Versuch VM 6 (Veterinärmedizin) „Mikroskop“
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Fakultät für Physik und Geowissenschaften Physikalisches Grundpraktikum Versuch VM 6 (Veterinärmedizin) „Mikroskop“ Aufgaben 1. Es sind mit einem der beiden Objektive bei jeweils fünf verschiedenen Bildweiten (b) für eine vorgegebene Gegenstandsgröße G vergrößerte Bilder zu messen und der Abbildungsmaßstäbe ob zu ermitteln. Stellen Sie ob in Abhängigkeit von b graphisch dar und bestimmen Sie über den Anstieg der Ausgleichsgeraden die Brennweite des Objektivs. 2. Mit dem Objektiv von Aufgabe 1 ist für einen vorgegebenen Abbildungsmaßstab von ob 5 das auf einem halbtransparenten Schirm erzeugte Bild einer Lochblende mit Hilfe einer Lupe zu vergrößern. Es ist die Lupenvergrößerung in der deutlichen Sehweite s0 = 25 cm durch Vergleichsmessungen zu bestimmen. 3. Es ist mit einem kommerziellen Labormikroskop der Abbildungsmaßstab von zwei Objektiven durch Vergleich von Maßstäben (Objektmikrometer, Okularstrichplatte) zu bestimmen. Messen Sie mit dem Mikroskop den Abstand zwischen den Linien eines optischen Gitters. Literatur Giese, Werner, Kompendium der Physik für Veterinärmediziner, Ferdinand Verlag, Stuttgart 1997, Kap. 12.5, 12.6, 12.7.2 (228-231) U. Haas, Physik für Pharmazeuten und Mediziner, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 6. Auflage, 35.3.2, 35.3.3 Zubehör Optische Bank, Lichtquelle (blaue oder grüne LED, Light Emitting Diode), Kollimator mit Lochblende (Durchmesser 3 mm), 2 Objektive in Drehhalterung, Lupe als Okular mit Vergleichsskala in deutlicher Sehweite, Schirm, Mikroskop mit 2 Objektiven, Objektmikrometer, Okular mit Strichplatte, Vergleichsskala, Messobjekte Schwerpunkte zur Vorbereitung - Strahlengang durch Sammellinse, optische Abbildung, Lupenprinzip - Abbildungsmaßstab und Abbildungsgleichung, Brechkraft einer Linse - Brennweitenbestimmung, Gegenstands- und Bildweitenbestimmung - Definition der Vergrößerung - Aufbau eines Mikroskops, Strahlengang im Mikroskop - Vergrößerung (Lupe, Mikroskop) - Auflösungsvermögen eines Mikroskops 1 Hinweise zu den Grundlagen und zur Versuchsdurchführung Zum prinzipiellen Verständnis des Sehens gehören grundlegende Kenntnisse über die Entstehung von Abbildungen durch Linsen. Die Bikonvexlinse entspricht den Augenlinsen von Menschen und Tieren, wobei Linsenvorderfläche und Linsenrückseite verschieden starke Krümmungen haben. In medizinisch-optischen Geräten findet man überwiegend Linsenkombinationen, die unterschiedliche Vergrößerungen und die Beseitigung von Linsenfehlern (Abbildungsfehlern) ermöglichen. In der medizinischen Praxis finden Endoskopie und Lichtmikroskopie eine breite Anwendung. Ziel dieses Versuches ist es, das Grundprinzip eines Lichtmikroskops (Hellfeldmikroskop) zu vermitteln. Neben dem gewöhnlichen Lichtmikroskop als Hellfeldmikroskop können durch eine Reihe von verschiedenen technisch-optischen Veränderungen weiterführende mikroskopische Beobachtungen ermöglicht werden. Im Falle eines Hellfeldmikroskops sind z. B. bei histologischen Schnitten sog. Amplitudenobjekte sichtbar, d. h., das Licht, das den Schnitt durchdringt, wird dabei an verschiedenen Objektstellen unterschiedlich stark geschwächt und es entstehen mikroskopische Bilder mit Hell-Dunkel-Kontrast. Anders ist es bei Präparaten, welche die Polarisationsebene oder die Phasenlage der Lichtwelle verändern. Das Polarisationsmikroskop erzeugt auch von anisotropen Präparaten, wie z. B. Knochenschliffen, kontrastreiche Bilder. In der medizinischen Forschung sind Zellkulturen unentbehrlich. Lebende Zellen ändern kaum die Amplitude, verschieben aber die Phase der einfallenden Lichtwellen. Je nach Brechungsindex wird sie an