Mattern_Felix_Bos_taurus

Alterungsbedingte Effekte auf DNA-Methylierungsprofile
entwicklungsrelevanter Gene in Eizellen und Embryonen am
Modellorganismus Bos taurus.
Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades
der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg
vorgelegt von
Felix Mattern
geboren in
Issyk, Kasachstan
Würzburg, November 2016
Eingereicht am:
Mitglieder der Promotionskommission:
Vorsitzender:
Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. Thomas Haaf
Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Christian Janzen
Tag des Promotionskolloquiums:
Doktorurkunde ausgehändigt am:
Die vorliegende Arbeit wurde von Februar 2012 bis November 2016 am Institut für
Humangenetik der Universität Würzburg unter Betreuung von Herrn Univ.-Prof. Dr. med.
Thomas Haaf angefertigt.
Eidesstattliche Versicherung
Hiermit erkläre ich, dass ich diese Doktorarbeit selbständig und ohne Hilfe einer
kommerziellen
Promotionsberatung
sowie
ausschließlich
unter
Verwendung
der
angegebenen Quellen und Hilfsmittel verfasst habe. Die den herangezogenen Werken
wörtlich oder sinngemäß entnommenen Stellen sind als solche gekennzeichnet.
Weiterhin versichere an Eides statt, dass ich die Gelegenheit zum Promotionsvorhaben nicht
kommerziell vermittelt bekommen habe und insbesondere nicht eine Person oder
Organisation eingeschaltet habe, die gegen Entgelt Betreuer bzw. Betreuerinnen für die
Anfertigung von Dissertationen sucht.
Ich erkläre hiermit, dass die Regeln der Universität Würzburg über gute wissenschaftliche
Praxis eingehalten wurden. Die Dissertation wurde bisher weder in gleicher noch in ähnlicher
Form einer anderen Hochschule oder in einem anderen Prüfungsfach mit dem Ziel, einen
akademischen Grad zu erwerben, vorgelegt.
Am 21.10.2011 wurde mir von der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg der
akademische Grad „Diplombiologe“ verliehen. Weitere akademische Grade habe ich weder
erworben noch versucht zu erwerben.
Würzburg, Oktober 2016
_______________________________
Felix Mattern
INHALTSVERZEICHNIS
Inhaltsverzeichnis
ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................... 1
ABSTRACT......................................................................................................................... 3
1
EINLEITUNG ....................................................................................................... 4
1.1
EPIGENETIK ...................................................................................................................... 4
1.1.1 DNA-Methylierung ..................................................................................................... 5
1.1.2 Genomische Prägung ................................................................................................. 7
1.1.2.1
Funktion und Regulation geprägter Gene .................................................... 8
1.1.3 Fehlregulation geprägter Gene................................................................................ 10
1.1.3.1
Prader-Willi-Syndrom und Angelman-Syndrom ......................................... 11
1.1.3.2
Silver-Russel-Syndrom und Beckwith-Wiedemann-Syndrom..................... 12
1.1.4 Epigenetische Genomreprogrammierung ............................................................... 13
1.2
OOGENESE UND OOZYTENMATURATION .............................................................................. 15
1.2.1 Allgemeine Oogenese .............................................................................................. 16
1.2.2 Follikulogenese beim Rind (Bos taurus) .................................................................. 17
1.2.3 Oozytenmaturation ................................................................................................. 21
1.2.4 Ovarielle Alterung .................................................................................................... 24
1.3
ASSISTIERTE REPRODUKTION ............................................................................................. 25
1.3.1 Assistierte Reproduktionstechniken in der humanen Reproduktionsmedizin ....... 26
1.3.2 Assistierte Reproduktionstechniken bei Nutztieren ............................................... 28
1.3.3 Assistierte Reproduktionstechniken und gesundheitliche Risiken ......................... 29
1.4
IN-VITRO-MATURATION VON EIZELLEN................................................................................ 32
1.4.1 IVM in der humanen Reproduktionsmedizin .......................................................... 32
1.4.2 IVM beim Rind (Bos taurus) ..................................................................................... 34
1.5
DAS HAUSRIND (BOS TAURUS) ALS MODELLORGANISMUS DER HUMANEN REPRODUKTION............ 35
1.6
ZIELSETZUNG DER ARBEIT ................................................................................................. 36
1.7
UNTERSUCHTE GENE ....................................................................................................... 38
1.7.1 Genset 1: Oozyten- und Maturations-spezifische Gene.......................................... 38
1.7.2 Genset 2: Oozyten- sowie Alters-spezifische Gene ................................................. 42
I
INHALTSVERZEICHNIS
1.8
2
KONTAMINATIONSKONTROLLE ........................................................................................... 44
MATERIAL UND METHODEN ............................................................................ 45
2.1
MATERIAL ..................................................................................................................... 45
2.1.1 Biologisches Material ............................................................................................... 45
2.1.1.1
Unreife Eizellen aus Schlachttieren ............................................................ 45
2.1.1.2
Unreife Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters ................................. 46
2.1.1.3
In vitro gereifte Eizellen .............................................................................. 47
2.1.1.4
Rinderembryonen ....................................................................................... 47
2.1.2 Puffer ....................................................................................................................... 48
2.1.3 Kommerzielle Kits und Reagenzien.......................................................................... 49
2.1.4 Geräte ...................................................................................................................... 49
2.2
METHODEN ................................................................................................................... 50
2.2.1 Natriumbisulfitbehandlung der DNA von Eizellen und Embryonen ........................ 50
2.2.2 Limiting Dilution ....................................................................................................... 52
2.2.3 Primersequenzen und PCR-Bedingungen ................................................................ 55
2.2.3.1
Genset 1: Oozyten- und Maturations-spezifische Gene ............................. 56
2.2.3.2
Genset 2: Oozyten- sowie Alters-spezifische Gene .................................... 58
2.2.4 Methoden zur Bisulfitsequenzierung ...................................................................... 61
2.2.4.1
Pyrosequenzierung ..................................................................................... 62
2.2.4.2
Direkte Bisulfitsequenzierung ..................................................................... 66
2.2.5 Computerprogramme und Datenbanken ................................................................ 68
3
ERGEBNISSE .................................................................................................... 70
3.1
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE ENTWICKLUNGSRELEVANTER GENE IN UNREIFEN RINDEREIZELLEN .. 73
3.2
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE ENTWICKLUNGSRELEVANTER GENE IN IN VITRO-GEREIFTEN
RINDEREIZELLEN UND DARAUS GENERIERTEN RINDEREMBRYONEN........................................... 76
3.2.1 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in in vitro-gereiften
Rindereizellen ....................................................................................................... 76
3.2.2 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Rinderembryonen aus
in vitro-gereiften Rindereizellen........................................................................... 79
3.3
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE DER PROMOTORREGION BDNMT3LS IN UNREIFEN UND IN VITROGEREIFTEN RINDEREIZELLEN SOWIE DARAUS GENERIERTEN RINDEREMBRYONEN ......................... 84
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.4
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE ENTWICKLUNGSRELEVANTER GENE IN UNREIFEN RINDEREIZELLEN AUS
KÜHEN UNTERSCHIEDLICHEN ALTERS ................................................................................. 88
4
DISKUSSION .................................................................................................... 93
4.1
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE ENTWICKLUNGSRELEVANTER GENE IN UNREIFEN UND IN VITROGEREIFTEN RINDEREIZELLEN SOWIE DARAUS GENERIERTEN RINDEREMBRYONEN ......................... 93
4.1.1 DNA-Methylierungsprofile der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und
DNMT3Lo in unreifen und in vitro-gereiften Rindereizellen sowie daraus
generierten Rinderembryonen............................................................................. 93
4.1.2 DNA-Methylierungsprofile der Promotorregion bDNMT3Ls in unreifen und in vitrogereiften Rindereizellen sowie daraus generierten Rinderembryonen............... 97
4.2
DNA-METHYLIERUNGSPROFILE ENTWICKLUNGSRELEVANTER GENE IN UNREIFEN RINDEREIZELLEN AUS
KÜHEN UNTERSCHIEDLICHEN ALTERS ............................................................................... 102
4.3
BEWERTUNG DER LIMITING DILUTION-BISULFITSEQUENZIERUNG ZUR UNTERSUCHUNG VON BOVINEN
EIZELLEN UND EMBRYONEN........................................................................................... 106
4.4
5
SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK ................................................................................. 109
REFERENZEN...................................................................................................112
5.1
6
LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................. 112
VERZEICHNISSE ...............................................................................................131
6.1
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. 131
6.2
ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................... 135
6.3
TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................... 136
7
PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE ....................................................139
7.1
PUBLIKATIONEN ............................................................................................................ 139
7.2
KONGRESSBEITRÄGE ...................................................................................................... 140
III
ZUSAMMENFASSUNG
Zusammenfassung
Die postovulatorische Alterung sowie die ovarielle Alterung konnten bei der Anwendung
assistierter Reproduktionstechniken (ARTs) als entscheidende Faktoren identifiziert werden,
die den Reproduktionserfolg nachhaltig beeinträchtigen. Die postovulatorische Alterung tritt
ein, sobald die reife Eizelle nicht mehr innerhalb ihres physiologischen Zeitfensters
befruchtet wird. Die ovarielle Alterung beschreibt hingegen die Abnahme des Follikel-Vorrats
mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums bzw. des Ovars. Sowohl die
postovulatorische Alterung als auch die ovarielle Alterung führen u.a. zu einer reduzierten
Oozytenqualität und einer geringeren Blastozystenrate. Die Zielsetzung dieser Arbeit
bestand darin, den Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung im
Holstein-Rind (Bos taurus) auf die DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Gene in
Eizellen und Embryonen zu untersuchen. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert. Eizellen aus Follikeln der
Größe 3-5 mm wurden für 24h (physiologisch) und 48h (gealtert) in vitro gereift (IVM). Die
gereiften Oozyten wurden anschließend in vitro fertilisiert und Embryonen im 4-6
Zellstadium generiert. Sowohl in den unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher
Größe als auch in den gereiften Oozyten und den Embryonen wurde die
Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und
bDNMT3Ls analysiert. Zur Untersuchung der ovariellen Alterung wurden mittelgroßen
Antralfollikel aus Ovarien lebender Rinder (in vivo) unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 37 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNAMethylierung der Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN bestimmt. Als Methode zur Analyse der
Promotormethylierung wurde die Limiting Dilution Bisulfit-Sequenzierung angewendet.
In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm)
konnte ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten Genen bH19
und bSNRPN von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) identifiziert werden. Dieses Ergebnis
könnte eine mögliche Ursache einer bereits bekannten und mehrfach beschriebenen
geringeren Entwicklungskompetenz von Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) auf epigenetischer
Ebene darstellen.
Die verlängerte Reifungsdauer der IVM-Eizellen hatte eine signifikante Hypermethylierung in
der Promotorregion des Gens DNMT3Lo von 48h-gereiften Eizellen zur Folge. Beim Übergang
von 48h-gereiften Eizellen zum Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von
CpG7 des stammzellspezifischen Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle
wies ebenfalls einen signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem
Methylierungszustand in unreifen Eizellen mit steigender Follikelgröße auf. Da sich die
CpG-Position innerhalb eines Sequenz-Motivs einer Bindungsstelle des Transkriptionsfaktors
CREB befindet, könnten die Methylierungsdaten auf eine Interaktion zwischen dem
Transkriptionsfaktor CREB und der DNA-Methylierung während der Entwicklung und Reifung
der Eizelle sowie der Transition von der Eizelle zum Embryo hindeuten.
Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen
unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die ovarielle Alterung bei Rindern zwischen 9
Monaten und 11 Jahren zeigte damit keinen Effekt auf die DNA-Methylierung der
untersuchten Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN.
1
Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h
konnte eine Veränderung der DNA-Methylierung der Oozyten-spezifischen (DNMT3Lo) und
Stammzell-spezifischen (DNMT3Ls) Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von
DNMT3A, DNMT3L, beobachtet werden. Die veränderte DNA-Methylierung von DNMT3Ls
tritt dabei erst im frühen Embryo in Erscheinung und interagiert vermutlich mit dem
Transkriptionsfaktor CREB. Die Veränderungen von DNMT3Lo in Eizellen und DNMT3Ls in
den daraus generierten Embryonen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine dynamische
Anpassung des Embryos auf äußere Umweltbedingungen der Eizelle über die Methylierung
der DNA handelt.
2
ABSTRACT
Abstract
Postovulatory aging and ovarian aging have been identified as key factors in assisted
reproductive techniques (ARTs) and have a lasting effect on reproductive success.
Postovulatory aging occurs if the mature egg is not fertilized within its physiological time
window. On the other hand, ovarian aging describes the decrease in the follicular reserve
with increasing age of the female or the ovary, respectively. Both post-ovulatory aging and
ovarian aging result in reduced oocyte quality and lower blastocyst rate. The aim of this
thesis was to explore the effects of postovulatory aging and ovarian aging in Holstein cattle
(Bos taurus) on the DNA methylation of developmentally important genes in oocytes and
embryos. Antral follicles of different sizes (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm) were isolated from
slaughterhouse ovaries. Female germ cells from middle-sized follicles (3-5 mm) were
matured for 24h (physiological conditions) and 48h (aged conditions) in vitro (IVM). The IVMoocytes were subsequently fertilized in vitro and embryos at the 4-6 cell stage were
generated. Promoter methylation of the genes bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4,
bDNMT3Lo and bDNMT3Ls was analysed in immature oocytes from antral follicles of
different sizes as well as in matured oocytes and the respective embryos. For studying
ovarian aging, middle-sized antral follicles were obtained in vivo from animals of different
age groups (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years). In the extracted immature gametes, the
DNA methylation of the promoter regions of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN was examined. The limiting dilution bisulfite
(pyro)sequencing method was applied to determine the promoter methylation of the
candidate genes at the single allele level.
In immature oocytes from antral follicles of different diameters (<2 mm, 3-5 mm and> 6 mm)
an increased occurrence of abnormally methylated alleles of the imprinted genes bH19 and
bSNRPN was identified in small follicles (<2 mm). This failure to establish imprinting could be
a possible cause of a well-known reduced developmental potential of small follicles (<2 mm)
at the epigenetic level.
The extended maturation time of the IVM-oocytes resulted in a significant hypermethylation
in the promoter region of DNMT3Lo in 48h matured oocytes. After transition from 48h
matured oocytes to embryos, a significant hypomethylation of CpG7 of the stem cell specific
transcript DNMT3Ls was detected. The same CpG site showed a significant increase of CpGs
with unclear methylation state in immature female germ cells with increasing follicular size.
This CpG position is located within a potential binding site of the transcription factor CREB.
Thus, the methylation data indicates an interaction between the transcription factor CREB
and the DNA methylation during development and maturation of oocytes as well as during
transition from the oocyte to the embryo.
The DNA methylation profiles of the analysed genes in immature oocytes from cows of
different age (9-12 months, 3-7 years and 8-11 years) showed no significant differences
between age groups. Hence, the ovarian aging in cattle between 9 months and 11 years
caused no effect on the DNA methylation of bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo, bH19 and bSNRPN.
After a simulated postovulatory aging by in vitro maturation for 48h, a change in the DNA
methylation of the oocyte-specific (DNMT3Lo) and stem cell-specific (DNMT3Ls) promoters
of the catalytically inactive DNA-methyltransferase DNMT3L was observed. The altered DNA
methylation of DNMT3Ls occurs in the early embryo and probably interacts with the
transcription factor CREB. The changes of DNMT3Lo in oocytes and DNMT3Ls in the resulting
embryos might represent a dynamic adaptation to external environmental conditions.
3
EINLEITUNG
1
Einleitung
Lebende Organismen kennzeichnen sich neben einer Vielzahl von Eigenschaften
insbesondere durch die Fähigkeit zur Evolution [1]. Evolution im biologischen Sinne kann
verstanden werden, als „der Wandel von Merkmalen in Populationen von Organismen, der
die
Lebenszeit
eines
einzelnen
Individuums
überschreitet“[2].
Als
molekulares
Speichermedium zur Übertragung der zellulären Information hat sich bereits vor 3,5
Milliarden Jahren die Desoxyribonukleinsäure (DNA) etabliert [3]. Die DNA als Träger der
Erbinformation des Organismus bzw. der Zelle erlaubt Aussagen über die Vergangenheit
(bereits durchlaufene Evolution), Gegenwart (funktionelle Konstitution) sowie eine mögliche
Zukunft (Prognose basierend auf der funktionellen Konstitution) der Zelle(n). Die
Forschungsdisziplin der Genetik untersucht und erklärt, „wie Erbinformation weitergegeben
wird, wie sie molekular aufgebaut ist und wie sie in den Zellen eines Organismus
funktioniert“ [4]. Die Teildisziplin der „Molekularen Genetik“ „beschäftigt sich mit der
stofflichen Grundlage der Gene, der DNA, ihrer Struktur sowie der Umsetzung ihrer
Information und der Regulation der Genaktivität“ [4]. Nach der Identifizierung zahlreicher
Gene und der Aufklärung ihrer Funktion tritt zunehmend die Analyse der Regulation und
Organisation der Gene in den wissenschaftlichen Fokus. Mechanismen zur zeitlichen und
räumlichen Koordination der Genaktivität sind essentiell, um den Organismus bzw. die Zelle
flexibel und erfolgreich an sich verändernde äußere Umweltbedingungen anzupassen und
letztlich die Chancen zur Weitergabe bzw. Erhaltung der gesamten oder eines Teils der
eigenen Erbinformation durch Reproduktion zu erhöhen. Neben der DNA-Sequenz in den
Promotobereichen der Gene selbst, werden einige essentielle Regulationsmechanismen der
Genaktivität durch epigenetische Veränderungen gesteuert.
1.1 Epigenetik
Der Begriff „Epigenetik“ wurde erstmals 1942 von Conrad Waddington verwendet und fasste
die kausalen Interaktionen zwischen Genen und ihren Produkten zusammen, die eine
phänotypische Expression ermöglichten [5]. Im Laufe der Zeit durchlief diese frühe Definition
der Epigenetik einen Wandel und beschreibt heute allgemein alle vererbbaren
Veränderungen des Phänotyps, welche nicht durch die primäre DNA-Sequenz verursacht
werden [6]. Diese Ursachen umfassen im Wesentlichen die DNA-Methylierung, Histon-
4
EINLEITUNG
Modifikationen sowie nicht-kodierende RNA [7]. Innerhalb dieser Mechanismen stellt die
DNA-Methylierung die am intensivsten untersuchte epigenetische Modifikation dar [7].
1.1.1 DNA-Methylierung
Als DNA-Methylierung wird im Allgemeinen die kovalente Verknüpfung einer Methylgruppe
(-CH3) an eine Nukleotidbase einer DNA bezeichnet. Bisher konnten 3 unterschiedliche
Typen
der
DNA-Methylierung
beschrieben
werden:
N6-Methyladenin
(6mA),
N4-Methylcytosin (4mC) und 5-Methylcytosin (5mC) [8-10]. Während 6mA und 4mC in
Prokaryoten und einzelnen Eukaryoten vorkommen, stellt 5mC die vorherrschende Form der
DNA-Methylierung in eukaryotischen Genomen dar [11]. In Säugern tritt 5mC überwiegend
innerhalb von Cytosin-Phosphat-Guanin (CpG) Dinukleotiden auf [12]. Evolutionär hat sich
die Methylierung der DNA vermutlich in Prokaryoten als Schutzmechanismus bakterieller
Zellen vor der Invasion von Fremd-DNA entwickelt und etabliert [13, 14]. Innerhalb der
prokaryotischen Restriktion-Modifikation-Systeme, die aus einem Restriktionsenzym
(Restriktionsendonuklease)
und
einem
modifizierenden
Enzym
(Methyltransferase)
bestehen, wird die zelleigene DNA an spezifischen Stellen methyliert und damit markiert,
wodurch die nicht-modifizierte Fremd-DNA erkannt und abgebaut werden kann [15-17].
Diese primitive Form eines Immunsystems richtet sich gegen für die Zelle potentiell
gefährliche, virale Fremd-DNA. Mittels Restriktionsendonukleasen kann die Zelle diese
parasitäre DNA unschädlich machen, bevor sie sich in das zelleigene Genom integrieren und
die Expression von Virus-Proteinen induzieren kann [14]. Eine mögliche Adaption an dieses
Abwehrsystem stellen Plasmide, Prophagen und Transposons dar, die in ihrem Genom eine
Methyltransferase ohne dazugehörige Restriktionsendonuklease kodieren [18]. Diese viralen
Elemente sind in der Lage ihre DNA zu methylieren und den Schutzmechanismus ihrer
prokaryotischen Wirte zu umgehen. Die Existenz und die Vermehrung dieser eigennützigen
Fremd-DNAs im Wirt bergen jedoch neben einer potentiellen Schädigung ebenfalls
potentielle evolutive Vorteile für die Zelle. Neben direkten Selektionsvorteilen wie
beispielsweise kodierten Antibiotikaresistenzen auf einem Plasmid [19], beschleunigen diese
mobilen genetischen Elemente die Veränderung des Genoms insgesamt [20, 21]. Dieser
„Infektion“ und Expansion mobiler DNA sind bzw. waren sowohl Prokaryoten als auch
Eukaryoten ausgesetzt. Während der Anteil dieser parasitären DNA in Bakterien bei 0-21%
liegt [22], enthalten eukaryotische Genome 0-65% dieser Sequenzen [21, 23]. Für das
menschliche Genom liegen die Schätzungen zwischen 40% [21] bis 65% [24]. Der Großteil
5
EINLEITUNG
dieser mobilen Sequenzen im humanen Genom besteht aus Retrotransposons (85%) [25].
Sowohl Retrotransposons als auch andere mobile genetische Elemente enthalten eigene,
intrinsische regulatorische Sequenzen wie Promotoren, Spleißstellen, Terminatoren,
Enhancer oder Insulatoren [26]. Diese DNA-Abschnitte ermöglichen es, die Expression
spezifischer Gene besser zu koordinieren und zu regulieren und sich dynamisch an
veränderte äußere Umweltbedingungen anzupassen. Aufgrund des damit einhergehenden
Selektionsvorteils wird vermutet, dass die Wirtsgenome im Laufe der Evolution
regulatorische Sequenzen von den mobilen Fremd-DNAs adaptierten. Für 20% der
evolutionär konservierten regulatorischen Regionen konnten mobile genetische Elemente
als Ursprung nachgewiesen werden [27-29]. Gleichzeitig stellen diese mobilen Elemente
Abschnitte für Chromatininstabilitäten und genomische Veränderungen dar und bedürfen
einer strickten Kontrolle [30, 31]. Als essentieller Mechanismus zur Repression von
Transposons insbesondere in der Keimbahn und in undifferenzierten Zellen hat sich die DNAMethylierung etabliert [32, 33]. Die primäre Funktion der Cytosin-Methylierung im Genom
von Säugetieren und anderen Wirbeltieren stellt die Suppression mobiler Sequenzabschnitte
dar. Neben diesem Abwehrmechanismus übernimmt die DNA-Methylierung jedoch ebenfalls
essentielle Funktionen in der Allel-spezifischen Genexpression wie bei der X-Inaktivierung
und der genomischen Prägung [34] sowie der Regulation der Genexpression insbesondere
während der fetalen Entwicklung (siehe Kapitel 1.1.4).
Die chemische Modifikation der Cytosin-Nukleotide wird von der Enzym-Klasse der
DNA-Methyltransferasen (DNMTs) übernommen. Bei den DNMTs in Säugern unterscheidet
man 3 unterschiedliche Familien: DNMT1, DNMT2 und DNMT3 [35]. Während die Funktion
von DNMT2 insbesondere in der Methylierung von Cytosinen in tRNA besteht [36], sind die
Enzyme der Familien DNMT1 und DNMT3 maßgeblich an der Methylierung der genomischen
DNA beteiligt [35]. DNMT1 übernimmt dabei die Funktion der Aufrechterhaltung der
Methylierungsmuster während der Replikation [37] und der Reparatur [38]. Die initiale de
novo-Etablierung der Methylierungsmuster wird durch DNMT3a, DNMT3b und DNMT3L
realisiert [35, 39, 40]. DNMT3L (DNMT3-Like Protein) stellt hierbei einen katalytisch
inaktiven, regulatorischen Faktor dar, der an DNMT3a bzw. DNMT3b bindet und sie unter
Interaktion mit Histon H3 an die zu methylierende Stelle leitet [41].
6
EINLEITUNG
1.1.2 Genomische Prägung
Sexualität ist die dominante Form der Reproduktion bei vielzelligen Organismen. Der
Unterschied zur nicht-sexuellen Fortpflanzung besteht in der zufälligen Verteilung der
väterlichen und mütterlichen Erbanlagen auf die Nachkommen. Diese Durchmischung
ermöglicht eine höhere Flexibilität mit der sich die Individuen an neue Umweltbedingungen,
Krankheitserreger und Parasiten anpassen können und stellt damit vermutlich den
entscheidenden evolutionären Vorteil der Sexualität dar. Ein typisches Merkmal der
sexuellen Reproduktion höherer Pflanzen und Tiere ist die Ausbildung zweier
unterschiedlicher Geschlechtszellen (Gameten) [42]. Bei der Verschmelzung einer
mütterlichen und einer väterlichen Keimzelle zur Zygote werden die haploiden GametenGenome zu einem diploiden Genom der Zygote kombiniert. Durch TransplantationsExperimente mit Vorkernen von Mäusen konnte aufgedeckt werden, dass das väterliche und
das mütterliche Genom in unterschiedlicher Weise zum Genom der Zygote beitragen [4346]. Nach Generierung von Embryonen mit zwei ausschließlich weiblichen Vorkernen
(maternal uniparental) und zwei ausschließlich männlichen Vorkernen (paternal uniparental)
zeigten sich Unterschiede in der Entwicklung der beiden Arten uniparentaler Embryonen.
Während die maternal uniparentalen Zygoten überwiegend Gewebe embryonischen
Ursprungs ausbildeten, bestanden die paternal uniparentalen Embryonen überwiegend aus
extraembryonischem Gewebe [47]. Mit Beginn der 1990er Jahre konnte diese genomische
Prägung (engl. „Imprinting“) anhand der ersten geprägten Gene, welche differenziell von
maternalen und paternalen Chromosomen exprimiert wurden, bestätigt werden [48-50]. Bis
heute konnte die genomische Prägung in Pflanzen (Bedecktsamer), Beuteltieren und höhere
Säugetieren (Plazentatieren) nachgewiesen werden [51]. Ähnlich wie in Säugetieren
beeinflusst die Expression der geprägten Gene in Pflanzen die Entwicklung des Endosperms,
einem extraembryonischem Gewebe, welches die Entwicklung des Embryos unterstützt [47].
Der evolutionäre Grund zur Ausbildung der genomischen Prägung ist nicht bekannt. Weil die
geprägten Gene sowohl bei Säugetieren als auch bei Pflanzen an der Versorgung des
Embryos mit Nährstoffen beteiligt sind, wird vermutet, dass die genomische Prägung einen
Regulationsmechanismus zur Verteilung mütterlicher Ressourcen darstellt [47, 52]. Da
paternal exprimierte Gene das fetale Wachstum verstärken wohingegen maternal
exprimierte Gene das Wachstum des Embryos abschwächen, wird angenommen, dass dieses
System in einer antagonistischen Weise funktioniert. Während die paternal exprimierten
7
EINLEITUNG
Gene zum Ziel haben der Mutter mehr Ressourcen zum Wohle der Entwicklung des
Nachkommen zu entziehen, erhalten die maternal exprimierten Gene die Ressourcen der
Mutter, um sie zwischen mehreren Nachkommen zu verteilen und den weibliche
Reproduktionserfolg zu maximieren [51].
1.1.2.1 Funktion und Regulation geprägter Gene
In höheren Säugetieren konnten bisher etwa 100 geprägte Gene identifiziert werden [53].
Die Transkripte der meisten dieser Gene wurden in der Plazenta und dem Gehirn
nachgewiesen [54, 55]. Darüber hinaus werden geprägte Gene auch in anderen Organen
wie Muskeln, der Lunge, den Nieren und dem Auge exprimiert [47]. Zwischen den
unterschiedlichen Arten der Säugetiere werden nicht zwingend gleiche Gene geprägt.
Beispielsweise liegen in der Maus geprägte Gene vor, die im menschlichen Genom keine
Prägung vorweisen [47]. Die im Gehirn exprimierten Gene mit Prägung stehen im
Zusammenhang mit der Modulation von Stoffwechselprozessen, dem Verhalten, Lernen
sowie der mütterlichen Brutpflege [47]. Charakteristisch für eine gestörte Prägung sind
jedoch vorallem eine beeinträchtigte Entwicklung und Physiologie der Plazenta. Eine
fehlende Expression des geprägten Gens Igf2 führt beispielsweise zu einem gestörten
Nährstofftransport zum wachsenden Fötus [56]. Igf2 wird sowohl in der Maus als auch im
Menschen paternal exprimiert und bildet einen Wachstumsfaktor der Plazenta und des
Embryos [57]. Knockout-Mäuse ohne das Plazenta-spezifische Transkript von Igf2 sind zum
Zeitpunkt der Geburt 40% kleiner als ihre normalen Artgenossen [58]. Die Regulation von
Igf2 erfolgt über eine differenziell methylierte Region (DMR) auf Chromosom 7 bei der Maus
und auf Chromosom 11 beim Menschen [51].
8
CTCF
1 2
CTCF
Igf2
CTCF
CTCF
EINLEITUNG
3
4
H19
Enhancers
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
Igf2
1 2
3
4
H19
Enhancers
Abbildung 1: Regulation des geprägten H19/Igf2-Lokus in der Maus. Die schwarzen Pfeile mit den Bezeichnungen der
Gene zeigen die Position der Gene und die Richtung ihrer Transkription im aktiven Zustand. Pfeile von rechts nach links
deuten die Interaktion zwischen den Enhancer-Sequenzen und den Genen an, die ihre Expression induziert. Der gelbe
Balken markiert die ICR mit 4 Bindungsstellen für das Zinkfinger-Isolator-Protein (CTCF). Auf dem maternalen Chromosom
liegt die ICR unmethyliert vor, wodurch CTCFs gebunden werden und die Interaktion zwischen Enhancern und Igf2
blockieren, was zur Expression von H19 führt. Auf dem paternalen Chromosom liegt die ICR methyliert vor. Dadurch können
keine CTCFs binden, wodurch die Enhancer die Expression von Igf2 induzieren können, während H19 nicht exprimiert wird.
Abbildung übernommen aus [59] und modifiziert.
DMRs weisen eine hohe Dichte an CpG-Dinukleotiden (CpGs) auf, deren Cytosine einen
methylierten oder unmethylierten Zustand einnehmen können. CpGs sind nicht gleichmäßig
über das Genom verteilt, sondern treten gehäuft in CG-reichen Sequenzabschnitten auf, die
als CpG-Inseln bezeichnet werden [60]. CpG-Inseln, die im Gegensatz zu DMRs für
gewöhnlich unmethyliert vorliegen, sind vorwiegend mit Promotoren von sog.
Haushaltsgenen (engl. „Housekeeping genes“) assoziiert [61]. Dabei handelt es sich um
Gene, die ubiquitär exprimiert werden und selten gehemmt werden. Übernimmt eine DMR
die Regulation mehrerer geprägter Gene wird diese Region auch als ICR (engl. „imprinting
control region“) bezeichnet [62-67]. Dementsprechend treten etwa 80% der bekannten
geprägten Gene in Clustern mit anderen geprägten Genen auf, die eine Region von 1 Mb
oder mehr umfassen können [51, 59]. Während maternal methylierte ICRs am Promotor
lokalisiert sind, befinden sich paternal methylierte ICRs in intergenischen Regionen [47]. Das
paternal exprimierte Igf2 ist 90 kb entfernt von der maternal exprimierten Gensequenz von
H19 [48, 49]. Beide Gene teilen sich eine Enhancer-Sequenz stromabwärts von H19
(Abbildung 1). Die ICR, die beide Gene reguliert, umspannt eine Region von 2-4 kb
stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle von H19 [68]. Sie ist paternal methyliert und
liegt intergenisch zwischen Igf2 und H19. Darüber hinaus enthält sie mehrere
Bindungsstellen für das Zinkfinger-Isolator-Protein (CTCF), welches ausschließlich an das
9
EINLEITUNG
unmethylierte maternale Chromosom bindet [69, 70]. Die Bindung von CTCF auf dem
maternalen Chromosom blockiert die Interaktion des Enhancers mit dem Promotor von Igf2,
wodurch das Gen deaktiviert bleibt (Abbildung 1). Stattdessen interagiert der Enhancer auf
dem maternalen Chromosom mit H19 und führt zur Expression des Gens. Auf dem
paternalen Chromosom hingegen liegt die ICR methyliert vor, wodurch die Bindung von CTCF
verhindert wird, die Interaktion des Enhancers mit dem Igf2 nicht blockiert wird und somit
Igf2 exprimiert wird [47, 57] (Abbildung 1).
Neben diesem Isolator-Model lassen sich die ICRs der Mehrheit der geprägten Gene in eine
zweite Klasse einteilen, bei welcher das ICR als Promotor einer nicht-kodierenden RNA
(ncRNA) fungieren [59]. Das am besten untersuchte Beispiel dieser Klasse von ICRs stellt das
Igf2r-Cluster dar [71]. Das ICR befindet sich hier in einer CpG-Insel innerhalb eines Introns
des Igf2r-Gens [72]. Exprimiert wird das Gen vom maternalen Chromosom, welches eine
intronische Methylierung aufweist [50]. Auf dem paternalen Chromosom liegt das ICR
dagegen unmethyliert vor und dient als Promotor einer langen nicht-kodierenden RNA
(Airn), die in Antisense-Richtung zum Igf2r-Gen transkribiert wird [63, 73]. Diese AntisenseTranskription passiert den Igf2r-Promotor und hemmt die Expression des Gens vom
paternalen Chromosom [74]. Neben Igf2r werden zwei weitere Gene stromabwärts ebenfalls
vom maternalen Chromosom exprimiert und vom paternalen Chromosom gehemmt. Bei
diesen Genen wird vermutet, dass Airn hemmende Histonmodifikationen induziert, welche
den Promotor auf dem paternalen Chromosom inaktivieren [75]. Die Regulation geprägter
Gene durch die Transkription einer nicht-kodierenden RNA in Abhängigkeit von DNAMethylierung ist ebenfalls für die geprägten Cluster Kcnq1 [67], Snrpn [76] und Gnas [65, 77]
beschrieben. Das Wissen über die Funktion und Regulation geprägter Gene basiert zu einem
erheblichen Teil auf Genotyp-Phänotyp-Studien von Patienten mit Störungen der
genetischen Prägung sowie Experimenten in Mäusen. Prinzipiell stimmen dabei die
Merkmale bzw. Symptome der Patienten überein mit denen der entsprechenden MausMutanten [47]. Welche Krankheiten und Krankheitssymptome durch eine Störung der
genetischen Prägung verursacht werden, wird im Folgenden kurz erläutert.
1.1.3 Fehlregulation geprägter Gene
Störungen der korrekten genomischen Prägung führen zu einer Veränderung der Expression
der betreffenden Gene und zu einer pathologischen Veränderung des Phänotyps.
10
EINLEITUNG
Erkrankungen dieser Art sind mit einer Inzidenz von 1-10 in 100.000 Kindern selten und
kennzeichnen sich durch ein auffällig verändertes Größenwachstum, verschiedene Arten von
Fehlbildungen, mentaler Retardierung und/oder Krebs im Kindesalter [78]. Dabei führen
unterschiedliche
Prägungen
am
gleichen
Genlokus
zu
unterschiedlichen
Imprintingerkrankungen mit deutlich verschiedenartigen Phänotypen. Die bekanntesten
Erkrankungen, die mit einer gestörten genomischen Prägung assoziiert sind, sind das PraderWilli-Syndrom (PWS), Angelman-Syndrom (AS), Silver-Russell-Syndrom (SRS), BeckwithWiedemann-Syndrom
(BWS),
der
transiente
neonatale
Diabetes
mellitus,
der
Pseudohypoparathyroidismus Typ 1b sowie das paternale bzw. maternale UPD 14-Syndrom
[47].
1.1.3.1 Prader-Willi-Syndrom und Angelman-Syndrom
Das Prader-Willi-Syndrom (PWS) und das Angelman-Syndrom (AS) sind die ersten bekannten
Erkrankungen, die in Verbindung mit geprägten Genen gebracht wurden. Beide Krankheiten
äußern sich durch neurogenetische Fehlfunktionen, die mit einer gestörten Prägung der
Gene des langen Arms von Chromosom 15 assoziiert sind. In der chromosomalen Region
15q11.2 befindet sich ein Cluster geprägter Gene, die ausschließlich vom paternalen oder
vom maternalen Chromosom exprimiert werden. Die Inzidenz beider Syndrome liegt bei 4-7
in 100000 Kindern.[79, 80]
Das klinische Bild von PWS äußert sich durch ein geringes Geburtsgewicht, Trinkschwäche im
ersten Lebensjahr, einer Hyperphagie und Adipositas im frühen Kindesalter, geistige
Behinderung, muskuläre Hypotonie, Hypogonadismus und Kleinwuchs. Bei 25-30% der
Patienten liegt eine maternale uniparentale Disomie des Chromosoms 15 [upd(15)mat] vor.
Die Ursache dafür liegt in einer Fehlsegregation während der maternalen Meiose gefolgt von
einem mitotischen Verlust des paternalen Chromosom 15 nach der Fertilisation. Dieser
Verlust hat zur Folge, dass geprägte Gene, die vom paternalen Chromosom exprimiert
werden, fehlen. Einige der dort lokalisierten Gene, die vermutlich maßgeblich zum Phänotyp
von PWS beitragen, sind die C/D box small nucleolar (sno-)RNA SNORD116 Gene sowie
SNURF-SNRPN, welches ebenfalls für snoRNA codiert. In welchem Ausmaß diese Gene zum
Phänotyp von PWS beitragen ist nicht bekannt. 1% der PWS-Fälle ist auf Imprinting-Defekte
zurückzuführen. [79, 80]
11
EINLEITUNG
Die Symptome des AS weisen eine Mikrozephalie, Ataxie, Epilepsie, faziale Dysmorphien,
ausbleibende Sprachentwicklung und geistige Behinderung auf. 2-5% der betroffenen ASPatienten zeigen eine paternale uniparentale Disomie des Chromosoms 15 [upd(15)pat].
