Instrumentelle Bioanalytik

Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
3.7
3-1
Grundlagen (Einführung, Prinzip und Funktionsabschnitte)
Strukturaufklärung organischer Moleküle
Alternative Ionisierungsverfahren
Alternative Analysatoren
Kopplungstechniken
Tandem-Massenspektrometrie / MS/MS-Prinzip
Massenspektrometrie in der Bioanalytik
10.12.2012
Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen
Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.1 Grundlagen
Einführung
Molekülmassenbestimmung und Elementaranalyse:
früher: (aufwändig, zeitraubend, relativ große Mengen an Reinsubstanz):
Molmassenbestimmung über Dampfdruck- oder Gefrierpunktserniedrigung
Summenformel durch quantitative Elementanalyse (Elementaranalyse)
heute: Molmasse und Summenformel mittels MS (schnell, präzise, mit sehr kleinen
Substanzmengen)
1910/1912: Trennung der Neon-Isotope 20
und 22 durch J.J. Thomson
1919: F.W. Aston baut das erste
funktionierende MS und trennt viele Isotope
(Nobelpreis für Chemie:1922)
Durchbruch als Analysenmethode (in der OC):
um 1960
Im Routinebetrieb (Elektronenstoß-MS): rel.
Molekülmassen bis ca 3500 Dalton
www.pm.ruhr-uni-bochum.de/ pm2008/msg00099.htm
3-2
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.1 Grundlagen
Prinzip des Massenspektrometers
Die zu untersuchende Substanz wird in die Gasphase überführt und ionisiert.
Die Ionen werden durch ein elektrisches Feld beschleunigt und im Analysator nach
dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis auftrennt.
Vier Funktionsabschnitte
-
Probenzuführung (Einlasssystem)
Ionen-Erzeugung (Ionisation)
Massentrennung / Analysator
Ionen-Nachweis / Detektor
HMZ-7-234
Schematische Darstellung
eines Massenspektrometers
KC-5/53
3-3
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3. Massenspektrometrie
3.1 Grundlagen
Funktionsabschnitte MS
Probenzuführung (Einlasssystem)
Substanzprobe unter Normaldruck muss ohne Unterbrechung des Hochvakuums ins
Hochvakuum eingebracht werden
Gas-Einlass für flüssige und gasförmige Proben
Flüssigkeiten werden mittels Mikrospritze direkt durch ein Septum in ein Vorratsbehälter injiziert
oder in einem Glasgefäß ausgefroren.
Gasproben werden durch einen Behälter mit Zerschlagventil und Glasschliffansatz in das
Vorratsgefäß gebracht.
Das Vorratsgefäß (der Probenbehälter) ist heizbar (bis 150°C) und mit der Ionenquelle über
eine Schleuse verbunden.
Direkt-Einlass für Feststoffe und zähflüssige Proben
Probe wird in einem Metalltiegel (Au, Al, 1 mm IØ) mittels Schubstange in eine
Schleusenkammer eingebracht. Nach Evakuierung wird die Schubstangenspitze gekühlt, in die
Ionenquelle geschoben und die Probe über ein Heizelement verdampft.
Probenbedarf: Gaseinlass: 0,1 bis 1 mg; Direkt: 1 bis 100 µg; GC: 10-9 bis 10-15 g
Alternativen: on-line (Kopplungsmethoden):
Verdampfbare Proben lassen sich über einen Gaschromatographen, gelöste Proben z.B. über
einen Flüssigchromatographen einbringen.
3-4
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3. Massenspektrometrie
3.1 Grundlagen
Funktionsabschnitte MS
Ionenerzeugung
Elektronenstoß-Massenspektrometrie: (electron ionization), EI-MS
Molekülstrahl aus dem Einlasssystem trifft in der Ionenquelle auf einen (hochenergetischen)
Elektronenstrahl. Die Potentialdifferenzwischen Glühkathode und Anode ist variabel und kann bis 300 V
betragen. (Niedrigvoltspektren: 12 bis 15 eV; Normalspektren: 60 bis 100 eV, meist 70 eV)
Bildung von positiv geladenen Molekül-Ionen (Radikal-Kationen):
M  e   M  2e 
selten:
M  e  M 2  3 e
Molekül-Ionen werden durch Anlegen einer
Spannung (2 bis 10 kV) beschleunigt und
fokussiert.
