Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und

Charakterisierung der
ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt
des Bakteriophagen T4
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen
Arbeitsgruppe Molekulare Genetik
vorgelegt von
Reinhard Depping
aus Detmold
Bochum
2001
Man kann nicht die wahren Schwierigkeiten eines Problems abschätzen,
bevor man es gelöst hat.
Carl Ludwig Siegel
für Nicole
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG
1
1.1 DER BAKTERIOPHAGE T4
2
1.1.1
DER INFEKTIONSZYKLUS
2
1.1.2
DIE SEQUENTIELLE GENEXPRESSION
3
1.2 ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN
4
1.2.1 MONO-ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN
5
1.2.2 POLY-ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN
11
1.2.3 DIE ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN MODA, MODB UND ALT
14
1.3 AUFGABENSTELLUNG
16
2 MATERIAL UND METHODEN
18
2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME
18
2.2 GERÄTE
18
2.3 VERBRAUCHSMATERIALIEN
19
2.4 OLIGONUKLEOTIDE
20
2.5 BAKTERIEN- UND BAKTERIOPHAGENSTÄMME
20
2.6 PLASMIDE
21
2.7 NÄHRMEDIEN
23
2.8 COMPUTER-SOFTWARE
23
2.9 ARBEITEN MIT BAKTERIEN UND PHAGEN
24
2.9.1 ANZUCHT VON BAKTERIEN
24
2.9.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER E. COLI ZELLEN ZUR ELEKTROPORATION (CALVIN &
HANAWALT, 1988)
24
2.9.3 ELEKTROTRANSFORMATION VON E. COLI-ZELLEN (CALVIN & HANAWALT, 1988)
24
2.9.4
HERSTELLUNG HITZESCHOCKKOMPETENTER ZELLEN MITTELS CACL2 (DAGERT &
EHRLICH, 1979)
25
2.9.5 HITZESCHOCKTRANSFORMATION (MODIFIZIERT NACH COHEN ET AL., 1972)
25
I
Inhaltsverzeichnis
2.9.6 PLASMIDSTABILITÄTSTEST DER PET-VEKTOREN
25
2.9.7 ÜBERPRÜFUNG DER TRANSFORMANDEN AUF IHRE EXPRESSIONSFÄHIGKEIT
26
2.9.8 ÜBERPRÜFUNG DER TOXIZITÄT VON MODA UND MODB SOWIE DEREN MUTANTEN
26
2.9.9 ANZUCHT VON BAKTERIEN ZUR INDUKTION UND ÜBEREXPRESSION VON PROTEINEN
27
2.10 ARBEITEN MIT DNA
27
2.10.1 PLASMIDISOLIERUNG
27
2.10.2 ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA
27
2.10.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE
27
2.10.4 ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN
28
2.10.5 HERSTELLUNG VON VEKTOREN MIT EINEM T-ÜBERHANG
28
2.10.6 POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR)
29
2.10.7 AUFREINIGUNG VON PCR-PRODUKTEN
29
2.10.8 ORTSGERICHTETE MUTAGENESE
30
2.10.9 DNA-SEQUENZIERUNG
30
2.11 PRÄPARATION UND ANALYSE VON PROTEINEN
30
2.11.1 BESTIMMUNG VON PROTEINKONZENTRATIONEN
31
2.11.2 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE NACH LAEMMLI (1970)
31
2.11.3 ZWEIDIMENSIONALE ELEKTROPHORESE MIT IMMOBILISIERTEN PH-GRADIENTEN
32
2.11.4 FÄRBUNG VON PROTEINGELEN
35
2.11.4.1 Kolloidale Coomassiefärbung
35
2.11.4.2 Silberfärbung nach Nesterenko et al. (1994) (modifiziert)
35
2.11.4.3 Silberfärbung nach Blum et al. (1987) (modifiziert)
36
2.11.5 AUFREINIGUNG VON "HIS-TAG"-PROTEINEN
36
2.11.5.1 Aufschluss von Bakterien und Präparation von Einschlusskörpern
37
2.11.5.2 Renaturierung von Einschlusskörper-Protein
37
2.11.5.3 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie
38
2.11.6 TRANSFER VON PROTEINEN AUF MEMBRANEN (WESTERN-BLOT)
39
2.11.6.1 Western Blot nach eindimensionaler SDS-PAGE
39
2.11.6.2 Western Blot nach zweidimensionaler SDS-PAGE
40
2.11.7 NACHWEIS VON REKOMBINANTEN "HIS-TAG" PROTEINEN
40
2.12. ADP-RIBOSYLTRANSFERASE AKTIVITÄTSTESTS
42
2.12.1 AKTIVITÄTSTEST MIT 32PNAD+
42
2.12.2 AKTIVITÄTSTEST MIT BIOTINYLIERTEN NAD (BNAD)
43
II
Inhaltsverzeichnis
2.12.3 NACHWEIS DER ADP-RIBOSYLIERUNG MITTELS MONO-ADP-RIBOSYLTRANSFERASEANTIKÖRPERN
44
2.12.4 AKTIVITÄTSTEST MITTELS ELISA ("ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY")
44
2.13 CIRCULARDICHROISMUS (CD)-SPEKTROSKOPIE
45
2.14 KRISTALLISATION
46
2.15 N-TERMINALE SEQUENZIERUNG VON PROTEINEN (EDMAN-ABBAU)
47
2.16 MASSENSPEKTROMETRIE
47
2.16.1 NANO-ELEKTROSPRAY-IONISATIONS-MASSENSPEKTROMETRIE (ESI-MS)
47
2.16.1.1 Bestimmung des Molekulargewichts von His-ModB und Trx-ModB
47
2.16.1.2 Identifikation von Zielproteinen der ADP-Ribosyltransferase Alt
47
2.16.2 MALDI-TOF-MS ANALYSE
48
3 ERGEBNISSE
49
3.1 ÜBEREXPRESSION DER ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN MODA UND MODB
49
3.2 VERSUCHE ZUR VERMEIDUNG VON EINSCHLUSSKÖRPERN
50
3.3 REINIGUNG DER ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN MODA UND MODB
52
3.3.1 ANREICHERUNG VON EINSCHLUSSKÖRPERN
52
3.3.2 NICKEL-NTA METALLCHELAT-AFFINITÄTSCHROMATOGRAPHIE
53
3.4 NACHWEIS DER POLYHISTIDIN-SEQUENZEN ("HIS-TAGS")
55
3.5 VERSUCH DER KRISTALLISATION VON MODA, MODB UND ALT
56
3.6 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER ADP-RIBOSYLTRANSFERASE MODB
56
3.6.1 BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTS
56
3.6.2 ISOELEKTRISCHE FOKUSSIERUNG
57
3.7
58
AKTIVITÄT DER ADP-RIBOSYLTRANSFERASEN MODB, MODA UND ALT
3.7.1 ADP-RIBOSYLTRANSFERASE AKTIVITÄT VON MODB
58
3.7.1.1 Identifizierung der Zielproteine von ModB
61
3.7.1.2 Aktivitätstest mit biotinyliertem NAD+
65
3.7.2 ADP-RIBOSYLTRANSFERASE AKTIVITÄT VON MODA
67
3.7.3 ADP-RIBOSYLTRANSFERASE AKTIVITÄT VON ALT
68
3.7.3.1 Identifizierung der Zielproteine von Alt
69
3.7.4 INHIBITORSTUDIEN
72
3.8 NACHWEIS KATALYTISCH AKTIVER AMINOSÄUREN
75
3.8.1 ORTSSPEZIFISCHE MUTAGENESE
75
III
Inhaltsverzeichnis
3.8.2 AGAROSEPLATTENTEST ZUR TOXIZITÄTSBESTIMMUNG VON MODA- UND MODBMUTANTEN
75
3.8.3 ELISA ZUR CHARAKTERISIERUNG DER MODB MUTANTEN
77
3.8.4 SEKUNDÄRSTRUKTURANALYSE
78
3.9 TEMPERATURSENSITIVITÄT VON MODB
80
4 DISKUSSION
82
5 ZUSAMMENFASSUNG
105
6 LITERATURVERZEICHNIS
108
IV
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen
A. dest.
destilliertes Wasser
ADP
Adenosin-Diphosphat
APS
Ammoniumpersulfat
bp
Basenpaare
CD
cirkularer Dichroismus
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
Gp
Genprodukt
HRP
Meerrettich-Peroxidase
IEF
Isoelektrische Fokussierung
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalaktosid
IPG
immobilisierte pH-Gradienten
MCS
Multiple Klonierungsstelle
Ni-NTA
Nickel-Nitrilotriaceticsäure
O.D.
optische Dichte
PARP
Poly ADP-Ribosyltransferase
PCR
Polymerasekettenreaktion
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF
Polyvinylidin Fluorid
RNAP
RNA-Polymerase
RNase
Ribonuklease
RSA
Rinderserumalbumin
SDS
Natriumdodecylsulfat
SV
Säulenvolumen
TCA
Trichloressigsäure
TEMED
N,N,N´,N´,-Tetramethylethylendiamin
Upm
Umdrehungen pro Minute
UV-Licht
ultraviolettes Licht
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
V
Abkürzungsverzeichnis
Maßeinheiten
A
Ampere
C
Celsius
Ci
Curie
Da
Dalton
deg
Degree (Maßeinheit für Winkel)
g
Gramm
h
Stunde
M
Molarität
min
Minute
s
Sekunde
V
Volt
Größenordnungen
k
kilo
m
milli
µ
mikro
n
nano
p
piko
VI
Einleitung
1 Einleitung
Ein essentielles Attribut des Lebens ist als die Möglichkeit sich selbst zu replizieren definiert
worden (Müller, 1929). Diese Annahme setzt voraus, dass ein lebender Organismus über
einen funktionierenden Stoffwechsel verfügt. Da dies für Viren nicht zutrifft, sind sie nicht als
Lebewesen anzusehen. Interessanterweise sind es gerade die Bakterien infizierenden Viren,
die zu Modellsystemen für Untersuchungen molekulargenetischer Mechanismen wurden. Sie
führten so zum Verständnis von fundamentalen biologischen Prinzipien lebender Organismen,
wie z.B. dem degenerierten Code der DNA und der Existenz von mRNA (Brenner et al.,
1961; Crick et al., 1961).
Der Bakteriophage T4 ist einer der besonders intensiv untersuchten Viren und schon seit den
vierziger Jahren molekularbiologisch und biochemisch studiert worden. Er gehört zu den sehr
eng miteinander verwandten gradzahligen T-Phagen (T2, T4 und T6), die in Bezug auf ihre
Struktur und ihren Replikationsmechanismus die komplexesten Bakteriophagen sind. Wie alle
Viren sind sie darauf angewiesen, die Kontrolle über den Stoffwechsel ihres Wirtes zu
erlangen und damit die eigene Vermehrung sicherzustellen. Für die Synthese ihrer Proteine
greifen sie auf die bakterielle, einer Vielzahl an Regulationsmechanismen unterliegende
Transkription und Translation zurück. Die Genexpression des Wirtes zu kontrollieren, ist
deshalb ein entscheidender Faktor im Infektionszyklus des Phagen. Zu den wichtigsten
Regulationsmechanismen bei T4 zählen die Transkriptionskontrolle durch die intrinsische
Promotorstärke, der Einsatz von Regulatorproteinen und die strukturelle Modifikation der
wirtseigenen RNA-Polymerase durch ADP-Ribosylierung. Der ebenfalls katalysierte Transfer
eines ADP-Ribosylrestes auf das wirtseigene Protein S1 ist ein Anhaltspunkt, dass der
Bakteriophage durch diese Art der posttranslationalen Modifikation auch die Translation zu
seinem Vorteil beeinflusst (Depping, 1998; Tiemann et al., 1999).
Nach einem Überblick über die Struktur und den Infektionszyklus des Bakteriophagen T4
wird deshalb im Folgenden die Enzymklasse der ADP-Ribosyltransferasen beschrieben und
insbesondere auf die Bedeutung der durch den Bakteriophagen T4 kodierten ADPRibosyltransferasen eingegangen.
1
Einleitung
1.1 Der Bakteriophage T4
Der zu den komplexen Bakteriophagen gehörende T4 besteht aus einem ikosaedrischen
Capsid und einem in etwa gleich langen Infektionsapparat mit kontraktiler Scheide und
zentraler Röhre. Im Bereich zwischen dem Capsid und dem Infektionsapparat befindet sich
ein Kragen mit sechs sogenannten "Whiskers". Die Anheftung an die Wirtszelle erfolgt an
spezifischen Rezeptoren über die an der Basalplatte der Scheide ansitzenden sechs
Schwanzfasern.
Im Inneren des Kopfes liegt das relativ große, zyklisch permutierte Genom als lineare dsDNA
mit 172 kbp und einer terminalen Redundanz von 3 kbp vor (Streisinger et al., 1964, 1967;
Kutter et al., 1994). Eine Besonderheit der T4-DNA ist das Vorkommen von glykosyliertem
5´-Hydroxymethyl-Cytosin anstelle des normalen Cytosins, wodurch ein wirksamer Schutz
gegen bakterielle Nukleasen aufgebaut wird (Wyatt & Cohen, 1952; Takahashi et al., 1979).
Das T4-Genom beinhaltet 274 offene Leserahmen von denen ca. 150 bereits bekannte Gene
darstellen, während die restlichen Leserahmen noch nicht charakterisiert wurden (Kutter et al.,
1994; Kawabata et al., 2000). Um die Expression dieser großen Anzahl an Genen kontrolliert
ablaufen zu lassen, verfügt der Phage über ein komplexes Transkriptionsregulationssystem,
durch das eine zeitlich koordinierte Entwicklung gewährleistet wird (1.1.2).
1.1.1 Der Infektionszyklus
Die Infektion der E. coli Wirtszellen durch den Bakteriophagen T4 erfolgt sehr schnell und
äußerst effizient, so dass annähernd jedes Virion, welches auf einem geeigneten
Bakterienrasen ausplattiert wird, auch einen Plaque bildet (Goldberg, 1980). Die Ursache für
diese hohe Effektivität ist der hochentwickelte Infektionsapparat, dessen Schwanzfäden die
reversible Anheftung an, je nach Wirt unterschiedliche, Strukturen der Wirtszelloberfläche
ermöglichen (Dawes, 1975; Mutoh et al., 1978; Furukawa et al., 1979). Wiederholtes
Anheften und Abdissoziieren einzelner Schwanzfäden ermöglichen es dem Phagen, die
Bakterienzelle abzutasten, eine geeignete Infektionsstelle zu finden und schließlich
irreversibel an diese zu binden (Stent & Wollman, 1952; Goldberg et al., 1994). Im Anschluss
wird durch eine Kontraktion der Scheide die noch verschlossene zentrale Röhre bis an die
innere Zellmembran geschoben. Der Kontakt mit dem hier vorhandenen Phosphatdiglycerin
bewirkt dann die Freigabe der Röhre für den DNA-Durchtritt (Furukawa et al., 1979, 1983;
Furukawa & Mizushima, 1982). Die DNA wird schließlich durch das Membranpotential (ab
2
Einleitung
ca. 90 mV) angetrieben in die Wirtszelle transferiert (Labedan & Goldberg, 1979; Labedan et
al., 1980). Zur Umsetzung seiner genetischen Information greift T4 auf die wirtseigene RNAPolymerase zurück. Daher konkurrieren die frühen T4-Promotoren zunächst mit den
wirtseigenen Transkriptionsstartpunkten um dieses Enzym. Die Genprodukte der ersten
T4-Gene verändern die Spezifität des Transkriptionsapparates dann soweit, dass eine
sequentielle Genexpression ermöglicht wird (1.1.2).
Im Verlauf der fünf Minuten nach der Infektion einsetzenden DNA-Replikation kommt es zu
einer umfangreichen Rekombination, deren Resultat zahlreiche, verzweigte Konkatemere sind
(Frankel, 1966; Tomich et al., 1974; Broker et al., 1975; Dannenberg et al., 1983), aus denen
letztlich bei der Phagenassemblierung Einheitschromosomen nach dem "Kopf-voll"-Prinzip
ausgeschnitten werden (Rao & Black, 1988). Zeitgleich verläuft die Synthese der ca. 50
verschiedenen Phagenhüllproteine sowie einiger Assemblierungs-Helferproteine. Die neuen
Phagenpartikel werden in einem jetzt einsetzenden Selbstassemblierungs-Prozess erzeugt,
wobei sich zunächst die drei Substrukturen, Infektionsapparat, DNA-gefüllter Phagenkopf und
Schwanzfäden, bilden (Dickson, 1973; Kozloff et al., 1981; Black et al., 1994). Mit Hilfe der
Assemblierungsfaktoren, unter denen sich ein GroES ähnliches Chaperon (Gp31) befindet,
erfolgt dann ihr Zusammenschluss zu fertigen Virionen (van der Vies et al., 1994). Für diesen
Prozess hat sich zusätzlich zu den phagenkodierten Faktoren als einziges wirtskodiertes
Protein das Chaperon GroEL als essentiell herausgestellt (Zeilstra-Ryalls et al., 1991).
Mit der Lyse der Wirtszelle etwa 25 Minuten nach der Infektion und der damit verbundenen
Freisetzung von ca. 200 Phagenpartikeln endet der Infektionszyklus des Bakteriophagen T4.
1.1.2 Die sequentielle Genexpression
Das während des Infektionszyklus ablaufende genetische Programm und die damit
verbundene sequentielle Transkription verschiedener Gengruppen, gewährleisten zu jedem
Zeitpunkt das Vorhandensein einer ausreichenden Menge des gerade benötigten
Genproduktes. Erreicht wird dies durch drei Promotorklassen, die sich in frühe, mittlere und
späte Promotoren einteilen lassen. Der Bakteriophage verfügt über 38 frühe, hoch konservierte
Promotoren, die der E. coli Konsensussequenz sehr ähnlich sind und von der wirtseigenen
σ70-RNA-Polymerase
erkannt
werden
(Wilkens & Rüger, 1994).
Die
unmodifizierte
RNA-Polymerase transkribiert in vitro nur von den frühen, aber nicht von den mittleren und
späten T4-Promotoren. Die gesteigerte Selektivität der wirtseigenen Transkriptionsinitiation
zu Gunsten der frühen T4-Promotoren leistet das Phagenprotein Alt (Koch et al., 1995;
3
Einleitung
Sommer et al., 2000). Alt gelangt in ca. 25-50 Kopien zusammen mit der injizierten viralen
DNA in die Wirtszelle (Goff, 1979) und katalysiert innerhalb der ersten 30 s die ADPRibosylierung bzw. die Alteration einer der beiden α-Untereinheiten der RNA-Polymerase
(1.2.3) (Horvitz, 1974a; Rohrer et al., 1975). Zu den frühen Genprodukten gehören u.a.
DNasen zur Degradation des Wirtsgenoms (Carlson et al., 1986; 1993), der Antisigmafaktor
AsiA, der Transkriptionsaktivator MotA sowie die zwei ADP-Ribosyltransferasen ModA und
ModB. Die parallel zur Replikation beginnende mittlere Transkription nutzt teilweise noch
frühe Promotoren, wobei die Transkripte jedoch durch Antiterminationsfaktoren bis zu einer
Länge von 15 kb verlängert werden (Brody et al, 1970; Hinton, 1989; Hsu et al., 1990; Sanson
et al, 1992). Für die Erkennung der mittleren Promotoren sind schließlich die Proteine AsiA
und MotA essentiell. Sie hemmen die Erkennung der frühen Promotoren und bewirken so die
Umschaltung von der frühen auf die mittlere Transkription (Ouhammouch et al., 1995;
March-Amegadzie & Hinton, 1995). Gleichzeitig wird durch ModA die zweite α-Untereinheit
der RNA-Polymerase ADP-ribosyliert, wodurch wahrscheinlich die Beendigung der frühen
Transkription eingeleitet wird (Wilkens et al., 1997). Diese Modifikation ist ca. vier Minuten
nach dem Beginn der Infektion abgeschlossen (Goff, 1974; Horvitz, 1974b).
Die späte Transkription wird durch 21 sicher bekannte, sowie 21 postulierte späte Promotoren
reguliert und zusätzlich durch Einzelstrangbrüche positiv beeinflusst (Herendeen et al., 1989;
Williams et al., 1994). Die Nutzung dieser Promotoren erfordert den phagenspezifischen
σ-Faktor Gp55 und den T4 kodierten Co-Aktivator Gp33 (Horvitz, 1973; Ratner, 1974). Mit
diesen beiden Proteinen interagiert das als "sliding clamp" der T4 DNA-Polymerase bekannte
Gp45, welches dadurch eine Kopplung der Transkription an die Replikation bewirkt (Nossal,
1994; Young et al., 1996).
1.2 ADP-Ribosyltransferasen
Die Genexpression kann definiert werden als die Umwandlung von Information, die in einem
Molekül DNA vorliegt, in eine RNA oder ein Protein. Jeder Schritt in diesem Prozess könnte
durch die posttranslationale Modifikation spezifischer Proteine mit ADP-Ribose beeinflusst
werden. Genau wie im Fall der Phosphorylierung wird die kovalente Verknüpfung von
ADP-Ribose an Proteine mit der Regulation einer Vielzahl zellulärer Prozesse in Verbindung
gebracht (Williamson & Moss, 1990; Lautier et al., 1993; Shall, 1995).
4
Einleitung
Das Substrat für ADP-Ribosylierungsreaktionen, das intrazelluläre Co-Enzym NAD+, wurde
ursprünglich als Cozymase beschrieben (Warburg et al., 1935) und ist seit einigen Jahrzehnten
als wichtigster Wasserstoff-Donor oder -Akzeptor in verschiedenen metabolischen Reaktionen
bekannt. Die molekulare Struktur wurde 1936 durch von Euler et al. aufgeklärt. Die ersten
Hinweise, dass NAD+ als Substrat für kovalente Proteinmodifikationen dient, wurden ca. 30
Jahre später gefunden (Chambon et al., 1963; Fujimura et al., 1967; Nishizuka et al., 1967).
