Überlegungen zu einem möglichen Projekt
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Lebensmittelmikrobiologisches Praktikum SS 2016 (Master Lebensmittelchemie Uni Hohenheim/Uni Stuttgart) Das Pflichtpraktikum wird in der Zeit vom 17.3. – 23.3.2016 ganztags durchgeführt. Es gehört zum 2. Semester (SS2016) Masterstudium Lebensmittelchemie. Kursbeginn ist täglich ab 8:30 mit einer Vorbesprechung im Seminarraum 0.106. Ende in der Regel gegen 17:00. Gelegentlich kann eine Verlängerung, je nach Experiment, erforderlich sein. Kursunterlagen wie z.B. Versuchsvorschriften können Sie mit Ihrem ILIAS-Zugang zum Modul einsehen. Die Studierenden werden in Zweiergruppen arbeiten. Es besteht Anwesenheitspflicht (tägliche Eintragung in Anwesenheitslisten). Der Kurs wird in diesem Rahmen erstmals mit Studierenden durchgeführt; es kann daher gelegentlich zu Abweichungen vom geplanten Ablauf kommen. Wir bitten, dies zu berücksichtigen. Im Folgenden finden Sie die unsere Regeln für den Kurs und die Protokolle, Regeln für sicheres Arbeiten und die theoretischen Grundlagen für die 4 Kursversuche. Die Übersicht über die Versuchsfolge an den einzelnen Versuchstagen und die Durchführungsvorschriften finden Sie ab Fr. 13.3. im ILIAS. Bitte bringen Sie die Versuchsvorschriften mit ins Praktikum und vergessen Sie bitte Ihren Laborkittel nicht! Unsere Regeln: Die erfolgreiche Teilnahme und die Vergabe einer entsprechenden Bescheinigung über das Praktikum hängt auch von der Anerkennung der Versuchsprotokolle durch die jeweiligen Betreuer statt. Dafür gilt: 1. Die Protokolle sind für jeden Versuchsblock abzugeben (bis zum Freitag, 1.4.2016) im Sekretariat des Instituts für Mikrobiologie der Universität Stuttgart oder elektronisch per e-mail an Prof. Sprenger). Protokolle, die später eingehen, gelten als nicht abgegeben (kein Schein)! 2. Die Protokolle werden vom jeweiligen Betreuer innerhalb von 3 Wochen korrigiert und sollen von den Autoren alsbald abgeholt werden. Nicht akzeptierte Protokolle können innerhalb von 6 Wochen nach Praktikumsende maximal zweimal korrigiert 1 werden. Sollten die Protokolle auch dann nicht akzeptiert sein, so gilt das Praktikum als nicht bestanden. Es wird erwartet, dass aus den Protokollen eine angemessene, inhaltliche Auseinandersetzung (Einleitung, Diskussion) mit dem Praktikum hervorgeht. Vorbemerkungen Vorbereitung: Durcharbeiten der Praktikumsvorschrift (Theorie zu den einzelnen Versuchen; Praktikumsversuchsvorschriften werden in der Woche vor dem Kurs im Ilias-System bekannt gegeben) Alle Agarplatten, Röhrchen und Kolben ausreichend beschriften mit: - Gruppennummer; - Versuchsnummer; - Art des Mediums; - Datum Für die Beschriftung den schwarzen EDDING-Stift benutzen, nur diese Beschriftung ist autoklavierfest. Enzymhaltige Zellextrakte, Enzyme und Coenzyme immer im Eisbad (4°C) lagern. Am Schluss eines jeden Arbeitstages Chemikalien zurückstellen und den Platz säubern. Hinweise zur Protokollführung und -gestaltung: Die Protokolle sollen möglichst direkt am Tag der Versuchsdurchführung geschrieben werden. Jeder soll sich vollständig die Messdaten notieren. Jede Gruppe (in der Regel 2 Personen) gibt jeweils ein Protokoll zu einem Versuch ab. Wird das Schreiben der Endfassung innerhalb der Gruppe aufgeteilt, soll der Name desjenigen aufgeführt werden, der für die Endfassung verantwortlich ist. Die Endfassung beinhaltet: - Kurze Erläuterung der Aufgabenstellung (mit Verweis auf die Vorschrift, aber nicht durch Abschreiben von Teilen der Vorschrift !) und der verwendeten Materialien und Methoden - Aufführen der Messergebnisse und Auswertung. Um die Auswertung beurteilen zu können, muss diese immer mit dem Aufführen der Originalmesswerte beginnen, nicht mit bereits abgeleiteten, berechneten Daten. - Diskussion der Ergebnisse. Evtl. Anhang mit Rohdaten. Sinn der anzufertigenden Protokolle ist es, die Ergebnisse von experimentellen Befunden in wissenschaftlicher Form so darzustellen und zu bewerten, dass sie von anderen Personen nachvollzogen werden können. Ferner sollen die Protokolle in 2 einer äußeren Form vorgelegt