V2 - Nippon

Gruppe 12: Christopher Rose, Florian Binder, Stefan Weiß
Protokoll zu Versuch 2 : Isolation von N-ERMAD aus
E.coli
Ziel des Versuchs:
Isolation von N-ERMAD (Ezrin-Radixin-Moesin association domain) aus E.coli. Dieses
Protein ist ein Bestandteil des Membranproteins Ezrin. N-ERMAD ist der N-Terminus von
Ezrin und ist über eine -Helix mit C-ERMAD verbunden. Der C-Terminus enthält eine
Bindungsstelle für F-Aktin. Ezrin trägt durch Verknüpfung von Zellmembran mit CytoskelettFilamenten zur Zellgestalt bei.
Um den N-Terminus von Ezrin in größeren Mengen zu gewinnen, wurde das Gen für NERMAD in das Genom von E.coli Bakterien eingebaut. Dazu werden die Bakterien vermehrt
und das Protein durch E.coli synthetisiert. Um die Reinigung von N-ERMAD zu
vereinfachen, wurde an den N-Terminus noch 6 Histidin Moleküle angebaut (His-Tag).
Dadurch kann das Protein durch Affinitätschromatographie gereinigt werden.
Aufreinigung von N-ERMAD:
1. Im ersten Schritt werden die präparierten E.coli Bakterien (Resistenz gegenüber
Kanamycin und Gen für N-ERMAD + His-Tag) auf LB1-Platten mit 200 L Kanamycin
(30mg/mL) bei 37°C über Nacht kultiviert. Dabei entstehen Kolonien der Bakterien, die
weiter vermehrt werden können.
Eine der Kolonien wird entnommen und eine 5mL LB-Kultur (wieder mit Kanamycin
versetzt ) angeimpft. Diese wird wieder über Nacht bei 37°C inkubiert.
Von dieser Vorkultur wird eine 50mL Hauptkultur angesetzt (wieder mit Kanamycin), indem
1mL der Vorkultur in die 50mL gegeben werden.
Die Hauptkultur lässt man solange inkubieren, bis eine Absorbanz von 0,6 bei einer
Wellenlänge von 600nm erreicht wird.
Dann gibt man 1mM IPTG2 zu und kultiviert die Bakterien weitere zwei Stunden bei 37°C.
Auf diese Weise wird das Protein N-ERMAD von den Bakterien exprimiert. Kanamycin ist
ein Antibiotikum und verhindert das Wachstum anderer Bakterien in der Kultur. Die
Verwendeten E.coli Bakterien haben eine Resistenz gegen Kanamycin. Bei einer Absorbanz
von 0,6 sind genügend Bakterien vorhanden, um größere Mengen an N-ERMAD zu
produzieren. Die Zugabe von IPTG führt dazu, dass das Gen exprimiert wird. IPTG ist
Strukturverwandt mit Lactose und kann den Repressor vom lac-Operon durch Bindung
entfernen.
Die Bakterien werden anschließend auf Eis gestellt (um Zersetzung zu vermeiden) und dann
15 Minuten bei 4°C und 4000 rpm zentrifugiert. Die Bakterien setzten sich dabei als Pellet ab
und der klare Überstand wird verworfen. Das Pellet wird dann in 4mL Lysispuffer3
resuspendiert.
1
LB steht für (Luria-Bertani-Agar); Routinemäßig eingesetzter Agar zum kultivieren von Bakterien
Isopropyl- -D-thiogalactopyranosid
3
Lysispuffer besteht aus: 300mM NaCl, 1mM EDTA, 40mM HEPES (=Puffer, pKa: 7,3), 20mM Imidazol,
1,5mM PMSF (Proteaseinhibitor gegen Serin-Proteasen), 10mM Mercaptoethanol.
