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Universität Ulm Institut für Mikrobiologie und Immunologie Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Reinhard Marre EINSATZ MOLEKULARER METHODEN ZUR IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG GRAM-NEGATIVER NONFERMENTATIVER STÄBCHENBAKTERIEN VON MUKOVISZIDOSEPATIENTEN DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Juliane Köthe geb. in Düsseldorf 2005 Amtierender Dekan: Prof. Dr.med. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. N. Wellinghausen 2. Berichterstatter: PD Dr. O. Sommerburg Tag der Promotion: 12.07.07 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis .……………………………...………………………………….….. I 1.Einleitung ............................................................................................................................... 1 1.1. Mukoviszidose ............................................................................................................... 1 1.2. Erregerspektrum pulmonaler Infektionen bei Mukoviszidose ....................................... 5 1.3. Mikrobiologische Diagnostik ....................................................................................... 10 1.4. Zielsetzung der Arbeit .................................................................................................. 14 2. Material .............................................................................................................................. 15 2.1. Chemikalien und Reagenzien....................................................................................... 15 2.2. Primer ........................................................................................................................... 17 2.3. Bakterienstämme .......................................................................................................... 17 2.4. Laborbedarf .................................................................................................................. 18 2.5. Kits ............................................................................................................................... 18 2.6. Geräte ........................................................................................................................... 19 2.7. Software ....................................................................................................................... 20 3. Methodik ............................................................................................................................ 21 3.1. Bakterienisolate von Mukoviszidosepatienten............................................................. 21 3.2. Bakterienkultur............................................................................................................. 22 3.3. Beurteilung der Morphologie der Bakterien ................................................................ 22 3.3.1. Koloniemorphologie.............................................................................................. 22 3.3.2. Prüfung des Wachstumsverhaltens bei 42 °C ....................................................... 22 3.4. Biochemische Identifizierung der Bakterien................................................................ 23 3.4.1. Oxidase-Test.......................................................................................................... 23 3.4.2. Api 20 NE.............................................................................................................. 24 3.5. Resistenztestung ........................................................................................................... 25 3.6. Molekularbiologische Identifizierung der Bakterien ................................................... 26 3.6.1. Isolierung von bakterieller DNA........................................................................... 27 3.6.2. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ..................................................................... 28 3.6.3. Agarosegelelektrophorese ..................................................................................... 29 3.6.4. DNA-Sequenzierung ............................................................................................. 30 3.6.5. Sequenzierung des RecA-Gens von Burkholderia cepacia Komplex ................... 34 3.7. Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) ............................................................................... 35 4. Ergebnisse .......................................................................................................................... 38 4.1. Identifizierung der Bakterienisolate .............................................................................. 38 4.1.1. Konventionelle Identifizierung der Bakterien....................................................... 39 4.1.2. Molekularbiologische Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung .... 41 4.1.3. Vergleich von konventioneller und molekularbiologischer Identifizierung ......... 42 4.2. Betrachtung ausgewählter Spezies ............................................................................... 46 4.2.1. Comamonas testosteroni und Pseudomonas alcaligenes...................................... 47 4.2.2. Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi .................................... 47 4.2.3. Inquilinus limosus ................................................................................................. 50 4.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung ............................................. 51 4.3.1. Achromobacter xylosoxidans ................................................................................ 51 4.3.2. Burkholderia cepacia Komplex ............................................................................ 55 4.3.3. Pseudomonas aeruginosa...................................................................................... 58 5. Diskussion .......................................................................................................................... 62 5.1. Identifizierung der Bakterienisolate ............................................................................. 62 5.2. Betrachtung ausgewählter Spezies ............................................................................... 68 5.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung ............................................. 71 5.4. Ausblick ....................................................................................................................... 76 6. Zusammenfassung............................................................................................................. 78 7. Literaturverzeichnis.......................................................................................................... 79 8. Danksagung........................................................................................................................ 93 9. Lebenslauf .......................................................................................................................... 94 Abkürzungsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis: A. Achromobacter Abb. Abbildung ADH Arginindihydrolase ATCC American Type Culture Collection Aqua bidest. Aqua bidestilliert B. Burkholderia bp Basenpaare BSA Bovines Seum Albumin ca. circa CF Zystische Fibrose, Mukoviszidose CFBP Collection Française de Bactéries Phytopathogènes CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator CFU Colony Forming Units, Kolonie-bildende Einheiten DIN EN ISO Deutsche Industrienorm Europäische Norm International Organisation for Standardisation DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleosidtriphosphate DSM Deutsche Sammlung von Mikroorganismen DTT Dithiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure Fa. Firma FISH Fluoreszenz in situ Hybridisierung ggf. gegebenenfalls GLU Glucose HCl Salzsäure HHD Hemmhof-Durchmesser H2O2 Wasserstoffperoxid IAM Institute of Applied Microbiology, University of Tokyo J. Jahre Kap. Kapitel kb Kilobasen Abkürzungsverzeichnis II kbp Kilobasenpaare LMG Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent MgCl2 Magnesiumchlorid Na Natrium NaCl Natriumchlorid NaOH Natriumhydroxid NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards Nr. Nummer P. Pseudomonas PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PFGE Pulsfeldgelelektrophorese RecA Recombination A rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur SDS Sodiumdodecylsulfat s. siehe sog. sogenannte, sogenanntes sp./spp. Spezies (Singular/Plural) ssp. Subspezies s.u. siehe unten Tab. Tabelle TBE Tris-Borat-EDTA TE Tris-EDTA TMPD Tetramethyl-p-phenylendiamin-Dichlorid Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U/min Umdrehungen pro Minute URE Urease UV Ultraviolett Für sämtliche physikalische Einheiten wurden die international anerkannten Abkürzungen verwendet. Einleitung 1 1.Einleitung 1.1. Mukoviszidose Die Geschichte der Mukoviszidose oder zystischen Fibrose (CF) lässt sich sehr lange zurückverfolgen. Bereits im 17. Jahrhundert war bekannt, dass Neugeborene, deren Haut beim Küssen salzig schmeckt, früh versterben. Auch andere anekdotische Schilderungen typischer Mukoviszidose-Symptome sind aus dem Mittelalter überliefert. Aus modernen Mutationsfrequenzanalysen schließt man heute, dass erste Mutationen bereits 40000 v. Chr. auftraten (25). Heutzutage ist die Mukoviszidose mit einer Häufigkeit von 1:2000 Lebendgeborenen die häufigste erbliche Stoffwechselerkrankung in Deutschland (101). Sie wird autosomal-rezessiv vererbt, wobei heterozygote Merkmalträger nicht erkranken. Die Häufigkeit der heterozygoten, gesunden Merkmalträger beträgt in Europa 1:20 bis 1:30 (122). Genetik Die Erkrankung wird durch Mutationen in einem bestimmten Gen ausgelöst. Die Entdeckung und Lokalisation dieses Zystische Fibrose (CF)-Gens im Jahre 1989 war ein bedeutender Fortschritt im Kenntnissstand über Mukoviszidose (10; 48; 78) und lässt seither auf Ansätze kausaler Therapien hoffen. Der Gendefekt des CF-Gens liegt bei 70 % der betroffenen Mitteleuropäer in der Mutation ∆F508 auf dem langen Arm des Chromosoms 7 (41). Diese Mutation führt zur Deletion der Aminosäure Phenylalanin. Insgesamt sind über 1300 weitere Mutationen im CF-Gen bekannt, welche allesamt zu einem defekten Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR)-Protein führen. Dieses entspricht funktionell einem Ionenkanal für den Transport von Chlorid- und BicarbonatIonen in der Zellmembran sekretorischer Drüsen. Zudem werden dem CFTR-Protein in der Literatur kontrovers diskutierte weitere Funktionen, wie z. B. die Regulation des Membranlipidstoffwechsels, die Regulation des intrazellulären Membrantransports, die Regulation der Aktivität anderer Ionenkanäle und die Bindung von Pseudomonas aeruginosa und anderen Bakterien, zugeschrieben (122). Pathophysiologie Als Resultat der verminderten Chloridpermeabilität der Zellmembranen ergibt sich eine pathologische Zusammensetzung der Sekrete verschiedener exokriner Drüsen und Organe, wie Lunge, Bauchspeicheldrüse, Darm, Leber und Gallenwege (89). Die zähflüssigen, hyperviskösen Sekrete führen zur Sekretretention und zur Obstruktion der Drüsen- Einleitung 2 ausführungsgänge der entsprechenden Organe. Infolgedessen zeigt sich die Mukoviszidose als Multiorgankrankheit mit einem breiten Symptomkomplex (100). Klinisches Bild der Mukoviszidose Das Krankheitsbild der Mukoviszidose erstreckt sich von sehr milder Symptomatik bis hin zu schweren Verläufen. Betroffene Neugeborene fallen in ca. 10 % der Fälle bei der Geburt durch Mekoniumileus auf (10; 74). Das typische Erscheinungsbild der Mukoviszidose ist eine Kombination von Symptomen aus den beiden hauptsächlich betroffenen Organsystemen, der Lunge und dem Gastrointestinaltrakt. Es manifestiert sich zum Teil jedoch erst nach Monaten bis Jahren (74; 100). Die gastrointestinale Symptomatik ist gekennzeichnet durch übelriechende, voluminöse Fettstühle, Bauchschmerzen, Blähungen und ein aufgetriebenes Abdomen. Langfristig führt die chronische Maldigestion und Malabsorption zu Gedeihstörungen und Entwicklungsverzögerung mit Minderwuchs und Gewichtsverlust. Die pulmonale Symptomatik geht mit Dyspnoe und quälendem Husten, der anfangs häufig mit Keuchhusten verwechselt wird, einher (100). Der hochvisköse Schleim führt durch verstärkte Haftung an den Bronchialwänden zu einer verminderten Selbstreinigungsfunktion der Alveolen durch die Zilien (mukoziliäre Clearance) und senkt die Effizienz der Hustenclearance (47). Dadurch kommt es zur Obstruktion der kleineren Atemwege durch angestauten Schleim (Mukostase) und zu chronischen Entzündungen, die eine Zerstörung der Bronchien mit Umbau des Lungengewebes nach sich ziehen. Aus der fortschreitenden Destruktion der Bronchien resultiert ein Stabilitätsverlust der Bronchialwände, der einen Bronchialkollaps begünstigt. Zusätzlich leiden Mukoviszidose-Patienten gehäuft unter Infektionen des Respirationstraktes. Rezidivierende bakterielle Bronchitiden und Pneumonien führen zum Untergang körpereigener Leukozyten und Epithelzellen und somit zur DNA-Freisetzung aus den Zellkernen dieser Zellen. Außerdem kommt es zu einer verstärkten Produktion von Elastase aus neutrophilen Granulozyten. Der steigende DNAGehalt und die vermehrte Elastase bedingen eine Steigerung der ohnehin schon erhöhten Viskoelastizität der respiratorischen Sekrete (47). Dies ist für eine zusätzliche Steigerung des Infektionsrisikos verantwortlich. Letztendlich führt dieser Circulus vitiosus von Sekretretention, Infektion und Lungenschädigung zu einer respiratorischen Insuffizienz mit pulmonaler Hypertonie und Rechtsherzdekompensation. Dies ist die Hauptursache der verminderten Lebenserwartung von Mukoviszidose-Patienten. Häufige bakterielle Erreger der pulmonalen Infektionen sind u.a. Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, Einleitung 3 Stenotrophomas maltophilia, B. cepacia Komplex und P. aeruginosa (s. u.), wobei insbesondere P. aeruginosa und der B. cepacia Komplex mit einer starken Beeinträchtigung der Lungenfunktion einhergehen. Diagnostik Die Diagnose Mukoviszidose wird meist schon früh durch das klinische Bild der Kinder gestellt. Ausschlaggebend ist hierbei die typische Kombination von gastrointestinaler und pulmonaler Symptomatik sowie der Gedeihstörung. Der diagnostische Standardtest ist der Schweißtest (Iontophorese) (100). Bei den an Mukoviszidose erkrankten Personen steigt der Natrium- und Chloridgehalt nach Pilocarpin-Stimulation auf über 60 mval pro Liter Schweiß an (74; 78; 100), wobei der Bestimmung des Chloridgehaltes aus dem gewonnenen Schweiß eine verlässlichere Aussagekraft zugesprochen wird. Hierbei sind Werte ab 30 mval/l bereits grenzwertig und Werte ab 40 mval/l bereits positiv. Interessanterweise korreliert die Höhe der Elektrolyte nicht mit Schwere oder Prognose der Erkrankung. Bei positivem Schweißtest erfolgt die Diagnosesicherung, falls möglich, durch den genetischen Nachweis der CF-Mutation (41). Eine weitere Nachweismethode, jedoch funktioneller Art, stellt die Stimulation der Chloridsekretion aus Rektumschleimhaut-Biopsaten in der Ussing-Kammer dar (52; 83). Therapie Die Therapie der Mukoviszidose orientiert sich am Grad der Organbeteiligung. Pankreasinsuffiziente Patienten (ca. 90% aller Patienten) müssen die fehlenden Enzyme substituieren. Gleichzeitig werden fettlösliche Vitamine verabreicht, um entsprechenden Mangelsituationen vorzubeugen. In Abhängigkeit vom Grad der Maldigestion weisen eine Reihe von Patienten eine Gedeihstörung auf. Bei diesen gehört auch eine spezielle hochkalorische Ernährung zur Basistherapie. Bei den meisten Mukoviszidosepatienten ist jedoch die Lungenbeteiligung lebenslimitierend. Um hier vorzubeugen, wird in Deutschland empfohlen, mehrmals tägliche Inhalationen mit Mukolytika (NaCl 0,9% oder höher) durchzuführen. Auch bronchodilatatorische Medikamente (β2-Sympathomimetika und Anticholinergika) sind Teil der medikamentösen Behandlung der pulmonalen Symptomatik bei Mukoviszidosepatienten (41). In jedem Fall besitzt die Physiotherapie einen großen Stellenwert im komplexen, zeitaufwändigen Behandlungsprogramm von Mukoviszidosepatienten. Ziele der Physiotherapie sind die Sekretmobilisation und -drainage sowie die Kräftigung der Atemmuskulatur. Hierbei werden sowohl passive Techniken wie z. B. bestimmte Einleitung 4 Lagerungen als auch aktive Techniken wie z. B. Vibrationen oder bestimmte Hustentechniken angewandt (47; 106). Zur Therapie der bakteriellen Infektionen des Respirationstraktes ist eine gezielte antibiotische Behandlung notwendig. Die Wahl des geeigneten Antibiotikums erfolgt entsprechend dem Antibiogramm des Erregers. Bei chronischen Infektionen, z. B. mit Pseudomonas aeruginosa und Burkholderia cepacia Komplex, werden antibiotische Intervalltherapien durchgeführt. Gewöhnlich werden dabei Kombinationstherapien aus zwei oder drei Antibiotika bevorzugt (78). Um bakterielle Infektionen rechtzeitig erkennen und behandeln zu können, sollten sich die Patienten kontinuierlich in Spezialambulanzen für Mukoviszidose betreuen lassen. Hier wird routinemäßig alle acht bis zwölf Wochen, bei akuten Infekten oder respiratorischer Verschlechterung eine Untersuchung des Sputums oder eines Rachenabstrichs zum Nachweis pathogener Bakterien und Pilze durchgeführt. Die einzige kausale Therapie der Mukoviszidose ist die Gentherapie. Als sogenannte Vektoren, d. h. als Transportmittel für das gesunde Gen in die Epithelzellen der Atemwege, eignen sich beispielsweise Adenoviren oder Lentiviren, aber auch nicht-virale Genfähren (10). Die ersten klinischen Studien zur Gentherapie wurden vier Jahre nach der Entdeckung des CFTR-Gens 1989 begonnen (48). Trotz anfangs ermutigender Ergebnisse beim ersten Versuch des Gentransfers in Nasenepithelzellen mittels Adenoviren zeigte sich der Gentransfer bei wiederholter Anwendung in den unteren Atemwegen wirkungslos (48; 59). Neben allgemeinen Problemen des Transfers von Genmaterial in Zellen der Lunge kommt speziell bei CF-Patienten folgendes Problem erschwerend hinzu: sowohl der zähe Schleim als auch die chronischen Entzündungen und die Kolonisation mit Bakterien stellen zusätzliche Barrieren für die Genfähren dar (43). Es wurden zahlreiche Studien sowohl am Tiermodell als auch an Patienten durchgeführt, aber bislang blieb der erhoffte Erfolg aus. Prognose Die Prognose und der klinische Verlauf der Erkrankung werden wesentlich durch pulmonale Infektionen bestimmt (s.u.). In den letzten Jahren konnten die Lebenserwartung und die Lebensqualität von Mukoviszidosepatienten kontinuierlich gesteigert werden. Dies lässt sich sowohl auf gute Betreuungskonzepte in Mukoviszidose-Ambulanzen als auch auf neue Kenntnisse über intensivierte Therapiemöglichkeiten sowie die Verwendung optimierter Antibiotika zurückführen. Einleitung 5 Abb. 1: Altersentwicklung der verstorbenen Mukoviszidosepatienten von 1968 bis 1995, nach Elborn et al. (34), S. 883 Gemäß Abb. 1 starben im Jahr 1968 die Mehrheit mukoviszidosekranker Kinder, bevor sie das Schulalter erreichten. Im Jahr 1996 lag die mittlere Überlebenszeit bereits bei 30 Jahren. Für heute geborene Kinder wird eine Lebenserwartung von 45 - 50 Jahren prognostiziert (26). 1.2. Erregerspektrum pulmonaler Infektionen bei Mukoviszidose Die chronischen bakteriellen Lungeninfektionen und die daraus resultierende pulmonale Insuffizienz sind bei 95 % der Mukoviszidosepatienten die Haupttodesursache (22; 67). Verursacher chronischer bakterieller Infektionen sind insbesondere Staphylococcus aureus, Haemophilus influenzae, P. aeruginosa und B. cepacia Komplex (67; 78; 89). Die Häufigkeitsverteilung dieser Erreger korreliert dabei mit dem Alter der Patienten (s. Abb. 2) (41). Infektionen mit Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae werden oft bereits im Säuglings- und Kleinkindalter erworben. Ab dem Schulkindalter steigt die Besiedlungsrate mit P. aeruginosa stark an. B. cepacia Komplex wird am häufigsten bei erwachsenen Patienten isoliert. In Bezug auf die Verschlechterung der pulmonalen Funktion spielen P. aeruginosa und B. cepacia Komplex die bedeutendste Rolle (22; 35; 41; 51; 68; 123). Eine Infektion mit P. aerginosa gilt als wichtigster Risikofaktor für Erkrankung und Tod von Mukoviszidosepatienten (54). Einleitung 6 Abb. 2: Altersspezifische Prävalenz von verschiedenen Erregern bei Lungeninfektionen von Mukoviszidosepatienten aus den USA, nach Gibson et. al (41) , S. 925 Pseudomonas aeruginosa P. aeruginosa ist ein gram-negatives, Oxidase-positives Stäbchenbakterium (61). Es gehört zur Gruppe der Nonfermenter, d. h. es ist nicht in der Lage, Glukose zur Energiegewinnung zu fermentieren. Charakteristische Merkmale von P. aeruginosa sind ein aromatischer Lindenblütengeruch, ein metallischer Glanz und die Bildung von blaugrünen bis gelbgrünen Pigmenten, die durch Pyocyanin und Fluorescein entstehen (64). P. aeruginosa kommt in der Umwelt ubiquitär in feuchtem Milieu vor. Potentielle Infektionsquellen für den Menschen sind u. a. Aerosole aus Wasserhähnen, Waschbecken, Toiletten, Duschen, Klimaanlagen und Inhalationsgeräten (61). Aufgrund dieses weit verbreiteten Vorkommens infizieren sich die meisten Mukoviszidosepatienten im Laufe ihres Lebens mit P. aeruginosa (41). Durch dessen Neigung zu Adhäsion und Kolonisation auf vorgeschädigter Schleimhaut persistiert P. aeruginosa nach Erstinfektion meist in der Lunge. In der USA sind 81 % aller 26- bis 30-jährigen Patienten mit P. aeruginosa infiziert (22). Einleitung 7 Zahlreiche Studien zeigen, dass eine chronische Infektion mit P. aeruginosa mit einer signifikanten Verschlechterung des klinischen Zustandes und einer Beeinträchtigung der Lebensqualität des Patienten einhergeht (41; 102). Bei Kosorok et al. (68) konnte der Erwerb von P. aeruginosa mit einem sukzessiven Abfall der Lungenfunktion assoziiert werden und in einer Studie von Emerson et al. (35) war das Risiko, in den nächsten acht Jahren zu versterben, bei Patienten mit positivem P. aeruginosa-Nachweis 2,6-fach höher als bei Patienten ohne P. aeruginosa-Besiedlung. Daher hat der Nachweis von P. aeruginosa in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten großen Einfluß auf Therapie und Prognose der Erkrankung. Bereits bei Erstnachweis von P. aeruginosa ist ein Eradikationsversuch mit Antibiotika indiziert. Eine kürzlich publizierte randomisierte Doppelblindstudie von Gibson et al. (42) zeigt, dass mit einer inhalativen Therapie mit Tobramycin (zwei mal täglich 300 mg über 28 Tage) eine deutliche Reduktion der P. aeruginosa-Dichte erzielt werden kann. Diese inhalative Therapie hat auch in der Mukoviszidose-Ambulanz Ulm die früher durchgeführte intravenöse Therapie teilweise ersetzt. Bei chronischer Pseudomonas-Infektion sollte zwei bis drei Mal pro Jahr eine intensive Antibiotikatherapie durchgeführt werden, beispielsweise abwechselnd mit inhalativem Colistin und Tobramycin für je 28 Tage. Die initiale Infektion mit P. aeruginosa erfolgt meist mit einem einzelnen Stamm aus der Umwelt (12). Übertragungen dieser P. aeruginosa-Stämme auf andere Mukoviszidosepatienten wurden nur selten und meist unter Verwandten oder sozial eng verbundenen Patienten beschrieben (41; 111). Im Rahmen einer chronischen Infektion kann der initial erworbene P. aeruginosa seinen Phänotyp ändern und eine mukoide Variante entwickeln (41). Diese ist gekennzeichnet durch die Bildung einer extrazellulären Schleimkapsel aus Polysacchariden und Alginat, die sowohl die Persistenz von P. aeruginosa als auch seine Resistenz gegenüber Antiobiotika verstärkt. Weiterhin treten bei Mukoviszidosepatienten oft atypische P. aeruginosa-Stämme mit Verlust der Pigmentproduktion oder Ausbildung sehr kleiner Kolonien auf (97). Bei chronischer Besiedlung mit P. aeruginosa kann es bei den Patienten im Laufe der Zeit auch zum Erwerb weiterer unterschiedlicher P. aeruginosa Stämme kommen, so dass in einem Patienten oft eine große Anzahl an unterschiedlichen genotypischen Varianten von P. aeruginosa nachweisbar ist (12). Ob es sich bei chronischen Infektionen mit P. aeruginosa um mehrere Stämme handelt und ob Übertragungen des Erregers zwischen Patienten stattgefunden haben, kann durch eine molekulare Erregertypisierung, z. B. mittels der Pulsfeldgelelektrophorese, geklärt werden. Einleitung 8 Burkholderia cepacia Komplex Die Spezies des B.cepacia Komplex sind wie P. aeruginosa gram-negative, Oxidasepositive, nonfermentative Stäbchenbakterien, die ubiquitär in der Umwelt vorkommen und ursprünglich als Phytopathogene bekannt wurden (19). Bei den Infektionsquellen handelt es sich analog zu P. aeruginosa um Feuchtbiotope und Wasserreservoire verschiedenster Art. Eine chronische Besiedlung mit Spezies des B. cepacia Komplexes findet sich bei bis zu 13 % der Patienten, scheint jedoch große regionale Unterschiede aufzuweisen. In München lag die Besiedlungrate von 1987-1997 bei 7,1 % (5), in Vancouver in Kanada von 1981-1998 bei 13 % (82). Der B. cepacia Komplex beinhaltet mindestens neun Spezies, die früher als Genomovare bezeichnet wurden und die sich aufgrund ihrer engen genetischen Verwandschaft nur schwierig differenzieren lassen (17; 51; 79; 125; 126). Sie zeigen jedoch Variationen in der Nukleotidsequenz des RecA-Gens, das für ein Protein kodiert, welches für die Reparatur und die Rekombination der DNA essentiell ist (80). Anhand der Sequenzierung des RecA-Gens kann die genaue Identifikation der Genomovare des B. cepacia Komplexes erfolgen (80). B. cenocepacia, früher als B. cepacia Genomovar III bezeichnet, geht mit einer signifikanten Verschlechterung der klinischen Situation des Mukoviszidosepatienten einher. Es verursacht unter allen Spezies des B. cepacia Komplex am häufigsten das sog. Cepacia-Syndrom, das durch hohes Fieber, Bakteriämie sowie eine schnell progrediente Verschlechterung der Lungenfunktion der betroffenen Patienten gekennzeichnet ist (57; 58; 86). Infektionen mit B. cenocepacia sind durch die höchste Mortalitätsrate unter allen Spezies des B. cepacia Komplex gekennzeichnet (73; 79; 82) und besitzen die schlechteste Prognose aller Infektionen durch Spezies des B. cepacia Komplexes (47; 123). B. multivorans, früher als B. cepacia Genomovar II bezeichnet, gehört zusammen mit B. cenocepacia zu den beiden häufigsten Spezies innerhalb des B. cepacia Komplex (99). Es wird in Deutschland häufig isoliert (19; 22) und ist nach einigen aktuellen Studien für mehr als 50 % der Infektionen mit B. cepacia Komplex verantwortlich (9; 76; 82). Die weiteren Arten des B. cepacia Komplexes, wie B. stabilis (ehemals Genomovar IV), B. vietnamensis (Genomovar V), B. dolosa (Genomovar VI), B. ambifaria (Genomovar VII), B. anthina (Genomovar VIII) oder B. pyrrocinia (Genomovar IX) kommen nur sehr selten bei Mukoviszidosepatienten vor (9; 99). Über ihre klinische Bedeutung ist wenig bekannt. Einleitung 9 Infektionsübertragungen auf andere Patienten und sogar kleinräumige Epidemien unter Mukoviszidosepatienten, beispielsweise bei Besuch gemeinsamer Freizeitaktivitäten, sind bei Infektionen mit B. cepacia Komplex beschrieben (19; 32; 45; 81; 88; 108; 134). Diese Übertragungen scheinen aber bei B. multivorans seltener als bei B. cenocepacia vorzukommen (5; 50; 82). Um andere Patienten vor Ansteckung zu schützen, ist bei Nachweis von Arten des B. cepacia Komplexes eine Isolierung des Patienten von anderen Mukoviszidosepatienten indiziert (58; 75). Die erforderlichen Maßnahmen sind leider meist auch mit einer beträchtlichen sozialen Isolierung der betroffenen Patienten verbunden. In der Regel weisen die chronisch mit Erregern des B. cepacia Komplex besiedelten Patienten nur einen einzigen Stamm des Erregers auf. Es ließ sich jedoch in vorhergehenden Studien mittels molekularen Methoden der Erregertypisierung nachweisen, dass es in seltenen Fällen im Verlauf einer chronischen Infektion zum sogenannten „Strain Replacement“ kommt (6). Dabei handelt es sich um einen Wechsel von dem initial infektionsauslösenden Stamm auf einen anderen Stamm derselben Spezies oder auf eine andere Spezies des B. cepacia Komplexes (6; 82). Neben dem sogenannten Strain Replacement wurden auch simultane Koinfektionen unterschiedlicher Stämme von B. cenocepacia beobachtet (45; 82). Koinfektionen wurden bei chronischen B. multivorans-Infektionen bislang nur vermutet, jedoch nicht nachgewiesen (6). Insgesamt sind Daten über die molekulare Epidemiologie von B. multivorans noch rar. Eine eindeutige Identifizierung der Spezies bei jedem Erregernachweis stellt sicher, dass Phänomene des Strain Replacement bei chronischen Infektionen, wie z. B. ein möglicher Erwerb von B. cenocepacia bei bestehender B. multivorans-Infektion, nicht übersehen werden. Die exakte mikrobiologische Diagnostik ist somit Voraussetzung für eine optimale Therapie der Patienten. Bei Nachweis einer Spezies des B. cepacia Komplexes ist ein Eradikationsversuch des Erregers indiziert. Allerdings lässt sich B. cepacia nur schwer eradizieren (7), und selbst eine intravenöse Antibiotika-Therapie zeigt nur bei 50 % der Patienten Erfolg (47). Eine therapeutische Herausforderung bei Infektionen mit Burkholderien liegt, ebenso wie bei Pseudomonaden, in der steigenden Resistenz gegenüber Antibiotika. Einleitung 10 Weitere gram-negative bakterielle Erreger bei Mukoviszidose Neben den oben beschriebenen Erregern finden sich bei Mukoviszidosepatienten häufiger Infektionen durch die gram-negativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien Achromobacter xylosoxidans und Stenotrophomonas maltophilia (41). Auch Infektionen durch atypische Mykobakterien, insbesondere Mycobacterium abscessus und Mycobacterium avium Komplex, wurden beschrieben und können sich als chronische Infektion manifestieren (36; 49; 91; 96). Die pathogenetische Bedeutung dieser Bakterien ist jedoch bislang nicht ausreichend geklärt (45; 78; 89; 101). Dies ist auch auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Identifizierung einiger Arten, z. B. A. xylosoxidans, mit konventionellen Methoden schwierig ist und Fehlidentifizierungen vorkommen ((65; 87; 113; 124), siehe auch unten). In neueren Studien, in denen molekularbiologische Methoden zur Identifizierung von Bakterien angewandt wurden, wurden vermehrt seltene oder zuvor noch nicht beschriebene Bakterienspezies und -gattungen, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species, Bordetella species (z. B. B. bronchiseptica, B. holmesii), Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus etc., bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesen (16; 18; 20; 21; 87; 128; 131). Dies zeigt, dass die Vielfalt der Bakterien, die den Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten besiedeln können, noch nicht vollständig bekannt ist. Daten zur Epidemiologie dieser seltenen oder erst kürzlich entdeckten Bakterien bei Mukoviszidosepatienten fehlen weitestgehend. Auch die klinische Bedeutung einer Infektion oder Kolonisation mit diesen Erregern bei Mukoviszidosepatienten sowie der Einfluss dieser Spezies auf andere Bakterien im Respirationstrakt der Patienten konnten bislang nicht hinreichend geklärt werden. Das bakterielle Keimspektrum von Mukoviszidosepatienten unterliegt einer stetigen Veränderung, die sowohl auf die kontinuierlich steigende Lebenserwartung der Patienten als auch auf den optimierten Gebrauch von neueren, effektiveren Antibiotika und die daraus resultierende Erregerselektion zurückzuführen sein könnte. 1.3. Mikrobiologische Diagnostik In der Mukoviszidose-Ambulanz der Universitäts-Kinderklinik Ulm werden im Rahmen der regelmäßigen Betreuung ein- bis zweimal pro Quartal und zusätzlich bei akuten Infekten und respiratorischer Verschlechterung Sputumproben zum Nachweis pathogener Erreger entnommen. Die Sputumproben werden in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, einem nach DIN EN ISO 15189 akkreditierten Labor, mittels standardisierter diagnostischer Verfahren mikrobiologisch untersucht. Einleitung 11 1.3.1. Konventionelle bakteriologische Diagnostik Die konventionelle bakteriologische Diagnostik beruht auf der Anzucht einer Reinkultur von Bakterien aus klinischen Untersuchungsmaterialien und deren anschließender Identifizierung. Bei respiratorischen Sekreten von Mukoviszidosepatienten erfolgt die Materialanlage auf verschiedenen Universal- und Selektiv-Nährböden. Die Bakterienisolate werden aufgrund ihres Wachstumsverhaltens auf den Nährmedien und ihren morphologischen und biochemischen Merkmale identifiziert. P. aeruginosa lässt sich anhand seiner charakteristischen Eigenschaften (s. Kap. 3.3.) gut identifizieren. Bei Mukoviszidosepatienten hingegen wird der Nachweis oft durch veränderte phänotypische Varianten, wie z. B. Stämme mit Verlust der Pigmentproduktion oder nur langsam wachsende Stämme, erschwert (97). In solchen Fällen werden, genau wie für die Identifizierung anderer gram-negativer, nonfermentativer Stäbchenbakterien, kommerzielle biochemische Verfahren, wie z. B. der Api 20 NE der Fa. BioMérieux, eingesetzt. Der Api 20 NE, der in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene routinemäßig verwendet wird, prüft das Vorhandensein verschiedener Enzymreaktionen, die Produktion bestimmter Stoffwechselendprodukte und die Fähigkeit zum Abbau von diversen Zuckern. In einer Studie von van Pelt et al. (124), in der verschiedene kommerzielle Identifizierungsmethoden für B. cepacia und P. aeruginosa aus Proben von Mukoviszidosepatienten verglichen wurden, war der Api 20 NE den anderen Methoden überlegen. Doch auch bei dieser Identifizierungsmethode traten in einem signifikanten Prozentsatz Fehlidentifizierungen von Nonfermentern oder Versagen der Identifizierung von Burkholderia gladioli und Ralstonia pickettii auf (87; 124). Neben ihrer relativ hohen Ungenauigkeit weisen die konventionellen Methoden der Identifizierung einen hohen Zeitbedarf auf (101). Dieser wird bedingt durch eine sehr langsame Wachstumskinetik einiger Bakterien oder die Hemmung des Wachstums der Erreger durch eine antibiotische Vorbehandlung des Patienten. Aufgrund der hohen Fehlerrate phänotypischer Identifizierungen und aufgrund der Tatsache, dass bei Mukoviszidosepatienten oft Stämme mit atypischem Erscheinungsbild auftreten, sind die routinemäßig angewendeten, konventionellen Identifizierungsmethoden bei der Erregerdiagnostik in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten nicht in jedem Fall ausreichend für den Nachweis und die Identifizierung pathogener Bakterien (65; 110). Sie bergen insbesondere das Risiko, dass pathogenetisch wichtige Bakterien, wie P. aeruginosa und Arten des B. cepacia Komplex, übersehen werden. Einleitung 12 1.3.2. Molekularbiologische Diagnostik In den letzten zwei Jahrzehnten gelang eine stetige Weiterentwicklung molekularbiologischer Nachweis- und Identifizierungsverfahren für bakterielle Infektionserreger. Im Gegensatz zu den konventionellen Identifizierungsstrategien werden die Erreger bei Anwendung molekularbiologischer Methoden anhand spezifischer Gene identifziert. Dabei umgehen molekularbiologische Verfahren das Problem der Variabilität der Phänotypen und ermöglichen somit häufig eine zuverlässigere Identifizierung der Bakterien (113). Eine noch junge Methode mit bedeutendem Stellenwert in der molekularbiologischen Diagnostik ist die DNA-Sequenzierung, mit der die Basensequenz von Nukleinsäureabschnitten, z. B. charakteristischen bakteriellen Genen, bestimmt wird (56). Mit Hilfe moderner Sequenziergeräte ist diese Methode heutzutage weitgehend automatisierbar. Für die Identifizierung von Bakterien wird meist das 16S rRNA-Gen eingesetzt, welches für die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA der Bakterien kodiert. Es eignet sich sehr gut zur Identifizierung von Bakterien, da es im Genom aller Bakterien in mehrfacher Kopienzahl vorkommt. Neben konstanten oder universellen Bereichen, die für die Primerbindung verwendet werden, besitzt es auch variable Abschnitte, in denen sich die meisten Bakterienarten unterscheiden (s. Abb. 3). Für die Identifizierung von gramnegativen, nonfermentativen Stäbchen ist das 16S rRNA-Gen sehr gut geeignet (38; 119). Abb. 3: Schematische Struktur des 16S rRNA-Gen. U kennzeichnet die universellen, nicht variablen Regionen , aus Gray et al. (46), S. 5840 Einleitung 13 Bislang bekannte DNA-Sequenzen stehen über das Internet in Datenbanken (z. B. GenBank-Datenbank des National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST) zur Verfügung. Die Identifizierung eines unbekannten Bakteriums erfolgt anhand des Homologie-Vergleichs zwischen einer sequenzierten 16S rRNA-Gen-Sequenz und allen vorhandenen Sequenzen der Datenbank (2; 8; 120). Mittels molekularbiologischer Methoden gelang die Entdeckung zahlreicher neuer Bakterien-Spezies (3; 98; 103; 130), die sich mit den üblichen Kulturverfahren bislang nicht anzüchten ließen. Auch bei Mukoviszidosepatienten wurde in neueren Studien, die molekularbiologische Methoden zur Identifizierung ungewöhnlicher Bakterien anwandten, das Vorkommen von seltenen oder zuvor noch gar nicht bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesenen Bakterien, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species, Bordetella bronchiseptica, Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus, beschrieben (11; 16; 18; 20; 21; 128; 131). Die Neuentdeckung solcher Erreger zeigt, dass die Vielfalt der Bakterien des Respirationstraktes von Mukoviszidosepatienten wahrscheinlich deutlich größer ist als heutzutage angenommen. Insbesondere auf dem Gebiet der konventionell schwierig zu identifizierenden gram-negativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien, zu denen auch alle oben erwähnten Bakterienarten und –gattungen zählen, sind durch die molekulare Diagnostik neue Erkenntisse zu erwarten. Es ist davon auszugehen, dass das Keimspektrum der Lungeninfektionen bei Mukoviszidose durch die moderne mikrobiologische Diagnostik insgesamt noch eine wesentliche Erweiterung erfahren wird (47). Einleitung 14 1.4. Zielsetzung der Arbeit Chronische Lungeninfektionen stellen die häufigste Todesursache bei Mukoviszidosepatienten dar. Zu den bedeutsamsten Erregern dieser Infektionen gehören P. aeruginosa und B. cepacia Komplex, aber auch andere, gram-negative, nonfermentative Stäbchenbakterien wie z. B. Comamonas testosteroni, P. alcaligenes, Achromobacter xylosoxidans und Ralstonia spp. werden regelmäßig in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Allerdings bereitet die Identifizierung dieser Bakterien mittels konventionellen biochemischen Methoden häufig Schwierigkeiten. Eine korrekte Identifizierung ist jedoch die notwendige Voraussetzung sowohl für die Erhebung zuverlässiger epidemiologischer Daten und die Beurteilung der klinischen Relevanz dieser Bakterien als auch für die adäquate Therapie des Patienten. Für die zuverlässige Identifizierung von Bakterien stehen heutzutage moderne molekularbiologische Methoden, wie die Sequenzierung des hochvariablen 16S rRNA-Gens, zur Verfügung. Ziel des ersten Teils dieser Arbeit ist daher, mittels des Verfahrens der Gen-Sequenzierung eine eindeutige Identifizierung von konventionell schwierig zu differenzierenden gram-negativen Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten zu ermöglichen. Dazu soll die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bei allen gram-negativen, Oxidase-positiven nonfermentativen Stäbchenbakterien, die im Rahmen der Routinediagnostik der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene im Jahr 2003 aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten der Universitäts-Kinderklinik Ulm isoliert wurden und mittels konventionellen Methoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, durchgeführt werden. Die Ergebnisse der molekularen Identifizierung sollen anschließend mit denen der konventionellen Diagnostik verglichen werden, um Aussagen über die Zuverlässigkeit der konventionellen Identifizierungsmethoden treffen zu können. Basierend auf den Ergebnissen der molekularen Identifizierung sollen im zweiten Teil der Arbeit einige ausgewählte, in der Routinediagnostik häufiger nachgewiesene Spezies, wie z. B. Comamonas testosteroni, P. alcaligenes und Ochrobactrum anthropi, in Hinblick auf ihre Epidemiologie sowie auf ihre klinische Bedeutung genauer betrachtet werden. Im dritten Teil der Arbeit soll eine molekulare Erregertypisierung mittels Pulsfeldgelelektrophorese von allen Bakterienspezies erfolgen, die bei denselben Patienten an mehreren Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurden. Hierdurch sollen Erregerpersistenzen von Reinfektionen unterschieden sowie mögliche Erregerübertragungen zwischen den Patienten nachgewiesen werden. Material 15 2. Material 2.1. Chemikalien und Reagenzien Alle Chemikalien und Reagenzien wurden in der Qualität „p.A.“ (pro Analysi) oder „für die Molekularbiologie“ von den nachfolgend aufgeführten Firmen bezogen. Reagenzien : Bezugsquelle: Aqua bidest., steril Klinikumsapotheke, Ulm Blue Dextran EDTA Applied Biosystems, Darmstadt Borsäure Sigma, St.Louis, MO, USA Bromphenolblau Merck, Darmstadt BSA New England BioLabs, Frankfurt am Main Antibiotika-Testplättchen Becton Dickinson GmbH, Heidelberg DNA Polymerisation Mix 20mM (dNTP) Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA EDTA Riedel-de Haën AG, Seelze Ethanol 100 % Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz Ethanol 70 % Merck, Darmstadt Ethidiumbromid Applied Biosystems, Darmstadt HiDi Formamide Merck, Darmstadt GRAMS Kristallviolettlösung Merck, Darmstadt Glycerin Merck, Darmstadt HCl Merck, Darmstadt H2O2, 30 % BioMérieux, Nürtingen James-Reagenz Merck, Darmstadt Karbolfuchsinlösung Klinikapotheke Ulm Lugol`sche Lösung Sigma, St.Louis, MO, USA MgCl2 Boehringer, Mannheim Na-Acetat, 3 M, pH 5,2 Braun, Melsungen NaCl-Lösung, 0,9 % BioMérieux, Nürtingen NaOH Merck, Darmstadt NIT 1 und 2 Reagenz BioMérieux, Nürtingen Paraffinöl (Mineralöl) Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Sarkosyl Sigma, St. Louis, MO, USA Seakem GTG Agarose Bio-Rad, München Material 16 SDS FMC Bio-Products, Rockland ME, USA Seal Plaque Agarose FMC Bio-Products, Rockland ME, USA TMPD-Pulver Sigma, St.Louis, MO, USA Tris Sigma, St.Louis, MO, USA Trisbase Sigma, St.Louis, MO, USA Triton Sigma, St.Louis, MO, USA Tween 20 Sigma, St.Louis, MO, USA Xylencyanol BioMérieux, Nürtingen Zinkpulver Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA 100 bp-Ladder 100 µg, 1 µg/µl Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ, USA Enzyme : Bezugsquelle: AmpliTaq DNA Polymerase Applied Biosystems, Darmstadt (5 Units/µl) mit 10 x Puffer Proteinase K Merck, Darmstadt Restriktionsendonuklease New England BioLabs, Frankfurt am Main (SpeI 10,000 Units/ml) mit 10x Restriktonspuffer (NEB-2) TaqPolymerase mit Q-Solution Qiagen, Hilden mit 10 x Puffer Nährmedien : Bezugsquelle: CASO-Agar ohne Blut Fa. Heipha, Eppelheim Kochblut-Agar Fa. Heipha, Eppelheim MacConkey-Agar Fa. Heipha, Eppelheim Müller-Hinton-Agar Fa. Heipha, Eppelheim Burkholderia cepacia-Selektivagar BC-Agar; Fa. MAST Diagnostika, GB Puffer: Zusammensetzung: CSB-Puffer 10 ml 1M TRIS pH 8,0; 20 ml 0,5 M EDTA pH 8,0; 70 ml steriles Aqua bidest. Ladepuffer 0,25 g Bromphenolblau; 0,25 g Xylencyanol; 0,2 ml 0,5 M EDTA; 50 ml 100 % Glycerin; 4 ml 1 M Tris-HCl pH 8,0–8,2; Material 17 5 ml 10 % SDS Lysis-Puffer 1 % Triton x 100; 0,5 % Tween 20; 10 mM Tris-HCL pH 8,0; 1 mM EDTA (alle Reagenzien von Sigma, St.Louis, USA) NEB-2-Puffer (1x) 50 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl; 10 mM MgCl2; 1 mM DTT (New England BioLabs, Frankurt am Main) Tris borate-EDTA-Puffer TBE-Puffer; Fluka, Buchs Tris-EDTA-Puffer TE-Puffer; Sigma, St.Louis, USA 10 x Restriktionspuffer MBI Fermentas, St.Leon-Rot 5 x Sequencing Puffer Applied Biosystems, Darmstadt 2.2. Primer Alle Primer wurden von Thermo Electron GmbH, Ulm bezogen. 