Dokument_27.

Einfluss N-terminaler Peptide des Glykoproteins E2
von GB-Virus C auf die HIV-Replikation
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.
vorgelegt von
Yvonne Ködel
aus Worms
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 29. Juli 2011
Vorsitzender der
Promotionskommision:
Prof. Dr. Rainer Fink
Erstberichterstatterin:
Prof. Dr. Jutta Eichler
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
A. Zusammenfassung ............................................................................................................... 5
B. Einleitung ............................................................................................................................. 7
1. Entdeckung des GB-Virus C (GBV-C).............................................................................. 7
2. Klinik und Prävalenz von GBV-C ..................................................................................... 7
3. Taxonomie der Flaviviridae............................................................................................... 8
4. Interferenz von GBV-C mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV) ....................... 10
5. Aufbau und Genomstruktur von GBV-C ......................................................................... 10
6. Zelltropismus von GBV-C ............................................................................................... 11
7. Die Strukturproteine von GBV-C .................................................................................... 12
8. HIV-Entry-Mechanismus ................................................................................................. 13
9. Virale Glykoproteine und Membranfusion ...................................................................... 15
10. Pseudotypisierte HIV-Reporterviren.............................................................................. 16
C. Ziel der Arbeit ................................................................................................................... 18
D. Material .............................................................................................................................. 19
1. Zellen und Zelllinien ........................................................................................................ 19
2. Bakterienstämme .............................................................................................................. 19
3. Virusstämme und Pseudotypen ........................................................................................ 19
4. Expressionsplasmide ........................................................................................................ 20
5. Antikörper ........................................................................................................................ 21
6. Reagenzien ....................................................................................................................... 21
7. Kits ................................................................................................................................... 22
8. Medien für Bakterienkulturen .......................................................................................... 22
9. Medien für Zellkulturen ................................................................................................... 22
10. Puffer und Lösungen ...................................................................................................... 23
11. Peptide............................................................................................................................ 25
12. Verbrauchsmittel ............................................................................................................ 27
E. Methoden............................................................................................................................ 28
1. Zellkultur.......................................................................................................................... 28
2. Transfektionsverfahren..................................................................................................... 28
3. Pseudotypisierung von HIV-Reporterpartikeln................................................................ 29
4. Virusanzucht..................................................................................................................... 30
Inhaltsverzeichnis
5. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut .......................................................... 30
6. Inkubation mit rekombinantem Glykoprotein.................................................................. 31
7. Replikationsversuche mit HIV-Reporterviren ................................................................. 31
8. Replikationsversuche mit HIV-Wildtypstämmen ............................................................ 33
9. Bestimmung der Peptid-Aktivität..................................................................................... 33
10. Immunoblotting.............................................................................................................. 33
11. Affinitätschromatographie ............................................................................................. 35
12. Hämolyse-Test ............................................................................................................... 35
13. Proliferations-Assay ....................................................................................................... 36
F. Ergebnisse........................................................................................................................... 37
1. Die inhibitorische Wirkung des GBV-C-Glykoproteins E2 auf die HIV-Replikation .... 37
2. Inititale Suche nach HIV-inhibitorischen Domänen durch Peptidscanning..................... 40
3. Eingrenzung der HIV-inhibitorischen Domäne und Identifizierung der wirksamsten
E2-Peptide ............................................................................................................................ 46
4. Aktivität unterschiedlich modifizierter E2-Peptide.......................................................... 49
5. Inhibitorische Potenz der E2-Peptide auf verschiedenen Stämmen von
Immundefizienviren ............................................................................................................. 51
6. Angriffspunkte der E2-Peptide im HIV-Replikationszyklus ........................................... 56
7. Zielstrukturen der E2-Peptide .......................................................................................... 57
G. Diskussion .......................................................................................................................... 61
1. N-terminale Peptide des GBV-C Glykoproteins E2 hemmen die HIV-Replikation........ 61
2. HIV-Isolate unterscheiden sich in ihrer E2-Reaktivität ................................................... 63
3. E2-Peptide hemmen den HIV-Entry durch Interaktion mit dem Viruspartikel ............... 68
H. Anhang ............................................................................................................................... 71
1. Vektorkarten..................................................................................................................... 71
2. Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................... 74
I. Literaturverzeichnis ........................................................................................................... 77
A - Zusammenfassung
A - Zusammenfassung
Das nicht-humanpathogene GB-Virus C (GBV-C), ein Mitglied der Flaviviridae, ist in
Individuen mit parenteralen oder sexuellen Risikofaktoren weit verbreitet. Bei HIV-Patienten
korreliert eine persistierende GBV-C-Virämie mit einer erhöhten Überlebensrate und einer
verlangsamten Progression zu AIDS. In früheren Studien wurde gezeigt, dass das E2Glykoprotein von GBV-C die Replikation von HIV-1 hemmen kann, indem es den Eintritt des
Virus in die Zelle (Entry) beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden,
welche Region(en) in E2 diese antivirale Aktivität vermittelt. Dazu wurden überlappende, von
E2 abgeleitete Peptide entwickelt und in Replikationsversuchen mit HIV auf ihre
inhibitorische Wirkung untersucht. Dabei wurde eine Region im N-Terminus von E2
identifiziert, die eine effiziente Inhibition der HIV-Replikation vermittelt. Diese inhibitorische
Domäne konnte auf die Aminosäuren 29 bis 72 des E2-Proteins eingegrenzt werden. In
diesem Bereich konnten zwei Peptide identifiziert werden, die äußerst potent die HIVReplikation unterdrücken können: P4-7 (AS 37 bis 56) und P6-2 (AS 45 bis 64). Experimente
mit modifizierten Varianten dieser Peptide zeigten, dass die Veränderung der linearen
Peptidsequenz zu einer Erniedrigung der antiviralen Aktivität führte. Der Austausch der
Cysteinreste in den Peptiden gegen Serinreste führte zu einem nahezu kompletten Verlust der
HIV-inhibitorischen Wirkung bei getesteten Peptidendkonzentrationen bis 100 µM. In
weiteren Experimenten zur HIV-inhibitorischen Potenz der E2-Peptide zeigten die Peptide
P6-2 (AS 45 bis 64) und P4762 (AS 37 bis 64) die stärkste antivirale Aktivität. In
Replikationsversuchen auf einer HIV-Reporterzelllinie (TZM-bl) erreichten diese Peptide mit
diversen HIV-Primärisolaten von Subtyp A bis H IC50-Werte im niedrigen mikromolaren
Bereich zwischen 0,1 und 2 µM. Es zeigte sich jedoch, dass die verschiedenen HIVPrimärisolate unterschiedlich sensitiv für E2-Peptide sind. Während die Replikation einiger
Stämme äußerst effizient hemmbar war, zeigten andere Stämme nur eine sehr schwache oder
keine Reaktivität. Die Sensitivität für E2-Peptide konnte jedoch nicht klar mit dem
Korezeptortropismus oder HIV-Subtyp in Korrelation gebracht werden. Untersuchungen mit
pseudotypisierten HIV-Reporterpartikeln ergaben, dass die Sensitivität der HIV-Isolate durch
das gp120/gp41-Hüllprotein bestimmt wird. Dabei wurden Viren verwendet, die mit
Hüllproteinen des X4-tropen HIV-Stamms HxB2 bzw. des R5-tropen HIV-Stamms ADA
(beide Subtyp B) pseudotypisiert waren. Weiterhin wurden HIV-Partikel untersucht, die das
heterologe G-Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis-Virus tragen, welche über einen HIVunabhängigen Weg durch Endozytose in die Wirtszelle eindringen. Mit diesen verschieden
5
A - Zusammenfassung
pseudotypisierten HIV-Partikeln konnte der Einfluss von E2-Peptiden auf frühe
Replikationsschritte gezielt untersucht werden. Dafür wurden jeweils HIV-suszeptible Zellen
bzw. pseudotypisierte HIV-Reporterpartikel mit E2-Peptiden inkubiert und überschüssige
Reagenzien anschließend durch intensive Waschschritte entfernt. Dabei konnte gezeigt
werden, dass die von E2 abgeleiteten Peptide spezifisch Virusbindung und/oder
Membranfusion durch direkte Interaktion mit dem Viruspartikel beeinflussen. In HämolyseTests wurde außerdem gezeigt, dass E2-Peptide die HIV-vermittelte Lyse von Erythrozyten
hemmen können. Somit wurde ein neuer Mechanismus der viralen Interferenz zwischen
GBV-C und HIV-1 aufgedeckt. Dabei werden die frühen Schritte der HIV-Infektion gezielt
durch Interaktion des GBV-C-Glykoproteins E2 mit HIV-Partikeln unterdrückt.
6
B - Einleitung
B - Einleitung
1. Entdeckung des GB-Virus C (GBV-C)
Das GB-Virus C (GBV-C) wurde Mitte der 1990er Jahr von zwei verschiedenen Gruppen
unabhängig voneinander identifiziert. Nach der Entdeckung des Hepatitis C-Virus (HCV)
konnten viele Hepatitiden keinem Virus zugeordnet werden. Etwa 10-20% der Patienten mit
Non-A,Non-B-Hepatitis schienen nicht mit HCV infiziert zu sein und man suchte daher einen
Hepatitisauslöser, der keiner dieser drei Virusgenera zuzuschreiben war. (Simons et al. 1995,
Linnen et al. 1996). Dank verbesserter Untersuchungsmethoden konnten schließlich neue
Hepatitisviren entdeckt werden. Im Zuge dessen identifizierte die Firma Genelabs ein zu
HCV verwandtes Virus aus einem Patienten mit Non-A-E-Hepatitis und nannten diesen
Erreger Hepatitis G-Virus G (HGV) (Simons et al. 1995). In den Forschungslaboratorien von
Abbott wurden gleichzeitig zwei Viren in Seidenäffchen identifiziert, die zuvor mit Serum
eines Non-A,Non-B-Hepatitis-Patienten beimpft worden waren. Sie entwickelten daraufhin
eine fulminante Hepatitis. Diese identifizierten Viren zeigten eine große Homologie zu HCV
und wurden in Bezug auf die Initialen den Patienten (G.B.) als GB-Virus A und B (GBV-A,
GBV-B) benannt (Schaluder et al. 1995). GBV-A und GBV-B wurden jedoch nicht im
Menschen gefunden. Die Verwendung von degenerierten Primern ermöglichte es, ein eng
verwandtes Virus im Menschen zu identifizieren, welches sie GBV-C nannten (Simons et al.
1995). Spätere Sequenzanalysen zeigten, dass HGV und GBV-C zwei Isolate desselben Virus
sind (Leary et al. 1996, Alter 1996).
2. Klinik und Prävalenz von GBV-C
Trotz zahlreicher Studien, die sich mit der Assoziation von GBV-C mit akuter oder
chronischer Hepatitis beschäftigten, konnte kein kausaler Zusammenhang zwischen einer
GBV-C-Infektion und Hepatitis hergestellt werden (Alter et al. 1997, Stapleton 2003).
Aufgrund dessen wird GBV-C als nicht-humanpathogenes Virus angesehen. GBV-C ist wie
HCV weltweit verbreitet und kann im Menschen persistieren (Lefrere et al. 1997). Eine
GBV-C-Infektion kommt häufig vor: in Industrienationen tragen etwa 1-5% der gesunden
Blutspender GBV-C-Viren im Blut. In Entwicklungsländern ist die Prävalenz der GBV-CInfektion entsprechend höher (Abb. 1.). Wiederum signifikant erhöht ist die Prävalenz in
Individuen, die bereits eine sexuell oder über Blut übertragbare Infektion tragen: bei HCVInfizierten liegt die GBV-C-Prävalenz bei ca. 20-30%, bei HIV-Infizierten bei 30-40% (Mohr
and Stapleton 2009).
7
B - Einleitung
Eine akute GBV-C-Virämie wird durch Detektion von viraler RNA im Serum oder Plasma
mittels RT-PCR bestimmt, während eine frühere Infektion durch Anwesenheit von GBV-C
E2-Antikörpern nachgewiesen wird. E2-Antikörper haben neutralisierende Wirkung und die
Fähigkeit, eine existierende GBV-C-Infektion zu eliminieren. Der Verlust der Virämie
korreliert zeitlich mit dem Auftreten von E2-Antikörpern. Es wird daher angenommen, dass
ca. 75% der GBV-C-Infektionen in Immunkompetenten innerhalb von zwei Jahren durch E2Antikörper neutralisiert werden (Alter et al. 1997, Mohr and Stapleton 2009). Dies gilt jedoch
nicht für Patienten mit geschwächtem Immunsystem. Während beispielsweise bei gesunden
Blutspendern das Verhältnis E2-Antikörper:Virämie 6:1 beträgt, liegt dieses Verhältnis bei
HIV-Patienten nur bei 2:1 (Williams et al. 2004). Außerdem ist die GBV-C-Infektion
verglichen mit einer HCV-Infektion weniger persistent. Die Zahl der virämischen HCVPatienten ist viermal höher als die Zahl der Patienten mit HCV-Antikörpern
(Antikörper:Viramie-Verhältnis 1:4) (Mohr and Stapleton 2009, Alter 1997)
Abbildung 1: GBV-C-Prävalenzraten in verschiedenen Regionen der Welt.
Die GBV-C-Virämie wurde in gesunden Blutspendern mittels RT-PCR bestimmt. Die Prävalenz für
GBV-C-RNA liegt zwischen 0,5 und 5% in Industrienationen, verglichen mit 5 bis 18,9% in
Entwicklungsländern. * Karibik (West-Indische Inseln). (Mohr and Stapleton 2009)
3. Taxonomie der Flaviviridae
Ausgehend von Nukleotidsequenz und Genomorganisation wurde GBV-C in die Familie der
Flaviviridae eingeordnet. Diese Virusfamilie unterteilt sich in drei Genera: Flavi-, Pesti- und
Hepaciviren (Abb. 2). GBV wird offiziell keinem dieser Genera zugeordnet. Aktuell wird die
Zuordnung von GBV-A, GBV-C und dem neu identifizierten GBV-D (Epstein et al. 2010) zu
einem eigenen Genus vorgeschlagen: den Pegiviren. Dieser Name soll die persistente
Infektion der GB-Viren widerspiegeln (Pe) sowie die Verwandtschaft zu ‚GB’-Agenzien und
dem Hepatitis G-Virus (G). GBV-B induziert als einziges GB-Virus tatsächlich Hepatitis in
8
B - Einleitung
Neuweltaffen und wird als GB-Virus den Hepaciviren zugeordnet. Alle anderen GB-Viren
sollen nach ihrem Wirtsspektrum benannt werden. GBV-C würde dann als Humanes
Pegivirus (HPgV) bezeichnet werden. Die Vorschläge zur Klassifizierung dieser Viren wird
dem International Commitee on Taxonomy of Viruses (ICTV) zur Begutachtung vorgelegt
(Stapleton et al. 2010).
Abbildung
2:
Phylogenetischer
Stammbaum
der
Flaviviridae.
Phylogenetische Verwandtschaft der RNA-Polymerasesequenz
verschiedener Flaviviridae. Es sind drei Genera der Flaviviren
(Flavi-, Hepaci- und Pestivrien) sowie die unklassifizierten
GB-Viren (unassigned) dargestellt. Der Stammbaum zeigt sechs
repräsentative Vertreter der Hepatitis C-Viren (HCV), fünf
GBV-C-Isolate,
eine
GBV-C-Variante
aus
Schimpansen
(troglodyte) und vier GBV-A-Genotypen. Weitere Vetreter der
Flavivirirdae:
BVDV (Bovines Virusdiarrhoe-Virus), YFV
(Gelbfiebervirus), TBEV (Tick-Borne Enzephalitis-Virus), DV
(Dengue-Virus) und JEV (Japanisches Enzephalitits-Virus).
(Mohr and Stapleton 2009)
Phylogenetische Analysen haben gezeigt, dass GBV-C in mehrere Genotypen untergliedert
werden kann. Die geografische Verteilung der Genotypen weist auf eine lange evolutionäre
Geschichte hin. Es zeigten sich Parallelen zu frühgeschichtlichen Völkerwanderungen
ausgehend von Afrika auf andere Kontinente. Der Genotyp 1 ist hauptsächlich in Afrika zu
finden. Genotyp 2 ist vorwiegend in Europa und Nordamerika vertreten. In Nordasien und
Ureinwohnern Südamerikas ist meist der Genotyp 3 zu finden, während Genotyp 4 in
Südasien vorherrscht (Smith et al. 1997, Naito and Abe 2001). Eine Analyse der
E2-Genregion verschiedener Isolate aus Südafrika deutet auf die Existenz eines Genotyps 5
hin (Tucker and Smuts 2000, Sathar et al. 1999, Muerhoff et al. 2005). Eine japanische Studie
berichtet außerdem von einer Unterteilung des Genotyps 1 in fünf Subtypen (1a-e) sowie des
Genotyps 2 in zwei Subtypen (2a und 2b) (Liu et al. 2003). Neuere Analysen deuten darüber
hinaus auf die Existenz eines sechsten Genotyps hin (Muerhoff et al. 2006).
9
B - Einleitung
4. Interferenz von GBV-C mit dem Humanen Immundefizienzvirus (HIV)
Aufgrund vergleichbarer Übertragungswege wurde der Einfluss von GBV-C auf eine
bestehende HIV-Infektion in einer Reihe epidemiologischer Studien untersucht. Dabei zeigte
sich, dass eine bestehende GBV-C-Koinfektion bei HIV-Patienten mit einer höheren
Überlebenswahrscheinlichkeit assoziiert ist (Toyoda et al. 1998, Heringlake et al. 1998,
Devereux et al. 1998, Lefrere et al. 1999, Yeo et al. 2000, Xiang et al. 2001, Tillmann et al.
2001, Williams et al. 2004). Es konnte außerdem gezeigt werden, dass der
HIV-supprimierende Effekt bei solchen Patienten am stärksten ausgeprägt ist, die eine
persistierende GBV-C-Virämie aufweisen. Aber auch die Eliminierung der GBV-C-Infektion
durch Bildung von E2-Antikörpern ist im Vergleich zu HIV-positiven Patienten, die nie mit
GBV-C in Kontakt gekommen sind, mit einer deutlich verlangsamten Progression zu AIDS
assoziiert (Williams et al. 2004, Tillmann et al. 2001). Im Gegensatz dazu scheint die
Eliminierung einer GBV-C-Virämie ohne Bildung neutralisierender E2-Antikörper mit einem
rascheren Verlauf der HIV-Infektion und einer schnelleren Progression zu AIDS zu
korrelieren (Williams et al. 2004, Björkman et al. 2003, Van der Bij et al. 2005).
5. Aufbau und Genomstruktur von GBV-C
Die Morphologie von GBV-C ist bisher wenig untersucht. Infektiöse Partikel anderer
Flaviviridae besitzen sphärische Kapside mit einem Durchmesser von 40–50 nm. Das Kapsid
wird vom viralen C-Protein gebildet. Die Existenz des entsprechenden kodierenden Bereichs
konnte bei GBV-C noch nicht eindeutig geklärt werden. Er wird jedoch am 5’-Ende in der
nichttranslatierten Region (NTR) vermutet. Das Kapsid ist außerdem von einer Hüllmembran
umgeben, in die virale Strukturproteine eingelagert sind. Das Genom besteht aus einer
einzelsträngigen RNA mit Plusstrangorientierung von etwa 9,4 kb Länge, die am 5’- und
3’-Ende von nicht-kodierenden Bereichen (NTR) flankiert wird (Abb. 3). Im 5’-NTR befindet
sich eine internal ribosomal entry site (IRES), an der die Translation von Polyproteinen
initiiert wird. Im Gegensatz zu HCV besitzt der 3’-NTR von GBV-C keinen poly(A)- oder
poly(U)-Schwanz (Xiang et al. 2000). Translation und Proteinprozessierung von HCV sind
experimentell belegt. Aussagen zur Prozessierung von GBV-C beruhen größtenteils auf
Voraussagen, denen Sequenzvergleiche mit HCV zugrunde liegen. So wird angenommen,
dass das GBV-C-Polyprotein durch zelluläre und virale Proteasen posttranslational prozessiert
wird. Im 5’-Bereich sind die Glykoproteine E1 und E2 kodiert, die als Heterodimere in die
Hülle des Viruspartikels eingelagert werden. Diese werden ebenso wie p5.6 vermutlich
analog zu HCV durch zelluläre Signalpeptidasen prozessiert (Leary et al. 1996). Von p5.6
10
B - Einleitung
Nichtstruktur‐Gene
Struktur‐Gene
p5.6
C‐Protein?
E1 TM
5‘ NTR
E2 TM
NS2
NS3
NS4A
NS4B
NS5A
NS5B
3‘ NTR
(+)ssRNA
25
198
40
aa 1
aa 340
Abbildung 3: Genomorganisation von GBV-C.
Die Abbildung zeigt den offenen Leserahmen von GBV-C, der am 5‘- und 3‘-Ende von nichttranslatierten
Regionen (NTR) flankiert wird. E1 und E2 bilden als Heterodimere die Hüllproteine des Viruspartikels.
P5.6 scheint ein Ionenkanal zu sein. Daran schließen sich die Nicht-Strukturproteine an: NS2
(Thiolprotease), NS3 (Protease und Helikase), NS4A und NS4B (Proteasekofaktoren), NS5A
(interferonsensitiver Bereich) und NS5B (RNA-abhängige RNA-Polymerase). Die Existenz des kodierenden
Bereichs für das C-protein konnte noch nicht eindeutig geklärt werden.
Glycosylierungsstellen in E2.
wird angenommen, dass es wie p7 von HCV einen Ionenkanal bildet (Penin et al. 2004,
Griffin et al. 2003). Im 3’-Bereich der viralen RNA befinden sich die Nicht-Strukturproteine
(NS) NS2, NS3, NS4A und B sowie NS5A und B. NS2, NS3 und NS4A besitzen
Proteaseaktivität und sind für die Prozessierung der NS-Proteine verantwortlich (Belyaev et
al. 1998). NS3 fungiert außerdem als Helikase und NTPase (Leary et al. 1996). NS4A und B
sind Kofaktoren der Protease und an der Replikation beteiligt. Bei NS5A handelt es sich um
ein Regulatorprotein, das wahrscheinlich die Umschaltung zwischen Replikation und
Translation reguliert. Zusätzlich vermittelt NS5A Interferonresistenz und ist an der
Unterdrückung von HIV-1 beteiligt (Prof. Thomas Pietschmann, persönliche Mitteilung,
Chang et al. 2007, Xiang et al. 2006). NS5B stellt die virale RNA-abhängige RNAPolymerase dar.
