch Entfernung
der OH Gruppe inaktivieren (AWMF online 2002, Fraser et al. 2003). Ein „latent
membran Protein“(LMP1) des Eppstein-Barr-Virus kann durch Phosphorylierung an
p85 zu einer PI-3K Aktivierung führen und somit als Oncogen wirken (Dawson et al.
2003).
Die Phosphorylierung von AKT erfolgt durch die Phosphoinositide-Dependent-Kinase1 (PDK-1) am Thr308 und Ser473-Rest und durch PDK-2 am Ser473-Rest. Beide sind
Serine/Threonin-Kinasen mit hoher Affinität zu 3-Phosphoinositiden. Meist werden
Ser473 und Thr308 simultan stimuliert, es bestehen aber auch unabhängige Regulationsmechanismen, wie eine direkte Aktivierung durch Insulin oder ILK sowie auch
Autophosphorylierungsmechanismen (Alessi et al. 1997, Kroner et al. 2000, Hill et al.
2001, Nicholson und Anderso 2002, Stokoe et al. 1997, Toker und Newton 2000).
Theoretisch hängt das Aktivitätsniveau von AKT in den Zellen von der Balance
zwischen „on“-Signalen (hervorgerufen durch erhöhte PIP3 Werte) und dem Einfluss
von „off“-Signalen ab, welche zu AKT-Dephosphorylierung führen. Dies können
abgeschwächte PI-3K/PIP3-Konzentrationen sein sowie osmotischer Stress und Ceramide, die durch Dephosphorylierung über Okadaicsäure-sensitive Phosphatasen
entstehen (Chen et al. 1999, Nicholson und Anderson 2002, Schubert et al. 2000).
Die Proteinphosphatase PTEN, ursprünglich identifiziert als Tumor Suppressor Gen,
wird oft als Gegenspieler von AKT angesehen, da es ein AKT direkt vorgeschaltetes
Upstream Target (PIP3) inhibiert (Lee et al. 2005a).
Mutationen werden regelmäßig in fortgeschrittenen Stadien einiger Karzinome, wie
zum Beispiel beim Ovarial-, Mamma-, Endometrium- und Prostatakarzinom, sowie
16
beim Glioblastom gefunden. Beim Ovarialkarzinom findet man in 30-50% der Fälle
eine PTEN Verminderung.
Seine Funktion besteht vor allem darin, das Zellwachstum zu inhibieren und eine
zunehmende Anfälligkeit der Zelle für Apoptose und Anoikisis zu induzieren. Als
Substrat gilt vor allem PIP3, welches direkt von PTEN dephosphoryliert wird und somit
eine Hemmung der PI-3K Kaskade bewirkt. Es scheinen weitere unabhängige
Mechanismen zu bestehen, sowie ein dephosphorylierender Einfluss auf ILK und das
AKT Substrat BAD. Ein PTEN Mangel, untersucht an PTEN-null embryonalen
Fibroblasten, bewirkt eine PIP3 Zunahme und nachfolgende unregulierte AKT
Aktivierung mit unkontrollierter Zell Proliferation. Umgekehrt bedeutet eine PTEN
Reexpression eine AKT Down-Regulierung (Brasil und Hemmings 2001, Haas-Kogan
1998, Kurose et al. 2001, Nicholson und Anderson 2002, Nieh et al. 2005, Stambolic et
al. 1998, Tang et al. 2006, Whang 1998).
AKT ist essentiell für das Überleben der Zelle. So findet man AKT1 und AKT3
ubiquitär in humanen Zellen. AKT2 findet man eher in Insulin abhängigem Gewebe
wie braunem Fettgewebe, Skelettmuskel und Leber (Bellacosa et al. 2004).
Jede der drei Isoformen der Proteinkinase AKT wird aber auch in speziellen Tumoren
exprimiert.. So findet man AKT1 vor allem bei Ovarial-, Magen-, Prostata- und
Mammakarzinomen. AKT2 wird vermehrt in Ovarial-, Pankreas-, Magen- und
Mammakarzinomen gefunden. Eine Überexpression von AKT3, mit selektiver Aktivierung durch verschiedene Wachstumsfaktoren findet man bei hormonunabhängigen
Mamma- und Prostatakarzinomen. Man geht davon aus, dass vor allem eine Erhöhung
der AKT2 Konzentration, regelmäßig in zahlreichen Tumoren gefunden werden kann.
Ab welchem Wert man allerdings von einer erhöhten Konzentration ausgehen kann und
ob es Grenzwerte und Vorhersagewerte gibt, ist kaum dokumentiert (Nicholson und
Anderson 2002, Ruggeri et al. 1998).
Um die Wirkmechanismen von AKT zu verstehen, muss man die zahlreichen Substrate
und deren Funktion kennen. In ruhenden, nicht stimulierten Zellen befindet sich AKT
im Zytoplasma, erst nach Aktivierung findet man es an der Plasmamembran, sowie im
Zytosol und im Nucleus. Im Nucleus befinden sich zahlreiche Substrate von AKT.
Es wird vor allem das Zellwachstum und Zellüberleben gefördert. Dies kann direkt über
Hemmung der Apoptose geschehen, wie auch über eine veränderte Regulierung der
17
Transkription von pro- oder anti- apoptotisch wirkenden Genen. Zum Beispiel wirkt die
Phosphorylierung von Mitgliedern der Forkhead Familie (FKHR) positiv regulierend
auf die Induktion von zellerhaltenden Genen, da diese nicht mehr inhibiert werden
können, nachdem FKHR durch Phosphorylierung vom Nucleus in das Zytoplasma
transferiert wurde. Dieser Mechanismus scheint beim Mamma Karcinom eine
besondere Bedeutung zu haben, da auch das Östrogen abhängige Wachstum durch
FKHR Verschiebung ins Zytoplasma verstärkt werden kann (Brunet et al. 1999, Dijkers
et al. 2000, Nicholson und Anderson 2002). Bestimmte Mitglieder der Forkhead
Familie sind in der Lage die Zelle in der G0 oder G1 Phase zu halten. Dieser Zellzyklus
Arrest hindert die Zelle an einer Proliferation und kann durch AKT induzierte
Phosphorylierung aufgehoben werden (Burgering und Kops 2002).
Viele Substrate werden von AKT stimuliert, um die Proliferation, Anti-Apoptose und
das Überleben der Zellen zu förden. Hierzu gehört auch die Tumorgenesis und vermehrte Einsprossung von Gefäßen, um das Wachstum durch gute Versorgung zu
fördern. Zu nennen ist hier zum Beispiel NF-κB, welches umgekehrt zu FKHR in den
Nucleus transloziert wird, um dort spezielle Gene der Entwicklung, Entzündung,
Abwehr und Zell Überleben zu verändern (Chen et al. 1999, Nicholson und Anderson
2002, Romashkova und Makarov 1999, Schubert et al. 2000).
AKT phosphoryliert auch direkt Schlüsselproteine der Apoptose-Regulation. Zum
Beispiel die Kinase BAD aus der Bcl-2 Familie, welche durch AKT Phosphorylierung
gehindert
wird
ihre
üblichen
Mechanismen
wie
Apoptose
Anregung
und
Antagonisierung von zellüberlebensfördernden Mitgliedern der eigenen Familie, auszuführen (Del Peso et al. 2001, Nicholson und Anderson 2002). Dieser Mechanismus fällt
zum Beispiel bei Patienten mit Zustand nach Leberteilresektion und anderen Ursachen
einer Leber-regeneration auf, bei denen Insulin, IL-6, EGF und HGF die AKT-Kaskade
aktivieren und somit unter anderem BAD-vermittelt einer Apoptose entgegenwirken
und somit die Regeneration fördern (Hong et al. 2000).
Interessant ist auch die Verbindung von AKT zur stressaktivierten Proteinkinase
(SAPKs). Diese ist involviert in eine durch ionisierende Strahlen, Hitzeeinwirkung und
osmotischen Stress induzierte Apoptose. Nach AKT-Intervention kann die SAPKsinduzierte Apoptose unterdrückt werden (Nicholson und Anderson 2002).
18
Bei direkter Bindung an ein Retinoblasten-Protein (pRB) im Nucleus, welches verschiedene Gene des Zellzyklus inhibiert, kann AKT eine Progression der G1/S Phase
induzieren und somit den Zellzyklus beschleunigen (Assoian und Schwartz 2001,
Nicholson und Anderson 2002).
Ein weiteres Substrat, welches den Zellzyklus verkürzt, ist CyclinD1. Es findet sich in
einigen Karzinomen, vor allem im Mammakarzinom und es ist in 50% der Fälle
hochreguliert. Durch Verkürzung des Zellzyklus wirkt es direkt auf die Tumorprogression. Außerdem wirkt es auf die Transkription, mRNA-Translation und auf die
Proteinstabilität. Es scheint, dass AKT in jedem Schritt regulativ auf CyclinD1
einwirken kann (Gille und Downward 1999, Nicholson und Anderson 2002, Takuwa et
al. 1999). Dies
erfolgt über eine Hemmung durch Phosphorylierung von GSK-3,
wodurch CyclinD1 stabilisiert wird. Außerdem fallen durch abnehmende GSK-3Konzentrationen hemmende Mechanismen auf das β-Catenin weg, was eine Zunahme
von CyclinD1 bewirkt. GSK-3 wird außerdem als Substrat in der Insulin-AKT-Kaskade
genutzt. Durch dessen Inhibierung wird die Glycogensynthese via Glycogen-Synthase
(GS) reguliert. Auch Prozesse der Differenzierung, Proliferation und Trans-formation
werden unterstützt (Cohen 1998, Cross et al. 1995, Nicholson und Anderson 2002).
Von besonderer Bedeutung ist der Einfluss von AKT`s auf die Wirkungsweise verschiedener Chemotherapeutika. In soliden Tumoren ist die Effiktivität der Chemotherapeutika abhängig von der Vaskularisation, der Proliferationsaktivität und von
Veränderungen in der Tumorumgebung wie der Abstand zu versorgenden Gefäßen.
Viele Tumore entwickeln eine Hypoxietoleranz, um einer Apoptose zu widerstehen und
proliferieren zu können. AKT scheint Einfluss auf diese Adaptionsvorgänge zu haben.
Außerdem besitzt AKT eine angiogenetische Fähigkeit. Es reagiert auf proangiogenetische Stimuli wie Angiopoetin und Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).
AKT phosphoryliert in aktiviertem Zustand Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS),
welche durch NO Freisetzung eine Neovaskularisation und VEGF induzierte
Endothelzellmiigration, Gefäßtonusveränderung und Differenzierung erlaubt (Bellacosa
et al. 2004, Dimmeler et al. 1999, Fulton et al. 1999).