16s for 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG -3’ (Position 8 – 27) 16s rev 5’-GTT TAC CTT GTT ACG ACT T -3’ (Position 1492-1510) 1111 rev 5’-TTG CGC TCG TTG CGG GAC T -3’ (Position 1111-1093) 821 rev 5’-CAT CGT TTA CGG CGT GGA C -3’ (Position 821-803) 536 rev 5’-GTA TTA CCG CGG CTG CTG G -3’ (Position 536-518) Alle Positionen beziehen sich auf das E. coli 16S rRNA-Gen, GenBank Nr. J01859. BCR1 5’-TGA CCG CCG AGA AGA GCAA -3’ (Position 2-20) BCR2 5’-CTC TTC TTC GTC CAT CGC CTC -3’ (Position 1044-1024) BCR4 5’-GCG CAG CGC CTG CGA CAT -3’ (Position 528-511) Alle Positionen beziehen sich auf das B. multivorans ATCC 17616 RecA-Gen, GenBank Nr. U70431. 2.3. Bakterienstämme (Kontrollstämme): Burkholderia cepacia Genomovar I ATCC 25416 Burkholderia cepacia Genomovar IIIa V 153520 (Patientenisolat) Burkholderia multivorans DSM 13243 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Material 18 2.4. Laborbedarf Laborbedarf und Verbrauchsmaterial: Bezugsquelle: Duran Glasflasche, 250 ml Schott, Mainz Einmalimpfösen 10 µl blau Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen Einmalhandschuhe Kimberly-Clark, Roswell, USA Einmal-Skalpell, Präzisa P.J. Dahlhausen & Co.GmbH, Köln Eppendorf-Reaktionsgefäße 0,5 ml, 1,5 ml Eppendorf, Rösrath Falcon-Röhrchen 50 ml Becton Dickinson GmbH, Heidelberg Gestopfte Pipettenspitzen 10 µl, 100µl, 1000 µl Sarstedt, Nümbrecht Klebeband Tesa, Hamburg Küvetten 1,5 ml, 2,5 ml Brand GmbH, Wertheim Nitrilhandschuhe Ansell Medical, München Objektträger Menzel GmbH&CoKG, Braunschweig Pipetten 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl Eppendorf, Rösrath Psipetten (sterile Einwegpipetten) BioMérieux, Nürtingen Reaktionsgefäße 0,5 ml und 1,5 ml Eppendorf, Rösrath Septa für 0,5 ml Reaktionsgefäße Applied Biosystems, Darmstadt sterile Wattestäbchen Greiner Labortechnik , Frickenhausen Stripette 5 ml, 10 ml Corning Incorporated, New York, USA sterile 4 ml Röhrchen Greiner Labortechnik, Frickenhausen 2.5. Kits Das QIAamp DNA Mini Kit von der Fa. Qiagen aus Hilden wurde zur DNA-Isolierung verwendet. Das Kit enthält: - Proteinase K (17,85 mg/ml) - AE-Puffer - AL-Puffer - ATL-Puffer - AW 1 u 2 Puffer Das QIAquick PCR Purification Kit von Fa. Qiagen aus Hilden wurde zur Aufreinigung der DNA verwendet. Das Kit enthält: - Puffer PB - Puffer PE Material - Puffer EB - QIAquick Spin Colums (Säulchen) - 2ml Reaktionsgefäße 19 BigDye Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction Kit Version 1.1 von Fa. Applied BioSystems aus Darmstadt wurde für die Sequenzierreaktion verwendet. Das Kit enthält: - Terminator Premix mit A-,C-,G-,T-DyeDeoxy-Terminatoren - dNTP-Mischung aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP - AmpliTaq DNA-Polymerase - Puffer (TRIS-HCl (pH 9,0), MgCl2) - wärmestabile Pyrophosphatase Der Api 20 NE von Fa. BioMérieux aus Nürtingen wurde zur biochemischen Differenzierung von Nonfermentern verwendet. Der Api 20 NE enthält: - Teststreifen - Inkubationswanne - Auswertungsblatt - AUX-Medium Das BBL DrySlide Oxidase Testkit wurde für den Oxidase-Test verwendet. Es enthält einen gebrauchsfertigen Einmalobjektträger mit vier Reaktionsflächen. 2.6. Geräte Geräte: Bezugsquelle: Abi Prism 310 Genetic Analyser Applied Biosystems, Darmstadt Bunsenbrenner IBS IntegraBiosciences, Chur, Schweiz CHEF-DR III Gerät Bio-Rad, München Disposable Plug Mold (50 well) Bio-Rad, München Elektrophorese-Spannungsgerät ST 606 T Life Technologies GmbH, Eggenstein Färbebank Werkstatt der Universität Ulm Gefrierschrank Liebherr, Ochsenhausen Gel Elektrophorese Apparatur Horizon Life Technologies GmbH, Eggenstein Gel-Kamm, 14-er Life Technologies GmbH, Eggenstein Kämme (15 und 30 well) Bio-Rad, München Kombinationskamm-Halter Bio-Rad, München Material 20 Kühlblock zum Pipettieren Eppendorf, Rösrath Kühlschrank Liebherr, Ochsenhausen Lichtmikroskop Olympus, Hamburg Mikrowelle Moulinex, Ecully, Frankreich PFGE-Geldokumentationssystem (Gel Doc) Bio-Rad, München Pipettierhilfe Pipetboy IBS IntegraBiosciences, Chur, Schweiz Raumluft-Brutschrank, 30 °C Heraeus, Osterode Raumluft-Brutschrank, 36 °C Heraeus, Osterode Raumluft-Brutschrank, 42 °C Heraeus, Osterode Spekol mit Deuterium Lampe (Ultraspec III) Pharmacia Biotech, Freiburg Standard Gießstand Bio-Rad, München Thermocycler Touch Down Abott Laboratories, IL, USA Thermomixer 5436 Eppendorf, Rösrath Transilluminator Bachofer, Reutlingen Videobildkopierer P68E mit Bildschirm Mitsubishi Electric Corporation, Tokyo Videodokumentationssystem CF 8/1 DX KAPPA Messtechnik GmbH, Gleichen Vortexer RS1 M. Zipperer GmbH, Staufen Waage Sartorius Basic plus Sartorius, Nümbrecht Wasserbad Köttermann,Uetze-Häningsen Zentrifuge miniSpin Eppendorf, Rösrath Zentrifuge 5417 Eppendorf, Rösrath 2.7. Software Programm: Bezugsquelle: APIlab Auswertungssoftware für Api 20 NE BioMérieux, Nürtingen BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST) Ridom TraceEdit 1,0 (Auswertungsprogramm) Ridom GmbH, Würzburg Methodik 21 3. Methodik 3.1. Bakterienisolate von Mukoviszidosepatienten Bei den in dieser Studie untersuchten Bakterienisolaten handelte es sich um gram-negative, Oxidase-positive, nonfermentative Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten, die im Rahmen der konventionellen mikrobiologischen Diagnostik der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene nicht eindeutig identifizierbar waren. Insgesamt wurden im Studienzeitraum vom 01.01.2003 - 31.12.2003 im Rahmen der mikrobiologischen Routinediagnostik 407 Isolate von gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien von 88 Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Davon konnten 317 Isolate zweifelsfrei identifiziert werden (s.u.). Die verbleibenden 90 Isolate, die mit konventionellen Identfizierungsmethoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, wurden in die vorliegende Studie aufgenommen. Alle Isolate stammen aus respiratorischen Sekreten von Mukoviszidosepatienten (n=25), die in der Mukoviszidose-Ambulanz der Universitäts-Kinderklinik in Ulm betreut werden. Das Alter der Patienten variierte zwischen 2 und 40 Jahren, das Durchschnittsalter betrug 21,6 Jahre. Die Identifizierung der gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien erfolgte in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, einem nach DIN EN ISO 15189 akkreditierten Labor, gemäß mikrobiologischer Standardmethoden. Dabei wurden die Isolate zuerst auf die Ausprägung morphologischer Merkmale wie z. B. grüne Pigmentbildung oder schleimige Kolonien untersucht. Weiterhin wurde das Wachstum bei 42 °C, das Wachstum auf MacConkey-Agar und die antimikrobielle Empfindlichkeit gegenüber Colistin geprüft. Ein Großteil der Isolate ließ sich bereits anhand dieser Kriterien als P. aeruginosa identifizieren. Bei den übrigen Isolaten wurde der Api 20 NE durchgeführt. Nur bei ausgezeichneter, sehr guter oder guter Identifizierung als P. aeruginosa im Api 20 NE wurde das Identifizierungsergebnis anerkannt. Alle anderen Isolate, die weder anhand typischer morphologischer Kriterien noch anhand eindeutiger biochemischer Ergebnisse eindeutig als P. aeruginosa identifiziert werden konnten, wurden in die Studie eingeschlossen und mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung identifiziert. Bei diesen Isolaten wurde zunächst die Beurteilung der Morphologie (s. Abschnitt 3.3.) und, wenn erforderlich, die biochemische Identifizierung (s. Abschnitt 3.4.) wiederholt, um zuverlässige Ergebnisse für den Vergleich der verschiedenen Identifizierungsmethoden zu erhalten. Methodik 22 3.2. Bakterienkultur Die Bakterienstämme wurden nach Isolierung aus den Patientenmaterialien in MicrobankRöhrchen bei - 20 °C gelagert. Als Nährmedium für die primäre Anzucht der Bakterienstämme aus den Microbank-Röhrchen wurden Blutagarplatten verwendet, die bei 36 °C unter Raumluft bebrütet wurden. Nach 24 - 48 h Bebrütung wurden von einzelnen Kolonien dieser Stämme sowohl auf MacConkey-Agar als auch auf Kochblut-Agar Subkulturen angelegt. Diese wurden erneut 24 - 48 h bei 36 °C unter Raumluft bis zur weiteren Verwendung bebrütet, um für die morphologische Beurteilung und die weitere Verarbeitung ausreichend bewachsene Reinkulturen zu erhalten. 3.3. Beurteilung der Morphologie der Bakterien 3.3.1. Koloniemorphologie Es erfolgte eine morphologische Beurteilung aller Isolate sowohl auf MacConkey-Agar als auch auf Kochblutagar in Bezug auf die folgenden Kriterien: a) Form und Größe der Kolonien b) Farbe der Kolonien c) Ausprägung mukoider Kolonien d) Geruch e) Hämolyseverhalten auf Blutagar f) Vorhandensein eines metallischen Glanzes Insbesondere wurde dabei geprüft, ob das Isolat typische morphologische Eigenschaften von P. aeruginosa aufweist. Dieser zeigt auf Blutagar meist eine Hämolyse. Neben einem aromatischen Lindenblütengeruch und einem metallischen Glanz ist die Bildung von blaugrünen bis gelbgrünen Pigmenten, die durch Pyocyanin und Fluorescein entstehen, für ihn charakteristisch. Ein weiteres Merkmal ist das Wachstum bei 42 °C auf Müller-HintonAgar. Bei Mukoviszidosepatienten findet sich häufig eine mukoide Variante, die durch die Bildung einer extrazellulären Schleimkapsel aus Polysacchariden und Alginat gekennzeichnet ist. 3.3.2. Prüfung des Wachstumsverhaltens bei 42 °C Zur Beurteilung der Temperaturansprüche wurden alle Isolate auf Müller-Hinton-Agar subkultiviert und für 18 - 24 h bei 42 °C unter Raumluft bebrütet. Methodik 23 3.3.3. Gram-Färbung Anhand der Gram-Färbung werden Bakterien in gram-negative und gram-positive Bakterien eingeteilt. Die Färbung wurde eingesetzt, um die Klassifizierung der in dieser Studie eingeschlossenen Bakterien als gram-negative Stäbchenbakterien zu bestätigen. Zur Durchführung der Gram-Färbung wurden einige Kolonien der zu untersuchenden Bakterien von einer zwei Tage alten Subkultur auf Kochblut-Agar in einem Tropfen physiologischer NaCl-Lösung auf einem Objektträger suspendiert. Das luftgetrocknete Präparat wurde durch dreimaliges Ziehen durch die Flamme eines Bunsenbrenners hitzefixiert und folgendermaßen gefärbt: - vollständiges Überschichten des Objektträgers mit GRAMS Kristallviolettlösung, 90 sek. einwirken lassen, danach abgießen - Objektträger mit Lugol’scher Lösung abspülen und komplett mit Lugol’scher Lösung bedecken, 90 sek. einwirken lassen, danach abgießen - mit 95 % Ethanol zur Entfärbung abspülen, bis alle Farbreste entfernt sind - unter fließendem Leitungswasser vorsichtig waschen - Auftropfen von Karbolfuchsinlösung, 60 sek. färben - mit Leitungswasser abspülen, lufttrocknen lassen Anschließend Betrachtung unter dem Lichtmikroskop bei 1000-facher Vergrößerung. Gram-negative Bakterien erscheinen rot, gram-positive Bakterien blau. 3.4. Biochemische Identifizierung der Bakterien 3.4.1. Oxidase-Test Der Oxidase-Test prüft, ob ein Bakterium Cyctochrom C in seiner Atmungskette enthält und somit zur Oxidation von Cytochrom C durch molekularen Sauerstoff fähig ist. Im Oxidase-Test wird das oxidierte Cytochrom C durch das Reagenz TMPD (Tetramethyl-pphenylendiamin-Dichlorid) reduziert. Dabei kommt es zum Farbumschlag des Reagenz von farblos nach violett. Der Nachweis dieses Cytochromoxidase-Systems erlaubt eine Einordnung der Isolate in Oxidase-positive und Oxidase-negative Bakterien. Alle wichtigen humanpathogenen Pseudomonaden sind Oxidase-positiv. Der OxidaseNachweis ist sowohl mit einer Trockenoxidase als auch einer Flüssigoxidase möglich. Durchführung des Trockenoxidase-Tests: - 1 Kolonie einer 18 - 24 h bebrüteten Reinkultur mit einer Impföse entnehmen und auf das Testplättchen auftragen Methodik - 24 im positiven Fall zeigt das farblose Reagenz innerhalb von 20 sek. während der ablaufenden Oxidasereaktion einen Farbumschlag nach violett Anmerkung: - bei mukoiden Isolaten kann aufgrund der Schleimkapsel eine verzögerte Oxidasereaktion auftreten Bei fraglichem Ausfall des Trockenoxidase-Test wurde der Flüssigoxidase-Test durchgeführt: - 1 % ige wässrige TMPD-Lösung auf eine oder mehrere Kolonien auftropfen - innerhalb von 20 sek. die Entwicklung einer dunkelvioletten Verfärbung der Kolonie beurteilen 3.4.2. Api 20 NE Der Api 20 NE (Fa. BioMérieux) ist ein kommerziell erhältlicher, biochemischer Test zur Identifizierung von gram-negativen, nonfermentativen Bakterien. Er identifiziert die Bakterien anhand ihrer charakteristischen Stoffwechseleigenschaften, wie z. B. diversen enzymatischen Reaktionen, und der Fähigkeit, verschiedene Zucker abzubauen (sog. Assimilationsreaktionen). Abb. 4: Api 20 NE der Firma BioMérieux. Dieser kommerziell erhältliche Test identifiziert Bakterien mittels charakteristischer Stoffwechseleigenschaften. Die Röhrchen auf der linken Hälfte der Abbildung testen verschiedene enzymatische Reaktionen, die Röhrchen auf der rechten Hälfte die Assimilationsreaktionen. Durchführung des Api 20 NE: - mit einigen Kolonien einer 18-24 h bebrüteten Reinkultur in 2 ml 0,85 % iger NaCl-Lösung eine Suspension nach McFarland-Standard 0,5 herstellen - die Röhrchen des Api 20 NE Teststreifen von NO3 bis PNPG (enzymatische Reaktionen) mit der Psipette möglichst blasenbildungsfrei befüllen - acht Tropfen der Suspension in eine Ampulle AUX-Medium pipettieren - Beimpfung der Röhrchen und Becher der Assimilationsreaktionen, bis der anfangs konkave Überstand in einen konvexen übergeht - Reaktionen GLU, ADH und URE mit Paraffinöl überschichten, um einen Sauerstoffabschluss zu gewährleisten Methodik - 25 Teststreifen in einer Inkubationswanne, die mit 5 ml Aqua bidest. befeuchtet wird, für 24 h bei 30 °C unter Raumluft inkubieren - zur Reinheitskontrolle der verwendeten Kultur mit der Suspension zusätzlich eine MacConkey-Agarplatte mit einem Dreiösenausstrich beimpfen, um eventuelle Kontaminationen anhand des Mischwachstums auf dem Agar erkennen zu können Die Ablesung des Api 20 NE erfolgt sowohl nach 24 h als auch nach 48 h, sowie in Einzelfällen erneut nach 72 h, entsprechend den Vorgaben des Herstellers. Bei der Ablesung wird die Farbe der Lösungen in den einzelnen Röhrchen der Enzymreaktionen bzw. die Trübung in den Röhrchen der Assimilationsreaktionen beurteilt. Die Auswertung des Api 20 NE erfolgte mit Hilfe der APIlab-Software. Die Software schlägt dabei vor, welche Spezies am ehesten zu dem jeweiligen Api-Ergebnis passt. Dabei verwendet der Api folgende Kriterien: - Prozentwert („% id.“): Dieser gibt die Wahrscheinlichkeit der Identifizierung im Vergleich mit allen Taxa der Datenbasis an - T-Wert („T“): Er liegt zwischen 0 und 1 und gibt den typischen Charakter des Stammes innerhalb eines Taxons an. Hohe T-Werte sprechen für ein typisches biochemisches Verhalten des Isolates und somit für eine gute Identifizierung - Widersprechende Reaktionen: hier wird die absolute Anzahl der Reaktionen angegeben, die dem typischen Taxon widersprechen Zusätzlich beurteilt die Software die Identifikationsgüte mit folgenden Bewertungen: „ausgezeichnete Identifizierung“, „sehr gute Identifizierung“, „gute Identifizierung“, „akzeptierbare Identifizierung“, „geringe Selektivität“, „unzuverlässige Identifizierung“, „zweifelhaftes Profil“ und „unakzeptierbares Profil“. 3.5. Resistenztestung Die Resistenztestung der Bakterien wurde mit der Agardiffusionstestmethode im Rahmen der Routinediagnostik durchgeführt. Sie dient der in vitro Sensitivitätsbestimmung von Bakterien gegenüber bestimmten Antibiotika. Die Empfindlichkeit des Bakteriums lässt sich aufgrund des Durchmessers der Hemmzone um die mit Antibiotika beschichteten Testplättchen als „sensibel“, „intermediär empfindlich“ oder „resistent“ gegenüber einem bestimmten Antibiotikum einstufen. Die Durchführung des Agardiffusionstests erfolgte gemäß der Standardmethode der NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA): Methodik - 26 Bakterienkolonien von einer 18-24 h bebrüteten Reinkultur mit einer sterilen Öse entnehmen und in 5 ml 0,9 % iger NaCl –Lösung suspendieren, bis eine Trübung von 0,5 McFarland entsteht - mit dieser Suspension eine Müller-Hinton-Agarplatte beimpfen - Antibiotika-Testplättchen mit speziellem Applikator auf der Agarplatte positionieren - 10-15 min. Vordiffusion bei RT, dann für 18-24 h bei 36 °C unter Raumluft bebrüten Die Auswertung erfolgt durch Ausmessen des Hemmhof-Durchmessers, der sich um das Antibiotikum-Plättchen ergibt, und Beurteilung des erhaltenen Werts nach den in Tab. 1 aufgelisteten Grenzwerten (NCCLS, Version M100-S11). Tab. 1: Auswertung der Resistenztestung mittels HHD (Hemmhof-Durchmesser) Die dargestellten Grenzwerte für die Größe des Hemmhof-Durchmessers entsprechen den Vorgaben des NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA) und dienen der Bestimmung der in vitro Sensitivität verschiedener Antibiotika. Antibiotikum Konzentration Resistent Sensibel pro Plättchen (µg) (HHD in mm) (HHD in mm) Colistin 10 < 11 ≥ 11 Gentamicin 10 ≤ 12 ≥ 15 Netilmicin 30 ≤ 12 ≥ 15 100 / 10 ≤ 17 ≥ 18 Cefotaxim 30 ≤ 14 ≥ 23 Ciprofloxacin 5 ≤ 15 ≥ 21 Ceftazidim 30 ≤ 14 ≥ 18 Imipenem 10 ≤ 13 ≥ 16 Amikacin 30 ≤ 14 ≥ 17 Meropenem 10 ≤ 13 ≥ 16 Tobramycin 10 ≤ 12 ≥ 15 Fosfomycin 200 < 10 ≥ 11 Levofloxacin 5 ≤ 13 ≥ 17 Piperacillin/Tazobactam 3.6. Molekularbiologische Identifizierung der Bakterien Molekularbiologische Methoden stellen heutzutage wertvolle Techniken für die Identifizierung von Bakterien dar, insbesondere für Bakterien, die sich durch morphologische und biochemische Kriterien nicht eindeutig differenzieren lassen. In der Methodik 27 vorliegenden Arbeit kamen sowohl PCR-Methoden als auch die DNA-Sequenzierung zum Einsatz. Für die Sequenzierung wurde das 16S rRNA-Gen verwendet. Die PCR ist Bestandteil der DNA-Sequenzierung und wurde außerdem für die Identifizierung von den Species des B. cepacia Komplexes angewendet. Zielgen war hierbei das RecA-Gen. Um Kontaminationen zu vermeiden, wurden bei allen Verfahren der molekularbiologischen Identifizierung von Bakterien Einmalhandschuhe getragen und gestopfte Pipettenspitzen, die Kontaminationen durch Aerosole verhindern, verwendet. 3.6.1. Isolierung von bakterieller DNA Es wurde die gesamte genomische DNA aus dem zu untersuchenden Bakterium isoliert. Um möglichst reine DNA-Präparationen zu erhalten, wurde die DNA-Isolierung anfangs mit dem QIAamp DNA Mini Kit der Fa. Qiagen durchgeführt. Dabei werden die Zellen mit Proteinase K enzymatisch lysiert. Die DNA adsorbiert in Anwesenheit hoher Salzkonzentrationen an eine Silikat-Gel-Membran im Säulchen, während übrige Zellbestandteile diese Membran passieren. In zwei Waschschritten, in denen Zelltrümmer, Proteine und sonstige bakterielle Bestandteile, die den Ablauf der PCR inhibieren können, entfernt werden, wird die DNA mit AE-Puffer von der Membran eluiert. DNA-Isolierung mit dem Qiagen-Kit: - eine Impföse Bakterien einer 24-48 h alten Subkultur entnehmen, diese in 1 ml PBS homogenisieren und 10 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - Pellet in 160 µl ATL-Puffer resuspendieren, 20 µl Proteinase K zugeben; vortexen - mind. 1 h bei 56 °C im Thermomixer inkubieren, dabei schütteln - Zugabe von 200 µl 96 % Ethanol und vortexen - Probe auf ein QIAmp-Säulchen geben und 1 min. bei 8000 U/min zentrifugieren - nach Zugabe von 500 µl AW-1 Puffer erneut 1 min. bei 8000 U/min und nach Zugabe von 500 µl AW-2 Puffer 3 min. bei 13400 zentrifugieren - zur DNA-Elution 50 µl AE-Puffer auf die in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß gesetzte Säule geben, 1 min. bei RT inkubieren, 1 min. bei 8000 U/min zentrifugieren - Wiederholung des letzten Arbeitsschrittes mit weiteren 50 µl AE-Puffer - das Eluat enthält nun die isolierte DNA Im Verlauf der Arbeit stellte sich heraus, dass mit der wesentlich weniger zeitaufwendigen Methode des „Kochens“ der Bakterien in speziellem Lysispuffer (Pufferzusammensetzung siehe 2.1.) ebenso gute DNA-Präparationen gewonnen werden konnten. Methodik 28 DNA-Isolierung mit Lysis-Puffer: - von einer 24-48 h alten Subkultur eine Impföse Bakterien entnehmen, diese in 500 µl Lysispuffer suspendieren und 10 min. bei 95 °C im Heizblock aufkochen - 5 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - den Überstand in ein Reaktionsgefäß überführen, dieser enthält die isolierte DNA Konzentrationsbestimmung der präparierten DNA: - Nach Herstellung einer Verdünnung von 1:25 aus 10 µl Eluat und 240 µl Aqua bidest. wurde eine Extinktionsmessung der DNA im Photometer mit der Deuterium Lampe bei 260 und 280 nm durchgeführt. Die Reinheit der DNA lässt sich durch Berechnung des Verhältnisses der Absorption bei 260 nm (A260) und bei 280 nm (A280) bestimmen. Bei reiner DNA liegt dieses Verhältnis A260 / A280 zwischen 1,7 und 1,9. 3.6.2. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Die PCR ist eine Methode, mit der DNA-Fragmente von bis zu 10 kbp mit Hilfe einer thermostabilen Taq-Polymerase (aus dem Bakterium Thermus aquaticus) vervielfältigt werden können. Die PCR läuft in einer Wiederholung bestimmter Zyklen (ca. 30 Stück) ab, in denen die Anzahl der DNA-Stücke jeweils verdoppelt wird und somit logarithmisch ansteigt. Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten: 1. Denaturierung bei 96 °C: Durch Aufbrechen der Wasserstoffbrücken wird die doppelsträngige DNA in zwei Einzelstränge getrennt. 2. Anlagerung (Annealing) der Primer, meist bei 50 °C: Zwei Oligonukleotid-Primer bekannter Sequenz binden an spezifische DNA-Abschnitte (Annealing) und begrenzen so von beiden Seiten das gewünschte Teilstück. 