Eine ADP-Ribosylierung von Proteinen kann grundsätzlich auf zwei unterschiedliche Arten
erfolgen. Dient als Akzeptor der Reaktion Wasser, spricht man von der Glykohydrolyse des
NAD+ zu Nikotinamid und ADP-Ribose (Koch-Nolte & Haag, 1997). Das Hauptprodukt der
NAD+ Glykohydrolase-Aktivität, die ADP-Ribose, kann auf nicht-enzymatische Weise durch
reaktive nukleophile Aminosäuren an primäre Lysine oder Cysteine gebunden werden
(Ceveantes-Laurean et al., 1993; Cervantes-Laurean, 1996). Bei diesen Reaktionen handelt es
sich aber um in vitro Beobachtungen, die bei hohen ADP-Ribose-Konzentrationen erfolgen.
Ihre Signifikanz in Signalkaskaden lebender Zellen konnte nicht gezeigt werden (Frei &
Richter, 1988).
In diesem Zusammenhang spielt die zweite Art der ADP-Ribosylierung eine bedeutende
Rolle; dabei wird die ADP-Ribosylgruppe auf ein spezielles Akzeptorprotein übertragen, und
damit dessen biologische Aktivität beeinflusst. Katalysiert wird diese Reaktion durch ADPRibosyltransferasen, die wiederum als Mono- und Poly-ADP-Ribosyltransferasen klassifiziert
werden und in Prokaryonten, Eukaryonten sowie Bakteriophagen vorkommen (Shall, 1995;
Domenighini & Rappuoli, 1996; Ziegler, 2000).
Diese Art der Modifikation besitzt eine hohe medizinische Relevanz, da auf ihr die
Pathogenität verschiedener bakterieller Toxine beruht und durch diese Krankheiten wie
Diphtherie und Cholera hervorgerufen werden (Domenighini et al., 1994). In 2001 konnten
zwei neue potentielle Toxine in den Genomen von S. pyogenes und S.typhi identifiziert
werden (Pallen et al., 2001).
1.2.1 Mono-ADP-Ribosyltransferasen
Die Mono-ADP-Ribosylierung ist eine der posttranslationalen Modifikationen, die an
zellulären Regulationsprozessen, wie z.B. der Stickstoff-Fixierung in Prokaryonten, beteiligt
sind. Entdeckt wurde die Reaktion ursprünglich als die Ursache der durch das Diphtherie
Toxin blockierten Proteinsynthese (Honjo et al., 1968).
5
Einleitung
Mono-ADP-Ribosyltransferasen katalysieren die Hydrolyse von NAD+ und die Assoziation
der so gewonnenen ADP-Ribose an ganz spezifische Aminosäuren ihrer Zielproteine über
eine S- oder N-glykosidische Bindung. Das NAD+ wird dabei so innerhalb des aktiven
Zentrums gebunden, dass durch den Akzeptor ein nukleophiler Angriff auf die glycosidische
Bindung erfolgen kann (Abb. 1.1). Das neben der ADP-Ribose ebenfalls aus der Hydrolyse
des NAD+ hervorgehende Nikotinamid wird durch die Reaktion freigesetzt.
Abb1.1: Illustration des Prinzips der durch Mono-ADP-Ribosyltransferasen katalysierten Reaktion. Der ADP-Riboserest
wird unter gleichzeitiger Freisetzung des Nikotinamids
direkt auf das Akzeptorprotein transferiert. Die dabei
modifizierte Aminosäure ist nicht zwingend Arginin (siehe
Tab. 1.1).
Durch die Art der modifizierten Aminosäure können die Mono-ADP-Ribosyltransferasen in
verschiedene Kategorien eingeteilt werden (Rappuoli & Pizza, 1991). Einige gut untersuchte
bakterielle Toxine haben Modellcharakter für diese Klassifizierung, da diese spezifisch
Cystein-, Diphtamid- (modifiziertes Histidin), Asparagin- oder Arginin-Positionen der
Wirtsproteine modifizieren (Tab. 1.1).
6
Einleitung
Tab. 1.1: Dargestellt ist die Aminosäurespezifität verschiedener Mono-ADP-Ribosyltransferasen einiger Pround Eukaryonten.
Für Prokaryonten sind die Toxine aufgelistet, die als ADP-Ribosyltransferase fungieren, während für
Eukaryonten die Zellen oder Gewebe angegeben sind, in denen ADP-Ribosylierungsreaktionen
nachgewiesen wurden (Iglewski et al., 1984; Jacobson et al., 1990; Zolkiewska et al., 1992;
Cervantes-Laurean, 1995).
Akzeptor Aminosäure
Vorkommen in Prokaryonten
Vorkommen in Eukaryonten
Arginin
Vibrio cholerae Toxin
Kaninchen Skelettmuskulatur
Asparagin
Clostridium botulinum C3 Toxin
Cystein
Bordetella pertussis Toxin
Diphtamid
Corynebacterium diphtheriae Toxin Hamster-Niere
Ratten-Leber
Serin, Threonin
Ratten-Leber
Das Resultat dieser Modifikationen ist häufig eine Inaktivierung des Akzeptorproteins. In
einigen
Systemen
werden
die
ADP-Ribosereste
durch
korrespondierende
ADP-
Ribosylhydrolasen wieder abgespalten und die Proteine damit reaktiviert. Die Wichtigkeit
einer solchen Kaskade konnte im Falle des Regulationsmechanismus der Stickstoff-Fixierung
von Rhodospirillum rubrum gezeigt werden (Pope et al, 1985; Ludden & Roberts, 1989;
Ludden, 1994). Hier wird die Dinitrogenase-Reduktase aufgrund eines externen Stimulus
(Dunkelheit
oder
eine
Stickstoffquelle)
durch
die
Dinitrogenase-Reduktase-ADP-
Ribosyltransferase (DRAT) gehemmt, während die Reaktivierung durch die entgegenwirkende
Dinitrogenase-Reduktase-ADP-Ribose-Glykohydrolase (DRAG) erfolgt.
Einige Bakterien sekretieren Toxine mit ADP-Ribosyltransferase-Aktivität und ermöglichen
dadurch eine spezifische Modifikation von Proteinen der Wirtszelle (Moss & Vaughan, 1988).
Auffallender Weise sind durch diese Reaktionen häufig nukleotidbindende Proteine und vor
allem G-Proteine betroffen; z.B. modifiziert Pertussis Toxin das Cystein 347 der
α-Untereinheit von Gi,o. Dadurch wird dessen Interaktion mit seinem Rezeptor verhindert und
es kommt zur Unterbindung seiner physiologischen Funktion, nämlich der Inhibierung der
cAMP-Synthese (Katada & Ui, 1982; West et al., 1985).
In ähnlicher Weise wirkt das Cholera Toxin des Bakteriums Vibrio cholerae. Es katalysiert die
Modifikation eines Arginins der α-Untereinheit von Gs und inhibiert dadurch die GTPaseAktivität, was eine permanente Stimulation der Adenylat-Cyclase veranlasst (Abb. 1.2). Die
ansteigende cAMP-Konzentration führt letztlich zu einem massiven Na+- und Wasserverlust
(Ziegler, 2000). Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa und Diphtherie Toxin von
Corynebacterium diphtheriae zeigen eine spezifische Aktivität für das modifizierte Histidin
7
Einleitung
(Diphthamid) im Elongationsfaktor EF-2 (Collier, 1975; Moss & Vaughan, 1988). Die Folgen
dieser ADP-Ribosylierung sind dramatisch und führen zu einer irreversiblen Inhibierung der
Translation und damit zum Zelltod (Passador & Iglewski, 1994).
Abb 1.2:
Verschiedene
Modifikation eines heterotrimeren G-Proteins durch Mono-ADPRibosylierung am Beispiel des Cholera Toxins. Nach der Aufnahme in die
Wirtszelle katalysiert Cholera Toxin die ADP-Ribosylierung der
α-Untereinheit von Gs und blockiert dadurch dessen GTPase-Aktivität.
Das führt zu einer permanenten Stimulation der Adenylyl Cyclase (AC).
Die ansteigende cAMP-Konzentration resultiert in einem massiven
Natrium-und Wasserverlust.
Clostridien-Stämme
besitzen
ebenfalls
ADP-Ribosyltransferasen.
Die
Exoenzyme von Clostridium botulinum und C. limosum modifizieren jeweils Rho-Proteine an
einem bestimmten Asparagin (Sekine et al., 1989; Aktories, 1997). Andere Toxine,
einschließlich der von C. botulinum und C. perfringens, ADP-ribosylieren Aktin an einem
spezifischen Arginin (Arg177) (Vandekerckhove et al., 1987; 1988).
Einige Gene der hier beschriebenen bakteriellen Toxine stammen ursprünglich aus
Bakteriophagen und sind durch Gentransfer in das Genom der Bakterien übernommen
worden. Das Strukturgen des Cholera Toxins kommt aus dem filamentösen Phagen CTXphi,
der in das Chromosom von Vibrio cholerae integriert wird (Waldor & Mekelanos, 1996). Für
Diphtherie Toxin wurde gezeigt, dass es sich um ein Gen des lysogenen Phagen β handelt
(Uchida et al., 1971).
Von Bedeutung sind bakterielle ADP-Ribosyltransferasen auch im Zusammenhang mit
Antibiotika-Resistenzen. So besitzt Mycobakterium smegmatis eine ADP-Ribosyltransferase,
8
Einleitung
die als Zielprotein das Antibiotikum Rifampicin modifiziert und damit inaktiviert (Quan et al.,
1997; Morisaki et al., 2000).
Für verschiedene bakterielle ADP-Ribosyltransferasen ist es gelungen, die dreidimensionale
Struktur aufzuklären. Dabei handelt es sich um die Toxine von Pseudomonas aeruginosa
(PAETA), Corynebakterium diphteriae (DT), Bordetella pertussis (PT), Vibrio cholerae (CT)
und E. coli (LT) (Allured et al., 1986; Choe et al.,1992; Stein et al., 1994 ; Domenighini &
Rappuoli, 1996). Diese Enzyme sind aus zwei funktionell unterschiedlichen Domänen
aufgebaut, die A-Domäne mit der enzymatischen Aktivität und die B-Domäne zur Bindung an
die Oberflächenrezeptoren der Zielzellen.
Die Suche nach gemeinsamen Motiven innerhalb der Aminosäuresequenzen der ADPRibosyltransferasen und der bekannten kristallographischen Daten ergab, dass die NAD+Bindetasche sowie die an der Katalyse beteiligten Aminosäuren stark konserviert sind
(Domenighini et al., 1994). Die NAD+-Bindetasche wird aus einem β-Faltblatt und einer
darauf folgenden angewinkelten α-Helix gebildet (Abb. 1.3). Sie wird von zwei β-Faltblättern
umgeben, die eine Glutaminsäure und ein Arginin bzw. Histidin beinhalten, die für die
Katalyse notwendig sind.
Abb. 1.3: Die NAD+-Bindetasche bakterieller Toxine. Dargestellt
ist die Überlagerung des Aminosäure-Rückgrats der die
Kavität von LT (grün), DT (rot), PAETA (blau)
bildenden β/α-Motive. Das NAD (blau) wurde
entsprechend den Verhältnissen in der DT Struktur
eingefügt. Die konservierten Glu und Arg/His
Positionen interagieren mit NAD+ (aus Domenighini &
Rappuoli, 1996).
9
Einleitung
Die α-Helix der Bindetasche hat in den verschiedenen Enzymen jeweils eine unterschiedliche
Länge. Aufgrund der generellen Organisation der NAD+-Bindetasche und der Substrate
können die bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxine auch ohne ausgeprägte Homologien in
die zwei Hauptgruppen DT und CT unterteilt werden.
Zu der DT Gruppe gehören DT und PAETA, während die CT Gruppe unter anderen CT, LT,
PT und die ADP-Ribosyltransferase Alt der Bakteriophagen T2 und T4 enthält. Obwohl keine
großen Homologien in den Aminosäuresequenzen der Mitglieder der CT-Gruppe vorhanden
sind, lassen sich drei sehr ähnliche Regionen erkennen (Domenighini et al., 1994). In der
ersten Region ist das bereits beschriebene essentielle Arginin bzw. Histidin vorhanden. Der
Austausch dieser Position führt zu einem drastischen Aktivitätsverlust (Burnette et al., 1991;
Lobet et al., 1991; Han & Galloway, 1995). Die zweite Region enthält viele aromatische und
hydrophobe Aminosäuren, um so eine Interaktion mit den aromatischen Ringen des NAD+ zu
ermöglichen. Die für die Katalyse essentielle und vollständig konservierte Glutaminsäure ist
in der dritten Region lokalisiert. Bezüglich DT bzw. PAETA wurde für diese Position gezeigt,
dass durch eine Mutation von Glu148 in DT bzw. Glu553 in PAETA die Enzymaktivität
inhibiert wird, dabei der KM-Wert für NAD+ aber gleich bleibt (Tweten et al., 1985; Douglas
& Collier, 1987).
Neben
den
zahlreichen
und
gut
charakterisierten
prokaryontischen
Mono-ADP-
Ribosyltransferasen werden auch zunehmend eukaryontische Mono-ADP-Ribosyltransferasen
beschrieben. Interessanterweise handelt es sich bei den meisten dieser Proteine um Enzyme,
die an extrazellulären Regulationsprozessen beteiligt sind, da sie entweder über Glykosylphosphatidylinositol-Anker in der Membran lokalisiert sind oder sekretiert werden (Okazaki
& Moss, 1998).
Die ersten klonierten eukaryontischen Arginin-spezifischen Mono-ADP-Ribosyltransferasen
stammten aus der Skelettmuskulatur von Kaninchen und aus Hühner-Knochenmark
(Zolkiewska et al., 1992; Tsuchiya et al., 1994). Für Vertebraten konnten Mono-ADPRibosyltransferasen mittlerweile in verschiedenen Zelltypen beschrieben werden. Einige
wichtige Beispiele sind die glatte Muskulatur von Koronararterien bei Rindern (Li et al.,
1999), Erythroblasten von Hühnern (Davis & Shall, 1995) sowie die T-Zellen im
lymphatischen System bei Säugern (Koch-Nolte et al., 1997). Eine wichtige Funktion in
eukaryontischen Zellen ist z.B. die Beteiligung an der Apoptose von HL60 Zellen
(Lodhi et al., 2001). Die zunehmende Anzahl identifizierter eukaryontischer Mono-ADPRibosyltransferasen hat zur Einführung einer systematischen Nomenklatur geführt, in der die
10
Einleitung
Enzyme der Säugetiere mit ART bezeichnet und durchnumeriert werden (Haag & Koch-Nolte,
1997; Okazaki & Moss, 1998).
Auch in Mitochondrien wurden Mono-ADP-Ribosyltransferasen nachgewiesen (Frei &
Richter, 1988). So dient die Glutamat-Dehydrogenase als Akzeptor für eine cysteinspezifische
ADP-Ribosylierung, die zur Inhibition ihrer Aktivität führt. Die Reaktivierung erfolgt über
eine Mg2+-abhängige mitochondriale ADP-Ribosylcystein Hydrolase. Damit ist die GlutamatDehydrogenase das erste identifizierte, durch ADP-Ribosylierung regulierte mitochondriale
Protein (Herrero-Yraola A et al., 2001). Dies spricht für die bereits 1996 durch Okazaki &
Moss vorgeschlagene physiologische Regulation eukaryontischer Systeme durch ADPRibosylierungszyklen. Interessanter Weise ist die Glutamin Synthetase verschiedener
Bakterien, wie z.B. R. rubrum, ebenfalls das Ziel einer ADP-Ribosylierungsreaktion, die im
Verlust der Enzymaktivität resultiert (Moss et al., 1990; Ludden, 1994). Diese Beobachtungen
lassen vermuten, dass die ADP-Ribosylierung eine allgemeine Rolle in der Kontrolle des
Stickstoff-Metabolismus spielt und auch die Stickstoff-Balance bei Eukaryonten auf diese
Weise kontrolliert werden könnte (Herrero-Yraola et al., 2001).
1.2.2 Poly-ADP-Ribosyltransferasen
Die Enzyme der Familie der Poly-ADP-Ribosyltransferasen katalysieren die Synthese von
ADP-Ribose-Polymeren
und
deren
Verknüpfung
mit
Glutaminsäuren
in
den
Akzeptorproteinen (Oei et al., 1997; Shieh et al., 1998; Smith et al., 1998, Ame´ et al., 1999;
Smith, 2001).
Das bekannteste und bestuntersuchte Enzym ist die Poly-ADP-Ribosyltransferase 1 (PARP1),
die im Nukleus von vielen Eukaryonten vorkommt (Shall, 1995). PARP1 ist hier an einer
Vielzahl fundamentaler Prozesse zur Wahrung der funktionalen Integrität des Genoms
beteiligt, wie z.B. der Rekombination, der Genexpression, der Differenzierung und der
Apoptose (Lindahl et al., 1995; Oei et al., 1997; Jeggo, 1998; Scovassi & Poirier, 1999). Eine
unmittelbare Reaktion zeigt das 113 kDa große Enzym auf DNA-Schäden, die z.B. durch
alkylierende Agenzien oder ionisierende Strahlung erzeugt werden (Burkle, 2001). Das
Produkt der durch die PARP1 katalysierten Reaktion ist schematisch in Abbildung 1.4
dargestellt. Das Protein hat eine Reihe katalytischer Möglichkeiten, um diese Reaktionen zu
bewirken; an die Akzeptoraminosäure wird zunächst eine ADP-Ribose angehängt
(Abb. 1.4 a), gefolgt von der Verlängerung der Poly-ADP-Ribose-Kette an der 2´ Position der
vorangegangenen ADP-Ribose (Abb. 1.4 b). Ungefähr an jeder 25-sten ADP-Ribose erfolgt
11
Einleitung
eine Verzweigung der Polymerkette durch die zusätzliche Addition einer ADP-Ribose an der
3´ Position (Juarez-Salinas et al., 1983). Auf diese Weise entstehen ADP-RibosePolymerketten mit einer Länge von ca. 200 ADP-Ribose Einheiten (Hayashi et al., 1983). Der
Netto-Effekt dieser Addition negativ geladener Polymere ist eine drastische Veränderung der
Eigenschaften des Akzeptorproteins (Abb. 1.4 c). Als Zielproteine fungieren u.a. die
Topoisomerasen I und II sowie die DNA-Polymerasen α und β (Oei et al., 1997).
Abb. 1.4:
Schematische Darstellung der durch Poly-ADP-Ribosyltransferasen
katalysierten Reaktionen. a) ADP-Ribosylierung einer Glutaminsäure eines
Akzeptorproteins mit NAD+ als Substrat. Der ADP-Ribosylrest kann dann
als Akzeptor für die Addition der nächsten ADP-Ribose dienen. b) Synthese
eines negativ geladenen ADP-Ribose-Polymers. c) Multiple ADP-RibosePolymere verändern die Eigenschaften des Akzeptorproteins. Poly-ADPRibosylierung eines DNA-gebundenen Proteins kann die DNA-Bindung
durch elektrostatische Wechselwirkungen mit dem negativ geladenen
Polymer inhibieren (aus Smith, 2001).
12
Einleitung
Mittlerweile konnten eine ganze Reihe Mitglieder der PARP-Familie identifiziert werden,
deren subzellulären Lokalisationen auf neue, unerwartete Funktionen, z.B. in der TelomerReplikation und dem zellulären Transport, schließen lassen (Smith, 2001). Die vier weiteren
Mitglieder dieser Enzym-Familie sind: PARP2, PARP3, vault-PARP (VPARP) und Tankyrase
(Jacobson & Jacobson, 1999). Das Enzym PARP1 besitzt eine N-terminale DNABindedomäne mit zwei Zinkfinger-Motiven, eine interne Automodifkations-Domäne und eine
C-terminale katalytische Domäne (Smith, 2001). Unter normalen Bedingungen befindet sich
das inaktive Enzym frei im Nukleoplasma. DNA-Strangbrüche bewirken dann die Bindung an
die DNA und die Aktivierung der katalytischen Domäne, so dass eine Poly-ADPRibosylierung der PARP1 selbst erfolgt. Die entstehende negative Ladung des Polymers
bewirkt schließlich die elektrostatische Abstoßung des Enzyms von der DNA. Es wird
vermutet, dass die vorübergehende Bindung an die Stelle der geschädigten DNA die
eingeleitete DNA-Reparatur moduliert (Shall & Murcia, 2000).
Insgesamt ist die Rolle des NAD+ und die der ADP-Ribosyltransferasen in den letzten Jahren
ständig erweitert worden. Man geht heute davon aus, dass dieses Molekül bedeutende
Funktionen sowohl in der Energie-Transduktion als auch in Signal-Kaskaden hat. In der
Abbildung 1.5 sind die wesentlichen Zusammenhänge der NAD+-abhängigen SignalKaskaden schematisch dargestellt.
NAAD
NA
DS
ynt
has
e
?
NAADP
NAD Kinase
NMN+ATP
NMN-Adenylyl
transferase
NAD
NADP
ADP-Ribosyl Zyklase
ADP-Ribosyltransferasen
cADPR
cADPRP
Calzium Mobilisierung
Poly-ADPMono-ADPRibosyltransferasen Ribosyltransferasen
Abb. 1.5: Schematische Darstellung von NAD+-abhängigen Signal-Kaskaden. NAD+ dient als
Substrat für ADP-Ribosylierungsreaktionen und für die Synthese von zyklischer ADPRibose. NADP+ wird aus NAD+ durch eine Kinase gebildet. Dieses Enzym
phosphoryliert möglicherweise NAAD+ zu NAADP+, welches als Calzium
mobilisierende Komponente fungiert. ADP-Ribosyl-Zyklasen katalysieren die Bildung
von cADPR. Mono- und Poly-ADP-Ribosyltransferasen übertragen ADP-Ribose-Reste
auf Proteine.
