ist pathologie
Werbung
Andras Kiss dr. med. habil, Ph.D., D.Sc. Semmelweis Universität, Budapest II. Institut für Pathologie den 17. Oktober, 2016 Makroskopische Pathologie Rokitansky- Wien 1840 Pathologische Anatomie Lobar and Broncho-Pneumonie Morgagni,1761 GI Krankheiten Virchow,1858 „Zellularpathologie” Watson & Creek, 1953 DNS Struktur XX. Jahrhundert Technologien • Makroskopie (Zuschnitt) • Zytologie • Histologie • Zytochemie • Immunhisto/zytoschemie • Elektronmikroskopie • • • Molekular Biologie Molekulargenetik XXI. Jahrhundert KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch AAA: Amicability Availability Affinity Freundlichkeit Verfügbarkeit Verbundenheit, Affinitat P4 Predictive Preventive Personalized Participatory prediktiv preventiv personalisiert teilnehmend, partizipativ KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch Allgemeine Probleme: - Tumorheterogenitat: biologische und diagnostische Bedeutung GEWEBSNAHME, Biopsie: Art und Menge - therapeutische Protokolle / Genehmigungsprotokolle und die Revision im Spiegel neue Ergebnisse Zieltherapien: - Einführung neuer Therpien, Anderung klinischer Protokolle (verwendbar in der ersten oder zweiten Linie ) - Einführung neuer, moderner diagnostischer Methode TRANSIT-ZEIT , QUALITATVERSICHERUNG ! EINGANGSMATERIAL • RESEKATE • Bioptaten – Zylinder/ Excision • Zelle – CYTOLOGIE • Flüssigkeit • Menschlicher Körper Die Arbeit der Pathologe • Histologische Analyse, Diagnose, Befund/Kommentar • Cytologie – zellulare Morphologie • Spezielle Untersuchungen: weitere Pünktlichkeit der Diagnose • Autopsie und Auswertung der Befunde • Unterrichtung • Konsultation ( mündlich auch !!!) Biopsien • Zytologie – Bürsten – Flüssigkeit – FNAB (Aspirationszytologie) • Bioptat für Histologie – Exzisionsbioptat (direkt, geöffnete OP, Videoassistiert) – Stanze (core) – Endoskopisch Gezielte Biopsie • visuell – Oberflachliche Lokalization, Körperhöhle, Organe mit Lumen • Bildgebende Verfahren (UH, CT, MR) – tiefe Lokalization Zytologische Materialnahme Exfoliative Zytologie (Bürste) • Oberflachliche Lasionen der schmalen, luminierten Stukturen =intraepitheliale oder invasive Tumoren (Zervix, kleine Bronchien, Gallengange) • Abstrich: viele normael/reaktive epitheliale Zelle • Fehlermöglichketi:reaktiv vs. maligne – Dysplasie vs. invasiver Tumor Feinnadelaspirationsbioptat (FNAB) • Einfache Gerate (Nadel, Spritze) • Gezielt – USCHALL (schnell, einfach, real time gezielt, ertse Wahl) – EUSCHALL (Sturkturen, Bildungen in der Nahe von luminierten Organe z.B. Pankreas, hilare LK) – CT (mit USCHALL nicht lokalizierbare Lasion, Bildungen in der Brustkorb: langeres Verfahren, Zielung nach fixierter Aufnahme KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch AAA: Amicability Availability Affinity Freundlichkeit Verfügbarkeit Verbundenheit, Affinitat P4 Predictive Preventive Personalized Participatory prediktiv preventiv personalisiert teilnehmend, partizipativ KOMPLEXITAT der KREBSTHERAPIE, TEAMARBEIT – systemisch Allgemeine Probleme: - Tumorheterogenitat: biologische und diagnostische Bedeutung GEWEBSNAHME, Biopsie: Art und Menge - therapeutische Protokolle / Genehmigungsprotokolle und die Revision im Spiegel neue Ergebnisse Zieltherapien: - Einführung neuer Therpien, Anderung klinischer Protokolle (verwendbar in der ersten oder zweiten Linie ) - Einführung neuer, moderner diagnostischer Methode TRANSIT-ZEIT , QUALITATVERSICHERUNG ! Routinverfahren der Histologie 1. Makroskopische Untersuchung – „Zuschnitt” 2. Fixierung der ausgeschnittene Gewebsblöcke Szövettani asszisztens 3. Schneiden 4. Farbung 5. Untersuchung Was zuschneiden? Färbungen • RUTINE: – haematoxylin-eosin (HE) – – – – PAS (perjodsaure-Schiff) Alzianblau + PAS Giemsa Papanicolau Speziale Färbungen Masson Nissl Grimelius Kristallviolet Best Gomori Schmorl Gram Ziehl-Neelsen Gallyas Romeis Van Gieson Orcein Grocott Tri-chrom Mallory Resorcin-fuchsin Kongo-rot Versilberung Kossa Endoskopie Magenbioptat 2 mm Helicobacter pylori Giemsa Warthin-Starry Färbung Amyloidose Kongo-rot Kongo-rot: in POLARIZIERTEM LICHT Metastase TUMORDIAGNOSTIK, Aufgabe der Pathologie Malignitat ausschliessen oder beweisen (so gut, wie möglich !) Was ist möglich ? - Histologie - Zytologie (Beschränkung: Nr. Der Blöcke, Serienschnitte) - Immunhistochemie - Molekular-Pathologie (FISH, PCR, usw.) GENETIK, CYTOGENETIK PATHOLOGIE MICROBIOLOGIE Pathologische Diagnose Klinisches Laboratorium Medizinische Mikrobiologie Pathologie - Anatomische Pathologie (+ klinische Pathologie) - Molekular-Pathologie Cytologie Histologie Immunohisstochemie Flow Cytometrie Molekular-Pathologie MORPHOLOGIE Schnitte: in 2 Dimension !! Biologische Strukturen: in 3 Dimension !! 1 2 3 4 1 2 3 5 4 5 6 6 Invazives Zervix Karzinom MOLEKULARE PATHOLOGIE Molekulare Biologie = Molekulare Pathologie MULTIDISZIPLINARES GEBIET Behandlung des Materials, Diagnose Stellung und Interpretation der Befunden benötigen Konsultation ! Ideale Tumormarker für Krebs HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER Ng/mL | 0.0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 100% Specificity | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 | 8.0 100% Sensitivity | 9.0 | 10.0 | 100.0 Realität der Untersuchungen HEALTHY & BENIGN DISEASE CUTOFF CANCER | 0.0 | 1.0 | 2.0 | 3.0 20% FALSE NEG. | 4.0 | 5.0 | 6.0 | 7.0 70% FALSE POS. | 8.0 | 9.0 | 10.0 | 100.0 Human Genom und Krebs • Alle Tumoren entstehen durch genetische Veränderungen • Tumorigenesis ist ein multi-step Prozess • ungefähr 5% bis 10% der Tumoren ist hereditär Tumor Diagnostik in der Pathologie Klassische Histoloige Immunhistochemie Molekular diagnostische Methoden Allgemeine Bemerkungen - SPECIFIZITAT, SENZITIVITAT - Wofür ist Pathologie (inkl. Molekulare Pathologie) ? FRAGEN ? Was sagt die Morphologie / genetische Information ? Entwicklungsanomlaie ? Vererblich ? Entzündung ? Akut oder chronisch ? Geschwulst ? Tumor like lesion, benigne, maligne ? Therapie / Prognose / Prediktion ! Allgemeine Bemerkungen malignus Tumoren: Fragen ? Primar oder sekundar (Metastase) ? When Metastase: wo ist Primartumor ? Therapie ? Parameters zu Therapie: grade und stage sind Therapie bstimmend: Resektion + Radiotherapie + Chemotherapie (preoperative oder postoperative) KOMMUNIKATION mit der Kliniker ! Sicherlisch maligne, sicherlich benigne: O.K. Pathologe weisst nicht: WARUM ? Chirurgische Resekate: R0 ? Resektionsrande ? Die Bedeutung des Genotypes Klassifizierung !! Klinikum Immunphenotyp Genetische Alterationen/Aberrationen Diagnosestellung Beurteilung der Prognose !! ansprechende Therapie ! Kontrolle ! Folgung ! Krankheit Therapie = personalisierte Therapie !! Formalin fixiertes, Paraffin Eingebettetes Material: FFP (E) ► Warum ? ► Grosses Basis von Material + Daten ► Was möchten wir erreichen ? ► Alles, aber …….. ► - DNA - RNA - PROTEIN Sequenzieren Klonieren MUTATION ANALYSE mRNA EXPRESSION (real time RT-PCR, DNA CHIP) mikroRNAs IMMUNHISTOCHEMIE WESTERN BLOT ANALYSE PROTEOMICS Optimel Grösse ? 5 mm dick alternatve Methode: RNAlater, Stickstoff z. B.: 8 cm- grosser Tumorresekat Mitte des Resekates: Nicht fixiert bis zu 3-4 Stunden: Degradierung !! + OP: relative Ischemie Was wirkt auf das Gewebe ? ? FORMALINE ( gepuffert ?) Crosslinking PROTEIN DEGRADIERUNG KONFORMATION Veranderung Brüche ALKOHOL Reihe Temperatur!!! PARAFFIN (trcokenes Warme !! ) PROTEINE und DNA, RNA Crosslinking (Methylol crosslink) DNA, RNA DEGRADIEUNG DN, RNA Brüche „ Wahre ” Schlussfolgerungen ? Frage: wozu ist dieses FFPE Material geiegnet ? Qualitative Analyse der Makromolekulen von FFPE Material • Histologie: – PRIMAR – Grosser informativer Hintergrund (KENTNISS) • PROTEIN – Immunohistochemie • Molekulare Analyse • Optimalisierung/ Erschliessung „ Kompensierung der Schadigugn „ – Isolierte Proteine • NUKLEINSAURE • DNS – Lange • RNS – Lange – Quantitat – Empfindlich Wirkung der Zeit der Fixierung an die Gewebsarchitektur 1 Tag 3 Tage 10 Tage Wirkung der Zeit der Fixierung an die Qualitat des isoliertes DNA 3Tage 1 Tag 10 Tage Wirkung der Zeit der Fixierung an die Qualitat des isoliertes RNA 3 days 1 day 10 days FFPE MATERIAL Gewebslokalisation In vitro Immunhistochemie DNA Techniken In situ Hibridisierung RNS Techniken (CISH, FISH) Protein Techniken NUKLEINSAURE ISOLATION DEPARAFFINIERUNG (Xylol + Alkoholreihe, Puffer „Verdauung „ (Proteinase-K) Nukleinsaure Isolation (Phenol/Chloroform) Prezipitation Auflösung in Puffer A. GAPDH PCR - DNA B. GAPDH RT-PCR Reaktion - cDNA C. Lebergewbe - HCV Test mit nested RT PCR RNA Integritat Kontrolle mit Gelelektrophorese 1 11 2 12 13 3 14 4 15 5 16 6 17 GAPDH RT PCR 7 18 8 19 9 20 10 21 22 Results of Real-time PCR on paraffin embedded normal human endometrium samples fixed with RNAlater™, acetone or formalin, showing 121, 225, 406 basepair (bp) products for GAPDH and 166, 310, 536 basepair products for [beta] globin. Páska és mtsai: Diagn Mol Pathol. 