Dokument_19.

Aus der Frauenklinik des Universitätsklinikums der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. M. W. Beckmann
Assoziationen zwischen Polymorphismen im Topoisomerase IIα Gen mit der
Länge des HER2-Amplikons auf Chromosom 17 - Implikationen für
Mechanismen der Genamplifikation und die Prognose bei
Mammakarzinompatientinnen
Inaugural-Dissertation zur Erlangung
der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Sebastian Bernd Weihbrecht
aus Erlangen
Erlangen, im Januar 2010
Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. M. W. Beckmann
Koreferent:
Priv.-Doz. Dr. med. P. A. Fasching
Tag der mündlichen Prüfung:
13.04.2011
Meinen Eltern
1. ZUSAMMENFASSUNG ..................................................................................................................... 1 2. EINLEITUNG...................................................................................................................................... 5 2.1. EPIDEMIOLOGIE DES MAMMAKARZINOMS........................................................................................ 7 2.2. RISIKOFAKTOREN ...................................................................................................................................... 8 2.3. BEHANDLUNG DES MAMMAKARZINOMS ........................................................................................ 12 2.3.1. Operation ............................................................................................................................................ 12 2.3.2. Strahlentherapie ............................................................................................................................. 15 2.3.3. Chemotherapie ................................................................................................................................ 17 2.3.4. Endokrine Therapie ...................................................................................................................... 19 2.3.5. Molekulare und zielgerichtete Therapie............................................................................ 21 2.4. THERAPIEENTSCHEIDUNG BEIM MAMMAKARZINOM ................................................................. 22 2.4.1. Prognosefaktoren und Prädiktivfaktoren .......................................................................... 23 2.4.2. Klinisch etablierte Prognosefaktoren.................................................................................. 25 2.4.3. Kombinierte Prognose- und Prädiktivfaktoren .............................................................. 28 2.4.4. Topoisomerase IIα......................................................................................................................... 33 2.5. RATIONALE UND FRAGESTELLUNG.................................................................................................. 35 3. MATERIAL UND METHODEN.................................................................................................... 36 3.1. BESCHREIBUNG DER PATIENTINNENKOHORTE .......................................................................... 36 3.2. DATENMANAGEMENT ............................................................................................................................ 37 3.3. ISOLATION DER DNA AUS DEM PATIENTINNENBLUT ................................................................ 38 3.4. SNP ANALYSE MITTELS RTQ-PCR ................................................................................................ 38 3.5. PRINZIP UND HERSTELLUNG DES TISSUE MICROARRAY ....................................................... 39 3.6. DURCHFÜHRUNG DER FLUORESZENZ IN SITU HYBRIDISIERUNG ........................................ 41 3.7. AUSWERTUNGSMETHODEN ................................................................................................................ 45 3.8. STATISTISCHE ÜBERLEGUNGEN....................................................................................................... 46 4. ERGEBNISSE................................................................................................................................... 47 4.1. PATIENTINNENCHARAKTERISTIKA .................................................................................................... 47 4.2. GENOTYPEN UND ASSOZIATION MIT TUMORCHARAKTERISTIKA ......................................... 50 4.3. UNIVARIATE KORRELATION MIT DEN PATIENTINNENCHARAKTERISTIKA .......................... 51 4.4. KORRELATION MIT DEM 10-JAHRES-GESAMTÜBERLEBEN UND DEM
FERNMETASTASENFREIEN ÜBERLEBEN DDFS ................................................................................... 56 4.5. COX-REGRESSIONSANALYSE ............................................................................................................ 58 5. DISKUSSION ................................................................................................................................... 63 6. LITERATUR .................................................................................................................................... 67 7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................................................... 97 8. ANHANG ........................................................................................................................................ 101 8.1. SCREENSHOTS DES DOKUMENTATIONSPROGRAMMES DOMAS .....................................101 8.2. DOKUMENTATIONSBOGEN DER BAVARIAN BREAST CANCER CASES AND CONTROLS
STUDIE ...............................................................................................................................................................105 9. DANKSAGUNG ............................................................................................................................. 122 1
1. Zusammenfassung
Titel: Assoziationen zwischen Polymorphismen im Topoisomerase IIα Gen mit
der Länge des HER2-Amplikons auf Chromosom 17 - Implikationen für
Mechanismen
der
Genamplifikation
und
die
Prognose
bei
Mammakarzinompatientinnen
Hintergrund und Hypothese: Eine Chemotherapie mit Anthrazyklinen stellt
zurzeit
die
Standardtherapie
bei
der
Therapie
von
Patientinnen
mit
Mammakarzinom dar. Der Amplifikationsstatus des Gens Topoisomerase IIα
(TOP2A) ist ein prädiktiver Faktor für die Wirksamkeit einer AnthrazyklinChemotherapie. Dies wird damit in Zusammenhang gebracht, dass TOP2A
eines der Angriffsziele dieser Chemotherapie ist. Auf Chromosom 17q21 ist
TOP2A Bestandteil eines langen Amplikons, welches vom zentromerisch
gelegenen HER2-Gen bis zu TOP2A reicht. TOP2A wird nie ohne HER2
amplifiziert, allerdings ist HER2 in den meisten Fällen ohne TOP2A amplifiziert.
Die molekularen Gründe hierfür sind unbekannt. Ziel dieser Arbeit ist es, den
Einfluss genetischer Polymorphismen im TOP2A-Gen auf die Prognose von
Mammakarzinompatientinnen
und
den
TOP2A-Amplifikationsstatus
zu
untersuchen.
Methoden: Die Bavarian Breast Cancer Cases and Controls Studie (BBCC) ist
eine
prospektive
Prognosefaktoren
Kohortenstudie
bei
zur
Untersuchung
Mammakarzinompatientinnen.
von
Von
Risikoden
und
meisten
Patientinnen sind Biomaterialien wie Keimbahn-DNA und Tumorgewebe
verfügbar. An Keimbahn-DNA wurde der Single Nucleotide Polymorphism
(SNP) rs13695 in der 3´UTR-Region von TOP2A mittels quantitativer RealTime-PCR genotypisiert. Zur Bestimmung des Amplifikationsstatus des TOP2AGens wurde ein Tissue Microarray aus in Formalin fixiertem, in Paraffin
eingebettetem Tumormaterial hergestellt und mittels fluoreszierender in situ
Hybridisierung die Genkopienzahl von HER2 und TOP2A quantifiziert. Diese
molekularen Marker wurden untereinander und mit der Prognose des
Mammakarzinoms assoziiert.
2
Ergebnisse: Insgesamt 1.276 Patientinnen konnten für den SNP rs13695
genotypisiert werden. Der homozygote CC-Genotyp war bei 736 Patientinnen
(57,7 %) vorhanden, der heterozygote CT- und der homozygote TT-Genotyp
konnte in 459 (36 %) bzw. in 81 (6 %) Patientinnen gefunden werden. Für
Patientinnen, die eine Chemotherapie erhalten hatten, konnte in der
multivariaten Überlebensanalyse gezeigt werden, dass der Genotyp ein
unabhängiger prognostischer Faktor war. Die adjustierte Hazards Ratio (HR)
pro T-Allel betrug 1,69 (95 % Konfidenzintervall: 1,14 bis 2,51; p = 0,009). Für
Patientinnen, die keine Chemotherapie erhalten hatten, war der Genotyp nicht
von prognostischer Relevanz. Die Bestimmung der Genkopienzahl von TOP2A
im Tumor war in 629 Fällen durchführbar. 587 Patientinnen (93,3 %) hatten eine
normale Genkopienzahl, 33 Patientinnen zeigten eine Amplifikation (5,2 %) und
bei 9 Patientinnen war TOP2A im Tumor deletiert (1,4 %). Bei der
Untersuchung der Assoziation zwischen dem Genotyp rs13695 und dem
Amplifikationsstatus von TOP2A konnte gesehen werden, dass der Anteil der
amplifizierten Patientinnen mit dem T-Allel zunimmt. Bei Patientinnen mit dem
homozygoten CC-Genotyp zeigte sich in nur 3,9 % der Fälle eine Amplifikation,
während diese bei heterozygotem CT- und homozygotem TT-Genotyp in 6,8 %
bzw. 9,7% der Tumoren gesehen werden konnte (p = 0,042).
Schlussfolgerung: Der TOP2A Genotyp in Bezug auf den SNP rs13695
scheint bei Mammakarzinompatientinnen, die eine Chemotherapie erhalten,
eine unabhängige prognostische Bedeutung zu haben. Des Weiteren scheint
der Genotyp mit dem Amplifikationsstatus dieses Gens assoziiert zu sein. Die
kausale Beziehung zwischen dem Keimbahngenotyp, dem Amplifikationsstatus
und
der
Prognose
Untersuchungen sein.
ist
noch
unklar
und
sollte
Bestandteil
weiterer
3
Title: Associations between Polymorphisms of the Topoisomerase IIα Gene
with the Length of the HER2 Amplicon on Chromosome 17 - Implications for
Mechanisms of Gene Amplification and Prognosis in Breast Cancer Patients
Background
and
hypothesis: The amplification status of the gene
Topoisomerase IIα (TOP2A) is a known predictive factor in breast cancer
patients, who are treated with anthracycline chemotherapy. TOP2A is located
on Chromosome 17q21. Topoisomerase IIα plays a key role in DNA replication
and repairing. Furthermore it is the molecular target of anthracycline
chemotherapies. Several studies could associate TOP2A gene amplification or
deletion with an altered response to anthracycline chemotherapy. It is never
amplified without a coamplification of the HER2 gene, which is located on the
same chromosome. However in most of the cases HER2 is amplified without
TOP2A. Aim of this study was therefore to examine whether genetic
polymorphisms in the TOP2A gene are prognostic factors in breast cancer
patients and whether the genotype is correlated with the TOP2A amplification
status of the tumor.
Methods: The Bavarian Breast Cancer Cases and Controls study (BBCC) is a
prospective cohort study, which aims at researching breast cancer risk and
prognostic factors. Biomaterials such as germline DNA and tumor tissue is
available from most of the patients. Real-time-PCR was performed in order to
genotype the single nucleotide polymorphism (SNP) rs13695 in the 3’UTR
region of the TOP2A gene. Amplification of the TOP2A gene was quantified by
fluorescent in situ hybridization (FISH) of the same patients. The tumours were
available as a tissue microarray (TMA), which was constructed from paraffin
embedded tumours. Genotyping results were analyzed concerning their
prognostic relevance in this breast cancer patient cohort and genotype and
amplification status were associated with each other.
Results: The genotype of the SNP rs13695 could be ascertained of 1.276
patients. A homozygous genotype CC could be seen in 736 patients (57,7 %),
the heterozygous CT genotype and the homozygous alternative genotype TT
was present in 459 (36 %) and 81 (6 %) patients respectively. In the multivariate
survival analysis the genotype of rs13695 was statistically only significant in
4
patients who received an adjuvant chemotherapy with an adjusted hazards ratio
per allele of 1,69 (95 % confidence interval CI: 1,14 to 2,51; p = 0,009). In
patients who did not receive a chemotherapy the genotype had no prognostic
relevance at all. FISH results for gene copy number variation analysis were
available of 629 patients. 587 (93,3 %) patients had a normal gene copy
number of TOP2A, 33 patients (5,2 %) and 9 patients (1,4 %) showed an
amplification or a deletion. Associating the rs13695 genotype with the
amplification status of TOP2A, an increasing proportion of tumors with an
amplification was seen with each T allele. Patients with a CC genotype had an
amplification of the TOP2A in the tumor in 3,9 % of all cases and in 6,8 % and
9,7 % for the CT and the TT genotype respectively (p = 0,042).
Conclusion: The genotype of the SNP rs13695 seems to be of independent
prognostic relevance in breast cancer patients, who are treated with a
chemotherapy. Furthermore the genotype was correlated with the gene
amplification status in the tumor. The reason for this observation remains
unclear. Further evaluation of the SNP as prognostic factor and the association
with the amplification status are to be subject to further investigation.
5
2. Einleitung
Bei einer Chemotherapie von Patientinnen mit Mammakarzinom stellt die
Therapie
mit
Anthrazyklinen
zurzeit
einen
Therapiestandard
dar.
Der
weitverbreitete Gebrauch der Anthrazykline (z. B. von Doxorubicin und
Epirubicin) in der adjuvanten Chemotherapie von Patientinnen mit einer
Mammakarzinomerkrankung (Pritchard et al., 2006) beruht auf einer Vielzahl
von prospektiv randomisierten Studien und auf mehreren Metaanalysen, wie
z. B. die der Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (Abe et al.,
2005; EBCTCG, 2005; Gennari et al., 2008), welche implizierten, dass
Patientinnen mit einem positiven HER2-Status von einem anthrazyklinhaltigen
Chemotherapieschema mehr profitieren als von einem Schema ohne
Anthrazykline. Die EBCTCG konnte in dieser 15.000 Patientinnen aus 17
Teilstudien umfassenden Kohorte eine 3 bis 4,5 %ige Verbesserung des
rezidivfreien
Überlebens
anthrazyklinhaltigen
(RFS)
Studienarm
und
im
Gesamtüberlebens
Vergleich
zum
(OS)
für
den
methotrexathaltigen
Studienarm nachweisen (Abe et al., 2005; EBCTCG, 2005). Dennoch gibt es
zunehmend mehr Studien, die sich mit der Frage beschäftigen, ob die generelle
Annahme der Überlegenheit einer anthrazyklinbasierten Chemotherapie (CHT)
gegenüber
einem
konventionellen
Schema
in
Anbetracht
der
nicht
unerheblichen anthrazyklinassoziierten Nebenwirkungen weiterhin Bestand hat
(Slamon and Press, 2009).
Bislang
betrachtete
man
die
Langzeitnebenwirkungen
einer
Anthrazyklintherapie, nämlich die Kardiotoxizität (Hoff et al., 1979; Ryberg et al.,
2008) und Sekundärleukämien (Diamandidou et al., 1996) als akzeptabel in
Anbetracht der Verbesserung der Prognose. Zwei Studien deuteten jedoch
bereits vor einigen Jahren darauf hin, dass die Langzeittoxizität initial
unterschätzt wurde (Doyle et al., 2005; Hershman et al., 2007). Dies hat dazu
geführt, dass im Zeitalter der individualisierten Medizin das Nutzen-SchadenVerhältnis für eine anthrazyklinhaltige Therapie erneut diskutiert wird (Bergh et
al., 2001). Die molekulare Klassifikation von Mammakarzinomen hat dazu
geführt, dass nicht mehr wie vor zehn Jahren alle Patientinnen dieselbe
Therapie bekommen, sondern dass diese dem molekularen Subtyp angepasst
6
wird, um einen maximalen Therapieeffekt bei den Patientinnen zu erreichen
(Perou et al., 2000; Slamon and Press, 2009; van Veer et al., 2002).
Es stellt sich nun die Frage, warum HER2-positive Mammakarzinome sensitiver
gegenüber Anthrazyklinen sind. In den letzen Jahren haben sich die Hinweise
gemehrt, dass nicht HER2 kausal mit der höheren Sensitivität assoziiert ist,
sondern das telomerisch von HER2 gelegene Gen Topoisomerase IIα (TOP2A)
(Glynn, Miller et al. 2010). TOP2A kodiert für ein zellzyklusabhängiges Protein,
welches essentielle Funktionen für die Zellteilung, die mRNA-Transkription, die
DNA-Transkription und die DNA-Replikation hat. Darüber hinaus ist TOP2A als
ein wesentliches molekulares Ziel der Anthrazyklintherapie bekannt (Järvinen et
al., 2000; Konecny et al., 2010; Larsen et al., 2003). Es konnte nachgewiesen
werden, dass die Funktionsweise von TOP2A eng mit dem Amplifikationsstatus
des Gens zusammenhängt und dass eine Amplifikation nur in Zusammenhang
mit einer Amplifikation des HER2-Gens auftritt. Umgekehrt kommt aber eine
TOP2A-Amplifikation ohne eine HER2-Amplifikation nicht vor (Jarvinen and Liu,
2006; Olsen et al., 2004; Slamon D et al., 2007). Klinische Studien, die einen
anthrazyklinhaltigen und einen anthrazyklinfreien Chemotherapiearm haben,
sind bereits auf diese Zusammenhänge hin untersucht worden. Es konnte
gezeigt werden, dass die Vorteile im rezidivfreien Überleben RFS (HR = 0,35;
95 % CI: 0,17 bis 0,73, P = 0,005) und Gesamtüberleben OS (HR = 0,33,
95 % CI: 0,15 bis 0,75, p = 0,008) einer anthrazyklinbasierten CHT wie im Falle
des anthrazyklinhaltigen Arms auf Patientinnen beschränkt sind, die Tumoren
mit einem alterierten TOP2A-Amplifikationsstatus haben. Bei Patientinnen mit
regulärer
Genkopienzahl
Anthrazyklinschema
im
konnte
RFS
0,90 (95CI = 0,66 bis 1,23, p = 0,49)
im
Behandlungsarm
dagegen
und
im
eine
OS
nach
dem
HR
von
eine
HR
von
1,09 (95 CI = 0,77 bis 1,56, p = 0,62) demonstriert werden (O'Malley et al.,
2009). Über die molekularen Zusammenhänge der Koamplifikation von HER2
und
TOP2A
ist
bislang
nichts
bekannt.