verschiedenen Objektstellen unterschiedlich stark verschoben. Die Strukturen lebender Zellen sieht man erst im Phasenkontrastmikroskop gut. Hier wird der Phasenunterschied zwischen nullter Ordnung und gebeugtem Licht durch eine ringförmige Phasenplatte in der hinteren Brennebene des Objektivs so vergrößert, dass er den Verhältnissen beim Amplitudenobjekt entspricht, man also einen Hell-Dunkel-Kontrast beobachtet. Beim Dunkelfeldmikroskop sorgt ein geeigneter Kondensor durch Schrägbeleuchtung des Präparats dafür, dass kein direktes Licht (nullte Ordnung) ins Objektiv gelangt. Nur an Objektstrukturen gebeugtes Licht gelangt in das Objektiv. Kleine Strukturen sind dann auf dunklem Hintergrund hell abgebildet und besonders gut sichtbar. Linsen Linsen sind Körper, die aus einem lichtbrechenden Stoff (i. a. Glas) bestehen und von zwei meist kugelförmigen Flächen begrenzt werden. Die Verbindungslinie der Mittelpunkte dieser Flächen wird als optische Achse bezeichnet. Man unterscheidet zwischen Sammellinsen (Konvexlinsen) und Zerstreuungslinsen (Konkavlinsen). Optische Linsen werden durch ihre Brennweite f charakterisiert. Das sind die Abstände der Brennebenen von den Hauptebenen sowohl auf der Gegenstandsseite als auch auf der Bildseite. Da bei einer Zerstreuungslinse immer ein virtuelles Bild auf der Gegenstandsseite entsteht, wird ihre Brennweite negativ angegeben. Der reziproke Wert der Brennweite ist die Brechkraft D = 1/f [Einheit 1 m-1 = 1 Dioptrie (dpt)]. Ist der Abstand der Hauptebenen h sehr viel kleiner als die Brennweite (h << f), liegen die gegenstands- und die bildseitige Hauptebene aufeinander, und man kann bei der Bildkonstruktion von einer Hauptebene in der Mitte der Linse ausgehen. Dieser Fall ist für die im Versuch verwendeten dünnen Linsen gegeben (Abb. 1). 2 Abb. 1 Schematische Darstellung von dünnen Linsen durch ihre Hauptebene H und die Brennpunkte F bzw. F´. Der Abstand zwischen H und Brennpunkt F bzw. F´ ist die Brennweite a) Sammellinse (reelles Bild, umgekehrt, seitenverkehrt, (1´ ) verkleinert, (2´ ) vergrößert H b) Zerstreuungslinse (virtuelles Bild durch rückwärtige Strahlenverlängerung konstruiert, verkleinert, aufrecht Mit der Änderung der Gegenstandsweite g ändert sich auch der Bildabstand (Bildweite b). Das Verhältnis von Bild- zu Gegenstandsgröße bezeichnet man als Abbildungsmaßstab . Mit Hilfe des B b G g Strahlensatzes erhält man bzw. G B . f b f (1b) 1 1 1 . f g b (2) (1a) Daraus folgt die Abbildungsgleichung Mit den Gln.(1a) und (2) ergeben sich die Beziehungen b f (1 ) (3) und 1 g f 1 . (4) Den Zusammenhang zwischen der Brennweite einer bikonvexen Linse und der Brechzahl n des Linsenmaterials sowie den Radien der zwei gekrümmten Flächen R1 und R2 beschreibt die sog. Linsenmacherformel 1 1 1 , (n 1) f R1 R2 (5) wobei das die Linse umgebende Medium Luft ist (nL 1). Die einfachste Art, einen vergrößerten Gegenstand zu beobachten, besteht darin, diesen näher an das Auge zu bringen, wodurch das Bild des Gegenstandes G auf der Netzhaut größer wird. Für das Auge sind deshalb der Sehwinkel und die scheinbare Objektgröße entscheidend. Die angulare Vergrößerung oder Winkelvergrößerung a eines optischen Instruments ist durch das Verhältnis des Sehwinkels ' mit Instrument zu dem Sehwinkel ohne Instrument bestimmt. Der Sehwinkel entsteht, wenn sich der Gegenstand G in 3 der deutlichen oder konventionellen Sehweite s0 befindet, d. h. das Auge ist 250 mm von G entfernt ' (Abb. 2): . (6) a Als laterale Vergrößerung definiert man tan ' . (7) la tan (a) (b) Abb. 2 Zur Definition der Vergrößerung (a) Sehwinkel ohne Instrument (b) Sehwinkel mit Instrument Lupe Befindet sich bei einer Sammellinse der Gegenstand (Objekt) innerhalb ihrer einfachen