ChlamydienRohmann - Universität zu Lübeck

Koinfektion von Chlamydia pneumoniae und Haemophilus
influenzae im humanen Lungengewebsmodell
Rohmann K.1, Rupp J.2, Drö
Drömann D.1, Goldmann T.3, Dalhoff K.1
[email protected], 1 Medizinische Klinik III, Universität zu Lübeck, 2Institut für Med. Mikrobiologie und
Hygiene, Universität zu Lübeck, 3Klinische und experimentelle Pathologie, Forschungszentrum Borstel
Einleitung
Chlamydophila pneumoniae (Cpn) und nontypeable Haemophilus influenzae (NTHI) sind häufig vorkommende respiratorische Erreger, die Lungenentzündungen oder chronische Bronchitiden verursachen.
Cpn ist ein obligat intrazellulärer Erreger, der sich nur
innerhalb einer Zelle vermehren kann1).
NTHI ist ein Erreger, der zwar in den Stoffwechsel der
infizierten Zelle eingreift, im Gegensatz zu Cpn aber ein
fakultativ intrazellulärer Erreger ist.2)
Die Lungenentzündung durch Cpn und NTHI kann man zum
einen im Lungengewebe untersuchen, andererseits ist es
möglich, unterschiedliche Zelltypen, die in der Lunge vorkommen, einzeln zu kultivieren. Dabei handelt es sich unter
anderem um Alveolarepithelzellen (A549-Zellen), die die
Luftwege von innen auskleiden, und ortsansässige Fresszellen
(Alveolarmakrophagen). Beide Zellpopulationen haben
Kontakt zu eindringenden Mikroorganismen und reagieren
unterschiedlich auf den Schaden, den die Bakterien ihnen
zufügen.
Schematische Darstellung des in vitro Infektionsmodells
humaner Lungenschnitte.
Fragestellung und Ziele
A
B
In situ Hybridisierung auf NTHI DNA in in vitro infizierter humaner Lunge
(Anti-DIG-AP-Neufuchsin; 400x). Die Anfärbung von Alveolarmakrophagen (A,
schwarzer Pfeil) und Typ II Epithelzellen (B, roter Pfeil) ist dargestellt.
Respiratorische Infektionen durch Cpn und NTHI sind schon
lange Gegenstand der Forschung. In unserem Projekt wurde
die Hypothese untersucht, ob eine Koinfektion von Cpn und
NTHI eine Steigerung der Cpn-Infektion und der Entzündungsreaktion bewirkt.
In unserem Modell werden die Zellen zunächst mit Cpn
infiziert, da diese in der Zelle persistieren.
Außerdem beeinflussen sie die Zelle so, dass es für den
zweiten Erreger (NTHI) leichter ist, die Zelle zu infizieren.
Auf welchem Weg diese Hilfestellung durch die
Chlamydien geschieht, ist ebenfalls Gegenstand des
Projektes.
Material und Methoden
1.) Zellkultur und Life-Death-Färbung
A549-Zellen teilen sich unter Zellkulturbedingungen permanent. Für die Versuche werden die Zellen gezählt und mit einer
bestimmten Konzentration von Cpn und NTHI infiziert. Dass
die Zellen die Infektion überleben, zeigt die Life-Death-Färbung
mit zwei verschiedenen Farbstoffen.
Die grünen Zellen sind lebendig und werden mit dem Farbstoff
SYTO 16 angefärbt. An die toten Zellen lagert sich der
Farbstoff Ethidium-Homodimer-2 an und färbt sie rot.
Aus Monocyten, die aus menschlichem Blut isoliert werden,
entwickeln sich durch Zugabe der Wachstumsfaktoren IL-4
und GM-CSF die Makrophagen für unseren Versuch.
2.) Western Blot
Im Western Blot werden Proteine (=Eiweiße) nachgewiesen,
die für die Signaltransduktion (=Nachrichtenübermittlung)
innerhalb der Zellen zuständig sind.
3.) Elisa
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) kann
Proteine nachweisen, die von den Zellen produziert und in
das Medium abgegeben werden.