Das
Verständnis
um
die
Wirkmechanismen könnte neue prädiktive Faktoren für eine anthrazyklinhaltige
Chemotherapie identifizieren. Vor diesem Hintergrund beschäftigt sich diese
Arbeit mit dem Koamplifikationsverhalten von HER2 und TOP2A, sowie dem
Zusammenhang
des
Koamplifikationsverhaltens
mit
einem
genetischen
7
Polymorphismus im TOP2A-Gen und den Auswirkungen auf die Prognose bei
Patientinnen mit Mammakarzinom.
2.1. Epidemiologie des Mammakarzinoms
Weltweit wird das Mammakarzinom der Frau über eine Million Mal pro Jahr
diagnostiziert (Bray et al., 2004). Mit über 57.000 Neuerkrankungen im Jahr und
einem relativen Anteil von etwa 27 % unter den häufigsten malignen
Erkrankungen der Frau in Deutschland ist es von herausragender Relevanz
(GEKID,
2008).
Auf
100.000
Frauen
kommen
in
Deutschland
104
Mammakarzinomneuerkrankungen und über 26 Todesfälle pro Jahr. Die
Inzidenz des Mammakarzinoms steigt seit 1980 in Deutschland kontinuierlich
an, während die Mortalität seit 1995 leicht sinkt. Die relative 5-JahresÜberlebensrate über alle Stadien lag im Jahr 2004 bei 81 % (GEKID, 2008).
Das Lebenszeitrisiko, an einem Mammakarzinom neu zu erkranken, beträgt bis
zum 70. Lebensjahr 10 % (Feuer et al., 1993). Das Mammakarzinom ist nach
Lungen- und Magenkrebs die dritthäufigste Krebsart der Welt und die häufigste
maligne Erkrankung der Frau. Des Weiteren ist es für 23 % aller
Krebstodesfälle bei Frauen weltweit verantwortlich und steht hierbei nach
Lungen-, Magen,- Kolorektal- und Leberkrebs an fünfter Stelle. Es ist die
Hauptursache für die Krebsmortalität bei Frauen in industrialisierten Ländern
(Parkin et al., 2002). Die Mammakarzinomraten stiegen in Amerika zwischen
1940 und 1980 jedes Jahr um 1,25 % . Die Wahrscheinlichkeit, ein invasives
Mammakarzinom
zu
entwickeln,
ist
in
verschiedenen
Altersgruppen
unterschiedlich. Die Wahrscheinlichkeit an einem invasivem Mammakarzinom
zu erkranken ist für das Lebensintervall bis zum 39. Lebensjahr mit 0,44% am
geringsten. Für die Altersintervalle 40. Bis 59. Lebensjahr und 60. bis 70.
Lebensjahr steigt das Risiko mit 4,14% und 7,53% stetig an. Die Betrachtung
des Gesamtlebenszeitraumes beinhaltet eine Erkrankungswahrscheinlichkeit
von 13,36% (Weir et al., 2003) (Jemal et al., 2004).
8
2.2. Risikofaktoren
Schon im 17. Jahrhundert sprach der Mönch Bernardo Ramazzini von einer
erhöhten Brustkrebsrate unter Nonnen (Ramazzini, 1713) und im Jahr 1866
berichtete Paul Broca von mehr als 10 Brustkrebsfällen in seiner Familie (Broca,
1866). Dies sind die ersten Beschreibungen der Risikofaktoren Nulliparität und
familiäre Häufung bei der Mammakarzinomerkrankung. Risikofaktoren sind
wichtige Parameter zur Einschätzung der Gefährdung der Patientinnen durch
die Krankheit, jedoch können bei etwa einem Drittel der Frauen mit
Mammakarzinom keine der bekannten Risikofaktoren gefunden werden (Colditz
et al., 1993; Harris et al., 1992a).
Frauen erkranken im Vergleich zu Männern etwa 135mal häufiger an
Brustkrebs (Bilimoria and Morrow, 1995; Giordano et al., 2002; Harris et al.,
1992a). Mit voranschreitendem Alter erhöht sich das Risiko. Es ist zu
erwarten,
dass
mit
zunehmendem
Alter
die
Inzidenz
der
Brustkrebserkrankung zunimmt (Bilimoria and Morrow, 1995; Jemal et al.,
2004). Eine lange Phase der Fruchtbarkeit mit vielen menstruellen Zyklen
erhöht das Risiko an Brustkrebs zu erkranken. Daraus folgt, dass eine frühe
Menarche und eine späte Menopause Risikofaktoren sind (Brinton et al.,
1988). Ein unregelmäßiger Zyklus mit einer geringeren Gesamtzahl
ovulatorischer Zyklen konnte hingegen als protektiv identifiziert werden
(Parazzini et al., 1993). Nulliparität ist mit einem deutlich erhöhtem
Erkrankungsrisiko assoziiert (Kvale et al., 1987). Die Einnahme oraler
Kontrazeptiva erhöht das Risiko nicht. Die CARE Studie (Contraceptive and
Reproductive Experiences Study) zeigte ein relatives Risiko (RR) von 1,0 mit
einem 95 % Konfidenzintervall (CI) von 0,8–1,3 (Marchbanks et al., 2002).
Eine gegenwärtig verabreichte Hormonersatztherapie in der Menopause
erhöht das Risiko. Das RR steigt auf 1,66 mit einem 95% Konfidenzintervall
(CI) von 1,58 – 1,75 (p<0,0001). Die Einnahmedauer korreliert mit der
Risikozunahme. Die Zugabe von Gestagenen steigert das Risiko zusätzlich.
(Beral, 2003; Chlebowski et al., 2003). Die mammografische Dichte des
Drüsenkörpers ist ebenfalls mit einem erhöhten Krankheitsrisiko assoziiert.
Frauen mit einer mammografisch dichten Brust haben, verglichen mit Frauen
9
mit einer weniger dichten Brust, ein erhöhtes Erkrankungsrisiko. Die
Wahrscheinlichkeit prämaligne oder maligne Läsionen in einer radiografisch
dichten Brust frühzeitig zu entdecken ist vermindert. Die Dichte des
Drüsenkörpers scheint vererbbar zu sein. Sie nimmt in der Schwangerschaft,
der
Menopause
und
unter
Tamoxifentherapie
ab, unter Hormonersatztherapie (HRT) hingegen zu (Boyd et al., 1998; Tice
et al., 2005). Frauen mit atypischer Hyperplasie haben ein vierfach erhöhtes
Mammakarzinomrisiko. Fibrozystische Veränderungen ohne Proliferation
erhöhen das Risiko nicht (Dupont et al., 1993; Hartmann et al., 2005). Frauen
welche zuvor bereits an einem Endometrium- oder Ovarialkarzinom erkrankt
sind haben ein zweifach erhöhtes Erkrankungsrisiko (Antoniou et al., 2003;
Sánchez et al., 2008; Trentham-Dietz et al., 2007). Effekte ionisierender
Strahlung
konnten
Brustkrebsrisiko
in
in
verschiedenen
Verbindung
Studien
gebracht
ebenfalls
werden.
Die
mit
dem
Effekte
sind
altersabhängig. Zwischen der Pubertät und dem 30. Lebensjahr sind die
Wirkungen ionisierender Strahlung am schädlichsten (Dershaw et al., 1992).
Ab dem 50. Lebensjahr überwiegt der Nutzen der Mammografie den
potenziellen Schaden. Dies konnte für jüngere Frauen nicht gezeigt werden.
Die Mammografie für Frauen über 50 Jahren schadet also nicht (Bhatia et al.,
1996; John and Kelsey, 1993). Über die kausalen Zusammenhänge des
alkoholassoziierten Risikozuwachses wird noch diskutiert. Die Stärke des
Zusammenhanges wird von noch zu determinierenden Modifikatoren
beeinflusst. Für Frauen, deren erstgradige Verwandte täglich Alkohol
konsumieren ist das relative Risiko gegenüber Frauen die noch nie Alkohol
konsumiert haben mit einem RR von 2,45 deutlich erhöht. Für Frauen ohne
familiäre Risikokomponente oder weiterem Verwandtschaftsgrad konnte
lediglich ein geringeres Risiko nachgewiesen werden (Hartmann et al., 2005;
Vachon et al., 2001). Mögliche Modifikatoren des Alkoholeinflusses sind
genetische Suszeptibilität, Grad der Verwandtschaft, ein veränderter
Steroidhormonrezeptorstatus sowie eine Suchtassoziierte Reduktion der
Folatzufuhr (Singletary and Gapstur, 2001; Zhang et al., 2003). Bei dem
Auftreten eines Mammakarzinoms bei erstgradig Verwandten wird eine
Risikoerhöhung um den Faktor zwei beschrieben. Bei zwei erstgradig
Verwandten mit Brustkrebs ist das Risiko bereits um den Faktor vier bis
sechs erhöht. 85% der Mammakarzinomerkrankung sind familiär nicht
10
assoziiert (Fossland et al., 2009; Olsen et al., 1999; Ramsey et al., 2006).
Jedoch können zwischen 5 % und 10 % der Mammakarzinome in einem
vererbbaren Zusammenhang gesehen werden. Am besten sind hierbei die
Gene BRCA1 und BRCA2 (BReast CAncer) untersucht (Antoniou et al.,
2003). Es sind Tumorsuppressorgene, welche für DNA-Reparaturproteine
kodieren. Das Risiko zu erkranken, ist bereits erhöht, wenn eine einzige
Mutation der bereits mehr als 500 bekannten Mutationen vorliegt (Easton et
al.,
1994;
Ford
et
al.,
1994).
Das
Lebenszeitrisiko,
an
einem
Mammakarzinom zu erkranken, wenn eine BRCA1-Mutation vorliegt, beträgt
etwa 50–80 % , bei einer BRCA2-Mutation etwa 40–70 % (Antoniou et al.,
2003). Das Lebenszeitrisiko für ein BRCA1-assoziiertes Ovarialkarzinom
beträgt 40 %, für ein BRCA2-assoziiertes Ovarialkarzinom liegt es bei 20 %
(Risch et al., 2001). Zur Beurteilung des Gesamtrisikos in Würdigung der
einezelnen Risikofaktoren wurden zwei mathematische Modelle entwickelt.
Das Gail-Modell vermag das persönliche Risikoprofil zu errechnen. Es gibt
das 5-Jahres-Risiko, an einem Mammakarzinom zu erkranken, im Vergleich
zu gleichaltrigen Populationen an und es kann das Lebenszeitrisiko für eine
Mammakarzinomerkrankung errechnen. Einschränkungen gibt es hinsichtlich
der Vorhersage für DCIS (duktales Carcinoma in situ) und LCIS (lobuläres
Carcinoma in situ), bei genetischen Mutationen und Fällen, die vermutlich
vererbt sind. Zweitgradig Verwandte werden nicht berücksichtigt (Decarli et
al.,
2006;
Gail
and
Rimer,
1998).
Das
Claus-Modell
sagt
das
Mammakarzinomrisiko über die Familienanamnese voraus. Es zieht hierzu
den Grad der Verwandtschaft und den Erstdiagnosezeitpunkt für das
kumulative Mammakarzinomrisiko in Betracht (Amir et al., 2010; Claus et al.,
1994). Weitere Modelle sind beschrieben, aber noch nicht ausgiebig evaluiert
(Fasching et al., 2007). Verschiedene potenziell risikomodifizierende
Faktoren, welche vor allem mit den Lebensgewohnheiten assoziiert, sind
wurden in diversen Studien untersucht (Linos et al., 2008). Es liegen unklare
Daten über eine fettreiche Diät vor (Thomson and Thompson, 2009), jedoch
sind kohlenhydratreiche Diäten über die elevierten Insulin- und IGF-Spiegel
mit einem erhöhten Risiko assoziiert (Hunter et al., 1996; Li et al., 2001; Velie
et al., 2005). In der Postmenopause ist Adipositas ein Risikofaktor.
Prämenopausal scheint sie präventiv zu wirken (Cleary and Grossmann,
2009; Morimoto et al., 2002; Renehan et al., 2008). Frauen, die in
wechselnden
Nachtschichten
Mammakarzinomrisiko.
Eine
11
arbeiten,
erhöhte
haben
ein
Östrogenexposition
erhöhtes
durch
den
Melatoninmangel wird hierfür verantwortlich gemacht (Kjaerheim et al., 2010;
Schernhammer et al., 2001). Risikosenkend wirkt sich ein junges Alter bei
erster ausgetragener Schwangerschaft aus (Lambe et al., 1994; Linos et al.,
2008). Die kumulative Dauer der Laktation und das junge Alter bei Laktation
senken das Risiko bei prämenopausalen Frauen an einem Mammakarzinom
zu erkranken. Ebenso gibt es Hinweise, dass gestillt worden zu sein vor
einem Mammakarzinom schützen kann (Kim et al., 2007; Lipworth et al.,
2000). Regelmäßige körperliche Aktivität kann das Mammakarzinomrisiko
senken (Sprague et al., 2007; Thune et al., 1997).
12
2.3. Behandlung des Mammakarzinoms
Die Behandlung des Mammakarzinoms richtet sich nach der Stadieneinteilung,
der Prognose der Erkrankung und der Einschätzung der Wirksamkeit der
geplanten Therapie. Patientinnen mit einer schlechten Prognose erhalten eine
umfangreichere Therapie als Patientinnen mit einer guten Prognose. Des
Weiteren können Tumor- oder Patientinnencharakteristika Hinweise auf die
Erfolgschancen einer Therapie geben wie z. B. der Hormonrezeptorstatus für
eine antihormonelle Therapie. Neben der Heilung ist auch die Erhaltung der
Lebensqualität ein wichtiges Ziel bei der Therapie des Mammakarzinoms.
Prinzipiell stehen Chemotherapie, Operation, Bestrahlung, Antihormontherapie
und zielgerichtete Therapie gegen spezifische Moleküle zur Verfügung (Chang
et al., 2001; Fasching et al., 2010; Harris et al., 1992b; Therasse et al., 2002).
2.3.1. Operation
Die Entscheidung für eine komplette Entfernung der Brust (Mastektomie) versus
einer brusterhaltenden Therapie (BET) wird von mehreren Faktoren abhängig
gemacht. Klar ist, dass die onkologische Sicherheit bei der operativen
Therapieentscheidung im Vordergrund steht (Pusic et al., 1999). Der Tumor
muss
mit
einem
tumorfreien
Resektionsrand
(R0)
exstirpiert
werden
(BlichertToft et al., 1997; Solin, 2006). Mikroskopisch soll der gemessene
Sicherheitsabstand zwischen Tumor und Resektionsrand 1 mm und mehr für
das invasive Karzinom betragen (O'Higgins et al., 1998) und beim duktalen
Carcinoma in situ (DCIS) sollte der Resektionsabstand 5 mm oder mehr
betragen. Beinhaltet das Resektat eines invasiven Karzinoms einen großen
Anteil
intraduktalen
Karzinoms,
wird
empfohlen
einen
minimalen
Resektionsrand von 5 mm in alle Richtungen einzuhalten, vor allem, wenn die
intraduktale Komponente bis an den Resektionsrand des invasiven Karzinoms
heranreicht (Kerlikowske et al., 2003; Schnitt et al., 1994). Die historische
radikale Mastektomie, welche von Halsted (1894) und Rotter (1896) zur
Therapie des Mammakarzinoms empfohlen wurde, umfasst die En-blocEntfernung des Brustdrüsenkörpers, des Pektoralmuskels, der ipsilateralen
13
axillären Lymphknotens und des axillären Fettgewebes. Die Inzision verläuft
normalerweise s-förmig geschwungen von der Axillamitte nach medial hin
abwärts
zum
Sternum
(Fisher,
1999).
Die
häufigen
Folgen
dieses
ausgedehnten chirurgischen Eingriffes sind eine ästhetische Entstellung,
eingeschränkte
ausgeprägtes
Beweglichkeit
Lymphödem
des
des
Armes
Arms
und
und
der
der
Schulter
Hand.
Die
und
ein
klassische
Mastektomie gilt seit vielen Jahren nicht mehr als das Standardverfahren zur
Behandlung des operablen Mammakarzinoms (Harris et al., 1992b; Ohsumi et
al., 2007; Veronesi et al., 2002a). Die radikale Mastektomie nach Halsted und
Rotter ist heute lediglich bei Erkrankungen indiziert, bei welchen eine Infiltration
des Musculus pectoralis major vorliegt und die gleichzeitig noch keine
Fernmetastasierung aufweisen (Harris et al., 1992a). Zur Vermeidung der
ausgeprägten Nebenwirkungen der radikalen Mastektomie und mit dem Wissen,
dass die Prognose für die Patientin weniger von der Radikalität der Operation
abhängt, wurde die modifizierte radikale Mastektomie entwickelt (Mattig et al.,
1997; van Dongen et al., 2000). Es handelt sich hierbei um eine Ablatio
mammae mit axillärer Lymphadenektomie. Zur Prognoseabschätzung werden
10 Lymphknoten der axillären Level I und II mitreseziert und auf einen
Tumorbefall hin untersucht. Der Musculus pectoralis mitsamt Gefäß- und
Nervenversorgung bleib erhalten. Diese Operation wird meist über einen
Stewart-Hautschnitt durchgeführt, welcher im Anschluss eine operative
Rekonstruktion ermöglicht (Fowble et al., 1993). Dieses Operationsverfahren
kommt zum Einsatz, wenn eine brusterhaltende Therapie z. B. aufgrund eines
ungünstigen Tumor-zu-Brustgrößenverhältnisses, der Multizentrizität, bei mehr
als drei Lokalrezidiven oder wegen des Ausbreitungsgrades kontraindiziert ist
(Pusic et al., 1999; Romics et al., 2008). Bei einem günstigen Tumor-zu-Brust
Größenverhältnis,
fehlender
Haut-
und
Brustinfiltration
und
günstigem
Tumorsitz wird heutzutage eine brusterhaltende Therapie (BET) durchgeführt.