Ursächlich dafür ist vermutlich in den meisten Fällen eine maternale Fehlsegregation mit
einer anschließenden postzygotischen Duplikation des paternalen Chromosoms 15 [81]. Als
Resultat fehlt eine aktive maternale Kopie des Gens UBE3A, was nachgewiesen zum ASPhänotyp führt. UBE3A kodiert eine E3 Ubiquitin-Ligase, die ausschließlich vom maternalen
Chromosom im Gehirn exprimiert wird [82, 83]. Der Mechanismus, wie die
gewebsspezifische Prägung von UBE3A reguliert wird, ist bisher nicht bekannt. Da das 3‘Ende des SNURF-SNRPN-Transkripts die Antisense-RNA von UBE3A darstellt, wird jedoch
vermutet, dass das paternal exprimierte SNURF-SNRPN-sense/ UBE3A-anti-sense Transkript
an der Hemmung des paternalen UBE3A-Allels beteiligt ist [84].
Zur diagnostischen Identifizierung von PWS als auch von AS stellt die Untersuchung der DNAMethylierung des SNURF-SNRPN-Lokus derzeit die sensitivste Methode dar. Während
gesunde Individuen hier ein methyliertes und ein unmethyliertes Allel zeigen, lässt sich bei
PWS nur das maternale methylierte Allel und bei AS nur das paternale unmethylierte Allel
nachweisen [84].
1.1.3.2 Silver-Russel-Syndrom und Beckwith-Wiedemann-Syndrom
Die beiden Imprintingerkrankungen Silver-Russel-Syndrom (SRS) und Beckwith-WiedemannSyndrom (BWS) zeigen, ähnlich wie PWS und AS, ein gegensätzliches genetisches wie
klinisches Bild. Ursächlich für beide Krankheiten ist in den meisten Patienten eine
Veränderung der geprägten Genregion auf Chromosom 11p15.5 [85, 86].
Der
Phänotyp
des
SRS
kennzeichnet
sich
durch
eine
prä-
und
postnatale
Wachstumsverzögerung mit altersentsprechendem Kopfumfang (relative Makrozephalie),
ein kleines dreieckiges Gesicht, Asymmetrie und einer Entwicklungsverzögerung. Den ersten
Nachweis einer Verbindung dieser Symptome mit der Expression geprägter Gene lieferte
eine maternale uniparentale Disomie des Chromosoms 7 [upd(7)mat], die bei 5-10% der
Patienten auftritt [79, 87]. Inwiefern die fehlende Expression der paternalen Gene bzw. die
Überexpression der maternalen Gene zum Phänotyp des SRS führt ist jedoch derzeit noch
Gegenstand der Forschung [86]. Molekulare Erkenntnisse im Zusammenhang zwischen
Genotyp und Phänotyp von SRS konnte man jedoch bei der häufigsten Ursache der Krankheit
12
EINLEITUNG
(35-60%), einer Veränderung des Chromosoms 11p15.5, gewinnen [79]. Chromosom 11p15
enthält zwei Imprintingkontrollregionen (ICR1 und ICR2), die die Expression von Genen
steuern, welche entscheidende Funktionen im prä- und postnatalen Wachstum
übernehmen. ICR1 reguliert die Expression des paternal exprimierten Igf2 und des maternal
exprimierten H19. Die Funktion von Igf2 als fetaler Wachstumsfaktor ist bekannt,
wohingegen die physiologische Rolle der nicht-translatierten RNA H19 unbekannt ist. Es wird
jedoch vermutet, dass die Hypomethylierung von H19 zur Abschwächung der Expression von
Igf2 führt und eine Wachstumsverzögerung verursacht. Das ausschließlich auf dem
maternalen Allel methylierte ICR2 reguliert die reziproke Expression von CDKN1C, KCNQ1
und weiterer Gene [85, 86]. Während eine Hypomethylierung von ICR1 in etwa 40% der Fälle
in SRS-Patienten nachgewiesen wird, zeigt ICR2 eine Hypomethylierung in 35-50% von BWSErkrankten [79, 86]. Die phänotypischen Merkmale von BWS sind ein prä- und postnataler
Großwuchs (Makrosomie), Makroglossie, Ohrfurchen, Bauchwanddefekte und eine
Viszeromegalie. Die Ausprägung des Phänotyps hängt hier vom molekularen Subtyp ab. Die
genauen molekularen Interaktionen der betroffenen Genprodukte, die zum Phänotyp von
BWS führen, konnten bisher nicht aufgeklärt werden [79, 85, 86].
Beide ICRs sind Gegenstand dieser Arbeit. Eine aberrante Methylierung der homologen
Regionen beim Rind wurde nach SCNT mit dem sog. „Large offspring syndrome“ (LOS) (vgl.
1.3.3) beschrieben.
1.1.4 Epigenetische Genomreprogrammierung
Die genomische Prägung führt zu spezifischen epigenetischen Veränderungen der
maternalen und paternalen Allele. Diese Prägungsmuster sind essentiell für die
postzygotische Phase des sich entwickelnden Embryos nach der Fertilisation. Der neu
entstehende
Organismus
bildet
seinerseits
ebenfalls
Keimzellen,
die
seine
geschlechtsspezifischen Prägungsmuster tragen. Um dies zu realisieren bedingt der Vorgang
der Prägung einen Mechanismus, der das Epigenom der sich entwickelnden Keimzellen in
einen neutralen Ausgangszustand zurückversetzt. Die Entfernung der parentalen
Prägungsmuster ermöglicht anschließend die geschlechtsspezifische Prägung des neu
entstandenen Organismus. Die Umsetzung dieses Prozesses erfolgt durch die epigenetische
Genomreprogrammierung. Die Reprogrammierung betrifft neben den geprägten Regionen
auch Keimzell-spezifische Gene, die es dem Genom des Spermiums und der Eizelle
13
EINLEITUNG
ermöglichen,
eine
totipotente
Zygote
zu
bilden.
Da
die
epigenetische
Genomreprogrammierung während der embryonalen Entwicklung erfolgt, liegen die meisten
Daten zu diesem Mechanismus aus Studien im Maus-Modell vor. Maus-Embryonen zeigen
zwei Phasen epigenetischer Reprogrammierung. Die erste frühe Phase beginnt unmittelbar
nach der Befruchtung und findet in der Präimplantationsphase statt. Die zweite spätere
Phase setzt nach dem embryonalen Stadium E7-E8 ein und betrifft ausschließlich die
Primordialen Keimzellen (PGCs) (Abbildung 2). In beiden Entwicklungsphasen besteht der
Reprogrammierungs-Prozess aus einer anfänglichen Demethylierung gefolgt von einer
anschließenden Remethylierung.
hoch
Embryo
DNA-Methylierung
Befruchtung
Methylierte Allele von DMRs
Spermatozoen
Gereifte
Oocyten
niedrig
Primordiale
Keimzellen
Prospermatogonien
Primäre Oocyten
Unmethylierte Allele von DMRs
E1
E4 - 5
E7 - 8
E15 - 16
GEBURT
PUBERTÄT
Entwicklungsphase
Abbildung 2: Epigenetische Reprogrammierung in der Maus. Die epigenetische Reprogrammierung erfolgt in zwei Phasen.
Sie beginnt unmittelbar nach der Befruchtung in der Präimplantationsphase. Zunächst werden das maternale (rot) und das
paternale (blau) Genom demethyliert. Dabei entgehen die geprägten gDMRs der Demethylierung. Die Remethylierung
erfolgt ab E4-E5. Etwa um den Zeitpunkt E7-E8 setzt die Demethylierung in den Primordialen Keimzellen (PGCs) ein und
betrifft genomweit alle Regionen. Die Remethylierung in den PGCs erfolgt geschlechtsspezifisch. Bei männlichen Individuen
(blau) wird die Etablierung der neuen DNA-Methylierungsmuster bis zur Geburt abgeschlossen. In der weiblichen Keimbahn
erfolgt die Remethylierung ab der Geburt kontinuierlich mit der Entwicklung der Eizelle. Abbildung übernommen aus [8890] und modifiziert.
Nach der Befruchtung setzt die Demethylierung der beiden Vorkerne ein und entfernt die
DNA-Methylierungsmuster des väterlichen Genoms schneller als die des mütterlichen
Genoms. Dabei werden die paternalen Regionen durch einen aktiven DemethylierungsMechanismus vermutlich in Verbindung mit der Oxidation durch Tet-Proteine demethyliert
[91]. Beim maternalen Genom geht man davon aus, dass die DNA-Methylierungsmuster
„passiv“ durch Replikation und ausbleibende Erhaltung der methylierten CpGs fortschreitend
mit jeder neuen Zellteilung entfallen [89]. Diesem Prozess der Demethylierung nach der
Befruchtung entgehen die geprägten Regionen des paternalen und maternalen Genoms und
bleiben erhalten. Die daraus resultierende erhaltene parental-Allel-spezifische Methylierung
14
EINLEITUNG
führt zu einer parental-Allel-spezifischen Expression der geprägten Gene im frühen
Embryonalstadium. Die Demethylierung aller anderen DNA-Regionen mit Ausnahme der
geprägten Sequenzen ist zum Zeitpunkt E4 bis E5 abgeschlossen. Die Remethylierung erfolgt
im Zuge der Differenzierung der somatischen Zellen bzw. Zelllinien zwischen E4/E5 und der
Geburt [89].
Die Demethylierung der PGCs beginnt parallel mit ihrer Proliferation und Migration in die
Genitalleiste im Stadium E7.5. Dieser Vorgang betrifft global das gesamte Genom
einschließlich der geprägten Regionen zeitgleich und unabhängig vom elterlichen Ursprung
und dauert bis zum Zeitpunkt E15/E16 an. Die anschließende Etablierung der DNAMethylierungsmuster in den PGCs erfolgt geschlechts-spezifisch und betrifft sowohl die
geprägten Gene als auch entwicklungsrelevante nicht-geprägte Gene. In männlichen Feten
findet die Remethylierung und Prägung bereits pränatal vor der Meiose im mitotisch
arretierten Stadium (G1-phase; Prospermatogonien) statt und ist bis zur Geburt
abgeschlossen [89]. In weiblichen Feten treten die primären Oozyten nach der
Demethylierung in die Meiose ein und verbleiben in der Prophase-I im Diplotän-Stadium. Die
Etablierung der Eizell-spezifischen Methylierungsmuster setzt in den primären Oozyten erst
nach der Geburt mit der zyklischen Rekrutierung der Eizellen (vgl. 1.2.2) ein und wird
zeitlebens bis zur Menopause mit dem Prozess der Follikelreifung abgeschlossen [92]. Mit
der Verschmelzung von Eizelle und Spermium bzw. der Befruchtung schließt sich der
Reprogrammierungszyklus. Damit stellt die epigenetische Genomreprogrammierung in einer
zyklischen Weise sicher, dass die essentielle, parental-spezifische Prägung in den
somatischen Zellen erhalten bleibt, während sie in den PGCs
geschlechts-spezifisch
angepasst wird.
1.2 Oogenese und Oozytenmaturation
Die Eizelle und das Spermium sind die zentralen Zellen der Reproduktion und Entwicklung in
Säugern. Eine der wichtigsten Aufgaben der Eizelle besteht darin, sowohl das Genom der
Eizelle selbst als auch das des Spermiums zu programmieren, um letztlich das neue
totipotente embryonale Genom zu formen. Zusätzlich zu dieser Eigenschaft stellt die
weibliche Keimzelle die einzige Zell-Art im erwachsenen Organismus dar, die in der Lage ist
das Genom einer somatischen Zelle aus einem differenzierten Stadium in einen totipotenten
Zustand
zu
versetzen
[93].
Um
diese
herausragende
Fähigkeit,
die
sog.
15
EINLEITUNG
Entwicklungskompetenz, zu erlangen, durchlaufen die Vorläufer der befruchtungsfähigen
Oozyte
einen
einzigartigen
Entwicklungsprozess,
der
durch
die
Oogenese
und
Follikulogenese sowie die finale Eizellreifung repräsentiert wird.
1.2.1 Allgemeine Oogenese
Die Oogenese beschreibt im Allgemeinen die Entwicklung einer Oogonie zu einer reifen,
befruchtungsfähigen Oozyte [94]. Dabei erlangt die Eizelle die Fähigkeit, sich nach der
Befruchtung durch ein Spermium zu einem Embryo und damit zu einem neuen Organismus
zu entwickeln. Um dieses Entwicklungspotential zu gewinnen, muss die Oozyte eine Reihe
von Veränderungen durchlaufen. Dies schließt insbesondere die Reduktionsteilung ein,
durch welche der diploide Chromosomensatz zu einem haploiden reduziert wird. Dieser
Vorgang ist nötig um die diploide Gendosis des adulten Organismus nach der Verschmelzung
der Oozyte und des Spermiums aufrechtzuerhalten. Die Oogenese beginnt bereits pränatal
im Mutterleib und wird erst mit Erlangung der Geschlechtsreife bzw. in der Pubertät
abgeschlossen [94].
Die Oogonien teilen sich zunächst in der frühen Fetalphase mitotisch mit einer speziesspezifischen Anzahl von Teilungen. In der humanen Oogenese wird die maximale Anzahl an
Oogonien mit geschätzt 5 Millionen Zellen etwa in der 20. Schwangerschaftswoche erreicht
[95, 96]. Von diesem Zeitpunkt an reduziert sich die Anzahl der Zellen jedoch rapide und
umfasst bei der Geburt etwa noch 295 000 [97]. Nach der mitotischen Teilungsphase gehen
die Oogonien in die Prophase der Meiose I über und werden fortan als primäre Oozyten
bezeichnet. Die Prophase von MI wird in 5 sequentielle Stufen unterteilt: Leptotän, Zygotän,
Pachytän, Diplotän und Diakenese [94]. Nach Abschluss der homologen Rekombination der
elterlichen Chromosomen, wird die Meiose im letzten Stadium der Prophase, dem Diplotän
arretiert. Aufgrund der netzartigen Struktur des Zellkerns (griech. diktyon = Netz) wird dieses
Stadium auch als Diktyotän bezeichnet. Der Zellkern der diplotänen Oozyte wird auch
Keimbläschen oder Germinalvesikel (engl.: germinal vesicle, GV) genannt. Im Diktyotän
verharren die primären Oozyten bis zum Eintritt der Pubertät. Mit Beginn der
Geschlechtsreife wird die Prophase durch einen starken Anstieg des luteinisierenden
Hormons (LH) etwa zwölf Stunden vor der Ovulation fortgesetzt. Dabei löst sich die Hülle des
Kerns auf (engl.: germinal vesicle breakdown; GVBD) und die Chromosomen bilden eine
Metaphaseplatte. Die Chromatiden werden dann paarweise voneinander getrennt und es
16
EINLEITUNG
kommt zu einer asymmetrischen Zellteilung. Dabei wird ein Chromosomensatz von einer
Kernmembran umschlossen und verbleibt mit nahezu dem gesamten Zytoplasma in der nun
als sekundär bezeichneten Oozyte, während der andere Chromosomensatz in einer kleinen,
funktionslosen Zelle, dem sog. ersten Polkörper, abgebaut wird. Die sekundäre Oozyte
durchläuft eine zweite meiotische Teilung. Diese beginnt kurz vor der Ovulation und wird
zunächst nur bis zum Stadium der Metaphase II (MII) passiert. Die Fortsetzung der zweiten
Reifeteilung erfolgt erst, wenn die sekundäre Oozyte von einem Spermium befruchtet wird.
Wie bereits bei der ersten Reifeteilung wird dann ein Chromosomensatz im sog. zweiten
Polkörper abgeschnürt und abgebaut. Der verbliebende haploide Chromosomensatz wird in
der befruchteten Oozyte von einer Kernmembran umgeben und bildet den weiblichen
Vorkern, womit die Reifeteilung der Eizelle abgeschlossen ist [94].
1.2.2 Follikulogenese beim Rind (Bos taurus)
Während der bovinen Oogenese wird die Oozyte bereits zu Beginn der ersten Meiose etwa
um den 90sten Tag nach der Befruchtung von einer einschichtigen Lage somatischer Zellen
(Granulosazellen) umschlossen und bildet damit einen Ovarialfollikel bzw. Primordialfollikel
[98]. Der Begriff Follikel bezeichnet eine Einheit aus einer Eizelle und mehreren sie
umgebenden somatischen Zellen und stellt das funktionelle Grundelement des Ovars dar
[99]. Die Oozyte verbleibt bis zur Ovulation im Follikel und steht dabei in einem intensiven
Stoffaustausch mit den Follikelzellen, der essentiell für die Entwicklung und Reifung der
Eizelle ist. Mit Bildung des Primordialfollikels beginnt die Follikulogenese, die die
Entwicklung des Primordialfollikels zum ovulationsfähigen Graafschen Follikel beschreibt
[100]. In den Ovarien von Rindern liegen grundsätzlich zwei unterschiedliche
Follikelpopulationen vor [101]. Eine Kategorie bilden dabei die Primordialfollikel, die sich in
einem
ruhenden
Stadium
befinden
und
Follikel
eines
nicht-wachsenden
Pools
repräsentieren. Die zweite Klasse umfasst alle Follikelstadien, die sich über das Stadium des
Primordialfollikels hinaus entwickeln und damit den wachsenden Pool bilden [101]. Der
Übergang vom nicht-wachsenden in den wachsenden Pool erfolgt durch eine initiale
Rekrutierung von Primordialfollikeln (Abbildung 3) [102].
17
EINLEITUNG
INITIALE
REKRUTIERUNG
ZYKLISCHE
REKRUTIERUNG
Ovulation
Selektion &
Dominanz
Atresie
Graafscher
Follikel
Maturation
atretisch
Antral
Antral
Sekundär
atretisch
Primär
Primordial
20. SSW
Erschöpfung der
Follikelreserve
(kontinuierliche initiale Rekrutierung)
Geburt
(kontinuierliche initiale Rekrutierung)
(Depletion)
Pubertät
Abbildung 3: Follikulogenese. Ab der 20. Schwangerschaftswoche werden mehrere Primordialfollikel zeitgleich durch die
zyklische Rekrutierung zur Weiterentwicklung aktiviert. Bis zur Pubertät entwickeln sich die Follikel nur bis zum
Antralstadium und gehen in die Atresie über. Mit Eintritt der Pubertät setzt die zyklische Rekrutierung ein. Dadurch geht
eine Kohorte von Antralfollikeln in die Phasen der Selektion und Dominanz über. Dabei entwickelt sich der dominante
Follikel zum Graafschen Follikel, während alle anderen Foolikel atretisch werden. Abbildung übernommen aus [102] und
modifiziert.
In
Rinder-Ovarien
beginnt
diese
initiale
Rekrutierung
bereits
in
der
20.
Schwangerschaftswoche [103]. Dabei veranlassen bisher unbekannte Faktoren einige
Primordialfollikel zum Wachstum und zur Weiterentwicklung zum primären, sekundären und
tertiären Follikelstadium (Abbildung 4). Ein Tertiär-Follikel wird aufgrund seines
flüssigkeitsgefüllten Hohlraums, dem sog. Antrum, auch als Antralfollikel bezeichnet [99].
Antralfollikel gehen vor dem Einsetzen der Geschlechtsreife immer in die Atresie über und
degenerieren [104]. Auch im geschlechtsreifen Rind stellt die Atresie bzw. die Rückbildung
das „übliche“ Schicksal eines Antralfollikels dar [105]. Mit Beginn der Pubertät setzt jedoch
zusätzlich zur initialen Rekrutierung die sog. zyklische Rekrutierung ein [102, 104]. Dabei
wird eine Gruppe von 3 bis 10 Antralfollikeln ausgelöst durch einen Anstieg des
follikelstimulierenden Hormons (FSH) zunächst vor der Atresie bewahrt und zur
Weiterentwicklung geführt [106, 107]. Der zyklischen Rekrutierung schließt sich unter
abnehmender FSH-Konzentration die Phase der Selektion an [108, 109]. Während dieser
Selektionsphase beginnt ein Antralfollikel der Kohorte stärker und schneller zu wachsen als
alle anderen Follikel, die zeitgleich von der zyklischen Rekrutierung aktiviert wurden. Die
Auswahl dieses dominanten Follikels hängt insbesondere von der FSH- und LH-Sensitivität ab
[106]. Die wachsenden Antralfollikel der Gruppe verursachen die Abnahme des FSH-Spiegels
bei gleichzeitiger FSH-Abhängigkeit. Die größten Follikel produzieren Estradiol und Inhibin,
die maßgeblich zur Reduktion von FSH beitragen [110]. Einzig der Follikel mit einer
ausreichenden Anzahl an FSH-Rezeptoren ist in der Lage sich unter diesen reduzierten FSHBedingungen weiterzuentwickeln [106]. Etwa 8h vor der Selektion des dominanten Follikels
18
EINLEITUNG
beginnen die Granulosazellen LH-Rezeptoren zu exprimieren. LH stimuliert zusätzlich die
Poduktion von Estradiol und damit die Abnahme der FSH-Konzentration [111]. Dadurch
nimmt die FSH-Abhängigkeit des dominanten Follikels stetig ab während gleichzeitig die LHSensitivität zunimmt [106, 112, 113]. Der sich unter diesen Bedingungen weiterentwickelnde
dominante Follikel nimmt in der letzten Phase der Follikulogenese, der Dominanz, deutlich
an Größe zu, während alle anderen Follikel der Gruppe atretisch werden [114-117]. Zu
Beginn der zyklischen Rekrutierung treten Antralfollikel mit einem Durchmesser von 4-5 mm
in die Selektionsphase ein, in der sie eine Größe von durchschnittlich 7,7-8,5 mm annehmen
[104]. Der dominante Follikel wächst anschließend bis zu einem Durchmesser von 12 - 20
mm, wobei er die Fähigkeit zur Ovulation bei einer Größe von 10 mm erlangt und als
Graafscher Follikel bezeichnet wird [104]. Die Abfolge aus zyklischer Rekrutierung, Selektion
und
Dominanz
tritt
in
regelmäßigen
Zeitabständen
mehrfach
innerhalb
eines
Menstruationszyklus im Rind auf. Da sich dabei stetig immer weniger Follikel der Kohorte
weiterentwickeln und die Anzahl der sich entwickelnden Follikel sozusagen „abebbt“, wird
die Abfolge dieser drei Phasen auch als Follikelwelle bezeichnet. Im Verlauf eines
interovulatorischen Intervals konnten im Rind 2 bis maximal 4 auftretende Follikelwellen
beobachtet werden, wobei 2 und 3 Wellen am häufigsten auftreten [104, 118-120].
Ausgelöst wird eine Follikelwelle mit Beginn der zyklischen Rekrutierung durch einen Anstieg
des follikelstimulierenden Hormons (FSH). Nach Durchlaufen der Selektion und Dominanz
erfolgt die Ovulation ausschließlich durch einen Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH)
[104]. Bleibt diese Ausschüttung von LH aus, beginnt der dominante Follikel sich
zurückzubilden und erlaubt die Rekrutierung einer neuen Kohorte bzw. Welle [120, 121].
Kommt es zu einer LH-Spitze wird die Meiose I in der Eizelle des präovulatorischen Follikels
wiederaufgenommen und die Ovulation ausgelöst [122]. Beim Eisprung expandieren die
Kumuluszellen, der Kontakt zwischen der Corona radiata und der Oozyte wird gelöst und es
kommt zur Bildung des Perivitellinen Spalts bevor letztlich die Eizelle in den Eileiter entlassen
wird [123, 124]. Die im Ovar verbleibenden Follikelzellen (Granulosazellen und Thekazellen)
bilden den Gelbkörper (Corpus luteum), der das für das Einsetzen und die Aufrechterhaltung
der Schwangerschaft essentielle Hormon Progesteron produziert. Durch Progesteron wird
u.a. ein Anstieg der LH-Konzentration unterdrückt, wodurch eine erneute Ovulation
verhindert wird. Bleibt die Befruchtung der Eizelle aus, bildet sich der Gelbkörper 16 bis 18
Tage nach dem Eisprung unter dem Einfluss des luteolytischen Faktors Prostaglandin F 2α
19
EINLEITUNG
(PGF2α) zurück und wird abgebaut. Die Luteolyse und die damit verbundene Absenkung des
Progesteron-Spiegels erlaubt anschließend eine erneute Ovulation eines Graafschen
Follikels. Innerhalb des Menstruationszyklus beginnt dann erneut die Follikelphase, die mit
der Ovulation abgeschlossen wird und in die Lutealphase übergeht [125, 126].
Meiose
1. Reifeteilung (Meiose I)
2. Reifeteilung (Meiose II)
OozytenWachstum
Prophase I
Oozytenmaturation
Meiotischer Arrest
Befruchtung
Mitose
1. Ovulation
Differenzierung
Befruchtung
(LH-Spitze)
Demethylierung
PGCs
FSH
Leptotän Zygotän Pachytän Diplotän
Diktyotän
Oogonien
GV
Metaphase I
Metaphase II
Follikulogenese
Zeit ab
Befruchtung
0
5
10
15
20
30
40 Wochen
Geburt
10 Monate
Pubertät
22 Tage (1. Zyklus)
2. Zyklus
Präovulatorischer Graaf-Follikel
Sekundärfollikel
Antralfollikel
80-130 µm
0,25-10 mm
Primärfollikel
12-20 mm
40-80 µm
Primordialfollikel
Diktyotän-Oozyte
Thekazellen
Granulosazellen
Antrum
Oozyte
Zona pellucida
<40 µm
Remethylierung
Follikelpool mit
wachsenden Follikeln
Follikelpool
im Ruhestadium
Zyklische Rekrutierung
Initiale Rekrutierung
Abbildung 4: Schematische Übersicht der bovinen Oogenese, Follikulogenese und Oozytenmaturation. Nach der
Befruchtung und anschließender Differenzierung beginnen die primordialen Keimzellen (PGCs) etwa ab der 5.
Schwangerschaftswoche (SSW) in die Genitalleiste zu wandern. Dabei teilen sich die PGCs ab der 9. SSW mitotisch. Die
mitotischen Teilungen setzen sich im Stadium der Oogonien etwa bis zur 22. SSW fort [127]. Zirka 75 bis 82 Tage nach der
Befruchtung (12. SSW) gehen die ersten Oogonien in die Prophase der Meiose I über und werden als primäre Oozyten
bezeichnet [98, 128]. Bis zum Zeitpunkt der Geburt durchlaufen alle Eizellen im bovinen Ovar die Phasen des Leptotäns,
Zygotäns und Pachytäns bis hin zum Diplotän der Prophase I, in dem sie arretiert werden (Meiotischer Arrest). Im Diplotän
verharren die Oozyten bis zum Eintritt in die Pubertät mit 9 bis 10 Monaten. Mit Beginn der Pubertät nimmt jeweils eine
Eizelle mit dem Menstruationszyklus ihre Meiose I unmittelbar vor dem ersten Eisprung erneut auf und geht zur
Oozytenmaturation über [127]. Ab der 13. SSW lagert sich eine einschichtige Lage von Prä-Granulosazellen um jeweils eine
Diplotäne-Oozyte an und bildet einen Primordialfollikel [98]. Die Primordialfollikel bilden einen Pool von Follikeln, die sich
im Ruhestadium befinden und nicht wachsen. Follikel, die sich über das primordiale Stadium weiterentwickeln (Primär-,
Sekundär und Antralfollikel sowie präovulatorischer Graaf-Follikel [127]) bilden den Pool wachsender Follikel [104]. Der
Übergang vom ruhenden in den wachsenden Pool erfolgt durch die initiale Rekrutierung einer Kohorte von
Primordialfollikeln [102]. Die erste initiale Rekrutierung erfolgt etwa in der 20. SSW und tritt dann regelmäßig 2- bis 3-mal
innerhalb einer Zyklusphase bis zur Menopause auf [103]. Die durch die initiale Rekrutierung aktivierten Follikel können das
Entwicklungsstadium des Antralfollikels erlangen, bevor sich in die Atresie übergehen. Erst mit Beginn der Pubertät und
dem ersten Auftreten der Zyklischen Rekrutierung durch FSH wird eine Kohorte von Antralfollikeln zur Weiterentwicklung
stimuliert, die nach dem Durchlaufen der Selektions- und Dominanzphasen zur Ovulation einer Eizelle ausgelöst durch eine
LH-Spitze führt [102]. Bereits kurz vor der Ovulation beginnt die Oozytenmaturation mit Auflösung der Kernmembran
(GVBD). Die Datenlage zu Demethylierungs- und Remethylierungsprozessen in bovinen Eizellen ist gegenwärtig limitiert.
Insbesondere die frühen Phasen der Demethylierung unmittelbar nach der Befruchtung sind im Rind weitgehend
unerforscht. Vermutlich erfolgt die Demethylierung jedoch während der Differenzierung der PGCs analog zur Maus (vgl.
Kapitel 1.1.4). Die Remethylierung des Oozyten-Genoms findet kontinuierlich mit der Entwicklung der Eizelle bzw. während
der Follikulogenese statt. Der Beginn sowie der Abschluss der Remethylierung sind bisher für bovine Eizellen ebenfalls nicht
beschrieben.
20
EINLEITUNG
Aus ethischen und technischen Gründen sind die Untersuchungsergebnisse sowie die daraus
gewonnen Erkenntnisse der humanen Follikulogenese deutlich limitierter als die der bovinen
Follikelentwicklung [129]. Dennoch konnte insbesondere die Entwicklung deutlich
verbesserter Ultraschallgeräte und -methoden innerhalb der letzten Dekade zu einem
Zugewinn wichtiger Daten auf dem Gebiet der humanen Follikulogenese führen [130]. Die
Auswertung dieser Daten liefert zunehmend Hinweise darauf, dass die Mechanismen der
Entwicklung und Reifung humaner Follikel in ähnlicher Weise ablaufen, wie die der
beschriebenen bovinen Follikulogenese [129]. Wie beim Rind werden die Primordialfollikel
durch eine initiale Rekrutierung aktiviert und entwickeln sich erst mit Beginn der Pubertät
durch die zyklische Rekrutierung über das antrale Stadium hinaus [102]. Das Auftreten von
Follikelwellen bzw. die Rekrutierung multipler Follikel-Kohorten wurde bereits seit den
1950er Jahren bei Frauen beobachtet [131-133]. Entscheidende Parallelen zum bovinen
Modell konnten jedoch erst durch jüngere Studien gezeigt werden [134-137]. Dabei weisen
etwa 68% der Frauen zwei und 32% drei Follikelwellen innerhalb eines interovulatorischen
Intervals auf [135]. Die Dynamiken, die während der Rekrutierung, Selektion und Dominanz
im humanen Ovar beobachtet werden, ähneln mit spezies-spezifischen Besonderheiten,
jedoch ohne fundamentale Unterschiede, denen der Follikulogenese im Rind [134, 138]. Die
zyklische Rekrutierung der Antralfollikel wird ebenfalls durch einen Anstieg von FSH
ausgelöst, wobei humane Follikel bereits bei geringeren FSH-Dosen aufgrund einer erhöhten
FSH-Sensitivität aktiviert werden [139]. Nach der Rekrutierung erfolgt die Selektion des
dominanten Follikels wie im bovinen Ovar unter einem abnehmenden FSH-Spiegel [139141]. Dabei produzieren die rekrutierten,
humanen Follikel gleichermaßen die FSH-
Inhibitoren Estradiol und Inhibin wie die Follikel-Kohorte der Kuh [142, 143]. Auch der für die
Ovulation benötigte Übergang von einer FSH-Abhängigkeit hin zu einer LH-Sensitivität
während der Entwicklung des dominanten Follikels zum ovulationsfähigen Graafschen
Follikel erfolgt wie beim Rind gleichermaßen auch bei der Frau [144, 145].
1.2.3 Oozytenmaturation
Als Oozytenmaturation bzw. Eizellreifung wird allgemein die Entwicklung von der arretierten
diplotänen Oozyte mit Keimbläschen bzw. Germinalvesikel (GV) hin zur befruchtungsfähigen
Eizelle bezeichnet [146, 147]. Diese Reifung beginnt mit der Fortsetzung der ersten
Reifeteilung bzw. Meiose I und der Auflösung der Kernhülle (engl.: germinal vesicle
breakdown; GVBD) (Abbildung 4). Im Rind (wie auch bei der Frau) tritt dies erstmalig mit
21
EINLEITUNG
Eintritt der Geschlechtsreife bzw. Pubertät auf, ausgelöst durch einen starken Anstieg des
luteinisierenden Hormons (LH) etwa 24 h bis 27 h vor der Ovulation [125]. Die
Oozytenmaturation umfasst sowohl die nukleäre Reifung mit der Reduktion des diploiden
Chromosomensatzes als auch die damit einhergehende zytoplasmatische Reifung mit
molekularen und strukturellen Veränderungen der Eizelle [148]. Beide Prozesse sind
miteinander verknüpft und werden während der Follikulogenese auch durch einen Stoffund Informationsaustausch mit den umgebenden Kumuluszellen reguliert.
Die nukleäre Reifung beschreibt die Entwicklung des Eizellkerns vom Stadium des
Germinalvesikels bis zum Erreichen der Metaphase II (MII). Dabei kommt es zur Auflösung
der Kernmembran (GVBD), zur Kondensation der Chromosomen, der Ausbildung der Spindel,
der Trennung der homologen Chromosomen, Ausschleusung des ersten Polkörpers und
letztlich die Arretierung in MII [99]. Die nukleäre Reifung ist ein gradueller Prozess und
benötigt in der bovinen Eizelle eine Dauer von 24 h [149]. Für die Auflösung der Kernhülle
(GVBD) ist im Rind, im Gegensatz zu Nagern wie der Maus, eine aktive Proteinsynthese
notwendig [150-156]. Mit der Abschnürung des ersten Polkörpers ist die Meiose I
abgeschlossen und die Eizelle wird fortan als sekundäre Oozyte bezeichnet. Im Anschluss an
die Meiose I geht die sekundäre Oozyte in die Meiose II über und wird im Stadium der
Metaphase II arretiert. Damit ist die nukleäre Reifung abgeschlossen. Die Fortsetzung der
Metaphase II und der Abschluss der Meiose II erfolgen einzig bei einer Befruchtung der
reifen Eizelle durch ein Spermium [99]. Die Fähigkeit zur nukleären Maturation korreliert
spezies-spezifisch mit der Größe der Antralfollikel bzw. der Größe der Oozyte [157]. In
Rindern wird diese bei einem Durchmesser von 2-3 mm des Antralfollikels [158-160] und 110
µm der Eizelle [158, 161] erlangt.
Die zytoplasmatische Reifung umfasst die Reorganisation des Zytoskeletts und der Organelle
sowie die Produktion und Speicherung von mRNAs, Proteinen und Transkriptionsfaktoren,
die am Reifungsprozess, der Befruchtung und der frühen Embryogenese beteiligt sind [162].
Diese Vorgänge sind zeitlich und räumlich miteinander koordiniert und schaffen die
strukturellen Voraussetzungen für die Bildung einer funktionsfähigen Zygote aus zwei
Gameten. Durch Mikrotubuli und Mikrofilamente des Zytoskeletts werden beim Übergang
vom Germinalvesikel-Stadium zu MII neben der Separation der Chromosomen die gesamten
Organellen einer Positionsänderungen innerhalb der Eizelle unterzogen [99, 163-165].
22
EINLEITUNG
Mitochondrien werden aus der Peripherie in der gesamten Zelle verteilt. Als
Schlüsselkomponenten des Energiestoffwechsels [163, 166] erhöht sich ihre Zahl dabei von
6.000 in der primären Oozyte auf mehr als 50.000 bis zum Abschluss der Reifung [167-170].
Die Fragmente des Golgi-Apparats werden während des GVBD von Vesikeln umschlossen
und bis zum MII-Stadium phosphoryliert an Stellen mit aktivem ER-Export transportiert [171,
172]. Die Membranen des ER enthalten Kalzium-Ionen, die gespeichert und freigesetzt
werden. Diese Kalziumoszillationen stellen die Voraussetzung für die Aktivierung der Eizelle
dar [173]. In enger Wechselwirkung mit dem Golgi-Komplex und dem ER stehen auch die
Corticalgranula. Diese befinden sich im GV-Stadium über die gesamte Eizelle verteilt. Bis zur
MII ordnen sie sich jedoch über die ganze innere Oberfläche nahe der Plasmamembran an.
Diese Nähe der Corticalgranula zur Plasmamembran ist ebenfalls entscheidend für die
Aktivierung der Eizelle und essentiell für die Verhärtung der Zona pellucida zur Verhinderung
einer Polyspermie während des Befruchtungsvorgangs [174-176].
Die strukturellen Veränderungen der Eizelle während der Reifung schließen auch die
Transkription, Speicherung und Prozessierung von mRNA-Molekülen ein. Das Anlegen dieser
Reserve von Makromolekülen ist notwendig, da bis zur Aktivierung des embryonalen
Genoms keine Transkription und Proteinsynthese stattfindet [162]. Der Zeitpunkt dieser
Aktivierung ist spezies-spezifisch und erfolgt in der Maus im 2-Zellstadium, beim Menschen
im 8-Zellstadium und beim Rind und Schaaf im 8-16-Zellstadium [177-179]. Die bei dieser
molekularen Maturation generierten Transkripte werden in einer stabilen und zunächst
inaktiven
Form
gespeichert.
Durch
die
Prozessierung
der
mRNA-Moleküle
zu
Ribonukleoprotein-Partikeln wird die mRNA vor einer nukleolytischen Degradation geschützt
bis sie im Verlauf der Reifung oder frühen Embryogenese translatiert wird [180-182].
Zu den Genen, die während der zytoplasmatischen Reifung sowohl transkribiert als auch
translatiert werden gehören insbesondere regulatorische Faktoren des Zellzyklus. Zu
erwähnen ist hier vorallem die Proteinkinase MPF (maturation promoting factor), die
entscheidend an der Regulation des Reifungsprozesses beteiligt ist [99, 162]. MPF besteht
aus der regulatorischen Komponente Cyclin B und der katalytischen Untereinheit p34 cdc2
[183]. Der MPF-Komplex scheint einen universellen Regulator der M-Phase sowohl für den
mitotischen als auch für den meiotischen Zellzyklus darzustellen [184, 185]. Die
Phosphorylierung bzw. Aktivierung des Proteins ist für den Übergang zu Meiose I und
23
EINLEITUNG
Meiose II notwendig. Erst nach Aktivierung von MPF geht die Oozyte vom GV-Stadium zum
GVBD-Stadium über und erreicht sein Aktivitätsmaximum in Meiose I [185, 186]. Während
der Transition von Meiose I zu Meiose II fällt die Aktivität von MPF bevor sie in der Meiose II
erneut ein Maximum erreicht [187].
1.2.4 Ovarielle Alterung
Zu Beginn der Oogenese teilen sich die Oogonien in der frühen Fetalphase mitotisch und
erreichen ein spezies-spezifisches Maximum von Zellen. Die maximale Anzahl an Oogonien
wird in der humanen Oogenese mit geschätzt 5 Millionen Zellen etwa in der 20.
