Bericht über die beim Internationalen Angelman

Bericht über die beim Internationalen
Angelman-Treffen in Paris 2014 vorgestellten Arbeiten
Die Monoamin-Transporter als Ziel für CaMK2alpha: Auswirkungen auf das AngelmanSyndrom
Monoamine transporters as targets of CaMK2alpha: Implications for Angelman Syndrome
Harald H. Sitte, Ph.D. (Österreich)
Das Nervensystem ist das wichtigste Organ für die Manifestationen (Ausprägungen) des AngelmanSyndroms. Wir haben kürzlich beobachtet, dass der Mangel an Ube3A die Aktivität des DopaminTransporters in den dopaminergen Neuronen verändert (Steingellner et al., J.Biol. Chem., 2012).
Dann sind wir dazu übergegangen, einen anderen Aspekt zu prüfen, nämlich dasjenige Phänomen,
derentwegen das Angelman-Syndrom oft von Kollateraleffekten (Nebeneffekten) auf das
serotoninerge System begleitet wird und welches die prinzipiellen Faktoren sind, die eine autistische
Symptomatik verursachen. So wie für das dopaminerge System, haben wir untersucht, ob der
Serotonin-Transporter, der oft in die Ausprägung der autistischen Symptomatik mit einbezogen ist,
und das serotoninerge System an sich ein Target (Ziel) für die klinische Medikation darstellen
könnten. Der Serotonin-Transporter ist bekannt als Target (Ziel) für eine Gruppe unterschiedlicher
Medikamente bei verschiedenen Krankheitsbildern (wie z.B. bei der Depression). Im Verlauf des
Vortrages wurde kurz der aktuelle Stand der Untersuchung zusammen mit einem Überblick über die
Möglichkeiten basierend auf der Einbeziehung des serotoninergen Systems bei Angelman-Syndrom
vorgestellt.
Modelle, um die Funktion des UBE3A/E6AP zu studieren
Model systems to study UBE3A/E6AP Function
Ben Distel, Ph.D. (Niederlande9
Das Gen UBE3A codiert das E6AP für die Ubiquitinligase, weswegen die mangelnde
Funktionstüchtigkeit des Ubiquitinierung-Prozesses (= Übertragung von Ubiquitin auf ein anderes
Molekül), welcher von E6AP an die Targets vermittelt wird, als Ursache des Angelman-Syndroms
betrachtet wird. Obwohl einige potentielle Targets für E6AP bekannt sind, ist es nötig zu zeigen, ob
eines (und welches) dieser Target zur Ausprägung des Angelman-Syndroms beiträgt.
Deswegen ist die Identifikation des/der kritischen (entscheidenden) Target/s des E6AP und die
Kenntnis ihres mechanistischen (fast automatisch) Beitrags zur Pathologie der erste Schritt in
Richtung der Entwicklung einer Therapie für des Angelman-Syndrom. Mittels eines ScreeningSystems auf Basis des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems (Yeast Two-Hybrid System) haben wir kürzlich
verschiedene Proteine, die mit E6AP interagieren (sich gegenseitig beeinflussen), identifiziert
(UB3EA) (UIPs), einschließlich eines Proteins, welches bekanntermaßen eine Intelligenzminderung,
die der bei Angelman-Syndrom ähnelt, verursacht sowie ein Protein, welches am Transport in den
Gehirnvesikeln (Gehirnbläschen) beteiligt ist. Um zu bestätigen, ob diese Proteine tatsächlich das
Target der E6AP sind, haben wir exakte Instrumente, die uns erlauben:
1) die direkte physische Interaktion dieser Proteine mit E6AP zu bewerten;
2) festzulegen, wie ihre Ubiquitinierung und Stabilität von der Aktivität des E6AP abhängt.
Es wurde die Validierung dieser Instrumente und die anfängliche Charakterisierung der mit E6AP
interagierenden Proteine, welche kürzlich identifiziert worden sind, vorgestellt. Zusätzlich wurde
diskutiert, wie diese Instrumente eingesetzt werden können, um innovative zielgerichtete Ansätze zu
entwickeln, damit neue neuronale Substrate und Aktivatoren des E6AP identifiziert werden können.
