E.coli _Versuch

7 Einfluss von Zuckerersatzstoffen auf E.coli Bakterien
7.1 Vorwort
Um zu beurteilen, welche der untersuchten Stoffe eine gute Alternative zur Saccharose
darstellen, interessierte uns der Einfluss der Zuckerersatzstoffe auf Bakterien, speziell der auf die
tierischen und menschlichen Darmbakterien Escherichia Coli (E.coli).
Dabei unterzogen wir dem Vergleich mit Saccharose Glucose, Stevia, Fructose, Xylitol und
Cyclamat, also sowohl Zuckeralkohole, Süßstoffe und andere Zuckeraustauschstoffe.
Stoppen, verlangsamen oder begünstigen sie gar dessen Wachstum?
Und was genau bedeutet das für uns und unseren Körper?
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7.2 Theoretische Grundlagen
Escherichia coli ist ein Bakterium, welches im menschlichen und tierischen Darm vorkommt. Im
menschlichen Darm dient es als Vitaminproduzent, ist jedoch auch häufigster Verursacher
menschlicher Infektionen.
Als ein Maß für die Bakterienkonzentration lässt sich die Transmission einer Lösung, die sowohl
Bakterien als auch Nährmedium enthält, bestimmen.
Als Transmission bezeichnet man die Menge eines Lichtes bestimmter Wellenlänge die nach
Bestrahlen der Lösung messbar ist. Je höher die Transmission, je höher also auch die
Bakterienkonzentration.
Als Nährmedium wurde dafür ein sogenanntes Minimalmedium verwendet, welches die – wie
der Name schon sagt – minimal nötige Menge an Energie, welche durch den jeweiligen Zucker
bzw. -ersatzstoff zur Verfügung gestellt wird, sowie andere Inhaltsstoffe (z.B. Salze) enthält, um
das Überleben und die Vermehrung der Bakterien zu ermöglichen.
Die zeitliche Änderung der Transmission stellt dabei ein Maß für die Bakterienkonzentration dar,
wobei der Referenzwert der jeweiligen Lösung die Transmission zum Zeitpunkt t 0 ist.
Da E.coli Bakterien sich optimal mit Glucose als Energiequelle vermehren, dient das
Wachstumsverhalten mit Glucose als eingesetzter Energiequelle als Referenzwert aller
untersuchten Zucker und dessen Ersatzstoffen.
Da sich Bakterien durch Zellteilung (bei optimal 37°) vermehren, wird ein exponentielles
Wachstum und somit auch ein exponentieller Anstieg der Transmission erwartet.
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7.3 Relevante Formeln
Masse des Zuckers / -ersatzstoffes
m  M  c V
(1)
Lambert-Beersches Gesetz:
E    c0  d
(2)
mit:
m = Masse in g
M = Molare Masse in g/mol
c = Konzentration in mol/l
V = Volumen in l
 = molarer Absorptionskoeffizient
d = optische Schichtdicke des Reagenzglases ( 1,3 cm = 0,013m)
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7.4 Apparaturbeschreibung und Versuchsdurchführung
Zunächst wird das Minimalnährmedium ohne Zucker hergestellt. Dafür werden 6 g
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), 3 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4), 1 g
Ammoniumchlorid (NH4Cl), 0,5 g Natriumchlorid (NaCl), 0,12 g Magnesiumsulfat (MgSO4),
0,01g Calciumchlorid (CaCl) und jeweils 30mM des Zuckers bzw. dessen Ersatzstoffes in 1 l
Wasser gelöst, wobei die Bakterien noch nicht hinzugegeben werden.
Um sicherzustellen, dass sich ausschließlich die antibiotikaresistenten E.coli Bakterien bilden/
teilen und wachsen, werden ca. zehn Milliliter des Antibiotikums Ampicillin hinzugegeben.
50 ml Nährmedium werden in je einen Erlenmeyerkolben pro Substanz gefüllt und der Zucker
bzw. -austauschstoff direkt darin vollständig gelöst.
Sind alle Erlenmeyerkolben vorbereitet, wird je ein Reagenzglas mit drei ml dieser Lösung
befüllt. Er dient als einerseits als Transmissionswert für den Zeitpunkt t 0 , welcher mit dem in
Abbildung 7.1 dargestellten Transmissionsmessgerät gemessen wird und andererseits als
Nullkalibrierung vor jeder weiteren Messung, da der Zucker selbst eine bestimmte Menge an
Licht absorbiert, was die nachfolgenden Messwerte verfälschen könnte.
Abbildung 7.1: Transmissionsmessgerät
Zu den verbliebenen Lösungen im Erlenmeyerkolben werden nun 13 ml der zuvor angesetzten
Bakterienkulturen gegeben. Anschließend werden die Erlenmeyerkolben durchgängig auf 37°
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temperiert und gleichmäßig gerührt um ein optimales und gleichmäßiges Wachstum zu
ermöglichen. Dafür dient das in Abbildung 7.2 dargestellte Gerät.