(Fokussierung durch elektrostatische Zusatzfelder)
(nicht geladene Moleküle werden aus dem
Spektrometer herausgepumpt)
Geschwindigkeit der Ionen am Spalt:
m  v2
zU 
2
v 
2 zU
m
KC-5/56
Alternativen: -
Druck im Ionenerzeugungsteil: 10-3 bis 10-4 Pa, im Analysatorteil 10-6 bis 10-7 Pa.
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chemische Ionisation
Elektrospray
MALDI
3. Massenspektrometrie
3.1 Grundlagen
Funktionsabschnitte MS
Massentrennung / Sektorfeld-Massenseparator
Auftrennung der Ionen im Feld eines Elektromagneten (Größenordnung 1 Tesla).
Teilchen gleicher Ladung fliegen auf masseabhängigen Ablenkradien, rm:
rm 
mv
zB
B : Magnetfeldstärke
Massenspektrometrische Grundgleichung
m
rm2  B 2

z
2U
Masse-zu-Ladungsverhältnis ist von der
Magnetfeldstärke, dem Ablenkradius und der
Beschleunigunsspannung abhängig.
Auftrennung dreier Ionenmassen in einem
Sektorfeld-Massenseparator;
Magnetfeld B senkrecht zur Zeichenebene
Alternativen:
Elektrostatischer Analysator
Quadrupole
Flugzeit (TOF)
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KC-5-61
3. Massenspektrometrie
Ionen-Nachweis / Detektoren
3.1 Grundlagen
Funktionsabschnitte MS
Konstanthaltung von Beschleunigungsspannung und Magnetfeldstärke:
m
 konst. rm2
z
Verwendung einer Photoplatte (robust, hohes Auflösevermögen) oder
vieler einzelner Kollektoren (Detektorzeile)
Faraday-Detektor (Detektion relativ hoher Ionenströme, billig, genau): Becher aus Edelstahl
( 2x4x4mm), über Hochohmwiderstand fließt die Ionenladung gegen Masse ab.
Beschleunigungsspannung und Ablenkradius konstant:
Magnetfeldstärke wird variiert (scan);
Verwendung eines einzelnen Ionenauffängers.
Sekundärelektronen-Vervielfacher (SEV)
zur Verstärkung der sehr schwachen
Ionenströme.
(Ionen treffen auf die erste Konversionsdynode und
generieren zwei bis drei Elektronen, Elektronenlawine
durch Kaskadierung; empfindlich, kurze Ansprechzeit,
aber begrenzte Haltbarkeit)
Kanalelektronen-Vervielfacher (Channel
Electron Multiplier, CEM) sehr weite Verbreitung
in der MS; kontinuierliche Dynode in Form eines
beschichteten gebogenen Rohres (begrenzte
Lebensdauer)
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m
 konst. B 2
z
3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung organischer Moleküle
Organische Verbindungen fragmentieren unter der Wirkung von Elektronenbeschuss (70 eV).
 Vielzahl von Linien (peaks) für eine Reinsubstanz   Massenspektrum
Massenspektrum ist wie ein „Fingerabdruck“ der Verbindung
[HMZ-7-246]
Stevenson-Regel:
Bei der Fragmentierung spaltet sich das größte
Radikal ab (je größer, desto mehr Schwingungsfreiheitsgrade, umso mehr Energie kann es übernehmen);
Das restliche Fragment bildet meist den Basispeak.
Spektrendarstellung: intensivster Peak des Spektrums
- Basispeak wird auf 100% (relative %) gesetzt, alle anderen
Signale werden entsprechend umgerechnet.
Molekül-Ion - das Signal mit der höchsten Masse
entspricht dem Molekülpeak M 
Gibt die Molekülmasse der untersuchten Verbindung an.
Massenspektrum von Nitropropan (EI, 70eV)
Wenige Ausnahmen:
- sogenannte [M+1]+- oder [M+H]+-Signale; durch Anlagerung eines Protons an Moleküle (selten, häufiger bei Aminen und
Alkoholen),
- Registrierung von [M-R]+-Ionen anstelle von Molekül-Ionen; bei Verbindungen, die leicht zerfallen.