3. Elongation bei 60 °C: Durch die hitzestabile Taq-Polymerase wird ein komplementärer Strang in der Syntheserichtung 5’3’ synthetisiert. Nach dem letzten Zyklus wurde auf 4 °C abgekühlt und die Probe bis zur weiteren Verarbeitung bei -20 °C aufbewahrt. Alle Reagenzien wurden für den Reaktionsansatz auf Eis gelagert und im Kühlblock pipettiert, um ein unkontrolliertes, zu frühes Beginnen der PCR und somit die Bildung unspezifischer Amplifikationsprodukte zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurden für die Amplifikation des 16S rRNA-Gens der Bakterien Primer eingesetzt, die an die Basen 8-27 (Primer 16s for) und 1388-1406 (Primer 1406 rev) bzw. 1492–1510 (Primer 16s rev) des E. coli 16S rRNA-Gens (ATCC Methodik 29 25922) binden und somit das gesamte 16S rRNA-Gen der Bakterien amplifizieren. Die Amplifikation des 16S rRNA-Gens stellt die Voraussetzung für die Sequenzierung des Gens dar. Pipettierschema für die PCR (Mastermix für einen Ansatz): - Primer 16s for (100 pmol/µl) 0,25 µl - Primer 16s rev (100 pmol/µl) 0,25 µl - dNTP 5 mM 1,3 µl - 10 x PCR Puffer 10 µl - Aqua bidest. 83,7 µl - Taq-Polymerase (5 Units/µl) 0,5 µl (zuletzt zugeben) In jeden Ansatz wurden 96 µl Mastermix pipettiert und 4 µl der isolierten DNA zugegeben. Anschließend wurde das Eppendorf-Reaktionsgefäß kurz anzentrifugiert. Bei jeder PCR wurden zur Qualitätskontrolle sowohl eine Positivkontrolle mit einem definierten Kontrollstamm (E. coli ATCC 25922) als auch eine Negativkontrolle, bei der anstelle der DNA Aqua bidest. zugeführt wurde, mitgeführt. Nur wenn die Kontrollen einwandfrei ausfielen, wurden die untersuchten Proben ausgewertet. Die PCR wurde im Thermocycler Touch Down in 25 Zyklen mit folgenden Schritten durchgeführt: 1. Erhitzen auf 96 °C, 15 sek. 2. Temperatur 50 °C, 15 sek. 25 Zyklen 3. Temperatur 60 °C, 4 min. 3.6.3. Agarosegelelektrophorese Zur Überprüfung der PCR-Produkte wurde eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, in der die Amplifikate der Größe nach aufgetrennt werden und somit die Größe der Produkte bestimmt werden kann. Die PCR-Produkte wurden mit einer Ethidiumbromidfärbung unter UV-Licht sichtbar gemacht und zur Dokumentation fotographiert. Vorbereitung des DNA Längenstandard: - 10 µl Längenstandard mit 10 µl Ladepuffer und 80 µl 1x TE-Puffer mischen Durchführung der Agarosegelelektrophorese: - 1 g Agarose in eine 250 ml Duran Flasche geben und mit 100 ml 1x TBE-Puffer in der Mikrowelle durch Aufkochen lösen, dann auf 50 °C abkühlen lassen Methodik 30 - 1,0 µg/ml Ethidiumbromid zugeben, dabei unbedingt Nitrilhandschuhe tragen! - Lösung in die zuvor mit Gelkämmen bestückte Gelelektrophorese-Apparatur gießen und ca. 20 min. aushärten lassen - währenddessen die Flasche mit Wasser und 30 % H2O2 ausspülen und im Sondermüllkanister für Ethidiumbromid entsorgen - Gel in die mit 1x TBE-Puffer befüllte Elektrophoresekammer einlegen, so dass das Gel vollständig bedeckt ist und die Gelkämme vorsichtig entfernen - je 12 µl PCR-Produkt und 1,5 µl Ladepuffer (Herstellung siehe 2.1.) mischen - diese Proben vorsichtig in die Geltaschen einbringen - zusätzlich 13,5 µl DNA-Längenstandard in eine Tasche pipettieren - elektrisches Feld anlegen und ca. 1 h bei 120 V auftrennen - Gelbanden unter UV-Licht im Transilluminator sichtbar machen und zur Dokumentation fotographieren - die PCR-Produkte sollten die folgende Größe haben: 1396 bp (Primer 1406 rev), 1502 bp (Primer 1510) 3.6.4. DNA-Sequenzierung 3.6.4.1. Prinzip der Methode Die DNA-Sequenzierung dient der Bestimmung der Nukleotidabfolge eines spezifischen Gens. In dieser Arbeit wurde das 16S rRNA-Gen von Bakterien verwendet, welches für die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA der Bakterien kodiert. Dieses etwa 1,5 kb große Gen eignet sich sehr gut zur Identifizierung von Bakterien, da es im Genom aller Bakterien in mehrfacher Kopienzahl vorkommt und neben konstanten Bereichen, die für die Primerbindung benötigt werden, auch variable, artspezifische Abschnitte für die Identifizierung besitzt. Die DNA-Sequenzierung wurde nach der Methode des Kettenabbruchverfahrens nach Sanger et al. (105), bei dem die Nukleotidabfolge anhand des Einbaus von Didesoxynukleotiden (ddNTPs) bestimmt wird, durchgeführt. Nach der Denaturierung des DNADoppelstranges werden während der Anlagerung der dNTPs an den Einzelstrang auch verschiedenfarbig fluoreszierende ddNTPs eingebaut, die zum Kettenabbruch an der entsprechenden Einbauposition führen. So entstehen unterschiedlich lange DNAFragmente, die das Vorhandensein einer bestimmten Base an der entsprechenden Position im Gen anzeigen. Methodik 31 Die DNA-Sequenzierung gliedert sich in folgende Arbeitsschritte: (1) Amplifikation des Zielgens mittels PCR (2) Aufreinigung des PCR-Produktes (3) Sequenzierreaktion (4) Aufreinigung des Sequenzierproduktes (5) Sequenzanalyse (6) Auswertung der Sequenzierung 3.6.4.2. Amplifikation des Zielgens Die Amplifikation des Zielgens erfolgte mittels PCR wie unter 3.6.2. beschrieben. 3.6.4.3. Aufreinigung des PCR-Produkts Um überschüssige Primer und freie Nukleotide zu entfernen, wurden die PCR-Amplifikate mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kit (Fa. Qiagen) aufgereinigt, welches sich für die direkte Reinigung von doppel- und einsträngigen PCR-Produkten von 100 bp -10 kbp Länge eignet. In diesem Verfahren können bis zu 10 µg DNA in Anwesenheit hoher Salzkonzentrationen durch Absorption an eine Silikat-Gel-Membran aufgereinigt werden. Der mitgelieferte PB-Puffer sorgt für ein effizientes Binden der DNA an diese spezielle Membran. Kontaminationen passieren die Membran und werden im Waschvorgang mit PE-Puffer gemeinsam mit den Salzen entfernt. Die DNA-Elution erfolgt in Anwesenheit niedriger Salzkonzentrationen mittels EB-Puffer. Durchführung der Aufreinigung der PCR-Produkte - 440 µl PB-Puffer mit 88 µl des PCR Produktes versetzen und auf eine QIAquickSäule in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß geben - 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren (dabei bindet die DNA an die Silikat-GelMembran) - 750 µl PE-Puffer zum Waschen und Entfernen von Salzen auf die Säule pipettieren und nochmals 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - Eluat verwerfen und erneut 1 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - Säule aus dem Reaktionsgefäß nehmen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß setzen - 50 µl EB-Puffer zur Elution der DNA auf die Säule geben - 1 min. bei RT stehen lassen, anschließend 1 min. bei 13400 U zentrifugieren Das gereinigte PCR Produkt befindet sich nun in dem 1,5 ml Reaktionsgefäß und kann direkt im Sequenzierungsansatz eingesetzt werden. Methodik 32 3.6.4.4. Sequenzierreaktion Für die Sequenzierreaktion wurde das BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit der Fa. Applied Biosystems entsprechend des Protokolls des Herstellers verwendet. Die Sequenzierreaktion wurde dabei mit folgenden Primern durchgeführt: 16s rev (entspricht 1510 rev), 1111 rev, 821 rev und 536 rev. Da je Primer ein Ansatz hergestellt werden muss, benötigt man pro Isolat vier Ansätze. Pipettierschema für Sequenzierungen eines Primer-Ansatzes: - BigDye Terminator Ready Reaction Mix 4,0 µl - Sequenzing-Puffer, 5x 4,0 µl - Primer (10 pmol /µl) 1,5 µl - Aqua bidest. 5,5 µl Zu dem Ansatz 5,0 µl gereinigtes PCR-Produkt zugeben. Im BigDye Terminator Cycle Sequenzing Ready Reaction Mix sind sowohl die dNTPs als auch die zum Kettenabbruch führenden, Fluoreszein-markierten ddNTPs enthalten. Es wurde während des Gebrauchs auf Eis gelagert, und der gesamte Reaktionsansatz wurde im Kühlblock pipettiert. Die Sequenzierreaktion stellt im Prinzip eine PCR dar. Sie wurde im Thermocycler Touch Down mit folgenden Einstellungen durchgeführt. 1. Erhitzen auf 96 °C, 30 sek. 2. Temperatur 50 °C, 15 sek. 25 Zyklen 3. Temperatur 60 °C, 4 min. Abschließend wurde auf 4 °C abgekühlt und die Probe wurde bis zur weiteren Verwendung bei 2 - 8 °C bzw. -20 °C aufbewahrt. 3.6.4.5. Aufreinigung der Sequenzierprodukte Um die Qualität der Sequenzierungsergebnisse zu optimieren, wurden nach der Sequenzierreaktion nicht gewünschte Bestandteile des Sequenzieransatzes, wie z. B. überschüssige dNTPs oder Primer, durch alkoholische Fällung entfernt. Durchführung der Aufreinigung der Sequenzierprodukte: - 250 µl 100 % iges Ethanol mit 10 µl 3 M Natriumacetat, pH 5,2, und 80 µl Dextranblau mischen - 20 µl des Sequenzierreaktionsproduktes zugeben und 10 min. bei RT inkubieren Methodik 33 - 30 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - nach Waschen durch Zugabe von 1000 µl 70 % igem Ethanol nochmals 5 min. bei 13400 U/min zentrifugieren - Pellet 5 min. bei 37 °C trocknen lassen - Pellet in 25 µl HiDi Formamid lösen und mit Hilfe einer Pipette resuspendieren Die Probe kann direkt für die Sequenzanalyse in das Sequenziergerät eingesetzt werden. 3.6.4.6. Sequenzanalyse im Sequenziergerät Die Sequenzanalyse erfolgte als automatisierte, computergestützte Bestimmung der Nukleotidabfolge im Kapillarsequenziergerät ABI Prism 310. Das Sequenziergerät trennt die fluoreszenzmarkierten DNA-Fragmente durch Kapillarelektrophorese auf und detektiert die jeweiligen Nukleotide nach Aktivierung der Fluoreszenzmoleküle durch einen Laser. Dabei transformiert das Sequenziergerät das Emissionsmuster in Chromatogramme, die anhand spezieller Software ausgewertet werden können und somit die Nukleotidsequenz darlegen. 3.6.4.7. Auswertung von Sequenzierungen Um für ein Isolat die vollständige DNA-Sequenz des 16S rRNA-Gens zu erhalten, müssen die einzelnen Teilstücke der vier Primer in der richtigen Reihenfolge und an den passenden Schnittstellen zusammengesetzt werden. Dies wurde mit Hilfe des Auswertungsprogramm Trace Edit, Fa. Ridom, durchgeführt. Die ermittelten Sequenzen wurden mit Hilfe des BLAST-Programmes der GenBankDatenbank des National Center for Biotechnology Information der USA (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/BLAST) mit allen in der Datenbank enthaltenen Sequenzen verglichen. Die Auswertung einer Sequenzierung gibt dabei einen Grad der Homologie zwischen zwei DNA-Sequenzen an. Eine Homologie des 16S rRNA-Gens größer 97 % zu einer Sequenz der Datenbank gilt als zuverlässige Identifizierung eines Bakteriums. In dieser Arbeit wurde jedoch als Kriterium für eine eindeutige Identifizierung der bakteriellen Spezies eine Homologie zur entsprechenden Spezies in der GenDatenbank von ≥ 99 % definiert, um möglichst exakte Ergebnisse zu erhalten. Bei hohen Anteilen von nicht identifizierten Basen oder Homologien von deutlich weniger als 97 % wurden die Sequenzierungen wiederholt. Methodik 34 Die Zuverlässigkeit der Identifizierung lässt sich außer an den Homologien anhand von Bit-Scores und E-Values einschätzen. Der Bit-Score ist eine Punktzahl, die die Identität zwischen zwei Sequenzen widerspiegelt. Ergänzend gibt der E-Value eine Wahrscheinlichkeit an, mit der die Datenbank-Sequenz der eingegebenen Sequenz nur zufällig ähnlich ist. Daher ist der Bit-Score umso signifikanter, je kleiner der E-Wert ist. Der Bit-Score überstieg bei 90 % der identifizierten Sequenzen den Wert von 2500 bei einem E-Value < 0,001. Zusätzlich zur Identifizierung mit der GenBank wurden alle Sequenzen mit den bekannten 16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme der jeweils erhaltenen Spezies verglichen (in Klammern die Stammnummer und die GenBank-Nummer): - Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC 9220, AF411021) - Agrobacterium radiobacter (ATCC 19358, AJ389904) - Burkholderia multivorans (LMG 13010, Y18703) - Inquilinus limosus (LMG 20952, AJ 043374) - Ochrobactrum anthropi (LMG 5140, AJ242580) - Pseudomonas aeruginosa (ATCC 10145, AF094713) - Pseudomonas alcaligenes (ATCC 14909, AF094721) - Pseudomonas brassicacearum (CFBP 11706, AF100321) - Pseudomonas putida (ATCC 12633, AF 094736) - Pseudomonas synxantha (IAM 12356, D84025) - Sphingomonas paucimobilis (ATCC 29837, U37337) Auch hierbei wurde ab Homologien größer 99,0 % eine korrekte Identifizierung angenommen. 3.6.5. Sequenzierung des RecA-Gens von Burkholderia cepacia Komplex Der B. cepacia Komplex enthält neun sehr eng verwandte Spezies bzw. Genomovare, die sich nur schwer differenzieren lassen. Zur exakten Unterscheidung der Genomovare des B. cepacia Komplexes eignet sich die Sequenzierung spezifischer Regionen des 1043 bp großen RecA-Gens, deren Nukleotidsequenzen in den unterschiedlichen Genomovaren variieren (80; 87). Diese Methode wurde für diejenigen Proben durchgeführt, die in der 16S rRNAGen Sequenzierung als Mitglied des B. cepacia Komplex bestätigt wurden. Die Vorgehensweise der RecA-Gen Sequenzierung erfolgte analog zur oben beschriebenen 16S rRNA-Gen Sequenzierung. Die Amplifizierung des RecA-Gens erfolgte mit den Primern Methodik 35 BRC1 und BRC2, die Sequenzierung in zwei Ansätzen mit dem Primer BRC2 bzw. BRC4 (s. Kap. 2.2.). Für die PCR wurde Taq-Polymerase mit Q-Solution (Fa. Qiagen) verwendet, um die Effektivität der PCR bei GC-reicher DNA zu erhöhen. Die Identifizierung des RecA-Genomovars erfolgte anhand eines Gendatenbank-Vergleichs, der ebenfalls mit dem BLAST-Programm, wie in 3.6.4.7. beschrieben, durchgeführt wurde. 3.7. Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) Bei allen Patienten, bei denen Bakterien derselben Spezies an mehreren Untersuchungszeitpunkten isoliert und mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bestätigt wurden, wurde eine PFGE durchgeführt. 3.7.1. Prinzip der Methode Die PFGE ist eine molekulargenetische Methode der Bakterientypisierung, mit der die Zugehörigkeit von Bakterienisolaten gleicher Spezies zu bestimmten Stämmen nachgewiesen werden kann. So wird beispielsweise die Aufdeckung von Koinfektionen oder die Differenzierung zwischen persistierenden Infektionen und Eradikation mit anschließender Reinfektion ermöglicht. Nach Restriktion der chromosomalen DNA der Bakterien mit speziellen Restriktionsenzymen werden die Restriktionsfragmente in einer Gelelektrophorese der Größe nach aufgetrennt, wobei ein typisches Bandenmuster für jeden Bakterienstamm entsteht. Da bei dieser Methode größere DNA-Fragmente als bei einer PCR aufgetrennt werden müssen, wird die Gelelektrophorese in einem gepulsten elektrischen Feld durchgeführt. Dabei ändert das elektrische Feld in bestimmten Zeitabständen seine Ausrichtung. Die Methode gliedert sich in folgende Arbeitsschritte: (1) Einbettung der Bakterien in Agarosegel-Blöckchen (2) Isolierung der DNA der Bakterien (3) Restriktion der DNA mittels spezifischer Restriktionsenzyme (4) eigentliche Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) (5) Darstellung der Banden im Gel mittels Ethidiumbromid (6) Auswertung der PFGE. 3.7.2. Einbettung der Bakterien in Agarosegel-Blöckchen Zur Durchführung benötigt man eine Reinkultur der zu untersuchenden Bakterien auf einer 24-48 h bebrüteten Caso-Agarplatte ohne Blut. Methodik 36 Durchführung der Methode: - aus 10 ml 2 % iger Seal Plaque GTG Agarose und 500 µl 10 % iger SDS eine 2 % ige Agaroselösung herstellen und bei 56 °C warm halten - im PS-Tube durch Homogenisieren von 10-20 Kolonien in 2 ml CSB-Puffer eine Suspension mit einer Trübung von 0,65 McFarland herstellen, dann 490 µl dieser Zellsuspension mit 10 µl Proteinase K und 500 µl 2 %iger Agaroselösung versetzen - Gießen der Gel-Blöckchen in die vorbereitete Gel-Apparatur durch möglichst blasenfreies Einfüllen und 30 min. erstarren lassen 3.7.3. Isolierung der DNA der Bakterien - Die hart gewordene Gel-Blöckchen vorsichtig mit Hilfe eines Spatels aus dem Gießstand herausdrücken und in je 5 ml TE-Puffer einlegen - nach Abgießen des TE-Puffers 5 ml Lysepuffer und 25 µl Proteinase K zugegeben - Blöckchen über Nacht bei 50 °C in einem Schüttelwasserbad inkubieren - je 2 mal mit 10 ml 50 °C warmem Aqua bidest. bzw. TE-Puffer waschen 3.7.4. Restriktion der DNA In den gewaschenen Agaroseblöckchen liegt die chromosomale DNA nun in einer für die Restriktionsenzyme zugänglichen Form vor. Entsprechend den Empfehlungen von Tenover et. al (121) wurde das Restriktionsenzym SpeI verwendet. Grundlage der PFGE ist, dass epidemiologisch nicht verwandte Isolate individuelle Restriktionsfragmentmuster zeigen, während verwandte Isolate identische oder nur minimal unterschiedliche Muster aufweisen. Mittels SpeI enstehen bei P. aeruginosa und verwandten Spezies 20 - 25 Restriktionsfragmente in der Größe von 10 - 700 kb (121). Durchführung der Restriktion: - Agaroseblöckchen vorsichtig mit einem scharfen Skalpell auf die passende Größe zuschneiden und in 300 µl TE-Puffer einlegen - vorsichtiges Abpipettieren des Puffers - Zugabe von 50 µl NEB-2-Puffer ohne Restriktionsenzym (1335 µl Aqua bidest. + 150 µl NEB-2 (10 x Restriktionspuffer) + 15 µl BSA (100 x)) - 15 min. bei 37 °C schütteln, danach Puffer abnehmen und verwerfen - Zugabe von 50 µl NEB-2-Puffer mit Restriktionsenzym (1245 µl Aqua bidest. + 150 µl NEB-2 (10 x Restriktionspuffer) + 15 µl BSA (100 x) + 90 µl SpeI) - 4 h bei 37 °C schütteln, danach Puffer abnehmen und verwerfen - je 250 µl 0,5 x TBE-Puffer zugeben, um den Restriktionsverdau zu beenden Methodik 37 3.7.5. Pulsfeldgelelektrophorese - Gel-Gießform nach Anleitung des Herstellers zusammensetzen - Blöckchen exakt auf die Zähne des Gieß-Kamms positionieren - mit einem Tropfen bei 56° C flüssig gehaltener Agaroselösung (aus 1,75 g Seakem GTG Agarose und 175 ml 0,5 x TBE-Puffer) fixieren - Agarosegel ohne Blasenbildung in die Form gießen und 30 min. erstarren lassen - das Gel für 1 h in der mit 2,5 l 0,5 x TBE-Puffer gefüllten Kammer äquilibrieren Danach wurde der Lauf im CHEF-DR III Gerät mit folgenden Einstellungen gestartet: Laufzeit: 23 h, Pulszeiten: 5 - 40 sek. Spannung: 6 V, Temperatur: 14 °C, Ampere: Start: 144, Ende: 172 3.7.6. Färbung und Auswertung der PFGE Nach dem Gellauf wurde das Gel mit Ethidiumbromid (20 µl/400 ml H2O) gefärbt (dabei Nitril-Handschuhe tragen!) und in Wasser abgespült. Zur Betrachtung des Gels wurde UVLicht verwendet und das entstandene Bild mithilfe des PFGE-Geldokumentationssystems fotographisch dokumentiert. Die Interpretation der PFGE beruht auf Differenzen im Bandenvergleich. Bakterien desselben Stammes haben ein identisches Bandenmuster in der PFGE. Als nah verwandt gelten Isolate, die sich nur durch ein einziges genetisches Ereignis wie beispielsweise eine Punktmutation, eine Deletion oder eine Insertion der DNA unterscheiden, was im PFGE-Bild zu zwei bis drei unterschiedlichen Banden führt (121). Daher betrachteten wir Isolate, die Abweichungen bei maximal drei Banden zeigten, als einem Bakterienstamm zugehörig. Isolate, die im Bandenvergleich vier bis sechs Differenzen aufweisen, unterscheiden sich in zwei Mutationen und sind als möglicherweise verwandt betrachet, wohingegen Isolate mit mindestens sieben unterschiedlichen Bandenpositionen als unterschiedliche Stämme bewertet wurden. Ergebnisse 38 4. Ergebnisse 4.1. Identifizierung der Bakterienisolate Während des Studienzeitraumes vom 1.1.2003 bis zum 31.12.2003 wurden insgesamt 407 Isolate von gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien aus respiratorischen Proben von 82 Mukoviszidosepatienten der Mukoviszidose-Ambulanz der Universitätskinderklinik Ulm nachgewiesen. Die Identifizierung der Bakterien erfolgte in der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, in einem nach DIN EN ISO 15189 akkreditierten Labor, gemäß mikrobiologischer Standardmethoden (s. Kapitel 3). Der Gang der Diagnostik folgte dabei einem Algorithmus, der sowohl Morphologie als auch biochemische Merkmale der Bakterien berücksichtigt (s. Abb. 5). Typische Morphologie grünes Pigment Wachstum bei 42 °C Wachstum auf MacConkey-Agar sensibel gegenüber Colistin P. aeruginosa (n = 143) ausgezeichnete, sehr gute oder gute Identifizierung als P. aeruginosa im API Wachstum bei 42°C und auf MacConkey Agar Colistin sensibel P. aeruginosa (n = 18) Typische Morphologie (mukoide Kolonien) Wachstum bei 42 °C Wachstum auf MacConkey-Agar sensibel gegenüber Colistin Alle anderen API 20NE (n = 108) Mukoider P. aeruginosa (n = 156) Alle anderen Aufnahme in die Studie zur 16S rRNA-GenSequenzierung (n = 90) Abb. 5: Identifizierungsverfahren für gram-negative, Oxidase-positive Stäbchenbakterien mit Angabe der Anzahl n der jeweiligen, nach diesem Algorithmus identifzierten Isolate (P.= Pseudomonas) Ergebnisse 39 Anhand dieses Algorithmus konnten 299 der 407 Isolate als P. aeruginosa oder als mukoider P. aeruginosa identifiziert werden. Mit dem biochemischen Identifizierungssystem Api 20 NE wurden 18 weitere Isolate als P. aeruginosa identifiziert (s. Abb. 5). Darunter befanden sich zwei Proben mit der Bewertung „ausgezeichnete Identifizierung“, 12 Proben mit „sehr guter Identifizierung“ und vier Isolate mit „guter Identifizierung“ im Api 20 NE. Die verbleibenden 90 Isolate (22,2 % aller Isolate), die weder anhand typischer morphologischer Kriterien noch anhand eindeutiger Ergebnisse des Api 20 NE als P. aeruginosa identifiziert werden konnten, wurden in die vorliegende Studie eingeschlossen und mittels molekularbiologischer Identifizierungsverfahren untersucht. Sie stammen aus respiratorischen Sekreten von insgesamt 25 Mukoviszidosepatienten im Alter von zwei bis 40 Jahren. Um die Zugehörigkeit zur Studienpopulation zu sichern, wurde zunächst bei allen 90 Isolaten der Oxidase-Test wiederholt. Dieser fiel bei allen Isolaten positiv aus. Daraufhin wurde von allen Proben ein Gram-Präparat angefertigt. Alle Isolate färbten sich gramnegativ, aber bei zwei Isolaten handelte es sich nicht um gram-negative Stäbchen, sondern um gram-negative Kokken. Diese beiden Isolate wurden daher aus der Studie ausgeschlossen. Beide Stämme wurden später als Neisseria mucosa identifiziert. Somit wurden in der vorliegenden Arbeit insgesamt 88 Isolate mit Hilfe der 16S rRNA-GenSequenzierung identifiziert. Für diese 88 Isolate werden in den folgenden Abschnitten (4.1.1. bis 4.1.3.) zuerst die Ergebnisse der konventionellen Identifizierung mittels API 20 NE und die Beurteilung der Morphologie dargestellt. Anschließend werden die Ergebnisse der molekularbiologischen Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung dargestellt. Zuletzt werden die Ergebnisse der konventionellen Identifizierung mit denen der molekularbiologischen Identifzierung verglichen. 