6. Zelltropismus von GBV-C
Ursprünglich wurde angenommen, dass GBV-C, vergleichbar mit HCV, in der Leber
repliziert. Es wurde berichtet, dass Negativstrang-RNA von GBV-C in Lebergewebe
nachgewiesen werden konnte, was auf eine aktive Replikation des Virus hindeutete (Madejon
et al. 1997, Saito et al. 1997). Der Vergleich der RNA-Mengen von HCV und GBV-C in der
Leber zeigte jedoch, dass HCV vorwiegend im Lebergewebe zu finden ist, während GBV-CTranskripte in großer Zahl im Serum zu finden waren. Aufgrund eines Leber:SerumVerhältnisses von GBV-C-RNA von <1 geht man davon aus, dass es sich bei der im
Lebergewebe detektierten RNA um Serumkontaminationen handelte (Pessoa et al. 1998).
11
B - Einleitung
Weiterhin war es Laskus et al. nicht möglich, Negativstrang-RNA von GBV-C in der Leber
nachzuweisen (Laskus et al. 1997). Hinzu kommt, dass die GBV-C-RNA-Menge im Serum
nach Lebertransplantation stagniert, obwohl HCV-RNA in diesem Fall in aller Regel in
geringeren Mengen nachzuweisen ist (Mohr and Stapleton 2009). Dies spricht für eine
GBV-C-Replikation außerhalb von Lebergeweben. Tatsächlich repliziert GBV-C in
Lymphozyten. GBV-C-RNA konnte in T- und B-Lymphozyten, die GBV-C-positiven
Patienten entnommen wurden, nachgewiesen und produziert werden (George et al. 2006,
Mellor et al. 1998). GBV-C-RNA ist sowohl in CD4+ als auch CD8+ T-Lymphozyten
nachweisbar, humane periphere mononukleäre Blutzellen (peripheral blood mononuclear
cells, PBMC) sind das Standard-Zellkultursystem zur in vitro-Anzucht von GBV-C. Das
Virus wird daher als lymphotrop angesehen. Fraglich ist jedoch, warum Negativstrang-RNA
in manchen Fällen kaum oder garnicht in den PBMC von Infizierten nachgewiesen werden
kann (Mellor et al. 1998). Es konnten aber RNA-Transkripte im Knochenmark und der Milz
nachgewiesen werden (Laskus et al. 1998). Dies spricht für eine lymphozytoide
Vorläuferzelle als Primärort der GBV-C-Replikation. Vergleichbar zu anderen lymphotropen
Viren wird auch GBV-C über Blut, vertikal und sexuell übertragen (Stapleton 2003).
7. Die Strukturproteine von GBV-C
Die Strukturproteine E1 und E2 werden durch zelluläre Signalpeptidasen von dem
Polyprotein abgespalten. Die Proteine werden in das Endoplasmatische Reticulum (ER)
transportiert und dort glykosyliert. Bei E1 und E2 handelt es sich um Typ-ITransmembranproteine mit einer Transmembrandomäne (Mohr and Stapleton 2009). E1 ist
ohne Glykosylierung schätzungsweise 20,7 kDa, E2 circa 41,8 kDa groß. Beide Proteine sind
N-glycosyliert: E1 besitzt eine, E2 drei Glykosylierungsstellen. Beide Proteine werden als
Heterodimere in die Hüllmembran des Viruspartikels eingebaut. E2 ist außerdem an der
Zellbindung beteiligt, zelluläre Rezeptoren konnten bis heute jedoch noch nicht eindeutig
identifiziert werden (Nattermann et al. 2004, Kaufman et al. 2007).
Unsere Gruppe konnte zeigen, dass das Glykoprotein E2 maßgeblich an der Hemmung der
HIV-Replikation beteiligt ist. Das E2-Protein beeinflusst frühe Replikationsschritte wie
Zellbindung und/oder den Eintritt des Virus in die Zelle (Entry). Der inhibitorische Effekt ist
dosisabhängig. In PBMC, die mit GBV-C-RNA transfiziert wurden, die sowohl für E2 als
auch E1, NS2 und NS3 kodiert, wird die Sekretion von löslichen Faktoren wie RANTES,
MIP-1α und MIP-1β induziert. Diese Chemokine sind natürliche Liganden des HIVKorezeptors CCR5, welcher in dieser Studie herunterreguliert wurde. Auch die Inkubation
12
B - Einleitung
von PBMC mit E2 vor Infektion führte zu einer Hemmung der HIV-Replikation (Jung et
al. 2005, Jung et al. 2007). 2005 wurde in biophysikalischen Analysen ein von E2 abgeleitetes
Peptid identifiziert, bei dem es sich vermutlich um das Fusionspeptid von E2 handelt (Larios
et al. 2005). Dieses Peptid bildet eine helikale Struktur aus, die leicht in Membranen
eindringen und diese destabilisieren kann (Mazzini et al. 2007). Die Gruppe von Haro und
Mitarbeitern konnte außerdem im Modellsystem zeigen, dass das Peptid E2(269-286) mit dem
Fusionspeptid (FP) von HIV-1 gp41 interagiert und die durch gp41-FP vermittelte
Destabilisierung von Modellvesikeln hemmt (Herrera et al. 2009). Neueste Ergebnisse dieser
Gruppe zeigen, dass eine Reihe von E2-Peptiden die HIV-Replikation in vitro hemmen kann
(Herrera et al. 2010).
8. HIV-Entry-Mechanismus
Der Eintritt von HIV in Wirtszellen ist ein komplexer Prozess aus mehreren verschiedenen
Schritten: die Anlagerung an Zellen gefolgt von CD4-Bindung, die Bindung an Korezeptoren
und anschließende Membranfusion. Die initiale Interaktion zwischen HIV und Wirtszellen
kommt durch unspezifische Wechselwirkungen zwischen positiv geladenen Domänen des
HIV-Hüllproteins gp120 und negativ geladenen Proteoglycanen der Zellmembran oder durch
spezifische Wechselwirkungen mit lectin-bindenen Proteinen auf der Zelloberfläche (z.B.
DC-SIGN) zustande (Mondor et al. 1998, Moulard et al. 2000, Tilton and Doms 2010,
Pohlmann et al. 2001). Diese Faktoren sind nicht essentiell für eine erfolgreiche Infektion,
erhöhen aber deren Effektivität (Tilton and Doms 2010, Geijtenbeek et al. 2000). Der
Primärrezeptor für HIV ist CD4, ein Vertreter der Immunglobulin-Superfamilie. Die
Interaktion von HIV mit CD4 wird über konservierte Strukturen auf gp120 vermittelt (Kwong
et al. 1998). Nach Bindung an CD4 durchläuft gp120 etliche Konformationsänderungen.
Zunächst wird eine Reihe von ß-Faltblattstrukturen umgefaltet und es kommt zur Bildung
einer viersträngigen ß-Faltblatt-Minidomäne, das sogenannte bridging sheet (Kwong et al.
1998, Tilton and Doms 2010, Chen et al. 2005). Anschließend falten sich die variablen
Regionen von gp120 (V1/V2- und V3-Schleife) um und werden somit exponiert. Außerdem
werden bridging sheet und V3-Schleife in Richtung der Zellmembran ausgerichtet, wodurch
sie mit dem Korezeptor interagieren können (Huang et al. 2005, Trkola et al. 1996, Wu et al.
1996). Die primären Korezeptoren für HIV-1 sind die Chemokinrezeptoren CCR5 und
CXCR4. Diese Proteine besitzen sieben Transmembranhelices, einen extrazellulären
N-Terminus und drei extrazelluläre Schleifen (extracellular loops, ECL), die eine Tasche
ausbilden. In CCR5 interagieren diese räumlich getrennten Domänen mit bestimmten
13
B - Einleitung
Regionen von gp120: der N-Terminus des Chemokinrezeptors bindet das bridging sheet und
die V3-Schleife, die zweite extrazelluläre Schleife von CCR5 interagiert mit der Spitze der
V3-Region (zusammengefasst in Tilton and Doms 2010). Die Bindung von gp120 an CXCR4
verläuft in ähnlicher Weise. Die V3-Schleife von X4-tropen Viren scheint jedoch stärker
positiv geladen zu sein (Fouchier et al. 1992, Tilton and Doms 2010). Die Bindung an den
Korezeptor führt zu weiteren Konformationsänderungen, die zur Freilegung und Insertion des
gp41-Fusionspeptids (gp41-FP) in die Zellmembran führen. Nach Eindringen des
gp41-FP in die Membran kommt es zu Umformungen in den heptad-repeat-Regionen HR1
und HR2 von gp41, die zur Bildung des six-helix-bundles führen. Dabei bilden die drei
HR1-Domänen eine innere coiled-coil-Struktur, um die sich die drei HR2-Domänen winden
(Chan et al. 1997, Weissenhorn et al. 1997). Diese Umlagerungen bringen die
Transmembrandomäne von gp41 in direkte Nähe des gp41-FP in der Zellmembran. Dadurch
werden Virus- und Zellmembran in Kontakt gebracht, so dass sich eine Fusionspore ausbilden
kann, die dann den Eintritt des HIV-Kapsids in die Wirtszelle ermöglicht. Neuere Studien
weisen außerdem darauf hin, dass Endozytose von Viruspartikeln für die volle Fusion
mitverantwortlich ist (Miyauchi et al. 2009).
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Eintritts von HIV in die Wirtszelle.
Das
gp120
von
HIV
interagiert
mit
dem
zellulären
Rezeptor
CD4,
was
zu
diversen
Konformationsänderungen führt. Dadurch werden die variablen Schleifen des gp120 umgelagert und können
so mit den Korezeptoren CXCR4 bzw. CCR5 in Verbindung treten. Durch weitere Strukturänderungen wird
so das Fusionspeptid von gp41 freigelegt, welches so in die Zellmembran eindringen kann. Es kommt
dadurch zu Umlagerungen im gp41, der Ausbildung des six-helix-bundles. Dadurch werden Virus- und
Zellmembran in direkte räumliche Nähe gebracht, was die Ausbildung einer Fusionspore und den Eintritt
des HIV-Kapsids in die Wirtszelle ermöglicht.
Quelle: http://www.microbiologybytes.com/blog/2006/08/
14
B - Einleitung
9. Virale Glykoproteine und Membranfusion
Die Glykoproteine umhüllter Viren können mit der Wirtszellmembran interagieren und diese
destabilisieren, um so den Eintritt des Viruskapsids in die Zelle zu ermöglichen. Obwohl
virale Glykoproteine sehr unterschiedliche Strukturen besitzen, wirken sie doch über
vergleichbare Mechanismen. Abhängig von der Virusfamilie findet die Fusion entweder an
der Plasmamembran statt, wo durch Rezeptorbindung verschiedene Konformationsänderungen in den Proteinen ausgelöst werden, oder in Endosomen, wenn Viren über
Endozytose aufgenommen werden. Diese Umstrukturierungen führen zur Freilegung von
hydrophoben Peptiden oder Strukturen (sog. Fusionspeptiden), die mit einer oder beiden
Membranen interagieren und sie destabilisieren können. Dies geschieht über Bildung einer
stabilen Haarnadelstruktur, die Transmembrandomänen und Fusionspeptide in räumliche
Nähe bringen und so Wechselwirkungen zwischen den Membranen ermöglichen
(Weissenhorn et al. 2007). Man unterscheidet drei Klassen viraler Fusionsproteine. Klasse IFusionsproteine sind durch trimere Haarnadelstrukturen und eine zentrale, helikale coiledcoil-Struktur gekennzeichnet. Zu dieser Gruppe der Klasse I-Fusionsproteine gehört z.B. das
HIV-1 gp41. Das E-Protein von Denguevirus 2 und 3 ist ein Vertreter der Klasse IIFusionsproteine. Sie bestehen aus trimeren Haarnadel- und ß-Faltblattstrukturen (Harrison
2005, Kielian and Rey 2006, Stiasny and Heinz 2006). Klasse III-Fusionsproteine bilden
ebenfalls trimere Haarnadelstrukturen aus. Sie vereinen zudem Charakteristika von Klasse Iund II-Fusionsproteinen, indem sie sowohl α-helikale als auch ß-Faltblattstrukturen
beinhalten (Roche et al. 2006, Heldwein et al. 2006). Ein gut untersuchter Vertreter der
Klasse III-Fusionsproteine ist das G-Protein des Vesikulären Stomatitis-Virus. Trotz
struktureller Unterschiede verlaufen einige Schritte der glykoproteinvermittelten Fusion
ähnlich. Durch die Aktivierung während der Rezeptorbindung oder durch die Ansäuerung in
Endosomen wird das Fusionspeptid freigelegt, was zur initialen Interaktion mit der
Zielmembran führt. Anschließende Umfaltungen führen zur Bildung einer Post-FusionProteinstruktur, bei der äußere Bereiche über den inneren Kern gestülpt werden. So werden
die Membranen gegeneinander ausgerichtet. In einem weiteren Rückfaltungsprozess von
membrannahen und Transmembranregionen werden die Membranen zusammengebracht und
verschmelzen miteinander, was nun die anschließende Einschleusung der viralen Kapside in
die Wirtszelle ermöglicht (Wharton et al. 1995, Gibbons et al. 2003).
15
B - Einleitung
10. Pseudotypisierte HIV-Reporterviren
Pseudotypisierte HIV-Partikel ermöglichen die Untersuchung der HIV-Replikation auf einer
Vielzahl von HIV-suszeptiblen Zellen. Sie sind insbesondere ein adäquates Mittel, um
Einflüsse auf frühe Replikationsschritte zu untersuchen, da unterschiedliche HIVHüllproteine eingebaut werden können. Zusätzlich kann man den HIV-spezifischen Eintritt in
die Zelle umgehen, indem man die HIV-Partikel mit heterologen Hüllproteinen anderer
umhüllter Virustypen pseudotypisiert. Des Weiteren enthalten HIV-Reporterpartikel ein
Reportergen, dessen Expression in Zellkultur leicht quantifizierbar ist. Die in dieser Arbeit
verwendeten Reporterviren enthalten ein Luciferasegen. Das transfizierte HIV-Genom enthält
das Luciferase-Reportergen, aber keine intakte Information für das env-Hüllprotein. Ein für
das entsprechende Hüllprotein kodierendes Expressionsplasmid wird zusätzlich transfiziert.
Nach Infektion einer Wirtszelle mit den durch Kotransfektion produzierten HIV-
Abbildung 5: Schematische Darstellung des HIV-Replikationszyklus mit Angriffspunkten für
antiretrovirale Substanzen.
1 Bindungsinhibitoren; 2 Fusionsinhibitoren; 3 Reverse-Transkriptase-Inhibitoren; 4 Integrase-Inhibitoren; 5
und 6 Proteaseinhibitoren; 7 Maturationsinhibitoren.
Quelle:http://www.aidsfinder.org/main/TWBA/afc2r.htm
16
B - Einleitung
Reporterpartikeln wird dann über Reverse Transkription (RT), Transkription und Translation
eine funktionelle Luciferase gebildet, deren Aktivität in Zelllysaten über die Umsetzung von
Luciferin mittels Luciferaseassay ermittelt werden kann. Abbildung 5 zeigt eine schematische
Darstellung
des
HIV-Replikationszyklus
mit
Angriffspunkten
für
unterschiedliche
antiretrovirale Substanzen. Verschieden pseudotypisierte HIV-Reporterpartikel unterscheiden
sich lediglich in ihrem Hüllprotein. Somit verlaufen nur frühe Replikationsschritte (Bindung,
Fusion und Uncoating) unterschiedlich. Die späteren Replikationsschritte wie RT, Integration,
Transkription und schließlich Translation sind identisch. Unterschiede im Verlauf des
Replikationszyklus bis zu dieser Stufe können mit der Quantifizierung der Luciferaseaktivität
erfasst werden. Die letzten Replikationsschritte (Zusammenbau und Ausknospung neuer
Viren) verlaufen ebenfalls bei allen Reporterpartikeln gleich, werden jedoch durch die
Quantifizierung des Reporters nicht mehr erfasst. Bei der Ausknospung der neu entstehenden
Viren wird nur die HIV-RNA ohne Information für Hüllproteine verpackt. Die Information
für Hüllproteine enthält kein Verpackungssignal und wird demzufolge nicht in die Virionen
eingeschleust. Daher besitzen neu produzierte Viren keine virusspezifischen Hüllproteine und
sind somit nicht infektiös. Es wird so tatsächlich nur ein Replikationszyklus im Reporterassay
quantifiziert.
17
C – Ziel der Arbeit
C - Ziel der Arbeit
In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe war gezeigt worden, dass das GBV-C-Glykoprotein E2
eine Hemmung der HIV-Replikation vermittelt. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht
werden, welcher Bereich des E2-Proteins für die beobachtete HIV-Inhibition verantwortlich
ist. Für diese Zwecke wurden überlappende Peptide herangezogen, welche die
Aminosäuresequenz des GBV-C E2-Proteins widerspiegeln. Diese Peptide sollten in Bezug
auf ihre HIV-inhibitorische Aktivität untersucht werden. Zum einen wurde die inhibitorische
Wirkung der Peptide in Replikationsversuchen mit pseudotypisierten HIV-Reporterviren auf
lymphoiden Zelllinien ermittelt, zum anderen der HIV-inhibitorische Effekt ausgewählter
E2-Peptide mit HIV-Wildtypviren bestätigt. Dies diente dem Zweck, den Mechanismus
auszuklären, über den E2-Peptide die HIV-Replikation hemmen. Hierfür wurden weitere
Replikationsversuche
mit
HIV-Reporterviren,
die
mit
verschiedenen
Hüllproteinen
pseudotypisiert waren, durchgeführt. So sollte der Einfluss von E2-Peptiden auf frühe
Replikationsschritte wie die Bindung von HIV an die Wirtszelle oder Fusion von Virus- und
Zellmembran untersucht werden.
18
D - Material
D - Material
1. Zellen und Zelllinien
PBMC
periphere mononukleäre Blutzellen, aus EDTA-Blut oder buffy coats,
über Ficoll-Gradienten isoliert
488-CBL
cord blood lymphocytes, Zellen aus Nabelschnurblut, über FicollGradienten isoliert; wurden mit Herpesvirus saimiri-Cosmid 488
immortalisiert
293T
humane Nierenepithelzellen, enthalten virale Adeno- und SV40-DNASequenzen (ATCC CRL-11268™)
TZM-bl
HeLa-Derivat (Cervixkarzinomzellen), exprimieren stabil hohe Mengen
an CD4, CXCR4 und CCR5, enthalten außerdem Reportergene
(Luciferase, ß-Galactosidase) unter Kontrolle des HIV-LTR (NIH AIDS
Research & Reference Reagent Program, Cat. No. 8129)
CEMx174-M7-R5
174xCEM-Derivat (Fusionsprodukt der humanen B-Zelllinie 721.174
und der humanen T-Zelllinie CEM), exprimieren CD4, CXCR4 und
CCR5, enthalten außerdem das Gen des Grünfluoreszierenden Proteins
(GFP) und ein Luciferasegen unter Kontrolle des HIV-LTR (Nationales
Referenzzentrum für Retroviren, Erlangen)
2. Bakterienstämme
DH5α™
Genotyp F- φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1
hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1 (Invitrogen Cat.
No. 18258-012)
3. Virusstämme und Pseudotypen
NL4-3
HIV-1-Laborstamm, X4-trop, Subtyp B
SF33
HIV-1-Laborstamm, X4-trop, Subtyp B, chemokinresistent
YU-2
HIV-1-Laborstamm, R5-trop, Subtyp B
JRCSF
klinisches HIV-1-Isolat, R5-trop, Subtyp B
92UG029
klinisches HIV-1-Isolat aus Ruanda, X4-trop, Subtyp A
92TH026
klinisches HIV-1-Isolat aus Thailand, R5-trop, Subtyp B
92BR025
klinisches HIV-1-Isolat aus Brasilien, R5-trop, Subtyp C
92UG024
klinisches HIV-1-Isolat aus Uganda, X4-trop, Subtyp D3
19
D - Material
93BR029
klinisches HIV-1-Isolat aus Brasilien, R5-trop, Subtyp F1
93BR020
klinisches HIV-1-Isolat aus Brasilien, X4-trop, Subtyp F2
RU570 /ARP173
klinisches HIV-1-Isolat aus Russland, R5-trop, Subtyp G
V1557
klinisches HIV-1-Isolat, dualtrop, Subtyp H
SIVmac239
SIV-Stamm aus Rhesusaffen
SIVmac251
SIV-Stamm aus Rhesusaffen
HIV-2mir
HIV-2-Isolat
HIVppHxB2
pseudotypisiertes Virus mit NL4-3-Kapsid und X4-tropem HxB2Hüllprotein (env), enthält Luciferase als Reportergen
HIVppADA
pseudotypisiertes Virus mit NL4-3-Kapsid und R5-tropem ADA env,
enthält Luciferase als Reportergen
HIVppVSV
pseudotypisiertes
Virus
mit
NL4-3-Kapsid
und
heterologem
G-Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis-Virus, enthält Luciferase als
Reportergen
4. Expressionsplasmide
pNL4-3.Luc.R-E-
pUC19-Vektor mit kloniertem NL4-3-Genom, enthält eine
Luciferase im nef-Leserahmen sowie zwei frameshifts im envbzw. vpr-Leserahmen (NIH AIDS Research & Reference
Reagent Program Cat. No. 3418)
pHxB2-env
HIV gp160-Fragment von HxB2gpt kloniert in pSV7d, kein
Verpackungssignal
pADA env
kodiert
für
das
gp160
des
HIV-Isolats
ADA,
kein
Verpackungssignal
pHEF-VSV-G
kodiert für das G-Protein des Vesikulären Stomatitis-Virus, kein
Verpackungssignal
pCEP4-E2(340)-Fc Iowa
Expressionsplasmid pCEP4 (Invitrogen) mit CMV-Promotor,
EBNA-1-Antigen,
kassette,
Ampicillin-
zusätzlich
murines
und
Hygromycinresistenz-
Ig
kappa-chain
V-J2-C
Signalpeptid, IgG1-Fc-Teil mit C-terminalem myc-Epitop und
6xHis-Tag, enthält verkürzte E2-Sequenz des Iowa-Isolats
AF121950 (AS 1 bis 340)
20
D - Material
5. Antikörper
Polyclonal Rabbit Anti-Human IgG/HRP
1:1000,
Code-Nr.