Aromatische Verbindungen z. B. zeigen einen ausgeprägten Molekülpeak, während tertiäre Alkohole oder sehr langkettige
Aliphaten meist überhaupt keinen aufweisen.
3-8
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3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung
Isotope
Die meisten Elemente sind keine Reinelemente, sondern natürlich vorkommende
Isotopengemische. Für organische Verbindungen häufige chemische Elemente:
- Reinelemente: 19F, 31P, 127I
- Elemente mit einem stark überwiegenden Isotop
(> 98%): H(1H), C(12C), N(14N), O(16O)
- Elemente mit zwei häufigen Isotopen
S(32S, 34S), Cl(35Cl, 37Cl), Br(79Br, 81Br)
Je nach Gehalt an diesen Elementen ist
der Molekül-Ionenpeak von einem oder
mehreren Isotopenpeaks begleitet.
Speziell chlorierte und bromierte
Verbindungen weisen ein sehr
charakteristisches Muster auf, das leicht
erkannt werden kann und sich auch zur
automatischen Auswertung gut eignet.
Massenspektrum von 1-Brompropan
3-9
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[B-5d-601]
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3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung
Bestimmung von Summenformeln
Die elementare Zusammensetzung eines Molekül (Molekül-Ions) lässt sich durch die
Bestimmung seiner exakten Masse erhalten  hochauflösende Massenspektrometrie.
Aus den exakten Massezahlen kann mit Computerhilfe die elementare Zusammensetzung
bestimmt werden.
(Anmerkung: Bei Molekülen höhere Masse ist die Zahl der
Kombinationsmöglichkeiten möglicherweise zu groß.)
Auflösungsvermögen:
Niederauflösende Massenspektrometer: 1000 bis 2000
Doppelt fokussierende Geräte: bis 150000 !
(Magnetischer (M) und elektrostatischer (E) Analysator
Doppelfokussierendes MS in der BE-Konfiguration
mit eingebauten Quadrupollinsen
3-10
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[KC-5/62]
3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung
Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle
Typ
Beschreibung
Ausgangs- WiederIon
holung?
Beispiel
a-Spaltung
McLaffertyUmlagerung
retro-Diels-AlderReaktion
[HMZ-7-269/270]
3-11
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3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung
Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle
Typ
Beschreibung
Ausgangs- WiederIon
holung?
Beispiel
Benzyl- oder
Allylspaltung
OniumReaktion
CO-Verlust
[HMZ-7-269/270]
3-12
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3. Massenspektrometrie
3.2 Strukturaufklärung
Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle
Beispiel: -Spaltung
-Bindungen zu Heteroatomen (wie N, S, O, seltener Halogen) werden bevorzugt gespalten,
wobei die Ladung durch das Heteroatom stabilisiert wird.
Wichtigste massenspektrometrische Primär-Fragmentierungsreaktion.
Tritt bei Zerfallsketten in der Regel nur einmal auf (-Spaltung des gebildeten Radikal-Kations zu
energieaufwändig)
Richtwerte für die relative
Stärke, mit der ein Substituent
ladungsstabilisierend wirkt.
(-Spaltung) [HMZ-7-255]
Massenspektrum von 2-Butanon
[HMZ-7-250]
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Hauptfragmentierung 2-Butanon
Konstitutionsformeln
3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Ionisierungsverfahren
Problem EI (Verdampfung und Elektronenstrahl): -Thermolabilität vieler Verbindungen
 Molekülion-Peak oftmals zu schwach ausgeprägt.
- Bioorganische Verb. (mit höherem Molekulargewicht) nicht pyrolysefrei verdampfbar.
- EI nicht mit LC (Flüssig-Chromatographie) kombinierbar.