Eine entscheidende Rolle des UBE3A in der Entwicklung des Gehirns
A critical role for UBE3A in brain development
Ype Elgersma, Ph.D. (Niederlande)
Ype hat in seiner Präsentation eine Aktualisierung über die Forschungslinien bezüglich des
Angelman-Syndroms geliefert. Er hat sich insbesondere auf die Daten des Mausmodells mit
Angelman-Syndrom konzentriert, in welchem es nämlich möglich ist, das Gen UBE3A jederzeit zu
aktivieren. Seine Experimente legen nahe, dass einige Phänotypen (Erscheinungsbild eines
Organismus‘), wenn auch nicht alle, der Angelman-Maus reversibel (wieder umkehrbar) sind, wenn
das Gen des Tiers im postnatalen (direkt nach der Geburt) Alter aktiviert wird. Dies zielt darauf hin,
dass es ein kritisches (spezielles) Fenster gibt, in dem man die Reversibilität erreichen kann und dass
das kritische Fenster nicht für alle Phänotypen das gleiche ist.
Imprinting-Mechanismen des UBE3A-Gens
Mechanisms of UBE3A imprinting
Angela Mabb, Ph.D. (USA)
Das Angelman-Syndrom wird durch genetische Deletionen oder Mutationen in der mütterlichen
Kopie des UBE3A-Gens hervorgerufen. In den Neuronen wird die mütterliche Kopie exprimiert
(genetische Expression = Form, wie die genetische Information eines Gens zum Ausdruck kommt),
die väterliche ist stumm. Eine mögliche Therapie für Patienten mit Angelman-Syndrom besteht
darin, die Expression der väterlichen Kopie des UBE3A wieder herzustellen und zwar durch
pharmakologische Mittel. Dank leistungsstarker Imaging-Tests (bildgebendes Verfahren) haben wir
einige Pharmazeutika – Topoisomerase-Hemmer - identifiziert (bereits von der FDA anerkannt/Food
and Drug Administration), die die väterliche Kopie des UBE3A-Gens bei Mäusen aktiviert. Dies
geht davon aus, die Expression des UBE3A-Gens bei Patienten mit Angelman-Syndrom
normalisieren zu können. Dies bietet eine einzigartige therapeutische Gelegenheit. Wir haben
versucht, die Reaktivierung des UBE3A-Gens mittels direkter Manipulationen der Topoisomerase zu
erforschen, sowie mittels Topoisomerase-Hemmer, viraler Transduktion und Linien von transgenen
Mäusen. Die Ausarbeitung dieser Studien hat uns ein klareres Bild davon gegeben, wie die
Topoisomerase die Aktivität des UBE3A-Gens regelt und hat uns erlaubt, die Wirkung der
Manipulationen der Topoisomerase während der Gehirnentwicklung besser zu verstehen. Unsere
Entdeckungen zielen darauf ab festzulegen, ob die Topoisomerase-Hemmer geeignete Kandidaten
für klinische Studien bei Angelman-Syndrom sind.
Charakterisierung der Mutationen des UBE3A-Gens in Patienten mit Angelman-Syndrom
Characterization of UBE3A Mutations in Angelman Patients
Silvia Russo, Ph.D. (Italien)
Mutationen und offensichtliche Deletionen im UBE3A-Gen umfassen ca. 10% der Defekte des
Angelman-Syndroms - charakterisiert durch ein mentale Störung, ein spezielles EEG, fehlende
Sprache, Ataxie (Koordinationsstörung der Bewegungen) und glückliches Wesen. Das Gen kodiert
für die Ubiquitinligase das E6AP und ist Subjekt für das genetische Imprinting mit einer
mütterlichen spezifischen Expression im Gehirn, genauer gesagt in den Nerven. Davon abgesehen
verursachen die mütterlichen interstitiellen Duplikationen des Chromosoms 15q11-13 Autismus. Bei
einer Gruppe von 163 Patienten mit einer genetisch gesicherten Diagnose des Angelman-Syndroms
haben wir 41 verschiedene Mutationen des UBE3A im Gen identifiziert. Der größere Teil der
Sequenz-Alterationen sind Abbrüche, eine ist ein Defekt im Spleißen (Weiterverarbeitung der RNA),
3 sind Frame-Shift-Mutationen (Verschiebung des Leserasters von Genen auf der DNA) und 6
Variationen an Missense-Mutationen (den Sinn verändernde Punktmutation). Mit dem Ziel, das
Verhältnis Genotyp-Phänotyp (Genotyp = gentische Ausstattung eines Organismus‘) zu
identifizieren, ist der Nonsense-mediated mRNA decay in den Abbruchmutationen analysiert
worden. Dieser wird von einer Nonsense-RNA verursacht und führt zu Abbruchmutationen
(Nonsense-RNA = Punktmutation, die zum Abbruch der Proteinsynthese führt // Decay = Untergang,
Zerfall). Die Planungen und Modellbildung der Missense-Mutationen wird in Zukunft diskutiert.