werden, wie es in wissenschaftlichen Publikationen im Life science Bereich üblich ist. Das bedeutet, dass gewisse formale Kriterien eingehalten werden müssen: - Berichtsstil - Ergebnisse werden in der Vergangenheitsform dargestellt - Lehrbuchwissen wird im Präsens dargestellt Gliederung des Protokolls in o Einleitung (Allg. Thematik, Hintergrund der Versuche, Zielsetzung) o Methoden (Methodik detailliert, so dass von jedem nachvollziehbar) ggf. Abweichung von üblicher Vorgehensweise o Ergebnisse (Ergebnisse im Berichtsstil, ggf. durch Abb. und Tabellen belegen. Aber: die Abb./Tab. ergänzen den Text; sie ersetzen die Nennung der Ergebnisse in eigenen Worten/Sätzen nicht!). Bitte keine Phrasen wie: die Ergebnisse sind wie erwartet; oder, die Ergebnisse sind in Abb.1 dargestellt. o Diskussion (die erhaltenen Ergebnisse sind auf Plausibilität und inhaltliche Bedeutung zu bewerten; hier dürfen – im Gegensatz zum Ergebnisteil–auch Spekulationen gemacht werden; Vergleich mit den Ergebnissen bei anderen Organismen bzw. bei vergleichbaren Fragestellungen o Literatur (vollständige Auflistung aller verwendeten Literatur oder sonstiger Quellen, d. h. alle Autoren mit Initialen, Jahr, Titel des Beitrages, Journal, Volume, Seitenzahl. Dabei bitte beachten: Abbildungen oder Tabellen haben immer (i) eine Überschrift und (ii) eine Legende. Aus der Legende muss ersichtlich sein, was, wie gemessen wurde. Eine Abb./Tabelle sollte immer für sich allein, d. h. auch ohne den begleitenden Text verständlich sein. Schlecht ist aber, wenn bestimmte Protokollteile ganz oder nahezu vollständig fehlen, wenn die Abbildungen nicht für sich verständlich sind. Phrasen wie: „Der Versuch hat gut geklappt“ oder „Die Ergebnisse sind in Abb. 1 zu sehen“ sind unbedingt zu vermeiden. Richtig wäre hier z. B.: „Wie in Abb. 1 dargestellt, weisen 4 der 6 3 untersuchten Proben DNA-Fragmente einer Größe von 10 bis 20 kbp auf. In einer Probe (#5) wurde ein Megaplasmid festgestellt (Größe außerhalb des Bereichs des Standards) und Probe # 6 enthält offenbar keine DNA.“ Bei Abbildungen ist darauf zu achten, dass die Achsen beschriftet sind und die jeweiligen Einheiten angeben sind. Bei Verwendung von verschiedenen Symbolen müssen diese erklärt werden. Selbst Symbole wie „+“ und „-„ müssen erklärt werden. Tabellen sollten immer den aufgenommenen Messwert enthalten (sowie die daraus abgeleiteten Werte, z. B. OD-Werte nach geeigneter Verdünnung, theoretischer ODWert der unverdünnten Suspension) Regeln für sicheres Arbeiten - Die Türen der Arbeitsräume sollen während der Arbeiten geschlossen sein. - In den Arbeitsräumen darf nicht getrunken, gegessen oder geraucht werden. - Im Labor ist Schutzkleidung (Kittel) zu tragen, beim Umgang mit Säuren und Laugen muss eine Schutzbrille getragen werden. - Mundpipettieren ist untersagt. Pipettieren darf nur mit Hilfe von mechanischen oder automatischen Pipettierhilfen durchgeführt werden. - Spritzen und Kanülen sollen nur wenn unbedingt nötig benutzt werden und müssen in besonders gekennzeichneten Gefäßen gesammelt werden. - Die offene Bunsenbrenner-Flamme ist eine sehr ernstzunehmende Quelle für Verletzungen. Die Flamme ist mitunter nur sehr schwer zu erkennen. Verletzungsgefahr besteht z.B. beim Herunterbeugen während des Überimpfens, oder beim Versuch, Kollegen beim Überimpfen zu helfen. Die Flamme soll daher nur während der tatsächlich benötigten Zeit brennen! - Bei allen Manipulationen muss darauf geachtet werden, dass keine vermeidbaren Aerosole oder Stäube auftreten. - Werden biologische Agenzien verschüttet, muss der betroffene Bereich umgehend mit 80% Ethanol dekontaminiert werden. - Nach Beendigung der Arbeit müssen die Hände sorgfältig mit Seife gewaschen werden. - Laborplätze sollen aufgeräumt und sauber gehalten werden. Auf den Arbeitstischen sollen nur die tatsächlich benötigten Geräte und Materialien stehen. 