Mikrobiologisch- Biochemisches Praktikum
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MikrobiologischBiochemisches Praktikum Roland Süßmuth, Jürgen Eberspächer Rainer Haag, Wolfgang Springer 2. völlig überarbeitete Auflage 142 Abbildungen 1999 Georg Thieme Verlag Stuttgart • New York jX Inhaltsverzeichnis 1 1.1 1.1.1 1.1.2 1.2 1.2.1 1.2.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.4 2 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4 2.3 Einführung in mikrobiologisches Arbeiten: Richtlinien und allgemeine Arbeitstechniken 1 Vorsichtsmaßnahmen bei Arbeiten mit Mikroorganismen 1 Vermeiden von Laborinfektionen 1 Notfallmaßnahmen bei Laborinfektionen 3 Bedeutung sterilen und sauberen Arbeitens 4 Arbeitsplatz- und Gerätepflege 4 Desinfektion und Sterilisation 5 Kultivierung von Mikroorganismen 13 Kulturmedien 13 Laboratoriums-Grundausstattung und Kulturgefäße 16 Isolierung, Bezug und Kurzzeithaltung von Mikroorganismen ... 18 Bestimmung der Keimzahl 21 Literatur 31 Stammhaltung und Konservierung von Mikroorganismen Stammhaltung aerober und anaerober Mikroorganismen (Kurzzeithaltung) Konservierte Kulturen (Langzeithaltung) Trockenkonservierung Gefrierkonservierung Konservierung unter Paraffinöl Konservierung in steriler Erde Versand von Mikroorganismen Literatur 3 Identifizierung von Bakterien 3.1 Allgemeine Bakterienidentifizierung 3.1.1 Morphologie 3.1.2 Färbungen 3.1.3 Wachstumsbedingungen 3.1.4 Verhalten gegen Sauerstoff 3.1.5 Stoffwechseleigenschaften 3.2 Identifizierung von gleitenden Bakterien 3.2.1 Nachweis der Gleitbewegung 3.2.2 Nachweis von Carotinoiden und Flexirubinen 3.2.3 Nachweis von bakteriolytischen Eigenschaften 32 34 36 36 44 49 50 50 51 52 54 55 56 65 67 69 80 80 81 81 Inhaltsverzeichnis 3.3 Identifizierung von Mikroorganismen mit standardisierten Testsystemen Identifizierung von Enterobacteriaceae Identifizierung von Bakterien mit chemotaxonomischen und molekularbiologischen Methoden Fettsäuren aus Bakterien (FAME) Bestimmung des GC-Gehaltes der DNA DNA-DNA-Hybridisierung Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens Literatur 88 89 92 95 98 107 4 Wachstum der Mikroorganismen 109 4.1 4.1.1 4.1.2 Wachstum in einer Batch-Kultur Aufnahme einer Wachstumskurve Wachstum in Abhängigkeit von verschiedenen Kohlenstoffquellen Wachstum in Abhängigkeit von der Substratkonzentration Wachstum aerober Mikroorganismen in Abhängigkeit von der Sauerstoffversorgung Wachstum der Mikroorganismen in einer kontinuierlichen Kultur Synchronisation der Zellteilung in Kulturen von Mikroorganismen Zellzyklusanalysen an Hefen Literatur 109 113 3.3.1 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 4.1.3 4.1.4 4.2 4.3 4.4 82 83 115 117 120 121 128 132 136 5 Bakteriophagen 137 5.1 5.2 Anreicherungsverfahren von Bakteriophagen Stufenwachstum der Phagen und Phagenzüchtung in Flüssigkultur Züchtung von Tl-Phagen Züchtung von Lambda-Phagen Versuche mit temperenten Phagen Nachweis der Lysogenie Isolierung von temperenten Phagen und sensitiven Bakterienstämmen Literatur 141 Untersuchungen mit anaerob wachsenden Bakterien 155 Literatur 165 Antibakterielle Wirkstoffe (Synthetische Wirkstoffe, Antibiotika) 166 Produktion durch Mikroorganismen Identifizierung