Weitere Schlüsselregulatoren, welche auf Hypoxie reagieren und durch Insulin und
Wachstumsfaktoren verstärkt werden, können AKT-abhängig die Transkription und
Translation verschiedener Gene der Angiogenese und des Glukose-Transports
19
induzieren und eine verstärkte VEGF Produktion auslösen (Cheng et al. 2002, Gerber et
al. 1998, Nicholson und Anderson 2002, Zhong et al. 2000, Zundel et al. 2000).
Im Glukose-Metabolismus wirkt AKT stimulierend auf die Glycogen-Synthese durch
GSK-3-Phosphorylierung. Außerdem unterstützt AKT die Translokation von GLUT4
an die Plasmamembran und induziert die GLUT1 Gen Transkription.
Desweiteren soll AKT die Toleranz der Zellen gegenüber Minderernährung fördern.
Dies kann es über das Substrat mTOR, welches oft in Tumoren aktiviert ist und
Ernährungsmechanismen im Tumor verändert und die Zellproliferation fördert, sowie
eine chromosomale Instabilität hervorruft (Bellacosa et al. 2004).
All diese Mechanismen erlauben es Tumoren, unter hypoxischen Bedingungen zu
proliferieren (Nicholson und Anderson 2002, Izuishi et al. 2000).
Speziell beim Ovarialkarzinom ist das Ansprechen auf die Chemotherapie, vor allem
mit platin- und taxolhaltigen Substanzen, von essentieller Bedeutung für die
Progression des Tumors und somit für das Überleben der Patientinnen. Der Wirkmechanismus von Platin beruht auf dessen Fähigkeit der Vernetzung von DNASträngen und Induzierung der Apoptose. Es scheinen auch Zusammenhänge zwischen
der Expression von spezifischen Genen für den Zelltod und der Down-Regulierung der
für das Zellüberleben wichtigen Gegenspieler von Platin zu existieren (Cheng et al.
2002, Li et al. 2001).
Bei vielen Patientinnen besteht eine Resistenz gegen Platin. Diese ist in 75% der Fälle
mit einer Resistenz gegen Taxol verbunden und stellt einen limitierenden Faktor in der
adjuvanten und palliativen Therapie dar. Die Mechanismen dieser Chemoresistenz sind
multifaktoriell. Es muss unterschieden werden zwischen primär bestehender und im
Laufe der Therapie entstandener Resistenz. Man geht von verändertem Transport der
Substanzen in die Zellen aus und einer speziellen Gen
Expression (Multi-Drug-
Resistance-Gen). Die erhöhte Rate von DNA-Reparaturmechanismen und eine erniedrigte Rate von chemotherapie-induzierten DNA und makromolekularen Schäden
spielen eine Rolle (Cheng et al. 2002, Reed et al. 1996). Also eine Vielzahl von intraund extrazellulären Resistenz-Faktoren gegen zytotoxische Substanzen.
Die empfindliche Balance zwischen Tumorsuppressorgenen und die für ein verlängertes zelluläres Überleben wichtigen Faktoren, wie Inhibitoren der Apoptose und
Bestandteile der gesamten PI-3K/AKT-Kaskade, scheint im Zusammenhang mit der
20
Chemoresistenz gestört zu sein. Man findet veränderte Proteinzusammensetzungen
(unter anderem eine Hochregulierung von AKT) in verschiedenen menschlichen Karzinomen. Dies lässt teilweise Rückschlüsse auf eine schlechtere Prognose zu (Cheng et
al. 2002, Sun et al. 2001).
Eine veränderte Platinsensitivität wird durch viele molekularbiologische Mechanismen
hervorgerufen. Man findet in Platin resistenten Tumoren zum Beispiel häufig eine
erhöhte Konzentration von X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein (XIAP). Daraus
folgt eine herabgesetzte Apoptoserate der Tumorzellen. Der Mechanismus beruht auf
einer Hemmung der Spaltung von AKT und einer erhöhten AKT-Phosphorylierung und
somit einer AKT-Aktivierung. XIAP vermittelt das von AKT verwendete Substrat.
Daraus resultiert eine indirekte Platinresistenz. Eine Reduzierung von XIAP sensibilisiert die Zelle für Platin. Platin bewirkt aber auch direkt eine XIAP-Reduzierung,
eine AKT-Spaltung und somit eine Induktion der Apoptose. In platinssensiblen Zellen
beobachtet man eine hohe Rate von AKT-Spaltung, nicht dagegen in platinrresistenten
Zellen, in denen die AKT-Spiegel erhöht sind.
Viele andere AKT-induzierte Wege wirken hier ähnlich und meist hemmend auf die
Apoptose. Man kann festhalten, dass man bei Tumoren, die eine erhöhte Resistenz
gegen Platin und eventuell auch gegen Taxane aufweisen, erhöhte AKT-Spiegel findet.
Diese Tumorzellen gehen nicht in eine platininduzierte Apoptose über (Cheng et al.
2002, Fraser et al. 2003, Li et al. 2001, Page et al. 2000, Sasaki et al. 2000).
Weitere Substratbindungsstellen, welche die Tumorgenese potentiell verändern können,
sind Östrogen- und Androgen-Rezeptoren. In steroidabhängigen Tumoren lassen sich
wegen herabgesetzter Stimulierbarkeit oft nach einiger Zeit Resistenzen gegen die
antihormonale Therapie feststellen mit konsekutiver hormonunabhängiger Proliferation.
AKT kann hier als Mediator fungieren, indem es eine Stimulierung der Rezeptoren
durch EGF und IGF-1 fördert. Außerdem phosphoryliert AKT direkt Steroidrezeptoren,
die dadurch hormonunabhängig aktiviert werden und eine Resistenz für antihormonelle
Substrate entwickeln (Campbell et al. 2001, Nicholson und Anderson 2002).
Bei speziellen Mäusearten, welche phänotypisch einen AKT-Mangel besitzen, kann
man eine kürzere Zellüberlebenszeit beobachten mit beeinträchtigter Insulin Wirkung
in der Leber und im Skelett Muskel (Brasil und Hemmings 2001, Cho 2001).
21
Betrachtet man all diese Mechanismen wird klar, dass AKT eine wichtige Rolle in
weiten Bereichen der Tumorgenese spielt. AKT wirkt direkt auf Tumorprogression,
Hyperplasie und Zellüberleben. Aber vor allem als Glied langer Enzymketten und in
Kooperation mit anderen onkogenen Wegen wirkt es auch zum Anstoß von Dysplasie
und Neoplasie.
Cheng et al. (2002) fand erhöhte AKT Spiegel bei fortgeschrittenen Tumoren mit
hohem Grading, allerdings nicht in frühen Tumorstadien. Dies scheint die These zu
untermauern, dass AKT eher die Tumor Progression unterstützt als die Initiation (Tang
et al. 2006, Nieh et al. 2005).
Es gibt verschiedene experimentelle Ansätze, um alle diese Erkenntnisse therapeutisch
zu nutzen. Ein wichtiger Ansatz ist die Sensitivität gegenüber den Chemotherapeutika
Platin und Taxol zu erhöhen, da sie die Chemotherapeutika der ersten Wahl beim
Ovarialkarzinom sind und die Chemoresistenz eines der Hauptprobleme in der Therapie
darstellt. Der Versuch der Genmanipulation, vor allem über adenovirale Vektoren,
scheint schon geglückt zu sein. Man ersetzt zum Beispiel Tumor Suppressorgene oder
initiiert einen Transfer von Genen der Multi-Drug-Resistance. Auch eine direkte XIAP
Reduzierung ist auf diesem Weg möglich, was eine bedeutende Rolle in der
Überwindung der Platinresistenz spielt (Cheng et al. 2002, Collinet et al. 2000).
Eine Reduzierung von AKT sensibilisiert die Zelle direkt für eine Chemotherapie.
Außerdem bewirkt man durch die Reduzierung eine höhere Apoptoserate und eine
Verminderung der Proliferation mit verlangsamtem Zellzyklus. Außerdem würde eine
vermehrte Anfälligkeit der Zelle für Hypoxie und die Reduktion von einsprossenden
Gefäße mit Unterversorgung an nährenden Substanzen, den Metabolismus der Tumorzellen herabsetzen (Cheng et al. 2002, Datta et al. 1999, Sun et al. 2001).
Versuche zur AKT-Reduktion beinhalten die Verabreichung von AKT-Antikörpern und
anderen Peptiden, welche die Aktivierung von AKT verhindern und in die Downstream
Kaskade eingreifen. Es ist ein pharmakologischer AKT-Inhibitor auf dem Markt
(Calbiochem), genaue Studien zur Wirkung stehen allerdings noch aus (Cheng et al.
2002).
22
1.3. Fragestellung
Die zahlreichen Signaltransduktionswege der Proteinkinase AKT sind vielfach
untersucht und erscheinen uns mittlerweile als gut bekannt. Durch ihre maßgebliche
Beteiligung am Tumorgeschehen, vor allem an der Tumorinduktion, Entwicklung und
Progression, muss ein vermehrtes Augenmerk auf die klinische Relevanz gelegt
werden.
Wir isolierten das Protein AKT und dessen phosphorylierte Form P-AKT aus 99
Tumorproben von Ovarialkarzinompatientinnen. Die Konzentrationen wurden mit
verschiedenen biologischen Parametern und der Rezidivfreiheit in Bezug gesetzt, um
somit
einen
Zusammenhang
Krankheitsverlauf zu erfassen.
zwischen
Konzentration
von
AKT
und
dem
23
2. Material und Methoden
2.1. Geräte und Chemikalien
2.1.1. Verwendete Geräte
Es wurden die nachfolgend aufgeführten Geräte eingesetzt:
- Zentrifuge Biofuge 15 (Fa. Heraeus, Hanau)
- Spannungsgeräte Power Pack 300 und 200, Imaging Densitometer GS 690, Criterion
Elektrophoresekammer, Criterion Blotter und Microplate Reader Model 550 (Fa.
Bio--Rad, München)
- Filmentwicklung: Curix 60 (Fa. AGFA, Leverkusen)
- Eindampfen: Concentrator 5301 (Fa. Eppendorf, Köln)
- Ultraschallbad Electric Sono Gerätetyp TK 52 (Fa. Bandelin, Berlin)
- Mikro-Dismembrator (Fa. Braun, Melsungen)
2.1.2. Verwendete Reagenzien
Es wurden folgende Reagenzien benutzt.
