ZIP

I
Aus der Medizinischen Universitätsklinik
- Abteilung Innere Medizin IV der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
D
Daass P
maattoossee T
Phhääoocchhrroom
Tyypp 11
moozzyyttoom
m bbeeii N
Neeuurrooffiibbrroom
K
Klliinniikk uunndd M
Moolleekkuullaarrggeenneettiikk
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2005
von Tomas Harenberg
geboren in Heidelberg
II
Dekan
Prof. Dr. R. Korinthenberg
1. Gutachter
Prof. Dr. med. H.P.H. Neumann
2. Gutachter
Prof. Dr. med. Ch. Bode
Promotionsjahr
2006
III
Meinen Eltern
Anna und Job
Meinem Bruder
Daniel
IV
Inhalt
Abkürzungen
Vorbemerkung
1
2
3
4
Einleitung
V
VI
1
1.1
Geschichte des Phäochromozytoms und der Neurofibromatose Typ 1
1
1.2
Das Phäochromozytom
4
1.3
Die Neurofibromatose Typ 1
7
1.4
Genetische Grundlagen
12
1.5
Fragestellung
14
Patientengut und Methoden
15
2.1
Patientengut
15
2.2
Methoden
16
Ergebnisse
26
3.1
26 Patientenfallbeschreibungen
27
3.2
Zusammenfassung der klinischen Daten
76
3.3
Mutationen des NF1-Gens
80
3.4
Tabellarische Zusammenfassung der Mutationen
99
3.5
Tabellarische Zusammenfassung der Polymorphismen
Diskussion
100
101
4.1
Klinische Ergebnisse
101
4.2
Molekulargenetische Ergebnisse
108
5
Zusammenfassung
115
6
Literaturverzeichnis
117
7
Danksagung
131
8
Curriculum vitae
133
V
Abkürzungen
A
Adrenalin
bp
Basenpaare
CT
Computertomografie - Röntgenologisches Verfahren zur Erstellung von
del
Deletion
DHPLC
Denaturing High Performance Liquid Chromatography
DNA
Desoxyribonuclein Acid (Säure)
DOPA
Dihydroxyphenylalanin
EDTA
Ethylendiamin-Tetraessigsäure
GAP
GTPase-activating protein
GDP
Guanosindiphosphat
GRD
GAP-related Domain
GTP
Guanosintriphosphat
ins
Insertion
M
Metanephrine
MAPK
Mitogen-activated protein kinase
MEN 2
Multiple Endokrine Neoplasie Typ 2
MIBG
Metaiodobenzylguanidin
MRT
Magnetresonanztomografie; Bildgebungsverfahren auf dem Prinzip der
magnetischen Kernresonanz, ohne ionisierende Strahlen
NA
Noradrenalin
NF1
Neurofibromatose Typ 1
NM
Normetanephrine
PCR
Polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
PET
Positronenemissionstomographie
PGL
Paragangliom-Syndrom
RET
Rearranged during transfection
RNA
Ribonuclein Acid (Säure)
SDH
Succinatdehydrogenase
Taq
Thermus aquaticus, Enzym für die PCR
VHL
Von-Hippel-Lindau
VI
Vorbemerkung
Das Phäochromozytom ist ein Tumor des Nebennierenmarkes, der sporadisch oder familiär
auftritt. Die klinische und molekulargenetische Klassifikation der Phäochromozytome ist das
langjährige Forschungsschwerpunkt der Freiburger Arbeitsgruppe von Prof. Neumann. In
diesem Rahmen sind bereits Publikationen zum von Hippel-Lindau Syndrom, zur Multiplen
Endokrinen Neoplasie Typ 2 und den Paragangliom-Syndromen 1-4 (Neumann et al. 2002A;
Neumann et al. 2004) erschienen. Die Freiburger Gruppe hat daraufhin mit der klinischen und
molekulargenetischen Charakterisierung der Phäochromozytome bei Neurofibromatose Typ 1
begonnen. Ursache der Krankheit ist eine Funktionsstörung des Proteins Neurofibromin. Das
kodierende Gen ist das NF1-Gen auf Chromosom 17q11.2. Es ist ein Tumorsuppressorgen.
Kooperationen bestanden mit dem Team von Herrn Prof. Opocher, Università degli Studi di
Padova, Padua, Italien und dem Team von Herrn Prof. Januszewicz, Institute of Cardiology,
Warschau, Polen. Innerhalb des Freiburger Labors erfolgte eine personelle Aufteilung der
Analysen des NF1-Gens. Die Sequenzierung der Exons 1-8 und 28-49, d.h. von 30 der 57
Exons wurde vom Verfasser im Rahmen eines 10 monatigen Studienaufenthaltes bis 2004 an
der Università degli Studi di Padova im Labor von Prof. Opocher begonnen und
weitestgehend durchgeführt aber nicht beendet. Laborleiterin war Frau Dr. Schiavi. Die
Untersuchung des kompletten NF1-Gens mittels der Denaturing High Performance Liquid
Chromatography (DHPLC) und die Sequenzierung aller mittels dieser Methode als auffällig
gefundener Exons wurde von Frau Dr. Bausch im Freiburger Labor etabliert und geleitet. In
der Freiburger Arbeitsgruppe haben weiterhin Frau Buchta (MTA), Frau Bacher (MTA) und
Herr Berisha (Hilfslaborant) am NF1-Projekt gearbeitet. Die in der DHPLC-Analyse
auffälligen Proben wurden zum Sequenzieren in das Labor der Core Facility (Leiter: Dr. M.
Hoffmann) der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg gegeben und von Frau Dr. Bausch
ausgewertet. Alle in dieser Arbeit abgebildeten molekulargenetischen Befunde, d.h. alle
Mutationen wurden von Frau Dr. Bausch entdeckt. 6 Mutationen konnten durch die
Sequenzierungen aus Padua bestätigt werden.
Die klinischen Daten wurden im wesentlichen von Herrn Prof. Neumann und dem Verfasser
der Arbeit mit den unmittelbar die Patienten betreuenden, ausserhalb Freiburgs tätigen
Kollegen zusammengestellt. Die Auswertung der klinischen Daten bis Mai 2005 erfolgten
von dem Verfasser der Arbeit.
1
1 Einleitung
1 Einleitung
1.1 Geschichte des Phäochromozytoms und der
Neurofibromatose Typ 1
Der Begriff Phäochromozytom setzt sich aus dem griechischen Wort "phaios", das "grau"
bedeutet, sowie den Wortteilen "chrom-" für "Farbe", "zyt" für "Zelle" und der Endung "-om"
für "Geschwulst" zusammen. "Phäo-chromo-zyt-om" bedeutet also, wörtlich übersetzt,
"graufarbene Zellgeschwulst". Der Begriff „Phäochromozytom“ geht auf den Berliner
Pathologen Ludwig Pick (1868–1944) zurück, der Bezug auf die dunkelbraune Farbe der
Zellen bei Kontakt mit Chromsalzen nimmt (Pick, 1912).
Der erste Fall eines Phäochromozytoms wurde von Fränkel 1886 als „Ein Fall von
doppelseitigem, völlig latent verlaufenen Nebennierentumor und gleichzeitiger Nephritis mit
Veränderungen am Zirkulationsapparat und Retinitis“ beschrieben (Fraenkel, 1886).
Die erste Verbindung von Phäochromozytom
mit Neurofibromatose hatte 1910 Suzuki
dargestellt
1910),
(Suzuki,
während
die
Koinzidenz mit anderen endokrinen Tumoren
1932 erstmalig von Eisenberg und Wallerstein
erwähnt wurde (Eisenberg et al. 1932). Glushien et
al. beschrieben 1953 eine familiäre Häufung
der Erkrankung im Rahmen von Phakomatosen
wie der Tuberösen Sklerose, dem SturgeWeber- und besonders dem von HippelLindau-Syndrom (VHL) (Glushien et al. 1953)
und
der
Neurofibromatose
Recklinghausen).
erklärt
sich
Dieser
durch
den
Typ
1
(M.
Zusammenhang
gemeinsamen
neuroektodermalen Ursprung der chromaffinen
Zellen und der oben genannten Syndrome und
deren Tumoren.
Abb. 1: Friedrich von Recklinghausen.
Friedrich von Recklinghausen (1833-1910)
(Abb. 1), Pathologe in Würzburg, gilt als der
2
1 Einleitung
Erstbeschreiber der Neurofibromatose Typ 1 (NF1). 1882 erschien seine klassische
Publikation "Über die multiplen Fibrome der Haut und ihre Beziehung zu den multiplen
Neuromen", in welcher er den später benannten "Morbus Recklinghausen" detailliert an Hand
der Autopsiebefunde zweier Patienten beschrieb ( von Recklinghausen, 1882).
Zeichnungen und Beschreibungen der Krankheit lassen sich allerdings schon zu früheren
Zeiten finden, so malte „Aldrovandi“ 1642
ein vermutliches NF-Abbild, das später als
„monstrorum historica“ (Abb.2) bekannt wurde (Zanca et al. 1975).
Abb. 2: Aldrovandis “monstrorum historica”, Opera Omnia. Bononiae, 1642
3
1 Einleitung
1773 beschrieb Tilesius einen Patienten mit multiplen fibrösen Hauttumoren, Café-au-lait
Flecken, Makrozephalie und Skoliose (Abb.3) (Ruggieri und Pulizzi 2003). Grossen Verdienst an
der Charakterisierung der Krankheit hatte auch der Lehrer Recklinghausens, Rudolf Virchow
(1821-1902), der von 1847 - 1863 eine Reihe von klinischen und neuropathologischen
Eigenschaften von Neuromen und Fibromen aufzeichnete und sogar Erblichkeit erkannte
(Virchow, 1863):
„Ein ausgezeichneter Fall dieser Art gab mir Gelegenheit, die Einzelheiten genau zu verfolgen. Eine 47jährige Frau trug auf
ihrem gamzen Körper zerstreut eine grosse Masse kleinerer und grösserer Gewächse, welche sich seit Jahren langsam
entwickelt hatten. Viele von ihnen waren ganz klein, erbsen- bis kirschkerngross, rund und von glatter Haut bedeckt; andere
waren grösser, wallnussgross und darüber, übrigens von gleicher Beschaffenheit. Der grösste sass links in der unteren
Rippengegend mit breiter Basis auf; es hatte 48 Zoll im Umfang und erstreckte sich von der Linea alba bis etwa 2 Zoll vom
Rückgraht. Es hing von da tief nach unten über die Hüfte herab. An seiner Oberfläche und in seinem Umfange trug es
mehrere kleine Secundärknoten; im Ganzen war die es bedeckende Haut aber glatt und verhältnissmässig dünn. Dabei fühlte
es sich weich, fast fluktuierend an. Nachdem es [….] extirpiert war, wog es 32½ Pfund. Neun Jahre fürher war es
Kindskopfgross gewesen. [….]
Diese Vorstellung wird noch mehr dadurch begünstigt, dass Fälle von ausgemachter erblicher Übertragung fibromatöser
Dispositionen vorkommen. Ich habe einen jungen Mann gesehen, dessen Körper ganz übersäet war mit Knoten von der
Grösse eines Stecknadelknopfs bis zu der von Taubeneiern, und in dessen Familie diese Besonderheit schon in der Dritten
Generation in erblicher Weise vorhanden war.”
Abb. 3: “the wart man”, Tilesius von Tilenau : Historia Pathologica Singularis Cutis Turpitudinis Leipzig,
Germany, 1793.
Im Folgenden werden die klinischen und molekulargenetischen Grundlagen des
Phäochromozytoms und der Neurofibromatose Typ 1 erläutert.
4
1 Einleitung
1.2 Das Phäochromozytom
1.2.1 Klinik
Phäochromozytome
sind
neuroendokrine
Tumoren
aus
chromaffinen
Zellen
des
Nebennierenmarkes, die Katecholamine - vor allem Noradrenalin und Adrenalin - produzieren
und sezernieren. Die 10% Regel (10% extraadrenal, 10% bilateral, 10% maligne, 10%
hereditär, Manger und Gifford, 1993) wurde allerdings inzwischen weitgehend widerlegt: Die
meisten Phäochromozytome kommen zwar sporadisch und unilateral vor, aber 24 % sind
familiär (Neumann et al. 2002A). Maligne Entartung kommt selten vor (10%). Häufigste
Lokalisation der Metastasen sind Lunge, Leber und Knochen. Bei adulten Patienten liegen
etwa 10% der Phäochromozytome extraadrenal (Neumann et al. 1993) und werden in der Regel
von Pathologen als Paragangliome bezeichnet.
Paragangliome stammen aus den hauptsächlich retroperitoneal gelegenen Paraganglien des
sympathischen Systems. Sie können aber auch in chromaffin negativen Zellen lokalisiert sein
und dem parasympatischen System angehören (Neumann et al. 2002A). Paragangliome liegen am
häufigsten paraaortal (75%), kommen aber auch in der Blase (10%), dem Thorax (10%), dem
Kopf-, Nackenbereich (3%) und im Becken (2%) vor (Kaltsas et al. 2004). Sie können
hormonaktiv und hormoninaktiv sein. Das Symptomenspektrum unterscheidet sich nicht von
dem des Phäochromozytoms.
Am häufigsten äußern sich Phäochromozytome mit einer klassischen Trias bestehend aus
Kopfschmerzen, Palpitationen und Schweißausbrüchen. Andere Symptome sind Hypertonie,
Blässe, psychische Störungen, Schmerzen und Übelkeit (Kaltsas et al. 2004).
Differentialdiagnostisch
kommen
Angsterkrankungen,
Schilddrüsenüberfunktion
(Hyperthyreose), Kopfschmerzen anderer Genese, Alkoholentzugssymptomatik sowie andere
sekundäre Hypertonieformen wie Hypercortisolismus, Nierenarterienstenose und ConnSyndrom (Hyperaldosteronismus) in Betracht.
1.2.2 Diagnostik und Therapie
Bei klinischer Indikation sollte als Screeningverfahren eine Adrenalin-, Noradrenalin-,
Metanephrin-, Normetanephrin- und Vanillinmandelsäurebestimmung im 24h-Urin, oder eine
Adrenalin- und Noradrenalinbestimmung im Plasma erfolgen, um einen Hinweis auf evtl.
erhöhte Katecholaminwerte zu erhalten (Eisenhofer et al. 2004). Im Plasma kann ein erhöhter
Noradrenalin-Ruhewert auf ein Phäochromozytom hinweisen. Als radiologische bildgebende
5
Verfahren
stehen
Magnetresonanztomographie
1 Einleitung
Ultraschallsonographie,
(MRT),
123-Jod
oder
Computertomographie
(CT),
131-Jod-Metaiodobenzylguanidin
(MIBG)- Szintigraphie und die 18-Fluor-DOPA-Positronenemissionstomographie (DOPAPET) zur Verfügung. Die Sonographie ist trotz verbesserter Technik ungenau und erfordert
einen versierten Untersucher. Die MRT ist der CT hinsichtlich der Sensitivität um ca. 15%
überlegen. Sie erlaubt aufgrund der multiplanaren Schnittführung eine optimale Darstellung
des Retroperitoneums, wo ca. 99% der Phäochromozytome lokalisiert sind. Die MIBGSzintigraphie (Van Gils et al. 1990; Campbell et al. 1996) nutzt den Katecholaminmetabolismus zum
Uptake innerhalb 48 Stunden und hat eine Sensitivität von ca. 85 bis 97%. Bei der 18-FluorDOPA-Positronenemissionstomographie (PET) wird eine hochauflösende Bildgebung mit der
Aufnahme des Radiopharmakons kombiniert. Nach einer Pilotstudie von Högerle et. al.
(2002) ist die 18-Fluor-DOPA-PET mit einer Sensitivität und Spezifität von 100% der MRT
gleichwertig und allen anderen Verfahren überlegen.
Die derzeit zu empfehlenden Nachweisverfahren sind in Tabelle 1 zusammengefasst.
Tab. 1: Sensitivität und Spezifität verschiedener Untersuchungen zur Diagnostik des Phäochromozytoms
Untersuchung
Adrenalin/Noradrenalin im Plasma
Sensitivität Untersuchung
33%/58%
Sensitivität
Sonographie
40%
Adrenalin im Urin
53%
CT
76%
Vanillinmandelsäure im Urin
64%
MRT
95%
Noradrenalin im 24h-Urin
86%
MIBG-Szintigramm
95%
Metanephrin/Normetanephrin im Urin
97%
18-Fluor-DOPA-PET
100%
Angaben nach Neumann et al. (1993), Eisenhofer et al. (1999), Högerle et al. (2002), Lenders et al. (2002)
Nach der bildgebenden und biochemischen Sicherung der Diagnose ist die Therapie der Wahl
bei Phäochromozytomen die laparoskopische organerhaltende Operation. Als präoperative
Medikation wird α- und β-Blockade mit Phenoxybenzamin und Metoprolol empfohlen
(Neumann et al. 2002B).
Die Behandlung maligner Phäochromozytome ist schwierig. Die Therapieoptionen sind
Resektion, Chemotherapie (Averbuch et al. 1988), die Jod-131-MIBG in hoher Dosierung oder
Oktreotid-Analoga sowie α-Blocker. Kriterien für ein Ansprechen der Therapie sind
Reduktion von Tumorgewebe, Senkung des Blutdrucks, der Katecholamine, und der
bestehenden Symptome.
1 Einleitung
6
1.2.3 Molekulargenetische Klassifikation
Anders als bisher angenommen, sind mehr als 10% der Phäochromozytome hereditär. Zu den
Tumorsyndromen, bei denen ein Phäochromozytom vorkommt, gehören:
•
Die multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN 2), ein autosomal dominantes
Syndrom, das in drei Subtypen unterteilt werden kann, MEN 2A, MEN 2B und das
familiäre medulläre Schilddrüsenkarzinom. Die Häufigkeit wird auf 1:35.000 geschätzt.
Ca. 50% der MEN 2A und MEN 2B Patienten entwickeln ein Phäochromozytom, wobei
sie auch multifokal und bilateral vorkommen. Ursache der Erkrankung sind Mutationen
des RET-Protoonkogens auf Chromosom 10q11.2 (Neumann et al. 2002A).
•
Das von Hippel-Lindau Syndrom (VHL), ebenfalls autosomal dominant, kann in zwei
Subtypen unterteilt werden: VHL Typ 1 (ohne Phäochromozytom) und VHL Typ 2 (mit
Phäochromozytom). Die Prävalenz wird zwischen 1:36.000 und 1:85.000 angegeben.
20-30% der VHL Patienten entwickeln ein Phäochromozytom, bis zu 50% sind
multifokal und/oder bilateral. Ursache sind Mutationen des VHL-Tumorsuppressorgens
auf Chromosom 3p25-26 (Gimm et al.2004).
•
Hereditäre Phäochromozytome und Paragangliome, deren genetische Ursachen erst
seit 2000 mit den SDHx Genen (Succinatdehydrogenase) entdeckt wurden. Die
Paragangliom-Syndrome unterteilen sich in 4 Entitäten. Das PGL 1 Syndrom bedingt
durch Mutationen des SDHD-Gens (Chromosom 11q23), das PGL 2 Syndrom, das im
Zusammenhang mit Veränderungen im chromosomalen Bereich 11q13 steht, das PGL 3
Syndrom, bedingt durch Mutationen des SDHC-Gens (1q21) und das PGL 4 Syndrom,
dessen genetische Ursache Mutationen des SDHB-Gens (1p36-1p35) sind. Im
Zusammenhang mit dem PGL 3 Syndrom spricht man nicht von Phäochromozytomen
sondern von HNPs („Head and Neck-Paragangliomas“). Mutationsanalysen ergaben
bisher nur relevante Ergebnisse für SDHB und SDHD (Neumann et al. 2002A).
•
Die Neurofibromatose Typ 1 (Morbus von Recklinghausen) mit einer Prävalenz von
1:3500. Die Inzidenz von Phäochromozytomen wird von 0,1– 5,7 % in vivo und bis zu
13% bei Autopsie angegeben (Walther et al. 1999A) (Tab. 2). Für die Krankheit sind
Mutationen des NF1-Tumorsuppresorgens verantwortlich.
7
1 Einleitung
1.3 Die Neurofibromatose Typ 1
1.3.1 Klinik, Diagnostik und Therapie
Die Neurofibromatose Typ 1 ist eine autosomal dominante Krankheit, deren Inzidenz bei
1:3500 Lebendgeburten liegt (Huson et al. 1994). Die eine Hälfte der Fälle kommt familiär vor,
die andere Hälfte ist sporadisch. Die Penetranz beträgt bei sehr variablen klinischen
Erscheinungsbildern annähernd 100%. Für die Diagnose müssen die Patienten mindestens
zwei der folgenden Merkmale aufweisen (Stumpf et al. 1988; Gutmann et al. 1997):
•
6 oder mehr so genannte Café-au-lait Flecken, hellbraune Hautflecken, die präpubertal
eine Größe von mindestens 5 mm, postpubertal über 15 mm aufweisen können. 95% der
Patienten bilden Café-au-lait Flecken (Abb. 4a).
•
2 oder mehr Neurofibrome, meist gutartige Geschwülste, die klinisch und histologisch
in drei Typen unterteilt werden können:
1.
Kutane Neurofibrome, benigne Tumoren in der Haut (Abb. 4b).
2.
Noduläre Neurofibrome in peripheren Nerven, ubiquitär auftretend und nicht
infiltrierend.
3.
Plexiforme (netzartig wachsende) Neurofibrome (ca. 30 % der Patienten), die bei
maligner Entartung die häufigste Todesursache der NF1 darstellen.
•
Sommersprossenartige Pigmentierung der Achselhöhlen und/oder der Leistengegend
(„Axillary Freckling“, „Inguinal Freckling“, Abb. 4c).
•
Ein Optikusgliom, ein Tumor am Sehnerv.
•
Mindestens
2
Irishamartome,
so
genannte
„Lisch-Knoten“,
die
sich
als
Pigmentanreicherungen auf der Regenbogenhaut des Auges äußern (Abb. 4d).
•
Eine ausgeprägte Knochendysplasie des Sphenoids und/oder der langen Röhrenknochen.
•
Mindestens ein Verwandter ersten Grades mit der Diagnose Neurofibromatose Typ 1.
8
1 Einleitung
a)
b)
c)
d)
Abb. 4 a-d: „Typischsten” Symptome der Neurofibromatose: a) Café-au-lait Fleck, Quelle: Internet b)
Fibrome der Haut, Quelle: Internet. c) Freckling, axillär (wie in diesem Fall) oder inguinal, Quelle: Internet.
d) Lisch-Knoten der Iris Quelle: Internet.
Weitere klinische Symptome, die gehäuft bei Neurofibromatose Typ 1 auftreten, sind
Skoliosen,
mentale
Retardierung
mit
Lern-,
Leistungs-
und
Verhaltensstörungen,
Minderwuchs, Makrozephalie, Hydrozephalus, Epilepsie, Hypertonie sowie Kopfschmerzen.
Vermehrt treten auch Tumoren im Intestinum, maligne Gliome, juvenile chronische
myeloische Leukämie und das Phäochromozytom auf (Hirsch et al. 2001).
Eine ursächliche Therapie der Krankheit ist nicht möglich. Somit steht die symptomatische
Behandlung im Vordergrund. Es können z.B. Neurofibrome der Haut laserchirurgisch auch in
großer Zahl entfernt werden. Die Neurofibromatose Typ 1 erfordert eine Betreuung durch
verschiedene Fachdisziplinen, wie durch Dermatologie, Genetik, Pädiatrie, Neurochirurgie,
Orthopädie, etc.. Dies ist am besten in einem Neurofibromatose-Zentrum gewährleistet.
9
1 Einleitung
1.3.2 Molekulargenetik des NF1-Gens
Das NF1-Gen (Abb. 5) wurde erst
Anfang der 90er Jahre identifiziert
(Cawthon et al. 1990, Viskochil et al. 1990). Es
ist auf Chromosom 17q11.2 lokalisiert.
Es ist mehr als 300 kb groß und besteht
aus 60 Exons. Das mRNA-Transkript ist
8454 Basen lang. Sie werden zu 2818
Aminosäuren translatiert. Das Produkt
ist das Protein Neurofibromin (Li et al.
1992).
Abb. 5: 3D-Struktur des Neurofibromins (aus
www.rcsb.org)
Es
gehört
zur
Gruppe
der
Tumorsuppressorgene (DeClue et al. 1992;
Li et al. 1995).
Eine im Protein zentral gelegene, 360 Aminosäuren lange Region zeigt dabei eine signifikante
Ähnlichkeit mit der katalytischen Domäne des Ras GTPase-aktivierenden Proteins
(p120GAP) der Säugetiere. Diese „GAP-related Domain“ (GRD) interagiert mit Ras und führt
zur Hydrolyse des an Ras gebundenen aktiven GTP (Guanosintriphosphat) zum inaktiven
GDP (Guanosindiphosphat) (Abb.6) (Xu et al. 1990; Feldkamp et al. 1999).
Dadurch wird der klassische MAP-Kinase-Signaltransduktionsweg (Abb.7) und die daraus
Abb. 6: Schematiche Darstellung des NF1-Gens, des mRNA Transkripts und des
Proteinproduktes, dem Neurofibromin. Das NF1-Gen ist 350 kb, die mRNA 8-9 kb lang.
Das große Protein Neurofibromin hat ein Molekulargewicht von 220 kDa. Blau markiert
ist die “GAP-related-Domain” = GRD, nach Feldkamp et al. (1999).
1 Einleitung
10
entstehende Zellproliferation unterbrochen. Mutationen führen zur gestörten Expression des
Neurofibromins und somit zu verminderten Inhibierung der Zellteilung, woraus Tumoren
entstehen können. Das Ras-Protein hat 21 kDa und beeinflusst eine Reihe weiterer
Mediatoren, meist Wachstumsfaktoren. Mutationen des Ras-Proteins sind bei 50% von
Kolon-, 90% von Pankreas- und 25% von anderen bösartigen Tumoren beschrieben worden
(Feldkamp et al. 1999).
Abb. 7: Schematische Darstellung des Ras-Reaktionsweges. Ein Signalmolekül dockt an den
Tyrosinkinaserezeptor an. Dessen Phosphorylisierung führt zur Bindung mehrerer Kinasen bis es zur
Aktivierung des Ras-Proteins kommt. Über mehrere Phosphorylierungen kommt es dann zur
Genexpression. Das Tumorsupressorgen Neurofibromin (NF) kann die Aktivierung des Ras-Proteins
unterbinden.
Verteilt im menschlichen Genom finden sich DNA-Sequenzen, die eine Homogenität von
über 95% zu der NF1-Gensequenz aufweisen (Luijten et al. 2001). Diese so genannten
Pseudogene spielen in der genetischen Untersuchung des NF1-Gens insofern eine Rolle, als
dass ihre Amplifikation ausgeschlossen werden muss, um Fehldeutungen zu vermeiden. Diese
Pseudogene können durch interchromosomale Konversion Ursprung mancher Mutationen im
NF1-Gen sein (Marchuk et al. 1992). In der Tabelle 2 sind die bisher entdeckten Pseudogene
aufgelistet.
11
1 Einleitung
Tab. 2: Auflistung der bekannten Pseudogene. Accession Nr. bezieht sich auf die Datenbank des NCBI.
Chromosom
Exon(s)
Accession Nr.
