02 Lichtmikroskopie Beleuchtung - Institut für Biomedizinische Optik
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Master MIW University of Lübeck Biomedizinische Optik II Optik des Mikroskops Einfluss der Beleuchtung auf Auflösung, Kontrast und Bildstrukturen Alfred Vogel / April 2012 Strahlengang im modernen Mikroskop & konjugierte Ebenen Abbildung Leuchtfeldblende Objekt Zwischenbild Objektiv Retina Okular Beleuchtung Lampenfilament Kollimator Aperturblende Augenpupille Hintere Brennebene Objektiv Kondensor Köhlersche Beleuchtung Bild der Lichtquelle in vorderer Brennebene des Kondensors von jedem Punkt der Lichtquelle ausgehend entsteht ein paralleles Strahlenbündel, welches das gesamte Objekt gleichmäßig beleuchtet Kondensor muß so positioniert sein, das er die Leuchtfeldblende scharf in die Objektebene abbildet gleichmäßige Beleuchtung des Objekts mit scharfer Berandung Feldlinse Abbildungsstrahlengang Zweistufige Abbildung mit Gesamtvergrößerung Vges = VObjektiv x VOkular Optimale Stellung der Kondensorblende • Das Auflösungsvermögen ist maximal bei voll geöffneter Blende: d min NAObj NABel • Der Kontrast verbessert sich bei Abblendung des Kondensors • Bei Abblendung des Kondensors tauchen falsche Strukturen auf Kondensorblende offen Blende etwas geschlossen Blende weit geschlossen ? Was ist die optimale Einstellung der Kondensorblende? ? Woher rühren Kontrastveränderung und falsche Strukturen? Einfluss der Beleuchtung auf die mikroskopische Abbildung ? Auflösungsvermögen und Kondensorapertur Geöffnete Kondensorblende Weitgehend geschlossene Blende 10 µm Der Auflösungsverlust kann maximal einen Faktor 2 betragen. Er ist besonders deutlich sichtbar bei Strukturen an der Auflösungsgrenze ! Räumliche Kohärenz Erweiterung unserer Kohärenzdefinition auf zwei beliebige Wellen ergibt die den Begriff der räumliche Kohärenz (Kreuzkorrelationsfunktion) Bei fester Phasenbeziehung zwischen den Strahlern Q 1 und Q2 (zeitl. Kohärenz) gibt es ein wohldefiniertes Interferenzmuster auf dem Schirm. Haben wir eine “inkohärente” Lichtquelle mit regellos schwankender Phase zwischen Q 1 und Q2 , dann überlagern sich die Felder so, dass man im Mittel nur die Summe ihrer Intensitäten misst. Die Interferenzterme, deren Werte sich ständig ändern, mitteln sich heraus. Wir müssen also die Intensitäten auf dem Schirm addieren. Interferenzstreifen sind dann sichtbar, wenn die beiden von Q 1 und Q2 erzeugten Streifenmuster nicht zu weit gegeneinander verschoben sind, z.B. nicht die Maxima des einen Systems auf die Minima des anderen fallen. Dies ist der Fall, wenn Formulierungen der räumlichen Kohärenzbedingung d = Gitterkonstante Räumliche Kohärenz, falls Mikroskopbeleuchtung Bei welcher Gitterkonstante im Objekt ist die räumliche Kohärenzbedingung erfüllt?: Für NA = 0,65 ist = 81° und d = 0,25 µm Für NA = 0,05 ist = 5,7° und d = 2,5 µm Partielle Kohärenz ist bereits bei NA > 0,05 bzw. Strukturen > 2,5 µm erreicht ! Kohärente und inkohärente Schatten: Fresnelsches Beugungsbild Beugung mit kohärentem Licht Raumfrequenz der Oszillation nimmt mit wachsendem Abstand von der Kante zu Nahfeld-Beugung mit inkohärentem Licht Inkohärente Schatten von großen Objekten im Sonnenlicht Fresnelsches und Fraunhofersches Beugungsbild im Mikroskop - weißes Licht, geschlossene Kondensorblende (parallele Beleuchtung), kleine Objekte - Fokussierte und defokussierte kohärente Abbildung von Kanten fokussiert: Gibbssches Phänomen (konstante Raumfrequenz, abh von cutoff Frequrenz) defokussiert: Fresnel-Beugung Kohärente