Methoden zum Virusnachweis 3

Tätigkeitsbericht
Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch Gesundheitsschutz 2007 · 50:1440–1442
DOI 10.1007/s00103-007-0373-9
Online publiziert: 7. November 2007
© Springer Medizin Verlag 2007
Methoden für die Probenahme und den Nachweis
von Viren
Nachweis von replikativen Vacciniaviren
Bericht des Unterausschusses Methodenentwicklung der Bund/Länder-AG Gentechnik
1 Zweck und Anwendungsbereich
3 Material
3.2 Reagenzien und Lösungen
Mit dieser Anleitung können replikative
Vacciniaviren (Wildtyp und rekombinant), welche zuvor von Laboroberflächen
abgewischt oder als Identifikationsproben
genommen wurden, auf ihre biologische
Funktion hin überprüft und damit nachgewiesen werden (zu den vorgenannten
Wischproben vgl. die entsprechende Methode des Unterausschuss Methodenentwicklung des LAG „Abwischen von Viren
von Laboroberflächen“).
3.1 Geräte
Es sind grundsätzlich analysenreine, für
die Zellkultur und die Molekularbiologie geeignete Reagenzien zu verwenden.
Soweit nicht anders angegeben, ist unter
„Lösung“ eine wässrige Lösung zu verstehen.
F Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline
(PBS),
F Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
(DMEM),
F Fetal Bovine Serum (FBS),
F 1 x Trypsin-EDTA-Lösung,
F Geneticin-Lösung (30 mg/ml),
F Crystal violet,
F Ethanol 70 %.
Kulturmedium bestehend aus:
F 500 ml DMEM,
F 50 ml FBS (ca. 10 %),
F 300 μl Geneticin-Lösung.
Färbelösung bestehend aus:
F 1 g Crystal violet,
F 710 ml H2O,
F 290 ml Ethanol 70 %.
F Vero-Zellen (Vero-B4).
2 Kurzbeschreibung
Biologisch aktive Vacciniaviren können
nebst anderen auch Verozellen („African
green monkey kidney cells“) infizieren.
Die Methode beschreibt neben der Kultivierung der Verozellen deren Infektion
mit Vacciniaviren (aus dem Probenmaterial). Spätestens 72 Stunden nach der
Infektion werden die Ansätze ausgewertet. Die Plaques können nach einer Fixierung und Blaufärbung des Zellrasens mit
dem Auge erkannt und ggf. unter dem
Mikroskop (40 x Vergrößerung) weiter
charakterisiert werden. Der Replikationszyklus dieser Viren ist so schnell, dass die
auf einer Monolayer-Kultur der Zelllinie
Vero entstehenden Plaques häufig bereits
nach 24 Stunden mit einem Mikroskop
sichtbar sind.
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Kunststoff- und Glasmaterialien müssen
vor der Verwendung sterilisiert werden.
Die Verwendung von aerosolgeschützten
Pipettenspitzen dient als Schutz vor Kontamination.
F Zentrifuge,
F Sicherheitswerkbank (Klasse II),
F Ultraschallgerät (z. B. Cup Horn mit
Ultraschallgenerator),
F Halter für graduierte 15-ml und
50-ml-Plastikröhrchen,
F Mikroskop mit Phasenkontrast,
F Pipetboy,
F Kryostat (Flüssigstickstoffbehälter
zum Aufbewahren von Zelllinien in
Kryoröhrchen),
F Ampullenträger für Kryoröhrchen,
F Zellkultur-Inkubator mit HEPA-Filter
und CO2-Zumischung (37 °C, mit 5 %
CO2).
Plastikverbrauchsmaterial:
F 15 ml und 50 ml graduierte Zentrifugenröhrchen mit verschraubbarem
Plastikdeckel,
F Einweg serologische Pipetten 25 ml,
10 ml, 5 ml,
F sterile Zellkulturflaschen mit Filterdeckel, 75 cm2,
F sterile Zellkultur-Testplatten mit
24 Löchern zu je 1,9 cm2.
4 Durchführung
Alle Arbeiten werden, soweit dies möglich
ist, in der Sicherheitswerkbank durchgeführt.