- TPER™ Tissue Protein Extraction Reagent (Fa. Pierce, Rockfort, IL, USA)
- 12,5% Tris-HCL Criterion Precast Gel, Criterion Blotting Sandwiches, Protein
Standard Marker, DC Protein Assay, Protein Assay Standard 1, Precision Protein
Standards (sämtlich Fa. Bio Rad, München)
- ECL-Marker, ECL-System, Chemilumineszenz-Filme (Fa. Amersham, Braunschweig)
- Antikörper anti-AKT (Ser 473), polyclonal anti rabbit (Fa. Cell Signaling, Taufkirchen)
- Antikörper anti-P-AKT (Ser 473), polyclonal anti rabbit (Fa. Bio Source, Solingen)
- zweiter Antikörper anti rabbit und HRP (Fa. Amersham, Braunschweig)
- Entwickler, Fixierer, Algezid II special biocide (Fa. AGFA, Leverkusen)
24
Alle weiteren Chemikalien der Qualitätsstufen "zur Analyse" oder "reinst" wurden von
der Fa. Merck (Darmstadt), der Fa. Sigma (Taufkirchen), der Fa. Serva (Heidelberg)
und der Fa. Fluka (Neu-Ulm) bezogen.
2.2. Isolation der Tumorzellen und Protein-Extraktion
Die Tumorzellen wurden aus frischem Tumorgewebe, malignem Aszites bzw. Pleuraerguß oder metastatisch befallenen Lymphknoten gewonnen. Eine vorläufige Tumorzellsuspension wurde direkt nach Gewinnung des Materials weiterverarbeitet oder,
wenn eine direkte Verarbeitung nicht erfolgen konnte, bei -70°C gelagert.
Bei der Aufbearbeitung wurden die Zellen "geerntet", d.h. das Tumorgewebe wurde
mechanisch im Dismembrator homogenisiert und daraufhin bei 5.000 rpm für fünf
Minuten dichtezentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
Es folgte ein Waschschritt in sterilem PBS (pH-Wert 7,2-7,4; 0,9% NaCl, 8 mM
KH2PO4, 1 mM KH2PO4) und eine erneute Zentrifugation bei 5.000 rpm für fünf
Minuten. Auch hier wurde der Überstand verworfen. Die auf diese Weise gewonnenen
Pellets könnten bei -70°C gelagert werden.
Bei endgültiger Verwendung der Proben zur Proteinisolation, wurden diese mit Extraktionspuffer (100 ml TPER; 0,3 µ/ml Proteinaseinhibitor Aprotinin und 1 mM ß-Mercaptoethanol) versetzt und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Pro 100 mg Tumorgewebe
wurde 1 ml Extraktionspuffer zugegeben. Bei Aszites bzw. Pleuraerguß wurde 1 ml
tumoröse Flüssigkeit mit 1 ml Extraktionspuffer versetzt. Auch diese Proben konnten
dann bei -20°C gelagert werden.
Die Zellen wurden im Ultraschallbad für 5 Minuten lysiert und anschließend bei 1400
rpm fünf Minuten dichtezentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde in ein frisches
Eppendorf-Cup überführt und bis zur Messung der Proteinkonzentration, bzw. Weiterverarbeitung in der Western Blot Analyse bei -20°C gelagert.
25
2.3. Proteingehaltbestimmung
Da bei jeder Probe eine festgesetzte Menge von 50 µg Gesamtprotein eingesetzt werden
sollte, musste die Proteinkonzentration jeder einzelnen Probe bestimmt werden.
Dies erfolgte unter Verwendung des Folin-Phenol-Reagenz. Dazu wurde das Protein
mit Kupfer vorbehandelt, welches nun eine Reduktion des Folin-Reagenz bewirkte.
Geschieht diese Reaktion der Proteine in alkalischem Milieu, kann man eine Farbentwicklung beobachten. Eine Farbentwicklung in Abwesenheit von Kupfer entsteht durch
den Tyrosin- und Tryptophangehalt des Proteingemisches. Durch die Zugabe von Kupfer kommt es unter alkalischen Bedingungen zu einer 3-15fachen Erhöhung der
Farbentwicklung, welche den generellen Proteingehalt des Gemisches widerspiegelt.
Kupfer hat jedoch nur eine geringe Wirkung auf die Farbentstehung durch freies
Tyrosin und Tryptophan. Die Farbentwicklung ist nach 5-10 Minuten maximal und
verändert sich innerhalb einer Stunde nur unwesentlich (Lowry et al. 1951).
Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte unter Verwendung eines Standards.
Die drei Komponenten des verwendeten Protein Assay sind folgende:
- Reagenz A: alkalische Kupfertartrat-Lösung,
- Reagenz S: Natriumdodecylsulfat,
- Reagenz B: Folin Reagenz.
Aus den Reagenzien A und S wurde kurz vor Gebrauch im Verhältnis S zu A von 1:50
das Reagenz A´ hergestellt.
Die Verdünnungsreihe des
Standards und der Proben wurden jeweils in Doppel-
bestimmung in einer Mikrotiterplatte angelegt. Zur Kontrolle wurde der Standard ein
zweites Mal aufgetragen und wie eine Probe behandelt.
Die Verdünnung erfolgte bis 1:16 beim Standard und bis 1:128 bei den Proben. Dazu
mussten 10 µl Probe bzw. Standard in Reihe A pipettiert werden. Darauf wurden 50 µl
A`-Reagenz pipettiert. In alle restlichen Vertiefungen wurden 30 µl A`-Reagenz vorgelegt. Es folgte die Verdünnung durch Entnahme von 30 µl aus Reihe A, die in Reihe
B pipettiert wurde. Nach kurzem umrühren wurden nun aus Reihe B 30µl entnommen
und Reihe C zugefügt usw. Zum Schluß wurde 200 µl Reagenz B in alle Vertiefungen
eingefügt.
26
Die charakteristische blaue Färbung entwickelte sich maximal nach einer Stunde. In
Dunkelheit wurde der Proteingehalt anhand der Extinktion bei 655 nm quantifiziert
2.4. Western Blots
Die Auftrennung der Proteine aus dem Lysat erfolgte in einer diskontinuierlich denaturierenden 12,5%igen Polyacrylamid-Gelelektophorese.
Dafür wurden jeweils 50 µg Gesamtprotein pro Probe aufgetragen, aufgenommen in 10
µl Aqua destillata. Bei eingedampften Proben und bei Proben, dessen Volumen unter
10 µl bei 50 µg Gesamtprotein lag, wurde mit Aqua dest. auf 10 µl aufgefüllt.
Zusätzlich wurden 10 µl SDS Page-Probenpuffer (6% ß-MCE; 6% SDS; 20% Glycerin;
0,6% Bromphenolblau; 0,2M DTT) hinzupipettiert. Es entstand ein Gesamtvolumen
von 20 µl für jede Geltasche. Ein Molekulargewichtsmarker wurde mitpipettiert, sowie
ein ECL-Marker und Positiv-Kontrollen.
Die Proben wurden anschließend im Thermobad für 5 Minuten bei 95°C denaturiert
und 10 Sekunden zentrifugiert, um das genaue pipettieren der Volumina zu
gewährleisten.
Es folgte die Pipettierung der Proben in das Gel (0,5 M Tris Criterion Precast Gel) und
Einfüllung des SDS-Gel-Laufpuffers (25 mM Tris-Base; 0,19 M Glycine; 0,1% SDS
bei pH 8,3). Angeschlossen an das Spanungsgerät Power Pack 300 wurden die Proben
für 10 Minuten bei 50 Volt auf einer Ebene gesammelt und danach bei konstant 120
Volt für 110 Minuten getrennt.
Im Anschluss wurden die aufgetrennten Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran
transferiert. Dies erfolgte in der Criterion-Blotting Kammer in Transferpuffer (48 mM
Tris-Base; 39 mM Glycine; 20% Methanol; 0,1% SDS) bei 100 Volt am Spannungsgerät Power-Pack 400 für 50 Minuten.
Die Expression des Proteins, welches bei 65 kDa nachweisbar ist, erfolgte durch
Inkubation mit einem Primär- und Sekundär-Antikörper. Zunächst aber wurde die
Nitrozellulose-Membran mit den übertragenen Proteinen in TBS-Puffer (10mM TrisBase; 0,9% NaCl; 0,1% TWEEN 20 bei pH7,4) vorblockiert und 60 Minuten in 6%iger
TBS-Milk blockiert, um unspeziefischen Reaktionen vorzubeugen.
27
Der verwendete AKT-Antikörper wurde im Verhältnis 1:4000 in TBS-Puffer gelöst
(der P-AKT-Antikörper hingegen in einem Verhältnis von 1:5000) und pro Membran
mit 4 ml aufgetragen. Über Nacht wurde bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde der
Blot dreimal für fünf Minuten in TBS gewaschen.
Um die Bindung des primären Antikörpers an das zu bestimmende Protein nachzuweisen, inkubierte man die Membran für 60 Minuten mit einem sekundären
Peroxidase-gekoppelten-Antikörper (Verdünnung des zweiten Antikörpers im Verhälsnis 1:10000, Verdünnung des HRP 1:1000), gelöst in 30 ml TBS-Puffer bei Raumtemperatur. Erneut wurde der Blot dreimal für fünf Minuten in TBS-Puffer gewaschen.
Es folgte die Inkubation des Blots mit der ECL-Detektionslösung (100 mM TRIS/HCl
bei pH 8,5; 0,2% p-Comuarinsäure; 0,5% 3-Aminophtalhydrazid (Luminel); 0,03% v/v
H2O2) für 30 Sekunden. Die entstehende Chemilumineszenz ist direkt proportional zur
Menge des Epitops, da die Lichtentstehung spezifische Antigene nachweist, die an die
Rettich-Peroxidase-gekoppelten Antikörper gebunden sind. Dies wurde auf jeweils
zwei Röntgenfilmen dargestellt, um die autoradiographische Reproduzierbarkeit des
quantitativen Ergebnisses zu gewährleisten.
Die Autoradiogramme wurden densitometrisch mit einem Grünfilter aufgenommen und
die entstandenen Banden bei 65 kDa mit der Multi-Analyst Software quantifiziert. Die
Menge des AKT/P-AKT Proteins, phosphoryliert an Serin 473, konnte somit berechnet
und ausgewertet werden.
2.5. Statistische Methoden
Die gewonnenen Untersuchungsdaten wurden in das Statistikprogramm Statistical
Package for Social Sciences (Fa. SPSS GmbH, München) eingegeben und ausgewertet.