13
Einleitung
In ähnlicher Weise wie NAD+ fungiert ATP als Substrat für kovalente Proteinmodifikationen
(Phosphorylierung) und ist dadurch an einer großen Zahl von Prozessen beteiligt, inklusive
der Regulation von metabolischen Stoffwechselwegen und der Kontrolle hochspezialisierter
Signalkaskaden (Ziegler, 2000). Zusätzlich dient es in Form von cAMP als "second
Messenger". Ein Vergleich dieser beiden Systeme lässt für die durch ADP-Ribosyltransferasen
katalysierten Reaktionen weitere, bisher noch nicht beschriebene, Beteiligungen an
Regulationsmechanismen erwarten.
1.2.3 Die ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt
Der Bakteriophage T4 kodiert für die drei ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt
(Seifert et al., 1969; Wilkens et al., 1997). Von großem wissenschaftlichen Interesse ist bis
heute der Zusammenhang dieser Enzyme mit der Kontrolle der Transkriptionsregulation.
Neben der Transkription scheint auch die Translation in noch nicht näher charakterisierter
Weise durch diese Enzyme beeinflusst zu werden (Depping, 1998; Tiemann et al., 1999).
Da eine alt- mod- Doppelmutante einen normalen Entwicklungszyklus aufweist (Goff &
Setzer, 1980), scheint die ADP-Ribosylierung von wirtseigenen und möglicherweise
T4-eigenen Proteinen nur unter speziellen Umweltbedingungen von Vorteil zu sein. Das
Vorhandensein
von
drei
ADP-Ribosyltransferase
Genen
und
der
aufwendige
Verpackungsmechanismus, mit dem das Alt Protein in den Phagenkopf und anschließend in
den Wirt gelangt, lassen zumindest auf eine nicht zu vernachlässigende Funktion schließen.
Die ADP-Ribosyltransferase Alt erzeugt innerhalb der ersten 30 s der Infektion an einer der
beiden α-Untereinheiten der wirtseigenen RNA-Polymerase die erste ADP-Ribosylierung
(Horvitz, 1974b). Sterische Behinderungen verhindern wahrscheinlich aufgrund der Größe des
Proteins, dass auch die zweite α-Untereinheit ADP-ribosyliert wird (Rohrer et al., 1975; Zillig
et al., 1977). Die ADP-Ribose wird dabei in vivo vorwiegend auf das Arginin 265 übertragen;
allerdings konnten mit geringerer Spezifität auch ADP-Ribosylierungen an den Positionen
Arginin 191 und Arginin 195 nachgewiesen werden (Goff, 1974; 1984; Ovchinnikov et al.,
1977). Das Arginin 265 liegt in der C-terminalen Region der α-Untereinheit der RNAPolymerase und ist zusammen mit den umliegenden Aminosäuren sowohl für die Erkennung
von UP-Elementen verschiedener Promotoren als auch der Interaktion mit Aktivatorproteinen
(z.B. CAP) verantwortlich (Busby & Ebright, 1994). Die Positionen Arginin 191 und
Arginin 195 befinden sich in der N-terminalen Domäne (Goff, 1984). Die Abbildung 1.6 zeigt
den C-terminalen Bereich der α-Untereinheit und die durch Alt übertragene ADP-Ribose.
14
Einleitung
Abb. 1.6: Darstellung der dreidimensionalen Struktur der
ADP-ribosylierten α-Untereinheit der E. coli
RNA-Polymerase. Die Aminosäure Arg 265 und
die ADP-Ribose sind als van der Waals Sphären
und der restliche Proteinteil als "Ribbons"
dargestellt. Die α-Helices sind markiert (1-4)
(aus Kamzolova et al., 2000).
Die Alteration der RNA-Polymerase löst die Umleitung des Enzyms von den wirtseigenen zu
den frühen T4 Promotoren aus (Koch et al, 1995). Dabei steigern T4-spezifische
Nukleotidsequenzen die Erkennung der frühen Promotoren durch die alterierte RNAPolymerase. Insbesondere Poly-Adenosin-Folgen in den "-52" und "-42" Bereichen sowie eine
erweiterte "-10" Region und ein Thymidin an der Position –33 scheinen hierfür eine wichtige
Funktion zu haben (Sommer et al., 2000).
Die Transkription des zwischen dem Gen 30 (DNA-Ligase) und dem Gen 54 (Basisplattenprotein) liegenden alt Gens selbst findet erst spät im Verlauf des Infektionszyklus statt
und führt zur Bildung eines 79 kDa Vorläuferproteins (Goff, 1979; Horvitz, 1974b). Während
der Assemblierung der Phagenpartikel erfolgt die proteolytische Spaltung zum aktiven 67 kDa
Protein und die Verpackung in den Phagenkopf (Coppo et al., 1973; Horvitz, 1974a).
Die ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit der RNA-Polymerase erfolgt durch das
Genprodukt ModA, dessen Gen hinter dem Promotor 13.149 liegt und mit dem davor
lokalisierten ModB Gen um ein Basenpaar überlappt (Wilkens et al., 1997). Sowohl ModA als
auch ModB konnten aufgrund von "Threading"-Experimenten den argininspezifischen ADPRibosyltransferasen zugeordnet werden (Wilkens et al., 1997). Die ADP-Ribosylierung durch
ModA ist nach vier Minuten vollendet (Goff, 1974; Horvitz, 1974b), und die Aktivität des
Enzyms nimmt anschließend stark ab (Skorko et al., 1977). Durch ModA können anders als
durch Alt beide α-Untereinheiten ADP-ribosyliert werden; es ist hier nur das Arginin 265
betroffen. Im Gegensatz zu Alt katalysiert ModA die Modifikation der anderen
15
Einleitung
RNA-Polymerase Untereinheiten allerdings nicht (Horvitz, 1974a; Goff & Setzer, 1980).
Neben der ADP-Ribosylierung einer Reihe noch nicht näher definierter Zielproteine führt
ModA zusätzlich noch eine Autoribosylierung durch (Tiemann et al., 1999). Insgesamt ist
diese ADP-Ribosyltransferase spezifischer als Alt, da durch sie insgesamt deutlich weniger
Proteine modifiziert werden.
Die ADP-Ribosyltransferase ModB zeigt ein überwiegend anderes Zielproteinspektrum als
ModA (Depping, 1998; Tiemann, 1999). Eine Modifizierung der α-Untereinheit der RNAPolymerase erfolgt durch ModB nicht, allerdings wurde gezeigt, dass das ribosomale Protein
S1 ADP-ribosyliert wird (Depping, 1998). Die Funktionen der durch ModB katalysierten
Modifikationen blieben indes noch ungelöst.
1.3 Aufgabenstellung
Durch die Klonierung der Gene der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt des
Bakteriophagen T4 wurde es möglich, eine genauere molekularbiologische und biochemische
Charakterisierung dieser Enzyme vorzunehmen (Koch, 1993; Tiemann, 1999). Um ein tieferes
Verständnis der molekularen Abläufe während des Infektionszyklusses und der damit
verbundenen Wechselwirkungen zwischen bakteriellen und viralen Proteinen zu erlangen,
sollten die ADP-Ribosyltransferasen im Hinblick auf ihre Funktion und Struktur eingehender
untersucht werden.
Die physiologische Funktion der ADP-Ribosyltransferasen beruht auf den von ihnen
modifizierten Proteinen. In einem ersten Ansatz zur Identifizierung des Zielproteinspektrums
der ADP-Ribosyltransferasen wurde mit dem ribosomalen Protein S1 ein Zielprotein für
ModB ermittelt (Depping, 1998). Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollten weiterführende
Analysen der Zielproteinspektren von ModA, ModB und Alt vorgenommen werden. Man
erhoffte sich, auf diese Weise deren Rolle in der Regulation der Transkription und der
Translation besser zu verstehen. Da die zweidimensionale Auftrennung der ADP-ribosylierten
wirtseigenen Proteine mit anschließender massenspektrometrischer Untersuchung ein guter
experimenteller Ansatz ist, die Zielproteine zu identifizieren, sollte die Methode der
hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese etabliert werden.
Um detaillierte Informationen über die Struktur der ADP-Ribosyltransferasen zu erhalten,
wurden zwei Strategien verfolgt.
16
Einleitung
-
Die
Kristallisation
und
Röntgenstrukturanalyse
sollte
die
Aufklärung
der
dreidimensionalen Proteinstruktur der ADP-Ribosyltransferasen ermöglichen. Dieser
Ansatz erforderte die Überexpression und Aufreinigung der jeweiligen Enzyme in
einer
Qualität
und
Quantität,
die
den
hohen
Anforderungen
von
Kristallisationsexperimenten genügten. Es sollte deshalb ein Protokoll erarbeitet
werden, das eine entsprechende Reinigung ermöglichte.
-
Der zweite Ansatz beruhte auf einem Alignment der Aminosäuresequenzen der
Phagenenzyme mit denen anderer ADP-Ribosyltransferasen. Obwohl die SequenzHomologien zwischen den bekannten ADP-Ribosyltransferasen nur sehr limitiert sind,
existieren gemeinsame Strukturen, die vornehmlich im Bereich des katalytischen
Zentrums zu finden sind. Um einen genaueren Einblick zu erhalten, welche
Aminosäuren von ModA und ModB an der Katalyse beteiligt sind, sollten
ortsgerichtete Mutagenesen durchgeführt und die enzymatische Aktivität der Mutanten
untersucht werden. Die Auswahl der auszutauschenden Aminosäuren sollte in den
Bereichen des Proteins erfolgen, in denen aufgrund des Alignments katalytisch
essentielle Positionen vorausgesagt wurden.
17
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien und Enzyme
Soweit nicht anders angegeben, wurden Chemikalien der Firmen J.T. Baker (Groß-Gerau),
Boehringer (Mannheim), Biomol (Hamburg), BioRad (Richmond, USA), Merck (Darmstadt,
Riedel-de Hæn (Hannover), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma (Deisenhofen)
verwendet.
Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und DNA-Polymerasen wurden von den
Firmen Boehringer (Mannheim), Gibco BRL (Neu-Isenburg), MBI-Fermentas (St. Leon-Rot),
Qiagen (Hilden) und Stratagene (La Jolla, USA) bezogen.
2.2 Geräte
Elektrophoresegeräte
Agarose-Gelkammern u. Zubehör (Werkstätten der
Ruhr-Universität Bochum)
EPS 3500 (APBiotech, Freiburg)
Power Pac 300 (BioRad, Richmond, USA)
Mini-Protean II u. 3 (BioRad, Richmond, USA)
Protean II XL (BioRad, Richmond, USA)
Protean IEF System (BioRad, Richmond, USA)
Elektroporator
Gene Pulse II (BioRad, Richmond, USA)
Geltrockner
Gel AirDryer (BioRad, Richmond, USA)
Inkubationsroller u. –schüttler
New Brunswick Scientific G10, Gio Gyrotory Shaker
(New Brunswick, Can)
PCR Mini-Cycler
MJ-Research PTC-150 (Biozym, H. Oldendorf)
pH-Meter
Typ pH526
Spektrophotometer
Navaspec II, APBiotech, Freiburg
Spektropolarimeter
J-715 (Jasco, Groß-Umstadt)
Ultraschallgerät
Branson Sonifier 250 (Branson, Ranbury, USA)
Branson Sonifier B-12 (Branson, Ranbury, USA)
Videodokumentation
GelPrint 2000i (UniEquip, München)
18
Material und Methoden
Western-Blot Apparatur
Mini-Trans-Blot Kammer (BioRad, Richmond, USA)
Western-Blot Apparatur ("semi-dry") Fastblot™ (Biometra, Göttingen)
Zentrifugen
Biofuge 13 (Heraeus, Osterode)
Biofuge pico (Heraeus, Osterode)
Sorvall RC-5B (Du Pont, Bad Homburg)
Alle weiteren hier nicht aufgeführten Geräte entsprachen dem üblichen Laborstandard.
2.3 Verbrauchsmaterialien
Chromatographie
Ni-NTA Agarose (Qiagen, Hilden)
IPG Streifen
ReadyStrip pH 3-10, pH 4-7, pH 5-8 (BioRad, Richmond, USA),
Rehydrierungsbehälter
(BioRad, Richmond, USA),
Mikrotiterplatter
Maxisorp (Nalge Nunc Intern., Wiesbaden)
Mineral Öl
(BioRad, Richmond, USA)
Molekularbiologische Kits
Qiaquick Gel Extraction (Qiagen, Hilden)
Quickchange Mutagenese (Stratagene, La Jolla, USA)
Nucleospin Extract (Macherey-Nagel, Düren)
Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel, Düren)
Molekulargewichtsmarker
100 bp Leiter Plus (MBI Fermentas, St.Leon-Rot)
10 kDa Leiter (Gibco BRL, Neu-Isenburg)
λ-Marker, EcoRI/HindIII (MBI Fermentas, St.Leon-Rot)
Precision Protein Standard™ (BioRad, Richmond, USA)
Prestained Protein Marker (NEB, Frankfurt a.M.)
Oligonukleotide
Gibco BRL, (Neu-Isenburg)
PVDF-Membran
Immobilon-P (Millipore, Bedford, USA)
Radiochemikalien
[32P]NAD+ spez. Aktivität : 800 Ci/mmol (NEN, Boston, USA)
Röntgenfilme
Fuji Medical X-Ray Film (Fuji, Tokyo, Japan)
Konica SR-H (Hohenbrunn)
19
Material und Methoden
2.4 Oligonukleotide
Bezeichnung
Sequenz
Seq-AP
AAACCAGATGACCATTCTTG
Seq-AT
CAAGAATGGTCATCTGGTTTT
Seq-BP
CAAGAATGGTCATCTGGTTT
Seq-BT
GAATGAAGCTCTTCATAAGC
T7-Promotor
TAATACGACTCACTATAGGG
p43-ModB-Anfang
CGGATCCATGATTATTAATCTTGCAG
p43-ModB-Ende
ATTGAGGTAGTTGAATGGCTCGAGC
Mut-B-R73A
CGCCTTATCAATTATATGCTGGTATATCAAAATCG
Mut-B-R73A-rev
CGATTTTGATATACCAGCATATAATTGATAAGGCG
Mut-B-E173A
GTGCGTGAACAAGCATGGATGATTCCAATTGG
Mut-B-E173A-rev
CCAATTGGAATCATCCATGCTTGTTCACGCAC
2.5 Bakterien- und Bakteriophagenstämme
Bakterienstamm
Genotyp
Herkunft
Referenz
BL21
E. coli B
Stratagene
Studier & Moffatt, 1986
Stratagene
Studier & Moffatt, 1986
F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal
BL21(DE3)
E. coli B
F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal
λ(DE3)
C41(DE3)
nicht näher definierte Mutante
Miroux & Walker, 1996
von BL21(DE3)
C43(DE3)
nicht näher definierte Mutante
Miroux & Walker, 1996
von BL21(DE3)
20
Material und Methoden
Bakterienstamm
Genotyp
Herkunft
Referenz
TOP10F´
F´ {lacIq Tn10 (TetR)} mcrA
Invitrogen
Δ(mrr-hsdRM-mcrBC)
Φ80lacZΔM15 ΔlacX74
recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL
(StrR) endA1 nupG
E. coli XL1 Blue
recA1 endA1 gyrA96 thi-1
Stratagene
Bullock et al., 1987
hsdR17 supE44 relA1
lac[F´proAB] lacIqZΔM15
Tn10(Tetr)]
Bakteriophagenstamm
T4
Wildtyp
Stammsammlung
2.6 Plasmide
Plasmid
pBlueskript II KS
pET-11d
pET-16b
pET-32b
pET-43a
pLysS
relevante Eigenschaften
allgemeiner Klonierungsvektor
Ampicillinresistenz
Expressionsvektor
T7 Promotor u. lac Operator
Ampicillinresistenz
Expressionsvektor
T7 Promotor u. lac Operator
N-terminaler His-Tag
Ampicillinresistenz
Expressionsvektor
T7 Promotor u. lac Operator
Thioredoxinfusion
C-terminaler His-Tag
Ampicillinresistenz
Expressionsvektor
T7 Promotor u. lac Operator
NusA-Fusion
Ampicillinresistenz
T7 Lysozym
Chloramphenicolresistenz
Referenz
Short et al., 1988
Studier & Moffatt, 1986
Rosenberg et al., 1987
Studier et al., 1990
Dubendorff & Studier, 1991
La Vallie et al., 1993
Harrison, 2000
Studier, 1991
21
Material und Methoden
Plasmid
pBN19
pGroESL
pT-GroE
pTKRI
p11modBB5
p16modB1
p16modB-R73A
p16modB-F111A
p16modB-F129A
p16modB-N130A
p16modB-Y131A
p16modB-E171A
p16modB-E173A
p16modB-R73A/E173A
p16modA7
p16modA-R72A
p16modA-F127A
p16modA-F129A
p16modA-E165A
p32modB3
p32modA2
p43modB
relevante Eigenschaften
DnaK
Tetracyclinresistenz
GroEL und GroES
Chloramphenicol
GroEL und GroES
Chloramphenicolresistenz
Alt
Kanamycinresistenz
basierend auf pET-11d
ModB
Ampicillinresistenz
basierend auf pET-16b
ModB
p16modB1 mit Mutation R73A
p16modB1 mit Mutation F111A
p16modB1 mit Mutation F129A
p16modB1 mit Mutation N130A
p16modB1 mit Mutation Y131A
p16modB1 mit Mutation E171A
p16modB1 mit Mutation E173A
p16modB1 mit Mutationen R73A/E173A
basierend auf pET-16b
ModA
p16modA7 mit Mutation R72A
p16modA7 mit Mutation F127A
p16modA7 mit Mutation F129A
p16modA7 mit Mutation E165A
basierend auf pET-32b
ModB
basierend auf pET-32b
ModA
basierend auf pET-43a
ModB
Referenz
Blum et al., 1992
Goloubinoff et al., 1989
Chang & Cohen, 1978
Koch et al., 1995
Tiemann, 1999
Tiemann, 1999
diese Arbeit
Depping, 1998
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
Depping, 1998
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
diese Arbeit
diese Arbeit
Tiemann, 1999
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
R. Nivinskas (Vilnius, Litauen)
Kaiser, 1999
Tiemann, 1999
diese Arbeit
22
Material und Methoden
2.7 Nährmedien
LB-Medium
SOC-Medium
1 % (w/v) Pepton
2 % (w/v) Pepton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v) NaCl
10 mM
NaCl
pH 7,5
2,5 mM
KCl
10 mM
MgCl2
2xYT-Medium
10 mM
MgSO4
1,6 % (w/v)
Pepton
20 mM
Glukose
1 % (w/v)
Hefeextrakt
pH 7,5
0,5 % (w/v)
NaCl
pH 7,5
2.8 Computer-Software
Zur Analyse der DNA- und Aminosäure-Sequenzen wurden folgende Programme eingesetzt:
1. DNAStar Programmpaket (DNAStar, Inc)
2. CloneManager (Scientific&Educational Software)
3. Tina 2.09 (Raytest Isotopenmessgeräte GmbH)
4. weitere frei im Internet verfügbare Programme und Datenbanken
Die
in
dieser
Arbeit
wiedergegebenen
Bilder
wurden
unter
Verwendung
von
Bildbearbeitungsprogrammen (Coral Draw 7.0 und Photo Paint 7.0, Corel Corporation
Limited, Canada) in das Dokument eingefügt. Die entsprechenden Originalgele, -filme und
-blotmembranen wurden mit Hilfe einer Videodokumentationsanlage digitalisiert.
Im Verlauf der Datenerfassung und -verarbeitung kam es zu keiner inhaltlichen Veränderung
der Abbildungen.
Die Anfertigung dieser Arbeit erfolgte mit Hilfe der Programme des Microsoft Office 2000
(Microsoft Corporation, Redmont, USA) Programmpakets.
23
Material und Methoden
2.9 Arbeiten mit Bakterien und Phagen
2.9.1 Anzucht von Bakterien
Die
Anzucht
von
Übernachtkulturen
erfolgte
in
5-20
ml
Flüssigmedium
bei
Inkubationstemperaturen zwischen 30 °C und 37 °C im Inkubationsschüttler oder -roller bei
220 Upm. Dem Flüssigmedium wurden gegebenenfalls Antibiotika zur Selektion zugegeben.
2.9.2 Herstellung kompetenter E. coli Zellen zur Elektroporation (Calvin &
Hanawalt, 1988)
2 x 200 ml 2x YT-Medium wurden 1 %-ig aus einer Bakterienübernachtkultur des
entsprechenden Stammes angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln (220 Upm) bis zu einer
OD590 von 0,5 - 0,8 inkubiert. Die Zellen wurden 15 min auf Eis gestellt, anschließend in
GSA-Becher überführt und bei 4000 x g für 15 min bei 4 °C sedimentiert. Der Überstand
wurde vollständig verworfen und die Zellen wurden in 200 ml eiskaltem, sterilem A. dest.
gewaschen. Nach einer erneuten Zentrifugation folgte ein weiterer Waschschritt mit 100 ml
eiskaltem, sterilem A. dest. Die Bakterien konnten jetzt in 4 ml 10 % (v/v) Glyzerin
aufgenommen und auf je vier 2 ml Eppendorfgefäße verteilt werden. Anschließend erfolgte
eine Zentrifugation für 15 min mit 3000 x g bei 4 °C und die Resuspension der
Bakterienpellets in 125 µl 10 % (v/v) Glyzerin, so dass die Zelldichte bei 1-3 x 1010 Zellen pro
ml lag. Die Bakterien wurden zu Aliquots von je 40 µl in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bei –80 °C für bis zu 6 Monate gelagert.