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4.1 Auftauen der Zellen
(Es können auch die Standardanleitungen
aus entsprechenden Methodensammlungen verwendet werden.)
F Wasserbad auf 37 °C vorwärmen,
F 1 x ca. 50 ml Kulturmedium auf 37 °C
vorwärmen,
F Kryoröhrchen mit Vero-Zellen dem
Kryostat entnehmen und während
1 Minute im Wasserbad auftauen
(Der Wasserstand sollte wegen der
Kontaminationsgefahr die Füllmenge
des Kryoröhrchens nicht übersteigen),
F Kryoröhrchen mit Alkohol außen abspritzen und aufgetaute Zellsuspension in je 5 ml vorgewärmtes Kulturmedium (15 ml Zentrifugenröhrchen)
transferieren,
F Zellen während 5 Minuten bei 100 x g
sedimentieren,
F Überstand entfernen und sedimentierte Zellen in 1 ml Kulturmedium
aufnehmen und danach in 30 ml vorgewärmtes Kulturmedium (Zellkulturflaschen mit 75 cm2 Boden) transferieren,
F Zellkultur bei 37°C und 5 % CO2 inkubieren und mindestens alle 2 Tage mit dem Mikroskop kontrollieren. Die verwendete Zelllinie benötigt nach dem Auftauen zum Erreichen der Konfluenz auf dem Boden
der Zellkulturflasche zwischen 3 und
5 Tage.
4.2 Umsetzen der Zellen
(Passagieren)
(Es können auch die Standardanleitungen
aus entsprechenden Methodensammlungen verwendet werden.)
F Kulturmedium vorsichtig entfernen.
F Zellrasen 2 x vorsichtig mit 1 x PBS
waschen.
F Mit 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung die
Zellen vom Boden der Zellkulturflächen lösen (dauert ca. 5 Min. bei
37 °C).
F Neue Kulturflaschen (75 cm2) mit je
30 ml Kulturmedium vorbereiten.
F Abgelöste Zellen mit 5 ml Kulturmedium versetzen (Inaktivieren von
Trypsin) und mit einer 10 ml serologischen Pipette resuspendieren.
F Je 1/5 bis 1/3 der Zellsuspension auf
die vorbereiteten Kulturflaschen animpfen.
F Zellkulturen bei 37 °C und 5 % CO2 inkubieren und mindestens alle 2 Tage mit dem Mikroskop kontrollieren.
Die verwendeten Zelllinien benötigen
beim Passagieren zum Erreichen der
Konfluenz auf dem Boden der Zellkulturflaschen zwischen 2 und 3 Tage.
4.3 Infizieren der Zelllinien
F Zellen aus einer 75 cm2 Kulturflasche
mit der Vero-Zelllinie, welche ca. 70 %
Konfluenz erreicht hat, werden wie
unter Punkt 4.2 beschrieben trypsiniert.
F Die Hälfte der Zellsuspension aus
dem Trypsinierungsvorgang wird mit
Kulturmedium auf 50 ml ergänzt.
F Je 2 ml verdünnte Vero-Zellsuspension wird zu den Löchern einer
24 Loch-Zellkultur-Testplatte gegeben.
F Die Zellen werden so lange bei 37 °C
und 5 % CO2 inkubiert, bis sie einen
konfluenten Zellrasen bilden (ca.
24–48 Stunden).
F Die Medienüberstände von jeder Kultur werden bis auf ca. 200 μl entfernt.
(Achtung! Die Zellen müssen immer
mit ca. 200 μl Kulturmedium überdeckt sein, damit sie nicht austrocknen!)