Schwangerschaftswoche erreicht [95, 96]. Nach Abschluss dieser mitotischen Teilungsphase
nimmt die Anzahl dieser Vorläufer von Eizellen stetig ab. Die durchschnittlich etwa 600.000
Primordialfollikel zum Zeitpunkt der Geburt stellen den Vorrat bzw. das Reservoir dar, aus
dem sich von der Pubertät bis zur Menopause der Frau befruchtungsfähige Oozyten
entwickeln [97]. Mit Einsetzen der Follikulogenese beginnt dieser Vorrat bereits vor der
Geburt ausgelöst durch regelmäßige Rekrutierungen von Follikel-Kohorten abzunehmen.
Diese Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des weiblichen Individuums
bzw. des Ovars wird als ovarielle Alterung bezeichnet und kennzeichnet sich durch mehrere
Eigenschaften [188]. Neben der Reduktion des Reservoirs von Primordialfollikeln ist die
ovarielle Alterung charakterisiert durch eine abnehmende Oozytenqualität [189-191]. In
Verbindung mit in-vitro-Fertilisationen (IVFs) [191-196] oder reproduktionsmedizinischen
Behandlungen im Allgemeinen führt die reduzierte Eizell-Qualität zu geringeren
Schwangerschaftsraten [194, 196, 197]. Gleichzeit wird ein erhöhtes Auftreten von
Aneuploidien im Embryo [198-200] sowie eine erhöhte Fehlgeburtenrate [201, 202]
beschrieben,
die
letztlich
eine
reduzierte
Entbindungsrate
nach
spontanen
Schwangerschaften und Schwangerschaften nach ART zur Folge haben [203]. Als Ursachen
der ovariellen Alterung gelten vorallem genetische Faktoren und die Verkürzung der
Telomere [204, 205]. Umweltfaktoren, wie die Ernährung oder oxidativer Stress,
beeinflussen ebenfalls die Abnahme des Follikel-Vorrats mit zunehmendem Alter des Ovars
[206]. Darüber hinaus konnten auch epigenetische Veränderungen in Eizellen von jüngeren
im Vergleich zu älteren weiblichen Individuen identifiziert werden [207, 208]. Die genauen
epigenetischen Mechanismen, die an der ovariellen Alterung beteiligt sind, sind jedoch
bisher nicht bekannt [209].
24
EINLEITUNG
1.3 Assistierte Reproduktion
Die Reproduktion bei höheren Säugetieren hängt von dem Erfolg bzw. Misserfolg komplexer,
teils wenig aufgeklärter, aufeinanderfolgender Prozesse ab, die zu einer Schwangerschaft
und letztlich zur Geburt des gesunden Nachwuchses führen. Diese Prozesse beinhalten die
Spermatogenese, die Oogenese, die Follikuliogenese, die Ovulation, den sexuellen Akt und
den Transport der Keimzellen, die Migration des Embryos in den Uterus sowie seine
darauffolgende Implantation und schließlich die interuterine Entwicklung des Fötus.
Störungen können in jedem Schritt dieser Abfolge auftreten. Am häufigsten sind jedoch
Fehler in den frühen Phasen zu beobachten. Die Gelegenheit eine Eizelle zu befruchten und
eine Schwangerschaft einzuleiten ergibt sich regelmäßig mit jedem Menstruationszyklus.
Beim Menschen zeigt sich für ein einzelnes Paar eine relativ konstante monatliche
Wahrscheinlichkeit eine Schwangerschaft zu verursachen. Zwischen unterschiedlichen
Paaren variiert diese Wahrscheinlichkeit jedoch stark zwischen 0% und 60%. Bei einer
monatlichen Probabilität von 0% eine Schwangerschaft zu induzieren, spricht man auch von
Sterilität, welche in 3%-5% aller Paare auftritt [210]. Während Sterilität das Unvermögen
beschreibt, schwanger zu werden, bezeichnet man mit Infertilität das Unvermögen, ein
lebendes Kind zu gebären. Beide Begriffe drücken einen absoluten Zustand aus, der für die
meisten „sterilen“ bzw. „infertilen“ Paare nicht zutrifft. Der größte Teil dieser Paare ist nicht
zu 100% unfruchtbar, sondern weist eine nicht genau quantifizierbare Einschränkung der
Fertilität auf [211]. Obwohl für die letzten Jahrzehnte ein Anstieg der Rate an Paaren mit
unerfülltem Kinderwunsch beschrieben wird, werden keine belastbaren Daten für diese
Vermutung genannt. In Statistiken aus Australien um das Jahr 1900 wird bereits über eine
ungewünschte Kinderlosigkeit von 11% berichtet [212]. Eine ähnliche Häufigkeit wird auch
für das gegenwärtige Auftreten vermutet [213]. Lässt sich der Kinderwunsch auf natürlichem
Wege nicht erfüllen, kann nach entsprechender Indikation die Verwendung assistierter
Reproduktionstechniken (ART) zum Erfolg führen bzw. Hilfe leisten. Als ART bezeichnet man
alle Methoden und Verfahren, die die in vitro-Behandlung von Eizellen und Spermien sowie
Embryonen
umfassen,
die
darauf
abzielen
eine
Schwangerschaft
bzw.
einen
Reproduktionserfolg herbeizuführen [214]. Darunter zählen u.a. die In-vitro-Maturation
(IVM), die In-vitro-Fertilisation (IVF) einschließlich intrazytoplasmatische Spermieninjektion
(ICSI), der Embryonentransfer (ET), der intratubare Gametentransfer (GIFT), der intratubare
Zygotentransfer (ZIFT), die Kryokonservierung von Eizellen und Embryonen, die Eizell- und
25
EINLEITUNG
Embryonenspende
sowie
die
Leihmutterschaft
[214].
ARTs
werden
neben
der
humanmedizinischen Anwendung auch zur Erzeugung von Nachkommen bei Zuchttieren
genutzt.
1.3.1 Assistierte Reproduktionstechniken in der humanen Reproduktionsmedizin
Eines der bedeutsamsten Ereignisse in der Geschichte der assistierten Reproduktion war die
Geburt von Louise Brown, dem ersten nach in-vitro-Fertilisation (IVF) und Reimplantation
geborenen Kind [215]. Die dadurch ausgelöste intensive Forschung auf diesem Gebiet führte
1992 zur Implementation der intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI; [216]). Seit
Einführung der ICSI gab es bis heute kein Verfahren, das in vergleichbarer Weise die
Konzeptionschancen in der Reproduktionsmedizin vervielfachen konnte [211]. Die
Motivation zur Entwicklung der IVF war ursprünglich die Therapie von Patientinnen mit
tubarer Sterilität. Durch die kontinuierliche Weiterentwicklung dieser Technik ist es heute
möglich, eine Vielzahl von Ursachen für Infertilität mittels IVF erfolgreich zu behandeln
[217]. Als IVF wird prinzipiell die Methode der assistierten Reproduktion beschrieben, bei
der das männliche Sperma und die weibliche Eizelle außerhalb des Körpers bzw.
extrakorporal miteinander kombiniert werden. Grundsätzlich besteht ein vollständiger IVFBehandlungszyklus aus einer ovariellen Stimulation, der Eizellgewinnung, der Fertilisation,
der Kultivierung des Embryos sowie dem Embryonentransfer [217]. Die ovarielle Stimulation
dient dazu, einen Eisprung oder eine Polyovulation zur Gewinnung mehrerer Eizellen für
anschließende extrakorporale Behandlungen herbeizuführen. Prinzipiell wird dies durch eine
indirekte oder direkte Erhöhung des Serum-FSH-Spiegels verursacht. Im Verlauf des
natürlichen Zyklus kommt es durch die FSH- und LH-Wirkung zu einer zyklischen
Rekrutierung von Follikeln im Ovar, die zur Selektion eines dominanten Follikels führt, der
letztlich in einer Monoovulation in den Eileiter entlassen wird (siehe Kapitel 1.2.2). Der
dominante Follikel stellt dabei den Follikel dar, der über die höchste FSH-Rezeptordichte und
damit über die höchste FSH-Sensitivität verfügt. Wird bei der Ovulationsinduktion das Ziel
einer Monoovulation forciert, wird der Serum-FSH-Spiegel minimal notwendig erhöht, um
die Reifung eines einzelnen Follikels zu induzieren [218]. Für eine Polyovulation bzw.
Superovulation wird der Serum-FSH-Spiegel gezielt so erhöht, dass sich neben dem
dominanten Follikel auch mehrere, nicht-dominante Follikel weiterentwickeln, die unter
natürlichen Bedingungen in die Atresie übergehen würden. Eine allgemein gültige Anzahl an
Eizellen, die ein optimales Ergebnis einer ovariellen Stimulation kennzeichnet, existiert nicht.
26
EINLEITUNG
Eine Studie, in der Nutzen und Risiken einer ovariellen Stimulation berücksichtigt wurden,
proklamiert jedoch, dass dabei zwischen 5 und 15 Eizellen für die IVF gewonnen werden
sollten [219]. Die Entnahme der reifen Follikel aus dem Ovar erfolgt in den meisten Fällen
durch eine transvaginale ultraschallgesteuerte Follikelpunktion. Diese Technik wurde 1985
entwickelt [220] und hat sich in den vergangenen 30 Jahren als Methode der Wahl in der
Reproduktionsmedizin etabliert. In der Regel werden alle Follikel punktiert, die punktiert
werden können und einen Durchmesser von mehr als 10 mm aufweisen. Die so gewonnenen
Follikel bzw. Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) werden anschließend einer visuellen
Beurteilung unterzogen, um die qualitativ hochwertigsten Follikel bzw. Eizellen für die IVF zu
identifizieren. Dabei kennzeichnet eine expandierte und luteinisierte Kumuluszellmatrix eine
reife Eizelle (Metaphase II) während dichter gepackte Kumuluszellen auf eine unreife Oozyte
hinweisen [221]. Ob die Befruchtung der Eizelle(n) durch eine IVF oder ICSI erfolgt
entscheidet die Qualität der Spermien nach der Aufbereitung des Ejakulats. Bei der IVF
werden ein oder mehrere COC in einem Kulturschälchen 2-3h nach der Punktion mit einer
bestimmten Anzahl von Spermien versetzt. Dabei liegt die Konzentration der Samenzellen
zwischen 20.000 und 25.000 Spermien pro Eizelle. Nach Inkubation über Nacht und der
Entfernung der umgebenden somatischen Zellen (Denudation) wird die Gegenwart von 2
Vorkernen bzw. 2 Polkörpern als erfolgreiche Befruchtung gewertet. Für eine Befruchtung
durch ICSI wird die Oozyte zunächst denudiert um zu ermöglichen, die Reife der sich
entwickelnden Gameten zu kontrollieren. Nach der Selektion und einer in der Regel
mechanischen Immobilisierung des Spermiums erfolgt die Injektion der männlichen Gamete
in die Eizelle. Dabei ist zu beachten die Einstichstelle möglichst weit vom ersten Polkörper zu
positionieren. Da sich die Teilungsspindel in unmittelbarer Nähe zum ersten Polkörper
befindet soll dadurch verhindert werden, dass die sensitiven Mikrotubuli der Spindel
mechanisch beschädigt werden [222]. Neben den beschriebenen standardisierten Abläufen
einer IVF bzw. ICSI gibt es eine Vielzahl modifizierter Protokolle, die sich in ihren technischen
Details unterscheiden und in den verschiedenen Kliniken und Laboratorien zur Anwendung
kommen. Im Allgemeinen sollte in 60% (IVF) bis 80% (ICSI) der Eizellen eine erfolgreiche
Befruchtung zu erwarten sein. Der Befruchtung schließt sich eine Inkubation in
Kulturmedium an, wobei die Reifung des sich entwickelnden Embryos überwacht und
bewertet wird. In Deutschland findet diese Bewertung der Embryonen nur nach
lichtmikroskopischen Kriterien statt. Nur in Ausnahmefällen bei entsprechender Indikation
27
EINLEITUNG
kann seit 2010 auch eine Präimplantationsdiagnostik (Trophektodermbiopsie) durchgeführt
werden. Nach Auswahl der optimalen Embryonen werden diese in die Gebärmutter der
Patientin transferiert. Während bis Ende der 1990er-Jahre die Embryonen üblicherweise
etwa 2 bis 3 Tage nach der Insemination (4- bis 8-Zell-Stadium) in den Uterus transferiert
wurden, hat sich seitdem eine längere, extrakorporale Kultur und der Blastozystentransfer
als erfolgreichere Technik nach IVF und ICSI etabliert [223, 224]. Um das Risiko von
Mehrlingsschwangerschaften zu reduzieren, ist die Anzahl der einzusetzenden Embryonen
nach dem Deutschen Embryonenschutzgesetz auf maximal 3 beschränkt. Das Einsetzen der
Embryonen in den Uterus erfolgt meist durch einen ultraschallgezielten oder freien
Embryonentransfer (ET) mit anschließender Bettruhe für 24h.
1.3.2 Assistierte Reproduktionstechniken bei Nutztieren
Die unter 1.3.1 genannten und beschriebenen Techniken der assistierten Reproduktion
wurden vor ihrer Anwendung in humanen Patienten in domestizierten Tier(modell)en
erprobt und entwickelt. Neben der Reproduktionsmedizinischen Nutzung im Menschen,
wurden und werden assistierte Reproduktionstechniken zur Selektion genetisch favorisierter
Zuchttiere insbesondere in Rindern, Schafen, Ziegen, Schweinen und Pferden eingesetzt. Die
erste erfolgreiche artifizielle Insemination wurde 1784 durch Spallanzani an einer Hündin
durchgeführt und beschrieben [225]. 1922 intensivierte Ivanoff die Untersuchungen dieser
Technik an Nutztieren, Hunden, Füchsen, Karnickel und Federvieh [226]. Heutzutage gehört
die artifizielle Insemination zu einer der am häufigsten angewandten Techniken in der
Nutztierzucht und wird pro Jahr an 100 Millionen Rindern, 40 Millionen Schweinen, 3,3
Millionen Schafen und 0,5 Millionen Ziegen weltweit durchgeführt [227].
Der erste erfolgreiche Transfer eines Säuger-Embryos gelang 1890 Walter Heap [228]. Heap
transferierte
zwei
4-Zell-Embryonen
von
Angorakaninchen
in
ein
weibliches
Hasenkaninchen, welches zwei Angorakaninchen und vier Hasenkaninchen gebar. In den
1930er und 1940er Jahren wurden die ersten erfolgreichen Embryonentransfers in Schafen
und Ziegen beschrieben [228, 229], bevor 1951 das erste, aus einem übertragenen Embryo
entwickelte Kalb geboren wurde [229, 230].
Die erste Lebendgeburt eines Säugetiers nach IVF gelang 1959 M.C. Chang, welcher Oozyten
von Kaninchen in vitro außerhalb des Organismus befruchtete [231]. 1968 wurde diese
Methode erfolgreich an Mäusen durchgeführt bevor 1978 das erste Kind nach einer in-vitro28
EINLEITUNG
Fertilisation geboren wurde [232]. Ein durch IVF entstandenes Kalb wurde erstmals 1981
beschrieben [233]. Im Zuge der erfolgreichen IVF-Experimente wurden auch Methoden zur
intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) erprobt, welche 1976 erstmalig erfolgreich in
einem Hamster durchgeführt werden konnten [234]. Die Anwendung assistierter
Reproduktionstechniken bei Nutztieren konnte zu einer beschleunigten Vermehrung der
Populationen genetisch favorisierter Zuchttiere von Rindern, Büffeln, Schafen, Ziegen,
Pferden und Schweinen führen. Nach aktuellen Daten des „International Embryo Transfer
Society Data Retrieval Committee“ umfasst die Anzahl der transferierten Embryonen pro
Jahr weltweit etwa 800.000 in Rindern, 25.000 in Schafen, 7000 in Ziegen, 30.000 in
Schweinen und 12.000 in Pferden, wobei etwa zwei Drittel in vivo gewonnen wurden und ein
Drittel in vitro fertilisiert wurde [235]. Die Techniken zur in vitro-Produktion von Embryonen
dienen nicht nur der Gewinnung von Nutztier-Populationen mit spezifisch gewünschten
Eigenschaften sondern stellen auch eine verhältnismäßig einfache und geeignete Quelle von
Embryonen für die biologische und biotechnologische Forschung dar. Biotechnologische
Verfahren wie Klonierungstechniken und Zellkerntransfer-Experimente, die aus ethischen
Gründen nicht an humanen Embryonen angewendet werden dürfen, können an tierischen
Embryonen
durchgeführt
werden
und
dazu
genutzt
werden
grundlegende
entwicklungsbiologische Prozesse zu untersuchen. Unter den aufgeführten Arten von
Zuchttieren zeigten insbesondere frühe embryonale Stadien von Rindern viele Ähnlichkeiten
zu
humanen
Embryonen
[236-239].
Diese
sowie
weitere
Übereinstimmungen
charakterisieren das Rind als geeigneten Modellorganismus der humanen Reproduktion,
worauf im Kapitel 1.5 ausführlich eingegangen wird.
1.3.3 Assistierte Reproduktionstechniken und gesundheitliche Risiken
Der gesamte Vorgang von der Entwicklung der Urkeimzellen bis zur Entstehung der Zygote
stellt nicht nur ein sensibles Regelwerk von Entwicklungsschritten dar sondern beinhaltet vor
allem zahlreiche notwendige Selektions- und Filtermechanismen, um einen Embryo mit
höchstem Entwicklungspotential zu generieren. Die Eizelle steht bereits während der
Entwicklung vom primordialen Stadium bis zur reifen, befruchtungsfähigen Oozyte unter
enormem Selektionsdruck. Dies zeigt sich beispielsweise daran, dass von etwa 40.000
primären Oozyten zu Beginn der Pubertät nur etwa 400 Eizellen innerhalb der reproduktiven
Lebensspanne ovulieren [240]. Unter Anwendung von ARTs werden in Abhängigkeit der
verwendeten Technik einige dieser natürlichen Selektions- und Filtermechanismen verändert
29
EINLEITUNG
bzw. umgangen. Diese Eingriffe bergen daher prinzipiell das Risiko, dass Keimzellen mit
vermindertem Entwicklungspotential zur Generierung eines Embryos verwendet werden, die
unter natürlichen Umständen bereits vor der Fertilisation aussortiert worden wären. Seit der
Geburt des ersten Kindes nach durchgeführter in-vitro-Fertilisation (IVF) 1978 [215] wurden
bis heute mehr als 5 Million IVF-Kinder weltweit geboren [241]. Innerhalb dieser 40 Jahre
moderner humaner Reproduktionsmedizin wurden zahlreiche Studien und Metaanalysen
durchgeführt, in denen die Auswirkung von ARTs auf die mütterliche und insbesondere auf
die kindliche Gesundheit untersucht wurde. Den größten Risikofaktor sowohl für das Kind als
auch für die Mutter in Verbindung mit ARTs stellen Mehrlingsschwangerschaften dar [242].
Um die Chancen einer Schwangerschaft zu erhöhen, werden mehrere, meist 3 Embryonen
transferiert. Damit erhöhen sich allerdings gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit einer
Mehrlingsschwangerschaft
und
das
damit
einhergehende
Risiko
für
Schwangerschaftskomplikationen. Der Transfer von 2 Embryonen kann diesen Risikofaktor
jedoch bei unveränderter Schwangerschaftrate deutlich reduzieren [243, 244]. In den
skandinavischen Ländern konnte sich die Übertragung von einzelnen Embryonen als
Standardmethode durchsetzen, wodurch die Häufigkeit von Mehrlingsschwangerschaften
erheblich gesenkt wurde [242, 245]. Eine weitere Beobachtung, die auch mit
Mehrlingsschwangerschaften in Verbindung steht, ist das gehäufte Auftreten von Kindern
mit niedrigem Geburtsgewicht nach ART [246, 247]. Als mögliche Ursache wird hier die
Superovulation vermutet [248, 249]. Die hormonelle Behandlung während der
Superovulation
wird auch
in
Zusammenhang mit
einem
erhöhten
Risiko
von
Implantationsversagen, Bluthochdruck, Blutungen, Placenta praevia und Imprinting-Fehlern
gebracht [250-254]. Die Etablierung und Aufrechterhaltung der genomischen Prägung, die
essentiell für eine normale Entwicklung des Embryos ist, könnten im besonderen Maße
durch
reproduktionsmedizinische
Eingriffe
beeinflusst
werden.
Da
die
Prägung
verschiedener Gene in unterschiedlichen Entwicklungsphasen erfolgt, wird vermutet, dass
durch unterschiedliche ARTs auch verschiedene Imprinting-Regionen betroffen sein könnten.
Die Prägung von SNRPN, die vermutlich spät in der Follikulogenese etabliert wird [255, 256],
könnte daher ebenfalls durch die Superovulation beeinträchtigt werden [254]. Das Auftreten
von Imprinting-Fehlern wurde in etwa 1% bei Patienten mit Prader-Willi-Syndrom (PWS), 3%
bei Patienten mit Angelman-Syndrom (AS), 50% bei Betroffenen mit Beckwith-WiedemannSyndrom (BWS) und 50% bei Patienten mit transientem neonatalem Diabetes mellitus
30
EINLEITUNG
nachgewiesen [254]. AS und BWS zeigen dabei eine Hypermethylierung der ImprintingKontrollregion auf dem maternalen Chromosom [254]. Die publizierten Studien, in denen
Imprinting-Fehler in ART-Kindern untersucht wurden, sind widersprüchlich. Bei den
unterschiedlichen Vergleichen von Kindern, die nach einer ART-Behandlung geboren
wurden, und denen, die auf natürlichem Weg entstanden, wird sowohl von erhöhten
Fehlerraten [257-263] als auch von unveränderten Häufigkeiten von Imprinting-Fehlern bei
ART-Kindern berichtet [254, 264, 265]. Aufgrund der geringen Inzidenz dieser Syndrome (110 in 100.000 Kindern, vgl. Kapitel 1.1.3) wird für eine solide Prüfung dieser Fragestellung
eine deutlich höhere Fallzahl benötigt, als die bisher durchgeführten Studien umfassen. Die
Anfälligkeit dieser Studien für Verzerrungen können bisher noch keine verlässlichen
Aussagen gewährleisten. Hinweise auf einen Verbindung zwischen ARTs und Störungen der
genomischen Prägung zeigen sich jedoch ebenfalls in Tiermodellen [266]. Das sog. „Large
offspring syndrome“ (LOS) konnte bei Rindern, Schafen [267, 268] und Mäusen [269-271]
nach Somatischem Zellkerntransfer (SCNT) und ARTs beobachtet werden und weist
vergleichbare phänotypische wie epigenetische Auffälligkeiten zum humanen BeckwithWiedemann-Syndrom (BWS) auf [272, 273]. Trotz schwieriger Gesamtbewertung begründen
die beschriebenen Einzelfälle den Verdacht einer Beeinträchtigung der genomischen
Prägung durch ARTs und sollte daher weiterhin unter intensiver Beobachtung bleiben [254,
264]. Eine eingeschränkte Bewertung der Daten wurde ebenfalls für Studien beschrieben,
die den Zusammenhang zwischen assistierten Reproduktionstechniken und großen
Fehlbildungen untersuchten. Von drei Metaanalysen [274-276], denen diese Fragestellung
zugrunde lag, konnten zwei eine signifikant erhöhte Fehlbildungsrate bei IVF- und ICSI-Kinder
gegenüber natürlich gezeugten Kindern nachweisen [275, 276]. Die Ergebnisse aller drei
Metaanalysen wiesen jedoch eine geringe Validität auf. Durch die Heterogenität der
einbezogenen
Einzelstudien
in
Bezug
auf
die
Fehlbildungsklassifikationen,
den
Untersuchungsmodus, den Studienaufbau sowie die Ergebnisse kann eine Verzerrung der
gesamten Analyse nicht ausgeschlossen werden [264]. Neben den geringen Fallzahlen und
der fehlenden Homogenität der gegenwärtig veröffentlichten Studien, wird die Bewertung
möglicher gesundheitlicher Risiken für das Kind durch ARTs allgemein durch den
biologischen Hintergrund der infertilen Eltern erschwert [254, 277]. So wird beispielsweise
vermutet, dass Eltern bereits eine genetische Prädisposition für eine genetische oder
epigenetische Instabilität vorweisen und mögliche gesundheitliche Folgen für das Kind nicht
31
EINLEITUNG
durch die verwendeten assistierten Reproduktionstechniken verursacht wurden [254].
Inwiefern ARTs die Entwicklung der Keimzellen und des Embryo bei vorliegender elterlicher
Prädisposition sowohl negativ als auch positiv beeinflussen bleibt eine der wichtigen Fragen
zukünftiger Forschung. Die Beobachtung und Dokumentation pathologischer Auswirkungen
nach Verwendung von ARTs bleibt jedoch von elementarer Bedeutung, um mögliche Risiken
für die Gesundheit des Kindes zu erkennen.
1.4 In-vitro-Maturation von Eizellen
Als In-vitro-Maturation (IVM) bezeichnet man den Prozess, bei dem unreife Eizellen aus
Antralfollikeln mittlerer Größe die Veränderungen der nukleären und zytoplasmatischen
Reifung extrakorporal in einem Zellkultur-System durchlaufen [278, 279]. Der Vorteil dieser
vergleichsweise jungen Methode der assistierten Reproduktionstechniken liegt insbesondere
in
der
Vermeidung
der
ovariellen
Stimulation
und
den
damit
verbundenen
Gesundheitsrisiken für die Eizellspendering [211]. Die Grundlagen dafür lieferten Pincus und
Kollegen in den 1930er Jahren. Sie beobachteten erstmals wie Eizellen von Kaninchen [280]
und Menschen [281] spontan die Meiose fortsetzten, nachdem sie aus dem Antralfollikel
isoliert wurden und in einem Medium kultiviert wurden. Die Untersuchungen an KaninchenEizellen wurden in den 50er Jahren von Chang intensiviert [282], bevor Bob Edwards Anfang
der 60er Jahre die nukleäre Reifung an Oozyten außerhalb des Follikels bei mehreren
Säuger-Spezies einschließlich dem Rind beobachten konnte [283]. 1969 gelang es ebenfalls
Edwards erstmals eine humane Eizelle erfolgreich zu befruchten, die durch eine IVM gereift
wurde [284]. Die erste humane Schwangerschaft nach IVM wurde 1991 von Cha et al.
beschrieben, welche an Eizellen aus exstirpierten Ovarien durchgeführt wurde [285]. Trotz
geringerer Schwangerschaftsraten im Vergleich zu in vivo gereiften Oozyten, konnte sich die
IVM als nützliche Anwendung in der Produktion von Zuchttieren wie dem Rind [286] und als
erfolgsversprechende
Alternative
für
bestimmte
Indikationsgruppen
in
der
Reproduktionsmedizin [211] etablieren.
1.4.1 IVM in der humanen Reproduktionsmedizin
Die ovarielle Gonadotropinstimulation bei der klassischen IVF/ICSI birgt bei bestimmten
Patientengruppen wie Frauen mit polyzystischen Ovarsyndrom (PCOS) das Risiko eines
ovariellen Überstimulationssyndroms (OHSS) (5% bei PCOS-Patientinnen [287]) [288]. Die
Intention
zur
Entwicklung
einer
extrakorporalen
Eizellreifung
in
der
humanen
32
EINLEITUNG
Reproduktionsmedizin bestand zunächst darin, die ovarielle Stimulation und das damit
verbundene Risiko eines OHSS zu vermeiden. Neben den Risikogruppen des OHSS können
auch Krebs-Patientinnen mit Kinderwunsch vor einer bevorstehenden zytotoxischen
Therapie wie beispielsweise einer Chemotherapie von einer IVM profitieren [289]. Die
technische
Durchführung
der
humanen
IVM
beginnt
mit
einer
dreitägigen
Kurzzeitstimulation mit Gonadotropinen in niedriger Dosierung. Die Oozytenentnahme
erfolgt
durch
eine
Follikelaspiration
unter
Verwendung
eines
hochauflösenden
Ultraschallgeräts. Die anschließende In-vitro-Maturation erfolgt durch Inkubation der
Kumulus-Eizell-Komplexe (COCs) in einem Kulturmedium für 24 h. Die Zusammensetzung des
Mediums variiert dabei zwischen unterschiedlichen Laboren in Abhängigkeit empirischer
Erfahrungen. Häufig wird als Basismedium Hams F-10 oder TCM 199 verwendet. Dieses wird
dann zumeist mit Glukose [290] sowie essenziellen und nicht essenziellen Aminosäuren und
Vitaminen angereichert [211]. Weitere Zusätze stellen auch FSH [291], LH und humanes
Choriongonadotropin
(HCG)
[292]
sowie
fetales
Nabelschnurserum,
humanes
Serumalbumin, synthetische Präparate als auch Serum von der Patientin selbst dar. Der
Inkubation schließt sich eine Beurteilung des Reifestadiums der Eizelle an, welche dann ggf.
durch IVF oder ICSI befruchtet wird. Nach erfolgreicher Befruchtung und dem
Embryonentransfer wird die Lutealphase mit Progesteron (und Östradiol ab Eizellgewinnung)
bis zur 12. Schwangerschaftswoche unterstützt [211]. Die Schwangerschaftsraten pro Zyklus
liegen zwischen 15% [293] und 24% [291, 294]. Dabei steigt die Schwangerschaftsrate mit
der Größe des für die IVM verwendeten dominanten Follikels (<10 mm: 21,1%; 14 mm:
40,3%) [295].
Neben den genannten Vorteilen der IVM birgt diese Methode jedoch auch eine Reihe von
Nachteilen. Dazu zählen die geringen Implantationsraten sowie der höhere technologische
Aufwand. Zu erwähnen sind jedoch insbesondere mögliche ungeklärte epigenetische und
anderweitige fetale Risiken verursacht durch die Reifung in einer unphysiologische In-vitroKultur. Aufgrund der geringen Anzahl der bisher nach IVM geborenen Kinder ist noch
ungeklärt,
ob
IVM
chromosomale
Aberrationen,
Genomreprogrammierungsfehler,
Fehlbildungen oder gesundheitliche Risiken für die Mutter verursacht, obgleich die wenigen
Studien bislang keine Hinweise darauf geben [254, 288, 296-301]. Gegenwärtig stellt die IVM
in der humanen Reproduktionsmedizin eine erfolgsversprechende und nützliche Alternative
zur konventionellen IVF/ICSI für eine spezifische Patientengruppe dar. Inwiefern die IVM
33
EINLEITUNG
jedoch die IVF/ICSI mit ovarieller Stimulation ersetzen wird, werden die zukünftigen
Erfahrungen aus den Kliniken sowie der Fortschritt der Forschung in den nächsten Jahren
zeigen.
1.4.2 IVM beim Rind (Bos taurus)
Ende der 60er und Anfang der 70er Jahre konnten Untersuchungen an Eizellen von Rindern
und Schafen die Chronologie der Oozytenreifung aufdecken. Bei in vitro-Experimenten zeigte
sich eine optimale Reifungsdauer von 24h, die dem natürlichen Intervall zwischen dem
präovulatorischen LH-Anstieg und der Ovulation der reifen Oozyte in beiden Tieren
entsprach. Der erste Bericht eines nach IVM und IVF geborenen Kalbs wurde 1986
veröffentlicht [302]. Das Ende der 80er Jahre etablierte Protokoll zur IVM von unreifen
Rindereizellen unterscheidet sich nicht fundamental von dem Protokoll, das in der humanen
Reproduktionsmedizin verwendet wird. Nach der Dissektion der Follikel aus dem Ovar
wurden daraus die Kumulus-Oozyten-Komplexe (COCs) isoliert. Die Inkubation der COCs
erfolgte dann für 24h in TCM 199, welchem zusätzlich Kumuluszellen und Granulosazellen
sowie Antibiotika und oestrisches Kuhserum (OCS) zugesetzt wurden. Die Zugabe von
Hormonen konnte keinen förderlichen Effekt für die Entwicklung des Embryos zeigen [303].
Ursächlich dafür könnten die Hormone des OCS sein, die die Eizellreifung bereits in
ausreichendem Maße unterstützen [304]. Ein negativer Effekt auf die Blastozystenrate
konnte hingegen bei einer Verlängerung der Reifungsdauer bzw. der Dauer der Inkubation
über 24h hinaus beobachtet werden [305-308]. Dieser als postovulatorische Alterung
bezeichneter Prozess wurde sowohl in vitro als auch in vivo neben dem Rind auch in der
Maus [309], dem Schwein [310] und dem Menschen [311] beschrieben. In vivo tritt dieser
Prozess ein, wenn das Spermium die Eizelle nach dem Eisprung verspätet und außerhalb des
optimalen Zeitfensters erreicht. In vitro setzt die postovulatorische Alterung ein, wenn die
Oozyte über die optimale Reifungsdauer hinaus inkubiert wird bevor bevor sie durch ein
Spermium befruchtet wird [312]. Trotz einer deutlich geringeren Blastozytenrate der IVM im
Vergleich zur Reifung in vivo (in vitro: 3%; in vivo: 40% [313]) bietet die IVM die einzigartige
Möglichkeit Embryonen mit Eizellen von Schlachthof-Ovarien zu produzieren [314]. Von
insgesamt 121.199 in vitro fertilisierten Oozyten in Europa 2014 wurden 37.414 Eizellen aus
Schlachthof-Ovarien gewonnen [315]. Neben der industriellen Nutzung bietet die Produktion
von Embryonen aus Schlachthof-Ovarien durch IVM eine günstige und einfache Quelle von
Embryonen für Forschungszwecke.
34
EINLEITUNG
1.5 Das Hausrind (Bos taurus) als Modellorganismus der humanen Reproduktion
Die Errungenschaften der Reproduktionsforschung ermöglichten es Paaren mit unerfülltem
Kinderwunsch eine Behandlung anzubieten und diesen Wunsch gegenwärtig für etwa jedes
5. Paar (20%) mit einem Kind zu erfüllen [316]. Um diese Erfolgsrate zu erhöhen und die
Grundlagen der humanen Reproduktionsmechanismen besser zu verstehen, ist das
Fortschreiten der Forschung auf dem Gebiet der Reproduktion elementar. Im Gegensatz zu
vielen anderen medizinischen Forschungsbereichen birgt die humane Reproduktionsmedizin
jedoch eine besondere ethische Problematik, die insbesondere durch die Verwendung von
Modellorganismen gelöst bzw. umgangen werden kann. Die Auswahl eines geeigneten
Modellorganismus orientiert sich maßgeblich an der Fragestellung der Untersuchung. Auf
dem Forschungsgebiet der Reproduktion und Embryologie stellt die Maus das bisher am
häufigsten genutzte Modell dar [317]. Erkenntnisse über die bovine Reproduktion, die in den
letzten Jahrzehnten gewonnen werden konnten, charakterisieren das Rind jedoch
zunehmend als geeigneteres Modell für die humane Reproduktion als die Maus. Im
Gegensatz zu Nagern sind Kühe und Frauen unipar und haben eine vergleichbare Dauer des
Menstruationszyklus (durchschnittlich 21 bis 22 Tage bei Kühen [125] und 28 Tage bei
Frauen [318]) sowie eine vergleichbare Tragzeit (etwa 280 Tage bei Kühen [125] und 266
Tage bei Frauen [319]). Neben einer ähnlichen Morphologie und Größe der Ovarien [118],
zeigen beide Spezies auch eine gleichartige Follikelentwicklung und -dynamik (siehe Kapitel
1.2.2) und weisen wichtige Gemeinsamkeiten in der finalen Phase der Eizellreifung auf. Vor
allem die Zeitspannen der Entwicklungsabläufe der Keimzellen und der Embyonen, die einen
entscheidenden Faktor darstellen, sind zwischen Rind und Mensch vergleichbar, wohingegen
sie bei Nagern deutlich beschleunigt ablaufen [317]. Die wellenförmige Entwicklung der
Follikel im Ovar beispielsweise, die bereits während der letzten zwei Dekaden beim Rind
beobachtet und beschrieben wurde, diente als Grundlage für die später entdeckten,
ähnlichen Wellen im humanen Ovar [118, 134, 320]. Auch beim Übergang zur Zygote und der
frühen embryonalen Entwicklung weisen bovine und humane Zellen Ähnlichkeiten auf. Diese
Analogien betreffen die Ausbildung der Mikrotubuli während der Befruchtung, den
Zeitpunkt der Genomaktivierung, die erforderlichen metabolischen Bedingungen, die
Interaktionen mit dem Kulturmedium sowie den zeitlichen Ablauf der Entwicklung vor der
Implantation [236-239]. Ein ebenfalls wesentlicher Unterschied zum Mausmodell stellt die
Interaktion zwischen dem Embryo und dem Gelbkörper (Corpus luteum) dar, die
35
EINLEITUNG
entscheidend für den Verlauf der Schwangerschaft ist. Bei Mäusen muss Prolactin zum
Zeitpunkt des Koitus ausgeschüttet werden, um die Transformation vom zyklischen
Gelbkörper (Corpus albicans) zum Gelbkörper, der bei einer Schwangerschaft vorliegt
(Corpus luteum graviditatis), zu induzieren. Diese Umwandlung des Gelbkörpers erfolgt in
Kühen durch Tau-Interferon und in Frauen durch Choriongonadotropin, deren Ausschüttung
in beiden Organismen durch ein Signal des Embryos ausgelöst wird [317]. Neben
physiologischen und biochemischen Parallelen zwischen Rind und Mensch im gesunden
Zustand zeigen beide Organismen auch Ähnlichkeiten bei Entwicklungsstörungen, die durch
epigenetische Veränderungen verursacht werden. Wie bereits in Kapitel 1.3.3 beschrieben
weist das sog. „Large offspring syndrome“ (LOS) beim Rind vergleichbare phänotypische wie
epigenetische Auffälligkeiten zum humanen Beckwith-Wiedemann-Syndrom (BWS) auf [272,
273]. Sowohl das LOS beim Rind als auch das BWS beim Menschen werden mit einer
gestörten
Keimzellentwicklung
bzw.
-reifung
und
der
Anwendung
assistierter
Reproduktionstechniken assoziiert [257-263, 266-268]. Diese Analogie unterstreicht das
Potential des Hausrinds als geeigneten Modellorganismus für die humane Reproduktion,
insbesondere für epigenetische Fragestellungen.
1.6 Zielsetzung der Arbeit
Die Prozesse der DNA-Methylierung, die während der Entwicklung der unreifen Eizelle im
Antralstadium zur befruchtungsfähigen Oozyte ablaufen, stellen essentielle Vorgänge für die
Entwicklung
des
Embryos
dar.
In
dieser
Phase
erlangt
die
Eizelle
ihre
Entwicklungskompetenz, die eine umfassende epigenetische Restrukturierung des Genoms
mittels
DNA-Methylierung
einschließt.
