c Gemeinsame Tagung der Deutschen

J8· Ra, Heft9
September 1962
Vortragsvorberichte
V. Klingmüller und Viktoria Klingmüller, Mannheim
und Heidelberg: Normale und pathologische Säure muster
im menschlichen Harn.
Der Harn enthält einen wechselnden Anteil an Kohlensäure, mit dem die Niere im Verhältnis zur Lunge nur
einen geringen Beitrag zur Säuren-Basen.Regulation
leisten kann. Vor allem muß aber die Niere alle diejenigen fixen, d. h. nichtflüchtigen Säuren ausscheiden,
die nicht im Stoffwechsel abgebaut werden oder die nicht
über den 'Darm und die Haut ausgeschieden werden. So
kommen im Harn außer den starken Säuren eine große
Anzahl schwacher Säuren vor; besonders wichtig ist
das sekundäre Phosphat, dann aber auch organische
Säuren, wie die Aminosäuren oder alle aus dem Zitronen·
säurezyklus bekannten sauren Metabolite. Ihre genaue
Einzelanalyse hat gerade in der letzten Zeit besondere
Fortschritte gemacht. Der dazu erforderliche analytische
Aufwand und Zeitverlust ist aber oft zu groß . Darum
wird hier ein einfacberer Weg beschritten, denn in de;r
Beschreibung einer Stoffwechsellage oder in der klinischen Diagnostik genü gen oft summarische Analysen; das
wird an einer großen Zahl von potentiometrischen Harntitrationen gezeigt. Sie gestatten es, die bevorzugte
Ausscheidung besonderer Säuregruppen zu erfassen und
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J. Koch und L. Jaenicke, Physiologisch-Chemisches
Institut der Universität Köln: Untersuchungen zum
Mechanismus der Carboligase-Reaktion.
Ein· neuer
"aktiver" Formaldehyd.
Ein auf Oxalsäure wachsendes Bakterium der Gattung
Pseudomonas braucht für den Abbau des Oxalats neben
Coenzym A als weiteren Cofaktor Thiamin-pyrophosphat
(TPP), Die zunächst über Oxalyl-CoA entst.e hende
Glyoxylsäure [Koch und .Taennicke, Alm. 652, 129
(1962)] wird in der Carboligase-Reaktion zu Tartronaldehydsäure
(CHO ' CHOH . COOH)
umgewandelt
[Krakow und Berkulis, B. B. A. 21, 593 (1956)],
die nach Reduktion zu Glycerinsäure in den Energiestoffwechsel eingeführt wird [H. L. Kornberg, B . .T. 81,
273 (1961)]. Das als ) Intermediärprodukt mögliche
Hydroxylmethyl-TPP- wurde synthetisiert und seine
Struktur bewiesen. Extrakte aus Pseudomonas sp.
bilden aus HC-markiertem Hydroxymethyl-TPP und
Glyoxylsäure Tartronaldehydsäure, deren spezifische
Aktivität derjenigen des eingesetzten HydroxylmethylTPP entspricht. Somit .ist der Mechanismus der Carboligase-Reaktion als eine Acetoin-Kondensation anzusehen, bei der erst nach Decarboxylierung eines Moleküls
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3iert
:c Gemeinsame Tagung der Deutschen Gesellschaft für Physiologische Chemie
~
und der Österreichischen Biochemischen Gesellschaft
V. Klingmüller (Vortragender), H. BerIet, H. von
Bernuth, W. Ruge und G. Ruge-Jeske, Zentrallaboratorium der städtischen Krankenanstalten Mannheim :
Bestimmung der Glutaminsäure in biologischem Material,
mit Glutamatdehydrogenase und Säulenchromatographie.
Die 'direkten klassischen Methoden der Glutaminsäurebestimmung, insbesondere das als Salz in gesättigter
HCI schwerlösliche Hydrochlorid', ergaben maximal nur
etwa eine Ausbeute von 80%; bei dieser diffizilen
Prozedur konnte das isolierte Produkt noch bis zu 5%
Verunreinigungen enthalten, ohne daß ' diese Verunreinigungen in der Elementaranalyse, optischer Rotation
und so weiter in Erscheinung treten.