2
Der Lysispuffer hat mehrere Aufgaben:
Verbesserung der Löslichkeit der Proteine durch Zusatz von NaCl (Einsalzeffekt). EDTA
komplexiert Schwermetallionen, die Proteine denaturieren könnten. HEPES dient als Puffer,
um einer Zersetzung der Proteine vorzubeugen. Imidazol wirkt ebenfalls als Puffer. PMSF
verhindert eine Zersetzung der Proteine durch Proteasen. Mercaptoethanol bewirkt eine
Reduktion von Disulfidbrücken zu Mercaptogruppen.
Dann wird die Bakteriensuspension 4 x 30 Sekunden sonifiziert. (Behandlung mit
Ultraschall), um die Bakterien zu zerstören. Dabei werden die Proteine in den Lysispuffer
freigesetzt.
Das Lysat wird bei 4°C und 15000 rpm eine Stunde zentrifugiert.
Die Zellreste der Bakterien und im Lysispuffer unlösliche Proteine bleiben als Pellet zurück.
Im klaren Lysat befindet sich das gewünschte lösliche N-ERMAD und andere Proteine von
E.coli. Das Pellet wird verworfen.
Zur Reinigung von N-ERMAD wird Affinitätschromatographie angewandt. Durch den HisTag bindet das Protein an das Nickel-NTA-Gel4 in der Säule5. Das Gel wird vorher mit
Equilibrierungspuffer6 gespült. Dann gibt man das Lysat auf die Säule und wäscht mit 8mL
Waschpuffer I7 und danach mit 4mL Waschpuffer II8.
Die Proteine ohne His-Tag werden durch das Gel kaum gehalten und gleich wieder eluiert.
Der His-Tag von N-ERMAD bindet das Protein an das Gel.
Mit Hilfe des Elutionspuffers9 wird N-ERMAD eluiert. Es werden 5 Fraktionen mit 1mL
entnommen.
Histidin und Imidazol sind strukturell Verwandt, da beide einen Imidazol-Ring besitzen.
Durch starke Erhöhung der Imidazol Konzentration im Puffer wird N-ERMAD eluiert, da
jetzt Imidazol an das Gel gebunden wird.
Zur analytischen Untersuchung der einzelnen Fraktionen wurden von allen Teilschritten und
verworfenen Fraktionen Proben entnommen. Diese werden durch Anwendung der SDSPAGE auf ihren Proteingehalt untersucht. Jede Probe besteht aus 5L Probenlösung und
15L SDS-Probenpuffer10.
4
Nickel-NTA = Nickel-Nitrilotriessigsäure (Ni-NTA), mit vierfach komplexierten Nickel
sehr kleine Säule (=Pasteurpipette)
6
=Lysispuffer ohne PMSF und Mercaptoethanol
7
=25mM Imidazol, 40mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Mercaptoethanol, pH: 7,4
8
=35mM Imidazol, 40mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM MgCl2, 10mM Mercaptoethanol, pH: 7,4
5
9
=250mM Imidazol, pH: 7,4
SDS-Probenpuffer: 0,175mM Tris, pH: 6,8; 5%SDS (w/w), 15% Glycerin, 0,06g/L Bromphenolblau, 0,3M
DTT
10
SDS-Gelelektrophorese:
Die Gele werden in den Hohlraum zwischen 2 Glasplatten gegossen, die am Rand durch
Gummibänder abgedichtet sind. Das Gel besteht aus zwei Schichten. Zuerst wird die untere
Schicht (=Trenngel) gegossen11. Diese wird mit Wasser überschichtet und nach erfolgter
Polymerisation wird das Wasser wieder abgegossen. Danach wird das Sammelgel gegossen 12
Bevor dieses polymerisiert, gibt man einen Kamm hinein, um Taschen im Gel zu erzeugen, in
die man später die Proben einfüllen kann.
Es entsteht hierbei ein ca. 12,5%iges Gel. Ammoniumperoxodisulfat initiiert die radikalische
Polymerisation, wobei TEMED als Katalysator wirkt. Bisacrylamid bewirkt eine Vernetzung
des Gels.