Wie
die
gesamte
Eizellentwicklung
bzw.
Follikulogenese folgt auch der epigenetische Umbau einem Zeitplan, der bestimmte
Veränderungen innerhalb spezifischer Zeitfenster vorsieht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit
bestand darin, den Einfluss der Verweildauer in spezifischen Entwicklungsphasen auf die
DNA-Methylierung entwicklungsrelevanter Kandidatengene in unreifen und reifen Eizellen
zu untersuchen. Durch die Analyse von drei unterschiedlichen Eizell-Kohorten wurde der
Effekt von drei verschiedenen Zeitfenstern dokumentiert. Oozyten aus Antralfollikeln
verschiedener Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) repräsentierten Eizellen, die sich für
unterschiedliche Zeitspannen im Antralstadium befinden (Abbildung 5). Follikel der
mittelgroßen Kategorie (3-5 mm) wurden für 24 h und 48 h in vitro gereift, um den Einfluss
der Reifungsdauer bzw. den Einfluss der postovulatorischen Alterung zu untersuchen. Aus
36
EINLEITUNG
gereiften Eizellen beider Gruppen wurden Embryonen generiert, um auch mögliche
Auswirkungen der Reifungsdauer für den Embryo zu identifizieren. Sowohl in den unreifen
Eizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe als auch in den gereiften Oozyten und
den Embryonen wurden die Promotormethylierung der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1,
bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls erfasst (Abbildung 5). Im dritten Teil der
Arbeit wurden ebenfalls Oozyten aus mittelgroßen Antralfollikeln analysiert, die aus Rindern
unterschiedlichen Alters gewonnen wurden (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre).
Aufgrund der verschiedenen Lebensalter der Tiere stellen ihre Oozyten Eizellen dar, die für
unterschiedliche Zeitspannen im Diplotän der Meiose I arretiert wurden und sich damit in
unterschiedlichen Stadien der ovariellen Alterung befinden. Die DNA-Methylierungsanalysen
umfassten hier die Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN (Abbildung 5). Die daraus gewonnenen Daten und
Erkenntnisse sollen dazu dienen, den Einfluss zeitlicher Faktoren bei der Etablierung der
DNA-Methylierungsmuster in unreifen und reifen Eizellen besser zu verstehen. Neben der
Erweiterung
des
Basiswissens
der
DNA-Methylierungsprozesse
während
der
Eizellentwicklung und -reifung, sollen die Schlussfolgerungen dieser Arbeit auch als
Grundlage zur Optimierung assistierter Reproduktionstechniken in der humanen
Reproduktionsmedizin genutzt werden.
Antralfollikel aus in vivo-Ovarien
Unreife Eizellen aus Kühen
unterschiedlichen Alters:
9-12 Monate
5-7 Jahre
Antralfollikel aus Schlachthof-Ovarien
Unreife Eizellen aus Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe:
8-11 Jahre
<2 mm
3-5 mm
In vitro gereifte Eizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer:
24h
3-5 mm
>6 mm
24h
DNA-Methylierung
In vitro fertilisierte Embryonen aus
Eizellen unterschiedlicher Reifungsdauer:
48h
48h
DNA-Methylierung
H19
SNRPN
DNMT3Lo
TERF2
REC8
BCL-XL
PISD
BUB1
H19
SNRPN
DNMT3Lo
ZAR1
OCT4
DNMT3A DNMT3Ls
Abbildung 5: Übersicht der untersuchten Proben und Gene. Es wurden Antralfollikel in vivo aus Kühen unterschiedlichen
Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) gewonnen. In den daraus isolierten unreifen Eizellen wurde die DNAMethylierung der Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bDNMT3Lo, bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1
37
EINLEITUNG
untersucht. Aus Schlachthof-Ovarien wurden Antralfollikel unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) isoliert.
Eizellen von Antralfollikeln mittlerer Größe (3-5 mm) wurden für 24h und 48h in vitro gereift. Aus beiden Kategorien in vitro
gereifter Eizellen wurden durch in vitro Fertilisation Embryonen generiert und bis zum 4-6 Zellstadium kultiviert. Sowohl in
den unreifen und gereiften Eizellen als auch in den generierten Embryonen wurden die Promotormethylierung der Gene
bH19, bSNRPN, bDNMT3Lo, bZAR1, bOCT4, bDNMT3A und bDNMT3Ls analysiert. Die rot unterlegten Gene (bH19, bSNRPN,
bDNMT3Lo, und bOCT4) dienten u.a. als Kontrollgene zu Erkennung somatischer Kontaminationen. Schematische Abbildung
eines Ovars entnommen aus [321].
1.7 Untersuchte Gene
Die DNA-Methylierungsanalysen der vorliegenden Arbeit konzentrierten sich auf
Promotorregionen von ausgewählten Kandidatengenen. Die Anzahl der analysierbaren Gene
wird dabei von der Menge des vorhandenen Probenmaterials bzw. der verwendeten
Methode limitiert. Bei der in dieser Arbeit verwendeten Methode der Limiting Dilution (LD)
wird die maximale Anzahl der untersuchten Regionen maßgeblich durch die in der MultiplexPCR eingesetzten Primer-Sequenzen bestimmt (siehe Kapitel 2.2.2). In der Multiplex-PCR
werden mehrere DNA-Regionen gleichzeitig amplifiziert. Dabei besteht das Risiko, dass
Primer-Moleküle unspezifisch binden und unspezifische Amplifikate produzieren, welche die
Analyse der Zielregionen beeinträchtigen. Um störende Interaktionen der Primer-Moleküle
auszuschließen, muss die Kompatibilität der Primer-Kombinationen empirisch getestet
werden. Das Genset 1 beinhaltete sieben DNA-Regionen (bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A,
bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls) und das Genset 2 acht Promotorregionen (bTERF2,
bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN). Die Gene H19, SNRPN und
DNMT3Lo waren in beiden Gensets enthalten, da sie aufgrund ihrer Prägung zusätzlich als
Kontrollgene zum Nachweis somatischer Kontamination dienten (siehe 1.8). Die Funktion der
untersuchten Gene beider Gensets wird im Folgenden ausführlich beschrieben.
1.7.1 Genset 1: Oozyten- und Maturations-spezifische Gene
Die Untersuchung mit dem Genset 1 zielte darauf ab, Veränderungen der DNAMethylierungsmuster zu erkennen, die während der Entwicklung und Reifung der Eizelle
auftreten. Dazu wurden die DNA-Regionen von bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4,
bDNMT3Lo und bDNMT3Ls (Abbildung 6) bei unreifen Eizellen und in vitro gereiften Eizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer sowie den daraus generierten Embryonen untersucht.
Bei den Genen bH19 und bSNRPN handelt es sich um geprägte Gene, welche nur von einem
elterlichen Allel exprimiert werden. Die genaue Funktion von H19 konnte bisher nicht
vollständig aufgeklärt werden. Es ist bekannt, dass H19 die Transkription des Gens IGF2
(insulin-like growth factor 2) hemmt. Darüber hinaus wird vermutet, dass H19 eine RNA
38
EINLEITUNG
kodiert, welche als primärer Vorläufer einer microRNA fungiert, die spezifische mRNAMoleküle während der Entwicklung von Wirbeltieren herunterreguliert. In Eizellen liegt der
Promotor von H19 unmethyliert vor, während er in Spermien methyliert ist [59, 322, 323].
SNRPN (small nuclear ribonucleoprotein N) kodiert einen Spleiß-Faktor und wird durch eine
differentiell methylierte Region (DMR) reguliert. Diese DMR ist in Eizellen methyliert und
wird im Falle einer abnormalen Methylierung mit dem Prader-Willi- und dem AngelmanSyndrom in Verbindung gebracht [324].
Die molekulare Funktion des Gens ZAR1 (zygote arrest 1) ist im Detail ebenfalls nicht
bekannt. Studien mit Knockout-Mäusen beobachteten jedoch eine entscheidende Rolle beim
Übergang von der Eizelle zum Embryo. Im Rind wird ZAR1 während der gesamten Phase der
Präimplantation des Embryos exprimiert. Das Transkript von ZAR1 wurde auch in den
Ovarien, den Hoden, dem Herzen und den Muskeln nachgewiesen. Das Protein dieses für die
Eizelle essentiellen Gens enthält eine evolutionär konservierte “plant-homeo Domäne“
(PHD), welche eine generelle Rolle in der Regulation der Transkription vermuten lässt [325327].
Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4) ist eines der validesten Marker-Gene für
epigenetische Reprogrammierung und Pluripotenz. Das von OCT4 kodierte Protein verfügt
über eine Pit-Oct-Unc (POU) Domäne, welche an ein Oktamer-Motiv als Erkennungssequenz
innerhalb von Promotor- oder Enhancer-Regionen bindet und die Transkription der Zielgene
reguliert. In pluripotenten Zellen wie embryonalen Stammzellen, embryonalen Krebszellen
und Eizellen liegt Oct4 unmethyliert vor und wird exprimiert. Die Struktur, Sequenz und
Lokalisation des Gens sowie die regulatorischen Regionen und Expressionsmuster sind
zwischen den orthologen Genen der Maus, des Menschen sowie des Rinds hoch konserviert
[328-330].
DNA-Methyltransferasen (DNMTs), wie DNMT1B, DNMT3A und DNMT3L, sind essentielle
Enzyme zur Etablierung und Aufrechterhaltung der korrekten DNA-Methylierungsmuster an
geprägten und nicht-geprägten DNA-Regionen während der Entwicklung. Dabei erfolgt durch
DNMT3A
in
Kombination
mit
DNMT3L
die
Etablierung
der
initialen
CpG-
Methylierungsmuster (de novo-Methylierung) während der Gametogenese. DNMT1B
hingegen ist vorrangig an der Aufrechterhaltung der Muster während der ChromosomenReplikation und –Reparatur beteiligt. DNMT3L hat im Komplex mit DNMT3A keine
39
EINLEITUNG
katalytische Aktivität und dient vielmehr als ein navigierendes Coenzym, indem es an
spezifische Histonmodifikationen bindet und DNMT3A rekrutiert. Studien in Mäusen zeigten,
dass DNMT3L durch drei unterschiedliche Keimzelllinien-spezifische Promotoren reguliert
wird und verschiedene Transkripte in Stammzellen (DNMT3Ls), Eizellen (DNMT3Lo) und
Hoden (DNMT3Lat) exprimiert. Dabei wird das Transkript von DNMT3Lat nicht translatiert,
wohingegen DNMT3Ls und DNMT3Lo Proteine produzieren, die durch DNA-Methylierung
reguliert werden [331-333].
40
Genset 1
EINLEITUNG
230 bp
18 CpGs
bZAR1
211 bp
16 CpGs
bDNMT3A
270 bp
8 CpGs
bDNMT3Ls
52 bp
7 CpGs
Genset
1 und 2
bOCT4
276 bp
30 CpGs
bSNRPN
bDNMT3Lo
bTERF2
Genset 2
230 bp
20 CpGs
bH19
bREC8
bBCL-XL
56 bp
5 CpGs
35 bp
7 CpGs
46 bp
5 CpGs
48 bp
8 CpGs
51 bp
6 CpGs
bPISD
bBUB1
38 bp
6 CpGs
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Promotorregionen des Gensets 1 und Gensets 2. Die untersuchten Promotorregionen von bZAR1, bDNMT3A, bDNMT3Ls, bOCT4, bH19, bSNRPN,
bDNMT3Lo, bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 sind als Lollipop-Diagramme dargestellt. Dabei respräsentiert eine schwarze Linie die untersuchte DNA-Region mit den darin enthaltenen
CpG-Dinukleotiden als sog. Lollipops. Die Länge der schwarzen Linien und die Distanzen zwischen den Lollipops entsprechen den relativen Längen bzw. Abständen im Genom. bH19, bSNRPN und
bDNMT3Lo sind in beiden Gensets (Genset 1 und Genset 2) enthalten. bZAR1, bDNMT3A, bDNMT3Ls, bH19, bSNRPN wurden mittels Sanger-Sequenzierung sequenziert. bOCT4, bDNMT3Lo,
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 wurden mittels Pyrosequenzierung untersucht. Die Größe der untersuchten DNA-Region ist in Basenpaaren (bp) angegeben.
41
EINLEITUNG
1.7.2 Genset 2: Oozyten- sowie Alters-spezifische Gene
Die in Genset 2 zusammengestellten DNA-Regionen wurden in unreifen in vivo gewonnen
Eizellen von Rindern unterschiedlichen Alters untersucht. Ziel dieser Analyse war es,
Veränderungen der DNA-Methylierung der Eizelle zu identifizieren, die durch Alterungsbedingte Effekte der Spendertiere verursacht wurden. Zur Untersuchung wurden daher
insbesondere Gene ausgewählt, die im Zusammenhang mit Alterungs-bedingten
Veränderungen stehen. Die mit Genset 2 analysierten Promotorregionen umfassen die Gene
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, sowie die bereits in Abschnitt 1.7.1 beschriebenen
Gene bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN (Abbildung 6).
Terf2 (telomeric repeat binding factor 2) gehört zur Gruppe der Telomer-assoziierten
Proteine des Shelterin-Komplexes, welche die Stabilität und Länge der Telomere regulieren
[334]. Die Funktion des Proteins besteht darin, die Bildung des sogenannten T-Loops zu
vermitteln und die Chromosomen vor einer Kopf-Kopf-Fusion zu schützen [335, 336].
Darüber hinaus ist Terf2 auch an DNA-Reparatur-Mechanismen beteiligt [337]. Die
Expression eines dominant-negativen Allels von Terf2 führt zum Verlust des G-Überhangs,
genomischer Instabilität, Kopf-Kopf-Fusion der Chromosomen und zur Aktivierung von
Faktoren der DNA-Schadensantwort [338]. Studien im Rind konnten eine dynamische mRNAExpression für verschiedene Entwicklungsstadien von der Eizelle im Germinalvesikel-Stadium
bis hin zum Blastozysten-Stadium nachweisen [339]. Im Ovar von Mäusen führt
Methylisocyanat, ein Reagenz, das Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies verursacht, zu
einem Verlust der Expression von Terf2 und einer vorzeitigen Seneszenz der Epithelzellen
[340]. Ein Hinweis auf eine mögliche epigenetische Regulation dieses Gens ist die
Hypomethylierung einer CpG-Insel im Promotorbereich bei gleichzeitiger Hochregulierung
der Transkription in humanen Magenkarzinomen. In diesem Gewebe korreliert die Abnahme
der Transkription ebenfalls stark mit einer Hypermethylierung des Gen-Promotors [341].
Die Ursachen maternaler, altersbedingter Aneuploidie beruhen insbesondere auf Störungen
der Rekombination, Defekte des Spindelapparat-Kontrollpunkts (spindle assembly checkpoint
(SAC)) und vorzeitiger Verlust der Schwesterchromatid-Kohäsion [342, 343]. Während der
Anordnung der Chromosomen in der Äquatorialebene (Metaphase) erkennt der SAC
einzelne nicht verbundene Kinetochore und hemmt den Anaphase-fördernden Komplex
(anaphase promoting complex, APC) bzw. das Zyklosom (C) und den Übergang zur Anaphase.
42
EINLEITUNG
Dadurch
wird
eine
Fehlsegregation
der
Chromosomen
verhindert
bevor
die
Schwesterchromatiden korrekt mit dem Spindelapparat verbunden sind. Das Kandidatengen
BUB1 (budding uninhibited by benzimidazole 1) nimmt innerhalb dieses KontrollpunktSystems die molekulare Rolle einer Kinase ein und phosphoryliert den APC/C-Aktivator
Cdc20 [344]. Maus-Studien zeigten, dass ein Abbau von BUB1 durch Mikroinjektion eines
spezifischen Antikörpers (anti-BUB1) in Eizellen von Mäusen zu einer vorzeitigen Anaphase
und einer erhöhten abnormalen Anordnung und Segregation von Chromosomen führt [345].
Es konnte ebenfalls in Mäusen nachgewiesen werden, dass Heterozygotie für ein verkürztes
BUB1-Protein bei weiblichen Tieren zu einer altersabhängigen Verstärkung der Aneuploidie
in Keimzellen führt, welche über die Zygote vererbt wird und das Überleben der Embryonen
beeinträchtigt [346]. Die vollständige Deletion von BUB1 in Maus-Keimzellen führt zur
Sterilität [347]. Das Kandidatengen REC8 ist ebenfalls in der Segregation von Chromosomen
involviert und stellt die meiosespezifische Untereinheit des Cohesin-Komplexes dar. Es ist
bekannt, dass Eizellen von Frauen im Alter von 40 Jahren und älter geringere
Konzentrationen von Rec8 aufweisen als Oozyten von Frauen im Alter von 20 Jahren [348].
Ein ähnliches Ergebnis lieferte ein Vergleich von Eizellen aus jungen und alten Tieren bei
Mäusen [349]. Die molekulare Verbindung zwischen Rec8 und Bub1 ist das Protein
Shugoshin, welches durch BUB1 reguliert wird und Rec8 vor einer Spaltung durch die
Separase schützt [350-352].
Bcl-XL gehört zur Gruppe der Apoptose-regulierenden Proteine der Bcl-2 Familie, benannt
nach dem B-Zell Lymphom 2. Durch die Bindung pro-apoptotischer Proteine wie Bad, Bid
und
Bim
erfüllt
Bcl-XL
eine
anti-apoptotische
Funktion
in
der
äußeren
Mitochondrienmembran [353, 354]. Bcl-XL wird in humanen, unreifen Eizellen exprimiert
und dient dort als eines der wichtigsten anti-apoptotischen Proteine [355].
Die
Phosphatidylserin
Membranphospholipids
Decarboxylase
(PISD)
Phosphatidylethanolamin
katalysiert
durch
die
die
Bildung
Decarboxylierung
des
von
Phosphatidylserin. PISD ist auf der äußeren Oberfläche der inneren Mitochondrienmembran
aktiv und nimmt eine zentrale Rolle im Phospholipid-Stoffwechsel ein. Die Inaktivierung von
PISD in Mäusen ist letal und führt zwischen Tag 8 und Tag 10 der embryonalen Entwicklung
zum Absterben der Frühstadien mit abnormal geformten Mitochondrien in den betroffenen
43
EINLEITUNG
Embryonen [356]. Verringerte mRNA-Konzentrationen des Gens wurden in Eizellen von
älteren Frauen nachgewiesen [357].
1.8 Kontaminationskontrolle
Molekularbiologische Untersuchungen von Keimzellen bergen stets das Risiko einer
Kontamination durch somatische Zellen. Um zu gewährleisten, dass die generierten Daten
ausschließlich von Keimzellen stammen, stellt der Einsatz einer geeigneten und verlässlichen
Kontrolle zum Ausschluss somatischer Kontamination eine der größten Herausforderungen
bei der molekularbiologischen Arbeit mit Keimzellen dar. Sowohl Genset 1 als auch Genset 2
enthielten die beiden geprägten Gene H19 und SNRPN sowie das entwicklungsrelevante,
nicht-geprägte Gen DNMT3Lo. Zusätzlich dazu umfasste Genset 1 mit Oct4 ein weiteres
nicht-geprägtes und für die Entwicklung entscheidendes Gen. H19 ist paternal geprägt und in
der Eizelle unmethyliert, wohingegen SNRPN maternal geprägt ist und damit methyliert in
der Oozyte vorliegt. Im Unterschied zur Eizelle besteht das Methylierungsmuster
somatischer Zellen aus dem maternalen und dem paternalen Allel und zeigt eine Mischung
aus methylierten und unmethylierten Molekülen für beide Gene. DNMT3Lo stellt den Eizellspezifischen Promotor des Gens DNMT3L dar. Sowohl DNMT3Lo als auch der PluripotenzMarker Oct4 liegen in der Eizelle unmethyliert vor und sind vollständig methyliert in
somatischen Zellen. Die unterschiedlichen Methylierungszustände in der Eizelle und in
somatischen Zellen machen alle 4 Genregionen zu geeigneten Kontrollgenen, um somatische
Kontaminationen zu erkennen. Gleichzeitig können somatische Methylierungsmuster jedoch
ebenfalls durch abnormal methylierte Allele (Epimutationen) der Eizelle verursacht werden.
Zur Abgrenzung einer somatischen Kontamination von einer Epimutation wurde eine
somatische Kontamination definiert als das Auftreten von mindestens einem abnormal
methylierten Allel (>50% abnormal methylierte CpGs) in mindestens 2 dieser 3 (Genset 2)
bzw. 4 (Genset 1) Promotorregionen innerhalb des gleichen Eizell-Pools.
44
MATERIAL UND METHODEN
2
Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Biologisches Material
Die untersuchten Eizellen und Embryonen stammen von Holstein-Rindern und wurden von
Mitarbeitern des Instituts für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Instituts (FLI) in
Mariensee/Hannover präpariert und bereitgestellt.
2.1.1.1 Unreife Eizellen aus Schlachttieren
Die unreifen Eizellen, die nach unterschiedlichen Follikelgrößen gruppiert und für die in vitro
Reifung (IVM), in vitro Fertilisation (IVF) sowie in vitro Kultivierung verwendet wurden,
stammten aus Schlachttieren. Die Isolation und Präparation wurde nach etablierten
Protokollen im FLI durchgeführt [358, 359]. Dazu wurden die Rinderovarien für den
Transport vom Schlachthof zum Labor in 0.9%iger NaCl-Lösung mit 6 µg/ml Penicillin und 50
µg/ml Streptomycin aufbewahrt und anschließend mit frischer Lösung gleicher
Zusammensetzung dreimal gewaschen. Die Gewinnung der unreifen Oozyten mitsamt den
sie umgebenden Kumuluszellen (COCs) erfolgte durch behutsames Schneiden („Slicen“) der
Ovarien in Dulbecco´s 1 x PBS - Medium (Sigma-Aldrich, München) versetzt mit 0,33 mM
Natriumpyruvat (Sigma-Aldrich), 5,56 mM D-Glukose (Roth, Karlsruhe), 0,9 mM
Kalziumchloriddihydrat (Fluka, Buchs, Schweiz), 50 µg/ml Streptomycinsulfat (AppliChem,
Darmstadt), 6 µg/ml Penicillin G (AppliChem), 4 IU/l Heparin und 1 mg/ml BSA (Fraktion V)
(Sigma-Aldrich). Die Auswahl der COCs für die nachfolgenden Analysen erfolgte unter einem
Stereomikroskop bei 50 x Vergrößerung in TCM-air pH 7,2 bestehend aus TCM199 (SigmaAldrich), 50 µg/ml Gentamycinsulfat (Sigma-Aldrich), 0,2 mM Natriumpyruvat, 4,2 mM
Natriumhydrogencarbonat (Roth) und 1 mg/ml BSA-FAF (Sigma-Aldrich). Um ein homogenes
und gutes Entwicklungspotential der Oozyten zu gewährleisten, wurden nur COCs mit einem
homogenen, gleichmäßig granulierten Zytoplasma und mindestens 3 Schichten kompakt
umgebender Kumuluszellen ausgewählt (Klasse I-II nach [360, 361]). Zum Entfernen der
Kumuluszellen wurden die COCs für 5 min bei 39 °C in 1 x PBS mit 1 mg/ml BSA (Fraktion V)
und 0,1% Hyaluronidase (aus Rinderhoden; Sigma-Aldrich) inkubiert und anschließend für
5 min bei 1.400 rpm gevortext. Verbliebene, anhaftende Kumuluszellen wurden behutsam
mit einer Pipette entfernt. Die isolierten, unreifen Oozyten wurden abschließend dreimal in
45
MATERIAL UND METHODEN
PBS mit 0.1 % Polyvinylalkohol (PVA) gewaschen und in Gruppen von 5-10 Eizellen für die
Analyse der DNA-Methylierung bei -80 °C aufbewahrt.
2.1.1.2 Unreife Eizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters
Die unreifen Eizellen aus Rindern unterschiedlichen Alters wurden durch eine
ultraschallgesteuerte transvaginale Follikelpunktion („ovum pick up“, OPU) gewonnen. Die
Kohorten der Spendertiere bestanden dabei aus 13 präpubertären Kühen (9-12 Monate alt),
8 erwachsenen weiblichen Rindern (3-7 Jahre alt) und 5 alten Kühen (>8-11 Jahre alt). Die
OPU wurde zweimal pro Woche in einem Zeitintervall von 3 bis 4 Tagen durchgeführt. Vor
der experimentellen Durchführung wurden die Tiere einer sorgfältigen Voruntersuchung
unterzogen, um den allgemeinen Gesundheitszustand sowie den Entwicklungsstand und die
allgemeine Konstitution der Reproduktionsorgane zu beurteilen.
Die ultraschallgesteuerte transvaginale Follikelpunktion wurde mit wenigen Modifikationen
nach etablierten Protokollen durchgeführt [323, 362-364]. Die Tiere wurden zunächst in
einen
Zwangsstand
geführt
und
fixiert.
Anschließend
wurden
die
äußeren
Geschlechtsorgane gereinigt und desinfiziert. Zur Visualisierung der Ovarien wurde ein Aloka
Echtzeit B-Mode Ultraschallsystem (Aloka SSD-4000, Hitachi Aloka Medical Ltd., Tokyo,
Japan) und eine 7,5 MHz Konvexsonde (Hitachi Aloka Medical Ltd., Tokyo, Japan) verwendet.
Die Sonde wurde in einen aus POM (Polyoxymethylen) bestehenden und in Mariensee
entwickelten Sondenträger eingebettet. Sondenträger und Sonde wurden mit einer EinmalSchutzfolie (32 mm x 190 mm, Servoprax® GmbH, Wesel) und Gleitgel (Bovivet Gel, Kruuse,
Langeskov, Dänemark) versehen und in die Vagina eingeführt. Sichtbare Follikel mit einem
Durchmesser von ≥ 3 mm wurden mit einer Einwegnadel 20G x 2¾” (0,9 x 70 mm, Terumo,
Eschborn) punktiert, welche mit einem flexiblen Schlauchsystem (1,5 mm x 0,5 mm x 1,5 m,
PTFE, BOLA, Grünsfeld) und einem sterilen 50 ml Zentrifugenröhrchen (Corning®, New York,
USA) verbunden war. An dem konischen 50 ml Zentrifugenröhrchen wurde eine
Vakuumpumpe (Aspirator 3, Labotect GmbH, Göttingen) angebracht und ein negativer Druck
von 60 mmHg (20 ml/min) angelegt. Nach der Punktion von 4-5 Follikeln wurden die
Punktionsnadel und das Schlauchsystem mit Dulbecco´s 1 x PBS - Medium (AppliChem,
Darmstadt) versetzt mit 2,2 IU/ml Heparin (AppliChem) und 1% hitzeinaktiviertem, fetalem
Kälberserum (PPA Laboratories, Coelbe) gespült. Nach der OPU wurden die COCs jedes
Spendertieres einzeln filtriert, gewaschen und während der Identifikation in Dulbecco´s 1 x
46
MATERIAL UND METHODEN
PBS - Medium
(AppliChem, Darmstadt) klassifiziert. Ausschließlich COCs mit einem
homogenen, gleichmäßig granulierten Zytoplasma und kompakt umgebenden Kumuluszellen
wurden für die weitere Analyse verwendet. Die Kumuluszellen wurden entfernt, indem die
COCs für 5 min bei 39 °C in 1 x PBS mit 1 mg/ml BSA (Fraktion V) und 0,1% Hyaluronidase
(aus Rinderhoden; Sigma-Aldrich) inkubiert wurden und anschließend für 5 min bei
1.400 rpm gevortext wurden. Verbliebene, anhaftende Kumuluszellen wurden behutsam mit
einer Pipette entfernt. Die isolierten, unreifen Oozyten wurden abschließend in Gruppen von
5-10 Eizellen für die Analyse der DNA-Methylierung bei -80 °C aufbewahrt.
2.1.1.3 In vitro gereifte Eizellen
Für die in vitro Reifung wurden unreife Eizellen mit anhaftenden Kumuluszellen verwendet,
den sogenannten Kumulus-Eizell-Komplexen (COCs). Diese wurden wie in 2.1.1.1
beschrieben aus Ovarien von Schlachttieren gewonnen. Die Reifung der Eizellen erfolge
somit vor dem Entfernen der Kumuluszellen. Dazu wurden die COCs in Gruppen von 15 in
einem Tropfen von 100 μl TCM199 pH 7,4, versetzt mit 0,2 mM Natriumpyruvat , 25 mM
Natriumhydrogencarbonat, 1 mg/ml BSA-FAF, 10 IU/ml equinem Choriongonadotropin
(PMSG)
und
5 IU/ml
humanem
Choriongonadotropin
(Suigonan®,
Intervet,
Unterschleißheim) in einem Inkubator bei 39 °C, 5% CO2-Gehalt und gesättigter
Luftfeuchtigkeit für 24h (Standard Protokoll) oder 48h (simulierte post-ovulatorische
Alterung) gereift. Nach Abschluss der Maturation wurden die Kumuluszellen wie in 2.1.1.1
beschrieben mittels Hyaluronidasebehandlung entfernt und vereinzelt verbliebene
Kumuluszellen mit einer Pipette beseitigt. Eine erfolgreiche Reifung wurde durch den
Ausschluss des ersten Polkörpers bestimmt. Die gereiften Oozyten wurden ebenfalls
abschließend dreimal in PBS mit 0.1 % Polyvinylalkohol (PVA) gewaschen und in Gruppen
von 5-10 Eizellen für die Analyse der DNA-Methylierung bei -80 °C aufbewahrt.
2.1.1.4 Rinderembryonen
Rinderembryonen wurden aus Eizellen bzw. COCs generiert, die wie in 2.1.1.3 beschrieben
einer in vitro Reifung unterzogen wurden und anschließend in vitro fertilisiert und in vitro
kultiviert wurden. Sowohl die in vitro Fertilisation (IVF) als auch die in vitro Kultivierung
wurden mit geringfügigen Modifikationen nach bereits etablierten Protokollen durchgeführt
[358, 359]. Für die Befruchtung wurde aufgetautes Tiefgefriersperma mit einer
Konzentration von 1x106 Spermien/ml eines Bullen mit nachgewiesenem IVF-Erfolg
47
MATERIAL UND METHODEN
verwendet. Das Sperma wurde zunächst bei 30 °C für 1 min aufgetaut und mittels
BoviPureTM (Labotect) dem Standard-Protokoll entsprechend aufgereinigt. Die SpermienPellets wurden zwischen den Zentrifugationsschritten mit Fert.-TALP gewaschen [365, 366].
Nach dem letzten Zentrifugationsschritt wurden die Spermien-Pellets in 50 μl Fert.-TALP
versetzt mit HHE (10 µM Hypotaurin (Sigma-Aldrich), 0,1 IU/ml Heparin (Serva), 1µM
Epinephrin (Sigma-Aldrich) und 6 mg/ml BSA (Fraktion V)) resuspendiert. Zur Vorbereitung
der IVF wurden die gereiften COCs zweimal mit 100 μl Fert.-TALP gewaschen und zur
Befruchtung in Gruppen von 15 in 100 μl Fert.-TALP/HHE mit den resuspendierten Spermien
bei 5 % CO2 und 39 °C für 19 h koinkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kumuluszellen
mechanisch durch vortexen bei 1.400 rpm für 5 min und anschließendes behutsames
pipettieren entfernt.
Die anhand eines exkludierten Polkörpers als befruchtet kategorisierten Eizellen wurden
zweimal mit SOFaa-Kulturmedium versetzt mit 4 mg/ml BSA-FAF [359] gewaschen und in
Gruppen von 5 Zellen in 30 μl Tropfen unter Silikonöl bei 5 % O2, 90 % N2 und 5 % CO2 in
feuchter Atmosphäre bei 39 °C kultiviert. Eine Prüfung auf Furchungsstadien erfolgte nach 3
Tagen Kultivierung.
2.1.2 Puffer
Die hergestellten Puffer umfassen den Denaturierungspuffer, den Waschpuffer und TAEPuffer. Der Denaturierungspuffer sowie der Waschpuffer wurden zur Immobilisierung und
Aufreinigung der PCR-Produkte für die Pyrosequenzierung mittels PyroMark Q96 Vacuum
Workstation verwendet. Der TAE-Puffer wurde zur Identifikation der PCR-Produkte mittels
Gelelektrophorese benötigt. Die genaue Zusammensetzung der Puffer ist in Tabelle 1
aufgeführt.
Tabelle 1: Zusammensetzung der hergestellten Puffer.
Puffer
Zusammensetzung
Denaturierungspuffer
0,2 M NaOH
TAE-Puffer (50 x)
2 M TRIS
1 M Essigsäure
0,05 M EDTA pH 8,0
48
MATERIAL UND METHODEN
Waschpuffer
10 mM TRIS
4 M Essigsäure bis pH 7,6
2.1.3 Kommerzielle Kits und Reagenzien
Alle kommerziell vertriebenen Kits sowie Reagenzien, die für diese Arbeit verwendet
wurden, sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2: Verwendete Kits und Reagenzien.
Produkt
Hersteller
Sitz
BigDye® Terminator v1.1 Cycle
Sequencing Kit
Applied Biosystems/
Technologies
CleanDTR Magnetic Beads
GCbiotech
Alphen aan den Rijn,
Niederlande
ExoSAP- IT®
Affymetrix
Santa Clara , CA/USA
EZ DNA Methylation-Direct™ Kit
Zymo Research
Freiburg
FastStart Taq DNA PolymeraseSystem
Roche Diagnostics
Mannheim
Hi - Di™ Formamide
Applied Biosystems/ Life
Darmstadt
Life
Darmstadt
Technologies
PyroGold® SQA Reagent Kit
Qiagen
Hilden
2.1.4 Geräte
Die für diese Arbeit benötigten Geräte mit der genauen Typenbezeichnung sowie dem
Hersteller sind in Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3: Verwendete Geräte.
Gerät
Typenbezeichnung
Hersteller
Elektrophoresekammer
STARLAB Horizontal Gel System
Starlab
49
MATERIAL UND METHODEN
Gel-Dokumentation
Intas Gel iX Imager
Intas-Science-Imaging
Instruments GmbH
Heizblock
Biometra Thermoblock TB2
Analytik Jena AG
Kapillarsequenzierer
Applied Biosystems 3130/3130xl
Genetic Analyzer
Applied Biosystems/
Technologies
PCR Werkbank
AirClean 600 PCR Workstation
AirClean / Starlab
Pipettier-Roboter
JANUS® Automated Workstation
PerkinElmer Inc.
Pyrosequenzierer
Pyromark Q96MD
Qiagen
Spannugsquellen
Bio-Rad PowerPac 1000
Bio-Rad
Thermocycler
DNA Engine
Cycler
Thermal
Bio-Rad
Vakuum-Station
PyroMark Q96 Vacuum Workstation
Qiagen
Tetrad®2
Life
2.2 Methoden
Das Methodenspektrum, das zur Generierung der Daten der vorliegenden Arbeit genutzt
wurde, umfasst im Wesentlichen die Natriumbisulfitbehandlung von DNA, die Limiting
Dilution, die Polymerasekettenreaktion sowie die Sequenzierung der amplifizierten DNARegionen. Eine zentrale Rolle nimmt hierbei die Limiting Dilution ein, die wie die anderen
Methoden im Folgenden detailliert beschrieben und erläutert wird.
2.2.1 Natriumbisulfitbehandlung der DNA von Eizellen und Embryonen
Die chemische Behandlung von DNA mit Natriumbisulfit ermöglicht es, die sogenannte 5.
Base, 5-Methylcytosin, nachzuweisen. Das Prinzip dieser Methode basiert auf der
Eigenschaft des Natriumbisulfits, selektiv Cytosin-Reste zu deaminieren. Die spezifische
Deaminierung von Cytosin durch Natriumbisulfit wurde erstmals 1970 von zwei Gruppen
unabhängig voneinander beobachtet [367, 368] und 1992 erstmals zur Detektion von
5-Methylcytosin in DNA genutzt [369]. Die Bisulfit-vermittelte Deaminierung des Cytosins
erfolgt in 3 Schritten (Abbildung 7) [370]. Im ersten Schritt erfolgt eine reversible Addition
von Bisulfit (HSO3-) an Cytosin (Sulfonierung). Im zweiten Schritt kommt es dann zur
50
MATERIAL UND METHODEN
Deaminierung durch eine hydrolytische Abspaltung von NH3. Der dritte Schritt führt zur
Freisetzung von Bisulfit (HSO3-), wodurch sich erneut eine 5,6-Doppelbindung ausbildet und
Uracil
entsteht
(Desulfonierung).
Der
geschwindigkeitsbestimmende
Schritt
der
Gesamtreaktion ist die Deaminierung in Schritt 2.
1. Sulfonierung
R
Cytosin
2. Deaminierung
R
Cytosin-6-Sulphonat
3. Desulfonierung
R
Uracil-6-Sulphonat
R
Uracil
R
5-Methylcytosin
Abbildung 7: Bisulfit-vermittelte Deaminierung von Cytosin. Die Bisulfit-vermittelte Deaminierung des Cytosins erfolgt in 3
Schritten bestehend aus einer Sulfonierung (1), Deaminierung (2) und einer Desulfonierung (3). Die Deaminierung von
5-Methylcytosin vermittelt durch Natriumbisulfit erfolgt in einer zweihundertfach geringeren Geschwindigkeit als bei
unmethyliertem Cytosin. Abbildung übernommen aus [370] und modifiziert.
Das resultierende Produkt Uracil-6-Sulphonat ist unter neutralen Bedingungen eine stabile
Verbindung. Im alkalischen Milieu wird die Desulfonierung von Uracil-6-Sulphonat unter
Bildung von Uracil begünstigt, wohingegen die Konvertierung von Cytosin zu Uracil-6Sulphonat optimal im sauren pH-Bereich (pH 5-6) erfolgt. Die Deaminierung von
5-Methylcytosin unter dem Einfluss von Natriumbisulfit findet ebenfalls statt, jedoch erfolgt
diese Reaktion in einer zweihundertfach geringeren Geschwindigkeit als bei unmethyliertem
Cytosin [371]. Diese Eigenschaft von Natriumbisulfit, selektiv unmethylierte Cytosine zu
deaminieren, ermöglicht es 5-Methylcytosine zu detektieren. Die Identifikation erfolgt dabei
durch eine auf die Natriumbisulfitbehandlung folgende PCR und eine anschließende
Sequenzierung des Produkts. Unmethylierte Cytosine werden durch die Bisulfitbehandlung
zu Uracil konvertiert, welches in der PCR als Thymin amplifiziert wird. 5-Methylcytosine
51
MATERIAL UND METHODEN
hingegen bleiben unverändert und treten im sequenzierten PCR-Produkt als Cytosine in
Erscheinung (Abbildung 8).