Die Missense-Mutationen zu beschreiben, kann helfen, den ausschlaggebenden Punkt des Proteins
Ube3a zu entdecken.
Die Rolle des UBE3A in den Modellen des Angelman-Syndroms: Die Regulierung der
Homöostase des Proteins
UBE3A in model systems of Angelman-Syndrome: Regulation of protein homeostasis
Ugo Mayer, Ph.D (Spanien)
Das Niveau der Ubiquitinligase E3 (UBE3A) ist entscheidend für die richtige Entwicklung und das
Funktionieren des Gehirns. Das Angelman-Syndrom entsteht durch einen Mangel dieses Proteins im
Gehirn. Die Forschung ist dabei zu vertiefen, welche Proteine im Gehirn durch das UBE3A reguliert
werden. Indem wir eine für die Isolierung, die Identifikation und die Validation der Substrate der
Ubiquitinierung in einem Modell der Drosophila-Fliege eine innovative Technik einsetzen, haben
wir die unmittelbare Ubiquitinierung der Rpn10 durch das Ube3a identifiziert, ein Shuttle-Faktor des
Protosomen und drei andere Proteine. Nur das Rpn10 ist gegen die Degradation nach der
Ubiquitinierung durch das UBE3A gerichtet und so nimmt man an, dass die Degradation nicht der
einzige Effekt des Ube3a auf seine Substrate sein kann. Zusätzlich haben wir die genetische in vivoInteraktion (in vivo = im lebendigen Organismus) zwischen dem Ube3a und dem C-Ende des Rpn10
identifiziert. Die übermäßige Expression dieser Proteine führt zu einer Anhäufung dieser UbiquitinProteine, was letztendlich die Interaktion auf dem biochemischen Niveau, welche man in den
Nervenzellen erhalten hat, ausmacht. Mittels unserer Maus „bioUb“, die kürzlich entwickelt und hier
eingesetzt wurde, um die Targets der Ubiquitinierung für ein spezifische E3-Ligase im Kontext des
internen Organismus‘ zu charakterisieren, sind wir aktuell an einem Projekt dran, die molekularen
Mechanismen, welche beim Angelman-Syndrom unterbrochen sind, zu charakterisieren.
Der Einsatz menschlicher, pluripotenter induzierter Stammzellen, um ein Modell für das
Angelman-Syndrom zu schaffen
Using human induced pluripotent stem cells to model Angelman Syndrome
Stormy J. Chamberlain (USA)
Während man von den Mausmodellen mit Angelman-Syndrom viel lernen kann und auch schon
gelernt hat, kann es Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen geben, die nicht berücksichtigt
werden, wenn man sich ausschließlich auf die Mausmodelle konzentriert. Wir haben pluripotente
menschliche Stammzellen (iPSC = Stammzellen, die sich zu vielen unterschiedlichen Zellen weiter
entwickeln können) von Personen mit Angelman-Syndrom erhalten. Die iPSC, die sich auf dem
funktionalen Niveau befinden, welches dem embryonalen menschlichen Stammzell-Niveau
entspricht, können in Neuronen umgewandelt werden. So können wir das Angelman-Syndrom in
menschlichen, lebenden Nervenzellen studieren, die in vitro („im Reagenzglas“) auf einer Platte
wachsen. Wir nutzen diese Nervenzellen mit Angelman-Syndrom für drei prinzipielle Ziele: 1.) Um
zu verstehen, wie sich das Imprinting des Ube3a in den Nerven stabilisiert. 2.) Die Veränderungen in
der Expression des neuronalen Gens, welches das Angelman-Syndrom begleitet, zu verstehen. 3.)
