Diplodia mutila

„Apfelsterben“ im Streuobst- und
Bioanbau
Neuartiger Diplodia-Rindenbrand
Ein Forschungsvorhaben an der FA Geisenheim
2008 - 2010
Oliver Martinez, DLR R-N-H
2013_Martinez
Inhalt
•
Apfelsterben? Von der Meldung zum
Projekt
•
Symptome
•
Untersuchungen und Ergebnisse
•
Empfehlungen an die Praxis
2013_Martinez
Bedeutung
•
Seit 2003 Häufung der Meldungen beim
zuständigen Pflanzenschutzdienst Hessen
•
Hohe Resonanz in der regionalen und
überregionalen Presse
2013_Martinez
Symptome
Anschnitt mit scharf abgegrenzte nekrotischen
Bereichen
2013_Martinez
Symptome
Wachstums-, Frostrisse und andere Beschädigungen der Rinde
werden nicht mehr überwallt.
2013_Martinez
Symptome
Nekrosenbildung ausgehend von
Wachstumsriss
2013_Martinez
Symptome
Cankerexpansion mit flacher Nekrosenbildung
Absterben der Borke und äußerer Bastbereiche
2013_Martinez
Symptome
Infektion und Nekrosenausbildung kann
flach erfolgen oder…
2013_Martinez
Symptome
…Splint- und Kernholz betreffen
2013_Martinez
Symptome
Ausgeprägte Zerstörung weiter Kambialbereiche mit
Verschwärzung des offenen Splintholzes
2013_Martinez
Verbreitung
•
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•
2010 Maintal/Hochstadt
auf 2 km² sind 400 Bäume (Alter 5 bis 12 Jahre) akut erkrankt
über 1000 Bäume wurden in den letzten Jahren ersetzt
2006 Bad Vilbel Pflanzjahr 1988
2005 Rodenbach
2005 Rosbach v.d.H.
2005 Sindlingen ca. 100 Bäume –
Anlage ist inzwischen gerodet
2004 Wetzlar
2003 Ockstadt
Symptome sind in vielen Obst- und Gartenbauvereinen
bekannt
Nach der Pressemitteilung viele Rückmeldungen über
Schäden
2013_Martinez
Vorgehen
Isolierung
Probennahme/ Dokumentation
Aufbau einer Stammsammlung
• 15 ml Zentrifugenrörchen
• MA [2%] + Holzmehlauflage
• DD/ 4,5 °C
2013_Martinez
2013_Martinez
Bestimmung
 Gruppenbildung nach:
Anzucht der Isolate auf verschiedenen
Nährmedien und Inkubationsbedingungen
• Medien: OMA / PDA/ MA/ SNA
• Licht: WUV/ DUV/ DD
• Temp.: 20°C
auf makroskopischer und lichtmikroskopischer Basis
 In den Gruppen stichprobenartige DNA-Isolierung
 Amplifizieren und Sequenzierung eines Teilbereichs
der ITS-Region
Sequenzvergleich mit internationalen Gendatenbanken [Megablast NCBI, Mycobank]
 Lichtmikroskopische Absicherung der Ergebnisse
2013_Martinez
Pathogenitäts-Vortests
twig-assay [Pathogenitäts-Vortest] an 1jährigen Trieben unter
definierten Bedingungen
[nach H. BESSHO, S. TSUCHIYA & J. SOEJIMA (1994)]
Nekrosenlänge [mm]
• Inokulation auf ‚künstliche Nekrose‘
 Bonitur 10 dpi/ 24°C/ DD/ RLF ~ 80%/ n = 20
2013_Martinez
Pathogenitäts-Vortests
Cladosporium spp.
Fusarium lateritium
Nectria haematococca/Fusarium solani
Fusarium sporotrichioides
Fusarium spp.
Aureobasidium pullulans
Aureobasidium spp.
Peniophora cinerea
Schizophyllum communis
Eucasphaeria capensis
Leotiomycetes spp./Diplocarpon mali
Yarrowia lipolytica
Mucor circinelloides
Mucor spp.
Candida glabrata
Entomocorticium spp.
Alternaria spp.
Lewia infectoria
Sordaria spp.
Eucasphaeria capensis
Stachybotrys echinata
Hypocrea lixii / Trichoderma harzianum
Diplodia coryli
Diplodia juglandis
Botryosphaeria sarmentorum
Botryosphaeria cypressi
Sclerostagonospora spp.
Phaeosphaeria spp.
