Instrumentelle Bioanalytik
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Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3-1 Grundlagen (Einführung, Prinzip und Funktionsabschnitte) Strukturaufklärung organischer Moleküle Alternative Ionisierungsverfahren Alternative Analysatoren Kopplungstechniken Tandem-Massenspektrometrie / MS/MS-Prinzip Massenspektrometrie in der Bioanalytik 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.1 Grundlagen Einführung Molekülmassenbestimmung und Elementaranalyse: früher: (aufwändig, zeitraubend, relativ große Mengen an Reinsubstanz): Molmassenbestimmung über Dampfdruck- oder Gefrierpunktserniedrigung Summenformel durch quantitative Elementanalyse (Elementaranalyse) heute: Molmasse und Summenformel mittels MS (schnell, präzise, mit sehr kleinen Substanzmengen) 1910/1912: Trennung der Neon-Isotope 20 und 22 durch J.J. Thomson 1919: F.W. Aston baut das erste funktionierende MS und trennt viele Isotope (Nobelpreis für Chemie:1922) Durchbruch als Analysenmethode (in der OC): um 1960 Im Routinebetrieb (Elektronenstoß-MS): rel. Molekülmassen bis ca 3500 Dalton www.pm.ruhr-uni-bochum.de/ pm2008/msg00099.htm 3-2 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.1 Grundlagen Prinzip des Massenspektrometers Die zu untersuchende Substanz wird in die Gasphase überführt und ionisiert. Die Ionen werden durch ein elektrisches Feld beschleunigt und im Analysator nach dem Masse-zu-Ladung-Verhältnis auftrennt. Vier Funktionsabschnitte - Probenzuführung (Einlasssystem) Ionen-Erzeugung (Ionisation) Massentrennung / Analysator Ionen-Nachweis / Detektor HMZ-7-234 Schematische Darstellung eines Massenspektrometers KC-5/53 3-3 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.1 Grundlagen Funktionsabschnitte MS Probenzuführung (Einlasssystem) Substanzprobe unter Normaldruck muss ohne Unterbrechung des Hochvakuums ins Hochvakuum eingebracht werden Gas-Einlass für flüssige und gasförmige Proben Flüssigkeiten werden mittels Mikrospritze direkt durch ein Septum in ein Vorratsbehälter injiziert oder in einem Glasgefäß ausgefroren. Gasproben werden durch einen Behälter mit Zerschlagventil und Glasschliffansatz in das Vorratsgefäß gebracht. Das Vorratsgefäß (der Probenbehälter) ist heizbar (bis 150°C) und mit der Ionenquelle über eine Schleuse verbunden. Direkt-Einlass für Feststoffe und zähflüssige Proben Probe wird in einem Metalltiegel (Au, Al, 1 mm IØ) mittels Schubstange in eine Schleusenkammer eingebracht. Nach Evakuierung wird die Schubstangenspitze gekühlt, in die Ionenquelle geschoben und die Probe über ein Heizelement verdampft. Probenbedarf: Gaseinlass: 0,1 bis 1 mg; Direkt: 1 bis 100 µg; GC: 10-9 bis 10-15 g Alternativen: on-line (Kopplungsmethoden): Verdampfbare Proben lassen sich über einen Gaschromatographen, gelöste Proben z.B. über einen Flüssigchromatographen einbringen. 3-4 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.1 Grundlagen Funktionsabschnitte MS Ionenerzeugung Elektronenstoß-Massenspektrometrie: (electron ionization), EI-MS Molekülstrahl aus dem Einlasssystem trifft in der Ionenquelle auf einen (hochenergetischen) Elektronenstrahl. Die Potentialdifferenzwischen Glühkathode und Anode ist variabel und kann bis 300 V betragen. (Niedrigvoltspektren: 12 bis 15 eV; Normalspektren: 60 bis 100 eV, meist 70 eV) Bildung von positiv geladenen Molekül-Ionen (Radikal-Kationen): M e M 2e selten: M e M 2 3 e Molekül-Ionen werden durch Anlegen einer Spannung (2 bis 10 kV) beschleunigt und fokussiert. (Fokussierung durch elektrostatische Zusatzfelder) (nicht geladene Moleküle werden aus dem Spektrometer