4 - Nach Beendigung der Arbeiten sind die Organismen sachgerecht aufzubewahren (deutliche Beschriftung mit Namen/Gruppennummer, Organismus, Datum) oder in geeigneter Weise zu entsorgen. Mikroorganismen werden vor der Entsorgung durch Autoklavieren abgetötet. Feste Abfälle (Petrischalen, benutzte Einmalhandtücher usw.) werden in Säcke gegeben und autoklaviert, bevor sie in den Müll kommen. Flüssige Abfälle oder Gerätschaften (Gefäße etc.) werden ebenfalls in geeigneten Behältern autoklaviert. Versuch 1: Isolierung von Mikroorganismen aus verschiedenen Lebensmitteln (Prof. Dr. Georg Sprenger, Marcel Wolfer, Emma Guitart Font) Kursziele: Mikroorganismen spielen seit alters her eine wichtige Rolle in der Gewinnung von Lebens- und Genußmitteln. Die Studierenden sollen anhand dreier Beispiele (Hefe aus Weinferment, Edelschimmel aus Käse und Milchsäurebakterien aus Joghurt) Methoden zur Anreicherung und Isolierung von Mikroorganismen kennenlernen. Am Beispiel ausgewählter Versuche sollen danach die einzelnen Mikroorganismen charakterisiert werden. Die pro- bzw. eukaryotischen Mikroorganismen sollen abschließend durch Sequenzierung der ribosomalen rDNA taxonomisch eingeordnet werden. A) Reinzuchthefen aus Weinferment Der eukaryotische Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae (auch Backoder Brauhefe genannt) ist einer der kommerziell bedeutendsten Mikroorganismen in der Erzeugung alkoholischer Getränke und in der Lebensmittelindustrie. Dieser Ascomycet vermehrt sich durch Knospung. Durch seine Eigenschaft Zucker zu CO2 und Ethanol abzubauen, wird S. cerevisiae zur Herstellung von Bier und Wein, sowie als Backtriebmittel (hier ist vor allem die Kohlensäure von Bedeutung) in der Herstellung von Teigwaren eingesetzt. Hefe ist als fakultativer Anaerobier in der Lage Energie durch den Abbau von Kohlenhydraten mit Sauerstoff über die Zellatmung zu gewinnen (aerober Stoffwechsel, hohe ATP-Ausbeute und Zellvermehrung, CO2 und Wasser als Hauptprodukte). Unter Sauerstoffmangel (anaerober Stoffwechsel) wachsen die Hefezellen wenig oder gar nicht und sie bilden durch die Glykolyse Pyruvat, was zunächst zu Acetaldehyd decarboxyliert wird (Enzym: Pyruvat5 Decarboxylase, PDC) und anschließend zu Ethanol reduziert wird (Enzym: AlkoholDehydrogenase, ADH). ADH dient einerseits zur Entgiftung des sehr reaktiven Acetaldehyds, vor allem aber zur Re-Oxidierung von NADH, welches in der Glykolyse entstanden ist (1). Heutzutage werden in der Lebensmittelindustrie hauptsächlich Reinzuchthefen eingesetzt. Diese Stämme sind zumeist auf ihre spezifischen Aufgaben optimiert. So können beispielsweise Brauhefen und die meisten anderen Saccharomyces sp. (z.B. in der Weinherstellung) die Aminosäure L-Lysin nicht als alleinige Stickstoffquelle nutzen (2). In diesem Versuch sollen Reinzuchthefen der Gattung Saccharomyces aus einer Wein-Fermentationsprobe isoliert und näher bestimmt werden. Konventionell können Mikroorganismen unter dem Mikroskop in Kombination mit einfachen Wachstumsversuchen klassifiziert werden. So lassen sich beispielsweise metabolische und physikalische Unterschiede durch das Wachstum auf Selektivmedien nachweisen. Hierbei spielt die Verwertung einzelner Kohlenstoffquellen, die Wachstumstemperatur und der pH-Wert unter aeroben oder anaeroben Bedingungen eine wichtige Rolle. Auch die potentielle Gasbildung ist ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal (Detaillierte Informationen können in entsprechender Fachliteratur nachgelesen werden (z.B. Quelle 2). Für die Isolate soll die Bildung von Ethanol anhand eines enzymatischen Nachweistests (Enzym-Assay mit Alkoholdehydrogenase) überprüft werden. Des Weiteren wird die Bildung von CO2 durch Gasbildung überprüft. Eine genauere taxonomische Zuordnung ausgewählter Isolate erfolgt mittels der 26S-rDNA Analyse. B) Isolierung von Edelschimmel (Penicillium sp.) aus Käse Penicillium („Pinselschimmel“)- Arten gehören zu den Schlauchpilzen. Sie sind für die Bildung zahlreicher antibiotischer Sekundärmetabolite (klassisch: Penicillin) bekannt, sie werden aber auch zur Produktion von Enzymen (z.B. Lipasen, Pektinasen, Amylasen) und wichtigen organischen Säuren (z.B. Zitronensäure) eingesetzt. In der Lebensmittelindustrie werden sie des Weiteren zur Verbesserung des Geschmacks verschiedener Käsesorten (Roquefort-, Camembert, Bayrischer Blauschimmel, Gorgonzola-Käse usw.) sowie für die Schinken- und Wurstherstellung verwendet. Das Ziel dieses Versuchs ist es aus Gorgonzola- und Roquefort-Käse den jeweiligen Edelschimmel zu isolieren und morphologisch zu charakterisieren. Mittels der 26S6 rDNA Analyse sollen die Stämme eindeutig identifiziert werden. Des Weiteren soll eine mögliche Antibiotikabildung der Isolate in einem Agar-Diffusionstest mit geeigneten Bakterienkulturen als Nachweissystem untersucht werden. C) Isolierung von Milchsäurebakterien aus Joghurt Milchsäurebakterien sind Gram-positive kokken- oder stäbchenförmige Bakterien; sie können als Einzelzellen oder z.B. in Ketten (Streptokokken) vorkommen. Sie leben fakultativ anaerob bzw. mikroaerophil (aerotolerant). Sie besiedeln natürlicherweise neben Kohlenhydrat-reichen Substrate wie Pflanzen (siehe auch Sauerkraut-Versuch), Mischfutter und Silage auch die tierischen und menschlichen Schleimhäute sowie ihren Verdauungstrakt. Wie ihr Name besagt bauen sie Kohlenhydrate Hauptstoffwechselprodukt auf ist dem Weg Milchsäure der bzw. Milchsäuregärung Lactat ab. Ihr (homofermentative Milchsäuregärung). Je nach Mikroorganismus werden dabei die D- bzw. die LMilchsäure gebildet; einige Arten bilden neben Milchsäure auch Essigsäure und/oder Ethanol (heterofermentative Milchsäuregärung). Der Mensch nutzt die Leistungen der Milchsäurebakterien (lange Zeit unbewusst) für die Gewinnung „milchsaurer“ Produkte wie Sauerkraut/Kimchi, Pickles, Sauermilch, Sauerteig, Joghurt, Kefir, Magerkäse und sogar von einigen Biersorten (Berliner Weiße) u.v.a.m. Industriell werden Milchsäurebakterien insbesondere in der Herstellung von Milcherzeugnissen genutzt. Die beiden Vertreter Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrückii ssp. bulgaricus sind wichtige Vertreter in der Herstellung von Joghurt. Hierbei führt die Milchsäureproduktion der Organismen zum Absenken des pH-Wertes und in Folge zur Verdickung der Milch und dem typischen Geschmack, Geruch und der Konsistent der Produkte. Um einheitliche Erzeugnisse zu erhalten sind gleichbleibende Bakterienverhältnisse von großer Bedeutung. Joghurt wird immer häufiger als Träger sogenannter probiotischer Mikroorganismen (vom Griechischen „pro bios“ = fürs Leben), welchen eine positive Bedeutung für die Gesundheit nachgesagt wird, verwendet (z.B. Bifidobacterium sp.)(1). Für den „probiotischen Effekt“ welcher nach heutigem Stand bei 10 6 koloniebildenden Einheiten pro Gramm (KFU/g) Joghurt liegt, ist auch hier eine kontinuierliche Kontrolle wichtig (2). Auch die Kontrolle auf Verunreinigungen durch Pathogene (Staphylokokken, Listerien) ist von besonderer Bedeutung. Die hohe 7 Anzahl verschiedener Mikroorganismen welche in einer Probe vorkommen können, erfordert spezielle Nachweisverfahren. Wie in Versuchsteil A und B werden auch hier Selektivmedien für die Isolierung eingesetzt. Details zu den Selektionskriterien und zur Isolierung einzelner Jogurt-Bakterien sind in Quelle 1 bzw. entsprechender Literatur beschrieben. Ziel dieses Versuchs ist es S. thermophilus und L. bulgaricus mit Hilfe selektiver Medien aus einer Joghurt-Probe nachzuweisen und die Lebendkeimzahl zu bestimmen. Die Isolate werden anschließend basierend auf ihren morphologischen und biochemischen Eigenschaften bestimmt. Eine genauere Zuordnung einzelner Isolate erfolgt mittels der 16S rDNA Analyse. Für den Versuch bekommt jede Gruppe eine Joghurt-Probe gestellt. Zusätzlich kann von jeder Gruppe eine zweite (mitgebrachte) Probe analysiert werden. Versuch 2: Anreicherung von Milchsäurebakterien aus Sauerkraut Isolierung von Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum (apl. Prof. Dr. Andreas Stolz, Sibylle Bürger, Erik Eppinger) Ziel: Ähnlich wie in Versuch 1 sollen an einem einfachen Beispiel Anreicherungsstrategien zur Isolierung von Bakterien aus Sauerkraut und das Potential biochemischer und molekularbiologischer Techniken in der Bakterientaxonomie demonstriert werden. Bei der Anreicherung und Isolierung eines Bakteriums aus Mischkulturen, wie sie z.B. in Boden- und Wasserproben