T
C
T
C
G
A
C
G
A
G
A
G
C
T
G
C
G
A
U
G
Denaturierung
Natriumbisulfitbehandlung
T
U
T
C
PCR
T
T
T
C
G
A
T
G
A
A
A
G
C
T
A
C
Abbildung 8: Konvertierung von Cytosin zu Thymin durch eine Natriumbisulfitbehandlung mit anschließender PCR. Die
unmethylierten Cytosine (C) werden durch Natriumbisulfit zu Uracil deaminiert und durch die PCR als Thymine amplifiziert.
5-Methylcytosin (C mit CH3-Gruppe) bleibt nach der Natriumbisulfitbehandlung und PCR unverändert.
Der genaue Mechanismus, durch den die Hydrolyse bzw. Deaminierung von Cytosin durch
Bisulfit katalysiert wird, ist nach wie vor nicht vollständig aufgeklärt [370, 372, 373]. Es wird
vermutet, dass die Addition von Bisulfit an Cytosin durch das Radikal erfolgt, das aus einer
Interaktion von Bisulfit und Sauerstoff generiert wird (•SO3-) [370]. Diese reaktive Spezies
würde ebenfalls den hohen Grad an DNA-Degradation erklären (84-96%), der unter
optimalen Reaktionsbedingungen mit Natriumbisulfit beobachtet wird [374, 375]. Trotz
dieser bestehenden technischen Herausforderungen, stellt die Natriumbisulfitbehandlung
bis heute die präziseste, effizienteste und am häufigsten genutzte Methode zur
Identifizierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA dar [376].
2.2.2 Limiting Dilution
Zur Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster boviner Eizellen und Embryonen wurde die
Limiting-Dilution-Methode verwendet. Bei dieser Methode wird die DNA so stark verdünnt,
dass im Reaktionsansatz zur Polymerasekettenreaktion (PCR) nur ein einzelnes DNA-Molekül
bzw. Allel als Matrize dient [377]. Im Vergleich zu genomischer DNA birgt Natriumbisulfitbehandelte DNA ein höheres Risiko, die unterschiedlich modifizierten DNA-Moleküle der
Zielregion asymmetrisch zu amplifizieren [376]. Die Natriumbisulfitbehandlung hat zur Folge,
52
MATERIAL UND METHODEN
dass methylierte Moleküle Cytosin-reicher sind, als unmethylierte Allele, welche hingegen
mehr Thymin-Basen enthalten. Dieses Gemisch von DNA-Molekülen mit unterschiedlichem
chemischem Charakter führt in der PCR dazu, dass eine oder mehrere Populationen von
Molekülen stärker amplifiziert werden als andere [378]. Da die Amplifikation exponentiell
verläuft, können geringe Ungleichgewichte in der Amplifikation unterschiedlicher DNAMatrizen zu Beginn der PCR zu einer erheblichen Verschiebung des Gemisches von DNASpezies im endgültigen PCR-Produkt führen. Die Wahrscheinlichkeit solch einer Verzerrung
nach Amplifikation Bisulfit-konvertierter DNA steigt, je weniger DNA in die PCR eingesetzt
wird. Bei der Limiting-Dilution-Methode wird dieses Risiko einer asymmetrischen
Amplifikation reduziert, indem nur ein einzelnes DNA-Molekül als Matrize in eine PCR
eingebracht wird [379]. In Verbindung mit zwei aufeinander folgenden PCRs wird es
ermöglicht, auch mehrere Regionen auf dem gleichen DNA-Molekül zu analysieren
(Abbildung 9). Dazu werden alle zu untersuchenden Regionen in einer ersten Multiplex-PCR
zunächst gleichzeitig amplifiziert. In einer zweiten, sogenannten Singleplex-PCR werden
dann die Regionen der einzelnen Gene separat vervielfältigt. Das anschließende Auftragen
der PCR-Produkte auf ein Gel liefert eine binäre Information über das Vorhandensein der
spezifischen Ziel-DNA in den jeweiligen Wells. Dabei kann entweder kein PCR-Produkt (0)
oder ein PCR-Produkt (1) vorliegen, weshalb diese Methode auch als digitale PCR
bezeichnet wird [380]. Die Kombination aus Natriumbisulfitbehandlung, Limiting Dilution,
Multiplex-PCR, Singleplex-PCR und einer finalen Sequenzierung der generierten Amplifikate
wird als Limiting Dilution Bisulfite Sequencing (LD) bezeichnet [377]. Die LD eignet sich
insbesondere zur Untersuchung von Einzelzellen bzw. Proben mit geringer Zellzahl. Der
geringe DNA-Gehalt der Proben ermöglicht es die Verdünnung technisch umzusetzen und
gleichzeitig ein repräsentatives Bild der DNA-Methylierungsmuster in der Auflösung
einzelner Moleküle und damit einzelner Allele zu liefern.
53
MATERIAL UND METHODEN
Eizellen /
Embryonen
Bisulfitbehandlung
Verdünnung
Multiplex-PCR
Singleplex-PCR
H19
SNRPN
DNMT3A
TERF2
Sequenzierung
Abbildung 9: Schematischer Ablauf der Limiting-Dilution-Methode (LD). Pools von 5-10 Oozyten und vereinzelte
Embryonen im 4- bis 8-Zell-Stadium wurden im ersten Schritt einer Bisulfitbehandlung unterzogen und anschließend bei der
Präparierung des PCR-Ansatzes limitierend verdünnt. Der PCR-Ansatz eines Eizellpools bzw. eines Embryos wurde dann auf
20 Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 4 Negativkontrollen verteilt. In einer ersten Multiplex-PCR wurden zunächst alle
zu untersuchenden Regionen gleichzeitig amplifiziert. Eine darauffolgende zweite Singleplex-PCR vervielfältigte dann die
Regionen der einzelnen Gene separat. Nach der Identifizierung der generierten PCR-Produkte mittels Gelelektrophorese
erfolgte im letzten Schritt die Sequenzierung mittels Pyrosequenzierung oder direkter Sangersequenzierung. Abbildung
übernommen aus [377] und modifiziert.
Die LD wurde an Pools von 5-10 Oozyten und vereinzelten Embryonen im 4- bis 8-ZellStadium
durchgeführt.
Dazu
wurde
das
biologische
Material
zunächst
einer
Natriumbisulfitbehandlung mittels EZ DNA Methylation Direct Kit (Zymo Research, USA)
entsprechend dem Herstellerprotokoll unterzogen. Die konvertierte DNA wurde mit 14 μl
Elutionspuffer in ein 1,5 ml LoBind tube (Eppendorf, Hamburg) eluiert. Das LoBind tube
verfügt über eine spezielle Beschichtung der Innenfläche, die die Adhäsion zwischen Probe
54
MATERIAL UND METHODEN
und Reaktionsgefäß reduziert. Da bei der LD mit sehr geringen DNA-Mengen gearbeitet wird
soll die Verwendung des LoBind tubes den Verlust einzelner DNA-Moleküle durch das
Anhaften an der Innenfläche des Reaktionsgefäßes minimieren bzw. vermeiden. Zu der
eluierten konvertierten DNA wurden 486 μl des zuvor vorbereiteten Multiplex-PCRMastermix gegeben (Zusammensetzung und PCR-Bedingungen unter 2.2.3). Um eine
gleichmäßige Verteilung der DNA-Moleküle in der Lösung zu gewährleisten, wurde das
Gemisch durch intensives Auf- und Abpipettieren durchmischt. Dieser DNA-Multiplex-PCRAnsatz wurde anschließend in Volumina von 25 μl in 20 Wells einer 96-Well-Mikrotiterplatte
verteilt. Sowohl zur Durchmischung als auch zur Verteilung der Lösung wurde die gleiche
Pipettenspitze verwendet um den Verlust von DNA durch Adhäsion an der Innenfläche der
Pipettenspitze zu reduzieren. Die Anzahl der Verdünnungsschritte wurde empirisch
ermittelt. Die untersuchten Eizellen enthielten sowohl die Zona Pellucida als auch den
Polarkörper. Damit ergibt sich eine maximal mögliche Anzahl von 4 amplifizierbaren Allelen
für jedes Gen, die in einer Oozyte vorliegen. Bei einem Pool von 10 Eizellen würde man
damit eine maximale Anzahl von 40 Allelen erwarten. Der hohe Grad an DNA-Degradation
während der Natriumbisulfitbehandlung führt jedoch dazu, dass die Anzahl der
analysierbaren Allele erfahrungsgemäß geringer als die Hälfte der eingesetzten Menge
beträgt. Mit 1:20 verdünnter DNA und 4 Negativkontrollen je Oozyten-Pool bzw. Embryo
konnten genau maximal 4 verschiedene Eizellpools auf eine 96-Well-Mikrotiterplatte
aufgebracht werden (Abbildung 9). 1 μl des PCR-Produkts der Multiplex-PCR wurde als
Matrize der nachfolgenden Gen-spezifischen Singleplex-PCR verwendet, in der alle zu
untersuchenden DNA-Regionen separat vervielfältigt werden (Zusammensetzung und PCRBedingungen unter 2.2.3). Da bei der LD limitierend geringe DNA-Mengen eingesetzt
werden, enthalten nicht alle Verdünnungen bzw. Wells DNA. Zur Identifikation der Wells, die
ein Amplifikat vorweisen, wurden alle Verdünnungen und Negativkontrollen in einem 1,5 %
Agarosegel mittels Gelelektrophorese analysiert. Im letzten Schritt werden die generierten
Amplifikate aus den entsprechenden Wells isoliert und sequenziert. Die in dieser Arbeit
angewandten Sequenzierungsmethoden umfassen die Pyrosequenzierung sowie die direkte
Sangersequenzierung, die unter 2.2.4 detailliert beschrieben sind.
2.2.3 Primersequenzen und PCR-Bedingungen
Alle Polymerasekettenreaktionen wurden mit dem FastStartTaq Polymerase-System (Roche,
Mannheim) in Kombination mit Primern für Bisulfit-konvertierte DNA durchgeführt. Die
55
MATERIAL UND METHODEN
Primer wurden mit Hilfe der Pyrosequencing Assay Design Software (Qiagen, Hilden) erstellt
und von der metabion GmbH (Planegg) synthetisiert. Das Standard-Protokoll des
FastStartTaq Polymerase-Systems besteht aus der Anfangsdenaturierung, Denaturierung,
Primer-Anlagerung (Annealing), Elongation und Abschlusselongation sowie einer Anzahl von
Zyklen, in denen sich Denaturierung, Annealing und Elongation wiederholen. Die PCRBedingungen der verschiedenen Gene bzw. Regionen unterscheiden sich dabei lediglich in
der Annealing-Temperatur und der Zyklenzahl, welche maßgeblich vom eingesetzten PrimerPaar
bestimmt
werden.
Mit
beiden
Gensets
wurden
Promotorregionen
entwicklungsrelevanter Gene untersucht. Dabei waren die Gene H19, SNRPN und DNMT3Lo
in beiden Gensets enthalten, da sie u.a. als Kontrollgene zum Nachweis somatischer
Kontamination dienten (siehe 1.8).
2.2.3.1 Genset 1: Oozyten- und Maturations-spezifische Gene
Mit dem Genset 1 wurden unreife Eizellen und unterschiedlich lange in vitro gereifte Eizellen
sowie die daraus generierten Embryonen untersucht. Das Genset 1 beinhaltet die
Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und
bDNMT3Ls. Die dafür verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle 4 aufgelistet. Die
detaillierte Zusammensetzung der Mastermixe der Multiplex-PCR sowie der Singleplex-PCRs
ist in Tabelle 5 aufgeführt. Die entsprechenden PCR-Bedingungen sind in Tabelle 6
beschrieben.
Tabelle 4: Primer des Gensets 1, die in der Multiplex-PCR, Singleplex-PCR und Pyrosequenzierung für die
Promotorregionen der Gene, bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bDNMT3Ls, bDNMT3Lo und bOCT4 in Rindereizellen und
Rinderembryonen verwendet wurden. Die Sequenzierung der Regionen von bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A und
bDNMT3Ls erfolgte durch Sangersequencierung. Die PCR-Produkte von bDNMT3Lo und bOCT4 wurden durch
Pyrosequenzierung analysiert. Der “inner forward” Primer von bOCT4 sowie der “inner reverse” Primer von bDNMT3Lo
wurden am 5‘-Ende biotinyliert (Bio-). *Ensembl release 82 - September 2015.
Gen
Primer
Sequenz (5’-3’)
bH19
Outer forward
GAGGGGTATTGAGAGGTTGT
Outer reverse
CAAACATAAAAATCCCTCAATATCCC
Inner forward
AGAGGTTGTGGGTGTGGAGATA
Inner reverse
TCCTCTCCCACCTTCAACAA
Outer forward
GGGGTGGGGTAGATATTATTTT
Outer reverse
AAAAAAAAAAAATATTACCCACCACAC
Inner forward
GGTTTTTTTGTTTGAGAGAG
Amplikonlänge (bp)
279
Chromosomale
Lokalisation*
Anzahl
der CpGStellen
29:5014781650148095
20
bSNRPN
230
29:5014782750148057
299
21:25818-26117
30
276
21:25818-26094
56
MATERIAL UND METHODEN
bZAR1
Inner reverse
AAAAAAAAAAAATATTACCCAC
Outer forward
ATTTGGGGTAAGTTTATTTTTAGATTAGT
Outer reverse
CCCCAAAACAACCATCAATA
Inner forward
GGGTGTGGAATATTTTTATATTAAGGT
Inner reverse
AAAACAACCATCAATATACCCCTAC
Outer forward
GGGTATTTAATTTTATTTGGATATTT
Outer reverse
CAAAACCCACTACACTCT
Inner forward
TTTTAAGGGAGGTTTAATTAATAGAGGT
Inner reverse
AACCCACTACACTCTACCT
Outer forward
TAGGGGGGTTTTTGAGAA
Outer reverse
CAACAAAAACACCCCACA
Inner forward
AGGGGGGTTTTTGAGAAGAAGA
Inner reverse
TCCACCCAAAACCCAATAACACTAA
Outer forward
GTTTAAGTTTAGGGGATGG
Outer reverse
CCTCCTTCTCCTTCAAAC
Inner forward
TAAGTTTAGGGGATGGATATAG
Inner reverse
Bio-TCCAAACCCCACTTCCTA
Pyro
GGGATGGATATAGTTGTTT
Outer forward
GGGAGGTTTTTGGAAGTTTAT
Outer reverse
TTCCCCCCACCCATCCAA
Inner forward
Bio-GGGAGGTTTTTGGAAGTTTAT
Inner reverse
AAATACCTTCCTTCCCCATA
Pyro
CCTTCCTTCCCCATAA
323
6:6882047868820801
18
bDNMT3A
230
6:6882056768820797
262
11:7396316073963422
16
bDNMT3Ls
211
11:7396320873963419
304
1:145717979145718283
8
bDNMT3Lo
bOCT4
270
1:145717980145718250
158
1:145750153145750311
88
1:145750156-
5
145750244
262
23:2776975627770018
143
7:51481766-
7
51481909
Tabelle 5: Zusammensetzung der Multiplex-PCR und Singleplex-PCR des Genset 1.
Konzentration
der
Stammlösung
MultiplexPCR
SingleplexPCR
(52x)
(51x)
Puffer
10x
130 μl
127,5 μl
1x
dNTPs
10 mM
26 μl
25,5 μl
200 μM
Primer Fwd
10 μM
52 μl (7x)
51 μl
0,4 μM
Komponente
Endkonzentration
57
MATERIAL UND METHODEN
Primer Rev
10 μM
52 μl (7x)
51 μl
0,4 μM
Taq DNA
Polymerase
5 U/μl
10,4 μl
10,2 μl
0,04 U/μl
Wasser
-
369,2 μl
958,8 μl
-
Tabelle 6: Ablauf und Bedingungen der Multiplex-PCR und der Singleplex-PCRs der untersuchten Regionen des Genset 1.
Singleplex-PCR
PCR-Schritt
Dauer
Multiplex-PCR
bH19
1. Anfangsdenaturierung
bSNRPN
bDNMT3A
bOCT4
bZAR1
bDNMT3Ls
bDNMT3Lo
64 °C
54 °C
32
32
4 min
95 °C
2. Denaturierung
30 s
95 °C
3. Annealing
30 s
4. Elongation
45 s
72 °C
7 min
72 °C
5. Abschlusselongation
Zyklenzahl (Wdh. der Schritte 2-4)
54 °C
35
65 °C
28
57 °C
31
2.2.3.2 Genset 2: Oozyten- sowie Alters-spezifische Gene
Genset 2 kam bei unreifen, in vivo gewonnen Eizellen von Rindern unterschiedlichen Alters
zur Anwendung. Die mit Genset 2 analysierten Promotorregionen beinhalten die Gene
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN. Die dafür
eingesetzten Primersequenzen sind in Tabelle 7 aufgelistet. Die genaue Zusammensetzung
der Mastermixe der Multiplex-PCR sowie der Singleplex-PCR sind in Tabelle 8 aufgeführt.
Die entsprechenden PCR-Bedingungen sind Tabelle 9 zu entnehmen.
58
MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 7: Primer des Gensets 2, die in der Multiplex-PCR, Singleplex-PCR und Pyrosequenzierung für die
Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN in Rindereizellen
verwendet wurden. Die Sequenzierung der Regionen von bH19 und bSNRPN erfolgte durch Sangersequencierung. Die PCRProdukte von bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1 und bDNMT3Lo wurden durch Pyrosequenzierung analysiert. Der
“inner forward” Primer von bDNMT3Lo und bBCL-XL sowie der “inner reverse” Primer von bTERF2, bREC8, bPISD und
bBUB1 wurden am 5‘-Ende biotinyliert (Bio-). *Ensembl release 82 - September 2015.
Gen
bTERF2
bREC8
bBCL-XL
bPISD
bBUB1
bDNMT3Lo
Primer
Sequenz (5’-3’)
Outer forward
AGTAGGTATTGYGGTTAGTATATTGG
Outer reverse
AAAACCRACCCTCACCCTACAT
Inner forward
GAGAGGGAGGTTGGGAGTTTT
Inner reverse
Bio-AAAACCRACCCTCACCCTACAT
Pyro
GGTTTTTTTTTTTTTAGAAGT
Outer forward
GTAGTTAATGGGGAATAGGGTTAAT
Outer reverse
AATCTCCTCCCCACTCATT
Inner forward
GTAGTTAATGGGGAATAGGGTTAAT
Inner reverse
Bio-AATCTCCTCCCCACTCATT
Pyro
GGGGAATAGGGTTAATT
Outer forward
AGAATGAATGGAAATGTGAATGTT
Outer reverse
AAAAAACCACATACCCCCTTC
Inner forward
Bio-AGAATGAATGGAAATGTGAATGTT
Inner reverse
ACCTCAATTTCCCTAAAAAAAC
Pyro
ACTTACAAACTCAATCAC
Outer forward
AGGTAGGTTTTTTAAATAGTTGTATTTG
Outer reverse
AAAACCTTAAACACATAACCCC
Inner forward
AGGTAGGTTTTTTAAATAGTTGTATTTG
Inner reverse
Bio-AAAACCTTAAACACATAACCCC
Pyro
GGGTAGTTATTTTAGATAT
Outer forward
GATTTATATTTATTGAAAAATATTTTT
Outer reverse
ACCCAAATAATTAACCAACTC
Inner forward
AGAGGAATTAGGGTAGTAGTA
Inner reverse
Bio-ACCCAAATAATTAACCAACTC
Pyro
ATTAGGGTAGTAGTAGTTT
Outer forward
GTTTAAGTTTAGGGGATGG
Outer reverse
CCTCCTTCTCCTTCAAAC
Inner forward
Bio-TAAGTTTAGGGGATGGATATAG
Ampliconlänge (bp)
507
Chromosomale
Lokalisation*
Anzahl
der CpGStellen
18:3664005736640564
467
18:36640057-
7
36640524
242
10:2081633420816576
242
10:20816334-
5
20816576
330
13:6181719861817528
198
13:61817330-
8
61817528
230
17:7245320372453433
230
17:72453203-
6
72453433
197
11:15591041559301
154
11:1559104-
6
1559258
158
1:145750153145750311
5
88
1:145750156145750244
59
MATERIAL UND METHODEN
bH19
bSNRPN
Inner reverse
TCCAAACCCCACTTCCTA
Pyro
GGGATGGATATAGTTGTTT
Outer forward
GAGGGGTATTGAGAGGTTGT
Outer reverse
CAAACATAAAAATCCCTCAATATCCC
Inner forward
AGAGGTTGTGGGTGTGGAGATA
Inner reverse
TCCTCTCCCACCTTCAACAA
Outer forward
GGGGTGGGGTAGATATTATTTT
Outer reverse
AAAAAAAAAAAATATTACCCACCACAC
Inner forward
GGTTTTTTTGTTTGAGAGAG
Inner reverse
AAAAAAAAAAAATATTACCCAC
279
29:5014781650148095
230
20
29:5014782750148057
299
21:25818-26117
276
21:25818-26094
30
Tabelle 8: Zusammensetzung der Multiplex-PCR und Singleplex-PCR des Genset 2.
Konzentration
der
Stammlösung
MultiplexPCR
SingleplexPCR
(52x)
(51x)
Puffer
10x
130 μl
127,5 μl
1x
dNTPs
10 mM
26 μl
25,5 μl
200 μM
Primer Fwd
10 μM
52 μl (8x)
51 μl
0,4 μM
Primer Rev
10 μM
52 μl (8x)
51 μl
0,4 μM
Taq DNA
Polymerase
5 U/μl
10,4 μl
10,2 μl
0,04 U/μl
Wasser
-
249,6 μl
958,8 μl
-
Komponente
Endkonzentration
60
MATERIAL UND METHODEN
Tabelle 9: Ablauf und Bedingungen der Multiplex-PCR und der Singleplex-PCRs der untersuchten Regionen des Genset 2.
Singleplex-PCR
PCR-Schritt
1.
Anfangs-
Dauer
MultiplexPCR
bTERF2
bREC8
bBUB1
bBCLXL
bPISD
4 min
95 °C
2.
Denaturierung
30 s
95 °C
3. Annealing
30 s
4. Elongation
45 s
72 °C
7 min
72 °C
denaturierung
5. Abschlusselongation
54 °C
Zyklenzahl
(Wdh. der Schritte 2-4)
35
66 °C
56 °C
35
35
53 °C
35
bDNMT3Lo
bH19
bSNRPN
52 °C
54 °C
65 °C
57 °C
35
32
28
31
2.2.4 Methoden zur Bisulfitsequenzierung
Die
Zielregionen
Pyrosequenzierung
der
aus
oder
Bisulfit-DNA
direkter
generierten
Amplifikate
Sanger-Sequenzierung
wurden
analysiert.
mittels
Die
Sequenzierungsmethode wurde dabei in Abhängigkeit der Dichte und Verteilung der CpGDinukleotide innerhalb der untersuchten DNA-Region gewählt. Neben den grundlegend
unterschiedlichen technischen Prinzipien unterscheiden sich beide Methoden insbesondere
in der Limitierung der Länge der zu analysierenden DNA-Fragmente. Während mit der
Pyrosequenzierung Regionen bis maximal 70 Basenpaare untersucht werden können,
ermöglicht die Sanger-Sequenzierung eine Analyse von bis zu 1000 Basenpaaren.
Dementsprechend wurden geprägte Genpromotoren mit typischerweise hoher CpG-Dichte
direkt Sanger-sequenziert, während nicht-geprägte Genpromotoren mit vereinzelten CpGs
überwiegend pyrosequenziert wurden. Mittels Pyrosequenzierung wurden die PromotorRegionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo und bOCT4
untersucht. Die Sangersequenzierung kam bei der Untersuchung der Gene bH19, bSNRPN,
bZAR1, bDNMT3A und bDNMT3Ls zur Anwendung. Im Folgenden wird die technische
Funktionsweise und Durchführung beider Methoden erläutert.
61
MATERIAL UND METHODEN
2.2.4.1 Pyrosequenzierung
Die Pyrosequenzierung ist eine Methode zur Sequenzierung von DNA-Fragmenten, die nach
dem Prinzip der Sequenzierung durch Synthese erfolgt. Durch eine Kaskade enzymatischer
Reaktionen wird dabei der Einbau eines Nukleotids in das synthetisierte DNA-Molekül in ein
Lichtsignal umgesetzt, welches von einem Detektor erfasst wird [381]. Da sich die
Pyrosequenzierung insbesondere zur Quantifizierung von Einzel-Nukleotid-Unterschieden
(Single Nucleotide Polymorphism = SNPs) eignet, lassen sich damit ebenfalls MethylierungsUnterschiede bzw. Sequenz-Unterschiede (C oder T) an CpG-Dinukleotiden Natriumbisulfitbehandelter DNA untersuchen [382].
1987 beschrieb P. Nyrén, erstmals wie die Aktivität der DNA-Polymerase in Form von
Biolumineszenz beobachtet werden kann und legte damit den Grundstein für das Prinzip der
Pyrosequenzierung [383, 384]. Nach 11 Jahren weiterer Entwicklungsarbeit wurde 1998 die
Pyrosequenzierung in ihrer heutigen Funktionsweise ebenfalls von der Gruppe um P. Nyrén
vorgestellt [381]. Die Enzym-Kaskade, die dabei vom eingebauten Nukleotid bis zum
detektierbaren Lichtsignal durchlaufen wird, beinhaltet das Klenow-Fragment der DNAPolymerase I, die ATP-Sulfurylase, die Luciferase und die Apyrase [385]. Neben diesen 4
Enzymen enthält der Sequenzierungs-Ansatz darüber hinaus Adenosinphosphosulfat (APS),
D-Luciferin
sowie
das
zu
sequenzierende
PCR-Produkt
mit
dem
spezifischen
Sequenzierungs-Primer. Die 4 Nukleotide werden einzeln nacheinander zum Ansatz
gegeben, während zeitgleich ein Sensor die emittierten Lichtsignale misst. Die
Reaktionsfolge nach Zugabe eines Nukleotids ist in Abbildung 10 dargestellt.
[DNA]n + dNTP
Polymerase
[DNA]n+1 + PPi
PPi + APS
dNTP
Apyrase
Luciferin
Sulfurylase
ATP
Oxyluciferin
Luciferase
Licht
Licht
dNDP + dNMP + Phosphat
dNTP = dATP-S, dTTP, dCTP, dGTP
Zeit
Abbildung 10: Enzymatische Reaktionsabfolge der Pyrosequenzierung. Der Reaktionsansatz der Pyrosequenzierung
enthält das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I, die ATP-Sulfurylase, die Luciferase und die Apyrase sowie den nichtenzymatischen Bastandteile Adenosinphosphosulfat (APS), D-Luciferin und das zu sequenzierende PCR-Produkt mit
angelagertem Sequenzierungs-Primer. Wird nach Zugabe einer Nukeotid-Sorte (dNTP) eine passende Base durch die
Polymerase in den wachsenden DNA-Strang ([DNA]n) eingebaut, kommt es zur Freisetzung von Pyrophosphat (PPi), das
wiederum als Substrat für die ATP-Sulfurylase dient, wodurch ATP gebildet wird. Luciferase setzt dieses ATP in Verbindung
mit D-Luciferin zu Oxyluciferin und Licht um, welches von einem Lichtsensor detektiert wird. Die Apyrase baut anschließend
62
MATERIAL UND METHODEN
Nukleotide, die nicht an der Reaktion beteiligt waren, sowie ATP ab bevor das nächste Nukleotid zum Ansatz gegeben wird
und die Reaktionskaskade erneut ablaufen kann. Abbildung übernommen aus [385] und modifiziert.
Das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I enthält die Domänen der Polymerase sowie der
3‘→5‘ Exonuklease-Aktivität. Zur Pyrosequenzierung wird ein Klenow-Fragment mit
mutierter und inaktiver 3‘→5‘ Exonuklease verwendet und eine reine Polymerase-Aktivität
aufweist. Dies ist entscheidend, um eine asynchrone DNA-Polymerisierung zu verhindern
und einzig die Synthese der zu sequenzierenden Basenfolge sicherzustellen [385]. Bei Zugabe
einer Sorte von Nukleotiden, die ein Basenpaar mit der DNA-Matrize bilden, erfolgt der
Einbau des Nukleotids in den wachsenden DNA-Strang durch das Klenow-Fragment der DNAPolymerase. Das dabei abgespaltene Pyrophosphat (PPi) dient daraufhin als Substrat für die
ATP-Sulfurylase, welche in Verbindung mit APS ATP generiert. Die finale Umsetzung des ATP
in Kombination mit Luciferin zu Oxyluciferin durch die Luciferase erzeugt Licht, das durch
einen Detektor erfasst wird. Nur der korrekte Einbau eines oder mehrerer passender
Nukleotide führt zu einem Lichtsignal, dessen Intensität proportional zur Anzahl der
eingefügten Nukleotide ist. Die übrigen, nicht eingebauten Nukleotid-Reste sowie ATP
werden durch die Apyrase verdaut, womit sich der Ansatz erneut im Ausgangszustand für
einen weiteren Reaktionsablauf mit neuen Nukleotiden befindet. Durch die wiederholte
Zugabe unterschiedlicher Nukleotide wird die Synthese des wachsenden DNA-Stranges in
Echtzeit dokumentiert bis die Synthese bzw. Sequenzierung der Zielregion vollständig
abgeschlossen ist (Abbildung 11) [385].
63
MATERIAL UND METHODEN
dATP-S
Polymerase
Template 3‘
Primer 5‘
A
dCTP
TGAA
A
PPi
A
A
5‘
A
A
Polymerase
Template 3‘
Primer 5‘
C
TGAA
AC
A
C
ATP
5‘
PPi
C
Sulfurylase
Apyrase
dGTP
C
C
Polymerase
Template 3‘
Primer 5‘
G
TGAA
AC
A
ATP
Luciferase
Luciferase
Licht
Licht
5‘
G
G
Sulfurylase
Apyrase
dTTP
G
G
Polymerase
Template 3‘
Primer 5‘
T
TGAA
ACTT
AC
Sulfurylase
Apyrase
2 PPi
T
T
5‘
T
T
Sulfurylase
2 ATP
Apyrase
Luciferase
Luciferase
Licht
Lichtintensität
ACTT
TGAA
Sequenz der
synthetisierten DNA
Sequenz der
Matrizen-DNA
Dispersions-Folge der Nukleotide
Pyrogram
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Prinzips der Pyrosequenzierung. Paart eine Base nach Zugabe eines
Nukleotids mit der DNA-Matrize, wird das Nukleotid durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I eingebaut,
Pyrophosphat wird abgespalten, was die ATP-Sulfurylase zur Bildung von ATP nutzt, wodurch die Luciferase Licht generiert.
Die Intensität des detektierten Lichtsignals ist dabei proportional zur Anzahl der eingebauten Nukleotide. Die Apyrase baut
vor der Zugabe einer Nukleotid-Sorte noch im Ansatz verbliebene Nukleotide und ATP ab und versetzt das enzymatische
System somit in den Ausgangszustand zurück. Abbildung übernommen aus [385] und modifiziert.
Voraussetzung für eine erfolgreiche Pyrosequenzierung ist das Vorliegen des zu
sequenzierenden PCR-Produkts als Einzelstrang mit angelagertem Sequenzierungs-Primer
vor der Zielregion. Durch Verwendung eines am 5‘-Ende biotinylierten Primers in der PCR ist
es möglich mittels Streptavidin-Beads einen DNA-Strang selektiv zu isolieren und mit einem
spezifischen Sequenzierung-Primer zu hybridisieren [386]. Das durchgeführte Protokoll zur
Präparation des PCR-Produkts für die Pyrosequenzierung wird im Folgenden kurz
beschrieben:
1. Zunächst wurde ein Mix aus Streptavidin Sepharose High Performance Beads (GE
Healthcare, München) (2 μl / Probe), Binding-Puffer (Qiagen, Hilden) (40 μl / Probe)
und Reinstwasser (28 μl / Probe) vorbereitet und 70 μl des Mixes in eine 96-WellMikrotiterplatte ohne Rand für jede Probe vorgelegt.
2. Nach Zugabe von 10 μl des PCR-Produkts zu dem vorgelegten Mix in der 96-WellMikrotiterplatte ohne Rand wurde die Wells der Platte mit einer selbstklebenden
64
MATERIAL UND METHODEN
Folie verschlossen und für 5 min bei 14.000 rpm geschüttelt (Stufe 5 auf
VortexGenie).
3. In die PyroMark® Q96 HS Pyrosequenzierplatte (Qiagen, Hilden) wurden für jede
Probe 11,5 μl Annealing-Puffer (Qiagen, Hilden) mit 0,5 μl des jeweiligen
Sequenzierungs-Primer entsprechend der Anordnung der Proben auf der
Mikrotiterplatte vorgelegt.
4. Nach der Inkubation des PCR-Produkts mit den Streptavidin Sepharose High
Performance Beads wurde die Mikrotiterplatte auf die Position 1 der PyroMark®
Q96 Vacuum Workstation (Qiagen, Hilden) überführt und der Kopf der Station unter
angelegtem Vakuum für 10 Sekunden in destilliertem Wasser gewaschen.
5. Der Vakuumkopf wurde anschließend auf die Mikrotiterplatte gesetzt, sodass die
Metallstifte des Kopfes in die Wells der Platte eingeführt wurden. Durch das Vakuum
wurde die Flüssigkeit in den Wells abgesaugt, während die Beads an der Membran
der Stifte haften blieben.
6. Der Kopf mit immobilisierten Streptavidin Sepharose Beads und gebundenem PCRProdukt wurde anschließend vorsichtig in ein Becken mit 70 % Ethanol überführt (10
s).
7. Diesem Waschvorgang schloss sich eine chemische Denaturierung in einer 0,2 M
NaOH-Lösung (Denaturierungspuffer, siehe Kapitel 2.1.2) (10 s) an. Dies diente dazu,
den zu sequenzierenden Strang vom komplementären Strang zu lösen und durch das
Vakuum zu entfernen.
8. Nach einem finalen Waschschritt im Waschpuffer (siehe Kapitel 2.1.2) (20 s) wurde
der Kopf vorsichtig über der Pyrosequenzierplatte mit vorgelegtem Annealing-Puffer
und Sequenzierungs-Primer positioniert. Unmittelbar vor dem Einführen der
Metallstifte in die Wells wurde das Vakuum abgeschaltet und die Beads durch sanftes
Schütteln des Kopfes im Volumen der Wells gelöst.
9. Die gereinigte Proben-DNA wurde für 2 min bei 80 °C auf einem Heizblock
denaturiert und anschließend für 5 min bei Raumtemperatur abgekühlt. In der Phase
65
MATERIAL UND METHODEN
der Abkühlung erfolgte die spezifische Anlagerung der Sequenzierungs-Primer, womit
die Präparation des PCR-Produkts für die Pyrosequenzierung abgeschlossen wurde.
Die Pyrosequenzierung wurde mit dem PyroMark® Q96 MD System (Qiagen, Hilden) und
dem PyroGold® SQA Reagent Kit (Qiagen, Hilden) durchgeführt [387]. Die Pyroassays bzw.
alle verwendeten Primer wurden mittels PyroMark® Assay Design 2.0 Software (Qiagen,
Hilden) entworfen. Die Datenauswertung erfolgte mit der Pyro Q-CpG Software (Qiagen,
Hilden). Vor Beginn der Sequenzierung wurden die einzelnen Dispensierküvetten mit dem
Enzymmix (DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luciferase und Apyrase), dem Substrat (APS
und Luciferin) und den einzelnen Nukleotiden (PyroGold® SQA Reagent Kit) befüllt. Die
benötigten Volumina der Reagenzien wurden nach Eingabe der Proben bzw. verwendeten
Assays durch die Pyro Q-CpG Software berechnet. Um Dispensierungsfehler von Beginn an
auszuschließen, wurde vor jedem Start der Pyrosequenzierung ein Dispensierungs-Test
durchgeführt. Nach der erfolgreichen Prüfung der korrekten Dispensierung aller Reagenzien
wurde die Pyrosequenzierplatte mit den zu untersuchenden Proben in das PyroMark® Q96
MD Sequenziergerät überführt und die Sequenzierung gestartet.
2.2.4.2 Direkte Bisulfitsequenzierung
Bei der direkten Bisulfitsequenzierung wird das aus Natriumbisulfit-behandelter DNA
generierte PCR-Produkt mittels Sanger-Sequenzierung analysiert. Die Sanger-Sequenzierung
wurde von Frederick Sanger 1977 entwickelt und basiert auf dem Prinzip der KettenabbruchSynthese [388]. Dabei werden einem normalen Standard-PCR-Ansatz aus DNA-Polymerase,
Sequenzierungs-Primer und normalen Desoxyribonucleosidtriphosphaten (dNTPs), zusätzlich
fluoreszenzmarkierte Didesoxyribonucleosidtriphosphate (ddNTPs) beigefügt. ddNTPs
besitzen keine 3‘-Hydroxylgruppe, die für die Verknüpfung der Nukleotide benötigt wird.
Nach Einbau eines ddNTPs ist eine weitere Verlängerung des DNA-Stranges nicht mehr
möglich, was einen Kettenabbruch zur Folge hat. Die zufällige statistische Verteilung dieser
Einbau- bzw. Abbruch-Stellen führt zu einem Gemisch aus unterschiedlich langen,
synthetisierten DNA-Fragmenten. Die fluoreszenzmarkierten Nukleotide am Ende dieser
DNA-Fragmente decken in ihrer Gesamtheit den vollständigen, zu sequenzierenden Bereich
der DNA-Matrize ab. Die Analyse dieser PCR-Produkte erfolgt in einem Sequenziergerät. Zur
Auflösung der Zielsequenz werden die Sequenzprodukte unterschiedlicher Länge
kapillarelektrophoretisch nach Größe aufgetrennt und photometrisch analysiert. Dabei regt
66
MATERIAL UND METHODEN
ein Laser die Fluoreszenzfarbstoffe an, deren emittiertes Licht von einer Kamera detektiert
wird. Aus dem resultierenden Elektropherogramm lässt sich dann die Basenfolge ablesen.
Die praktische Durchführung der direkten Bisulfitsequenzierung wurde zunächst mit einer
Aufreinigung des PCR-Produkts mittels ExoSAP-IT® (Affymetrix, USA) begonnen. Dabei
wurden verbliebene Reste von Primern und Nukleotiden im PCR-Produkt enzymatisch
abgebaut. Dazu wurde in einer PCR-Platte 1 μl PCR-Produkt mit 0,5 μl ExoSAP- IT® und 5,5 μl
Reinstwasser versetzt. Der Verdau erfolgte in einem Thermocycler bei 37 °C für 30 min,
gefolgt von 85 °C für 15 min und 95 °C für 2 min. Die darauf folgende Sequenzierreaktion
wurde in dieser Arbeit mit dem BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems, Damstadt) durchgeführt. Dafür wurde zunächst ein Mastermix bestehend aus 1
μl BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Mix, 2 μl BigDye® Terminator
v1.1/3.1 Sequencing Buffer (5x) und 1 μl Sequenzierprimer (M13/Stuffer-Reverse) pro Probe
vorbereitet und jeweils 4 μl des Mastermixes zum aufgereinigten PCR-Produkt dispensiert.