Für die beschreibende Statistik wurden absolute (n) und relative (%) Häufigkeit sowie
Mittelwert (Med), Standardfehler des Mittelwertes (SEM), Median (Med), Minimum
(Min) und Maximum (Max) errechnet.
Die intervall- und rationalskalierten Daten der Studie (Alter der Patientinnen,
Gesamtproteingehalt, AKT, P-AKT, Ca-125 prä- und postoperativ, Rezidiv- und
Progressionsfreiheit postoperativ) wurden zunächst einer Prüfung auf Normalverteilung
28
mittels Kolmogorov-Smirnov-Test unterzogen. Mit Ausnahme des Patientinnenalters
und der Progressionsfreiheit musste jedoch eine Gauß-Verteilung der Daten abgelehnt
werden. Deshalb wurden generell streuungsunempfindliche, nicht-parametrische Prüfverfahren verwendet (z.B. Kruskal-Wallis-Test, Korrelation nach Spearman). Für die
Kalkulation der 5-Jahres-Überlebensraten wurden Überlebenstabellen nach KaplanMeier verwendet. Das Signifikanzniveau wurde auf p < 0,05 festgelegt. Die für die
Signifikanzprüfung verwendeten Testverfahren sind im Ergebnisteil benannt.
29
3. Ergebnisse
3.1. Beschreibung des Patientinnenkollektivs und der untersuchten Gewebeproben
Das Patientinnenkollektiv bestand aus 85 Frauen mit Ovarialkarzinom, deren mittleres
Alter zum Zeitpunkt des ersten operativen Eingriffs 58,4 + 1,3 Jahre (Median 59,5
Jahre) betrug. Die jüngste Patientin war zu diesem Zeitpunkt 27 Jahre und die älteste
Patientin 85 Jahre alt. Wie die nachfolgende Abbildung zeigt, stellten die 61-70jährigen
Patientinnen die mit Abstand größte Gruppe im Untersuchungskollektiv (33,7%),
gefolgt von den 41-50jährigen (23,3%) und den 51-60jährigen (20,9%). Die über 70jährigen Patientinnen stellten 15,1% des Kollektivs. Jüngere Patientinnen im Alter bis zum
40. Lebensjahr waren mit 7% selten vertreten.
Abbildung 4: Altersverteilung der 86 Patientinnen in Jahresklassen
30
Im Untersuchungszeitraum vom 18.02.1998 bis 19.07.2001 wurden von den Tumorpatientinnen insgesamt 99 Gewebeproben im Rahmen von 43 primären (43,4%) und 56
sekundären (56,6%) Tumoroperationen gewonnen - vergleiche Abbildung 5.
Abbildung 5: Untersuchte Patienten und gewonnene Gewebeproben (GP)
Die nachfolgenden Ausführungen beziehen sich nicht mehr auf die ursprüngliche
Patientinnenzahl (n=86) sondern auf die Anzahl insgesamt untersuchter Gewebeproben
(n=99).
31
3.2. Tumorhistologie, Grading, FIGO-Stadium der Gewebeproben
Die Tumorhistologie konnte bei 98 der 99 entnommenen Gewebeproben untersucht
werden. Die Mehrzahl der Gewebeproben waren aus einem papillär-serösem Adenom
(Zyste) entnommen worden (57,1%). Bei acht Gewebeproben handelte es sich um ein
endometroides Karzinom (8,2%) und bei weiteren fünf Gewebeproben um ein muzinöses Karzinom. Jeweils zwei Gewebeproben stammten aus poly-pleomorphen Karzinomen bzw. einem Granulosazelltumor. Eine Gewebeprobe war einem Borderline-Tumor
entnommen worden. Bei den verbleibenden 24 Gewebeproben lagen nicht näher klassifizierte Ovarialkarzinome vor (vgl. Abbildung 6).
Abbildung 6: Tumorhistologie von 98 untersuchten Gewebeproben (Ca = Karzinom;
Tu = Tumor)
32
Das Grading konnte bei 88 Gewebeproben aus den Akten entnommen werden. Bei
mehr als der Hälfte der Ovarialkarzinome lag ein G3-Tumor vor, bei knapp einem weiteren Drittel der Fälle handelte es sich um G2-Tumoren. G4-Ovarialkarzinome stellten
knapp 10% der untersuchten Gewebeproben, während G1-Tumoren selten vorhanden
waren (siehe Abbildung 7).
Abbildung 7: Tumor-Grading bei 88 Gewebeproben von Ovarialkarzinomen
33
Aus den Unterlagen von 96 Gewebeproben waren Angaben zum FIGO-Stadium des
Ovarialkarzinoms eruierbar gewesen. Dabei waren bei 12,5% dieser Fälle die Tumoren
im Stadium FIGO I bis II erkannt worden. Zwei Drittel der Tumoren war erst im
Stadium FIGO III und ein weiteres Fünftel erst im Stadium FIGO IV erkannt worden
(siehe auch Abbildung 8).
Abbildung 8: FIGO-Stadium der auswertbaren 96 Gewebeproben
34
Bei 39 Gewebeproben von insgesamt 21 Patientinnen war aus den Krankenunterlagen
ein Zusammenhang zur Platinsensibilität des Tumors herstellbar. Die Voraussetzung
für diesen Zusammenhang war die Durchführung einer Platintherapie sowie einer R0Resektion des Ovariakarzinoms. Deshalb wurden aus der Betrachtung die 25 Gewebeproben, bei denen keine Platintherapie vorgenommen worden war, sowie weitere 35
Gewebeproben, bei denen das Ovarialkarzinom nicht R0-reseziert worden war, ausgeschlossen.
Von den verbleibenden 39 Gewebeproben zeigte sich die Mehrzahl (87,2%) als platinsensibel, lediglich 7,7% waren platinresistent (siehe Abbildung 9).
Abbildung 9: Platinsensibilität bei 39 untersuchten Gewebeproben
35
3.3. AKT- und P-AKT-Konzentration
Die chirurgische Therapie der Ovarialkarzinompatientinnen erfolgte bei 43 Gewebeproben als Primäreingriff (43,4%). Bei weiteren 56 Fällen (56,6%) war die Probenahme im Rahmen eines Rezidiveingriffs vorgenommen worden.
Es konnten allerdings nicht von allen oben genannten Gewebeproben erfolgreich
Untersuchungen hinsichtlich der AKT- und P-AKT-Bande erfolgen. Bei insgesamt 76
Gewebeproben war eine AKT-Bestimmung möglich.
Der durchschnittliche AKT-Wert lag bei Geweben, die im Rahmen von Primäreingriffen gewonnen worden waren, etwas höher als bei Proben aus Rezidiveingriffen, jedoch
zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen Gewebeproben aus einer Primäroder Sekundär-operation (Mann-Whitney: p = 0,8746). Demgegenüber war der durchschnittliche P-AKT-Wert von Proben aus Sekundäreingriffen deutlich höher als jener
von Gewebeproben aus Primäreingriffen, aber auch hier ergab sich kein signifikanter
Unterschied der P-AKT-Bande zwischen den Gewebeproben, die bei einem Primärbzw. Sekundäreingriff gewonnen wurden (Mann-Whitney: p = 0,3408) - siehe auch
Tabelle 2.
Tabelle 2: AKT- und P-AKT-Konzentration bei primär und sekundär operierten Fällen
Parameter
AKT
P-AKT
Primäroperation
Min-Max
n
n mean + SEM Med
32 648,6 + 120,6 524,2 0,14 - 3224,5 44
38 662,7 + 122,8 371,9 17,8 - 3673,6 46
Sekundäroperation
mean + SEM
Med
Min-Max
626,0 + 85,2
445,3
13,6 - 2670,3
604,3
18,2 - 4439,7
752,2 + 115,8
36
3.4. Korrelation zwischen den Proteinkonzentrationen von AKT und P-AKT mit
verschiedenen Krankheitsparametern
3.4.1. AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zum FIGO-Stadium
Ein Zusammenhang zwischen dem FIGO-Stadium der Gewebeproben und der AKTKonzentration war nicht festzustellen. Es fand sich diesbezüglich kein signifikanter
Unterschied (vgl. Abbildung 10 und Tabelle 3).
Abbildung 10: AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom FIGO-Stadium (73 Gewebeproben); Boxplot-Graphik
37
Es fand sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied der P-AKT-Konzentration
zwischen den unterschiedlichen FIGO-Stadien der auswertbaren Gewebeproben (siehe
Abbildung 11 und Tabelle 3).
Abbildung 11: P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom FIGO-Stadium (81
Gewebeproben); Boxplot-Graphik
Tabelle 3: AKT- und P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom FIGO-Stadium
FIGOAKT-Konzentration
P-AKT-Konzentration
Stadium
Min-Max
n mean + SEM
Med
Min-Max
n
mean + SEM Med
FIGO I
906,3
3
18,2 - 1793,5
381,5 + 198,8 427,4 16,4 - 700,6 3 906,0 + 512,5
FIGO II
454,8 + 177,8 324,4 77,8 - 1061,5 7 397,8 + 139,3
304,5
5
17,9 - 1035,8
FIGO III 49 713,4 + 94,8 535,7 0,1 - 3224,5 55 781,7 + 111,8
567,9
22,3 - 4439,7
FIGO IV 16 421,7 + 76,5 317,7 14,5 - 1066,9 16 422,7 + 93,4
302,1
80,8 - 1329,9
p-Wert1)
0,4371
0,2239
1)
Kruskal-Wallis-Test
38
3.4.2. AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zum Grading
Zwischen den unterschiedlichen Grading-Stufen der auswertbaren OvarialkarzinomGewebeproben fand sich kein statistisch signifikanter Unterschied der AKT-Konzentration (vgl. Abbildung 12 und Tabelle 4).
Abbildung 12: AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom Grading (68 Gewebeproben); Boxplot-Graphik
39
Es fand sich ebenfalls kein signifikanter Unterschied der P-AKT-Konzentration
zwischen den vier Grading-Stufen bei den Ovarialkarzinom-Gewebeproben (siehe
Abbildung 13 und Tabelle 4).