Referenz
2
10b, 12a-19a, 27b
AF232292-AF232302
2
12b-19a, 27b
AC0009477
The sanger centre*
2
13-15*
Y07858
Regnier et al. 1997
2
13
U35697
Purandare et al. 1995
12
16
U35686
Purandare et al. 1995
12
16, 17
AC024000
14
10b, 12a-19a, 27b
AF232248-AF232258
Luijten et al. 2000
14
10b, 12a-19a, 27b
AF232259-AF232269
Luijten et al. 2000
14
10b, 12a-19a, 27b
AF232270-AF232280
Luijten et al. 2000
14
10b, 12a-19a, 27b
AF232281-AF232291
Luijten et al. 2000
14
10b, 12a-19a, 27b
AL512624
14
12b-19a, 27b
AL512310
14
13-15
Y07854, Y07855
14
13, 15, 16, 18
U35696, U35684, U35687, U35690
15
13-15
Y07856, Y07857
15
14
AF011743
15
15
U35685
15
15
AF011746, AF011744
15
18
U35691
Purandare et al. 1995
15
19b
U35693
Purandare et al. 1995
15
20-22
M84131
Legius et al. 1992
15
21
AF011748
15
23.1
U35694
Purandare et al. 1995
15
24
U35695
Purandare et al. 1995
15
24
AF011747, AF011745, AF011749
15
25-27b
M84131
15
13-23-1, 24-27b
AC021585, AC023191, AC037471
Birren et al. unpubliziert
15
13-23-1, 24-27b
AC020679
Birren et al. unpubliziert
15
24-27b
AC060814
Birren et al. unpubliziert
18
7-9, 11
AP001004
Hattori et al. unpubliziert
18
8
U35688
Purandare et al. 1995
Purandare et al. 1995
Luijten et al. 2000
Birren et al. unpubliziert
Genoscope**
Genoscope**
Regnier et al. 1997
Purandare et al. 1995
Regnier et al. 1997
Kehrer-Sawatzki et al. 1997
Purandare et al. 1995
Kehrer-Sawatzki et al. 1997
Kehrer-Sawatzki et al. 1997
Kehrer-Sawatzki et al. 1997
Legius et al. 1992
18
9
U35689
21
7-9, 11
D26141, AC004527
Suzuki et al. 1994
22
10b, 12a-19a, 27b
AC002471, AC003064, AC005374
Luijten et al. 2000
22
13-15
Y07859
Regnier et al. 1997
22
18
U35692
Purandare et al. 1995
* = siehe Literaturverzeichnis, ** Genoscope, Centre National de Sequencage (www.genoscope.cns.fr). Tabelle nach Luijten
et al. (2001).
12
1 Einleitung
1.4 Genetische Grundlagen
1.4.1 Transkription und Translation
Die genomische DNA (gen. DNA)
wird im Zellkern in die messenger
RNA (mRNA), auch codierende DNA
(cDNA) genannt, übersetzt. Sie ist die
Grundlage der Aminosäuren und somit
der Proteinsynthese. Dabei werden die
Nukleotide Adenin (A), Cytosin (C),
Guanin (G) übernommen, Thymin (T)
jedoch in Uracil (U) umgewandelt. Der
genetische Code beinhaltet, dass von
drei
Abb. 8: Der genetische Code nach Bresch und
Hausmann veranschaulicht die Verschlüsselung
der 20 verschiedenen Aminosäuren durch die
Basen der DNA. Das Triplett wird von innen nach
außen gelesen. Bestimmte Dreierkombinationen
von Basen signalisieren, wann die Proteinsynthese
in den Ribosomen beginnen (Start-Codon) und
wann sie enden soll (Stopp-Codon).
Nukleotiden
(Codon)
eine
Aminosäure codiert wird (Abb. 8). Der
Code ist universell, das heißt, er ist bei
Menschen,
Tieren
und
Pflanzen
identisch. Der Ausdruck „degeneriert“
bedeutet, dass eine Aminosäure durch
verschiedene Tripletts codiert werden
kann. Die mRNA wandert aus dem Zellkern zu den Ribosomen im Zellplasma und wird dort
zu den Proteinen translatiert. Jedem Basen-Triplett wird eine Aminosäure zugeordnet. ATG
codiert für das Start-Codon, somit beginnen alle Proteine mit der Aminosäure Methionin.
Stopp-Codons (TGA, TAA, TAG) beenden die Proteinbiosynthese. Die 20 Aminosäuren sind
in Tabelle 3 aufgelistet.
Tab. 3: Abkürzungen der einzelnen Aminosäuren.
Aminosäure
1. Alanin
2. Arginin
3. Asparagin
4. Asparaginsäure
5. Cytosin
6. Glutamin
7. Glutaminsäure
8. Glycin
9. Isoleucin
10. Histidin
3-Buchstaben
Code
Ala
Arg
Asp
Asn
Cys
Glu
Gln
Gly
Ile
His
1-Buchstaben
Aminosäure
Code
A
R
D
N
C
Q
E
G
I
H
11. Leucin
12. Lysin
13. Methionin
14. Phenylalanin
15. Prolin
16. Serin
17. Threonin
18. Tryptophan
19. Tyrosin
20. Valin
3-Buchstaben 1-Buchstaben
Code
Code
Leu
Lys
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tyr
Val
L
K
M
F
P
S
T
W
Y
V
13
1 Einleitung
Bei Angabe von Mutationen können verschiedene Angaben gemacht werden:
1. Die Zahl nach Nukleotiden steht für die Position des Nukleotids, die Buchstaben für
die Basen. Das Beispiel 1101 C/T bedeutet, dass im Nukleotid 1101 der codierenden
DNA die Base Cytosin (C) durch die Base Thymin (T) ersetzt ist.
2. Die Zahl zwischen zwei Aminosäuren steht für die Codonnnummer. Der Buchstabe
vor der Zahl steht für die Aminosäure in der Wildtypsequenz, der Buchstabe danach
für die Aminosäure, die durch die Mutation resultiert. Im Beispiel der Mutation
D112Y wird im Codon 112 die Aminosäure Asparagin (D) durch Tyrosin (Y) ersetzt.
Alternativ kann auch die Aminosäure durch den dreibuchstabigen Code benannt
werden (Asp 112 Tyr).
3. Handelt es sich bei der Mutation um eine Insertion oder Deletion von Basen, so führt
dies zum so genannten Frameshift. Der Frameshift sagt aus, dass durch die Insertion
oder die Deletion es zu einer Verschiebung des Leserasters kommt und die
ursprüngliche Aminosäuresequenz nicht eingehalten wird. So werden „falsche“
Aminosäuren übersetzt, bis es zu einem Stopp-Codon kommt. Bei Insertionen und
Deletionen wird die Nukleotidnummer genannt, nach der es zu einer Baseninsertion
oder –deletion kommt. (z.B. 2706 ins C oder 1507 del A).
4. Mutationen, die sich 2 Basen vor oder 2 Basen nach dem Exon befinden, betreffen die
AG/GT-Regel. Die AG/GT-Regel besagt, dass Introns - die nicht codierenden
Sequenzen zwischen zwei Exons – am 5`Ende des Introns mit den Basen GT beginnen
und mit der Basenfolge AG am 3`Ende des Introns enden (Breathnach et al. 1978; Mount
SM, 1982). Bei der Darstellung dieser so genannten Splice site Mutationen wird
entweder die Lokalisation des ersten Nukleotids des Exons genannt mit dem Zusatz -1
oder -2. Diese Angabe verdeutlicht die Entfernung zu dem Beginn des Exons. Bei
einer Mutation im GT-Bereich nach dem Exon wird die Nukleotidnummer der letzten
Base des Exons genannt. Es folgt der Zusatz +1 oder +2, um die genaue Position nach
dem Exon anzugeben.
1 Einleitung
14
1.5 Fragestellung
Die Neurofibromatose Typ 1 ist eine häufige Erbkrankheit, die Assoziation mit
Phäochromozytomen aber selten. Von zentralem Interesse war die Charakterisierung der
zugrunde liegenden Mutationen bei Patienten, die beide Merkmale aufweisen. Im Verlaufe
stellten sich zwei Herausforderungen: Zum einen erschien es wichtig, die Zielgruppe
möglichst groß zu gestalten, um repräsentative Ergebnisse zu erzielen. Zum anderen waren
erhebliche Probleme bei den DNA-Analysen zu lösen. Vor diesem Hintergrund lässt sich die
Fragestellung wie folgt fassen:
1. Klinische Charakterisierung von NF1-assoziierten Phäochromozytomen: Wie ist das
Spektrum hinsichtlich Alter, Geschlecht, Produktion/Elimination der Katecholamine,
Lokalisation und Zahl der Tumoren sowie Vorkommen maligner Tumoren?
2. Unter welchen methodischen Voraussetzungen lassen sich Mutationen nachweisen
und welche Sensitivität wird dabei erreicht?
3. Wie häufig kommen intraexonische Mutationen des NF1-Gens als Ursache vor?
4. Lassen sich genetische Besonderheiten hinsichtlich der Lokalisation im Gen oder dem
Mutationstypus (Missense Mutationen versus Protein-verkürzende Mutationen)
feststellen?
5. Lässt sich die Untersuchung des NF1-Gens kostengünstig und schnell als
Routinediagnostik durchführen, und welche Konsequenz und welcher Nutzen ergibt
sich daraus für den Patienten und deren Angehörige?
15
2 Patientengut und Methoden
2 Patientengut und Methoden
2.1 Patientengut
Grundlage für das Patientengut ist das Freiburger Phäochromozytomregister. Zu diesem
Register haben im Wesentlichen folgende Erhebungen beigetragen:
1. Epidemiologische Erfassung aller Phäochromozytome in Südwestdeutschland,
schwerpunktmäßig prospektiv seit 1983 bis 2005 und retrospektiv bis 1975.
2. Erfassung aller Phäochromozytome des Kindes- und Jugendalters in Deutschland,
durchgeführt von 1998 bis 1999.
3. Erfassung aller Patienten mit Phäochromozytomen in Zentral-Polen, durchgeführt von
Prof. W. Januszewicz und von Prof. A. Januszewicz, Warschau.
4. Weiterhin wurden zahlreiche Phäochromozytom-Patienten als Einzelfälle und kleinere
Serien, unter anderem von den deutschen Universitäten in Lübeck und Essen sowie
von italienischen Universitäten in Padua und Rom gemeldet. Einzelne Fälle lieferten
Nancy, London und Basel.
Von allen Patienten wurden folgende Daten erhoben:
In
•
Geburtsdatum
•
Geschlecht
•
OP-Datum
•
Lokalisation und Größe des Tumors
•
Multiple oder solitäre Tumoren
•
Dignität der Tumoren
•
Tumoren in anderen Organen
•
Familienanamnese
dieser
Arbeit
wurden
alle
Patienten
aus
dem
Freiburger
Internationalen
Phäochromozytomregister berücksichtigt, die eine Neurofibromatose Typ 1 und ein
Phäochromozytom aufwiesen. Die Neurofibromatose Typ 1 wurde klinisch, das
Phäochromozytom histologisch diagnostiziert. Die Registrierung war auf den 15.05.2005
limitiert. Von jedem Patienten musste Blut oder Blut-DNA verfügbar sein.
16
2 Patientengut und Methoden
2.2 Methoden
Die Exons 1-8 und 28-49 wurden vom Verfasser in einem Labor in Kooperation mit Herrn
Prof. Opocher der endokrinologischen Abteilung der Università degli Studi di Padova (Padua)
in
Italien
während
eines
10
monatigen
Forschungsaufenthaltes
sequenziert.
Die
Untersuchungen konnten allerdings nicht komplett abgeschlossen werden. Die DHPLC und
die Sequenzierung der Exons mit auffälligen DHPLC-Diagrammen wurde im Labor von
Herrn Prof. H.P.H. Neumann unter Leitung von Frau Dr. Bausch durchgeführt.
2.2.1 Klinische Kasuistikdarstellung
Die vorhandenen Akten und Informationen wurden gesammelt und im Detail ausgewertet. Für
alle Patienten wurde ein Fragebogen erstellt, mit dem folgende Informationen eingeholt
wurden:
1. Allgemeine Patientendaten
2. Detaillierte Anamnese
3. Familienanamnese
4. Klinischer Untersuchungsbefund
5. Diagnostik
a) 24h-Blutdruckmessung präoperativ
b) Katecholaminuntersuchungen im 24h-Urin und im Plasma
c) Bildgebende Befunde:
• Computertomogramm des Abdomens
• Kernspintomogramm des Abdomens
• MIBG-Szintigraphie
• DOPA-PET
6. Therapie
7. Postoperativer Verlauf
Diese Erhebungen gestalteten sich mehrheitlich mühevoll, da die Akten in den primär
betreuenden Krankenhäusern erneut eingesehen werden mussten. Für eine gute Darstellung
der Fälle in der vorgelegten Arbeit wurden alle verfügbaren Abbildungen zusammengetragen,
ausgewertet und auszugsweise wiedergegeben.
17
2 Patientengut und Methoden
2.2.2 DNA-Extraktion aus EDTA-Blut
Die DNA aus peripheren Blutleukozyten wurde mittels Extraktion durch Säulen von Qiagen
(QIAamp DNA Blood Kit von Qiagen, Scherczinger et al. 1997) gewonnen.
Das QIAamp DNA isolation blood kit beinhaltet verschiedene Puffer-Lösungen und eine
Extraktionssäule.
In ein 50 ml Falcon-Tube werden 5 ml EDTA antikoaguliertes Vollblut zu 5 ml eiskaltem
Puffer C1 und 15 ml eiskaltem ddH2O gegeben und vorsichtig gemischt. Anschließend wird
das Gemisch für 10 min auf Eis inkubiert. Die Lyse der Zellen erfolgt durch den Puffer C1,
der Nukleus bleibt jedoch intakt. Das Lysat wird für 15 min bei 4°C und 2500 U/min
zentrifugiert. Danach wird der Überstand verworfen. Das durch residuelles Hämoglobin
rötlich gefärbte Pellet wird mit 1 ml eiskaltem Puffer C1 und 3 ml eiskaltem ddH2O
resuspendiert und nochmals für 15 min bei 4°C und 2500 U/min zentrifugiert. Dadurch
werden restliches Hämoglobin und weitere Zelltrümmer entfernt. Die Resuspension des
weißen Pellets erfolgt durch Vortexen mit 5 ml Puffer G2. Darauf werden 95 μl Proteinase KLösung zugefügt und bei 50°C für 30 bis 60 min inkubiert. Der Puffer G2 bewirkt eine Lyse
des Nukleus und eine Denaturierung von Proteinen, welche durch die Proteinase in kleinere
Fragmente verdaut werden. Die Lösung sollte dabei klar werden, damit die mit Puffer QBT
äquilibrierte Säule, auf die sie gegeben wird, nicht verstopft. Nachdem die Lösung die Säule
passiert hat, werden 2 mal 7,5 ml Wasch-Puffer QC hinzugegeben. Durch 5 ml EluierungsPuffer wird die DNA von der Säule gelöst und mittels 3,5 ml Isopropanol präzipiert. Die
DNA-Fäden können mit einer Pipettenspitze gefangen und in Tris-Borat-EDTA (TBE) gelöst
werden.
2.2.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Einzelne spezifische DNA-Abschnitte können mittels PCR vervielfältigt werden. In mehreren
Zyklen werden DNA-Einzelstrangabschnitte durch eine thermostabile DNA-Polymerase
repliziert (Saiki et al. 1985). Jeder Zyklus besteht aus drei Teilschritten. Vor Beginn des ersten
Zyklus erfolgt eine verlängerte Denaturierungsphase. Der erste der drei Teilschritte trennt
nach jedem Zyklus die doppelsträngig vorliegende DNA in zwei Einzelstränge. Im zweiten
Schritt folgt die Hybridisierung der Primer mit den DNA-Einzelsträngen. Jedes Primerpaar
hat eine spezifische Annealing-Temperatur. Die beiden am 3` Ende zum Strang und
Gegenstrang komplementären Primer-Oligonukleotide flankieren die zu replizierende DNA.
Die kurzen Doppelstrangabschnitte, die von den Einzelsträngen und den daran gebundenen
18
2 Patientengut und Methoden
Primern beim Annealing gebildet werden, dienen als Ausgangspunkt für die Replikation
durch die thermostabile Taq-Polymerase. Dies geschieht im dritten Teilschritt. Die
Replikation des zwischen den beiden Primern vorliegenden DNA-Abschnittes erfolgt bei
jedem Zyklus genau so oft, wie Strang und Gegenstrang vorliegen.
Die sechzig Exons des NF1-Gens wurden mit den in der Tabelle 5 aufgelisteten Primerpaaren
und Untersuchungsbedingungen untersucht. Um die Amplifikation der vielen Pseudogene zu
verhindern, wurden die Primer mit dem Programm Primer Express von Applied Biosystems
erstellt. Das Programm stellt den Primer so
her,
dass
er
Abweichung
am
3`-Terminus,
eine
zu den Sequenzen der
Pseudogene aufweist (so genannte Allelspezifische PCR, Abb. 9) (Newton et al.
1989). Dadurch kommt am Pseudogen eine
Basenfehlpaarung
am
3`-Terminus
zustande, wodurch die Taq-Polymerase
unter optimierten Reaktionsbedingungen
am 3`-Terminus des Primers, der sich an
das Pseudogen heftet, nicht anbinden kann
und
so
zu
einer
allel-spezifischen
Amplifikation führt (Ugozzoli et al,. 1991).
Alle verwendeten Primer sind in Tabelle 4
Abb. 9: Schematiche Darstellung des
Funktionsprinzips einer Allel-spezifischen (AS)
PCR. Der 3`-Terminus des Primers weist eine
Base auf, die nur an die Wildtyp-Sequenz andockt.
Somit kann die Polymerase am Pseudogen keine
Amplifikation starten. Sind beide Pimer
allelspezifisch, steigt die Spezifität des Produktes.
aufgelistet.
2.2.4 Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese dient der Kontrolle von erfolgter Amplifikation. Zusätzlich
kann mittels der Agarosegelelektrophorese die Größe der Amplifikationsprodukte der
Polymerasekettenreaktion bestimmt werden. Bei der Herstellung wird Agarose in TBE-Puffer
(Tris-Borat-EDTA) gelöst und aufgekocht. Nach Abkühlung wird die noch flüssige Gelmasse
in ein Geltablett gegossen. Das Geltablett wird mit Kämmen bestückt, um die Ladetaschen im
Gel zu bilden. Die DNA-Proben werden vor dem Auftrag auf das Gel mit AgarosegelLadepuffer versetzt. Das Füllen der Taschen erfolgt nach dem Einlegen des Gels in die mit
TBE gefüllte horizontale Elektrophoresekammer. Zum Abschätzen der Länge und
Konzentration der Nukleinsäuren, wird ebenso ein DNA-Längenstandard aufgetragen. Der
19
2 Patientengut und Methoden
Längenstandard
definierte
beinhaltet
Menge
Größen
von
und
eine
definierte
DNA.
Die
Auftrennungszeit beträgt im Schnitt 30
min bei 100 Volt. Dabei werden die
Fragmente
im
entsprechend
elektrischen
Größe
und
Feld
Ladung
aufgetrennt. Durch Färben des Gels
mittels
einer
fluoreszierendes
Abb. 10: Agarosegel mit aufgetragenem Marker V
in Spalte 1, sowie Exon 2 ,3 ,4b, 34 und 35+36 in
Spalten 2-16. Leere Spalten enthalten als
Kontrolle Premix ohne DNA Zusatz.
Lösung,
die
Ethidiumbromid
enthält, können die Fragmente unter
UV-Licht der Wellenlänge 366 nm
sichtbar gemacht, mit einer PolaroidKamera fotografiert und dokumentiert
werden.
Auf dem Agarosegel in Abbildung 10 erkennt man in der ersten Spalte den Längenmarker
und in den folgenden Spalten die Produkte der Exons. Der aufgetragene Marker vom Typ V
zeigt 3 Bandenpakete mit definierten Größen, die das Abschätzen der Produktgrößen
erleichtert. Deren Längenunterschiede sind deutlich zu erkennen.
2.2.5 Sequenzierung in Italien
Das PCR-Amplifikat wurde für die Sequenzierung (Sanger et al. 1977) anhand eines
Agarosegels durch Vergleich an einer mit Marker gefüllten Tasche quantifiziert und
anschließend diluiert, um die richtige Menge DNA für die Sequenzreaktion zu erhalten. Die
Sequenzierreaktion fand in einem 10 μl Ansatz statt. Darin enthalten waren 1 μl Primer, 5 μl
verdünntes Amplifikat und 4 μl Big Dye (Applied Biosystems). Sie lief über 25 Zyklen bei 3
Teilschritten. Nach der Denaturierung des Amplifikats bei 96°C folgt das Annealing des
Primers bei 50°C. Die Sequenzreaktion findet bei 60°C statt.
Nach Aufreinigung des Produktes durch Zentrifugieren auf CentriSep-Säulen, wurden die
Ergebnisse der Sequenzier-PCR in einem benachbarten Labor mittels Elektrophorese
untersucht und als ABI-Datei bereitgestellt. Diese wurden danach mit dem Programm MTNavigator von Applied Biosystems bearbeitet.
2 Patientengut und Methoden
20
Tab. 4: Sequenz der verwendeten Primer. F steht für den Forward-Primer, R für den Reverse-Primer, MgCl2 für die
Magnesiumchlorid-Konzentration in mM. TA bezeichnet die Annealing Temperatur des jeweiligen Primers in °C. Die drei
Splice-Alternativen, Exons 9br, 23a und 48a, sind nicht aufgelistet, da sie nicht untersucht wurden.
Primer
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
Exon Primersequenz ( 5´ - 3´)
1
2
3
4a
4b
4c
5
6
7
8
9
10a
10b
10c
11
12a
12b
13
14
15
16
17
18
19a
19b
20
21
22
23-1
23-2
24
F: CAG ACC CTC TCC TTG CCT CTT C
R: CCA CTT ATCCCC CCT TCC C
F: CGT CAT GAT TTT CAA TGG CAA G
R: GCT CAC TGA ATC TAA AAC CCA GC
F: GCC ATT TCT GTT TGC CTT AGA CT
R: TCA AAT TCA CAA AGC CTG CC
F: TTG TTC TGT GTG TGT GTT TG
R: TTC AGT AGT CCC ATG TGG A
F: GAG ATA CCA CAC CTG TCC CCT AA
R: TTG ACC CAG TGA TTT TTT TCA GA
F: GCT CTG AGT TGT ATT TGT GT
R: ACA ACA GCA AAT TTT ACA TC
F: GAA GGA AGT TAG AAG TTT GTG
R: TCT TTT AAA TGC CTA CTT GTG
F: CAT GTT TAT CTT TTA AAA ATG TTG CC
R: GGA GGG CAA AAT TAT TTC CAT TAT
F: CTG TTA ATT TGC TAT AAT ATT AGC
R: CAT AAT ACT TAT GCT AGA AAA TTC
F: GTA ATG TGT TGA TGT TAT TAC ATG
R: GTC TTT TTG TTT ATA AAG GAT AAC A
F: CTT TCT ATT TGC TGT TCT TTT TGG
R: CCT TTT TGA AAA CCA AGA GTG CA
F: GAT AAA ACT TAA AAC TAC AGT GAT AAA CAG
R: ATG CAA TAG AAA GGA GGT GAG ATT C
F: TCC TGA GTC TTA TGT CTG ATA CCA TG
R: TTG GCG TTT CAG CTA AAC CC
F: ATT GAA GTT TCC TTT TTT TCC TTG
R: GTA TAG ACA TAA ACA TAC CAT TTC
F: CTA TAT ATT GAA ACT ACA AAT GAA AG
R: AGT TTT ACA ATG TAC TAA GTA CTA C
F: TGC TAT TGA CAC TTT GAT AAC TGT TTC TC
R: TCT CAC CAT TAC CAT TCC AAA TAT TCT T
F: TTA TTC CTC TTG GTT GTC AGT GCT
R: TTT ACC AAA TTT CAT TCA GAA AAC AAA C
F: CCC AAG TTG CAA ATA TAT GTC
R: GTG CTT TGA GGC AGA CTG AG
F: TGA AGC ATT TGC TCT GCT CT
R: GTT TCA AAC TTG ATG TAT ATT AAA
F: CAA GTT TGA AAC TTG GCT GTA
R: ATA TAT TTA GCA GAT CAG TTA AC
F: GGA AGA AAT GTT GGA TAA AGC A
R: AAA CAA GTC ACT CTA TTC ATA GA
F: TAT CTG TAT GCT TAT TTG GCT CTA
R: GTG CAG TAA AGA ATG GCC AG
F: AAA CTT ACA TTT AAT TCG TTT TAC
R: TCC TTT CTA CCA ATA ACC GC
F: TTG TTC CCT TCT GGC TTT TAT
R: ATC TCA AAA GTT TAA ATA CAC C
F: ATT TGA GGG GAA GTG AAA GAA C
R: GCT TTA TTT GCT TTT TGC TTT A
F: CCA CCC TGG CTG ATT ATC G
R: CTC TTA CAT GCC AGT TCT C
F: TGG TCT CAT GCA CTC CAT A
R: AAC ATC TTT CTT CTG GCT CTG
F: TGC TAC TCT TTA GCT TCC TAC
R: CAT ACC TCA GCA CAC ACA TA
F: ATA TGG AGC AGG TAT AAT AAA C
R: AAA ACA GCG GTT CTA TGT G
F: CGT TGC ACT TGG CTT AAT GTC TG
R: CCA TCA GCA GCT AGA TCC TTC TTT
F: CTT ATA CTC AAT TCT CAA CTC C
R: GAA TTT AAG ATA GCT AGA TTA TC
[MgCl2]
TA
1,5 mM
65°C
59°C
59°C
58°C
58°C
57°C
49°C
51°C
58°C
57°C
51°C
47°C
53°C
58°C
61°C
59°C
55°C
55°C
57°C
57°C
59°C
59°C
71°C
65°C
57°C
59°C
56°C
56°C
59°C
59°C
59°C
60°C
58°C
59°C
54°C
59°C
53°C
53°C
53°C
53°C
55°C
55°C
55°C
55°C
53°C
53°C
53°C
53°C
56°C
51°C
55°C
51°C
51°C
55°C
55°C
53°C
53°C
51°C
61°C
59°C
55°C
53°C
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
2,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
21
Primer
Exon
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
25
26
27a
27b
28
29
30
31
32
33
34
35+36
37
38
39
40
41
42
43
44+45
46
47
48
49
Primersequenz ( 5´ - 3´)
F: GAC TTC ATA CAA TAA ATA ATC TG
R: TAT TTG ATT CAA ACA GAG CAA C
F: CTC CAT ATT TGT AAT CTT AGT TA
R: GGA GAG TGT TCA CTA TCC C
F: AAT TTT TTT TCT AAG TAG TTT GCT G
R: CAA CCA AAA AGA AAG CAA TCA ACT
F: TAG ACA ACA TAA AGC CTC ATA A
R: CCA TCT CTC TAT ATT TGC TAT A
F: TGA ATC CAG ACT TTG AAG AAT TGT T
R: CTA GGG AGG CCA GGA TAT AGT CTA GT
F: GGT TGG TTT CTG GAG CCT TTT AGA
R: CAA CAA ACC CCA AAT CAA ACT GA
F: TTG GAA CTA TAA GGA AAA ATA CGT TT
R: AGG GTT TTC TTT GAA TTC TCT TAG A
F: CCA TTT TTT CCC CGA ATT CTT
R: CCC AAT GTG GCA CCA GAT AAA
F: TTG ATT AGG CTG TTC CAA TGA A
R: CAA AAC AAA AAA CCT CCT GAT GAT
F: GTG CTA AAA CTT TGA GTC CCA TGT
R: ATA ATC TAT ATT GAT CAG GTG AAG TA
F: GCA AGG AGC ATT AAT ACA ATG TAT C
R: CCA TGC AAG TGT TTT TAT TTA AGC
F: GGT AAC AGG TCA CTT AAT GAC ATC A
R: GAC CTC AAA TTT AAA CGT CTT TTA GA
F: TCA TTC CGA GAT TCA GTT TAG GAG
R: GAT ACC CAA AAT GAA TGC ACT CA
F: TCC CCA AAA GAG AAA ACA TGG
R: AGC AAC AAG AAA AGA TGG AAG AGT
F: TGT GTG AAC CTC ATC AAC CAT C
R: GCC TGG CCT AGT TTG CAT TT
F: GGA AGA AGA CCT CAG CAG ATG C
R: CAA CCG CCA AAA AAC CTA TAG G
F: TTT TTT AAC CTG CCA CCG TTT
F: CCT CCA TTA GTT GGA AAA TTG AAA
F: AAA CGA TGG TTG TAT TTG TCA CC
R: TGC TAC ACT GAC ATG GAA AAT TTT
F: GCT CCA GGG ATG TAT TAG AGC TTT
R: TGA CTT TCA TGT ACT CTC CCA CCT
F: TGA AGT GAT TAT CCA GGT GTT TGA
R: AAA GAC AGG CAC GAA GGT GA
F: AAT TTT GGC ACA TTA TTC TGG G
R: AGC AAG TTC ATC AAC CAT CCT T
F: AGG TTT TAG TTG CTT TGA CAC TCA
R: GCA GGC ATA CTA ATT TGA ACA GAA
F: ATA TTT TTG GCT TCA GAT GGG
R: TTG GTG TCT TAT ATT GTT GCT CAA
F: AAG CGA CAC ATG ACT GCA ATG
R: TGG CTT TCA TCA CTG GCC A
2 Patientengut und Methoden
[MgCl2]
TA
1,5 mM
53°C
53°C
53°C
53°C
53°C
55°C
53°C
53°C
57°C
58°C
61°C
60°C
55°C
55°C
58°C
59°C
56°C
57°C
57°C
61°C
55°C
56°C
56°C
56°C
58°C
58°C
58°C
57°C
57°C
58°C
59°C
59°C
57°C
57°C
57°C
57°C
58°C
58°C
57°C
57°C
57°C
56°C
56°C
56°C
55°C
55°C
58°C
60°C
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
2,3 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
1,5 mM
2 Patientengut und Methoden
22
2.2.6 Denaturing High-Performance Liquid Chromatography Analyse (DHPLC)
Für die Detektion von NF1-Keimbahnmutationen wurde die DHPLC Methode angewendet,
auf der das WAVE® Nucleic Acid Fragment Analysis System (WAVE-System) von
Transgenomic basiert.