Diplodia scrobiculata
Epicoccum nigrum
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Trametes corrugata
Stenocarpella maydis
Botrytis spp.
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Nectria gliocladioides
Bionectria ochroleuca
Epicoccum nigrum
Gloeosporium spp.
Pezicula alba
Glomerella spp.
………..
Diplodia mutila (Botryosphaeria stevensii)
Diplodia seriata (Botryosphaeria obtusa)
Dothiorella sarmentorum (Diplodia malorum)
Cytospora schulzeri (Valsa malicola)
Eutypa lata
Nectria cinnabarina
Nectria galligena
TWA [10 dpi/ 24°C/ DD/ RLF ~ 80%]
2013_Martinez
Ergebnisse
TWA [10 dpi/ 24°C/ DD/ RLF 82%]
Cladosporium spp.
Fusarium lateritium
Nectria haematococca/Fusarium solani
Fusarium sporotrichioides
Fusarium spp.
Aureobasidium pullulans
Aureobasidium spp.
Peniophora cinerea
Schizophyllum communis
Eucasphaeria capensis
Leotiomycetes spp./Diplocarpon mali
Yarrowia lipolytica
Mucor circinelloides
Mucor spp.
Candida glabrata
Entomocorticium spp.
Alternaria spp.
Lewia infectoria
Sordaria spp.
Eucasphaeria capensis
Stachybotrys echinata
Hypocrea lixii / Trichoderma harzianum
Diplodia coryli
Diplodia juglandis
Botryosphaeria sarmentorum
Botryosphaeria cypressi
Sclerostagonospora spp.
Phaeosphaeria spp.
Diplodia scrobiculata
Epicoccum nigrum
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Trametes corrugata
Stenocarpella maydis
Botrytis spp.
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Nectria gliocladioides
Bionectria ochroleuca
Epicoccum nigrum
Gloeosporium spp.
Pezicula alba
Glomerella spp.
………..
Diplodia mutila (Botryosphaeria stevensii)
Diplodia seriata (Botryosphaeria obtusa)
Dothiorella sarmentorum (Diplodia malorum)
Cytospora schulzeri (Valsa malicola)
Eutypa lata
Nectria cinnabarina
Nectria galligena
2013_Martinez
Ergebnisse
TWA [10 dpi/ 24°C/ DD/ RLF ~ 80%]
Cladosporium spp.
Fusarium lateritium
Nectria haematococca/Fusarium solani
Fusarium sporotrichioides
Fusarium spp.
Aureobasidium pullulans
Aureobasidium spp.
Peniophora cinerea
Schizophyllum communis
Eucasphaeria capensis
Leotiomycetes spp./Diplocarpon mali
Yarrowia lipolytica
Mucor circinelloides
Mucor spp.
Candida glabrata
Entomocorticium spp.
Alternaria spp.
Lewia infectoria
Sordaria spp.
Eucasphaeria capensis
Stachybotrys echinata
Hypocrea lixii / Trichoderma harzianum
Diplodia coryli
Diplodia juglandis
Botryosphaeria sarmentorum
Botryosphaeria cypressi
Sclerostagonospora spp.
Phaeosphaeria spp.
Diplodia scrobiculata
Epicoccum nigrum
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Trametes corrugata
Stenocarpella maydis
Botrytis spp.
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Nectria gliocladioides
Bionectria ochroleuca
Epicoccum nigrum
Gloeosporium spp.
Pezicula alba
Glomerella spp.
………..
Diplodia mutila (Botryosphaeria stevensii)
Diplodia seriata (Botryosphaeria obtusa)
Dothiorella sarmentorum (Diplodia malorum)
Cytospora schulzeri (Valsa malicola)
Eutypa lata
Nectria cinnabarina
Nectria galligena
in 98%
in 24%
in 43%
in 9,8%
in 3,7%
in 0%
in 44%
in 0%
in 2,6%
in 0%
in 0,3 %
in 0 %
in 0,5 %
in 0 %
der Übergangsder angrenzenden symptomlosen
Bereiche nachweisbarProbestellen nachweisbar
2013_Martinez
Ergebnisse
TWA [10 dpi/ 24°C/ DD/ RLF 82%]
Cladosporium spp.
Fusarium lateritium
Nectria haematococca/Fusarium solani
Fusarium sporotrichioides
Fusarium spp.
Aureobasidium pullulans
Aureobasidium spp.