2.9.3 Elektrotransformation von E. coli-Zellen (Calvin & Hanawalt, 1988)
Die elektrokompetenten Zellen wurden mit 1 µg Plasmid-DNA, bzw. 10 µl eines
Ligationsansatzes vermischt und in eine eisgekühlte Elektroporationsküvette (EquiBio 2 mm,
Peqlab, Erlangen) überführt. Ligationsansätze wurden zuvor durch Dialyse (Millipore,
0,025 µm Porengröße) gegen A. dest. entsalzt. Nach erfolgter Transformation wurden die
Bakterien in 1 ml SOC-Medium (2.7) aufgenommen und zur phänischen Expression der
plasmidkodierten Antibiotikaresistenzen für 1 Stunde bei 37 °C und 220 Upm inkubiert. Je
24
Material und Methoden
nach eingesetzter DNA-Menge wurden 50-200 µl der Bakteriensuspension auf entsprechenden
Selektivmedien ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
2.9.4 Herstellung hitzeschockkompetenter Zellen mittels CaCl2 (Dagert &
Ehrlich, 1979)
400 ml LB-Medium wurden aus einer Übernachtkultur 1 %-ig angeimpft und bei 37 °C auf
einem Schüttler inkubiert, bis eine OD590 von ca. 0,37 erreicht war. Anschließend wurden die
Zellen sedimentiert (7 min, 1600 x g, 4 °C) und in 40 ml eiskalter CaCl2-Lösung (60 mM
CaCl2, 15 % (w/v) Glyzerin, 10 mM MOPS) resuspendiert. Nach einer weiteren
Zentrifugation für 5 min bei 4 °C und 1100 x g wurden die Zellen ein weiteres Mal in 40 ml
CaCl2-Lösung aufgenommen und für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluss an die
darauffolgende Zentrifugation wurde das Zellpellet in 8 ml CaCl2-Lösung resuspendiert und in
Aliquots zu je 100 µl bei -80 °C eingefroren.
2.9.5 Hitzeschocktransformation (modifiziert nach Cohen et al., 1972)
100 µl hitzeschockkompetenter Zellen wurden mit Plasmid-DNA (ca. 1 µg) versetzt und für
30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden im Anschluss einem zweiminütigen Hitzeschock
bei 42 °C ausgesetzt. Nach einer Abkühlphase von ca. 5 min erfolgte die Zugabe von 1 ml
SOC-Medium und die phänische Expression auf einem Schüttler bei 37 °C für eine Stunde.
Anschließend wurde ein Aliquot des Transformationsansatzes auf einem geeignetem
Selektionsmedium ausplattiert.
2.9.6 Plasmidstabilitätstest der pET-Vektoren
Vor der Induktion von pET-Vektoren konnte die Kultur auf den Anteil der Bakterien (Stamm:
BL21(DE3)) untersucht werden, die das Plasmid noch trugen und das rekombinante Protein
exprimieren könnten. Dazu wurden Verdünnungen der Bakterienkultur auf unterschiedlichen
Agarplatten ausplattiert (siehe Tab. 2.1).
25
Material und Methoden
Tabelle 2.1: Im Plasmidstabilitätstest verwendete Agarplatten und die zu erwartenden Koloniezahlen.
LB-Agar-Platte
ohne Zusatz
mit 100 µg/ml Ampicillin
Verdünnung
2 x 10-4
2 x 10-4
erwartetes
Wachstum in %
100
100
mit 1 mm IPTG
10-3
<2
mit 100 µg/ml Ampicillin und
1 mM IPTG
10-3
< 0,01
Wachstum von:
alle Zellen
Zellen mit Plasmid
Zellen ohne Plasmid oder
Mutanten, die die Ziel-DNA
nicht mehr exprimieren
können
Mutanten, die die Ziel-DNA
nicht mehr exprimieren
können
2.9.7 Überprüfung der Transformanden auf ihre Expressionsfähigkeit
Die Expressionsfähigkeit der Transformanden konnte mit einem leicht modifizierten
Plasmidstabilitätstest (2.9.6) überprüft werden. Dazu wurden die Transformanden in einem
Raster (69 Kolonien/Platte) auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin sowie auf solche
mit 100 µg/ml Ampicillin und 1 mM IPTG übertragen. Die Kolonien ohne einen Gegenpart
auf den IPTG-haltigen Agarplatten waren in der Lage das entsprechende Protein zu
exprimieren, und wurden von den nicht IPTG-haltigen Agarplatten für die Überexpression
angeimpft.
2.9.8 Überprüfung der Toxizität von ModA und ModB sowie deren Mutanten
Um Hinweise über die Toxizität von ModA und ModB sowie deren Mutanten zu erhalten,
wurde eine weitere Variante des Plasmidstabilitätstests (2.9.6) eingesetzt. Für diesen Test
wurde die nicht genau definierte Mutante C41(DE3) des Stammes BL21(DE3) verwendet
(Miroux & Walker, 1996). Diese Mutante hat die Fähigkeit, auch unter induzierten
Bedingungen Kolonien zu bilden, da vermutlich die Prozessivität oder die Menge der
gebildeten T7 RNA-Polymerase reduziert ist.
Zur Überprüfung der Toxizität wurden die zu untersuchenden Plasmide in C41(DE3)
transformiert und auf Selektivmedium mit und ohne 1 mM IPTG ausplattiert.
26
Material und Methoden
2.9.9 Anzucht von Bakterien zur Induktion und Überexpression von Proteinen
Für Überexpressions-Experimente wurden E. coli-Stämme verwendet, die das Gen der T7RNA-Polymerase durch den lysogenen λ-Phagen DE3 im Genom integriert haben (2.5). Zur
Verwendung kamen die Stämme BL21(DE3), C41(DE3) und C43(DE3), die in der Regel
noch das Plasmid pLysS enthielten. Auf diesem Plasmid ist das Gen für das T7 Lysozym
vorhanden, welches als natürlicher Inhibitor der T7-RNA-Polymerase dient und damit eine
stringente Kontrolle der Überexpression ermöglicht.
500 ml Selektivmedium wurden aus einer Übernachtkultur 1-2 %-ig angeimpft und bei 30 °C
oder 37 °C inkubiert (220 Upm) bis eine OD590 von 0,5 erreicht wurde. Die Induktion erfolgte
durch die Zugabe von IPTG (0,3 mM bis 1,5 mM Endkonzentration). Anschließend wurden
die Kulturen bei 30 – 37 °C für 2-3 h bebrütet.
2.10 Arbeiten mit DNA
2.10.1 Plasmidisolierung
Zur Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli-Kulturen wurden Plasmid Isolations Kits der
Firmen Qiagen (Hilden), Macherey-Nagel (Düren) und Boehringer (Mannheim) nach
Angaben des Herstellers verwendet.
Desweiteren wurden die Methoden nach Birnboim & Doly (1979) und Goode & Feinstein
(1992) (Schnellisolierung) eingesetzt.
2.10.2 Enzymatische Modifikation von DNA
Enzymatische Modifikationen von Plasmid-DNA wie Restriktionsverdau, Ligation, und
Dephosphorylierung erfolgten nach den Angaben der entsprechenden Enzymhersteller
(GibcoBRL, Neu-Isenburg; MBI Fermentas, St. Leon-Rot; Boehringer, Mannheim) oder nach
Ausubel et al. (1993).
2.10.3 Agarosegelelektrophorese
Die elektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge zu
analytischen oder präparativen Zwecken erfolgte in Flachbettgelkammern (9 x 10 x 0,5 cm)
27
Material und Methoden
mit Agarosekonzentrationen von 0,8 % - 2 % in TAE-Laufpuffer. Die Proben wurden vor der
Elektrophorese mit einem entsprechenden Volumen 10x DNA-Probenpuffer versetzt und bei
einer konstanten Stromstärke von 80 mA für 0,5–2 h aufgetrennt. Anschließend wurden die
Gele in einem Ethidiumbromidbad (1 mg/ml) gefärbt und die DNA unter UV-LichtBestrahlung betrachtet. Ein Größenstandard (100 bp-Leiter oder EcoRI/HindIII-restringierte λDNA (2.3)) wurde zur Abschätzung der Fragmentlängen mitgeführt.
10x DNA-Probenpuffer
10x TAE
12 % (w/v) Glyzerin
400 mM
Tris pH 7,6
0,02 % (w/v) Bromphenolblau
10 mM
Essigsäure
in 1x TAE
2
EDTA
mM
2.10.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte nach der elektrophoretischen
Auftrennung (2.10.3) mittels des "NucleoSpin Extract" Kits (Macherey-Nagel) nach Angaben
des Herstellers.
2.10.5 Herstellung von Vektoren mit einem T-Überhang
Die Herstellung von T-Vektoren erfolgte mit einem Protokoll von Marchuk et al. (1991) ,das
nach Hadjeb & Berkowit (1996) verändert wurde.
PCR-Produkte, die mittels Amplifikation durch eine Taq-Polymerase synthetisiert werden,
besitzen an ihren 3´-Enden A-Überhänge. Diese Eigenschaft kann genutzt werden, um eine
Klonierung dieser Fragmente in Vektoren mit einem T-Überhang am 3´-Ende vorzunehmen.
Die Herstellung von sogenannten "T-Vektoren" erfolgte durch eine Linearisierung des Vektors
pBluescript II KS mittels der Restriktionsendonuklease EcoRV und die Verlängerung des 3´Endes um ein Thymidin durch Inkubation (2 h, 72 °C) des Restriktionsansatzes mit 5
Enzymeinheiten Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) und 20 mM dTTP in PCR-Puffer (Qiagen,
Hilden) in einem Gesamtvolumen von 100 µl. Im Anschluss erfolgte die Reinigung der
T-Vektoren
durch
eine
Phenol-Chloroform-Extraktion
und
Ethanolfällung
(Sambrook et al., 1989). Das getrocknete Pellet wurde in 30 µl Puffer (5 mM Tris-HCl, pH
8,5) resuspendiert. Um Vektoren ohne den gewünschten T-Überhang zu entfernen, wurde eine
Selbstligation (2.10.2) durchgeführt . Die linearen T-Vektoren wurden anschließend in einer
28
Material und Methoden
Agarosegelelektrophorese (2.10.3) von den ligierten Vektoren getrennt und aus dem
Agarosegel extrahiert (2.10.4).
Alternativ zu den auf pBKS basierenden T-Vektoren wurden auf dem Vektor pCR2.1
aufbauende T-Vektoren des TA Cloning® Kits (Invitrogen; Carlsbad, USA) eingesetzt. Die
Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
2.10.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Zur Amplifikation des modB Gens aus dem Genom des Bakteriophagen T4 wurde die
Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet. Als DNA-Matrize wurde T4 DNA verwendet,
die anstelle des 5´-Hydroxymethyl-Cytosins Cytosin beinhaltet (Cyt-DNA aus T4 alc563 [42(amC87), 56- (amE51), denB- (amS19), alc (unf39)]). Die Aufreinigung der DNA erfolgte in
unserer Arbeitsgruppe durch U. Aschke-Sonnenborn.
Die PCR wurde nach folgendem Standard-Protokoll durchgeführt:
1. 30 s
95°C
2. 2 min
5-10 °C unter der Schmelztemperatur der Startermoleküle
3. 1 min
72 °C
4. gehe zu 1)
35 mal
5. 10 min
72 °C
Die Reaktionsansätze setzten sich im Allgemeinen folgendermaßen zusammen:
Komponente
µl
T4Cyt-DNA (XhoI-hydrolysiert) 10 ng/µl
1
10x Puffer (15 mM MgCl2)
5
je 2,5 mM dNTP´s
5
"Primer" 1 (10 pmol/µl)
2,5
"Primer" 2 (10 pmol/µl)
2,5
Taq-Polymerase (2 U/µl)
0,5
A. dest
33,5
2.10.7 Aufreinigung von PCR-Produkten
Die während einer PCR amplifizierten DNA-Fragmente wurden über Silica-Säulen
(NucleoSpin Extrakt; Macherey-Nagel) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Zur
29
Material und Methoden
Überprüfung der Qualität der Reinigung wurde die DNA mittels Agarosegelelektrophorese
(2.10.3) überprüft.
2.10.8 Ortsgerichtete Mutagenese
Zur Durchführung der ortsgerichteten Mutagenese wurde das "QuickChange™ Site-Directed
Mutagenesis Kit" (Stratagene, La Jolla (USA)) nach den Angaben des Herstellers verwendet.
Dabei wurden die unter 2.4 aufgeführten Oligonukleotide als Mutagenese-"Primer" eingesetzt.
Um ein optimales anhybridisieren der "Primer" zu ermöglichen wurde das Standard PCRProtokoll abgewandelt.
PCR-Protokoll
1)
30 s
95 °C
2)
1 min
40 °C
2 min
↓ Temperaturerhöhung bis auf
68 °C
3)
13 min
68 °C
4)
gehe zu 1)
16 mal
Nach erfolgter Amplifikation wurde die methylierte, nicht mutierte Parental-DNA durch
DpnI-Verdau hydrolysiert. Die anschließend verbliebenen mutagenisierten Plasmide wurden
in E. coli XLI-Blue transformiert und auf Selektivmedium ausplattiert. Zur Identifizierung
positiver Klone wurde die Plasmid DNA isoliert (2.10.1) und sequenziert (2.10.9).
2.10.9 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von Plasmid-DNA wurde nach der Didesoxymethode (Sanger et al., 1977)
mit dem "Auto Read Sequencing Kit" (Pharmacia, Freiburg) auf einem A.L.F.Express
(Pharmacia, Freiburg) am Lehrstuhl für Molekulare Neurobiologie durchgeführt. Die
Auftrennung erfolgte in 5,5 %-Polyacrylamid / 6 M Harnstoffgelen bei 50 °C. Die fluoreszenzmarkierten Reaktionsprodukte wurden während der Gelelektrophorese nach Anregung
durch einen Laserstrahl automatisch detektiert (Ansorge et al., 1986; 1987).
2.11 Präparation und Analyse von Proteinen
30
Material und Methoden
2.11.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Kolorimetrisch nach Bradford (1976)
Die Bestimmung von Proteingemischen oder gereinigtem Protein erfolgte nach der Methode
von Bradford (1976). Dazu wurden 1-10 µl der Probe mit A. dest in einem Ansatzvolumen
von 200 µl verdünnt, mit 2 ml Bradfordreagenz versetzt und für 10 min inkubiert. Die
Messung erfolgte photometrisch bei einer OD595. Die Proteinkonzentration wurde anhand
einer mit Rinderserumalbumin erstellten Eichgerade bestimmt.
Bradfordreagenz:
10 % (v/v) Phosphorsäure
5
% (v/v) Ethanol
0,01 % (w/v) Coomassie Brillantblau G-250
Kolorimetrisch mittels BCA-200 Protein Assay Kit
Die Konzentration von gereinigtem Protein wurde anhand des BCA-200 Protein Assay Kits
(Pierce, Illinois (USA)) nach den Angaben des Herstellers ermittelt.
Spektroskopisch
Proteinkonzentrationen von gereinigtem Protein wurde alternativ auch spektroskopisch bei
einer OD280 bestimmt. Die zur Berechnung der Proteinkonzentration notwendigen Werte
(1A280= x µg Protein) wurden mit Hilfe des Programms Protean (DNAStar, Inc) kalkuliert.
2.11.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970)
Die eindimensionale Auftrennung von Proteinen wurde in einem diskontinuierlichen
Gelsystem (MiniPROTEAN II,bzw. 3) nach Laemmli (1970) nach Angaben des Herstellers
durchgeführt. Es kamen 4 %-ige Sammelgele und, auf die Proben abgestimmt, 8 - 15 %-ige
Trenngele zum Einsatz. Zur Denaturierung der Proteine und deren Beladung mit SDS wurden
die Proben mit 1x SDS-Probenpuffer gemischt und für 5 min gekocht. Die Elektrophorese
erfolgte in Tris-Glycin Laufpuffer (200V / ca. 45 min). Die Gele wurden im Anschluss mittels
Coomassie Brillantblau (2.12.4.1) oder Silbernitrat (2.12.4.2) gefärbt.
31
Material und Methoden
Sammelgel (4%)
Trenngel (13%)
0,5 ml
1,25 ml
3,25 ml
25 µl
20 µl
10 µl
3,25 ml
2,5 ml
4,25 ml
40 µl
40 µl
20 µl
Rotiphorese 29:1 (40%)
4x Sammelgelpuffer
A. dest
20 % (w/v) SDS
10 % (w/v) APS
TEMED
Rotiphorese 29:1 (40%)
4x Trenngelpuffer
A. dest
20 % (w/v) SDS
10 % (w/v) APS
TEMED
4x Sammelgelpuffer
4x Trenngelpuffer
0,5 M
1,5 M
Tris-HCl pH 6,8
Tris-HCl pH 8,8
5x SDS-Probenpuffer
Tris-Glycin Laufpuffer
10 % (v/v)
5 % (v/v)
3 % (w/v)
0,5 % (w/v)
62,5 mM
25 mM
190 mM
0,1 % (w/v)
Glyzerin
β-Mercaptoethanol
SDS
Bromphenolblau
Tris, pH 6,8
Tris
Glycin
SDS
2.11.3 Zweidimensionale Elektrophorese mit immobilisierten pH-Gradienten
Eindimensionale Trenntechniken wie z.B. die SDS-Gelelektrophorese sind leistungsfähige
Methoden zur Trennung und Charakterisierung von Proteinen. Die eindimensionalen
Elektrophoresen können jedoch im günstigsten Fall nur ca. 50-100 Proteinbanden gleichzeitig
auftrennen. Zur elektrophoretischen Auftrennung und Darstellung von Reaktionsansätzen, in
denen zellulärer Rohextrakt eingesetzt wurde, kam deshalb die zweidimensionale
Elektrophorese nach Görg (1985) zum Einsatz. Mit dieser Methode ist es möglich, ganze
Zellinhalte in viele hundert Proteinspots aufzutrennen. Um diese Auftrennung zu erreichen,
werden zwei unabhängige Kriterien miteinander kombiniert, nämlich Ladung (Isoelektrische
Fokussierung)
und
Molekulargewicht
(SDS-PAGE).
Diese
hochauflösende
2-D
Elektrophorese unterscheidet sich grundsätzlich von der klassischen 2-D Elektrophorese nach
O´Farrell (1975). Die isoelektrische Fokussierung wird hier nicht in mit Trägerampholyten
erzeugten pH-Gradienten, sondern in immobilisierten pH-Gradienten (IPG) durchgeführt
(Bjellqvist et al., 1982; Görg et al. 2000).
Isoelektrische Fokussierung (Erste Dimension)
Die isoelektrische Fokussierung erfolgte je nach Versuchsbedingungen in IPG-Streifen mit
linearen pH-Gradienten von pH 3-10, pH 4-7 oder pH 5-8 und einer Trennstrecke von 7 cm
32
Material und Methoden
bzw. 17 cm. Die IPG-Streifen wurden zunächst in Rehydrierungspuffer rehydriert (12 h ,
20 °C). Die Rehydrierung erfolgte entweder passiv ohne angelegte Spannung oder aktiv bei
einer Spannung von 50V. Das dafür benötigte Puffervolumen war 350 µl für 17 cm IPGStreifen bzw. 125 µl für 7 cm IPG-Streifen. Die Probenaufgabe erfolgte mittels zweier
unterschiedlicher Verfahren. Entweder wurde die Proteinprobe in Lysispuffer gelöst und mit
dem Rehydrierungspuffer appliziert oder sie wurde nach beendeter Rehydrierung seitlich
neben den aufgequollenen IPG-Streifen in die Fokussierungskammer gegeben. Als
Proteinprobe wurde aufgereinigtes Protein (2.12.5) oder TCA-gefälltes Protein aus ADPRibosyltransferasetests (2.14.1) verwendet. Die gefällten Proteine wurden zuvor in 40 µl
Lysispuffer solubilisiert. Um ein Austrocknen der Streifen bzw. die Auskristallisierung von
Harnstoff zu verhindern, wurde sowohl bei der Rehydrierung als auch bei der eigentlichen
Fokussierung eine ausreichende Menge Silikonöl (BioRad, Richmond (USA)) auf die Streifen
pipettiert. Die Isoelektrische Fokussierung wurde bei 20 °C und 0.05 mA pro Streifen nach
den Angaben des Herstellers in einer PROTEAN® IEF-Cell (BioRad, Richmond (USA))
durchgeführt.
Folgende
Parameter
wurden
für
die
unterschiedlichen
IPG-Streifen
programmiert:
7 cm IPG-Streifen
17 cm IPG-Streifen
Programmschritt Spannung [V]
Zeit [h]
Programmschritt
Spannung [V]
Zeit [h]
1
200
1
1
200
1
2
500
1
2
500
1
3
4000
2,5
3
10000
3,5
optional schließt sich ein Halteschritt bei 500 V an
Die IPG-Streifen wurden im Anschluss an die Fokussierung mit A. bidest. gespült und
konnten dann für die zweite Dimension verwendet oder zur späteren Nutzung bei -80 °C
eingefroren werden.
Rehydrierungspuffer
Lysispuffer
8
M Harnstoff
9 M Harnstoff
0,5
%
2
CHAPS
%
CHAPS
33
Material und Methoden
15
mM DTT
1 % DTT
0,2
% Biolyte 3-10
0,8 % Biolyte 3-10
0,001 % Bromphenolblau
5 mM Pefabloc
SDS-PAGE (zweite Dimension)
Für die zweite Dimension wurden homogen vernetzte 12 %-ige Polyacrylamidgele ohne
Sammelgel verwendet und die Elektrophorese in einem Puffersystem nach Laemmli (1970)
über Nacht in einer PROTEAN® II Zelle (BioRad, Richmond (USA)) durchgeführt. Die
Gießkassette wurde so mit der Gellösung befüllt, dass ein ca. 1,5 cm breiter Streifen frei blieb,
der ein leichtes Auflegen der IPG-Streifen ermöglichte. Das SDS-Gel wurde nach dem Gießen
mit 1 ml wassergesättigtem 2-Butanol überschichtet, um eine glatte Gelkante zu erzeugen. Die
Polymerisation des Gels erfolgte für ca. 2-3 H.