P0214,
DakoCytomation, Eching
6. Reagenzien
2% Bisacrylamid Gel B
Carl Roth, Karlsruhe
30% Rotiphorese Gel 30
Carl Roth, Karlsruhe
Ampuwa
Fresenius Kabi AG, Bad Homburg
ATP
Carl Roth, Karlsruhe
Bacto Yeast Extract
BD, Heidelberg
BES
Invitrogen, Darmstadt
CaCl2
Merck, Darmstadt
Centricon Ultracel YM-10
Millipore, Schwalbach
Complete mini Proteaseinhibitor
Roche, Mannheim
DCTA
Sigma-Aldrich, München
DMSO
Carl Roth, Karlsruhe
DTT
Carl Roth, Karlsruhe
EDTA
Carl Roth, Karlsruhe
Ethanol
Carl Roth, Karlsruhe
Essigsäure
Merck, Darmstadt
FKS (Fötales Kälberserum)
PAA
Laboratories
GmbH,
Pasching, Österreich
Glycerol
Carl Roth, Karlsruhe
Glycin
Carl Roth, Karlsruhe
HCl
Carl Roth, Karlsruhe
HiTrap rProtein A FF Säulen
GE Healthcare, München
Isopropanol
Merck, Darmstadt
Luciferin
PJK GmbH, Kleinblittersdorf
Luminol
Sigma-Aldrich, München
Magermilchpulver
Saliter, Günzburg
MgCl2
Merck, Darmstadt
MgSO4
Merck, Darmstadt
NaCl
Merck, Darmstadt
Na2HPO4
Merck, Darmstadt
PageRuler Prestained Protein Ladder
Fermentas, St. Leon-Rot
21
D - Material
Panserin-401
Pan Biotech, Aidenbach
para-Hydroxycoumarinsäure
Sigma-Aldrich, München
PonceauS
Carl Roth, Karlsruhe
PVDF-Membran
Millipore, Schwalbach
SDS
Carl Roth, Karlsruhe
TEMED
Carl Roth, Karlsruhe
Tris
Carl Roth, Karlsruhe
Triton X-100
Sigma-Aldrich, München
Trypton
BD, Heidelberg
Tween 20
Sigma-Aldrich, München
7. Kits
Qiagen Plasmid Maxi Kit
Qiagen, Hilden
EndoFree Plasmid Maxi Kit
Qiagen, Hilden
PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit
Invitrogen, Darmstadt
8. Medien für Bakterienkulturen
LB-Medium
10 g Bacto Trypton
5 g Bacto Yeast Extract
5 g NaCl
ad 1l H2O (Ampuwa)
pH 7,2
gegebenenfalls Zugabe von 100 mg Ampicillin oder 30 mg
Kanamycin
9. Medien für Zellkulturen
293T/ TZM-bl
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
10 % Fötales Kälberserum (FKS)
350 mg/l Glutamin
100 mg/l Gentamycin
22
D - Material
CEMx174-M7-R5
50% Panserin-401
40% RPMI-1640
10 % FKS
350 mg/l Glutamin
100 mg/l Gentamycin
PBMC/488-CBL
50% Panserin-401
40% RPMI-1640
10 % FKS
350 mg/l Glutamin
100 mg/l Gentamycin
Zur Stimulierung für mind. 2 Tage nach Isolierung 10U/ml IL2 und 10μg/ml PHA zugeben.
Einfriermedium
FKS
10% DMSO
Essentielle Aminosäuren, Antibiotika und FKS wurden vor Gebrauch zugegeben. DMEM und
RPMI-1640 wurden im hauseigenen Medienlabor hergestellt.
10. Puffer und Lösungen
PBSo
phosphate buffered saline: physiologischer Phosphatpuffer
137 mM NaCl
2,68 mM KCl
7,3 mM Na2HPO4
1,47 mM KH2PO4
23
D - Material
2xBBS
BES-buffered saline
50 mM BES (N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure)
280 mM NaCl
1,5 mM Na2HPO4
ad 1l H20
auf pH 6,95 einstellen
0,45 µM sterilfiltrieren
Aliquots bei -20 °C lagern
2x Lysispuffer
62,5 ml 100 mM Tris pH 7,8 (mit H3PO4 einstellen)
500 µl 1M DTT
0,1732 g DCTA (1,2-Diaminocyclohexantetraacetat)
2,5 ml Triton X-100
25 ml Glycerol
ad 125 ml H20
in Aliquots bei -20°C lagern
Luciferasepuffer
9,3 ml H2O
1,2 ml 0,1M KPO4-Puffer
180 µl 1M MgSO4
1,2 ml 0,1M rATP
120 µl 25 mM Luciferin
5x Auftragspuffer:
1g
SDS
1,5 ml 5% Beta-Mercaptoethanol
5,0 ml 10% Glycerin
0,5 ml 1 mM EDTA
15 µl 3% BPB-Lösung
3,125 ml 62,5 mM Tris-HCl pH 6,8
ad 10 ml H2O bidest
24
D - Material
10x Laufpuffer (1L):
30,2 g Tris (25mM Tris)
188 g Glycin (25mM Glycin)
10 g SDS (0,1% SDS)
ad 1 L H2O bidest
10x Transferpuffer (1L):
58,2 g Tris (48mM Tris)
29,3 g Glycin (39 mM Glycin)
ad 1L H2O bidest
PonceauS (500 ml):
0,5 g Ponceau S (0,1 % PonceauS)
100 ml Essigsäure (5% Essigsäure)
400 ml H2O bidest
ECL-Lösung A:
200 ml 1,2 M Tris-HCl pH 8,6
50 mg Luminol (Sigma, A4685)
62 µl 30 % H2O2
ECL-Lösung B:
11 mg para-Hydroxycoumarinsäure (Sigma C9008) in
10 ml DMSO
11. Peptide
Die Peptide (s.Tab.1) wurden von EMC Microcollections (Tübingen) synthetisiert. Für
initiale Screenings wurden unaufgereinigte Rohpeptide verwendet (Reinheitsgrad ca. 6070%), für die Bestimmung der IC50-Werte HPLC-aufgereinigte Peptide (Reinheit > 90%). Die
Peptide wurden in 75% DMSO/H20 gelöst, Peptidstocks mit einer Konzentration von
25 µg/µl in Aliquots bei -80°C gelagert. Für Experimente wurden die Peptidstocks
entsprechend der Verwendung in Medium mit Complete mini-Proteaseinhibitoren (Roche,
Mannheim) verdünnt.
25
D - Material
Peptidnr.
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P4-1
P4-2
P4-3
P4-4
P4-5
P4-6
P4-7
P4-8
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6-5
P6-6
P6-7
P6-8
P4-7-NH2
P4-7s
P4-7scr
P6-2-NH2
P6-2s
P6-2scr
P4762
Position AS
1-20
11-30
21-40
31-50
41-60
51-70
61-80
71-90
81-100
91-110
101-120
111-130
121-140
131-150
141-160
151-170
161-180
171-190
181-200
191-210
201-220
211-230
221-240
231-250
241-260
251-270
261-280
271-290
281-300
291-310
301-320
311-330
321-340
23-42
25-44
27-46
29-48
33-52
35-54
37-56
39-58
43-62
45-64
47-66
49-68
53-72
55-74
57-76
59-78
37-56
37-56
37-56
45-64
45-64
45-64
37-64
Sequenz
Ac-GAPASVLGSRPFDYGLKWQS
Ac-PFDYGLKWQSCSCRANGSRI
Ac-CSCRANGSRIPTGERVWDRG
Ac-PTGERVWDRGNVTLLCDCPN
Ac-NVTLLCDCPNGPWVWVPAFC
Ac-GPWVWVPAFCQAVGWGDPIT
Ac-QAVGWGDPITHWSHGQNQWP
Ac-HWSHGQNQWPLSCPQYVYGS
Ac-LSCPQYVYGSVSVTCVWGSV
Ac-VSVTCVWGSVSWFASTGGRD
Ac-SWFASTGGRDSKIDVWSLVP
Ac-SKIDVWSLVPVGSASCTIAA
Ac-VGSASCTIAALGSSDRDTVV
Ac-LGSSDRDTVVELSEWGVPCV
Ac-ELSEWGVPCVTCILDRRPAS
Ac-TCILDRRPASCGTCVRDCWP
Ac-CGTCVRDCWPETGSVRFPFH
Ac-ETGSVRFPFHRCGTGPRLTK
Ac-RCGTGPRLTKDLEAVPFVNR
Ac-DLEAVPFVNRTTPFTIRGPL
Ac-TTPFTIRGPLGNQGRGNPVR
Ac-GNQGRGNPVRSPLGFGSYTM
Ac-SPLGFGSYTMTKIRDSLHLV
Ac-TKIRDSLHLVKCPTPAIEPP
Ac-KCPTPAIEPPTGTFGFFPGV
Ac-TGTFGFFPGVPPINNCMPLG
Ac-PPINNCMPLGTEVSEALGGA
Ac-TEVSEALGGAGLTGGFYEPL
Ac-GLTGGFYEPLVRRCSELMGR
Ac-VRRCSELMGRRNPVCPGYAW
Ac-RNPVCPGYAWLSSGRPDGFI
Ac-LSSGRPDGFIHVQGHLQEVD
Ac-HVQGHLQEVDAGNFIPPPRW
Ac-CRANGSRIPTGERVWDRGNV
Ac-ANGSRIPTGERVWDRGNVTL
Ac-GSRIPTGERVWDRGNVTLLC
Ac-RIPTGERVWDRGNVTLLCDC
Ac-GERVWDRGNVTLLCDCPNGP
Ac-RVWDRGNVTLLCDCPNGPWV
Ac-WDRGNVTLLCDCPNGPWVWV
Ac-RGNVTLLCDCPNGPWVWVPA
Ac-TLLCDCPNGPWVWVPAFCQA
Ac-LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG
Ac-DCPNGPWVWVPAFCQAVGWG
Ac-PNGPWVWVPAFCQAVGWGDP
Ac-WVWVPAFCQAVGWGDPITHW
Ac-WVPAFCQAVGWGDPITHWSH
Ac-PAFCQAVGWGDPITHWSHGQ
Ac-FCQAVGWGDPITHWSHGQNQ
Ac-WDRGNVTLLCDCPNGPWVWV-NH2
Ac-WDRGNVTLLSDSPNGPWVWV
Ac-LNWGTPDWDVRNCVGVLWCP
Ac-LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG-NH2
Ac-LSDSPNGPWVWVPAFSQAVG
Ac-PLCVNCWPQVCGDFPWGAVA
Ac-WDRGNVTLLCDCPNGPWVWVPAFCQAVG
Tabelle 1: Verwendete Peptide, deren Sequenz und Position im E2-Protein
26
D - Material
12. Verbrauchsmaterial
0,2 ml-Reaktionsgefäße
PeQLab, Erlangen
0,65 ml-Reaktiongefäße
Sarstedt, Nümbrecht
1,5 ml-Reaktionsgefäße
Sarstedt, Nümbrecht
2 ml-Reaktionsgefäße
Sarstedt, Nümbrecht
15 ml-Röhrchen
Sarstedt, Nümbrecht
50 ml-Röhrchen
Sarstedt, Nümbrecht
FACS-Röhrchen
Sarstedt, Nümbrecht
Spritzenvorsatzfilter (0,22 µm/0,45 µm)
Sarstedt, Nümbrecht
Zellkulturflaschen
Sarstedt, Nümbrecht
Zellkulturplatten
Sarstedt, Nümbrecht
Pipettenspitzen
Sarstedt, Nümbrecht
27
E - Methoden
E - Methoden
1. Zellkultur
Eukaryonte Zellen wurden in 75cm2-Zellkulturflaschen bei 37°C, 7% CO2 und 80%
Luftfeuchtigkeit kultiviert. Adhärent wachsende Zellen wurden nach Ausbildung eines ca.
90% konfluenten Zellrasens gesplittet (ca. alle 2-3 Tage). Dazu wurde das alte Medium
abgezogen und die Zellen zweimal mit 3 ml Trypsin/EDTA abgespült, in 5 ml Trypsinlösung
für 5 min im Brutschrank inkubiert und schließlich mit weiteren 5 ml frischen Mediums vom
Boden der Flasche abgespült und in ein 15 ml-Röhrchen gegeben. Suspensionszellen wurden
bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte gesplittet (ca. zweimal wöchentlich). Dazu wurde
die Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen überführt. Nach Zentrifugation (300xg, 5 min)
wurde das Zellsediment in 10 ml frischem Medium aufgenommen, auf frische
Zellkulturflaschen verteilt und mit ca. 20 ml des entsprechenden Mediums aufgefüllt. Die
Zellen wurden dabei in folgenden Verhältnissen auf neue Zellkulturflaschen verteilt: 293T
1:15, TZM-bl 1:20, CEMx174-M7-R5 1:5, PBMC und CBL bei Bedarf 1:2 bis 1:4.
2. Transfektionsverfahren
Zur Transfektion von 293T-Zellen mittels Calciumphosphatmethode wurden am Vortag
1,5x106 Zellen in 25cm2-Zellkulturflaschen ausgesät. Zum Zeitpunkt der Transfektion sollte
der Zellrasen ca. 50-70% konfluent sein. Pro Ansatz wurden 10 µg DNA und 25 µl 2,5M
CaCl2 zusammenpipettiert und mit bi-H20 auf 250 µl Endvolumen aufgefüllt. In einem
sterilen FACS-Röhrchen wurden 250 µl 2xHEBS vorgelegt. Unter Vortexen wurde die DNAVerdünnung in den HEBS-Puffer getropft und für 30s weiter geschüttelt. Der Ansatz wurde
dann zu den Zellen gegeben. Kurz vor Transfektion wurde das alte Medium durch 5 ml
frisches Medium ersetzt. Ca. 16h nach Transfektion wurde das Transfektionsmedium entfernt
und durch 10 ml Vollmedium ersetzt. Zur Produktion von stabilen Zelllinien wurden die
Zellen auf entsprechendes Selektionsmedium umgesetzt. Je nach Bedarf wurden die Zellen,
wie unter Punkt 1 beschrieben, behandelt bzw. zur Aufreinigung von rekombinantem Protein
expandiert.
Die
Zellkulturüberstände
wurden
dazu
geerntet,
durch
0,22 µm-
Spritzenvorsatzfilter sterilfiltriert, und für mind. 1h entgast. Die Aufreinigung wurde, wie
unter Punkt 11 beschrieben, durchgeführt.
28
E - Methoden
3. Pseudotypisierung von HIV-Reporterpartikeln
Zur Produktion von HIV-Reporterviren wurden 293T-Zellen mit pNL4-3.Luc.R-E- und
Expressionsplasmiden,
die
für
homologe
bzw.
heterologe
Hüllproteine
kodieren,
kotransfiziert. Dazu wurden am Vortag der Transfektion 293T-Zellen ca. 1:10 in 75cm2Zellkulturflaschen ausgesät, so dass der Zellrasen am Tag der Transfektion ca. 60-80%
konfluent war. Direkt vor Zugabe der Transfektionsansätze wurde das alte Medium von den
Zellen abgezogen und durch 10 ml frisch angesetztes Medium ersetzt. In sterilen FACSRöhrchen wurden pro Ansatz 500 µl 2xBBS-Puffer vorgelegt. Außerdem wurden
entsprechende Volumen der Expressionsplasmide mit bi-H2O in einem Gesamtvolumen von
400 µl verdünnt. Die Plasmide wurden mit Qiagen-Maxi™-Säulen (Qiagen, Hilden) nach
Angaben des Herstellers aufgereinigt. Tabelle 2 zeigt die eingesetzten DNA-Mengen der
entsprechenden Expressionsplasmide. Kurz vor Transfektion wurden 100 µl 2,5M CaCl2 zur
DNA-Verdünnung pipettiert und dieser Ansatz unter Vortexen zum vorgelegten 2xBBS
getropft. Nach ca. 30s Vortexen wurde der Reaktionsansatz zu den Zellen gegeben. Ein
Mediumwechsel
wurde
24h
nach
Transfektion
durchgeführt.
Dazu
wurde
das
Transfektionsmedium entfernt und 10 ml frisches Vollmedium zugegeben. Weitere 24h später
wurden die infektiösen Überstände geerntet. Dafür wurde der Zellkulturüberstand durch
0,22 µm-Spritzenvorsatzfilter
sterilfiltriert,
um
mögliche
Verunreinigungen
durch
Zellmaterial zu entfernen. Die Überstände wurden aliquotiert und bei -80°C gelagert.
Größe
einzusetzende
pmol
einzusetzende
µg
pNL4-3.Luc.R-E-
14824 bp
1
10
pHxB2 env
5326 bp
10
35
pADA env
3500 bp
3
6,9
pHEF-VSV-G env
5471 bp
3
10,8
Plasmid
Tabelle 2: Verwendete Expressionsplasmide.
Es sind die Größen der verwendeten Plasmide, die eingesetze Menge in pmol und die entsprechende Menge
in µg angegeben. Die Umrechnungen wurden unter http://www.promega.com/biomath/ durchgeführt.
29
E - Methoden
4. Virusanzucht
Klinische HIV-Isolate, Laborstämme sowie SIV- oder HIV-2-Varianten wurden auf
CEMx174-M7-R7 oder PBMC angezogen. Dazu wurden Zellen in 25cm2-Zellkulturflaschen
ausgesät und mit infektiösen Überständen der entsprechenden Virusstämme infiziert. Mit
X4-tropen Stämmen infizierte Zellkulturen, die Syncytien ausbilden, wurden auf Bildung
eines cytopatischen Effekts (CPE) untersucht. Zeigte sich ein moderater Effekt, wurden die
Kulturen auf 75cm2-Zellkulturflaschen mit frischen Zellen expandiert. Dies war nach ca. 4-7
Tagen der Fall. Die Überstände wurden geerntet, wenn sich ein starker CPE ausgebildet hatte
(ca. weitere 5 Tage später). Dazu wurde die Zellsuspension 5 min bei 300xg zentrifugiert und
der Überstand durch 0,22 µm-Spritzenvorsatzfilter sterilfiltriert. Die so gewonnenen zellfreien
Überstände wurden aliquotiert und bei -80°C eingefroren.
R5-trope Stämme bilden keine Syncytien, die Infektion lässt sich daher schwer anhand des
CPE beurteilen. Die Virusanzuchten wurden in der Regel nach ca. 7 Tagen expandiert und
nach weiteren 5 Tagen Inkubation geerntet. Die infektiösen Überstände wurden, wie oben
beschrieben, behandelt.
5. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut
PBMC wurden aus EDTA-Blut oder buffy coats gesunder Blutspender über Ficoll-Gradient
aufgereinigt. Dazu wurde das Blut 1:2 mit PBS in 50 ml-Röhrchen verdünnt. In weitere
50 ml-Röhrchen wurden 20 ml Ficoll-Lösung vorgelegt, mit 25 ml verdünntem Blut
überschichtet und anschließend bei 3200 rpm bei RT für 20 min ohne Bremse zentrifugiert. In
ein weiteres 50 ml-Röhrchen wurden 40 ml RPMI-1640 vorgelegt. Nach Zentrifugation
wurde die hell erscheinende Leukozytenbande mit der Pipette vorsichtig abgezogen und die
Zellen in das bereitgestellte Medium gegeben. Die Zellen wurden für 5 min bei RT bei 300xg
zentrifugiert und zweimal mit 50 ml PBS gewaschen. Die Zellen wurden anschließend in
Vollmedium resuspendiert. Eine Probe der Zellen wurde mit Tryptophanblau versetzt und in
der Zählkammer ausgezählt. Nach Berechnung der Gesamtzellzahl wurde die Zelldichte auf
1 bis 1,5x106 Zellen/ml eingestellt. Die PBMC wurden vor Verwendung zwei Tage mit
10U/ml IL2 und 10μg/ml PHA stimuliert.
30
E - Methoden
6. Inkubation mit rekombinantem Glykoprotein
Pro Ansatz wurden 5x105 PBMC oder 488-CBL verwendet. Die benötigte Zellmenge wurde
ausgezählt und das entsprechende Volumen der Zellsuspension in ein 50 ml-Röhrchen
gegeben. Die Zellen wurden mit 50 ml RPMI-Medium gewaschen und für 10 min bei
1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen in RPMI-1640
(Zelldichte 5x106/ml) resuspendiert. Pro 106 Zellen wurde 1 µg IgG zugegeben und für 1h bei
37°C im Brutschrank inkubiert, um freie Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche abzusättigen.
Die Zellen wurden anschließend mit 50 ml PBS gewaschen und bei 1500 rpm für 10 min
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in PBS (Zelldichte 4x107/ml)
resuspendiert und in 2 ml-Reaktionsgefäße überführt. Es wurden 40 pmol E2/106 Zellen
(entspricht 3,8 µg) bzw. 20 pmol Fc/106 Zellen (entspricht 1,6 µg) zugegeben und bei 4°C bei
600 rpm im Thermoschüttler für 45 min inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal
mit 2 ml PBS gewaschen und für 10 min bei 1500 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde
verworfen. Die Zellen wurden in 100 µl Medium pro Ansatz resuspendiert, in Rundboden-96Loch-Platten ausgesät und für 36h bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Die inkubierten Zellen
wurden dann mit pseudotypisierten HIV-Reporterpartikeln in einem Gesamtvolumen von
200 µl infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Überstände abgezogen und die Zellen in
je 50 µl Lysispuffer pro Ansatz lysiert. Die Lysate wurden in weiße 96-Loch-Platten
überführt. Zur Bestimmung der HIV-Replikation wurde die Luciferaseaktivität in den
Zelllysaten gemessen. Die Luciferase katalysiert die Oxidation von Luciferin. Bei dieser
Reaktion wird Licht freigesetzt, das im Luminometer als Biolumineszenz gemessen werden
kann. Pro Loch wurden dafür 100 µl Luciferinpuffer zugegeben. Nach einem zeitlichen
Versatz von 2,05s wurde für 1s die Biolumineszenz im Orion II Microplate Luminometer
(Berthold Detection Systems, Pforzheim) gemessen. Die Hemmung der HIV-Replikation in
inkubierten Zellen wurde anschließend aus den relative light units per second (RLU/s) dieser
Zellen im Verhältnis zu unbehandelten Zellen berechnet.