F Nach dem Auftauen der Proben oder
Wischproben werden diese während
30 Sekunden im Wasserbad mit Ultraschall homogenisiert (Achtung! Geeignete Einstellung des Ultraschallgerätes wählen, um Probe nicht zu schädigen!)
F 500 μl jeder zu untersuchenden
Wischprobe oder maximal 107 Pfu
eines Vacciniavirus-Überstandes werden mit 1 ml Kulturmedium versetzt.
F Je 300 μl dieser verdünnten Probe (Wischprobe bzw. VacciniavirusÜberstand) werden auf je 4 Loch-Kulturen der 24-Loch-Zellkultur-Testplatte transferiert.
F Als Negativ-Kontrolle dient das reine
Kulturmedium.
F Als Positiv-Kontrolle können mit Kulturmedium verdünnte, zuvor schon
validierte Vacciniavirensuspensionen
verwendet werden (im Minimum
10 Pfu pro Loch).
F Für die Infektion werden die Zellen
während 1 Stunde bei 37 °C und 5 %
CO2 inkubiert. Die Zellkultur-Testplatte wird während dieser Zeit alle
15 Minuten 3 x leicht gewippt, um ein
Antrocknen der Zellen in der Mitte
des Zellrasens zu verhindern.
F Nach 1 Stunde werden die Zellkulturen mit je 1,5 ml Kulturmedium ergänzt.
4.4 Inkubation und Färben der
Zellkulturen
(Es können auch die Standardanleitungen
aus entsprechenden Methodensammlungen verwendet werden.)
F Die Zellkultur-Testplatte wird nach
der Infektion bei 37 °C und 5 % CO2
während 72 Stunden inkubiert.
F Die Kulturmedien werden vorsichtig
entfernt und verworfen (Achtung! Potenziell infektiöses Material! Zum Inaktivieren am besten mit einem Vakuumabsaugsystem direkt in einen Behälter mit einem geeigneten Desinfektionsmittel absaugen.)
F 200 μl Färbelösung zum Boden jeder
Kultur geben und durch Wippen auf
dem gesamten Zellrasen jeder Kultur
verteilen.
F Nach ca. 60 Sekunden Färbelösung
absaugen und Zellkultur-Testplatte an
der Luft in der Sicherheitswerkbank
trocknen.
5 Auswertung
Plaques sind mit bloßem Auge als helle,
durchsichtige Punkte/Flecken in einem
blauen Hintergrund (gefärbte Zellen)
sichtbar. „Echte“, durch Viren erzeugte
Plaques können von anderen Löchern
im Zellrasen unter dem Mikroskop leicht
unterschieden werden, da die Zellen am
Rand des Plaques eine veränderte Morphologie aufweisen und zudem viel intensiver gefärbt sind (dunkelblau).
6 Ringversuch
Im Jahr 2002 wurde diese Methode durch
den Unterausschuss „Methodenentwicklung“ des LAG in einem Ringversuch vali-
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Fachnachricht
diert, an dem insgesamt 6 bundesdeutsche
und ein Schweizer Überwachungslabor
teilnahmen. Alle 7 Laboratorien wendeten die vorliegende Nachweismethode
„mit Erfolg“ an.
An jeden Teilnehmer waren 4 codierte
Proben, jeweils 2 Proben mit rekombinanten Vacciniaviren, eine positive Kontrollprobe (Wildtyp Vacciniaviren) sowie
Puffer als Negativprobe, verschickt worden. Diese 4 Proben wurden von allen beteiligten Laboren richtig erkannt.
Diese Methode beruht auf einer Standard-Arbeitsanweisung (SOP) des kantonalen Laboratoriums Basel-Stadt (SOP
P283), deren Entwicklung finanziell durch
das Schweizer Bundesamt für Umwelt,
Wald und Landschaften (BUWAL) unterstützt wurde.