Bevor die IPG-Streifen für die zweite Dimension auf das SDS-Polyacrylamidgel gelegt
wurden, mussten diese äquilibriert werden. Die Äquilibrierung erfolgte in zwei Schritten:
Zunächst wurden die IPG-Streifen für 10-15 min in Äquilibrierlösung + DTT (1% (w/v)) und
anschließend für 10-15 min in Äquilibrierlösung + Iodacetamid (260 mM) geschüttelt. Die
äquilibrierten IPG-Streifen wurden kurz in A. dest getaucht und luftblasenfrei auf das SDSGel gelegt. Um die IPG-Streifen in dieser Position zu fixieren, wurden sie mit Agarose (0,5 %
in Elektrodenpuffer) überschichtet. Zur Gewährleistung eines optimalen Proteintransfers von
der ersten auf die zweite Dimension, wurde die Stromstärke für 45 min auf 20 mA pro Gel
begrenzt. Die Trennung erfolgte dann bei konstant 150 V für 16 H.
Äquilibrierungspuffer
10x Elektrodenpuffer
6
0,1
M Harnstoff
% SDS
30 % (w/v) Glycerol
0,025 M Tris
2
0,192 M Glycin
% SDS
0,05 M Tris-HCl pH 8,8
pH 8,3
12 % SDS-Gel
Trenngelpuffer
16 ml Acrylamid/Bis-Acrylamid (30%, 37,5:1)
1,5 M Tris-HCl pH 8,8
10 ml Trenngelpuffer
0,4 % SDS
34
Material und Methoden
13,8 ml A. dest
0,2 ml 20 % SDS
2.11.4 Färbung von Proteingelen
Nach einer Elektrophorese müssen die aufgetrennten Proteine sichtbar gemacht werden. Die
Proteine wurden als gefärbte Komplexe nach ihrer Reaktion mit Farbstoff (Coomassie) oder
Silbersalzen detektiert.
2.11.4.1 Kolloidale Coomassiefärbung
Die SDS-Gele wurden nach einer eindimensionalen Elektrophorese für 5-10 min in die
Coomassie-Färbelösung gegeben und unter Schütteln gefärbt. Der Gelhintergrund wurde im
Folgenden durch mehrmaliges Wechseln der Entfärbelösung für 2-3 h entfärbt und
anschließend in A. dest gespült.
Coomassie-Färbelösung
Entfärbelösung
45,5 % (v/v) Essigsäure
30 % (v/v) Methanol
9
7,5 % (v/v) Essigsäure
% (v/v) Methanol
0,25 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G250
2.11.4.2 Silberfärbung nach Nesterenko et al. (1994) (modifiziert)
Zur Silberfärbung von SDS-Mini-Gelen wurde die Methode nach Nesterenko (1994)
angewendet. Zunächst wurde das Gel für 5 min in die Fixierlösung gegeben und im Anschluss
mit A. dest. gespült (3x 5 s, 1x 5 min, 3x 5 s). Nach einer Vorbehandlung mit 50 % Azeton für
5 min und Na2S2O3-Lösung für 1 min wurde erneut mit A. dest. gespült. Die Färbung des Gels
erfolgte dann für 8 min in der Färbelösung. Ein weiterer Waschschritt mit A. dest. (2x 5 s)
bereitete das Gel auf die Entwicklung vor. Diese wurde für 10 – 30 s in Entwicklerlösung
durchgeführt und durch Transfer des Gels in 1 %-ige Essigsäure gestoppt.
Fixierlösung
Na2S2O3-Lösung
60 ml 50 % (v/v) Aceton
100 µl 10 % (w/v) Na2S2O3
35
Material und Methoden
1,5 ml 50 % (w/v) TCA
60 ml A. dest.
25 µl 37 % Formaldehyd
Färbelösung
Entwicklerlösung
0,16 g AgNO3
1,2 g NaCO3
0,6 ml 37 % Formaldehyd
25 µl 37 % Formaldehyd
60 ml A. dest.
25 µl 10 % (w/v) Na2S2O3
60 ml A. dest.
2.11.4.3 Silberfärbung nach Blum et al. (1987) (modifiziert)
Die SDS-Gele der zweiten Dimension wurden aufgrund der besseren Kompatibilität mit
Methoden der Proteinidentifizierung mittels Silberfärbung nach Blum et al. (1987) angefärbt.
Das Gel wurde für mindestens 1 h fixiert (40 % Methanol, 10 % Essigsäure) und anschließend
zweimal in Ethanol (30 %) und einmal in A. bidest. für jeweils 20 min gewaschen. Es folgte
eine einminütige Inkubation in Na2S2O3-Lösung (0,02 % (w/v)) und ein weiterer Waschschritt
mit A. bidest. (3 x 20 s). Die Färbung wurde im Anschluß für 20 min in Färbelösung
durchgeführt und dann wiederum in A. bidest. gewaschen (3 x 20 s). Für die Entwicklung
wurde das Gel in Entwicklerlösung überführt und für 3-5 min inkubiert. Nach einem
Waschschritt in A. bidest. wurde die Entwicklung mit 1 %-igem Glycin gestoppt (5 min) und
das Gel dreimal für 10 min mit A. bidest. gewaschen.
Färbelösung
Entwicklerlösung
0,2 % (w/v) AgNO3
3
% (w/v) NaCO3
0,02 % Formaldehyd (37%)
0,05
% Formaldehyd
0,0005 % (w/v) Na2S2O3
2.11.5 Aufreinigung von "His-Tag"-Proteinen
Die Proteine ModA und ModB sowie deren Mutanten lagen nach ihrer Expression im
Cytoplasma der exprimierenden Zellen nicht in löslicher Form vor, sondern als unlösliche
Einschlusskörper ("Inclusion Bodies"). Die Einschlusskörper wurden deshalb zunächst
vorgereinigt und anschließend in eine lösliche Form überführt. Die renaturierten Proteine
36
Material und Methoden
konnten unter nativen Bedingungen über eine immobilisierte Metallchelat-AffinitätsChromatographie gereinigt werden.
2.11.5.1 Aufschluss von Bakterien und Präparation von Einschlusskörpern
Die aus einer 500 ml Überexpressionskultur mittels Zentrifugation (4000 x g, 20 min, 4 °C)
geernteten Zellen wurden in 10 ml Aufschlusspuffer resuspendiert und mit Ultraschall
(100 W, 3x 45 s) aufgeschlossen. Während dieser Prozedur wurden die Zellen ständig gekühlt,
um eine Proteindenaturierung zu verhindern.
Im Anschluss an den Zellaufschluss wurden die Einschlusskörper mittels Zentrifugation
(3000 x g, 4 °C, 20 min) sedimentiert und dadurch von Zellresten und löslichen Proteinen
getrennt. Die auf diese Weise gewonnenen "Inclusion Bodies" wurden in IB-Waschpuffer
resuspendiert und eine Stunde auf Eis gelagert und in regelmäßigen Abständen durch
Vortexen gemischt. Es folgte eine weitere Zentrifugation bei 10000 x g für 20 min bei 4 °C
und die Aufnahme der Einschlusskörper in Denaturierungspuffer.
Denaturierungspuffer
100 mM Tris
2
M
Harnstoff
pH 12,0
Aufschlusspuffer
IB-("Inclusionbody")-Waschpuffer (Hlodan et al., 1991)
50 mM NaH2PO4, pH 8,0
50 mM
Tris-HCl pH 7,5
300 mM NaCl
2
EDTA
10 mM Imidazol
100 mM
NaCl
1
mM DTT
1
Harnstoff
2
mM PMSF
0,05 %
mM
M
1
mM
1
mM
(w/v) Deoxycholat
DTT
PMSF
0,5 mg/ml Lysozym
2.11.5.2 Renaturierung von Einschlusskörper-Protein
Die im Denaturierungspuffer aufgenommenen Einschlusskörper (2.11.5.1) wurden auf eine
Proteinkonzentration von 1-3 mg/ml eingestellt. Die Renaturierung dieser Proteine erfolgte im
Verlauf einer ca. 16-stündigen Dialyse bei 4 °C in Dialyseschläuchen mit einer
Ausschlussgröße von 12-16 kDa (Dialysemembran Typ 20, Biomol, Hamburg) gegen 1 Liter
37
Material und Methoden
Lysis-Puffer. Nach der Dialyse weiterhin vorhandene unlösliche Bestandteile wurden durch
Filtration (0,45 µm Filter) entfernt.
Lysis-Puffer
50 mM NaH2PO4
300 mM NaCl
2
M Harnstoff
pH 8,0
2.11.5.3 Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie
Die Reinigung von Proteinen, die über einen "His-Tag" verfügen, erfolgte durch die
immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie (Porath et al., 1975; Porath 1992).
Diese Methode basiert auf der Eigenschaft einer hohen Affinität von Oligo-Histidinen (5-10 in
Reihe) zu zweiwertigen Ionen. Für die Reinigung von Proteinen unter nativen Bedingungen
wurde Ni-NTA- (Nickel-Nitrilotriacetic Acid) Agarose (Qiagen, Hilden) nach Angaben des
Herstellers verwendet. Die an das Säulenmaterial gebundenen Proteine konnten durch
Einwirkung von Imidazol wieder von der Säule eluiert werden.
Bevor das zuvor renaturierte Protein (2.11.5.2) auf die Säule geladen werden konnte, wurde
die Säule (2 ml) mit Lysis-Nativ-Puffer äquilibriert. Nach dem Auftragen des Proteins auf die
Säule wurde diese mit bis zu 6 Säulenvolumen Lysis-Nativ-Puffer gewaschen. Im Anschluss
erfolgte die Elution der gebundenen Proteine in jeweils 5 Säulenvolumina Elutionspuffer mit
ansteigender Imidazol-Konzentration (50 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM). Jeweils 2 ml
Fraktionen wurden gesammelt und mittels SDS-PAGE auf ihren Proteingehalt analysiert.
Fraktionen, die das gewünschte Protein enthielten, wurden vereinigt und gegen Dialyse-Puffer
über Nacht dialysiert. Die Lagerung der gereinigten Proteine erfolgte bei -20 °C.
Lysis-Nativ-Puffer
Elutionspuffer
50
mM
NaH2PO4
50
mM NaH2PO4
300
mM
NaCl
300
mM NaCl
Imidazol
50-250 mM Imidazol
10-20 mM
pH 8,0
pH 8,0
38
Material und Methoden
Dialyse-Puffer
50
mM
Tris-Acetat
500
mM
NH4Cl
1
mM
EDTA
10
mM
β-Mercaptoethanol
50
% (v/v) Glyzerin
pH 7,5
2.11.6 Transfer von Proteinen auf Membranen (Western-Blot)
Der Transfer von Proteinen aus SDS-Gelen erfolgte auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)Membranen durch das Anlegen eines elektrischen Feldes (Elektroblotten). Im Anschluß an
den Transfer der Proteine auf eine Membran sind diese einer Färbung, Immunodetektion und
Mikrocharakterisierung zugänglich. Es kamen zwei verschiedene Verfahren zur Anwendung:
2.11.6.1 Western Blot nach eindimensionaler SDS-PAGE
Die im Verlauf einer eindimensionalen SDS-PAGE in einem Gel aufgetrennten Proteine
wurden in einer Mini-Trans-Blot-Kammer (BioRad, Richmond (USA)) nach dem sogenannten
"Tank-Blot"-Verfahren auf die PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde zunächst für
5 s in Methanol getränkt, 2 min in A. dest. gespült und für 5 min in Dunn-Carbonat Puffer
äquilibriert. Das MiniTrans-Blot®-Modul (BioRad, Richmond (USA)) wurde nach den
Angaben des Herstellers zusammengesetzt und in der Blot-Kammer fixiert. Nach Zugabe des
eiskalten Dunn-Carbonat Puffers erfolgte der Transfer der Proteine auf die Membran für 15
min bei 150 mM und 30 min bei 300 mA. Die Membran konnte durch eine Inkubation (2-3
min) in Blotfärbelösung angefärbt werden und anschließend der Hintergrund mittels Spülen in
Entfärbelösung entfärbt werden.
Transferpuffer
10 mM NaHCO3
3 mM Na2CO3
39
Material und Methoden
20 % Methanol
Blotfärbelösung
Entfärbelösung
0,1 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R250
30 % (v/v) Methanol
45 % Methanol
7,5 % (v/v) Essigsäure
10 % Essigsäure
2.11.6.2 Western Blot nach zweidimensionaler SDS-PAGE
Die Proteine aus SDS-Gelen der zweiten Dimension wurden aufgrund der Größe (20 x 20 cm)
dieser Gele nicht mit Hilfe des Tank-Blot-Verfahrens, sondern durch das "Semi-Dry-Blotting"
auf die Membran überführt. Zunächst wurde die PVDF-Membran für einige Sekunden in
Methanol angefeuchtet und anschließend zweimal für je fünf Minuten in A. dest gewaschen,
bevor sie in "Semi-Dry"-Blotpuffer für fünf Minuten äquilibriert wurde. Der Aufbau der BlotApparatur (Fastblot™, Biometra) erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Der
elektrophoretische Transfer wurde bei 0,8 mA pro cm2 Gelfläche durchgeführt. Nachdem der
Blot-Vorgang beendet war, wurde die Membran dreimal für fünf Minuten in 0,9 % NaCl
gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Durch eine Färbung mit Coomassie
Brillant Blue (2.11.6.1) konnten die membrangebundenen Proteine sichtbar gemacht werden.
"Semi-Dry"-Blotpuffer
50 mM
Tris
50 mM Borsäure
10 %
Methanol
pH 8,3
2.11.7 Nachweis von rekombinanten "His-Tag" Proteinen
Zum Nachweis von rekombinanten Proteinen, die über einen "His-Tag" verfügen, wurde
"Ni-NTA-Horseradish Peroxidase (HRP)-Konjugat" (Qiagen, Hilden) bzw. der Penta-His™
Antikörper (Qiagen, Hilden) verwendet. Sowohl das Konjugat als auch der Antikörper
besitzen eine hohe Affinität zu aufeinanderfolgenden Histidinresten. Im Fall des Konjugats
erlaubt die Aktivität der gekoppelten Peroxidase die Detektion der rekombinanten Proteine
40
Material und Methoden
anhand von Chemilumineszenz. Bei Verwendung des Antikörpers ist eine Detektion je nach
eingesetztem Zweit-Antikörper über Chemilumineszenz oder Farbreaktion möglich.
Detektion mittels Ni-NTA(HRP) Konjugat:
Nach erfolgtem Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran (2.11.6) wurde diese zweimal
für 10 Minuten in TBS-Puffer, eine Stunde in Block-Puffer und weitere dreimal für je 10
Minuten in TBS-Tween Puffer gewaschen. Im Anschluss erfolgte eine einstündige Inkubation
in einer 1/1000 Verdünnung der Ni-NTA Konjugat-Stocklösung (Qiagen, Hilden) gefolgt von
dreimaligem Waschen für 10 Minuten in TBS-Tween Puffer. Die Membran wurde zusammen
mit 1 ml ECL-Reagenz (APBiotech, Freiburg) in durchsichtige Folie überführt. Die Detektion
der "His-Tag" Proteine erfolgte durch 5-20 sekündige Exposition eines Röntgenfilms auf der
Folie. Die Schwärzung des Röntgenfilms zeigte die Lokalisation des rekombinanten "HisTag" Proteins an.
TBS-Puffer
TBS-Tween-Puffer
10 mM Tris-HCl pH 7,5
20
150 mM NaCl
500 mM
mM
Tris-HCl pH 7,5
NaCl
0,05 % (v/v) Tween 20
Block-Puffer
3 % (w/v) RSA
in TBS-Puffer
Detektion mittels Penta-His™-Antikörper
Die PVDF-Membran wurde zweimal 10 Minuten in TBS-Puffer gewaschen und anschließend
für eine Stunde in Block-Puffer2 inkubiert. Danach wurde zweimal 10 Minuten in TBSTween/Triton und einmal 10 Minuten in TBS-Puffer gewaschen. Zur Bindung des Penta-HisAntikörpers erfolgte eine Inkubation für eine Stunde in einer 1/2000 (v/v) Verdünnung (in
Block-Puffer). Im Anschluss erfolgten zwei weitere Waschschritte für jeweils 10 Minuten in
TBS-Tween/Triton und einmal für 10 Minuten in TBS. Der Zweit-Antikörper (Ziege-AntiMouse-HRP) wurde in 10 % (w/v) Milchpulver in TBS 1/3000 (v/v) verdünnt und die
Membran in dieser Lösung für eine Stunde inkubiert. Um nicht gebundene Antikörper zu
entfernen, schlossen sich vier Waschschritte in TBS-Tween/Triton für jeweils 10 Minuten an.
Die Detektion erfolgte wie oben bereits beschrieben.
41
Material und Methoden
TBS-Tween/Triton
Block-Puffer2
20 mM
10 % (w/v) Milchpulver in TBS
Tris-HCl pH 7,5
500 mM
NaCl
0,05 % (v/v) Tween 20
0,2 % (v/v) Triton X-100
2.12. ADP-Ribosyltransferase Aktivitätstests
Die Aktivität der aufgereinigten ADP-Ribosyltransferasen wurde durch den Einsatz von zwei
unterschiedlichen NAD+-Varianten als Substrat überprüft.
2.12.1 Aktivitätstest mit 32PNAD+
Die ADP-Ribosyltransferase Aktivität der Proteine ModA, ModB und Alt sowie
verschiedener Mutanten wurde in ADP-Ribosyltransferasetests nach Rohrer et al. (1975)
ermittelt. Die Ansätze wurden im Allgemeinen wie in Tabelle 2.2 dargestellt
zusammengestellt. Als Substrat wurde in diesen Tests
32
P-markiertes NAD+ verwendet. Die
Reaktionen fanden in einem Volumen von 100 µl und einer Inkubationszeit von 30 – 90 min
bei 15 °C bzw. RT statt. Um die Reaktionen zu stoppen, wurden die Proteine durch Zugabe
von 40 µl 50 %-iger (w/v) Trichloressigsäure gefällt und durch Zentrifugation (13000 Upm,
10 min, RT) sedimentiert. Das Präzipitat wurde mit 0,5 ml Aceton (70 %, v/v) ein- bis dreimal
gewaschen (Zentrifugation für 5 min bei RT) und luftgetrocknet. Danach konnten die Proteine
in 40-80 µl SDS-Probenpuffer resuspendiert und anschließend für 5 Minuten gekocht werden.
Aliquots dieser Ansätze wurde durch SDS-PAGE (2.11.2) analysiert und das Gel mit
Coomassie Brillant Blau gefärbt (2.11.4.1). Das daraufhin getrocknete Gel wurde dann auf
einem Röntgenfilm für einen Zeitraum von 16 h bis zu einer Woche exponiert.
Tabelle 2.2: Allgemeine Zusammensetzung des 32PNAD Aktivitätstests
lösliche E. coli (BL 21) Rohextraktproteine
10x Transferasepuffer
32
PNAD+ (1 µCi)
ADP-Ribosyltransferase (5 – 30 µg)
42
Material und Methoden
10x Transferasepuffer
500 mM Tris-Acetat pH 7,5
100 mM Magnesium-Acetat
220 mM NH4Cl
10 mM EDTA
10
mM
β-Merkaptoethanol
2.12.2 Aktivitätstest mit biotinylierten NAD (bNAD)
Der Aktivitätstest folgte im Wesentlichen dem unter 2.12.1 beschriebenen Protokoll. Als
Substrat wurde in diesen Ansätzen allerdings nicht radioaktives, sondern biotinyliertes-NAD
(Pierce, Rockport (USA)) in einer Konzentration von 50 pM eingesetzt. Die nach dem ADPRibosylierungstest in einer SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden mittels Western-Blot
(2.11.6.1) auf eine PVDF-Membran transferiert. Anschließend wurde die Membran für 1 h in
Block-Puffer3 inkubiert und dann je zweimal in PBST-Puffer gewaschen. Danach wurde die
Membran für 30 min in einer in Antikörper-Lösungspuffer 1/1000 verdünnten StreptavidinHRP Lösung geschüttelt, je zweimal für 5 min in PBST-Puffer gewaschen sowie in BARLösung (BioRad, Richmond (USA)) für 10 min inkubiert. Es folgten 2-4 Waschschritte in
20 % DMSO/PBST-Puffer und 1-2 Waschschritte in PBST-Puffer für jeweils 5 min. Die
Membran wurde dann in Streptavidin-HRP für 30 min geschüttelt und zweimal für je 5 min in
PBST-Puffer gewaschen. Die colorimetrische Detektion erfolgte durch die Zugabe von 1:10
verdünntem Opti-4CN-Konzentrat (BioRad, Richmond (USA)) und Opti-4CN-Substrat (0,2
ml/10 ml Lösung) (BioRad, Richmond (USA)). Die Membran inkubierte unter leichtem
Schütteln für 30 min und wurde anschließend in A. bidest für 15 min gewaschen.
10x PBST-Puffer
Block-Puffer3
100 mM Na2HPO4
10 mM Na2HPO4
1,5 M NaCl pH 7,4
150 mM NaCl pH 7,4
1 % Tween
1 % (w/v) Casein
Antikörperlösungs-Puffer
BAR-Lösung
1 % RSA in PBST
50 % 2x Verstärkerlösung (BioRad, Richmond (USA))
43
Material und Methoden
25 % 4x BAR-Lösung (BioRad, Richmond (USA))
25 % A. dest
2.12.3 Nachweis der ADP-Ribosylierung mittels Mono-ADP-Ribosyltransferase-Antikörpern
Der Antikörper R-28 zum Nachweis von Mono-ADP-Ribosylresten wurde von Dr. K.K.
McMahon (Departement of Pharmacology, Lubbock, Texas) zur Verfügung gestellt. Für die
Detektion wurde die Membran in TBS-Puffer mit 3 % Milchpulver (w/v) für 1 h geschüttelt.