eines antibakteriellen Wirkstoffes 167 171 5.2.1 5.2.2 5.3 5.3.1 5.3.2 6 7 7.1 7.2 143 144 146 147 148 150 153 Inhaltsverzeichnis XI 7.3 7.4 7.4.1 7.4.2 7.4.3 7.4.4 7.5 Resistenz gegen antibakterielle Stoffe Bestimmungsmethoden für antibakterielle Aktivitäten Verdünnungstest Agardiffusionstest Kinetische Meßmethoden für antibakterielle Wirkungen Konzentrationsbestimmungen von antibakteriellen Stoffen Interaktionen zwischen verschiedenen Antibiotika Literatur 175 179 179 182 188 190 196 204 8 Erzeugung von Mutanten und Photoreparatur 206 8.1 Mutationsauslösung mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) Behandlung einer Bakterienkultur mit Mutagen und Bestimmung der Inaktivierung Isolierung und Bestimmung von Mutanten nach Mutagenbehandlung Mutantenanreicherungsverfahren Stempeltest Strichtest Blättchentest Deutung von auxotrophen Mutantentypen Isolierung verschiedener Mutantentypen Mutationsauslösung durch Transposition Transposonmutation mit dem Phagen Mu Photoreparatur bei Bakterien Literatur 213 213 215 220 220 222 226 227 230 235 240 9 Mutagenitäts- und Toxizitätsprüfung mit bakteriellen Systemen 242 9.1 9.1.1 Mutagenitätsprüfung mit bakteriellen Systemen Mutagenitätstest mit metabolischer Aktivierung von Testverbindungen (Arnes-Test) Arnes-Test mit Hefemikrosomen Repair-Test Toxizitätstest mit Bakterien Der Leuchthemmtest mit Leuchtbakterien Der Schwärmhemmtest mit Proteus mirabilis Literatur 8.1.1 8.1.2 8.1.3 8.1.4 8.1.5 8.1.6 8.1.7 8.1.8 8.2 8.2.1 8.3 9.1.2 9.1.3 9.2 9.2.1 9.2.2 10 208 210 243 247 254 256 258 258 261 263 Untersuchungen von Biosynthesen mit Hilfe von Mutanten .. 265 10.1 Untersuchungen von Biosynthesen mit Mangelmutanten 10.1.1 Kreuzfütterungstest mit Mangelmutanten 10.1.2 Lokalisierung eines Biosyntheseblocks von Mangelmutanten durch einen Wachstumstest 266 270 271 XII Inhaltsverzeichnis 10.2 Akkumulation von Biosynthesezwischenprodukten der Tryptophan-Biosynthese, Isolierung und erste Charakterisierung . 273 Literatur 278 11 Regulation von Stoffwechselvorgängen 11.1 11.2 Einfacher Nachweis einer Regulation bei intakten Zellen Versuche mit der biosynthetischen Threonindesaminase (Repression, allosterische Hemmung und Aktivierung) 11.2.1 Herstellung der Enzymrohextrakte mit verschiedenen Aufschlußverfahren 11.2.2 Bestimmung der spezifischen Aktivität der biosynthetischen Threonindesaminase im Rohextrakt 11.2.3 Abhängigkeit des Threoninumsatzes von verschiedenen Parametern 11.3 Induktion und Katabolitrepression der ß-Galactosidase von £ coli Literatur 12 279 284 287 293 293 295 298 302 Proteinbiosynthese in vitro und in vivo bei Escherichia coli... 303 12.1 12.2 12.3 Zellfreie Proteinsynthese Proteinsynthese in vivo Untersuchungen an Ribosomen Literatur 306 314 316 321 13 Isolierung und Charakterisierung von Desoxyribonukleinsäuren 322 13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 Sedimentationsverfahren zur Stofftrennung 326 Isolierung von Plasmid-DNA 329 Isolierung von Phagen-DNA 334 Isolierung von genomischer DNA 337 Charakterisierung von Plasmid-, Phagen- und genomischer DNA durch Spaltung mit Restriktionsenzymen 339 Literatur 347 14 Genklonierung in Escherichia coli 14.1 Richtlinien zum Schutz vor Gefahren durch in vitro neukombinierte Nukleinsäuren Laborsicherheitsmaßnahmen Biologische Sicherheitsmaßnahmen Arbeitsschritte der Genklonierung Präparative Spaltung von pBR322-Plasmid-DNA und Lambda-Phagen-DNA Ligierung von Plasmid- und Phagen-DNA Isolierung von kompetenten E.