7. Replikationsversuche mit HIV-Reporterviren
Pseudotypisierte HIV-Reporterviren wurden durch Kotransfektion von 293T-Zellen mit
pNL4-3.Luc.R-E- und Expressionsplasmiden, die für homologe bzw. heterologe Hüllproteine
kodieren, produziert (s. Punkt 3). Diese Viren sind nur für einen Replikationszyklus infektiös,
da die Partikel keine Information für das env-Hüllprotein tragen. Das Prinzip dieses
Experiments ist in Abb. 6 dargestellt. 5x104 CEMx-M7-R5-Zellen wurden in Rundboden-96Loch-Platten ausgesät und pro Ansatz 5 µM der jeweiligen Peptide (Endkonzentration)
31
E - Methoden
zugegeben. Anschließend wurden die Zellen mit pseudotypisierten HIV-Reporterviren
infiziert. Drei Tage nach Infektion wurden die Zellen bei 300xg für 5 min zentrifugiert, das
Medium abgezogen und die Zellen in 50 µl Lysispuffer lysiert und die Lysate in weiße 96Loch-Platten überführt. Zur Bestimmung der HIV-Replikation wurde die Luciferaseaktivität
in den Zelllysaten, wie unter Punkt 6 beschrieben, gemessen. Die Hemmung der HIVReplikation in Zellen nach Zugabe von Peptid wurde anschließend aus den relative light units
per second (RLU/s) dieser Zellen im Verhältnis zu unbehandelten Zellen berechnet.
Transfektion von 293T mit pNL4-3.Luc.R-E- und homologen bzw. heterologen envs
luc
LTR
LTR
vpr
Í
env
Í
LTR
LTR
und
Ψ
HXB2 env
Ψ
ADA env
Ψ
VSV-G env
Pseudotypisierte Reporterviren
Infektion von CEMx174-M7-R5
Messung der Luciferase-Aktivität in Zelllysaten
Abbildung 6: Schematische Darstellung des Replikationsversuchs mit pseudotypisierten HIVReporterpartikeln.
293T-Zellen werden mit pNL4-3.Luc.R-E- und homologen bzw. heterologen envs kotransfiziert.
pNL4-3.Luc.R-E- kodiert für das HIV-Virion, besitzt jedoch einen frameshift im env- und revLeserahmen. Außerdem ist ein Luciferasegen im nef-Leserahmen eingefügt. Die Expressionsplasmide
für die env-Hüllproteine besitzen kein Verpackungssignal Ψ und werden daher nicht im Viruspartikel
verpackt. Diese Partikel sind mangels Hülle nicht mehr infektiös, man spricht daher von einem
single-round of infection-Reporterassay. Die HIV-Replikation lässt sich anschließend anhand der
Luciferaseaktivität in Zelllysaten bestimmen.
32
E - Methoden
8. Replikationsversuche mit HIV-Wildtypstämmen
1x104 TZM-bl-Zellen wurden am Vortag der Infektion in Flachboden-96-Loch-Platten
ausgesät. Kurz vor Infektion wurden Endkonzentrationen von 10 µM je Peptid pro Loch
zugegeben und die Zellen anschließend mit infektiösen Überständen von klinischen HIVIsolaten, Laborstämmen bzw. SIV-/HIV-2-Varianten infiziert. Drei Tage nach Infektion
wurde das Medium von den Zellen abgezogen und die Zellen in je 50 µl Lysispuffer pro Loch
lysiert. Anschließend wurde die Luciferaseaktivität in den Lysaten, wie unter Punkt 6
beschrieben, bestimmt.
9. Bestimmung der Peptid-Aktivität
1x104 TZM-bl-Zellen wurden am Vortag der Infektion in Flachboden-96-Loch-Platten
ausgesät. Kurz vor Infektion wurden absteigende Peptidendkonzentrationen zugegeben.
Startkonzentration war je nach Versuchsansatz 200 µM bzw. 100 µM je Peptid, die in 1:5Verdünnungsschritten weiter verdünnt wurden. Die Zellen wurden anschließend mit
infektiösen Überständen von klinischen HIV-Isolaten, Laborstämmen bzw. SIV-/HIV-2Varianten infiziert. Drei Tage nach Infektion wurde das Medium von den Zellen abgezogen
und diese in je 50 µl Lysispuffer pro Loch lysiert. Anschließend wurde die Luciferaseaktivität
in den Lysaten bestimmt. IC50-Werte wurden aus den erhaltenen Titrationskurven mit
SigmaPlot 11 berechnet.
10. Immunoblotting
Zunächst wurde eine SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wurden
diskontinuierliche Polyacrylamidgele (PAA-Gele) verwendet. Die Porengröße des Gels
richtete sich nach der Größe des zu untersuchenden Proteins. Für die Versuche dieser Arbeit
wurden in aller Regel 10%ige PAA-Gele verwendet. Zunächst wurde ein Trenngel
entsprechender
Konzentration
gegossen
und
mit
Isopropanol
überschichtet.
Nach
Polymerisation des Trenngels wurde das Isopropanol entfernt und das Sammelgel gegossen.
Die fertigen Gele wurden in die entsprechende Elektrophoresekammer (Biorad, München)
gesetzt und die Kammer mit 1x Laufpuffer aufgefüllt. Als Proteinstandard wurden 5 µl des
PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot) aufgetragen. Die zu
untersuchenden Proben wurden mit 5x Auftragspuffer versetzt, für 5 min bei 95°C denaturiert
und ebenfalls auf das Gel aufgetragen. Der Gellauf wurde bei 120V für ca. 1,5h durchgeführt.
Anschließend wurden die Proteine vom Gel auf eine PVDF-Membran transferiert. Dazu
wurden zunächst zwei Whatmanpapiere zuerst in Methanol und dann in 1x Transferpuffer
33
E - Methoden
äquilibriert und in die Semi-Dry-Blottingapparatur (Biorad, München) gelegt. Anschließend
wurden PVDF-Membran und Gel ebenfalls in Methanol und Transferpuffer äquilibriert und
auf die Whatmanpapiere gelegt. Abschließend wurden zwei weitere Whatmanpapiere
aufgelegt und mit Transferpuffer durchtränkt. Etwaige Luftblasen wurde mit einem 15 mlRöhrchen herausgerollt. Der Proteintransfer wurde für 1h bei 10V durchgeführt. Zur
Kontrolle des Proteintransfers wurde die Membran mit einer 0,1% PonceauS-Lösung
inkubiert, welche die Proteine auf der Membran reversibel anfärbt. So wurde auch der
Proteinstandard auf der Membran sichtbar gemacht und mit einem Stift markiert. Die
Membran wurde anschließend in H2O wieder entfärbt und mit 5% Milchpulver in PBSo für
1h bei RT oder bei 4°C über Nacht blockiert. Anschließend wurde der Blot mit einer 1:1000Verdünnung eines anti-human IgG/HRP-Antikörpers (DakoCytomation, Eching) in PBSo für
1h bei RT inkubiert. Nach Inkubation wurde der Blot dreimal für 5 min mit PBSo gewaschen.
Für die Entwicklungslösung wurden 5 ml der ECL-Lösung A mit 2 µl H2O2 und 50 µl der
ECL-Lösung B gemischt. Die Lösung wurde auf den Blot gegeben und die Reaktion mit einer
CCD-Kamera detektiert.
Trenngel (ausreichend für 2 Minigele):
30% Rotiphorese Gel 30
2% Bisacrylamid Gel B
2 M Tris/HCl pH 8,8
10% SDS
H2O bidest.
TEMED
10% APS
8%
2,72 ml
655 µl
1,85 ml
100 µl
4,71ml
15 µl
90 µl
10%
3,4 ml
655 µl
1,85 ml
100 µl
4,1 ml
15 µl
90 µl
Sammelgel (5%):
850 µl
350 µl
620 µl
38 µl
3,15 ml
10 µl
25 µl
30% Rotiphorese Gel 30
2% Bisacrylamid Gel B
1M Tris/HCl pH 6,8
10% SDS
H2O bidest.
TEMED
10% APS
34
12%
4,1 ml
655 µl
1,85 ml
100 µl
3,33 ml
15 µl
90 µl
15%
5,55 ml
655 µl
1,85 ml
100 µl
2,6 ml
15 µl
90 µl
E - Methoden
11. Affinitätschromatographie
Zur Aufreinigung von rekombinantem E2 wurden HiTrap rProteinA FF-Säulen verwendet,
die an eine Peristaltikpumpe (Heidolph, Schwabach) angeschlossen wurden. Vor Beginn der
Aufreinigung wurden alle Schläuche mit Desinfektionsmittel abgesprüht und zuerst mit PBSo
bei einer Flussrate von 5 ml/min und anschließend mit 70% Ethanol (5ml/min) für einige
Minuten
durchgespült.
Dann
wurde
das
System
mit
Bindungspuffer
(20 mM
Natriumphosphatpuffer pH7) gespült. Die Säule und entsprechende Adapter wurden
desinfiziert und die Flussrate der Pumpe auf 1 ml/min herabgesetzt. Die Säule wurde mit
Bindungspuffer gefüllt, luftblasenfrei angeschlossen und für 10 min gespült. Anschließend
wurde die Pumpe angehalten und der entgaste Zellkulturüberstand (vgl. Punkt 2) angehängt.
Dabei wurde darauf geachtet, dass sich keine Luftblasen im Schlauch befinden. Befanden sich
Luftblasen im System, wurde die Säule entfernt, bis die Luftblasen durch Pumpen aus dem
Schlauch gedrückt wurden, und wieder luftblasenfrei angeschlossen. Der komplette
Zellkulturüberstand wurde mit einer Flussrate von 1 ml/min auf die Säule geladen. Die Säule
wurde danach für 10 min mit Bindungspuffer gewaschen. In der Zwischenzeit wurden für die
Elution zehn 1,5 ml-Reaktionsgefäße vorbereitet und 200 µl 1M Tris pH9 mit Complete miniProteaseinhibitor vorgelegt. Es wurden Fraktionen von je 1 ml gesammelt. Zunächst wurde
0,1M Zitronensäure pH5 angehängt. Sobald der Elutionspuffer das Ende der Säule erreicht
hatte, wurden zwei Fraktionen mit diesem pH-Wert eluiert, danach zu 0,1M Zitronensäure
pH3 als Elutionspuffer gewechselt und die restlichen Fraktionen eluiert. Von jeder Fraktion
wurden 15 µl zur Analyse im Western Blot abgenommen und alle Proben bei -20°C
eingefroren. Die Säule wurde zunächst für 10 min mit Bindungspuffer und anschließend für
5 min mit 20% Ethanol gespült. Die Säule wurde anschließend mit 20% Ethanol gefüllt,
verschlossen und in einem 15 ml-Röhrchen gefüllt mit 20% Ethanol bei 4°C gelagert. Die
Schläuche der Pumpe wurden nach Abschluss der Aufreinigung geleert.
12. Hämolyse-Test
Zur Gewinnung von Erythrozyten wurde Vollblut für 10 min bei 1000xg zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen und die Zellen dreimal mit PBS gewaschen. Anschließend
wurden die Erythrozyten 1:10 in PBS verdünnt. Die so gewonnenen Erythrozyten wurden bis
zu vier Wochen nach Isolierung verwendet und bei 4°C gelagert. Vor Verwendung wurden
bereits lysierte Zellen bei Bedarf zentrifugiert (10 min bei 1000xg). Pro Ansatz wurden
100 µM gp41-FP (AVGIGALFLGAAGSTMGARS-NH2) in Rundboden-96-Loch-Platten
pipettiert und 100 µM bzw. 10 µM der zu untersuchenden Peptide zugegeben. Die Reaktion
35
E - Methoden
wurde in 100 µl PBS durchgeführt. Die Peptide wurden 1h bei 37°C inkubiert. Anschließend
wurden 10 µl der Erythrozytensuspension zugegeben und für eine weitere Stunde bei 37°C
inkubiert. Die Zellen wurden danach für 5 min bei 1000xg zentrifugiert und die Überstände in
frische Flachboden-96-Loch-Platten überführt. Die Absorption des freigesetzten Hämoglobins
wurde bei 405nm gemessen. Die Hemmung der durch gp41-FP vermittelten Hämolyse durch
E2-Peptide wurde in Bezug auf mock-behandelte Zellen berechnet.
13. Proliferations-Assay
Um zu überprüfen, ob Peptide oder verwendete Lösungsmittel (75% DMSO) zelltoxisch auf
CEMx174-M7-R5-Zellen wirken, wurde ein Proliferations-Assay durchgeführt. Dazu wurde
das CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay-Kit (Promega, Mannheim)
verwendet. Es wurden 5x104 Zellen in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät und 10 µM je
Peptid (Endkonzentration) bzw. die entsprechende Menge DMSO zugegeben. Die Zellen
wurden nun drei Tage im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden pro Ansatz
20 µl der CellTiter 96® AQueous One Solution-Reagenz zugegeben und für 2h bei 37°C
inkubiert. Anschließend wurde die Absorption bei 490nm in einem ELISA-Reader gemessen.
Die Proliferation der behandelten Zellen wurde im Verhältnis zu unbehandelten Zellen
berechnet.
36
F - Ergebnisse
F - Ergebnisse
1. Die inhibitorische Wirkung des GBV-C-Glykoproteins E2 auf die HIV-Replikation
In früheren Arbeiten unserer Gruppe wurde gezeigt, dass das Glykoprotein E2 von GBV-C
die HIV-Replikation inhibiert. Sowohl die Expression von E2 in Zellen als auch die
Inkubation von Zellen mit rekombinantem E2 vermittelte hierbei eine Hemmung der HIVReplikation (Jung et al. 2005, Jung et al. 2007). Für diese Arbeiten wurde eine verkürzte
Form von
E2
verwendet
(Iowa-Isolat,
GenBank
Nr.
AF121950),
bei
der
die
Transmembrandomäne durch die humane IgG1-Fc-Domäne und einen myc/His-Tag ersetzt
wurde (E2(340)-Fc). Zusätzlich wurde N-terminal das IgG-Signalpeptid angehängt. Das
Anhängen des Signalpeptids ermöglicht die Produktion von rekombinantem Protein in
eukaryonten Zellen und die anschließende Sekretion des Proteins. Die Fc-Domäne stabilisiert
das rekombinante Protein, ermöglicht eine erleichterte Aufreinigung aus Zellkulturüberständen mittels ProteinA-Säulen und den Nachweis von Protein mit humanen IgGAntikörpern (AK). Der myc/His-Tag kann ebenfalls zur Aufreinigung des Proteins mittels
Nickel-Chelat-Säulen und zum Nachweis mit myc- bzw. His-spezifischen Antikörpern
verwendet werden. Zur Etablierung von stabilen Zelllinien, welche das rekombinante
E2-Protein exprimieren und sezernieren, besitzt der Expressionsvektor für das GBV-C
E2-Konstrukt (pCEP4-E2(340)-Fc) eine Hygromycin-Resistenzkassette.
Um weitere Untersuchungen zur E2-vermittelten HIV-Suppression durchführen zu können,
wurde rekombinantes E2(340)-Fc exprimiert und aufgereinigt. Dafür wurden 293T-Zellen mit
pCEP4-E2(340)-Fc mittels Calciumphosphatmethode transfiziert und mit Hygromycin auf
stabile
E2-Expression
selektiert.
Stabil
transfizierte
Zellen
wurden
dann
zur
Proteinaufreinigung expandiert. Die sterilfiltrierten und entgasten Zellkulturüberstände
wurden zur Aufreinigung auf HiTrap rProteinA FF-Säulen geladen. Rekombinantes E2 wurde
mit 0,1M Zitronensäure in einem Gradienten von pH5 bis pH3 eluiert. Es wurden in der Regel
zehn Fraktionen gesammelt und die Eluate anschließend im Western Blot auf ihren
spezifischen E2-Gehalt getestet. Um den Reinheitsgrad der Aufreinigung abzuschätzen,
wurde die Membran vor Antikörperinkubation mit PonceauS gefärbt. Dabei zeigten sich keine
weiteren Proteinbanden, was für einen hohen Reinheitsgrad der E2(340)-Fc-Eluate spricht
(Daten nicht gezeigt). Als Antikörper zum Nachweis von rekombinantem E2 wurde ein HRPgekoppelter anti-human IgG-Antikörper verwendet, welcher den humanen Fc-Teil des
Proteins
erkennt.
Gebundene
Antikörper
37
wurden
durch
eine
HRP-katalysierte
F - Ergebnisse
Abbildung 7: Western Blot einer E2-Aufreinigung.
+ Positivkontrolle E2(340)-Fc Iowa 1 µg ; - Negativkontrolle 293T Zellkulturüberstand,
1-10 E2-Fraktionen 1-10.
Gellauf 1,5h bei 100V, Blotting 1h bei 10V, 10s Belichtungszeit.
Chemilumineszenzreaktion sichtbar gemacht, die mit einer CCD-Kamera detektiert wurde.
Abbildung 7 zeigt den exemplarischen Nachweis einer erfolgreichen E2-Aufreinigung.
Rekombinantes E2(340)-Fc hat eine Größe von ca. 75 kDa. Als Positivkontrolle wurde in
diesem Versuch E2(340)-Fc einer früheren Aufreinigung mitgeführt. Hier ist eine zweite
Bande bei ca. 140 kDa zu erkennen, welche vermutlich von E2-Dimeren stammt. Als
Negativkontrolle wurden Zellkulturüberstände von untransfizierten 293T-Zellen verwendet.
Hier ist keine Bande zu erkennen. In den Spuren der Eluat-Fraktionen 7 und 8 sind starke
Banden auf der Höhe von 75 kDa zu erkennen. Diese beiden Fraktionen wurden vereinigt und
in einen physiologischen Puffer (PBSo) umgepuffert. Bei diesem Schritt ist die
Proteinausbeute oftmals gering. Daher wurde das Ergebnis nach Umpuffern nochmals im
Western Blot getestet. Somit können auch etwaige Degradationen des aufgereinigten Proteins
ausgeschlossen werden. Der Western Blot wurde wie oben beschrieben durchgeführt. In der
Positivkontrolle ist eine Bande bei 75 kDa und 140 kDa zu erkennen, wobei die höhere Bande
vermutlich E2-Dimere repräsentiert (Abb. 8). In der Spur der Negativkontrolle ist keine
Bande sichtbar. Außerdem ist eine sehr deutliche E2-Bande bei 75 kDa ohne Nebenbanden
erkennbar. Dies spricht für eine hohe Proteinausbeute von guter Qualität. Abschließend wurde
die Proteinkonzentration mit Roti Nanoquant nach Anleitung des Herstellers bestimmt.
38
F - Ergebnisse
Abbildung 8: Western Blot einer
E2-Aufreinigung nach Ummpuffern.
+ Positivkontrolle E2(340)-Fc Iowa 1 µg ,
- Negativkontrolle 293T-Zellkulturüberstand,
E2 E2(340)-Fc Iowa 5 µl Probe
Gellauf 1,5h bei 100V, Blotting 1h bei 10V,
10s Belichtungszeit.
Im Weiteren sollte nun die HIV-inhibitorische Aktivität des rekombinanten E2-Proteins
untersucht werden. Für diesen Versuch wurden CEMx174-M7-R5-Zellen bzw. cord blood
lymphocytes (488-CBL, Lymphozyten aus Nabelschnurblut, welche mit Herpesvirus saimiriCosmiden immortalisiert wurden) zunächst mit humanem IgG für eine Stunde vorinkubiert,
um unspezifische Reaktionen von rekombinantem E2(340)-Fc mit Fc-Rezeptoren auf der
Zelloberfläche zu verhindern. Anschließend wurden die Zellen intensiv gewaschen und mit
äquimolaren Mengen von E2(340)-Fc (4 µg/106 Zellen) oder der Fc-Negativkontrolle
(2 µg/106 Zellen) für eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend
gewaschen, in RPMI-Vollmedium resuspendiert und in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät,
um 36h später mit verschiedenen HIV-Reporterpartikeln infiziert zu werden. Es wurden
Partikel verwendet, die mit X4- bzw. R5-tropen HIV-Hüllproteinen (HxB2 env bzw. ADA
env) oder dem heterologen G-Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV)
pseudotypisiert waren. Drei Tage nach Infektion wurde die Aktivität des Luciferase-Reporters
in Zelllysaten bestimmt und so das Maß der HIV-Replikation quantifiziert. Anschließend
wurde die Hemmung der HIV-Replikation in E2(340)-Fc-inkubierten bzw. in Fc-inkubierten
Zellen im Verhältnis zu mock-inkubierten (PBSo-inkubierten) Zellen berechnet. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 9 dargestellt. Die Inkubation mit rekombinantem E2(340)-Fc
führt zu einer deutlichen Reduktion der HIV-Replikation sowohl in CEMx174-M7-R5-Zellen
als auch in 488-CBL. Die Inkubation mit Fc allein beeinflusst die Replikation nicht. Auch die
Replikation von VSV-G-pseudotypisierten HIV-Partikeln wird durch E2(340)-Fc nicht
beeinflusst.
39
F - Ergebnisse
488-CBL
CEMx174-M7-R5
100%
HIV‐Inhibition
HIV‐Inhibition
60%
40%
20%
0%
80%
60%
40%
20%
0%
HXB2 env
ADA env
E2(340)-Fc Iowa
VSV env
HXB2 env
Fc
ADA env
E2(340)-Fc Iowa
VSV env
Fc
Abbildung 9: Rekombinantes E2 hemmt die HIV-Replikation in CEMx174-M7-R5 und 488-CBL.
Zellen wurden mit rekombinantem E2(340)-Fc bzw. Fc alleine inkubiert und mit pseudotypisierten HIVReporterpartikeln infiziert. Die Replikationsrate wurde durch Messung der Luciferaseaktivität in Zellysaten
bestimmt und in Bezug auf PBSo-inkubierte Zellen (mock) berechnet. Der Versuch wurde in
Dreifachansätzen durchgeführt.
2. Initiale Suche nach HIV-inhibitorischen Domänen durch Peptidscanning
Im Weiteren sollte nun der Bereich in E2 eingegrenzt werden, der für den inhibitorischen
Effekt verantwortlich ist. Dafür wurden Peptide entworfen, welche den E2-Anteil des zuvor
verwendeten E2(340)-Fc-Fusionsproteins widerspiegeln. Die Transmembranregion des E2Proteins wurde hier nicht berücksichtigt, da diese Domäne auch im HIV-inhibitorischen
E3(340)-Fc nicht enthalten ist. Es wurden Peptide konzipiert, die jeweils 20 Aminosäuren
(AS) lang sind und in 10 AS überlappen (Abb. 10, Tab. 3). Alle Peptide sind N-acetyliert, um
einen schnellen Abbau in Zellkultur zu vermeiden. Außerdem wurden den verwendeten
Peptidverdünnungen Proteaseinhibitoren zugesetzt, um Degradation zu verhindern.