Anschließend wurde mit TBS-Puffer für 20 min gewaschen. Der Antikörper wurde in TBSPuffer mit 1 % Milchpulver (w/v) 1:1000 verdünnt und über Nacht bei RT inkubiert. Danach
erfolgten zwei Waschschritte in TBS-Puffer für mindestens 20 min. Als Zweitantikörper
(1:5000 in TBS-Puffer/1 % Milchpulver) kam ein Ziege/Antikaninchen-Antikörper, der mit
HRP konjugiert war, zum Einsatz (1 h, RT). Nach zwei weiteren Waschschritten konnte die
Membran mit ECL-Reagenz entwickelt werden.
TBS-Puffer
20 mM Tris
pH 7,4
500 mM NaCl
2.12.4 Aktivitätstest mittels ELISA ("Enzyme-linked Immunosorbent Assay")
Um die Aktivität des ModB-Wildtyp und seiner Mutanten vergleichen zu können, wurde ein
ELISA-Test entwickelt. Die ModB-Mutante R73A wurde als Zielprotein auf die Oberfläche
einer Mikrotiterplatte gebunden und die ADP-Ribosylierung durch ModB-wt bzw. ModBMutanten bestimmt. Die Mutante ModB R73A kam als Zielprotein in Betracht, weil diese die
durch ModB katalysierte Autoribosylierung nicht mehr durchführt.
In jedes "well" einer "96-well"-Mikrotiterplatte wurden 100 µl einer Resuspension der ModB"knock-out"-Mutante R73A in PBSN-Puffer gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Es
44
Material und Methoden
folgten vier Waschschritte mit PBS-Puffer und die Absättigung von freien Bindestellen durch
ELISA-Blockpuffer für 1,5 h bei RT. Nach drei weiteren Waschschritten mit PBS-Puffer
wurde in jede Öffnung ein ADP-Ribosylierungsansatz (2.12.2) mit biotinyliertem-NAD
pipettiert. Es wurden jeweils Doppelansätze mit 0 µg, 2 µg, 10 µg, 15 µg, und 20 µg der zu
testenden ADP-Ribosyltransferase durchgeführt (30 min / RT). Anschließend wurde viermal
mit PBS-Puffer gewaschen, danach 50 µl einer in ELISA-Blockpuffer 1/500 verdünnten HRPStreptavidin-Lösung (BioRad, Richmond (USA)) hinzugegeben und für 30 min bei RT
inkubiert. Nach weiteren vier Waschschritten mit PBS-Puffer wurde die Mikrotiterplatte
invertiert und 50 µl TACS-Sapphire™ (R&D Systems, Wiesbaden) als Substrat hinzugefügt.
Der Verlauf des Substratumsatzes innerhalb von 30 min wurde durch photometrische
Messung (µQuant-Photometer, Bio-Tek Instruments Inc.) der Zunahme der OD630 bestimmt.
Die Auswertung der Messwerte erfolgte mit Hilfe des Programms Mikrowin 3.0 (Mikrotek
Laborsystem GmbH).
PBS-Puffer
PBSN-Puffer
137 mM NaCl
137 mM NaCl
2,7 mM KCl
2,7 mM KCl
4,3 mM Na2HPO4
4,3 mM Na2HPO4
1,4 mM KH2PO4
1,4 mM KH2PO4
0,005 % NaN3
ELISA-Blockpuffer
0,05 % Tween 20
0,25 % RSA
in PBS-Puffer
2.13 Circulardichroismus (CD)-Spektroskopie
Zur experimentellen Bestimmung der Verteilung von Sekundärstrukturen der ADPRibosyltransferase ModB und deren Mutanten wurde die Methode der CD-Spektroskopie
eingesetzt. Optisch aktive Substanzen absorbieren links- und rechtsdrehendes polarisiertes
Licht leicht unterschiedlich, so dass die Differenz der molaren Absorptionskoeffizienten
gemessen werden kann. Diese Differenz wird als Elliptizität bezeichnet und steht in
Abhängigkeit zur Schichtdicke der Küvette und der Konzentration der Probe. Nimmt man die
45
Material und Methoden
Elliptizität in Abhängigkeit zur Wellenlänge auf, so erhält man ein CD-Spektrum (CottonEffekt).
Die
charakteristischen
CD-Spektren
von
Proteinen
wurden
in
einem
Wellenlängenbereich von 190 bis 250 nm gemessen. Die unbekannte Verteilung von
Sekundärstrukturen der untersuchten Proteine wurde durch mathematische Anpassung ihrer
CD-Spektren an Spektren von Proteinen mit bekannter Struktur errechnet.
Die Proteine wurden gegen 5 mM NaH2PO4 pH 8,0 dialysiert und die Proteinkonzentration
durch Zentrifugationsfiltration auf 0,05 mg/ml eingestellt. Die Aufnahme der CD-Spektren
wurde am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen (Prof. Dr. Rögner, Ruhr-Universität
Bochum), unter Verwendung eines Jasco SS-338 CD-Spektrometers (Groß-Umstadt) und der
in Tabelle 2.3 aufgeführten Parameter durchgeführt. Die Schichtdicke der Küvette betrug
0,2 cm.
Tabelle 2.3.: Allgemeine Parameter
Spektroskopie.
Wellenlängenbereich
Auflösung
Bandweite
Schrittweite
Empfindlichkeit
Response
Geschwindigkeit
Messwiederholungen
für
die
Durchführung
der
CD-
190-250 nm
1 nm
1 nm
0,5 nm
100 mdeg
4s
100 nm/min
10
Die Bestimmung der Verteilung der Sekundärstrukturen in den Proben erfolgte durch das
Programm "Protein Secondary Estimation Programm" der Firma Jasco (Groß-Umstadt). Als
Referenzdatensatz dienten die Spektren von Yang et al. (1986).
2.14 Kristallisation
Kristallisationsexperimente wurden in Zusammenarbeit Dr. Virginie Guegen-Chaignon und
Dr. Solange Moréra im Laboratorium für Enzymologie und strukturelle Biochemie am CNRS
in Gif-sur-Yvette (Paris, Frankreich) durchgeführt. Nach der „hanging drop“-Methode wurden
5-10 µg Protein in einem Tropfenvolumen von 3-5 µl (Reservoirvolumen 1 ml) bei ca. 16 °C
verwendet. Es wurden diverse Pufferbedingungen eingesetzt und auf Kristallbildung der
Proteine überprüft.
46
Material und Methoden
2.15 N-terminale Sequenzierung von Proteinen (Edman-Abbau)
Die Identifizierung von Proteinen auf PVDF-Membranen erfolgte in Zusammenarbeit mit Dr.
A. Sickmann (Institut für Physiologische Chemie, Ruhr-Universität Bochum). Die das Protein
enthaltenden Membranbereiche wurden ausgeschnitten; die Bestimmung der Primärstruktur
erfolgte anschließend mittels N-terminaler Aminosäure-Sequenzierung nach Edman (1970) in
einem ABI CLC 493 Protein-Sequenzierer (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Foster City,
CA).
2.16 Massenspektrometrie
Im Verlauf der Arbeiten wurden unterschiedliche massenspektrometrische Verfahren
angewandt.
2.16.1 Nano-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (ESI-MS)
2.16.1.1 Bestimmung des Molekulargewichts von His-ModB und Trx-ModB
Die massenspektrometrischen Untersuchungen zur Bestimmung der Gesamtmassen der
Proteine ModB und Trx-ModB wurden durch Dr. Markus Piotrowski am Lehrstuhl für
Pflanzenphysiologie (Ruhr-Universität Bochum) durchgeführt. Die Proteinproben wurden
durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion mit Zip-Tips C4 (Millipore) nach den Angaben des
Herstellers entsalzt und mit 2 µl 60 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert. Die
Analyse
erfolgte
mit
einem
Quadrupol-Flugzeitmessungs-Hybrid-Massenspektrometer
(QTOF2, Micromass, Manchester, UK).
2.16.1.2 Identifikation von Zielproteinen der ADP-Ribosyltransferase Alt
Zur Identifikation der Zielproteine von Alt wurden ESI-MS Analysen in Kooperation mit
Dr. C. Lohaus (Institut für Physiologische Chemie, Ruhr-Universität Bochum) durchgeführt.
Die aus einem 2D-Gel (2.11.3) gewonnenen Gelstücke wurden für jeweils 10 min in VerdauPuffer (10 mM NH4HCO3, pH 7,8) und Verdau-Puffer/Acetonitril (1:1 v/v) gewaschen. Dieser
Vorgang wurde dreimal wiederholt. Ein letzter Waschschritt mit Acetonitril bewirkte das
Einschrumpfen der Gelstücke, die anschließend mit 2 µl Protease-Lösung (Trypsin 0,05 µg/µl
47
Material und Methoden
in Verdau-Puffer) wieder aufgequollen wurden. Der tryptische Verdau erfolgte dann über
Nacht. Die tryptischen Peptide wurden im Folgenden mittels "reversed phase" nanoHPLC auf
einer 75 µm ID x 250 mm PepMap Säule (LC Packings, Amsterdam, Niederlande)
aufgetrennt. Die extrahierten Peptide konnten dann durch eine vorgeschaltete µ-Vorsäule (0,3
mm x 5 mm) aufkonzentriert werden. Das Lösungsmittelsystem bestand aus (A) 0,5 %
Ameisensäure und (B) 0,5 % Ameisensäure/ 84 % MeCN. Der verwendete Gradient war
5-50 % Lösung (B) in 40 min und 50-99 % in 15 min. Die LC-MS/MS Spektren wurden mit
einem Finnigan LCG Ionenfallen Massenspektrometer (Finnigan MAT, Bremen), das mit
einer Nanoelektrospray Ionenquelle ausgerüstet war, aufgezeichnet. Die Interpretation der
MS/MS-Daten erfolgte automatisch mittels SEQUEST (Yates et al., 1995; 1998). Die
Fragmentionenspektren wurden dazu mit bekannten Daten in Protein-Datenbanken verglichen.
2.16.2 MALDI-TOF-MS Analyse
Die Analysen zur Identifikation der Zielproteine der ADP-Ribosyltransferase ModB mittels
MALDI-TOF-MS erfolgten in Zusammenarbeit mit Dr. A. Sickmann (Institut für
Physiologische Chemie, Ruhr-Universität Bochum). Die Peptide wurden wie bereits
beschrieben erzeugt. Zur Durchführung wurden 0,3 µl der Probe mit demselben Volumen
gesättigter 4-Hydroxy-α-Zimtsäure (Sigma) in 0,1 % TFA/MeCN (1:1 v/v) auf dem Träger
gemischt. Die MALDI-MS Analysen wurden mit einer Reflex-III, ausgestattet mit einer Scout
384 Ionenquelle, durchgeführt (Bruker Daltonik, Bremen). Die Datenaufnahme erfolgte an
einer SUN Ultra5 mit dem Programm XACQ 4.0.2 . Die anschließende Datenauswertung
erfolgte mit dem Programm XMASS 5.0.
48
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Die ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB werden durch zwei sich überlappende
Leserahmen kodiert (Wilkens et al., 1997). Wie von Tiemann et al. (1999) gezeigt, sind beide
Genprodukte für die meisten E. coli Überexpressionsstämme toxisch. Die Leserahmen für
modA und modB wurden deshalb in besonders für die Expression toxischer Proteine geeignete
Plasmide des pET-Systems kloniert (Kaiser; 1999 Tiemann, 1999). Diese Konstrukte standen
in unserer Arbeitsgruppe bereits zur Verfügung. Im Gegensatz zu ModA und ModB erwies
sich die ADP-Ribosyltransferase Alt als nicht toxisch, so dass der Leserahmen problemlos in
das Plasmid pBKS integriert und zur Expression gebracht werden konnte (Koch, 1993).
3.1 Überexpression der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB
Um eine biochemische Charakterisierung sowie die zur Röntgenstrukturaufklärung
notwendige Kristallisation der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB zu ermöglichen,
mussten beide Proteine in großer Menge und hoher Qualität aufgereinigt werden. Die
Expression
der
Proteine
erfolgte
in
verschiedenen
Bakterienstämmen
(2.9.9).
Bakterienkolonien (Klone), die für den Ansatz einer Übernachtkultur in Selektivmedium
verwendet werden sollten, wurden zuvor auf ihre Überexpressionsfähigkeit getestet (2.9.7):
Befanden sich auf einer IPTG-haltigen Agarplatte im Vergleich zu einer IPTG-freien
Agarplatte nur wenige Kolonien (1-6 %), wurden die rekombinanten Proteine durch diese
Zellen auch überexprimiert. Mit Hilfe dieses Tests konnten immer auf sehr zuverlässige Weise
Überexpressionsklone selektiert werden. In Abbildung 3.1 ist am Beispiel der ADPRibosyltransferase ModB die Analyse einer Überexpressionskultur mit Hilfe der SDS-PAGE
(2.11.2) dargestellt. 3 Stunden nach der Induktion mit 1 mM IPTG ist deutlich die Synthese
eines 27 kDa schweren Proteins festzustellen (Spur 1). Dieses Molekulargewicht stimmt gut
mit dem für His-ModB (Polyhistidin-ModB-Fusion) errechneten Molekulargewicht von
26,8 kDa überein.
Die Überexpressionen von ModA sowie die der Mutanten von ModA und ModB wurden in
der gleichen Weise durchgeführt und ergaben übereinstimmende Resultate.
Auf diese Weise konnten große Mengen Zellextrakte erzeugt werden, die das jeweils
gewünschte rekombinante Protein enthielten.
49
Ergebnisse
M
1
2
50 kDa
40 kDa
30 kDa
His-ModB
20 kDa
10 kDa
Abb. 3.1: Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel einer HisModB (p16modB1) Überexpressions-kultur im
Stamm C41 DE3. Aufgetragen wurden Proben
vor und nach der Induktion mit 1 mM IPTG.
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1: Zellextrakt 3h nach der Induktion
Spur 2: Zellextrakt vor der Induktion
3.2 Versuche zur Vermeidung von Einschlusskörpern
Die rekombinanten Proteine ModA und ModB lagen nach ihrer Expression in unlöslicher
Form
als
Einschlusskörper
vor
(Abb.
3.2).
Um
eine
Aufreinigung
der
ADP-
Ribosyltransferasen ohne eine vorangehende Denaturierung und anschließender Renaturierung
zu ermöglichen, wurden Versuche unternommen, die Expression von löslichem Protein zu
erzielen. Nach Schein (1991) gibt es unterschiedliche Methoden, die Bildung von
Einschlusskörpern zu verhindern, z.B. die Veränderung der Wuchsbedingungen, die Fusion
mit einem Solubilisierungslinker, oder die Coexpression von Chaperonen.
Veränderungen der Wuchsbedingungen
Um zu überprüfen, ob sich durch Variationen in den Anzuchtbedingungen eine Erhöhung der
Löslichkeit von ModB erreichen ließ, wurden die Überexpressionskulturen bei Temperaturen
zwischen 16 °C und 37 °C inkubiert, sowie IPTG-Konzentrationen zwischen 0,3 mM und
1,5 mM getestet (2.9.9). Keiner der Versuchsansätze zeigte eine verbesserte Löslichkeit von
ModB.
50
Ergebnisse
Fusion mit einem Solubilisierungslinker
In 2000 konnte Harrison zeigen, dass eine Fusion mit dem NusA Protein (495 Aminosäuren)
in 85 % der getesteten Proteine die Expression von löslichen Proteinen bewirkte. Daher wurde
der Leserahmen des Gens modB mit der T4 alc DNA als Matrize mittels PCR amplifiziert
(2.10.6) und über die dabei eingeführten Restriktionsschnittstellen BamHI und XhoI in das
Plasmid pET-43a kloniert. In diesem Vektor liegt der Leserahmen für nusA direkt vor der
multiplen Klonierungsstelle, so dass eine Expression von ModB als Fusionsprotein erfolgt.
Die Klonierung wurde durch Restriktionsanalyse (2.10.2) und DNA-Sequenzierung (2.10.9)
überprüft. Das so entstandene Plasmid wurde im Folgenden für Überexpressionsexperimente
eingesetzt, in deren Verlauf allerdings keine Expression von löslichem ModB festgestellt
werden konnte. Dasselbe Resultat wurde für ModA beobachtet, dessen Leserahmen ebenfalls
in pET43a kloniert wurde (Förster, persönliche Mitteilung).
Coexpression von Chaperonen
Eine Vielzahl von Proteinen benötigt Chaperone, um mit deren Hilfe in die aktive Form
gefaltet zu werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das Wachstum der Bakteriophagen
λ und T4 in E. coli Mutanten, die eine Mutation im Chaperon GroEL tragen, nicht möglich ist
(Georgopoulos et al., 1972 und 1978). Damit die in einer Zelle vorhandenen Chaperone
während einer Überexpression nicht austitriert werden, kann man diese koexprimieren und so
in ausreichender Anzahl zur Verfügung stellen. Dazu wurden die Plasmide pGroESL
(Goloubinoff et al., 1989), pT-groE (Chang & Cohen, 1978) und pBN19 (Blum et al., 1992a;
1992b) verwendet. Die Plasmide pGroESL und pT-groE tragen die Gene der
Hitzeschockproteine GroES und GroEL, während das Plasmid pBN19 für das HSP70
Chaperon DnaK kodiert. Für die Überexpressionen (2.9.9) wurden Kotransformanden von
ModB kodierenden pET-Konstrukten (p16modB1, p32modB3, p16modA7 und p32modA2)
und jeweils einem der oben genannten Plasmide eingesetzt. Die anschließende Analyse der
Zellextrakte ergab, dass die Chaperone gut überexprimierbar waren, während ModB weiterhin
in Form von unlöslichen Einschlusskörpern ausfiel.
51
Ergebnisse
3.3 Reinigung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB
Durch die Variation der Wuchsbedingungen während der Proteinexpression war es nicht
möglich, den Anteil des löslichen, rekombinanten Proteins zu erhöhen. Die Reinigung der
ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB erfolgte deshalb erst im Anschluss an eine
Renaturierung der unlöslichen Einschlusskörper.
3.3.1 Anreicherung von Einschlusskörpern
Die Anreicherung der Einschlusskörper der ADP-Ribosyltransferasen ModA oder ModB
erfolgte über zwei aufeinanderfolgende Waschschritte (2.11.5.1), in deren Verlauf zelluläre
Proteine und Membranbestandteile teilweise entfernt wurden. In der Abbildung 3.2 sind am
Beispiel des His-ModB die einzelnen Schritte einer Einschlusskörper-Reinigung dargestellt.
M
1
2
3
4
5
6
50 kDa
30 kDa
His-ModB
20 kDa
Abb. 3.2: Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel mit verschiedenen
Fraktionen einer Einschlusskörper-Aufreinigung von HisModB.
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1: Gesamtzellextrakt
Spur 2: unlösliche Proteine des Gesamtzellextraktes
Spur 3: lösliche Proteine des Gesamtzellextraktes
Spur 4: Sediment nach dem Waschen mit IB-Waschpuffer
Spur 5: Überstand nach dem Waschen mit IB-Waschpuffer
Spur 6: angereicherte und in Lösung gebrachte Einschlusskörper
Die nach dem Zellaufschluss im Rohextrakt enthaltenen Proteine (Spur 1) wurden durch
Zentrifugation in eine unlösliche (Spur 2) und eine lösliche Fraktion (Spur 3) getrennt. Es ist
gut zu erkennen, dass lediglich in der unlöslichen Fraktion His-ModB Protein vorhanden war.
Das unlösliche His-ModB wurde in IB-Waschpuffer gewaschen, wobei das Protein weiterhin
als Einschlusskörper im Sediment verblieb (Spur 4). Mit dem Überstand konnte ein Teil der
52
Ergebnisse
zellulären Proteine entfernt werden (Spur 5). Die aggregierten Proteine wurden anschließend
unter denaturierenden Bedingungen bei pH 12,0 in Lösung gebracht (Spur 6). Die
Renaturierung der Proteine erfolgte während einer Dialyse gegen Lysis-Puffer (2.12.5.2), in
deren Verlauf der pH Wert auf 8,0 gesenkt wurde. Auf diese Weise erfolgte eine
Anreicherung von His-ModB auf bis zu 80 % der Gesamtproteinkonzentration.
3.3.2 Nickel-NTA Metallchelat-Affinitätschromatographie
Die renaturierten ADP-Ribosyltransferasen (3.3.1) wurden unter nativen Bedingungen über
eine Ni-NTA Metallchelat-Affinitätschromatographie gereinigt (2.12.5.3). Die Elution der
über ihren "His-Tag" an das Säulenmaterial gebundenen Proteine erfolgte dabei über einen
steigenden Imidazol-Stufengradienten. Die Abbildung 3.3 zeigt die Analyse der einzelnen
Fraktionen einer His-ModB-Reinigung durch eine SDS-PAGE (2.11.2).
M A D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
50 kDa
30 kDa
- His-ModB
20 kDa
Abb. 3.3: Reinigung der ADP-Ribosyltransferase His-ModB mittels immobilisierter
Metallchelat-Affinitätschromatographie. Dargestellt sind ein silbergefärbte
Polyacrylamidgele der verschiedenen Säulenfraktionen.