Für schwer oder nicht verdampfbare Proben wichtige Verfahren:
- Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
- Elektrospray-Ionisation (ESI)
- Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
3.3.1 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)
Die aus einer geheizten Kapillare austretende Lösung
wird bei Atmosphärendruck zu einem feinen Nebel
versprüht. Der Nebel wird durch eine Entladungsnadel
ionisiert, wobei sich hauptsächlich protonierte
Lösungsmittel-Ionen bilden, die durch
Zusammenstöße mit neutralen Molekülen diese
protonieren. Durch elektrische Felder werden die
[M+H]+-Ionen dem Massenanalysator zugeführt
Prinzipskizze: Atmospheric Pressure Chemical Ionization
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[HMZ-7-283]
3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Ionisierungsverfahren
3.3.2 Elektrospray-Ionization (ESI)
Substanzlösung wird durch eine Kapillare in eine Kammer versprüht. Diesem Sprühnebelstrahl
entgegengerichtet strömt ein Trockengas. Zwischen der Kapillare und dem Kammermantel (zylindrische
Elektrode) ist ein Potential von einigen Kilovolt angelegt. Es entstehen geladenen Tröpfchen, die unter
Verdampfung des Lömi kleiner werden. Getrieben durch das elektrische Feld, bewegen sich die geladenen
Tröpfchen durch eine Glaskapillare in den Analysatorvorraum und werden durch elektrostatische
Linsensysteme fokussiert, in den Analysator des Massenspektrometers (z.B. Quadrupol-MS) gelenkt und
analysiert. (Ionisationsquelle: elektrisches Potential)
Bildung von ein- und mehrfach geladene Ionen [M + nH]n+ und [M - nH]n-.
Prinzipskizze Elektrospray-Ionenquelle (Finnigan MAT) [HMZ-7-290]
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3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Ionisierungsverfahren
3.3.3 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)
(LDI:) Photoionisation von Molekülen durch Bestrahlung mit energiereichen Lasern (z.B. gepulster
N2-Laser, 337nm).
Problem: viele Verbindungen absorbieren nur ungenügend.
 Probensubstanz mit einer Matrix vermischen. Matrixmoleküle nehmen die Energie auf und übertragen
diese rasch, ohne dass thermische Zersetzung eintritt, auf die Moleküle der Untersuchungssubstanz. Diese
werden ionisiert und durch äußere elektrische Felder (Ziehblenden) aus dem Gemisch abgezogen.
Wahl der Matrixsubstanz (etwa 1000-facher Überschuss) hängt von der untersuchten Substanz ab.
Allgemein einsetzbar: Zimtsäure oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure.
MALDI: Moleküle mit einem Molekulargewicht bis ca. 1,5 MDa analysierbar (MALDI-TOF-MS, siehe 1.4.x)
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3. Massenspektrometrie
3.3 Ionisierungsverfahren
[HMZ-7-284/285]
3-17
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3. Massenspektrometrie
3.3 Ionisierungsverfahren

Biomakromoleküle

[HMZ-7-284/285]
3-18
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3. Massenspektrometrie
3.4 Alternative Analysatoren
3.4.1 Quadrupol-Massenanalysatoren
Prinzip und Aufbau: Massenselektion im elektromagnetischen Quadrupolfeld (hochfrequenten E-Feldern.)
Quadrupolfilter besteht aus vier konzentrisch und parallel zueinander angeordneten Stabelektroden (etwa
15 cm lang, Ø 6 mm). Werden paarweise, gegenüberliegend an (variabler) Gleichspannung angeschlossen,
der eine modulierbare sinusförmige hochfrequente Wechselspannung überlagert wird  nur Ionen gleichen
Masse (m/z) passieren auf stabilen Wellenbahnen und erreichen den Detektor.
Massenscan durch Variation der Frequenz oder Variation der angelegten Spannungen
Scan-Dauer im ms-Bereich!
Am weitesten verbreitet, da preisgünstig und robust.
Kompakt und schnell genug, ideal für
on-line-Kopplungen, vor allem mit GC.
Auflösungsvermögen: R ≈ 3000 bis 4000
Auch zur Bündelung/Fokussierung von Ionenströmen
und zur Abtrennung Neutralteilchen.
Schema eines Quadrupolmassenfliters mit
stabilen und instabilen Ionenbahnen
3-19
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[KC-5/62]
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3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Analysatoren
3.4.2 Ionenfalle (Ion-trap, IT)
Weiterentwicklung des Quadrupolmassenfilters - dreidimensionale Quadrupolionenfalle.
(Nobelpreis für Physik an W. Paul und H.G. Dehmelt für die IT-Entwicklung, 1989)
Prinzip: Einschluss und Speicherung von Ionen;
Molekülionen zirkulieren auf dreidimensionalen,
stabilen Bahnen innerhalb des
Elektrodenraumes und werden (durch erhöhen
der Umlaufamplitude) nach dem m/z-Verhältnis
sukzessive ausgeschleust und detektiert.