Brennweite, so entsteht ein vergrößertes virtuelles Bild und die Linse wirkt als Lupe, deren Brennweite in der Regel einige Zentimeter beträgt. Der Strahlengang ist in Abb. 2b für den Fall angegeben, dass sich das Objekt in der Brennebene der Lupe befindet, d. h. die Gegenstandsweite ist gleich der Brennweite der Lupe (g = fL) und das Bild entsteht im Unendlichen (Bildweite b = ). Die rückwärtige Verlängerung der auf das Auge auftreffenden Strahlen ergibt das vergrößerte virtuelle Bild des Gegenstandes. Das Auge kann in diesem Fall entspannter ohne anstrengendes Akkomodieren (Fernakkomodation) und damit weniger ermüdend sehen. Die Mikroskopokulare (und auch die Fernrohrokulare) haben reine Lupenfunktionen. Die Vergrößerung einer Lupe ergibt in diesem Fall (L,, auch als Normalvergrößerung L,N der Lupe bezeichnet) nach Abb. 2b die Beziehung L,N tan ' G / f s0 . tan G / s0 fL (8) Mikroskop Ein Mikroskop ist ein zweistufiges Abbildungssystem und dient zur Vergrößerung in der Nähe liegender Objekte. Mit einem Objektiv wird ein reelles Zwischenbild eines Objekts erzeugt entsprechend dem Abbildungsmaßstab ob, das mit einem als Lupe wirkenden Okular (Vergrößerung ok) betrachtet wird. Den Abstand zwischen den beiden zugewandten Brennpunkten von Objektiv und Okular nennt man die optische Tubuslänge to des Mikroskops (Abb. 3). 4 Abb. 3 Charakteristische Abstände im Mikroskop Demgegenüber setzt sich die mechanische Tubuslänge tm aus der optischen Tubuslänge to, der Brennweite des Objektives fob und ggf. einem Korrekturabstand lok zusammen: tm= to + fob + lok. Die Größe lok bezeichnet man auch als Abgleichlänge des Okulars. Die Mittelebene des Objektivs stimmt in guter Näherung mit der unteren Tubusanlagefläche überein. Für die Gesamtbrennweite fM des Mikroskops (vereinfacht als Zweilinsen-System betrachtet) gilt: 1 1 1 d . (9) fM fob fok fob fok Hierin ist d der Linsenabstand mit d = to + fob + fok. Bezüglich der Vergrößerung des Mikroskops beobachtet man im Fall der Normalvergrößerung (Abb. 4) mit auf Unendlich akkommodiertem Auge das Zwischenbild, das in der Brennebene des Okulars entsteht. Abb. 4 Strahlenverlauf im Fall der Normalvergrößerung MN=(b=) eines Mikroskops Mit der Bildweite b = to + fob für das Zwischenbild BZ ergibt sich für den Abbildungsmaßstab des Objektivs nach Gl. (3) t b (10) ob 1 o . fob fob Für die Normalvergrößerung MN des Mikroskops erhält man t s MN ob okN o 0 . fob fok (11) Auflösungsvermögen eines Mikroskops Nach der Theorie der geometrischen Optik sollte es möglich sein, bei genügend großen Tubuslängen und kleinen Objektivbrennweiten nach Gl. (11) die Vergrößerung beliebig zu erhöhen. Dem widerspricht jedoch eine Begrenzung des Auflösungsvermögens. Zur Erklärung dieser Erscheinung benötigt man die wellenoptische Theorie über die Interferenz und Beugung des Lichtes. 5 Abb. 5 Zur wellenoptischen Erklärung des Auflösungsvermögens Einfallendes Licht wird an den Strukturen des Gegenstands (Objekt G) gebeugt. In der Brennebene einer Linse (Objektiv O) entsteht durch Interferenz ein Beugungsmuster. Intensitätsmaxima ergeben sich, wenn alle Teilwellen konstruktiv interferieren, d. h., wenn die Phasendifferenz der Wellen benachbarter Strukturen (Abstand d) ein ganzzahliges Vielfaches der Wellenlänge betragen. Das ist d sin für die Bedingung (12) 0, 1, 2,... erfüllt (zwischen G und O ist Luft, n 1 ). Der Beugungswinkel ist umso größer, je kleiner der Abstand d wird. Es müssen mindestens die Teilwellen von zwei benachbarten Beugungsordnungen von der Linse erfasst werden, d. h. der Winkel für die 1. Beugungsordnung darf höchstens gleich dem objektseitigen Öffnungswinkel sein. Damit gilt für den kleinsten auflösbaren Abstand: . (13) dmin sin Der