Abbildung 13: P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom FIGO-Stadium
(73 Gewebeproben); Boxplot-Graphik
Tabelle 4: AKT- und P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit vom Grading
Grading
AKT-Konzentration
Min-Max
n
mean + SEM Med
G1
3 238,6 + 195,5 68,9
18,4 -628,6
G2
20 511,1 + 142,1 373,2 0,1 - 2670,3
G3
41 679,3 + 95,0 535,7 14,4 - 3224,5
G4
4 1143,9 + 479,6 986,2 248,7 - 2354,8
p-Wert1)
0,1498
1)
Kruskal-Wallis-Test
P-AKT-Konzentration
n mean + SEM
Med
Min-Max
245,5
62,8 - 330,5
4 221,1 + 61,3
466,5
17,8 - 4439,7
23 699,5 + 197,0
570,6
35,7 - 3673,6
41 729,6 + 105,9
527,9
205,5 - 2039,2
5 792,6 + 330,8
0,2478
40
3.4.3. AKT- und P-AKT-Konzentration in Relation zur Platinsensibilität
Die AKT-Konzentration unterschied sich nicht statistisch signifikant zwischen
Ovarialkarzinom-Gewebeproben von Tumoren mit unterschiedlicher Platinsensibilität
(vgl. Abbildung 14 und Tabelle 5).
Abbildung 14: AKT-Konzentration in Abhängigkeit von der Platinsensibilität des
Ovarialkarzinoms (30 Gewebeproben); Boxplot-Graphik
41
Auch die P-AKT-Konzentration zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen
Gewebeproben aus unterschiedlich platinsensiblen Ovarialkarzinomen (vgl. Abbildung
15 und Tabelle 5).
Abbildung 15: P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit von der Platinsensibilität des
Ovarialkarzinoms (34 Gewebeproben); Boxplot-Graphik
Tabelle 5: AKT- und P-AKT-Konzentration in Abhängigkeit von der Platinsensibilität
PlatinAKT-Konzentration
sensibilität n
Min-Max
mean + SEM Med
resistent
3 599,0 + 341,4 568,0 23,9 - 1205,2
intermediär 2 740,3 + 306,4 740,3 433,9 - 1046,7
sensibel
25 708,5 + 127,5 535,7 0,1 - 2670,3
p-Wert1)
0,9661
1)
Kruskal-Wallis-Test
P-AKT-Konzentration
n mean + SEM
Med
Min-Max
2 1218,7 + 51,6 1218,7 1167,1 - 1270,4
771,9
872,7 - 1543,7
2 771,9 + 100,8
544,1
22,3 - 4439,7
30 782,5 + 158,7
0,2265
42
3.4.4. Korrelation der AKT-Konzentration mit der prä- und postoperativen Ca-125Konzentration
Eine Korrelation zwischen der AKT-Konzentration und der präoperativ gemessenen
Konzentration des Tumormarkers Ca-125 lag nicht vor (siehe Abbildung 16).
Abbildung 16: Korrelation (Spearman) zwischen AKT-Konzentration und präoperativer
Ca-125-Konzentration (57 auswertbare Gewebeproben)
Präoperativ war der Ca-125-Serumspiegel bei 10 Proben unter der Norm von 35 U/ml
gelegen, bei 66 Gewebeproben jedoch über der Norm. Daten sowohl zum CA-125Spiegel als auch zur AKT-Konzentration lagen präoperativ aber nur bei 57 Proben vor.
Bei fünf dieser 57 Proben war der präoperative Tumormarker unauffällig und bei 52
über der Norm gewesen, die korrespondierenden AKT-Konzentrationen betrugen im
Durchschnitt 242,4 + 76,4 bzw. 596,3 + 83,8, unterschieden sich aber nicht signifikant
(Mann-Whitney: p = 0,2713).
43
Eine Korrelation zwischen der AKT-Konzentration und der postoperativ gemessenen
Konzentration des Tumormarkers Ca-125 war ebenfalls nicht feststellbar (siehe
Abbildung 17).
Abbildung 17: Korrelation (Spearman) zwischen AKT-Konzentration und postoperativer Ca-125-Konzentration (39 auswertbare Gewebeproben)
Postoperativ war der Ca-125-Serumspiegel bei 5 Proben unter der Norm von 35 U/ml
gelegen, bei 47 Gewebeproben jedoch über der Norm. Daten sowohl zum CA-125Spiegel als auch zur AKT-Konzentration lagen präoperativ aber nur bei 43 Proben vor.
Bei drei dieser 43 Proben war der postoperative Tumormarker unauffällig bzw. bei 40
über der Norm gewesen. Die entsprechenden AKT-Konzentrationen betrugen im
Durchschnitt 1546,4 + 928,6 bzw. 556,5 + 84,9, unterschieden sich aber nicht
signifikant (Mann-Whitney: p = 0,3908).
44
3.4.5. Korrelation der P-AKT-Konzentration mit der prä- und postoperativen Ca-125Konzentration
Eine Korrelation zwischen der P-AKT-Konzentration und der präoperativ gemessenen
Konzentration des Tumormarkers Ca-125 lag nicht vor (siehe Abbildung 18).
Abbildung 18: Korrelation (Spearman) zwischen P-AKT-Konzentration und präoperativer Ca-125-Konzentration (62 auswertbare Gewebeproben)
Präoperativ war der Ca-125-Serumspiegel bei 10 Proben unter der Norm von 35 U/ml
gelegen, bei 66 Gewebeproben jedoch über der Norm. Daten sowohl zum CA-125Spiegel als auch zur P-AKT-Konzentration lagen präoperativ aber nur bei 62 Proben
vor.
Bei neun dieser 62 Proben war der präoperative Tumormarker unauffällig und bei 53
über der Norm gewesen, die korrespondierenden P-AKT-Konzentrationen lagen im
Mittel bei 341,1 + 89,3 bzw. 653,3 + 92,4, unterschieden sich aber nicht signifikant
(Mann-Whitney: p = 0,2424).
45
Es war ebenso keinerlei Korrelation zwischen der P-AKT-Konzentration und der
postoperativ gemessenen Konzentration des Tumormarkers Ca-125 ermittelbar (siehe
Abbildung 19).
Abbildung 19: Korrelation (Spearman) zwischen P-AKT-Konzentration und postoperativer Ca-125-Konzentration (39 auswertbare Gewebeoproben)
Postoperativ war der Ca-125-Serumspiegel bei 5 Proben unter der Norm von 35 U/ml
gelegen, bei 47 Gewebeproben jedoch über der Norm. Daten sowohl zum CA-125Spiegel als auch zur AKT-Konzentration lagen präoperativ aber nur bei 43 Proben vor.
Bei drei dieser 43 Proben war der postoperative Tumormarker unauffällig bzw. bei 40
über der Norm gewesen. Die entsprechenden AKT-Konzentrationen betrugen im
Durchschnitt 1614,3 + 1072,8 bzw. 639,0 + 127,1, unterschieden sich aber nicht
signifikant (Mann-Whitney: p = 0,3809).
46
3.4.6. Korrelation der AKT- und der PAKT-Konzentration mit der rezidivfreien
postoperativen Überlebenszeit
Bei 59 Gewebeproben war das postoperative rezidivfreie Überleben der Patientin und
der AKT-Gehalt bekannt. Bei 68 Gewebeproben lagen Daten zum P-AKT-Gehalt und
gleichzeitig zum postoperative rezidivfreien Überleben vor. Diese Überlebenszeitspanne wurde mit dem AKT- und dem PAKT-Gehalt korreliert. Es zeigte sich jedoch
bei keinem der beiden Proteingehalte eine signifikante Korrelation mit der rezidivfreien
Überlebenszeit (vgl. Abb. 20).
Abbildung 20: Korrelation der AKT- und der P-AKT-Konzentration mit dem
rezidivfreien postoperativen Überleben (Monate)
47
3.4.7. Korrelation der AKT- und der P-AKT-Konzentration mit dem postoperativen
progessionsfreien Überleben
Bei 16 Gewebeproben war das postoperative progressionsfreien Überleben der
Patientin und der AKT-Gehalt bekannt. Bei weiteren 19 Gewebeproben lagen Daten
zum P-AKT-Gehalt und gleichzeitig zum postoperativen progressionsfreien Überleben
vor. Das progressionsfreie Überlebens wurde mit dem AKT- und dem PAKT-Gehalt
korreliert, zeigte aber in beiden Fällen keinen signifikanten Zusammenhang (vgl. Abb.
21).
Abbildung 21: Korrelation der AKT- und der P-AKT-Konzentration mit dem
postoperativen progressionsfreien Überleben (Monate)
4. Diskussion
48
Die Prognose des Ovarialkarzinoms hat sich in den letzten 20 Jahren nicht wesentlich
verändert. Trotz optimalem chirurgischem Management und extensiver Chemotherapie
mit standardisiertem Behandlungsplan, stellt die späte Tumorerkennung und die
Hämoresistenz nach wie vor ein erhebliches Behandlungsproblem dar.
Viele Studien der letzten Jahre haben gezeigt, dass der AKT-Signaltransduktionsweg
essentiell ist für ein ungehemmtes Zellwachstum und ein verlängertes Überleben der
Zellen. Die genannten Wirkmechanismen, die Hemmung der Apoptose und der erhebliche Einfluss auf die Chemoresistenz veranlassen, die Therapiemöglichkeiten einiger
Karzinomarten zu überdenken und neue Wege, vor allem auf molekularer Ebene, zu
begehen.
Während die klinischen und histologischen Prognosefaktoren des Ovarialkarzinoms vor
allem nach chirurgischem Staging und Grading gut bekannt sind, muss der biologische
Prozess, welcher zu ungehemmtem Wachstum führt, genauer beleuchtet werden. Die
Imbalance zwischen Zellwachstum und Apoptose spielt eine wesentliche Rolle und
nicht nur die die Wachstumsrate der Tumorzellen.
Das Ansprechen auf die Chemotherapie ist im ersten Moment erfreulich, da die
Mehrzahl der Patientinnen eine Remission erfährt. Leider entwickeln die meisten
Patientinnen im Verlauf eine Resistenz gegen die jeweiligen Chemotherapeutika. Der
Mechanismus beruht auf einem verändertem Transport der Medikamente zur den
entsprechenden Zellen, der Expression von Multi-Drug Resistance Genen, einer
erhöhten DNA-Reparaturrate und einer verminderten DNA- oder makromolekularen
Schädigung durch die Chemotherapeutika.
Die Studien belegen eine Schädigung der intra- und extrazellulären apoptotischen
Wege als einen der Hauptgründe der Chemoresistenz. Eine gestörte Balance zwischen
Expression oder Aktivierung und Inaktivierung von Zellüberlebensfaktoren und
Tumorsuppressoren, wie zum Beispiel AKT und dessen Up- und DownstreamSubstraten sowie deren Gegenspieler, zeigt die regelmäßige Veränderung der Konzentration dieser Proteine in vielen menschlichen Karzinomen, vor allem auch beim
Ovarialkarzinom.