Auch zur gezielten Auswahl bestimmter
Molekülionen für MS/MS/MS (siehe 3.5).
3-20
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3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Analysatoren
3.4.3 Ionenzyklotronresonanz (ICR)
Simultane Massentrennung und -detektion.
Kernstück ist eine Ionenfalle, in der die Ionen über einen längeren Zeitraum mit bestimmter
Umlauffrequenz zirkulieren. Erreicht wird dies durch ein statisches Magnetfeld (1 bis 3 T). Wird ein
elektrisches Wechselfeld eingestrahlt, dessen Frequenz der Umlauffrequenz des Ions entspricht, nimmt
das Ion Energie auf und wird dadurch beschleunigt. Dadurch vergrößert sich die die Ionenkreisbahn
(Spiralbahn nach außen, bis das Wechselfeld weggenommen wird; danach im Prinzip wieder stationäre
Kreisbahn) Die kohärente Kreisbewegung von Ionen gleicher Masse induziert dabei einen Wechselstrom
auf den Empfängerelektroden/platten, der von der Zahl der Ionen in Resonanz abhängig ist.
Das induzierte Frequenzsignal klingt durch Stöße zwischen den Ionen innerhalb kurzer Zeit ab
(transientes Signal im Bereich 0,1 bis 10 s). Durch Scannen der Frequenz können alle Ionen aufeinander
folgend detektiert werden.
Prinzipskizze einer ICR-Zelle /
Prinzipskizze der Energieaufnahme
und der Nachweis einer Ionensorte
[HMZ-7-299]
3-21
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3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Analysatoren
3.4.4 FT-ICR, Fourier-Transformations-ICR
Variante der ICR,
Anregung mit einem Hochfrequenzpuls (ca 5 ms), dessen Frequenz während der Dauer
linear (70 kHz bis 3,6 MHz) anwächst. Über Fouriertransformation des induzierten Stromes
(aller Ionen, Zeitdomänensignal) in Frequenzdomänensignale (10 bis 100 ms) lässt sich
das MS berechnen.
Sehr teure Geräte, die mit supraleitenden Magneten ausgestattet sind (vergl. PFT-NMR)
Massenauflösungen von R ≈ 1000000 erreichbar!
3-22
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3. Massenspektrometrie
3.3 Alternative Analysatoren
3.4.5 Flugzeit-Detektion (Time of Flight, TOF)
Erfordert gepulste Ionenquelle. Die simultan erzeugten Ionen werden durch einen kurzen Spannungsstoß
(etwa 4 bis 35 kV) beschleunigt und auf einer feldfreien Flugstrecke von 0,1 bis 4 m Länge allein durch ihre
massenabhängige Flugzeit (ca 1 bis 100 ms ) unterschieden. (Teilchen gleicher kinetischer Energie fliegen
mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, wenn sie unterschiedliche Masse aufweisen.)
m 2U  t2

z
s2
Die Flugzeit wird aus der Zeitdifferenz von Ionenbildung und Detektorsignal ermittelt. Erfordert
Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Deshalb werden für die Ionenbildung gepulste Quellen, vor allem
Laser eingesetzt.
 MALDI-TOF-MS, siehe auch 3.5.X, inzwischen
routinetaugliche Technik zur
Molekulargewichtsbestimmung von Molekülen hoher
Masse (bis 1,5 MDa) und zur Charakterisierung von
Biopolymeren und von synthetischen Polymeren.)
Massenauflösungen kommerzieller Geräte um 3000;
kann durch Reflektionseinheiten gesteigert werden
(RETOF)
3-23
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3. Massenspektrometrie
3.5 Kopplungstechniken
Analyse komplexer Substanzgemische;
Kopplung der hohen Trennleistung der GC
bzw. HPLC mit der hohen Nachweisstärke
und Massenauflösung des MS.
GC-MS, LC-MS und HPLC-MS Kopplungen
sind in der instrumentellen Analytik
inzwischen weit verbreitete Routineverfahren:.