Allerdings ist bei einer BET ohne folgende Bestrahlung im Vergleich zur
Mastektomie das Risiko für die Entstehung eines Lokalrezidivs um das Drei- bis
Vierfache erhöht (Arndt et al., 2008; Martin et al., 2007; Pusic et al., 1999).
Deshalb wird an die BET obligat eine nachfolgende Brustbestrahlung
angeschlossen. Bezüglich des Überlebens ist die BET in Kombination mit der
obligaten Bestrahlung der alleinigen, modifiziert radikalen Mastektomie
gleichwertig (Fisher et al., 2002; Veronesi et al., 2002b; Weaver et al., 2000).
14
Bei der BET wird entlang der Hautfalten bogenförmig über dem Tumor oder,
wenn von dort erreichbar, durch einen areolären Randschnitt inzidiert und der
Tumor mitsamt der Haut und einem Sicherheitssaum von mindestens 1 cm
nach allen Seiten entfernt. Das Resektat muss für die nachfolgende
histologische Aufarbeitung dreidimensional fadenmarkiert werden, sodass im
Falle einer erforderlichen Nachresektion die Resektionsränder sicher zu finden
sind. In Abhängigkeit von der Beziehung des Tumors zur Brustwarze wird diese
mitentfernt. Von einer zweiten Inzision aus werden die axillären Lymphknoten
entfernt (Krag et al., 1993; Martin et al., 2007; Takashima, 1998). Für
Patientinnen mit größeren Tumoren (> 2 cm) gibt es auch die Möglichkeit einer
neoadjuvanten, präoperativen Chemotherapie zur Tumorverkleinerung. Für
diese therapeutische Möglichkeit bleiben aber noch viele Fragen offen, weshalb
diese Therapieoption nicht außerhalb von Studien angeboten wird (Afonso and
Bouwman, 2008; Laenkholm et al., 2008). Der Lymphknotenstatus ist einer der
wichtigsten prognostischen Faktoren des Mammakarzinoms, deshalb gehört die
axilläre Lymphonodektomie bei der BET und der Mastektomie obligat zum
diagnostischen und therapeutischen Konzept (Fitzgibbons et al., 2000;
Guadagnoli et al., 1998; Krag et al., 1993). Sie dient darüber hinaus der
Resektion von Lymphknotenmetastasen und dem pathologisch-anatomischen
Staging. Derzeit wird die offene axilläre Lymphadenektomie gegenüber der
sogenannten Sentinel-Node-Lymphonodektomie diskutiert. Bei der SentinelTechnik wird peritumoral Patentblau und/oder Technetium injiziert, um die
ersten vom Tumorgebiet drainierenden Lymphknoten zu identifizieren. Diese
werden reseziert und histologisch aufgearbeitet. Sind diese tumorfrei, kann auf
eine weitere Lymphknotendissektion verzichtet werden. Der Vorteil dieses
Verfahrens liegt in der Schonung bestehender Lymphstrukturen (Krag et al.,
1993; Luini et al., 2005). Nach einer Mastektomie kann die Brust während
derselben Operation oder nach einer Latenzzeit rekonstruiert werden. Die
Rekonstruktion kann mit heterologem Material oder autologem Gewebe
erfolgen. Die Vielzahl der plastischen Rekonstruktionsverfahren umfasst z. B.
die thorako-epigastrischen, den Latissimus-dorsi- und den Rectus-abdominisSchwenklappen (Reavey and McCarthy, 2008; Sandelin et al., 2003).
15
2.3.2. Strahlentherapie
In den letzten Jahren haben sich viele Therapiekonzepte für die Therapie des
Mammakarzinoms etabliert. Die Strahlentherapie leistet einen wichtigen Beitrag
zur postoperativen lokalen Tumorkontrolle (Rutqvist et al., 2003). Die
Forschung auf diesem Feld beschäftigt sich vornehmlich mit der Frage, das
Strahlenfeld zu reduzieren ohne geografische Verluste in Kauf nehmen zu
müssen (Costa et al., 2004). In 80–90 % der Fälle entstehen Rezidive an oder
in der Nähe des Lumpektomieareals. Tumorbettferne Rezidive treten mit einer
Inzidenz von weniger als 6 % auf (Kuerer et al., 2004). Im Anschluss an eine
brusterhaltende chirurgische Therapie ist eine Bestrahlung der Brust und der
angrenzenden Thoraxwand obligat (Clarke et al., 2005; Vinh-Hung and
Verschraegen, 2004). Bei der konventionellen Bestrahlung des Tumorbettes
und
der
Restbrust
zeigen
viele
Studien
eine
Verbesserung
des
Gesamtüberlebens (Overgaard et al., 1997; van de Steene et al., 2000). Das
Ziel der adjuvanten Radiotherapie ist die lokale Tumor- und Rezidivkontrolle
(Cuzick et al., 1994; Early Breast Cancer Trialists' Collaborative, 1995). Die
postoperative Radiatio nach BET gilt zurzeit als obligat, denn sie kann die
Lokalrezidivrate von 30 % auf 5 % senken (Livi et al., 2007; Mannino and
Yarnold, 2009). Sie kann durch vier verhinderte Lokalrezidive einen
krebsbedingten Todesfall im Verlauf von 15 Jahren verhindern (Clarke et al.,
2005). Die Teilbrustbestrahlung, ein derzeit noch experimentelles und nur
innerhalb von Studien durchgeführtes Verfahren, umfasst üblicherweise die
Lumpektomiehöhle mit einem sehr geringen Gerät zu Wundabstand und kann
sowohl interstitiell als Brachytherapie als auch extern z. B. unter Anwendung
eines 3D-CRT-Gerätes (three-dimensional-conformal radiation therapy device)
verabreicht werden. Hintergrund und Vorteil ist die direkte Applizierbarkeit
deutlich höherer Strahlungsdosen sowie die Schonung durchstrahlter Gewebe
und Organe. Im Vergleich zwischen der Teilbrustbestrahlung und der
konventionellen Bestrahlung der Brust beträgt die kumulative 5-Jahres-Inzidenz
für Lokalrezidive in beiden Gruppen 1 % (p = 0,65). Es gab keinen Unterschied
im erkrankungsfreien Überleben (DFS), im Gesamtüberleben oder in der
Fernmetastasierung. Einschränkend ist jedoch zu bemerken, dass das Kollektiv
der Teilbrustbestrahlten eine ausgewählte Gruppe von Patientinnen darstellt,
16
welche keinesfalls das Gros der Patientinnen repräsentieren kann (Vicini et al.,
2003).
Weitere
Teilbrustbestrahlungsverfahren
sind
MammoSite®
( = Verwendung eines Remote-Afterloading Systems mit High Dose Rate
Brachytherapie) sowie TARGIT ( = targeted intra-operative radiation therapy),
eine
Teilbrustbestrahlungsmethode
Photonenbestrahlung.
Die
unter
Einsatz
Teilbrustbestrahlung
ohne
intraoperativer
ergänzende
Homogenbestrahlung der Brust ist experimentell. Deshalb soll sie nicht
außerhalb von Studien erfolgen (Graham and Fourquet, 2006; Sauer et al.,
2005). Bislang ist der therapeutische Wert einer regionalen Bestrahlung des
Lymphabflussgebietes noch nicht durch prospektive und randomisierte Studien
belegt, weshalb nur nach individueller Risikoeinschätzung eine Entscheidung
für die Bestrahlung getroffen werden sollte (Hoebers et al., 2000; Recht et al.,
2001).
17
2.3.3. Chemotherapie
Die Tumorbiologie ist ein stetig an Bedeutung gewinnender Faktor für die
Auswahl eines Therapieregimens. So sind die Hormonrezeptoren- und der
HER2-Rezeptorstatus neben dem Lymphknotenstatus an die wichtigste Stelle
der Prognosefaktoren gerückt, gefolgt vom Grading und anderen Faktoren.
Basis für die Entscheidung für ein spezifisches Regimen bildet die
Risikoklassifikation und die Prädiktion eines endokrinen Ansprechens des
Tumors. Bislang wurde die zytostatische Therapie mit den AC/EC/FECSchemata
(A = Adriamycin,
E = Epirubicin,
F = Fluorouracil,
C = Cyclophosphamid) bzw. dem veralteten CMF-Schema (M = Methotrexat)
durchgeführt. Immer mehr rücken nun auch die Taxane (T) in den Vordergrund
(Hortobagyi, 2003; Kaklamani and Gradishar, 2005). In Metaanalysen der Early
Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group (EBCTCG) konnte gezeigt werden,
dass die adjuvante Polychemotherapie mit oder ohne begleitende endokrine
Therapie das Gesamtüberleben in allen Altersgruppen unabhängig vom
Nodalstatus verbessert. Tamoxifen und Anthrazykline können jeweils für sich
alleine die relativen 15-Jahres-Mortalitätsraten um etwa 30 % senken, die
Kombination aus beiden vermindert die Mortalität noch deutlicher (EBCTCG,
2005). Die Auswahl der Art der adjuvanten Chemotherapie (CHT) und die
Risikoeinstufung erfolgt leitlinienbasiert (Bergh et al., 2001; Kreienberg, 2008).
Die CHT ist in den empfohlenen Dosierungen zu verabreichen. Bei einer zu
niedrigen Dosierung oder bei Reduktion der Zyklen droht ein Effektivitätsverlust.
Dosissteigerungen bei Cyclophosphamid oder Doxorubicin führen zu keiner
Effektivitätsverbesserung (Bonadonna et al., 1995; Fumoleau et al., 2003;
Henderson et al., 2003). Die Zytostatika können sequenziell oder simultan
verabreicht
werden.
Bei
erhöhtem
Rezidivrisiko
können
dosisdichte
Therapieschemata eingesetzt werden (Henderson et al., 2003; Untch et al.,
2009). Die adjuvante Kombinations-Chemotherapie sollte ein Anthrazyklin
enthalten. Die Indikationsstellung hierfür ist unabhängig vom Nodal- und
Rezeptorstatus. Sind die axillären Lymphknoten befallen, sollte zusätzlich ein
Taxan gegeben werden (Bria et al., 2006; Levine and Steering Comm Clin
Practice, 2001; Shenkier et al., 2004). Die nachgewiesenen positiven Effekte
einer adjuvanten CHT auf die Rezidiv- und Sterberisiken sind bei Frauen <50
Jahre am deutlichsten, dennoch profitieren auch postmenopausale Frauen. Die
18
Überlegenheit anthrazyklinhaltiger Schemata gegenüber CMF konnte nur in
Dreierkombinationen FAC, FEC in adäquater Dosierung und ausreichender
Zykluszahl (6 Zyklen) nachgewiesen werden. Eine Behandlung von über 6
Monaten bringt keinen zusätzlichen Benefit (Abe et al., 2005; Bria et al., 2006;
Campone et al., 2005). Die neoadjuvante systemische Therapie gilt heute als
weitere Therapieoption für Patientinnen mit lokal fortgeschrittenen, primär
inoperablen oder inflammatorischen Mammakarzinomen. Die neoadjuvante
CHT darf weiterhin bei allen Patientinnen durchgeführt werden, bei denen einen
Chemotherapie indiziert ist (Costa et al., 2009; Sarid et al., 2006). Sie stellt eine
weitere Therapieoption für Patientinnen dar, denen eigentlich eine Mastektomie
empfohlen wird, die aber eine brusterhaltende Therapie wünschen (Brito et al.,
2001; Kaufmann et al., 2006). Bei primär inoperablen Tumoren kann durch die
neoadjuvante Therapie eine operable Ausgangssituation vor der Operation
erreicht werden. Die Resektion ist dann in den neuen Grenzen möglich, wenn
dadurch eine komplette Resektion mit ausreichendem Sicherheitsabstand
erzielt werden kann (Kaufmann et al., 2003; Sarid et al., 2006). Bezüglich des
Langzeitüberlebens besteht kein Unterschied zwischen neoadjuvant und
adjuvant verabreichter CHT (Mauri et al., 2005). Bei postmenopausalen
Patientinnen mit hormonrezeptorpositiven Tumoren kann, wenn CHT oder
Operation nicht möglich sind, eine endokrine Therapie mit Aromatasehemmern
der dritten Generation durchgeführt werden (Ellis et al., 2001; Smith et al.,
2005).
19
2.3.4. Endokrine Therapie
Östrogen- und Progesteronrezeptoren sind Kernproteine, an die Östrogen und
Progesteron
binden
und
die
unter
anderem
das
Wachstum
des
hormonsensitiven Mammakarzinoms regulieren. Der Östrogenentzug ist die
wichtigste Methode in der anti-endokrinen Behandlung des Mammakarzinoms.
Tumoren
prämenopausaler
Frauen
sind
in
der
Hälfte
der
Fälle
hormonrezeptorpositiv (Anderson et al., 2001). Postmenopausal beträgt der
Anteil
etwa
75 %
(Chlebowski
et
al.,
2007).
Die
Prognose
bei
hormonrezeptorpositiven Frauen ist günstiger. Jede Patientin mit einem
positiven Hormonrezeptorstatus sollte eine anti-endokrine Therapie erhalten,
welche nach Abschluss der Chemotherapie begonnen wird (Bentrem et al.,
2003; Kreienberg, 2008). Bei prämenopausalen Frauen ist das Ovar der
Hauptsyntheseort für Östrogene und Gestagene. Hier bietet sich die
medikamentöse ovarielle Suppression mittels GnRH-Analoga an. Auch die
operative Ablation kann für manche Patientinnen erwogen werden. Die
Ovarsuppression mittels GnRH-Analoga oder Ovarektomie ist in ihrer
Wirksamkeit einer CMF-Chemotherapie vergleichbar. Die Therapie mit GnRHAnaloga
sollte
mindestens
zwei
Jahre
andauern.
Der
Effekt
einer
Ovarsuppression nach Chemotherapie ist ungewiss (Cuzick et al., 2007;
Robertson and Blamey, 2003; von Alten et al., 2006). Der Nutzen einer
Tamoxifeneinnahme, welche üblicherweise mit 20 mg/d dosiert und für fünf
Jahre gegeben wird, besteht für Frauen jeden Alters, unabhängig vom
Menopausenstatus, vom Nodalstatus oder dem Einsatz einer adjuvanten CHT.
Sie kann das relative Risiko für ein Rezidiv um 40 % und die Sterblichkeit um
31 % nach 15 Jahren senken (Abe et al., 2005; EBCTCG, 2005). Nach der
Menopause wird die Hauptmenge des Östrogens durch Aromatisierung von
Androgenen in der Leber, dem Muskel und insbesondere dem Fettgewebe
synthetisiert.
Hier
kommen
zur
endokrinen
Therapie
beim
hormonrezeptorpositiven Mammakarzinom vor allem Aromatasehemmer zum
Einsatz
(Howell
et
al.,
2005).
Die
Hauptnebenwirkungen
von
Aromataseinhibitoren sind muskuloskelettale Schmerzen und Osteoporose.
Dafür
treten
Hitzewallungen,
thrombembolische
Ereignisse
und
Endometriumkarzinome seltener als bei Tamoxifen auf. Tamoxifen und
Aromatasehemmer können auch sequenziell nacheinander gegeben werden.
20
Bei dieser Therapie folgt auf zwei Jahre Tamoxifen für zwei bis drei Jahre eine
Behandlung mit einem Aromataseinhibitor (Abe et al., 2005; Long et al., 2004).
21
2.3.5. Molekulare und zielgerichtete Therapie
Trastuzumab ist ein rekombinanter Anti-HER2-Antikörper, der gezielt und mit
hoher Affinität die extrazelluläre Domäne des HER2-Wachstumsrezeptors
bindet und so die Signaltransduktion und konsekutiv die Proliferation von
Tumorzellen verhindert (Slamon et al., 2001). Der HER2-Expressionsstatus
wird mittels Immunohistochemie oder FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung)
zum Nachweis einer Genamplifikation bestimmt. In der Immunhistochemie
werden Werte von 0 bis 3+ vergeben (Wolff et al., 2007). Patientinnen mit
einem Wert von 3+ sind sicher positiv und sollten eine Behandlung mit
Trastuzumab über ein Jahr erhalten. Diese kann simultan zu einem Taxan oder
sequenziell zu einer Anthrazyklin-Taxan-Chemotherapie verabreicht werden
(Baselga et al., 2006; Slamon et al., 2006). Trastuzumab vermag in
Kombination oder Sequenz zur Standard-CHT die Rezidivrate bei HER2überexprimierenden Tumoren um 45 % bis 50 % zu senken. Die Mortalität wird
um etwa 30 % gesenkt (Joensuu et al., 2006). Die Therapiedauer beträgt ein
Jahr. Als relevante Komplikation ist die Kardiotoxizität von Trastuzumab, vor
allem in Kombination mit Anthrazyklinen, zu nennen. Die Inzidenz beträgt bis zu
4,1 % für klinisch relevante Herzinsuffizienzen (New York Heart Association
NYHA III/IV), weshalb ein Monitoring der linksventrikulären Auswurffraktion
obligat ist (Romond et al., 2005).