Die DHPLC-Analyse nach der Methode von Oefner (Oefner et al. 1998) basiert auf der
unterschiedlichen Migrationsgeschwindigkeit von DNA-Homo- und Heteroduplices bei der
Passage durch die Matrix einer Trennsäule. Diese werden von einer mobilen Phase
(Laufpuffer) auf die DHPLC-Trennsäule aufgetragen, die aus einer hydrophoben
Polymermatrix besteht. Dabei werden die DNA-Moleküle an die Säule gebunden, indem sich
hydrophobe Ammonium-Kationen des Triethylammoniumacetats (TEAA) im Laufpuffer an
die negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA anlagern und die Alkylgruppen des TEAA
an die Oberfläche der Polymermatrix binden. Danach werden die DNA-Fragmente über
Ionenpaar-Umkehrphasen-Chromatographie freigegeben, wobei die DNA-Fragmente mittels
einer kontinuierlich steigenden Acetonitril-Konzentration von der Polymermatrix eluiert
werden. Längere Fragmente haften dabei stärker und damit länger an der Säule als kürzere
Fragmente. Die Trennung verläuft bei einer nicht denaturierenden Temperatur daher streng
nach Fragmentlänge und ist somit unabhängig von der Basenzusammensetzung. Anders
verhält es sich bei der Mutationsanalyse. Hier werden PCR-Fragmente identischer Länge
voneinander getrennt, die sich aufgrund einer Mutation in ihrer Basenzusammensetzung
unterscheiden. Werden die PCR-Produkte kontrolliert denaturiert, können sich bei der
Renaturierung bei einer vorhandenen heterozygoten Mutation vier mögliche DNA-Duplices
generieren. (Wildtyp / Wildtyp, Wildtyp / Mutante(sense), Mutante(antisense) / Wildtyp,
Mutante / Mutante). Abbildung 11 veranschaulicht die vier möglichen DNA-Duplices. Diese
unterscheiden sich während der DHPLC-Analyse im Bereich ihrer Schmelztemperatur
aufgrund minimaler struktureller Unterschiede in ihren Migrationsgeschwindigkeiten. So
entsteht ein Elutionsprofil mit bis zu vier Elutionspeaks. Mit der Größe der
Migrationsunterschiede zwischen den vier möglichen DNA-Duplices wächst auch der
Abstand der einzelnen Elutionspeaks. Liegen die Migrationsgeschwindigkeiten jedoch
aufgrund struktureller Besonderheiten der Hetero- bzw. Homoduplices nahe beieinander, so
können die einzelnen Peakflächen miteinander verschmelzen, so dass weniger als vier Peaks
im Elutionsprofil auftreten (Abb. 12). Im Minimalfall zeigt eine Mutation nur einen Peak mit
einer „Schulter“. In Einzelfällen ist sie überhaupt nicht von der Wildtypsequenz zu
unterscheiden. Hebt man die Temperatur über die Schmelztemperatur der DNA-Duplices an,
23
2 Patientengut und Methoden
denaturieren diese vollständig, so dass ihre Einzelstränge nur mit einem Elutionspeak
angezeigt werden. Auch wenn nur Homoduplices vorliegen, entsteht ein Einzelpeakprofil,
z.B. beim Vorliegen einer homozygoten Wildtyp-Sequenz oder beim Vorliegen einer
homozygoten Mutation. Durch Zumischen von Wildtyp-Amplifikat kann die homozygote
Mutation detektiert werden. Für die DHPLC-Analyse werden die PCR-Produkte bei 95°C 20
min. denaturiert und zur Bildung der DNA-Duplices schrittweise (1°C/min) auf 65°C
abgekühlt. Die spezifischen Schmelztemperaturen wurden mittels der Navigator™-Software
ermittelt.
Zur
Ermittlung
der
optimalen
Analysetemperatur wurden die Amplifikate um
das von der Navigator™-Software berechnete
Temperaturoptimum
mit
mindestens
3
verschiedenen Temperaturen analysiert, meist 2C°
unter und über der vorgeschlagenen Temperatur.
Die optimalen Temperaturbedingungen und die
Konzentration des Puffers B sind in Tabelle 5
aufgelistet.
Es wurden 5 µl PCR-Produkt auf die DNA
Sep®Column Trennsäule injiziert und mit einem
linearen Acetonitril-Gradienten aus Puffer A (0,1
M TEAA, ph 7,0) und Puffer B (0,1 M TEAA,
25% Acetonitril, 0,1 mM EDTA) eluiert. Die
Durchflussrate des Elutionspuffers durch die
Säule
lag
konstant
bei
1,5
ml/min.
Die
Abb. 11: Schematische Darstellung
des Funktionsprinzips einer DHPLCAnalyse.
Gesamtanalysezeit betrug 2,5 min.
Abb. 12: Beispiel eines DHPLC Diagramms. Nach
mV
0
1.6
1.7
1.8 m
Denaturierung der PCR-Produkte können sich bei
Mutationen während der Renaturierung bis zu vier
verschiedene
DNA-Duplices
bilden.
Diese
unterscheiden sich aufgrund kleinster struktureller
Unterschiede in ihrer Schmelztemperatur und führen
zu minimalen Migrationsunterschieden durch die
Polymermatrix. Die gestrichelte Kurve gilt als
Referenz und kennzeichnet das Wildtyp-DNADuplex. Jeder weitere Peak oder jede weitere
„Schulter“ zeigt das Vorhandensein eines NichtWildtyp-Duplices an. Diese müssen zur Verifizierung
der Mutation oder des Polymorphismus sequenziert
werden. Die X-Achse kennzeichnet die Dauer in
Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung
in Millivolt an.
24
2 Patientengut und Methoden
Tab. 5: Temperaturen der Trennsäule und Konzentration des Puffers B bei der DHPLC-Analyse.
Größe
(bp)
Temp.
Größe
(bp)
Temp.
Start
Puffer B(%)
Exon 1
323
65°C
57,4
Exon 23-1
253
56,6
55,1
Exon 2
438
55°C
59,7
Exon 23-2
327
54°C
57,5
Exon 3
324
55°C
57,4
Exon 24
226
56.2°C
54
Exon 4a
314
56°C
57,1
Exon 25
195
55°C
52,5
Exon 4b
215
54.5°C
53,5
Exon 26
298
55.6°C
56,7
Exon 4c
190
54.9°C
52,2
Exon 27a
223
54°C
53,9
Exon 5
210
53°C
53,3
Exon 27b
223
52.3°C
53,9
Exon 6
301
56°C
56,8
Exon 28
644
54.9°C
62
Exon 7
328
55.2°C
57,5
Exon 29
467
55.3°C
60,1
Exon 8
273
54.5°C
56
Exon 30
321
53.3°C
57,3
Exon 9
264
54°C
55,6
Exon 31
350
56.3°C
58
Exon 10a
267
58.4°C
55,7
Exon 32
298
56.0°C
56,7
Exon 10b
248
54.7°C
55
Exon 33
385
54°C
58,8
Exon 10c
275
58.7°C
53,3
Exon 34
507
53.0°C
60,7
Exon 11
308
51.9°C
57
Exon 35+36
512
52.5°C
60,7
Exon 12a
341
53.9°C
57,8
Exon 37
219
54.0°C
53,7
Exon 12b
283
53.6°C
56,2
Exon 38
334
56.0°C
57,6
Exon 13
336
56.8°C
57,7
Exon 39
303
54.0°C
56,8
Exon 14
347
58.6°C
58
Exon 40
303
54.7°C
56,8
Exon 15
215
55.4°C
53,5
Exon 41
233
55.0°C
54,3
Exon 16
576
54.8°C
64,4
Exon 42
335
51.9°C
57,7
Exon 17
385
55.5°C
58,8
Exon 43
325
55.3°C
57,4
Exon 18
321
57°C
57,3
Exon 44+45
506
56.1°C
60,6
Exon 19a
365
55°C
58,4
Exon 46
290
54.4°C
56,4
Exon 19b
237
50.4°C
54,5
Exon 47
263
54.2°C
55,5
Exon 20
390
58.1°C
58,9
Exon 48
339
54.8°C
57,8
Exon 21
476
56.5°C
60,3
Exon 49
571
56.4°C
61,4
Exon 22
279
57.5°C
56,1
Produkt
Start
Produkt
Puffer B(%)
25
2 Patientengut und Methoden
2.2.7 Sequenzierung
Bei den in der DHPLC-Analyse auffälligen Proben wurden zum Sequenzieren in das Labor
der Core Facility (Leiter: Dr. Hoffmann) der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg
gegeben. Die Sequenzierung erfolgte mit fluoreszenz-markierten Primern nach der
Dideoxymethode in einem halbautomatischen Sequenzierer. Die Abbildung 13 zeigt ein
Diagramm einer Sequenzierung.
Wildtyp-Sequenz:
GAAGC TAT AAGTA
Mutierte Sequenz:
GAAGC TGT AAGTA
Nukleotid: 1466
Substitution: A/G
Codon 489
Abb. 13: Beispiel eines Sequenz-Diagramms: Der komplementäre Strang zu einer einzelsträngigen
Matrize wird von der Taq-Polymerase synthetisiert. Es werden Desoxynukleosidtriphosphate (dNTP`s) als
Bausteine benutzt. Der Kettenabbruch erfolgt durch hinzugefügte fluoreszenzmarkierte
Didesoxynukleosidtriphosphate (ddNTP`s), die im Vergleich zu den dNTP`s eine weitere OH-Gruppe an
ihrer Ribose besitzen und nicht verlängert werden können. Dadurch entstehen Produkte unterschiedlicher
Kettenlänge, die durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und druch Fluorographie sichtbar
gemacht werden. Mittels einer speziellen DNA-Sequenzierungsmaschine und eines entsprechenden
Programms entsteht die oben dargestellte farbige Kurve. Anhand der unterschiedlichen Farben der Kurven
läßt sich die Sequenz ablesen. Rot steht für Thymin (T), grün steht für Adenin (A), blau steht für Cytosin
(C) und schwarz steht für Guanin (G). Peaks der jeweiligen Kurve kennzeichnen das Auftreten der
entsprechenden Base an der jeweiligen DNA-Position. Das Textfeld beschreibt die Wildtyp- und die
mutierte Sequenz, sowie die Nukleotidnummer und die Substitution. Das rot eingerahmte Kästchen
markiert das mutierte Codon 489.
2.2.8 Mutationen und Polymorphismen
Die intraexonischen Abweichungen der DNA von der Normalsequenz (=Wildtyp) wurden wie
folgt bewertet: Stopp Codon, Insertionen, Deletionen und Splice site Mutationen führen zu
verkürztem (Neurofibromin) Protein und sind damit Mutationen, d.h. Auslöser der
Erkrankung. Missense Varianten wurden anhand mindestens 100 gesunder anonymisierter
Blutspender überprüft. Wenn sie hierbei nicht auftraten, wurden sie als Mutationen,
andernfalls als Polymorphismen bezeichnet. Als Polymorphismen wurden auch Varianten
bezeichnet, die trotz Änderung des Codons für dieselbe Aminosäure codieren.
3 Ergebnisse
26
3 Ergebnisse
Zusammengetragen wurden insgesamt 26 Fälle. Die Herkunft ist in Abbildung 14 dargestellt.
Das Durchschnittsalter liegt bei 41 Jahren. Die Geschlechtsverteilung beträgt 15 weibliche zu
11 männlichen Patienten.
Im Folgenden werden alle Fälle einzeln dargestellt. Danach werden die wesentlichen Daten in
Tabellen 36-39 zusammengefasst.
Schließlich folgt der molekulargenetische Teil mit den Ergebnissen der Untersuchung des
NF1-Gens aller Patienten. Diese Ergebnisse sind in den Tabellen 40-42 zusammengefasst.
Abb. 14: Herkunft der Fälle. Hierbei sind die primär betreuenden Zentren genannt.
27
3 Ergebnisse
3.1 26 Patientenfallbeschreibungen
Kasuistik 1
Quelle: Phäochromozytom-Register Universitätsklinik Freiburg, Prof. Dr. Neumann
Initialen: C.S.
Jahr der Operation: 1994
Geburtsjahr: 1951
Alter bei Operation: 43 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin waren schon immer
disseminierte Veränderungen der Haut im
Sinne
einer
Neurofibromatose
von
Recklinghausen bekannt.
1995 präsentierte sich die 43jährige Patientin
beim Hausarzt mit Oberbauchbeschwerden
und Druckgefühl im Kopf.
Daraufhin wurde die Patientin stationär
aufgenommen.
Familienanamnese:
Bekannt ist eine Neurofibromatose Typ 1
beim Vater und bei der Tochter der Patientin.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Guter Allgemeinzustand, Puls 112/min, RR
155/90
mmHg.
Multiple
kutane
und
subkutane Fibrome am ganzen Körper (Abb.
15). Am Integument 5 diskrete Café-au-lait
Flecken.
Abb. 15: Klinisches Bild zu Fall 1 mit
multiplen Fibromen.
28
3 Ergebnisse
Diagnostik und Befunde:
Adrenalin und Noradrenalin zeigten erhöhte Werte. In allen radiologischen Verfahren waren
die Raumforderungen sichtbar, zudem fanden sich ein Neurofibrom der Galea (2cm) und des
Hinterhauptes (1cm) (Tab.6).
Tab. 6: Diagnostik und Befunde zu Fall 1.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
18
Sonographie:
Raumforderung in beiden Nebennieren
CT:
Raumforderung rechte (4 cm) und linke Nebenniere(2 cm)
MRT-Abdomen:
•
A (μg/die)
Norm: <20
42
NA (μg/die)
Norm: <80
82
M (μg/die)
Norm: <80
k. A.
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
Phäochromozytom typische adrenale Raumforderung rechts und links von
4/2 cm Größe (Abb. 16 a und b)
•
MIBG-Szintigraphie:
Multiple kutane Neurofibrome thorakal und abdominal
Aufnahme des Radiopharmakons in beiden Nebennierentumoren
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
a)
b)
a)
b)
Abb. 16 a und b: Fall 1: MRT-Abdomen mit sichtbaren Raumforderungen beidseits (Pfeile).
a) Horizontale- b) transversale Projektion.
29
3 Ergebnisse
Therapie:
In der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg wurde eine Laparatomie mit bilateraler
subtotaler Adrenalektomie durchgeführt. Gleichzeitig wurden Fibrome aus der linken
Thoraxwand und dem M. psoas links entfernt. Der intraoperative Verlauf war
komplikationslos. Die Phäochromozytome wurden histologisch bestätigt.
Verlauf:
Katecholamine im 24h-Urin waren zwei Monate nach OP normal (Tab.7). Es ist postoperativ
keine Raumforderung erkennbar.
Tab. 7: Verlauf zu Fall 1.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
7
CT:
Kein Tumorrezidiv
MRT-Abdomen:
Kein Tumorrezidiv
A (μg/die)
Norm: <20
4
NA (μg/die)
Norm: <80
52
M (μg/die)
Norm: <80
k. A.
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Der Hormonstatus zur Nebennierenrinde der Patientin erwies sich zwei Jahre nach OP weiter
im Normbereich: Cortisol 112 ng/ml, Aldosteron 79 pg/ml, Renin-Aktivität 2,0 ng/ml/h. Ein
ACTH-Test zur Kontrolle der Nebennierenrindenfunktionsreserve drei Jahre nach OP ergab
ein gutes Ansprechen der Nebennierenrinde:
bei 0 min.:
80ng/ml Cortisol.
bei 30 min.:
205ng/ml Cortisol.
bei 60 min.:
252ng/ml Cortisol.
3 Ergebnisse
30
Kasuistik 2
Quelle: Praxis Dr. Ising, Sindelfingen
Initialen: R. B.
Alter bei Operation: 46 Jahre
Geburtsjahr: 1957
Jahr der Operation: 2003
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten waren schon immer disseminierte Veränderungen der Haut im Sinne einer
Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
2002 präsentierte sich der 44jährige Patient beim Arzt wegen Nackenschmerzen. Dieser
stellte einen erhöhten Blutdruck fest. Der Patient war asymptomatisch.
2004 wurde der Patient zum Ausschluss einer neuroendokrinen Ursache der schwer
einstellbaren arteriellen Hypertonie stationär in Stuttgart aufgenommen.
Familienanamnese:
Bei der Tochter ist eine Neurofibromatose Typ 1 bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Patient in gutem Allgemeinzustand, Puls 78/min, RR 150/100 mmHg, Multiple
Neurofibrome, Café-au-lait Flecken.
Diagnostik und Befunde:
Die Metanephrine und Normetanephrine waren im 24h-Urin massiv erhöht. Sowohl in der
MRT, als auch in der Szintigraphie waren die Raumforderungen sichtbar (Tab. 8).
31
3 Ergebnisse
Tab. 8: Diagnostik und Befunde zu Fall 2.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
13
50
1255
1717
Sonographie:
Kein sicherer Anhalt für einen Nebennierentumor
MRT-Abdomen:
Phäochromozytomtypische Raumforderung beidseits von 2 und 3 cm mittlerem
Durchmesser ( Abb. 17 a und b)
Beidseits adrenale phäochromozytomtypische MIBG-Speicherung ( Abb. 18)
MIBG-Szintigraphie:
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine. k. A.
=keine Angabe; Stark erhöhte Werte für Metanephrine und Normetanephrine im 24h-Urin.
b)
a)
Abb. 17 a und b: MRT zu Fall 2: Darstellung der Tumoren in der a) linken und b) rechten Nebenniere in
transversaler Projektion. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Ising, Sindelfingen.
Therapie:
Die Einstellung des Blutdrucks auf zufriedenstellende Bereiche erfolgte mit Carvediol 25-025
mg
und
Phenoxybenzamin
retroperitoneoskopische
20-10-20
Nebennierenresektion
mg.
Anschließend
beidseits
wurde
durchgeführt.
Phäochromozytome wurden histologisch bestätigt.
Verlauf:
Der postoperative Verlauf war unauffällig. Die Blutdruckwerte liegen um 120/80 mmHg.
eine
Die
3 Ergebnisse
32
1.
2.
3.
Abb. 18: Fall 2: MIBG-Szintigraphie mit Phäochromozytom-typischer Speicherung links. Reihe 1
transaxiale Projektion, Reihe 2 coronale, Reihe 3 sagittale Projektion. Mit freundlicher Genehmigung von
Dr. Ising, Sindelfingen.
33
3 Ergebnisse
Kasuistik 3
Quelle: Universitäts-Kinderklinik Essen, Herr PD Dr. Kremens
Initialen: N.T.
Jahr der Operation: 1994
Geburtsjahr: 1980
Alter bei Operation: 13 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Der Patient berichtete seit über einem Jahr ständig über Kopfschmerzen und Schwindel.
Dabei bestand auch verstärkter Husten und Leistungsverminderung. Der Blutdruck lag bei
170/110 mmHg. Eine erste Röntgen-Thorax Aufnahme zeigte multiple noduläre
Verschattungen
in
beiden
Lungenflügeln.
Eine
durchgeführte
Sonographie-
und
Echokardiographie Untersuchung blieb ohne pathologischen Befund. Eine Kontrolle der
multiplen
Verschattungen
ließ
eine
Progredienz
erkennen.
Im
Rahmen
eines
Krankenaufenthaltes wurde schließlich eine Blutdruckspitze von 250/180 mmHg gemessen,
worauf der Patient in die Universitätsklinik Essen verlegt wurde.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Patient in gutem Allgemeinzustand, Blutdruck: 140/95 mmHg. Multiple subkutane Fibrome,
Café-au-lait Flecken und Hypopigmentierungen. Inguinales und axilläres „Freckling“. LischKnoten an der linken Iris. Der Patient hat überstreckbare Gelenke und eine schwache
Rückenmuskulatur mit Rundrücken und beginnender Skoliose.
Diagnostik und Befunde:
Im 24h-Urin zeigen sich die Vanillinmandelsäure und die Metanephrine, sowie die
Normetanephrine stark erhöht. In der bildgebenden Diagnostik waren die Tumoren überall
erkennbar und zeigten vermehrte Speicherung in der Szintigraphie (Tab. 9). Die Diagnose der
Neurofibromatose Typ 1 wurde erst im Zusammenhang mit dem Auftreten des
metastasierenden Phäochromozytoms gestellt. Die Metastasen waren zu diesem Zeitpunkt in
Lunge und Knochen nachweisbar.
34
3 Ergebnisse
Tab. 9: Diagnostik und Befunde zu Fall 3.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
458
CT:
Raumforderung im Bereich der linken Nebenniere (7x8x6cm) (Abb. 19 a und b)
MRT-LWS, BWS:
Teils diffuse, teils umschriebene Metastasierung in zahlreichen Brust- und
A (μg/die)
Norm: <20
k. A.
NA (μg/die)
Norm: <80
k. A.
M (μg/die)
Norm: <80
↑↑
NM (μg/die)
Norm: <120
↑↑
Lendenwirbeln
MIBG-Szintigraphie:
Disseminierte,
speichernde
Metastasierung
als
Hinweis
auf
ein
Phäochromozytom
Multiple pulmonale und ossäre Metastasierung (Abb. 20 a-d)
PET
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe; ↑↑ = stark erhöht, ohne genaue Angabe.
a)
b)
Abb. 19 a und b: Fall 3: a und b): CT-Bilder der Lunge des Patienten. Beide Flügel sind mit massiven
Raumforderungen durchsetzt. Mit freundlicher Genehmigung von Herrn PD Dr. Kremens, Essen.
Therapie:
1994 wurde der Patient laparatomiert und der Tumor Nebennieren-organerhaltend entfernt.
1995 wurde eine Therapie mit 4,5 Gbq 131-Jod-MIBG durchgeführt.
1999 ist der Patient mit 7,0 GBq 131-Jod-MIBG therapiert worden.
Der Hypertonus wurde zufrieden stellend mit Dibenzyran 20-10-20 mg (Phenoxybenzamin)
und Beloc-Zok 190 mg/die (Metoprololsukzinat) eingestellt (RR: 140/85 mmHg).
35
3 Ergebnisse
Verlauf:
Nach der 2. MIBG-Therapie wurden folgende Untersuchungen durchgeführt (Tab.10):
Tab. 10: Diagnostik und Befunde des Verlaufs zu Fall 1.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
80
Plasma:
A (μg/die)
Norm: <20
k. A.
NA (μg/die)
Norm: <80
k. A.
M (μg/die)
Norm: <80
k. A.
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
1302
4170
Röntgen-Thorax:
Multiple Lungenmetastasen in beiden Lungenflügeln
Ganzkörper-MRT:
Ossäre, pulmonale und hepatische Herde
Ganzkörper-PET:
Speichernde Herde in Schädel, Schultern, Humerus, Lungen, Rippen, Brust-,
Lenden-, Sakralwirbel und Femura ( Abb. 19)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Die pulmonalen und ossären Metastasen zeigen jedoch keinen Anhalt auf Progredienz. Der
Patient fühlte sich unbeeinträchtigt, so dass sich von einer onkologische Tumortherapie keine
Verbesserung versprochen wurde. Der Patient verstarb schließlich im Alter von 24 Jahren an
seinem Leiden.
a)
c)
b)
d)
Abb. 20 a-d: PET-Sequenzen zu Fall 3. Die Pfeile markieren die multiplen Metastasen. a)
multiple Metastasen im Thorax b) große Metastase in der Lunge. c) Metastasen in einer Rippe.
d) große Metastase im Becken. Mit freundlicher Genehmigung von Herrn PD Dr. Kremens,
Essen.
36
3 Ergebnisse
Kasuistik 4
Quelle: Kliniken Essen-Mitte, Prof. Dr. Walz
Initialen: K.-A.D.
Jahr der Operation: 2004
Geburtsjahr: 1972
Alter bei Operation: 32
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Der Patient hat eine Neurofibromatose von Recklinghausen. Es besteht eine Hypertension seit
5 Jahren und ein irritables Kolon. An Symptomen sind gelegentliche Dyspnoe,
Hitzewallungen, Kopfschmerzen und Palpitationen sowie Tremor bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Disseminierte Zeichen der Neurofibromatose Typ 1 am Rumpf. RR: 150/100 mmHg.
Diagnostik und Befunde:
Adrenalin und Noradrenalin im Urin waren erhöht. Der Tumor war in Sonographie, MRTAbdomen und MIBG-Szintigraphie darstellbar (Tab. 11).
Tab. 11: Diagnostik und Befunde zu Fall 4.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
k. A.
Sonographie:
Raumforderung im Bereich der linken Nebenniere
MRT-Abdomen:
•
6x5 cm großer Tumor der linken Nebenniere
•
Mehrere große Steine in der Gallenblase
MIBG-Szintigraphie:
A (μg/die)
Norm: <20
186
NA (μg/die)
Norm: <80
340
M (μg/die)
Norm: <80
k. A.
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
Linksseitig adrenale phäochromozytomtypische MIBG-Speicherung.
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
37
3 Ergebnisse
Therapie:
Der Bluthochdruck wurde präoperativ mit 3x40 mg Phenoxybenzamin behandelt. Die
Entfernung des Tumors der linken Nebenniere erfolgte endoskopisch in Form einer
Adrenalektomie. Ein Teil des Tumors wurde unmittelbar nach der Entnahme asserviert (Abb.
21 a und b). Die Gallenblase wurde laparoskopisch entfernt. Das Phäochromozytom wurde
histologisch bestätigt.
a)
b
Abb. 21 a und b: Fall 4: Operatives Resektat. a): Phäochromozytom nach Entnahme. b): Resektat
aufgeschnitten. Gut erkennbar die zentrale zystisch-nekrotische Form. Am oberen Bildrand ist ein
Zentimetermaß angefügt. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Walz, Essen.
Verlauf:
Der Blutdruck lag postoperativ im Normbereich (120/80 mmHg). Die Patientin stammte aus
Kuwait. Deshalb sind keine Daten zum weiteren Verlauf bekannt.
3 Ergebnisse
38
Kasuistik 5
Quelle: Universitätskinderklinik Leipzig, Prof. Dr. Pfäffle
Initialen: S.H.