Zunächst sollte untersucht werden, ob sich der inhibitorische Effekt von E2 auch mit davon
abgeleiteten Peptiden reproduzieren lässt. Hierzu wurden 5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen mit
Peptiden in einer Endkonzentration von 10 µM für 1h bei 4°C inkubiert und anschließend in
Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät. Die vorinkubierten Zellen wurden dann mit
pseudotypisierten HIV-Reporterpartikeln, die das X4-trope Hüllprotein des Laborstammes
HxB2 tragen (HIVppHxB2), infiziert. Die Zellen wurden drei Tage nach Infektion lysiert und
die Replikationseffizienz durch Bestimmung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten ermittelt.
40
F - Ergebnisse
GBV-C E2
aa 1
P1
P3
P2
P5
P4
P7
P6
P9
P8
P11
P10
P13
P12
P15
P14
P17
P16
P19
P18
P21
aa 340
P20
P23
P22
P25
P24
P27
P26
P29
P28
P31
Abbildung 10: Schematische Darstellung der von E2 abgeleiteten Peptide.
Peptidnr.
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
Position AS
1-20
11-30
21-40
31-50
41-60
51-70
61-80
71-90
81-100
91-110
101-120
111-130
121-140
131-150
141-160
151-170
161-180
171-190
181-200
191-210
201-220
211-230
221-240
231-250
241-260
251-270
261-280
271-290
281-300
291-310
301-320
311-330
321-340
Sequenz
Ac-GAPASVLGSRPFDYGLKWQS
Ac-PFDYGLKWQSCSCRANGSRI
Ac-CSCRANGSRIPTGERVWDRG
Ac-PTGERVWDRGNVTLLCDCPN
Ac-NVTLLCDCPNGPWVWVPAFC
Ac-GPWVWVPAFCQAVGWGDPIT
Ac-QAVGWGDPITHWSHGQNQWP
Ac-HWSHGQNQWPLSCPQYVYGS
Ac-LSCPQYVYGSVSVTCVWGSV
Ac-VSVTCVWGSVSWFASTGGRD
Ac-SWFASTGGRDSKIDVWSLVP
Ac-SKIDVWSLVPVGSASCTIAA
Ac-VGSASCTIAALGSSDRDTVV
Ac-LGSSDRDTVVELSEWGVPCV
Ac-ELSEWGVPCVTCILDRRPAS
Ac-TCILDRRPASCGTCVRDCWP
Ac-CGTCVRDCWPETGSVRFPFH
Ac-ETGSVRFPFHRCGTGPRLTK
Ac-RCGTGPRLTKDLEAVPFVNR
Ac-DLEAVPFVNRTTPFTIRGPL
Ac-TTPFTIRGPLGNQGRGNPVR
Ac-GNQGRGNPVRSPLGFGSYTM
Ac-SPLGFGSYTMTKIRDSLHLV
Ac-TKIRDSLHLVKCPTPAIEPP
Ac-KCPTPAIEPPTGTFGFFPGV
Ac-TGTFGFFPGVPPINNCMPLG
Ac-PPINNCMPLGTEVSEALGGA
Ac-TEVSEALGGAGLTGGFYEPL
Ac-GLTGGFYEPLVRRCSELMGR
Ac-VRRCSELMGRRNPVCPGYAW
Ac-RNPVCPGYAWLSSGRPDGFI
Ac-LSSGRPDGFIHVQGHLQEVD
Ac-HVQGHLQEVDAGNFIPPPRW
Tabelle 3: Sequenzen der verwendeten Peptide und deren Postion im E2-Protein
41
P30
P33
P32
F - Ergebnisse
Die Hemmung der HIV-Replikation durch Behandlung mit E2-Peptiden wurde in Bezug auf
unbehandelte Zellen berechnet.
Die Ergebnisse des initialen Peptidscannings sind in Abb. 11 dargestellt. Es zeigt sich, dass
eine große Zahl von Peptiden einen schwachen inhibitorischen Effekt auf die HIVReplikation hat, die Peptide 4 und 6 aber reproduzierbar eine deutliche HIV-Hemmung von
über 60 bis 90% verursachen. Die Peptide P4 und P6 repräsentieren einen Bereich im
N-Terminus von E2 von AS 31 bis 70.
HIV-Inhibition
100%
80%
60%
40%
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P10
P11
P12
P13
P14
P15
P16
P17
P18
P19
P20
P21
P22
P23
P24
P25
P26
P27
P28
P29
P30
P31
P32
P33
20%
HIVppHxB2
aa 31
Peptid P4
Peptid P6
aa 70
PTGERVWDRGNVTLLCDCPNGPWVWVPAFCQAVGWGDPIT
Peptid P5
Abbildung 11: Initiales Peptidscanning - Zellinkubation.
CEMx174-M7-R5-Zellen wurden mit 10 µM je Peptid für 1h bei 4°C inkubiert und anschließend mit HIVppHxB2
infiziert. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion durch Messung der Luciferaseaktivität in
Zelllysaten nachgewiesen. Das Diagramm zeigt Durchschnittswerte von drei bis fünf Einzelversuchen, die jeweils in
Dreifachansätzen durchgeführt wurden. Der Bereich in E2, der die hemmenden Peptide P4 und P6 umfasst, ist
unterhalb des Diagramms dargestellt.
42
F - Ergebnisse
Als nächstes sollte untersucht werden, inwieweit Modifikationen im Inkubationsprotokoll die
Ergebnisse beeinflussen können. Deshalb wurde in diesem Versuch getestet, ob die
Vorinkubation von HIV-Partikeln mit E2-Peptiden zu anderen Ergebnissen führt. Dafür
wurden
HxB2-pseudotypisierte
(HIVppHxB2)
HIV-Reporterpartikel
mit
einer
End-
konzentration von 5 µM je Peptid für 1h bei 4°C bzw. 37°C inkubiert. Pro Ansatz wurden
5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät und diese mit den
vorinkubierten Viren infiziert. Entsprechend den Vorversuchen wurde auch hier die
Replikationseffizienz drei Tage nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in
Zelllysaten ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis zur Replikation in Zellen
berechnet, die mit mock-inkubierten Viren infiziert waren. Die Ergebnisse sind in Abb. 12
dargestellt.
Virusinkubation 4°C
100%
HIV-Inhibition
80%
60%
40%
P28
P29
P30
P31
P32
P33
P29
P30
P31
P32
P33
P24
P27
P23
P24
P25
P28
P22
P23
P27
P21
P22
P25
P26
P20
P21
P19
P18
P19
P20
P17
P16
P15
P14
P13
P12
P11
P9
P10
P8
P7
P6
P4
P5
P3
P2
P1
20%
HIVppHxB2
Virusinkubation 37°C
100%
HIV-Inhibition
80%
60%
40%
P26
P18
P17
P16
P14
P15
P13
P12
P11
P9
P10
P8
P7
P5
P6
P4
P3
P2
P1
20%
HIVppHxB2
Abbildung 12: Initiales Peptidscanning - Virusinkubation.
HIV-Pseudotypen wurden mit einer Endkonzentration von 5 µM je Peptid für 1h bei 4°C bzw. 37°C inkubiert und
5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen mit den vorinkubierten Viren infiziert. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage
nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis
zur Replikation in Zellen berechnet, die mit mock-inkubierten HIV-Pseudotypen infiziert waren. Die Versuche
wurden in Triplikaten durchgeführt, das Diagramm zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen.
43
F - Ergebnisse
Auch in diesen Versuchsansätzen vermitteln die Peptide P4 und P6 eine starke und
spezifische Hemmung der HIV-Replikation. Interessanterweise ist bei Inkubation der HIVPartikel bei 4°C ein tendenziell erhöhtes Auftreten unspezifischer Effekte zu beobachten. Hier
zeigen fast alle Peptide einen zumindest schwachen inhibitorischen Effekt mit relativ großen
Standardabweichungen. Die Ergebnisse bei Inkubation der HIV-Partikel mit Peptiden unter
physiologischen Bedingungen bei 37°C sind etwas eindeutiger. Auch hier treten im mittleren
Bereich von E2 vereinzelt Peptide mit moderater HIV-inhibitorischer Aktivität auf, die
Abweichung der Einzelwerte fällt im Vergleich zur 4°C-Inkubation jedoch etwas geringer
aus. Im Allgemeinen spiegelt dieser Versuch die Ergebnisse aus den Experimenten mit
peptidvorinkubierten Zellen wider.
Im folgenden Experiment wurden Peptide und Viruspartikel gleichzeitig zu den Zellen
gegeben, ohne dass eine längere Inkubationszeit eingehalten wurde. Auch hier wurden 5x104
CEMx174-M7-R5-Zellen in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät. Anschließend wurden
Endkonzentrationen von 5 µM je Peptid und HIV-Reporterpartikel (HIVppHxB2) zugegeben.
Drei Tage nach Infektion wurden die infizierten Zellen lysiert und die Luciferasaktivität in
den Zelllysaten mittels Luciferaseassay bestimmt. Die Hemmung der HIV-Replikation wurde
als Verhältnis der Luciferaseaktivität in peptid- und lösungsmittelinkubierten (mockinkubierten) Zellen berechnet. Die erhaltenen Werte sind in Abbildung 13 dargestellt. Auch
hier zeigt sich, dass die stärkste HIV-Inhibition von den Peptiden 4 und 6 ausgeht.
100%
HIV-Inhibition
80%
60%
40%
P33
P32
P31
P30
P29
P28
P27
P26
P25
P24
P23
P22
P21
P20
P19
P18
P17
P16
P15
P14
P13
P12
P11
P9
P10
P8
P7
P6
P5
P4
P3
P2
P1
20%
HIVppHxB2
Abbildung 13: Initiales Peptidscanning – direkte Infektion.
CEMx174-M7-R5-Zellen wurden mit HIVppHxB2 infiziert. Peptide wurden direkt vor Infektion in einer
Endkonzentration von je 5 µM zugegeben. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion durch
Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten nachgewiesen. Das Diagramm zeigt Durchschnittswerte von drei bis
sechs Einzelversuchen, die jeweils in Dreifachansätzen durchgeführt wurden.
44
F - Ergebnisse
Die meisten verwendeten Peptide sind mit einem Anteil an hydrophoben AS-Resten von
>50% stark hydrophop. Sie sind daher unlöslich in wässrigen Lösungsmitteln und Puffern.
Als Lösungsmittel für hydrophobe Peptide wird im Allgemeinen DMSO verwendet, das
jedoch aufgrund seiner Zytotoxizität in Zellkulturexperimenten kritisch sein kann. Auch wenn
einige der Peptide durchaus in wässrigen Puffern lösbar sind, sollte für die Experimente ein
einheitliches Lösungsmittel verwendet werden. Die Peptide wurden daher in 75% DMSO/H20
gelöst. Um zytotoxische Effekte von DMSO in den verwendeten Konzentrationen
auszuschließen, wurde ein Proliferations-Assay durchgeführt. Peptide gelten im Allgemeinen
als nicht toxisch. Sie wurden in diesem Versuch jedoch zusätzlich einzeln untersucht, um eine
Beeinflussung der Zellproliferation auszuschließen.
Zur Untersuchung der Proliferation wurde das CellTiter 96® AQueous One Solution Cell
Proliferation Assay-Kit (Promega, Mannheim) verwendet. Diese Methode erlaubt die
kolorimetrische Bestimmung der Zahl lebender Zellen. Metabolisch aktive Zellen produzieren
durch Dehydrogenasen NADPH und NADH. Diese Koenzyme reduzieren die MTSTetrazolium-Komponente des Assay-Reagenz, es entsteht das lösliche Formazan. Dieser
Farbstoff kann photometrisch bei 490 nm nachgewiesen und daraus die Zahl der metabolisch
aktiven Zellen abgeleitet werden. Es wurden 5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen in Rundboden96-Loch-Platten ausgesät und Endkonzentrationen von 10 µM des jeweiligen Peptids bzw. die
entsprechende Menge DMSO zugegeben. Die Zellen wurden nun drei Tage im Brutschrank
inkubiert. Anschließend wurden pro Ansatz 20 µl der CellTiter 96® AQueous One Solution120%
Proliferation
100%
80%
60%
P33
P32
P31
P30
P29
P28
P27
P26
P25
P24
P23
P22
P21
P20
P19
P18
P17
P16
P15
P14
P13
P12
P11
P9
P10
P8
P7
P6
P5
P4
P3
P2
P1
Mock
0,1% DMSO
40%
Abbildung 14: Proliferations-Assay.
CEMx174-M7-R5-Zellen wurden mit 5 µM je Peptid (Endkonzentration) bzw. einer entsprechenden
Konzentration DMSO für drei Tage inkubiert. Anschließend wurde die Proliferation der Zellen mit dem
CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay-Kit nach Angaben des Herstellers bestimmt und
die Proliferationsrate in Bezug auf mock-inkubierte Zellen berechnet. Jeder Einzelversuch wurde in Triplikaten
durchgeführt, die Abbildung zeigt Mittelwerte von zwei unabhängigen Versuchen.
45
F - Ergebnisse
Reagenz zugegeben und für 2h bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Absorption bei 490nm
in einem ELISA-Reader gemessen. Die Proliferation der behandelten Zellen wurde im
Verhältnis zu unbehandelten Zellen berechnet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 14
dargestellt. DMSO sowie die verwendeten Peptide (mit Ausnahme des Peptids P32)
beeinflussen die Proliferation der Zellen in den verwendeten Konzentrationen nicht
maßgeblich. Die Hemmung der Proliferation durch P32 erscheint jedoch nicht relevant, da
dieses Peptid in keinem Versuchsansatz eine signifikante HIV-Hemmung induzierte und nicht
in weiterführende Versuche einbezogen wurde.
3. Eingrenzung der HIV-inhibitorischen Domäne und Identifizierung der wirksamsten
E2-Peptide
Nachdem in den vorangegangen Untersuchungen die E2-Peptide P4 und P6 als potente HIVInhibitoren bestimmt werden konnten, sollte im Folgenden der inhibitorische Bereich in E2
weiter eingegrenzt und die wirksamsten Peptide identifiziert werden. P4 und P6
repräsentieren die Aminosäuren 31 bis 70 des E2-Proteins. Für dieses Vorhaben wurden nun
20mer Peptide entworfen, die in 18 Aminosäuren überlappen und den Bereich in E2 von
Aminosäure 23 bis 78 abdecken (Tab. 4). Für dieses Experiment wurden 5x104 CEMx174M7-R5-Zellen mit HIVppHxB2 infiziert. Die Peptide wurden direkt vor Infektion in einer
Endkonzentration von 5 µM zugegeben. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach
Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten gemessen und die HIVInhibition im Verhältnis zu mock-behandelten Zellen berechnet.
Peptidnr.
P4-1
P4-2
P4-3
P4-4
P4
P4-5
P4-6
P4-7
P4-8
P5
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6
P6-5
P6-6
P6-7
P6-8
Position AS
23-42
25-44
27-46
29-48
31-50
33-52
35-54
37-56
39-58
41-60
43-62
45-64
47-66
49-68
51-70
53-72
55-74
57-76
59-78
Sequenz
Ac-CRANGSRIPTGERVWDRGNV
Ac-ANGSRIPTGERVWDRGNVTL
Ac-GSRIPTGERVWDRGNVTLLC
Ac-RIPTGERVWDRGNVTLLCDC
Ac-PTGERVWDRGNVTLLCDCPN
Ac-GERVWDRGNVTLLCDCPNGP
Ac-RVWDRGNVTLLCDCPNGPWV
Ac-WDRGNVTLLCDCPNGPWVWV
Ac-RGNVTLLCDCPNGPWVWVPA
Ac-NVTLLCDCPNGPWVWVPAFC
Ac-TLLCDCPNGPWVWVPAFCQA
Ac-LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG
Ac-DCPNGPWVWVPAFCQAVGWG
Ac-PNGPWVWVPAFCQAVGWGDP
Ac-GPWVWVPAFCQAVGWGDPIT
Ac-WVWVPAFCQAVGWGDPITHW
Ac-WVPAFCQAVGWGDPITHWSH
Ac-PAFCQAVGWGDPITHWSHGQ
Ac-FCQAVGWGDPITHWSHGQNQ
Tabelle 4: Sequenzen und Position der verwendeten Peptide
46
F - Ergebnisse
HIV-Inhibition
20%
40%
60%
80%
100%
P4-1
P4-2
P4-3
P4-4
P4
P4-5
P4-6
P4-7
P4-8
P5
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6
P6-5
P6-6
P6-7
P6-8
HIVppHxB2
Peptid P4
Peptid P6
CSCRANGSRIPTGERVWDRGNVTLLCDCPNGPWVWVPAFCQAVGWGDPITHWSHGQNQWP
Peptid P3
Peptid P5
aa 21
Peptid P7
aa 80
Abbildung 15: Eingrenzung des inhibitorischen Bereichs in E2.
CEMx174-M7-R5-Zellen wurden nach Zugabe von E2-Peptiden (5 µM Endkonzentration) mit
HIVppHxB2 infiziert. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion über Messung der
Luciferaseaktivität in Zelllysaten ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis zu mock-inkubierten
Zellen berechnet. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt, das Diagramm zeigt die
Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen.
In diesem Feinscreening konnte der inhibitorische Bereich in E2 zwischen AS 29 bis 72 (P4-4
bis P6-5) bestätigt werden. Wie in Abbildung 15 zu sehen, hemmen die Peptide P4-4, P4,
P4-7, P4-8 und P6-1 bis P6-5 die HIV-Replikation zu mindestens 50%. Die durch P4-5, P4-6
und P5 vermittelte Inhibition ist etwas schwächer mit Inhibitionsraten von ca. 35%. Die
Peptide P4-7 und P6-1 bis P6 vermitteln in diesen Versuchen die stärkste HIV-Hemmung.
Diese Peptide unterdrücken die HIV-Replikation in den verwendeten Endkonzentrationen von
5 µM fast komplett (ca. 95% Inhibition). Für weiterführende Experimente wurden diese
Peptide, die vermutlich den Kernbereich der HIV-inhibitorischen Region repräsentieren, zur
Bestimmung der mittleren inhibitorischen Konzentration (half maximal inhibitory
concentration, IC50) herangezogen, um die Potenz dieser Peptide zu bestimmen. Diese
47
F - Ergebnisse
Titrationen wurden mit klinischen HIV-1-Isolaten durchgeführt, um gleichzeitig die
Wirksamkeit der Peptide auf Wildtyp-HIV zu untersuchen. Es wurden die Isolate 92UG024
(X4-trop, Subtyp D3) und RU570 (R5-trop, Subtyp G) verwendet. Als suszeptible Zelllinie
wurden TZM-bl-Zellen verwendet. Diese HeLa-Derivate exprimieren den HIV-Rezeptor CD4
sowie die Korezeptoren CXCR4 und CCR5 auf ihrer Oberfläche. Sie enthalten außerdem ein
Luciferasegen unter Kontrolle des HIV-LTR, was die Detektion infizierter Zellen mittels
Luciferaseassay erlaubt. Für diese Experimente wurden 1x104 TZM-bl-Zellen am Vortag der
Infektion in Flachboden-96-Loch-Platten ausgesät. Die Peptide wurden direkt vor Infektion in
einer Endkonzentration von 200 µM zugegeben und in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:5
weiter verdünnt. Die Zellen wurden mit den HIV-Isolaten 92UG024 und RU570 infiziert und
die Replikationseffizienz drei Tage nach Infektion über Luciferaseassay bestimmt. Die
Hemmung der HIV-Replikation wurde im Verhältnis zu unbehandelten Zellen berechnet und
die IC50-Werte aus den erhaltenen Titrationskurven mit SigmaPlot11 berechnet. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 16 dargestellt und die IC50-Werte tabellarisch aufgelistet. Es ist
zu sehen, dass alle getesteten Peptide die HIV-Replikation der beiden verwendeten HIVIsolate effizient hemmen können. Als besonders potent zeigen sich die Peptide P4-7, P6-1 und
P6-2 mit IC50-Werten zwischen 1,3 und 3,3 µM. Diese Peptide repräsentieren den Bereich
von AS 37 bis 64 in E2. Diese Region stellt vermutlich eine Kerndomäne der E2-vermittelten
HIV-Inhibition dar.
RU570 (R5, clade G)
92UG024 (X4, clade D3)
100%
P4
P4-7
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6
75%
50%
25%
0%
0,01
0,1
IC50
1
10
100
1000
HIV-Replikation
HIV-Replikation
100%
50%
25%
0%
0,01
µM
P4
P4-7
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6
75%
0,1
1
10
100
1000 µM
P4
P4-7
P6-1
P6-2
P6-3
P6-4
P6
92UG024
15,07
2,95
2,36
3,33
4,00
11,88
16,80
RU570
18,28
2,66
1,29
1,32
2,00
8,04
3,57
Abbildung 16: Titration der E2-Peptide und Bestimmung der IC50 –Werte.
TZM-bl-Zellen wurden mit den klinischen HIV-Isolaten 92UG024 und RU570 infiziert. E2-Peptide wurden
direkt vor Infektion in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die Replikationseffizienz wurde drei
Tage nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten bestimmt. Konzentrationen und
IC50 –Werte sind in µM angegeben, die Werte der potentesten Peptide sind fett gedruckt. Die Versuche
wurden in Triplikaten durchgeführt, die Diagramme zeigen Mittelwerte aus drei unabhängigen
Experimenten.
48
F - Ergebnisse
4. Aktivität unterschiedlich modifizierter E2-Peptide
In diesen Versuchen sollte die Spezifität des beobachteten HIV-inhibitorischen Effektes der
E2-Peptide untersucht werden. Es sollte analysiert werden, in welcher Weise sich
Modifikationen auf die antivirale Aktivität der Peptide auswirken. Die inhibitorische Potenz
eines Peptids kann durch Anhängen von Acetyl- oder Amidgruppen sowie durch Veränderung
der linearen AS-Sequenz drastisch reduziert werden. Außerdem befinden sich in der
inhibitorischen Kerndomäne des E2-Proteins Cysteinreste, die auf intra- und/oder
intermolekulare Disulfidbrücken schließen lassen. Aus diesem Grund wurden verschiedene,
modifizierte Peptidvarianten untersucht: Peptide mit zusätzlicher Amidgruppe am
C-Terminus (P6-2-NH2), Peptide mit zufällig angeordneter AS-Sequenz (scrambledVarianten, P4-7scr und P6-2scr) und Peptide, in denen die Cysteinreste gegen Serinreste
ausgetauscht wurden (P4-7s, P6-2s). In Replikationsversuchen auf TZM-bl-Zellen wurde die
HIV-inhibitorische Aktivität der Peptide untersucht.