22
2.4. Therapieentscheidung beim Mammakarzinom
Das Wissen über die Prognoseveränderung oder den Erfolg einer möglichen
Therapie ist die wichtigste Grundlage für die Entscheidung über die Art und den
Umfang der Therapie. Noch wichtiger wird dieses Wissen im Kontext der heute
in beträchtlicher Anzahl zur Verfügung stehenden Therapieoptionen und der mit
ihnen verbundenen Nebenwirkungen. Diese Faktoren, die eine Prognose
und/oder eine Prädiktion auf das Überleben der Patienten voraussagen, geben
Wahrscheinlichkeiten für den Eintritt eines bestimmten Ereignisses (z. B. Tod
oder Rezidiv) an. Ein Prognosefaktor ist hierbei, unabhängig von der Therapie,
mit der Eintrittswahrscheinlichkeit eines bestimmten Ereignisses verbunden.
Der Prädiktivfaktor hingegen ist für die Eintrittswahrscheinlichkeit des
Ereignisses unter der Voraussetzung einer spezifischen Therapie verbunden.
Vom Prädiktivfaktor ist der Surrogatmarker abzugrenzen, der im Therapie- oder
Krankheitsverlauf
noch
vor
dem
Erreichen
des
Endpunktes
vorherzusagen vermag (Abbildung 1) (P.A. Fasching, 2005).
Abbildung 1: Prognose- und Prädiktivfaktoren (P.A. Fasching, 2005)
diesen
23
2.4.1. Prognosefaktoren und Prädiktivfaktoren
Therapieentscheidungen
beim
Mammakarzinom
werden
aufgrund
der
Risikoeinschätzung für die Endpunkte Rezidiv und Tod getroffen. Die
Risikoeinschätzung basiert auf empirischen Erfahrungswerten für Biomarker,
welche über die Korrrelation des Biomarkers mit den jeweils betrachteten
Endpunkten an großen Kollektiven valide Aussagen zulassen. Akzeptierte
Biomarker für das Mammakarzinom sind das Alter, die Klassifikation
entsprechend dem TNM-Atlas, das Grading, die Lymph- und Gefäßinfiltration,
der Steroidhormonrezeptorstatus und der HER2-Status (Broet et al., 1999;
Fasching et al., 2005). Prognosefaktoren können für das Überleben oder das
Rezidiv (Endpunkte) gut oder schlecht sein. Ein Prognosefaktor liefert eine
Aussage über den klinischen Verlauf ab dem Zeitpunkt der Diagnose der
Erkrankung, unabhängig von einer Therapie. Obgleich er unabhängig von einer
eventuellen Therapie ist, kann er Aufschluss über ein mögliches Ansprechen
einer therapeutischen Option geben (Fasching et al., 2005). Ein Prädiktivfaktor
liefert eine Aussage über den klinischen Verlauf in Abhängigkeit von einer
eingeleiteten Therapie, jedoch sind prädiktive Aussagen nur für die jeweiligen
Subgruppen entsprechend der Therapieoption valide (Fasching et al., 2005;
McGuire and Clark, 1992). Die Notwendigkeit dieser Differenzierung wird
deutlich, wenn man den folgenden Zusammenhang betrachtet. 30 % der
nodalnegativen Patientinnen würden ohne eine eingeleitete Therapie an ihrem
Mammakarzinom versterben. Das bedeutet aber auch, dass 70 % der Frauen
dieses Kollektivs ohne Therapie überleben würden (McGuire and Clark, 1992).
In Anbetracht dieser Zahlen stellt sich die Frage, ob es Determinanten, also
Prädiktiv- oder Prognosefaktoren gibt, die Frauen identifizieren können, welche
von einer Therapie profitieren und solche, denen eine Therapie erspart werden
kann. Der Vorteil wird in einer Veränderung der Prognose gemessen. Oftmals
sind
aber
die
Biomarker,
welche
üblicherweise
Marker
der
klinisch-
pathologischen Aufarbeitung des Tumormaterials oder des klinischen Stagings
sind, nicht eindeutig als Prognose- oder Prädiktivfaktor zu unterscheiden. Für
Patientinnen ist der Steroidhormonrezeptorstatus im Zusammenhang mit einer
Antihormontherapie sowohl ein prognostischer als auch ein prädiktiver Faktor.
Der Steroidrezeptorstatus lässt sich hierbei oft nicht eindeutig der Prognose
oder der Prädiktion zuordnen, weil Therapien oft multimodal verabreicht werden
24
und sich gegenseitig beeinflussen (Abbildung 2). Hormonrezeptornegative
Patientinnen profitieren nicht von einer endokrinen Therapie, sprechen aber
besser auf eine Chemotherapie an (Broet et al., 1999; Fasching et al., 2005;
Henderson et al., 2003).
Abbildung 2: Prognoseänderung, Faktoreigenschaft, Therapie
(Fasching et al., 2005)
Aus Abbildung 2 wird ersichtlich, dass sich beim gemischten Prognose- und
Prädiktivfaktor die Prognose des Endpunktes mit der Durchführung einer
25
Therapie verbessert, unabhängig davon, ob der Faktor negativ oder positiv ist,
wenngleich natürlicherweise eine größere Prognoseverbesserung im Falle einer
Markerpositivität
zu
erwarten
ist.
Allerdings
ist
die
Steigerung
der
Prognoseverbesserung bei einem reinen Prognosefaktor, wenn er auch negativ
ist, größer als bei einem gemischten Faktor. Daraus folgt, dass der reine
Prognosefaktor verglichen mit einem reinen Prädiktivfaktor und verglichen mit
einem gemischten Prognose- und Prädiktivfaktor die größte Aussagekraft hat,
unabhängig davon, ob eine Therapie durchgeführt wird oder nicht.
2.4.2. Klinisch etablierte Prognosefaktoren
Zu einem Viertel drainieren die Lymphabflusswege aller Quadranten in die
Lymphabflussbahnen entlang der Arteria mammaria interna. Metastasen in
diesem Lymphabflussweg kommen ohne die Beteiligung axillärer Lymphknoten
nur
in
etwa
5%
der
Fälle
vor
(Morrow
and
Foster,
1981).
Der
Hauptlymphabfluss der Brust erfolgt über die Axillärlymphknoten, wobei die
Anzahl
der
befallenen
Lymphknoten
einen
der
aussagekräftigsten
Prognosefaktoren darstellt (siehe Tabelle 1) (Lønning, 2007).
Tabelle 1: Rezidiv, 5-Jahresüberlebensrate (5-JÜR) und Lymphknotenstatus
(Valagussa et al., 1978)
Anzahl der LK (+)
Rezidiv nach 5 Jahren
10-Jahres-Überlebensrate
In %
in %
0
20
65–80
1–3
30–40
35–65
4
44
-
>4
54–82
13–24
(+) = befallene Lymphknoten
Im Falle histologisch gesicherter Mikrometastasen in Lymphknoten ist deren
Bedeutung bezüglich der Prognose nicht gesichert. Sie dürfen deshalb nicht zur
Aussage über eine schlechtere Prognose herangezogen werden (Friedman et
al., 1988).
26
Die Tumorgröße korreliert positiv mit dem Ausmaß der Lymphknotenbeteiligung
(Tabelle 2) (Abner et al., 1998).
Tabelle 2: Tumorgröße und Lymphknotenbeteiligung (Rosen et al., 1993)
Tumorgröße
Axilläre Lymphknotenbeteiligung
in %
<1cm
<20–30
1–2 cm
27–39
2–3 cm
29–57
Duktale oder lobuläre Läsionen mit einer Größe <1cm haben eine gute
Prognose, werden jedoch selten in diesem Stadium entdeckt. Eine Studie mit
20 Jahren Nachsorge nach Operation bei 767 Patientinnen, welche zum
Zeitpunkt der Diagnose mit Tumoren des Stadiums T1–T2 und negativem
Lymphknotenstatus diagnostiziert wurden, und die keine Chemo- oder
Radiotherapie erhielten, zeigte, dass 88 % ein rezidivfreies Überleben von 20
Jahren hatten. Lediglich 12 % erlitten in dieser Zeit einen Rückfall (Rosen et al.,
1993). Der Hormonrezeptorstatus ist ebenfalls ein wichtiger Prognosefaktor. Die
Detektion von Östrogen (ER)- und Progesteronrezeptoren (PR) erfolgt
immunohistochemisch. Frauen mit einem ER-positiven Mammakarzinom in
einem frühen Stadium und ohne postoperative CHT haben im Vergleich zu ERnegativen Frauen eine 5–10 % geringere Wahrscheinlichkeit, nach 5 Jahren ein
Rezidiv zu entwickeln. Dieser Vorteil schwindet jedoch mit zunehmender Dauer
der Nachsorge (Allred et al., 1998). Ein positiver ER-Status ist deshalb ein
Prognosefaktor für das Rezidivmuster und beeinflusst damit eher das
rezidivfreie Überleben (DFS) als das Gesamtüberleben (Adami et al., 1985).
ER-positive Tumoren kommen häufiger bei älteren Patientinnen vor, sind
histologisch
meist
Proliferationsindex
gut
und
differenziert,
haben
häufig
einen
sind
diploid
(Arisio
et
meist
al.,
niedrigen
2000).
Östrogenrezeptorpositive Karzinome sind zudem weniger häufig assoziiert mit
Amplifikation, Mutation oder Verlust von mammakarzinomassozierten Genen
wie z. B. p53, HER2 und dem epidermal growth factor receptor (EGFR), welche
alle mit einer schlechteren Prognose einhergehen (Diab et al., 2000; Wenger et
al.,
1993).
Östrogenrezeptorpositive
Karzinome
tendieren
häufiger
zur
27
Entwicklung klinisch apparenter Metastasen im Knochen- und Genitaltrakt.
Östrogenrezeptornegative Karzinome metastasieren eher in das Gehirn und die
Leber, was mit einem schlechteren Überleben assoziiert ist (Andrulis et al.,
1998).
Für
das
Ansprechen
auf
eine
Antihormontherapie
ist
der
Hormonrezeptorstatus der stärkste Prädiktivfaktor (Rody et al., 2005). Des
Weiteren ist das Grading ein essentieller Prognosefaktor. Das Grading ist ein
vom Pathologen determinierter morphologischer Marker, der die Abweichung
des untersuchten Gewebes vom originären Gewebe angibt. Die UICC
unterscheidet drei Differenzierungsgrade (Tabelle 3). Eine Kodierung mit 4 und
9 bezeichnet technische Sonderzustände.
Tabelle 3: Grading gemäß UICC
Grad 1 = gut differenziertes malignes Gewebe, es besteht eine hohe Ähnlichkeit
zum benignen Gewebe
Grad 2 = mäßig differenziertes malignes Gewebe
Grad 3 = schlecht differenziertes malignes Gewebe
Grad 4 = nicht differenziertes malignes Gewebe; Die Zugehörigkeit zu einem
Gewebe kann nur mit Hilfe anderer Verfahren (IHC) bestimmt werden.
Grad 9 = Grad der Differenzierung ist nicht zu beurteilen.
Wichtige Zuordnungsparameter für den Pathologen sind die Form der Zellkerne,
die Zellkerngröße im Verhältnis zur Zellgröße und die Zellteilungsaktivität. Für
die verschiedenen Tumoren wurden weiterhin spezifische Einteilungsparameter
entwickelt. In multivariaten Analysen behält das Grading neben der Tumorgröße
und dem Lymphknotenstatus eine signifikante, unabhängige Aussagekraft. In
Zusammenführung dieser Prognosefaktoren wurde der Nottingham-PrognoseIndex entwickelt (Kollias et al., 1997). Die Invasion von Tumorgewebe in
umliegende Blut- und Lymphgefäße erlaubt als eigenständiger Faktor ebenfalls
eine Aussage über die Prognose. Bislang zeigen Studien, dass eine Infiltration
in die umliegenden Gefäße und Lymphbahnen mit einem erhöhten Risiko für
Lokalrezidive
und
Fernmetastasen
assoziiert
ist.
Studien
mit
langem
Beobachtungszeitraum konnten schon früh nachweisen, dass das Risiko für
Rückfall und Tod erhöht ist (Broet et al., 1999; Gasparini et al., 1994).
28
2.4.3. Kombinierte Prognose- und Prädiktivfaktoren
Kombinierte
Prognose-
und
Prädiktivfaktoren
sind
Biomarker,
welche
unabhängig oder abhängig von einer durchgeführten Therapie die Prognose zu
beeinflussen vermögen. Das HER2-Onkogen, welches auf 17q21 lokalisiert ist,
kodiert für ein 185 kD schweres, transmembranöses Glykoprotein mit
intrazellulärer Tyrosinkinaseaktivität (Pietras et al., 1995b; Slamon et al., 1989).
Der Rezeptor für dieses Onkogen gehört zur Familie der epidermalen
Wachstumsfaktoren
(EGFR).
Der
Rezeptor
ist
entscheidend
für
die
intrazelluläre Signaltransduktion, welche für Zellproliferation und -teilung
verantwortlich ist. Die Familie der human epidermal growth factor receptors
(HER) umfasst die Rezeptoren EGFR (HER1), c-erbB-2 (HER2), c-erbB-3
(HER3),
c-erbB-4
(HER4),
welche
allesamt
transmembranöse
Tyrosinkinaserezeptoren sind und direkt und/oder indirekt an der Regulation
des Zellwachstums und der Proliferation mitwirken (Pietras et al., 1995b). Es
besteht eine hohe Ähnlichkeit mit anderen Wachstumsfaktoren, wie z. B. dem
Insulin-like-growth-factor-Rezeptor (Kaufmann et al.) oder dem Transforminggrowth-factor-Rezeptor (TGFR). Der aktive Rezeptor ist ein Dimer. HER3 und
HER4 induzieren allein keine Signaltransduktion, können aber, wenn sie mit
HER2 ein Heterodimer bilden, über die Tyrosinkinase die Signaltransduktion in
Gang setzen. Beim Mammakarzinom gibt es eine komplexe Familie von
Liganden, welche vor allem durch selbststimulierende Rückkopplung ihre
Proliferation steigern (Hagen et al., 2007; Pegram et al., 2000). EGFR ist in
Mammakarzinomen selten amplifiziert und überexprimiert. Bei Überexpression
ist die Prognose ungünstig, weil eine Resistenz gegenüber einer endokrinen
Therapie, eine Medikamentenresistenz und eine umgekehrte Korrelation mit
dem ER-Status besteht (DiGiovanna et al., 2005). Eine Amplifikation von HER2
oder eine Überexpression des Proteins ist in 10–30 % der Fälle zu beobachten.
Jede normale epitheliale Zelle inklusive der benignen Brustzelle exprimiert
20.000
bis
50.000
überexprimierende
HER2-Rezeptoren
Zellen
zeigen
an
Millionen
ihrer
von
Oberfläche.
Rezeptoren
auf
HER2ihrer
Zelloberfläche. Auf normalen Brustdrüsenzellen und Zellen mit Atypien oder
Hyperplasien sind die Rezeptoren vorhanden, aber nicht überexprimiert
(Klapper et al., 1999; Slamon et al., 1989). Die United States Food and Drug
Administration hat zwei kommerzielle FISH-Assays (Path Vision HER2 DNA
29
Probe Kit, Vysis, Inc und INFORM HER2 Test, Ventana, Inc.) und einen IHC Kit
(Herceptest, DAKO, Inc.) für folgende Anwendungssituationen zugelassen:
1. Selektion von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom für die
Trastuzumabtherapie,
2. Prognoseabschätzung bei lymphknotennegativen Patientinnen (INFORM
HER2-Test),
3. Auswahl von Doxorubicin in der adjuvanten Therapie (PathVision HER2
DNA Probe Kit).
30
Tabelle 4: Korrelation IHC und FISH (Couturier et al., 2000; Middleton et al.,
2009)
IHC (+)
FISH-Amplifikation in %
HER2
3+
90
HER2
2+
20–25
HER2
0–1+
10
Die Überexpression von HER2-Rezeptoren ist mit einer schlechten Prognose
assoziiert und wurde in vielen Studien als Marker für eine schlechte Prognose
bei Patientinnen mit positivem Lymphknotenbefall bestätigt (Slamon et al.,
2001). Eine Überexpression findet sich beim DCIS vom Komedotyp und ist
beim DCIS generell mit einem hohen Neovaskularisationsgrad und Aneuploidie
sowie invers proportional mit dem Hormonrezeptorstatus vergesellschaftet (van
de Vijver et al., 1988). Der HER2-Rezeptor ist ebenfalls beim inflammatorischen
Mammakarzinom und häufig beim Morbus Paget der Mammille unabhängig von
einem begleitenden DCIS überexprimiert. Die Überexpression von HER2 ist
eher ungewöhnlich bei BRCA1/2-assoziierten Tumoren, aber doppelt so häufig
beim DCIS im Vergleich zum invasiven Mammakarzinom (Mass et al., 2005).