herausgepumpt) Geschwindigkeit der Ionen am Spalt: m v2 zU 2 v 2 zU m KC-5/56 Alternativen: - Druck im Ionenerzeugungsteil: 10-3 bis 10-4 Pa, im Analysatorteil 10-6 bis 10-7 Pa. 3-5 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik chemische Ionisation Elektrospray MALDI 3. Massenspektrometrie 3.1 Grundlagen Funktionsabschnitte MS Massentrennung / Sektorfeld-Massenseparator Auftrennung der Ionen im Feld eines Elektromagneten (Größenordnung 1 Tesla). Teilchen gleicher Ladung fliegen auf masseabhängigen Ablenkradien, rm: rm mv zB B : Magnetfeldstärke Massenspektrometrische Grundgleichung m rm2 B 2 z 2U Masse-zu-Ladungsverhältnis ist von der Magnetfeldstärke, dem Ablenkradius und der Beschleunigunsspannung abhängig. Auftrennung dreier Ionenmassen in einem Sektorfeld-Massenseparator; Magnetfeld B senkrecht zur Zeichenebene Alternativen: Elektrostatischer Analysator Quadrupole Flugzeit (TOF) 3-6 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik KC-5-61 3. Massenspektrometrie Ionen-Nachweis / Detektoren 3.1 Grundlagen Funktionsabschnitte MS Konstanthaltung von Beschleunigungsspannung und Magnetfeldstärke: m konst. rm2 z Verwendung einer Photoplatte (robust, hohes Auflösevermögen) oder vieler einzelner Kollektoren (Detektorzeile) Faraday-Detektor (Detektion relativ hoher Ionenströme, billig, genau): Becher aus Edelstahl ( 2x4x4mm), über Hochohmwiderstand fließt die Ionenladung gegen Masse ab. Beschleunigungsspannung und Ablenkradius konstant: Magnetfeldstärke wird variiert (scan); Verwendung eines einzelnen Ionenauffängers. Sekundärelektronen-Vervielfacher (SEV) zur Verstärkung der sehr schwachen Ionenströme. (Ionen treffen auf die erste Konversionsdynode und generieren zwei bis drei Elektronen, Elektronenlawine durch Kaskadierung; empfindlich, kurze Ansprechzeit, aber begrenzte Haltbarkeit) Kanalelektronen-Vervielfacher (Channel Electron Multiplier, CEM) sehr weite Verbreitung in der MS; kontinuierliche Dynode in Form eines beschichteten gebogenen Rohres (begrenzte Lebensdauer) 3-7 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik m konst. B 2 z 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung organischer Moleküle Organische Verbindungen fragmentieren unter der Wirkung von Elektronenbeschuss (70 eV). Vielzahl von Linien (peaks) für eine Reinsubstanz Massenspektrum Massenspektrum ist wie ein „Fingerabdruck“ der Verbindung [HMZ-7-246] Stevenson-Regel: Bei der Fragmentierung spaltet sich das größte Radikal ab (je größer, desto mehr Schwingungsfreiheitsgrade, umso mehr Energie kann es übernehmen); Das restliche Fragment bildet meist den Basispeak. Spektrendarstellung: intensivster Peak des Spektrums - Basispeak wird auf 100% (relative %) gesetzt, alle anderen Signale werden entsprechend umgerechnet. Molekül-Ion - das Signal mit der höchsten Masse entspricht dem Molekülpeak M Gibt die Molekülmasse der untersuchten Verbindung an. Massenspektrum von Nitropropan (EI, 70eV) Wenige Ausnahmen: - sogenannte [M+1]+- oder [M+H]+-Signale; durch Anlagerung eines Protons an Moleküle (selten, häufiger bei Aminen und Alkoholen), - Registrierung von [M-R]+-Ionen anstelle von Molekül-Ionen; bei Verbindungen, die leicht zerfallen. Aromatische Verbindungen z. B. zeigen einen ausgeprägten Molekülpeak, während tertiäre Alkohole oder sehr langkettige Aliphaten meist überhaupt keinen aufweisen. 