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Prionen und Retroviren - eine
unheilige Allianz? – Expression
endogener Retroviren ist nach
Prionen-Infektion verändert
Im Rahmen des ausgelaufenen Bayerischen
Forschungsverbundes Prionen (FORPRION)
konnte ein Team um die Wissenschaftlerin
Prof. Dr. Christine Leib-Mösch zeigen, dass
Prion-Proteine in infizierten Gehirnzellen
endogene Retroviren aktivieren können.
Die Gruppe sucht am Institut für Molekulare Virologie des GSF-Forschungszentrums
für Umwelt und Gesundheit in Neuherberg/
München (Helmholtz-Gemeinschaft) nach
zellulären Komponenten, deren Regulation
infolge einer Prion-Infektion verändert
ist. In Zusammenarbeit mit Kollegen der
Technischen Universität München und der
Universität Heidelberg konnten sie mit
Mikroarry-Techniken – Mikroarrys sind Chips
mit Tausenden oder Zehntausenden von
DNA- oder Protein-Proben – nachweisen,
dass die Expression von endogenen Retroviren im Mausmodell durch Infektion mit PrionProteinen beeinflusst wird.
Prionen – Kurzform für proteinaceous
infectious particles – gelten als Auslöser für
eine Reihe von Erkrankungen des Gehirns
und Nervensystems, den so genannten spongiformen Enzephalopathien. Zu diesen zählen unter anderem BSE bei Rindern, Scrapie
bei Schafen und Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
bei Menschen. Prionen sind Strukturvarianten von Proteinen, die auch in gesunden Geweben – vor allem im Gehirn – vorkommen.
Das Fatale an Prionen ist, dass sie, einmal in
den Organismus eingedrungen, ihre „gesunden“ Verwandten strukturell so modifizieren
können, dass diese ebenfalls pathogen
werden und die Erkrankung fortschreiten
lassen. Über die molekularen Mechanismen
der Pathogenese, die Rolle von Ko-Faktoren
und die Interaktion von Prion-Proteinen mit
zellulären Bestandteilen ist allerdings immer
noch wenig bekannt.
Retroviren wiederum bauen ihre genetische Information in das Erbgut ihrer
Wirtszellen ein. Bei endogenen Retroviren
handelt es sich um Überreste von lang zurückliegenden retroviralen Infektionen, die
über viele Generationen über die Keimbahn
weitergegeben wurden. Nahezu zehn Prozent des gesamten Genoms der Maus und
des Menschen bestehen aus endogenen
retroviralen Sequenzen, die sich im Verlauf
der Evolution akkumuliert haben. Die meisten Strukturgene der endogenen Retroviren
sind zwar inaktiviert, aber viele regulatorische Elemente, wie zum Beispiel Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren, sind häufig
noch aktiv und können benachbart liegende
zelluläre Gene beeinflussen.
Die GSF-Wissenschaftler infizierten in
Kultur gehaltene neuronale Mauszellen mit
Prion-Proteinen und analysierten anschließend die Expressionsmuster der endogenen
Retroviren. Die Ergebnisse zeigten, dass die
Expression einer ganzen Reihe endogener
retroviraler Sequenzen durch die PrionInfektion beeinflusst wird: Im Vergleich zu
nichtinfizierten Zellen nahm die Expression
– je nach Zelllinie und Art der untersuchten
endogenen Retroviren – zum Teil zu, zum
Teil aber auch ab. Durch Pentosan-Polysulfat,
einem Anti-Prion-Präparat, konnten diese
Effekte unterdrückt werden, das heißt die
Beeinflussung der Expression ist tatsächlich
auf Prionen zurückzuführen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass Prion-Proteine nicht nur mit Hilfe von Viruspartikeln
verbreitet werden, sondern möglicherweise
sogar die Produktion solcher Partikel durch
Aktivierung von endogenen Retroviren selbst
anregen. Diese Retrovirus-ähnlichen Partikel
könnten dann dazu benutzt werden, PrionProteine von Zelle zu Zelle zu transportieren
und so die Infektion zu verbreiten.
Quelle: GSF-Forschungszentrum
für Umwelt und Gesundheit
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