Mögliche Therapien für das Angelman-Syndrom zu testen.
In Richtung einer Therapie für das Angelman-Syndrom mittels des Knockdowns einer
repressiven, nicht verschlüsselten RNA
Arthur L. Beaudet, M.D. (USA)
Das Angelman-Syndrom ist eine schwere Pathologie der Gehirnentwicklung, verursacht durch einen
Mangel an Imprinting des UBE3A-Gens. Obwohl die molekularen Mechanismen des mütterlichen
Genmangels verschiedene sind, haben alle Patienten mit Angelman-Syndrom mindestens eine Kopie
des väterlichen UBE3A-Gens, welches stumm, aber intakt ist. Unser Ziel ist es, die Expression des
UBE3A-Gens zu korrigieren, indem man das väterliche Allel (Zustandsform eines Gens) als
Therapie für das Angelman-Syndrom aktiviert.
Das UBE3A-ATS ist das Antisense -Transcript des UBE3A-Gens, welches die Expression des
UBE3A-Gens in die negative Richtung regelt. Indem wir diese Antisense-RNA bei Mäusen gekappt
haben, konnten wir zeigen, dass die Elimination des Ube3a-ATS ausreichend ist, um die Expression
des väterlichen Ube3a zu aktivieren und die Defekte im Phänotyp des AS-Mausmodells
wiederherzustellen, einschließlich der motorischen Probleme, der kognitiven Schwierigkeiten und
des langfristig reduzierten Ausbaus in den Neuronen.
Um das UBE3A beim Angelman-Syndrom wiederherzustellen, haben wir versucht, das väterliche
UBE3A mittels eines Knockdowns des UBE3A-ATS mit Antisense-Oligonukleotiden (ASO) zu
aktivieren. Mittels eines Screenings von in vitro kultivierten Neuronen haben wir mit Erfolg einige
ASO, welche vollständig das väterliche UBE3A bei Mäusen aktivieren können, identifiziert. Im
Unterschied zu der Behandlung mit Topoisomerase-Hemmern sind die ASO spezifisch und haben
nur einen minimalen Effekt auf die väterlichen Gene, die sich in der Nachbarschaft von SNRPN,
SNORD115 und SNORD116 befinden. Wir haben dann die Effekte der ASO in vivo (in lebenden
Organismen) mittels intracerebroventricolärer Injektionen (= Injektionen in den Gehirnventrikel)
untersucht. Im Vergleich zu Tieren, die mit PBS behandelt worden waren, zeigten die Mäuse, welche
mit den ASO behandelt worden waren, 4 Wochen nach der Injektion ein bedeutendes Knockdown
der UBE3A-ATS und eine Aktivierung des väterlichen UBE3A-Gens im Cortex und in anderen
Gehirnregionen. Dies legt nahe, dass die ASO in vivo funktionieren.
Die aktuellen Studien zielen daraufhin ab, letzte Details in der mechanistischen Sichtweise der
repressiven Funktion der UBE3A-ATS zu liefern, um eine phänotypische Verbesserung im MausModell mit Angelman-Syndrom zu erreichen, indem man dem zentralen Nervensystem die ASO
verabreicht und spezifische ASO identifiziert, die für den Menschen in der Behandlung des
Angelman-Syndroms angewandt werden können.