Karzinome mit HER2-Rezeptor-Überexpression sind in der Regel deutlich
schlechter
differenziert,
hormonrezeptornegativ
und
lymphknotenpositiv.
Außerdem korreliert der HER2-Status mit der Aggressivität der Erkrankung und
ist umgekehrt proportional mit der Prognose assoziiert (Gusterson et al., 1992;
Tandon et al., 1989). Die Bestimmung des HER2-Status gehört heute zur
Routinediagnostik (Fitzgibbons et al., 2000). Der HER2-Status ist ein Prädiktor
des Ansprechens auf eine adjuvante endokrine Therapie. Zwischen den HER2und
den
ER-Signaltransduktionskaskaden
existiert
ein
physiologischer
Crosstalk, der in vitro die Tamoxifenresistenz in ER-positiven humanen
Mammakarzinomzellen erklären kann (Pietras et al., 1995a). Eine relative
Resistenz HER2-positiver Frauen gegenüber einer endokrinen Therapie konnte
auch in vivo beobachtet werden. Es existieren zahlreiche Studien, einerseits
solche, die bei einer HER2-positiven Ausgangslage und zusätzlicher endokriner
Therapie eine schlechtere Prognose stellen, als auch jene, die keinen Einfluss
oder gar einen positiven Effekt nachweisen konnten. Es zeigte sich, dass die
31
Interferenz im Speziellen mit Tamoxifen assoziiert ist und deshalb der HER2Status wohl eher prognostischen als prädiktiven Charakter hat (Shou et al.,
2004). Der HER2- Status ist ein Prädiktor für die Effektivität einer adjuvanten
Chemotherapie (Ellis et al., 2001). Das Expertengremium für Tumormarker
beim Mammakarzinom der „American Society of Clinical Oncology“ stellte fest,
dass
immunhistochemisch
determinierte
Überexpression
von
HER2
in
Mammakarzinomen zur Identifikation von Patientinnen führt, die von einer
anthrazyklinhaltigen
adjuvanten
Chemotherapie
besonders
profitieren.
Umgekehrt darf aber ein negativer HER2-Status nicht zum Zurückhalten bei der
Indikation für eine anthrazyklinhaltige CHT führen (Ellis et al., 2001). Beim
metastasierten Mammakarzinom liegen noch keine ausreichenden Daten vor,
um eine HER2-statusabhängige Therapieempfehlung bezüglich Anthrazyklinen
oder Taxanen auszusprechen (Bast et al., 2001; Penault-Llorca et al., 2001;
Viale et al., 2003).
32
Tabelle 5 gibt einen zusammenfassenden Überblick über die bekannten
Prognose- und Prädiktivfaktoren.
Tabelle 5: Etablierte und neue Prognose- und Prädiktivfaktoren (Fasching et al.,
2005)
(+: Zusammenhang in mehreren Studien bewiesen; (+): Zusammenhang wahrscheinlich; -: kein
Zusammenhang gezeigt)
Etablierte und neue Prognose- und Prädiktivfaktoren
Biomarker
Prognosefaktor
Prädiktivfaktor
Tumorgröße
+
-
Lymphknotenstatus
+
-
Lymphgefäßinvasion
+
-
Grading
+
(+)
Proliferationsmarker
+
(+)
Alter
+
-
ER-Status
+
+
PR-Status
(+)
+
HER2-Status
+
+
uPA/PAI
+
+
Genexpressionsprofile
+
(+)
Biomarkerset nach Paik et al.
+
-
Topo II alpha
+
+
Zirkulierende Tumorzellen
+
(+)
(CTC´s)
Knochenmarkmikrometastasen +
-
P53-Mutationen
-
+
33
2.4.4. Topoisomerase IIα
Ein weiterer Prädiktivfaktor für das Ansprechen der Anthrazyklintherapie ist die
Amplifikation des Gens Topoisomerase IIα (TOP2A) (Knoop et al., 2005;
Tanner et al., 2006). Das TOP2A-Gen kodiert für ein 170 kD Enzym, welches
das Aufbrechen und die Wiedervereinigung von doppelsträngiger DNA
katalysiert, um sogenannte DNA-Supercoils während der Replikation zu
entspannen. Die Typ-II-Topoisomerasen sind wichtige Enzyme, die die
Replikation von DNA ermöglichen (Slamon and Press, 2009). Des Weiteren
spielen sie eine fundamentale Rolle in nukleären Prozessen wie z. B. der
Transkription, der chromosomalen Strukturgebung und der Kondensation. Das
TOP2A-Gen ist in gesunden diploiden Zellen in zwei Kopien vorhanden und ist
ebenso wie HER2 auf 17q21 lokalisiert (Sng et al., 1999). TOP2A wurde als
Proliferatiosmarker detektiert. Die Expression des Enzyms variiert mit dem
Zellzyklus sowohl in gesunden als auch in karzinomatösen Zellen (Smith et al.,
1993). Die Expression von TOP2A korreliert positiv mit der Expression von Ki67
(Mueller et al., 2004). Nur 20 % der TOP2A-überexprimierten Fälle gingen mit
einer Genamplifikation von TOP2A einher, jedoch korrelierte in 93 % der
TOP2A-amplifizierten Fälle die TOP2A-Überexpression (Callagy et al., 2005;
Olsen et al., 2004). Die Typ-II-Topoisomerasen sind eines der Ziele der
Anthrazyklintherapie (Hortobágyi, 1997). Ob nun die TOP2A-Überexpression
oder die Genkopienveränderung des TOP2A-Gens mit der Effektivität einer
Anthrazyklintherapie assoziiert ist, ist zum aktuellen Zeitpunkt noch strittig
(Slamon D et al., 2007). Eine Studie der Danish Breast Cancer Group mit
insgesamt 773 Patientinnen zeigte, dass die Aberration von TOP2A signifikant
mit einem kürzeren rezidivfreien Überleben (p<0,0001) und kürzerem
Gesamtüberleben (p<0,0001) vergesellschaftet ist (Nielsen et al., 2008). Fälle
mit einer Deletion von TOP2A hatten eine schlechtere Prognose als TOP2Aamplifizierte Mammakarzinome (Knoop et al., 2005). In einem Cox-proportionalhazards-Modell erwies sich die Amplifikation von TOP2A als signifikanter und
unabhängiger Prognosefaktor für das recurrence free survival (RFS) und das
overall survival (OS) (Brase et al., 2010). Bei der Stratifizierung nach dem
Therapiearm, welcher entweder anthrazyklinbasiert oder methotrexatbasiert
gestaltet wurde, zeigte sich für den Endpunkt RFS eine signifikante
Risikoreduktion um 61 % (p = 0,002) und für den Endpunkt OS um 51 %
(p = 0,01)
für
34
TOP2A-amplifizierte
Mammakarzinome
im
Anthrazyklintherapiearm (Nielsen et al., 2008). Es gibt zunehmende Evidenz,
dass
der
TOP2A-Genamplifikationsstatus
ein
Prognosefaktor
und
ein
Prädiktivfaktor für die Anthrazyklintherapie ist (Brase et al., 2010; Rody et al.,
2009). Wie bereits erwähnt, kommt eine Amplifikation von TOP2A nur
zusammen mit einer Amplifikation von HER2 vor. Ungefähr 30 % aller HER2positiven Tumoren haben auch eine Amplifikation von TOP2A. Umgekehrt
kommt eine TOP2A-Amplifikation nie ohne eine HER2-Amplifikation vor.
Hinweise auf eine unterschiedliche Effektivität der Anthrazykline in der HER2negativen Patientinnengruppe gibt es deswegen bislang nicht (Hicks et al.,
2005; Konecny et al., 2010).
35
2.5. Rationale und Fragestellung
Mit dem bisherigen Stand des Wissens ist klar, dass Patientinnen mit einem
HER2-positiven Tumor besser auf eine anthrazyklinhaltige Chemotherapie
ansprechen als HER2-negative. Insbesondere die Patientinnen, die eine zur
HER2-Amplifikation
zusätzliche
TOP2A-Amplifikation
zeigen,
scheinen
besonders von einer solchen Therapie zu profitieren. Relativ wenig ist bekannt
über weitere Biomarker, die in Zusammenhang mit TOP2A stehen. So könnten
auch genetische Polymorphismen mit dem Therapieansprechen und der
Prognose in Zusammenhang stehen.
Des Weiteren ist ebenfalls wenig über die Mechanismen der TOP2AAmplifikation bekannt. Da es Anhaltspunkte für einen Zusammenhang zwischen
genetischen Alterationen und dem Amplifikationsmuster der entsprechenden
Genregion gibt, soll sich diese Arbeit mit folgenden Fragen beschäftigen:
1) Haben genetische Polymorphismen im TOP2A-Gen einen Einfluss auf
die Prognose von Mammakarzinompatientinnen?
2) Stehen genetische Polymorphismen in Zusammenhang mit der TOP2AAmplifikation?
3) Bieten
genetische
Patientinnengruppe
Polymorphismen
weitere
Chemotherapie-Effektivität?
Hinweise
in
auf
der
eine
HER2-positiven
differentielle
36
3. Material und Methoden
3.1. Beschreibung der Patientinnenkohorte
Für die Fragestellung stand die Patientinnenkohorte der Bavarian Breast
Cancer Cases and Controls Studie (BBCC) zur Verfügung. Die BBCC ist eine
Kohorten-Kontroll-Studie und wurde konzipiert, um Suszeptibilitätsfaktoren und
Prognosemarker für die Erkrankung Mammakarzinom zu diagnostizieren. In
den Kohorten-Arm konnten Patientinnen mit einem histologisch gesicherten
Mammakarzinom eingeschleust werden und in den Kontrollarm gesunde
Frauen, bei welchen in ihrem bisherigen Leben keine Krebserkrankung
diagnostiziert worden ist. Für die vorliegende Arbeit wurde lediglich der
Kohorten-Arm der Studie untersucht. Der Rekrutierungszeitraum lag zwischen
2002 und 2006. 1.387 Mammakarzinompatientinnen konnten gewonnen werden,
bei denen die Diagnose nicht länger als ein Jahr zurücklag. Für die Studie liegt
ein positives Ethikvotum der Ethikkommission des Universitätsklinikums
Erlangen vor und alle Frauen gaben ihr schriftliches Einverständnis zur
Teilnahme an der Studie. Alle Patientinnen füllten in einem Interview einen
epidemiologischen Fragebogen aus und die patientinnenbezogenen und
krankheitsbezogenen Daten wurden aus der Krankenakte dokumentiert. Zur
Erfassung der Rezidive, der Fernmetatasen und Todesfälle wurden die
Patientinnen einmal pro Jahr kontaktiert, wenn die Nachsorge nicht ohnehin im
Brustzentrum des Universitätsklinikums erfolgte. Todesdaten wurden über
spezifische Abfragen bei den Einwohnermeldeämtern für alle Patientinnen
eingeholt. Für die vorliegende Auswertung wurde ein Datenbankschluss am 31.
August 2009 durchgeführt. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug zu
diesem Zeitpunkt 6,82 Jahre.
37
3.2. Datenmanagement
Die Frauenklinik des Universitätsklinikums Erlangen ist ein zertifiziertes
Brustzentrum der Deutschen Krebsgesellschaft, der Deutschen Gesellschaft für
Senologie
und
der
European
Society
of
Mastology
(EUSOMA).
Die
Zertifizierung ist auf eine Qualitätskontrolle und Qualitätsverbesserung
ausgerichtet. Teil dieser Zertifizierung ist eine prospektive Dokumentation.
Hierfür ist in der Frauenklinik ein Dokumentationssystem (DOMAS Version
2.0©) eingerichtet worden. Es erfasst die Krankengeschichte der Patientinnen
und gewährleistet eine organspezifische Tumordokumentation. Des Weiteren ist
in die Datenerfassung eine Reihe von epidemiologischen Parametern integriert,
die mit dem Risiko für das Entstehen einer Mammakarzinomerkrankung in
Verbindung gebracht werden können und die dem von den Patientinnen
ausgefüllten Fragebogen entsprechen. Die klinischen Daten wurden den
Originalbefunden der Krankenakte entnommen und über die Software DOMAS
Version 2.0© eingepflegt. Im Rahmen der Erstdokumentation der Erkrankung
wurde der Tumorstatus entsprechend der TNM-Klassifikation dokumentiert. Der
Tumortyp wurde entsprechend der ICD-O-3-Klassifikation für Tumoren erfasst
und zur Auswertung in folgende Kategorien eingeteilt: invasiv duktal, invasiv
lobulär, medullär und sonstige. In Bezug auf die histopathologischen
Untersuchungen sind alle immunhistochemischen Färbungen im Institut für
Pathologie des Universitätsklinikums Erlangen durchgeführt worden. Das
Grading wurde nach Elston und Ellis bestimmt (Elston and Ellis, 1993). Die
Färbung für den Wachstumsfaktorrezeptor HER2 ist mit dem HercepTest®
(Dako, Dänemark) erhoben worden, was den momentanen Anforderungn an
diese Testung entspricht (Wolff et al., 2007). Alle Ergebnisse, die 3+ beurteilt
worden sind, wurden im Rahmen dieser Analyse als positiv gewertet, während
die Intensitäten 0 bis 1+ als negativ gewertet worden sind. Für Fälle mit einem
Wert von 2+ in der klinischen Routine wurde ein FISH durchgeführt und
Patientinnen mit einer Genamplifikation wurden als positive erachtet. In Bezug
auf die Testung für den Östrogen- und den Progesteronrezeptor wurden solche
Patientinnen als positiv gewertet, die eine Anfärbung in mehr als 90 % der
Zellen aufwiesen.
38
3.3. Isolation der DNA aus dem Patientinnenblut
Die DNA wurde aus 8 ml EDTA-Blutproben, welche im Rahmen der BBCCStudie asserviert und bei -18°C gelagert wurden, extrahiert. Sofort nach dem
Zentrifugieren wurde der buffy coat aus dem Patientinnenblut entfernt und mit
dem RBC Lyse Puffer vermengt, welcher bei einem pH von 7,3; 0,15M NaH4Cl;
0,01M K2CO3 und 0,1M Na-EDTA enthielt. Nach zehnminütiger Inkubation
wurde das Lysat erneut bei 2.000 g zentrifugiert und mit 3 ml Zelllyse Puffer
inkubiert, welcher 20 mM Tris pH 7,4 sowie 15 mM Na-EDTA und 1 SDS
enthielt. Das Lysat wurde mit RNAase A und Proteinase K (alle von Aldrich
Chemie GmbH, Schnelldorf, Deutschland) behandelt. Die Proteine wurden
anschließend mit 1 ml Proteinprezipitationslösung ausgefällt (Puregene). Die
DNA wurde durch Zugabe von Isopropanol ausgefällt, mit 70 % Ethanol
gewaschen, getrocknet und in Tris-EDTA Puffer bei pH 7,5 gelöst. Die DNA
wurde mittels Spektrophotometer quantifiziert und bei –20 °C gelagert. Bei
diesem Vorgehen konnten durchschnittlich 70–100 µg DNA pro Patientin
gewonnen werden (Visvikis et al., 1998).
3.4. SNP Analyse mittels RTq-PCR
Die Auswertung erfolgte mit dem im Applied Biosystems ABI Prism® 7700
enthaltenen Sequenzdetektionsprogramm. Der Fluoreszenzanstieg wurde mit
Hilfe des ABI 7700® Sequence Detector Zyklus für Zyklus erfasst. Die visuelle
Komponente des Systems ist eine CCD (Charge-coupled Device)-Kamera. Die
Emissionen der Reporterfarbstoffe wurden auf einen Spektrografen fokussiert
und von der CCD-Kamera nach Wellenlängen und Intensitäten detektiert und
von der zugehörigen Software analysiert, quantifiziert und ausgegeben, sodass
die genotypische Zuordnung für den untersuchten DNA-Abschnitt jeder
Patientin zugeordnet werden konnte. Das Prinzip der RTq-PCR besteht darin,
die gewonnene, aufbereitete und dilutierte DNA der Patientinnen mit einem für
den SNP spezifischen Primer sowie einer zur Sichtbarmachung der Ergebnisse
notwendigen Hydrolyse-Sonde (TaqMan) zu inkubieren und die PolymeraseKettenreaktion in einem Thermocycler durchzuführen (Mullis, 1990; Mullis et al.,
1994).
Danach
werden
die
Signalcodes
und
-intensitäten
mit
einer
39
Fluoreszenzreporter-Kamera erfasst und ausgewertet. Für jede untersuchte
Patientin kann nun angegeben werden, ob sie einen homozygoten Wildgenotyp
aufweist, heterozygot variant oder homozygot variant ist.
3.5. Prinzip und Herstellung des Tissue Microarray
Von allen Patientinnen, von denen Keimbahn-DNA aus der BBCC-Kohorte zur
Verfügung stand, wurden die Paraffinblöcke gesucht, die den Tumor enthielten.
Insgesamt 914 Tumorblöcke konnten so identifiziert werden. Ebenfalls wurden
die in der klinischen Routine angefertigten, zu den Blöcken korrespondierenden
Hematoxylin-Eosin
(HE)-Färbungen
herausgesucht.