4.1.1. Konventionelle Identifizierung der Bakterien 4.1.1.1. Biochemische Identifizierung mittels Api 20 NE Der Api 20 NE ergab nur bei 47 % der Isolate (n=41) ein eindeutiges Ergebnis mit den folgenden Bewertungen: „ausgezeichnete Identifizierung“ (n=7; 8 %), „sehr gute Identifizierung“ (n=15; 17 %) und „gute Identifizierung“ (n=19; 22 %) (s. Tab.2). Dabei wurden Ergebnisse 40 mit dem Api folgende Spezies bestimmt: Agrobacterium radiobacter, Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia Komplex, Comamonas testosteroni/ Pseudomonas alcaligenes, Ochrobactrum anthropi, Photobacterium damsela, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas spp., Psychrobacter phenylpyruvicus und Ralstonia pickettii. Bei 11 Isolaten (13 %) ergab der Api 20 NE eine „akzeptierbare Identifizierung“ und bei 36 Isolaten (41 %) nicht akzeptable Bewertungen wie „geringe Selektivität“, „unzuverlässige Identifizierung“, „zweifelhaftes Profil“ oder „unakzeptierbares Profil“. Tab. 2: Ergebnisse des Api 20 NE: Bakterienstämme Anzahl Ausgezeichnete Identifizierung Agrobacterium radiobacter Achromobacter xylosoxidans Burkholderia cepacia Pseudomonas fluorescens 7 2 1 2 2 Sehr gute Identifizierung Burkholderia cepacia Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fluorescens 15 12 1 2 Gute Identifizierung Achromobacter xylosoxidans Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes Ochrobactrum anthropi Photobacterium damsela Pseudomonas species Pseudomonas fluorescens Psychrobacter phenylpyruvicus Ralstonia pickettii 19 2 6 2 3 1 3 1 1 Akzeptierbare Identifizierung Burkholderia cepacia Comamonas testosteroni/Pseudomonas alcaligenes Moraxella species Moraxella lacunata Oligella ureolytica Pasteurella species Pseudomonas fluorescens 11 1 3 1 1 1 3 1 geringe Selektivität unzuverlässige Identifizierung zweifelhaftes Profil unakzeptierbares Profil 25 4 3 4 Ergebnisse 41 4.1.1.2. Morphologische Beurteilung der Isolate Aufgrund der besonderen Bedeutung von P. aeruginosa bei Mukoviszidosepatienten wurden alle 88 Isolate auf das Vorhandensein von einigen für P. aeruginosa charakteristischen Eigenschaften, wie z. B. das Wachstumsverhalten bei 42 °C, die Anwesenheit von Hämolyse, Lindenblütenduft und metallischem Glanz, untersucht (s. Tab. 3). Diese Eigenschaften sind für P. aeruginosa zwar charakteristisch, aber nicht bei allen Stämmen vorhanden und bislang auch als nicht genügend spezifisch für eine eindeutige Identifikation des Erregers berichtet. Tab. 3: Prüfung der morphologischen Eigenschaften: Eigenschaft Anzahl der Isolate (Prozent) Wachstum bei 42 °C 69 (78 %) Hämolyse 37 (42 %) Metallischer Glanz 24 (27 %) Lindenblütenduft 15 (17 %) Metallischer Glanz + Lindenblütenduft 11 (13 %) 4.1.2. Molekularbiologische Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung konnte bei 87 der 88 Isolate (99 %) eine genaue Spezies bestimmt werden (s. Tab. 4). In einem Fall war die Identifizierung nur auf GenusEbene möglich (Chryseobacterium spp.). Die Spezies- bzw. Genusbestimmung erfolgte wie in Kapitel 3 beschrieben durch einen Homologievergleich der erhaltenen 16S rRNAGen-Sequenz mit den Sequenzen der GenBank-Datenbank anhand des BLASTAlgorithmus. Zusätzlich wurde von allen auf Spezies-Ebene identifizierten Sequenzen ein Homologievergleich mit den jeweiligen Sequenzen der definierten Typstämme (s. Kap. 3.6.4.7) durchgeführt. Die bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung erhaltenen Sequenzen wiesen bis auf zwei Ausnahmen eine Homologie von > 99 % zu den Sequenzen der jeweiligen Typstämme auf. Die beiden Ausnahmen P. putida und P. aeruginosa wiesen Homologien von 98,9 % bzw. 98,8 % auf. Ergebnisse 42 Tab. 4: Ergebnisse der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Bakterienstämme Anzahl % Pseudomonas aeruginosa 52 59,1 Achromobacter xylosoxidans 16 18,2 Burkholderia cepacia Komplex 10 11,4 Agrobacterium radiobacter 2 2,3 Chryseobacterium species 1 1,1 Inquilinus limosus 1 1,1 Ochrobactrum anthropi 1 1,1 Pseudomonas alcaligenes 1 1,1 Pseudomonas brassicacearum 1 1,1 Pseudomonas putida 1 1,1 Pseudomonas synxantha 1 1,1 Sphingomonas paucimobilis 1 1,1 Bei 59 % aller Isolate (n=52) handelte es sich um P. aeruginosa. Da in die Studie ursprünglich nur Isolate aufgenommen wurden, die mittels konventionellen Methoden im Rahmen der Routinediagnostik nicht als P. aeruginosa identifiziert wurden, ist dieses Ergebnis überraschend. Die große Anzahl der Fehlidentifizierungen von P. aeruginosa mit routinediagnostischen Methoden ist sehr bedeutsam, zumal eine Infektion mit P. aeruginosa mit einer schlechten Prognose und beträchtlichen therapeutischen Konsequenzen für den Mukoviszidosepatienten einhergeht. 4.1.3. Vergleich von konventioneller und molekularbiologischer Identifizierung Da sich das bei der Sequenzierung erhobene Artenspektrum deutlich von dem der biochemischen Identifizierung unterscheidet, wurden im Folgenden die Ergebnisse beider Methoden gegenüber gestellt. Wie man Tab. 5 entnehmen kann, wurde mit dem Api 20 NE nur bei 15 der 88 untersuchten Isolate (17 %) die korrekte Bakterienspezies erkannt. Eine relativ gute Übereinstimmung der Ergebnisse lag nur in der Gruppe mit der Bewertung „ausgezeichnete Identifizierung“ vor. Sogar bei den Bewertungen „sehr gute“ und „gute Identifizierung“ traten hohe Raten an Fehlidentifizierungen auf (67 % bzw. 84 %). Ergebnisse 43 Tab. 5: Vergleich der Api 20 NE-Ergebnisse mit den Sequenzierungsergebnissen Api 20NE Ausgezeichnete Identifizierung Agrobacterium radiobacter Achromobacter xylosoxidans Anzahl 16S rRNA Sequenzierung 7 2 Agrobacterium radiobacter 1 Achromobacter xylosoxidans Burkholderia cepacia Komplex Pseudomonas fluorescens 2 2 Sehr gute Identifizierung Burkholderia cepacia Komplex 15 12 Comamonas testosteroni / Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas fluorescens 1 Gute Identifizierung Achromobacter xylosoxidans Anzahl 2 1 Burkholderia cepacia Komplex Pseudomonas synxantha Pseudomonas brassicacearum 2 1 1 Burkholderia cepacia Komplex Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas alcaligenes 5 7 1 Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas putida 1 1 19 2 Achromobacter xylosoxidans 2 Comamonas testosteroni/ Pseudomonas alcaligenes Ochrobactrum anthropi 6 Pseudomonas aeruginosa 6 2 Photobacterium damsela Pseudomonas species Pseudomonas fluorescens Psychrobacter phenylpyruvicus Ralstonia pickettii 3 1 3 1 1 Ochrobactrum anthropi Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 1 1 3 1 3 1 1 Akzeptierbare Identifizierung Burkholderia cepacia Komplex Comamonas testosteroni/ Pseudomonas alcaligenes Moraxella species Moraxella lacunata Oligella ureolytica Pasteurella species Pseudomonas fluorescens 11 1 3 Burkholderia cepacia Komplex Pseudomonas aeruginosa 1 3 1 1 1 3 1 Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa 1 1 1 3 1 Geringe Selektivität Unzuverlässige Identifizierung Zweifelhaftes Profil Unakzeptierbares Profil 25 4 3 4 Bestätigung des API Ergebnisses Bestätigung des API Ergebnisses Bestätigung des API Ergebnisses Bestätigung des API Ergebnisses 2 0 0 0 2 Ergebnisse 44 Von sieben Isolaten, die im Api 20 NE „ausgezeichnet“ identifiziert wurden, konnten fünf durch die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung bestätigt werden. Die anderen beiden im Api als Pseudomonas fluorescens identifizierten Isolate wurden in der Sequenzierung jedoch als Pseudomonas synxantha und Pseudomonas brassicacearum identifiziert. Da diese beiden Arten allerdings nicht in der Datenbank des Api 20 NE enthalten sind, wäre eine korrekte Identifizierung mit dem Api nicht möglich gewesen. Von den 15 „sehr gut“ identifizierten Isolaten konnten mittels Sequenzierung nur fünf Isolate (33,3 %) bestätigt werden. Bei diesen fünf Isolaten handelte es sich um B. cepacia Komplex. Ein Pseudomonas alcaligenes wurde im Api zumindest „halb-richtig“ als Pseudomonas alcaligenes oder Comamonas testosteroni identifiziert. Besonders häufig kam in der Gruppe der „sehr gut“ identifizierten Isolate Achromobacter xylosoxidans vor (n=8), welcher im Api in sieben Fällen als Burkholderia cepacia Komplex und einmal als Pseudomonas fluorescens fehlidentifiziert wurde. Bei Betrachtung der 19 im Api „gut“ identifizierten Stämme fällt auf, dass nur drei Isolate korrekt identifiziert wurden (15,8 %): zwei Achromobacter xylosoxidans und ein Ochrobactrum anthropi. 15 Pseudomonas aeruginosa Isolate wurden fälschlicherweise für Comamonas testosteroni oder Pseudomonas alcaligenes, Photobacterium damsela, Pseudomonas fluorescens, Psychrobacter phenylpyruvicus oder Ralstonia pickettii gehalten. Unter den Isolaten mit „akzeptierbarer“ Identifizierung im Api befand sich nur ein einziger korrekt identifizierter Stamm. Es handelte sich um ein Isolat des B. cepacia Komplexes. Bei den 36 Isolaten mit nicht akzeptablen Api-Ergebnissen konnte die vom Api als am ähnlichsten vorgeschlagene Spezies nur in zwei Fällen bestätigt werden. Unter den übrigen Isolaten mit nicht akzeptierbaren Bewertungen befanden sich 27 Pseudomonas aeruginosa, vier Achromobacter xylosoxidans und je ein Isolat von Burkholderia cepacia Komplex, Chryseobacterium spp. und Inquilinus limosus. Ergebnisse 45 16S rRNA Sequenzierung Api 20NE Nicht identifiziert Achromobacter xylosoxidans Agrobacterium radiobacter Burkholderia cepacia Komplex Chryseobacterium spp. Comamonas testosteroni or P. alcaligenes Inquilinus limosus Moraxella lacunata Moraxella spp. Ochrobactrum anthropi Oligella ureolytica Pasteurella spp. Photobacterium damsela Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas brassicacearum Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas spp. Pseudomonas synxantha Psychrobacter phenylpyruvicus Ralstonia pickettii Sphingomonas paucimobilis 0 10 20 30 40 50 60 Abb. 6: Ergebnisse des Api 20 NE bzw. der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung mit Angabe der absoluten Häufigkeit (Anzahl) der identifizierten Stämme. Die Abkürzung P. steht für Pseudomonas und spp. für Spezies. Bemerkenswert am Vergleich der beiden Identifizierungsmethoden ist insbesondere, wie viele Isolate (n=52) des pathogenetisch so bedeutsamen Erregers P. aeruginosa mit den konventionellen Identifizierungsverfahren der Routinediagnostik übersehen wurden (s.Abb. 6). Daher wurde im Folgenden geprüft, in wieweit die oben beschriebenen charakteristischen morphologische Eigenschaften für die Identifizierung von P. aeruginosa geeignet sind (Tab. 6). Ergebnisse 46 Tab. 6: Betrachtung der P. aeruginosa - Isolate und der „Nicht - P. aeruginosa“Isolate in Bezug auf das Vorhandensein spezieller morphologischer Merkmale (P. = Pseudomonas; n = Anzahl) P. aeruginosa (n=52) Nicht-P. aeruginosa (n=36) Wachstum bei 42 °C 51 (98 %) 18 (50 %) Hämolyse 36 (69 %) 1 Metallischer Glanz 24 (46 %) 0 Lindenblütenduft 15 (29 %) 0 Metallischer Glanz + 11 (21 %) 0 (03 %) Lindenblütenduft Diese Daten zeigen, dass die Merkmale „metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ eine 100 % Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa haben und sich somit gut zur Diskrimination von P. aeruginosa gegenüber anderen gram-negativen Stäbchenbakterien eignen. Die Sensitivität der Merkmale „metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ für die Identifizierung von P. aeruginosa liegt jedoch nur bei 46 % bzw. 29 %. 4.2. Betrachtung ausgewählter Spezies In neueren Studien, die molekularbiologische Methoden zur Isolierung und Identifizierung ungewöhnlicher Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten anwandten, wurden vermehrt seltene oder zuvor noch nicht beschriebene Bakterienspezies und –gattungen, wie z. B. Pandoraea species, Ralstonia species, Bordetella species (z. B. B. bronchiseptica, B. holmesii), Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus etc., bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Die klinische Bedeutung dieser seltenen oder erst kürzlich entdeckten Bakterien als Infektionserreger des Respirationstraktes von Mukoviszidosepatienten konnte bislang noch nicht hinreichend geklärt werden. Auch Daten zur Epidemiologie dieser Bakterien fehlen weitestgehend. Desgleichen liegen auch noch keine Erkenntnisse über den Einfluß dieser seltenen Spezies auf andere Bakterien im Respirationstrakt des Patienten vor. Im Folgenden soll daher genauer auf die in der vorliegenden Arbeit nachgewiesenen Spezies Comamonas testosteroni, Pseudomonas alcaligenes, Agrobacterium radiobacter, Ochrobactrum anthropi und Inquilinus limosus eingegangen werden. Ergebnisse 47 4.2.1. Comamonas testosteroni und Pseudomonas alcaligenes Bei Comamonas testosteroni und P. alcaligenes handelt es sich um wenig pathogene Bakterien, die zur Familie der Pseudomonadaceae gehören. Berichte über Infektionen mit diesen Erregern sind selten. In der mikrobiologischen Routinediagnostik fiel auf, dass diese Erreger in den letzten Jahren häufiger in respiratorischen Sekreten von Mukoviszidosepatienten nachgewiesen wurden. Im Jahr 2003 erfolgte bei 15 Isolaten der Nachweis von Comamonas testosteroni oder P. alcaligenes im Api 20 NE. Dabei erhielt ein Isolat die Bewertung „sehr gute Identifizierung“, sechs Isolate „gute“ und drei „akzeptierbare Identifizierung“. Die übrigen fünf Isolate konnten diesen Spezies nur mit „geringer Selektivitat“ zugeordnet werden. Überraschenderweise wurde mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung nur einer der 15 vermeintlichen Comamonas testosteroni oder P. alcaligenes-Stämme als P. alcaligenes bestätigt. Die anderen 14 Isolate wurden als P. aeruginosa identifiziert. Comamonas testosteroni scheint somit bei den Patienten, die in der Ulmer Mukoviszidose-Ambulanz betreut werden, nicht vorzukommen. Auf den einmaligen Nachweis von P. alcaligenes bei einem Patienten wird unter 4.2.2. noch näher eingegangen. Anlässlich dieser hohen Rate an Fehlidentifizierungen muß das Ergebnis des Api 20 NE bei Nachweis der Spezies Comamonas testosteroni oder P. alcaligenes hinterfragt und gegebenenfalls durch molekularbiologische Methoden, wie die 16S rRNA-Gen- Sequenzierung, abgesichert werden. 4.2.2. Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi Diese beiden Spezies kommen häufig in der Umwelt vor, insbesondere in Erde und Humus. Agrobacterium radiobacter ist der häufigste, humanpathogene Vertreter der Gattung Agrobacterium. Ochrobactrum anthropi ist eng verwandt mit der Gattung Achromobacter. Erkrankungen durch diese Erreger umfassen insbesondere Infektionen von zentralen Kathetern oder anderen Fremdkörpern. Auch als Verursacher von Lungeninfektionen bei Mukoviszidosepatienten wurde Agrobacterium radiobacter vereinzelt beschrieben. Ochrobactrum anthropi wurde nach Literaturangaben noch nicht im Zusammenhang mit Mukoviszidosepatienten beschrieben. Daher ist über die Bedeutung von Ochrobactrum anthropi bei Mukoviszidosepatienten noch nichts bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi bei zwei Patienten gefunden: Ergebnisse 48 Bei einem 18-jährigen Patienten (Patient AP) wurde Agrobacterium radiobacter im Juli 2003 ganz vereinzelt neben vereinzeltem Vorkommen von Stenotrophomonas maltophilia und massenhaftem Vorkommen von Staphylococcus aureus nachgewiesen. Interessanterweise handelt es sich hierbei um denselben Patienten, bei dem P. alcaligenes im November 2003 detektiert wurde. Weder Agrobacterium radiobacter noch P. alcaligenes waren in der Lage, in der Lunge des Patienten zu persistieren, da sie jeweils nur an einem einzigen Zeitpunkt isoliert werden konnten. Abb. 7 verdeutlicht, welche anderen pathogenen Erreger in respiratorischen Sekreten des Patienten während des Studienzeitraumes nachgewiesen wurden. Es findet sich eine chronische Besiedlung mit Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus und Stenotrophomonas maltophilia. Summe der Nachweisraten Summe der Nachweisraten 12 10 8 6 4 2 17 .0 1. 2 1 4 0 03 .0 2. 2 0 3 0 03 .0 3. 2 1 7 0 03 .0 3. 2 0 1 0 03 .0 4. 2 2 8 0 03 .0 4. 2 1 0 0 03 .0 6. 2 0 4 0 03 .0 7. 2 2 1 0 03 .0 7. 2 0 5 0 03 .0 8. 2 2 0 0 03 .0 8. 2 0 3 0 03 .0 9. 2 2 5 0 03 .0 9. 2 2 1 0 03 .1 1. 20 03 0 Unte rs uchungsze itpunkte A. radiobacter H. influenza P. aeruginosa muk oid P. alcaligenes S. aureus S. maltophilia Abb. 7: Sämtliche Bakteriennachweise aus respiratorischen Proben von Patient AP im Jahr 2003 Das Untersuchungsmaterial wurde semiquantitativ kulturell angelegt und die Nachweisraten der einzelnen Erreger mit Punkten entsprechend ihrer Häufigkeit gekennzeichnet (ganz vereinzelt = 1, vereinzelt = 2, reichlich = 3, massenhaft = 4 ). A.= Agrobacterium; H.= Haemophilus; P.= Pseudomonas; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. maltophilia = Stenotrophomas maltophilia Ergebnisse 49 Bei einer 6-jährigen Patientin (Patient AO) wurden Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi an demselben Untersuchungszeitpunkt im April 2003 vereinzelt neben reichlichem Vorkommen von Haemophilus influenzae nachgewiesen. Weitere Spezies, die im Verlauf des Studienzeitraumes bei dieser Patientin aus Sputumproben isoliert wurden, beinhalten Staphylococcus aureus, Stenotrophomas maltophilia und Pseudomonas putida (s. Abb. 8). Auch bei dieser Patientin erfolgte der Nachweis von Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi nur einmalig. 8 Summe der Nachweisraten Summe der Nachweisraten 7 6 5 4 3 2 1 3 09 .0 9 .0 9 .2 .2 00 00 3 3 01 .0 8 07 .0 5 .2 .2 00 00 3 3 27 10 29 .0 4 .0 4 .2 .2 00 00 3 3 00 .2 .0 3 11 03 20 .0 1 .0 2 .2 .2 00 00 3 3 0 Untersuchungszeitpunkte A. radiobacter Chryseomonas luteola H. influenzae Ochrobactrum anthropi P. putida S. aureus S. maltophilia Abb. 8: Sämtliche Bakteriennachweise aus respiratorischen Proben von Patient AO im Jahr 2003 Das Untersuchungsmaterial wurde semiquantitativ kulturell angelegt und die Nachweisraten der einzelnen Erreger mit Punkten entsprechend ihrer Häufigkeit gekennzeichnet (ganz vereinzelt = 1, vereinzelt = 2, reichlich =3, massenhaft = 4 ). A.= Agrobacterium; H.= Haemophilus; P.= Pseudomonas; S. aureus = Staphylococcus aureus; S. maltophilia = Stenotrophomas maltophilia Aufgrund der bei beiden Patienten beobachteten chronischen Besiedlung mit mehreren pathogenen, für eine Progression der Lungenveränderungen bei Mukoviszidose relevanten Erregern, kann die klinische Bedeutung von Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi wie auch Pseudomonas alcaligenes anhand dieser beiden Patienten nicht näher beurteilt werden. Es wurde daher auf die Auswertung klinischer Daten sowie Laborparameter verzichtet. Ergebnisse 50 4.2.3. Inquilinus limosus Bei Inquilinus limosus handelt es sich um ein im Jahre 2002 neu entdecktes gramnegatives Stäbchenbakterium, das nicht mit den Pseudomonadaceae verwandt ist. In der Studie von Coenye et al., in der dieses Bakterium erstmals bei acht Patienten mit Mukoviszidose beschrieben wurde, wurde der Name Inquilinus limosus vorgeschlagen, da die Art charakteristische schleimige Kolonien bildet (limosus (Griechisch) = schleimig). Da diese neue Spezies erst einmalig in der obigen Veröffentlichung beschrieben wurde, ist ihre klinische Bedeutung noch unklar. Auch das natürliche Reservoir von Inquilinus limosus ist noch nicht bekannt, jedoch lässt seine enge Verwandtschaft zu anderen gramnegativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien eine Verbreitung in der Umwelt vermuten. Abb. 9: Ausbildung mukoider Kolonien bei Inqulinus limosus, angezüchtet auf Blutagarplatten, nach 48 - 72 - stündiger Bebrütung Unter den Bakterien der vorliegenden Arbeit wurde Inqulinus limosus erstmals in Deutschland nachgewiesen. Der Erreger wurde vereinzelt aus einer Sputumprobe eines 17jährigen Patienten isoliert, der zudem mit Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, inklusive der mukoiden Variante von P. aeruginosa, und Haemophilus influenzae chronisch besiedelt war. Der Nachweis des Inquilinus limosus erfolgte nach zweitägiger Inkubation bei 36 °C und weiteren vier Tagen Inkubation bei Raumluft auf einem Selektivagar für B. cepacia. Das Isolat zeichnete sich durch ausgeprägte Schleimbildung (s. Abb. 9) und Fehlen von Pigmentbildung, metallischem Glanz und Lindenblütenduft aus. Von den Pseudomonaden und den meisten anderen gram-negativen Bakterien lässt sich Inquilinus limosus durch fehlendes Wachstum auf MacConkey-Agar unterscheiden. Im Api 20 NE wurde das Isolat als Sphingomonas paucimobilis mit zweifelhaftem Profil fehlidentifiziert. Die endgültige Identifizierung erfolgte mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, bei der sich Ergebnisse 51 eine Homologie von 99,8 % zum 16S rRNA-Gen des Inquilinus limosus–Typstammes LMG 20952T zeigte. Der mit Inquilinus limosus infizierte Patient wurde auch über den Zeitraum dieser Studie hinaus in der Mukoviszidose-Ambulanz weiter betreut und es wurden bis März 2005 vier weitere Sputumproben untersucht. Der Inquilinus limosus-Stamm persistierte über 17 Monate trotz mehrfach durchgeführter Antibiotika-Therapien zur Pseudomonas aeruginosa-Eradikation. Möglicherweise trägt die ausgeprägte Schleimbildung dieser Spezies zur Persistenz und zur Resistenz gegenüber Antibiotika bei. Eine Beurteilung der klinischen Relevanz des Erregers war, analog zu den oben beschriebenen Spezies, aufgrund der chronischen Besiedlung mit anderen pathogenen Erregern nicht möglich. 4.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung Wenn bei einem Patienten an mindestens zwei verschiedenen Untersuchungszeitpunkten mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung die gleiche Bakterienspezies nachgewiesen wurde, wurde eine molekulare Typisierung der Erreger vorgenommen. Dies diente der Klärung der Frage, ob es sich um eine persistierende Infektion oder um eine Reinfektion mit derselben Spezies handelte. Bei Nachweis der gleichen Bakterienspezies bei verschiedenen Patienten wurde zusätzlich untersucht, ob die Patienten mit einem identischen Stamm inifiziert sind, das heißt, ob möglicherweise eine Übertragung des Erregers zwischen den Patienten stattgefunden hat. Für die Erregertypisierung wurde die Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) angewandt. Es handelt sich hierbei um eine molekularbiologische Methode, mit der die Zugehörigkeit von Bakterienisolaten gleicher Spezies zu bestimmten Stämmen bzw. Klonen nachgewiesen werden kann. Ein mehrfacher Nachweis derselben Bakterienspezies fand sich bei Achromobacter xylosoxidans, Burkholderia cepacia Komplex und Pseudomonas aeruginosa. Diese Arten werden daher im Folgenden näher beschrieben. 