3-8 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung Isotope Die meisten Elemente sind keine Reinelemente, sondern natürlich vorkommende Isotopengemische. Für organische Verbindungen häufige chemische Elemente: - Reinelemente: 19F, 31P, 127I - Elemente mit einem stark überwiegenden Isotop (> 98%): H(1H), C(12C), N(14N), O(16O) - Elemente mit zwei häufigen Isotopen S(32S, 34S), Cl(35Cl, 37Cl), Br(79Br, 81Br) Je nach Gehalt an diesen Elementen ist der Molekül-Ionenpeak von einem oder mehreren Isotopenpeaks begleitet. Speziell chlorierte und bromierte Verbindungen weisen ein sehr charakteristisches Muster auf, das leicht erkannt werden kann und sich auch zur automatischen Auswertung gut eignet. Massenspektrum von 1-Brompropan 3-9 10.12.2012 [B-5d-601] Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung Bestimmung von Summenformeln Die elementare Zusammensetzung eines Molekül (Molekül-Ions) lässt sich durch die Bestimmung seiner exakten Masse erhalten hochauflösende Massenspektrometrie. Aus den exakten Massezahlen kann mit Computerhilfe die elementare Zusammensetzung bestimmt werden. (Anmerkung: Bei Molekülen höhere Masse ist die Zahl der Kombinationsmöglichkeiten möglicherweise zu groß.) Auflösungsvermögen: Niederauflösende Massenspektrometer: 1000 bis 2000 Doppelt fokussierende Geräte: bis 150000 ! (Magnetischer (M) und elektrostatischer (E) Analysator Doppelfokussierendes MS in der BE-Konfiguration mit eingebauten Quadrupollinsen 3-10 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik [KC-5/62] 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle Typ Beschreibung Ausgangs- WiederIon holung? Beispiel a-Spaltung McLaffertyUmlagerung retro-Diels-AlderReaktion [HMZ-7-269/270] 3-11 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle Typ Beschreibung Ausgangs- WiederIon holung? Beispiel Benzyl- oder Allylspaltung OniumReaktion CO-Verlust [HMZ-7-269/270] 3-12 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.2 Strukturaufklärung Hauptfragmentierungsreaktionen organischer Moleküle Beispiel: -Spaltung -Bindungen zu Heteroatomen (wie N, S, O, seltener Halogen) werden bevorzugt gespalten, wobei die Ladung durch das Heteroatom stabilisiert wird. Wichtigste massenspektrometrische Primär-Fragmentierungsreaktion. Tritt bei Zerfallsketten in der Regel nur einmal auf (-Spaltung des gebildeten Radikal-Kations zu energieaufwändig) Richtwerte für die relative Stärke, mit der ein Substituent ladungsstabilisierend wirkt. (-Spaltung) [HMZ-7-255] Massenspektrum von 2-Butanon [HMZ-7-250] 3-13 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik Hauptfragmentierung 2-Butanon Konstitutionsformeln 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Ionisierungsverfahren Problem EI (Verdampfung und Elektronenstrahl): -Thermolabilität vieler Verbindungen Molekülion-Peak oftmals zu schwach ausgeprägt. - Bioorganische Verb. (mit höherem Molekulargewicht) nicht pyrolysefrei verdampfbar. - EI nicht mit LC (Flüssig-Chromatographie) kombinierbar. Für schwer oder nicht verdampfbare Proben wichtige Verfahren: - Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) - Elektrospray-Ionisation (ESI) - Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) 3.3.1 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Die aus einer geheizten Kapillare austretende Lösung wird bei Atmosphärendruck zu einem feinen Nebel versprüht. Der Nebel wird durch eine Entladungsnadel ionisiert, wobei sich hauptsächlich protonierte Lösungsmittel-Ionen bilden, die durch Zusammenstöße mit neutralen Molekülen diese protonieren. Durch elektrische Felder werden die [M+H]+-Ionen dem Massenanalysator zugeführt Prinzipskizze: Atmospheric Pressure Chemical Ionization 3-14 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik [HMZ-7-283] 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Ionisierungsverfahren 3.3.2 Elektrospray-Ionization (ESI) Substanzlösung wird durch eine Kapillare in eine Kammer versprüht. Diesem Sprühnebelstrahl entgegengerichtet strömt ein Trockengas. Zwischen der Kapillare und dem Kammermantel (zylindrische Elektrode) ist ein Potential von einigen Kilovolt angelegt. Es entstehen geladenen Tröpfchen, die unter Verdampfung des Lömi kleiner werden. Getrieben durch das elektrische Feld, bewegen sich die geladenen Tröpfchen durch eine Glaskapillare in den Analysatorvorraum und werden durch elektrostatische Linsensysteme fokussiert, in den Analysator des Massenspektrometers (z.B. Quadrupol-MS) gelenkt und analysiert. (Ionisationsquelle: elektrisches Potential) Bildung von ein- und mehrfach geladene Ionen [M + nH]n+ und [M - nH]n-. Prinzipskizze Elektrospray-Ionenquelle (Finnigan MAT) [HMZ-7-290] 3-15 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Ionisierungsverfahren 3.3.3 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) (LDI:) Photoionisation von Molekülen durch Bestrahlung mit energiereichen Lasern (z.B. gepulster N2-Laser, 337nm). Problem: viele Verbindungen absorbieren nur ungenügend. Probensubstanz mit einer Matrix vermischen. Matrixmoleküle nehmen die Energie auf und übertragen diese rasch, ohne dass thermische Zersetzung eintritt, auf die Moleküle der Untersuchungssubstanz. Diese werden ionisiert und durch äußere elektrische Felder (Ziehblenden) aus dem Gemisch abgezogen. Wahl der Matrixsubstanz (etwa 1000-facher Überschuss) hängt von der untersuchten Substanz ab. Allgemein einsetzbar: Zimtsäure oder 2,5-Dihydroxybenzoesäure. MALDI: Moleküle mit einem Molekulargewicht bis ca. 1,5 MDa analysierbar (MALDI-TOF-MS, siehe 1.4.x) 3-16 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Ionisierungsverfahren [HMZ-7-284/285] 3-17 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Ionisierungsverfahren Biomakromoleküle [HMZ-7-284/285] 3-18 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.4 Alternative Analysatoren 3.4.1 Quadrupol-Massenanalysatoren Prinzip und Aufbau: Massenselektion im elektromagnetischen Quadrupolfeld (hochfrequenten E-Feldern.) Quadrupolfilter besteht aus vier konzentrisch und parallel zueinander angeordneten Stabelektroden (etwa 15 cm lang, Ø 6 mm). Werden paarweise, gegenüberliegend an (variabler) Gleichspannung angeschlossen, der eine modulierbare sinusförmige hochfrequente Wechselspannung überlagert wird nur Ionen gleichen Masse (m/z) passieren auf stabilen Wellenbahnen und erreichen den Detektor. Massenscan durch Variation der Frequenz oder Variation der angelegten Spannungen Scan-Dauer im ms-Bereich! Am weitesten verbreitet, da preisgünstig und robust. Kompakt und schnell genug, ideal für on-line-Kopplungen, vor allem mit GC. Auflösungsvermögen: R ≈ 3000 bis 4000 Auch zur Bündelung/Fokussierung von Ionenströmen und zur Abtrennung Neutralteilchen. Schema eines Quadrupolmassenfliters mit stabilen und instabilen Ionenbahnen 3-19 10.12.2012 [KC-5/62] Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Analysatoren 3.4.2 Ionenfalle (Ion-trap, IT) Weiterentwicklung des Quadrupolmassenfilters - dreidimensionale Quadrupolionenfalle. (Nobelpreis für Physik an W. Paul und H.G. Dehmelt für die IT-Entwicklung, 1989) Prinzip: Einschluss und Speicherung von Ionen; Molekülionen zirkulieren auf dreidimensionalen, stabilen Bahnen innerhalb des Elektrodenraumes und werden (durch erhöhen der Umlaufamplitude) nach dem m/z-Verhältnis sukzessive ausgeschleust und detektiert. Auch zur gezielten Auswahl bestimmter Molekülionen für MS/MS/MS (siehe 3.5). 