Die
Tumor-Regionen
wurden auf den HE-Schnitten markiert. Somit konnte auf dem Anschnitt des
Paraffinblocks die Region des Tumors identifiziert werden. Für die Herstellung
des Tissue Microarrays wurden mit einem Stanzzylinder Gewebebiopsien aus
der Tumorregion innerhalb der Paraffinblöcke entnommen. Das Stanzgerät
enthielt zwei dünnwandige Hohlnadeln. Eine wird benötigt, um das Gewebe aus
dem Donorblock zu entnehmen, die andere braucht man, um im Rezipientblock
einen entsprechenden Hohlraum zu schaffen, in welchem die Biopsie der ersten
Hohlnadel dann ihren Platz findet. Auf diese Art und Weise ist es möglich, vor
den Färbe-, Inkubations- und Waschprozeduren der Fluoreszenz in situ
Hybridisierung, Biopsien mehrerer Donorblöcke auf einem Rezipientblock neu
zu arrangieren. Um das ausgestanzte Gewebe wieder herauslösen zu können,
ist jede Nadel mit einem inneren Stempel ausgestattet. So kann das Paraffin
des Rezipientblockes entfernt und die Biopsie des Donorblockes in das
vorgesehene Rezipientbett platziert werden. Besonders zu beachten ist, dass
alle Donorbiopsien in gleicher Höhe in den Rezipientblock eingesetzt werden,
weil sonst im Anschluss an den Schnitt des Blockes leere Regionen auftreten
können. Der Innendurchmesser einer Nadel betrug 0,6 mm (Hsu et al., 2002).
Diese Größe wird allgemein als ausreichend repräsentativ anerkannt (Hoos et
al., 2001). Durch digitale Steuerung der Biopsieplatzierung im Rezipientblock
kann ein Biopsieraster von bis zu einigen hundert Proben pro Block erzielt
werden. Für diese Studie enthielten ein Block 330, ein Block 323 und ein dritter
Block 261 Proben. Die hergestellten Schnitte wurden auf einen Objektträger
übertragen (Moch et al., 2001). Um für unsere Studie die Gewebematrix zu
40
dokumentieren, wurde eine Excel-Datei angelegt, die für jede Probe an jedem
Ort des Objektträgers eine zweifelsfrei eindeutige Identifizierung ermöglicht. Um
die Lesbarkeit für den Pathologen zu gewährleisten, wurde der Objektträger in
vier große Einzelblöcke A–D aufgeteilt. Innerhalb der Blöcke erhielten die
vertikalen Reihen eine fortlaufende Nummerierung 1–8, und innerhalb der
Reihen wurde fortlaufend mit Kleinbuchstaben des Alphabets unterschieden.
Von jedem Tumor gibt es nur eine eindeutige Probe auf dem aus dem TMA
gewonnenen Objektträger. Die Identifikation besteht dann aus dem Quadranten
auf dem Objektträger, der vertikalen Reihenhöhe, durchnummeriert und dem
Ortsindikator in der Reihe, einem kleinen Buchstaben des Alphabets, z. B. PF
ARRAY #1, A1a. Die Raster sind entsprechend folgender Abbildung konstruiert
worden (Abbildung 3).
Abbildung 3: Raster Tissue Microarray
41
3.6. Durchführung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Für die Ermittlung des Genamplifikationsstatus für TOP2A sowie HER2 mittels
Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) wurden folgende Reagenzien
verwendet: Für die FISH-Analyse wurde eine 3-fach DNA-Sonde für TOP2A,
Chromsome enumeration probe (CEP) 17 und HER2 mit den Farben
SpectrumOrange für den Locus specific identifier (LSI) TOP2A, SpectrumGreen
für den LSI HER2 sowie SpectrumAqua für den LSI der CEP 17 verwendet. Die
Reagenzien stammen von Vysis, Inc., jetzt Abbott Laboratories, Illinois, USA.
Die Gen-Sonden LSI binden an spezifischen DNA-Abschnitten auf dem
Chromosom. Folgende Darstellungen (Abbildungen 4 bis 6) zeigen, dass die
Bindungsstellen zwar relativ nah, aber dennoch so weit voneinander entfernt
liegen, dass eine akzidentielle Bindung der falschen Sonde nahezu
ausgeschlossen ist und dass sich die Sonden gegenseitig nicht behindern. Des
Weiteren ist der Abstand der Bindungsstellen auch für das spätere visuelle
Auszählen der Signale von Bedeutung (Bouchalova et al., 2006).
Abbildung 4: Bindungsstellen auf Chromosom 17
(Abbott Laboratories)
42
Abbildung 5: Locus specific identifier HER2 (Abbott Laboratories)
Abbildung 6: Locus specific identifier TOP2A (Abbott Laboratories)
43
Alle verwendeten Reagenzien sind in Tabelle 6 gelistet:
Tabelle 6: Liste der Reagenzien zur Vorbehandlung und Gegenfärbung
Gegenfärbung:
PathVysion HER2 DNA Probe Kit:
DAPI Gegenfärbung: 1000ng/ml DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol) in
Phenylendiamin Dihydrochlorid, Glyzerin, Puffer
NP-40 (Nonyl-phenoxylpolyethoxylethanol)
20xSSC Salz, Natriumchlorid und Natriumcitrat (saline sodium citrate buffer)
Vysis Inc., Illinois
Paraffin-Vorbehandlung:
Vorbehandlung:
50ml Natriumthiozyanat (NaSCN)
Protease Puffer:
50ml Natriumchlorid (NaCl) pH 2,0
Protease:
25mg 2500-3000U/mg Pepsin A
Vysis Inc., Illinois
20xSSC:
88,2g Tri-Natrium Citrat Dihydrat + 175,3g Natrium Chlorid auf 1000ml H2O,
pH 7,0
2xSSC:
100ml 20xSSC auf 900ml H2O, pH 7,0
2xSSC/NP-40:
997ml 2xSSC+3ml NP-40, pH 7,0
Ethanol 100
Xylol, Merck
Steriles Aqua dest., Braun
4-Formaldehyd
Die Hybridisierung erfolgte am HyBrite Hybridisiergerät von Vysis, Inc., Illinois.
Die Auswertung erfolgte am Zeiss Axioscope (Carl Zeiss, Jena, Deutschland).
Die Signale wurden optovisuell ausgewertet. Der ungefärbte, 0,1 µm dicke,
formalinfixierte und paraffineingebettete Schnitt des zuvor erstellten Tissue
Microarrays wurde auf einen silanisierten Objektträger (DAKO) aufgezogen und
bei 37 °C über Nacht getrocknet. Die Entparaffinisierung erfolgte mittels
44
Wärmeinkubation mit 55°C über Nacht und anschließender Xylolbehandlung
(Xylol, Merck, Darmstadt, Deutschland). Es erfolgt die Entwässerung mit
Ethanol. Darauf folgte die Inkubation mit NHCL für 20 Minuten, Aqua dest. für
drei Minuten und Spülung mit 2xSSC (100ml 20xSSC auf 900ml H2O, pH 7,0).
Danach erfolgte eine 30-minütige Inkubation mit 50 ml Natriumthiozyanat bei
80 °C. Zusätzlich wurde nochmals mit Aqua dest. für eine Minute und zwei mal
fünf Minuten Waschpuffer gespült. Der Verdau erfolgt mit einer Protease über
90 Minuten bei 37 °C mit anschließender Fixation durch 4-Formaldehyd und
erneuter Spülung mit Pufferlösung. Der Objektträger wurde dann mit 10 µl DNASonde (3-fach DNA-Sonde: LSI, TOP2A SpectrumOrange; LSI, HER2
SpectrumGreen; LSI, CEP 17, SpectrumAqua (Vysis, Inc., jetzt Abbott
Laboratories,
Illinois)
inkubiert.
Danach
erfolgte
im
HyBrite-Gerät
die
Denaturierung der Proben für 5 Minuten bei 75 °C und danach die
Hybridisierung für etwa 18 Stunden bei 37 °C. Nach erfolgter Hybridisierung
wurden die Deckgläser entfernt, der Überschuss der Detektionsverbindung
durch Spülung mit 2xSSC/NP-40 (997ml 2xSSC + 3ml NP-40, pH 7,0) für 5
Minuten bei Raumtemperatur und für 3 Minuten bei 75° im Wasserbad entfernt.
Die Gegenfärbung erfolgte mit 10 µl DAPI. Fixation. Die Lagerung erfolgte
lichtgeschützt bei -20°C. Zur Optimierung der Signalqualität wurde die Dauer
der Denaturierung und/oder die Dauer der Hybridisierung variiert (Press, 2007).
45
3.7. Auswertungsmethoden
Die Auswertung der Fluoreszenz in situ Hybridisierung erfolgte durch
optovisuelles Erfassen der Signale für HER2- bzw. TOP2A-Genkopien.
Verwendet
wurde
hierzu
das
Mikroskop
Axioscope
von
Zeiss.
Das
TOP2A/HER2/Zentromer-17 Verhältnis wurde aus dem Signalverhältnis von
HER2/TOP2A zu CEP 17 aus 20 gezählten Zellkernen, welche eindeutig einem
Tumorareal zuzuordnen waren, gebildet. Die Ergebnisse wurden in einer ExcelDatei erfasst. Die Ratios wurden automatisiert (Rechenvorschrift) gebildet. Dem
Protokoll von Vysis, Inc., Illinois folgend lag eine HER2- bzw TOP2AAmplifikation vor, wenn die Ratio > = 2,0 war. Ratios zwischen 1,8 und 2,2
wurden zur Verifikation mehrmals durchgezählt. Durch das Ratioverfahren war
eine von der Chromosomenanzahl (Chromosomenpolyploidie) unabhängige
Detektion der Genamplifikation möglich. Die Ergebnisse wurden von einem
zertifizierten Pathologen gegengeprüft.
Abbildung 7 zeigt das typische Bild einer erfolgreichen Fluoreszenz in situ
Hybridisierung. Zu erkennen sind Zellkerne mit der blauen Gegenfärbung DAPI,
welche an DNA und RNA (schwächer) bindet, sowie intrazelluläre Signale in
drei verschiedenen Farben. Grüne Signale repräsentieren die Anzahl der
HER2-Allele pro Zellkern, die orangen Signale die Anzahl der TOP2A-Allele.
Blau repräsentiert die Anzahl der Chromosomen 17 pro Zellkern.
Abbildung 7: Screenshot FISH-Signale (Abbott Laboratories)
46
3.8. Statistische Überlegungen
Alle drei Analysemethoden (HER2-Amplifikation, TOP2A-Amplifikation und
TOP2A-Genotypisierung) wurden univariat mit den Patientinnencharakteristika
assoziiert. Für kategoriale Variablen wurde dies mittels Pearson’s Chi-QuadratTest durchgeführt. Sollte die Linearität eines Zusammenhangs geprüft werden,
wurde hierfür der Mantel-Haenszel-Test benutzt. Die Konstruktion der
Überlebenskurven in der univariaten Analyse wurden für das Gesamtüberleben
und
das
fernmetastasenfreie
Überlebens
mittels
Kaplan-Meier-Schätzer
konstruiert. Um auf Unabhängigkeit der Prognoseparameter zu testen, wurden
Cox-proportional-hazards-Modelle konstruiert und adjustierte hazard Ratios, inkl.
95 % CI, angegeben. Cox-proportional-hazards-Modelle wurden gebildet für
das Gesamtüberleben und das fernmetastasenfreie Überleben, jeweils für die
Gesamtkohorte, für die Subgruppe, die eine Chemotherapie erhalten hatte, für
die Subgruppe, die keine Chemotherapie erhalten hatte, und letztendlich für die
Chemotherapiepatientinnen, klassifiziert nach HER2-Status. Alle statistischen
Analysen wurden mit dem Software-Programm SPSS (SPSS Software Inc.,
Chicago, Illinois) durchgeführt und p-Werte unter 0,05 wurden als signifikant
erachtet.
47
4. Ergebnisse
An einem Gesamtkollektiv von 1.387 Patientinnen wurde für die Patientinnen,
für die die jeweiligen Biomaterialien vorhanden waren, mittels FISH der HER2und der TOP2-Amplifikationsstatus, sowie mittels RTq-PCR der Genotyp von
rs13695 in TOP2A bestimmt. Im Folgenden soll gezeigt werden, dass
genetische Polymorphismen einen Einfluss auf die Prognose und das
Therapieansprechen von Mammakarzinompatientinnen haben und dass
genetische
Polymorphismen
mit
dem
Amplifikationsstatus
von
TOP2A
korrelieren.
4.1. Patientinnencharakteristika
Tabellen 7 und 8 stellen die Patientinnencharakteristika und deren Assoziation
mit den Genotypisierungsergebnissen für den TOP2A SNP rs13695 dar: Die
Patientinnen hatten ein Durchschnittsalter von 55,32 (±11,98) Jahren und einen
durchschnittlichen Body Mass Index von 26,03 (±4,86) kg/m2. In Bezug auf die
Tumorcharakteristika zeigte sich eine typische Verteilung. Die meisten
Patientinnen hatten einen Tumor ≤2cm (57,9 %), waren von duktalem
histologischen Typ (65,9 %) und waren nodalnegativ (63,7 %). Der Östrogenrezeptorstatus war bei 513 Patientinnen (75,6 %) positiv. Der in der klinischen
Routine bestimmte HER2-Status war in 16,3 % der Fälle positiv und die
Proliferation, bestimmt mit der Immunhistochemie gegen Ki67, zeigte in 43,2 %
der Patientinnen eine Positivität, welche definiert war als eine Anfärbung bei
mehr als 13 % aller Karzinomzellen. Der mit FISH bestimmte HER2-und
TOP2A-Status aus dem TMA war in 15,8 % und 5,2 % der Fälle amplifiziert.
48
Tabelle 7: Patientinnencharakteristika (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat
Test; **: Mantel-Haenszel-Test)
Genotyp
CC
Patientinnenalter
BMI
Tumorstadium
p-Wert
0,447‡
54,3
55,32
S
11,7 12,4
11,8
11,98
Mittelwert
26,1 25,85 25,86 26,03
S
4,95 4,64
5,33
4,86
43
724
% 58,5 57,2
56,6
57,9
N 246
27
429
% 34,0 34,6
35,5
34,3
N 25
19
5
49
% 3,5
4,2
6,6
3,9
N 29
18
1
48
% 4,0
4,0
1,3
3,8
N 723
451
76
1250
0,761 *
% 100
100
100
100
0,789**
N 490
297
49
836
% 66,8 65,1
62,0
65,9
N 126
20
239
% 17,2 20,4
25,3
18,8
N 117
10
193
% 16,0 14,5
12,7
15,2
N 733
456
79
1268
0,343 *
% 100
100
100
100
0,884**
kein
N 471
280
46
797
Lymphknotenbefall
% 65,5 61,9
57,5
63,7
Lymphknotenbefall
N 248
34
454
% 34,5 38,1
42,5
36,3
N 719
452
80
1251
0,229 *
% 100
100
100
100
0,087**
N 78
41
6
125
% 11,3 9,5
7,7
10,4
N 443
54
783
% 63,9 66,1
69,2
650
N 172
18
296
% 24,8 24,5
23,1
24,6
N 693
433
78
1204
0,754 *
% 100
100
100
100
0,663**
T1
T4
Gesamt
duktal
Typ
lobulär
andere
Gesamt
Gesamt
Grading
Gesamt
55,6 54,9
T3
Nodalstatus
TT
Mittelwert
T2
Histologischer
CT
G1
G2
G3
Gesamt
N 423
258
156
93
66
172
286
106
0,266‡
49
Tabelle 8: Fortsetzung Patientinnencharakteristika
Genotyp rs13695
CC
Östrogenrezeptor
negativ
positiv
Gesamt
HER IHC
positiv
negativ
Gesamt
Ki67
>13 %
<13 %
Gesamt
CHT
keine CHT
CHT
Gesamt
HER2-Status
normal
amplifiziert
Gesamt
TOP2A-Status
deletiert
normal
amplifiziert
Gesamt
CT
TT
Gesamt
p-Wert
N 199
136
19
354
% 27,9
31,1
24,4
28,8
N 513
302
59
874
% 72,1
68,9
75,6
71,2
N 712
438
78
1228
0,353 *
% 100
100
100
100
0,777**
N 92
52
8
152
% 16,9
15,8
12,9
16,3
N 452
277
54
783
% 83,1
84,2
87,1
83,7
N 544
329
62
935
0,693 *
% 100
100
100
100
0,419**
N 320
195
33
548
% 57,6
56,5
51,6
56,8
N 236
150
31
417
% 42,4
43,5
48,4
43,2
N 556
345
64
965
0,652 *
% 100
100
100
100
0,425**
N 272
186
26
484
% 54,5
57,6
51,0
55,4
N 227
137
25
389
% 45,5
42,4
49,0
44,6
N 499
323
51
873
0,491 *
% 100
100
100
100
0,373**
N 264
145
27
436
% 85,2
81,9
87,1
84,2
N 46
32
4
82
% 14,8
18,1
12,9
15,8
N 310
177
31
518
0,577 *
% 100
100
100
100
0,668**
N 6
2
0
8
% 1,9
1,1
0
1,5
N 292
163
28
483
% 94,2
92,1
90,3
93,2
N 12
12
3
27
% 3,9
6,8
9,7
5,2
N 310
177
31
518
0,385 *
% 100
100
100
100
0,042**
50
4.2. Genotypen und Assoziation mit Tumorcharakteristika
Die DNA der Patientinnen wurde auf SNPs im TOP2A-Gen mittels RTq-PCR
untersucht.