CE-MS: Kapillarelektrophorese, kombiniert
mit MS; Ionisation mit den für die LC
geeigneten Methoden: APCI oder ESI
(CE-APCI-MS bzw. CE-ESI-MS)
Kopplung mit ICP,  ICP-MS
(ICP: Inductively Coupled Plasma (engl. für
induktiv gekoppeltes Plasma), welches bei der
Atomspektroskopie benutzt wird; Atomisierung
und Ionisation in einem Ar-Plasma)
GC-MS-System, demonstriert an einem
Vier-Komponenten-Gemisch (Diasteroemere!)
[HMZ-7-305]
3-24
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3. Massenspektrometrie
3.6 Tandem-Massenspektrometrie / MS/MS-Prinzip
Kann als eigenständiges analytisches Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von
Reinstoffen und von komplexen Stoffgemischen oder in Kombination mit
Chromatographie- (GC, HPLC, LC) oder Pyrolysesystemen (z.B. ICP) eingesetzt werden.
Einzelne Ionen werden mit Hilfe des ersten
MS ausgewählt und über eine Zwischenzone,
ein sogenanntes Interface oder eine
Stoßkammer (kann auch eine Ionenfalle sein)
in ein zweites MS eingeleitet und detektiert.
Die Übergangszone ermöglicht die gezielte
Fragmentierung einer ausgewählten Masse
durch Stoßionisation oder Laseranregung.
Zum Einsatz gelangen auch bis zu vier
hintereinandergeschaltete
Mehrsektorfeldanalysatoren oder TrippelQuadrupol-MS/MS Systeme (MSn-Systeme).
MS/MS-Prinzip für die Identifikation eines bestimmten Ions /
Analyse eines (komplexen) Stoffgemisches
[KC-5/73]
3-25
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3. Massenspektrometrie
3.7 Massenspektrometrie in der Bioanalytik
Übersicht
Verbindungsklasse
Ionisationsmechanismus
Peptide
Proteine
Glykoproteine
Oligo/Polysaccharide
Protonierung/Deprotonierung
Protonierung
Protonierung (Kationisierung)
Kationisierung
Protonierung/Deprotonierung
Kationisierung
Protonierung/Deprotonierung
Deprotonierung
Lipide
Oligonukleotide
Desorptions/IonisationsTechnik
FAB, MALDI, ESI
MALDI, ESI
MALDI
FAB, MALDI, ESI
FAB, MALDI, ESI, APCI,
SIMS
FAB, MALDI, ESI
Modus
+/+
+
+/+/-
Proteinanalytik
Massenspektrometrie in Kombination mit ESI und MALDI ist heutzutage die wichtigste
Analysenmethode für die Peptid- und Proteinanalytik.
- genaue Bestimmung der Molekülmasse
- Analyse posttranslationaler Modifikationen (Phosphorylierung, Glykosylierung, Sulfatierung etc.)
- Ermittlung der Aminosäuresequenz (Primärstruktur) durch proteolytische Spaltung in
Kombination mit massenspektrometrischen Fragmentierungstechniken wie
PSD (post source decay) und CID (collision induced dissociation)
3-26
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3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
MALDI-TOF-MS / Molekulargewichtsbestimmung
Grundlagen: siehe 3.3.3 / 3.4.5
Für Peptide beobachtet man im MALDI-Spektrum
überwiegend die einfach geladenen Molekülionen.
Bei größeren Molekülen wie Proteine treten neben den
einfach geladenen Dimerionen [2M+H]+ auch die mehrfach
geladenen monomeren Ionen auf ([M+2H]2+, [M+3H]3+ etc.)
MALDI-TOF-Spektrum eines
monoklonalen Antikörpers
(Matrix: DHB, Dihydroxybenzoesäure)
[LE-2-341]
Schematische Darstellung eines
Flugzeitmassenspektrometers. Der Laserimpuls
(schwarz, fett) desorbiert die Probe vom
Probenteller und startet über die Photodiode die
Zeitmessung. Die Videokamera erlaubt die
optische Betrachtung des Targets (rot, fett). Je
nach Schaltung können die Ionen (rot) einmal im
Linearmodus (Detektor: SEV lin.) oder im
Reflektormodus (SEV Refl.) detektiert werden.
[LE-2-338]
3-27
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
MALDI-TOF-MS / Molekulargewichtsbestimmung
Eine Einschränkung der MALDI-TOF-MS ergibt sich aus der Energieverteilung der gebildeten Ionen. Nicht
alle Ionen werden vom gleichen Ort zur gleichen Zeit desorbiert und ionisiert, so dass es zu Energie-, Orts
und Zeitunschärfen kommt. Dies führt zur Verringerung der Massenauflösung.