Jahr der Operation: 2002
Geburtsjahr: 1985
Alter bei Operation: 16 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin ist seit ihrer Kindheit eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
Zudem leidet sie an einer Epilepsie.
1995 war die Patientin wegen eines Optikus-Glioms in onkologischer Behandlung. Bei einer
ambulanten Routinekontrolle fiel ein erhöhter Blutdruck auf. Es bestanden gelegentlicher
Kopfschmerz und eine Flush-Symptomatik. Daraufhin erfolgte zur Abklärung eine stationäre
Aufnahme.
Familienanamnese:
Die Mutter und die Großmutter leiden an einer Neurofibromatose Typ 1.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Blutdruck: 130/80 mmHg, Hydrozephalus (Kopfumfang 59 cm; >97. Perzentile). Mehrere
Café-au-lait Flecken.
Diagnostik und Befunde:
Die Werte für Noradrenalin, Metanephrine und Normetanephrine im 24h-Urin waren stark
erhöht. Im Plasma zeigte sich eine massiv vermehrte Sekretion von Noradrenalin. In allen
radiologischen Bildgebungen ließ sich der Tumor darstellen (Tab. 12).
39
3 Ergebnisse
Tab. 12: Diagnostik und Befunde zu Fall 5.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
k. A.
1465
286
8879
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
92
17914
Sonographie:
Tumor im Bereich der rechten Nebenniere
CT-Thorax:
Pulmonale Rundherde
MRT-Abdomen:
•
Bestätigung des Tumors der Nebenniere
•
Multiple Läsionen im Bereich der Lendenwirbelsäule
MIBG-Szintigraphie:
Aufnahme des Radiopharmakons in der rechten Nebenniere (Abb. 22 a und b)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie:
Die Patientin wurde laparatomiert und der Tumor entfernt. Die Nebenniere konnte erhalten
werden. Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt. Die Behandlung der Metastasen
erfolgte durch 131-Jod MIBG Therapie. Danach zeigte sich in der Ganzkörperszintigraphie
jedoch ein unverändertes Bild mit multiplen Herden überwiegend in der Brust- und
Lendenwirbelsäule. Danach wurde eine chemotherapeutischen Behandlung begonnen, die
aber zu keinem Rückgang der Metastasen führte. Daraufhin wurde eine Bestrahlung der
Metastasen durchgeführt.
Der Hypertonus wurde mit Captohexal und Dibenzyran eingestellt.
Verlauf:
Vereinzelte kurze Blutdruckspitzen bis 230/120 mmHg, die bei der Patientin eine Aura
erzeugten. Das MRT erbrachte einen unauffälligen Befund im Nebennierenbereich und
unveränderte Darstellung der bekannten metastatischen Herde.
2004 entwickelte die Patientin eine Akute Myeloische Leukämie, die chemotherapeutisch
nach dem Pädiatrischen Rezidiv-AML 2001 Protokoll bis zur kompletten Remission
therapiert wurde.
3 Ergebnisse
a)
40
b)
Abb. 22 a und b: MIBG-Szintigraphie zu Fall 5. a) Ansicht von anterior. b) Ansicht von posterior. Man
sieht multiple Metastasen in der Schädelkalotte, im Brust und Lendenwirbelbereich, pulmonal, sowie im
Becken und im Femur. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Dr. Pfäffle, Universitätsklinik Leipzig.
41
3 Ergebnisse
Kasuistik 6
Quelle: Phäochromozytom-Sammlung Lübeck, Dr. Klingenberg
Initialen: M.-L.M.
Jahr der Operation: 1999
Geburtsjahr: 1949
Alter bei Operation: 50 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin ist die Diagnose der Neurofibromatose Typ 1 im zweiten Lebensjahrzent
gestellt worden. Klinische Zeichen waren Café-au-lait Flecken. Sie wurde wegen einem seit
vier Jahren bestehenden Hypertonus mit Blutdruckkrisen stationär aufgenommen.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Multiple kutane Café-au-lait Flecken.
Diagnostik und Befunde:
Es fällt der leicht erhöhter Wert von Adrenalin in Plasma und 24h-Urin im Gegensatz zur
massiven Vermehrung des Noradrenalin im 24h-Urin und Plasma auf. CT, MRT und die
Szintigraphie ließen den Tumor erkennen (Tab. 13).
Tab. 13: Diagnostik und Befunde zu Fall 6.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
45
1392
426
2585
Plasma:
CT:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
180
10392
•
Zystisch zerfallener Tumor der rechten Nebenniere
•
Vergrößerte mediastinal gelegene LK, szintigraphisch kein Uptake
MRT-Abdomen:
Zystisch zerfallener Tumor der rechten Nebenniere
MIBG-Szintigraphie:
Eindeutiges Uptake des Radiopharmakons in der rechten Nebenniere (Abb. 23)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
42
3 Ergebnisse
a)
b)
Abb. 23 a und b: Fall 6: MIBG-Szintigraphie. Deutliche Mehranreicherung (Pfeile) im Bereich der
rechten Nebenniere. a) Ansicht von anterior. b) Ansicht von posterior. Mit freundlicher Genehmigung von
Herrn Dr. Klingenberg, Universitätsklinikum, Schleswig-Holstein, Lübeck.
Therapie:
An der Universitätsklinik Lübeck wurde der Tumor transabdominell reseziert (Abb. 24).
Intraoperativ war eine Zwerchfellinfiltration zu erkennen. Diese wurde entfernt. Das
Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt (Abb. 25 a-c). Die regionalen Lymphknoten
zeigten keinen Tumorbefall.
Verlauf:
Postoperativ lagen im Urin und im Plasma die Katecholamine im Normbereich (Tab. 14). Ein
MRT, das wegen der Zwerchfellinfiltration und der damit verbundenen Frage nach Malignität
durchgeführt wurde, zeigte keine Tumorformationen. Sechs Monate nach Operation erfolgte
ein Kontrolluntersuchung: MRT, Thorax-CT und MIBG-Szintigraphie ergaben keinen
Hinweis auf ein Tumorrezidiv.
43
3 Ergebnisse
Tab. 14: : Verlauf zu Fall 6: Biochemische Werte der Katecholamine und Metaboliten in Urin und Plasma sechs Monate
postoperativ.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
9
51
29
34
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
31
262
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Abb. 24 Fall 6: Operatives Resektat. Partiell zystischnekrotisch verändertes Phäochromozytom. Mit freundlicher
Genehmigung von Dr. Klingenberg, Universitätsklinik
Schleswig-Holstein, Lübeck.
a)
b)
c)
Abb. 25 a-c: Fall 6: Histologie a) HE-Färbung, gut sichtbare Mitose (Pfeil). b) HE-Färbung,Tumor mit
einem Gefäßeinbruch am oberen Bildrand. c) Färbung Chromogranin A. Mit freundlicher Genehmigung
von Dr. Klingenberg, Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Lübeck.
44
3 Ergebnisse
Kasuistik 7
Quelle: Phäochromozytom-Sammlung Lübeck, Dr. Klingenberg
Initialen: R. P.
Jahr der Operation: 1999
Geburtsjahr: 1939
Alter bei Operation: 60 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin sind seit dem zweiten Lebensjahrzehnt disseminierte Veränderungen der
Haut im Sinne einer Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Weiterhin Zustand nach
Strumektomie bei Struma multinodosa. Es besteht eine beidseitige Gonarthrose. Stationär
wurde
sie
zur
Abklärung
intermittierender
hypertensiver
Krisen
und
Blutdruckwerten im Intervall aufgenommen.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Multiple kutane Fibrome, Café-au-lait-Flecken (Abb. 26 a und b).
a)
b)
Abb. 26 a und b: klinisches Bild zu Fall 7: Klinisches Bild der multiplen Fibrome und
Café-au-lait Fleck am Rumpf (Pfeil). Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Klingenberg,
Universitätsklinikum Schleswig-Holstein, Lübeck.
hypotonen
45
3 Ergebnisse
Diagnostik und Befunde:
Im 24-Urin waren die Metanephrine erhöht. Der Tumor war in MRT und in der Szintigraphie
sichtbar (Tab. 15).
Tab. 15: Diagnostik und Befunde zu Fall 7.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
28
36
504
102
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
16
432
MRT-Abdomen:
Raumforderung der linken Nebenniere
MIBG-Szintigraphie:
Verstärkte Anreicherung des Radiopharmakons in der linken Nebenniere
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie:
Die Patientin wurde an der Universitätsklinik Lübeck laparatomiert, der Tumor extirpiert und
in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Mittels HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) konnte ein Exzess der Katecholamine und der Metabolite nachgewiesen
werden. Damit ist von einem Metanephrin produzierendem Phäochromozytom auszugehen.
Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Postoperativ lagen die 24h-Urin und die Plasmawerte bis auf Noradrenalin im Normbereich. 6
Monate postoperativ zeigten sich im Urin und im Plasma die Katecholamine und deren
Metaboliten im Normbereich (Tab. 16).
Tab. 16: Diagnostik und Befunde des Verlaufes zu Fall 7.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
23
57
36
75
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
18
669
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
46
3 Ergebnisse
Kasuistik 8
Quelle: Phäochromozytom-Sammlung Lübeck, Dr. Klingenberg
Initialen: A. S.
Jahr der Operation: 2000
Geburtsjahr: unbekannt
Alter bei Operation: 41 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin wurde die Diagnose der Neurofibromatose von Recklinghausen im 16.
Lebensjahr gestellt. Seitdem sind mehrere Fibrome entfernt worden. Die 40-jährige Patientin
präsentierte sich beim Hausarzt wegen Schwindel, Kopfschmerzen und starkem Schwitzen.
Die Blutdruckwerte waren erniedrigt. Sonographisch fand sich eine Raumforderung der
linken Nebenniere. Die Patientin wurde darauf zur weiteren Abklärung stationär
aufgenommen.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Multiple kutane und subkutane Fibrome am ganzen Körper. Hypotone Blutdruckwerte (RR
<100/60 mmHg).
Diagnostik und Befunde:
Katecholamine waren im 24h-Urin und im Plasma erhöht. Radiologisch ließ sich der Tumor
darstellen. Im MRT fanden sich des Weiteren paravertebrale Neurofibrome (Tab. 17).
Tab. 17: Diagnostik und Befunde zu Fall 8.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
88
195
255
199
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
227
1581
MRT-Abdomen:
Bestätigung der Raumforderung der linken Nebenniere
MIBG-Szintigraphie:
Verstärktes Uptake des Radiopharmakons in der linken Nebenniere
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
47
3 Ergebnisse
Therapie:
An der Universitätsklinik Lübeck wurde der Patient mittels Flankenschnitt-Zugang
adrenalektomiert. Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Postoperativ zeigten sich im Urin und im Plasma eine Normalisierung der Katecholamine
(Tab. 18). Die Patientin wurde 6 Monate später mit der gleichen Symptomatik wieder
aufgenommen. Tumorrezidive ließen sich aber mit Laboruntersuchungen und 131-J-MIBG
nicht nachweisen. Die Beschwerden persistierten bis zur nächsten stationären Aufnahme 10
Monate nach der Operation. Wiederum lagen die Laborwerte des Urins und des Plasmas im
Normbereich. Eine durchgeführte FDG-Positronenemissionstomographie (PET) ergab
schließlich ein verstärktes Enhancement im Beckenbereich. Der Bereich speicherte jedoch
kein Jod-MIBG, so dass nicht von einem katecholaminproduzierenden Tumor auszugehen ist.
Eine weitere Operation mit Resektion des Befundes wurde von der Patientin abgelehnt.
Tab. 18: Verlauf zu Fall 8.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
18
32
35
k. A.
Plasma:
A (ng/l); Norm: <150
NA (ng/l); Norm: <450
10
397
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
48
3 Ergebnisse
Kasuistik 9
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsspital Basel, Dr. Walter
Initialen: J.F.
Jahr der Operation: 1990
Geburtsjahr: 1949
Alter bei Operation: 40 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Eine Hypertonie
besteht seit 12 Jahren. Episoden mit Hitzegefühl, Kaltschweißigkeit und Tachykardien sind
seit 2 Jahren bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Blutdruck: 180/120 mmHg, Vereinzelte Café-au-lait Flecken und multiple Neurofibrome.
Diagnostik und Befunde:
Katecholamine im 24h-Urin stark erhöht, der Tumor war in Sonographie, CT und in der
Szintigraphie sichtbar (Tab. 19).
Tab. 19: Diagnostik und Befunde zu Fall 9.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
18
548
939
k. A.
k. A.
Sonographie:
Raumforderung in der rechten Nebenniere
CT:
Bestätigung des Tumors von 5x5 cm Größe
MIBG-Szintigraphie:
Verstärkte Anreicherung im Bereich der rechten Nebenniere
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie und Verlauf:
Die Laparotomie mit Entfernung des Tumors an der rechten Nebenniere verlief
komplikationslos. Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt. Der Verlauf war
unauffällig.
49
3 Ergebnisse
Kasuistik 10
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Padua, Prof. Opocher
Initialen: M.-C.A.
Jahr der Operation: 1988
Geburtsjahr: 1952
Alter bei Operation: 36 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
Familienanamnese:
Bei dem Vater, der Schwester und dem Neffen ist eine Neurofibromatose Typ 1 bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Vereinzelte Café-au-lait Flecken am Gesicht, wenige Neurofibrome. Die Patientin wurde
wegen erhöhten Blutdrucks stationär aufgenommen.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Diagnostik, Bildgebung und deren Befunde vor.
Therapie:
Der Blutdruck wurde mit ß-Blockern kontrolliert. Die Entfernung des Tumors der rechten
Nebennieren erfolgte laparotomisch und verlief komplikationslos. Das Phäochromozytom
wurde histologisch bestätigt.
50
3 Ergebnisse
Kasuistik 11
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Padua, Prof. Opocher
Initialen: M.-M.C.
Jahr der Operation: 2002
Geburtsjahr: 1954
Alter bei Operation: 48 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei Geburt bestanden bei der Patientin Deformationen des Gesichtes. Die Diagnose der
Neurofibromatose Typ 1 wurde bei der Patientin erst mit 23 Jahren durch Auftreten von
Neurofibromen gestellt. Aufgrund einer akuten Pankreatitis wurde die Patientin 2002 stationär
aufgenommen.
Familienanamnese:
Bei der Mutter ist eine Neurofibromatose Typ 1 bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Die Patientin war asymptomatisch. Vereinzelte Neurofibrome und Café-au-lait Flecken.
Diagnostik und Befunde:
Das Adrenalin im 24h-Urin war leicht erhöht, der Tumor ließ sich in MRT und in der
Szintigraphie darstellen (Tab. 20).
Tab. 20: Diagnostik und Befunde zu Fall 11.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
32
79
k. A.
k. A.
MRT-Abdomen:
Bestätigung des Tumors im Bereich beider Nebennieren von 2 cm (links) und 6
cm Größe (rechts)
MIBG-Szintigraphie:
Verstärkte Anreicherung im Bereich beider Nebennieren
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
51
3 Ergebnisse
Therapie:
Laparoskopische Entfernung des Tumors an beiden Nebennieren verlief komplikationslos.
Die Phäochromozytome wurden histologisch bestätigt.
Verlauf:
Alle Kontrolluntersuchungen waren unauffällig. Bei der Patientin besteht weiterhin eine
Tachykardie.
3 Ergebnisse
52
Kasuistik 12
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Padua, Prof. Opocher
Initialen: I.-R.C.
Jahr der Operation: 1996
Geburtsjahr: 1953
Alter bei Operation: 43 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Die Neurofibromatose von Recklinghausen wurde im Alter von 13 Jahren bei einer zervikalen
Fibromektomie diagnostiziert. Im Laufe der Jahre erfolgten mehrere Entfernungen von
Neurofibromen. Weitere Krankheitsanamnese:
1. 1969 Spontanpneumothorax
2. 1973 Gastroduodenale Ulzera
3. 1982 Diskushernie L4-L5
An die Universitätsklinik Padua kam die Patientin 1996 schließlich mit akut aufgetretenem
Herzklopfen, Vertigo und Kopfschmerzen.
Familienanamnese:
Der Vater und der Bruder wiesen eine Neurofibromatose Typ 1 und Hypertonie auf. Der
Vater ist 59-jährig an einem Blasenkarzinom verstorben, der Bruder 30-jährig an einem
zervikalen Fibrosarkom.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Am Intugement typische Zeichen einer Neurofibromatose Typ 1, Blutdruck: 165/110 mmHg.
Diagnostik und Befunde:
Auffällig im 24h-Urin war die starke Erhöhung der Metanephrine. Im CT und in der
Szintigraphie war der Tumor zu erkennen (Tab. 21).
53
3 Ergebnisse
Tab. 21: Diagnostik und Befunde zu Fall 12.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
150
82
1800
k. A.
CT:
4 cm großer Tumor der linken Nebenniere
MIBG-Szintigraphie:
Vermehrte Speicherung im Bereich der linken Nebenniere
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie:
Die Einstellung der RR-Werte auf zufrieden stellende Bereiche erfolgte mit Cardula (aBlocker). Der Patient wurde laparatomiert und der Tumor mittels Adrenalektomie entfernt.
Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Die Katecholamine des 24h-Urins befanden sich postoperativ im Normbereich.
54
3 Ergebnisse
Kasuistik 13
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Padua, Prof. Opocher
Initialen: A.C.
Jahr der Operation: 2002
Geburtsjahr: 1967
Alter bei Operation: 35 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Die Patientin leidet an einer Neurofibromatose von Recklinghausen.
Weiterhin sind bei der Patientin Granulosazelltumoren der Haut und der Blase bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Die Patientin war asymptomatisch. Café-au-lait Flecken und multiple Neurofibrome am
Intugement.
Diagnostik und Befunde:
Die Untersuchungen ergaben erhöhte Werte für Metanephrine und Normetanephrine im 24-hUrin. CT und MRT zeigten den Tumor (Tab. 22).
Tab. 22: Diagnostik und Befunde zu Fall 13.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
k. A.
k. A.
↑
↑
CT:
Raumforderung im Bereich der rechten Nebenniere
MRT-Abdomen:
Bestätigung des Tumors im Bereich der rechten Nebenniere (2,5cm)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie und Verlauf:
Die laparoskopische Entfernung des Tumors der rechten Nebenniere verlief komplikationslos.
Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt. Der Patientin geht es postoperativ gut.
Alle Katecholaminkontrolluntersuchungen waren unauffällig.
55
3 Ergebnisse
Kasuistik 14
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Rom, Prof. Letizia
Initialen: L.d.A.
Jahr der Operation: 2001
Geburtsjahr: 1958
Alter bei Operation: 43 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten besteht eine Neurofibromatose von Recklinghausen. Zudem besteht eine
chronische Autoimmunthyreoiditis. Er wurde wegen einer hypertensiven Krise (RR: 200/110
mmHg) eingeliefert. An Symptomen sind Kopfschmerzen, Palpitationen und starkes
Schwitzen bekannt.
Familienanamnese:
Beim Vater besteht eine Neurofibromatose Typ 1.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Adipöser Patient (BMI 33,4) mit leichter Hypertonie (150/90mmHg) mit paroxysmalen
Krisen. Café-au-lait Flecken und multiple Neurofibrome am ganzen Körper. „Freckling“ im
Bereich der Achselhöhlen. An den Augen sind Lisch-Knoten vorhanden.
Diagnostik und Befunde:
In allen radiologischen Bildgebungen ließ sich den Tumor darstellen (Tab.23).
Tab. 23: Diagnostik und Befunde zu Fall 14.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
17
k. A.
k. A.
460
k. A.
Sonographie:
Raumforderung in der rechten Nebenniere
CT:
Bestätigung des Tumors von 2 cm Größe in der rechten Nebenniere
MRT-Abdomen:
Bestätigung des Tumors von 2 cm Größe in der rechten Nebenniere
MIBG-Szintigraphie:
Anreicherung im Bereich der rechten Nebenniere (Abb. 27)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe;
3 Ergebnisse
56
Abb. 27 MIBG-Szintigraphie zu Fall 14. Ansicht von hinten. Der weiße Pfeil markiert das
Phäochromozytom, der rote Pfeil die Leber und der gelbe Pfeil die Milz.Mit freundlicher Genehmigung von
Prof. Letizia, Universitätsklinik Rom, Italien.
Therapie:
Präoperativ wurden 2 mg/die Doxazosin zur Behandlung des Hypertonus verabreicht. Darauf
laparoskopische Entfernung des Tumors der rechten Nebenniere. Das Phäochromozytom
wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Alle Kontrolluntersuchungen ergaben keine Auffälligkeiten.
57
3 Ergebnisse
Kasuistik 15
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Rom, Prof. Letizia
Initialen: I.C.
Jahr der Operation: 2004
Geburtsjahr: 1971
Alter bei Operation: 33 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Er wurde von
seinem Dermatologen in die Ambulanz wegen seit einem Monat bestehenden Phasen mit
massiver Blutdruckerhöhung überwiesen. Es bestanden Palpitationen.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Blutdruck: 175/105 mmHg, Puls 80/min. Café-au-lait Flecken und multiple Neurofibrome am
ganzen Körper. „Freckling“ im Bereich der Achselhöhlen.
Diagnostik und Befunde:
Sonographie und CT ließen den Tumor erkennen (Tab. 24).
Tab. 24: Diagnostik und Befunde zu Fall 15.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
15
k. A.
k. A.
388
k. A.
Sonographie:
Raumforderung in der rechten Nebenniere
CT:
Bestätigung des Tumors von 3,5x3 cm
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie und Verlauf:
Präoperativ wurden 4 mg/die Doxazosin zur Behandlung des Hypertonus verabreicht. Die
laparoskopische Entfernung des Tumors an der rechten Nebenniere verlief komplikationslos.
Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt. Alle Kontrolluntersuchungen ergaben
keine Auffälligkeiten.
58
3 Ergebnisse
Kasuistik 16
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Rom, Prof. Letizia
Initialen: M.M.
Jahr der Operation: 2004
Geburtsjahr: 1962
Alter bei Operation: 42Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
Es besteht eine Osteoporose. Er trägt seit einer Amputation des rechten Unterschenkels wegen
einer Pseudarthrose des Kniegelenkes eine Prothese.
Er wurde von seinem Dermatologen in die Ambulanz mit seit sechs Monaten bestehender
asymptomatischer Hypertonie (RR: 150/90 mmHg) überwiesen.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Blutdruck: 145/90 mmHg. Café-au-lait Flecken und multiple Neurofibrome am Rumpf, sowie
„Freckling“ im Bereich der Achselhöhlen. An den Augen sind Lisch-Knoten und eine
hypertensive Retinopathie Grad 2 vorhanden.
Diagnostik und Befunde:
Die VMA und die Metanephrine waren im 24h-Urin leicht erhöht. MRT und Szintigraphie
zeigten eine Raumforderung (Tab. 25).
Tab. 25: Diagnostik und Befunde zu Fall 16.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
12
k. A.
k. A.
398
k. A.
MRT-Abdomen:
Tumor der linken Nebenniere von 2x3 cm Größe
MIBG-Szintigraphie:
Deutliches Uptake im Bereich der linken Nebenniere (Abb. 28)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
59
3 Ergebnisse
Therapie:
Präoperativ wurden 4 mg Doxazosin und 80 mg/die Propanolol zur Behandlung des
Hypertonus verabreicht. Der Patient wurde laparatomiert und der Tumor der linken
Nebenniere entfernt. Intraoperativ wurde ein intestinales Neurofibrom entdeckt (Abb. 29).
Perioperativ gab es keine Komplikationen. Das Phäochromozytom wurde histologisch
bestätigt.
Verlauf:
Alle Kontrolluntersuchungen ergaben keine Auffälligkeiten.
Abb. 28 MIBG-Szintigraphie zu
Fall 16. Ansicht posterior-anterior.
Sichtbare Mehranreicherung im
Bereich der linken Nebenniere
(weißer Pfeil). Der schwarze Pfeil
markiert
die
Leber.
Mit
freundlicher Genehmigung von
Prof. Letizia, Universitätsklinik
Rom, Italien.
Abb. 29:
Neurofibrom des
Dünndarms von Fall 16, das
während
Operation
entdeckt
wurde.
Mit
freundlicher
Genehmigung von Prof. Letizia,
Universitätsklinik Rom, Italien.
3 Ergebnisse
60
Kasuistik 17
Quelle: Department für Endokrinologie, Universitätsklinik Rom, Prof. Letizia
Initialen: F.P.
Jahr der Operation: 2001
Geburtsjahr: 1964
Alter bei Operation: 37 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Zudem leidet der
Patient an einer multiplen endokrinen Neoplasie Typ 2A (MEN 2A; Sipple-Syndrom) mit
primärem Hyperparathyreoidismus (bedingt durch ein Adenom der Nebenschilddrüse) und
einem C-Zellkarzinom.
Er wurde von seinem Dermatologen in die Ambulanz wegen seit einem Monat bestehender
Hypertension überwiesen. Paroxysmale Krisen, Palpitationen, Kopfschmerzen, sowie Angstund Schweißzustände sind bekannt. Der Dermatologe hatte den Bluthochdruck mit ßBlockern und ACE-Hemmern nicht senken können.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Patient
mit
konstanter
Hypertension
(160/120 mmHg), Puls 120/min. Café-au-lait
Flecken und multiple Neurofibrome am
ganzen
Körper,
sowie
„Freckling“
im
Bereich der Achselhöhlen (Abb. 30). Die
Augenuntersuchung
zeigte
Lisch-Knoten
und eine hypertensive Retinopathie Grad 2.
Abb. 30: Links zu sehen ist das klinisches Bild zu Patient
17. Man sieht multiple Neurofibrome, einen Café-au-Lait
Fleck. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Letizia,
Universitätsklinik Rom, Italien.
61
3 Ergebnisse
Diagnostik und Befunde:
Die Werte für Vanillinmandelsäure und Metanephrine waren im 24h-Urin erhöht. Alle
bildgebenden Untersuchungen ließen die Raumforderung erkennen (Tab. 26).
Tab. 26: Diagnostik und Befunde zu Fall 17.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
15
k. A.
k. A.
415
k. A.
Sonographie:
Raumforderung in der linken Nebenniere
CT:
Bestätigung des Tumors von 4,5x3 cm Größe
MRT-Abdomen:
Bestätigung des Tumors von 4,5x3 cm Größe
MIBG-Szintigraphie:
•
Verstärkte Anreicherung der linken Nebenniere (Abb. 31 a)
•
Adenom des rechten Schilddrüsenlappens (Abb. 31 b)
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
a)
b)
Abb. 31 a und b: a) MIBG-Szintigraphie zu Fall 17. Aufnahme posterior-anterior. Verstärkte
Anreicherung in der linken Nebenniere (weißer Pfeil). Der rote Pfeil zeigt die Leber. b) MIBISzintigraphie der Schilddrüse (grün umrahmt). Der rote Fleck im rechten Drüsenlappen entspricht
dem Adenom (Pfeil). Der helle Bereich am unteren Bildrand stellt die Lunge dar. Mit freundlicher
Genehmigung von Prof. Letizia, Universitätsklinik Rom, Italien.
Therapie und Verlauf:
Präoperativ wurden 4 mg/die Doxazosin und 80 mg/die Propanolol zur Behandlung des
Hypertonus verabreicht. Die laparoskopische Entfernung des Tumors an der linken
Nebenniere verlief komplikationslos. Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Der weitere Verlauf war unauffällig.
3 Ergebnisse
62
Kasuistik 18
Quelle: Department Endokrinologie, Hopital Barbois, Universität Nancy, Dr. Muresan
Initialen: L.F.
Jahr der Operation: 2004
Geburtsjahr: 1956
Alter bei Operation: 47 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei der Patientin waren schon immer disseminierte Veränderungen der Haut im Sinne einer
Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt (Abb. 32). Im Laufe der Jahre erfolgten
mehrere Entfernungen von Neurofibromen.