Spur M:
Spur A:
Spur D:
Spuren 1-3:
Spuren 4-6:
Spuren 7-9:
Spuren 10-12:
Spuren 13-15:
Spuren 16-18:
10 kDa Proteinmarker
Auftrag von renaturiertem His-ModB Protein
Durchlauf
Waschfraktionen
Elution mit 50 mM Imidazol
Elution mit 100 mM Imidazol
Elution mit 150 mM Imidazol
Elution mit 200 mM Imidazol
Elution mit 250 mM Imidazol
53
Ergebnisse
Die auf die Säule gegebene Proteinmenge überstieg deren Bindekapazität, so dass ein Teil des
Proteins im Durchlauf (Spur D) zu finden war. Aufgrund der vorangegangenen effektiven
Einschlusskörper-Anreicherung
lagen
kontaminierende
Proteine
nur
in
geringen
Konzentrationen vor und konnten in den Waschfraktionen daher nicht detektiert werden
(Spuren 1-3). His-ModB eluierte schließlich ohne nachweisbare Verunreinigungen ab einer
Konzentration von 100 mM Imidazol (Spur 7). Die Fraktionen, die die ADPRibosyltransferase enthielten (Spur 7-16), wurden vereinigt und gegen Dialyse-Puffer
dialysiert (2.12.5.3). Anschließend konnte das Protein bei –20 °C bis zur weiteren
Verwendung gelagert werden.
Die Reinheit der aufgereinigten Proteine im Dialysat wurde durch SDS-PAGE (2.11.2) und
Silberfärbung des SDS-Polyacrylamidgels (2.11.4.2) mit anschließender densitometrischer
Auswertung (Tina 2.09) überprüft.
A) Trx-ModB
90
80
70
60
50
40
30
20
0
0
100
[o
d
]
10
B
0
150
100
50
A
0
M
B) His-ModB
[o
d
]
10
2000
20
50
6000
60
8000
20 kDa
40
[mm]
[mm]
30 kDa
30
4000
50 kDa
70
80
Abb 3.4: Darstellung der densitometrischen Auswertung silbergefärbter Polyacrylamidgele von
gereinigtem Trx-ModB und His-ModB.
A) links: Spur M: 10 kDa Proteinmarker; Spur A: gereinigtes Trx-ModB
rechts: Profil der densitometrischen Auswertung entlang des in Spur A
markierten Bereichs.
B) links: Spur B: gereinigtes His-ModB
rechts: Profil der densitometrischen Auswertung entlang des in Spur B
markierten Bereichs.
Abbildung 3.4 zeigt die densitometrische Auswertung silbergefärbter Polyacrylamidgele mit
aufgetragenemTrx-ModB (Thioredoxin-ModB-Fusionsprotein) bzw. His-ModB Protein.
His-ModB zeigte im Gel keine Verunreinigungen durch andere Proteine (Spur B), während in
der Trx-ModB Reinigung eine zweite Bande bei 27 kDa vorhanden war (Spur A). Bei diesem
54
Ergebnisse
Protein handelte es sich wahrscheinlich um ModB von dem die Thioredoxin-Fusion
abgetrennt wurde. Für die Proteine His-ModB und Trx-ModB konnte densitometrisch eine
Homogenität von 94,5 % bzw. 91,5 % bestimmt werden. Diese Reinheitsgrade konnten
reproduzierbar für alle durchgeführten Reinigungen der ADP-Ribosyltransferasen ModA und
ModB erreicht werden. Die gereinigten Proteine waren deshalb sowohl qualitativ als auch
quantitativ
für
den
Einsatz
in
Aktivitätstests
und
für
die
Verwendung
in
Kristallisationsansätzen geeignet.
3.4 Nachweis der Polyhistidin-Sequenzen ("His-Tags")
Polyhistidin-Sequenzen können immunologisch durch den Einsatz von Anti-HistidinAntikörpern oder Ni-NTA-Konjugaten nachgewiesen werden (2.11.7). Sowohl Antikörper als
auch Ni-NTA-Konjugate weisen eine hohe spezifische Affinität zu aufeinanderfolgenden
Histidinen auf. Für den Nachweis des "His-Tags" an rekombinanten Proteinen wurden die
entsprechenden Proteinextrakte zunächst in SDS-Polyacrylamidgelen (2.112) aufgetrennt und
anschließend auf PVDF-Membranen übertragen (2.11.6.1). Die Detektion des "His-Tags"
erfolgte daraufhin mittels Chemolumineszenz (2.11.7).
M
50 kDa
40 kDa
1
2
3
4
5
6
- Trx-ModB
30 kDa
- His-ModB
20 kDa
Abb. 3.5:
Nachweis der Polyhistidin-Fusionen von His-ModB und TrxModB mittels Ni-NTA-Konjugat. Dargestellt sind jeweils die
in einer SDS-PAGE aufgetrennten und auf PVDF-Membran
übertragenen Proteine und das davon angefertigte
Autoradiogramm.
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1: Gesamtzellextrakt einer Überexpressionskultur
Spur 2: Autoradiogramm von Spur 1
Spur 3: gereinigtes His-ModB
Spur 4: Autoradiogramm von Spur 3
Spur 5: gereinigtes Trx-ModB
Spur 6: Autoradiogramm von Spur 5
55
Ergebnisse
Die Abbildung 3.5 zeigt diesen Nachweis am Beispiel von His-ModB (Ni-NTA-Konjugat)
und Trx-ModB (Penta-His-Antikörper). Dargestellt sind jeweils die korrespondierenden
Spuren des SDS-Polyacrylamidgels und des zugehörigen Röntgenfilms. Für das bei 27 kDa im
Gel laufende His-ModB erfolgte der Nachweis sowohl im Rohextrakt (Spur 1 u. 2) als auch
nach einer Ni-NTA-Reinigung (Spur 3 u. 4). In den Spuren 5 und 6 wurde der "His-Tag" des
bei ca. 45 kDa lokalisierten Trx-ModB für das aufgereinigte Protein dokumentiert.
3.5 Versuch der Kristallisation von ModA, ModB und Alt
Mit dem Ziel der Röntgenstrukturaufklärung der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und
Alt wurden in Zusammenarbeit mit Dr. Virginie Guegen-Chaignon und Dr. Solange Moréra
Kristallisationsexperimente mit den gereinigten Enzymen durchgeführt.
Für Alt und ModA wurden in keinem Fall Kristallisationskerne beobachtet. Auch die
Verwendung von verschiedenen ModA Mutanten brachte hier keine Verbesserung. Für ModB
konnte bei Ansätzen mit der Mutante ModB-R73A eine reproduzierbare Kristallbildung
festgestellt werden. Die dabei gewonnenen Kristalle waren allerdings sehr klein und äußerst
fragil. Die Experimente zur Strukturaufklärung im Synchrotron am ESRF in Grenoble führten
aus diesem Grund zu keinem Ergebnis. Zur Zeit erfolgen weitere Experimente durch
Dr. Virginie Guegen-Chaignon und Dr. Solange Moréra mit dem Ziel, die Pufferbedingungen
zu verbessern und damit größere Kristalle zu erzeugen.
3.6 Biochemische Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferase ModB
3.6.1 Bestimmung des Molekulargewichts
Die
ADP-Ribosyltransferase
ModB
hat
ein
aus
dem
Leserahmen
errechnetes
Molekulargewicht von 24,244 kDa. Für die Aufreinigungen und die weiterführenden
Experimente
wurden
Konstrukte
verwendet,
die
über
eine
Polyhistidin-,
bzw.
Thioredoxin/Polyhistidin-Fusion verfügten. Die für diese Proteine errechneten theoretischen
Massen von 26,766 kDa für His-ModB und 42,868 kDa für Trx-ModB konnten durch SDSPAGE Analysen mit ca. 27 und 45 kDa grob bestätigt werden (3.5). Zur Bestimmung der
56
Ergebnisse
exakten Massen der beiden Fusionsproteine wurden die aufgereinigten Enzyme in einer NanoElektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie analysiert. In Abbildung 3.6 sind die
aufgenommenen
Massenspektren
dargestellt.
Für His-ModB (Teil
A) wurde der
Hauptmassenpeak bei 26633,71 +/- 1,6 Da gemessen, so dass eine Abweichung von der
errechneten Masse von ca. 133 Da festzustellen ist. Das Thioredoxin-Fusionsprotein erzeugte
ein Maximum bei 42806,03 +/- 2,59 und damit eine Differenz von der errechneten Masse von
ca. 62 Da.
Abb: 3.6: Darstellung der Massenspektren von Nano-ElektrosprayIonisations-Massenspektren der aufgereinigten Proteine HisModB und Trx-ModB. Aufgetragen sind die relativen
Ausschläge des Detektors gegen die Masse pro Ladung.
A) Massenspektrum von His-ModB
B) Massenspektrum von Trx-ModB
3.6.2 Isoelektrische Fokussierung
Die Aminosäurekomposition eines Proteins bestimmt dessen isoelektrischen Punkt (pI) und
damit eine wichtige biochemische Eigenschaft eines jeden Proteins. Für die experimentelle
Bestimmung des pI von ModB wurde gereinigtes Protein in einer isoelektrischen
Fokussierung mit immobilisiertem pH-Gradienten nach Görg et al. (1985) eingesetzt (2.11.3).
Dabei wurde ein linearer pH-Gradient von pH 5-8 verwendet, so dass die in Relation zum pHGradienten gesetzte Proteinlaufstrecke den pI ergibt (Abb. 3.7).
57
Ergebnisse
Abb. 3.7: Isoelektrische Fokussierung von aufgereinigtem His-ModB mittels immobilisiertem pHGradienten (pH 5-8).
Der isoelektrische Punkt der ADP-Ribosyltransferase ModB konnte experimentell mit pH 6,9
festgestellt werden. Da die Aminosäurezusammensetzung des Proteins bekannt war, wurde
vergleichend auch eine Berechnung des pI durchgeführt und durch das Programm Protean mit
pH 6,41 kalkuliert.
3.7
Aktivität der ADP-Ribosyltransferasen ModB, ModA und Alt
Die ADP-Ribosylierungstests erfolgten nach der von Rohrer et al. (1975) beschriebenen
Methode mit
32
PNAD+ als Substrat (2.12.1). Die in den Tests eingesetzten löslichen E. coli
Proteine wurden in SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und anschließend Autoradiogramme
der gefärbten Gele angefertigt.
3.7.1 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModB
Die Abbildung 3.8 stellt die Modifikation von E. coli Proteinen durch gereinigtes (2.11.5)
Trx-ModB dar. Die Kontrollen (Spur 1 u. 2) zeigen deutlich, dass es sich um eine spezifische,
durch ModB katalysierte Reaktion handelt, da ohne die Zugabe von Enzym bzw. radioaktivem
Substrat keine Signale nachweisbar waren. Zusätzlich zu der ADP-Ribosylierung von ZielProteinen führt das Enzym eine Autoribosylierung durch. Dies konnte eindeutig an der in Spur
3 aufgetragenen Kontrolle ohne zusätzliches E. coli Protein beobachtet werden. Zusätzlich
sind hier zwei weitere Signale sichtbar. Dabei könnte es sich um Verunreinigungen handeln,
58
Ergebnisse
die bei der Reinigung nicht entfernt wurden und die ebenfalls Zielproteine von ModB sind.
Die Molekulargewichte sprechen allerdings für die Annahme, dass es sich um ModB und
Thioredoxin handelte. Diese könnten als Spaltprodukte aus dem Thioredoxin-Fusionsprotein
hervorgegangen sein (vergleiche Abb. 3.10). Das weitere Ziel-Proteinspektrum von ModB
erstreckte sich auf Proteine mit Molekulargewichten von 10 kDa, 20 kDa, 27 kDa, 32 kDa, 35
kDa, 40 kDa, 48 kDa, 58 kDa, 72 kDa, 100 kDa. Die Erhöhung der E. coli
Proteinkonzentration in den Ansätzen (Spur 4-9) bewirkte eine Verstärkung des detektierbaren
Signals, da in diesen Fällen mehr Zielproteine zur Verfügung standen.
A)
M 1
2
3 4
5
6
7
8
9
B)
M 1
2
3
4
5
6
7 8 9
80 kDa
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.8: Darstellung der ADP-Ribosylierungsaktivität von ModB. Die Banden der durch ModB modifizierten
Proteine sind markiert (rechts).
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel verschiedener Ansätze eines ADP-Ribosylierungstests mit
ModB.
B) Autoradiogramm von A.
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4+5:
Spur 6+7:
Spur 8+9:
10 kDa Proteinmarker
Kontrolle ohne 32PNAD+
Kontrolle ohne ModB
Ansatz ohne Zellextrakt
Ansatz mit 15 µg Zellextrakt
Ansatz mit 30 µg Zellextrakt
Ansatz mit 50 µg Zellextrakt
Die Abhängigkeit der Signalstärke von der Proteinkonzentration konnte auch im Fall der
Autoribosylierung beobachtet werden. Wurde die in einem ADP-Ribosylierungstest
eingesetzte ModB Konzentration erhöht, nahm die Intensität des Signals proportional zu. In
der Abbildung 3.9 ist die Verstärkung des durch die Auto-ADP-Ribosylierung erzeugten
Signals im Autoradiogramm bei einer Verdopplung der Enzymkonzentration von 15 µg
(Spur 3) auf 30 µg (Spur 4) deutlich sichtbar.
59
Ergebnisse
A)
M
1
2
3
4
B)
1
2
3
4
90 kDa
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.9: Auto-ADP-Ribosylierungsaktivität von ModB in
Abhängigkeit von der eingesetzten Enzymkonzentration.
A) Coomassie
gefärbtes
Polyacrylamidgel
verschiedener Auto-ADP-Ribosylierungstests.
B) Autoradiogramm von A
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1: Kontrolle ohne 32PNAD+
Spur 2: Kontrolle ohne ModB
Spur 3: Ansatz mit 15 µg ModB
Spur 4: Ansatz mit 30 µg ModB
Unterschiede in ihren Zielproteinspektren zwischen den in diesen Experimenten eingesetzten
Thioredoxin-Fusionsproteinen und den thioredoxinfreien Enzymen waren weder für ModB
noch für ModA feststellbar. Der Grund für die Konstruktion der Fusionsproteine war der
Versuch, eine erhöhte Löslichkeit bei der Überexpression zu erreichen (3.2). Die verwendeten
Vektoren kodieren außer für Thioredoxin auch für eine Enterokinase-Schnittstelle, so dass
eine Trennung der aufgereinigten ADP-Ribosyltransferase von Thioredoxin möglich ist. Um
die Aktivität von ModB nach einem Enterokinase-Verdau zu untersuchen, wurde das für 16 h
mit 0,2 U Enterokinase behandelte Enzym in einem ADP-Ribosylierungstest eingesetzt
(Abb. 3.10). Der Ansatz ohne zusätzliche Gabe von unverdautem Enzym wies eine geringe
Aktivität auf, so dass nur zwei schwache Signale im Bereich von ModB und dem nicht
vollständig umgesetzten Trx-ModB zu detektieren waren (Spur 1). Die geringe Aktivität wird
wahrscheinlich durch die Inkubation bei Raumtemperatur während des Enterokinaseverdaus
bewirkt. Durch zusätzliches unverdautes Trx-ModB im Ansatz wurden die Signale deutlich
verstärkt und es trat eine weitere Bande im Bereich des abgetrennten Thioredoxins auf
(Spur2). Das abgespaltene ModB würde sich deshalb wahrscheinlich nicht für
Kristalliationsansätze oder Aktivitätstests eigenen.
60
Ergebnisse
A)
M
1
2
B)
M
1
50 kDa
2
- Trx-ModB
30 kDa
- ModB
20 kDa
- Thioredoxin
Abb. 3.10: ADP-Ribosylierungstest mit enterokinaseverdautem Trx-ModB
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel mit
zwei ADP-Ribosylierungstest-Ansätzen
B) Autoradiogramm von A
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1: Ansatz ohne zusätzliches Trx-ModB
Spur 2: Ansatz mit zusätzlichem Trx-ModB
3.7.1.1 Identifizierung der Zielproteine von ModB
In den Aktivitätstests modifizierte die ADP-Ribosyltransferase ModB nachweisbar eine Reihe
unterschiedlicher Proteine (3.7.1). Es war bekannt, dass das Enzym neben der
Autoribosylierung auch das ribosomale Protein S1 (72 kDa Bande) als Zielprotein besitzt
(Depping, 1998).
Um weitere durch ModB ADP-ribosylierte Proteine identifizieren zu können, wurde die
Methode der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese (2.11.3) für dieses System etabliert. Die
damit verbundene erhöhte Auflösung war erforderlich, da sich in einer 1D-Auftrennung in
einer Bande statistisch 4-5 verschiedene Proteine befinden können, die die Bestimmung des
modifizierten Proteins möglicherweise verfälschen.
Die in einem ADP-Ribosylierungstest (2.12.1) eingesetzten E. coli Rohextrakte wurden
zunächst in immobilisierten pH-Gradienten nach ihrem pH Wert aufgetrennt. Im Anschluss
erfolgte die Trennung nach ihrem Molekulargewicht in einer SDS-PAGE. Anfänglich wurden
die Proteine auf Membranen übertragen, um die potentiellen Zielproteine mittels N-terminaler
Sequenzierung (2.15) identifizieren zu können (2.11.6.2). Abbildung 3.11 zeigt die nach einer
2D-Gelelektrophorese auf eine PVDF-Membran übertragenen Proteine sowie das davon
61
Ergebnisse
angefertigte Autoradiogramm. Zwei in ihrer Intensität deutlich unterschiedliche Spots
(Spot 1 u. 2) wiesen eine radioaktive Markierung auf.
A)
B)
60 kDa
2
2
1
1
40 kDa
20 kDa
pH
Abb. 3.11: Western Blot einer zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese mit Proteinen aus
einem ModB ADP-Ribosylierungstest und das davon angefertigte Autoradiogramm.
Proteinspots, die im Autoradiogramm ein Signal erzeugen, sind numeriert.
A)
B)
Coomassie gefärbte PVDF-Membran (Western Blot)
Autoradiogramm von A)
Die beiden Proteinspots wurden aus der Membran ausgeschnitten und ihre N-terminalen
Aminosäuren sequenziert. Die ersten zehn Edman-Zyklen sind beispielhaft für Spot 2 in
Abbildung 3.12 dargestellt. Die für beide Proteine ermittelten Sequenzen wurden für Abfragen
in einer E. coli Datenbank verwendet. In der Tabelle 3.1 werden die Ergebnisse dieser
Proteinidentifizierung zusammengefasst. Bei dem in Spot 2 vorhandenen Protein handelt es
sich um den Trigger Faktor, ein 48 kDa Protein mit einem pI von 4.7. Das zweite Protein
wurde als Thioredoxin bestimmt; die Position des Spots im Gel bei ca. 40 kDa lässt allerdings
vermuten, dass es sich nicht um das zelluläre Thioredoxin, sondern um den N-terminalen
Fusionsanteil des im Aktivitätstest eingesetzten Trx-ModB handelt. Zelluläres Thioredoxin
wäre mit einem Molekulargewicht von 14 kDa und einem pI von 5,25 nicht an dieser Position
zu erwarten.
62
Ergebnisse
Met
Position 1
Glu
Position 6
Gln
Position 2
Thr
Position 7
Val
Position 3
Thr
Position 8
Ser
Position 4
Thr
Position 9
Val
Position 5
Gly
Position 10
Abb. 3.12:
N-terminale Proteinsequenzierung nach Edman (1970). Dargestellt sind die
Chromatogramme der ersten 10 Zyklen. Die jeweilige identifizierte Aminosäure ist über
dem Chromatogramm im Drei-Buchstaben-Code angegeben.
63
Ergebnisse
Tabelle 3.1: Identifizierung der durch ModB modifizierten Proteine durch N-terminale
Sequenzierung. Dargestellt sind die ermittelten Peptidsequenzen und die
dadurch identifizierten Proteine.
Peptidsequenz
identifiziertes Protein
Spot 1
SDKIIHLTDDSFDTD
Thioredoxin
Spot 2
MQVSVETTQG
Trigger Faktor
Insgesamt waren relativ wenige Spots auf der PVDF-Membran nachweisbar. Im weiteren
Verlauf der Arbeiten wurde deshalb auf den Übertrag der Proteine auf Membranen verzichtet.
Diese Vorgehensweise hatte den Vorteil, dass keine weiteren Proteinverluste auftraten und
sensitivere Färbemethoden angewendet werden konnten. Die Polyacrylamidgele wurden
silbergefärbt und anschließend getrocknet. Die Anzahl der anfärbbaren Proteinspots konnte so
im Vergleich zu den PVDF-Membranen deutlich gesteigert werden (Abb. 3.13). Das
angefertigte Autoradiogramm zeigte drei Markierungen, die in ihrer Lage mit einem
Proteinspot korrelierten und mit den schon auf den PVDF-Membranen gefundenen Spots
übereinstimmten. Zusätzlich waren weitere vier Signale im Autoradiogramm vorhanden, die
allerdings keinem anfärbbaren Spot im Polyacrylamidgel zuzuordnen waren.
A
B
150 kDa
1
1
3
Mw
3
2
2
10 kDa
3
pH
10
Abb. 3.13: Zweidimensionale Gelelektrophorese mit Proteinen aus einem ADP-Ribosylierungstest mit
ModB. Proteinspots, die im Autoradiogramm ein Signal erzeugten, sind numeriert.
A) Silbergefärbtes Polyacrylamidgel
B) Autoradiogramm von A
64
Ergebnisse
Die Analyse der Spots erfolgte durch die Aufnahme von MALDI-MS Spektren (2.16.2). In
Abbildung 3.14 ist das für Spot 1 aufgezeichnete Spektrum dargestellt. Die Datenbanksuche
mit dem Programm ProFound ermittelte das Protein "Trigger Faktor" und bestätigte damit das
2439,211
2195,207
1687,955
1445,789
842,510
2039,119
1266,812
Resultat der vorangegangenen Experimente.
Abb. 3.14: MALDI-TOF-Spektrum ("Mass Fingerprint")
eines in einer 2D-PAGE (Spot 1/Abb. 3.13)
aufgetrennten Proteins aus einem ADPRibosylierungstest mit ModB. Die Interpretation des Massenspektrums indentifizierte
das E. coli Protein Trigger Faktor.