2004 Dec;13(4):234-40. Páska und Mitarbeiter: Diagn Mol Pathol. 2004 Dec;13(4):234-40. Different Size Amplicon GAPDHs and [beta] Globins’ Real-Time PCR CT (Threshold Cycle Number) Values (Mean ± SD) for RNAlater, Acetone, and Formalin Fixatives and Differences of Expression Between Fixatives Ratio of Downregulation of Longer Transcript Detection (225- and 406-bp GAPDH, 166and 310-bp [beta] Globin) Compared to the Smallest Amplicon (121-bp GAPDH) in the Various Fixatives, Respectively. Welche Methode ist geeignet ? ? FORMALIN (buffered ?) „Cross links” zwischen Proteine PROTEIN DEGRADIERUNG CONFORMATION CHANGE BREAKS ALKOHOL REIHE TEMPERATUR!!! PARAFFIN (trockene Warme) PROTEINE und NUKLEIN SAURE CROSSLINKS (Methylol Kreuzbindungen) DNS, RNS DEGRADATION DNS, RNS BRICHT Können „ Wahre ” Konklusions festgestellt werden von FFPE Material Frage: What could be answered from FFPE material ? ? Qualitatsanalyse der isolierten Makromolekulen von Paraffin eingebetteten Material (FFPE) • Histologie: – PRIMAR – Riesige Menge Information Hintergrund (Wissen und Wissentschaft) • PROTEINS – Immunohistochemie • Molekulare Analyse • Optimisierung /” retreaval „Eröffnung der Antigene • Schadenkorrektion – Isolierte Proteine • NUKLEINSAURE • DNA – Lange • RNA – Lange – Quantitat und Qualitat – EMPFINDLICHST FFPE Material Gewebe Lokalisation In vitro Immunhistochemie DNA basierte Techniken In situ Hybridisation RNA basierte Techniken (CISH, FISH) Protein basierte Techniken MILESTONE TissueSAFE High Vacuum Biospecimens Transfer System ™ 34 C° !!! Niere, 0. Tag, Niere, 3. Tag, HE, 400x HE, 400x VAKUUM FOLIE GEPACKT, PARRAFFIN EINGEBETTETE NIERE Niere, 6. Tag, Niere, 10. Tag, HE, 400x HE, 400x Niere, 0. Tag, Niere, 3. Tag, PAS, 400x PAS, 400x VAKUUM FOLIE GEPACKT, PARRAFFIN EINGEBETTETE NIERE Niere, 6. Tag, Niere, 10. Tag, PAS, 400x PAS, 400x Niere, 0. Tag, Niere, 3. Tag, CD-10, 400x CD-10, 400x VAKUUM FOLIE GEPACKT, PARRAFFIN EINGEBETTETE NIERE Niere, 6. Tag, Niere, 10. Tag, CD-10, 400x CD-10, 400x FRAGMENTATION der isolierten DNS von Vakuum Folie Proben LEBER DAY: VAKUUM, 0. NIERE 1 3. 6. 0. 4. NIERE 2 7. 10. 0. 3. NIERE 3 6. 0. 4. 7. MAGEN CC. 10. 0. 3. 6. dann: -80Co 1000 bp 500 bp Einbettung 1000 bp 500 bp Nap: 0. 3. 6. LIVER 0. 4. 7. 10. KIDNEY 1 0. 3. 6. 0. 4. 7. KIDNEY 2 KIDNEY3 10. 0. 3. 6. GASTRIC CC Formalin Fixierung, dann Einbettung ~0,5 µg DNS/Probe, 1.2% Gel 1000 bp 500 bp Nap: 0. 3. 6. NIERE 2 0. 4. 7. 10. NIERE 3 0. 3. 6. MAGEN CC. Immunhistochemie - Deparaffinization - Antigen Eröffnung / Mikrowelle Behandlung Substrat Farbe Reaktion - Blockierendes Serum Peroxiase - Primar AK Biotin - Secekundare AK - Avidin - Biotin - Komplex Avidin Sekundar AK Anti-Maus Anti-Hase AK AK - Peroxidase Reaktion / DAB / - Hingergrund Farbung / haematoxylin (Nuklei sind blau/) Primar AK prod. in Maus Blockierende Proteine Antigen prod. in Hase PATHOLOGIE – Lungenkrebs Kleinzellig (SCLC) ? Nicht-Kleinzellig (NSCLC) Subtyping of undifferentiated non-small cell carcinomas in bronchial biopsy specimens. Loo PS, Thomas SC, Nicolson MC, Fyfe MN, Kerr KM. J Thorac Oncol. 