Untersucht wurden die Chemokine IL-8 und MCP-1 und
der Entzündungsmediator IL-6.
Ergebnisse
Life-Death-Färbung
Western Blot
Elisa
Auf dem Bild sieht man A549-Zellen aus einer 24h-Zellkultur in
RPMI-Medium mit 10% Serumzusatz.
Im oberen Bild sieht man β-Actin, ein Protein, das als
Versuchskontrolle dient, weil es von allen Zellen produziert
wird.
Die Ergebnisse sind beispielhaft dargestellt als Mittelwerte
der IL-8-Sekretion mit positiver Standardabweichung
(* p=0,005 vs. Einzelinfektion mit Cpn, ** p=0,09 vs. Einzelinfektion mit Cpn).
Das untere Bild zeigt die Produktion von phospho p44/42,
einem Botenstoff für den IL-8-Signalweg.
IL-8-Sekretion von A549-Zell en
175kDa
83kDa
62kDa
47,5kDa
pg/ml
Im Durchschnitt überleben über 99% der Zellen bis zu vier Tage
Stimulation. Die Infektion mit Cpn alleine senkt die Überlebensrate nur auf 98%, während sie bei der Koinfektion bis auf 93%
absinken kann.
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
16,5kDa
32,5kDa
120000
105000
90000
75000
60000
45000
30000
15000
0
16,5kDa
NTHI 24h
**
IL-8
Med 72h
25kDa
Cpn 72h +
NTHI 24h
IL-8-Sekreti on von Makrophagen (MDM)
pg/ml
175kDa
83kDa
62kDa
47,5kDa
Cpn 72h
Stimulation der Zellen (n=13)
25kDa
5= Med (2h), 6= Cp (2h), 7= Cp+HAIN 107Keime/ml (2h),
8= Cp+HAIN 106Keime/ml (2h)
IL-8
Med 72h
32,5kDa
1= Med (30min), 2= Cp (30min), 3= Cp+HAIN 107Keime/ml
(30min), 4= Cp+HAIN 106Keime/ml (30min)
*
Cpn 72h
Cpn 72h +
NTHI 24h
NTHI 24h
Stimulation der Zellen (n=5)
Diskussion und Ausblick
Auf den ersten Blick mag es logisch erscheinen, dass eine
Lungenentzündung, die durch zwei Erreger hervorgerufen wird,
eine stärkere Entzündungsreaktion hervorruft als jeweils eine
Einzelinfektion. Die Koinfektion könnte allerdings auch zur
gegenseitigen Hemmung der Erreger führen. Somit ist die
Untersuchung des Verlaufs der Koinfektion von entscheidender
Bedeutung.
Zu den Vorversuchen gehörte die Life-Death-Färbung, die
zeigt, dass ausreichend Zellen die Stimulation überleben.
Weiterhin wurde mittels Western Blot- und Elisa-Technik der
veränderte Stoffwechsel der Zellen untersucht. Im Western
Blot zeigte sich eine vermehrte Expression von phospho
p44/42. Dies ist ein Signalprotein, welches durch Aktivierung
eines Signalweges letztlich zur Produktion von Botenstoffen
führt (z.B. IL-8), die der Zelle bei der Abwehr von
Krankheitserregern helfen oder andere Zellen anlocken.
Die Verstärkung der Entzündungsreaktion durch die
Koinfektion könnte sich durch eine veränderte Expression
von Bakterienrezeptoren erklären, die in der Lage sind,
NTHI zu erkennen. Zu prüfen bleibt, ob eben diese NTHIRezeptoren durch die Cpn-Infektion reguliert werden.
Literatur
1) Yang, J. et al. "Induction of proinflammatory cytokines in human lung epithelial cells during Chlamydia pneumoniae infection." Infect.Immun. 71.2 (2003): 614-20.
2) Wang, B. et al. "Up-regulation of interleukin-8 by novel small cytoplasmic molecules of nontypeable Haemophilus influenzae via p38 and extracellular signal-regulated kinase pathways."
Infect.Immun. 71.10 (2003): 5523-30.
PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com