Von den modernen Möglichkeiten schienen sich die
Säulenchromatographie oder die indirekte enzymatische
Analyse mit Dehydrogenase als besonders vorteilhaft
anzubieten, um eine optimale Schnellmethode für große
Analysenzahlen auszuarbeiten. Allerdings ist die analytische Säulenchromatographie allein zu aufwendig,
wenn Glutaminsäure r ein lmd quantitativ erhalten
werden soli; die alleinige enzymatische Bestimmung im
optischen Test ist aber in biologischem Material zu
störanfällig. Bei der Bestimmung der freien Glutaminsäure im unbearbeiteten Harn treten Ausbeuteverluste
bis zu 40% auf. Wir haben gefunden, daß die Kombination beider Methoden am besten ist: erstens eine vereinfachte säulenchromatographische Fraktionierung ohne
Fraktionssammler über Dowex 50 X 8, 200 bis 400 mesh,
mit einer Säule von 15 X 0,9 cm, entsprechend zirka
9 ml Dowex; Substanzen, die die Enzymreaktion beim
optischen Test hemmen, werdEm durch einen geeigneten
Pufferverlauf eliminiert. Die Fraktion der sauren Amino·
säuren, in der die Glutaminsäure enthalten ist, wird in
zirka 6 bis 8 ml Eluat durch Wechsel des Puffer-pHs
aus der Säule ausgewaschen. Zweitens der optische Test
mit einem zirka 30fach molaren Überschuß an DPN+
und Hydrazinsulfat. Acetylpyridin·DPN+ ist nicht
erforderlich. Es lassen sich 1,0 bis 1000 nMol Glutaminsäure in 1 bis 2 ml Harn zu 98% bis 102 % bestimmen
oder zugesetzte Glutaminsäure wiederfinden. Ähnliche
Ergebnisse wurden mit glutamathaitigen Hydrolysaten
und Würzen erhalten.
= CHO· CHOH· COOH
+ TPP.
Bei der Carboligase-Reaktion tritt also der Formaldehyd selbst als nucleophiler Partner auf,. während er
bei den bisher bekannten Aktivierungen an Tetrahydrofolsäure nucleophile Partner erfordert.
R. Krauze*, E. Broda (Vortragender). G. Kellner und
J. Frimmcl, Institut für Physikalische Chemie und
Histologisch-embryologisches Institut der Universität
Wien: Untersuchungen über die Synthese von Proteinen
durch Zellen in Kultur.
Mit Hilfe eines für diesen Zweck entwickelten Gaszählrohres können einfache und sehr empfindliche Serienbestimmungen von ~adiokohlenstoff durchgeführt
werden. Die Methode wurde auf die Untersuchung der
autonomen Bildung individueller Proteine durch Zellen
in Kultur angewendet. Die Zellen (menschliche HeLaTumorzellen oder Mesenchymzellen embryonaler Hühner)
werden mit radioaktiver Alninosäure inkubiert, die
Gesamtheit der löslichen Proteine wird durch mtrafil~ration unter Druck abgeschieden, diese Mischlmg
wird durch Fällungen oder Elektrophorese in Komponenten aufgetrennt und die Radioaktivität der Fraktionen
mit dem Gaszählrohr geprüft. Aktivität einer Fraktion
zeigt, daß die Zellen Aminosäuren in die Proteine dieser
Fraktion eingebaut, also diese Proteine synthetisiert
haben. Die endgültige IdentifizierUng der Proteine erfolgt
durch Radioimmunochemie, d. h. es wird nach Zusatz
von Antiserum gegen das nachzuweisende Protein zu der
Lösung der Fraktion festgestellt, ob der Radiokohlenstoff
sich in dem Niederschlag befindet. Die Bildung von
Milcrogramniengen ist noch ohne Schwierigkeit festzustellen. Mannigfache Kontrollversuche wurden an gestellt, um Stönmgen durch Adsorption, unspezifische
Anlagerung von Aminosäuren u. dgl. auszuschalten.
Unter anderem wurde auch mit A . Budzynsld (Mh.
Chem., im Druck) durch Dinitrophenylierung und
Hydrazinolyse gezeigt, daß der endständig gebundene
Anteil der markierten Aminosäure (Leucin) minimal ist.