Die Sequenzierreaktion erfolgte in einem Thermocycler. Die dabei durchgeführten CyclerSchritte sind in Tabelle 10 aufgeführt.
Tabelle 10: Ablauf und Bedingungen der Sequenzierreaktion.
Cycler-Schritt
Dauer
Temperatur
1. Anfangsdenaturierung
2 min
96 °C
2. Denaturierung
20 s
96 °C
3. Annealing
20 s
58 °C
4. Elongation
3 min
60 °C
5. Abschlusselongation
3 min
60 °C
Zyklenzahl
(Wdh. der Schritte 2-4)
25
Der Sequenzierreaktion schloss sich eine Ethanolfällung (85%) mit den CleanDTR Magnetic
Beads (GCbiotech, Niederlande) mit Hilfe eines Pipettier-Roboters (JANUS® Automated
Workstation, Perkin Elmer, Rodgau) an. Die in 40 μl Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems,
67
MATERIAL UND METHODEN
Damstadt) gelöste DNA wurde auf einem ABI 3730 oder ABI 3130 xl Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, Damstadt) sequenziert.
2.2.5 Computerprogramme und Datenbanken
Zur
Erstellung
der
Primersequenzen
(Primerdesign),
der
Literaturrecherche,
der
Datenauswertung sowie der Datenverarbeitung wurden unterschiedliche Programme sowie
öffentlich zugängliche Internetseiten verwendet. Eine detaillierte Auflistung der genutzten
Software und Internetadressen mit den dazugehörigen Herstellern bzw. Betreibern sowie
dem Verwendungszweck sind in Tabelle 11 aufgeführt.
Tabelle 11: Verwendete Computerprogramme und Datenbanken.
Programm / Internetseite
Hersteller / Betreiber
Max-Planck-Institut für
BiQ Analyzer v2.0
Informatik, Saarbrücken
[389]
Verwendungszweck
Datenauswertung der direkten
Bilsufitsequenzierungen
Institute of Enzymology,
Bisearch
http://bisearch.enzim.hu/
BRC, Hungarian Academy
of Sciences, Budapest
Primerdesign
[390, 391]
Technelysium Pty Ltd,
Chromas Lite 2.1.1
South Brisbane,
Australien
DNA-Baser 3.5.4.2
Datenauswertung der direkten
Bilsufitsequenzierungen
Heracle BioSoft SRL,
Konvertierung der AB1-
Rumänien
Dateien zu FASTA-Dateien
The European
Bioinformatics Institute
(EMBL-EBI), Cambridge,
Ensembl
http://www.ensembl.org/index.html
UK
Primerdesign und
Datenauswertung
The Wellcome Trust
Sanger Institute,
Cambridge, UK
LASAGNA-Search 2.0
Department of Computer
Identifizierung von
http://biogrid-
Science and Engineering,
Transkriptionsfaktor-
68
MATERIAL UND METHODEN
lasagna.engr.uconn.edu/lasagna_search/
USA [392]
bindestellen
Textverarbeitung,
Microsoft-Office 2010
Microsoft Corporation
Datenauswertung und
Erstellung von Abbildungen
National Center for
NCBI
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Biotechnology
Primerdesign und
Information, Bethesda,
Datenauswertung
USA
Pyro Q-CpG 1.0.9
Pyro-Mark Assay Design 2.0
Biotage, Uppsala,
Datenauswertung der
Schweden
Pyrosequenzierungen
Qiagen, Hilden
Primerdesign
69
ERGEBNISSE
3
Ergebnisse
Zur Unterscheidung einer somatischen Kontamination von einer Epimutation wurde eine
somatische Kontamination definiert als das Auftreten von mindestens einem abnormal
methylierten Allel (>50% abnormal methylierte CpGs) in mindestens 2 der 3
Promotorregionen bH19, bSNRPN und bDNMT3Lo bei Genset 2 bzw. 2 der 4
Promotorregionen bH19, bSNRPN, bDNMT3Lo und bOCT4 bei Genset 1 innerhalb des
gleichen Eizell-Pools. Unter Anwendung dieser Definition wurden 7 von insgesamt 118
untersuchten Eizell-Pools aufgrund potentieller Kontamination durch somatische Zellen aus
der Analyse ausgeschlossen. Eine detaillierte Auflistung der betroffenen Eizell-Gruppen ist
Tabelle 12 zu entnehmen.
Tabelle 12: Auflistung der Anzahl der untersuchten Eizell-Pools sowie der somatisch kontaminierten Eizell-Pools.
Unreifen Eizellen aus
Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe
Anzahl der
untersuchten EizellPools
Anzahl der somatisch
kontaminierte EizellPools
Eizellen von Kühen
unterschiedlichen Alters
IVM-Eizellen
unterschiedlicher
Reifungsdauer
Σ
<2 mm
3-5 mm
>6 mm
9-12
Monate
3-7
Jahre
8-11
Jahre
24h
48h
19
11
8
15
17
13
18
17
118
2
(10%)
0
0
0
1
(6%)
0
4
(22%)
0
7
(6%)
Allele wurden als vollständig methyliert bewertet, wenn sie mehr als 50% methylierte CpGs
enthielten. DNA-Moleküle, die weniger als 50% methylierte CpGs aufwiesen wurden als
vollständig unmethyliert kategorisiert. Auf der Ebene einzelner CpG-Stellen wurden aufgrund
der Verwendung zweier unterschiedlicher Sequenzierungstechniken Methoden-spezifische
Definitionen für die Methylierungszustände formuliert. Die Pyrosequenzierung liefert
quantitative Rohdaten in Form eines Messwerts zwischen 1% und 100% für einzelne CpGStellen. Als vollständig methyliert wurden CpG-Stellen gewertet, die eine Methylierung von
mehr als 80% aufwiesen. CpGs, die geringer als 20% methyliert waren, wurden als
vollständig unmethyliert klassifiziert. Methylierungswerte einzelner CpGs zwischen 20% und
80% konnten weder als vollständig methyliert noch als vollständig unmethyliert gewertet
werden und wurden als CpGs mit uneindeutigem Methylierungszustand kategorisiert. Unter
70
ERGEBNISSE
der Annahme, dass die LD Sequenzdaten einzelner DNA-Moleküle bzw. Allele liefert, wurden
Methylierungswerte von 0 bzw. 100% an einzelnen CpG-Positionen erwartet. Unter
Berücksichtigung der Messungenauigkeit wurde der Toleranzbereich auf <20% bzw. >80%
ausgedehnt. Bei Messwerten zwischen 20% und 80% Methylierung einzelner CpGs konnte
jedoch nicht mehr davon ausgegangen werden, dass es sich um die Sequenzdaten eines
einzelnen DNA-Moleküls handelt. Werte dieser Art können das Ergebnis eines überlagerten
Signals von mindestens zwei Allelen mit CpGs unterschiedlicher Methylierung sein. Eine
unvollständige Natriumbisulfit-Konvertierung kann jedoch ebenfalls als mögliche Ursache für
diese Messwerte nicht ausgeschlossen werden.
Die direkte Bisulfitsequenzierung bzw. Sanger-Sequenzierung lieferte qualitative Rohdaten in
Form eines Chromatogramms. Deutliche heterozygote Signale an einer CpG-Stelle wurden
als CpG-Stellen mit uneindeutigem Methylierungszustand definiert. Im Chromatogramm
stellte sich dieser Zustand durch zwei überlagerte Peaks für Cytosin und Thymin dar. Eine
Gegenüberstellung von Rohdaten der Pyrosequenzierung sowie der Sanger-Sequenzierung
für die aufgeführten Methylierungszustände sowie der im späteren Verlauf verwendeten
vereinfachten Darstellungsform sind in Abbildung 12 veranschaulicht.
71
ERGEBNISSE
Sanger-Sequenzierung
Darstellung
Pyrosequenzierung
0% Methylierung
50% Methylierung
und/oder
100% Methylierung
Abbildung 12: Exemplarische Darstellung von Chromatogrammen (Sanger-Sequenzierung, bDNMT3Ls) und Pyrogrammen
(Pyrosequenzierung, bDNMT3Lo) sowie die verwendete schematische Darstellung der CpG-Stelen. Die CpG-Stellen sind
mit schwarzen Pfeilen in den Chromatogrammen der Sanger-Sequenzierungen und grau hinterlegt in den Pyrogrammen
markiert. Rote Pfeile zeigen die CpG-Stellen mit uneindeutiger (50% Methylierung) Methylierung. Ein einzelnes Quadrat
repräsentiert ein einzelnes CpG. Aneinander angrenzende Quadrate befinden sich auf dem gleichen DNA-Molekül. Ein
weißes Quadrat zeigt ein unmethyliertes CpG (0% Methylierung), ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG (100%
Methylierung) und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand (50% Methylierung). Als CpGs mit
uneindeutigem Methylierungszustand wurden bei der Pyrosequenzierung Messwerte zwischen 20% und 80% einzelner
CpGs bewertet sowie ein deutliches heterozygotes Signal an einer CpG-Stellen in der Sanger-Sequenzierung (mittlere Zeile;
50% Methylierung).
Zur Beurteilung der Effizienz der Limiting Dilution wurde die Ausbeute der identifizierten
Allele als Verhältnis der Anzahl sequenzierter DNA-Moleküle zu der Anzahl eingesetzter
Allele bestimmt. Da die Eizellen noch im Besitz der Zona pellucida und des Polkörpers waren,
lagen 4 amplifizierbare Allele für jedes Gen in einer einzelnen Eizelle vor. Damit waren für
einen Pool von 10 Eizellen maximal 40 detektierbare Allele zu erwarten. Aufgrund des hohen
Grads an DNA-Degradation verursacht durch die Natriumbisulfitbehandlung lag der
empirische Wert jedoch unter der Hälfte der Anzahl eingesetzter Allele. Die ausführliche
Auflistung der Ausbeuten für die einzelnen Gene in den untersuchten Eizellen bzw.
72
ERGEBNISSE
Embryonen sind Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15 und Tabelle 19 zu entnehmen (AllelAusbeute).
3.1 DNA-Methylierungsprofile
entwicklungsrelevanter
Gene
in
unreifen
Rindereizellen
Die Untersuchung der DNA-Methylierung in unreifen Rindereizellen umfasste die
Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4, bDNMT3Lo und
bDNMT3Ls (Genset 1). Die untersuchten Eizellen wurden aus Antralfollikeln von
Schlachttieren isoliert und nach Follikelgrößen von <2 mm, 3-5 mm und >6 mm gruppiert
(siehe 2.1.1.1). Die Mehrzahl der detektierten Allele (>95%) zeigte für die Gene bH19, bZAR1,
bOCT4, bDNMT3A und bDNMT3Lo ein vollständig unmethyliertes Muster und für bSNRPN
ein hypermethyliertes Muster (Abbildung 13). Insgesamt konnten für diese 6 Gene 466 DNAMoleküle mit 6318 CpGs aus 343 Eizellen analysiert werden (Tabelle 13). Dabei zeigten 3 der
466 untersuchten Allele (<1%) ein abnormales Methylierungsmuster (>50% abnormal
methylierte CpGs). Alle 3 abnormal methylierten DNA-Moleküle wurden in Eizellen aus
Follikeln <2 mm nachgewiesen und enthielten eine aberrante Methylierung in bH19 und 2
abnormal methylierte Allele in bSNRPN.
Die detektierten Allele der Promotorregion des Gens DNMT3Ls zeigten nach direkter SangerSequenzierung eine Mischung aus methylierten und unmethylierten CpGs sowie eine
erhöhte Häufigkeit von CpGs mit uneindeutigem Methylierungszustand (Abbildung 17A). Da
sich das Methylierungsmuster von DNMT3Ls deutlich von denen der anderen Gene des
Gensets (bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und DNMT3Lo) unterschied, werden die
Ergebnisse für die Promotorregion von DNMT3Ls gesondert dargestellt (siehe Kapitel 3.3).
73
ERGEBNISSE
bDNMT3Lo
bH19
<2 mm
3-5 mm
>6 mm
<2 mm
3-5 mm
>6 mm
<2 mm
bOCT4
bSNRPN
<2 mm
3-5 mm
bDNMT3A
>6 mm
<2 mm
3-5 mm
3-5 mm
>6 mm
bZAR1
>6 mm
<2 mm
3-5 mm
>6 mm
Abbildung 13: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bOCT4, bDNMT3A und bDNMT3Lo in unreifen Rindereizellen aus
Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm). Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundener Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein
weißes Quadrat zeigt ein unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Allele, die CpGs mit
uneindeutigem Methylierungszustand (graue Quadrate) enthalten, wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Rote Pfeile markieren die als abnormal kategorisierten Allele.
74
ERGEBNISSE
Tabelle 13: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19,
bSNRPN, bOCT4, bDNMT3A, bDNMT3Lo und bZAR1 in unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe
(>2 mm, 3-5 mm und >6 mm). Die ausgeschlossenen Allele beinhalten Allele, die CpG-Stellen mit einem uneindeutigen
Methylierungszustand enthalten (vgl. graue Quadrate, Abbildung 12). Diese Allele tragen nicht zur Anzahl der Einzel-CpGFehler bei und wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Signifikante Unterschiede zwischen den Follikeln
verschiedener Größen in der Methylierung von vollständigen Allelen und Einzel-CpG-Fehlern wurden für keines der
untersuchten Gene detektiert.
Gen
bH19
bSNRPN
bOCT4
bDNMT3A
bDNMT3Lo
bZAR1
Σ
Anzahl der
CpG-Stellen
im Assay
<2 mm
3-5 mm
>6 mm
Σ
18
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
33
19 (58%)
1 (7%)
3 (1%)
0,05
40
26 (65%)
0
1 (1%)
0,10
16
10 (63%)
0
1 (1%)
0,06
89
55 (62%)
1 (3%)
5 (1%)
0,06
30
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
15
2 (13%)
2 (15%)
2 (1%)
0,02
8
6 (75%)
0
1 (2%)
0,02
8
4 (50%)
0
2 (2%)
0,03
31
12 (39%)
2 (11%)
5 (1%)
0,02
7
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
23
1 (4%)
0
6 (4%)
0,03
25
3 (12%)
0
5 (3%)
0,06
28
3 (11%)
0
3 (2%)
0,10
76
7 (9%)
0
14 (3%)
0,06
16
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
16
6 (38%)
0
2 (1%)
0,02
37
18 (49%)
0
8 (3%)
0,09
21
11 (52%)
0
4 (3%)
0,08
74
35 (47%)
0
14 (2%)
0,05
5
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
104
12 (12%)
0
4 (1%)
0,15
28
0
0
0
0,07
26
6 (23%)
0
2 (2%)
0,09
158
18 (11%)
0
6 (1%)
0,12
18
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
2
2 (100%)
0
0
0,003
27
11 (41%)
0
1 (0%)
0,07
9
7 (78%)
0
0
0,03
38
20 (53%)
0
1 (0%)
0,03
94
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
193
42 (22%)
3 (2%)
17 (1%)
0,05
165
64 (39%)
0
16 (1%)
0,07
108
41 (38%)
0
12 (1%)
0,07
466
147 (32%)
3 (1%)
45 (1%)
0,06
75
ERGEBNISSE
3.2 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in in vitro-gereiften
Rindereizellen und daraus generierten Rinderembryonen
Um mögliche Veränderungen der DNA-Methylierung verursacht durch in vitro-Reifung zu
identifizieren, wurden Eizellen aus 3-5 mm großen Antralfollikeln von Schlachttieren für 24h
(Standard Protokoll) und 48h (simulierte post-ovulatorische Alterung) gereift (siehe 2.1.1.3).
Zur Generierung von Rinderembryonen wurden die gereiften Eizellen einer in vitro
Fertilisation (IVF) mit anschließender in vitro Kultivierung unterzogen (siehe 2.1.1.4). Wie
bereits bei unreifen Rindereizellen, umfasste die Untersuchung der DNA-Methylierung
sowohl bei den in vitro-maturierten (IVM) Eizellen als auch bei den daraus generierten
Rinderembryonen die Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A,
bOCT4, bDNMT3Lo und bDNMT3Ls (Genset 1). Mehr als 98% der detektierten Allele der
Eizellen und Embryonen zeigten für die Gene bH19, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und
bDNMT3Lo ein vollständig unmethyliertes Profil und für bSNRPN ein vollständig methyliertes
Profil (Abbildung 14, Abbildung 15 und Abbildung 16). Ähnlich wie bei den analysierten
Allelen der unreifen Eizellen, wiesen die DNA-Moleküle der Promotorregion des Gens
DNMT3Ls auch bei IVM-Oozyten und Embryonen ein Methylierungsmuster aus methylierten
und unmethylierten CpGs auf (Abbildung 17B). Die Ergebnisse dieser Promotorregion von
DNMT3Ls in IVM-Eizellen und Embryonen werden gemeinsam mit den Resultaten der
unreifen Eizellen separat beschrieben (siehe Kapitel 3.3).
3.2.1 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in in vitro-gereiften
Rindereizellen
In den analysierten IVM-Eizellen wurden 7 abnormal methylierte Allele identifiziert
(Abbildung 14 und Tabelle 14). Alle 7 DNA-Moleküle mit aberranter Methylierung wurden in
Eizellen nachgewiesen, welche für 48h reiften. Dabei gehört 1 abnormal methyliertes Allel
dem geprägten Gen bSNRPN an und 6 aberrante Allele der Promotorregion von DNMT3Lo.
Das Auftreten der abnormal methylierten DNA-Moleküle von DNMT3Lo repräsentiert einen
signifikanten Gruppenunterschied zwischen in vitro-gereiften Eizellen für 24h und 48h
(p<0.03). Für die Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A und bOCT4 konnten keine
signifikanten Gruppenunterschiede in der DNA-Methylierung vollständiger Allele sowie beim
Auftreten von Einzel-CpG-Fehlern in IVM-Eizellen detektiert werden.
76
ERGEBNISSE
bH19
24h
bSNRPN
48h
24h
48h
*
24h
48h
24h
48h
bDNMT3A
bDNMT3Lo
24h
bOCT4
bZAR1
48h
24h
48h
Abbildung 14: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3Lo, bDNMT3A und bOCT4 in gereiften Rindereizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h).Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundener Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weißes Quadrat zeigt ein
unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Allele, die CpGs mit uneindeutigem
Methylierungszustand (graue Quadrate) enthalten, wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Rote Pfeile markieren die als abnormal kategorisierten Allele. Eizellen, die für 48h
gereift wurden zeigten für die Promotorregion von bDNMT3Lo eine signifikant erhöhte Anzahl abnormal methylierter Allele im Vergleich zu den 24h-gereiften Oozyten (*).
77
ERGEBNISSE
Tabelle 14: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19,
bSNRPN, bDNMT3A, bZAR1, bOCT4 und bDNMT3Lo in gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und
48h). Die ausgeschlossenen Allele beinhalten Allele, die CpG-Stellen mit einem uneindeutigen Methylierungszustand
enthalten (vgl. graue Quadrate, Abbildung 14). Diese Allele tragen nicht zur Anzahl der Einzel-CpG-Fehler bei und wurden
bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Eizellen, die für 48h gereift wurden zeigen für die Promotorregion von
bDNMT3Lo eine signifikant erhöhte Anzahl abnormal methylierter Allele im Vergleich zu den 24h-gereiften Oozyten (*).
Gen
bH19
bSNRPN
bDNMT3A
bZAR1
bOCT4
bDNMT3Lo
Σ
Anzahl der
CpG-Stellen
im Assay
24h
48h
Σ
20
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
20
2 (10%)
0
0
0,03
55
24 (44%)
0
3 (1%)
0,08
75
26 (35%)
0
3 (1%)
0,05
30
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
20
6 (30%)
0
6 (1%)
0,03
16
7 (44%)
1 (6%)
5 (2%)
0,02
36
13 (36%)
1 (3%)
11 (2%)
0,03
16
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
39
1 (3%)
0
19 (3%)
0,06
38
4 (11%)
0
7 (1%)
0,06
77
5 (6%)
0
26 (2%)
0,06
18
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
14
10 (71%)
0
2 (3%)
0,02
2
2 (100%)
0
0
0,003
16
12 (75%)
0
2 (3%)
0,01
7
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
31
11 (35%)
0
2 (1%)
0,04
45
3 (7%)
0
5 (2%)
0,07
76
14 (18%)
0
7 (2%)
0,06
5
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
93
14 (15%)
0*
10 (3%)
0,13
103
10 (10%)
6* (6%)
12 (3%)
0,15
196
24 (12%)
6 (3%)
22 (3%)
0,14
96
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
217
44 (20%)
0
39 (1%)
0,05
259
50 (19%)
7 (3%)
32 (1%)
0,06
476
94 (20%)
7 (2%)
71 (1%)
0,06
78
ERGEBNISSE
3.2.2 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in Rinderembryonen aus
in vitro-gereiften Rindereizellen
Die Embryonen, die aus in vitro-gereiften Eizellen unterschiedlicher Dauer (24h und 48h)
generiert wurden, wiesen für die Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und
bDNMT3Lo keine signifikanten Gruppenunterschiede in der Promotormethylierung auf
(Abbildung 15, Abbildung 16 und Tabelle 15). Die beiden Embryonengruppen zeigten weder
einen signifikanten Unterschied in der Methylierung vollständiger Allele noch im Auftreten
einzelner aberrant methylierter CpGs. In der 24h-Gruppe der Embryonen wurde ein
abnormal methyliertes Allel des Gens DNMT3Lo nachgewiesen. Unabhängig von der
Reifedauer der Eizellen wurde in den Embryonen für die mittels Sanger-Sequenzierung
analysierten Allele von DNMT3A ein Anstieg von CpG-Stellen mit undefinierbarem
Methylierungszustand (7.9%) gegenüber den anderen Genen (bZAR1: 2.4%, bOCT4: 2.0%,
bDNMT3Lo: 1.0%) beobachtet.
79
ERGEBNISSE
bZAR1
24h
bDNMT3A
48h
24h
48h
bOCT4
24h
bDNMT3Lo
48h
24h
48h
Abbildung 15: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und bDNMT3Lo in Embryonen aus gereiften Rindereizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundener Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weißes Quadrat zeigt
ein unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Allele, die CpGs mit uneindeutigem
Methylierungszustand (graue Quadrate) enthalten, wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Rote Pfeile markieren die als abnormal kategorisierten Allele.
80
ERGEBNISSE
Tabelle 15: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19,
bSNRPN, bDNMT3A, bZAR1, bOCT4 und bDNMT3Lo in Embryonen aus gereiften Rindereizellen unterschiedlicher
Reifungsdauer (24h und 48h). Die ausgeschlossenen Allele beinhalten Allele, die CpG-Stellen mit einem uneindeutigen
Methylierungszustand enthalten (vgl. graue Quadrate, Abbildung 15). Diese Allele tragen nicht zur Anzahl der Einzel-CpGFehler bei und wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der
Methylierung von vollständigen Allelen oder Einzel-CpG-Fehlern zwischen den beiden Gruppen von Embryonen für die
untersuchten Gene detektiert.
Gen
bH19
bSNRPN
bDNMT3A
bZAR1
bOCT4
bDNMT3Lo
Σ
Anzahl der
CpG-Stellen
im Assay
24h
48h
Σ
20
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
35
17 (48%)
0,14
21
16 (76%)
0,10
56
33 (59%)
0,12
30
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
18
5 (28%)
0,07
14
9 (64%)
0,06
32
14 (44%)
0,07
16
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
50
29 (58%)
0
10 (3%)
0,20
48
40 (83%)
0
14 (11%)
0,22
98
69 (70%)
0
24 (5%)
0,21
18
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
21
4 (19%)
0
4 (1%)
0,08
22
8 (36%)
0
1 (1%)
0,10
43
12 (28%)
0
5 (1%)
0,09
7
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
23
1 (4%)
0
4 (3%)
0,09
28
3 (11%)
0
9 (5%)
0,13
51
4 (8%)
0
13 (4%)
0,11
5
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
34
1 (3%)
1 (3%)
4 (3%)
0,13
43
2 (5%)
0
5 (2%)
0,20
77
3 (4%)
1 (1%)
9 (3%)
0,16
96
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
181
57 (32%)
1 (1%)
22 (1%)
0,12
176
78 (44%)
0
29 (1%)
0,13
357
135 (38%)
1 (1%)
51 (1%)
0,13
Das embryonale Genom enthält nach der Verschmelzung des paternalen Spermien- und
maternalen Eizellgenoms für die geprägten Gene bH19 und bSNRPN eine Kombination aus
methylierten und unmethylierten Allelen für beide Imprinting-Gene. Zur besseren Übersicht
81
ERGEBNISSE
der Verteilung der gewonnen Allele in den einzelnen Embryonen wurden die analysierten
DNA-Moleküle von bH19 und bSNRPN aufgetrennt nach den einzelnen Embryonen
dargestellt (Abbildung 16). Das paternal geprägte Gene bH19 und das maternal geprägte
Gen bSNRPN zeigten in 7 von 15 untersuchten Embryonen unabhängig von der Reifedauer
der Eizellen ein gemischtes Methylierungsprofil mit einer Kombination aus vollständig
methylierten und vollständig unmethylierten Allelen (Abbildung 16; 24h: E7, E8, E12, E13;
48h: E1, E3, E4). Für 3 Proben konnten nur DNA-Moleküle von bH19 amplifiziert werden (E9,
E6, E23). In beiden Reifungsgruppen konnten jeweils zwei deutlich hypomethylierte
Embryonen identifiziert werden, die
ausschließlich unmethylierte Allele der beiden
geprägten Gene aufwiesen (24h: E10, E15; 48h: E5, E24). Da zum Zeitpunkt der
experimentellen
Durchführung
keine
Sequenzinformationen
zu
Einzelnukleotid-
Polymorphismen in der untersuchten bovinen DNA-Region von bH19 und bSNRPN vorlag,
konnte nicht bestimmt werden, ob die analysierten Allele väterlichen oder mütterlichen
Ursprungs sind.
82
ERGEBNISSE
24h
Embryo
bH19
48h
bSNRPN
Embryo
E7
E1
E8
E2
E9
E3
E10
E4
E12
E5
E13
E6
E15
E23
bH19
bSNRPN
E24
Abbildung 16: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bH19 und bSNRPN in Embryonen aus gereiften Rindereizellen unterschiedlicher
Reifungsdauer (24h und 48h). Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundener Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weißes Quadrat zeigt ein unmethyliertes
CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Die detektierten Allele für bH19 und bSNRPN sind separat für die
einzelnen Embryonen dargestellt.
83
ERGEBNISSE
3.3 DNA-Methylierungsprofile der Promotorregion bDNMT3Ls in unreifen und in
vitro-gereiften Rindereizellen sowie daraus generierten Rinderembryonen
Die detektierten Allele der Promotorregion des Gens DNMT3Ls zeigten nach direkter SangerSequenzierung eine Mischung aus methylierten und unmethylierten CpGs in Eizellen aus
Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) (Abbildung 17A).
Zusätzlich zu diesen beiden Zuständen konnte eine erhöhte Häufigkeit von CpGs mit
uneindeutigem Methylierungszustand beobachtet werden, welche sich im Chromatogramm
durch eine heterozygote Überlagerung von Cytosin und Thymin an den uneindeutigen CpGStellen zeigte (vgl. Beispiel in Abbildung 12). Insbesondere CpG7 und CpG8 wiesen in allen
analysierten Allelen von Eizellen der größten Follikelkategorie (>6 mm) ausschließlich Signale
uneindeutiger Methylierungszustände auf. Die statistische Auswertung bestätigte einen
signifikanten Anstieg dieser Signale für CpG2, CpG7 und CpG8 in Eizellen aus großen
Antralfollikeln (>6 mm) im Vergleich zu Oozyten aus kleinen (<2 mm: pCpG2 < 0.01, pCpG7 <
0.0001, pCpG8 < 0.0001) und mittelgroßen Follikeln (3-5 mm: pCpG2 < 0.004, pCpG7 <
0.0001, pCpG8 < 0.0001) (Tabelle 16). Die untersuchte Promotorregion von DNMT3Ls
schließt den Transkriptionsstartpunkt mit einem Bereich von 134 bp stromaufwärts und 169
bp stromabwärts ein (Abbildung 17C). CpG1 bis CpG4 befinden sich im ersten Exon während
CpG5 bis CpG8 110 bp stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts lokalisiert sind. Um zu
prüfen, ob sich die Methylierung der CpG-Stellen des ersten Exons von der Methylierung des
Bereichs stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts unterscheidet, wurden die Messwerte
der benachbarten 4 CpGs miteinander kombiniert und separat für beide Regionen des
geteilten Amplikons analysiert. Dieser Vergleich zeigte für beide Bereiche CpG 1-4 und CpG
5-8 eine signifikante Zunahme der uneindeutigen Methylierung in Eizellen großer Follikel (>6
mm) gegenüber mittelgroßen Follikeln (3-5 mm) (pCpG1-4 < 0.002, pCpG5-8 < 0.0001)
(Abbildung 17A). Eine signifikante Zunahme dieser Methylierungszustände konnte ebenfalls
zwischen Eizellen kleiner Follikel (<2 mm) und Oozyten großer Follikel (>6 mm) für CpG5 bis
CpG8 (pCpG5-8 < 0.0001) nachgewiesen werden (Abbildung 17A). Eine Sequenzanalyse nach
möglichen Transkriptionsfaktorbindestellen innerhalb der untersuchten Sequenz von
DNMT3Ls führte zu einer Bindestelle des „cAMP response element (CRE)-binding protein“
(CREB) an CpG7 der untersuchten Promotorregion von bDNMT3Ls (Abbildung 17C).
84
ERGEBNISSE
A
3-5mm
100
40
20
0
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8
20
0
5-8
80
60
40
20
80
60
40
20
0
1-4
24h
5-8
1-4
100
100
100
80
80
80
60
60
60
60
40
40
40
40
20
20
20
0
0
1 2 3 4 5 6 7 8
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8
0
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
*
100
100
100
100
80
80
80
80
60
60
60
60
40
40
40
40
20
20
20
20
0
0
1-4
5-8
5-8
0
0
1-4
5-8
1-4
5-8
1-4
5-8
*
*
*
48h
80
*
100
0
1-4
20
48h
*
Methylation [%]
Methylation [%]
40
40
Embryonen
100
1 2 3 4 5 6 7 8
100
60
60
0
*
80
80
1 2 3 4 5 6 7 8
100
Methylierung [%]
60
100
80
24h
Methylierung [%]
80
Gereifte Eizellen
>6mm
Methylation [%]
100
Methylation [%]
Methylierung [%]
<2mm
Methylierung [%]
B
Unreife Eizellen
C
bDNMT3Ls
1
+169
2
12 bp
3 4
19 bp
1 bp
56
137 bp
+1
7
8
0 bp 8 bp 12 bp
-134
CGCGCAGGATGACGCAGGGATGAGAGCG
CREB Bindungsstelle
Abbildung 17: Zusammenfassung der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregion des Gens
bDNMT3Ls in unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm)(A) und
gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h) sowie den daraus generierten Embryonen (B).
A/B: Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Jede Reihe stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weißes Quadrat
zeigt ein unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit
uneindeutigem Methylierungszustand (heterozygot T/C in direkter Sanger-Sequenzierung). Die Balkendiagramme stellen
die relative Methylierung für die einzelnen CpG-Positionen sowie für die Kombination der exonischen CpGs (CpG 1-4) und
der Promotorregion (CpG
5-8) von DNMT3Ls dar. A: Das Auftreten von CpGs mit einem uneindeutigen
Methylierungszustand ist signifikant erhöht für die CpG-Positionen 2, 7 und 8 in Eizellen aus großen Follikeln (>6 mm) im
Vergleich zu Oozyten aus kleineren Follikeln (<2 mm und 3-5 mm)(*). B: CpG5 und CpG7 sind in Embryonen von 48h
85
ERGEBNISSE
gereiften Eizellen signifikant hypomethyliert im Vergleich zu Embryonen, die aus Oozyten generiert wurden, die nur 24h
gereift wurden (*, durchgezogene Linie). CpG7 zeigt zusätzlich eine signifikante Hypermethylierung der 24h-Embryonen
gegenüber 24h gereiften Eizellen (*, gestrichelte Linie) B: Untersuchte Region von DNMT3Ls mit der Anordnung der CpGs
auf dem Amplikon. CpG1 bis CpG4 befinden sich im ersten Exon. CpG5 bis CpG8 liegen in der Promotorregion von
DNMT3Ls. An CpG7 befindet sich eine CREB Bindungsstelle.
Tabelle 16: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in
unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm). Die CpG-Positionen 2, 7
und 8 zeigten einen signifikanten Anstieg von CpGs mit uneindeutigem Methylierungszustand in Eizellen aus großen
Antralfollikeln (>6 mm, ab) im Vergleich zu Oozyten aus a: kleinen (<2 mm) (p(CpG2) < 0.01, p(CpG7) < 0.0001, p(CpG8) <
0.0001) und b: mittelgroßen Follikeln (3-5 mm) (p(CpG2) < 0.004, p(CpG7) < 0.0001, p(CpG8) < 0.0001).
Follikelgröße
CpG-Kategorie
<2 mm
CpG-Position
1
2
3
4
5
6
7
8
methylierte CpGs
uneindeutige CpGs
Unmethylierte CpGs
5
2
15
16
a
1
5
1
0
21
3
1
18
8
1
13
11
3
8
7
a
4
11
13
a
2
7
3-5 mm
methylierte CpGs
uneindeutige CpGs
unmethylierte CpGs
11
0
20
22
b
1
8
0
0
31
2
1
28
10
0
21
14
0
17
7
b
11
13
13
b
0
18
>6 mm
methylierte CpGs
uneindeutige CpGs
unmethylierte CpGs
1
1
10
5
ab
5
2
0
1
11
3
0
9
3
1
8
4
2
6
0
ab
12
0
0
ab
12
0
Tabelle 17: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in
gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). Es konnten keine signifikanten Unterschiede in
der Häufigkeit von methylierten bzw. unmethylierten CpGs zwischen den 24h und 48h gereiften Eizellen identifiziert
werden.
Reifungsdauer
CpG-Kategorie
24h
48h
CpG-Position
1
2
3
4
5
6
7
8
methylierte CpGs
unmethylierte CpGs
8
24
26
6
2
30
7
25
9
23
16
16
7
25
12
20
methylierte CpGs
unmethylierte CpGs
7
16
15
8
4
19
7
16
12
11
14
9
7
16
10
13
Tabelle 18: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in
Embryonen aus gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). Die CpG-Positionen 5 und 7
zeigten eine signifikante Abnahme an methylierten CpGs in Embryonen, die aus Eizellen generiert wurden, die für 48h
gereift wurden, im Vergleich zu Embryonen aus 24h gereiften Eizellen (*; p(CpG5) < 0.05, p(CpG7) < 0.05).
Reifungsdauer
CpG-Kategorie
24h
48h
CpG-Position
1
2
3
4
5
6
7
8
methylierte CpGs
unmethylierte CpGs
16
27
22
21
21
22
16
27
22*
21*
23
20
27*
16*
25
18
methylierte CpGs
unmethylierte CpGs
13
25
12
26
20
18
18
20
10*
28*
16
22
15*
23*
18
20
86
ERGEBNISSE
In IVM-Eizellen und den daraus entwickelten Embryonen bildete die Promotorregion von
DNMT3Ls ein Methylierungsprofil ab, das fast ausschließlich methylierte und unmethylierte
CpGs in einzelnen Allelen enthielt (Abbildung 17B). CpGs mit uneindeutigem
Methylierungszustand traten im Vergleich zu den detektierten Allelen in unreifen Oozyten
deutlich seltener auf. Um mögliche Muster der auftretenden Methylierungszustände zu
erkennen, wurden die Daten in ähnlicher Weise ausgewertet wie die Ergebnisse der unreifen
Eizellen. Bei der statistischen Auswertung wurden zunächst Gruppenvergleiche (24h vs. 48h)
innerhalb der Eizellen sowie der Embryonen durchgeführt (Eizellen24h vs. Eizellen48h;
Embryonen24h vs. Embryonen48h). Zusätzlich dazu wurden ebenfalls die Gruppen gleicher
Kategorie zwischen den Eizellen und den Embryonen getestet (Eizellen 24h vs. Embryonen24h;
Eizellen48h vs. Embryonen48h). Diese Vergleiche wurden sowohl für die einzelnen CpGPositionen durchgeführt als auch für die kombinierten Daten von CpG1 bis CpG4 und CpG5
bis CpG8. Da CpGs mit uneindeutigen Methylierungszuständen nur vereinzelt ohne
statistische Relevanz (p>0,05) auftraten, wurden die betroffenen Allele aus der Analyse
ausgeschlossen und nur Moleküle mit eindeutig methylierten und unmethylierten CpGs
berücksichtigt. Die Testung der beiden Maturationsgruppen von Eizellen zeigte weder für
einzelne CpG-Positionen noch für die kombinierten Daten des geteilten Amplikons
signifikante Unterschiede in der DNA-Methylierung (Abbildung 17B und Tabelle 17). Der
Vergleich der beiden Reifungsgruppen von Embryonen wies hingegen eine signifikante
Hypomethylierung in der 48h-Gruppe auf, welche sowohl die einzelnen CpG-Positionen 5
(CpG5; p<0.03) und 7 (CpG7; p<0.05) als auch den kombinierten exonischen Bereich dieser
CpGs von CpG5 bis CpG8 (p<0.002) betraf (Abbildung 17B und Tabelle 18). Die
Gegenüberstellung der unterschiedlich lange gereiften Eizellen mit Embryonen, die sich aus
Eizellen
gleicher
Reifedauer
entwickelten,
ergab
keine
signifikanten
Methylierungsunterschiede zwischen den 48h-Gruppen. In Embryonen, die aus 24h gereiften
Eizellen generiert wurden, zeigten jedoch sowohl das CpG7 als auch die kombinierten
Methylierungszustände von CpG5 bis CpG8 eine signifikante Hypermethylierung von
p<0.0005 bzw. p<0.0002 gegenüber den 24h-Eizellen (Abbildung 17B).
87
ERGEBNISSE
3.4 DNA-Methylierungsprofile
entwicklungsrelevanter
Gene
in
unreifen
Rindereizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters
Um Veränderungen der DNA-Methylierung in der Eizelle zu identifizieren, die mit dem
steigenden Lebensalter des weiblichen Individuums auftreten, wurden Oozyten aus Rindern
unterschiedlichen Alters untersucht (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). Die
Kandidatengene, die in den Eizellen unterschiedlich alter Spendertiere analysiert wurden,
umfassen bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN (Genset 2).