4.3.1. Achromobacter xylosoxidans Achromobacter xylosoxidans ist ein wenig pathogenes Bakterium, das eng mit Bordetella spp. verwandt ist. Es kommt ubiquitär in der Umwelt vor und wird nur selten als Verursacher humaner Infektionen beschrieben. Bei Mukoviszidosepatienten kann A. xylosoxidans hingegen persistierende Infektionen bzw. chronische Besiedlungen des Respirationstraktes auslösen. Es wird vermutet, dass dies eine Rolle bei der Verschlechterung der pulmonalen Funktion spielt. A. xylosoxidans besitzt zwei Subspezies Ergebnisse 52 (ssp. xylosoxidans und ssp. denitrificans), aber bislang wurde nur die Subspezies xylosoxidans bei Mukoviszidosepatienten nachgewiesen. Zur molekularen Epidemiologie einzelner Stämme bei chronischen Infektionen liegen bisher nur wenige Daten vor. In der vorliegenden Arbeit fanden sich insgesamt 16 Isolate von A. xylosoxidans unter den 88 Isolaten der Studienpopulation (18 %). Diese 16 Proben stammen von vier Patienten, so dass 4,9 % aller 82 Patienten der Mukoviszidose-Ambulanz innerhalb des einjährigen Studienzeitraumes besiedelt waren. Bei allen A. xylosoxidans Isolaten handelte es sich um die Subspezies xylosoxidans. Neben der biochemischen Identifizierung (s. Kap. 4.1.3.) bereitete bei dieser Spezies auch die molekulare Identifizierung Schwierigkeiten: Acht A. xylosoxidans Isolate wurden mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zunächst fälschlicherweise als Alcaligenes faecalis identifiziert. Diese Fehlidentifizierung beruhte auf einer falschen Benennung der Sequenz AJ509012 in der GenBank-Datenbank. Bei diesem GenBank-Eintrag handelte es sich um eine 16S rRNA-Gen-Sequenz von A. xylosoxidans, die jedoch als Alcaligenes faecalis in der Datenbank benannt ist. Durch Homologievergleiche dieser Sequenz mit den 16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme von Alcaligenes faecalis (ATCC 8750, GenBank-Eintrag M22508) und Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC 9220, GenBank-Eintrag AF411021) konnte der Fehler aufgeklärt werden. Der Datenbankfehler (AJ509012) hatte jedoch in der Routinediagnostik dazu geführt, dass drei Isolate fälscherlicherweise als Alcaligenes faecalis befundet worden waren (s. auch unten). Bei drei Patienten wurde A. xylosoxidans innerhalb des einjährigen Studienzeitraumes mehr als einmal isoliert, so dass bei diesen Patienten Verlaufsbeurteilungen durchgeführt werden konnten, die im Folgenden dargestellt werden. Patient A1 ist ein 12-jähriger Patient, bei den fünf A. xylosoxidans Isolate von fünf verschiedenen Zeitpunkten zwischen April und Oktober 2003 nachgewiesen wurden. Wie man Abb. 10, A1 entnehmen kann, lag eine persistierende Infektion mit einem einzigen Stamm vor. Patient A2 ist ein 31-jähriger Patient, bei dem sechs A. xylosoxidans Isolate detektiert wurden. Diese Proben stammen von drei verschiedenen Zeitpunkten zwischen Januar und Oktober 2003. Auch bei diesem Patienten bestand eine persistierende Infektion mit einem einzelnen Stamm (s. Abb 10, A2). Da dieser Stamm nicht mit demjenigen von Patient A1 identisch ist, hat keine Infektionsübertragung zwischen den beiden Patienten beim Kontakt in der Mukoviszidose-Ambulanz stattgefunden. Ergebnisse 53 4 5 6 7 10 1 A1 3 10 A2 Abb. 10: Pulsfelsgelelektrophorese-Bilder der Alcaligenes xylosoxidans Stämme (links Patient A1, rechts Patient A2). Die Entnahmezeitpunkte der Proben sind durch weiße Striche unterteilt. Die entsprechenden Monate des Jahres 2003 stehen in Zahlen über der jeweiligen Spur. Bei Patient A3 (16 J.) lagen drei A. xylosoxidans Isolate an drei verschiedenen Zeitpunkten vor. Der Api 20 NE ergab drei unterschiedliche Ergebnisse für diese Isolate und auch die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, die bei den ersten beiden Isolaten bereits im Rahmen der Routinediagnostik durchgeführt worden war, ergab beste Homologien für unterschiedliche Gensequenzen (s. Tab. 7). Tab. 7: Identifizierungsergebnisse der Isolate von Patient A3: Ergebnis des Ergebnis Ergebnis der Sequenzierung Api 20 NE auf Befund (Genbank-Nummer) Isolat 1 Alcaligenes faecalis, Pseudomonas Uncultured ß-Proteobacterium (07.05.03) unzuverlässige Identifizierung species (AY 695723) Isolat 2 Alcaligenes denitrificans, Pseudomonas Alcaligenes faecalis (22.05.03) geringe Selektivität species (AJ 509012) Isolat 3 Pasteurella species, Alcaligenes Alcaligenes faecalis (10.07.03) geringe Selektivität faecalis (AJ 509012) Ergebnisse 54 Die Fehlidentifizierungen der Isolate zwei und drei als A. faecalis sind auf den zuvor beschriebenen Fehler (s. S. 51) der Sequenz AJ 509012 in der Genbank-Datenbank zurückführen. Dieser Genbank-Eintrag war fälschlicherweise als A. faecalis benannt worden. In Wahrheit handelte es sich aber um einen Achromobacter xylosoxidans. Erst in der Pulsfeldtypisierung stellt man überraschenderweise fest, dass es sich allen drei Isolaten um den gleichen Stamm handelt (s. Abb. 11). 5 5 7 Abb. 11: Pulsfeldgelelektrophorese-Bild der Alcaligenes xylosoxidans Stämme von Patienten A3. Die Entnahmezeitpunkte der Proben sind durch weiße Striche unterteilt. Die entsprechenden Monate des Jahres 2003 stehen in Zahlen über der jeweiligen Spur. Bei Isolat drei fällt auf, dass eine Mutation vorliegt, die zu einem höher molekularen Restriktionsfragment geführt hat. Dennoch ist dieses Isolat nach den Interpretationsrichtlinien der PFGE (s. Kap. 3.7.6.) als zugehörig zum gleichen Stamm zu betrachten. Zusammenfassend läßt sich über die Verlaufuntersuchungen der Infektionen mit A. xylosoxidans sagen, dass bei allen drei Patienten persistierende Infektionen mit einem einzigen Stamm vorlagen. Dabei veranschaulichten die PFGE-Bilder, dass jeder der drei Patienten seinen eigenen Stamm trug. Somit konnten bei diesen drei Patienten Infektionsübertragungen beim Kontakt in der Mukoviszidose-Ambulanz ausgeschlossen werden. Ergebnisse 55 4.3.2. Burkholderia cepacia Komplex Der B. cepacia Komplex enthält neun sehr eng verwandte Spezies, die früher als Genomovare bezeichnet wurden und sich mit der Sequenzierung des 16S rRNA-Gens nur schwer differenzieren lassen. Sie zeigen jedoch Variationen in der Nukleotidsequenz des 1043 bp großen RecA-Gens. In der vorliegenden Arbeit wurden mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zehn Isolate des B. cepacia Komplexes detektiert (11,4 % der 88 Isolate), die in der weiteren Untersuchung mittels RecA-Gen-Sequenzierung alle als B. multivorans identifiziert wurden. Die zehn Isolate stammen von drei verschiedenen Patienten (B1 –B3). 4 1 B1 8 10 B2 Abb. 12: B 1: Burkholderia mulivorans Stamm an einem Untersuchungszeitpunkt im April 2003 von Patient B1 B 2: Burkholderia mulivorans Stämme an drei Untersuchungszeitpunkten im Jahr 2003 von Patient B2 Die Untersuchungszeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren geben den jeweiligen Monat aus dem Jahr 2003 an, in dem die Probe entnommen wurde. Ergebnisse 56 Patient B1 ist eine 17-jährige Patientin, bei der nur eine einzige Sputumprobe vorlag, so dass keine Verlaufsuntersuchung durchgeführt werden konnte. Um jedoch einen Vergleich ihres B. multivorans Stammes mit den Stämmen der anderen Patienten durchführen zu können und dadurch Rückschlüsse auf Infektionsübertragungen zu ermöglichen, wurde trotzdem eine PFGE dieses einzelnen Stammes durchgeführt (s. Abb. 12, B1). Es zeigte sich, dass die B. multivorans Stämme der drei Patienten (B1-B3) nicht identisch sind. Patient B2 ist eine 22-jährige Patientin, bei der innerhalb von zehn Monaten drei Isolate von B. multivorans nachgewiesen wurden. Die PFGE zeigte, dass es sich bei allen 3 Isolaten um denselben Stamm handelt (s. Abb. 12, B2) und somit eine persistierende Infektion mit einem B. multivorans-Stamm vorlag. Patient B3 ist ein 28-jähriger Patient, bei dem an drei aufeinanderfolgenden Untersuchungszeitpunkten innerhalb von fünf Monaten insgesamt sechs morphologisch unterschiedliche Isolate nachgewiesen wurden. Die molekulare Erregertypisierung ergab, dass es sich um drei unterschiedliche Stämme handelte (s. Abb. 13). Während eine persistierende Infektion mit Stamm A vorlag, fand sich an zwei Zeitpunkten eine temporäre Koinfektion mit zwei verschiedenen B. multivorans Stämmen (B und C). M 7/03 A 8/03 A B 11/03 A C C Abb. 13: Burkholderia multivorans Stämme von Patient B3 an drei Untersuchungszeitpunkten im Jahr 2003. Die Untersuchungszeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. In der mit M bezeichneten Spur wurde der Marker eingesetzt. Die unterschiedlichen Stämme wurden mit A, B und C benannt. Ergebnisse 57 In Abb. 13 ist erkennbar, dass im Verlauf des Jahres 2003 Koinfektionen mit unterschiedlichen B. multivorans-Stämmen vorlagen. Diese Erkenntnis stellt ein bisher nur vermutetes, aber zuvor noch nicht bewiesenes Detail der molekularen Epidemiologie von B. multivorans dar. Die beiden koinfizierenden Stämme waren nicht in der Lage, den persistierenden Stamm zu verdrängen. In der weiteren Verlaufsbeurteilung nach Ende des Studienzeitraumes zeigte sich zudem, dass die chronische Infektion mit dem persistierenden Stamm auch in den folgenden neun Monaten bestand. Aufgrund dieser besonderen Beobachtung wurde im Folgenden geprüft, ob sich die unterschiedlichen Stämme in Bezug auf ihre morphologischen Charakteristika, ihren sog. Phänotyp oder ihre Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika, ihren sog. Resistenztyp, unterscheiden lassen. Dafür wurde in Abhängigkeit von morphologischen Charakteristiken wie Koloniefarbe, Wachstumsgeschwindigkeit, Schleimbildung und Adhärenz der Kolonien u.s.w. jedem Isolat ein morphologischer Typ von A bis E zugeordnet. Basierend auf den Ergebnissen der Empfindlichkeitsprüfung (s. Kap. 3.5.) wurde jedes Antibiogramm einem sogenannten Resistenztyp zugeordnet. Ein Resistenztyp unterschied sich von einem anderen in einer abweichenden Bewertung mindestens eines Antibiotikums als sensibel, intermediär oder resistent. Die Abweichungen betrafen dabei folgende Substanzen: Cefotaxim, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Meropenem. Der Vergleich der Phänotypen (Morphologischer Typ und Resistenztyp) mit den Genotypen (PFGE-Typen) zeigt, dass keine Korrelationen zwischen Phänotyp und Genotyp feststellbar ist (s. Tab. 8). Somit lassen morphologische Merkmale und Ergebnisse der Empfindlichkeitsprüfung keine Rückschlüsse auf das Vorliegen eines bestimmten Stammes bzw. PFGE-Typs zu. Tab. 8 : Vergleich von Morphologischem Typ, Resistenz-Typ und Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) -Typ Date Morphologischer Typ Resistenz-Typ PFGE-Typ 7/2003 A A A 8/2003 B B A 8/2003 A B B 11/2003 C C A 11/2003 D C C 11/2003 E C C Ergebnisse 58 4.3.3. Pseudomonas aeruginosa Infektionen mit P. aeruginosa sind bei Mukoviszidosepatienten sehr häufig. Mit 52 Isolaten war P. aeruginosa auch die häufigste Spezies der vorliegenden Arbeit, obwohl nur Isolate aufgenommen wurden, die mit konventionellen Methoden nicht als P. aeruginosa identifiziert werden konnten. Die initiale Infektion mit P. aeruginosa geht häufig in eine chronische Infektion über, in deren Verlauf es auch zum Erwerb zusätzlicher Stämme oder deren Verlust kommen kann. Übertragungen des Erregers auf andere Patienten bei gemeinsamen Aktivitäten oder beim Kontakt in einer Mukoviszidose-Ambulanz sind wohl eher selten, wurden aber berichtet. Zur Erkennung solcher Übertragungen oder zu Entdeckung zusätzlicher Stämme ist eine molekulare Erregertypsisierung notwendig. Diese wurde in der vorliegenden Arbeit bei sechs Patienten (P1 bis P6), bei denen P. aeruginosa innerhalb des einjährigen Studienzeitraumes mehrmals isoliert wurde, mittels PFGE durchgeführt (s. Abb. 14 und 15). Bei Patient P5 konnte P. aeruginosa sogar 21 Mal an elf verschiedenen Untersuchungszeitpunkten isoliert werden. M 9 11 P1 1 2 3 4 5 7 8 11 P2 2 3 P3 7 3 10 M P4 Abb. 14: Pulsfeldgelelektrophorese-Bilder der an mehreren Zeitpunkten nachgewiesenen Pseudomonas aeruginosa Stämme der Patienten P1 bis P4. Die Entnahmezeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren sind die Monate des Jahres 2003, in denen die Proben entnommen wurden. In den äußeren, mit M bezeichneten Spuren wurde der Marker eingesetzt. Bei Patient P1 wurde eine Probe von 11/2003 in den beiden rechten äußeren Spuren des Patienten versehentlich doppelt aufgetragen. Daher sind fünf Gelbanden dargestellt, obwohl Pseudomonas aeruginosa nur an vier verschiedenen Zeitpunkten isoliert wurde. Ergebnisse M 1 1 59 2 3 4 4 6 7 7 10 11 12 1 3 7 M A B A C A A A B A A A A A A A A A A A A A P5 P6 Abb. 15: Pulsfeldgelelektrophorese-Bilder der an mehreren Zeitpunkten nachgewiesenen Pseudomonas aeruginosa Stämme der Patienten P5 und P6. Die Entnahmezeitpunkte sind durch weiße Striche unterteilt. Die Zahlen über den Spuren sind die Monate des Jahres 2003, in denen die Proben entnommen wurden. In den äußeren mit M bezeichneten Spuren wurde der Marker eingesetzt. Die verschiedenen Stämme des Patienten P5 wurden mit A, B und C markiert. Patienten P1 (18 J.), P2 (32 J.), P3 (26 J.) und P6 (39 J.) weisen persistierende Infektionen mit je einem einzelnen, identischen Stamm auf, welcher sich von den Stämmen der anderen Patienten unterscheidet (s. Abb. 14 und 15). Patient P4 (40 J.): P. aeruginosa wurde im Jahr 2003 sowohl im März als auch im Oktober aus respiratorischen Proben isoliert. Die PFGE zeigt, dass es sich um zwei verschiedene P. aeruginosa Stämme handelt. Folglich kam es nach der Infektion im März zur Eradikation von P. aeruginosa und im Oktober zur Reinfektion mit einem anderen Stamm derselben Spezies (s. Abb. 14). Patient P5 (36 J.): bei dieser Patientin wurde P. aeruginosa an elf Untersuchungszeitpunkten im Studienzeitraum isoliert. Im PFGE-Bild erkennt man insgesamt drei unterschiedliche P. aeruginosa Stämme (s. Abb. 15). Stamm A ist Verursacher einer persistierenden Infektion, die Stämme B und C verursachen kurzzeitige Koinfektionen. Das zeitliche Auftreten der Stämme A, B und C ist in Tab. 9 dargestellt: Ergebnisse 60 Tab. 9: Infektionsverlauf bei Patient P5 mit drei verschiedenen Pseudomonas aeruginosa Stämmen A, B und C. Es sind die Untersuchungszeitpunkte, an denen Sputumproben gewonnen wurden, und die Nachweise der unterschiedlichen Pseudomonas aeruginosa Stämme A, B und C am jeweiligen Datum dargestellt. Datum 01.01.02 17.01.03 26.02.03 12.03.03 15.04.03 30.04.03 Bis Dez.03 Stamm A A A A A A A Stamm - B - - B - - Stamm - - C - - - - Zusammenfassend zeigte sich bei den Verlaufuntersuchungen der mit P. aeruginosa kolonisierten Patienten, dass jeder der Patienten einen eigenen Stamm trug. Damit konnten bei diesen sechs Patienten Infektionsübertragungen beim Kontakt in der MukoviszidoseAmbulanz ausgeschlossen werden. 4.3.3.1. API 20NE Ergebnisse von persistierenden P. aeruginosa-Stämmen Aufgrund der hohen Unzuverlässigkeit des Api 20 NE bei der Identifizierung der P. aeruginosa Stämme dieser Studie, stellte sich die Frage, in wieweit die Api Ergebnisse bei einem identischen, mehrmals nachgewiesenen Stamm voneinander abweichen. Tatsächlich unterschieden sich die Api-Ergebnisse derselben Stämme an den unterschiedlichen Untersuchungszeitpunkten beträchtlich. Nachfolgende Auflistung zeigt die Api Ergebnisse von den fünf persistierenden Stämmen. Dabei wurden Ergebnisse mit nicht akzeptablen Api-Bewertungen („geringe Selektivität“, „unzuverlässige Identifizierung“, „zweifelhaftes Profil“ oder „unakzeptierbares Profil“) nicht berücksichtigt. In Klammern ist jeweils die Anzahl der Isolate, bei denen das jeweilige Ergebnis auftrat, aufgeführt. - Stamm 1 (gefunden an 11 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P5, Stamm A) Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (2) Gute Identifizierung: P. fluorescens (2) Akzeptierbare Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (3) Akzeptierbare Identifizierung: Moraxella lacunata (1) Akzeptierbare Identifizierung: Pasteurella spp. (1) Ergebnisse - Stamm 2 (gefunden an 8 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P2) Gute Identifizierung: Photobacterium damsela (2) Gute Identifizierung: Psychrobacter phenylpyruvicus (1) Akzeptierbare Identifizierung: Moraxella spp. (1) Akzeptierbare Identifizierung: Oligella ureolytica (1) - Stamm 3 (gefunden an 3 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P3) Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (2) - Stamm 4 (gefunden an 2 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P6) Gute Identifizierung: Comamonas testosteroni/P. alcaligenes (1) Akzeptierbare Identifizierung: Pasteurella spp. (1) - Stamm 5 (gefunden an 2 Untersuchungszeitpunkten bei Patient P1) Akzeptierbare Identifizierung: P. fluorescens (1) 61 Diskussion 62 5. Diskussion Chronische Infektionen der Lunge stellen die Hauptursache für den frühen Tod von Mukoviszidosepatienten dar (22; 67). Als Auslöser der pulmonalen Infektionen kommen verschiedene Bakterien und Pilze in Betracht, wobei die Häufigkeitsverteilung der Erreger je nach Alter der Mukoviszidosepatienten unterschiedlich ist (41). Die häufigsten pathogenen Bakterien umfassen Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus und die Spezies des Burkholderia cepacia Komplexes (41; 67; 78; 89). Sie alle, aber insbesondere P. aeruginosa und B. cepacia Komplex, gehen mit einer progredienten Verschlechterung der Lungenfunktion einher. Neben den oben genannten Spezies können jedoch auch seltenere Bakterien, wie z. B. andere gram-negative, Oxidasepositive nonfermentative Stäbchenbakterien, Infektionen des Respirationstraktes verursachen. Viele dieser Bakterien kommen ubiquitär in der Umwelt vor. Die Identifizierung von Bakterien erfolgt im Rahmen der mikrobiologischen Routinediagnostik in der Regel mit konventionellen biochemischen Verfahren, wie z. B. der Prüfung spezieller Stoffwechseleigenschaften. Die Identifizierung vieler seltener Spezies aus respiratorischen Proben von Mukivoszidose-Patienten, insbesondere aus der Gruppe der gram-negativen, nonfermentativen Stäbchenbakterien, ist mit konventionellen Methoden allerdings oft schwierig und mit einer hohen Rate an Fehlidentifizierungen verbunden (65; 87; 110; 124). Dies ist unter anderem darauf zurückzuführen, dass bei Mukoviszidosepatienten auch phänotypisch ungewöhnliche Varianten der Bakterien auftreten (97; 113). Molekulare Methoden umgehen das Problem der phänotypischen Variabilität und ermöglichen auch bei phänotypisch ungewöhnlichen Varianten eine zuverlässige Identifizierung (113; 130). Die eindeutige Identifizierung aller obligat und fakultativ pathogenen Bakterien in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten ist eine notwendige Voraussetzung für die Erhebung epidemiologischer Daten, für die Beurteilung der klinischen Relevanz der Bakterien bei Mukoviszidosepatienten und letztendlich für eine adäquate Therapie des Patienten. 