2010 Apr;5(4):442-7. A reevaluation of the clinical significance of histological subtyping of non--small-cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review. PATHOLOGIASCHE DIAGNOSTIK PRIMER TÜDŐRÁK NE markerek + TTF-1 + p63 – HMWCKs (CK 5/6) – CD56 + Neuro-endokr. markerek EGYÉB NSCLC, n.o.s. SQC SCLC / LCCNEC ADC TTF-1 + p63 – CK7 + HMWKCKs - - rosszul diff. carcinoma átmeneti fenotípus TTF-1 P63 - TTF-1 p63 + CK7 -/+ CK 5/6 + HMWKCKs + S100A7 + A reevaluation of clinical significance of histological subtyping of non-small cell lung carcinoma: diagnostic algorithms in the era of personalized treatments. Rossi G, Pelosi G, Graziano P, Barbareschi M, Papotti M. Int J Surg Pathol. 2009 Jun;17(3):206-18. Review CITOLÓGIAI MINTAVÉTEL hazai gyakorlat Bronchoszkópos ( + transthroracalis) szövettani mintavétel 1 Bronchoszkópos citológiai mintavétel 4 Hátránya: - mintavételi hibák - fixálási hibák - kevesebb pontos diagnózis Rezekat Makrodissektion….. Transbronchiale Bioptat T/N<1:8 T/N <1:2 Bronchus Bürstenzytologie T/N>1/10 (10%) T/N>10/1 (90%) SQC TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + p63 TTF-1 SQC HMW CK TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + Chromogranin Bronchoskopie - Bioptat p63 p63 SQC TTF-1 TTF-1 p63 + CK 5/6 + HMWKCKs + CK7 -/+ S100A7 + TTF-1 ADC TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + CK-7 TTF-1 ADC CK-7 TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + TTF-1 Bronchoskopie - Bioptat CK7 CK7 ADC TTF-1 TTF-1 + p63 – HMWKCKs – CK7 + TTF-1 50,297 80 jahriger Mann Anamnese: Strumektomie, Diabetes Mellitus Typ II. Parkinson Krkht., Katarakt (opus) Stroke Gehirnatrophie, Demenz Ösophagusgeschwür Hospitalization wegen Bronchitis Stazionierung: Hypoglikämie, Exsiccation Gastroskopie: Histologie: Magenkarzinom US: multiplexe Lebermetastasen – Asp. Zytologie, FNAB : Metastase von kolorektalem Karzinom ??? Primär Tumor ??? Gravis Anämie - Transfusionen - Tod unter tumoröser Kachexie CK-20 CK-7 DARM – Sigma cc. CK-20 CK-7 Magen cc. CK-20 CK-7 LEBER MET. IHC: Lebermetastase des Koloncc. Haupterkrankung / Grunderkrankung: Magenkarzinom (cardia) Komplikation 1. (zu dem Tod führend / dem Tod vorgehend): tumoröse Infiltration der Milz Lymphknotemetastase (neben truncus coeliacus) Anämie Lungenembolie Dilatation des linken Ventrikels - Herzinsuffizienz Lungenödem Hydrothorax Atelektasie (l.s.) Todesursache: Begleitskrankheiten: Nebenkrankheiten: tumoröse Kachexie Sigmakarzinom Sigmakarzinom Metastasen der Leber Gehirnatrophie Status lacunaris cerebri Meningeom Nephrosclerosis arteriolo et artriosclerotica akute Bronchitis Nierenhypoplasie (l.s.) MOLECULARE PATHOLOGIE • Tumor Diagnostik • Diagnostik der Infektionskrankheiten • Diagnostik der genetischen Krankheiten Danke für Ihre Aufmerksamkeit !