Nachdem das Gel fest ist, werden die Proben in die Taschen des Gels gegeben. Da jede Probe
Glycerin enthält (das eine hohe Dichte hat), sinken die Proben in den Taschen ab. Dann
erfolgt die Auftrennung durch Anlegen des Stroms (15mA pro Gel). Das Sammelgel dient zur
Konzentrationserhöhung der Proteine, während die Auftrennung im stark vernetzten Trenngel
stattfindet. Die Zugabe von SDS zu jeder Probe hat den Sinn, Proteine in eine lineare,
gleichmäßig geladene Form überzuführen, um eine Auftrennung nach Masse zu ermöglichen.
Disulfidbrücken würden hier ebenfalls stören, doch diese sind schon durch Behandlung mit
Mercaptoethanol entfernt worden.
Die erhaltenen Gele13 zeigen die Effizienz de Reinigung. Das Lysat Ü enthält noch eine
Vielzahl an Proteinen, wobei man schon deutlich erkennen kann, dass eine Bande besonders
intensiv ist. Das sollte das Protein N-ERMAD sein. Die Probe von dem Pellet ist nur schwer
abzulesen, jedoch sind hier wie im Lysat eine Vielzahl von Proteinen enthalten.
Der Durchlauf D ist annähernd frei von N-ERMAD, alle anderen Proteine die schon in Ü
enthalten waren sind auch hier im Durchlauf.
Waschlösungen I und II sind annähernd frei von Proteinen. Die Elutionsfraktionen E1 bis E5
enthalten praktisch nur noch N-ERMAD. Wobei die Konzentration von E1 bis E5 konstant
abnimmt.
Molekulargewicht von N-ERMAD:
Aus Vergleich mit dem Standard ergibt sich eine molare Masse von etwa 55000 g/mol.
Konzentrationsbestimmung nach Bradford:
Die Konzentration an Protein in den Elutionsfraktionen werden bestimmt. Hierbei nutzt man
die bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums des Farbstoffs Coomassie Brilliant
Blue G250. Diese ist der Konzentration an Protein proportional.
Die Konzentration an N-ERMAD in den Elutionen wird mit Hilfe einer Eichgerade bestimmt.
Dazu werden verschiedene Konzentrationen an Serumalbumin mit Brilliant Blue Reagenz
versetzt und die Absorbanz gemessen.
11
entseht aus 4mL Trenngelstammlösung (H2O, 1,5M Tris pH: 8,8, Acrylamid-Bisacrylamid-Mix, SDS), 40L
Ammoniumperoxodisulfat und 2L TEMED.
12
entseht aus 2mL Sammelgelstammlösung (H2O, 1M Tris pH: 6,8, Acrylamid-Bisacrylamid-Mix, SDS), 20L
Ammoniumperoxodisulfat und 2L TEMED.
13
Ü: Lysat nach Sonifikation; Pell: Pellet nach 1h Zentrifugation; D: Durchlauf durch Säule; Wasch I und
Wasch II: Waschlösungen der Säule; E1-E5: Elution von N-ERMAD mit Imidazol
Die Konzentration beträgt dabei in der 1. Fraktion 7,3 g/mL und in der 5. Fraktion noch 1,9
g/mL.
Zusammenfassung:
Das Reinigungsverfahren für N-ERMAD war sehr gut, da man nach der Reinigung durch
Affinitäts-Cromatographie nur noch die Bande für dieses Protein auf dem Gel erkennen kann.
Die Bildung des Proteins durch E.coli war ebenfalls sehr effizient, da die Bande von NERMAD am stärksten ist. Das bedeutet, dass ein Großteil der gesamten Proteinmasse von
E.coli das gewünschte Protein ist. Die Elution durch hohe Imidazol-Konzentration war auch
wirksam, wobei immer noch ein Teil auf der Säule zurückbleibt, den man mit größeren
Mengen an Imidazol ebenfalls noch freisetzen könnte.