5.1. Identifizierung der Bakterienisolate In der vorliegenden Arbeit wurden daher alle gram-negativen, Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten (n=88), die im Jahr 2003 im Rahmen der mikrobiologischen Routinediagnostik Diskussion 63 mit konventionellen Identifizierungsmethoden nicht eindeutig identifiziert werden konnten, mittels molekularbiologischer Methoden untersucht. Alle Isolate, die anhand typischer Morphologie und charakteristischer Eigenschaften, wie Wachstum bei 42 °C, Wachstum auf MacConkey-Agar, Sensibilität gegenüber Colistin und Bildung von grünem Pigment (s. auch 3.3.), im Rahmen der Routinediagnostik eindeutig als P. aeruginosa identifiziert wurden, wurden nicht in diese Studie aufgenommen. Die routinemäßig durchgeführten Methoden der konventionellen Identifizierung beinhalteten sowohl die morphologische Beurteilung der Isolate, wie Pigmentbildung, Schleimbildung und Wachstumsverhalten, als auch die biochemische Identifizierung mittels Api 20 NE. Der Api ist eine weit verbreitete, kommerziell erhältliche Identifizierungsmethode (70; 104). Für die eindeutige molekularbiologische Identifizierung der Bakterien wurde in dieser Arbeit die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens durchgeführt. Das 16S rRNA-Gen kodiert für die kleine Untereinheit der ribosomalen RNA. Es ist im Genom aller Bakterien in zumeist mehreren Kopien enthalten und besitzt sowohl konstante, universelle als auch spezifische, variable Bereiche (s. Abb.3 in Kap. 1.3.2.). Anhand dieser von Spezies zu Spezies variierenden Bereiche erfolgt die Differenzierung der Bakterien (119). Die DNASequenzierung gilt als sehr zuverlässige Methode zur Identifizierung und taxonomischen Einteilung von Bakterien (29; 38; 44; 119). Sie eignet sich genauso für schnell wachsende wie für anspruchsvolle, langsam wachsende Bakterien und liefert auch bei phänotypisch ungewöhnlichen Varianten einer Spezies sehr zuverlässige Ergebnisse (40; 130). Ein weiterer Vorteil der DNA-Sequenzierung liegt darin, dass die Interpretation der Ergebnisse nach objektiven Kriterien erfolgt und nicht mit subjektiven Entscheidungen verbunden ist (115; 119). Die Ergebnisse der in dieser Arbeit durchgeführten molekularen Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen-Sequenzierung erlauben eine retrospektive Beurteilung der Zuverlässigkeit der konventionellen Identifizierung der Bakterien im Rahmen der Routinediagnostik. Der Vergleich der beiden Identifizierungsmethoden (s. Tab. 5 in Abschnitt 4.1.3.) zeigte, dass nur eine Minderheit (17 %) der 88 untersuchten Isolate mit dem Api 20 NE korrekt identifiziert worden war. Nur in der Gruppe mit der Api-Bewertung „ausgezeichnete Identifizierung“ lag eine gute Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des Api 20 NE und der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung vor. Sogar bei den Api-Bewertungen „sehr gute Identifizierung“ und „gute Identifizierung“ traten hohe Raten an Fehlidentifizierungen auf (67 % bzw. 84 %). Diskussion 64 Diese hohen Raten an Fehlidentifizierungen betrafen verschiedene Spezies. Bei genauer Betrachtung fielen aber drei besonders häufige Fehler des Api 20 NE auf: Der häufigste Fehler betraf die Fehlidentifizierung von P. aeruginosa. Insgesamt wurden 52 Isolate von P. aeruginosa im Api 20 NE nicht erkannt. Auf die Bedeutung dieses signifikanten Ergebnises wird später ausführlich eingegangen. Der zweite häufige Fehler betraf die Fehlidentifizierung von Achromobacter xylosoxidans als Spezies des B. cepacia Komplexes. Dieser Fehler trat sogar in den vom Api als zuverlässig bewerteten Kategorien auf: Sieben der zwölf in der Kategorie „sehr gute Identifizierung“ als B. cepacia Komplex identifizierten Stämme wurden in der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als A. xylosoxidans identifiziert. Die Beobachtung der häufigen Verwechselungen von A. xylosoxidans mit Spezies des B. cepacia Komplex in der vorliegenden Arbeit bestätigt eine frühere Veröffentlichung von McMenamin et al. (87). Desgleichen betrafen auch in einer weiteren Studie die häufigsten Fehlidentifizierungen des Api 20 NE die Identifizierung von A. xylosoxidans, P. aeruginosa, und Stenotrophomas maltophilia als B. cepacia Komplex (38). Ferner betrug die Rate der mittels phänotypischer Methoden, wie u. a. dem Api 20 NE, fehlidentifizierten A. xylosoxidans in einer Studie aus dem Jahr 2001 11 %, wobei auch hier die A. xylosoxidans-Stämme als P. aeruginosa, B. cepacia und Stenotrophomas maltophilia fehlidentifiziert wurden (104). Diese mehrfach berichtete hohe Rate an Fehlidentifizierungen von A. xylosoxidans ist besonders in Hinsicht auf seine Fähigkeit zur Verursachung chronischer Infektionen und seine bislang noch unklare klinische Relevanz bedeutsam. Schließlich ist die korrekte Identifizierung von A. xylosoxidans Voraussetzung, um dessen Bedeutung bei Mukoviszidosepatienten endgültig klären zu können. Der dritte auffällige Fehler betraf die falsche Identifizierung seltener Spezies nonfermentativer Stäbchenbakterien. Gemäß den in der Routinediagnostik erhaltenen Api-Ergebnissen bestand die Annahme, dass einige seltenere Bakterienspezies, wie Comamonas testosteroni und P. alcaligenes, häufiger bei Mukoviszidosepatienten nachweisbar sind als zumeist in der Literatur angenommen wird. Beispielsweise wurden 15 der 88 Isolate im Api 20 NE als C. testosteroni/P. alcaligenes identifiziert. Allerdings stellte sich bei der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung heraus, dass 14 der 15 Isolate im Api fehlidentifiziert wurden und es sich in Wahrheit um P. aeruginosa handelte. Auch andere seltene Spezies, wie z. B. P. fluorescens, waren im Api mit zu großen Häufigkeiten identifiziert worden. Somit können die fehlerhaften Api-Ergebnisse bei dieser Gruppe der Diskussion 65 schwierig zu identifizierenden, nonfermentativen Stäbchenbakterien zur Überschätzung der Häufigkeit seltenerer Spezies führen (132). In einer Studie, in der drei verschiedene, kommerzielle Identifizierungsmethoden für gram-negative Spezies verglichen wurden, zeigte der Api mit 92 % korrekten Identifizierungen noch die besten Ergebnisse (70). Ebenso wurde in einer Studie von van Pelt et al. (124) die Überlegenheit des Apis unter den kommerziell erhältlichen Identifizierungsmethoden für die phänotypische Identifizierung von B. cepacia und P. aeruginosa beschrieben. Dennoch traten auch hier in einer bedeutenden Anzahl Fehlidentifizierungen insbesondere von den seltenen Nonfermentern B. gladioli und Ralstonia pickettii, aber auch Fehlidentifizierungen von A. xylosoxidans mit Spezies des B. cepacia Komplex, auf (124). Der häufigste und bedeutsamste Fehler war die Fehlidentifizierung von 52 Isolaten von P. aeruginosa (59 % aller untersuchten Isolate) als verschiedene andere Bakterienspezies. Ein Übersehen von P. aeruginosa kann für den betroffenen Patienten gravierende Folgen haben, da es zu einer inadäquaten Therapie bzw. zum Vorenthalten der Eradikationstherapie, die bereits bei Erstnachweis von P. aeruginosa indiziert ist, kommen kann. Auch bei Patienten, die bereits chronisch mit P. aeruginosa infiziert sind, kann eine Fehlidentifizierung dieser Spezies im Krankheitsverlauf bedeutende therapeutische Konsequenzen haben. Es wurde daher in dieser Arbeit geprüft, in wie weit sich die biochemischen Identifizierungsergebnisse bei fünf persistierenden P. aeruginosa-Stämmen unterscheiden. Dabei zeigte sich, dass der Api 20 NE bei demselben Stamm deutlich unterschiedliche Ergebnisse lieferte. Ein identischer P. aeruginosa Stamm wurde mit bis zu vier verschiedenen Spezies im Api verwechselt. Beispielsweise wurde P. aeruginosa Stamm 1 im Studienzeitraum als Comamonas testosteroni/P. alcaligenes, P. fluorescens und Moraxella lacunata fehlidentifiziert. P. aeruginosa Stamm 2 wurde als Photobacterium damsela, Psychrobacter phenylpyruvicus, Moraxella spp. und Oligella ureolytica fehlidentifiziert. Diese Daten bestätigen erneut die Unzulänglichkeiten des Api 20 NE, bzw. der biochemischen Methoden für die Identifizierung phänotypisch ungewöhnlicher Varianten von P. aeruginosa. Um ein Übersehen von P. aeruginosa im Rahmen der Routinediagnostik zu vermeiden, wurde in dieser Arbeit geprüft, ob das Vorhandensein bestimmter morphologischer Eigenschaften, wie Hämolyse auf Blutagar, metallischer Glanz und Lindenblütengeruch, eine eindeutige Identifizierung von P. aeruginosa ermöglichen. Diese Eigenschaften gelten zwar als typisch für P. aeruginosa, werden jedoch in der Literatur nicht als so charakteristisch beschrieben, dass sie allein, z. B. bei nicht-pigmentierten Isolaten, eine Diskussion 66 Identifizierung als P. aeruginosa erlauben. Im Vergleich der morphologischen Kriterien mit den Sequenzierungsergebnissen (s. Tab. 6) zeigte sich, dass ein Teil der P. aeruginosa Isolate der vorliegenden Arbeit tatsächlich anhand der Merkmale metallischer Glanz und Lindenblütengeruch korrekt identifizierbar gewesen wären. Diese Merkmale wiesen eine 100 % ige Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa bei Sensitivitäten von 46 % bzw. 29 % auf (s. Tab. 6). Beide Merkmale sollten daher in den diagnostischen Algorithmus konventioneller Identifizierungsverfahren von P. aeruginosa integriert werden. Die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als molekulares Identifizierungsverfahren lieferte in dieser Arbeit weitaus zuverlässigere Ergebnisse als die konventionelle Identifizierung. Es konnten 99 % der Isolate auf Speziesebene identifiziert werden. Allerdings hat die molekulare Diagnostik auch Limitierungen. Die Ergebnisse der Sequenzierung können nur so gut sein, wie es die benutzte Datenbasis, die für die Auswertung der Sequenzen verwendet wird, wie z. B. die GenBank, erlaubt. Diese Limitierung zeigte sich in dieser Arbeit sehr deutlich: Mehrere Isolate der Spezies Achromobacter xylosoxidans wurden zunächst im Rahmen der Routinediagnostik mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als Alcaligenes faecalis identifiziert (s. Kap. 4.3.1, Patient A3). Diese Fehlidentifizierung beruhte auf einer falschen Benennung der Sequenz AJ509012 in der GenBank-Datenbank. Bei diesem GenBank-Eintrag handelt es sich um eine 16S rRNA-Gen-Sequenz von A. xylosoxidans, die jedoch als Alcaligenes faecalis in der Datenbank bezeichnet ist. Durch Homologievergleiche dieser Sequenz mit den 16S rRNA-Gen-Sequenzen der Typstämme von Alcaligenes faecalis (ATCC 8750, GenBank-Eintrag M22508) und Achromobacter xylosoxidans ssp. xylosoxidans (ATCC 9220, GenBank-Eintrag AF411021) konnte der Fehler aufgeklärt werden. Der Datenbankfehler hatte jedoch in der Routinediagnostik dazu geführt, dass zwei Isolate fälschlicherweise als Alcaligenes faecalis befundet worden waren (s. Tab. 7 in 4.3.1.). Diese Fehlidentifizierungen von A. xylosoxidans als A. faecalis in der 16S rRNA-GenSequenzierung zeigen, dass auch bei einer an sich zuverlässigen Methode die Identifizierungsergebnisse nicht ungeprüft übernommen werden sollten. Es bedarf in zweifelhaften Fällen einer Überprüfung durch einen Homologievergleich mit Referenzstamm-Sequenzen. Eine weitere Unsicherheit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung als relativ neue molekulare Identifizierungsmethode liegt darin, dass noch keine endgültige Klarheit darüber besteht, wie viel Prozent Homologie das 16S rRNA-Gen zu einem Typstamm haben sollte, um eine eindeutige Spezieszugehörigkeit zu bestimmen. Die Variabilität des 16S rRNA-Gens scheint sich innerhalb unterschiedlicher Bakterien- Diskussion 67 gattungen und –gruppen beträchtlich zu unterscheiden. Während früher von einer Homologie > 97 % für die Speziesbestimmung ausgegangen wurde, sind heutzutage einige Bakterien, wie z. B. Mykobakterien und Nokardien, bekannt, die sich in weniger als 0,5 % ihres 16S rRNA-Gens unterscheiden (30; 39; 71; 114). Eine Homologie von > 99 % zum Typstamm der jeweiligen Spezies wird jedoch bei den meisten Bakterien, insbesondere bei gram-negtiven Stäbchenbakterien, als ausreichend für die Speziesidentifizierung angesehen und daher auch in dieser Arbeit berücksichtigt. Weitere Limitierungen der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung betreffen ihre im Vergleich zur biochemischen Identifizierung hohen Kosten und einen beträchtlichen Arbeitsaufwand, für den zudem besonders geschultes Personal erforderlich ist. Daher ist sie für einen breiten Einsatz in der mikrobiologischen Routinediagnostik wenig geeignet. Es wäre deshalb sinnvoll, eine einfache und schnelle, aber dennoch zuverlässige Methode für die Routinediagnostik von P. aeruginosa zu entwickeln. Die molekularen Verfahren der real-time Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wären hierfür geeignete Kandidaten, da sie einerseits einen spezifischen Nachweis bestimmter Bakterien mittels spezieller Fluoreszenzsonden ermöglichen und zum anderen, basierend auf nur einer Kolonie des Bakeriums, innerhalb weniger Stunden Ergebnisse liefern können (130). Das Testprinzip der häufig verwendeten real-time LightCycler PCR beruht auf einer klassischen PCR, bei der zusätzlich mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Oligonukleotide als spezifische Sonden eingesetzt werden. In der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm wurde bereits eine real-time LightCycler PCR für den Schnellnachweis der meisten klinisch relevanten Bakterien aus positiven Blutkulturen von Wellinghausen et al. entwickelt und evaluiert (133). Auch in anderen Studien wurde die real-time LightCycler PCR bereits erfolgreich in der Diagnostik von verschiedenen bakteriellen Infektionserregern eingesetzt (66; 85; 97). Die FISH eröffnet die Möglichkeit, Nukleinsäuren in Geweben, Zellen und Chromosomen nachzuweisen (62). Dabei lassen sich die Nukleinsäuren direkt im biologischen Präparat, also „in situ“, lokalisieren (117). Eine einsträngige DNA-Sonde, die spezifisch an das Zielgen bzw. an die RNA bindet, wird mit Fluoreszenzfarbstoffen gekoppelt. Die FISH wurde bereits zur Identifizierung von Bakterien in Sputumproben von Mukoviszidosepatienten eingesetzt (53). Aufgrund der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden von Wellinghausen et al. sowohl eine real-time LightCycler-PCR als auch eine neue FISH-Sonde zur molekularen Schnelldiagnostik von P. aeruginosa in dieser Studienpopulation von Bakterien evaluiert (132). Beide Methoden zeigten eine sehr hohe Diskussion 68 Sensitivität und Spezifität für die Identifizierung von P. aeruginosa. Vorteilhafterweise benötigt die FISH keine teure technische Ausrüstung und kann somit sogar in kleineren Laboren als günstige Methode angewendet werden. Durch beide SchnelldiagnostikMethoden kann ein Übersehen und eine Fehlidentifizierung von P. aeruginosa vermieden werden. Zudem können nicht nur für die Identifizierung von P. aeruginosa, sondern auch für andere Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten, wie z. B. B. cepacia Komplex oder Haemophilus influenzae, neue molekulare Methoden der Schnelldiagnostik erfolgreich verwendet werden (31; 53; 60). 5.2. Betrachtung ausgewählter Spezies Mittels molekularbiologischer Methoden gelang in neueren Studien vermehrt die Isolierung und Identifizierung ungewöhnlicher, gram-negativer, nonfermentativer Bakterien aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten. Dabei wurden seltene oder neu entdeckte Bakterienspezies und – gattungen, wie z. B. Pandoraea spp., Ralstonia spp., Bordatella spp. (z. B. Bordetella bronchiseptica, Bordetella holmesii), Alcaligenes xylosoxidans, Comamonas testosteroni, Agrobacterium radiobacter, Inquilinus limosus etc., nachgewiesen (11; 16-18; 21; 109; 128; 131). Ebenso wurden in der vorliegenden Arbeit einige Spezies, die zu seltenen Genera gehören, isoliert. Daten zur Epidemiologie dieser seltenen oder erst kürzlich entdeckten Bakterien bei Mukoviszidosepatienten fehlen weitestgehend. Auch die klinische Bedeutung einer Infektion oder Kolonisation mit diesen Erregern bei Mukoviszidosepatienten sowie der Einfluss dieser Spezies auf andere Bakterien im Respirationstrakt der Patienten konnten bislang nicht hinreichend geklärt. Die Ergebnisse der konventionellen Routinediagnostik hatten vermuten lassen, das Comamonas testosteroni bzw. Pseudomonas alcaligenes häufige Erreger bei Mukoviszidose darstellen, da sie 15 Mal bei acht Patienten im Api nachgewiesen worden waren. Die molekulare Identifizierung ergab jedoch, dass nur ein einziger Pseudomonas alcaligenes der 15 Isolate korrekt identifiziert worden war. Die anderen 14 Isolate waren in Wahrheit P. aeruginosa. Somit scheint Comamonas testosteroni unter den Patienten der Mukoviszidose-Ambulanz Ulm nicht vorzukommen. Die Prävalenz von P. alcaligenes betrug aufgrund des einmaligen Nachweises im Jahr 2003 unter den Patienten der Mukoviszidose-Ambulanz Ulm 1,1 %. Diese Prävalenzrate entspricht den Prävalenzen anderer Studien. Beispielsweise betrug der Anteil von P. alcaligenes unter allen Isolaten aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten in einer Studie von Klinger et al. 1,3 % (67). Diskussion 69 P. fluorescens wurde in der vorliegenden Arbeit nach den Ergebnissen der konventionellen Diagnostik sieben Mal nachgewiesen, aber auch hier ergab die molekulare Identifizierung, dass nur ein einziger P. fluorescens korrekt identifiziert worden war. P. fluorescens ist ein wenig pathogenes, ubiquitär verbeitetes Stäbchenbakterium, das vor allem in feuchtem Milieu vorkommt (64). Im Zusammenhang mit Infektionen des Respirationstraktes von Mukoviszidosepatienten wurde es nur selten beschrieben (113; 119), was die erhobene Prävalenz in dieser Arbeit bestätigt. Bersonders hervorzuheben unter den seltenen nonfermentativen Stäbchenbakterien der vorliegenden Arbeit ist Inquilinus limosus. Dieses Bakterium wurde 2002 erstmals von Coenye et al. in respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten in den USA entdeckt (16). Im Rahmen der vorliegenden Studie wurde Inquilinus limosus erstmals bei Mukoviszidosepatienten in Deutschland gefunden (131). Inquilinus limosus gehört zu den α-Proteobakterien und ist nur fern verwandt mit Burkholderien und Pseudomonaden (16). Der Name Inquilinus limosus lässt sich auf seine ausgeprägte Schleimbildung (limosus = schleimig) zurückführen (s. Abb. 9 in 4.2.3.). In der vorliegenden Studie wurde Inquilinus limosus aus einer respiratorischen Probe eines 17-jährigen Patienten isoliert. Der Patient befand sich derzeit in gutem klinischem Zustand (131). Auch über den Zeitraum dieser Studie hinaus konnte Inquilinus limosus bei diesem Patienten über viele Monate nachgewiesen werden, obwohl zwischenzeitlich AntibiotikaTherapien durchgeführt wurden. Inquilinus limosus besitzt somit, wie Wellinghausen et al. erstmals gezeigt hat, die Fähigkeit, im Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten zu persistieren (131). Es ist anzunehmen, dass die Fähigkeit zur Persistenz u. a. auf dessen charakteristische Schleimbildung zurückzuführen ist, denn die Produktion einer dicken Schleimschicht kann generell als Schutzbarriere gegenüber Antibiotika dienen und die Phagozytose erschweren (61). Neben dem Nachweis von Inquilinus limosus bei dem Patienten der vorliegenden Arbeit wurde Inquilinus limosus von Wellinghausen et al. (131) auch bei einer 14-jährigen Patientin der Mukoviszidoseambulanz der Universitätsklinik Ulm, die nicht in diese Studie eingeschlossen war, isoliert (131). Da die Stämme beider Patienten in der PFGE unterschiedliche Bandenmuster aufwiesen, konnte eine gegenseitige Übertragung ausgeschlossen werden. Eine aktuelle Veröffentlichung berichtet vom Nachweis von Inquilinus species bei fünf Patienten aus Frankreich (13). Bei einem Patienten lag eine transiente Besiedelung mit einem nicht-mukoiden Stamm vor, bei den vier anderen Patienten jeweils eine persistierende Infektion mit mukoiden Stämmen. Drei dieser vier Patienten erhielten eine antibiotische Therapie mit Imipenem, welche jedoch Diskussion 70 trotz in vitro getesteter Empfindlichkeit gegenüber Imipenem Inquilinus nicht eradizieren konnte (13). Somit belegt diese Publikation die Annahme, dass die Schleimproduktion eine wesentliche Rolle bei der Persistenz und Antibiotikaresistenz von Inquilinus spielt. Zwei weitere selten nachgewiesene Spezies gram-negativer Nonfermenter umfassen Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi. Beide Spezies kommen häufig in der Umwelt vor und verursachen in erster Linie Infektionen von zentralen Kathetern oder anderen Fremdkörpern (33; 55; 107). Agrobacterium radiobacter wurde aber auch selten aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten isoliert (16; 37). In einer jüngeren Studie wurden z. B. vier Isolate von Agrobacterium radiobacter gefunden (16), worunter sich zwei identische Isolate, die zum gleichen Zeitpunkten bei zwei verwandten Mukoviszidosepatienten nachgewiesen wurden, befanden. Diese Daten deuten somit auf eine stattgefundene Infektionsübertragung von Patient zu Patient hin. Ochrobactrum anthropi wurde nach Literaturangaben bislang noch nicht aus respiratorischen Proben von Mukoviszidosepatienten isoliert. Daher liegen keine Daten zur Epidemiologie sowie zur klinischen Bedeutung dieser Spezies bei Mukoviszidosepatienten vor. In der vorliegenden Arbeit wurden Agrobacterium radiobacter (n=2) und Ochrobactrum anthropi (n=1) bei zwei Patienten nachgewiesen. Interessanterweise lag bei einem der beiden Patienten eine Koinfektion mit Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi vor (s. Abb. 8 in Kap. 4.2.2). Beide Spezies wurden bei diesem Patienten an demselben Untersuchungszeitpunkt im April 2003 isoliert. Gleichzeitig lag außerdem eine Kolonisation mit Haemophilus influenzae vor. Da keine weiteren Nachweise erfolgten, besaßen weder Agrobacterium radiobacter noch Ochrobactrum anthropi die Fähigkeit, zu persistieren. Bei dem anderen mit Agrobacterium radiobacter kolonisierten Patienten (s. Abb. 7) wurde innerhalb des Studienzeitraumes eine Infektion mit einer weiteren seltenen Spezies beobachtet: Pseudomonas alcaligenes. Auch bei diesem Patienten wurden beide Spezies nur an einem einzigen Untersuchungszeitpunkt nachgewiesen: Agrobacterium radiobacter im Juli, P. alcaligenes im November 2003. Beide waren nicht in der Lage, persistierende Infektionen zu verursachen. Da sich die beiden mit Agrobacterium radiobacter besiedelten Patienten zu unterschiedlichen Terminen in der MukoviszidoseAmbulanz vorstellten und sie untereinaner keinen Kontakt hatten, wurde eine gegenseitige Übertragung des Erregers bei diesen Patienten als sehr unwahrscheinlich betrachtet. Aufgrund der Tatsache, dass bei beiden Patienten zusätzlich chronische Infektionen mit anderen für eine Progression von Lungenveränderungen relevanten patho- Diskussion 71 genen Bakterien vorlagen, wie z. B. Staphylococcus aureus und Haemophilus influenzae, konnte die klinische Bedeutung von Agrobacterium radiobacter und Ochrobactrum anthropi wie auch P. alcaligenes bei diesen Patienten nicht näher beurteilt werden. Da bislang jedoch keine bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren der Erreger bekannt sind, ist ihre klinische Bedeutung wahrscheinlich gering. 