Abbildung 7.2: Bakterienaufbewahrung während der Wachstums- und Vermehrungsphase
Nun wird so oft wie möglich (am besten alle halbe Stunde) die Transmission gemessen. Dabei
wird zuerst mit der bakterienfreien Zuckerlösung kalibriert und anschließend jeweils drei
Milliliter der temperierten, bakterienhaltigen Zuckerlösung in ein Reagenzglas gefüllt und dieses
anschließend ins Messgerät gestellt. Die Flüssigkeit wird anschließend wieder möglichst
verlustfrei in den dazugehörigen Erlenmeyerkolben überführt.
Erreicht die Transmission einen Wert (deutlich) größer als eins, so muss die Lösung verdünnt
werden, um einen zuverlässigen Wert zu erhalten. Gleichzeitig ist nach Erreichen dieses Wertes
die Messreihe für diese Substanz beendet.
41
7.5 Messwerte und Auswertung
Mittels Gleichung (1) werden zunächst die einzuwiegenden Massen von Glucose und den
Zuckerersatzstoffen berechnet. Die Konzentration beträgt jeweils 30  10 3 mol / l und das
Volumen 0,05 l. Lediglich die Molmasse unterscheidet sich.
Die Molmassen und daraus resultierenden einzuwiegenden Massen sind in Tabelle 7.1
zusammengetragen.
Anhand von Glucose wird eine Beispielrechnung durchgeführt.
m  M  c V
m  M (Glu cos e)  30  10 3 mol / l  0,05l  180 g / mol  30  10 3 mol / l  0,05l  0,27 g
Molmasse [g/mol]
einzuwiegende Masse [g]
Glucose
180
0,27
Stevia
804,9
1,21
Saccharose
342,3
0,51
Fructose
180
0,27
Xylitol
152,15
0,23
Cyclamat
201,22
0,30
Tabelle 7.1: einzuwiegende Massen
Nachdem alle Lösungen wie oben beschrieben präpariert wurden, ließen sich die in den Tabellen
7.2-7.7 dargestellten Messwerte aufnehmen. In der dazugehörigen Abbildung wurde die
Extinktion gegen die Zeit aufgetragen, um den zeitlichen Verlauf des Bakterienwachstums zu
veranschaulichen.
42
t [min]
E
0
0,11
44
0,14
115
0,22
154
0,22
230
0,56
287
0,69
345
0,76
376
0,85
394
0,87
430
1,01
463
1,11
1431
3.54
Tabelle 7.2: Messwerte für Glucose
43
Abbildung 7.3: Zeit-Extinktion-Verlauf für Glucose
t [min]
E
0
0,17
42
0,10
119
0,17
157
0,16
235
0,12
293
0,14
348
0,13
379
0,21
398
0,17
435
0,17
476
0,16
501
0,15
1424
0,17
Tabelle 7.3: Messwerte für Stevia
44
Abbildung 7.4: Zeit-Extinktion-Verlauf für Stevia
t [min]
E
0
0,14
48
0,16
119
0,11
157
0,13
236
0,13
294
0,13
348
0,12
380
0,15
399
0,15
436
0,13
470
0,09
504
0,09
1425
0,20
Tabelle 7.4: Messwerte für Saccharose
45
Abbildung 7.5: Zeit-Extinktion-Verlauf für Saccharose
t [min]
E
0
0,09
53
0,08
124
0,10
163
0,18
241
0,36
299
0,42
353
0,48
385
0,60
404
0,56
442
0,56
476
0,64
501
0,63
1430
2,00
1434
3,15
Tabelle 7.5: Messwerte für Fructose
46
Abbildung 7.6: Zeit-Extinktion-Verlauf für Fructose
t [min]
E
0
0,08
53
0,07
125
0,11
162
0,14
241
0,18
302
0,17
354
0,16
385
0,14
404
0,12
444
0,16
478
0,16
509
0,16
1432
0,31
1558
0,51
1725
0,73
Tabelle 7.6: Messwerte für Xylitol
47
Abbildung 7.7: Zeit-Extinktion-Verlauf für Xylitol
t [min]
E
0
0,12
56
0,11
128
0,11
166
0,10
246
0,10
307
0,13
358
0,07
389
0,06
408
0,06
449
0,09
481
0,07
514
0,11
1436
0,09
Tabelle 7.7: Messwerte für Cyclamat
48
Abbildung 7.8: Zeit-Extinktion-Verlauf für Cyclamat
Es zeigt sich in allen Kurvenverläufen eine Unregelmäßigkeit im Bereich von ungefähr 360 –
550 min. Dieser ist darauf zurückzuführen, dass das Gerät statt bei den benötigten 37° nur mit
26,5° heizte, wodurch die Bakterien ein verlangsamtes (bis gar kein) Wachstum zeigten.
Wie aus Gleichung (2), dem Lambert-Beerschen Gesetz ersichtlich, verhalten sich Konzentration
und Extinktion proportional zueinander.