3-20 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Analysatoren 3.4.3 Ionenzyklotronresonanz (ICR) Simultane Massentrennung und -detektion. Kernstück ist eine Ionenfalle, in der die Ionen über einen längeren Zeitraum mit bestimmter Umlauffrequenz zirkulieren. Erreicht wird dies durch ein statisches Magnetfeld (1 bis 3 T). Wird ein elektrisches Wechselfeld eingestrahlt, dessen Frequenz der Umlauffrequenz des Ions entspricht, nimmt das Ion Energie auf und wird dadurch beschleunigt. Dadurch vergrößert sich die die Ionenkreisbahn (Spiralbahn nach außen, bis das Wechselfeld weggenommen wird; danach im Prinzip wieder stationäre Kreisbahn) Die kohärente Kreisbewegung von Ionen gleicher Masse induziert dabei einen Wechselstrom auf den Empfängerelektroden/platten, der von der Zahl der Ionen in Resonanz abhängig ist. Das induzierte Frequenzsignal klingt durch Stöße zwischen den Ionen innerhalb kurzer Zeit ab (transientes Signal im Bereich 0,1 bis 10 s). Durch Scannen der Frequenz können alle Ionen aufeinander folgend detektiert werden. Prinzipskizze einer ICR-Zelle / Prinzipskizze der Energieaufnahme und der Nachweis einer Ionensorte [HMZ-7-299] 3-21 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Analysatoren 3.4.4 FT-ICR, Fourier-Transformations-ICR Variante der ICR, Anregung mit einem Hochfrequenzpuls (ca 5 ms), dessen Frequenz während der Dauer linear (70 kHz bis 3,6 MHz) anwächst. Über Fouriertransformation des induzierten Stromes (aller Ionen, Zeitdomänensignal) in Frequenzdomänensignale (10 bis 100 ms) lässt sich das MS berechnen. Sehr teure Geräte, die mit supraleitenden Magneten ausgestattet sind (vergl. PFT-NMR) Massenauflösungen von R ≈ 1000000 erreichbar! 3-22 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.3 Alternative Analysatoren 3.4.5 Flugzeit-Detektion (Time of Flight, TOF) Erfordert gepulste Ionenquelle. Die simultan erzeugten Ionen werden durch einen kurzen Spannungsstoß (etwa 4 bis 35 kV) beschleunigt und auf einer feldfreien Flugstrecke von 0,1 bis 4 m Länge allein durch ihre massenabhängige Flugzeit (ca 1 bis 100 ms ) unterschieden. (Teilchen gleicher kinetischer Energie fliegen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, wenn sie unterschiedliche Masse aufweisen.) m 2U t2 z s2 Die Flugzeit wird aus der Zeitdifferenz von Ionenbildung und Detektorsignal ermittelt. Erfordert Zeitauflösung im Femtosekundenbereich. Deshalb werden für die Ionenbildung gepulste Quellen, vor allem Laser eingesetzt. MALDI-TOF-MS, siehe auch 3.5.X, inzwischen routinetaugliche Technik zur Molekulargewichtsbestimmung von Molekülen hoher Masse (bis 1,5 MDa) und zur Charakterisierung von Biopolymeren und von synthetischen Polymeren.) Massenauflösungen kommerzieller Geräte um 3000; kann durch Reflektionseinheiten gesteigert werden (RETOF) 3-23 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.5 Kopplungstechniken Analyse komplexer Substanzgemische; Kopplung der hohen Trennleistung der GC bzw. HPLC mit der hohen Nachweisstärke und Massenauflösung des MS. GC-MS, LC-MS und HPLC-MS Kopplungen sind in der instrumentellen Analytik inzwischen weit verbreitete Routineverfahren:. CE-MS: Kapillarelektrophorese, kombiniert mit MS; Ionisation mit den für die LC geeigneten Methoden: APCI oder ESI (CE-APCI-MS bzw. CE-ESI-MS) Kopplung mit ICP, ICP-MS (ICP: Inductively Coupled Plasma (engl. für induktiv gekoppeltes Plasma), welches bei der Atomspektroskopie benutzt wird; Atomisierung und Ionisation in einem Ar-Plasma) GC-MS-System, demonstriert an einem Vier-Komponenten-Gemisch (Diasteroemere!) [HMZ-7-305] 3-24 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.6 Tandem-Massenspektrometrie / MS/MS-Prinzip Kann als eigenständiges