Weitere Krankheitsanamnese:
•
1969 Operation einer großen Meningocele
•
1977 Entfernung eines gutartigen Tumors aus der Lunge (Histologie unbekannt)
•
1979 Sectio caesarea
•
Seit 2001 insulinpflichtiger Typ 2 Diabetes
•
Hyperlipidämie
•
Hypertonie
Familienanamnese:
Es sind Hautveränderungen im Sinne einer Neurofibromatose Typ 1 bei der Tochter bekannt.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Multiple Neurofibrome am ganzen Körper, vereinzelte Café-au-lait Flecken, inguinales
„Freckling“ (Abb. 32 a und b). Die Patientin präsentierte sich mit der Trias Kopfschmerzen,
Schweißzuständen und Palpitationen. Zusätzlich bestand starke Hypertonie.
63
a)
3 Ergebnisse
b)
Abb. 32 a und b: Klinisches Bild zu Fall 18 mit multiple Neurofibromen und vereinzelten Caféau-lait Flecken. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Muresan, Universität Nancy, Frankreich.
Diagnostik und Befunde:
Katecholamine und deren Metabolite waren im 24h-Urin stark erhöht. Die CT und die
Szintigraphie zeigten Tumoren (Tab.27).
Tab. 27: Diagnostik und Befunde zu Fall 18.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
↑↑
↑↑
↑↑
↑↑
CT:
4 cm große Raumforderung in rechten Nebenniere (Abb. 33a)
MRT-Abdomen:
3,5 cm große Raumforderung in linken Nebenniere (Abb.33b)
MIBG-Szintigraphie:
Aufnahme des Radiopharmakons in beiden Nebennieren
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
3 Ergebnisse
a)
64
b)
Abb. 33 a und b: Fall 18: a) CT-Abdomen mit Raumforderung im Bereich der rechten Nebenniere
(Pfeil). b) MRT-Abdomen zu deutlichen Raumforderung im Bereich der linken Nebenniere (Pfeil). Mit
freundlicher Genehmigung von Dr. Muresan, Universität Nancy, Frankreich.
Therapie:
Im Juli 2004 Operation des linken Nebennierentumors, wonach die erhöhten Katecholaminund Calcitoninwerte persistierten. Im November 2004 erfolgte die Exzision des rechten
Nebennierentumors. Die Phäochromozytome wurden jeweils histologisch bestätigt.
Verlauf:
Nach Entfernung beider Phäochromozytome normalisierten sich der Blutdruck, die
Katecholamine, sowie das Calcitonin. Zusätzlich kam es zu einer starken Reduktion des
Bedarfs an Insulin.
65
3 Ergebnisse
Kasuistik 19
Quelle: Department Endokrinologie St. Gorge Hospital London, Prof. MacGregor
Initialen: D.K.
Jahr der Operation: 1987
Geburtsjahr: 1944
Alter bei Operation: 43 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei dem Patienten waren schon immer disseminierte Veränderungen der Haut im Sinne einer
Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. 9 Jahre nach dem Phäochromozytom wurde
ein linksseitiges Mammakarzinom diagnostiziert.
Familienanamnese:
Screening der Familie ergab erhöhte Vanillinmandelsäure bei der Mutter 37 mg/die (Norm:
<8 mg/die).
Klinischer Untersuchungsbefund:
Multiple Neurofibrome, Café-au-lait Flecken.
Diagnostik und Befunde:
Erhöhte Werte für VMA, Adrenalin und Noradrenalin im 24h-Urin. Die Sonographie und die
CT ließen den Tumor erkennen (Tab.28).
Tab. 28: Diagnostik und Befunde zu Fall 19.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
14
185
321
k. A.
k. A.
Sonographie:
Raumforderung im Bereich der rechten Nebenniere
CT:
Bestätigung des Tumors der rechten Nebenniere von 3 cm Größe
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
66
3 Ergebnisse
Therapie:
Der Tumor wurde mittels Laparatomie und Adrenalektomie entfernt.
Verlauf:
Es wurde post-operativ jährlich eine Kontrolluntersuchung anhand 24h-Urins durchgeführt
(Tab. 29):
Tab. 29: Verlauf zu Fall 19.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
7
7
86
k. A.
k. A.
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin M = Metanephrine, NM = Normetanephrine; Plasma:
A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe
67
3 Ergebnisse
Kasuistik 20
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: J.K.
Jahr der Operation: 1997
Geburtsjahr: 1955
Alter bei Operation: 42 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten waren disseminierte Veränderungen der Haut im Sinne einer
Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
1997 wurde der 42-jährige Patient wegen paroxysmaler Hypertonie (bis 240/110 mmHg)
Herzpalpitationen und Schweißausbrüchen stationär aufgenommen. Der Patient ist seit seiner
frühen Kindheit am rechten Auge blind.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Patient mit multiplen subkutanen Fibromen am Kopf, Rumpf und der unteren Extremität. Am
Integument mehrere diskrete Café-au-lait Flecken und Vitiligo. Lisch-Knoten der Iris im
linken Auge. Großer Tumor (ca. 30 cm) über dem rechten Becken (Abb. 34).
Diagnostik und Befunde:
Adrenalin und Noradrenalin waren im 24h-Urin erhöht. In Sonographie, CT und in der
Szintigraphie war der Tumor sichtbar (Tab. 30).
Tab. 30: Diagnostik und Befunde zu Fall 20.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
377
331
k. A.
k. A.
Sonographie:
Raumforderung (37x31x32 mm) oberhalb der linken Niere
CT:
Bestätigung des Tumors der linken Nebenniere von 3cm Größe
MIBG-Szintigraphie:
Erhöhte Akkumulation des Radionukleotids in der linken NN
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
68
3 Ergebnisse
Abb. 34 a-c: Klinisches Bild zu Fall 20. Am Intugement Fibrome, multiple Café-au-lait
Flecken und Vitiligo. Deutlich sichtbarer Tumor über der rechten Hüfte. Mit freundlicher
Genehmigung von Prof. Januszewicz, Warschau, Polen.
Therapie:
Im Juni 1997 wurde eine Laparotomie mit linksseitiger Adrenalektomie durchgeführt. Das
Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Es liegen keine Angaben zum Verlauf vor.
69
3 Ergebnisse
Kasuistik 21
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: W.K.
Jahr der Operation: 1990
Geburtsjahr:1944
Alter bei Operation: 46 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Es sind keine
weiteren Informationen vorhanden.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Der Patient weist Zeichen der Neurofibromatose Typ 1 auf. RR:124/78 mmHg.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Katecholaminbestimmung, zu radiologischen oder
nuklearmedizinischen Diagnostik vor.
Therapie und Verlauf:
1990 wurde das Phäochromozytom mittels Laparatomie und Adrenalektomie entfernt. Der
Tumor war in der linken Nebenniere lokalisiert. Das Phäochromozytom wurde histologisch
gesichert.
Der Patient stellte sich zur Kontrolluntersuchung 1996 in Warschau vor. 24h-Blutdruck:
130/80 mmHg (Tab. 31).
Tab. 31: Postoperativer Verlauf zu Fall 21.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
2
12
k. A.
k. A.
CT:
ohne pathologischen Befund
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine; k. A. =
keine Angabe.
70
3 Ergebnisse
Kasuistik 22
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: K.P.
Jahr der Operation: 1992
Geburtsjahr:1940
Alter bei Operation: 52 Jahre
Geschlecht: weiblich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Es sind keine
weiteren Informationen vorhanden.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Der Patient hat Zeichen der Neurofibromatose Typ 1. RR: 110/70 mmHg.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Katecholaminbestimmung, zu radiologischen oder
nuklearmedizinischen Diagnostik vor.
Therapie:
1992 wurde das Phäochromozytom mittels Laparatomie und Adrenalektomie entfernt. Der
Tumor war in der linken Nebenniere lokalisiert.
Verlauf:
24h-Blutdruck: 113/75 mmHg. Die Kontrolluntersuchungen waren unauffällig (Tab. 32).
Tab. 32: Postoperativer Verlauf zu Fall 22.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
4
31
k. A.
k. A.
CT:
ohne pathologischen Befund
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine; k. A. =
keine Angabe.
71
3 Ergebnisse
Kasuistik 23
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: W.S.
Jahr der Operation: 2003
Geburtsjahr: 1942
Alter bei Operation: 61 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten sind disseminierte Veränderungen der Haut im Sinne einer
Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt.
2003 wurde der 61jährige Patient im Department of Hypertension, Institute of Cardiology,
Warschau, wegen Hypertonie aufgenommen. Sonographisch war zuvor ein Tumor der linken
Nebenniere festgestellt worden. Die Hypertonie war seit 10 Jahren bekannt. Der Patient gab
zudem intermittierende Kopfschmerzen, Schwitzen und Palpitationen an.
Familienanamnese:
Die Tochter hat Hautveränderungen im Sinne einer Neurofibromatose Typ 1.
Klinischer Untersuchungsbefund:
RR: 230/170 mmHg. Multiple kleine, subkutane Fibrome am ganzen Körper. Am Integument
mehrere, mehr als 15 mm große, diskrete Café-au-lait Flecken. Axillär und inguinal deutlich
sichtbares „Freckling“.
Diagnostik und Befunde:
Auffällig ist die enorme Erhöhung der Metanephrine im 24h-Urin. Sonographie, CT und
Szintigraphie ließen den Tumor erkennen (Tab. 33).
72
3 Ergebnisse
Tab. 33: Diagnostik und Befunde zu Fall 23.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
102
459
34201
k. A.
Sonographie:
Bestätigung der Raumforderung in der Nebenniere
CT:
•
13 cm große, kalzifizierende Raumforderung der linken Nebenniere
•
vergrößerte Prostata mit Verdacht eines Prostata-Karzinoms
MIBG-Szintigraphie:
starke Aufnahme des Radiopharmakons im Bereich der linken Nebenniere
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine;
Plasma: A = Adrenalin, NA = Noradrenalin; k. A. = keine Angabe.
Therapie:
Präoperativ
wurde
für
zwei
Wochen
die
Kombination
eines
α-Adrenoblockers
(Phenoxybenzamin 40 mg/die) mit einem β-Blocker (Metoprolol 75 mg/die) eingesetzt.
In Warschau wurde dann eine Laparatomie mit linksseitiger Adrenalektomie durchgeführt.
Dabei wurde ein zweiter Tumor exzidiert, der sich histologisch als Lymphknotenmetastase
des Prostata-Karzinoms herausstellte. Das Phäochromozytom wurde histologisch bestätigt.
Verlauf:
Postoperativ ergaben sich keine Komplikationen. Die Katecholamine des 24h-Urins lagen
nach der Operation bis auf die Metanephrine im Normbereich (Tab. 34).
Tab. 34: Diagnostik und Befunde zu Fall 23.
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
3
10
245
k. A.
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine; k. A. =
keine Angabe.
73
3 Ergebnisse
Kasuistik 24
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: J.S.
Jahr der Operation: 1993
Geburtsjahr: 1955
Alter bei Operation: 38 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Es liegen keine Informationen zur Anamnese vor.
Familienanamnese:
Es liegen keine Informationen zur Familienanamnese vor.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Es liegen keine Informationen zum Untersuchungsbefund vor.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Diagnostik, Bildgebung und deren Befunde vor.
Therapie:
1993 erfolgte die Laparatomie mit Entfernung des Tumors und der rechten Nebenniere.
Verlauf:
Es liegen keine Informationen zum Verlauf vor.
74
3 Ergebnisse
Kasuistik 25
Quelle Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: J.W.
Jahr der Operation: 1986
Geburtsjahr:1936
Alter bei Operation: 50 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Es sind keine
weiteren Informationen vorhanden.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Der Patient hat Zeichen der Neurofibromatose Typ 1. RR 140/80 mmHg.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Katecholaminbestimmung, zur radiologischen oder
nuklearmedizinischen Diagnostik vor.
Therapie:
1986 wurde das Phäochromozytom mittels Laparatomie und Adrenalektomie entfernt. Der
Tumor war in der linken Nebenniere lokalisiert.
Verlauf:
Der Patient stellte sich zur Kontrolluntersuchung 1996 in Warschau vor. Die Katecholamine
befanden sich im Normbereich (Tab. 35). 24h-Blutduck: 150/85 mmHg.
Tab. 35: Verlauf zu Fall 25:
Diagnostik
Befund
24h-Urin:
VMA (mg/die)
Norm: <8
A (μg/die)
Norm: <20
NA (μg/die)
Norm: <80
M (μg/die)
Norm: <80
NM (μg/die)
Norm: <120
k. A.
2
12,3
k. A.
k. A.
Urin: VMA = Vanillinmandelsäure, A = Adrenalin, NA = Noradrenalin, M = Metanephrine, NM = Normetanephrine; k. A. =
keine Angabe.
75
3 Ergebnisse
Kasuistik 26
Quelle: Phäochromozytom-Register Warschau, Prof. Januszewicz
Initialen: W.W.
Jahr der Operation: 1990
Geburtsjahr: 1957
Alter bei Operation: 33 Jahre
Geschlecht: männlich
Anamnese:
Bei dem Patienten ist eine Neurofibromatose von Recklinghausen bekannt. Es sind keine
weiteren Informationen vorhanden.
Klinischer Untersuchungsbefund:
Es liegen keine Informationen zum Untersuchungsbefund vor.
Diagnostik und Befunde:
Es liegen keine Informationen zur Katecholaminbestimmung, zur radiologischen oder
nuklearmedizinischen Diagnostik vor.
Therapie:
1990 wurden dem damals 33jährigen Patienten zwei Phäochromozytome mittels Laparatomie
und beidseitiger Adrenalektomie entfernt.
Verlauf:
Es liegen keine Informationen zum Verlauf vor.
76
3 Ergebnisse
3.2 Zusammenfassung der klinischen Daten
Tab. 36: Allgemeine Patientendaten.
Fall
Geschl. Geb.Jahr OP Jahr OP Alter
s/f
Herkunftsland
Ort Klinik
1
w
1951
1995
44
f
Deutschland
Freiburg
2
m
1957
2003
46
f
Deutschland
Freiburg
3
m
1980
1994
14
s
Deutschland
Essen
4
w
1972
2004
32
s
Deutschland
Essen
5
w
1985
1985
16
f
Deutschland
Leipzig
6
w
1949
1999
52
s
Deutschland
Lübeck
7
w
1939
1999
60
s
Deutschland
Lübeck
8
w
1959
2000
41
s
Deutschland
Lübeck
9
w
1949
1990
40
s
Schweiz
Basel
10
w
1952
1988
36
f
Italien
Padua
11
w
1954
2002
48
f
Italien
Padua
12
w
1953
1996
43
s
Italien
Padua
13
w
1967
2002
35
s
Italien
Padua
14
m
1958
2001
43
f
Italien
Rom
15
m
1971
2004
33
s
Italien
Rom
16
m
1962
2004
42
s
Italien
Rom
17
m
1964
2001
37
s
Italien
Rom
18
w
1956
2004
48
f
Frankreich
Nancy
19
w
1944
1987
43
s
Großbritannien
London
20
m
1955
1997
42
s
Polen
Warschau
21
w
1944
1990
46
s
Polen
Warschau
22
w
1940
1992
52
k. A.
Polen
Warschau
23
m
1942
2003
61
f
Polen
Warschau
24
m
1955
1993
38
k. A.
Polen
Warschau
25
m
1936
1986
50
k. A.
Polen
Warschau
26
m
1957
1990
33
k. A.
Polen
Warschau
s = sporadisch, f = familiär; k. A. = keine Angabe.
77
3 Ergebnisse
Tab. 37: Typische NF1 Zeichen und Phäochromozytom-Symptomatik.
Fall
Café-auKutane
Freckling Augen
lait
Fibrome
Flecken
RR
Palpit. Schwitzen
Kopf
schmerz.
1
pos
pos
neg
neg
pos
neg
neg
neg
2
pos
pos
neg
neg
pos
neg
neg
neg
3
pos
pos
pos
Lisch
pos
neg
neg
pos
4
pos
pos
pos
k. A.
pos
pos
pos
pos
5
pos
neg
neg
Gliom
pos
neg
neg
pos
6
pos
neg
neg
neg
pos
pos
pos
pos
7
pos
pos
neg
neg
pos
pos
pos
pos
8
pos
pos
neg
neg
neg
pos
pos
pos
9
pos
pos
neg
neg
pos
pos
pos
neg
10
pos
pos
k. A.
neg
pos
k. A.
k. A.
k. A.
11
pos
pos
k. A.
neg
neg
neg
neg
neg
12
pos
pos
neg
neg
pos
pos
neg
pos
13
pos
pos
pos
neg
neg
neg
neg
neg
14
pos
pos
pos
Lisch
pos
pos
pos
pos
15
pos
pos
pos
neg
pos
pos
neg
neg
16
pos
pos
pos
Lisch
pos
neg
neg
neg
17
pos
pos
pos
Lisch
pos
pos
pos
pos
18
pos
pos
pos
neg
pos
pos
pos
pos
19
pos
pos
pos
neg
neg
neg
pos
pos
20
pos
pos
pos
Lisch
pos
pos
pos
pos
21
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
22
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
23
pos
pos
k. A.
neg
pos
pos
pos
pos
24
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
25
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
26
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A. = keine Angabe.
78
3 Ergebnisse
Tab. 38: Phäochromozytom-spezifische Befunde I.
Fall
1
CT MRT MIBG
pos
2
U-A
<20
μg/d
UNA
<80
VMA
1-8
mg/d
U-M
<80
μg/d
U-NM
<120
μg/d
Pl-A
<150
ng/l
Pl-NA
<450
ng/l
pos
pos
42
81
18
-
-
-
-
pos
pos
13
50
-
1255
1717
-
-
3
pos
pos
pos
↑
↑
458
↑
↑
5000
2700
4
pos
pos
pos
186
340
-
-
-
-
-
5
pos
pos
pos
-
1465
-
286
8879
92
17914
6
pos
pos
pos
45
1392
-
426
2585
180
10392
7
pos
pos
pos
28
36
-
504
102
16
432
8
pos
pos
pos
88
195
-
255
199
227
1581
9
pos
-
pos
548
939
18
-
-
4
8
10
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
11
pos
pos
pos
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
32
79
12
pos
-
pos
150
82
5
1800
-
-
-
13
pos
pos
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
↑
↑
k. A.
k. A.
14
pos
pos
pos
-
-
17
460
-
-
-
15
pos
pos
-
-
-
16
388
-
-
-
16
-
pos
pos
-
-
12
398
-
-
-
17
pos
pos
pos
-
-
15
415
-
-
-
18
pos
pos
pos
↑
↑
2692
926
↑
↑
19
pos
-
-
185
321
14
-
-
-
-
20
pos
k. A.
pos
377
331
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
21
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
22
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
23
pos
-
pos
102
459
-
34201
-
-
-
24
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
25
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
26
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
k. A.
24-Urin: Adrenalin (U-A), Noradrenalin (U-NA), Vanillinmandelsäure (VMA), Metanephrine (U-M) und Normetanephrine
(U-NM); Plasma: Adrenalin (Pl-A) und Noradrenalin (Pl-NA). ↑ = erhöht ohne genaue Angabe, k. A. = keine Angabe, - =
nicht durchgeführt.
79
3 Ergebnisse
Tab. 39: Phäochromozytom-spezifische Befunde II.
Fall
Zahl der Lokalisation Art der Größe
Metastasen
Histol.
Dignität
Tumoren
adrenal
Operation cm
Lokalisation
1
2
beidseits
Laparatomie
4/2
pos
keine
benigne
2
2
beidseits
Endoskopie
4/3
pos
keine
benigne
3
1
links
Laparatomie
7
pos
Lunge, Knochen
maligne
4
1
links
Endoskopie
6
pos
keine
benigne
5
1
rechts
Laparatomie
5
pos
Lunge, Knochen
maligne
6
1
rechts
Laparatomie
9
pos
keine
benigne
7
1
links
Laparatomie
4
pos
keine
benigne
8
1
links
Laparatomie
3
pos
keine
9
1
rechts
Laparatomie
5
pos
keine
Frgl.
infiltrativ
benigne
10
1
rechts
Laparatomie
2
pos
keine
benigne
11
2
beidseits
Endoskopie
6/2
pos
keine
benigne
12
1
links .
Laparatomie
4
pos
keine
benigne
13
1
rechts
Endoskopie
3
pos
keine
benigne
14
1
rechts .
Endoskopie
2
pos
keine
benigne
15
1
rechts
Endoskopie
3
pos
keine
benigne
16
1
links
Laparatomie
3
pos
keine
benigne
17
1
links
Endoskopie
4
pos
keine
benigne
18
2
beidseits
Laparatomie
4/3
pos
keine
benigne
19
1
rechts
Laparatomie
3
pos
keine
benigne
20
1
links
Laparatomie
3
pos
keine
benigne
21
1
links
Laparatomie
k. A.
pos
keine
benigne
22
1
links
Laparatomie
k. A.
pos
keine
benigne
23
1
links
Laparatomie
13
pos
keine
benigne
24
1
links
Laparatomie
k. A.
pos
keine
benigne
25
1
rechts
Laparatomie
k. A.
pos
keine
benigne
26
2
beidseits
Laparatomie
k. A.
pos
keine
benigne
k. A. = keine Angabe.
80
3 Ergebnisse
3.3 Mutationen des NF1-Gens
Im Folgenden werden die Kurven und Sequenzen, die eine Mutation identifizieren ließen,
abgebildet und erläutert. Sie sind nach den Fällen sortiert. Dabei sind Missense Mutationen rot
eingekreist, Splice site Mutationen blau, Deletionen und Insertionen grün gekennzeichnet. Die
Polymorphismen werden lediglich in einer zusammenfassenden Tabelle aufgelistet.
Fall 1:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 10b ein von der Norm abweichendes Diagramm.
Die Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 1466 A/G entspricht Y489C
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 10b ist in Abbildung 35a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 35b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 1466. Die Base Adenin (A)
ist durch Guanin (G) ersetzt. Das Codon 489, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz TAT und codiert für die Aminosäure Tyrosin (Y). Die mutierte
Basensequenz lautet somit TGT und codiert eigentlich für Cystein (C). Diese Mutatione
ist nur formal eine Missense Mutation, weil sich durch die neue Nukleotidsequenz eine
neue Splice site AG-GT bildet, die zu einem Verlust von 62 bp führt. Dies wurde von
Messiaen et al. (1999) durch RNA-Analyse gezeigt.
a)
b)
mV
1
Wildtyp-Sequenz:
GAAGC TAT AAGTA
Mutierte Sequenz:
GAAGC TGT AAGTA
Nukleotid: 1466
0
1.9
2
2.1
m
Substitution: A/G
Codon 489
Abb. 35 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 1 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,9 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 1466 A/G Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
81
3 Ergebnisse
Diese Mutation ist in der Literatur bereits beschrieben (Messiaen et al. 1999). Es ist eine
Mutation, deren Sequenz der eines Pseudogenes entspricht (Luijten et al. 2001). In Abbildung 36
ist die Wildtyp-Sequenz mit der Pseudogensequenz als „Blast“ vergleichend dargestellt.
„Blast“ ist ein Computerprogramm des National Center for Biotechnology Information
(NCBI), mit dem sich Sequenzen vergleichen lassen.
Abb. 36: Blast-Sequenz von Wildtyp-Exon 10b (obere Sequenz) und Pseudogen ähnlich Exon 10b auf Chromosom 22
(AC002471). Das so genannte Blast ist ein Computerprogramm des National Center for Biotechnology Information
(NCBI), mit dem sich Sequenzen vergleichen lassen. Rot markiert ist die in Fall 1 und 17 gefundene Mutation, die in der
Sequenz des Pseudogens vorkommt. Grün markiert sind alle weiteren Unterschiede, die jedoch in der Sequenzierung der
beiden Fälle unauffällig waren, womit eine versehentliche Amplifikation ausgeschlossen ist.
Fall 2:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 2 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 61-1 G/A (IVS2-1 G/A) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Intron 1/Anfang Exon 2
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 10b ist in Abbildung 37a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 37b dargestellt. Das Exon 2 beginnt am
Nukleotid 61. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 61-1. Dies
betrifft die Splice-Region des Exons 2. Die Base Guanin (G) ist durch Adenin (A) ersetzt.
Dadurch kommt es zu einem inkorrekten Splice-Vorgang der mRNA, wodurch eine
veränderte Synthese des Proteins resultiert. Dies stellt daher eine Mutation dar.
82
3 Ergebnisse
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
TTTTCAG CTTCCA
Mutierte Sequenz:
TTTTCAA CTTCCA
Nukleotid: 61-1
0
Substitution: G/A
1.6
1.7
1.8
1.9
AG/GT-Regel
Codon 21
m
Abb. 37 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 2 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Ein Peak fehlt bei 1,83 min. b) Dazugehörige
Sequenzierung mit blau eingekreister 61-1 G/A Splice site Mutation. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Fall 3:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 3 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 277 T/C entspricht C93R
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 3 ist in Abbildung 38a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 38b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 277. Die Base Thymin (T)
ist durch Cytosin (C) ersetzt. Das Codon 277, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz TGT und codiert für die Aminosäure Cystein (C). Die mutierte
Basensequenz lautet somit CGT und codiert für Arginin (R). Diese Basenänderung fand
sich bei keinem der Kontrollproben. Sie stellt daher eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
GAAAAA TGT CTTG
Mutierte Sequenz:
GAAAAA CGT CTTG
Nukleotid: 277
0
Substitution: T/C
1.4
1.5
1.6
m
Codon 93
Abb. 38 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 3 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,4 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 277 T/C Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
83
3 Ergebnisse
Fall 4:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 37 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 6795 ins C entspricht E2255Frameshift
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 37 ist in Abbildung 39a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 39b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung nach Nukleotid-Position 6795. Es ist die Base
Cytosin (C) eingefügt. Durch die Insertion kommt es ab dem Codon 2266, in dem die
Base eingefügt ist, zu einer Verschiebung des Leserasters der Aminosäurentranslation,
dem so genannten Frameshift. Dies stellt somit eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
TACAAC AGT CAAG
Mutierte Sequenz:
TACAAC CAG TCAA
Nukleotid: 6795
0
Insertion: C
1.8
1.9
Codon 2266
m
Abb. 39 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 4 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,83 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit grün eingekreister Cytosin-Insertion am Nukeotid 6795. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Insertion an.
Dadurch werden 19 falsche Aminosäuren übersetzt, bis es im 20. Triplett zu einem StoppCodon kommt (Abb. 40). Dies führt zum Abbruch der Proteinbiosynthese.
Abb. 40: Rot eingerahmt ist das Codon, in dem die homozygote TT-Insertion zum Frameshift führt. Zum Vergleich sind
Wildtyp-DNA- und Aminosäurensequenz angegeben. Der Frameshift findet in Exon 37 statt und beginnt in Codon 2266.
84
3 Ergebnisse
Fall 5:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 16 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 2849 ins TT homo entspricht Q950Frameshift
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 16 ist in Abbildung 41a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 42b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung nach Nukleotid-Position 2849. Es sind zwei
zusätzliche Basen Thymin (T) eingefügt. Durch die Insertion kommt es ab dem Codon
2849, in dem die erste Base eingefügt ist, zu einer Verschiebung des Leserasters der
Aminosäurentranslation, dem so genannten Frameshift. Dies stellt somit eine Mutation
dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
GGA CAG GTAAAGT
Mutierte Sequenz:
GGA CAT TGGTAAA
Nukleotid: 2849
0
Insertion: TT homo
1.8
1.9
Codon 950
m
Abb. 41 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 5 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,78 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit grün eingekreister Thymin-Insertion am Nukleotid 2849. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Insertion an.
Dadurch werden 4 falsche Aminosäuren übersetzt, bis es im 5. Triplett zu einem Stopp-Codon
kommt. Dies ist in Abbildung 42 gezeigt.
Abb. 42: Homozygote TT Insertion am Ende von Exon 16 (rot eingerahmt). In der mutierten Sequenz (5. Reihe)
verschieben sich die weiteren Basen zur Wildtyp-Sequenz (Reihe 3) um 2 Basen nach rechts. In der untersten
Reihe erkennt man die zur normalen Aminosäurensequenz (Reihe 4) veränderte Sequenz. Nach vier Aminosäuren
kommt es im Triplett zu einem Stopp-Codon (X).