In der ersten Versuchsreihe wurden das Peptid P6-2 und seine modifizierten Varianten
P6-2-NH2, P6-2s und P6-2scr getestet. Am Vortag der Infektion wurden 1x104 TZM-blZellen in Flachboden-96-Loch-Platten ausgesät. Die Peptide wurden direkt vor Infektion in
einer Endkonzentration von 200 µM zugegeben und in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:5
weiter verdünnt. Die Zellen wurden mit den HIV-Isolaten 92UG024 und RU570 infiziert und
die Replikationseffizienz drei Tage nach Infektion über Luciferaseassay bestimmt. Die
Hemmung der HIV-Replikation in peptidinkubierten Zellen wurde im Verhältnis zur
Replikation in unbehandelten Zellen berechnet. Die Titrationskurven sind in Abbildung 17
dargestellt.
Peptidnr.
P4-7s
P4-7scr
P6-2s
P6-2scr
P6-2-NH2
Position AS
37-56
37-56
45-64
45-64
45-64
Sequenz
Ac-WDRGNVTLLSDSPNGPWVWV
Ac-LNWGTPDWDVRNCVGVLWCP
Ac-LSDSPNGPWVWVPAFSQAVG
Ac-PLCVNCWPQVCGDFPWGAVA
Ac-LCDCPNGPWVWVPAFCQAVG-NH2
Tabelle 5: Sequenzen der verwendeten Peptide und deren Position im E2-Protein.
49
F - Ergebnisse
RU570 (R5, clade G)
92UG024 (X4, clade D3)
100%
HIV-Replikation
HIV-Replikation
100%
75%
50%
25%
0%
0,01
0,1
P6-2
1
P6-2-NH2
10
P6-2s
100
1000 µM
75%
50%
25%
0%
0,01
P6-2scr
0,1
P6-2
1
P6-2-NH2
10
P6-2s
100
1000 µM
P6-2scr
Abbildung 17: Titrationskurven modifizierter E2-Peptide.
TZM-bl-Zellen wurden mit den klinischen HIV-Isolaten 92UG024 (X4) und RU570 (R5) infiziert.
E2-Peptide wurden direkt vor Infektion in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben. Die
Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten
bestimmt. Konzentrationen sind in µM angegeben. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt, die
Diagramme zeigen Mittelwerte aus mindestens zwei unabhängigen Experimenten.
Beim Betrachten der Titrationskurven bei 50% HIV-Inhibition wird deutlich, dass die
antivirale Aktivität des Peptids P6-2 durch unterschiedliche Modifikationen deutlich reduziert
wird. Durch das Anhängen der Amidgruppe wird die Aktivität des Peptids um 1 bis 2 logStufen verringert. P6-2-NH2 kann jedoch wie das Ursprungspeptid die Replikation von HIV
in hohen Konzentrationen komplett unterdrücken. Die Peptide P6-2s und P6-2scr setzen die
Aktivität ebenfalls um 1 bis 2 Größenordnungen im Vergleich zum Ursprungspeptid herab.
Der Verlust der Aktivität im Vergleich zum Ursprungspeptid ist hier jedoch deutlicher, da
selbst hohe Peptidkonzentrationen bis 200 µM die HIV-Replikation nicht vollständig
unterdrücken können.
In einem weiteren Experiment wurden zusätzlich zwei HIV-Laborstämme (NL4-3, YU-2)
untersucht. Wie oben beschrieben, wurden am Vortag der Infektion 1x104 TZM-bl-Zellen in
96-Loch-Platten ausgesät. Die Peptide wurden direkt vor Infektion in einer Endkonzentration
von 100 µM zugegeben und in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:5 weiter verdünnt. Die
Zellen wurden mit den HIV-Isolaten infiziert und die Replikationseffizienz, wie im
Vorangegangenen beschrieben, bestimmt. Die IC50-Werte wurden aus den Titrationskurven
berechnet und sind in Tabelle 6 aufgelistet. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die Werte der
Varianten mit Cysteinaustauschen bzw. die scr-Varianten allgemein höher sind als die der
ursprünglichen Peptide. Die IC50-Werte der Peptide mit Cysteinaustauschen sind um
mindestens den Faktor 20 höher als beim Ursprungspeptid. Bei den beiden getesteten HIVLaborstämmen
NL4-3
und
YU-2
konnte
50
selbst
mit
der
höchsten
eingesetzten
F - Ergebnisse
IC50-Wert (µM)
Peptid
92UG024
RU570
NL4-3
YU-2
P4-7
2,9
3,3
3,0
5,2
P6-2
2,7
2,7
2,3
2,4
P4-7s
66,3
63,1
>100
>100
P6-2s
66,6
90,4
>100
>100
P4-7scr
4,4
10,0
>100
86,5
P6-2scr
4,5
8,3
>100
23,5
Tabelle 6: IC50–Werte unterschiedlich modifizierter E2-Peptide im Vergleich.
Peptidkonzentration von 100 µM keine maßgebliche Hemmung der HIV-Replikation erzielt
werden. Der Austausch von Cysteinresten gegen Serine setzt die inhihitorische Potenz dieser
E2-Peptide somit drastisch herab.
Ein ähnlicher Effekt ist auch bei den scr-Peptidvarianten zu beobachten, bei denen die
Aminosäuren zufällig angeordnet wurden. Der Unterschied zwischen scr-Variante und
Ursprungspeptid ist hier zumindest für NL4-3 und YU-2 deutlich. Auf den Primärisolaten
92UG024 und RU570 unterscheiden sich die IC50-Werte jedoch nur um den Faktor 2 bis 3.
Der Unterschied zwischen Ursprungspeptid und scr-Variante ist weniger deutlich als bei
Peptiden mit Cysteinaustauschen. Zusammenfassend spielen sowohl die lineare Sequenz als
auch die Anwesenheit von Cysteinresten in den inhibitorischen E2-Peptiden eine wichtige
Rolle in der peptidvermittelten Hemmung der HIV-Replikation.
5.
Inhibitorische
Potenz
der
E2-Peptide
auf
verschiedenen
Stämmen
von
Immundefizienzviren
In den vorangegangen Versuchen konnte gezeigt werden, dass der Bereich von AS 37 bis 64
die Kerndomäne darstellt, die für die GBV-C E2-vermittelte HIV-Inhibition verantwortlich
ist. In weiteren Infektionsversuchen sollte nun die inhibitorische Breite der E2-Peptide
ermittelt werden. Dazu wurden zunächst diverse primäre HIV- (SF33, 92UG024, 93BR029,
RU570, HIV-2mir) und SIV-Isolate (SIVmac239, SIVmac251) mit einer definierten
Peptidkonzentration (Endkonzentration 10 µM) in Bezug auf ihre Hemmbarkeit durch
E2-Peptide getestet. Dazu wurden 1x104 TZM-bl-Zellen am Vortag der Infektion in
Flachboden-96-Loch-Platten ausgesät. Direkt vor Infektion wurden die Peptide P4 und P6 in
einer Endkonzentration von 10 µM zugegeben und die Zellen mit den entsprechenden
51
F - Ergebnisse
100%
HIV-Inhibition
80%
P4
60%
P6
40%
20%
SF33
92UG024
93BR029
X4-trop
RU570
SIVmac239
R5-trop
SIVmac251
HIV-2
SIV / HIV-2
Abbildung 18: Inhibitorische Breite der E2-Peptide.
TZM-bl-Zellen wurden mit verschiedenen HIV-/SIV-Subtypen infiziert und Peptide in einer festen
Endkonzentration von 10 µM direkt vor Infektion zugegeben. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage
nach Infektion gemessen und die HIV-Hemmung im Verhältnis zu mock-inkubierten Zellen berechnet. Das
Diagramm zeigt Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen.
Virusstämmen infiziert. Drei Tage nach Infektion wurde die Replikationsrate, wie bereits
beschrieben, gemessen und die HIV-Inhibition berechnet (Abb. 18). Man sieht, dass beide
X4-tropen HIV-Stämme durch die Peptide P4 und P6 gehemmt werden, wobei P6 eine
stärkere HIV-Inhibition vermittelt. Von den untersuchten R5-tropen HIV-Stämmen konnte
93BR029 von keinem der beiden Peptide inhibiert werden. Das ebenfalls R5-trope HIV-Isolat
RU570 konnte jedoch äußerst effizient von P4 und P6 gehemmt werden. Die Replikation der
verwendeten SIV-Stämme bzw. von HIV-2mir wurde durch Zugabe von E2-Peptiden in der
getesteten Konzentration nicht beeinflusst.
In weiterführenden Experimenten wurde eine größere Gruppe von HIV-Subtypen auf ihre
Sensitivität für E2-Peptide untersucht. Darüber hinaus wurden die IC50-Werte ausgewählter
Peptide auf diesen HIV-Stämmen bestimmt, um deren antivirale Potenz zu ermitteln. Für
diese
Titrationen
wurden
die
Peptide
P4-7,
P6-2
und
P5,
welches
zwischen
P4-7 und P6-2 liegt, herangezogen. Außerdem wurde ein längeres Peptid entworfen, das den
kompletten inhibitorischen Kernbereich in E2 von AS 37 und 64 umfasst. Zusätzlich wurden
Titrationen mit P28 durchgeführt. Dieses Peptid entspricht einem Bereich, von dem berichtet
wurde, dass es mit dem gp41-Fusionspeptid (gp41-FP) interagiert. Diese Beobachtung
impliziert, dass es sich hier ebenfalls um ein HIV-inhibitorisches Peptid handeln müsste
(Herrera et al. 2009). Jedoch zeigte dieses Peptid in den vorangegangenen Untersuchungen in
52
F - Ergebnisse
Endkonzentrationen von 5-10 µM keine antivirale Wirkung. In diesem Teil der Arbeit sollte
noch einmal untersucht werden, ob möglicherweise mit höheren Peptidkonzentrationen bzw.
mit anderen HIV-Stämmen ein inhibitorischer Effekt zu beobachten ist. Für die Bestimmung
der Potenz (IC50) wurden HPLC-gereinigte Peptide mit einer Reinheit von >90% verwendet.
Als Positivkontrolle für die Titrationen diente VIR-576, ein Derivat des virus-inhibitory
peptide (VIRIP). VIRIP ist ein 20mer-Peptid, welches ursprünglich aus humanen
Hämofiltraten isoliert wurde. Dieses Peptid entspricht der C-proximalen Region des SerinProteaseinhibitors α1-Antitrypsin und hemmt effizient und spezifisch die HIV-1-Replikation
durch Bindung an das gp41-Fusionspeptid (gp41-FP) (Munch et al. 2007). VIR-576 wurde
uns freundlicherweise von Jan Münch als Referenzprobe zur Verfügung gestellt.
Für diese Versuche wurden 1x104 TZM-bl-Zellen am Vortag der Infektion in Flachboden-96Loch-Platten ausgesät. Die Peptide wurden direkt vor Infektion in einer Endkonzentration von
100 µM zugegeben und in einer Verdünnungsreihe jeweils 1:5 weiter verdünnt. Das
Experiment wurde, wie bereits beschrieben, über Messung der Luciferaseaktivtät drei Tage
nach Infektion ausgewertet. Aus den erhaltenen Titrationskurven (Beispiele in Abb. 19)
wurden die entsprechenden IC50-Werte mit SigmaPlot 11 berechnet. Die IC50-Werte konnten
bei einigen Experimenten nicht akkurat berechnet werden, da die erhaltenen Titrationskurven
nicht vollständig sigmoidal sind. SigmaPlot 11 berechnet in diesem Fall angenäherte Werte,
die in Tabelle 7 zusammengefasst sind. Die Daten lassen deutliche Unterschiede zwischen
verschiedenen HIV-Stämmen in Bezug auf ihre Sensitivität für E2-Peptide erkennen. Sowohl
E2-Peptide als auch VIR-576 zeigen bei den verwendeten Konzentrationen von maximal
100 µM keine antivirale Aktivität auf SIVmac251 und HIV-2mir. Des Weiteren wurde eine
Reihe
verschiedener
HIV-1-Laborstämme
und
klinischer
Isolate
untersucht,
die
unterschiedliche HIV-Subtypen von A bis H repräsentierten. Von diesen 13 getesteten
Virusstämmen sind jedoch nur neun sensitiv für E2-Peptide. Die nichtsensitiven HIV-1Stämme (92TH026, 92BR025, 92UG035, 93BR029) werden bei Konzentration bis 100 µM
nicht maßgeblich gehemmt. Diese Isolate sind alle R5-trop und gehören den Subtypen B, C,
D und F an. Der Subtyp selbst gibt jedoch keinen Aufschluss darüber, ob ein Virusstamm
sensitiv für E2-Peptide ist, da andere Vertreter der Subtypen B, D und F durchaus hemmbar
sind. Von Subtyp C wurde nur ein Vertreter getestet. Legt man den Korezeptor-Tropismus
zugrunde, lässt sich beobachten, dass alle X4-tropen Stämme durch E2-Peptide gehemmt
werden, auch wenn das Isolat 92BR020 nur teilweise reaktiv ist. In der Gruppe der R5- und
53
F - Ergebnisse
RU570 (R5, clade G)
92UG024 (X4, clade D3)
100%
HIV-Replikation
HIV-Replikation
100%
75%
50%
25%
0%
0,001
VIR-576
0,01
0,1
P4-7
1
P5
10
P6-2
75%
50%
25%
0%
0,001
100 µM
P4762
VIR-576
0,01
P4-7
NL4-3 (X4, clade B)
HIV-Replikation
HIV-Replikation
75%
50%
25%
0%
VIR-576
0,01
0,1
P4-7
1
P5
10
P6-2
100 µM
P4762
P6-2
75%
50%
25%
0%
0,001
P4762
VIR-576
0,01
0,1
P4-7
1
P5
10
P6-2
100 µM
P4762
JRCSF (R5, clade B)
93BR020 (X4, clade F2)
100%
HIV-Replikation
HIV-Replikation
P5
10
100%
100 µM
100%
75%
50%
25%
0%
75%
50%
25%
0%
0,001
0,01
P4-7
0,1
1
P5
10
P6-2
100 µM
0,001
P4762
0,01
P4-7
HIV-Replikation
50%
25%
0%
VIR-576
0,01
P4-7
0,1
P5
1
10
P6-2
100 µM
P4762
HIV-2
75%
0,001
0,1
P5
SIVmac251
100%
HIV-Replikation
1
YU-2 (R5, clade B)
100%
0,001
0,1
1
10
P6-2
100%
75%
50%
25%
0%
0,001
100 µM
P4762
VIR-576
0,01
P4-7
0,1
P5
1
10
P6-2
100 µM
P4762
Abbildung 19: Titrationskurven verschiedener Stämme von Immundefizienzviren.
TZM-bl-Zellen wurden mit diversen HIV-Stämmen, SIV bzw. HIV-2 infiziert. E2-Peptide wurden direkt
vor Infektion in absteigenden Konzentrationen zugegeben und die Replikationsstärke drei Tage nach
Infektion gemessen. Die Replikationsrate wurde in Bezug auf unbehandelte Zellen berechnet und gegen die
entsprechende Peptidkonzentration aufgetragen. Die Graphen zeigen Mittelwerte aus mindestens drei
unabhängigen Versuchen, die jeweils in Triplikaten durchgeführt wurden.
54
F - Ergebnisse
dualtropen HIV-Stämme waren nur vier der acht getesteten Isolate mindestens schwach
sensitiv. Die anderen vier Isolate konnten auch mit einer maximalen Peptidkonzentration von
100 µM nicht gehemmt werden. Somit lässt sich ausgehend vom Korezeptor-Tropismus oder
HIV-Subtyp keine sichere Aussage über die Sensitivität von HIV-Stämmen gegenüber E2Peptiden treffen. Die antivirale Potenz der Peptide schwankt stark zwischen getesteten
Isolaten und ist somit stammabhängig.
Als wirksamste E2-Peptide haben sich das 20mer P6-2 (AS 45 bis 64) und das 28mer P4762
(AS 37 bis 64) herauskristallisiert. Für diese lag der IC50-Wert zwischen <0,1 µM und ca.
2 µM für suszeptible HIV-Isolate und war somit mit der antiviralen Potenz der Referenzprobe
VIR-576 vergleichbar. Bei P4762 ist im Vergleich zu den kürzeren Peptiden P4-7 und P6-2
keine signifikant erhöhte Wirksamkeit zu beobachten. Synergistische Effekte sind daher
auszuschließen. Im Gegensatz dazu wurde auch in diesen Versuchsansätzen keine
inhibierende Aktivität von P28 beobachtet, von dem beschrieben wurde, dass es mit dem
gp41-FP interagieren soll (Herrera et al. 2009). Auch bei der maximal eingesetzten
Peptidmenge von 100 µM konnte hier keine signifikante Beeinflussung der HIV-Replikation
nachgewiesen werden.
Peptid
HIV-Stamm
Tropismus Subtyp
VIR-576
P4-7
P5
P6-2
P4762
P28
92UG029
X4
A
n.d.
0,76
5,05
1,44
0,85
n.d.
NL4-3
X4
B
0,11
3,01
5,72
2,30
1,03
> 100
SF33
X4
B
n.d.
10,21
3,84
0,96
1,92
n.d.
YU-2
R5
B
0,55
5,21
7,30
2,39
1,97
> 100
JRCSF
R5
B
n.d.
98,68
85,08
> 100
> 100
n.d.
92TH026
R5
B
n.d.
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
92BR025
R5
C
n.d.
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
92UG035
R5
D2
n.d.
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
92UG024
X4
D3
0,31
0,33
0,71
0,08
0,13
> 100
93BR029
R5
F1
n.d.
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
92BR020
X4
F2
n.d.
> 100
94,35
> 100
20,78
n.d.
RU570
R5
G
21,82
0,74
1,96
0,58
0,09
> 100
V1557
X4/R5
H
n.d.
72,23
80,54
> 100
> 100
n.d.
SIVmac251
> 100
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
HIV-2
> 100
> 100
> 100
> 100
> 100
n.d.
Tabelle 7: IC50­Werte der E2­Peptide. Die Werte sind in µM angegeben. n.d.: nicht durchgeführt.
55
F - Ergebnisse
6. Angriffspunkte der E2-Peptide im HIV-Replikationszyklus
Replikationsversuche mit pseudotypisierten HIV-Partikeln sind ein adäquates Mittel, um
Einflüsse auf frühe Replikationsschritte zu untersuchen. Die verwendeten pseudotypisierten
Viren bestehen aus einem NL4-3-Kapsid mit unterschiedlichen Hüllproteinen (vgl. Abb. 6).
Diese verschieden pseudotypisierten HIV-Reporterpartikel unterscheiden sich lediglich in
ihrem Hüllprotein, welches einem HIV-Ursprung entstammen, aber auch von anderen
umhüllten Viren abgeleitet werden kann. Die pseudotypisierten Viren können so über
verschiedene Mechanismen in die Zielzelle eindringen. Somit verlaufen nur frühe
Replikationsschritte (Bindung, Fusion und Uncoating) unterschiedlich. In diesem Versuch
sollte
untersucht
werden,
ob
die
Behandlung
mit
E2-Peptiden
diese
frühen
Replikationsschritte beeinflusst. Es wurden Reporterpartikel verwendet, die mit X4- bzw.
R5-tropen HIV-Hüllproteinen (HxB2 env bzw. ADA env, beide Subtyp B) oder dem
heterologen G-Hüllprotein des Vesikulären Stomatitis-Virus (VSV) pseudotypisiert waren.
Während HIV-pseudotypisierte Viren über Bindung an den Rezeptor CD4 und den
Korezeptor CXCR4 bzw. CCR5 und anschließender Membranfusion in die Wirtszelle
gelangen, geschieht dies bei VSV-G-pseudotypisierten Partikeln über andere ubiquitäre
Rezeptoren und anschließende Endozytose. So kann unterschieden werden, ob E2-Peptide die
100%
HIV-Inhibition
80%
P4
P6
60%
40%
20%
HIVppHxB2 (X4)
HIVppADA (R5)
HIVppVSV
Abbildung 20: E2-Peptide interferieren mit frühen HIV-Replikationsschritten.
CEMx174-M7-R5 wurden mit HIV-Pseudotypen infiziert. Peptide wurden direkt vor Infektion in einer
Endkonzentration von je 5 µM zugegeben. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion durch
Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten nachgewiesen. Das Diagramm zeigt Durchschnittswerte
von drei Einzelversuchen, die jeweils in Dreifachansätzen durchgeführt wurden.
56
F - Ergebnisse
HIV-spezifische Bindung und/oder Fusion beeinflussen (Abb. 5 Punkt 1 und 2) oder mit
späteren Replikationsschritten interferieren. Für diese Untersuchungen wurden direkt vor
Infektion mit HIV-Reporterviren (HIVppHxB2, HIVppADA und HIVppVSV) 5 µM der
jeweiligen Peptide (Endkonzentration) zu CEMx174-M7-R5-Zellen zugegeben. Die
Replikationseffizienz wurde entsprechend der vorangegangenen Versuche über Messung der
Luciferaseaktivität ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis zu mock-inkubierten
(PBSo-inkubierten) Zellen berechnet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 20 dargestellt. Die
Replikation von HIVppHxB2 wird durch Zugabe von E2-Peptiden deutlich gehemmt, nicht
jedoch die Replikation von HIVppADA und VSV-G-pseudotypisierten HIV-Partikeln. Daraus
lässt sich schließen, dass E2-Peptide frühe Replikationsschritte (Entry) beeinflussen, da sich
die verwendeten Pseudotypen lediglich in ihren Hüllproteinen unterscheiden. Bei der
Beeinflussung von Post-Entry-Schritten durch E2-Peptide könnten mit dem verwendeten
Testsystem keine Unterschiede in der Replikation detektiert werden. Da HxB2- und ADApseudotypisierte HIV-Partikel unterschiedlich sensitiv sind, lassen diese Versuche die
Vermutung zu, dass das HIV-Hüllprotein die Sensitivität für E2-Peptide bestimmt. Daraus
ergibt sich die Frage, ob von E2 abgeleitete Peptide direkt mit Komponenten der Virushülle
wie gp120 und/oder gp41 interagieren.
7. Zielstrukturen der E2-Peptide
Im Weiteren sollte eingegrenzt werden, an welche Zielstrukturen E2-Peptide binden können.
Dazu sollte zunächst überprüft werden, ob E2-Peptide an zelluläre Zielstrukturen binden
können. Hierzu wurden 5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen mit Endkonzentrationen von 5 µM je
Peptid für 1h bei 4°C in 100 µl Medium inkubiert und anschließend mit PBSo gewaschen, um
ungebundene Peptide zu entfernen. Als Kontrolle wurde der Fusionsinhibitor AMD-3100
(100 µM Endkonzentration) verwendet, welcher als small molecule antagonist den zellulären
CXCR4-Korezeptor bindet und somit die Infektion X4-troper HIV-Partikel verhindern kann.