 Strategien zur Steigerung des Auflösungsvermögens
 Verzögerte Ionenextraktion (Delayed Extraction):
Startgeschwindigkeitsverteilung für Ionen gleicher Massen
Elektrisches Feld über der Probenoberfläche wird nicht permanent, sondern zeitversetzt zum Desorptionslaserimpuls eingeschaltet.
Ionen mit einer höheren Startgeschwindigkeit entfernen sich während der Verzögerungszeit weiter von der Probenoberfläche
und erfahren nach dem Einschalten des elektr. Feldes eine
geringere kinetische Energie als Ionen mit niedrigerer
Startgeschwindigkeit;
 Reflektor:
Richtungsumkehr der Ionen in einem elektrischen
Gegenfeld, das sich an die Driftstrecke anschließt.
Ionen gleicher Masse, aber höherer Startenergie
dringen dabei tiefer in das Gegenfeld ein, legen
somit einen weiteren Weg im Reflektor zurück und
holen die langsameren Ionen nach der
Richtungsumkehr an einem bestimmten Punkt in
der Driftstrecke wieder ein. Auflösungen bis etwa
15000 im Massenbereich bis etwa 5000 Dalton.
.
3-28
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Instrumentelle Bioanalytik
Reflektor-Flugrohr (ReTOF)
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Sequenzierung von Peptiden mit MALDI
Kombination der MS mit klassischen Methoden der Sequenzanalyse
Chemisch: Edman-Abbau (N-terminal) und Schlack-Kumpf-Abbau (C-terminal)
Biochemisch: Proteasen, Exopeptidasen (Carboxypetidase, C-terminal), Endopeptidasen]
Vorteil: zeitaufwändige chromatographische Trennung entfällt.
Sequenzierung über PSD-MALDI
MALDI: sanfte Ionisierungsmethode; intakte
Molekülionen und wenige Fragmentionen
(prompte Fragmentierung)
Beobachtung: metastabile Fragmentierung:
spontane Fragmentierung während der
Beschleunigung im elektrischen Feld und in der
feldfreien Driftstrecke.
(Fragmentionen, die sich in der
Beschleunigungs-strecke bilden tragen zum
Rauschen im Spektrum bei.)
PSD (post source decay): metastabile Zerfälle
in der Driftzone (10 bis 50% der ursprünglich
gebildeten Molekülionen);
Analyse der Fragmentionen nur mittels ReTOF
möglich:
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Instrumentelle Bioanalytik
Lineares Flugrohr
[LE-2-347]
Reflektor-Flugrohr (ReTOF)
3. Massenspektrometrie
Sequenzierung über PSD-MALDI
Sequenzanalyse:
durch niederenergetische Stoßbedingungen
werden hauptsächlich die Peptidbindungen
entlang der Aminosäurekette gespalten.
Auswertung:
rechnerische Kombination aller Teilspektren
(unterschiedlicher Reflektorspannung) zum
kompletten PSD-Spektrum mittels
Computerprogrammen, die auch zur
Massenkalibrierung und Sequenzermittlung
verwendet werden.
(Manuelle Interpretation nur dann, wenn
posttranslational modifizierte oder nicht
sequenzierte Genprodukte identifiziert werden
sollen.)
Schema der Fragmentierung von Peptiden
(Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann)
[LE-2-348]
3-30
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Instrumentelle Bioanalytik
3.7 Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Sequenzierung über PSD-MALDI
Nachteil im Standardbetrieb (statisches Feld): die meisten PSD-Ionen kehren auf Grund ihrer
zu geringen Energie zu früh um und treffen nicht auf die Detektoroberfläche. Weiterhin gilt zu
berücksichtigen, dass die PSD-Ionen nicht auf ihrer korrekten Masse dargestellt werden.
Abhilfe: spezielle Reflektoren mit variabler Spannung, die der geringen Energie der PSDIonen angepasst sind.
Prinzip der PSD-Massenanalyse im zweistufigen Gitterreflektor. Molekülionen (Pm+), die in der feldfreien
Driftstrecke zerfallen, können durch stufenweises Absenken des Reflektorpotentials detektiert werden. Mit
der Ablenkelektrode ist es möglich, nur Molekülionen einer gewünschten Masse aus einem Gemisch zu
selektionieren.