85
3 Ergebnisse
Fall 6:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 22 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 3826 C/T entspricht R1276X
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 22 ist in Abbildung 43a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 43b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 3826. Die Base Cytosin (C)
ist durch Thymin (T) ersetzt. Das Codon 1276, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz CGA und codiert für die Aminosäure Arginin (R). Die mutierte
Basensequenz lautet somit TGA und codiert für ein Stopp-Codon (X). Dadurch kommt es
zum Abbruch des Translationsvorganges. Die Basenänderung stellt daher eine Mutation
dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
CTCTTC CGA GGCA
Mutierte Sequenz:
CTCTTC TGA GGCA
Nukleotid: 3826
0
Substitution: C/T
1.8
1.9
Codon 1276
m
Abb. 43 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 6 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,8 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 3826 C/T Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Diese Mutation ist von Heim et al. (1995) schon identifiziert worden. Sie entspricht der
Sequenz eines Pseudogens auf Chromosom 15. Um eine fehlerhafte Amplifikation
auszuschließen, ist in Abbildung 44 die Wildtyp-Sequenz von Exon 22 mit der PseudogenSequenz als Blast vergleichend dargestellt.
3 Ergebnisse
86
Abb. 44: Blast Sequenz zwischen Wildtyp-Exon 22 (obere Reihe) und dem Pseudogen auf Chromosom 15 (untere Reihe)
(Accession Nr. AC021585, AC020679). Das so genannte Blast ist ein Computerprogramm des National Center for
Biotechnology Information (NCBI), mit dem sich Sequenzen vergleichen lassen. Die in Fall 6 gefundene Mutation ist rot
markiert. Sie entspricht der Sequenz des Pseudogens. Alle weiteren Unterschiede, die jedoch in der Sequenzierung
durchgehend unauffällig waren, sind grün eingerahmt, womit eine versehentliche Amplifikation trotz der allel-spezifischen
PCR ausgeschlossen werden kann.
Fall 7:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 15 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 2409+1 G/C (IVS15+1 G/C) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 15/Anfang von Intron 15
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 15 ist in Abbildung 45a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 45b dargestellt.
Das Exon 15 endet am Nukleotid 2409. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an
Nukleotid-Position 2409+1. Dies betrifft die Splice-Region des Exons 15. Die Base
Guanin (G) ist durch Cytosin (C) ersetzt. Dadurch kommt es zu einem inkorrekten SpliceVorgang der mRNA, wodurch eine veränderte Synthese des Proteins resultiert. Dies stellt
somit eine Mutation dar.
87
mV
1
a)
3 Ergebnisse
b)
Wildtyp-Sequenz:
GGCCAG GT AAGTC
Mutierte Sequenz:
GGCCAG CT AAGTC
Nukleotid 2409+1
0
2.1
2.2
2
m
Substitution G/C
Codon 803 AG/GT-Regel
Abb. 45 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 7 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,9 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit blau eingekreister 2409+1 G/C Splice site Mutation. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Fall 9:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 35 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 6641+1 G/A (IVS35+1 G/A) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 35/Anfang von Intron 35
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 35 ist in Abbildung 46a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 46b dargestellt.
Das Exon 35 endet am Nukleotid 6641. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an
Position 6641+1. Dies betrifft die Splice-Region des Exons 35. Die Base Guanin (G) ist
durch Adenin (A) ersetzt. Dadurch kommt es zu einem inkorrekten Splice-Vorgang der
mRNA, wodurch eine veränderte Synthese des Proteins resultiert. Dies stellt somit eine
Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
TCAAAG GT ATGAC
Mutierte Sequenz:
TCAAAG AT ATGAC
Nukleotid: 6641+1
0
Substitution: G/A
1.6
1.7
1.8
1.9
Teilcodon 2214
AG/GT-Regel
2 m
Abb. 46 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 9 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,77 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit blau eingekreister 6641+1 G/A Splice site Mutation. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
88
3 Ergebnisse
Fall 10:
Die DHPLC-Analyse zeigte für die Exons 7 und 45 von der Norm abweichende Diagramme.
Die Sequenzierung der Exons ergab folgende Ergebnisse:
1. Mutation: NF1 c. 1062+2 T/C (IVS7+2 T/C) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 7/Anfang von Intron 7
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 7 ist in Abbildung 47a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 47b dargestellt.
Das Exon 7 endet am Nukleotid 1062. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an
Nukleotid-Position 1062+2. Dies betrifft die Splice-Region des Exons 7. Die Base
Thymin (T) ist durch Cytosin (C) ersetzt. Dadurch kommt es zu einem inkorrekten SpliceVorgang der mRNA, wodurch eine veränderte Synthese des Proteins resultiert. Sie stellt
daher eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
TTAAG GT AACATG
Mutierte Sequenz:
TTAAG GC AACATG
Nukleotid: 1062+2
0
1.4
m
Substitution: T/C
Codon 354 AG/GT-Regel
Abb. 47 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 10 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,37 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit blau eingekreister 1062+2 T/C Splice site Mutation. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
2. Mutation: NF1 c. 9833 T/A entspricht D2611E
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 45 ist in Abbildung 48a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 48b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukeosid-Position 7833. Die Base Thymin (T)
ist durch Adenin (A) ersetzt. Das Codon 2611, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz GAT und codiert für die Aminosäure Asparagin (D). Die mutierte
Basensequenz lautet somit GAA und codiert für Glutamin (E). Diese Basenänderung fand
sich bei keinem der Kontrollproben. Sie stellt daher eine Mutation dar.
89
a)
b)
mV
1
3 Ergebnisse
Wildtyp-Sequenz:
CACA GAT GAGTTT
Mutierte Sequenz:
CACA GAA GAGTTT
Nukleotid: 7833
0
1.7
1.8
1.9
m
Substitution: T/A
Codon 2611
Abb. 48 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 10 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,73 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 7833 T/A Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Fall 14:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 23-2 ein von der Norm abweichendes Diagramm.
Die Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 4077 del T entspricht P1359Frameshift
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 23-2 ist in Abbildung 49a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 49b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleosid-Position 4077. Das Nukleotid
Cytosin (C) ist deletiert. Dadurch kommt es ab dem Codon 1359, in dem die Base fehlt,
zu einer Verschiebung des Leserasters der Aminosäurentranslation, dem so genannten
Frameshift. Dies stellt somit eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
CCCC CTC ACTTC
Mutierte Sequenz:
CCCC CCA CTTCG
Nukleotid: 4077
0
Deletion: T
1.8
1.9
Codon 1359
m
Abb. 49 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 14mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der Peak ist verbreitert und beginnt bei
1,78 min. b) Dazugehörige Sequenzierung mit grün eingekreister Thymin-Deletion am Nukeotid 4077. Das Textfeld
zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Deletion an.
3 Ergebnisse
90
Dadurch werden 25 falsche Aminosäuren übersetzt, bis es im 26. Triplett zu einem StoppCodon kommt. Dies ist in Abbildung 50 gezeigt.
Abb. 50: Deletion in Exon 10c. In der Ersten Zeile ist jeweils das Exon genannt. Die zweite Zeile beschreibt das Codon.
Unter der Wildtyp-Nukleotid-Sequenz ist die Aminosäuresequenz dargestellt. Es folgt die mutierte Sequenz von Fall 14.
Rot eingerahmt ist das Codon der Deletion. Durch die Leserasterverschiebung werden “falsche” Aminosäuren übersetzt,
bis es zu einem Stopp-Codon kommt (X).
Fall 15:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 10c ein von der Norm abweichendes Diagramm.
Die Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 1580 del C entspricht Q950Frameshift
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 10c ist in Abbildung 51a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 51b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleosid-Position 1580. Das Nukleotid
Cytosin (C) ist deletiert. Dadurch kommt es ab dem Codon 950, in dem die Base fehlt, zu
einer Verschiebung des Leserasters der Aminosäurentranslation, dem so genannten
Frameshift. Dies stellt somit eine Mutation dar.
91
mV
1
a)
3 Ergebnisse
b)
Wildtyp-Sequenz:
TAATT ACA GGGCT
Mutierte Sequenz:
TAATT AAG GGCTC
Nukleotid: 1580
0
1.7
1.8
1.9
m
Deletion: C
Codon 527
Abb. 51 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 15 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,7 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit grün eingekreister Cytosin-Deletion am Nukeotid 1580. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Deletion an.
Dadurch codieren die folgenden 28 Tripletts für falsche Aminosäuren, bis es im 29. Triplett
zu einem Stopp-Codon kommt. Dies ist in Abbildung 52 gezeigt.
Abb. 52: Frameshift-Sequenz der Deletion in Exon 10c. In der ersten Zeile ist jeweils das Exon genannt. Die zweite Zeile
zeigt das Codon der Wildtyp-Sequenz. Darunter ist die Wildtyp-Aminosäuresequenz dargestellt. Darunter steht die in Fall
15 beobachtete Basensequenz. Rot eingerahmt ist das Codon der Deletion. Durch die Leserasterverschiebung werden
“falsche” Aminosäuren übersetzt, bis es zum Stopp-Codon kommt (X).
92
3 Ergebnisse
Fall 17:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 10c ein von der Norm abweichendes Diagramm.
Die Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 1466 A/G entspricht Y489C
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 10b ist in Abbildung 53a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 53b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 1466. Die Base Adenin (A)
ist durch Guanin (G) ersetzt. Das Codon 489, zu dem diese Base gehört lautet in der
Wildtyp-Sequenz TAT und codiert für die Aminosäure Tyrosin (Y). Die mutierte
Basensequenz lautet somit TGT und codiert eigentlich für Cystein (C). Diese Mutation ist
nur formal eine Missense Mutation, weil sich durch die neue Nukleotidsequenz eine neue
Splice site AG-GT bildet, die zu einem Verlust von 62 bp führt. Dies wurde von Messiaen
et al. (1999) durch RNA-Analyse gezeigt.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
GAAGC TAT AAGTA
Mutierte Sequenz:
GAAGC TGT AAGTA
Nukleotid: 1466
0
Substitution: A/G
2
2.1
2.2 m
Codon 489
Abb. 53 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 17 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,9 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 489 A/G Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Diese Mutation ist in der Literatur bereits beschrieben (Messiaen et al. 1999). Es ist eine
Mutation, deren Sequenz der eines Pseudogenes entspricht (Luijten et al. 2001). In Abbildung 36
ist die Wildtyp-Sequenz mit der Pseudogensequenz als Blast vergleichend dargestellt.
93
3 Ergebnisse
Fall 19:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 41 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 7337 C/G entspricht S2446X
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 41 ist in Abbildung 54a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 54b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleosid-Position 7337. Die Base Cytosin (C)
ist durch Guanin (G) ersetzt. Das Codon 2446, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz TCA und codiert für die Aminosäure Serin (S). Die mutierte
Basensequenz lautet somit TGA und codiert für ein Stopp-Codon (X). Dadurch kommt es
zum Abbruch des Translationsvorganges. Dies stellt somit eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
ATATT TCA ATGGA
Mutierte Sequenz:
ATATT TGA ATGGA
Nukleotid: 7337
0
Substitution: C/G
1.7
1.8
m
Codon 2446
Abb. 54 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 19 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,9 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 7337 C/G Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Fall 20:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 29 von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 5537+1 G/T (IVS29+2 G/T) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 29/Anfang von Intron 29
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 29 ist in Abbildung 55a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 55b dargestellt.
Das Exon 29 endet am Nukleotid 5537. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an
Nukleotid-Position 5537+1. Dies betrifft die Splice-Region des Exons 29. Die Base
94
3 Ergebnisse
Guanin (G) ist durch Thymin (T) ersetzt. Dadurch kommt es zu einem inkorrekten SpliceVorgang der mRNA, wodurch eine veränderte Synthese des Proteins resultiert. Dies stellt
somit eine Mutation dar.
mV
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
TTTACG GT AGGTT
Mutierte Sequenz:
TTTACG TT AGGTT
Nukleotid: 5537+1
0
1.6
1.7
1.8 m
Substitution: G/T
Teilcodon 1849
AG/GT-Regel
Abb. 55 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 20 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Zwei zusätzliche Peaks beginnen bei 1,58
min. und 1,64 min. b) Dazugehörige Sequenzierung mit blau eingekreister 5537 G/T Splice site Mutation. Das Textfeld
zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Fall 21:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 2 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 269 T/C entspricht L90P
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 2 ist in Abbildung 56a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 56b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Nukleotid-Position 269. Die Base Thymin (T)
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
ATACA CTG GAAAA
Mutierte Sequenz:
ATACA CCG GAAAA
Nukleotid: 269
0
Substitution: T/C
1.4
1.5
1.6
Codon 90
m
Abb. 56 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 21 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,48 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 269 T/C Substitution. Das Textfeld zeigt Wildtyp-Sequenz, mutierte
Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
95
3 Ergebnisse
ist durch Cytosin (C) ersetzt. Das Codon 90, zu dem diese Base gehört, lautet in der
Wildtyp-Sequenz CTG und codiert für die Aminosäure Leucin (L). Die mutierte
Basensequenz lautet somit CCG und codiert für Prolin (P). Diese Basenänderung fand
sich bei keinem der Kontrollproben. Sie stellt daher eine Mutation dar.
Fall 24:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 37 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 6858+2 T/C (IVS37+2 T/C) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 37/Anfang von Intron 37
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 37 ist in Abbildung 57a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 57b dargestellt.
Das Exon 37 endet am Nukleotid 6858. Die Basensequenz zeigt eine Änderung an
Nukleotid-Position 6858+2. Dies betrifft die Splice-Region des Exons 37. Die Base
Thymin (T) ist durch Cytosin (C) ersetzt. Dadurch kommt es zu einem inkorrekten SpliceVorgang der mRNA, wodurch eine veränderte Synthese des Proteins resultiert. Die
Basenänderung stellt daher eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
ATAAG GT AATTAC
Mutierte Sequenz:
ATAAG GC AATTAC
Nukleotid: 6858+2
0
1.8
1.9
m
Substitution: T/C Codon 2286 AG/GT-Regel
Abb. 57 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 24 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,76 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit blau eingekreister 6858+2 T/C Splice site Mutation. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
96
3 Ergebnisse
Fall 25:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 13 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 2023 ins C entspricht G675Frameshift
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 13 ist in Abbildung 58a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 58b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung nach Nukleotid-Position 2023. Es ist die Basen
Cytosin (C) eingefügt. Dadurch kommt es ab dem Codon 675, in dem die Base eingefügt
ist, zu einer Verschiebung des Leserasters der Aminosäurentranslation, dem so genannten
Frameshift. Dies stellt somit eine Mutation dar.
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
CCCC CCG ATTTGC
Mutierte Sequenz:
CCCC CCC GATTTG
Nukleotid 2033
0
1.6
1.7
1.8
1.9
m
Insertion C
Codon 678
Abb. 58 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 25 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Der zusätzliche Peak beginnt bei 1,83 min.
b) Dazugehörige Sequenzierung mit grün eingekreister Cytosin-Insertion nach Nukeotid 2033. Das Textfeld zeigt WildtypSequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Insertion an.
Hierdurch kommt es zur Verschiebung des Leserasters und der Translation von 24 falschen
Aminosäuren, bis das Triplett TGA, das für ein Stopp-Codon codiert, zum Abbruch der
Proteinsynsthese führt. Dies ist in Abbildung 59 gezeigt.
97
3 Ergebnisse
Abb. 59: Sequenzen zur Insertion von Fall 25. In Exon 13 (Reihe 1) findet sich im Codon 675 (Reihe 2) in der mutierten
Sequenz (Reihe 5) eine Insertion von Guanin (rot eingerahmt). Dadurch kommt es in der Aminosäuresequenz zu einem
Frameshift (Reihe 6) bis ein Stopp-Codon (X) auftritt. Zum Vergleich sind Wildtyp-Seqzenz (Reihe 3) und die
Aminosäurenfolge des Wildtyp-Proteins (Reihe 4) dargestellt.
Fall 26:
Die DHPLC-Analyse zeigte für das Exon 44 ein von der Norm abweichendes Diagramm. Die
Sequenzierung des Exons ergab folgendes Ergebnis:
Mutation: NF1 c. 7739 C/G entspricht L234S
Das DHPLC-Diagramm zu Exon 44 ist in Abbildung 60a wiedergegeben. Die
dazugehörige Sequenzierung ist in Abbildung 60b dargestellt.
Die Basensequenz zeigt eine Änderung an Position 7739. Die Base Cytosin (C) ist durch
Guanin (G) ersetzt. Das Codon 234, zu dem diese Base gehört, lautet in der WildtypSequenz TCA und codiert für die Aminosäure Leucin (L). Die mutierte Basensequenz
lautet somit TGA und codiert für Serin (S). Diese Basenänderung fand sich bei keinem der
Kontrollproben. Sie stellt daher eine Mutation dar.
98
3 Ergebnisse
mV
1
a)
b)
Wildtyp-Sequenz:
CTGAA TCA AATGT
Mutierte Sequenz:
CTGAA TGA AATGT
Nukleotid: 7739
0
Substitution: C/G
1.8
1.9
Codon 2580
m
Abb. 60 a und b: a) DHPLC Diagramm zu Fall 26 mit gestrichelter Kurve als Referenz. Die X-Achse kennzeichnet die
Dauer in Minuten, die Y-Achse gibt die elektrische Spannung in Millivolt an. Die Kurve stellt sich über den ganzen
Verlauf dünner dar. b) Dazugehörige Sequenzierung mit rot eingekreister 7739 C/G Substitution. Das Textfeld zeigt
Wildtyp-Sequenz, mutierte Sequenz und gibt Codon-, sowie Nukleotidnummer und die Substitution an.
Nach Abschluß der Auswertungen in Freiburg wurden die Sequenzierungen, die von 17
Fällen für die Exons 1-8 und 28-49 in Padua durchgeführt wurden, noch vorgenommen.
Es konnten dabei folgende Mutationen bestätigt werden:
Fall 2: Mutation: NF1 c. 61-1 G/A (IVS2-1 G/A) entspricht einem Basenaustausch der SpliceRegion am Ende von Intron 1/Anfang Exon 2.
Fall 4: Mutation: NF1 c. 6795 ins C entspricht E2255Frameshift in Exon 37.
Fall 10: Mutation: NF1 c. 1062+2 T/C (IVS7+2 T/C) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 7/Anfang von Intron 7.
Fall 21: Mutation: NF1 c. 269 T/C entspricht L90P in Exon 3.
Fall 24: Mutation: NF1 c. 6858+2 T/C (IVS37+2 T/C) entspricht einem Basenaustausch der
Splice-Region am Ende von Exon 37/Anfang von Intron 37.
Fall 26: Mutation: NF1 c. 7739 C/G entspricht L234S.
99
3 Ergebnisse
3.4 Tabellarische Zusammenfassung der Mutationen
Tab. 40: Tabellarische Zusammenfassung der Mutationen aufgelistet in aufsteigender Zahl der Exons.
Fall
Codon
Genomische
Mutation
Konsequenz
MutationsTypus
Exon 2
2
-
61-1 G/A
-
Splice-Defekt
Exon 3
21
90
269 T/C
L90P
Missense
Exon 3
3
93
277 T/C
C93R
Missense
Exon 7
10
-
1062+2 T/C
-
Splice-Defekt
Exon 10b
1
489
1466 A/G
Y489C
Missense
Exon 10b
17
489
1466 A/G
Y489C
Missense
Exon 10c
15
527
1580 del C
T527 Frameshift
Deletion
Exon 13
25
675
2023 ins G
G675 Frameshift
Insertion
Exon 15
7
-
2409+1 G/C
-
Splice-Defekt
Exon 16
5
950
2849 ins TT homo
Q950 Frameshift
Insertion
Exon 22
6
1276
3826 C/T
R1276X
Stopp
Exon 23-2
14
1359
4077 del T
P1359 Frameshift
Deletion
Exon 29
20
-
5537+1 G/T
-
Splice-Defekt
Exon 35
9
-
6641+1 G/A
-
Splice-Defekt
Exon 37
4
2266
6795 ins C
E2255 Frameshift
Insertion
Exon 37
24
-
6858+2 T/C
-
Splice-Defekt
Exon 41
19
2446
7337 C/G
S2446X
Stopp
Exon 44
26
2580
7739 C/G
S2580A
Missense
Exon 45
10
2611
7833 T/A
D2611E
Missense
Lokalisation
s = sporadisch, f = familiär. ins = Insertion, del = Deletion.
100
3 Ergebnisse
3.5 Tabellarische Zusammenfassung der Polymorphismen
Tab. 41: Tabellarische Zusammenfassung I der exonischen Polymorphismen aufsteigend nach der Lokalisation.
Vorkommen in
dieser Studie
Heterozygot
Exon 2
4%
1/26 (4%)
Exon 5
58%
5/26 (19%)
Exon 13
15%
4/26 (15%)
Lokalisation
Homozygot
10/26 (38%)
NukleotidKonsequenz
Substitution
168 C/T
S56S
702 G/A
L234S
2034 G/A
P678P
IVS = intervening sequenze (Introns).
Tab. 42: Tabellarische Zusammenfassung II der intronischen Polymorphismen aufsteigend nach der Lokalisation.
Lokalisation
Vorkommen in
dieser Studie
Heterozygot Homozygot
NukleotidKonsequenz
Substitution
IVS 2
8%
2/26 (8%)
204+51 G/C
Intron
IVS 10c
15%
4/26 (15%)
1641+39 T/C
Intron
IVS 11
4%
1/26 (4%)
1642-88 A/G
Intron
IVS 11
4%
1/26 (4%)
1721+73 C/T
Intron
IVS 17
4%
1/26 (4%)
2851-16 T/C
Intron
IVS 21
19%
4/26 (15%)
3497-88 C/A
Intron
IVS 26
19%
5/26 (19%)
4368-46 G/C
Intron
IVS 28
15%
4/26 (15%)
5205+23 T/C
Intron
IVS 29
23%
6/26 (23%)
5537+19 T/A
Intron
IVS 39
96%
3/26 (12%)
2/26 (8%)
7126+37 C/G
Intron
IVS 39
96%
6/26 (23%)
19/26 (73%
7126+74 T/C
Intron
IVS 42
92%
6/26 (23%)
18/26 (69%)
7395-29 G/A
Intron
IVS = intervening sequenze (Introns).
1/26 (4%)
101
4 Diskussion
4 Diskussion
Die klinische und molekulargenetische Klassifikation von Phäochromozytomen ist das
langjährige Forschungsleitthema der Freiburger Arbeitsgruppe von Prof. Neumann. In diesem
Rahmen ist die vorgelegte Arbeit entstanden. Ziel war es, ein repräsentatives Patientengut mit
Neurofibromatose Typ 1 und Phäochromozytomen zusammenzustellen und mit den
verfügbaren molekulargenetischen Methoden zu charakterisieren.
4.1 Klinische Ergebnisse
Orientierende Eckdaten ergaben sich aus der Perspektive der Neurofibromatose Typ 1 aus der
viel beachteten Übersichtsarbeit von Riccardi aus dem New England Journal of Medicine von
1981,
der
für
das
Zusammentreffen
beider
Erkrankungen
eine
Prävalenz
von
Phäochromozytomen bei Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 von einem Prozent angibt
(Riccardi et al. 1981). Hierdurch ist klar ein überzufälliges Vorkommen der Phäochromozytome
belegt. Eine gemeinsame Ursache lässt sich weiterhin daraus ableiten, dass beide
Erkrankungen neuroektodermalen Ursprungs sind. Die Neurofibromatose Typ 1 ist eine der
häufigsten hereditären Erkrankungen. Die Prävalenz in der Gesamtbevölkerung wird mit
1:3500 angegeben (Huson et al. 1994). Die Durchsicht der medizinischen Literatur mittels der
elektronischen Suchsysteme Medline und Pubmed ergab allerdings für die letzten 20 Jahre
keine Original-Darstellung eines größeren Patientengutes von Neurofibromatose Typ 1
Patienten mit Phäochromozytomen, vielleicht weil für eine anstrebenswerte Zahl von ca. 20
Fällen eine Untersuchung von etwa 2000 Patienten erfordert.
Somit stellte sich die Frage nach der Prävalenz von Phäochromozytomen bei Patienten mit
Neurofibromatose Typ 1. Als Eckdaten stehen Schätzungen im Raum, die von einer
Forschergruppe von den National Institutes of Health in Bethesda mit bis zu 5,7 Prozent
angegeben werden (Walther et al. 1999A). Es lässt sich ableiten, dass für eine Fallzahl von 20
Patienten mit Phäochromozytom und Neurofibromatose Typ 1 eine Sammlung von
mindestens 400 Neurofibromatose-Patienten notwendig ist, um 20 Fälle zu finden. Da solche
Registerzahlen bislang nur von Fahsold et al. (2000) bekannt sind, dürfte dies die Erklärung
sein, dass eine umfassende Darstellung dieser Erkrankungskombination bislang nicht
existiert. Möglicherweise sind die angegebenen Eckdaten auch zu hoch angesetzt.
Das Freiburger Internationale Phäochromozytom Register hat sich von einer regionalen
Sammlung der in Freiburg operierten Patienten über ein überregionales Register (Neumann et al.
1993) zu einem internationalen Register entwickelt, das bis 2002 neben familiären Fällen 274
102
4 Diskussion
nicht syndromale Phäochromozytome umfasste (Neumann et al. 2002A). Das Register wurde in
der Folgezeit durch Meldung von zahlreichen Zentren ergänzt, wobei systematische
epidemiologische Arbeiten in Zentral-Polen einen wesentlichen Anteil ausmachten. Damit
waren gute Voraussetzungen für die Thematik dieser Dissertation gegeben. Beim Start dieser
Arbeit waren 12 Fälle von Neurofibromatose Typ 1 und Phäochromozytom registriert. Durch
gezielte Weitergabe des neuen Interessenschwerpunktes konnten in der Folge 8 Fälle aus
Italien, 3 Fälle von einer kasuistischen Publikation aus Lübeck und 1 Fall aus der Schweiz
aufgenommen werden. Die regelmäßig weiter erfolgten Meldungen erbrachten weitere 2
Patienten aus Behandlungszentren in Lothringen und Deutschland, wobei letztere Patientin
aus Kuwait stammte. Damit gelang es, zum Aufnahmeschlussdatum 15.05.05 insgesamt 26
Fälle von Phäochromozytomen bei Neurofibromatose Typ 1 zu registrieren. Der Registerstand
aller Phäochromozytome, d.h. aller Patienten mit funktionell aktiven Tumoren von
Nebennierenmark und der Paraganglien in Abdomen und Thorax betrug zu diesem Zeitpunkt
624 Fälle. Zieht man hiervon die Fälle mit syndromalen Phäochromozytomen ab, so
verbleiben 397 Fälle. Bezogen auf dieses Patientengut beträgt die Prävalenz von
Neurofibromatose
Typ
1
-
Phäochromozytomen
im
Freiburger
Internationalen
Phäochromozytom-Register 26/397 und somit 6,5%. Dieser Wert ist aufgrund der gezielten
Anfragen nach solchen Patienten als zu hoch einzuschätzen und lässt sich somit nicht
verallgemeinern. Betrachtet man den Zeitpunkt der Diagnose der Neurofibromatose Typ 1Phäochromozytom Fälle unter der Prämisse, dass in einem gegebenen geographischen Raum
die jährliche Erkrankungsrate konstant sein sollte (siehe Fallbeschreibungen und Tab. 43), so
zeigen sich zwar keine überdurchschnittlichen Schwankungen pro Jahr, aber unklare
geographische Grenzziehungen, womit die Aussagekraft der Prävalenzangabe von 6,5%
weiter relativiert werden muss.