Der Genotyp wurde von 1.276 Patientinnen erhoben, von denen KeimbahnDNA vorhanden war. 736 Patientinnen (53,06 % ) hatten einen homozygoten
Wildtyp Genotyp (CC). 459 Patientinnen (33,09 % ) waren heterozygot (CT) und
81 Patientinnen (5,84 % ) waren homozygot variant (TT). Tabelle 12 zeigt die
Genotypenverteilung und die Allelverteilung. Bei der Testung auf das HardyWeinberg-Equilibirium wurde keine Abweichung festgestellt (p = 0,407).
Tabelle 9: Allelverteilung
Genotypverteilung
CC
CT
TT
736
459
81
58 % 36 % 6 %
Allelverteilung
Gesamt
1276
C
1931
76 %
T
621
24 %
Gesamt p-Wert
2552
0,407
Bei dem Vergleich von Genotyp und Tumor- und Patientinnencharakteristika
(Tabelle 8) war keiner der Parameter mit dem Genotyp assoziiert außer dem
TOP2A-Amplifikationsstatus. Patientinnen mit einem CC-Genotyp zeigten in
3,9 % der Fälle eine Amplifikation, während dies beim CT- oder TT-Genotyp in
6,9 % bzw. in 9,7 % der Fälle vorkam (p = 0,042).
51
4.3. Univariate Korrelation mit den Patientinnencharakteristika
Die weiteren Testergebnisse dieser Arbeit, der HER2-und der TOP2AAmplifikationsstatus wurden anhand eines Tissue Microarrays standardisiert
mittels FISH bestimmt. Von insgesamt 629 (69,4 %) der 906 Proben konnte ein
Status erhoben werden. Der Hauptgrund für fehlende Werte war eine
mangelnde Anfärbung der Proben. Die Ergebnisse wurden ebenfalls univariat
mit den Patientinnencharakteristika in Verbindung gebracht (Tabellen 10 und
11). Es scheint so zu sein, dass Patientinnen mit einem HER2-amplifizierten
Tumor eher jünger sind (55,25 Jahre vs. 58,19 Jahre; p = 0,027). Auch das
Tumorstadium
war
mit
dem
HER2-Amplifikationsstatus
assoziiert.
Erkrankungen mit einer Amplifikation neigten zu einem größeren Tumor.
Tumoren kleiner 2 cm konnten bei normaler Genkopienzahl in 56,4 % der Fälle
gefunden werden, während diese bei einer Amplifikation nur in 45,5 % der Fälle
vorkamen (p = 0,009). Genauso ging eine Amplifikation mit einem höheren
Grading einher (p<0,001). Der Nodalstatus und der histologische Typ hingegen
zeigten keine Korrelation mit dem HER2-Amplifikationsstatus.
52
Analyse der
Tabelle 10: Univariate
Variablen mit dem HER2Amplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat-Test; **: Mantel-Haenszel-Test)
HER2 Status
deletiert normal amplifiziert
Alter
Tumorstadium
55,25
57,71
S
12,31
11,84
12,27
N 0
294
46
340
% 0
56,4
45,5
54,7
N 0
185
41
226
% 0
35,5
40,6
36,3
N 0
23
5
28
% 0
4,4
5,0
4,5
N 0
19
9
28
% 0
3,6
8,9
4,5
N 0
521
101
622
0,053 *
% 0
100
100
100
0,009**
N 0
350
78
428
% 0
66,4
76,5
680
N 0
100
14
114
% 0
19
13,7
18,1
N 0
77
10
87
% 0
14,6
9,8
13,8
N 0
527
102
629
0,135 *
% 0
100
100
100
0,058**
N 0
300
61
361
% 0
57,4
61,0
57,9
N 0
223
39
262
% 0
42,6
39,0
42,1
N 0
523
100
623
0,499 *
% 0
100
100
100
0,500**
N 0
51
4
55
% 0
9,8
4,0
8,9
N 0
351
59
410
% 0
67,5
59,0
66,1
N 0
118
37
155
% 0
22,7
37,0
25,0
N 0
520
100
620
0,004 *
% 0
100
100
100
0,001**
T1
T4
Gesamt
duktal
lobulär
andere
Gesamt
negativ
positiv
Gesamt
Grading
0,027‡
58,19
T3
Nodalstatus
p-Wert
Mittelwert
T2
Histologischer Typ
Gesamt
G1
G2
G3
Gesamt
53
Tabelle 11: Fortsetzung univariate Analyse HER2
HER2 Status
deletiert
Östrogenrezeptor
normal
amplifiziert
Gesamt
N 0
114
45
159
% 0
21,8
44,6
25,5
N 0
408
56
464
% 0
78,2
55,4
74,5
N 0
522
101
623
<0,001 *
% 0
100
100
100
<0,001**
N 0
41
49
90
% 0
8,2
50,0
15,0
N 0
462
49
511
% 0
91,8
50,0
85,0
N 0
503
98
601
<0,001 *
% 0
100
100
100
<0,001**
N 0
278
73
351
% 0
55
73,7
58,1
N 0
227
26
253
% 0
45
26,3
41,9
N 0
505
99
604
% 0
100
100
100
N 0
130
27
157
% 0
46,8
46,6
46,7
keine CHT N 0
148
31
179
% 0
53,2
53,4
53,3
N 0
278
58
336
0,977 *
% 0
100
100
100
0,977**
negativ
positiv
Gesamt
HER IHC
positiv
negativ
Gesamt
Ki67
>13 %
<13 %
Gesamt
Chemotherapie
CHT
Gesamt
p-Wert
0,001
TOP2A war in 5,2 % (n = 33) der Fälle überamplifiziert und in 9 Fällen (1,4 %)
deletiert. In einem Fall wurde eine Amplifikation ohne eine HER2-Amplifikation
gesehen. Im Rest der Fälle (N = 32/33; 97 %) war HER2 immer koamplifiziert.
Dies bedeutet, dass 31,4 % (n = 32/102) der HER2-positiven Tumoren auch
eine Koamplifikation von TOP2A zeigten. Bei der Assoziation mit den Tumorund Patientinnencharakteristika zeigten TOP2A-positive Tumoren häufiger ein
fortgeschrittenes Tumorstadium und hatten ein höheres Grading (Tabelle12 und
13). Die übrigen Parameter zeigten keine signifikante Assoziation.
54
Tabelle 12: Univariate Analyse der Tumorcharakteristika mit dem TOP2AAmplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat-Test; **: Mantel-Haenszel-Test)
TOP2A Status
Alter
Tumorstadium
deletiert
normal
amplifiziert
Gesamt
p-Wert
Mittelwert
50,87
57,90
56,13
57,71
0,175‡
S
11,42
12,28
12,01
12,27
N 6
320
14
340
% 66,7
55,1
43,8
54,7
N 3
212
11
226
% 33,3
36,5
34,4
36,3
N 0
27
1
28
% 0
4,6
3,1
4,5
N 0
22
6
28
% 0
3,8
18,8
4,5
N 9
581
32
622
0,009 *
% 100
100
100
100
0,003**
N 6
398
24
428
% 66,7
67,8
72,7
680
N 1
108
5
114
% 11,1
18,4
15,2
18,1
N 2
81
4
87
% 22,2
13,8
12,1
13,8
N 9
587
33
629
0,899 *
% 100
100
100
100
0,520**
N 5
337
19
361
% 55,6
57,9
59,4
57,9
N 4
245
13
262
% 44,4
42,1
40,6
42,1
N 9
582
32
623
0,976 *
% 100
100
100
100
0,830**
N 1
54
0
55
% 11,1
9,3
0
8,9
N 7
382
21
410
% 77,8
66,0
65,6
66,1
N 1
143
11
155
% 11,1
24,7
34,4
250
N 9
579
32
620
0,282 *
% 100
100
100
100
0,040**
T1
T2
T3
T4
Gesamt
Histologischer
duktal
Typ
lobulär
andere
Gesamt
Nodalstatus
negativ
positiv
Gesamt
Grading
G1
G2
G3
Gesamt
55
Tabelle 13: Fortsetzung Univariate Analyse der Tumorcharakteristika mit dem
TOP2A-Amplifikationsstatus (‡: Student’s T-Test; *: Pearson’s Chi-Quadrat Test; **: MantelHaenszel-Test)
TOP2A Status
deletiert
normal amplifiziert
Gesamt
N 2
147
10
159
% 22,2
25,3
31,3
25,5
N 7
435
22
464
% 77,8
74,7
68,8
74,5
N 9
582
32
623
0,732 *
% 100
100
100
100
0,441**
N 2
71
17
90
% 22,2
12,6
56,7
15,0
N 7
491
13
511
% 77,8
87,4
43,3
85,0
N 9
562
30
601
<0,001 *
% 100
100
100
100
<0,001**
N 5
322
24
351
% 55,6
57,2
75,0
58,1
N 4
241
8
253
% 44,4
42,8
25,0
41,9
N 9
563
32
604
0,137 *
% 100
100
100
100
0,072**
N 4
146
7
157
% 66,7
46,8
38,9
46,7
keine
N 2
166
11
179
CHT
% 33,3
53,2
61,1
53,3
Gesamt
N 6
312
18
336
0,496 *
% 100
100
100
100
0,283**
Östrogenrezeptor negativ
positiv
Gesamt
HER IHC
positiv
negativ
Gesamt
Ki67
>13 %
<13 %
Gesamt
Chemotherapie
CHT
p-Wert
56
4.4. Korrelation mit dem 10-Jahres-Gesamtüberleben und dem
fernmetastasenfreien Überleben DDFS
Um
die
prognostische
Relevanz
der
Genotypisierung
und
des
Genamplifikationsstatus zu prüfen, wurden die 10-Jahres-Gesamt- und
fernmetastasenfreien Überlebenswahrscheinlichkeiten berechnet und mittels
Log-rank-test verglichen. In Bezug auf das Gesamtüberleben zeigten alle
bekannten prognostischen Faktoren eine statistische Signifikanz. Weder der
HER2- noch der TOP2A-Amplifikationsstatus waren mit dem Überleben
assoziiert, genauso wenig der rs13695 Genotyp. Ähnliches zeigte sich beim
fernmetastasenfreien Überleben. Hier war zusätzlich das Grading nicht von
prognostischer Relevanz (Tabelle 14).
57
Tabelle 14: Korrelation mit dem 10J-Gesamtüberleben (OS) und dem
10J-fernmetastasenfreien Überleben (DDFS)
Patientinnencharakteristika
N
Events
10J-OS
Tumorstadium
T1
T2
T3
T4
Gesamt
763
475
51
49
1338
53
77
13
15
158
89,8
75,6
73,6
61,2
Histologie
duktal
lobulär
andere
Gesamt
898
253
199
1350
118
29
15
162
81,3
84,1
90,3
Nodalstatus
negativ
positiv
Gesamt
822
506
1328
53
103
55
90,4
73,5
Grading
G1
G2
G3
Gesamt
134
847
318
1299
5
99
56
160
94,6
82,1
79,1
ER
negativ
positiv
Gesamt
367
955
1322
64
95
159
79,6
84,3
HER IHC
negativ
positiv
Gesamt
878
166
1044
112
33
145
78,6
67,9
Ki67
<13 %
>13 %
Gesamt
462
610
1072
42
101
143
82,7
76,4
HER2
normal
amplifiziert
Gesamt
527
101
628
67
15
82
79,1
76,1
TOP2A
deletiert
normal
amplifiziert
Gesamt
9
587
32
628
0
79
3
82
Genotyp
rs 13695
CC
CT
TT
Gesamt
p-Wert
<0,001
0,028
<0,001
<0,001
0,001
0,023
<0,001
0,489
0,462
77,9
90,1
0,459
721
445
79
1245
84
64
11
159
84,6
80,3
82,8
Patientinnencharakteristika
N
Events
10DDFS
Tumorstadium
T1
T2
T3
T4
Gesamt
765
476
51
49
1342
60
90
17
15
182
88,3
72,9
60,1
81,4
Histologie
duktal
lobulär
andere
Gesamt
900
253
200
1353
138
28
15
182
78,6
85
88,2
Nodalstatus
negativ
positiv
Gesamt
838
503
1341
62
120
182
88,2
70
Grading
G1
G2
G3
Gesamt
135
847
319
1301
9
104
63
176
88,2
82,7
74,5
ER
negativ
positiv
Gesamt
368
957
1325
59
120
179
81,7
80,5
HER IHC
negativ
positiv
Gesamt
878
166
1044
109
31
140
80,2
72,6
Ki67
<13 %
>13 %
Gesamt
462
610
1072
38
98
136
86,3
77,3
HER2
normal
amplifiziert
Gesamt
527
101
628
53
16
69
83,6
80,0
TOP2A
deletiert
normal
amplifiziert
Gesamt
9
587
32
628
1
65
3
69
88,9
82,4
90,5
Genotyp
rs 13695
CC
CT
TT
Gesamt
p-Wert
<0,001
0,001
<0,001
<0,001
0,154
0,027
<0,001
0,059
0,981
0,848
721
448
79
1248
99
66
12
177
82,0
79,5
87,8
58
4.5. Cox-Regressionsanalyse
Für die multivariate Analyse zur Testung der prognostischen Relevanz des
rs13695 Genotyps wurde ein Cox-proportional-hazards-Modell gebildet, in
welches
das
Tumorstadium,
der
Nodalstatus,
das
Grading
und
der
Östrogenrezeptorstatus einbezogen wurden. Die Modelle wurden einmal für das
Gesamtüberleben der Gesamtkohorte (Tabelle 15), das fernmetastasenfreie
Überleben der Gesamtkohorte (Tabelle 16) und gleiche Endpunkte für die
Subgruppen mit (Tabellen 17 und 18) und ohne Chemotherapie (Ergebnisse für
die Subgruppe ohne CHT nicht gezeigt) gebildet. In der Gesamtkohorte hat der
Genotyp von rs13695 weder in Bezug auf das Gesamtüberleben noch in Bezug
auf das fernmetastasenfreie Überleben eine prognostische Bedeutung. Es zeigt
sich zwar eine Tendenz, dass Genotypen mit dem T-Allel eine schlechtere
Prognose haben, diese Unterschiede waren aber nicht signifikant (p = 0,362
und p = 0,492).
Tabelle 15: Cox-Regression für das Gesamtüberleben
Adjustierte HR
95 % CI
Signifikanz
0,657
1
Genotyp
CC
rs13695
CT
1,018
0,724 -
1,431
0,919
TT
1,360
0,702 -
2,634
0,362
Tumorstadium
Nodalstatus
Grading
ER Status
T1
<0,001
1
T2
2,249
1,553 -
3,258
<0,001
T3
2,285
1,169 -
4,467
0,016
T4
4,194
2,301 -
7,646
<0,001
N0
1
N1
2,319
1,631 -
3,295
<0,001
G1
0,204
1
G2
1,927
0,775 -
4,791
0,158
G3
2,282
0,894 -
5,828
0,085
negativ
1
positiv
0,603
0,423 -
0,858
0,005
59
Tabelle 16: Cox-Regression für das metastasenfreie Überleben in der
Gesamtkohorte
Adjustierte HR
95 % CI
Signifikanz
1
Genotyp
CC
rs13695
CT
0,952
0,688
-
1,317
0,765
TT
1,247
0,664
-
2,342
0,492
Tumorstadium
Nodalstatus
Grading
ER Status
T1
0,715
1
<0,001
T2
2,079
1,468
-
2,945
<0,001
T3
3,147
1,777
-
5,576
<0,001
T4
3,325
1,817
-
6,086
<0,001
N0
1
N1
2,500
1,791
-
3,491
<0,001
G1
1
0,034
G2
1,140
0,569
-
2,284
0,712
G3
1,765
0,856
-
3,638
0,124
0,643
-
1,288
0,595
negativ 1
positiv
0,910
Bei der Betrachtung der Untergruppen mit und ohne adjuvante Chemotherapie
konnte jedoch in der Untergruppe der Patientinnen, die eine Chemotherapie
erhalten hatten, ein prognostischer Effekt des rs13695 Genotyps gesehen
werden. Patientinnen, die mit einer adjuvanten Chemotherapie behandelt
worden waren, hatten mit zunehmender Anzahl von T-Allelen ein höheres
Risiko zu sterben. Patientinnen mit einem heterozygoten CT-Genotyp hatten mit
einer HR von 1,33 (95 % CI: 0,74 bis 2,38; p = 0,337) und Patientinnen mit
einem TT-Genotyp mit einer HR von 2,99 (95 % CI: 1,1 bis 8,4; p = 0,038) ein
höheres Risiko zu sterben als Patientinnen mit dem homozygoten CC-Genotyp
(Tabelle 17). Ein ähnlicher Effekt zeigte sich für das fernmetastasenfreie
Überleben. Hier lag die adjustierte HR für den CT-Genotyp bei 1,42 (95 % CI:
0,85 bis 2,37; p = 0,178) und für den TT-Genotyp bei 3,59 (95 % CI: 1,54 bis
8,40; p = 0,003).