Die detektierten Allele (>95%) wiesen für die Gene bTERF2, bBCL-XL, bPISD, bBUB1,
bDNMT3Lo und bH19 ein vollständig methyliertes Muster auf und für bREC8 und bSNRPN ein
vollständig unmethyliertes Muster (Abbildung 18 und Abbildung 19). Die Ausbeute der Daten
beinhaltet insgesamt für alle 8 Gene 1044 Allele mit 88740 CpGs von 372 Rindereizellen. 9
der 1044 DNA-Moleküle (<1%) zeigten eine abnormale Methylierung (>50% abnormal
methylierte CpGs), die in 3 der 8 Kandidatengene (bREC8, bDNMT3Lo und bH19) auftraten.
Für bREC8 wurden 2 aberrante Allele in Eizellen von 8-11 Jahre alten Kühen identifiziert.
DNMT3Lo war abnormal methyliert in einem DNA-Molekül aus Kühen der jüngsten (9-12
Monate) und der ältesten Gruppe (8-11 Jahre) sowie 2 Allelen aus Kühen mittleren Alters (37 Jahre). Abnormal methylierte Allele von bH19 wurden mit einem Molekül in Eizellen aus
jungen Kühen (9-12 Monate) und mit 2 Sequenzen in Oozyten von alten Tieren (8-11 Jahre)
beobachtet (Tabelle 19). Einzelne, abnormal methylierte CpGs traten für die Gene bREC8,
bBCL-XL, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN auf (insgesamt 68, <1%). bDNMT3Lo, bH19 und
bSNRPN enthielten in allen drei Gruppen von Eizellen CpG-Fehler, bREC8 nur in der Kohorte
junger Kühe und bBCL-XL in Eizellen junger und alter Tiere. Die statistische Auswertung
zwischen den drei Kategorien von Oozyten ergab für kein Gen weder für das Auftreten
abnormal methylierter Allele noch für die Häufigkeit von CpG-Fehlern signifikante
Gruppenunterschiede.
88
ERGEBNISSE
bBCL-XL
bPISD
9-12 Monate
3-7 Jahre
8-11 Jahre
9-12 Monate
3-7 Jahre
bBUB1
8-11 Jahre
9-12 Monate
3-7 Jahre
8-11 Jahre
bTERF2
9-12 Monate
3-7 Jahre
8-11 Jahre
bREC8
9-12 Monate
3-7 Jahre
8-11 Jahre
Abbildung 18: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bREC8, bPISD, bBUB1, bTERF2 und bBCL-XL in Rindereizellen von Kühen unterschiedlichen
Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundender Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weisses Quadrat zeigt
ein unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Allele, die CpGs mit uneindeutigem
Methylierungszustand (graue Quadrate) enthalten, wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Rote Pfeile markieren die als abnormal kategorisierten Allele.
89
ERGEBNISSE
bDNMT3Lo
9-12 Monate 3-7 Jahre 8-11 Jahre 9-12 Monate
bH19
3-7 Jahre
bSNRPN
8-11 Jahre
9-12 Monate
3-7 Jahre
8-11 Jahre
Abbildung 19: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN in Rindereizellen von Kühen unterschiedlichen Alters (9-12
Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). Ein einzelnes Quadrat repräsentiert ein einzelnes CpG. Eine Reihe verbundender Quadrate stellt ein einzelnes Allel dar. Ein weisses Quadrat zeigt ein
unmethyliertes CpG, ein schwarzes Quadrat ein methyliertes CpG und ein graues Quadrat ein CpG mit uneindeutigem Methylierungszustand. Allele, die CpGs mit uneindeutigem
Methylierungszustand (graue Quadrate) enthalten, wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Rote Pfeile markieren die als abnormal kategorisierten Allele.
90
ERGEBNISSE
Tabelle 19: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der Gene
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN in Rindereizellen von Kühen unterschiedlichen
Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). Die ausgeschlossenen Allele beinhalten Allele, die CpG-Stellen mit einem
uneindeutigen Methylierungszustand enthalten (vgl. graue Quadrate, Abbildung 18 und Abbildung 19). Diese Allele tragen
nicht zur Anzahl der Einzel-CpG-Fehler bei und wurden bei der statistischen Auswertung ausgeschlossen. Signifikante
Unterschiede zwischen den verschiedenen Altersgruppen in der Methylierung von vollständigen Allelen und Einzel-CpGFehlern wurden für keines der untersuchten Gene detektiert.
Gen
bTERF2
bREC8
bBCL-XL
bPISD
bBUB1
bDNMT3Lo
bH19
bSNRPN
Anzahl der
CpG-Stellen
im Assay
9-12
Monate
3-7
Jahre
8-11
Jahre
Σ
7
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
23
0
0
0
0,04
16
1 (6%)
0
0
0,03
26
0
0
0
0,06
65
1 (2%)
0
0
0,05
5
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
18
1 (6%)
0
1 (1%)
0,03
4
0
0
0
0,01
21
0
2 (10%)
0
0,05
43
1 (2%)
2 (5%)
1 (1%)
0,03
8
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
66
0
0
3 (1%)
0,13
31
0
0
0
0,07
54
1 (2%)
0
1 (1%)
0,13
151
1 (1%)
0
4 (1%)
0,11
6
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
26
0
0
0
0,05
23
2 (9%)
0
0
0,05
19
1 (5%)
0
0
0,04
68
3 (4%)
0
0
0,05
6
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
111
0
0
0
0,21
63
0
0
0
0,13
81
1 (1%)
0
0
0,19
255
1 (1%)
0
0
0,18
5
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
103
5 (5%)
1 (1%)
8 (2%)
0,2
47
2 (4%)
2 (4%)
8 (4%)
0,10
67
5 (8%)
1 (2%)
10 (3%)
0,16
217
12 (6%)
4 (2%)
26 (3%)
0,15
18
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
77
14 (18%)
1 (1%)
7 (1%)
0,15
39
2 (5%)
0
2 (1%)
0,08
60
9 (15%)
2 (3%)
5 (1%)
0,14
176
25 (14%)
3 (2%)
14 (1%)
0,12
30
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
25
10 (40%)
0
8 (2%)
0,05
25
5 (20%)
0
9 (2%)
0,05
19
0
0
6 (1%)
0,04
69
15 (22%)
0
23 (1%)
0,05
91
ERGEBNISSE
Σ
85
Analysierte Allele
Ausgeschlossene Allele
Abnormale Allele
CpG-Fehler
Allel-Ausbeute
449
30 (7%)
2 (1%)
27 (1%)
0,11
248
12 (5%)
2 (1%)
19 (1%)
0,07
347
17 (5%)
5 (1%)
22 (1%)
0,10
1044
59 (6%)
9 (1%)
68 (1%)
0,09
92
DISKUSSION
4
Diskussion
4.1 DNA-Methylierungsprofile entwicklungsrelevanter Gene in unreifen und in
vitro-gereiften Rindereizellen sowie daraus generierten Rinderembryonen
Die korrekte Entwicklung des Spermiums und der Eizelle stellen die Grundlage einer
normalen,
gesunden
Embryogenese
dar.
Insbesondere
epigenetische
Prozesse
repräsentieren entscheidende Schritte sowohl in der Entwicklung der Keimzellen als auch in
der anschließenden embryonalen Entwicklung [393]. Fehler im epigenetischen Profil von
Keimzellen führen zu Erkrankungen wie dem Beckwith-Wiedemann-Syndrom beim
Menschen bzw. dem „Large Offspring Syndrome“ (LOS) in Wiederkäuern [272, 273, 394].
Die Untersuchung von unreifen und in vitro-gereiften Rindereizellen sowie den daraus
generierten Rinderembryonen hat zum Ziel, die Entwicklung vom Frühstadium der Eizelle bis
hin zum Frühstadium des Embryos abzudecken. Sowohl beim Rind als auch beim Menschen
liegt die optimale Zeitspanne der Eizellreifung bei 24 h (siehe Kapitel 1.4). Damit stellt das
Rind ein geeignetes Modell insbesondere für die post-ovulatorische Reifung bzw. postovulatorische Alterung der Oozyte im humanen Organismus dar. Die abnehmende
Entwicklungskompetenz bei einer Reifung der Eizelle über 24 h hinaus könnten durch
epigenetische Veränderungen verursacht werden. Durch die Auswahl unterschiedlicher
Stadien von unreifen Eizellen bzw. durch gereifte Oozyten unterschiedlicher Reifedauer
sollen natürliche Veränderungen sowie Veränderungen induziert durch eine verlängerte
Maturation im DNA-Methylierungsprofil entwicklungsrelevanter Gene identifiziert werden.
4.1.1 DNA-Methylierungsprofile der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und
DNMT3Lo in unreifen und in vitro-gereiften Rindereizellen sowie daraus
generierten Rinderembryonen
Aus früheren Studien ist bekannt, dass bei der IVM humaner Eizellen die Erfolgsraten mit der
Größe des Antralfollikels der Oozyte korrelieren [295]. Die in dieser Arbeit untersuchten
unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6
mm) repräsentierten Eizellen, die für unterschiedliche Zeitspannen im Antralstadium der
zyklischen Follikelreifung des geschlechtsreifen Rind verweilten. Die Mehrzahl der
amplifizierten Allele der Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und bDNMT3Lo
weisen ein normales DNA- Methylierungsmuster in allen drei Kategorien von Eizellen auf. 3
93
DISKUSSION
von 466 (<1%) detektierten DNA-Molekülen zeigten ein abnormales Methylierungsprofil. Alle
3 abnormal methylierten Allele wurden in geprägten Genen von Eizellen aus kleinen
Antralfollikeln (<2 mm) nachgewiesen (Abbildung 13). Diese Beobachtung stellt keinen
signifikanten Anstieg abnormaler Methylierung in dieser Gruppe weiblicher Keimzellen dar.
Dieses Ergebnis kann jedoch dennoch auf ein potentiell höheres Risiko für MethylierungsFehler in Eizellen von Antralfollikeln <2 mm hinweisen. Frühere Studien haben gezeigt, dass
bovine Eizellen aus Antralfollikeln <2 mm signifikant geringere Erfolgsraten bei der in vitroReifung und Fertilisation aufweisen und nicht im Stande sind sich über das 8-Zellstaium
hinaus zu teilen [395]. Eine höhere Entwicklungskompetenz wurde jedoch für Eizellen aus
Follikeln >6 mm im Vergleich zu Oozyten aus Follikeln <4 mm nachgewiesen [396]. Ähnliche
Resultate wurden bei der Bewertung der Entwicklungskompetenz von Eizellen
unterschiedlicher Größen gewonnen. Bei Oozyten mit einem Durchmesser von <100 μm,
100-110 μm, 110-120 μm und >120 μm wurde untersucht, in wie fern sie über das Potential
verfügen die Stadien der Meiose II, der Furchung und der Bildung einer Blastozytse zu
erreichen. Der Anteil an Eizellen, die diese Entwicklungsstadien erreichten, stieg graduell mit
dem Durchmesser der Oozyten. Der höchste Anstieg wurde dabei zwischen Eizellen mit
einem Durchmesser von 100-110 μm und 110-120 μm beobachtet. Dieser Anstieg könnte die
Oozyten-Größe von 100-120 μm als entscheidenden Punkt zur Erlangung der
Entwicklungskompetenz der Eizelle kennzeichnen [397]. Bovine weibliche Keimzellen
erlangen die volle meiotische Kompetenz bei einem Durchmesser von etwa 110 μm und
zeigen bei einer Größe >110 μm keine transkriptionelle Aktivität [158]. Die Gruppe um Fair
konnte zeigen, dass es eine schwache Korrelation zwischen der Oozyten-Größe und der
Größe des Follikel gibt (r=0.32, p<0.0001) [158]. Dabei enthalten 10 bis 15% der großen
Follikel kleine Eizellen und umgekehrt. Die Eizelle stellt ihr Wachstum bei einem
Durchmesser von 120 μm ein wenn der Follikel eine Größe von 3 mm erreicht hat. Die
kritische Größe von 110 μm erlangt die Eizelle bei einem Follikeldurchmesser von etwa 2 mm
[158]. Somit bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit mit einer erhöhten abnormalen
Methylierung in Keimzellen von Follikeln <2 mm die reduzierte Entwicklungskompetenz von
Oozyten dieser Kategorie auf epigenetischer Ebene. O’Doherty et al. untersuchten die
Etablierung der DNA-Methylierung geprägter Gene in bovinen Eizellen unterschiedlicher
Größe [398]. Analysiert wurde die Methylierung von SNRPN, MEST, IGF2R, PEG10 und
PLAGL1 in Oozyten mit einem Durchmesser von 101-110 μm, 110-120 μm und ≥120 μm. Die
94
DISKUSSION
Ergebnisse zeigten einen graduellen genspezifischen Anstieg der Methylierung in
Abhängigkeit der Größe der Eizelle. Die größte Veränderung der DNA-Methylierung konnte
bei SNRPN, PEG10 und PLAGL1 zwischen Eizellen kleiner und größer als 110 μm beobachten.
Diese Resultate bestätigen unsere Daten für SNRPN. Bovine Eizellen mit einem Durchmesser
unter 110 μm haben eine reduzierte Entwicklungskompetenz und weisen ein vermutlich
noch nicht vollständig etabliertes DNA-Methylierungsprofil bei geprägten Genen auf. Eine
mögliche Erklärung dieser Beobachtung könnte sein, dass Eizellen aus Follikeln <2 mm bzw.
Oozyten mit einem Durchmesser <110 μm kritische Zwischenstadien sich entwickelnder
Eizellen repräsentieren. Es ist anzunehmen, dass die reduzierte Entwicklungskompetenz von
Eizellen <110 μm in Verbindung mit DNA-Methylierungsprofilen geprägter Gene steht, die zu
diesem Zeitpunkt der Entwicklung noch nicht vollständig etabliert sind. Die Präsenz
abnormal methylierter Allele geprägter Gene in dieser Wachstumsphase stellt vermutlich ein
natürliches Zwischenstadium der sich entwickelnden Eizelle und keinen pathologischen
Zustand dar. Da dieser Prozess der epigenetischen Reprogrammierung noch nicht vollständig
abgeschlossen ist, haben Eizellen dieser Größe weiterhin das Potential die korrekten
Methylierungsprofile und die vollständige Entwicklungskompetenz zu erlangen.
Mit Antralfollikeln der Größe 3-5 mm wurde eine in vitro-Reifung für 24h (Standard
Protokoll) und 48h (simulierte post-ovulatorische Alterung) durchgeführt. Follikel dieser
Größenordnung
sollten
100-120
μm
große
Eizellen
mit
potentiell
hoher
Entwicklungskompetenz enthalten. Das Risiko möglicher Entwicklungsdefizite, die bereits in
der unreifen Eizelle vorliegen, wird damit reduziert und die Untersuchung des Einflusses der
Reifedauer auf die Entwicklung der Oozyte und des Embryos ermöglicht.
Zur Simulation der post-ovulatorischen Alterung bei Ausbleiben der Befruchtung wurden die
Eizellen experimentell über die üblichen 24 h hinaus im Reifungsmedium belassen. Erst nach
48 h wurden diese post-ovulatorisch gealterten Eizellen befruchtet und die gewonnenen
Embryonen epigenetisch untersucht. Die Gen-spezifische Methylierungsanalyse der postovulatorisch gealterten Eizellen zeigte signifikant mehr abnormal methylierte Allele für die
Oozyten-spezifische Form von DNMT3L (DNMT3Lo). DNMT3L stellt einen essentiellen
Cofaktor für die korrekte Funktionsweise von DNMT3A bei der de novo Methylierung
während der Embryonalentwicklung dar. Die signifikante Hypermethylierung von DNMT3Lo
in der 48h-Gruppe könnte das Protein als Schlüsselmolekül identifizieren, das durch die post95
DISKUSSION
ovulatorische Alterung beeinflusst wird. Die Hypermethylierung von DNMT3Lo könnte zu
einer reduzierten Expression von DNMT3L in der Eizelle führen, was zu einer fehlerhaften
oder verminderten de novo Methylierung geprägter und nicht-geprägter Gene in der Oozyte
führt. So ist aus Studien in Mäusen bekannt, dass eine veränderte Expression von DNMT3L
verursacht durch eine Hypermethylierung die Entwicklung der Plazenta und der
Nachkommenschaft beeinträchtigt [399, 400]. Während eine Hypermethylierung von
DNMT3Lo in post-ovulatorisch gealterten Eizellen vorlag, konnte in der vorliegenden Arbeit
hingegen keine Hypermethylierung von DNMT3Lo in Embryonen detektiert werden, die aus
dieser Kategorie von Eizellen generiert wurden. Die aberrante Methylierung von DNMT3Lo
scheint damit während der Reprogrammierungsprozesse im Embryo eine Veränderung zum
normalen Methylierungsmuster durchlaufen zu haben.
Der Einfluss einer post-ovulatorischen Alterung auf geprägte Gene ist noch weitgehend
unerforscht. In einer Studie im Mausmodell von Imamura et al. wurde das geprägte Gen
Peg1/Mest
in
ovulierten
Eizellen,
in
vitro-gealterten
Oozyten
sowie
Präimplantationsembryonen untersucht [401]. Die Ergebnisse zeigten eine dynamische
Veränderung der Methylierung. Eizellen in der Metaphase II wiesen ein heterogenes
Methylierungsmuster auf, das nach 22h in vitro-Kultivierung hypermethyliert wurde und
nach weiteren 20h in vitro-Kultur (insgesamt 42h) erneut hypomethyliert in den Eizellen
vorlag. Diese für 42 h gereiften Oozyten besaßen damit ein ähnliches Methylierungsprofil
wie Embryonen. In einer weiteren Studie mit Mäusen von Liang et al. wurde die DNAMethylierung von Peg1/Mest und Snrpn in post-ovulatorischen Eizellen analysiert, die für
13h, 21h und 29h in vivo gereift wurden sowie in Oozyten mit Kumuluszellen („cumulusenclosed oocytes“ (CEOs)) und ohne Kumuluszellen („denuded oocytes“ (DOs)), die für 21h
und 29h in vitro-kultiviert wurden [402]. Peg1/Mest zeigte keine Demethylierung in allen
Gruppen unterschiedlicher Reifung, während Snrpn sowohl in den in vivo- als auch in vitrogereiften DOs nach 29h demethyliert wurde. Die ungleichen Ergebnisse beider Studien
hinsichtlich der Peg1-Demethylierung könnten durch die unterschiedlichen Methoden der
Reifung (in vivo- und in vitro) aber auch durch die verschiedenen Reifungszeiträume erklärt
werden. Die Methylierungsprofile von Peg1/Mest nach 21h (Liang) und 22h (Imamura)
weisen unabhängig von der Art der Reifung einen vollständig methylierten Zustand auf. Die
29 h in vitro-gereiften CEOs in Liangs Studie lassen nur eine leichte Demethylierung
erkennen und deuten damit einen Trend zur Hypomethylierung von Peg1 an, was in Einklang
96
DISKUSSION
mit den 42h in vitro-kultivierten Eizellen in Imamuras Studie steht. Obwohl Peg1/Mest hier
nicht als Kandidatengen untersucht wurde, konnte für das geprägte Gen SNRPN ein
abnormal methyliertes Allel detektiert werden, was einen ähnlichen Trend wie bei
Peg1/Mest in Imamuras Studie wiederspiegelt. Dieses Ergebnis ist nicht zwingend
widersprüchlich zu den Daten von Liang für SNRPN, da für die in vitro-Reifung der
vorliegenden Arbeit ausschließlich Eizellen mit Kumuluszellen (CEOs) verwendet wurden, die
keine Demethylierung bei Liang aufwiesen. Zudem wurden die bovinen Eizellen mit 48 h
länger gealtert als die Eizellen bei Liang mit 29 h, was das Auftreten abnormaler
Methylierung für SNRPN erklären könnte.
4.1.2 DNA-Methylierungsprofile der Promotorregion bDNMT3Ls in unreifen und in vitrogereiften Rindereizellen sowie daraus generierten Rinderembryonen
Die Promotorregion des Stammzell-spezifische Transkript des Gens bDNMT3L (bDNMT3Ls)
wies im Vergleich zu allen anderen untersuchten DNA-Bereichen dieser Arbeit ein auffällig
heterogenes Methylierungsmuster bestehend aus methylierten und unmethylierten CpGs
sowie CpGs mit uneindeutigem Methylierungszustand auf. Die statistische Auswertung des
Auftretens der drei Methylierungszustände an einzelnen CpG-Positionen konnte signifikante
Gruppenunterschiede zwischen den einzelnen Kohorten aufdecken (Abbildung 17).
Die gereiften Eizellen verschiedener Reifungsdauer wiesen keine signifikanten Unterschiede
in bDNMT3Ls auf. In den daraus generierten Embryonen konnte jedoch eine signifikante
Hypomethylierung der Positionen 5 und 7 in der 48h-Gruppe nachgewiesen werden
(Abbildung 17B). Der Vergleich der Gruppen gleicher Kategorie zwischen den Eizellen und
den Embryonen (Eizellen24h vs. Embryonen24h; Eizellen48h vs. Embryonen48h) identifizierte
eine signifikante Hypermethylierung von Position 7, die ausschließlich zwischen den 24hgereiften Eizellen und den entsprechenden Embryonen auftrat. Da die in vitro-Reifung der
Eizellen für 24h die physiologischen Bedingungen simulieren bzw. repräsentieren, lassen
diese Ergebnisse darauf schließen, dass die Hypermethylierung der CpG-Stelle von DNMT3Ls
an Position 7 nach erfolgter Befruchtung einen normalen, physiologischen Zustand darstellt.
Diese Hypermethylierung beim Übergang von der Eizelle zum Embryo trat nicht auf, wenn
die Eizellen eine verlängerte Reifungsdauer von 48h durchliefen. Die verlängerte in vitroMaturation der Oozyte hat somit einen Einfluss auf die physiologischen MethylierungsVeränderungen der CpG-Stelle an Position 7 der Promotorregion von bDNMT3Ls beim
97
DISKUSSION
Übergang von der Eizelle zum Embryo. Eine solche spezifische Veränderung einzelner CpGStellen könnte ein Hinweis auf eine funktionelle Rolle der betreffenden Stelle(n) sein. Eine
Suche nach möglichen Transkriptionsfaktorbindestellen innerhalb der analysierten Sequenz
von DNMT3Ls führte zu einer Bindestelle des „cAMP response element (CRE)-binding
protein“ (CREB) an CpG7 der untersuchten Promotorregion von bDNMT3Ls (Abbildung 17C).
CREB stellt einen entscheidenden Transkriptionsfaktor dar, welcher eine Vielzahl
biologischer Prozesse reguliert mit dem Ziel einer korrekten Zelldifferenzierung und eines
gesunden Zellwachstums [403]. Ursprünglich wurde CREB als Zielprotein des zyklischen AMP
(cAMP) Signalwegs identifiziert. Es wird darüber hinaus von mehreren, verschiedenen
Signalwegen angesteuert, die ihrerseits durch zahlreiche unterschiedliche Stimuli aktiviert
werden [404]. Die Regulation der Expression wird dabei durch die Bindung an ein „cAMP
response element“ (CRE) im Promotorbereich des Gens vermittelt. Dabei bindet der
Transkriptionsfaktor an zwei unterschiedliche Klassen von CREs. Beide Klassen unterscheiden
sich lediglich in der Symmetrie bzw. Asymmetrie des enthaltenen DNA-Motivs CGTCA. Bei
der asymmetrischen Form ist diese Sequenz nur jeweils einmal enthalten, während die
symmetrische Form zwei dieser Motive in palindromischer Anordnung aufweist (TGACGTCA)
[405]. Eine methylierungssensitive Regulation der Expression durch CREB konnte für die
Matrix-Metalloproteinase
(MMP)
13
nachgewiesen
werden.
Indem
CREB
methylierungssensitiv an den Promotor von MMP13 bindet, sobald die CpG-Stelle
unmethyliert vorliegt, wird die Expression des Gens induziert [406]. CREB stellt u.a. ein
essentielles Protein für die Eizelle und die frühe embryonale Entwicklung dar, was in Studien
an Eizellen von Fröschen (Xenopus laevis) und Fischen (Oreochromis niloticus and Clarias
gariepinus) gezeigt wurde [407, 408]. Untersuchungen an Eizellen und Blastozysten von
Xenopus laevis konnten eine essentielle Rolle von maternalem CREB der Eizelle für die
Gastrulation nachweisen [407]. In Oreochromis niloticus konnten drei unterschiedliche
Formen von CREB identifiziert werden. CREB1 und CREB2 konnten dabei neben dem Ovar
auch in anderen Geweben nachgewiesen werden, wohingegen CREB3 ausschließlich im Ovar
und den Follikeln exprimiert wurde. Eine Gonadotropin-induzierte Maturation der Eizelle
führte zu einer Steigerung der Expression sowohl von CREB2 (Faktor 1,5) als auch CREB3
(Faktor 3). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass CREB2 und CREB3 entscheidende
Funktionen während der Reifung von Eizellen ausführen, während CREB1 eine wichtige Rolle
im Wachstum der Oozyte zugeschrieben wird [408]. Clarias gariepinus wies nur eine Form
98
DISKUSSION
von CREB auf. Die Steigerung der Expression durch Gonadotropin lässt jedoch ebenfalls
vermuten, dass der Transkriptionsfaktor eine essentielle Aufgabe während der Maturation
der Eizelle übernimmt [408]. Diese entscheidende Rolle von CREB in der Eizelle sowie die
Fähigkeit zur methylierungssensitiven Regulation der Expression könnten aufgrund der
vorliegenden Methylierungsdaten für CpG7 der analysierten Promotorregion von bDNMT3Ls
auf einen ähnlichen Regulationsmechanismus von bDNMT3Ls in bovinen Eizellen und
Embryonen hinweisen.
Neben den gereiften Eizellen und Embryonen weist CpG7 auch signifikante Unterschiede in
den Methylierungsprofilen der ungereiften Eizellen unterschiedlicher Größe auf. Bei den
unreifen Eizellen unterschiedlicher Größe konnte eine erhöhte Frequenz von CpGs mit
uneindeutigem Methylierungszustand beobachtet werden. Im Gegensatz zu methylierten
und unmethylierten CpGs, zeigte das Auftreten der unklaren CpGs signifikante Unterschiede
an den Positionen 2, 7 und 8 zwischen großen Eizellen (>6mm) und Eizellen der beiden
kleineren Kategorien (<2mm und 3-5mm) (Abbildung 17A). Dies entspricht einem graduellen
Anstieg an CpGs mit uneindeutigem Methylierungszustand an Position 7 mit zunehmender
Oozyten-Größe
(Abbildung
Sangersequenzierung
17A).
Dieser
Methylierungszustand
ist
in
der
durch ein heterozygotes Signal eines Cytosins und Thymins
gekennzeichnet. Empirisch ist bekannt, dass diese Muster selten auftreten. Für gewöhnlich
wurden diese Muster als technische Artefakte interpretiert, da vermutet wurde, dass sie
durch eine unvollständige Bisulfit-Konvertierung oder eine fehlgeschlagene Separation
mehrerer Allele verursacht wurden. Vor dem Hintergrund der Resultate für bDNMT3Ls in in
vitro-gereiften
Eizellen
und
Embryonen
könnten
diese
uneindeutigen
Methylierungszustände an CpG7 in unreifen Eizellen auf eine biologische Ursache hinweisen.
Als eine mögliche physiologische Erklärung für das signifikant erhöhte Auftreten dieser
Signale an spezifischen CpG-Stellen könnte die molekulare Maschinerie darstellen, die für die
epigenetische Regulation verantwortlich ist. Das gemeinhin verwendete Standard-Protokoll
für die Bisulfitsequenzierung enthält zwischen dem Schritt der DNA-Isolierung und der
Zugabe des Bisulfitreagenz einen Schritt zur Entfernung von Proteinen. In den meisten
Protokollen, einschließlich des verwendeten Protokolls, wird dieser Arbeitsschritt durch eine
Behandlung mit Proteinase K durchgeführt. In einer Studie von Warnecke und Kollegen
wurde untersucht, welchen Einfluss Proteine auf die Bisulfitsequenzierung ausüben wenn sie
vor der Bisulfitbehandlung nicht entfernt wurden [376]. Dazu wurde eine Region des GSTP199
DISKUSSION
Promotors in DU145 Zellen mit und ohne Proteinase K Verdau vor der Bisulfitbehandlung
kloniert und sequenziert. Ein Vergleich der Sequenzen beider Behandlungen zeigte sowohl
einen hohen Grad von nicht-CpG-Methylierung als auch eine partielle Konvertierung
beliebiger Cytosin-Nukleotide in Sequenzen, die aus DNA generiert wurde, die nicht mit
Proteinase K behandelt wurde. Dieses extreme Beispiel zeigt, dass Proteine, die an der DNA
gebunden sind, tatsächlich mit dem Bisulfitreagenz interagieren und die Qualität der
Konvertierung beeinflussen. Obwohl bei der Generierung der vorliegenden Daten ein
Proteinase K Vedau durchgeführt wurde und keine nicht-CpG Methylierung beobachtet
werden konnte, liegt die Vermutung nahe, dass die uneindeutigen Signale an spezifischen
CpGs durch Faktoren verursacht werden, die mit der DNA-Methylierung in Verbindung
stehen und nicht ausreichend durch Proteinase K entfernt werden konnten. Der
Methylierungsstatus der CpGs an den Positionen 2, 7 und 8 innerhalb der untersuchten
Region von DNMT3Ls scheinen eine entscheidende Rolle für die Regulation des Gens zu
spielen. Diese Stellen molekularer Aktivität durchlaufen Methylierungs-Veränderungen
während der Entwicklung der unreifen Eizelle. Diese molekulare Aktivität verstärkt sich mit
zunehmender Follikelgröße bzw. Oozytengröße und erreicht sein Maximum in Eizellen aus
Follikeln mit einem Durchmesser >6mm. Als Folge der molekularen Interaktion der DNAMethylierungs-Maschinerie
mit
den
regulatorischen
CpGs
kommt
es
zu
einer
Beeinträchtigung der Bisulfitreaktion, wodurch die unklaren Signale an den betreffenden
CpG-Positionen verursacht werden.
DNMT3L als katalytisch inaktives und navigierendes Coenzym von DNMT3A nimmt eine
zentrale Rolle in DNA-Methylierungsprozessen von Eizellen und frühen embryonalen Zellen
ein. Während für DNMT3A keine signifikanten Unterschiede in der DNA-Methylierung
unreifer und in vitro-gereifter Rindereizellen sowie den daraus generierten Embryonen
identifiziert werden konnten, zeigten sowohl DNMT3Lo als auch DNMT3Ls Veränderungen in
den Methylierungsprofilen der untersuchten Stadien. Diese Ergebnisse könnten ein Hinweis
darauf sein, dass DNMT3L neben der räumlichen Koordination auch einen entscheidenden
Faktor bei der zeitlichen Abfolge der Methylierungsprozesse von der Entwicklung der Eizelle
bis hin zum frühen Embryonalstadium darstellt. Die zeitliche Steuerung dieser Prozesse
erfolgt
dabei
vermutlich
durch
eine
Promotorbereiche
sowie
unterschiedlicher
Steuerungsmechanismen
Kombination
Transkriptionsfaktoren
von
wie
könnte
DNA-Methylierung
CREB.
es
dem
Diese
der
Kombination
komplexen
DNA100
DISKUSSION
Methylierungssystem ermöglichen dynamisch und flexibel auf äußere Störfaktoren vor der
Fertilisation zu reagieren und die Methylierungsprofile des entstehenden Organismus stabil
aufrecht zu erhalten. Die vorliegenden Ergebnisse in vitro-gereifter Eizellen sowie den daraus
erzeugten Embryonen unterstützen diese Theorie. Neben bDNMT3Lo weisen auch die Gene
bZAR1, bOCT4, bDNMT3A, bH19 und bSNRPN keine signifikanten Unterschiede in der DNAMethylierung der beiden untersuchten Gruppen von Embryonen auf. Damit scheint die
abnormale Methylierung von DNMT3Lo in den post-ovulatorisch gealterten Eizellen keinen
Einfluss auf die Methylierungsprofile von DNMT3Lo, ZAR1, OCT4, DNMT3A, H19 und SNRPN
in den resultierenden 4-8-Zell-Embryonen zu haben. Einzig DNMT3Ls zeigt eine abnormale
Veränderung der Methylierung einer potentiellen Transkriptionsfaktorbindetelle in
Embryonen aus post-ovulatorisch gealterten Eizellen. Diese Veränderung könnte als
balancierende Regulation interpretiert werden, um das System an den äußeren Einfluss der
verlängerten Reifung anzupassen und eine stabile Etablierung der DNA-Methylierungsprofile
des Embryos zu gewährleisten.
Ähnliche
Ergebnisse
lieferte
eine
Studie
im
Mausmodell,
in
der
die
DNA-
Mtehylierungsmuster verschiedener Gene (SCP3, DAZL, CDKN1C, IGF2RDMR1, IGF2 DMR1,
OCT4, DNMT3Lo, DNMT3Ls und 4 unterschiedlichen repetitiven Sequenzen) in Embryonen
DNMT3Ls-difizienter Mäuse untersucht wurden [409]. Mit Ausnahme von OCT4 und IGF2R
DMR1 konnten keine signifikanten Unterschiede bzw. nur Unterschiede im E6.5 Stadium
nicht jedoch zum späteren E9.5 Stadium zwischen dem Wildtyp und den DNMT3Lsdifizienten Embryonen gemessen werden. Gleichzeitig beobachtete man eine signifikante
Steigerung der Expression von DNMT3A in E6.5 DNMT3Ls-defizienter Embryonen. Die
Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen war, dass die Expression von DNMT3L nicht
essentiell für die de novo Methylierung im frühen Embryo zu sein scheint und das Fehlen von
DNMT3L durch eine Verstärkte Bildung von DNMT3A ausgeglichen werden könnte [409].
Neben den DNA-Methylierungsdaten der vorliegenden Arbeit wurde zusätzlich als Teil der
Studie die RNA-Expression einiger entwicklungsrelevanter Gene von Mitarbeitern des
Instituts für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Instituts in Mariensee/Hannover bestimmt.
Dabei wurde u.a. eine signifikante Abnahme der Expression von DNMT3A in Embryonen aus
post-ovulatorisch gealterten Eizellen identifiziert, die nicht auf Veränderungen der DNAMethylierung zurückzuführen ist. Obgleich in der vorliegenden Arbeit frühere embryonale
Stadien im Rind untersucht wurden und keine DNMT3Ls-Defizienz vorlag, gleichen sich
101
DISKUSSION
sowohl der Studienentwurf als auch die Ergebnisse in Teilen mit der Studie im Mausmodell.
Als Schlussfolgerung aus beiden Studien lässt sich festhalten, dass die beiden für die
Etablierung der DNA-Methylierung essentiellen Proteine DNMT3A und DNMT3L sowohl
direkt über molekulare Interaktion als auch indirekt über DNA-Methylierung und RNAExpression in einer komplexen Verbindung stehen. Diese Verbindung ermöglicht es dem
biologischen System bei der sensiblen Transition von der Eizelle zum Embryo flexibel auf
äußere Störfaktoren zu reagieren um letztendlich die für das Überleben des Embryos
essentiellen korrekten DNA-Methylierungsmuster stabil zu etablieren.
4.2 DNA-Methylierungsprofile
entwicklungsrelevanter
Gene
in
unreifen
Rindereizellen aus Kühen unterschiedlichen Alters
Der Prozess der Alterung biologischer Systeme ist charakterisiert durch mindestens neun
zelluläre
und
molekulare
Kennzeichen,
einschließlich
genomischer
Instabilität,
Telomerverkürzung, Proteostase und epigenetischen Veränderungen [410]. Während
entscheidende Faktoren der Alterung somatischer Zellen identifiziert wurden, ist wenig über
die reproduktive Alterung bzw. die ovarielle Alterung bekannt. Vergleiche der Erfolgsquoten
nach IVF und Embryonentransfer bei jüngeren und älteren Frauen zeigten ein höheres
Auftreten von Implantationsversagen und Spontanaborten bei älteren Patientinnen [200,
411, 412]. Als Ursache für die Abnahme der weiblichen Fertilität mit steigendem Lebensalter
konnte die Eizellqualität identifiziert werden [195]. Die erhöhte Häufigkeit von Aneuploidien
in Eizellen älterer Frauen (50%) [413, 414] im Vergleich zu Oozyten jüngerer Frauen (20%)
[342] deutet auf eine fehlerhafte Separation der Chromosomen in alternden Ovarien hin
[415, 416]. Ein Nachlassen der Kohäsion könnte für die durch Alterung verursachte,
fehlerhafte Trennung der Chromosomen während der Meiose verantwortlich sein [417-419].
Cohesin beispielsweise als Schlüsselprotein, welches die Separation der Chromosomen
reguliert und für die Stabilisierung der Chiasmata benötigt wird, steht im Verdacht mit dem
Alter auftretende Aneuploidien zu verursachen [420, 421]. Neben einer fehlerhaften
Verteilung der Chromosomen beeinflussen auch apoptotische Prozesse [422-424], die
Veränderung der Telomere [425-427] sowie die Funktion der Mitochondrien [428-434] die
Qualität der Eizelle in alternden Ovarien. In der vorliegenden Arbeit wurde das epigenetische
Profil von 8 entwicklungsrelevanten Genen in bovinen Eizellen untersucht, welche in vivo aus
Spendertieren von drei unterschiedlichen Alterskategorien (9-12 Monate, 3-7 Jahre und >8-
102
DISKUSSION
11 Jahre) gewonnen wurden. Zur Untersuchung altersbedingter Effekte wurde neben den
Genen bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN, die u.a. als Kontrollgene dienten, Promotorbereiche
von Genen analysiert, die Funktionen in der meiotischen Separation der Chromosomen
(bREC8 [349, 350, 352, 419], Bub1 [344-347, 350, 352]), in der Apoptose (Bcl-XL [353-355]),
in der Protektion der Telomere (bTERF2 [334-341]) und der Mitochondrienmembran (bPISD
[356, 357]) übernehmen.