Tab. 43: Diagnose und Herkunftsland der Patienten
Fall
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Diagnosejahr
Herkunftsland
1995
2003
1994
2004
1985
1999
1999
2000
1990
1988
2002
1996
2002
Deutschland
Deutschland
Deutschland
Kuwait
Deutschland
Deutschland
Deutschland
Deutschland
Schweiz
Italien
Italien
Italien
Italien
Fall
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
Diagnosejahr
Herkunftsland
2001
2004
2004
2001
2004
1987
1997
1990
1992
2003
1993
1986
1990
Italien
Italien
Italien
Italien
Frankreich
Großbritannien
Polen
Polen
Polen
Polen
Polen
Polen
Polen
103
4 Diskussion
Zusammenfassend konnten für diese Arbeit 26 Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 und
Phäochromozytom zusammengestellt werden. Es sind 15 Frauen und 11 Männer. Das Alter
bei Diagnose rangiert zwischen 14 und 61 Jahren und lag im Mittel bei 41 Jahren. Alle
Patienten zeigten adrenale Tumoren. Kein Patient hatte extraadrenale Tumoren. Multiple
Tumoren wiesen 5 Patienten auf. Maligne Tumoren lagen bei 2 Patienten vor. Die Metastasen
waren in Lungen und Knochen lokalisiert. Ein Patient erlag dem Tumorleiden.
Im Folgenden werden die Ergebnisse als „Freiburg-Studie“ bezeichnet.
Wie oben ausgeführt existieren ähnliche Fallsammlungen als Originalpublikation eines
Zentrums oder eines Forschungskonsortiums nicht. Allerdings haben Walther et al (1999A)
148 Fallberichte der Literatur ausgewertet, nachdem sie eine große elektronische Suche für
die Stichworte „Neurofibromatose“ und „von Recklinghausen“ der Jahre 1966 bis 1999
durchführten („Walther-Studie“ im Folgenden genannt). Die Ergebnisse werden im Vergleich
mit der Freiburg-Studie in der Tabelle 44 gegenübergestellt.
Das Durchschnittsalter der Patienten lag bei der Walther-Studie mit 42 Jahren im gleichen
Bereich wie in der Freiburg-Studie (41 Jahre).
In der Freiburg-Studie waren 9% der Patienten symptomfrei. Eine Hypertonie fand sich in
der Walther-Studie nur bei 61%, während in der Freiburg-Studie 85% der Patienten erhöhte
Blutdruckwerte aufwiesen. 61% der Patienten der Walther-Studie gaben Symptome an, die
dem Phäochromozytom zugerechnet werden können; in der Freiburg-Studie waren es 74%.
22% der Patienten der Walther-Studie wiesen keine Phäochromozytom-assoziierten
Symptome auf, in der Freiburg-Studie waren es 25%.
In der Walther-Studie hatten 84 % unilaterale und 10% bilaterale adrenale
Phäochromozytome. In der Freiburg-Studie wiesen 81% unilaterale und 19% bilaterale
Phäochromozytome auf. Diese Unterschiede sind nicht erheblich. Sie könnten aber auch
durch die Entwicklung der diagnostischen Möglichkeiten erklärt werden. Das Review von
Walther et al. (1999A) geht bis in das Jahr 1966 zurück. Die MRT, die MIBG-Szintigraphie
und die PET, die die höchste Sensitivität in der Phäochromozytom-Diagnostik aufweisen,
wurden erst ab den 90er Jahren in größeren medizinischen Zentren regelmäßig bei den
gegebenen Fragestellungen eingesetzt. Extraadrenale Phäochromozytome werden in der
Walther-Studie mit 6%, in der Freiburg-Studie aber gar nicht beobachtet. Dies lässt vermuten,
dass extraadrenale Phäochromozytome bei Neurofibromatose Typ 1 sehr selten vorkommen.
104
4 Diskussion
Erwähnt werden soll in diesem Zusammenhang die klinische Studie zu Neurofibromatose Typ
1 und Phäochromozytom von Kalff et al. (1982). Sie untersuchten Neurofibromatose Typ 1 –
Patienten, die einen Hypertonus aufwiesen. Bei 10 von 18 hypertensiven Patienten
diagnostizierte man ein Phäochromozytom. In der Kalff-Studie sind Angaben zu
Durchschnittsalter, Lokalisation, Dignität und Symptomen ähnlich wie in der Freiburg-Studie
(Tab. 44).
Eine maligne Entartung zeigten in der Freiburg-Studie 8%, in der Walther-Studie 12% und
in der Kalff-Studie 10% der Patienten.
Tab. 44: Tabellarischer Vergleich der Ergebnisse der Freiburg-Studie und zwei anderen Studien.
Patienten (n)
Alter bei Diagnose
Durchschnittsalter
Multi-fokal
Unilateral adrenal
Bilateral adrenal
Extraadrenal
Malignität
Symptomfrei
Hypertonus
Phäochromozytomassoziierte Symptome
NF1
(diese Arbeit)
NF 1
(Walther et al. 1999A)
NF 1
(Kalff et al. 1982)
26
14-61 Jahre
41 Jahre
19%
81%
19%
0%
8%
9%
85%
74%
148
2-74 Jahre
42 Jahre
17%
84%
10%
6%
12%
22%
61%
61%
10
15-62 Jahre
42 Jahre
20%
80%
20%
0%
10%
10%
90%
80%
Zu den Phäochromozytom-assoziierten Symptomen zählen Kopfschmerz, Palpitationen und Schweißausbrüche. Angaben
nach Walther et al. (1999A) und Kalff et al. (1982).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich für mittleres Alter bei Diagnose, multifokale
Phäochromozytome und Malignität nur sehr geringe Abweichungen zeigen. Dagegen sind in
der Walther-Studie 6% extraadrenale Phäochromozytome aufgeführt, die weder in der
eigenen Serie noch in der Kalff-Studie vorkamen. Bemerkenswert erscheint, dass
Phäochromozytome lange keine Symptome verursachen können; der Anteil der Patienten lag
in den Studien zwischen 9% und 22%.
Die Einteilung der Neurofibromatose Typ 1 der WHO nach Schwergraden von Riccardi und
Eichner (1992) in minimal (Grad 1), mild (Grad 2), moderat (Grad 3) und schwer (Grad 4)
wurde im eigenen Patientengut wegen weitgehend fehlender entsprechender Angaben nicht
durchgeführt.
105
4 Diskussion
4.1.1 Phäochromozytom-assoziierte Syndrome
Phäochromozytome
kommen
sporadisch
oder
familiär
vor.
Die
familiären
Phäochromozytome haben somit eine genetische Ursache. Die Begriffe familiär bedingte und
genetisch verursachte Phäochromozytome werden oft synonym verwendet. Man muss jedoch
beachten, dass auch als Einzelfälle beobachtete Patienten mit Phäochromozytomen durchaus
eine entsprechende Anlage aufweisen können. So zeigte die Freiburger Arbeitsgruppe, dass
von 274 nicht syndromalen, d.h. sporadischen Phäochromozytomen bei 24% eine Mutation
im Blut nachweisbar war (Neumann et al. 2002A). Dies sind sog. Keimbahnmutationen oder
konstitutionelle Mutationen, die sich mit molekulargenetischen Techniken, ähnlich wie in
dieser Arbeit beschrieben, in den Genen VHL, RET, SDHB oder SDHD (siehe unten)
nachweisen lassen. Mutationen in den genannten Genen liegen in der Regel nicht nur den
Phäochromozytomen sondern komplexen Krankheitsbildern zugrunde, die im Folgenden kurz
beschrieben werden.
Im von Hippel-Lindau Syndrom (VHL) kommen - neben Phäochromozytomen - retinale
Angiome, Hämangioblastome des Zentralnervensystems (vorwiegend Kleinhirn, Hirnstamm
und Rückenmark), Nierenkarzinome, Nierenzyste, Pankreaszyste, Inselzelltumore und
Nebenhodenzystadenome vor. Andere zystische oder neoplastische Läsionen sind selten. Das
Phäochromozytom tritt nicht bei allen VHL-Patienten auf; die Angaben schwanken; im Mittel
werden 20% angegeben. Das zugrunde liegende Gen wird VHL genannt. Die Charakteristika
der VHL-assoziierten Phäochromozytome werden in Tab. 45 gezeigt.
Die Multiple Endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN 2) ist charakterisiert durch das Auftreten
von C-Zelltumoren der Schilddrüse (medulläres Schilddrüsenkarzinom) kombiniert mit
Phäochromozytomen in ca. 50 % der Fälle. Die MEN 2 entsteht auf dem Boden
konstitutioneller Mutationen des 21 Exons umfassenden RET-Gens. Bei Patienten mit
Phäochromozytom wurden Mutationen nur in den Exons 10, 11 und 16 gefunden (Eng et al.
1996, Neumann et al. 2002A).
Die häufigste Form MEN 2A zeigt in 15% einen
Hyperparathyreoidismus. Bei der seltenen MEN 2B fehlt die Nebenschilddrüsenbeteiligung,
dafür treten eine Schleimhautganglioneuromatose und ein marfanoider Habitus hinzu. Der
dritte Subtypus, familiäres medulläres Schilddrüsenkarzinom (FMTC), zeigt keine weiteren
Endokrinopathien. Die Charakteristika der MEN 2-assoziierten Phäochromozytome werden in
Tab. 45 gezeigt.
Das Paragangliom Syndrom Typ 1 (PGL 1) wurde anhand familiär auftretender
Paragangliome der Hals-Schädelbasisregion beschrieben. Es entsteht auf dem Boden von
Mutationen des so genannten SDHD Gens. Dabei steht SDH für das im Zitratzyklus und in
106
4 Diskussion
der Atmungskette zentral bedeutsame Enzym Succinatdehydrogenase und D für die nach
Buchstaben benannten Untereinheiten, hier also für die Untereinheit D (Baysal et al. 2000). Kurz
nach dieser Beschreibung wurden von der Freiburg-Columbus/Ohio-Kooperationsgruppe
Mutationen des SDHD Gens auch bei Patienten mit Phäochromozytomen beschrieben (Gimm et
al. 2000). Andere Organe sind beim PGL 1 nicht involviert. Die Charakteristika der PGL 1-
assoziierten Phäochromozytome werden in Tab. 45 gezeigt.
Das
Paragangliom
Syndrom
Typ
4
(PGL
4)
beruht
auf
Mutationen
der
Succinatdehydrogenase Untereinheit B (Astuti et al. 2001). Die PGL 4 stellt die jüngste Entität
dar und korreliert nach neuesten Erkenntnissen neben dem Phäochromozytom in seltenen
Fällen auch mit dem Auftreten von Nierenkarzinomen (Vanharanta et al. 2004). Die
Charakteristika der PGL 4-assoziierten Phäochromozytome werden in Tabelle 45 gezeigt.
Tab. 45: Vergleich der Phäochromozytom-assoziierten Syndrome
MEN 2
VHL
SDHD
(PGL1)
SDHB
(PGL4)
36 Jahre
18 Jahre
29 Jahre
26 Jahre
41 Jahre
44
67%
58%
74%
28%
19%
5%
Adrenal
fast immer
adrenal
88%
53%
28%
100%
78%
Extraadrenal
Abdominal
sehr selten
12%
21%
50%
0%
6%
Thorakal
sehr selten
selten
18%
9%
0%
1%
Paragangliome des
Halses und der
Schädelbasis
sehr selten
sehr selten
79%
31%
0%
0%
4%
sehr selten
sehr selten
35%
8%
10%
Durchschnittsalter
Multifokal
Malignität
Assoziierte
Tumoren
Gen-Name
Gen-Lokalisation
Nr. Exons
Hämangiome
medulläres
HämangioSchilddrüsen
blastome
karzinom
Nieren-,
HyperparaPankreasthyreoidiszysten
mus
Nierenkarzino
me
NF1
Nicht(diese Studie) Syndromal
keine
Neurofibrome,
Assoziation NierenzellIrishamartome,
mit anderen karzinom
Optikusgliome
Tumoren
-
RET
VHL
SDHD
SDHB
NF1
ohne
10q11.2
3p25-26
11q23
1p36
17q11.2
-
21
3
4
8
57
-
Angaben nach Neumann et al. (2002A), Pawlu et al. (2005) und Manger und Gifford (2002)
107
4 Diskussion
Alle vier Syndrome werden autosomal dominant vererbt. Als Besonderheit gibt es beim
Paragangliom Syndrom Typ 1 (PGL 1) den „parent of origin-effect“: Es entwickeln sich nur
Tumoren bei Personen, die die Mutation vom Vater erben. Mutationsträger, deren Mütter die
Mutation weitergaben, bleiben gesund. Allen diesen Syndromen ist das Auftreten der
Phäochromozytome gemeinsam. Die Unterschiede lassen sich aus Tabelle 45 ableiten.
Das Alter bei Diagnose des Phäochromozytoms liegt bei der MEN 2 unter 30 Jahren (Nguyen
et al. 2001), bei VHL Patienten um 30 Jahre (Bauters et al. 2003) und bei PGL 1 und PGL 4 im
Bereich von 31 Jahren (Neumann et al. 2002A). Bei der Neurofibromatose Typ 1 liegt nach der
Freiburg-Studie der Durchschnitt bei 41 Jahren. Damit ist das mittlere Alter ähnlich hoch wie
bei Patienten mit sporadischem Phäochromozytom (44 Jahre, Tab. 45).
Die Lokalisation der Phäochromozytome ist bei der MEN 2 fast immer adrenal (Bryant et al.
2003). Multifokale Tumoren kommen bei der MEN 2 in 67% der Patienten vor (Modigliani et al.
1995). Im VHL-Syndrom überwiegen mit 88% adrenale Phäochromozytome, wovon 58%
multifokal auftreten (Walther et al. 1999B). Dagegen sind beim PGL 4 nur etwa 28% der
Phäochromozytome adrenal lokalisiert. Extraadrenale Tumoren fanden sich abdominal bei
50% und thorakal bei 9% der Patienten mit PGL 4 (Neumann et al. 2002A). Beim PGL1 treten
extraadrenale abdominale Phäochromozytome bei 21% und thorakale bei 18% der Patienten
auf. Multiple Tumoren finden sich beim PGL1 in 74% der Patienten (Neumann et al. 2002A).
Differierend hierzu zeigen Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 seltener multiple
Phäochromozytome (in der Freiburg-Studie 19%).
Die Malignität der Tumoren liegt bei MEN 2 in 4% (Modigliani et al. 1995). Auch beim VHLSyndrom entarten die Phäochromozytome selten. Bei PGL 4 hingegen kommt es in 35% zu
maligner Entartung (Neumann et al. 2002A). Für die PGL 1 sind maligne Phäochromozytome
nicht beschrieben. Bei der Neurofibromatose Typ 1 traten in der Freiburg-Studie bei 8% der
Patienten maligne Phäochromozytome auf .
Von besonderem Interesse ist Fall 17. Es besteht zweifelsfrei eine Neurofibromatose Typ 1
und
ein
adrenales
Phäochromozytom.
Darüber
hinaus
wurde
ein
medulläres
Schilddrüsenkarzinom operiert und histologisch gesichert. Des Weiteren wurde ein
Nebenschilddrüsenadenom bei Hyperparathyreoidismus entfernt und ebenfalls histologisch
gesichert. Es liegt also das eigentümliche Zusammentreffen einer Neurofibromatose Typ 1
und einer Multiplen Endokrinen Neoplasie Typ 2 vor. Ähnliche Beobachtungen sind in der
verfügbaren Literatur nicht zu finden.
4 Diskussion
108
4.2 Molekulargenetische Ergebnisse
Die molekulargenetischen Untersuchungen, die den Ergebnissen dieser Arbeit zugrunde
liegen, erfolgten mit der derzeit modernsten Technik unter Berücksichtigung einer
Optimierung der notwendigen Arbeitszeit und der vertretbaren Kosten. Die wesentlichen
Schritte waren DNA-Extraktion aus Blutproben und ein Suchverfahren (Mutationsscreening),
um die teure und hinsichtlich Auswertung aufwendige Sequenzierung auf das Nötigste zu
minimieren.
Als Screeningverfahren wurde die Denaturing High Performance Liquid Chromatography
(DHPLC) eingesetzt (Gerät WAVE der Firma Transgenomics). Mit diesem Verfahren werden
zuvor durch PCR amplifizierte DNA-Abschnitte durch Schmelzkurven abgebildet und DNASequenzvarianten in Kurvenabweichungen erkennbar. Im Vergleich zur bislang im Labor der
Arbeitsgruppe eingesetzten Single Strand Confirmation Polymorphism (SSCP) Methode
arbeitet das WAVE-Gerät vollautomatisch und wesentlich schneller. Der programmierte
Ablauf erlaubt ein Beladen des Gerätes mit Probenserien mehrfach am Tag, womit auch die
Nachtstunden genutzt werden können. Als grober Anhalt kann die Zeitersparnis auf ein
Fünftel des bisherigen Zeitaufwandes genannt werden. Die Trefferquoten für die Detektion
bekannter Mutationen (Sensitivität) werden für die DHPLC-Methode mit etwa 99%
angegeben (Oefner et al. 1998). Durch diese technischen Neuerungen wurde es möglich, große
Gene in einer Serie von Probanden zu untersuchen, was zuvor von führenden Gruppen anhand
der SSCP und vergleichbaren Methoden nicht für durchführbar gehalten wurde. Zu derart
großen Genen zählt das NF1-Gen mit insgesamt 57 Exons.
Ein weiteres großes Problem der Analyse des NF1-Gens ist das Vorkommen vieler so
genannter Pseudogene. Hierunter versteht man Sequenzen der DNA, die weitestgehende
Übereinstimmungen mit Abschnitten des NF1-Gens aufweisen. Es besteht somit die
Möglichkeit, dass bei der DNA-Amplifikation – in der Regel eines Exons – mit
entsprechenden Primern Abschnitte von Pseudogenen mitamplifiziert werden und die
Ergebnisse somit verfälscht sind. Die Zahl der Pseudogene des NF1-Gens liegt bei 36 (Luijten
et al. 2001).
Im Labor in Padua hat der Verfasser in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Schiavi die Analyse des
NF1-Gens begonnen, aber nicht vollständig abschließen können. Im Freiburger Labor wurde
schließlich eine Wissenschaftlerin als Hauptmitarbeiterin und Volltagskraft, Frau Dr. Bausch,
gewonnen, die die molekulargenetischen Untersuchungen mittels der neuen Methode, der
109
4 Diskussion
DHPLC, durchgeführt hat und dabei auffällige Exons sequenziert hat. Nach Fertigstellung der
Analysen von Frau Dr. Bausch hat der Verfasser die Sequenzierungsdaten des Labors aus
Padua noch auswerten können. Dies ermöglichte einen Vergleich bzw. eine Bestätigung der
Freiburger Befunde.
Die Ergebnisse der Analysen der 26 Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 und
Phäochromozytom zeigten in 18 Fällen 19 Mutationen. Eine Mutation kam zweimal vor.
Diese 18 verschiedenen Mutationen sind in Abbildung 61 graphisch hinsichtlich ihrer
Lokalisation im NF1-Gen dargestellt (vgl. auch Tab. 40). Es zeigt sich, dass die Mutationen
auf das gesamte Gen verteilt sind. Dabei liegen in 13 Exons eine Mutation und in 3 Exons 2
Mutationen. Protein-verkürzende Mutationen kamen 13x vor. Dabei handelte es sich 2x um
Stopp-Codons, 3x um Insertionen von einem oder zwei Nukleotiden, 2x um Deletionen von
einem Nukleotid und 6x um Splice site Mutationen. 6 Mutationen waren Missense
Mutationen (einschließlich der Mutation NF1 c. 1466 A/G, siehe unten) nach dem Abgleich
mit den Befunden von 100 gesunden Probanden (siehe Methodik).
Folgende Besonderheiten wurden beobachtet:
1. Ein Fall (Fall 10) wies eine Splice site Mutation (NF1 c. 1062+2 T/C) und eine
Missense Mutation (NF1 c. 7833 T/A) auf. Die Interpretation ist schwierig. Es ist sehr
ungewöhnlich, dass neben einer Splice site Mutation eine Missense Mutation beim
selben Patienten vorkommt. Es kann ein sehr seltener Polymorphismus nicht
ausgeschlossen werden. Die Entscheidung bleibt bis auf weiteres offen.
2. Die Mutation NF1 c. 1466 A/G (Fall 1 und 17) ist nur formal eine Missense Mutation,
weil das neue Codon für eine Aminosäure codieren könnte. Jedoch bildet sich durch
die neue Nukleotidsequenz eine Splice site AG-GT, die zu einem Verlust von 62 bp
führt. Dies wurde von Messiaen et al. (1999) durch RNA-Analyse gezeigt.
3. Die Insertion NF1 c. 2849 ins TT ist homozygot. Homozygote Mutationen kommen in
der Regel nur bei autosomal-rezessiven Erkrankungen vor. Die Analyse müsste auf die
Eltern ausgedehnt werden, um weitere Erkenntnisse zu erhalten. Leider war dies nicht
möglich. Das Verständnis dieser Veränderung bleibt somit offen. Phänotypisch
unterscheidet sich der zugehörige Fall 5 von den anderen 25 Fällen nicht.
Nur drei der festgestellten Mutationen sind in der Literatur beschrieben:
1. NF1 c. 61-1 G/A von Fahsold et al. (2000)
2. NF1 c. 1466 A/G von Fahsold et al. (2000)
3. NF1 c. 3826 C/T von Heim et al. (1995)
Somit sind 15 Mutationen in dieser Dissertation neu beschrieben.
4 Diskussion
110
Abb. 61: Schematische Darstellung der Lokalisation der in dieser Arbeit detektierten Mutationen. Grau
unterlegt ist die Serin-Cystein-reiche Domäne zwischen Exon 11 und 17. Grün unterlegt die “GAP-related
Domain” (GRD). * = in der Literatur beschrieben.
111
4 Diskussion
3 DNA-Varianten innerhalb der Exons 2, 5 und 13 waren auch bei 100 Normalkontrollen
vorhanden; dies sind somit Polymorphismen. Die nachträglich erfolgte Auswertung der
Sequenzierungsdaten aus Padua ergab, dass 6 Mutationen bestätigt werden können. Die
anderen in Freiburg gefundenen Mutationen lagen in Exons, die in Padua nicht analysiert
wurden, oder sie fanden sich bei Fällen, die in Padua nicht sequenziert wurden.
Die Detektionsrate der Freiburg-Studie für intraexonische Mutationen lässt sich mit 18/26 =
69% angeben (18 Mutationen bei 26 Patienten). Warum 31% der Mutationen nicht gefunden
wurden, kann drei Gründe haben. Am wahrscheinlichsten ist, dass Deletionen größerer DNAAbschnitte vorliegen. Solche Deletionen entziehen sich der DNA-Amplifikation und somit
der Analyse mit der eingesetzten Methodik. Zweitens kann die DHPLC nicht zur Aufdeckung
geführt haben, weil die Sensitivität „nur“ 99%, nicht 100% beträgt. Drittens ist es möglich,
dass Patienten mit Neurofibromatose Typ 1 ein Mosaik aufweisen (genomische Unterschiede
verschiedener Körperzellen), so dass in den untersuchten Blut-Lymphozyten, aus denen die
DNA stammt, die Mutation nicht vorgelegen hat und somit nicht erkennbar war.
Zahlreiche Publikationen wurden inzwischen vorgelegt, in denen über Mutationen des NF1Gens berichtet wurde. Hieraus wurden acht Arbeiten herausgegriffen, die einen ähnlichen
Ansatz wie die Freiburg-Studie hatten. Dies war die komplette Analyse des NF1-Gens auf
intraexonische Mutationen in einem größeren Patientengut. In Tabelle 46 sind diese Arbeiten
aufgelistet mit Zahl der untersuchten Probanden, Methodik und wesentlichen Ergebnissen.
Ähnlich wie in der Freiburg-Studie wurde die DHPLC bislang nur in den Studien von Han et
al. (2001), de Luca et al. (2003) und Upadhyaya et al. (2004) zum Mutationsscreening
eingesetzt, während die anderen Studien auf weniger sensitive Methoden wie SSCP,
Sequenzierung (DGS), Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH), Heteroduplex-Analyse
(HDA) oder Temperature Gradient Gel Electrophoresis (TGGE), sowie Protein Truncating
Test (PTT) beruhten.
112
4 Diskussion
Tab. 46: Zusammenfassung der im Text beschriebenen Studien zur Mutationssuche im NF1-Gen.
NF1Patienten
Methodik
Kern-Ergebnisse
Upadhyaya et al. (1997)*
320
HDA, SSCP
16 Mutationen in der GRD, 14 neue
Mutationen
Abernathy et al. (1997)
67
HDA, SSCP
Detektionsrate 19%; 13 Mutationen in 45
Exons
Messiaen et al. (1999)**
232
PTT
9 Mutationen in Exon 10b
Messiaen et al. (2000)**
67
PTT, FISH
Detektionsrate aller Methoden zusammen
95%; 32 neue Mutationen,
Fahsold et al. (2000)
521
TGGE, DGS
Detektionsrate 53%; 161 neue Mutationen
u.a. der GRD
Han et al. (2001)*
111
DHPLC
Sensitivität DHPLC 97%; Detektionsrate
68%; 22 neue Mutationen
De Luca et al. (2003)
40
DHPLC
Detektionsrate 72%; 18 neue Mutationen
Upadhyaya et al. (2004)*
43
DHPLC
Detektionsrate 58%; 11 neue Mutationen
Freiburg-Studie (2005)
26
DHPLC
Nur Patienten mit NF1 und
Phäochromozytom; Detektionsrate 69%; 15
neue Mutationen
Autoren
* = Ein Zentrum, daduch Überschneidungen der NF1-Patienten möglich; ** = Überschneidungen der NF1-Patienten möglich.
HDA = Heteroduplex-Analyse; SSCP = Single Strand Confirmation Polymorphism; PTT = Protein Truncation Test; FISH =
Fluoreszenz in situ Hybridisierung; TGGE = Temperature Gradient Gel Electrophoresis; DGS = Direct Genome Sequencing.
All diese Serien wurden darauf geprüft, ob es Abschnitte im NF1-Gen gibt, in denen
Mutationen gehäuft auftreten. Dies ist z.B. für das RET-Gen, das der MEN 2 zugrunde liegt
(siehe oben), bekannt. Über 90% der Mutationen liegen im Exon 11, Codon 634. Solche
„Hotspots“ sind allein schon aus praktischen Gesichtspunkten interessant, weil bei gegebener
klinischer Befundkonstellation die Analyse auf Hotspots konzentriert werden kann. Hotspots
im NF1-Gen wurden diskutiert für Exon 31 und 37 von Upadhyaya und Cooper (1998), Exon
10b von Messiaen et al. (1999), Exon 4b und Exon 37 von Fahsold et al. (2000) und Exons
10a-10c und 37 zusammen geben Messiaen et al 30 % an. In der Freiburg-Studie sind es 5/19
Mutationen, d.h. 26%. Ein anderer interessanter Aspekt ist die Frage, ob Mutationen gehäuft
in Regionen des NF1-Gens vorkommen, denen nach derzeitigem Wissenstand besondere
Funktionen zugeschrieben werden. Hier sind zu nennen die so genannte GAP-related Domain
(GRD) in Exons 20-27a (vergleiche Einleitung) und eine Cystein/Serin-reiche Domäne in den
Exons 11 bis 17, die ATP-Bindung anregen kann (Fahsold et al. 2000). Fahsold et al. (2000)
identifizierten 28 verschiedene Mutationen (10%) in der GRD und in der Cystein/Serinreichen Domäne. De Luca et al. (2003) beschrieben 4 Mutationen (19%) in der GRD und 9 in
der Cystein/Serin-reichen Region (31%). In der Freiburg-Studie sind es in der GRD 2/19
Mutationen (11%) und in der Cystein/Serin-reichen Region 3/19 Mutationen (16%).
113
4 Diskussion
Alle diese Studien und weitere wie die von Carey et al. (1999) und von Rasmussen et al.
(2000) suchten nach Geno-Phänotyp-Beziehungen. Es ließen sich aber keine Besonderheiten
herauskristallisieren.