5.3. Verlaufsbeurteilung und molekulare Erregertypisierung In der vorliegenden Arbeit wurde eine molekulare Erregertypisierung mittels Pulsfeldgelelektrophorese bei allen Isolaten einer Spezies durchgeführt, die bei demselben Patienten an mehreren aufeinanderfolgenden Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurden. Damit sollte geprüft werden, ob es sich um persistierende Infektionen mit einem einzelnen oder ggf. auch mehreren Stämmen oder um mögliche Reinfektionen handelte. Fernerhin wurde durch den Vergleich der PFGE-Muster von Stämmen verschiedener Patienten untersucht, ob bei mehreren Patienten derselben Bakterienstamm einer Spezies nachweisbar war. Dies ließe auf gegenseitige Infektionsübertragungen beim Kontakt in der Mukoviszidose-Ambulanz schließen. Ein mehrfacher Nachweis derselben Spezies fand sich bei den Spezies Achromobacter xylosoxidans, B. cepacia Komplex und P. aeruginosa. Die Taxonomie von Achromobacter xylosoxidans unterlag in den letzten 20 Jahren einigen Änderungen. Nachdem dieser Erreger ursprünglich der Gattung Alcaligenes zugeordnet wurde, wurde er 1998 in die Gattung Achromobacter eingeordnet (15; 77). Vor allem bei erwachsenen Mukoviszidosepatienten wird A. xylosoxidans immer häufiger nachgewiesen (77; 89; 104). Die Prävalenz von A. xylosoxidans zeigt jedoch regionale Unterschiede. In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 16 Proben als A. xylosoxidans identifiziert, die von vier Patienten stammen. Somit waren 4,9 % Prozent der 82 Patienten der Mukoviszidoseambulanz Ulm innerhalb des einjährigen Studienzeitraums mit A. xylosoxidans besiedelt. Bei Burns et al. (11) waren 52 von 595 Mukoviszidosepatienten aus 69 Mukoviszidose-Ambulanzen der USA mit A. xylosoxidans kolonisiert (8,7 %). Da A. xylosoxidans die Fähigkeit zur Persistenz im Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten aufweist (11; 90; 94), treten auch chronische Infektionen mit A. xylosoxidans auf. Temporäre Infektionen scheinen jedoch häufiger zu sein, denn in einer Studie von Tan et al. (118) bei 370 Mukoviszidosepatienten aus England betrug die Prävalenz von chronischen Infektionen mit A. xylosoxidans nur 2,3 % verglichen mit ca. 10 % bei temporären Infektionen. Diskussion 72 Im Studienzeitraum der vorliegenden Arbeit waren drei der vier mit A. xylosoxidans kolonisierten Patienten chronisch infiziert. Die molekulare Erregertypisierung mittels PFGE zeigte, dass die chronischen Infektionen jeweils nur durch einen einzigen persistierenden A. xylosoxidans-Stamm ausgelöst wurden. Diese Beobachtung wird bestätigt durch die Daten einer Studie von Krzewinski et al. (69), in der die Mehrheit von 92 untersuchten Patienten ebenfalls nur einen einzigen A. xylosoxidans-Stamm aufwiesen. Koinfektionen mit einem zweiten A. xylosoxidans Stamm wurden nur selten und vorübergehend beobachtet (69). Eine ebenfalls in dieser Arbeit beschriebene Übertragung des Erregers zwischen verschiedenen Mukoviszidosepatienten, hauptsächlich zwischen Verwandten oder Personen mit engem Kontakt (69), konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden, da sich die PFGE-Muster der individuellen Stämme deutlich unterschieden. Die Bedeutung einer chronischen Infektion der Lunge mit A. xylosoxidans für den Mukoviszidosepatienten ist bislang noch unklar, da der Einfluss von A. xylosoxidans auf die Progression der Lungenerkrankung von Mukoviszidosepatienten noch nicht vollständig geklärt ist. Im Jahr 2002 wurde eine retrospektive Fall-Kontroll-Studie (118) durchgeführt, die die Assoziation von chronischen Infektionen durch A. xylosoxidans mit Morbidität und Mortalität der Mukoviszidosepatienten untersuchte. Dabei konnte keine Korrelation zwischen chronischer Infektion und der Prognose der Patienten gefunden werden (118). Diese Ergebnisse allein lassen jedoch noch keine endgültige Beurteilung der klinischen Relevanz des Erregers zu. Die Spezies des B. cepacia Komplexes zählen zu den bedeutsamsten Erregern bei Mukoviszidosepatienten, da Infektionen durch diese Arten mit einer deutlich verschlechterten Prognose des Patienten einhergehen (1; 23; 51; 73). Schon 1984 wurde in einer der ersten detaillierten Beschreibungen der klinischen Bedeutung einer Infektion mit B. cepacia Komplex das häufig rasch progrediente sog. Cepacia-Syndrom beschrieben (57). Die Häufigkeiten der Spezies innerhalb des B. cepacia Komplex weisen regionale Unterschiede auf, wobei B. cenocepacia verschiedenen Studien zufolge die häufigste Spezies des B. cepacia Komplexes bei Mukoviszidosepatienten ist (1; 23; 63; 84; 95; 112). Die zweithäufig isolierte Spezies ist B. multivorans (9; 24; 76; 82; 99; 123). In der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass alle Patienten, bei denen eine Spezies des B. cepacia Komplexes nachgewiesen wurde, mit B. multivorans besiedelt waren. Dies bestätigt Diskussion 73 kürzlich publizierte Daten, die in Europäischen Mukoviszidose-Zentren einen höheren Anteil von B. multivorans als in Amerikanischen Zentren fanden (9; 123). Aufgrund der besonderen klinischen Bedeutung von B. cepacia Komplex, wurde die molekulare Epidemiologie dieser Erregergruppe bereits recht gut untersucht. Infektionsübertragungen von B. cepacia Komplex auf andere Mukoviszidosepatienten, die sowohl in Kliniken als auch im Rahmen von Freizeitaktivitäten stattfanden (1; 19; 27; 32; 45; 81; 88; 93; 108; 134), sind mehrfach dokumentiert. Dabei wurden Übertragungen durch direkten Kontakt nachgewiesen, aber auch Tröpfchenübertragungen sind wahrscheinlich. In Sputumtröpfchen können Burkholderien auf Oberflächen wie z. B. Latex oder insbesondere Polyvinylchlorid mehr als 24 Stunden überleben (28). Bei Nachweis einer Spezies des B. cepacia Komplexes werden daher spezifische Maßnahmen zur Infektionsverhütung empfohlen, um andere Patienten vor Ansteckung zu schützen (58; 75). Diese Maßnahmen umfassen neben besonderen hygienischen Vorkehrungen in Mukovsizidose-Ambulanzen und Klinken auch die Aufklärung der Patienten und Familien, sowie eine Isolierung des infizierten Patienten von anderen Mukoviszidosepatienten. Dadurch konnten Übertragungen erfolgreich verhindert werden (41; 45; 134), aber leider sind die erforderlichen Maßnahmen meist mit einer beträchtlichen sozialen Isolierung der betroffenen Patienten verbunden. Infektionsübertragung unter den mit B. multivorans kolonisierten Patienten konnten in der vorliegenden Arbeit ausgeschlossen werden, weil bei jedem der drei mit B. multivorans infizierten Patienten unterschiedliche Stämme nachweisbar waren. Bezüglich der molekularen Epidemiologie von B. cenocepacia wurden bei Mukoviszidosepatienten sowohl persistierende Infektionen mit einem einzigem Stamm beobachtet als auch ein Wechsel des infizierenden Stammes auf einen anderen Stamm der gleichen Spezies oder einer anderen Spezies des B. cepacia Komplexes, das sog. “Strain replacement“ (82). Auch Koinfektionen mit verschiedenenen Stämmen traten in seltenen Fällen auf (45; 82). Desgleichen wurden auch bei B. multivorans persistierende Infektionen beobachet, hier jedoch meist nur mit einem einzigen Stamm (50). Koinfektionen mit unterschiedlichen Stämmen an einem Untersuchungszeitupunkt wurden bei B. multivorans noch nicht beschrieben. Insgesamt sind die Daten über die molekulare Epidemiologie von B. multivorans noch spärlich. In der vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur Epidemiologie von B. multivorans gewonnen werden. Bei einem Patienten (B3) konnten erstmals Koinfektionen mit zwei unterschiedlichen B. multivorans Stämme nachgewiesen werden (s. Abb. 13 in Diskussion 74 Kap. 4.3.2.). Bei diesem Patient lag eine persistierende B. multivorans-Infektion mit einem Stamm vor, die an zwei unterschiedlichen Zeitpunkten von Koinfektionen mit zwei verschiedenen Stämmen begleitet wurde. Die neu erworbenen Stämme waren nicht in der Lage, den persistierenden Stamm zu verdrängen und verursachten daher nur kurzzeitige Koinfektionen (129). Warum diese Stämme nicht in der Lage waren zu persistierten, ist bislang ungeklärt. Beispielsweise könnten Interaktionen mit dem persistierenden Stamm eine Rolle spielen oder der persistierende Stamm könnte sich von nur temporär infizierenden Stämmen durch die Expression bestimmter, noch unbekannter Pathogenitätsfaktoren unterscheiden. Möglicherweise spielt auch die von Chu et al. beschriebene Persistenz von B. multivorans in Makrophagen der Lunge eine Rolle (14). Ähnliche Beobachtungen in Bezug auf die molekulare Epidemiologie von B. multivorans wurden von Bernhardt et al. im Jahre 2003 gemacht (6). In dessen Arbeit wurde ein Wechsel von einem initial infektionsauslösenden Stamm auf einen anderen B. mulivoransStamm und der anschließende Wiedererwerb des ursprünglichen Stammes beschrieben. Dadurch wurde bereits vermutet, dass Koinfektionen verschiedener Stämme bei chronischen B. multivorans-Infektionen stattfinden. Diese Vermutung konnte nun durch den Patienten B3 der vorliegenden Arbeit bestätigt werden. Der Nachweis der Koinfektion in dieer Arbeit wurde wahrscheinlich durch die folgenden beiden Unterschiede im Studiendesign möglich: Das Entnahmeintervall der Proben betrug bei Bernhardt et. al mindestens 6 Monate, während die Sputumproben in der vorliegenden Studie in deutlich kleineren Intervallen entnommen wurden (ca. 3 Monate). Außerdem wurden in der vorliegenden Arbeit alle phänotypisch unterschiedlichen Isolate untersucht, wohingegen bei Bernhardt et al. (6) nur ein Isolat an jedem Untersuchungszeitpunkt in die Untersuchung einbezogen wurde. Es ist bekannt, dass bei B. multivorans auffällige phänotypische Variationen vorkommen (72; 116). Zur Klärung der Frage, ob die Koinfektionen bei Patient B3 bereits anhand unterschiedlicher Phänotypen hätten erkannt werden können, wurden die unterschiedlichen morphologischen Typen und die Resistenztypen mit dem jeweiligen Genotyp verglichen (s. Tab. 8 in Kap. 4.3.2.). Es lag jdoch keine Korrelation zwischen Phänotyp und Genotyp der B. multivorans-Stämme des chronisch infizierten Patienten B3 vor. Folglich können Koinfektionen durch die großen phänotypischen Variabilitäten, die auch innerhalb eines Stammes auftreten, mittels morphologischen Merkmalen nicht erkannt werden. Ebenso kann die Anwesenheit eines spezifischen Stammes nicht mit phänotypischen Identifizierungsmethoden untersucht werden. Die Möglichkeit von Koinfektionen mit Diskussion 75 unterschiedlichen Stämmen muss bei der Interpretation von Studien zur Epidemiologie und zum klinischen Verlauf von B. cepacia Komplex berücksichtigt werden. Nur die molekulare Erregeridentifizierung und -typisierung kann eindeutig Aufschluss über die Art der infizierenden Spezies und die Frage einer persistierenden Infektion geben. Die meisten Mukoviszidosepatienten infizieren sich im Laufe ihres Lebens mit Pseudomonas aeruginosa (41). Durch dessen Neigung zu Adhäsion und Kolonisation auf vorgeschädigter Schleimhaut persistiert P. aeruginosa nach Erstinfektion meist in der Lunge (127). Zahlreiche Studien zeigen, dass eine chronische Infektion mit P. aeruginosa mit einer signifikanten Verschlechterung des klinischen Zustandes und der Prognose des Patienten einhergeht (35; 41; 68; 102). Mit 52 Isolaten war P. aeruginosa auch die am häufigsten isolierte Spezies der vorliegenden Studie und diejenige Spezies, die für die meisten persistierenden Infektionen verantwortlich war. Die P. aeruginosa-Stämme werden in der Regel aus der Umwelt erworben, und die Patienten sind meist mit einen eigenen Stamm infiziert (12; 41). Übertragungen von P. aeruginosa-Stämmen auf andere Mukoviszidosepatienten wurden nur selten beschrieben. Meist betreffen sie Verwandte oder Patienten mit engem Kontakt im Rahmen von gemeinsamen Freizeitaktivitäten (41; 111). Allerdings wurde 2002 eine Arbeit veröffentlicht (4), in der eine weite Verbreitung eines einzelnen P. aeruginosa Stammes in einer pädiatrischen Mukoviszidose-Klinik beschrieben wurde. In dieser Studie waren 65 der 152 untersuchten Patienten, also 55 % der Patienten der Mukoviszidose-Klinik, mit demselben Genotyp von P. aeruginosa infiziert (4). Möglicherweise handelt es sich in diesem Fall um einen P. aeruginosa-Stamm mit stärkerer Virulenz als die meisten sporadischen Stämme. Unter den Patienten der vorliegenden Studie konnten gegenseitige Übertragungen ausgeschlossen werden, da die molekulare Erregrtypisierung mittels PFGE darlegte, dass alle untersuchten Patienten mit unterschiedlichen Stämmen besiedelt waren. Zusätzlich zu chronisch infizierenden Stämmen können Mukoviszidosepatienten im Laufe ihres Lebens auch sporadisch weitere P. aeruginosa-Stämme erwerben (92). Diese Beobachtung konnte in der vorliegenden Arbeit bei einer Patientin (P3) bestätigt werden, bei der P. aeruginosa an elf Untersuchungszeitpunkten nachgewiesen wurde: Während ein Stamm persistierte, lagen temporäre Koinfektionen mit zwei weiteren Stämmen vor (s. Kap. 4.3.3., Abb.15). Bei einem weiteren Patienten (P4) wurde P. aeruginosa an zwei Untersuchungszeitpunkten im Abstand von acht Monaten isoliert. In der PFGE zeigte sich, dass es sich um zwei unterschiedliche P. aeruginosa Stämme (s. Abb. 14) handelte. Diskussion 76 Folglich hat während des Studienzeitraums eine Eradikation des ersten P. aeruginosaStammes und eine anschließende Reinfektion mit einem anderen Stamm derselben Spezies stattgefunden. Insgesamt ist zu berücksichtigen, dass in diese Studie nur morphologisch untypische P. aeruginosa eingegangen sind, während typische Isolate (Bildung von grünem Pigment bzw. mukoide P. aeruginosa) aufgrund des Studien-Designs ausgeschlossen wurden (s. Abb. 5, Kap. 4.1.). Somit beziehen sich die Auswertungen zur molekularen Epidemiologie von P. aeruginosa nur auf eine Subpopulation aller bei den Patienten nachgewiesenen Isolate und lassen keine abschließende Beurteilung zu. 5.4. Ausblick Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass molekulare Identifizierungsmethoden, wie die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung, den konventionellen Verfahren bei der Identifizierung von gram-negativen, Oxidase-positiven nonfermentativen Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten überlegen sind. Dennoch haben auch molekulare Verfahren Limitierungen. Beispielsweise können in öffentlich zugänglichen Gen-Datenbanken fehlerhafte Sequenzen enthalten sein und zu Fehlidentifizierungen führen. Die Einführung von Qualitätskontrollmaßnahmen bei der Einstellung von Sequenzen in die Datenbanken wäre daher sinnvoll und könnte die Qualität der Datenbanken verbessern. Auch die Einrichtung von Datenbanken, die ausschließlich Sequenzen von definierten Bakterienstämmen und Typstämmen beinhalteten, würde die Qualität der Identifizierung von Bakterien mittels Gensequenzierung erheblich steigern. Dieses Konzept wurde bereits in der Ridom-Datenbank der Fa. Ridom, die wie die GenBank frei im Internet zugänglich ist, für Mykobakterien verwirklicht. Für die Zukunft wäre es außerdem wünschenswert, einfach durchzuführende, preisgünstige molekulare Schnellverfahren zu entwickeln. Denkbar wäre zum Beispiel eine Ausweitung der FISH-Methode auf den Direktnachweis von Bakterien direkt in Sputumproben. Erhebliches Potential hat auch die Entwicklung sog. DNA-Chips. DNA-Chips bestehen aus einem festen Trägermaterial, auf dem einzelsträngige DNA-Fragmente bekannter Sequenz als Gensonden in regelmäßigem Muster angeordnet sind. Diese Sonden können durch Hybridisierung an spezifische Gensequenzen der Bakterien eine schnelle, zuverlässige Identifizierung vieler verschiedener Bakterienspezies auf nur einem Chip ermöglichen. Moderne molekulare Nachweisverfahren könnten auch dazu beitragen, weitere, bislang noch unbekannte Bakterienspezies, die sich biochemisch nicht identifizieren lassen, bei Mukoviszidosepatienten nachzuweisen. Wie der Nachweis von Inquilinus limosus in der Diskussion 77 vorliegenden Arbeit zeigt, ist die bakterielle Vielfalt der Erreger bei Mukoviszidosepatienten noch längst nicht vollständig bekannt. Daher ist davon auszugehen, dass das Spektrum von Infektionserregern des Respirationstraktes bei Mukoviszidosepatienten durch die moderne mikrobiologische Diagnostik noch eine deutliche Erweiterung erfahren wird. Der zunehmende Einsatz molekularer Typisierungsverfahren bei der Beurteilung der Epidemiologie einzelner Erreger kann zudem neue Einblicke in die Dynamik von Bakterienpopulationen bei chronischen Infektionen sowie in die Aufdeckung von Infektionsübertragungen, sowohl im Hospitalbereich als auch bei Freizeitaktivitäten oder innerhalb von Familien, bieten. Das hauptsächliche Potential der modernen mikrobiologischen Diagnostik liegt jedoch darin, zu einer verbesserten Patientenversorgung, einer Erhöhung der Lebensqualität und letztendlich zu einem längeren Überleben von Mukoviszidosepatienten beizutragen. Zusammenfassung 78 6. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit erfolgte eine molekulare Identifizierung aller biochemisch nicht eindeutig zu differenzierenden gram-negativen Stäbchenbakterien aus respiratorischen Sekreten von Mukoviszidose-Patienten aus dem Jahre 2003 mittels 16S rRNA-GenSequenzierung. Der Vergleich der biochemischen Identifizierungsmethode, dem kommerziellen Testsystem Api 20 NE, mit der 16S rRNA-Gen-Sequenzierung zeigte, dass nur 17 % der 88 untersuchten Oxidase-positiven, nonfermentativen Stäbchenbakterien in der Routinediagnostik mit dem Api 20 NE korrekt identifiziert worden waren. Von besonderer Bedeutung ist, dass es sich beim 52 der 88 Isolaten um Pseudomonas aeruginosa handelte, die mit dem Api 20 NE fehlidentifiziert worden waren. Ein Übersehen von Pseudomonas aeruginosa kann aufgrund der besonderen klinischen und prognostischen Bedeutung dieses Erregers gravierende Folgen für den Patienten haben. Die Beurteilung der morphologischen Merkmale „Metallischer Glanz“ und „Lindenblütenduft“ zeigte, dass diese Merkmale eine 100 %ige Spezifität für die Identifizierung von Pseudomonas aeruginosa haben und somit eine wertvolle Ergänzung zur konventionellen Diagnostik darstellen. Neben Pseudomonas aeruginosa erfolgte im Api eine häufige Fehlidentifizierung von Achromobacter xylosoxidans und Burkholderia cepacia Komplex. Die 16S rRNA-GenSequenzierung führte auf der anderen Seite zum Nachweis einiger seltener oder erst kürzlich beschriebener Spezies bei Mukoviszidose-Patienten. So konnte beispielsweise der erst 2002 beschriebene Erreger Inquilinus limosus erstmals in Deutschland nachgewiesen werden. Charakteristische Merkmale dieses Bakteriums sind eine ausgeprägte Schleimbildung und die Fähigkeit zur Pesistenz im Respirationstrakt von Mukoviszidose-Patienten. Bei chronischen Infektionen mit Burkholderia multivorans, Pseudomonas aeruginosa und Achromobacter xylosoxidans wurde anhand molekularer Typisierung mittels Pulsfeldgelelektrophorese gezeigt, dass jeder Patient mit einem oder mehreren individuellen Stämmen infiziert ist. Übertragungen der Erreger zwischen den Patienten wurden ausgeschlossen. Es konnten jedoch mittels Pulsfeldgelelektrophorese erstmals temporäre Koinfektionen mit unterschiedlichen Burkholderia multivorans-Stämmen bei einem chronisch infizierten Patienten nachgewiesen werden. Der Einsatz molekularer Methoden stellt einen wesentlichen Fortschritt bei der Identifizierung und Charakterisierung gram-negativer, Oxidase-positiver nonfermentativer Stäbchenbakterien bei Mukoviszidose-Patienten dar und kann somit zu einer Verbesserung der Therapie und Prognose der Patienten beitragen. Literaturverzeichnis 79 7. Literaturverzeichnis 1. Agodi A, Mahenthiralingam E, Barchitta M, Giannino V, Sciacca A und Stefani S: Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology, and genomovar status. J Clin Microbiol 39: 2891-2896 (2001) 2. Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W und Lipman DJ: Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res 25: 3389-3402 (1997) 3. Amann RI, Ludwig W und Schleifer KH: Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 59: 143169 (1995) 4. 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Ganz besonders danken möchte ich ihr aber für ihre geduldige, herzliche und überaus freundliche Umgangsweise mit uns Studenten. Außerdem danke ich Herrn Prof. Dr. Reinhard Marre, dem ärztlichen Direktor der Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm, dass ich diese Arbeit unter hervorragenden Arbeitsbedingungen in seiner Abteilung anfertigen durfte. Frau Beate Wirths danke ich besonders herzlich für die Einarbeitung in sämtliche Versuche und für ihre freundliche Unterstützung bei der praktischen Durchführung dieser Arbeit. Mit Ihrer Erfahrung und Kompetenz war sie mir stets eine große Hilfe. Auch Frau Ulrike Simnacher danke ich herzlich, insbesondere für die Hilfe bei der Sequenzierung. Bei Frau Angelika Mörike möchte ich mich für die ausgezeichnete Anleitung bei der Durchführung der PFGE bedanken. Auch allen anderen medizinisch-technischen Assistentinnen und Mitarbeitern der Abteilung danke ich für die freundliche Aufnahme und ständige Hilfsbereitschaft. Zu guter Letzt danke ich meinem Freund Maximilian Merz für seine stete Motivation und Unterstützung, für die computertechnische Hilfe und nicht zu vergessen für sein großes Interesse an meiner Arbeit. Ebenso herzlich danke ich meinen Eltern, die mir ein sorgloses Studium ermöglichen und mich ebenfalls während der gesamten Zeit meiner Dissertation mit Aufmunterungen und Korrekturlesen unterstützten. Lebenslauf 94 9. Lebenslauf Persönliche Daten: Geburtsdatum und -ort: 16. Januar 1981 in Düsseldorf Staatsangehörigkeit: deutsch Familienstand: ledig Eltern: Dr. Ulrich Köthe, Apotheker Roswitha Köthe, Apothekerin Geschwister: Alexander Köthe, Thomas Köthe Ausbildung: 1987- 1991 Theodor-Heuss-Grundschule, Rutesheim 1991- 2000 Gymnasium Renningen, Abschluss: Abitur seit WS 2000/ 2001 Studium der Humanmedizin an der Universität Ulm September 2002 Physikum August 2003 1. Staatsexamen seit September 2003 Doktorarbeit in der Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene (Universität Ulm) unter der Leitung von Frau PD. Dr. Nele Wellinghausen; Thema: „Einsatz molekularer Methoden zur gramnegativer Identifizierung nonfermentativer und Charakterisierung Stäbchenbakterien von Mukoviszidosepatienten“ Weitere Tätigkeiten: seit Oktober 2004 Aushilfstätigkeiten als Arzthelferin in der dermatologischen Praxis Dr.Schwarz, Langenau seit April 2004 wissenschaftliche Hilfskraft in der Abteilung allgemeine Pharmakologie und Toxikologie der Universität Ulm als Gruppenleiterin für „POL“ (Problemorientiertes Lernen) 10/2003 - 2/2004 wissenschaftliche Hilfskraft zur Betreuung von Studenten in der Abteilung Medizinische Mikrobiologie und Hygiene der Universität Ulm Im Zusammenhang mit dieser Dissertation entstanden folgende Veröffentlichungen: Wellinghausen N, Köthe J, Wirths B, Sigge A und Poppert S: Superiority of molecular techniques for identification of gram-negative, oxidase-positive rods, including morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa, from patients with cystic fibrosis. J. Clin. Microbiol. 43: 4070-4075 (2005) Wellinghausen N und Köthe J: Evidence of coinfection with distinct strains of Burkholderia multivorans in a Cystic Fibrosis patient. Infection (2006) (zur Publikation angenommen) Wellinghausen N, Köthe J, Wirths B, Sigge A und Poppert S: Superiority of molecular techniques for identification of gram-negative, oxidase-positive rods, including morphologically nontypical Pseudomonas aeruginosa from Cystic Fibrosis patients. Poster auf dem 2. Gemeinsamen Kongress der DGHM und VAAM, Göttingen, 25.28.09.05, veröffentlicht in Biospektrum, S. 134, MUP002 (2005)