analytisches Verfahren zur Identifizierung und Quantifizierung von Reinstoffen und von komplexen Stoffgemischen oder in Kombination mit Chromatographie- (GC, HPLC, LC) oder Pyrolysesystemen (z.B. ICP) eingesetzt werden. Einzelne Ionen werden mit Hilfe des ersten MS ausgewählt und über eine Zwischenzone, ein sogenanntes Interface oder eine Stoßkammer (kann auch eine Ionenfalle sein) in ein zweites MS eingeleitet und detektiert. Die Übergangszone ermöglicht die gezielte Fragmentierung einer ausgewählten Masse durch Stoßionisation oder Laseranregung. Zum Einsatz gelangen auch bis zu vier hintereinandergeschaltete Mehrsektorfeldanalysatoren oder TrippelQuadrupol-MS/MS Systeme (MSn-Systeme). MS/MS-Prinzip für die Identifikation eines bestimmten Ions / Analyse eines (komplexen) Stoffgemisches [KC-5/73] 3-25 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Massenspektrometrie in der Bioanalytik Übersicht Verbindungsklasse Ionisationsmechanismus Peptide Proteine Glykoproteine Oligo/Polysaccharide Protonierung/Deprotonierung Protonierung Protonierung (Kationisierung) Kationisierung Protonierung/Deprotonierung Kationisierung Protonierung/Deprotonierung Deprotonierung Lipide Oligonukleotide Desorptions/IonisationsTechnik FAB, MALDI, ESI MALDI, ESI MALDI FAB, MALDI, ESI FAB, MALDI, ESI, APCI, SIMS FAB, MALDI, ESI Modus +/+ + +/+/- Proteinanalytik Massenspektrometrie in Kombination mit ESI und MALDI ist heutzutage die wichtigste Analysenmethode für die Peptid- und Proteinanalytik. - genaue Bestimmung der Molekülmasse - Analyse posttranslationaler Modifikationen (Phosphorylierung, Glykosylierung, Sulfatierung etc.) - Ermittlung der Aminosäuresequenz (Primärstruktur) durch proteolytische Spaltung in Kombination mit massenspektrometrischen Fragmentierungstechniken wie PSD (post source decay) und CID (collision induced dissociation) 3-26 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik MALDI-TOF-MS / Molekulargewichtsbestimmung Grundlagen: siehe 3.3.3 / 3.4.5 Für Peptide beobachtet man im MALDI-Spektrum überwiegend die einfach geladenen Molekülionen. Bei größeren Molekülen wie Proteine treten neben den einfach geladenen Dimerionen [2M+H]+ auch die mehrfach geladenen monomeren Ionen auf ([M+2H]2+, [M+3H]3+ etc.) MALDI-TOF-Spektrum eines monoklonalen Antikörpers (Matrix: DHB, Dihydroxybenzoesäure) [LE-2-341] Schematische Darstellung eines Flugzeitmassenspektrometers. Der Laserimpuls (schwarz, fett) desorbiert die Probe vom Probenteller und startet über die Photodiode die Zeitmessung. Die Videokamera erlaubt die optische Betrachtung des Targets (rot, fett). Je nach Schaltung können die Ionen (rot) einmal im Linearmodus (Detektor: SEV lin.) oder im Reflektormodus (SEV Refl.) detektiert werden. [LE-2-338] 3-27 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik MALDI-TOF-MS / Molekulargewichtsbestimmung Eine Einschränkung der MALDI-TOF-MS ergibt sich aus der Energieverteilung der gebildeten Ionen. Nicht alle Ionen werden vom gleichen Ort zur gleichen Zeit desorbiert und ionisiert, so dass es zu Energie-, Orts und Zeitunschärfen kommt. Dies führt zur Verringerung der Massenauflösung. Strategien zur Steigerung des Auflösungsvermögens Verzögerte Ionenextraktion (Delayed Extraction): Startgeschwindigkeitsverteilung für Ionen gleicher Massen Elektrisches Feld über der Probenoberfläche wird nicht permanent, sondern zeitversetzt zum Desorptionslaserimpuls eingeschaltet. Ionen mit einer höheren Startgeschwindigkeit entfernen sich während der Verzögerungszeit weiter von der Probenoberfläche und erfahren nach dem Einschalten des elektr. Feldes eine geringere kinetische Energie als Ionen mit niedrigerer Startgeschwindigkeit; Reflektor: Richtungsumkehr der Ionen in einem elektrischen Gegenfeld, das sich an die Driftstrecke anschließt. Ionen gleicher Masse, aber höherer Startenergie dringen dabei tiefer in das Gegenfeld ein, legen somit einen weiteren Weg im Reflektor zurück und holen die langsameren Ionen nach der Richtungsumkehr an einem bestimmten Punkt in der Driftstrecke wieder ein. Auflösungen bis etwa 15000 im Massenbereich bis etwa 5000 Dalton. . 