vorliegen, versucht man, ein möglichst selektives Minimalmedium zu finden, das nur dem gesuchten Organismus das Wachstum erlaubt oder ihn zumindest gegenüber allen anderen Konkurrenten bevorzugt. Spezifische Faktoren, die man bei der Anreicherung benutzen kann, sind z.B. Energie-, Kohlenstoff- und Stickstoffquelle, H-Akzeptor, Licht, Temperatur und pH. Je extremer die Ansprüche bzw. Verträglichkeiten eines Organismus gegen einen dieser Faktoren sind, desto leichter fällt seine Anreicherung und Isolierung. Milchsäurebakterien vergären Kohlenhydrate auch in Gegenwart von Sauerstoff und bilden hierbei entweder fast ausschließlich Milchsäure (homofermentative Milchsäuregärung) oder Milchsäure und andere Säuren und/oder Alkohole (heterofermentative Milchsäuregärung). Es handelt sich um unbewegliche Grampositive Bakterien, die heutzutage (zusammen u.a. mit Bacillus-Stämmen) zu den Firmicutes gestellt werden. Milchsäurebakterien sind in der Umwelt weit verbreitet 8 und können aus Milch und Milchprodukten, sich zersetzenden Pflanzen, Schleimhäuten von Tieren und Menschen und aus dem Darm isoliert werden. Die meisten Milchsäurebakterien können nicht auf reinen Mineralmedien kultiviert werden und benötigen verschiedene Aminosäuren und Vitamine als Suppline im Medium. Milchsäurebakterien besitzen eine große biotechnologische Bedeutung in der Lebensmittel-Industrie, insbesondere bei der Herstellung von Milchprodukten (z.B. Joghurt, Käse), Rohwürsten (z.B. Salami) und pflanzlichen Produkten (z.B. Sauerkraut). In diesen Prozessen konservieren sie einerseits die Lebensmittel durch die mit der Milchsäure-Bildung verbundene Ansäuerung, beeinflussen durch die Ansäuerung (und die Bildung von extrazellulären Polymeren) aber auch die Konsistenz der Produkte. Außerdem haben die von den Milchsäurebakterien gebildeten Säuren und Alkohole einen großen Einfluss auf den Geschmack der Nahrungsmittel. Neben der Anwendung in der Lebensmittel-Industrie werden Milchsäurebakterien auch großtechnisch für die Produktion von Chemikalien, wie Milchsäure (z.B. zur Synthese von Polylactid) oder Dextran (z.B. zur Synthese von Sephadex) eingesetzt. Die Gattung Leuconostoc umfasst heterofermentative Milchsäure-Bakterien, die Glukose zu äquimolaren Mengen an D-Milchsäure, Ethanol und CO2 vergären. Vertreter dieser Gattung können vielfach von Pflanzen-Materialien isoliert werden. Im mikroskopischen Bild zeigen sie i.A. eher „ovoide“ Formen (keine „echten“ Kokken). Der Gattungsname leitet sich vom griechischen „leukos“ (hell, klar) ab und bezieht sich auf das Aussehen der Kolonien. Beim Wachstum auf dem Disaccharid Saccharose (Rohrzucker) verwerten die meisten Leuconostoc-Arten zunächst primär den Fructose-Anteil des Substrats und polymerisieren den verbleibenden GlucoseAnteil zu dem Polysaccharid Dextran, das primär aus -1,6-glykosidisch verknüpften Glucose-Einheiten besteht, aber häufig auch -1,3-Verzweigungen enthält. Viele Leuconostoc-Stämme Agarplatten bilden beim Wachstum auf Saccharose-enthaltenden große Mengen an Dextran, das dann um die Bakterienkolonien als schleimige Masse für das bloße Auge sichtbar wird. In dem hier beschriebenen Versuchsteil soll der Dextran-bildende Stamm Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum von Pflanzenmaterial isoliert und charakterisiert werden. Literatur: Steinbüchel, A., F.B. Oppermann-Sanio, C. Ewering & M. Pötter. 2013, Mikrobiologisches Praktikum. Versuche und Theorie. 2. Auflage, Springer Spektrum. 9 Versuch 3: Bakteriophagen der Milchsäurebakterien (apl. Prof. Dr. Dieter Jendrossek; Simone Reinhardt, Anna Schweter) Bakteriophagen und ihre Bedeutung in der Lebensmittelindustrie und Medizin Biotechnologie, Unter Bakteriophagen versteht man Viren, die (ausschließlich) Bakterien als Wirte befallen. Bakteriophagen verfügen wie andere Viren auch über keinen eigenständigen Stoffwechsel sondern sind auf den Stoffwechsel ihres Wirtes angewiesen. Bakteriophagen bestehen im Wesentlichen aus nur zwei Komponenten, nämlich ihrer Erbsubstanz (Nukleinsäure: DNA oder RNA!) im Inneren und einer die Nukleinsäure umgebenden