* Beurlaubt von der Vakzin- und Serumanstalt,
Ministerium für Gesundheitswesen, Warszawa, Polen.
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Osterreichische
Chemiker-Zeitung
Vortragsvorberichte
Im R efer at wird über die neuesten Ergebnisse dieser
Untersuch1.mgen, und zwar auch über die Beeinflussung
der Proteinbild1.mg durch ionisierende Strahlen, berichtet.
polymerase ergeben sich keine Unterschiede zwischen
den auf unterschiedliche Weise gewonnenen DNS Proben.
G. Kreil, Institut für Biochemie der Universität Wien:
Über die Artspezifität VOll Cytochrom c: Vergleich der
Aminosäuresequenz von Pferde- und Thunfisch-Cyto chrom-co
Cytochrom c ist infolge seiner leichten Isolierbarkeit,
seines niederen Molgewichtes und seines nahezu ubiquitären Vorkommens ein besonders günstiges Studienobjekt für Untersuchungen über die Artspezifität der
Proteinstruktur. Die nun zur Gänze aufgeklärte Aminosäuresequenz des Pferde-CytochToms-c [E . Margoliash ,
E . L. Smith, G_ Kreil 1.md H . Tuppy, Nature 192,
1124 (1961)] bildet hierfür eine günstige Ausgangsbasis.
Beim Vergleich der Struktur des Thunfisch-Cytochroms-c
mit der des Pferde-Cytochroms -c wurde bisher an elf
Stellen der Polypeptidkette ein Austausch einzelner
Aminosäurereste gefunden; sieben weitere Unterschiede
konp.ten wahrscheinlich gemacht werden. Besonders
interessant ist d er Ersatz eines Histidinrest es' im PferdeCytochrom-c (NI'. 33) durch Tryptophan im ThunfischCytochrom. In beiden Proteinen wurde ein acetyliertes
Glycin in N-terminaler Position gefunden.
H. Kromphardt, Institut für vegetative Physiologie der
Universität Frankfurt am Main: Die Aufnahme von
Taurin in Ehrlich-Ascitestumorzellen.
Asciteszellen nehmen aerob 3sS-Taurin während
2 Stunden mit annähernd konstanter Geschwindigkeit
auf. Dabei wird die Radioaktivität im Zellwasser auf
ein Vielfaches der Außenkonzentration angereichert.
Papierchromatographisch verhält sich die aus den
Zellen mit gesättigter wäßriger Pikrinsäure ' extrahierbare
Radioaktivität wie reines Taurin. D er Rückstand enthält weniger als 1 % der Zellaktivität. B ei Variation der
Taurinkonzentration im Medium läßt sich der Influx
durch Addition einer Sättigungskurve (KM = 0,2 mM,
V m = 0,3 ",Mjg ,min) Ulld einer linearen Funktion der
Außenkonzentration beschreiben. (X-Aminosäuren hemmen nur geringfügig, ß -Alanin dagegen stärker und
kompetitiv . H+-Ionen hemmen sofort und reversibel,
aber nicht kompetitiv. Die pH-Abhängigkeit des
Transportes entspricht der Dissoziationskurve einer
sauren Gruppe mit einem pK von 6. Vorbeladung
der Zellen mit Taurin oder ß-Alanin verändert
die Auf;nahme des markierten Taurins nicht. Von
der Zelle aufgenommenes 3sS-Taurin wird sehr langsam, bei Anwesenheit von Taurin oder ß -Alanin im
Außenmedium etwas schneller abgegeben. Vorbehandlung mit Dinitrophenol hemmt den Influx. Es wird
versucht, diese Bef1.mde mit Hilfe eines aktiven CarrierMechanismus zu erklären.
(Die Arbeit wurde von der National Science
Foundation, Grant Nr. NSF G, 19812, unterstützt.)
A. Kreiling, W. Ludwig und G. Pfleiderer, Institut für
Biochemie im Institut für Organische Chemie der
Universität Frankfurt am Main: Über die Pantothensäuresynthetase aus Escherichia coli.
Eine zusätzliche Reinigung der PSase aus E . coli
wurde mit Hilfe der Säulenchromatographie mit CMCellulose und DEAE -Sephadex errelcht.