60
Tabelle 17: Cox-Regression für das Gesamtüberleben für Patientinnen mit
adjuvanter CHT (* Fallzahl für G1 zu gering zum Einschluss in das Modell)
Adjustierte HR
Genotyp
Tumorstadium
Nodalstatus
Grading
CC
95 % CI
Signifikanz
1
0,110
CT
1,329
0,744
-
2,375
0,337
TT
2,990
1,061
-
8,424
0,038
T1
1
0,039
T2
2,009
1,058
-
3,815
0,033
T3
2,472
0,993
-
6,156
0,052
T4
3,573
1,277
-
9,998
0,015
N0
1
N1
1,779
0,941
-
3,363
0,076
0,297
-
0,986
0,045
G1*
G2
G3
ER Status
negativ
1
positiv
0,541
61
Tabelle 18: Cox-Regression für das metastasenfreie Überleben für Patientinnen
mit adjuvanter CHT
Adjustierte
95 % CI
HR
Genotyp
Tumorstadium
Nodalstatus
Grading
ER Status
CC
Signifikanz
1
0,012
CT
1,421
0,852
-
2,367
0,178
TT
3,591
1,536
-
8,397
0,003
T1
1
0,005
T2
1,952
1,113
-
3,422
0,020
T3
2,821
1,304
-
6,102
0,008
T4
3,826
1,595
-
9,178
0,003
N0
1
N1
1,589
0,905
-
2,790
0,107
G1
1
0,006
G2
3,692
0,500
-
27,25
0,200
G3
7,581
1,025
-
56,07
0,047
negativ
1
positiv
0,921
0,551
-
1,539
0,752
Da eine prognostische Relevanz von TOP2A nur in der Untergruppe der HER2positiven Tumoren zu vermuten war, wurde ein weiteres Modell für diese
Untergruppe gebildet und eine adjustierte HR von 22 (95 % CI: 1,6 bis 318,
p = 0,021) gefunden. Die entsprechenden Überlebenskurven sind in Abbildung
8 dargestellt.
Abbildung
8:
Überlebenskurven
62
aus
der
Cox-Regression
für
das
fernmetastasenfreie Überleben in der Subgruppe der HER2-positiven Tumoren,
die eine adjuvante Chemotherapie erhalten hatten.
63
5. Diskussion
In dieser Arbeit konnte der genetische Polymorphismus rs13695 im Gen
Topoisomerase IIα mit der Prognose von Mammakarzinompatientinnen unter
Chemotherapie korreliert werden. Des Weiteren wurde gesehen, dass der
Amplifikationsstatus des TOP2A Gens mit dem untersuchten Genotyp in der
3’UTR-Region des Gens zusammenhängt. Somit muss diskutiert werden,
inwieweit der Genotyp als prognostischer bzw. prädiktiver Faktor für
Patientinnen mit Mammakarzinom gesehen werden kann.
Für die Optimierung der Therapie des Mammakarzinoms wird es immer
wichtiger, durch eine individuelle Therapieplanung die Effektivität einer
durchgeführten Therapie so gut wie möglich vorherzusagen und somit ein
optimales Nutzen-Nebenwirkungsverhältnis für die Patientin zu erzielen. Für die
Vorhersage einer Effektivität einer Anthrazyklintherapie konnten bislang der
HER2-Expressionsstatus, der HER2-Amplifikationsstatus und der TOP2AAmplifikationsstatus herangezogen werden (Gennari et al., 2008; Pritchard et
al., 2006; Slamon D et al., 2007). Der Zusammenhang, dass eine TOP2AAmplifikation nur in HER2-positiven Tumoren gefunden wurde, beschränkt den
Stellenwert dieses Tests auf HER2-positive Patientinnen. Testverfahren, die
einen Hinweis auf eine alterierte TOP2A-Funktion geben, waren Bestandteil
dieser Arbeit. Wir untersuchten einen Polymorphismus in der 3’UTR-Region des
TOP2A-Gens. Polymorphismen in dieser Region konnten bereits bei anderen
Genen mit einem alterierten Expressionsverhalten oder einer alterierten
Proteinfunktion in Verbindung gebracht werden (Fasching et al., 2008;
Kristensen et al., 1998). Auch wird vermutet, dass sich in der 3’UTR-Region
Bindungsstellen für miRNA befinden, die ebenfalls regulatorisch in die
Organisation des Genoms eingreifen. In der Gesamtkohorte konnte kein
prognostischer Wert des Genotyps von SNP rs13695 gefunden werden. Jedoch
in der Subgruppe der mit Chemotherapie behandelten Patientinnen zeigte sich
eine schlechtere Prognose in Bezug auf das fernmetastasenfreie Überleben für
die Patientinnen, die den selteneren homozygot varianten Genotyp aufwiesen.
In der multivariaten Analyse zeigte diese Assoziation nur einen statistischen
64
Trend. Nach der Adjustierung für Tumorgröβe, Nodalstatus, Grading und
Östrogenrezeptorstatus jedoch war der Effekt mit einem p-Wert von 0,003
deutlich und mit einer HR pro Allel von 1,791 (95% CI 0,557–5,752) auch
klinisch relevant.
Zur Erklärung dieses Effektes ist unklar, ob der untersuchte SNP zu der
bedeutenden biologischen Veränderung im TOP2A-Enzym führt, welches mit
dem phänotypischen Verhalten assoziiert werden kann. Um den Bereich des
TOP2A-SNPs rs13695 findet man zwei Linkage-Blöcke, welche sich jeweils
über ca. 100.000 Basenpaare spannen (www.hapmap.org)(Gibbs et al., 2003).
Jeder mit rs13695 in Kopplung stehende SNP könnte für den biologischen
Effekt verantwortlich sein.
Gene, welche mit dem SNP rs13695 in Verbindung stehen (Abbildung 9), sind
z. B. CDC6 (cell division cycle 6 protein), RARA (retinoic acid receptor), GJC1
(gap junction protein), TOP2A, IGFBP4 (insulin like growth factor binding
protein 4). Ein weiteres sogenanntes fine-scale Mapping dieser Genregion
müsste zur weiteren Klärung durchgeführt werden, um zu sehen, ob andere
Polymorphismen stärker mit der Prognose in dieser Patientinnengruppe
assoziieren.
65
Abbildung 9: Lokalisation des SNPs rs 13695 auf Chromosom 17 (Pfeil) und
Darstellung des Linkage Disequilibriums durch LD plots (nach
www.hapmap.org) (Gibbs et al., 2003)
Da eine Amplifikation des TOP2A-Gens bislang zur Erklärung einer
differentiellen Effektivität der Anthrazyklintherapie herangezogen wurde, lag es
nahe
zu
prüfen,
ob
der
genetische
Polymorphismus
mit
dem
Amplifikationsverhalten dieses Gens assoziiert ist. Auch gibt es erste Hinweise,
dass die 3’UTR-Region von Genen beim Amplifikationsprozess eine Rolle zu
spielen scheint (Slack et al., 2006).
In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass eine Assoziation zwischen
dem Polymorphismus rs13695 und einer Amplifikation von TOP2A möglich
erscheint. Pro Allel schien sich die Anzahl der Patientinnen mit einem
amplifizierten Gen zu verdoppeln. Für eine kausale Analyse in Bezug auf den
prognostischen Effekt dieses Zusammenhangs ist die betrachtete Kohorte
jedoch zu klein.
In der Gruppe der HER2-negativen Patientinnen konnte kein prognostischer
Wert der TOP2A-Genotypisierung gesehen werden, was gezeigt hat, dass sich
66
der zusätzliche prognostische Stellenwert einer TOP2A-Genotypisierung auf die
HER2-positive Subgruppe beschränkt. HER2-negative Patientinnen zeigen
keine TOP2A-Amplifikation, was bedeutet, dass der Genotyp nur für ein
Patientinnenkollektiv von Relevanz ist, in dem prinzipiell die Möglichkeit für eine
Amplifikation gegeben sein muss. Die Anzahl der TOP2A-amplifizierten
Patientinnen ist zu klein, um die Frage zu beantworten, ob in der Gruppe der
TOP2A-amplifizierten Patientinnen der Genotyp von besonderer Relevanz ist.
Zumindest in der HER2-positiven Subgruppe zeigte sich ein deutlicher
prognostischer Effekt des TOP2A-Genotyps.
Um weitere Subgruppenanalysen in Bezug auf die Interaktion zwischen
TOP2A-Amplifikationsstatus und der Prognose zu machen, war das Kollektiv zu
klein, was für die erforderlichen Untersuchungen zum Thema dieser Arbeit
nachteilig war. Obwohl diese Studie mit mehr als 1.300 Patientinnen keine
kleine Studie ist, beschränkt sich der prognostische Wert der Genotypisierung
auf die HER2-positiven Patientinnen, die ca. 15 % der Gesamtkohorte
ausmachen.
Momentan kann eine Genotypisierung noch nicht in der klinischen Routine
eingesetzt werden. Die gefundenen Ergebnisse müssen zunächst an anderen
Kohorten validiert und bestätigt werden, bevor eine Rationale gegeben ist, den
Test in einer prospektiven Studie für eine Stratifikation von Patientinnen
einzusetzen. Ein solcher Test könnte zumindest für HER2-positive Patientinnen
neben den TOP2A-überamplifizierten Patientinnen eine weitere Subgruppe von
Frauen identifizieren, die besonders von einer Anthrazyklintherapie profitieren
könnten.
67
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97
7. Abkürzungsverzeichnis
°C
Grad Celsius
µg
Mikrogramm
3D-CRT-Device
Three-dimensional-conformal radiation therapy device
ABC
Avidin-Biotin-Komplex
AC
Adriamycin Cyclophosphamid
ASCO
American Society of Clinical Oncology
ATM
Ataxia teleangiectasia mutated
Bcl-2
B-cell lymphoma-2
BCPT
Breast Cancer Prevention Trial
BET
Brusterhaltende Therapie
bFGF
Basic fibroblast growth factor
BMI
Body Mass Index
BRCA
Brustkrebsgen (breast cancer gene)
BRCA1
BReast CAncer 1
BRCA2
BReast CAncer 2
CCD-Kamera
Charge-coupled Device Kamera
CDH1
Cadherin 1
cDNA
Complementary DNA
CEF
Cyclophosphamid Epirubicin 5-Fluorouracil
CEP
Chromosome enumeration DNA probe
CEP 17
Chromosome enumeration probe 17
c-erbB-2
Human epidermal growth factor receptor 2
CHK2
Checkpoint kinase 2
CHT
Chemotherapie
CLIS
Carcinoma lobulare in situ
CMF
Cyclophosphamid Methotrexat 5-Fluorouracil
CNV
Copy number variation
CPG
Cytosin-phosphatidyl-Guanosin
CR
Complete Remission
CTC
Circulating tumor cells
DAB
Diaminobenzidin
DAPI
4,6-Diamidino-2-phenylindol
DCIS
98
Duktales Carcinoma in situ
DDE
Dichlordiphenyldichlorethen
DDT
Dichlordiphenyltrichlorethan
DFS
Disease free survival
DDFS
Distant disease free survival
DNA
Deoxyribonucleic acid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EBCTCG
Early Breast Cancer Trialists’ Collaborative Group
EBCTG
Early Breast Cancer Trialists’ Group
EC
Epirubicin Cyclophosphamid
EGFR
Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
ELISA
Enzyme linked immunosorbent assay
EORTC
European Organisation for Research
and Treatment of Cancer
ER
Estrogenrezeptor
ER(-)
Estrogenrezeptor negativ
ER(+)
Estrogenrezeptor positiv
EUSOMA
European Society of Mastology
F(ab)
Fragment antigen binding (antigenbindendes Fragment )
FAC
5-Fluorouracil Adriamycin Cyclophosphamid
FAM
Fluorophor
Fc
Fragment crystalline (kristallines Fragment )
FDA
Food and Drug Administration
FEC
5-Fluorouracil Epirubicin Cyclophosphamid
FISH
Fluoreszenz in situ Hybridisierung
FRET
Förster-Resonanz-Energie-Transfer
GEKID
Gesellschaft der epidemiologischen
Krebsregister in Deutschland e.V.
GEP
Genexpressionsprofil
GnRH
Gonadotropin Releasing Hormon
Gy
Gray
HDR Brachytherapie
High dose radiation Brachytherapie
HER
Humaner epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
HER2
Human epidermal growth factor receptor 2
HR
Hazard Ratio
HRT
99
Hormonal replacement therapy
IBIS-1
International Breast Cancer Intervention Study
ICD-O
International Classification of Diseases for Oncology
Ig
Immunglobulin
IGF(R)
Insuline like growth factor (receptor)
ICH
Immunhistochemie
ICH
Immunhistochemie
Kb
Kilobasen
kD
Kilo Dalton
LCIS
Lobuläres Carcinoma in situ
LK
Lymphknoten
LSAB
Labelled streptavidin biotin method
LSI
Locus specific identifier
M
Molar (Mol/Liter)
Mg
Milligramm
MINDACT
Microarray In Node Negative
Disease may Avoid ChemoTherapy
Ml
Milliliter
MLH1
Häufig mit Nonpolypösem Kolonkarzinom
vergesellschaftetes Gen
mM
Millimolar
MORE
Multiple Outcomes of Raloxifen Study
MRM
Modifiziert radikale Mastektomie
mRNA
Messenger ribonucleic acid
MRT
Magnetresonanztomografie
MSH2
Häufig mit Nonpolypösem Kolonkarzinom
vergesellschaftetes Gen
N
Anzahl unabhängiger Versuche
NCI
National Cancer Institute
Ng
Nanogramm
NP
Nonylphenyl-polyethylenglycol
NSABP
National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project
NYHA
New York Heart Association
OS
Overall survival
p27
Cyclin dependant kinase regulatorgene
p53
100
Tumorsuppressorgen
PAI
Plasminogen Aktivator Inhibitor
PCB
Polychlorierte Biphenyle
PCR
Polymerase chain reaction
pH
Negativer dekadischer Logarithmus der
Wasserstoffionenkonzentration
PR
Progesteronrezeptor
PROSE
Prevention and Observation of Surgical Endpoints
PTEN
Phosphatase and tensin homolog
RB1
Retinoblastomgen 1
RBC
Red Blood Cells
RFS
Recurrence free survival
RR
Relatives Risiko
RT
Reverse Transkriptase
RTq-PCR
Real-time quantitative polymerase chain reaction
SERM
Selektiver Estrogen Rezeptor Modulator
SNP
Single nucleotide polymorphism
SSC
Raline sodium citrate
T
Taxan
TAILORx
Trial Assigning IndividuaLized Options for Treatment x
TARGIT
Targeted intra-operative radiation therapy
TMA
Tissue Microarray
TNM
Tumor Nodes Metastases
TOP2A
Topoisomerase IIα Gen
Topo II alpha
Topoisomerase II alpha Genprodukt
.000
Tausend
TVT
Tiefe Beinvenenthrombose
UICC
Union International contre le Cancer
uPA
Urokinase Plasminogen Aktivator
VEGF
Vascular endothelial growth factor
VIC
Fluorophor
VPF
Vascular permeability factor
ZK
Zellkern
Μl
Mikroliter
95 % CI
95 % Konfidenzintervall
101
8. Anhang
8.1. Screenshots des Dokumentationsprogrammes DOMAS
Eingangsmaske
102
Dokumentation der Krankheiten nach ICD10
103
Dokumentation der Tumorereignisse im Verlauf
104
Spezielle Dokumentation der Tumoreigenschaften
105
8.2. Dokumentationsbogen der Bavarian Breast Cancer Cases
and Controls Studie
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
121
122
9. Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Matthias W. Beckmann danke ich für die Überlassung des
Themas und die umfangreiche Unterstützung meiner Doktorarbeit in Erlangen
und Los Angeles.
Besonderer Dank gilt Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Peter A. Fasching für seine
engagierte und sachkundige Betreuung. Sein unermüdliches Engagement und
sein Fachwissen trugen wesentlich zur Fertigstellung dieser Arbeit bei.
Darüber hinaus danke ich Frau Pamela Strissel, PhD, und Herrn Priv.-Doz. Dr.
rer. nat. Rainer Strick für die Unterstützung meiner Laborarbeit in Erlangen.
Herrn Dr. med. Michael Schrauder, Herrn Dr. med. Christian Löhberg sowie
Frau Sonja Oeser gebührt ebenfalls Dank für die Unterstützung im Labor. Den
Mitarbeitern der Studienzentrale, im Besonderen Frau Doris Herbst und Ulrike
Müller, sei für die unermüdliche Betreuung des Dokumentationssystems und die
uneingeschränkte Hilfe gedankt. Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Arno Dimmler, der
bei der Markierung der Tumorregionen geholfen hat, gebührt ebenfalls Dank.
Für die Mitwirkung im Labor des Norris Comprehensive Cancer Center, Los
Angeles, gilt besonderer Dank Herrn Professor Michael Press, MD, PhD,
Yvonne Villalobos, Roberta Guzman, Angela Santiago, Sherin Shirazi, MD,
Armen Gasparyan und Yan Ling, MD PhD.
Reisekosten nach Los Angeles wurden durch ein Stipendium des Bavaria
California Technology Center (BaCaTec), Erlangen/San Francisco, unter dem
Titel „Association of gene amplification, prognostic factors and genetic
polymorphisms in breast cancer patients“ in der Bewilligungsperiode ab
01.01.2008 gefördert.
Abschließend gebührt mein ganz besonderer Dank meiner Familie, besonders
meinen Eltern, für die immerwährende Unterstützung bei dieser Arbeit und
während meines ganzen Studiums.