Proteinhülle. Die Proteinhülle besteht häufig nur aus (zahlreichen) Kopien von nur einer einzigen (oder wenigen) Proteinsorten, die sich zu einer Proteinhülle (Kapsid) zusammenlagern und zusammen mit der DNA das sogenannte Nukleokapsid morphologische bilden. Besonderheiten Manche (aus Bakteriophagen weiteren Proteinen), enthalten z.B. noch Schwanz- strukturen/Tentakeln, mit deren Hilfe die Bakteriophagen ihre Wirte erkennen und z.B. an spezielle Rezeptorproteine der Zelloberfläche des Wirtes "andocken". Nach der Bindung an den Wirt, erfolgt die Injektion der Bakteriophagen-Nukleinsäure (Phagen-Gene) in die Wirtszelle. Die Phagen-Gene bewirken danach die Umstellung des Stoffwechsels der Wirtszelle auf die Synthese von neuen Phagenpartikeln (d. h. Replikation der Nukleinsäure, Synthese von Hüllproteinen mithilfe der wirtseigenen "Infrastruktur", d.h. mit Hilfe von wirtseigenen Enzymen und Ribosomen). Nach der Synthese der Phagen-Bestandteile erfolgt die Assemblierung dieser Teile zu infektiösen Phagenpartikeln spontan. Durch Zelllyse des Wirtsbakteriums erfolgt dann die Freisetzung der neuen Phagenpartikel und ein neuer Zyklus kann mit der Infektion von weiteren Wirtszellen erfolgen. Die Zeit zwischen der Infektion einer Wirtszelle und der Freisetzung der Tochter-Bakteriophagen beträgt je nach Wirt/Phagenspezies und den Umweltbedingungen (z.B. Temperatur) zwischen ca. 20 min bis wenige Stunden. Nach wenigen Stunden und Bakteriophagen-Zyklen ist die gesamte Bakterienkultur zusammengebrochen und nahezu vollständig lysiert (= lytischer Lebenszyklus). Viele Bakteriophagen haben die Möglichkeit, neben dem oben beschriebenen lytischen Zyklus, also der wiederholten Infektion von Wirtszellen und anschließender Freisetzung der Tochtergeneration von Bakteriophagen, einen sogenannten 10 lysogenen Lebenszyklus einzuschlagen. Dabei erfolgt nach der Infektion der Wirtszelle mit der Einschleusung der Bakteriophagen-Nukleinsäure eine Integration der Phagen-DNA (u.U. nach Überschreibung aus RNA) in das Chromosom der Wirtszelle. Unter diesen Bedingungen erfolgt keine unmittelbare Produktion neuer Phagenpartikel, sondern nur die DNA des Bakteriophagen vermehrt sich im Zuge der Replikation der Bakterien-DNA, d. h. jede Bakterien-Tochterzelle enthält ebenfalls eine Kopie der Phagen-DNA. Der Bakteriophage "schläft" gewissermaßen. Durch plötzliche Veränderung der Umweltbedingungen (z.B. durch Temperaturveränderung) kann der "schlafende Bakteriophage" den lysogenen Zustand verlassen und wieder in den lytischen Zyklus wechseln, d. h. mit der Produktion neuer Phagenpartikel beginnen und die Wirtszelle wenig später unter Freilassung der Tochterphagen durch Zelllyse abtöten. Bakteriophagen sind in der Natur weit verbreitet und können fast alle Arten von Prokaryoten (Bacteria, Archaea) befallen. Sie weisen meist eine recht hohe Wirtsspezifität auf. Bakteriophagen kontrollieren die Zelldichte von Bakterien in vielen Ökosystemen (z.B. in Teichen, Boden). Bakteriophagen stellen auch ein ernstes Problem in der Biotechnologie und Nahrungsmittelindustrie dar, z.B. in biotechnologischen Verfahren, bei denen das gewünschte Produkt durch eine vorangehende exponentielle Vermehrung der beteiligten Mikroorganismen erfolgt (z.B. bei der Herstellung von Glutaminsäure durch Corynebakterium glutamicum, bei der Essigsäureherstellung durch Essigsäurebakterien oder bei der Herstellung von Starterkulturen für die Milchindustrie (Joghurtbakterien)). In solchen biotechnologischen Verfahren kann der Befall der Kultur mit Bakteriophagen rasch zum Totalausfall der Produktion führen. Es kann z.B. bereits ausreichen, wenn die mit (lysogenen) Bakteriophagen befallen Bakterien von nur einer Kuh in die Joghurtproduktion bzw. in die Produktion von Starterkulturen gelangen. Darüber hinaus ist es extrem schwierig, einmal mit Bakteriophagen kontaminierte Industrieanlagen wieder völlig frei von Bakteriophagen zu bekommen. Aus den oben genannten Gründen ist es für die Biotechnologie wichtig, Bakterienkulturen zu entwickeln, die eine hohe Resistenz gegenüber ihren spezifischen Phagen ausweisen (z.B. durch