Da der molare Adsorptionskoeffizient der einzelnen untersuchten Substanzen nicht in der
Literatur zu finden ist und demnach experimentell bestimmt werden müsste, lassen sich keine
genauen Konzentrationen berechnen.
Für die E.coli Bakterien in glucosehaltigem Nährmedium lässt sich der erwartete
Wachstumsverlauf beobachten. Auch E.coli Bakterien in fructosehaltiger oder xylitolhaltiger
Lösung zeigen eine ähnliche Wachstumskurve. Dies scheinen also eine mögliche Alternative für
E.coli Bakterien zu sein.
In saccharosehaltigem Nährmedium hingegen kann nur eine geringe Zunahme der Extinktion und
somit auch der Bakterienkonzentration verzeichnet werden, obwohl Saccharose aus Glucose und
Fructose besteht. Offensichtlich scheinen E.coli Bakterien nicht in der Lage zu sein, Saccharose
in seine beiden Bestandteile zu spalten, bzw. es als Energiequelle zu nutzen.
Auch Cyclamat und Stevia stellen anhand der Extinktions-Zeit-Verläufe scheinbar kein Ersatz
für Glucose als Energiequelle zu sein. Es ist lediglich vorstellbar, dass Saccharose, Cyclamat und
Stevia die gerade zum Überleben nötige Energie zur Verfügung stellen, die aber keineswegs
ausreichend für eine Fortpflanzung durch Zellteilung ist.
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7.6 Diskussion und Fehlerbetrachtung
Das verwendete Gerät zur Messung der Transmission stellt eine große Fehlerquelle dar. Es zeigte
teilweise deutliche Schwankungen innerhalb einer Messung einer Probe zu einem beliebigen
Zeitpunkt t auf. Es musste mehrmals mit der jeweiligen bakterienfreien Zuckerlösung kalibriert
und dann die bakterienhaltige Lösung gemessen werden, um einen verlässlichen Wert zu
erhalten. Dadurch sind ebenfalls (neben der Zeitspanne mit ungünstiger Wachstumstemperatur)
Unregelmäßigkeiten während den Messreihen zu erklären.
Unreinheiten auf dem Reagenzglas beeinträchtigten ebenfalls eine exakte Messung der
Extinktion.
Durch Überführen der je Messung entnommenen Probe aus dem Reagenzglas zurück in den
dazugehörigen Erlenmeyerkolben entstanden geringe Verluste von Nährmedium und Bakterien,
welche jedoch während aller Messungen mit allen Lösungen entstanden, wodurch dieser Fehler
alle Werte ungefähr im gleichen Maß beeinflusst. Er ist somit zu vernachlässigen.
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7.7 Zusammenfassung
Das Bakterium E.Coli ist ein natürlicher Bestandteil unseres Darmtrakts, liegt dort jedoch
lediglich in einer Konzentration von unter einem Prozent vor.
Colibakterien sind lebenswichtig zur Erhaltung der Darmflora, indem andere Bakterien durch
deren Anwesenheit abgetötet werden. Im Übermaß agieren sie jedoch auch als Krankheitserreger
und können so zu starken Infektionen führen. Für ein intaktes Stoffwechselsystem ist somit die
richtige Konzentration von E.Coli Bakterien von großer Bedeutung.
Wichtig ist eine gleichbleibende Konzentration, da Colibakterien aus unterschiedlichsten
Gründen (z.B Regeneration) absterben und durch Zellteilung die Darmflora intakt bleibt. Denn
auch eine Konzentrationsabnahme und somit das Absterben dieser Bakterien ist ein Auslöser für
Krankheiten, da sich Krankheitserreger sonst ungehindert im Darmtrakt vermehren und auch
andere Organe infizieren könnten.
Dieser Versuch zeigte, dass Cyclamat und Stevia aufgrund der Konzentrationsabnahme zu solch
einer Infektion im Körper führen könnten, da diese für E.Coli Bakterien kein geeignetes
Nährmedium darstellen und die Bakterien somit absterben würden. Somit können Süßstoffe im
übermäßigen Verzehr laut Versuch zu einer Zerstörung der Darmflora führen. Eine
kalorienbewusste Alternative wäre Xylitol. Jedoch ist hier mit hoher Wahrscheinlichkeit das
Wachstum zu gering, um eine einwandfreie Funktionsweise des Darmtrakts zu garantieren.
Glucose und Fructose in hohem Maß hingegen würden nach den Versuchsergebnissen zu einer
übermäßigen Vermehrung führen, sodass eine Eigeninfektion durch E.coli daraus resultiert.
Unsere optimalste Lösung wäre Saccharose, da nur ein leichter Anstieg zu verzeichnen war. Das
Wachstum würde dann in etwa dem Absterben der Bakterien im Darmtrakt entsprechen, was wie
gewünscht zu einer konstanten Konzentration führen würde.
Diese Schlussfolgerungen basieren jedoch auf dem theoretischen Wissen aus dem Versuch,
unabhängig davon, ob das verwendete Minimalnährmedium dem des Darmtrakts entspricht.
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