49
Um die Chemotherapie, den Hauptpfeiler der Therapie des Ovarialkarzinoms, wirksamer eizusetzen und deren langfristige Erfolgsrate zu erhöhen, sind deshalb GenManipulationen, zum Beispiel via Adenoviren, oder eine direkte Hemmung von
Onkogenen durch Antikörper denkbar. Diese Therapieansätze sind in klinischer Erprobung, vor allem sind Antikörper gegen AKT und Peptide, welche an dessen PHterminales Ende binden, anstatt zum Beispiel PI3K, vorhanden und im klinischen
Alltag auf dessen Wirkung zu überprüfen. Durch diesen Therapiezusatz würde die AKT
Konzentration und die Aggressivität der Tumorzellen verringert. Außerdem wurde eine
vermehrte Apoptoserate in verschiedenen Zelllinien beobachtet, sowie vermindertes
Zellwachstum und Überleben der Tumorzellen (Cheng et al. 2002, Liu et al. 2001, Sato
et al. 2000).
Die meisten Forschungsgruppen, die sich vor allem in den letzten 15 Jahren mit der
Proteinkinase AKT und deren Substraten befassten, legten ihr Augenmerk auf die
Erforschung der Bedeutung von AKT in vivo und in vitro auf molekularer Ebene. Es
wurde dann das Ziel verfolgt, die Signaltransduktionswege langer Enzymketten, AKT
vor- und nachgeschaltet, zu erkennen und im Ganzen zu verstehen. Diese Erkenntnisse
wurden genutzt, um die Enzyme den verschiedenen Zellstrukturen zuzuordnen, die
Gegenspieler zu identifizieren, die Lokalisation innerhalb der Zelle zu bestimmen und
die genaue Wirkung auf die verschiedenen Systeme, vor allem in humanen Zellen
darzustellen.
Nur mit diesen Vorarbeiten lässt sich nun die klinische Bedeutung erarbeiten und es
lassen sich die therapeutischen Möglichkeiten für die Zukunft nutzen. Der Weg für
neue Optionen in der Therapie bzw. Therapieverbesserungen und unterstützende
Maßnahmen sind durch diese Studien möglich. Die wenigen Arbeiten, die sich nun mit
der klinischen Relevanz für das Ovarialkarzinom befassen, gehen bevorzugt auf die
quantitative Bestimmung von AKT in Tumorzellen ein, im besonderen auch in
Ovarialkarzinomzellen im Gegensatz zu normalem Stroma. Die qualitative Bewertung
ist jedoch nur im Ansatz erfasst.
Das Patientinnenkollektiv der vorliegenden Studie bestand aus 85 Frauen mit
Ovarialkarzinom, deren mittleres Alter zum Zeitpunkt des ersten operativen Eingriffs
58,4 Jahre betrug. Insgesamt wurden von diesen Patientinnen 99 Proben gewonnen. Die
Mehrzahl der Gewebeproben waren aus einem papillär-serösem Adenom (Zyste)
50
entnommen worden (57,1%). Bei acht Gewebeproben handelte es sich um ein
endometroides Karzinom (8,2%) und bei weiteren fünf Gewebeproben um ein muzinöses Karzinom. Jeweils zwei Gewebeproben stammten aus poly-pleomorphen Karzinomen bzw. einem Granulosazelltumor. Eine Gewebeprobe war einem Borderline-Tumor
entnommen worden. Bei den verbleibenden 24 Gewebeproben lagen nicht näher klassifizierte Ovarialkarzinome vor.
Es wird von einigen Autoren beobachtet, dass vor allem in späten Stadien wie in den
FIGO Stadien III und IV erhöhte AKT Konzentrationen zu finden sind (Noske et al.
2007).
Bei den Proben der eigenen Patientinnen war das FIGO-Stadium nur bei einem Teil der
Proben eruierbar. 12,5% der Proben betrafen Karzinome des FIGO-Stadiums I-II, 2/3tel
betrafen FIGO-Stadium III und lediglich 1/5tel das FIGO-Stadium IV. Mehr als die
Hälfte der Tumoren betraf G3-Tumoren, knapp ein Drittel G2-Tumoren, knapp 10%
G4-Tumoren. G1-Tumoren waren nur selten vorhanden. Allerdings hatte in den
eigenen Proben die AKT- und die P-AKT-Aktivität keinen signifikanten Zusammenhang zum FIGO-Stadium oder zu den Gradingstufen gezeigt. Die AKT-Werte
waren bei den eigenen Proben aus Primäreingriffen leicht, jedoch nicht statistisch
signifikant, höher als bei den Proben aus Rezidiveingriffen. Umgekehrt verhielt es sich
mit der P-AKT-Aktivität. Diese war bei den Primäreingriff-Proben, aber ebenfalls nicht
signifikant, niedriger als bei den Proben aus Rezidiveingriffen. Damit werden die
Befunde von Noske et al. (2007) durch die eigenen Ergebnisse nicht gestützt. Die
mittlere AKT-Konzentrationen lagen bei den Proben aus Primäreingriffen bei 648,6
und jenen aus Sekundäreingriffen bei 626,0. Die P-AKT-Konzentrationen betrugen im
Mittel bei den Proben aus Primäreingriffen 662,7 und jenen aus Sekundäreingriffen
752,2. Die eigenen Ergebnisse lassen also nicht den Schluss zu, dass Ovarialkarzinome
in späteren Tumorstadien höhere AKT- oder P-AKT Konzentrationen aufweisen. Eine
erhöhte AKT-Expression bei fortgeschrittenen Ovarialkarzinomen wird von einigen
Autoren allerdings beschrieben (Noske et al. 2007, Cristiano et al. 2006). Cristiano et
al. (2006) fanden im Rahmen einer Studie an Proben von 92 primären Ovarialtumoren
bei 93% der Proben eine AKT-3-Erhöhung. Noske et al. (2007) beschrieben bei 58%
ihrer 45 primär invasiven Ovarialkarzinom-Proben eine AKT-Expression, wobei die
Werte umso höher ausfielen, je fortgeschrittener der Tumor war.
51
Dies impliziert eine Aufrechterhaltung und Progression des Tumors durch AKT, sowie
eine Überführung in aggressivere Phänotypen, mehr denn die Annahme einer Initiation.
Hier besteht sicherlich noch Bedarf an Studien mit höheren Fallzahlen, um zu
eindeutigen Ergebnissen zu kommen.
Eine der ersten Arbeiten, welche sich mit der quantitativen Erhöhung von AKT in
malignem Tumorgewebe befasste, stammt von Bellacosa et al. (1995). Sie bestimmten
AKT2-Gen-Konzentrationen durch Southern Blot- und Northern Blot-Analyse in
Ovarial- und Mammakarzinomgewebe. Bei einem Patientenkollektiv von 132
Patientinnen mit Ovarialkarzinom beobachteten sie eine AKT2-Erhöhung bei 16
Patientinnen (12,1%) im Southern Blot Verfahren. Ein signifikanter Anstieg wurde bei
undifferenzierten Tumoren festgestellt (4 von 8 Fällen). In einer gesonderten Gruppe
wurden keine AKT-Erhöhungen bei benignen- oder Borderline-Tumoren gefunden (0
von 24 Fällen). In der Northern Blot Analyse fielen nur drei Patientinnen mit AKTErhöhung bei 25 Untersuchten auf. Die Erhöhung wurde im Vergleich zu plazentarer
DNA/RNA gemessen und galt bei densitometrischer Messung ab einer Verdopplung
der Dichte als erhöht. Die meisten Erhöhungen lagen bei 3-5facher Dichte.
Eine leichte AKT Erhöhung ließ sich auch bei Patientinnen über dem 50. Lebensjahr
messen. Ebenso fiel bei der Gruppe mit erhöhten Werten eine erhöhte Mortalität im
Gegensatz zu der Gruppe mit normalen Werten auf (keine signifikante Erhöhung). Dies
lässt auf eine schlechtere Prognose bei AKT-Erhöhung schließen sowie auf eine
aggressivere Tumorform, wenn man die AKT-Erhöhung bei undifferenzierten Tumoren
bedenkt.
Im Vergleich zur oben beschriebenen Messung der DNA und RNA Konzentrationen
von AKT2, wurde in der vorliegenden Studie die AKT-Proteinkonzentration durch
Western Blot Technik, vor allem aber die aktivierte Form als P-AKT bewertet. Man
kann nicht von erhöhten Werten sprechen, da kein „normales“ Gewebe zum Vergleich
herangezogen wurde. In dieser Studie beziehen sich die Daten auf Vergleiche innerhalb
des Kollektivs, welches ausschließlich maligne Ovarialkarzinome beinhaltete. Innerhalb des Patientenkollektivs wurde die AKT/P-AKT-Konzentration bei einer Fallzahl
von insgesamt 84 Patientinnen miteinander verglichen. Zu bedenken ist, dass sich
52
einige Patientinnen im Untersuchungszeitraum mehrfach Operationen unterzogen, so
dass die Probenanzahl auf 99 stieg. Die Dichte wurde am Densitometer gemessen und
die somit errechnete Konzentration in Beziehung zu Überleben, FIGO Stadium,
Grading, Platin-Sensibilität und Erst- und Zweitoperation gesetzt.
Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen den AKT-Konzentrationen der
verschiedenen Parameter festgestellt werden. Die Cox-Überlebensanalyse, in die nur
die 42 Proben einbezogen wurden, bei denen der genaue Zeitraum der Progressionsund Rezidivfreiheit aus den Akten zu ermitteln war, zeigte keine signifikante AKTVeränderung bei kürzeren Intervallen zu Progression und Rezidiv. Es konnten auch
keine signifikant höheren Werte bei Patientinnen mit hohem Grading (n=88) oder
hohen FIGO Stadien (n=82) ermittelt werden, ebenso wenig bei Patientinnen mit
Platinresistenz im Gegensatz zu Patientinnen mit intermediärem Verhalten gegenüber
Platin oder gegenüber Platin-sensiblen Patientinnen (n=39). Ein Trend ließ sich nur in
der Gruppe der sekundär operierten Patientinnen mit im Durchschnitt höheren P-AKTWerten feststellen.
Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass man innerhalb eines erkrankten Kollektivs keine
signifikanten Konzentrationsveränderungen von AKT/P-AKT beobachten kann, die auf
ein vorangeschrittenes Krankheitsstadium oder eine schlechtere Prognose schließen
helfen lassen würden.