Mutation von Genen für Rezeptorproteine an der Zelloberfläche) und die frei von lysogenen, also im Genom "schlafend" vorhandener, Bakteriophagen sind. 11 Andererseits können Bakteriophagen auch helfen, unerwünschte Keime zu unterdrücken. Es gibt in der Lebensmittelindustrie bereits kommerziell erhältliche Phagenkulturen (z.B. ListShild, Listex P100), die Bakteriophagen gegen in Lebensmitteln häufig vorkommenden Problemkeime verwenden (Listerien [Listeria monocytogenes], z.B. in Rohmilchprodukten). Des Weiteren sind eine Reihe von Bakteriophagen mit Spezifität gegen human-pathogene Bakterien bekannt und wurden bereits zur Behandlung von bakteriellen Infektionen, insbesondere bei Hautinfektionen, erfolgreich eingesetzt. Die Bedeutung von Bakteriophagen zur Infektionsbehandlung wird bei fortschreitender Verbreitung von multi-resistenten Keimen (Bakterien, die gegen viele/alle bekannten Antibiotika resistent sind) in der Zukunft vermutlich zunehmen. Versuch 4: Tryptophanbildung durch Biotransformation mit rekombinanten Escherichia coli -Zellen (Dr. Jung-Won Youn; Erik Eppinger, Emma Guitart Font) Ziel des Versuches Im Rahmen dieses Versuches soll die Bildung einer wirtschaftlich relevanten aromatischen Aminosäure, L-Tryptophan, durch die Biotransformation mit ruhenden, rekombinanten Escherichia coli Zellen beobachtet und untersucht werden. Einleitung: Aminosäureproduktion mit Hilfe von Mikroorganismen Proteinogene Aminosäuren sind Bausteine von Proteinen und bestehen aus mindestens einer Aminogruppe (-NH2) und einer Carboxylgruppe (-COOH). Jedoch werden und können nicht alle Aminosäuren im Menschen (oder Nutztier) selbst hergestellt werden. Diese sogenannten essentiellen Aminosäuren müssen zusätzlich über die Nahrung aufgenommen werden. Die Anwendungsbereiche verschiedener Aminosäuren sind groß. Diese werden sowohl in der Tierfutterindustrie, wie auch in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie eingesetzt (Abb. 1, Tab.1). Die industrielle Herstellung von L-Aminosäuren mit Mikroorganismen hat den entscheidenden Vorteil, dass im Gegensatz zur chemischen Synthese keine Racemate von D-/L- Aminosäuren entstehen. Somit entfällt mit der mikrobiologischen und biotechnologischen Herstellung die komplizierte Aufbereitung der L- Aminosäuren. Diese 20 üblichen Aminosäuren werden aus verschiedenen Zentralstoffwechselwegen abgeleitet. Die Biosynthese der Aminosäuren ist 12 normalerweise streng und auf verschiedenen Ebenen reguliert, so dass von den Zellen keine überschüssigen Aminosäuren gebildet und ausgeschieden werden. Abb1. Anwendungsbereiche von verschiedenen Aminosäuren. (Quelle: (1) Appl Microbiol Biotechnol. 69: 1-8) Tab. 1 Übersicht durch biotechnologischen Verfahren gewonnene Aminosäuren (aus Positionspapier der DECHEMA e.V., 2004, Industrielle Mikrobiologie, 2013 Springer Spektrum R. Takors (Hrsg.)und (2) ), aktualisiert für 2015: G.S. Aminosäuren Mengen [t/a] Anwendung L-Glutamat ca. 2.800.000 Geschmacksverstärker L-Lysin ca. 2.000.000 Futtermittel L-Threonin 430.000 Futtermittel L-Aspartat 13.000 Aspartam Herstellung L-Phenylalanin ca. 30.000 Aspartam, Medizin L-Tryptophan ca. 20.000 Ernährung, Futtermittel L-Arginin 2000 Medizin, Kosmetik L-Cystein 4.000 Pharma, Lebensmittel L-Alanin 1500 Infusionslösungen L-Methionin Biologisch: 400 Infusionslösungen, Chemisch: ca. 600.000 Futtermittel 13 Zu den Regulationsmechanismen in der Aminosäurebiosynthese gehören die Transkriptionsregulation durch Repression (z.B. TrpR-Repressor bei Escherichia coli, Corepressor ist dabei L-Tryptophan), die Regulation auf Translationsebene durch Attenuation (z.B. bei Tryptophan, Histidin, Isoleucin u.a. ) sowie die feedback-Inhibition durch Endprodukte an Schrittmacherenzymen (Eingangsreaktionen) von Biosynthesestrecken (z.B. Aspartat-Familie, aromatische Aminosäuren). Das Interesse an der Aminosäuregewinnung entstand 1908 in Japan mit der Entdeckung, dass Glutaminsäure (bzw. das Salz Mono-Natrium-Glutamat, MSG) als Geschmacksverstärker in Suppen und Speisen wirkt („umami“). Bereits 1909 brachte die Firma Ajinomoto Co. Mono-Natrium-Glutamat (aus Proteinhydrolysaten) auf den japanischen Markt. [Erst vor einigen Jahren wurde entdeckt, dass „umami“ (auf deutsch in etwa „würzig“) die fünfte Geschmacksempfindung der menschlichen Zunge darstellt, neben den lange bekannten süß, sauer, salzig und bitter]. Bereits 1957 wurde bei der Suche nach einem natürlich vorkommenden GlutamatProduzenten bei Screening-Versuchen durch Kinoshita das gram-positive keulenförmige Bakterium Corynebacterium glutamicum isoliert. Heute ist C. glutamicum ein herausragender Organismus für die industrielle Amino- säureproduktion, mit je mehr als 2 Mio Tonnen L-Glutamat bzw. L-Lysin pro Jahr bei steigendem Bedarf. Seit 1958 produziert die Firma Kyowa Hakko Co. mit C. glutamicum (heutiger Name) Glutaminsäure; weitere Firmen wie Ajinomoto, BASF, ADM, CJ Cheiljedang oder Evonik folgten nach. Der große wirtschaftliche Erfolg des Einsatzes von C. glutamicum führte seit ca. 1985 in verstärktem Maße dazu, dass auch andere L-Aminosäuren wie L-Lysin oder LThreonin mit Hilfe genetisch veränderter Bakterienstämme in großem Maße produziert werden. Durch gezielte Stammverbesserungen sind inzwischen auch Escherichia coli-Stämme für die aromatische Aminosäureproduktion, wie LPhenylalanin und L-Tryptophan, entwickelt worden. Das Ziel der Stammoptimierung ist mit Hilfe von gentechnischen Methoden gezielt die Ausbeute zu erhöhen und Nebenprodukte zu minimieren. Tryptophanbildung durch Biotransformation mit E. coli-Zellen L-Tryptophan ((S)-1-Amino-2-Indolylpropionsäure) ist eine proteinogene Aminosäure mit einem aromatischen Strukturanteil (Abb. 2) und ist ein essentieller Bestandteil der 14 Ernährung. Menschen und viele Tiere sind nicht in der Lage Tryptophan selbst zu synthetisieren und müssen es über die Nahrung aus Pflanzen und mikrobiellen Quellen aufnehmen, um neben Proteinen auch andere Verbindungen wie z.B. den Neurotransmitter Serotonin bilden zu können. Daher ist Tryptophan vom großen Interesse als Nahrungsmittelergänzungsmittel. Die industrielle Produktion erfolgt z.B. durch Biotransformation mit ruhenden E. coliZellen aus L-Serin und Indol; dazu wird ein Mutantenstamm mit erhöhter Tryptophansynthase-Aktivität verwendet. Tryptophansynthase ist ein hetero- tetrameres Enzym (zwei α- und zwei β- Untereinheiten, Gene trpA und trpB). Die βUntereinheit der Tryptophansynthase katalysiert den letzten Schritt zum LTryptophan. Tryptophansynthase verbindet in der Biotransformation L-Serin und Indol zu L- Tryptophan (Teilreaktion des Enzyms!); seine Funktion in der Biosynthese ist in Abb. 2 dargestellt. Abb. 2: Reaktion der durch die Tryptophan-Synthase katalysierten Synthese von L-Tryptophan. Indol-3-glycerin-phosphat wird zunächst unter Abspaltung von Glycerinaldehyd-3-phosphat (GAP) zu Indol umgesetzt. Die ß-Untereinheit (TrpB) katalysiert anschließend die Kondensation von Indol und LSerin zu L-Tryptophan. Praktischer Teil Tryptophan-Synthese: Ziel des Praktikumsteils ist mit Hilfe eines rekombinanten E. coli-Stammes Tryptophan durch eine Biotransformation mit Indol und Serin zu produzieren. Die Tryptophansynthase soll für die Umsetzung zunächst überproduziert werden (Überproduktion von Proteinen (TrpAB)). Die ruhenden E. coli-Zellen sollen dann in einer Ganzzell-Biotransformation Indol und Serin zu Tryptophan umsetzen. Die qualitative und quantitative Bestimmung von Indol wird photometrisch mit Kovac´s Reagenz (4-(N,N-Dimethylamino)-benzaldehyd) während der Biotransformation 15 durchgeführt, um den Verbrauch an Indol zu verfolgen. Die quantitative Bestimmung von Tryptophan und ebenfalls Indol erfolgt mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Weiter führende Literatur: 1. Leuchtenberger W, Huthmacher K, Drauz K. 2005. Biotechnological production of amino acids and derivatives: current status and prospects. Appl Microbiol Biot 69:1-8. 2. Rodriguez A, Martinez JA, Flores N, Escalante A, Gosset G, Bolivar F. 2014. Engineering Escherichia coli to overproduce aromatic amino acids and derived compounds. Microbial cell factories 13:126. 3. Takors R (Hrsg.), 2013 Industrielle Mikrobiologie, Springer Spektrum 16