auflösbare Abstand wird kleiner, wenn der Raum zwischen Objekt und Objektiv durch ein Medium mit dem Brechungsindex n 1 ausgefüllt wird (Immersionsmittel), da sich dann die Wellenlänge um den Faktor n verkleinert: dmin n sin (14) A Die Größe A n sin wird als numerische Apertur des Objektivs bezeichnet und ist in der Regel für n = 1 auf dem Objektivgehäuse angegeben. Kennt man die numerische Apertur, kann man mit dem Wert für die mittlere Wellenlänge des Lichtes im sichtbaren Bereich ( = 550 nm) die Größe von dmin abschätzen. Versuchsdurchführung Aufgabe 1: Als Gegenstand (Gegenstandsgröße G) wird eine Lochblende (Durchmesser 3 mm) verwendet, die mit parallelem blauen (grünem) Licht beleuchtet wird. Das Bild (Bildgröße B) entsteht auf einem halbtransparenten Schirm, auf dem sich ein Millimeterraster befindet (Abb. 6). Die Größe des Bildes hängt in charakteristischer Weise nach Gl. (1b) von der Bildweite b (Abstand zwischen Schirm und Hauptebene des Objektivs) ab. Durch das Ausmessen des vergrößerten Durchmessers der Lochblende kann man den Abbildungsmaßstab ob = Bobj/G ermitteln. Die Werte ob sind für 5 verschiedene Bildweiten b zu messen. Mittels einer grafischen Darstellung [b als Funktion von ob dargestellt] findet man aus dem Anstieg S=b/ob der besten Geraden die gesuchte Größe fob gemäß Gl. (3). 6 Abb. 6 Optische Bank (Aufgabe 1) (1) Lichtquelle (blaue oder grüne LED), (2) Kollimator zur Erzeugung von parallelem Licht mit Lochblende als Gegenstand (G = 3 mm Durchmesser) und dünnem Draht zur besseren Scharfeinstellung, (3) Drehhalterung mit zwei Objektiven (A und B), (4) transparenter Schirm, Bobj Bild der Lochblende auf dem Schirm mit Millimeterraster Die Zeiger sind in der Mitte der Zeiss-Reiter montiert. Bei der Messung der Gegenstands- bzw. der Bildweite sind die in der Abbildung angegebenen Korrekturabstände zu berücksichtigen. Aufgabe 2: Der Aufbau der optischen Bank erfolgt analog zu Aufgabe 1. Zusätzlich wird eine Lupe als Okularlinse so angeordnet, dass sich das durch das Objektiv vergrößerte Bild der Lochblende (ob 5, Zwischenbild BZB 15mm) in der Brennweite der Lupe befindet. Abb. 7 Optische Bank für Aufgabe 2 (Draufsicht) (1) Lichtquelle (blaue oder grüne LED), (2) Kollimator zur Erzeugung von parallelem Licht mit Lochblende (3 mm Durchmesser) und dünnem Draht zur besseren Scharfeinstellung, (3) Drehhalterung mit zwei Objektiven (A und B), (4) Schirm (halbtransparent mit Millimeterraster), (5) Lupe (Okular), S Vergleichsskala. 7 Das durch die Lupe vergrößerte (virtuelle) Bild kann nicht auf einem Schirm abgebildet und ausgemessen werden. Zur Bestimmung der Vergrößerung des durch das Objektiv erzeugten Bildes der Lochblende (Zwischenbild BZB 15 mm) auf dem transparenten Schirm mit Hilfe einer Lupe (Okular) werden mit beiden Augen (gleichzeitig) sowohl das vergrößerte Zwischenbild (Abstand zwischen Zwischenbild und Lupe ist gleich der Brennweite der Lupe, Normalvergrößerung) als auch eine Vergleichsskala S (Millimetereinteilung) betrachtet, die sich 250 mm entfernt vom Auge befindet (Abb.7). Sieht man durch geeignete Einstellung der Augen beide Bilder scharf, so ist das die Vergleichsskala beobachtende Auge auf die Entfernung von 250 mm akkommodiert. Durch Größenvergleich geeigneter Skalenabschnitte (xZB, xref; Einheit mm) ist dann die Bestimmung der Vergrößerung der Lupe möglich: x (mm) . (15) L,N ref xZB (mm) Der Größenvergleich ist mehrmals durchzuführen und als Ergebnis wird der Mittelwert angegeben. Aufgabe 3: Die Bestimmung des Abbildungsmaßstabs von Objektiven ob in kommerziellen Mikroskopen erfolgt im Allgemeinen durch Vergleichsmessungen. Dabei wird das vergrößerte Bild (Zwischenbild) eines Objektmikrometers mit der Skala einer