Die Ergebnisse zeigten eine geringe Häufigkeit abnormal methylierter Allele (<1%) ohne
signifikante Unterschiede zwischen den Eizellen unterschiedlicher Altersgruppen. Dies
deutet daraufhin, dass eine abnormale Methylierung eines vollständigen Allels (>50%
abnormal methylierte CpGs) in Rindereizellen der untersuchten Altersspanne für die 8
selektierten Gene ein seltenes Ereignis darstellt. In einer früheren Studie wurden die DNAMethylierung und mRNA-Expression in Eizellen untersucht, welche aus präpubertären
Kälbern und erwachsenen Kühen isoliert wurden. Für die entwicklungsrelevanten, nicht
geprägten Gene SLC2A1, PRDX1 und ZAR1 konnten keine signifikanten Unterschiede
identifiziert werden, während die Methylierung der Satelliten-DNA „bovine testis satellite I“
(BTS) eine signifikante Abnahme mit steigendem Alter der Spendertiere zeigte [362].
Ähnliche Ergebnisse für die globale Methylierung konnten in unterschiedlich alten Eizellen
von Mäusen nachgewiesen werden [207]. In einer Studie von Malhi et al. wurde die
Entwicklungskompetenz boviner Eizellen während der reproduktiven Alterung untersucht
[435]. Dazu wurden die gewonnenen Embryonen sowie die Schwangerschaftsraten von 13
bis 16 Jahre alten Kühen mit denen ihrer 3 bis 6 Jahre jungen Töchter verglichen. Alle Tiere
beider Altersgruppen wurden zu diesem Zweck zunächst einer Superovulation unterzogen.
Die generierten Embryonen wurden anschließend in 2 bis 5 Jahre alte Empfänger-Kühe
transferiert. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte eine geringere Ausbeute an Embryonen
bzw. einen größeren Anteil an unbefruchteten Eizellen bei den Oozyten der älteren Kühe (13
bis 16 Jahre). Keinen Unterschied zwischen alten und jungen Rindern gab es jedoch in den
Schwangerschaftsraten nach dem Morula- bzw. Blastozystenstadium. Erickson et al. konnte
beobachten, dass etwa die Hälfte einer Herde von 14 bis 15 Jahre alten Kühen infertil war
[436] (bei einer durchschnittlichen Lebenserwartung von 20 Jahren [437]). Damit stellen 13
bis 16 Jahre alte Kühe eine Altersgruppe dar, in der die reproduktive Alterung bereits
vorangeschritten ist wodurch die reduzierte Entwicklungskompetenz der Eizellen verursacht
wird. Die ältesten Spender-Kühe der in dieser Arbeit verwendeten Eizellen stehen mit 8-11
103
DISKUSSION
Jahren möglicherweise noch nicht am Ende ihrer reproduktiven Lebenspanne. Die
Untersuchung von Eizellen älterer Spendertiere (>13 Jahre) könnte aufgrund der
fortgeschrittenen reproduktiven Alterung eine erhöhte abnormale DNA-Methylierung
aufzeigen. Betrachtet man jedoch die vorliegenden Methylierungs-Ergebnisse aller Gene
einer Altersgruppe, weisen die Eizellen der ältesten Spendertiere (8-11 Jahre) die höchste
Anzahl abnormal methylierter Allele (n=5) auf, verglichen mit denen der beiden jüngeren
Alterskategorien (jeweils n=2). 2 der 5 abnormal methylierten Allele der Eizellen von 8-11
Jahre alten Kühen traten für das Gen bREC8 auf. Inwiefern bREC8 durch einen
epigenetischen Mechanismus reguliert wird ist bisher nicht bekannt. Die gezeigten
Ergebnisse stellen die ersten DNA-Methylierungsdaten für bREC8 dar und weisen für diese
Promotorregion in bovinen Eizellen einen vollständig methylierten Zustand nach.
Neben bREC8 wiesen ausschließlich bDNMT3Lo und bH19 abnormal methylierte Allele auf.
Für bDNMT3Lo konnte jeweils 1 abnormal methyliertes Allel in der jüngsten und ältesten
Altersgruppe identifiziert werden (9-12 Monate: 1%; 8-11 Jahre: 2%) und 2 aberrant
methylierte DNA-Moleküle in 3-7 Jahre alten Spendertieren (4%). bH19 zeigte 1 abnormales
Allel in Eizellen von jungen Kühen (9-12 Monate: 1%) und 2 aberrante Moleküle in Oozyten
der ältesten Rinder (8-11 Jahre: 3%). Zusätzlich zu abnormal methylierten Allelen traten auch
Einzel-CpG-Fehler in den Genen bREC8, bDNMT3Lo und bH19 sowie bBCL-XL und bSNRPN.
Auffällig dabei ist, dass die drei entwicklungsrelevanten Gene bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN
von abnormalen Veränderungen der DNA-Methylierung betroffen sind. In den anderen 5
untersuchten Genen (bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1) traten hingegen in 3 dieser
5 Regionen weder ein aberrant methyliertes Allel noch ein Einzel-CpG-Fehler auf.
Eine genauere Betrachtung der Funktionen der Kandidatengene lässt erkennen, dass sich die
ausgewählten Gene nach ihrer biologischen Aufgabe grundsätzlich in zwei Gruppen einteilen
lassen. bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN sind primär für die Entwicklung des Embryo
entscheidend,
wohingegen
bTERF2
(telomeric
repeat
binding
factor
2),
bREC8
(meiosespezifische Untereinheit des Cohesin-Komplexes), Bcl-XL (Apoptose-Regulator),
bPISD (Phospholipid Metabolismus) und bBUB1 (Teil des Spindelapparat-Kontrollpunkts)
vorwiegend essentiell für die korrekte Entwicklung der Eizelle sind. Ausgehend von dieser
Gruppierung zeigte statistische Testung eine Tendenz für ein erhöhtes Auftreten abnormal
methylierter Allele (p=0,09) und eine signifikant höhere Häufigkeit von Einzel-CpG-Fehlern
104
DISKUSSION
(p=0,0001) in bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN im Vergleich zu bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD
und bBUB1. Neben dem signifikanten Unterschied in der Häufigkeit von Einzel-CpG-Fehlern
stellt auch das Auftreten von ausgeschlossenen Allelen bedingt durch einen nichteindeutigen Metylierungszustand einzelner CpGs einen signifikanten Unterschied zwischen
den beiden Gruppen von Genen dar (p=0,0001). Die Tatsache, dass die Untersuchungen von
bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN über 10fach mehr Allele generierten, welche ausgeschlossen
werden mussten (12,6%) als die Messungen der anderen 5 Gene (1,2%) könnte theoretisch
auf einen technisch bedingtes Artefakt hindeuten. Ein Vergleich der Häufigkeiten
ausgeschlossener Allele bzw. Allele mit nicht-eindeutigen Metylierungszuständen zwischen
den verschiedenen untersuchten Eizell-Kategorien zeigt jedoch eine deutliche Variation
innerhalb des gleichen Gens für bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN (Follikeln unterschiedlicher
Größe: bDNMT3Lo: 11,4%; bH19: 61,8%; bSNRPN:38,7%; IVM: bDNMT3Lo: 12,3%; bH19
(ohne die letzten beiden CpGs): 4,0%; bSNRPN: 36,1%; Follikeln aus Kühen unterschiedlichen
Alters:
bDNMT3Lo:
5,5%;
bH19:
14,0%;
bSNRPN:
21,75%).
Diese
dynamischen
Veränderungen der Methylierungszustände dieser drei Assays (experimentell definierter
Untersuchungsmethoden) zwischen verschiedenen Entwicklungsstadien von Eizellen
spiegeln eher eine biologische Ursache als ein technisches Artefakt wieder. Betrachtet man
die erhöhte Methylierungsdynamik der Gene (bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN im Vergleich zu
bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1), wären drei unterschiedliche Erklärungen dafür
möglich: (i) bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 werden nicht primär durch DNAMethylierung reguliert und damit nicht beeinflusst. (ii) Die Methylierungsprofile dieser zwei
Gruppen von Genen werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Entwicklung
etabliert. (iii) bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN, als essentielle Gene für die Entwicklung des
Embryo, sind weniger widerstandsfähig gegen Methylierungs-Veränderungen als die
anderen 5 Gene, welche entscheidende Funktionen für die Entwicklung der Eizelle ausüben.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit beinhalten erstmals DNA-Methylierungsdaten für die
Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 in bovinen Eizellen.
Obwohl eine Genregulation durch DNA-Methylierung nur für bTERF2 vermutet wird [341],
lässt sich nicht ausschließen, dass bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 epigenetisch reguliert
werden. Im Gegensatz zu diesen Regionen wird die epigenetische Regulation der zwei
mitunter am umfassendsten untersuchten geprägten Gene bH19 und bSNRPN sowie dem
Eizell-spezifischen Promotor von DNMT3L (DNMT3Lo) in mehreren Studien beschrieben [51,
105
DISKUSSION
323, 324, 332, 409]. Aus Studien in Mäusen ist ebenfalls bekannt, dass die Methylierung
geprägter Gene in unreifen Eizellen in einer Gen-spezifischen zeitlichen Abfolge stattfindet
[438-440]. O’Doherty und Kollegen untersuchten in einer früheren Studie die Etablierung
von DNA-Methylierungsmustern von 5 maternal geprägten Genen (SNRPN, MEST, IGF2R,
PEG10 und PLAGL1) in unreifen bovinen Eizellen unterschiedlicher Größe [398]. Ein
wesentliches Ergebnis dieser Untersuchung war, dass diese Prägungen in einer von der
Eizellgröße abhängigen Form etabliert werden, wobei der Grad der Methylierung mit
zunehmender Oozytengröße ansteigt. Diese genspezifische zeitliche Abfolge zeigt sich durch
unterschiedliche Methylierungsgrade der 5 geprägten Gene innerhalb des gleichen
Entwicklungsstands repräsentiert durch die Oozytengröße. Diese Daten bestätigen die
vorliegenden Ergebnisse, dass bSNRPN und bH19 als geprägte Gene und vermutlich auch das
nicht-geprägte
Gen
bDNMT3Lo
Regionen
darstellen,
welche
dynamischen
Methylierungsveränderungen während der Eizellentwicklung ausgesetzt sind. Diese
Unterschiede in der DNA-Methylierung deuten nicht notwendigerweise auf eine abnormale
Entwicklung hin sondern könnten Variationen der normalen Entwicklung repräsentieren.
Inwiefern bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD und bBUB1 Regionen geringerer MethylierungsAktivität in der Eizelle darstellen, muss durch weitere Studien an unterschiedlichen
Entwicklungsstadien untersucht werden. Diese 5 Gene zeigten jedoch eine signifikant
geringere Anzahl an abnormalen Methylierungsveränderungen als bDNMT3Lo, bH19 und
bSNRPN. Diese Unterschiede lassen die Annahme zu, dass DNA-Regionen, welche
entscheidend für die Entwicklung nach der Fertilisation sind, wie geprägte Gene oder Gene
wie DNMT3L stärker Methylierungsveränderungen unterworfen sind als Gene die primär
essentiell für die Entwicklung der Eizelle sind. Damit könnten Gene, welche entscheidend für
die Entwicklung des Embryos sind, anfälliger bzw. sensitiver für MethylierungsVeränderungen sein als Gene, die Aufgaben bei der Entwicklung der Eizelle selbst
übernehmen.
4.3 Bewertung der Limiting Dilution-Bisulfitsequenzierung zur Untersuchung von
bovinen Eizellen und Embryonen
Die Limiting Dilution-Bisulfitsequenzierung (LD-BS) ist eine Methode zur Sequenzierung
geringer DNA-Mengen auf Einzel-Allel-Ebene bzw. in der Auflösung einzelner DNA-Moleküle.
Dabei verbindet diese Technik die Anwendung der digitalen PCR mit einer Folge aus
106
DISKUSSION
Multiplex-
und
Singelplex-PCR
um
mehrere
Regionen
geringer
Mengen
von
Bisulfit-konvertierter DNA zu untersuchen. Die digitale PCR wurde ursprünglich entwickelt,
um seltene Mutationen innerhalb eines Gemisches von Wildtyp-Sequenzen zu identifizieren
und allelische Imbalancen in Tumorgewebe zu bewerten [380, 441, 442]. Dazu werden
einzelne DNA-Moleküle durch Verdünnung separiert und isoliert, bevor sie individuell durch
PCR amplifiziert werden. Dadurch wird das exponentielle, analoge Signal der
konventionellen PCR in ein lineares, digitales Signal umgewandelt. Dies ermöglicht
statistische Analysen des PCR-Produkts und verbessert gleichzeitig das Signal-RauschVerhältnis der PCR. Da sich im Reaktionsansatz nur ein einzelnes DNA-Molekül als Matrize in
der PCR befindet wird das Risiko einer unspezifischen Bindung der Primer an HintergrundDNA reduziert und die Generierung von Hintergrund-Amplifikaten verhindert bzw. minimiert
[443]. Die unspezifische Bindung der Primer erhöht sich mit abnehmender Komplexität der
DNA-Sequenz. Bisulfit-konvertierte DNA enthält außerhalb von Regionen mit methylierten
Cytosinen nur drei Basen. Aufgrund dieser erhöhten Redundanz stellt die unspezifische
Bindung der Primer eine entscheidende Schwierigkeit bei PCR-basierten Untersuchungen
von Bisulfit-konvertierter DNA dar [443]. Die Analyse der DNA-Methylierung nach erfolgter
Natriumbisulfitbehandlung stellt daher ein ideales Anwendungsgebiet der digitalen PCR dar.
In Kombination mit einer Multiplex- und Singelplex-PCR ermöglicht diese Technik die präzise
Identifizierung unterschiedlicher Epiallele mehrerer DNA-Regionen. Alternative Methode zur
Sequenzierung einzelner Epiallele stellen die klassische Bisulfitsequenzierung nach
vorangegangener Klonierung [444] sowie moderne NGS-basierte Verfahren [445] dar.
Verglichen mit diesen beiden Techniken wird bei der LD-BS die aufwendige Klonierung
vermieden und die klassische Sanger-Sequenzierung bzw. Pyrosequenzierung genutzt. Trotz
Vermeidung der Klonierung stellt die LD-BS verglichen mit NGS-basierten Ansätzen eine
aufwendige Methode dar. So wurden beispielsweise im Rahmen dieser Arbeit etwa 17.520
PCRs durchgeführt um 2343 Allele zu identifizieren (Tabelle 20). Dabei lag die Allel-Ausbeute
(Anzahl identifizierter Allele pro Gen / Anzahl Allele) zwischen 0,05 (<2 mm) und 0,11 (9-12
Monate) bei Eizellen sowie bei 0,12 (24h) und 0,13 (48h) in Embryonen. Die vergleichsweise
geringen
Allel-Ausbeuten
sind
auf
die
starke
DNA-Degradation
während
der
Natriumbisulfitbehandlung in Kombination mit dem hohen Verdünnungsgrad der geringen
DNA-Mengen zurückzuführen [377]. In den Sequenzen Bisulfit-konvertierter DNA treten
CpGs, die nicht methyliert sind, als Thymine auf, wohingegen methylierte CpGs als Cytosine
107
DISKUSSION
bestehen bleiben. Nach der Amplifikation eines einzelnen DNA-Moleküls sollte damit in der
Sequenz nur ein einzelnes Signal für Thymin oder Cytsoin für jedes einzelne CpG zu
detektieren sein. In den identifizierten Allelen wurden jedoch ebenfalls Überlagerungen
beider Signale an CpG-Stellen gemessen. Da man beim Auftreten solcher Messergebnisse
nicht mehr davon ausgehen kann, dass es sich dabei um das PCR-Produkt eines einzelnen
DNA-Moleküls handelt, wurden die betroffenen Allele aus der statistischen Auswertung
ausgeschlossen. Eine mögliche Ursache einer solchen Amplifizierung von mehreren Allelen
könnte eine unzureichende Trennung von DNA-Molekülen sein. Durch ein Verklumpen der
DNA (engl. „DNA-Clumping“) können DNA-Moleküle trotz intensiven Mischens nicht
voneinander getrennt werden. Nach der PCR treten bei der Sequenzierung die überlagerten
Signale der amplifizierten DNA-Moleküle auf. Der Anteil solcher Sequenzen liegt in Eizellen
zwischen 5% (3-7 Jahre, 8-11 Jahre) und 39% (3-5 mm) sowie bei 32% (24h) und 44% (48h) in
Embryonen (Tabelle 20). Insgesamt mussten etwa 19% der detektierten Allele aufgrund von
nicht eindeutigen Messwerten ausgeschlossen werden. Dieser Wert erscheint zunächst
hoch. NGS-basierte Methoden zur Sequenzierung von Bisulfit-behandelter DNA generieren
ebenfalls Sequenzdaten einzelner DNA-Moleküle. Vor der Datenanalyse werden dabei die
Rohdaten des Sequenzierungslaufs zunächst gefiltert. Bei dieser Filterung werden etwa 30%
der Rohdaten von der weiteren Datenanalyse ausgeschlossen (von 14,15 Millionen
generierten Sequenzen wurden 10 Millionen analysiert [445]). Wie hoch dabei der Anteil von
Sequenzen mit heterozygoten Signalen für einzelne CpGs ist, ist nicht bekannt. Dennoch ist
anzunehmen, dass der relative Wert dieser unerwarteten Messwerte bei NGS-basierten
Methoden in einer ähnlichen Größenordnung wie bei der hier angewendeten LD-BS liegt.
Obgleich man mittels NGS eine deutlich höhere Menge an Sequenzdaten in kürzerer Zeit
generieren kann als mit LD-BS, bietet LD-BS die einzigartige Möglichkeit mit vergleichsweise
simpler Methodik einzelne DNA-Moleküle zu amplifizieren und zu sequenzieren. In den im
Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen erwies sich die LD-BS als geeignete
Methode zur Sequenzierung Bisulfit-konvertierter DNA aus bovinen Eizellen und Embryonen.
Insbesondere die hohe Präzision und Reproduzierbarkeit kennzeichnen diese Technik als
zuverlässige Methode zur Untersuchung der DNA-Methylierung geringer DNA-Mengen.
108
DISKUSSION
Tabelle 20: Auflistung unterschiedlicher Daten der untersuchten Proben sowie der durchgeführten Analysen zur
Berwertung der Limiting Dilution-Bisulfitsequenzierung.
Eizellen
Embryonen
Σ
<2
mm
3-5
mm
>6
mm
9-12
Monate
3-7
Jahre
8-11
Jahre
24h
48h
Σ
24h
48h
Σ
Anzahl der
untersuchten
Pools/Embryonen
19
11
8
18
17
15
17
13
118
14
14
28
146
Anzahl der
enthaltenen
Zellen
173
101
69
176
169
132
118
107
1045
64
55
119
1164
Anzahl der
enthaltenen
Allele
692
404
276
704
676
528
472
428
4180
256
220
476
4656
Anzahl der
identifizierten
Allele pro Gen
32.2
27.5
18.0
36.2
43.2
56.1
31.0
43.4
287.5
30.2
29.3
59.5
347.0
Allel-Ausbeute
0.05
0.07
0.07
0.05
0.06
0.11
0.07
0.10
0.07
0.12
0.13
0.13
0.10
Anzahl der
durchgeführten
PCRs
2280
1320
960
2160
2040
1800
2040
1560
14160
1680
1680
3360
17520
Anzahl der
identifizierten
Allele aller Gene
193
165
108
217
259
449
248
347
1986
181
176
357
2343
Ausgeschlossene
Allele
42
(22%)
64
(39%)
41
(38%)
44 (20%)
50
(19%)
30
(7%)
12
(5%)
17
(5%)
300
(15%)
35
(32%)
53
(44%)
88
(38%)
435
(19%)
4.4 Schlussfolgerung und Ausblick
Die Zielsetzung dieser Arbeit war, die bereits bestehenden Erkenntnisse zu DNAMethylierungsprofilen entwicklungsrelevanter Gene während der Entwicklung und Reifung
von Eizellen sowie der Transition zum Embryo zu erweitern. Der Schwerpunkt lag dabei auf
dem Einfluss der postovulatorischen Alterung und der ovariellen Alterung auf die DNAMethylierung der Eizelle. Die gewonnenen Fakten und Analysen dieser Arbeit sollen darüber
hinaus auch als Grundlage zur Optimierung assistierter Reproduktionstechniken in der
humanen Reproduktionsmedizin dienen. Aufgrund der Ähnlichkeit
der bovinen
Follikulogenese und Embryogenese zur humanen Follikel- und Embryonalentwicklung wurde
als Modell für diese Studie das Holstein-Rind (Bos taurus) gewählt.
109
DISKUSSION
Die Daten der vorliegenden Arbeit liefern wichtige Erkenntnisse zum Verständnis von DNAMethylierungsprozessen, die während der Entwicklung der unreifen Eizelle hin zur
befruchtungsfähigen Oozyte ablaufen und die DNA-Methylierung des Embryos beeinflussen.
Die DNA-Methylierungsprofile der untersuchten Gene in unreifen Eizellen aus Kühen
unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre) wiesen keine signifikanten
Unterschiede zwischen den Altersgruppen auf. Die Methylierungsmuster der untersuchten
Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und
bSNRPN wurden damit nicht von der ovariellen Alterung der weiblichen Rinder zwischen 9
Monaten und 11 Jahren beeinträchtigt. In unreifen Eizellen aus Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe (<2 mm, 3-5 mm und >6 mm) zeigten lediglich Oozyten kleiner
Follikel (<2 mm) ein erhöhtes Auftreten abnormal methylierter Allele in den geprägten
Genen bH19 und bSNRPN. Insgesamt stellt sich jedoch in den Eizellen aus unterschiedlich
großen
und
unterschiedlich
alten
Antralfollikeln
eine
stabile
Etablierung
der
Methylierungsprofile der untersuchten Gene dar.
Nach einer simulierten postovulatorischen Alterung durch eine in vitro Reifung für 48h
konnte eine signifikante Hypermethylierung in der Promotorregion des Gens DNMT3Lo in
48h-gereiften Eizellen detektiert werden. Beim Übergang von 48h-gereiften Eizellen zum
Embryo konnte eine signifikante Hypomethylierung von CpG7 des stammzellspezifischen
Transkripts DNMT3Ls beobachtet werden. Diese CpG-Stelle wies ebenfalls einen
signifikanten Anstieg von CpGs mit nicht-eindeutigem Methylierungszustand in unreifen
Eizellen mit steigender Follikelgröße auf und befindet sich innerhalb eines Bindungs-Motivs
des Transkriptionsfaktors CREB.
Durch Studien im Maus-Model wurde bereits gezeigt, dass DNMT3L durch unterschiedliche
Promotoren bzw. Transkripte Oozyten-spezifisch (DNMT3Lo) und Stammzell-spezifisch
(DNMT3Ls) reguliert bzw. exprimiert wird [332]. Die vorliegende Arbeit liefert erstmals
Daten, die einen Zusammenhang zwischen der DNA-Methylierung von DNMT3Lo und
DNMT3Ls in Verbindung mit einer verlängerten Reifungsdauer von Eizellen und den daraus
generierten Embryonen zeigt. Diese dynamisch methylierten DNA-Regionen erlauben dem
entstehenden Organismus möglicherweise flexibel auf äußere Störfaktoren zu reagieren und
eine stabile Etablierung der essentiellen DNA-Methylierungmuster zu gewährleisten. Das
System der DNA-Methylierung stellt sich somit nicht als starrer, strickt regulierter und
110
DISKUSSION
dadurch störungsanfälliger Mechanismus dar, sondern weist eine Fähigkeit zur flexiblen
Anpassung auf, die maßgeblich zur Stabilität des Systems beitragen könnte. Eine
entscheidende Rolle bei dieser Anpassungsfähigkeit in der Eizelle und dem Embryo scheinen
die Gene und Promotoren des katalytisch inaktiven Cofaktors von DNMT3A, DNMT3L
einzunehmen. Das System der DNA-Methylierung scheint sich dabei durch eine
Feinjustierung dieser DNMT3L-Promotoren in einer Art Selbstregulation in Kombination mit
Transkriptionsfaktoren aktiv an die veränderten Umstände anzupassen, um die
Methylierungsmuster
entwicklungsrelevanter
Gene
stabil
zu
etablieren
und
aufrechtzuerhalten. Inwiefern diese Vermutung bzw. Hypothese tatsächlich den realen
Mechanismen in der Zelle bzw. dem Organismus entspricht, müssen
weitere
Untersuchungen aufklären. Zukünftige Studien sollten neben der DNA-Methylierung auch
Transkriptionsfaktoren
und
weitere
epigenetische
Modifikationen
wie
Histon-
Modifikationen und nicht-kodierende RNA in ihren Fokus aufnehmen. Eine der
entscheidenden Herausforderungen bei der Arbeit mit Eizellen und frühen Embryonen stellt
nach wie vor die Analyse des begrenzten Probenmaterials dar. Eine mögliche Lösung dieses
Problems stellen die Einzel-Zell-Untersuchungsmethoden dar, die auf der Sequenzierung der
nächsten Generation (engl. next generation sequencing, NGS) basieren. Mit dieser Technik
ist es bereits möglich eine genomweite Bisulfitsequenzierung von Einzelzellen durchzuführen
[446]. Zukünftig wird diese Methode es jedoch ermöglichen, mehrere integrierte, auf DNASequenzierung basierende Analysen von Einzelzellen zu realisieren [447]. In Anbetracht der
gegenwärtigen rasanten Entwicklung dieser Einzel-Zell-Untersuchungsmethoden werden
vermutlich bald die technischen Voraussetzungen geschaffen sein, um tiefere Einblicke in die
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VERZEICHNISSE
6
Verzeichnisse
6.1 Abkürzungsverzeichnis
6mA
N6-Methyladenin
4mC
N4-Methylcytosin
5mC
5-Methylcytosin
A
Adenin (DNA-Base)
APC
engl. anaphase promoting complex
APS
Adenosinphosphosulfat
AR
Assistierte Reproduktion
ART
Assistierte Reproduktionstechniken
AS
Angelman-Syndrom
ATP
Adenosintriphophat
b
bovin (lat. Rind-/ Rinder-)
Bio-
biotinyliert
bp
Basenpaar(e)
BSA
Bovines Serum-Albumin
BSA-FAF
essentially fatty acid-free BSA
BWS
Beckwith-Wiedmann-Syndrom
bzw.
beziehungsweise
C
Cytosin (DNA-Base)
ca.
circa (etwa, ungefähr)
CEO
engl. cumulus-enclosed oocytes
131
VERZEICHNISSE
CpG
Cytosin-Phosphat-Guanin-Dinukleotid
CTCF
CCCTC-binding factor
DMR
differenziell methylierte Region
DNA
Desoxyribonukleinsäure (engl. desoxyribonucleic acid)
DNMT
DNA-Methyltransferase
DO
engl. denuded oocytes
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
ddNTP
Didesoxyribonukleosidtriphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
engl.
englisch
ET
Embryonentransfer
et al.
et alii (lateinisch: und andere, weitere)
FLI
Friedrich-Löffler-Institut für Nutztiergenetik (Mariensee)
FSH
Follikelstimulierendes Hormon
G
Guanin (DNA-Base)
GIFT
intratubare Gametentransfer
griech.
griechisch
GV
Germinales Vesikel
GVBD
Germinal vesicle breakdown
h
Stunde(n)
HCG
humanes Choriongonadotropin
ICR
Imprinting-Kontroll-Region (engl. Imprinting Control Region)
132
VERZEICHNISSE
ICSI
Intrazytoplasmatische Spermieninjektion
IVF
in vitro-Fertiliation
IVM
in vitro-Maturation
COC
Kumulus-Oozyten-Komplex
LD
Limiting Dilution
LD-BS
Limiting Dilution-Bisulfitsequenzierung
LH
Luteinisierendes Hormon
LOS
Large Offspring Syndrome
MII
Metaphase II
MPF
engl. maturation promoting factor
MS-PCR
methylierunssensitive PCR
ncRNA
nicht-kodierende RNA
OCS
oestrisches Kuhserum
OHSS
ovarielles Hyperstimulationssyndrom
OPU
ultrasound guided ovum pick up (transvaginale Follikelpunktion)
PBS
phosphatgepufferte Salzlösung (engl. phosphate buffered saline)
PCOS
Polyzystisches Ovarialsyndrom
PCR
Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction)
PGC
primordiale Keimzelle (engl. primordial germ cell)
PGF2α
Prostaglandin F2α
PHD
plant-homeo Domäne
PMSG
Pregnant mare serum gonadotropin
133
VERZEICHNISSE
PPi
Pyrophosphat
PVA
Polyvinylalkohol
PWS
Prader-Willi-Syndrom
RNA
Ribonukleinsäure (engl. ribonucleic acid)
rpm
Umdrehungen pro Minute (engl. revolutions per minute)
SAC
engl. spindle assembly checkpoint
SCNT
somatic cell nuclear transfer
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
snoRNA
engl. small nucleolar RNA
SRS
Silver-Russell-Synd
SSW
Schwangerschaftswoche
T
Thymin (DNA-Base)
Taq
Thermus aquaticus
TCM
Tissue Culture Medium
TRIS
Trishydroxymethylaminomethan
u.a.
und andere/ unter anderem
UPD
Uniparentale Disomie
vgl.
vergleiche
Wdh.
Widerholung
ZIFT
intratubare Zygotentransfer
rom
134
VERZEICHNISSE
6.2 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Regulation des geprägten H19/Igf2-Lokus in der Maus. ...................................... 9
Abbildung 2: Epigenetische Reprogrammierung in der Maus. ................................................ 14
Abbildung 3: Follikulogenese. .................................................................................................. 18
Abbildung 4: Schematische Übersicht der bovinen Oogenese, Follikulogenese und
Oozytenmaturation........................................................................................................... 20
Abbildung 5: Übersicht der untersuchten Proben und Gene. ................................................. 37
Abbildung 6: Schematische Darstellung der Promotorregionen des Gensets 1 und Gensets 2.
........................................................................................................................................... 41
Abbildung 7: Bisulfit-vermittelte Deaminierung von Cytosin. ................................................. 51
Abbildung 8: Konvertierung von Cytosin zu Thymin durch eine Natriumbisulfitbehandlung
mit anschließender PCR. ................................................................................................... 52
Abbildung 9: Schematischer Ablauf der Limiting-Dilution-Methode (LD). .............................. 54
Abbildung 10: Enzymatische Reaktionsabfolge der Pyrosequenzierung. ................................ 62
Abbildung 11: Schematische Darstellung des Prinzips der Pyrosequenzierung. ..................... 64
Abbildung 12: Exemplarische Darstellung von Chromatogrammen (Sanger-Sequenzierung,
bDNMT3Ls) und Pyrogrammen (Pyrosequenzierung, bDNMT3Lo) sowie die verwendete
schematische Darstellung der CpG-Stelen........................................................................ 72
Abbildung 13: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bOCT4, bDNMT3A und bDNMT3Lo in unreifen
Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm).
........................................................................................................................................... 74
Abbildung 14: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bH19, bSNRPN, bZAR1, bDNMT3Lo, bDNMT3A und bOCT4 in gereiften
Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). ..................................... 77
135
VERZEICHNISSE
Abbildung 15: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bZAR1, bDNMT3A, bOCT4 und bDNMT3Lo in Embryonen aus gereiften
Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). ..................................... 80
Abbildung 16: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bH19 und bSNRPN in Embryonen aus gereiften Rindereizellen unterschiedlicher
Reifungsdauer (24h und 48h). .......................................................................................... 83
Abbildung 17: Zusammenfassung der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm)(A) und gereiften Rindereizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h) sowie den daraus generierten
Embryonen (B). A/B: ......................................................................................................... 85
Abbildung 18: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bREC8, bPISD, bBUB1, bTERF2 und bBCL-XL in Rindereizellen von Kühen
unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). ................................ 89
Abbildung 19: Ergebnisse der Analyse der DNA-Methylierung für die Promotorregionen der
Gene bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN in Rindereizellen von Kühen unterschiedlichen
Alters (9-12 Monate, 3-7 Jahre und 8-11 Jahre). .............................................................. 90
6.3 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zusammensetzung der hergestellten Puffer. .......................................................... 48
Tabelle 2: Verwendete Kits und Reagenzien............................................................................ 49
Tabelle 3: Verwendete Geräte. ................................................................................................ 49
Tabelle 4: Primer des Gensets 1, die in
der Multiplex-PCR, Singleplex-PCR und
Pyrosequenzierung für die Promotorregionen der Gene, bH19, bSNRPN, bZAR1,
bDNMT3A, bDNMT3Ls, bDNMT3Lo und bOCT4 in Rindereizellen und Rinderembryonen
verwendet wurden............................................................................................................ 56
Tabelle 5: Zusammensetzung der Multiplex-PCR und Singleplex-PCR des Genset 1. ............. 57
136
VERZEICHNISSE
Tabelle 6: Ablauf und Bedingungen der Multiplex-PCR und der Singleplex-PCRs der
untersuchten Regionen des Genset 1. .............................................................................. 58
Tabelle 7: Primer des Gensets 2, die in
der Multiplex-PCR, Singleplex-PCR und
Pyrosequenzierung für die Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD,
bBUB1, bDNMT3Lo, bH19 und bSNRPN in Rindereizellen verwendet wurden. .............. 59
Tabelle 8: Zusammensetzung der Multiplex-PCR und Singleplex-PCR des Genset 2. ............. 60
Tabelle 9: Ablauf und Bedingungen der Multiplex-PCR und der Singleplex-PCRs der
untersuchten Regionen des Genset 2. .............................................................................. 61
Tabelle 10: Ablauf und Bedingungen der Sequenzierreaktion. ............................................... 67
Tabelle 11: Verwendete Computerprogramme und Datenbanken. ........................................ 68
Tabelle 12: Auflistung der Anzahl der untersuchten Eizell-Pools sowie der somatisch
kontaminierten Eizell-Pools. ............................................................................................. 70
Tabelle 13: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bOCT4, bDNMT3A, bDNMT3Lo und bZAR1
in unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm
und >6 mm). ...................................................................................................................... 75
Tabelle 14: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bDNMT3A, bZAR1, bOCT4 und bDNMT3Lo
in gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). ................. 78
Tabelle 15: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregionen der Gene bH19, bSNRPN, bDNMT3A, bZAR1, bOCT4 und bDNMT3Lo
in Embryonen aus gereiften Rindereizellen unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und
48h). .................................................................................................................................. 81
Tabelle 16: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in unreifen Rindereizellen aus Antralfollikeln
unterschiedlicher Größe (>2 mm, 3-5 mm und >6 mm). .................................................. 86
137
VERZEICHNISSE
Tabelle 17: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in gereiften Rindereizellen unterschiedlicher
Reifungsdauer (24h und 48h). .......................................................................................... 86
Tabelle 18: Übersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregion des Gens bDNMT3Ls in Embryonen aus gereiften Rindereizellen
unterschiedlicher Reifungsdauer (24h und 48h). ............................................................. 86
Tabelle 19: Gesamtübersicht der Ergebnisse zur Analyse der DNA-Methylierung für die
Promotorregionen der Gene bTERF2, bREC8, bBCL-XL, bPISD, bBUB1, bDNMT3Lo, bH19
und bSNRPN in Rindereizellen von Kühen unterschiedlichen Alters (9-12 Monate, 3-7
Jahre und 8-11 Jahre). ....................................................................................................... 91
Tabelle 20: Auflistung unterschiedlicher Daten der untersuchten Proben sowie der
durchgeführten Analysen zur Berwertung der Limiting Dilution-Bisulfitsequenzierung.
......................................................................................................................................... 109
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PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE
7
Publikationen und Kongressbeiträge
7.1 Publikationen
Extended in vitro maturation affects gene expression and DNA methylation in bovine
oocytes.
Heinzmann J, Mattern F, Aldag P, Bernal-Ulloa SM, Schneider T, Haaf T, & Niemann H.
Mol Hum Reprod. 2015 Oct;21(10):770-82.
Development of a New Antileishmanial Aziridine-2,3-Dicarboxylate-Based Inhibitor with
High Selectivity for Parasite Cysteine Proteases.
Schad C, Baum U, Frank B, Dietzel U, Mattern F, Gomes C, Ponte-Sucre A, Moll H, Schurigt U,
Schirmeister T.
Antimicrob Agents Chemother. 2015 Nov 23;60(2):797-805.
DNA methylation and mRNA expression of developmentally important genes in bovine
oocytes collected from donors of different age categories.
Mattern F, Herrmann D, Heinzmann J, Hadeler KG, Bernal-Ulloa SM, Haaf T, Niemann H.
Mol Reprod Dev. 2016 Sep;83(9):802-814.
Gene specific profiling of DNA methylation and mRNA expression in bovine oocytes
derived from follicles of different size categories
Mattern F, Heinzmann J, Herrmann D, Lucas-Hahn A, Haaf T, Niemann H.
Reproduction, Fertility and Development. Eingereicht am 19. August 2016.
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PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE
7.2 Kongressbeiträge
Epigenetic and developmental effects of extended in vitro maturation-time in bovine
oocytes.
Mattern F, Heinzmann J, Aldag P, Wrenzycki C, Niemann H, Haaf T.
Conference of the German Society of Human Genetics, Essen, Germany (2014)
Epigenetic determinants of resilience - Implications of positive environmental factors
during pregnancy.
Mattern F, Pliushch G, Post A, Reif A, Haaf T.
Conference of the German Society of Human Genetics, Lübeck, Germany (2016)
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PUBLIKATIONEN UND KONGRESSBEITRÄGE
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Thomas Haaf bedanken, der mir die
Möglichkeit gab, mich im Rahmen meiner Promotion wissenschaftlich zu verwirklichen.
Seine geduldige und großzügige Betreuung erlaubte es mir Projekte eigenverantwortlich zu
entwickeln und in die Realität umzusetzen.
Bei Herrn Prof. Dr. Christian Janzen möchte ich mich recht herzlich für die Übernahme der
Zweitkorrektur als Gutachter der Fakultät für Biologie bedanken.
Besonderer Dank gebührt Dr. Tamara Schneider für das Korrekturlesen meiner Dissertation
und ihre erfahrenen und wichtigen Ratschläge, auf die ich stets zählen konnte.
Bedanken möchte ich mich auch bei Herrn Prof. Dr. Heiner Niemann, Dr. Julia Heinzmann
und Doris Herrmann vom Institut für Nutztiergenetik des Friedrich-Löffler-Instituts (FLI) in
Mariensee/Hannover für die Bereitstellung der bovinen Eizellen sowie Embryonen und die
gute Zusammenarbeit während meiner Promotion.
Des Weiteren danke ich Dr. Eberhard Schneider, Anna Maierhofer und Dr. Nady El Hajj sowie
allen anderen Mitgliedern der Arbeitsgruppe Haaf, auf deren fachlichen Rat ich immer bauen
konnte und die zur guten Stimmung im Labor beitrugen.
Ganz besonders bedanken möchte ich mich aber an dieser Stelle bei meinen Eltern, Helene
und Oleg Mattern, für die finanzielle, aber vor allem moralische Unterstützung während
meiner gesamten Studienzeit. Sowohl biologisch, finanziell und moralisch wäre diese Arbeit
ohne euch nicht möglich gewesen!
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