und inkohärente Kantenfunktion bei scharfer Abbildung Kohärente Abbildung Inkohärente Abbildung Intensität El. Feld Kantenbreite hängt ab von Punktbildbeite Intensität Oszillationen sind im Schattenbereich kaum sichtbar Ideale Kantenposition Optische Übertragungsfunktion Ideale Kantenposition http://www.tu-ilmenau.de/fakmb/fileadmin/template/fgto/Lehre/Vorlesung_Zeiss/2.4_Linien_und_Kanten.pdf Gibbssches Phänomen Entwickelt man eine Fourierreihe aus einer unstetigen Funktion mit Sprungstellen, so ergeben sich an den Unstetigkeitsstellen typische Über- und Unterschwinger, die sich auch dann nicht verringern, wenn man versucht, die Funktion durch weitere Summenglieder anzunähern. Die relative Höhe des Überschwingers in einer Richtung, bezogen auf die halbe Sprunghöhe, lässt sich im Grenzwert unendlich vieler Fourier-Summenglieder bestimmen zu: womit sich ein prozentueller Fehler von etwa 18% der Sprunghöhe ergibt. n=5 n = 25 n = 125 Für n ∞ strebt die Höhe der Über- und Unterschwinger strebt gegen einen konstanten Grenzwert aber die Breite gegen Null. Somit strebt die Abweichung von der Zielfunktion ebenfalls gegen Null. Bei Abbruch der Reihe (endliches n) werden die Überschwinger sichtbar. http://en.wikipedia.org/wiki/Gibbs_phenomenon Falsche Strukturen vor einer Stoßwelle bei kohärenter Abbildung 30 ps, 400 µJ Raumfrequenz der Oszillationen ist annähernd konstant – anders als bei Fresnelbeugung 100 µm Punktbildduchmesser 3,5 µm Optische Übertragungsfunktion Der scharfe Abfall der kohärenten Übertagungsfunktion erzeugt ein Überschwingen an Bildkanten (Gibbssches Phänomen; tritt bei inkohärenter Abbildung und Apodisation nicht auf) Kohärente und inkohärente Übertragungsfunktion Übertragene Beugungsordnungen 1 kohärente Beleuchtung 2 inkohärente Beleuchtung (große NA der Beleuchtung) 1 2 1. Ordnung 2. Ordnung 0. Ordnung 1. Ordnung -1. Ordnung 0. Ordnung 2 1 2’ Beleuchtungs-NA = 0: Überragung von Raumfrequenzen bis f 0, gebeugtes Licht von feineren Gitterstrukturen mit höherer Raumfreuenz geht an der Abbildungslinse vorbei Große NA der Beleuchtung: Auch hohe Raumfrequenzen bis 2 f 0 werden noch übertragen, aber nur durch Beugung von den Großwinkel-Anteilen des Beleuchtungslichtes Kontrastabnahme Fokussierte und defokussierte Abbildung Auflösungsplatte bei unterschiedlichen Stellungen der Kondensorblende (40x, NA = 0,6) Kleinste Öffnung Defokus 1/3 geschlossen offen Defokus 0 µm 0 µm 3 µm 3 µm 6 µm 6 µm 9 µm 9 µm Fokussierte und defokussierte Abbildung Auflösungsplatte bei unterschiedlichen Stellungen der Kondensorblende (40x, NA = 0,6) Kleinste Öffnung 1/3 geschlossen offen 0 µm 0 µm 3 µm 3 µm 6 µm 6 µm 9 µm 9 µm Umspringen von Hell-Dunkel bei Defokussierung ! Defokussierung und Aberrationen im Formalismus der Fourieroptik Der Einfluss der Apertur der abbildenden Linse wird als Multiplikation des Raumfrequenzspektrums mit der Pupillenfunktion beschrieben. Der Einfluss von Aberrationen, speziell dann wenn sie Phasenfehler betreffen, kann durch Multiplikation mit einer generalisierten Pupillenfunktion beschrieben werden . Als einfaches Modell für Aberrationen kann man die Auswirkung von Defokussierung auf das Raumfrequenzspektrum betrachten. Die Defokussierung führt dazu, dass die Weglängen zwischen Objekt- und Bildpunkt nicht mehr für die gesamte Linsenapertur gleich groß sind, sondern eine Funktion des Abstandes von der optischen Achse werden. Die hierdurch bedingten Abweichungen von der phasenrichtigen Überlagerung in der Bildebene können durch eine Veränderung der Übertragungsfunktion (bzw. Der generalisierten Pupillenfunktion) ausgedrückt werden. Wenn man die generalisierte Pupillenfunktion kennt, kann man durch geeignete Filterung auf der optischen Bank oder im Rechner die Phasenverzerrung wieder rückgängig machen Zentrum Siemensstern,fokussiert (Raumfrequenz nimmt kontinuierlich nach innen zu) 20 mm defokussiert (f = 400 mm) Optische Transferfunktion (OTF) für defokussierte Abbildung OTF entlang der Raumfrequenzachse fx für verschiedene Werte des Parameters Wm/ Dabei ist Wm der maximale Fehler der optischen Weglänge durch Defokussierung. Die Berechnung wurde zur Vereinfachung für eine quadratische Apertur durchgeführt. Goodman: Introduction to Fourier Optics, 3rd Ed, p. 150 Defokussierung und Aberrationen im Formalismus der Fourieroptik 40 mm defokussiert (f = 400 mm) 80 mm defokussiert (f = 400 mm) Durch die Phasenverzerrung bei Defokussierung nimmt die Übertragungsfunktion abwechselnd positive und negative Werte an. Das Vorzeichen wechselt um so häufiger, je stärker die Defokussierung ist. Der Vorzeichenwechsel der Übertragungsfunktion drückt sich als Umspringen der hellen und dunklen Keile in bestimmten Abständen von der optischen Achse aus. Nahe der Nullstellen der Übertragungsfunktion hat diese einen geringen Wert. Dies drückt sich darin aus, dass die Keile des Siemenssterns bei Raumfrequenzen Bereichen des “Umspringens” nur mit schlechtem, Kontrast zu sehen sind. Fokussierte und defokussierte Abbildung Haut-Schnitt bei unterschiedlichen Stellungen der Kondensorblende (100x, NA = 1,3) Kleinste Öffnung 1/3 geschlossen offen -1 µm -1 µm 1 µm 1 µm 3 µm 3 µm 5 µm 5 µm 7 µm 7 µm Speckles in kohärentem und partiell kohärentem Licht Mikroskop. Bild mit Weißlicht-Speckles Laser-Speckles Sonnenlicht-Speckles http://www.maa.org/mathland/mathtrek_09_20_04.html Einfluss der Beleuchtung auf die mikroskopische Abbildung • Das Auflösungsvermögen ist maximal bei voll geöffneter Kondensorblende: d min NAObj NABel • Schließen der Blende bewirkt einen Übergang von inkohärenter zu partiell kohärenter Beleuchtung und somit das Auftreten von Interferenzeffekten erhöhter Kontrast, aber auch falsche Strukturen • Akzeptanzwinkel für Streulicht ist geringer bei Beleuchtung mit kleiner NA größere Extinktion durch Objekte die absorbierenden und streuen besserer Kontrast • (Abbildungsfehler des Objektivs fallen bei voller Ausleuchtung des Objektives stärker ins Gewicht als wenn nur das vom Objekt gebeugte oder gestreute Licht durch den Randbereich des Objektivs fällt weniger Kontrast.) Kondensorblende offen Blende etwas geschlossen Blende weit geschlossen Die Säume im rechten Bild rühren von Nahfeldbeugung aus Ebenen leicht außerhalb der Schärfenebene her. Sie werden bei partiell kohärenter Beleuchtung (kleine NA) sichtbar. Optimale Stellung der Kondensorblende + * Der Zilienbesatz * der Epithelzellen der Ductuli efferentes des Nebenhodens lässt sich bei teilweise geschlossener Kondensorblende deutlich besser erkennen. Details der Chromatinstuktur der Zellkerne gehen dann aber verloren. Fibroblasten + des Bindegewebes lassen sich bei offener Kondensorblende besser von den kollagenen Fasern abgrenzen. Die optimale Einstellung hängt vom Einzelfall ab. Faustregel: Kondensorblende etwa 1/3 zuziehen http://130.60.57.53/histologie/histotech/PM09iris.htm Experimente • Laser-Speckle • Schatten von Bleistift im Sonnenlicht auf weißem Papier, Variation des Abstandes (Poissonscher Fleck bzw. Linie) • Weißlichtspeckle auf Fingernagel im Sonnenlicht • Weißlicht- und Regenbogenhologramme