3-28 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik Reflektor-Flugrohr (ReTOF) 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Sequenzierung von Peptiden mit MALDI Kombination der MS mit klassischen Methoden der Sequenzanalyse Chemisch: Edman-Abbau (N-terminal) und Schlack-Kumpf-Abbau (C-terminal) Biochemisch: Proteasen, Exopeptidasen (Carboxypetidase, C-terminal), Endopeptidasen] Vorteil: zeitaufwändige chromatographische Trennung entfällt. Sequenzierung über PSD-MALDI MALDI: sanfte Ionisierungsmethode; intakte Molekülionen und wenige Fragmentionen (prompte Fragmentierung) Beobachtung: metastabile Fragmentierung: spontane Fragmentierung während der Beschleunigung im elektrischen Feld und in der feldfreien Driftstrecke. (Fragmentionen, die sich in der Beschleunigungs-strecke bilden tragen zum Rauschen im Spektrum bei.) PSD (post source decay): metastabile Zerfälle in der Driftzone (10 bis 50% der ursprünglich gebildeten Molekülionen); Analyse der Fragmentionen nur mittels ReTOF möglich: 3-29 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik Lineares Flugrohr [LE-2-347] Reflektor-Flugrohr (ReTOF) 3. Massenspektrometrie Sequenzierung über PSD-MALDI Sequenzanalyse: durch niederenergetische Stoßbedingungen werden hauptsächlich die Peptidbindungen entlang der Aminosäurekette gespalten. Auswertung: rechnerische Kombination aller Teilspektren (unterschiedlicher Reflektorspannung) zum kompletten PSD-Spektrum mittels Computerprogrammen, die auch zur Massenkalibrierung und Sequenzermittlung verwendet werden. (Manuelle Interpretation nur dann, wenn posttranslational modifizierte oder nicht sequenzierte Genprodukte identifiziert werden sollen.) Schema der Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann) [LE-2-348] 3-30 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3.7 Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Sequenzierung über PSD-MALDI Nachteil im Standardbetrieb (statisches Feld): die meisten PSD-Ionen kehren auf Grund ihrer zu geringen Energie zu früh um und treffen nicht auf die Detektoroberfläche. Weiterhin gilt zu berücksichtigen, dass die PSD-Ionen nicht auf ihrer korrekten Masse dargestellt werden. Abhilfe: spezielle Reflektoren mit variabler Spannung, die der geringen Energie der PSDIonen angepasst sind. Prinzip der PSD-Massenanalyse im zweistufigen Gitterreflektor. Molekülionen (Pm+), die in der feldfreien Driftstrecke zerfallen, können durch stufenweises Absenken des Reflektorpotentials detektiert werden. Mit der Ablenkelektrode ist es möglich, nur Molekülionen einer gewünschten Masse aus einem Gemisch zu selektionieren. 