Peniophora cinerea
Schizophyllum communis
Eucasphaeria capensis
Leotiomycetes spp./Diplocarpon mali
Yarrowia lipolytica
Mucor circinelloides
Mucor spp.
Candida glabrata
Entomocorticium spp.
Alternaria spp.
Lewia infectoria
Sordaria spp.
Eucasphaeria capensis
Stachybotrys echinata
Hypocrea lixii / Trichoderma harzianum
Diplodia coryli
Diplodia juglandis
Botryosphaeria sarmentorum
Botryosphaeria cypressi
Sclerostagonospora spp.
Phaeosphaeria spp.
Diplodia scrobiculata
Epicoccum nigrum
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Trametes corrugata
Stenocarpella maydis
Botrytis spp.
Sphaeriothyrium filicinum
Glonium pusillum
Nectria gliocladioides
Bionectria ochroleuca
Epicoccum nigrum
Gloeosporium spp.
Pezicula alba
Glomerella spp.
………..
Diplodia mutila (Botryosphaeria stevensii)
Diplodia seriata (Botryosphaeria obtusa)
Dothiorella sarmentorum (Diplodia
malorum)
Cytospora schulzeri (Valsa malicola)
Eutypa lata
Nectria cinnabarina
Nectria galligena
invivo - Pathogenitätstest
• 6monatige ‚GD‘-Sämlinge
• 24°C/ 18°C [Tag/Nacht]
• n=20
• Inokulation
auf künstliche Nekrose
• Rückisolierung 26 dpi
• Bonitur 32 dpi
2013_Martinez
Ergebnisse
invivo
– Pathogenitätstest 32 dpi
Diplodia mutila
Diplodia seriata
D. sarmentorum
2013_Martinez
Gewächshausversuch
Mangelvariante: - 0,47 bis - 0,6 MPa
‚Optimalversorgung‘: - 0,05 bis - 0,12 MPa
‚Optimalversorgung‘: - 0,05 bis - 0,12 MPa
Mangelvariante: - 0,47 bis - 0,6 MPa
Wasserversorgung
Gesamtwasserpotentials Ψwpre [MPa; predawn]
Temperaturführung:
30°C/24°C [Tag/Nacht]
22°C/14°C [Tag/Nacht]
• Versuchsisolate:
- D. mutila [iso364/iso784]
- D. seriata [iso85]
- Kontrolle
• Infektion auf künstliche
Nekrose
• n = 40/Variante
• 8monatige-‘GD‘ Sämlinge
• auf 50 cm eingekürzt
• 4l – Gefäße
• Rückisolierungen 30/60 dpi
• Abschlussbonitur 104 dpi
2013_Martinez
Gewächshausversuch
2013_Martinez
Nekrosenlänge [cm]
Gewächshausversuch
Temperatur
Wasserversorgung
D. mutila-Isolat:
Temperatur:
Wasserversorgung:
Isolat 364
high
low
‚optimal‘
mangel
Isolat 784
2013_Martinez
Gewächshausversuch
2013_Martinez
Gewächshausversuch
b
a
2013_Martinez
10 mm
50 cm
11,5 cm
3,8 cm
Ergebnisse
Nekrosen verursacht durch D. mutila [30 dpi]
Abgestorbener Haupttrieb verursacht durch
D. mutila [30 dpi]
2013_Martinez
Ergebnisse
Nicht-infizierte Brandverletzung mit
beginnender Überwallung [30 dpi]
2013_Martinez
D. mutila
Rückisolierung
4 min.
3 Waschschritte
3 cm
3 cm
Nekrosenrand
NaOCl [3,5%]
Aqua dest.
Infektionsstelle
Inkubation
[MA [0,6 %], 24°C, DUV]
Nekrosenrand
3 cm
3 cm
Bestimmung
[lichtmikroskopisch]
2013_Martinez
D. mutila
3 cm
60 dpi
n=32
n=32
-
65 %
52 %
92 %
100 %
100 %
Rückisolierung
4 min.
3 Waschschritte
3 cm
Nekrosenrand
30 dpi
NaOCl [3,5%]
100 %
100 %
100 %
100 %
Aqua dest.