-coli-Zellen und Plasmidtransformation 14.1.1 14.1.2 14.2 14.2.1 14.2.2 14.2.3 349 353 353 355 356 356 359 360 Inhaltsverzeichnis XIII 14.2.4 Charakterisierung von rekombinanten Bakterienklonen 363 14.3 Klonierung und Expression des Luziferasegens von Vibrio fischen in Escherichia coli 366 Literatur 372 15 Erregerdetektion durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) . 374 15.1 Nachweis der Methicillinresistenz von Staphylokokken durch DNA-Diagnostik mit der Polymerasekettenreaktion Literatur 16 374 379 Transformation von chromosomaler DNA in Bacillus subtilis . 380 Literatur 388 17 Stoffbestimmungen mit Mikroorganismen 389 17.1 17.2 Aminosäurebestimmung durch Trübungsmessung Vitaminbestimmung durch Trübungsmessung oder Messung gebildeter Milchsäure Literatur 390 18 Isolierung von Farbstoffen aus Bakterien 396 18.1 18.2 Cytochrom c-556 Prodigiosin Literatur 398 400 402 19 Mikrobieller Abbau 403 19.1 Isolierung toluolabbauender Mikroorganismen aus Wasserproben Abwasseranalytik Bestimmung des biochemischen Sauerstoffbedarfs (Verdünnungs-BSB nach DIN 38409 Teil 51) Respirometrische Untersuchungen von Abbauvorgängen Atmungsaktivität von Belebtschlamm beim Abbau verschiedener Substanzen Respirometrische BSB-Bestimmung Respirometrischer Abbaunachweis Anaerober Abbau Literatur 19.2 19.2.1 19.3 19.3.1 19.3.2 19.3.3 19.4 20 20.1 20.2 Stoffumwandlungen durch Mikroorganismen (Biotransformationen) Hydroxylierung von Progesteron mit Calonectria decora Gewinnung von L-Asparaginsäure mit immobilisierten Escherichia-coli-Zellen Literatur 392 395 404 409 410 416 416 419 422 423 427 429 429 432 435 XIV Inhaltsverzeichnis 21 Gewinnung von Metallen durch bakterielle Laugung (Leaching-Verfahren) 436 21.1 21.2 21.2.1 21.2.2 Perkolator-Leaching Submersleaching Submersleaching mit chemolithotrophen Bakterien Submerslaugung mit heterotrophen Mikroorganismen Literatur 438 441 441 443 443 22 Mikrobiologische Trinkwasseruntersuchung nach der Trinkwasserverordnung 444 22.1 22.2 22.2.1 22.2.2 22.2.3 22.3 22.4 22.5 22.6 22.7 22.8 23 Bestimmung der Koloniezahl Nachweis von Escherichia coli und coliformen Bakterien Flüssiganreicherung in Laktosebouillon Isolierung von Escherichia coli und coliformen Keimen Identifizierung von Escherichia coli und coliformen Keimen Nachweis von sulfitreduzierenden sporenbildenden Anaerobiern Nachweis von Pseudomonas aeruginosa Nachweis von Fäkalstreptokokken (Enterokokken) Nachweis von Legionella pneumophila Nachweis von atypischen Mykobakterien Viren im Trinkwasser Literatur 446 448 448 449 450 452 455 456 457 459 460 461 Pflanzenpathogene Pilze 463 23.1 Infektion von Äpfeln mit pilzlichen Erregern und Kochsche Postulate 463 23.1.1 Isolierung und Bestimmung von Erregern der Apfelfruchtfäule .. 464 23.1.2 Infektion von Äpfeln 465 23.2 Biologische Bekämpfung von Gurkenmehltau mit einem Hyperparasiten 466 Literatur ." 470 Medienanhang Anhang: Empfehlungen zur Entsorgung von Abfällen 471 475 Sachverzeichnis 477