3-31 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik ESI-MS (Elektrosprayionisations-MS) Ionisierungsprinzip: siehe 3.3.2 Molekulargewichtsbestimmung Die Bildung von mehrfach geladenen Ionen ist für den ESI-Prozess charakteristisch. Im MS treten für Peptide und Proteine ihrem Molekulargewicht entsprechend eine Serie von Ionensignalen mit einer Ladungsdifferenz von jeweils eins (in der Regel durch Addition eines Protons) auf. Die Ladungszahl kann bei entsprechenden Molekülen im Bereich von 100 liegen, [M + nH]n+. Die Ladung n eines mehrfach geladenen Molekülions und damit das Molekulargewicht M lassen sich aus den aufeinander folgenden Molekülionen berechnen. Die Auswertung erfolgt in der Regel mit Hilfe von Computerprogrammen. Als Resultat erhält man Rekonstruktionen (hypermass), die ein gegebenes Spektrum für einen entsprechenden Molekulargewichtsbereich umgerechnet zeigen. Massenanalyse meistens mit Quadrupol-Analysatoren oder Ionenfalle Entschlüsseltes ESI-Massenspektrum [HMZ-7-291] von Interleukin 3-32 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik ESI-Massenspektrum von Interleukin 6 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Strukturanalyse mit ESI-MS Beruht auf dem Einsatz von Tandemmassenspektrometer (auch: Triple-Quadrupol-MS, MS/MS-Prinzip, siehe auch 3.6) und der Fragmentierung in einer Kollisionskammer durch Inertgas (Stickstoff, Helium, Argon). Fragmentierung durch niederenergetische Stöße: CID (collision-induced dissociation) bzw. CAD (collision-activated dissociation). Schematischer Aufbau eines Triple-Quadrupolmassenspektrometers [LE-2-366] 3-33 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie Strukturanalyse mit ESI-MS 3-34 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3.7 Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Sequenzierung von Peptiden mit CID (weitere Methoden) Q-TOF-MS Hybridmassenspektrometer ReTOF: höherer Massenbereich, bessere Auflösung, sehr schnelle Analyse aller Ionen 3-35 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Sequenzierung von Peptiden mit CID (weitere Methoden) MALDI-TOF-TOF 3-36 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Proteincharakterisierung und Analyse von Proteinwechselwirkungen SELDI-TOF-MS: Surface Enhanced Laser Desorption/Ionisation - Time of Flight - MS Weiterentwicklung des MALDI-TOF-MS (Patent bei Ciphergen®) Prinzip: Retentions/Affinitätschromatographie und Massenspektrometrie “Elution” mit MALDI (und Analyse mit TOF) 3-37 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik SELDI-TOF-MS Anwendungen: - On-chip separation of proteins - Protein Purification - Fingerprinting/Biomarker Discovery (Detect proteins from two different states e.g. disease versus normal tissue samples) - Protein characterisation (including identification of novel ligands and protein characteristics) 3-38 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik - Expression Difference Mapping - Interaction Difference Mapping - Antibody-Antigen Interaction - DNA Protein Interaction - Glycosylation Analyses - Quantification of proteins 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Analyse von Proteingemischen / Proteomics 3-39 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie 3.7 Bioanalytik Proteomics 3-40 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik 3. Massenspektrometrie Literatur: Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie / Manfred Hesse, Herbert Meier und Bernd Zeh; 7., überarbeitete Auflage, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 2005 HMZ-7(Auflage)-Seitenzahl Instrumentelle analytische Chemie: Verfahren, Anwendungen und Qualitätssicherung / Karl Cammann (Hrsg.) – Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl., 2001 KC-5(Kapitel)/Seitenzahl Organische Chemie / Paula Y. Bruice, 5. Auflage, Pearson Studium, München, 2007 B-5(Auflage)d(deutsche Ausgabe)-Seitenzahl Bioanalytik / Friedrich Lottspeich, Joachim W. Engels; 2. Auflage, Elsevier GmbH, München, 2006 LE-2(Auflage)-Seitenzahl 3-41 10.12.2012 Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle Bioanalytik