Die Zellen wurden in Medium resuspendiert, in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät und
anschließend mit HxB2-pseudotypisierten HIV-Partikeln infiziert. Die Replikationseffizienz
wurde drei Tage nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität ermittelt und die HIVInhibition im Verhältnis zu mock-inkubierten (PBSo-inkubierten) Zellen berechnet. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 21 dargestellt. Im Gegensatz zu AMD-3100 können unter
diesen Versuchsbedingungen P4 als auch P6 keine HIV-Hemmung vermitteln. Demzufolge
ist unwahrscheinlich, dass sich die Zielstruktur der Peptide P4 und P6 auf der Zelloberfläche
befindet.
AMD-3100
bindet
an
CXCR4
57
und
blockiert
die
Bindung
F - Ergebnisse
HIV-Inhibition
100%
80%
60%
40%
20%
0%
P4
P6
AMD-3100
HIVppHxB2
Abbildung 21: E2-Peptide binden nicht an Zellen.
CEMx174-M7-R5-Zellen wurden mit den Peptiden P4 und P6 bzw. entsprechenden Kontrollen für 1h bei 4°C
inkubiert und anschließend intensiv mit PBSo gewaschen. Die Zellen wurden mir HxB2-Pseudotypen infiziert.
Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion über Messung der Luciferaseaktivität in Zelllysaten
ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis zu mock-inkubierten Zellen berechnet. Die Versuche wurden in
Triplikaten durchgeführt, das Diagramm zeigt die Mittelwerte von drei unabhängigen Versuchen.
X4-troper HIV-Pseudotypen an die Zellen. Bei Verwendung dieses Inhibitors bleibt der HIVinhibitorische
Effekt
nach
Waschen
der
Zellen
erwartungsgemäß
erhalten,
bei
peptidinkubierten Zellen jedoch nicht.
In weiteren Versuchen sollte nun die mögliche Bindung von E2-Peptiden an HIV-Partikel
untersucht werden. Dazu wurden HxB2-pseudotypisierte HIV-Reporterpartikel in 100 µl
Medium mit Endkonzentrationen von 5 µM der Peptide P4 und P6 für 1h bei 37°C inkubiert
und anschließend mit Medium gewaschen, um ungebundene Peptide zu entfernen. Dazu
wurde das 1,5 ml-Reaktionsgefäß mit Medium aufgefüllt. Nach Zentrifugation bei 15.000 rpm
für 30 min wurde der Überstand verworfen. Anschließend wurden noch einmal 1,5 ml
Medium zugeben und ein weiteres Mal zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die
pelletierten Viren in 100 µl Medium je Ansatz resuspendiert. 5x104 CEMx174-M7-R5-Zellen
wurden in Rundboden-96-Loch-Platten ausgesät und mit den vorinkubierten Viren infiziert.
Die Replikationsrate wurde, wie oben beschrieben, bestimmt und die Hemmung der HIVReplikation in Bezug auf Zellen berechnet, die mit mock-inkubierten Viren infiziert waren.
Abbildung 22 zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. Die Hemmung der Replikation von
58
F - Ergebnisse
HIV-Inhibition
100%
80%
60%
40%
20%
0%
P4
P6
T-20
HIVppHxB2
Abbildung 22: E2-Peptide interagieren mit HIV-Partikeln.
HIVppHxB2 wurden mit den Peptiden P4 und P6 sowie entsprechenden Kontrollen für 1h bei 37°C inkubiert und
anschließend intensiv mit Medium gewaschen. CEMx174-M7-R5-Zellen wurden mit vorinkubierten HxB2Pseudotypen infiziert. Die Replikationseffizienz wurde drei Tage nach Infektion über Messung der
Luciferaseaktivität in Zelllysaten ermittelt und die HIV-Inhibition im Verhältnis zu mock-inkubierten Zellen
berechnet. Die Versuche wurden in Triplikaten durchgeführt, das Diagramm zeigt die Mittelwerte von zwei
unabhängigen Versuchen.
HIVppHxB2 bleibt auch nach Waschen der Viren erhalten. Der Fusionsinhibitor T-20 bindet
an gp41, vermittelt in diesem Versuchsansatz jedoch keine Inhibition. T-20 bindet an eine
transitorische Form des gp41, welche sich erst nach Virusbindung an den zellulären Rezeptor
bildet. Diese Beobachtung spricht für eine direkte Interaktion zwischen E2-Peptiden und
HIV-Partikel.
Im Weiteren sollte im Hämolyse-Test untersucht werden, ob E2-Peptide mit dem
Fusionspeptid des HIV-1 gp41-Proteins (gp41-FP, AVGIGALFLGAAGSTMGARS-NH2)
interagieren. Fusionspeptide sind hydrophobe Bereiche im Protein, die helikale Strukturen
ausbilden, welche leicht in Membranen eindringen und diese destabilisieren können. Sie
ermöglichen dadurch das Einschleusen des Viruskapsids in die Wirtszelle. Das gp41-FP allein
ist in der Lage, in diesem Testsystem die Erythrozytenmembran aufzulösen. Durch Lyse der
Membran wird Hämoglobin freigesetzt, die Menge des freien Hämoglobins kann
photometrisch bestimmt werden. Sollten E2-Peptide mit dem gp41-FP interagieren, müsste
dies als Hemmung der gp41-vermittelten Lyse von Erythrozyten zu beobachten sein. Dazu
wurden Erythrozyten mit gp41-FP allein bzw. zusammen mit verschiedenen E2-Peptiden
59
F - Ergebnisse
100%
Hämolyse
80%
60%
40%
20%
0%
gp41-FP
P1
VIR-576
100 µM gp41-FP + 100 µM Peptid
P4-7
P6-2
100 µM gp41-FP + 10 µM Peptid
Abbildung 23: E2-Peptide hemmen die gp41-FP-vermittelte Hämolyse.
Erythrozyten wurden mit gp41-FP und E2-Peptiden bzw. VIR-576 für 1h bei 37°C inkubiert. Die Absorption des
freigesetzten Hämoglobins wurde bei 405nm gemessen. Die Hämolyserate wurde in Bezug auf Erythrozyten
berechnet, die nur mit gp41-FP inkubiert waren, berechnet. Die Versuche wurden in Duplikaten durchgeführt,
das Diagramm zeigt die Mittelwerte von zwei unabhängigen Versuchen.
inkubiert. Das Peptid P1 diente als Negativkontrolle, da es in vorangegangenen Tests keine
antivirale Aktivität zeigte. Als Positivkontrolle wurde VIR-576 verwendet, welches
nachweislich mit dem gp41-FP interagiert (Munch et al. 2007). Die zu untersuchenden
Peptide wurden in Endkonzentration von 100 µM und 10 µM eingesetzt, das gp41-FP in
Endkonzentrationen von 100 µM. Erythrozyten wurden zusammen mit den entsprechenden
Peptiden für 1h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Absorption des freigesetzten
Hämoglobins photometrisch bei 405nm gemessen und die Hämolyserate in peptidinkubierten
Erythrozyten in Relation zu Erythrozyten berechnet, die nur mit gp41-FP inkubiert waren. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 23 dargestellt.
Das Peptid P1 inhibiert die gp41-FP-vermittelte Lyse der Erythrozyten nicht. VIR-576
interagiert mit dem gp41-FP und hemmt die Destabilisierung der Erythrozytenmembran. Der
Effekt ist dosisabhängig. Die Peptide P4-7 und P6-2 unterdrücken ebenfalls effizient die Lyse
der Erythrozyten. Diese Ergebnisse implizieren, dass die HIV-inhibitorischen E2-Peptide mit
dem gp41-FP interagieren.
60
G - Diskussion
G - Diskussion
1. N-terminale Peptide des GBV-C Glykoproteins E2 hemmen die HIV-Replikation
Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass eine GBV-C-Infektion einen positiven Effekt
auf Krankheitsverlauf und Überlebensdauer von koinfizierten HIV-Patienten vermittelt
(Xiang et al. 2001, Tillmann et al. 2001, Williams et al. 2004). Unsere Arbeitsgruppe konnte
in früheren Arbeiten zeigen, dass das GBV-C-Glykoprotein E2 eine wichtige Rolle in der
Interferenz mit HIV spielt und die Replikation von HIV hemmen kann. Sowohl die
Expression von E2 in Zellen als auch die Inkubation von Zellen mit rekombinantem E2
vermittelte hierbei eine Hemmung der HIV-Replikation (Jung et al. 2005, Jung et al. 2007).
Für diese Arbeiten wurde eine verkürzte Form von E2 (E2(340)-Fc) verwendet, bei der die
Transmembrandomäne durch die humane IgG1-Fc-Domäne ersetzt wurde. Diese Verkürzung
sowie das Anhängen des Fc-Fragments ermöglichen die Produktion und Sekretion von
rekombinantem Protein von eukaryonten Zellen. Zu Beginn sollten in einführenden
Experimenten zu dieser Arbeit die bereits bekannten Daten reproduziert werden. Dazu musste
zunächst rekombinantes E2 in Zellen produziert und aus Zellkulturüberständen aufgereinigt
werden. Dabei traten Schwankungen in Proteinausbeute und Qualität des rekombinanten
E2(340)-Fc auf, was sich auch in den Versuchsergebnissen widerspiegelte. So konnte nicht
mit jeder E2-Charge der HIV-inhibitorische Effekt von E2 beobachtet werden, mit qualitativ
guten Aufreinigungen waren die Ergebnisse aus den Vorarbeiten jedoch reproduzierbar.
Nach den einführenden Experimenten sollten im Weiteren mögliche HIV-inhibitorische
Domänen in E2 identifiziert werden. Dazu wurden Peptide herangezogen, die den Bereich in
E2 von AS 1 bis 340 repräsentieren. Dies entspricht der verkürzten E2-Variante, die in den
vorangegangen Versuchen verwendet wurde. Bei den Peptiden handelte es sich um 20mere,
die in 10 AS überlappen. Dabei stellte sich zunächst die Frage, ob sich auch mit Peptiden, die
jeweils nur einen kleinen Ausschnitt von E2 repräsentieren, eine Hemmung der HIVReplikation erzielen lässt. In initialen Screening-Experimenten konnten jedoch die Peptide P4
und P6 als potente HIV-Inhibitoren identifiziert werden. Diese Peptide repräsentieren den
N-terminalen Bereich in E2 von AS 31 bis 70. Dieser Bereich wurde in einem
weiterführenden Peptidscanning genauer untersucht. Dazu wurden 20mer-Peptide in Auftrag
gegeben, die in 18 AS überlappen und den Bereich von AS 23 bis 78 abdecken. Durch diese
feinere Rasterung sollten die HIV-inhibitorische Domäne in E2 weiter eingegrenzt und die
wirksamsten Peptide identifiziert werden. In Replikationsversuchen mit HIV-Pseudotypen auf
CEMx174-M7-R5-Zellen mit einer definierten Peptidendkonzentration von 5 µM konnte
61
G - Diskussion
gezeigt werden, dass Peptide des Bereichs von AS 29 bis 72 äußerst effizient die Replikation
von HIV hemmen können und diese Region somit eine inhibitorische Domäne in E2
repräsentiert. In weiterführenden Titrationsversuchen mit Wildtypviren auf TZM-bl-Zellen
zeigten die Peptide P4-7 (AS 37 bis 56), P6-1 (AS 43 bis 62) und P6-2 (AS 45 bis 64) die
größte HIV-inhibitorische Potenz mit IC50-Werten zwischen 1,3 und 3,3 µM für die Stämme
92UG024 und RU570. Der Bereich in E2 von AS 37 bis 64 bildet somit eine inhibitorische
Kerndomäne.
Im Weiteren sollte die Spezifität des beobachteten HIV-inhibitorischen Effekts der
E2-Peptide untersucht werden. Es wurde analysiert, in welcher Weise sich Modifikationen der
Peptide P4-7 und P6-2 auf deren antivirale Aktivität auswirken. Die inhibitorische Potenz
eines Peptids kann durch Anhängen von Acetyl- oder Amidgruppen sowie durch Veränderung
der linearen AS-Sequenz drastisch reduziert werden. Außerdem befinden sich in der
inhibitorischen Kerndomäne des E2-Proteins Cysteinreste, die auf intra- und/oder
intermolekulare Disulfidbrücken schließen lassen. Es zeigte sich, dass die inhibitorische
Potenz der Peptide durch verschiedene Modifikationen um mindestens 1 bis 2 log-Stufen
herabgesetzt wurde. Bei Peptiden mit veränderter AS-Sequenz bzw. mit Cystein-zu-SerinAustauschen war der Effekt besonders drastisch. Hier ging die inhibitorische Aktivität der
Peptide durch Modifikation fast komplett verloren, selbst hohe Peptidkonzentrationen
konnten die HIV-Replikation hier nicht vollständig unterdrücken. Die IC50-Werte der
scr-Varianten auf den HIV-Stämmen 92UG024, RU570 und YU-2 unterscheiden sich im
Vergleich
zum
Ursprungspeptid
jedoch
weniger
stark
als
bei
Peptiden
mit
Cysteinaustauschen. In den scr-Peptiden ist die lineare Sequenz im Vergleich zum
Ursprungspeptid verändert. Die Cysteinreste sind jedoch vorhanden und intra- oder
intermolekulare Wechselwirkungen durch Disulfidbrückenbildung möglich. Dabei ist eine
Zyklisierung der Peptide durch intramolekulare Disulfidbrücken, als auch dimere oder
oligomere Peptide durch intermolekulare Disulfidbrücken sehr wahrscheinlich. Cysteine
bilden in aller Regel auch ohne Zugabe von Oxidationsmittel Disulfidbrücken aus. Daher sind
Cysteinreste im Protein vorwiegend in Disulfidbrücken eingebunden. Freie Reste sind selten
und meist sterisch abgeschirmt oder befinden sich in einem reduzierenden Milieu. Cysteine
tragen durch Disulfidbrückenbildung hauptsächlich zur Stabilisierung der Proteinstruktur bei.
So stabilisiert zum Beispiel das Einfügen von Cysteinresten in den helikalen Bereich der
gp41-Ektodomäne das labile gp160-Hüllprotein. Die Bildung von Disulfidbrücken führt
darüber hinaus zur Stabilisierung von Env-Trimeren (Farzan et al. 1998). In gp41 sind zwei
Cysteinreste zu finden, die bei retroviralen Transmembran-Hüllproteinen konserviert sind.
62
G - Diskussion
Diese sind an der Bildung von intramolekularen Disulfidbrücken beteiligt. Darüber hinaus
spielt die Protein-Disulfid-Isomerase (PDI) auf der Oberfläche von Zellen eine wichtige Rolle
beim HIV-Entry. Die Inhibition der PDI blockiert die Fusion von HIV mit der Wirtszelle.
Dies legt nahe, dass Redoxreaktionen im HIV-Hüllprotein für den Eintritt von HIV in die
Zelle essentiell sind (Fenouillet et al. 2001, Barbouche et al. 2003, Yuan et al. 2005). Die
stabilisierende Funktion von Disulfidbrücken erklärt die Aktivität der Peptide mit
Cysteinresten jedoch nicht ausreichend, da die Disulfidbrücken im Peptid vermutlich nicht
mit denen im Protein identisch sind. Es ist vielmehr denkbar, dass durch Zyklisierung bzw.
Oligomerisierung der Peptide deren bindende Konformation begünstigt wird und diese
dadurch besser an entsprechende Zielstrukturen binden können als lineare SerinPeptidvarianten. Zusammengefasst deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass Cysteinreste
für die Vermittlung der HIV-Inhibition essentiell sind, da der Austausch der Cysteine gegen
Serinreste die Aktivität der E2-Peptide aufhebt.
2. HIV-Isolate unterscheiden sich in ihrer E2-Reaktivität
In weiteren Versuchen wurde die inhibitorische Breite der E2-Peptide auf unterschiedlichen
Stämmen von Immundefizienzviren getestet. In diesen Experimenten wurden die Peptide
P4-7, P5 und P6-2 sowie das längere Peptid P4762, welches den kompletten inhibitorischen
Kernbereich in E2 von AS 37 bis 64 umfasst, untersucht. Die stärkste Inhibition in
Replikationsversuchen auf TZM-bl-Zellen vermittelten die Peptide P4-7, P6-2 sowie das
längere Peptid P4762. Abhängig vom HIV-Isolat lagen die IC50-Werte für die Peptide P6-2
und P4762 zwischen 0,1 und 2 µM, für das Peptid P4-7 bei 0,3 bis 10 µM. Das längere Peptid
P4762 zeigte keine deutlich stärkere Wirksamkeit als die kürzeren Peptide P4-7 und P6-2.
Synergistische Effekte sind daher auszuschließen. Die Potenz der E2-Peptide ist mit der
Potenz von VIR-576 vergleichbar, ein um zwei Größenordnungen potenteres Derivat von
VIRIP (Munch et al. 2007). Die Potenz der E2-Peptide reicht jedoch nicht an die Aktivität des
Fusionsinhibitors T-20 (Fuzeon®/Enfuvirtide®) oder dessen Derivat T-1249 heran
(Gulick 2003).
In der vorliegenden Arbeit wurden Peptide im Bereich von AS 29 bis 72 des E2-Proteins
identifiziert, die äußerst effizient die HIV-Replikation unterdrücken können. In einer 2010
veröffentlichten Arbeit wurde von Herrera und Mitarbeiter derselbe N-terminale Bereich in
E2 als eine inhibitorische Domäne identifiziert (Herrera et al. 2010). Es wurden Peptide
untersucht, die das komplette E2-Protein umfassen. Dabei konnten unter anderem drei HIVinhibitorische Peptide identifiziert werden, die den E2-Bereich von AS 31 bis 75 umfassen.
63
G - Diskussion
Dieser Bereich ist praktisch identisch mit der HIV-inhibitorischen Domäne der vorliegenden
Doktorarbeit. Obwohl in Replikationsstudien beider Arbeiten TZM-bl-Zellen verwendet
wurden, waren die N-terminalen Peptide der spanischen Gruppe weniger potent als P4-7, P6-2
und P4762. Ein Grund dafür könnte sein, dass sich die Peptide von unterschiedlichen E2Isolaten ableiten und sich somit in einzelnen Aminosäuren unterscheiden. Weiterhin wurden
verschiedene HIV-Isolate verwendet. Von Herrera et al. wurden noch weitere HIVinhibitorischen Peptide identifiziert, deren antivirale Aktivität in der vorliegenden Arbeit
jedoch nicht nachgewiesen werden konnte. Das Peptid P124 (AS370-387) wurde in unserer
Studie nicht untersucht, da Peptide eingesetzt wurden, die das GBV-C E2-Protein ohne
Transmembrandomäne (AS 1 bis 340) repräsentieren. Außerdem wurden in unseren
Screenings nur therapeutisch relevante Peptidkonzentrationen von 5 bis 10 µM getestet,
wohingegen Herrera et al. mit erheblich höheren Konzentrationen von bis zu 500 µM
gearbeitet haben. Dazu schreiben die Autoren, dass alle 124 getesteten E2-Peptide eine
schwache inhibitorische Aktivität bei diesen hohen Konzentrationen aufweisen. Dies spricht
für eine unspezifische Aktivität der E2-Peptide bei hohen Konzentrationen. Die großen
Unterschiede in den eingesetzten Peptidkonzentrationen sind vermutlich auch der Grund,
weshalb in unserer Studie nur der N-terminale Bereich als Region mit HIV-inhibitorischer
Aktivität identifiziert werden konnte. Interessant ist außerdem, dass Herrera et al. 2009 ein
Peptid E2(269-286) beschrieben haben, welches nachweislich mit dem gp41-FP interagiert
(Herrera et al. 2010). Sowohl dieses Peptid als auch der gesamte untersuchte Bereich dieser
früheren Studie (AS259-287) zeigten in der neusten Arbeit keine Interaktion mit gp41 und
keine inhibitorische Wirkung (Herrera et al. 2009, Herrera et al. 2010).
Die antivirale Aktivität der E2-Peptide scheint sich auf HIV-1-Isolate zu beschränken. Die
Replikation von HIV-2mir, SIVmac239 und SIVmac251 wurde durch Behandlung mit E2-Peptiden
auch in hohen Endkonzentrationen von bis zu 100 µM nicht beeinflusst. Es wurden jedoch
nur zwei SIV-Isolate und ein HIV-2-Isolat untersucht. Es ist bei dieser geringen Zahl an
getesteten
Virusstämmen
nicht
auszuschließen,
dass
andere
Vertreter
dieser
Immundefizienzviren durch E2-Peptide hemmbar sind. Zumindest die untersuchten Isolate
wurden durch die eingesetzten Peptidkonzentrationen nicht maßgeblich beeinflusst. Es ist
bekannt, dass der kinetische Prozess der Fusion bei HIV-2 schneller abläuft als bei HIV-1
(Gallo et al. 2006). Das Zeitfenster für die Bindung von Entry-Inhibitoren wie AMD-3100
und C34 ist dadurch verkürzt und HIV-2 somit weniger sensitiv für diese Substanzen. Ein
ähnlicher Mechanismus ist auch für SIV denkbar und könnte erklären, weshalb HIV-2 und
SIV bei der Behandlung mit E2-Peptiden nicht reaktiv sind.
64
G - Diskussion
Aber auch einige der getesteten HIV-1-Isolate der Subtypen A bis H waren bei Behandlung
mit E2-Peptiden nur schwach bzw. nicht reaktiv. Die Sensitivität der verschiedenen HIVStämme ist jedoch nicht klar abhängig vom Korezeptorgebrauch oder vom HIV-Subtyp. Im
Allgemeinen waren X4-trope Virusstämme allerdings reaktiver in Bezug auf ihre
Hemmbarkeit durch E2-Peptide als R5-trope HIV-Stämme, was bereits von Herrera et al.
beobachtet wurde (Herrera et al. 2010). Diese Beobachtungen stehen jedoch im Gegensatz zu
früheren Untersuchungen unserer Arbeitsgruppe. In Koinfektionsversuchen mit HIV-1 und
GBV-C konnte eine größere Bandbreite von HIV-Isolaten gehemmt werden (Jung et al.
2005). Dies lässt darauf schließen, dass der N-terminale Bereich von E2 nur einen Teil der
gesamten Interferenz von GBV-C im Allgemeinen und E2 im Speziellen mit HIV-1 bedingt.