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
ESI-MS (Elektrosprayionisations-MS)
Ionisierungsprinzip: siehe 3.3.2
Molekulargewichtsbestimmung
Die Bildung von mehrfach geladenen Ionen ist für den
ESI-Prozess charakteristisch. Im MS treten für Peptide
und Proteine ihrem Molekulargewicht entsprechend eine
Serie von Ionensignalen mit einer Ladungsdifferenz von
jeweils eins (in der Regel durch Addition eines Protons)
auf. Die Ladungszahl kann bei entsprechenden
Molekülen im Bereich von 100 liegen, [M + nH]n+.
Die Ladung n eines mehrfach geladenen Molekülions und
damit das Molekulargewicht M lassen sich aus den
aufeinander folgenden Molekülionen berechnen. Die
Auswertung erfolgt in der Regel mit Hilfe von
Computerprogrammen. Als Resultat erhält man
Rekonstruktionen (hypermass), die ein gegebenes
Spektrum für einen entsprechenden
Molekulargewichtsbereich umgerechnet zeigen.
Massenanalyse meistens mit
Quadrupol-Analysatoren oder Ionenfalle
Entschlüsseltes ESI-Massenspektrum
[HMZ-7-291]
von Interleukin
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Instrumentelle Bioanalytik
ESI-Massenspektrum von Interleukin 6
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Strukturanalyse mit ESI-MS
Beruht auf dem Einsatz von Tandemmassenspektrometer (auch: Triple-Quadrupol-MS,
MS/MS-Prinzip, siehe auch 3.6) und der Fragmentierung in einer Kollisionskammer durch
Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon).
Fragmentierung durch niederenergetische Stöße:
CID (collision-induced dissociation) bzw. CAD (collision-activated dissociation).
Schematischer Aufbau eines Triple-Quadrupolmassenspektrometers [LE-2-366]
3-33
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
Strukturanalyse mit ESI-MS
3-34
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Instrumentelle Bioanalytik
3.7 Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Sequenzierung von Peptiden mit CID (weitere Methoden)
Q-TOF-MS
Hybridmassenspektrometer
ReTOF: höherer Massenbereich, bessere Auflösung, sehr schnelle Analyse aller Ionen
3-35
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Sequenzierung von Peptiden mit CID (weitere Methoden)
MALDI-TOF-TOF
3-36
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Proteincharakterisierung und Analyse von Proteinwechselwirkungen
SELDI-TOF-MS: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation - Time of Flight - MS
Weiterentwicklung des MALDI-TOF-MS (Patent bei Ciphergen®)
Prinzip: Retentions/Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie
“Elution” mit MALDI (und Analyse mit TOF)
3-37
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
SELDI-TOF-MS
Anwendungen:
- On-chip separation of proteins
- Protein Purification
- Fingerprinting/Biomarker Discovery
(Detect proteins from two different states
e.g. disease versus normal tissue samples)
- Protein characterisation
(including identification of novel ligands and protein characteristics)
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Instrumentelle Bioanalytik
- Expression Difference Mapping
- Interaction Difference Mapping
- Antibody-Antigen Interaction
- DNA Protein Interaction
- Glycosylation Analyses
- Quantification of proteins
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Analyse von Proteingemischen / Proteomics
3-39
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
3.7 Bioanalytik
Proteomics
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Instrumentelle Bioanalytik
3. Massenspektrometrie
Literatur:
Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie / Manfred Hesse, Herbert Meier und Bernd
Zeh; 7., überarbeitete Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 2005
HMZ-7(Auflage)-Seitenzahl
Instrumentelle analytische Chemie: Verfahren, Anwendungen und Qualitätssicherung / Karl Cammann
(Hrsg.) – Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl., 2001
KC-5(Kapitel)/Seitenzahl
Organische Chemie / Paula Y. Bruice, 5. Auflage, Pearson Studium, München, 2007
B-5(Auflage)d(deutsche Ausgabe)-Seitenzahl
Bioanalytik / Friedrich Lottspeich, Joachim W. Engels; 2. Auflage, Elsevier GmbH, München, 2006
LE-2(Auflage)-Seitenzahl
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Instrumentelle Bioanalytik