Wie schon eingangs dieser Diskussion gesagt, findet sich zur Thematik Neurofibromatose
Typ 1 und Phäochromozytom nur die Studie von Kalff et al. (1982) mit 10 Fällen. Eine
entsprechende molekulargenetische Analyse wird mit der Freiburg-Studie erstmals
präsentiert. Spezielle Regionen des NF1-Gens, die ursächlich mit der Entstehung des
Phäochromozytoms in Zusammenhang gebracht werden können, lassen sich nach Abgleich
mit den Mutationen der diskutierten Studien und der Zusammenfassung aller bekannten
Mutationen unter http://www.hgmd.org, den über 600 Mutationen der Human Genome
Mutation Database des Institutes für Medizinische Genetik der Universität Cardiff, nicht
erkennen. Mit einer Detektionsrate von 69% liegt die Freiburg-Studie international
methodisch an der Spitze. Diese Quote wird sicherlich noch ansteigen, wenn die im Aufbau
begriffene Analyse des NF1-Gens mittels Real Time PCR auf größere Deletionen ausgewertet
werden kann. Wie das überzufällige Zusammentreffen von Neurofibromatose Typ 1 und
Phäochromozytom zu erklären ist, muss daher anderen Studien überlassen werden.
114
115
5 Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Phäochromozytome sind Tumoren des Nebennierenmarkes, die Katecholamine produzieren
und sezernieren. Die Tumorsyndrome, bei denen ein Phäochromozytom vorkommt, sind:
Multiple endokrine Neoplasie Typ 2 (MEN 2), von Hippel-Lindau Syndrom (VHL), die
Paragangliom-Syndrome Typ 1 und Typ 4 sowie die Neurofibromatose von Recklinghausen
(NF1); die Inzidenz von Phäochromozytomen bei NF1 beträgt 0,1 – 5,7 %. Die NF1 ist eine
autosomal dominante Erkrankung, deren Inzidenz bei 1:3500 Lebendgeburten liegt. Sie wird
klinisch diagnostiziert.
Ziel der Arbeit war es, eine hohe Zahl an Fällen klinisch zu charakterisieren und Mutationen
des NF1-Gens zu bestimmen.
Aufnahmekriterium war die klinisch gesicherte Neurofibromatose Typ 1 und das
Vorhandensein eines Phäochromozytom. Die klinischen Daten der Patienten wurden
gesammelt und dargestellt. Bis zum 15. Mai 2005 sind 26 Fälle in die Studie aufgenommen
worden. 8 Fälle stammen aus Deutschland, ebenso viele aus Italien, 7 aus Polen, ein Fall
jeweils aus Frankreich, der Schweiz und England. Als relevante klinische Daten wurden die
allgemeinen Patientendaten, die Eigen-, die Familien-, sowie die aktuelle Anamnese, die
klinischen Untersuchungsbefunde, die Diagnostik, sowie die Therapie und der Verlauf
erhoben. 5/26 Patienten (19%) hatten bilaterale Phäochromozytome. Es fanden sich keine
extraadrenalen Phäochromozytome. In 2 Fällen (8%) kam es zur malignen Entartung.
Molekulargenetisch wurden die Analysen des NF1-Gens mittels „Denaturing High
Performance Liquid Chromatography“ (DHPLC) und Sequenzierung durchgeführt. Die
Amplifikation der vielen Pseudogene des NF1-Gens wurde durch Allel-spezifische PCR
ausgeschlossen.
In den 26 Fällen wurden bei 18 Patienten 19 Mutationen identifiziert, wovon 15 erstmals
beschrieben wurden. Darunter waren 8 Basensubstitutionen; davon führten 2 zum Abbruch
der Proteinbiosynthese, während 6 einen Aminosäureaustausch bewirkten. Weiterhin fanden
sich 2 Deletionen und 3 Insertionen von 1 oder 2 Nukleotiden, die zum Verschieben des
Leserasters führen. Splice Defekte wurden in 6 Fällen identifiziert. Die Mutationen fanden
sich in den Exons 2, 3(2x), 7, 10b(2x), 10c, 13, 15, 16, 22, 23-2, 29, 37(2x), 41 und 44. Dies
ist die bisher einzige Studie einer größeren Serie von Phäochromozytomen bei
Neurofibromatose Typ 1. Die Detektionsrate der NF1-Mutationen mittels DHPLC ist 69%
und liegt damit international an der Spitze.
116
117
6 Literaturverzeichnis
6 Literaturverzeichnis
Abernathy CR, Rasmussen SA, Stalker HJ, Zori R, Driscoll DJ, Williams CA,
Kousseff BG, Wallace MR (1997)
NF1 mutation analysis using a combined heteroduplex/SSCP approach.
Hum Mutat 9: 548-54
Astuti D, Latif F, Dallol A, Dahia PL, Douglas F, George E, Skoldberg F, Husebye ES,
Eng C, Maher ER (2001)
Gene mutations in the succinate dehydrogenase subunit SDHB cause susceptibility to
familial pheochromocytoma and to familial paraganglioma.
Am J Hum Genet 69: 49-54
Averbuch SD, Steakley CS, Young RC, Gelmann EP, Goldstein DS, Stull R, Keiser
HR (1988)
Malignant
pheochromocytoma:
effective
treatment
with
a
combination
of
cyclophosphamide, vincristine, and dacarbazine.
Ann Intern Med 109: 267-73
Bauters C, Vantyghem MC, Leteurtre E, Odou MF, Mouton C, Porchet N, Wemeau
JL, Proye C, Pigny P (2003)
Hereditary phaeochromocytomas and paragangliomas: a study of five susceptibility
genes.
J Med Genet 40: e75
Baysal BE, Ferrell RE, Willett-Brozick JE, Lawrence EC, Myssiorek D, Bosch A, van
der Mey A, Taschner PE, Rubinstein WS, Myers EN, Richard CW 3rd, Cornelisse CJ,
Devilee P, Devlin B (2000)
Mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in hereditary paraganglioma.
Science 287: 848-51
6 Literaturverzeichnis
118
Breathnach R, Benoist C, O'Hare K, Gannon F, Chambon P (1978)
Ovalbumin gene: evidence for a leader sequence in mRNA and DNA sequences at the
exon-intron boundaries.
Proc Natl Acad Sci U S A 75: 4853-7
Bryant J, Farmer J, Kessler LJ, Townsend RR, Nathanson KL (2003)
Pheochromocytoma: the expanding genetic differential diagnosis.
J Natl Cancer Inst 95: 1196-204
Campbell L, Mouratidis B, Sullivan P (1996)
Improved detection of disseminated pheochromocytoma using post therapy I-131 MIBG
scanning.
Clin Nucl Med 21: 960-3
Carey JC, Viskochil DH (1999)
Neurofibromatosis type 1: A model condition for the study of the molecular basis of
variable expressivity in human disorders.
Am J Med Genet 89: 7-13
Cawthon RM, Weiss R, Xu GF, Viskochil D, Culver M, Stevens J, Robertson M, Dunn
D, Gesteland R, O'Connell P (1990)
A major segment of the neurofibromatosis type 1 gene: cDNA sequence, genomic
structure, and point mutations.
Cell 13: 193-201
De Luca A, Buccino A, Gianni D, Mangino M, Giustini S, Richetta A, Divona L,
Calvieri S, Mingarelli R, Dallapiccola B (2003)
NF1-Gene analysis based on DHPLC.
Hum Mutat 21: 171-2
119
6 Literaturverzeichnis
DeClue JE, Papageorge AG, Fletcher JA, Diehl SR, Ratner N, Vass WC, Lowy DR
(1992)
Abnormal regulation of mammalian p21ras contributes to malignant tumor growth in von
Recklinghausen (type 1) neurofibromatosis.
Cell 69: 265-73
Eisenberg AA, Wallerstein H (1932)
Pheochromocytoma of the suprarenal medulla (paraganglioma).
Arch Pathol 14: 818–836
Eisenhofer G, Lenders JW, Pacak K (2004)
Biochemical diagnosis of pheochromocytoma.
Front Horm Res 31: 76-106
Eisenhofer G, Lenders JWM, Linehan WM, Walther MM, Goldstein DS, Keiser HR
(1999)
Plasma normetanephrine and metanephrine for detecting pheochromocytoma in von
Hippel-Lindau disease and multiple endocrine neoplasia type 2.
New Engl J Med 340: 1872-9
Eng C, Clayton D, Schuffenecker I, Lenoir G, Cote G, Gagel RF, van Amstel HK, Lips
CJ, Nishisho I, Takai SI, Marsh DJ, Robinson BG, Frank-Raue K, Raue F, Xue F,
Noll WW, Romei C, Pacini F, Fink M, Niederle B, Zedenius J, Nordenskjold M,
Komminoth P, Hendy GN, Mulligan LM (1996)
The relationship between specific RET proto-oncogene mutations and disease phenotype
in multiple endocrine neoplasia type 2. International RET mutation consortium analysis.
JAMA 276: 1575-9
Fahsold R, Hoffmeyer S, Mischung C, Gille C, Ehlers C, Kucukceylan N, Abdel-Nour
M, Gewies A, Peters H, Kaufmann D, Buske A, Tinschert S, Nurnberg P (2000)
Minor lesion mutational spectrum of the entire NF1-gene does not explain its high
mutability but points to a functional domain upstream of the GAP-related domain.
Am J Hum Genet 66: 790-818
6 Literaturverzeichnis
120
Feldkamp MM, Angelov L, Guha A (1999)
Neurofibromatosis type 1 peripheral nerve tumors: aberrant activation of the Ras
pathway.
Surg Neurol 51: 211-8
Fraenkel F (1886)
Ein Fall von doppelseitigem, völlig latent verlaufenen Nebennierentumor und
gleichzeitiger Nephritis mit Veränderungen am Circulationsapparat und Retinitis.
Arch Pathol Anat Physiol Klin Med 103: 244-263
Gimm O, Armanios M, Dziema H, Neumann HP, Eng C (2000)
Somatic and occult germ-line mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in
nonfamilial pheochromocytoma.
Cancer Res 60: 6822-5
Gimm O, Koch CA, Januszewicz A, Opocher G, Neumann HP (2004)
The genetic basis of pheochromocytoma.
Front Horm Res 31: 45-60
Glushien AS, Mansuy MM, Littman DS (1953)
Pheochromocytoma. Its relationship to the neurocutaneous syndromes.
Am J Med 14: 318
Gutmann DH, Aylsworth A, Carey JC, Korf B, Marks J, Pyeritz RE, Rubenstein A,
Viskochil D (1997)
The diagnostic evaluation and multidisciplinary management of neurofibromatosis 1 and
neurofibromatosis 2.
JAMA 278: 51-7
Han SS, Cooper DN, Upadhyaya MN (2001)
Evaluation of denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) for the
mutational analysis of the neurofibromatosis type 1 ( NF1) gene.
Hum Genet 109: 487-97
121
6 Literaturverzeichnis
Heim RA, Kam-Morgan LN, Binnie CG, Corns DD, Cayouette MC, Farber RA,
Aylsworth AS, Silverman LM, Luce MC (1995)
Distribution of 13 truncating mutations in the neurofibromatosis 1 gene.
Hum Mol Genet 4: 975-81
Hirsch NP, Murphy A, Radcliffe JJ (2001)
Neurofibromatosis: clinical presentations and anaesthetic implications.
Br J Anaesth 86: 555-64
Hoegerle S, Nitzsche E, Altehoefer C, Ghanem N, Manz T, Brink I, Reincke M, Moser
E, Neumann HP (2002)
Pheochromocytomas: detection with 18F DOPA whole body PET-initial results.
Radiology 222: 507-12
Huson SM, Hughes RAC (1994)
The neurofibromatoses: a pathogenetic and clinical overview.
London: Chapman&Hall
Kalff V, Shapiro B, Lloyd R, Sisson JC, Holland K, Nakajo M, Beierwaltes WH (1982)
The spectrum of pheochromocytoma in hypertensive patients with neurofibromatosis.
Arch Intern Med 142: 2092-8
Kaltsas GA, Papadogias D, Grossman AB (2004)
The clinical presentation (symptoms and signs) of sporadic and familial chromaffin cell
tumours (phaeochromocytomas and paragangliomas).
Front Horm Res 31: 61-75
Kehrer-Sawatzki H, Schwickardt T, Assum G, Rocchi M, Krone W (1997)
A third neurofibromatosis type 1 (NF1) pseudogene at chromosome 15q112
Hum Genet 100: 595-600
6 Literaturverzeichnis
122
Legius E, Marchuk DA, Hall BK, Andersen LB, Wallace MR, Collins FS, Glover TW
(1992)
NF1-related locus on chromosome 15.
Genomics 13: 1316-1318
Lenders JW, Pacak K, Walther MM, Linehan WM, Mannelli M, Friberg P, Keiser
HR, Goldstein DS, Eisenhofer G (2002)
Biochemical diagnosis of pheochromocytoma: which test is best?
JAMA 287: 1427-34
Li Y, Bollag G, Clark R, Stevens J, Conroy L, Fults D, Ward K, Friedman E,
Samowitz W, Robertson M (1992)
Somatic mutations in the neurofibromatosis 1 gene in human tumors.
Cell 69: 275-81
Li Y, O'Connell P, Breidenbach HH, Cawthon R, Stevens J, Xu G, Neil S, Robertson
M, White R, Viskochil D (1995)
Genomic organization of the neurofibromatosis 1 gene (NF1).
Genomics 25: 9-18
Luijten M, Fahsold R, Mischung C, Westerveld A, Nurnberg P, Hulsebos TJ (2001)
Limited contribution of interchromosomal gene conversion to NF1-Gene mutation.
J Med Genet 38: 481-5
Luijten M, Wang Y, Smith BT, Westerveld A, Smink LJ, Dunham I, Roe BA,
Hulsebos TJ (2000)
Mechanism of spreading of the highly related neurofibromatosis type 1 (NF1)
pseudogenes on chromosomes 2, 14 and 22.
Eur J Hum Genet 8: 209-214
Manger WM, Gifford RW (1993)
Pheochromocytoma: current diagnosis and management.
Cleve Clin J Med 60: 365-78
123
6 Literaturverzeichnis
Manger WM, Gifford RW (2002)
Pheochromocytoma.
J Clin Hypertens 4: 62-72
Marchuk DA, Saulino AM, Tavakkol R, Swaroop M, Wallace MR, Andersen LB,
Mitchell AL, Gutmann DH, Boguski M, Collins FS (1991)
cDNA cloning of the type 1 neurofibromatosis gene: complete sequence of the NF1-gene
product.
Genomics 11: 931-40
Messiaen LM, Callens T, Mortier G, Beysen D, Vandenbroucke I, Van Roy N,
Speleman F, De Paepe A (2000)
Exhaustive mutation analysis of the NF1-gene allows identification of 95% of mutations
and reveals a high frequency of unusual splicing defects.
Hum Mutat 15: 541-555
Messiaen LM, Callens T, Roux KJ, Mortier GR, De Paepe A, Abramowicz M,
Pericak-Vance MA, Vance JM, Wallace MR (1999)
Exon 10b of the NF1-Gene represents a mutational hotspot and harbors a recurrent
missense mutation Y489C associated with aberrant splicing.
Genet Med 1: 248-253
Modigliani E, Vasen HM, Raue K, Dralle H, Frilling A, Gheri RG, Brandi ML,
Limbert E, Niederle B, Forgas L (1995)
Pheochromocytoma in multiple endocrine neoplasia type 2: European study. The
Euromen Study Group.
J Intern Med 238: 363-7
Mount SM (1982)
A catalogue of splice junction sequences.
Nucleic Acids Res 22: 459-72
6 Literaturverzeichnis
124
Neumann HP, Bausch B, McWhinney SR, Bender BU, Gimm O, Franke G, Schipper
J, Klisch J, Altehoefer C, Zerres K, Januszewicz A, Eng C, Smith WM, Munk R,
Manz T, Glaesker S, Apel TW, Treier M, Reineke M, Walz MK, Hoang-Vu C,
Brauckhoff M, Klein-Franke A, Klose P, Schmidt H, Maier-Woelfle M, Peczkowska
M, Szmigielski C, Eng C for The Freiburg-Warsaw-Columbus Pheochromocytoma
Study Group (2002A)
Germ-line mutations in nonsyndromic pheochromocytoma.
N Engl J Med 346: 1459-66
Neumann HP, Hoegerle S, Manz T, Brenner K, Iliopoulos O (2002B)
How many pathways to pheochromocytoma?
Semin Nephrol 22: 89-99
Neumann HP, Pawlu C, Peczkowska M, Bausch B, McWhinney SR, Muresan M,
Buchta M, Franke G, Klisch J, Bley TA, Hoegerle S, Boedeker CC, Opocher G,
Schipper J, Januszewicz A, Eng C for the European-American Paraganglioma Study
Group (2004)
Distinct clinical features of paraganglioma syndromes associated with SDHB and SDHD
gene mutations.
JAMA 292: 943-51
Neumann HPH, Berger DP, Sigmund G, Blum U, Schmidt D, Parmer RJ, Volk B,
Kirste G (1993)
Pheochromocytoma, multiple endocrine neoplasia type 2, and Von-Hippel-Lindau
disease.
N Engl J Med 329: 1531-8
Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, Powell SJ, Summers C, Kalsheker N, Smith
JC, Markham, AF (1989)
Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system.
Nucleic Acids Res 17: 2503-16
125
6 Literaturverzeichnis
Nguyen L, Niccoli-Sire P, Caron P, Bastie D, Maes B, Chabrier G, Chabre O, Rohmer
V, Lecomte P, Henry JF, Conte-Devolx B; French Calcitonin Tumors Study Group
(2001)
Pheochromocytoma in multiple endocrine neoplasia type 2: a prospective study.
Eur J Endocrinol 144: 37-44
Oefner PJ, Underhill PA (1998)
DNA mutation detection using denaturing highperformance liquid chromatography
(DHPLC).
Current Protocols in Human Genetics Wiley & Sons, New York, Supplement 19:7.10.17.10.12.
Pawlu C, Bausch B, Reisch N, Neumann HP (2005)
Genetic testing for pheochromocytoma-associated syndromes.
Ann Endocrinol 66: 178-85
Pick L (1912)
Das Ganglioma embryonale sympathicum - eine typisch bösartige Geschwulstform des
sympathischen Nervensysthems.
Berl Klin Wochenschr 49: 16-22
Purandare SM, Huntsman Breidenbach H, Li Y, Zhu XL, Sawada S, Neil SM,
Brothman A, White R, Cawthon R, Viskochil D (1995)
Identification of neurofibromatosis 1 (NF1) homologous loci by direct sequencing,
fluorescence in situ hybridization, and PCR amplification of somatic cell hybrids.
Genomics 30: 476-485
Rasmussen SA, Friedman JM (2000)
NF1-gene and neurofibromatosis 1.
Am J Epidemiol 151: 33-40
126
6 Literaturverzeichnis
Régnier V, Meddeb M, Lecointre G, Richard F, Duverger A, Nguyen VC, Dutrillaux
B, Bernheim A, Danglot G (1997)
Emergence and scattering of multiple neurofibromatosis (NF1)- related sequences during
hominoid
evolution
suggest
a
process
of
pericentromeric
interchromosomal
transposition.
Hum Mol Genet 6: 9-16
Riccardi VM (1981)
Von Recklinghausen neurofibromatosis.
N Engl J Med 305: 1617-27
Riccardi VM, Eichner JE (1992)
Neurofibromatosis: phenotype, natural history and pathogenesis. 2nd ed. Baltimore, MD.
John Hopkins University Press
Ruggirei M, Pulizzi A (2003)
From Aldrovandi’s "Homuncio" (1592) to Buffon’s girl (1749) and the "Wart Man" of
Tilesius (1793): antique illustrations of mosaicism in neurofibromatosis?
J Med Genet 40: 227-232
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (1985)
Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis
for diagnosis of sickle cell anemia.
Science 230: 1350–4
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977)
DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci U S A 74: 5463-7
Scherczinger CA, Bourke MT, Ladd C, Lee HC (1997)
DNA extraction from liquid blood using QIAamp.
J Forensic Sci 42: 893-6
127
6 Literaturverzeichnis
Stumpf DA, Alksne JF, Annegers JF, Brown SS, Conneally PM, Housman D, Leppert
MF, MillerJP, Moss ML, Pileggi AJ, Rapin I, Strohman RC, Swanson LW,
Zimmerman A (1988)
Neurofibromatosis: conference statement.
Arch Neurol 45: 575-578
Suzuki H, Ozawa N, Taga C, Kano T, Hattori M, Sakaki Y (1994)
Genomic analysis of a NF1-related pseudogene on human chromosome 21.
Gene 147: 277-280
Suzuki S (1910)
Über zwei Tumoren aus Nebennierenmarkgewebe.
Berlin Klin Wchnschr 47: 1623
The Sanger Centre, The Washington University Genome Sequencing Center
Toward a complete human genome sequence.
Genome Res 8: 1097-108
Ugozzoli L, Wallace RB (1991)
Allele-specific polymerase chain reaction.
Methods Enzymol 2: 42-48
Upadhyaya M, Cooper DN (1998)
Neurofibromatosis type 1: from genotype to phenotype.
Oxford BIOS Scientific Publ
Upadhyaya M, Han S, Consoli C, Majounie E, Horan M, Thomas NS, Potts C,
Griffiths S, Ruggieri M, von Deimling A, Cooper DN (2004)
Characterization of the somatic mutational spectrum of the neurofibromatosis type 1
(NF1) gene in neurofibromatosis patients with benign and malignant tumors.
Hum Mutat 23: 134-46
6 Literaturverzeichnis
128
Upadhyaya M, Osborn MJ, Maynard J, Kim MR, Tamanoi F, Cooper DN (1997)
Mutational and functional analysis of the neurofibromatosis type 1 (NF1) gene.
Hum Genet 99: 88-92
van Gils AP, van der Mey AG, Hoogma RP, Falke TH, Moolenaar AJ, Pauwels EK,
van Kroonenburgh MJ (1990)
Iodine-123-metaiodobenzylguanidine scintigraphy in patients with chemodectomas of
the head and neck region.
J Nucl Med 31: 1147-55
Vanharanta S, Buchta M, McWhinney SR, Virta SK, Peczkowska M, Morrison CD,
Lehtonen R, Januszewicz A, Jarvinen H, Juhola M, Mecklin JP, Pukkala E, Herva R,
Kiuru M, Nupponen NN, Aaltonen LA, Neumann HP, Eng C (2004)
Early-onset renal cell carcinoma as a novel extraparaganglial component of SDHBassociated heritable paraganglioma.
Am J Hum Genet 74: 153-9
Virchow R (1863)
Die krankhaften Geschwülste.
Berlin:: Hirschwald: 325-327
Viskochil D, Buchberg AM, Xu G, Cawthon RM, Stevens J, Wolff RK, Culver M,
Carey JC, Copeland NG, Jenkins NA, et al. (1990)
Deletions and a translocation interrupt a cloned gene at the neurofibromatosis type 1
locus.
Cell 62: 187-92
von Recklinghausen FD (1882)
Über die multiplen Fibrome der Haut und ihre Beziehung zu den multiplen Neuromen.
Berlin: Hirschwald: 3-18
129
6 Literaturverzeichnis
Walther MM, Herring J, Enquist E, Keiser HR, Linehan WM (1999A)
von Recklinghausen's disease and pheochromocytomas.
J Urol 162: 1582-6
Walther MM, Reiter R, Keiser HR, Choyke PL, Venzon D, Hurley K, Gnarra JR,
Reynolds JC, Glenn GM, Zbar B, Linehan WM (1999B)
Clinical and genetic characterization of pheochromocytoma in von Hippel-Lindau
families: comparison with sporadic pheochromocytoma gives insight into natural history
of pheochromocytoma.
J Urol 162: 659-64
Xu GF, O'Connell P, Viskochil D, Cawthon R, Robertson M, Culver M, Dunn D,
Stevens J, Gesteland R, White R (1990)
The neurofibromatosis type 1 gene encodes a protein related to GAP.
Cell 62: 599-608
Zanca A (1975)
Iconografia dermatologica del XVI secolo. Un caso di neurofibromatosi multipla
illustrato da Ulisse Aldrovandi.
Arch Ital Dermatol Sessuol 40: 119-123
130
131
7 Danksagung
7 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Neumann. Für die Überlassung des Themas und die
Unterstützung bedanke ich mich ebenso wie für die Bereitstellung des Materials. Erst die
jahrelange
Sammlung
von
Patientenproben
und
die
genaue
Dokumentation
von
Patientendaten haben diese Studie ermöglicht. Weiterhin danke ich ihm für das Vertrauen und
die Unterstützung, mit der er es mir in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Opocher ermöglicht
hat, einen Teil der Arbeit in Italien absolvieren zu können. Er hat mir damit neben der
beruflichen Weiterbildung ein wundervolles Jahr geschenkt. An dieser Stelle seien all
diejenigen, die daran Teil hatten, gegrüßt.
Frau Dr. Birke Bausch, Mary Buchta und Gani Berisha, sowie dem ganzen Laborteam danke
ich für die Überlassung ihrer Ergebnisse. Vor allem Frau Dr. Bausch trägt einen großen Anteil
am Zustandekommen dieser Arbeit.
Ein großes „Grazie“ für Herrn Professor Opocher und Dottoressa Francesca Schiavi.
Francesca Schiavi war in Italien meine Ansprechpartnerin für jegliche Probleme und stand
mir mit Rat und Tat beiseite. Sie hat mein molekulargenetisches Verständnis und das
molekulargenetische Arbeiten in vielen Stunden geprägt.
Meiner Freundin Rena Hönlein danke ich für ihre große mentale Unterstützung, für die vielen
entspannenden Stunden und das Verständnis sowie die Geduld, die sie aufbrachte.
Meinen Eltern Anna Trapanesi und Job Harenberg danke ich für die finanzielle Stütze, die sie
während des gesamten Studiums leisteten. Des Weiteren sei ihnen und meinem Bruder Daniel
Harenberg für die ständige Unterstützung und Liebe gedankt.
Daniel Paul, Martin Koeppel, Johanna Feindt und dem Tenno danke ich für die
immerwährende Freundschaft.
132
133
8 Lebenslauf
8 Curriculum vitae
Persönliche Daten
Name
Tomas Harenberg
Geburtstag
27. Juni 1979
Geburtsort
Heidelberg
Nationalität
deutsch und italienisch
Familienstand
ledig
Akademische Ausbildung
Juni 1998
Abitur am Kurfürst Friedrich Gymnasium, Heidelberg
Okt. 1999 - Aug. 2001
Studium der Humanmedizin an der Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg
Aug. 2001
Vordiplom (“Physikum”), Ruprecht-Karls-Universität, Heidelberg
Seit Okt. 2001
Studium der Humanmedizin an der Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Aug. 2002
1. Staatsexamen, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
März 2003
Okt. 2003 - Aug. 2004
Beginn der Doktorarbeit bei Prof. Dr. med. H.P.H. Neumann,
Abteilung Innere Medizin IV Universitätsklinikum Freiburg
Forschungs- und Studienaufenthalt, Università degli Studi di Padova, Italien
Stipendium der Baden-Württemberg-Stiftung
März 2005
2. Staatsexamen, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Oktober 2006
3. Staatsexamen, Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg
Praktische Tätigkeiten
Okt. 1998 - Aug. 1999
Wehrdienst, Marineversorgungsschule, Sylt, Sanitätsgrundausbildung,
Sanitäter, Führungsakademie der Bundeswehr, Hamburg
Feb. 2001 - Juni 2001
Hilfswissenschaftler, Max-Planck-Institut für med. Forschung, Heidelberg
Sept. 2002
Famulus, Universitätsklinik, Freiburg, internistische Station
Sept. 2003
Famulus, Universität von Stellenbosch, Südafrika, Thoraxchirurgie
Sept. 2004
Famulus, Universitätsklinik, Freiburg, orthopädische Ambulanz
Okt. 2004
Famulus, Frauenklinik, Gerolstein, Gynäkologie und plastische Chirurgie
134