Selektive Reaktionen des UBE3A-Gens in einem Maus-Modell mit Angelman-Syndrom
Targeted Reaction of UBE3A in a Mouse model of Angelman Syndrome
David Segal (USA)
Das Angelman-Syndrom wird verursacht durch einen Verlust der Expression des mütterlichen
UBE3A in den Neuronen des Zentralnervensystems. Unser Thema ist es, das väterliche UBE3A,
welches wegen der Expression des Transcripts eines Antisense-UBE3A-AT stumm ist, zu
reaktivieren. Wir setzen die künstlichen Transkriptionsfaktoren (ATF) vom Typ Zinkfinger ein, die
so programmiert werden können, dass sie eine spezifische Stelle der DNA anbinden können. An
einem Regler der Aktivierung oder der Repression anhaftend können die ATF die Aktivität der
Transkription erhöhen oder unterdrücken. Es wurde ein ATF-Repressor entwickelt, um das UBE3AATS zum Verstummen zu bringen. Dies dahingehend, dass dieser ATF-Repressor als gereinigtes
Protein mittels intraperitonealer Injektionen injiziert wird, er die Blut-Hirn-Schranke überwindet und
die Expression des UBE3A in den Neuronen eines Mausmodells mit Angelman-Syndrom aktiviert.
Unser aktueller Fortschritt und unsere Projekte für die zukünftige Entwicklung dieses Ansatzes
werden weiterhin diskutiert.
Klinische Tests mit Levodopa appliziert bei Angelman-Syndrom: Ziele, Methodik,
Bewertungskriterien und Follow-up (nachträgliches Prüfen bezüglich der Wirksamkeit)
Clinical trial of levodopa applied to Angelman Syndrome: Objectives, methodology,
assessment criterials and follow-up issues
Perrine Charles, M.D., Ph.D. (Frankreich)
Das Angelman-Syndrom ist eine genetische Pathologie der Gehirnentwicklung, welches
charakterisiert ist durch gravierende Lern-Probleme, Ataxie, epileptische Anfälle (mit einem
charakteristischem EEG) und einem glücklichen Verhalten, für welches im Moment noch keine
spezifische Behandlung existiert. Die Tiermodelle erlauben uns, die Pathophysiologie der Krankheit
besser zu verstehen. In heterozygoten (mischerbig) Mäusen mit einer Mutation des UBE3A-Gens
mütterlicherseits vererbt kann die menschliche Pathologie wirklichkeitstreu reproduziert werden:
 Die motorischen Defizite können der Dysfunktion der Substantia Nigra zugeschrieben
werden (Mulherkar et al., 2010)
 Die Probleme im Verhalten korrelieren mit der gestörten Aktivität des Dopamin-Systems
(Verminderung der Freilassung von Dopamin in der Substantia Nigra und Erhöhung der
Freilassung an Dopamin im Mesolimbischen System) (Riday et al., 2012)
 Die falsche Regulierung der CaMK2 („Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II“) ist
eine der molekularen Ursachen für das Defizit im neurologischen Verhalten (Weeber et al.,
2003)
 Die neurologischen Defizite können durch eine Reduktion der inhibitorischen (hemmenden)
Phosphorilation des alpha CaMK2 verringert werden
 Die Behandlung auf der Basis des Levodopa ist auch imstande, die Autophosphorilation des
alphaCaMKII zu normalisieren (Picconi et al., 2004)
Zusätzlich hat Harbord 2001 berichtet, dass die Parkinsonsymptomatik in 2 Erwachsenen mit
Angelman-Syndrom auf Levodopa reagierte. Die extrapyramidalen (Bewegungssteuerung außerhalb
des pyramidalen Systems) Symptome waren nicht den Pharmazeutika zuzuordnen und haben sich
durch die Therapie auf der Basis von Levodopa drastisch verbessert.
Diese Entdeckungen können zur Entwicklung neuer therapeutischer Ausblicke für das AngelmanSyndrom hinführen.
Treviso im Oktober 2014
Tommaso Prisco/Präsident des OR.S.A.
ORGANIZZAZIONE SINDROME DI ANGELMAN
(Übersetzt von Christel Kannegießer-Leitner: Wegen der besseren Lesbarkeit wurden nicht alle Begriffe ins Deutsche
übersetzt und wegen des besseren Verständnisses wurde versucht, deren Übersetzung in kursiv in Klammern anzufügen)