sog. Okularstrichplatte (Okularmikrometer) verglichen. Das Objektmikrometer besteht aus einer Glasplatte, auf der sich eine 2 mm lange Skala mit 0,01mm-Einteilung befindet. Die Okularstrichplatte mit einer 5 mm langen Skala und einer Unterteilung in 200 Teilstriche ist in der Brennebene des Okulars befestigt, in der auch das Zwischenbild beobachtet wird. Die beiden Skalen werden bei geeigneter Mikroskopeinstellung scharf abgebildet, so dass der direkte visuelle Vergleich von Skalenabschnitten des Zwischenbildes (dob) und der Skala der Okularstrichplatte in der Zwischenbildebene (dok) und damit die Bestimmung von ob möglich ist: ob= dok / dob. Die Vergleichsmessungen sind für beide Objektive jeweils fünfmal zu wiederholen und als Ergebnis sind die Mittelwerte für ob anzugeben. Abb. 8 Beispiel für den Vergleich zwischen Okularmikrometerskala einer Okularstrichplatte und des vergrößerten Zwischenbildes der Skala eines Objektmikrometers. Die vergrößerte Skala des Objektmikrometers (Zwischenbild) liegt bei der Beobachtung (Scharfeinstellung) mit dem Okular in einer Ebene. Man erkennt, dass bei einer 0,01mm-Einteilung des Objektmikrometers und bei einer 0,025mm-Einteilung der Okularstrichplatte der Abbildungsmaßstab des Objektivs etwa 6,3 beträgt [ob = dok/ dob =(25x0,025mm)/(10x0,01mm) =6,25]. Eine einfache Art der direkten (visuellen) Bestimmung der Vergrößerung eines Mikroskops besteht darin, eine Vergleichsskala mit einem Auge zu beobachten, während das andere Auge das durch das Mikroskop vergrößerte Bild des Objektmikrometers sieht. Wichtig dabei ist, dass das Auge, das die Vergleichsskala abbilden soll, sich im Abstand der deutlichen Sehweite befindet (analog zu Aufgabe 2). Bei einiger Übung kann man die vergrößerte Skala des Objektmikrometers mit der mm-Teilung der Vergleichsskala in Deckung bringen und geeignete Strichabstände (cob, cref) miteinander vergleichen. Mit M,N=cref / cob ergibt sich die Gesamtvergrößerung des Mikroskops. Diese Messungen sollen für eine Objektivlinse mindestens fünfmal durchgeführt werden. Es ist der Mittelwert für M,N 8 als Ergebnis anzugeben. Mit den nun bekannten Vergrößerungen ist die Messung des Linienabstands eines optischen Gitters möglich. Zur Messung des Abstandes zwischen den Linien eines optischen Strichgitters sind die Abstände für 5, 10 und 15 Linien mit der Okularstrichplatte bei Wahl eines Objektivs zu messen. Es ist der Mittelwert für den Abstand zwischen zwei benachbarten hellen bzw. dunklen Linien anzugeben. Zur Erfassung der Messwerte sind die vorgefertigten Tabellen auf den Seiten 8 und 9 zu verwenden. Am Ende des Protokolls sind alle Ergebnisse in einer Zusammenfassung übersichtlich darzustellen. Aufgabe 1: Abbildungsmaßstab einer Objektivlinse ob in Abhängigkeit von der Bildweite b Objektiv : ________ Gegenstandsgröße G = 3 mm Nr. der Messung 1 2 3 4 5 Position Bild: xB (mm) Position Objektivlinse: xob (mm) Bildweite: b (mm) Bildgröße: Bob (mm) ob = Bob/G Aufgabe 2: Normalvergrößerung einer Lupe (Okularlinse), s0 = 250 mm Objektiv: __________ Nr. der Messung 1 2 Gegenstandsgröße G (xZB / mm) Bildgröße B (xref / mm) Vergrößerung L,N = xref / xZB Mittelwert L,N 9 3 4 5 Aufgabe 3: Linearer Abbildungsmaßstab eines Mikroskops ob,M , Okular: x Objektiv : ________ Nr. der Messung 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 dob (mm) dok (mm) ob,M = dok / dob Mittelwert ob,M Objektiv : ________ Nr. der Messung dob (mm) dok (mm) ob,M = dok / dob Mittelwert ob,M Linienabstand aG eines optischen Strichgitters (Abstand zwischen dunklen bzw. hellen Linien) Nr. der Messung Zahl der Linien 1 2 3 5 10 15 dok, i / mm dok,i / ob,M (µm) Mittelwert für den Linienabstand aG Zusammenfassung und Diskussion der Ergebnisse 10 µm