Eine mögliche Erklärung ist die Annahme, dass mehrere Bereiche in E2 und nicht nur der
N-terminale Bereich zwischen AS 29 und 72 für den vollen inhibitorischen Effekt auf die
HIV-1-Replikation benötigt werden. Diese Vermutung wird von Daten von Herrera et al.
unterstützt, die mehrere Bereiche in E2 identifizieren konnten, die über Interaktion mit dem
gp41-Fusionspeptid die Replikation von HIV-1 in vitro hemmen konnten (Herrera et al.
2010). In dieser Studie wurden Berechnungen in Bezug auf die Hydrophilie von E2-Peptiden
und deren Zugänglichkeit im Protein durchgeführt. Die Ergebnisse deuten auf hydrophile
Regionen im Bereich der inhibitorischen Peptide hin. Diese Domänen befinden sich nach
Computervoraussagen an der Oberfläche des E2-Proteins. Sie wären somit leicht zugänglich
und
würden
Wechselwirkungen
Wasserstoffbrückenbindungen
und
mit
anderen
Molekülen
erlauben.
Van-der-Waals-Wechselwirkungen
Hier
sind
wahrscheinlich,
welche in Modellsystemen zwischen E2-Peptiden und gp41-FP nachgewiesen werden
konnten (Herrera et al. 2010). Durch das Zusammenspiel von mehreren Bereichen in E2
könnte so die volle inhibitorische Aktivität erzielt werden. Einzelne Peptide sind daher
möglicherweise in ihrer HIV-inhibitorischen Wirkung limitiert. Eine weitere Erklärung für
die größere inhibitorische Breite von GBV-C im Vergleich zu den von E2 abgeleiteten
Peptiden könnte sein, dass die Interferenz von GBV-C mit HIV durch mehrere verschiedene
Mechanismen vermittelt wird. Dafür sprechen frühere Studien, in denen gezeigt werden
konnte, dass eine GBV-C-Infektion die Ausschüttung von HIV-inhibitorischen Chemokinen
in primären Lymphozyten induziert und die Expression von GBV-C NS5A die
Empfänglichkeit von lymphoiden Zellen gegenüber einer HIV-Infektion herabsetzt (Jung et
al. 2005, Xiang et al. 2004, Xiang et al. 2006). In Replikationsversuchen dieser Arbeit auf
TZM-bl-Zellen wurde das chemokinresistente HIV-Isolat SF33 untersucht. Dieser HIV-
65
G - Diskussion
Stamm wurde durch Zugabe der Peptide P4 und P6 gehemmt. Diese Beobachtung spricht
gegen eine Induktion von HIV-inhibitorischen Chemokinen durch diese E2-Peptide.
Darüber hinaus ist denkbar, dass unterschiedliche Rezeptor- oder Korezeptor-Spezifitäten den
dynamischen Prozess des Eintritts von HIV in die Wirtszelle beeinflussen können, was
wiederum die Sensitivität gegenüber E2-Peptiden beeinträchtigen kann. Dieser Effekt wurde
bereits für andere Entry-Inhibitoren beschrieben. Der Fusionsinhibitor T-20 ist ein 36merPeptid, das sich von der heptad-repeat-Region 2 (HR2) des HIV-1 gp41 ableitet. Es kann
nach Virusbindung an den CD4-Rezeptor an eine Zielsequenz in der HR1 binden und
behindert so weitere Konformationsänderungen, die letztendlich zur Fusion von viraler und
zellulärer Membran führen. Es ist bekannt, dass es große Unterschiede in der Sensitivität
verschiedener HIV-Isolate für T-20 gibt. Diese sind durch unterschiedliche Affinitäten zum
Korezeptor bedingt. Hüllproteine mit hoher Affinität zum Korezeptor sind weniger reaktiv auf
T-20 als schwach-affine Hüllproteine. Es wird angenommen, dass eine starke Bindung des
Hüllproteins an den Korezeptor die Bildung des six-helix-bundles beschleunigt und somit das
Zeitfenster für die Bindung von T-20 an gp41 verkürzt. Der Austausch von X4-tropen gegen
R5-trope V3-Schleifen in gp120 führt zu einer verringerten Sensitivität für T-20 (Derdeyn et
al. 2001, Reeves et al. 2002). Diese Tatsache liefert einen Erklärungsansatz für die geringere
Sensitivität von R5-tropen HIV-Stämmen in unseren Versuchen.
Darüber hinaus wird angenommen, dass auch Regionen in gp41, die nicht direkt an der
Fusion beteiligt sind, die Kinetik des Fusionsprozesses beeinflussen. Diese für die Fusion
verantwortlichen Domänen in gp41 sind konserviert. Unterschiede in der C-helikalen Region
von gp41 scheinen die Stabilität des six-helix-bundles zu beeinflussen (Gallo et al. 2006,
Gallo et al. 2004, Gustchina et al. 2005). Auch der cytoplasmatische Teil von gp41 kann die
Fusion beeinflussen. Sowohl bei HIV-1 als auch bei SIV und HIV-2 kann diese Region mit
unterschiedlichen Oberflächenmolekülen der Wirtszelle interagieren (Wyss et al. 2005, Wyss
et al. 2001, Kim et al. 2002, Tencza et al. 1995, Zhang et al. 1999, Evans et al. 2002).
Weiterhin sind drei alpha-helikale Domänen beschrieben, die in HIV-1 hochkonserviert sind.
Diese können mit der Plasmamembran der Zielzelle interagieren, diese destabilisieren, die
Permeabilität für Ionen verändern und zum Zelltod führen (Miller et al. 1993, Kliger and Shai
1997, Comardelle et al. 1997, Gallo et al. 2006). All diese Faktoren beeinflussen über
verschiedene Wege die Fusionskinetik von HIV mit der Wirtszelle. Der KorezeptorTropismus ist somit nur ein kleiner Faktor im komplexen HIV-Entry-Prozess. Durch diese
Vielzahl an möglichen Faktoren, die die Wechselwirkungen zwischen Virus und Zelle
66
G - Diskussion
beeinflussen, sind auch Schwankungen in der Sensitivität von verschiedenen HIV-Stämmen
gegenüber antiviralen Substanzen wie T-20 oder den GBV-C E2-Peptiden zu erklären.
Es wird darüber hinaus deutlich, dass auch die Zusammensetzung der Wirtszellmembran
einen Einfluss auf die Fusionskinetik hat. In Bezug auf die Reaktivität von T-20 ist
beschrieben, dass die Korezeptordichte auf der Wirtszelle die Sensitivität beeinflusst. Eine
hohe Korezeptordichte führt zu einer schnellen Membranfusion und verringerter T-20Reaktivität. Bei geringer Korezeptorzahl ist das Gegenteil zu beobachten (Reeves et al. 2002).
Die Expression von CD4, CCR5 und CXCR4 ist in TZM-bl-Zellen sehr hoch und somit nur
bedingt auf die in vivo-Situation übertragbar. Durch die hohe Korezeptordichte ist es
wahrscheinlich, dass das Zeitfenster für den Angriff von E2-Peptiden sehr kurz ist. Dies
würde erklären, weshalb in diesem Testsystem viele HIV-Isolate nicht reaktiv waren. Neueste
Daten unserer Gruppe weisen darauf hin, dass es Unterschiede in der Reaktivität auf
unterschiedlichen Zelltypen gibt. Es zeigte sich eine große Übereinstimmung der Ergebnisse
auf TZM-bl-Zellen mit den Ergebnissen auf CEMx174-Zellen. Die Reaktivität der HIVIsolate auf die E2-Behandlung war hier weitestgehend identisch. Im Vergleich von TZM-blZellen mit PBMC waren jedoch Unterschiede sichtbar. Einige nicht-reaktive Isolate waren auf
PBMC durch E2-Peptide hemmbar (Koedel et al. 2011, in press, Holger Wend,
unveröffentlichte Daten). Die Aktivität von E2-Peptiden scheint wie bei T-20 ebenfalls mit
der Korezeptordichte zu korrelieren.
Bei der Knospung (budding) von Retroviren erhalten diese eine Lipidhülle, die sich von der
Plasmamembran der Wirtszelle ableitet. Darin sind hauptsächlich zelluläre Lipide sowie
virale und zelluläre Oberflächenproteine enthalten (Cantin et al. 2005, Schon et al. 2006, Ott
2008). Daher spiegelt die Zusammensetzung der Virushülle in Teilen ihren zellulären
Ursprung wider. Somit können sich abhängig von der Ursprungszelle Unterschiede in der
Infektiosität als auch in der Hemmbarkeit durch E2-Peptide zwischen verschiedenen
Viruspräparationen ergeben. Die Unterschiede zwischen den Ursprungszellen der Virusstocks
erklären die Unterschiede in der Reaktivität verschiedener HIV-Stämme auf die Behandlung
mit E2-Peptiden jedoch nicht ausreichend. Sowohl sensitive als auch nicht-sensitive HIV-1Stämme wurden sowohl auf PBMC als auch auf CEMx174-M7-R5-Zellen produziert.
Zwischen den Viren verschiedenen Ursprungs konnten jedoch keine Unterschiede in ihrer
Sensitivität gegenüber E2-Peptiden beobachtet werden. Außerdem wurden sowohl reaktive
als auch nicht-reaktive pseudotypisierte HIV-1-Reporterviren identifiziert, die ausschließlich
in 293T-Zellen produziert wurden. Diese Reporterviren unterscheiden sich nur im enthaltenen
gp120/gp41. Daraus lässt sich schließen, dass die unterschiedliche Reaktivität der Viren allein
67
G - Diskussion
durch das HIV-1-Hüllprotein bestimmt wird. Um dieser Vermutung weiter nachzugehen,
wurden die Aminosäuresequenzen der Hüllproteine aller getesteten HIV-1-Isolate unter
Verwendung der CLUSTALW Software (version 1.83; Swiss Institute of Bioinformatics,
Switzerland
[http://www.ch.embnet.org/software/CLUSTALW.html])
verglichen.
Dabei
konnten jedoch weder Mutationen noch Aminosäuremotive in gp120 bzw. gp41 identifiziert
werden, die die unterschiedliche Sensitivität der HIV-Isolate erklären könnte (Daten nicht
gezeigt). Strukturelle Unterschiede zwischen verschiedenen gp120/gp41-Varianten, welche
die Sensitivität gegenüber E2 möglicherweise beeinflussen, können jedoch nicht
ausgeschlossen werden.
3. E2-Peptide hemmen den HIV-Entry durch Interaktion mit dem Viruspartikel
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass GBV-C E2-Peptide frühe Schritte des HIVReplikationszyklus wie Bindung an den CD4-Rezeptor sowie die Korezeptoren CXCR4 und
CCR5 oder Fusion zwischen viraler und zellulärer Membran beeinflussen. Diese frühen
Replikationsschritte werden ausschließlich durch die Interaktion von E2-Peptiden mit dem
HIV-1-Partikel beeinflusst. Eine direkte Interaktion mit der Wirtszelle, wie sie für diverse
small-molecule-Rezeptorantagonisten beschrieben ist (Tilton and Doms 2010), kann
ausgeschlossen werden, da eine Vorinkubation von HIV-suszeptiblen Zellen mit Peptiden und
anschließenden Waschschritten zur Entfernung von ungebundenen Reagenzien zu einem
Verlust der antiretroviralen Aktivität führte. Herrera et al. beschreiben in ihrer Studie
entsprechende Ergebnisse. Die Inkubation von TZM-bl-Zellen mit E2-Peptiden vor Zugabe
von Viruspartikeln konnte die Infektion mit HIV nicht verhindern (Herrera et al. 2010). In der
vorliegenden Arbeit konnte die inhibitorische Wirkung jedoch weiterhin beobachtet werden,
wenn HIV-Partikel mit E2-Peptiden vorinkubiert und anschließend intensiv gewaschen
wurden. Diese Ergebnisse wurden innerhalb der Arbeitsgruppe von Kristin Eißmann in einem
weiteren Versuchsansatz mittels Virus-Zell-Fusionsassay nach Cavrois et al. bestätigt
(Cavrois et al. 2002, Koedel et al. 2011, in press). Da GBV-C im Blut in hohen Titern von 107
bis 108 Kopien pro Milliliter vorkommt, kann das E2-Protein auf der Oberfläche von GBV-C
leicht mit HIV-Partikeln in koinfizierten Patienten in Kontakt treten (Jung et al. 2005,
Tillmann et al. 2001). Die direkte Interaktion von E2 mit dem HIV-Partikel ist somit auch in
vivo möglich. Bisher konnte in dieser Arbeit jedoch noch nicht abschließend geklärt werden,
worauf die Interaktion der E2-Peptide mit dem HIV-Partikel beruht. Zum einen könnten
Peptide direkt an Strukturen des Virions binden und den Entry-Prozess somit sterisch
behindern, zum anderen könnten die Peptide das Virus durch direkten Kontakt irreversibel
68
G - Diskussion
verändern. Letzteres wurde bereits für eine lösliche Form des CD4 (sCD4) und dessen
Derivate beschrieben (Arthos et al. 2002, Schon et al. 2006). In Hämolyse-Tests konnte
allerdings gezeigt werden, dass E2-Peptide die gp41-vermittelte Lyse von Erythrozyten
hemmt. Herrera et al. konnten ebenfalls eine Interaktion diverser E2-Peptide mit gp41
nachweisen (Herrera et al. 2010). Somit ist anzunehmen, dass gp41 ein Interaktionspartner für
inhibitorische E2-Peptide ist. Im Viruspartikel selbst ist das gp41 jedoch nicht frei zugänglich.
Erst durch eine Vielzahl von Konformationsänderungen im gp120 nach Rezeptor- und
Korezeptorbindung wird das gp41-FP freigelegt und so eine Interaktion mit der
Wirtszellmembran ermöglicht (zusammengefasst in Tilton and Doms 2010). In der
vorliegenden Arbeit wurden jedoch Wechselwirkungen von E2-Peptiden mit freien
Viruspartikeln nachgewiesen, obwohl das gp41 in diesem Fall noch durch gp120 abgeschirmt
ist. Ein Erklärungsansatz dazu liefern die HIV-neutralisierenden Antikörper 2F5 und 4E10.
Diese Antikörper binden ebenfalls an Epitope in gp41, die schwer zugängig sind. In
Untersuchungen mit Modellvesikeln, die die Zusammensetzung viraler bzw. zellulärer
Membranen widerspiegeln, wurde gezeigt, dass beide Antikörper an Membranen binden.
Diese Bindung ist sehr stark und nahezu irreversibel. Die Antikörper können so an
Zielmembranen binden und nach Umfaltung des HIV-Hüllproteins mit dem freigelegten gp41
interagieren (Veiga et al. 2009). Ein ähnlicher Mechanismus ist auch für den Fusionsinhibitor
T-20 denkbar. Dieses Peptid beinhaltet ein Tryptophan-Motiv (WNWF), welches eine
lipidbindende Domäne repräsentiert (Liu et al. 2007). Über dieses Motiv kann sich T-20 an
Lipide der Zellmembran anlagern und so nach Konformationsänderung in Folge von
Rezeptor- und Korezeptorbindung an gp41 binden. Die E2-Peptide P4-7, P6-2 und P4762
beinhalten ebenfalls ein Tryptophan-Motiv (WVWV). Es ist daher denkbar, dass sich diese
Peptide ebenfalls an Lipide anlagern und so unspezifisch an freie HIV-Partikel binden
können. Nach Umfaltung des gp120 können diese mit gp41 interagieren.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden von GBV-C E2 abgeleitete Peptide identifiziert, die den
HIV-Entry effektiv hemmen können. Diese Peptide reihen sich somit in die Gruppe der
Peptid-Fusionsinhibitoren wie T-20 und VIR-576 ein und könnten als neues Therapeutikum
in der Behandlung von HIV-Patienten verwendet werden, deren Therapie aufgrund der
Entwicklung verschiedener Resistenzen versagt. T-20 war der erste Fusionsinhibitor, der für
die Anwendung im Menschen 2003 zugelassen wurde. Eine erste Studie mit VIR-576 im
Patienten verlief ebenfalls erfolgreich. In bisher unbehandelten Patienten konnte die Viruslast
mit der höchsten Dosis von 5g/Tag um 95% reduziert werden. Die CD4-Zellzahl blieb
unverändert. Nebenwirkungen konnten während dieser 10-tägigen Monotherapie nicht
69
G - Diskussion
beobachtet werden (Forssmann et al. 2010). Ein Vorteil dieser Substanzklasse ist die relativ
gute Verträglichkeit. Bisher konnten keine Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten
oder Kreuzresistenzen festgestellt werden. Diese Peptid-Fusionsinhibitoren werden jedoch im
Magen-Darm-Trakt schnell abgebaut und können somit nicht oral verabreicht werden. T-20
muss zweimal täglich subkutan injiziert werden, was die Anwendung für den Patienten
erschwert. Trotzdem kann diese Substanzklasse als Salvage-Therapie in Patienten eingesetzt
werden, die aufgrund bisheriger Behandlung Resistenzen gegen andere Substanzklassen
entwickelt haben. Die neu identifizierten E2-Peptide könnten in der Zukunft ebenfalls Einzug
in die HIV-Therapie finden.
70
H - Anhang
H – Anhang
1. Vektorkarten
pNL4-3.Luc.R-ENIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number 3418
71
H - Anhang
pHXB2 env
NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number 1069
pHEF-VSVG
NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, Catalog Number 4693
72
H - Anhang
pCEP4-Fc
pCEP4-E2(340)-Fc
73
H - Anhang
2. Abkürzungsverzeichnis
µl
Microliter
µM
Micromolar
A
Alanin
Abb.
Abbildung
AK
Antikörper
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure(n)
ATP
Adenosintriphosphat
BBS
BES-buffered saline
BES
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure
BPB
Bromphenolblau
bzw.
beziehungsweise
C
Cystein
ca.
circa
CBL
cord blood lymphocytes, Lymphozyten aus Nabelschnurblut
CCD
Charge-Coupled Device
CPE
cytopathischer Effekt
D
Asparaginsäure
DC-SIGN
Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Nonintegrin
DCTA
1,2-Diaminocyclohexantetraacetat
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DTT
Dithiothreitol
E
Glutaminsäure
ECL
Elektrochemilumineszenz
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
env
envelope, virales Hüllprotein
ER
Endoplasmatisches Reticulum
F
Phenylalanin
Fc
fragment constant
FKS
Fötales Kälberserum
74
H - Anhang
FP
Fusionspeptid
G
Glycin
g
Gramm
GBV
GB-Virus
GFP
Grün-Fluoreszierendes Protein
H
Histidin
h
Stunde
HCV
Hepatitis C-Virus
HEBS
HEPES-buffered saline
HEPES
2-(4-(2-Hydroxyethyl)- 1-piperazinyl)-ethansulfonsäure
HGV
Hepatitis G-Virus
HIV
humanes Immundefizienzvirus
HPLC
high performance/pressure liquid chromatography, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
HRP
horseradish peroxidase, Merrettich-Peroxidase
I
Isoleucin
IC50
half-maximal inhibitory concentration, mittlere inhibitorische Konzentration
IgG
Immunglobulin G
K
Lysin
kb
Kilobasen(paare)
kDa
Kilodalton
L
Leucin
l
Liter
M
Molar
M
Methionin
mg
Milligramm
min
Minute
mind.
mindestens
mM
Millimolar
N
Asparagin
nm
Nanometer
NTR
Nicht-translatierte Region
P
Prolin
PAA
Polyacrylamid
75
H - Anhang
PBMC
peripheral blood mononuclear cells, periphere mononukleäre Blutzellen
PBS
phosphate-buffered saline, physiologischer Phosphatpuffer
pmol
Picomol
PVDF
Polyvinylidenfluorid
Q
Glutamin
R
Arginin
RLU/s
relative light unites per second
RNA
ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
rpm
revolutions per minute
RPMI Zellkulturmedium des Roswell Park Memorial Institute
RT
Reverse Transkription
RT-PCR
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
s
Sekunde
S
Serin
s.
siehe
s.o.
siehe oben
scr
scrambled, hier: zufällig angeordnete AS-Sequenz
SDS
Sodium Dodecyl Sulphate, Natriumlaurylsulfat
SIV
Simian Immunodeficiency Virus, Affen-Immundefizienzvirus
T
Threonin
Tab.
Tabelle
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TM
Transmembrandomäne
V
Valin
V
Volt
vgl.
vergleiche
VIRIP
virus-inhibitory peptide
VSV
Vesikuläres Stomatits Virus
W
Tryptophan
WT
Wildtyp
Y
Tyrosin
z.B.
zum Beispiel
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domain of HIV-1 gp41 and p115-RhoGEF. Curr. Biol. 9:1271-1274.
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Danksagung
Danksagung
Besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Jutta Eichler, die diese Arbeit als Erstgutachterin der
Naturwissenschaftlichen Fakultät vertreten hat, für ihren wissenschaftlichen Rat, ihre
freundliche Unterstützung und ständige Diskussions- und Erklärungsbereitschaft.
Ich danke außerdem Herrn Prof. Dr. Bernhard Fleckenstein für die Chance, diese
Doktorarbeit am Virologischen Institut durchführen zu können und seine fachliche
Unterstützung besonders in der Endphase dieser Arbeit.
Weiterhin danke ich Frau Dr. Dr. Heide Reil für die Möglichkeit, diese Doktorarbeit in Ihrer
Gruppe durchführen zu können.
Außerdem gilt mein Dank Herrn Prof. Dr. Michael Mach für seine freundschaftliche
Unterstützung in den vergangenen Jahren.
Nicht zu vergessen sind an dieser Stelle natürlich alle Menschen, mit denen ich im
Laboralltag zu tun hatte. Allen voran danke ich Kristin Eißmann und Holger Wend, die das
Leben im Labor um einiges erleichtert haben, für die gute Zusammenarbeit. Ein ganz dickes
Dankeschön geht an ‚Bine’ Wittmann und Dr. Hauke Walter, die mir stundenlange
Pipettieraktionen im S3-Labor durch amüsante und anregende Unterhaltungen versüßt haben.
Weiterhin Dank an Marek Mössl für Analysen, Berechnungen und ungezählte Kannen Kaffee
mit dem Rest der Eichlers.
Mein besonderer Dank gilt natürlich meinen Freunden und meiner Familie. Ich danke
besonders Volker Bergemann für viele offene und hilfreiche Gespräche, wenn mal wieder
Land unter war. Dr. Wolfgang Ruhland danke ich für seine Unterstützung in allen
Lebenslagen, Asyl in München und für entspannte Tage im Schnee.
Der größte Dank gilt jedoch den beiden Menschen, die mich immer unterstützt haben: Mama
und Martin. Ich danke euch von Herzen für euer unerschütterliches Vertrauen in mich und
meine Fähigkeiten. Danke, dass ihr immer für mich da seid. Ohne euch hätte ich es nicht
geschafft!
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