Es lässt sich hier allerdings keine Aussage über eventuelle AKT-Erhöhungen insgesamt
im Kollektiv treffen. Da hiervon aber auszugehen ist, dürfen die eigenen Ergebnisse
nicht zur Unterschätzung der Bedeutung von AKT in der Tumorgenese beitragen.
Es bleibt die Frage, ob man wie bei Bellacosa et al. (1995) überhaupt direkt gesundes
mit krankem Gewebe vergleichen kann. Ebenso stellt sich die Frage, ob eine Grenze bei
der Verdopplung der Dichte zur Erhöhung zu ziehen ist. Deshalb war ein Vergleich
innerhalb eines kranken Patientenkollektivs wichtig, um hier eventuelle Prognoseunterschiede und Unterschiede in der Ausprägung des Tumors herauszuarbeiten.
Vergleichbar aufgebaute Studien zu Bellacosa et al. (1995) führten Yuan et al. (2000)
und Sun et al. (2001) in Western Blot Technik zur AKT-Proteingehaltbestimmung
durch. Wie auch die eigene Arbeit, so benutzten auch sie einen Phospho-Ser-473 AKTAntiköper, durch welchen sich die aktivierte Form von AKT (P-AKT) darstellen lässt.
53
Yuan et al. (2000) wiesen eine regelmäßige P-AKT2 Erhöhung bei Patientinnen mit
Ovarialkarzinom nach. Hohe P-AKT Werte fanden sie in 42 von 91 Fällen (46%). Es
wurde von ihnen aber nicht definiert, ab wann die P-AKT Werte als erhöht gelten
können. Zusätzlich untersuchten Yuan et al. (2000) die AKT2-Kinase-Aktivität durch
in vitro Kinase Assay und wiesen eine erhöhte AKT2 Kinase-Aktivität nach. Hier
wurde die Grenze zu normalen Werten bei einer dreifachen Erhöhung festgelegt. Diese
erhöhten Werte fanden sich in 33 von 91 Proben (36,3%) - vor allem bei Tumoren mit
hohem Grading (52,9%) und Staging (FIGO III und IV mit 48,5%). Allerdings fanden
sich keine erhöhten Werte bei Endometrium-, Borderline-, Muzinösen- oder
Granulosazelltumoren. Die Ergebnisse der Studie sprechen für eine Erhöhung der
AKT-Werte bei Tumorprogression und aggressiverem Phänotyp und decken sich mit
den Ergebnissen von Bellacosa et al. (1995). Auch in dieser Studie erfolgt allerdings
kein direkter Vergleich zwischen den einzelnen Patientinnen bzw. keine Beurteilung
der Quantität der Erhöhung.
Ein ähnlicher Studienaufbau findet sich bei Sun et al. (2001). Mit geringeren Fallzahlen
wiesen sie regelmäßig erhöhte P-AKT1-Werte bei Patientinnen mit Ovarialkarzinom
nach. Nach der Aktivitätsuntersuchung der AKT1-Kinase mit einer Erhöhung der
Werte bei 11 von 23 Patientinnen mit serösen Adenokarzinomen erfolgte die Bestätigung der Werte durch die Proteinbestimmung von P-AKT durch Western Blot Technik,
jedoch ohne Angabe einer Grenze der Erhöhung zu normalem Gewebe. Regelmäßig
wurden bei Patientinnen mit erhöhter AKT1-Kinaseaktivität erhöhte P-AKT-Werte
gemessen. In „normalem“ Gewebe (Gewebe nicht benannt) sowie in Gewebe ohne
AKT1-Kinase-Aktivität waren keine P-AKT-Werte messbar.
Es fand sich keine Erhöhung der AKT1-Kinase-Aktivität bei den zwei untersuchten
Borderlinekarzinomen, aber die Mehrheit der erhöhten Werte war in der Gruppe der
Patientinnen mit hohem Staging und Grading zu beobachten. Auch diese Befunde
decken sich mit den vorangegangenen Studienergebnissen bzw. belegen, dass nicht nur
AKT2, sondern auch AKT1 regelmäßig im Gewebe maligner Ovarialtumoren erhöht
vorzufinden ist.
Eine neuere Studie von Altomare et al. (2004) bestätigt diese Vorarbeiten. Es zeigten
21 von 31 Patientinnen (68%) mit Ovarialkarzinom in immunhistochemischen Untersu-
54
chungen mit Antikörpern gegen die phosphorylierte (aktive) Form aller drei AKT
Isoformen an Ser473 erhöhte Werte im Vergleich zu normalem ovariellem Gewebe.
Diese Erhöhungen waren aber von den Autoren nicht eindeutig definiert worden,
sondern lediglich mit „++“ und „+++“ beschrieben worden. Erklärt wird der relativ
hohe Anteil der Patientinnen mit erhöhten Werten durch die Berücksichtigung aller drei
AKT Isoformen. Dies ist zulässig, da vor allem für AKT1 und AKT2 eine Rolle in der
Tumorgenese des Ovarialkarzinoms als erwiesen gelten kann.
Bei 39 Gewebeproben von insgesamt 21 eigenen Patientinnen war aus den
Krankenunterlagen ein Zusammenhang zur Platinsensibilität des Tumors herstellbar.
Dabei zeigte sich die Mehrzahl (87,2%) als Platin-sensibel, lediglich 7,7% waren
platinresistent. Die Ergebnisse der eigenen Studie zeigten allerdings keinerlei
signifikante Zusammenhänge der AKT- und P-AKT-Aktivität zur Platinsensibilität der
Ovarialkarzinome.
Die eigenen Ergebnisse flossen jedoch
in eine weitere Studie unserer
Forschungsgruppe ein. Untersucht wurde hier zusätzlich die Korrelation zwischen dem
Tumorsuppressionsprotein PTEN und der Platinsensitivität von Patientinnen mit
malignem Ovarialkarzinom sowie die Korrelation zwischen der PTEN und P-AKT
Expression in malignen Ovarialkarzinomen (Schöndorf et al. 2003). Im Kollektiv
befanden sich 20 Patientinnen mit fortgeschrittenem Tumorstadium, welche einem
standardisierten Behandlungsverfahren mit radikaler Operation und platinhaltiger
Chemotherapie unterzogen worden waren.
Sieben Patientinnen galten als platinsensibel mit einer Tumorprogressionsfreiheit von
über 12 Monaten. Erfolgte die Progression des Tumors innerhalb der ersten 12 Monate,
galten die Patientinnen als platinresistent, dies war bei 13 Patientinnen des Kollektivs
der Fall. Zum einen zeigte sich in der platinresistenten Gruppe eine signifikante PTENVerminderung sowie in der platinsensiblen Gruppe ein Anstieg der PTENKonzentration. Dieses Ergebnis ist im Zusammenhang mit einigen Arbeiten aus der
Literatur interessant. Yan et al. (2006) verglichen chemosensitive und -resistente
Ovarialkarzinomzelllinien miteinander und stellten fest, dass die PTEN-Überexpression
chemoresistente Ovarialkarzinomzelllinien sensibilisieren konnte. In diesen Prozess ist
eine p53-mediierte apoptotische Kaskade involviert. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen
Selvendiran et al. (2007). Eine Suppression der PTEN-Expression verminderte
55
signifikant die p53- und p21-Spiegel und aktivierte die AKT-Phosphorylisierung, was
zu einer verminderten Apoptoserate und einer erhöhten Zellüberlebensrate führte. Die
Überexpression von PTEN induzierte andererseits aber auch eine Apoptose. Die
Ergebnisse von Selvendiran et al. (2007) bestätigten, dass eine Hochregulation von
PTEN das AKT inhibiert, was wiederum p53-Spiegel stimuliert und damit die
Apoptose fördert.
Eine Studie von Lee et al. (2005b) an verschiedenen Ovarialkarzinomzelllinien führte
zu dem Ergebnis, das ein niedriger Spiegel einer PTEN-Expression mit einer erhöhten
AKT-Aktivierung einhergeht. Eine verminderte PTEN-Expression ging mit einer
Resistenzentwicklung gegen Cisplatin einher. Nach Yang et al. (2006) ist die AKTmediierte Cisplatinresistenz bei Ovarialzellkarzinomen abhängig von der p53Regulation. Ein möglicher Mechanismus der Beeinflussung der Apoptose bei cisplatinresistenten Ovarialzelllinien beschrieben Weir et al. (2007). Sie stellten fest, dass
Curcumin die Proliferation von cisplatinresistenten und -sensitiven menschlichen
Ovarialkarzinomzellen hemmte. Curcumin hemmte auch die Phosphorylierung von
AKT, während die Phosphorylierung von p38 MAPK verstärkt wurde. Zusammengefasst zeigten die Ergebnisse von Weir et al. (2007), dass Curcumin in der Lage ist,
die Proliferation von cisplatinresistenten Ovarialkarzinomzellen durch eine Induktion
von Superoxidbildung und Apoptose zu hemmen. Kim et al. (2007) beschrieben einen
weiteren interessanten Befund, wonach auch Paclitaxel die Anzahl phosphorylierter
AKT-Moleküle bei Ovarialkarzinomzelllinien in einer zeitabhängigen Weise hemmt.
Die Inhibition von AKT durch spezifische Phosphatidylinositol-Kinase-Inhibitoren
erhöhte die Effizienz der Paclitaxel-induzierten Apoptose bei diesen Zelllinien. Dies
lässt den Rückschluss zu, dass die Applikation eines AKT-Inhibitors die therapeutische Effizienz von Paclitaxel bei Patienten mit Ovarialkarzinom eventuell steigern
könnte.
Die AKT- und P-AKT-Bestimmung der eigenen Proben zeigte keinen signifikanten
Zusammenhang zu den prä- oder postoperativen Ca-125-Konzentrationen und auch
keinerlei signifikante Zusammenhänge zum rezidivfreien Überleben oder zum postoperativen progressionsfreien Überleben. Dieses Ergebnis wird von einer Studie von
Wang et al. (2005) bestätigt. An 118 fortgeschrittenen Ovarialkarzinom-Patientinnen
56
zeigte sich, dass 51,6% der Proben positiv für P-AKT waren, wobei allerdings die PAKT-Werte kein statistisch unabhängiger prognostischer Marker waren.