Mit diesem hochgereinigten Enzym wurde eine Reihe
allgemeiner Eigenschaften der PSase geprüft, wie Stabilität, Säureempfindlichkeit, Umsatzzahl und Molekulargewicht. Die elektrophoretischen Untersuchungen lassen
auf eine Heterogenität des Enzyms schließen.
Hemmversuche mit hohen Harnstoff- und Guanidinkonzentrationen zeigten, daß das Substrat Pantoylsäure
sowie Pantoylsäure + ATP einen gewissen Schutz vor
der D enaturierung bieten. VolU::ommen inaktivierte
PSase läßt sich durch Verdünnen des Harnstoff-EnzymInkubationsgemisch es wieder bis zu 50% r eaktivieren.
Die Denaturierung beträgt beim Guanidininkubationsgemisch ·25%. Die Kinetik der Denaturierung wurde aufgenommen.
{
Zur Aufklärung des aktiven Zentrums wurde die
PSase mit gruppenspezifischen Hemmstoffen inkubiert.
Eine Inaktivierung wurde vor allem b ei Reagentien be obachtet, die am Tyrosin, Tryptophan oder Histidin
einerseits und am Lysin andrerseits angreifen.
I. Kröger und H. Kröger, Physiologisch-Chemisches
Institut d er Universität Freiburg ·im Breisgau : Eine
einfache Methode zur Isolierung von Desoxyribonucleinsäure aus Bakterien.
Bei der Fraktionierung eines Bakterien-Extraktes mit
Ammoniumsulfat bleibt der größte Teil der DNS in dem
Überstand nach der 80 %igen Sättigung. Das Protein und
die RNS sind im Sediment. Nachdem das Ammoniumsulfat durch Dialyse geg€ln citrathaltiges Wasser aus dem
Überstand entfernt wird, kann die DNS mit Alkohol
gefällt werden.
Auf diese Weise kann eine DNS gewonnen werden, die
- ohne Anwendung von RNase - frei von RNS ist. Die
Sedimentationskonstante und die Viskosität dieser DNS
sind etwas geringer als von der DNS, die durch die
Desoxycholat-Methode isoliert wurde. Bei einem Vergleich der Transformation von Streptomycin-Resistenz
bei Pneumokokken und der Starterwirkung für RNS-
C. Klltzbach und L. Jaenicke, Physiologisctt-Chemisches Institut der Universität Köln: Phosphol'ylierte
l\lodelle der Tetmhydl'ofolsäure.
N,N' -Diaryläthylendiamine tragen die Wirkgruppe
der Tetrahydrofolsäure, des Coenzyms des Cl"Stoffe
wechsels (vgl. J aenicke, Ciba-Study group on the
mechanism of action of water soluble vitamins, London,
1961). Es gelang nun auch, unsymmetrisch aryl-substituierende Verbindungen dieses Typs darzustellen. Diese
sind bessere Modelle der Tetrahydrofolsäure als die
früher verwendeten, da die beiden N -Atome verschieden
basisch sind. Die Verbindungen stehen daher dem
natürlichen Cofaktor näher . . Um die Formiat-Aktivierungsreaktion. der Tetrahydrofolat-Formylase besser
zu verstehen (Jaenicke, a. a. 0.), werden symmetrische
und unsymmetrische Diaryläthylendiamine phosphoryliert. Man erhält dabei sehr glatt cyclische Diamidphosphate. Diese Verbindungen geben bei H ydrolyse in
Gegenwart von Formiat unter milden Bedingungen
N-Monoformyl-Derivate nach
/ ® ",
""
H+
Ar'N /
N·Ar - - - - +
HCOO. CH 2 • CH 2 •
CHO
H
->-
Ar' N
N · Ar
. CH 2 • CH 2
+ H 3P0
4•
•
Die Ausbeute liegt über 50%. An den unsymmetrischen Diaryläthylendiamin-Modellen konnte die Orientierung dieser Formolyse-Reaktion untersucht werden.
Durch diese Beobachtungen wird der aus enzymatischen
Studien an der Taubenleber-FOl'mylase abgeieitete
Mechanismus erhärtet.
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