Infektionsstelle
Inkubation
[MA [0,6 %], 24°C, DUV]
Nekrosenrand
3 cm
3 cm
38 %
52 %
-
10%
Bestimmung
[lichtmikroskopisch]
2013_Martinez
10 cm
‚Nekrosenflöte‘ 32 dpi
D. mutila ‚iso784‘
Infektionsstelle
2013_Martinez
10 cm
1 cm
‚Nekrosenflöte‘ 32 dpi
D. mutila ‚iso784‘
Fruchtkörperbildung
Infektionsstelle
2013_Martinez
Freilandversuch
81 dpi
23 cm
26 cm
81 dpi
2013_Martinez
Infektionsversuch Frucht
Pathogenität:
D. mutila
D. seriata
Infektion in Tasche:
x
x
Auflage:
-
x
[Einwachsen über Lentizellen]
 Inkubationsbedingungen: GD/ 24°C/ DD/
RLF ~ 65%/ n = 20 / Variante
2013_Martinez
Wachstumskurven
22,5°C
23,5°C
Inkubation bei
• 4°C/ 12°C/ 18°C/20°C/ 24°C/
27°C/ 30°C/ 32°C/ 35°C
• DD
• RLF ~ 80%
• OMA (3%; n=5)
• PDA (n=5)
• twigs (n=20)
• Termin 9 dpi
28°C
2013_Martinez
Die Gattung Botryosphaeria spp.
Reich:
Abteilung:
U.Abt.:
Klasse:
Ord.:
Familie:
Gattung:
Bitunicate, keulenförmige Asci
Fungi
Ascomycota (Schlauchpilze)
Pezizomycotina (Echte Schlauchpilze)
Dothideomycetes
Botryosphaeriales C.L.SCHOCH, CROUS & SHOEMAKER 2007 Incertae sedis
Botryosphaeriaceae THEISS. & P.SYD.
Botryosphaeria spp.
1fach septierte,
pigmentierte Ascosporen
Ascomata
[Fotos: Phillips, 2004]
Anamamorphe: Diplodia spp., Lasiodiplodia spp., Fusicoccum spp., Dothiorella spp.
Pyknidien
Konidogene Zellen mit Konidien
Konidien
[ Diplodia-Typ]
2013_Martinez
Die Gattung
Botryosphaeria spp.
Gute Anpassung an Hitze und Trockenheit
• 10 °C Minimum
• 27 °C Optimum
• 35 °C Maximum
Starke Pigmentierung
Zahlreiche Wirtspflanzen v.a. aus dem subtropischen Bereich
Kolonie-Morphologie von D. mutila auf PDA [WUV; 25C°]
2013_Martinez
Zusammenfassung
• Hauptverantwortlicher: Diplodia mutila (Botryosphaeria stevensii)
• Gilt als Schwächeparasit – wird v.a. in Trockenstress praedisponierten Wirten parasitisch
• Wasserversorgung stärkster Einfluss auf Infektionsverlauf
• Endophytische Besiedlung
• Infektionen verlaufen meist flach am äußeren Rindenkambium
Verschleppung des Erregers tiefer ins Holz durch entomologische
Faktoren (Blausieb, Blutlaus, etc.) und andere Verletzungen
• Türöffnerfunktion‘ für weitere holzzersetzende
Basidiomyceten (Schizophyllum commune)
• Kein Einfluss sonstiger Faktoren feststellbar
• Standort und Versorgung betroffener Bäume (Boden-, Blattproben)
• Herkunft der Bäume (Baumschulen)
• Sortenanfälligkeit usw…….
2013_Martinez
Empfehlungen
Kontrolle
Bekämpfung
• Fungizide gegen Schorf wirksam
(=> Befall tritt vor allem in Streuobst und z. T. in Biobetrieben auf)
• Kupferpräparate ?
Prophylaxe
• Sorgfältige Auswahl der Anbauflächen
• optimale Bedingungen bei der Etablierung von Jungbäumen
• Ausschneiden befallener Partien bei beginnendem Befall
 Fungizidhaltige Wundverschlussmittel
• Beseitigung von Schnittholz (Verbrennen)
• gute Baumpflege
• gute Wasser- und Nährstoffversorgung
Praedisponierende Faktoren vermindern
2013_Martinez
Beteiligte
Organisationen
•
•
•
•
•
HMULV / Hr. Maltzahn
LLH / Hr. Poloczek
Forschungsanstalt Geisenheim
Fachgebiete für Obstbau und
Phytomedizin
JKI Dossenheim / Hr. Dr. Kollar
RP Giessen Dez. 51.4
Pflanzenschutzdienst Hessen
Frau Ulrich und Herr Fischbach
2013_Martinez
VIELEN DANK FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT
1 mm
0,5 mm
2013_Martinez