Nakayama et al. (2006) berichteten bei 65 Ovarialtumoren im Fish-Test über eine
18,2%ige Amplifikation von AKT2 bei Karzinomen in höheren Tumorstadien. Daraus
zogen die Autoren den Schluss, dass das AKT2 eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Ovarialkarzinomen spielt. Nach Meng et al. (2006) ist AKT1 bei Ovarialzellkarzinomzelllinien in die Zellbewegung, Invasion und Proliferation involviert. Auch
Woenckhaus et al. (2007) konnten keinen signifikanten Zusammenhang zwischen den
P-AKT-Spiegeln und dem Outcome von 74 Patientinnen mit Ovarialkarzinomen
feststellen. Die Autoren fanden lediglich, dass bei denjenigen Patientinnen, die eine PAKT-Immunoreaktivität zeigten, ein leichter Trend zu einer besseren Überlebensrate
auszumachen war. Es fanden sich aber keine statistischen Signifikanzen. Die Autoren
postulierten eine wichtige Rolle der AKT-Phosphorylierung bei Ovarialkarzinomen.
Verglich man die PTEN-Entwicklung mit den P-AKT-Werten in den vorliegenden
Operationspräparaten, zeigte sich bei 14 der 20 Patientinnen eine inverse Entwicklung
der PTEN- und der P-AKT-Werte. Dies bedeutet eine P-AKT-Erhöhung bei rückläufigen PTEN-Werten.
Zu ähnlichen Ergebnissen auch andere Forschungsgruppen. Sun et al. (2001)
beobachtet eine fehlende PTEN-Expression bei 2 von 11 Patientinnen mit erhöhten
AKT-Werten und zusätzlicher PI 3-Kinase-Aktivierung. Yuan et al. (2000) zeigten
diese Entwicklung bei 3 von 18 Patientinnen auf. Die höhere positive Korrelation in der
vorliegenden Arbeit lässt sich mit der Beschreibung einer Entwicklung in beide
Richtungen erklären. Es wird hier von inverser Korrelation gesprochen, es liegt keine
beschränkte Betrachtungsweise auf nur ansteigende P-AKT-Werte bzw. abfallende
PTEN-Werte vor.
Es zeigt sich, dass die ovarielle Karzinogenese mit einer Verminderung der PTEN
Expression einhergeht, ausgelöst durch verschiedene Faktoren, darunter die
Phosphorylierung (Aktivierung) der Proteinkinase AKT. Es ist bekannt, dass das AKTabhängige Zellüberleben negativ durch PTEN beeinflusst wird. Zellen des Ovarialkarzinoms mit erhöhten AKT-Spiegeln zeigen niedrigere PTEN-Werte mit intensiviertem Transduktionsweg für das Zellüberleben. Es wurde auch demonstriert, dass
57
Patientinnen bei längerem progressionsfreiem Intervall erhöhte PTEN-Werte zeigen,
also die klinische Entwicklung und Ausprägung tatsächlich abhängig zu sein scheint
von Tumorsuppressoren und Aktivatoren.
Gomes und Andrade (2006) berichteten, dass die PTEN-Spiegel weder mit dem
Tumorvolumen noch mit dem Tumorstadium in einem signifikanten Zusammenhang
standen. Sie hatten in ihrer Studie 70 Patientinnen mit Ovarialkarzinomen aufgenommen. Die PTEN-Inaktivierung ist laut Gomes und Andrade (2006) ein sehr
früher Schritt in der Karzinogenese des Ovarialkarzinoms. In einer Untersuchung von
Lee et al. (2005b) an 54 Adenokarzinomen und 23 Borderline-Karzinomen des Ovars
ging eine reduzierte PTEN-Expression mit signifikant höheren Adenokarzinomstadien
im Vergleich zu den Borderline-Tumoren einher. Eine verminderte PTEN-Expression
bei den Adenokarzinomen korrelierte jedoch nicht mit dem FIGO-Stadium. Auch Lee
et al. (2005b) hielten Veränderungen des PTEN-Gens für einen wichtigen, tumorauslösenden Faktor. Willner et al. (2007) berichteten bei 12 Clearzell-, 26 endometroiden und 51 serösen Ovarialkarzinomen über den Einfluss verschiedener Marker,
u.a. PTEN. PTEN-Mutation waren bei low-grade-Karzinomen häufiger. In einer Studie
von Sui et al. (2006) war die PTEN-Expression von benignen zu malignen Stadien des
Ovarialkarzinoms vermindert und zwar statistisch signifikant. Ferner zeigte sich eine
inverse Korrelation zwischen der PTEN-Expression und des Survivins. Die PTENExpression korrelierte signifikant mit dem Tumorgrading, des histologischen Subtypes, dem Vorliegen von Aszites. Ferner zeigte sich eine signifikante Korrelation
zwischen einer verminderten PTEN-Expression und einem schlechteren Gesamtüberleben.
Der jeweilige Einfluss der Proteine der an der Tumorgenese beteiligten Enzymketten
bei verschiedenen Individuen erweist sich als sehr unterschiedlich. Dies zeigen alle
angeführten Studien durch die fehlende Ausschließlichkeit der Ergebnisse in
verschiedenen Untersuchungen. Natürlich existieren zahlreiche unbekannte und wenig
erforschte Einflüsse, sowie persönliche Ausprägungen und Determinationen.
Große Anstrengungen werden deshalb unternommen, das chemotherapeutische Regime
zur Behandlung des Ovarialkarzinoms zu intensivieren und zu verbessern. Ein Erfolg
wird sicher auf molekularer Ebene zu erzielen sein, da nun zahlreiche Wege bekannt
sind, um in einige der Transduktionswege einzugreifen. Dies wäre zum Beispiel durch
58
eine Hemmung des AKT-Signaltransduktionsweges denkbar, vor allem durch Antikörper als antineoplastische Therapie oder durch Unterstützung der PTEN regulierten
Wege, zum Beispiel über Hemmung von PI3K, den direkten Antagonisten von PTEN.
All diese Ansätze beschränken ihre Wirkung auf proliferierende Tumorzelllinien in
fortgeschrittenen Karzinomen, was bedeutet, dass gesundes Gewebe geschont würde.
Außerdem würde durch eine solche additive Therapie der Effekt der platinhaltigen
Chemotherapeutika auf die Tumorzellen intensiviert werden.
Die Verlängerung des Intervalls zu Progression des Tumors oder zur Entwicklung eines
Rezidivs ist für jede Patientin von essentieller Bedeutung und speziell beim
Ovarialkarzinom ein lohnenswertes Ziel, um die Überlebenszeit zu verlängern und
Lebensqualität zu verbessern.
59
5. Zusammenfassung
Die Prognose des Ovarialkarzinoms hat sich in den letzten Jahrzehnten nur
unwesentlich verändert. Ein großes Problem der Therapie des Ovarialkarzinoms ist die
Resistenz auf platinhaltige Chemotherapeutika. Da aufgrund der schlechten Prognose
des Ovarialkarzinoms auf der Basis von Chemotherapieresistenz und später Diagnose
erheblicher Forschungsbedarf besteht, versucht man, die Chemosensilbilität vo
Ovarialkarzinomen zu erhöhen. Einen möglichen Ansatz stellen Signaltransduktionswege der Proteinkinase AKT dar. In der vorliegenden Arbeit wurde das Protein
AKT und dessen phosphorylierte Form P-AKT aus 99 Tumorproben von Ovarialkarzinompatientinnen isoliert. Die Konzentrationen wurden mit verschiedenen biologischen
Parametern und der Rezidivfreiheit in Bezug gesetzt, um somit einen eventuellen
Zusammenhang zwischen Konzentration von AKT und dem Krankheitsverlauf zu
erfassen. Es wurde von einigen Autoren beobachtet, dass vor allem in späten Stadien
erhöhte AKT Konzentrationen zu finden waren. Allerdings hatte in den eigenen Proben
die AKT- und die P-AKT-Aktivität keinen signifikanten Zusammenhang zum FIGOStadium oder zu den Gradingstufen gezeigt. Die AKT-Werte waren bei den eigenen
Proben aus Primäreingriffen leicht, jedoch nicht statistisch signifikant, höher als bei den
Proben aus Rezidiveingriffen. Umgekehrt verhielt es sich mit der P-AKT-Aktivität.
Diese war bei den Primäreingriff-Proben, aber ebenfalls nicht signifikant, niedriger als
bei den Proben aus Rezidiveingriffen. Es konnte auch kein signifikanter Unterschied
zwischen den AKT-Konzentrationen der übrigen untersuchten Parameter festgestellt
werden. Die Cox-Überlebensanalyse, in die nur die 42 Proben einbezogen wurden, bei
denen der genaue Zeitraum der Progressions- und Rezidivfreiheit aus den Akten zu
ermitteln war, zeigte keine signifikante AKT- Veränderung bei kürzeren Intervallen zu
Progression und
Rezidiv. Es konnten auch keine signifikant höheren Werte bei
Patientinnen mit Platinresistenz im Gegensatz zu Platin-sensiblen Patientinnen
festgestellt werden. Ein Trend ließ sich nur in der Gruppe der sekundär operierten
Patientinnen mit im Durchschnitt höheren P-AKT- Werten feststellen.
Die eigenen Ergebnisse zeigen, dass man innerhalb eines erkrankten Kollektivs keine
signifikanten Konzentrationsveränderungen von AKT/P-AKT beobachten kann, die auf
60
ein vorangeschrittenes Krankheitsstadium oder eine schlechtere Prognose schließen
helfen lassen würden.
Es lässt sich hier allerdings keine Aussage über eventuelle AKT-Erhöhungen insgesamt
im Kollektiv der Ovarialkarzinompatientinnen treffen. Da hiervon aber auszugehen ist,
dürfen die eigenen Ergebnisse nicht zur Unterschätzung der Bedeutung von AKT in der
Tumorgenese beitragen.
61
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Lebenslauf
PERSÖNLICHE DATEN:
Name:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Staatsangehörigkeit:
Familienstand:
Adresse:
Ines Kristin Middel
15.03.1977
Mainz
deutsch
ledig
Siedlungsstr. 9, 65719 Hofheim
SCHULBILDUNG:
1983 – 1987
1987 – 1996
1996
Taunusblick- Grundschule, Wallau
Elly- Heuss- Gymnasium, Wiesbaden
Abitur
HOCHSCHULBILDUNG:
WS 1998/ 99WS 2000/ 01
5 Semester des Medizinstudiums an der Freien Universität
Berlin
SS 2001- 2005
Beendigung des Medizinstudiums an der Universität zu Köln
BERUFSTÄTIGKEIT:
2005
Assistenzärztin im chirurgischen Zentrum der Asklepios
Paulinen Klinik Wiesbaden, bis heute
SPRACHKENNTNISSE:
Englisch:
sehr gut in Wort und Schrift
Französisch: gut in Wort und Schrift
Hofheim, den 12.03.2009