Für Spot 2 wurde die ADP-Ribosyltransferase ModB identifiziert. Dadurch konnte die schon
im Rahmen der Edman-Sequenzierung gemachte Vermutung bewiesen werden, dass es sich
bei diesem Spot nicht um zelluläres Thioredoxin handelte, sondern um autoribosyliertes TrxModB. Das Protein in Spot 3 enthielt den prokaryontischen Translationsfaktor EF-Tu.
Die Ergebnisse wurden in mehrfachen Wiederholungen der Experimente jeweils bestätigt, so
dass das Zielproteinspektrum von ModB um den Trigger Faktor und EF-Tu erweitert werden
kann.
3.7.1.2 Aktivitätstest mit biotinyliertem NAD+
ADP-Ribosylierungsreaktionen werden normalerweise durch den Einsatz von radioaktivem
NAD+ zur Markierung des ADP-ribosylierten Proteins studiert (Zhang & Snyder, 1993)
(3.7.1). Das hat allerdings den Nachteil, dass die Radioaktivität lediglich als Indikator für die
65
Ergebnisse
abgelaufene Reaktion dienen kann. Außerdem muss die Detektion in einem geringen
zeitlichen Abstand zur Durchführung der Markierung stattfinden, da ansonsten die Aktivität
des normalerweise verwendeten P32 aufgrund des radioaktiven Zerfalls nicht mehr ausreicht.
Um diese Nachteile zu umgehen, wurde der ADP-Ribosylierungstest durch den Einsatz von
biotinyliertem NAD+ (bNAD+) modifiziert (2.12.2). Der Nachweis des bNAD+ erfolgte hier
durch HRP-gekoppeltes Streptavidin.
Die Abbildung 3.15 zeigt das Ergebnis eines ADP-Ribosylierungstests mit biotinyliertem
NAD+ als Substrat. In allen Ansätzen konnte die erwartete Autoribosylierung des Trx-ModB
nachgewiesen werden. Wie bei der Verwendung radioaktiven Substrats nahm bei einer
ansteigenden bNAD+-Konzentration auch die Intensität des Signals zu. Die Kontrolle zeigte
das erwartete negative Resultat.
M
1
6,25
10
50
100
0
97,4 kDa
45 kDa
Abb. 3.15: Western
Blot
eines
ADPRibosylierungs-tests mit bNAD+ als
Substrat.
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4:
Spur 5:
Spur 6:
Proteinmarker
Ansatz mit 1 pM bNAD+
Ansatz mit 6,25 pM bNAD+
Ansatz mit 10 pM bNAD+
Ansatz mit 50 pM bNAD+
Ansatz mit 100 pM bNAD+
Kontrolle ohne bNAD+
Um zu überprüfen, ob die ADP-Ribosyltransferase ModB während ihrer Expression in E. coli
bereits ADP-ribosyliert wird, wurde ein ADP-Ribosylierungstest mit bNAD+ durchgeführt
(2.12.2). Die Detektion erfolgte, abweichend vom normalerweise angewandten Protokoll,
nicht durch Streptavidin-HRP, sondern mit einem von Dr. Kathryn K. McMahon (Lubbock,
USA) zur Verfügung gestellten Mono-ADP-Ribosyl Antikörper (2.12.3). Wie die Abbildung
3.16 darstellt, konnte eine Autoribosylierung der eingesetzten ADP-Ribosyltransferase ModB
66
Ergebnisse
in allen Ansätzen festgestellt werden (Spuren 1-3), während eine Abhängigkeit des
Detektionssignals von der eingesetzten Substratkonzentration nicht vorlag. Dass die ADPRibosyltransferase bereits in ADP-ribosylierter Form gereinigt wird, kann aufgrund der
Kontrolle ohne bNAD+ (Spur 4) vermutet werden; auch hier war ein positives Signal zu
detektieren.
M
1
2
3
4
48 kDa
33 kDa
Abb. 3.16: Nachweis des im ADP-Ribosylierungstest übertragenen
ADP-Ribosylrestes mittels eines Mono-ADP-RibosylAntikörpers. Dargestellt ist ein Western Blot von
verschiedenen Ansätzen eines ADP-Ribosyltransferase
Aktivitätstests.
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4:
Proteinmarker
Ansatz mit 1 pM bNAD+
Ansatz mit 5 pM bNAD+
Ansatz mit 10 pM bNAD+
Kontrolle ohne bNAD+
3.7.2 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von ModA
Die katalytische Aktivität der aufgereinigten ADP-Ribosyltransferase ModA wurde analog zu
den Tests mit ModB nach der Methode von Rohrer et al. (1975) mit
32
PNAD+ und E coli-
Rohextrakt bestimmt (2.12.1). Nach der Auftrennung der löslichen Proteine in einem
13 %igen SDS-Polyacrylamidgel wurde ein Autoradiogramm des gefärbten und getrockneten
Gels angefertigt. Die Abbildung 3.17 zeigt das durch ModA hervorgerufene ADPRibosylierungsmuster. Die Kontrollen ohne
32
PNAD+ (Spur 1) und ohne ModA (Spur2)
zeigten, wie erwartet, keine radioaktiv markierten Proteine. Die Kontrolle (Spur 3), zu der
kein weiterer E. coli-Rohextrakt gegeben wurde, wies eine Autoribosylierung bei dem bei ca.
67
Ergebnisse
26 kDa laufenden ModA auf. Zusätzlich erfolgte die ADP-Ribosylierung von E. coli Proteinen
mit den Molekulargewichten von ca. 10, 25, 37 und 70 kDa (Spuren 4-9). Eine Verstärkung
des Signals durch die erhöhte Zellextraktzugabe, wie im Fall von ModB, konnte nicht
festgestellt werden.
A)
M
B)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.17: Darstellung der ADP-Ribosylierungsaktivität von ModA
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel verschiedener Ansätze eines ADP-Ribosylierungstests
mit ModA.
B) Autoradiogramm von A.
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4+5:
Spur 6+7:
Spur 8+9:
10 kDa Proteinmarker
Kontrolle ohne 32PNAD+
Kontrolle ohne ModA
Ansatz ohne Zellextrakt
Ansatz mit 15 µg Zellextrakt
Ansatz mit 30 µg Zellextrakt
Ansatz mit 50 µg Zellextrakt
In den 2D-PAGE-Experimenten zeigte ModA eine zu geringe Aktivität, so dass die
Experimente zur Zielproteinidentifizierung aufgrund von fehlenden radioaktiven Nachweisen
zu keinen Resultaten führten.
3.7.3 ADP-Ribosyltransferase Aktivität von Alt
Die ADP-Ribosyltransferase Alt wurde durch U. Aschke-Sonnenborn aufgereinigt und zur
Verfügung gestellt.
Das Alt-Protein ist von den drei ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 das aktivste
Enzym und verfügt, wie in Abbildung 3.18 verdeutlicht wird (Spuren 3-6), über ein breiteres
Spektrum an Zielproteinen. Es wurden Proteine in allen Molekulargewichtsgrößen
modifiziert. Mit zunehmender E. coli Proteinkonzentration erfolgte auch hier eine
Verstärkung der einzelnen Signale (Spur 4-6). Das im Experiment eingesetzte Alt war nicht
68
Ergebnisse
bis zur Homogenität aufgereinigt worden, so dass eine zweite Bande im SDSPolyacrylamidgel und zusätzliche Signale im Autoradiogramm auftraten (Spur 3).
M
1
2
3
4
5
6
M
1
2
3
4
5
6
120 kDa
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.18: Darstellung der ADP-Ribosylierungsaktivität von Alt.
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel von verschiedenen ADP-Ribosylierungstests.
B) Autoradiogramm von A
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4:
Spur 5:
Spur 6:
10 kDa Proteinmarker
Kontrolle ohne 32PNAD+
Kontrolle ohne Alt
Ansatz ohne Zellextrakt
15 µg Zellextrakt
30 µg Zellextrakt
50 µg Zellextrakt
3.7.3.1 Identifizierung der Zielproteine von Alt
Zur Identifizierung der Zielproteine der ADP-Ribosyltransferase Alt wurde nach dem schon
für ModB beschriebenen Verfahren vorgegangen. Die Abbildung 3.19 zeigt die in einer
zweidimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennten E. coli Proteine und das von diesem Gel
angefertigte Autoradiogramm. Die detektierbaren Proteine wiesen Molekulargewichte
zwischen 10 und 120 kDa auf; sie befanden sich allerdings zum größten Teil in einem
pH-Bereich von ca. pH 5 bis pH 8,5. Proteine des äußerst sauren, bzw. basischen Milieus
scheinen bei den gewählten experimentellen Parametern nicht erfasst werden zu können.
Insgesamt waren 27 Markierungen auf dem Autoradiogramm detektierbar, von denen 10
Signale einem anfärbbaren Proteinspot zugeordnet werden konnten. Diese wurden aus dem
Gel ausgeschnitten und tryptisch verdaut. Die erhaltenen Peptide wurden mittels nHPLC
aufgetrennt und mit einem Ionenfallen-Massenspektrometer analysiert. Die Interpretation der
erhaltenen MS/MS-Daten erfolgte automatisch mittels der Sequest-Software (Molecular
69
Ergebnisse
Biotechnology, Univ. of Washington, J.Eng/J.Yates). In der Abbildung 3.20 ist am Beispiel
von Spot 3 (Abb. 3.19) die Identifizierung eines Proteins mittels ESI-MS dargestellt. Durch
eine Abfrage in einer E. coli Datenbank wurde das Chaperon GroEL identifiziert. Insgesamt
konnten 447 Aminosäuren der 548 in der Primärstruktur (81,6 %) vorkommenden
Aminosäuren ermittelt werden. In allen untersuchten Spots wurden auf diese Weise
Zielproteine identifiziert (Tab. 3.2). Bei sieben Proteinen war die Identität eindeutig, während
in Spot 2, 4 und 8 jeweils zwei Proteine vorhanden waren. In diesen Fällen ist es möglich,
dass nur eines der beiden Proteine tatsächlich modifiziert wurde, es kann aber auch sein, dass
beide Proteine betroffen sind. In diesen Fällen sind weitere Experimente notwendig, um eine
eindeutige Aussage machen zu können. Mit den in Spot 3 und 4 identifizierten Proteinen
GroEL und Trigger Faktor sind zwei Faltungshelfer Proteine betroffen, von denen der Trigger
Faktor auch durch ModB modifiziert wird (3.7.1.1). Als weitere Zielproteine wurden die
Dihydrolipoamid-Acetyltransferase, die Prolyl-tRNA-Synthetase, die Pyruvat Kinase I, die 3Oxoacyl-Synthase, der Elongationsfaktor EF-Tu, das ThiF Protein, das ribosomale Protein L1,
die MTA/SAH Nukleosidase, NADPH-Sulfit Reduktase, Dihydrolipoamid Dehydrogenase
und die Ribose-5-Phosphat Isomerase nachgewiesen (Tab. 3.2).
A)
B)
100 kDa -
1
3
2
1
5
3
6
2
4
5
6
50 kDa -
7
4
7
8
30 kDa -
8
9
9
10
10
20 kDa -
3
pH
10
Abb. 3.19: Zweidimensionale Gelelektrophorese mit Proteinen aus einem ADP-Ribosylierungstest mit Alt.
Proteinspots, die im Autoradiogramm ein Signal erzeugten, sind numeriert.
70
Ergebnisse
A)
46.97
100
90
80
53.28
70
60
60.31
70.28
44.89
50
76.60 83.21
40
38.26
30
84.85
62.80
37.59
20
85.36
91.83
92.44
10
0
B)
100
90
80
70
60
50
40
57.26
30
44.87
20
38.23
36.16
10
62.77
45.22
54.87
53.17
70.14
66.99
0
30
40
50
60
70
71.81
80
84.74
90.86
90
Abb. 3.20: ESI-MS/MS Spektren eines in einer 2D-PAGE
aufgetrennten Proteins (Abb. 3.19, Spot 3) aus einem
ADP-Ribosylierungstest mit Alt.
A) ESI-MS Spektrum
B) ESI-MS/MS Spektrum eines fragmentierten Signals aus A).
Dieses Spektrum diente als Grundlage für die
Zielproteinidentifikation mittels Sequest-Datenanalyse.
Tabelle 3.2: Identifizierte Zielproteine der ADP-Ribosyltransferase Alt. Dargestellt ist die in der
zweidimensionalen Gelelektrophorese eingeführte Spot-Numerierung, das identifizierte Protein,
sowie die prozentuale Sequenzabdeckung der gefundenen Peptidsequenzen mit der Datenbank.
Spot Nr.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
identifiziertes Protein
Dihydrolipoamid Acetyltransferase
Komponente des Pyruvat Dehydrogenase Komplexes
1. Prolyl-tRNA-Synthetase
2. NADPH-Sulfit Reduktase
1. GroEL / 60 kDa Chaperon
1. Trigger Faktor
2. Dihydrolipoamid Dehydrogenase
Pyruvat Kinase I
Translations Elongationsfaktor / EF-Tu
3-Oxoacyl-Synthase
1. ThiF Protein
2. L1 50 S ribosomales Protein
MTA/SAH Nukleosidase
Ribose 5-Phosphat Isomerase
Sequenzabdeckung (%)
55,1
72,6
13,9
81,6
68,1
31,4
76,8
31,5
24,4
55,0
44,4
49,6
41,1
71
Ergebnisse
3.7.4 Inhibitorstudien
Tiemann (1999) hatte versucht, durch die Zugabe der Inhibitoren 3-Methoxybenzamid und
1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (jeweils 2 mM) in Selektivagarplatten die Klonierung der ADPRibosyltransferasen ModA und ModB zu ermöglichen. Der Ansatz beruhte auf der Annahme,
dass eine Inhibierung der Enzyme deren Toxizität herabsetzt. Die in diesem Zusammenhang
durchgeführten Versuche waren aber erfolglos. Durch den direkten Einsatz der Inhibitoren
(2 mM) in einem ADP-Ribosylierungstest (2.12.1) mit aufgereinigtem ModB sollte überprüft
werden, ob überhaupt ein Einfluss auf die Aktivität des Enzyms besteht, und ob es sich bei
den T4 ADP-Ribosyltransferasen tatsächlich um die postulierten Arginin-spezifischen MonoADP-Ribosyltransferasen handelt (Wilkens et al., 1997). Abbildung 3.21 zeigt, dass das als
Inhibitor von Poly-ADP-Ribosyltransferasen beschriebene 3-Methoxybenzamid (Banasik &
Ueda, 1994) auf die Reaktion nicht hemmend sondern verstärkend wirkte (Spur 2). Im
Gegensatz dazu wurde durch den für Mono-ADP-Ribosyltransferasen spezifischen Inhibitor
1H,3H-Chinazolin-2,4-dion (Banasik & Ueda, 1994) eine im Vergleich zur Kontrolle (Spur 1)
ca. 50%ige Abschwächung des Signals (Spur 3) erreicht.
A)
M 1
B)
2
3
1
2
3
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.21: Auswirkung der ADP-RibosyltransferaseInhibitoren 3-Methoxybenzamid und 1H,3HChinazolin-2,4-dion auf die Aktivität von
ModB.
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel verschiedener Aktivitätstests.
B) Autoradiogramm von A
Spur M: 10 kDa Proteinmarker
Spur 1:ADP-Ribosylierungstest mit 2 mM 3-Methoxybenzamid
Spur 2:ADP-Ribosylierungstest mit 2 mM 1H,3H-Chinazolin-2,4-dion
72
Ergebnisse
Arginin-spezifische Mono-ADP-Ribosyltransferasen werden durch Zugabe von L-Arginin in
ihrer Funktion gestört, da es zu einer kompetitiven Verdrängung der Arginine des Zielproteins
kommt. L-Arginin bewirkte in ADP-Ribosylierungstests mit ModB bei einer Zugabe von
105 mM (Spur 2) einen deutlichen Aktivitätsverlust im Vergleich zur Kontrolle ohne Inhibitor
(Spur 3) (Abb. 3.22). Die Kontrolle wies neben dem Signal der Autoribosylierung von
Trx-ModB noch weitere radioaktiv markierte Banden auf. Dabei handelte es sich
wahrscheinlich um ModB- bzw. Thioredoxin-Anteile des Fusionsproteins. Diese wurden bei
einer Zugabe von 105 mM L-Arginin nicht mehr ADP-ribosyliert, so daß nur noch die
Trx-ModB detektierbar war. Wurden 210 mM Arginin zu dem ADP-Ribosylierungstest
gegeben (Spur 1), konnte keine ADP-Ribosylierungsaktivität mehr festgestellt werden.
A)
M
B)
1
2
3
1
2
3
- Trx-ModB
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.22: Auswirkung von L-Arginin auf die Aktivität der ADPRibosyltransferase ModB.
A) Coomassie gefärbtes Polyacrylamidgel verschiedener
Aktivitätstests
B) Autoradiogramm von A
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
10 kDa Proteinmarker
Ansatz mit 210 mM L-Arginin
Ansatz mit 105 mM L-Arginin
Kontrolle ohne L-Arginin
Ein weiterer wichtiger Hemmstoff für die Klasse der Mono-ADP-Ribosyltransferasen ist
Novobiocin (Banasik et al., 1992; Yamada et al., 1994). Die Enzyme ModA, ModB und Alt
wurden daher auch zusammen mit ansteigenden Novobiocin-Konzentrationen (0 mM, 5 mM,
50 mM) auf ihre Aktivität getestet. Die Abbildung 3.23 zeigt, dass alle T4 ADPRibosyltransferasen bei einer Konzentration von 50 mM Novobiocin vollständig in ihrer
Aktivität gehemmt wurden (Spur 3, 6 u. 9), während bei einer Konzentration von 5 mM
73
Ergebnisse
Novobiocin noch kein eindeutiger Einfluss feststellbar war (Spur 2, 5 u. 8). Bei dem Signal in
Spur 6 des Autoradiogramms handelte es sich um ein Artefakt das durch die starke
Radioaktivität in Spur 7 erzeugt wurde. Die Resuspension von ModA war nach dem ADPRibosyltransferasetest sehr schlecht, weshalb auch nur sehr wenig ModA auf das Gel geladen
wurde (Abb. 3.23,A, Spuren 7-9). Auffällig ist die trotzdem hohe Aktivität des Enzyms und
die dadurch verursachten sehr starken Signale im Autoradiogramm.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
50 kDa
30 kDa
Abb. 3.23: Auswirkung des spezifischen Mono-ADP-Ribosyltransferase Inhibitors auf die Aktivität von ModA,
ModB und Alt. Die ADP-Ribosyltransferasen wurden im Aktivitätstest unter Zugabe von 5 mM und
50 mM Novobiocin auf Autoribosylierungs-Aktivität gestestet.
A) Coomassie-gefärbtes Polyacrylamidgel mit verschiedenen ADP-Ribosylierungstests
B) Autoradiogramm des Polyacrylamidgels
Spur M:
Spur 1:
Spur 2:
Spur 3:
Spur 4:
Spur 5:
Spur 6:
Spur 7:
Spur 8:
Spur 9:
10 kDa Proteinmarker
Trx-ModB; Kontrolle ohne Novobiocin
Trx-ModB; mit 5 mM Novobiocin
Trx-ModB; mit 50 mM Novobiocin
Alt; Kontrolle ohne Novobiocin
Alt; mit 5mM Novobiocin
Alt; mit 50 mM Novobiocin
ModA; Kontrolle ohne Novobiocin
ModA; mit 5 mM Novobiocin
ModA; mit 50 mM Novobiocin
Alle getesteten ADP-Ribosyltransferase-Inhibitoren bestätigten die Voraussage, dass es sich
bei den ADP-Ribosyltransferasen um argininspezifische Mono-ADP-Ribosyltransferasen
handelt.
74
Ergebnisse
3.8 Nachweis katalytisch aktiver Aminosäuren
3.8.1 Ortsspezifische Mutagenese
Für Cholera Toxin und weitere ADP-Ribosyltransferasen wurde gezeigt, dass ein Austausch
des in diesen Enzymen konservierten Arginins zu einer deutlichen Verringerung bis hin zum
vollständigen Verlust der Aktivität führt (Burnette et al., 1991, Perelle et al., 1996).
Bazan & Koch-Nolte (1997) postulierten für die ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB
eine Reihe katalytisch essentieller Aminosäuren (Abb. 4.1). Der Austausch einzelner
Aminosäuren aus den vorhergesagten katalytischen Zentren sollte experimentell Aufschlüsse
über die Richtigkeit dieser Berechnungen erbringen.
Von dem Enzym ModB wurden die Mutanten R73A, E173A und die Doppelmutante
R73A/E173A erzeugt (2.10.8) und durch DNA-Sequenzierung bestätigt (2.10.9). Darüber
hinaus wurden weitere, bereits in früheren Arbeiten (Depping, 1998) sowie in Kooperation
mit der Arbeitsgruppe von Dr. habil. R. Nivinskas (Institut für Biochemie, Vilnius, Litauen)
erzeugte Mutanten getestet. Dabei handelte es sich um ModB F111A, F129A, N130A,
Y131A, E171A und Q172A. Im Fall von ModA wurden die Mutanten R72A, F127A, F129A
und E165A verwendet, die ebenfalls durch die Arbeitsgruppe Dr. habil. R. Nivinskas zur
Verfügung gestellt wurden.
3.8.2 Agaroseplattentest zur Toxizitätsbestimmung von ModA- und ModBMutanten
Die Mutanten der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB wurden in einem
Agaroseplattentest zur Überprüfung ihrer Toxizität eingesetzt, der auf dem Vergleich der
Koloniegrößen unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen beruht (2.9.8). Der
Bakterienstamm C41(DE3) wurde mit den einzelnen Wildtyp-, bzw. Mutanten-Plasmiden
transformiert. Ein Einsatz des Stamms BL21(DE3) kam hier nicht in Frage, da mit diesem
Stamm unter induzierten Bedingungen kein Wachstum festzustellen ist. In Tabelle 3.3 ist
aufgelistet, wie sich die einzelnen Mutationen auf die relativen Koloniegrößen auswirkten.
Aufgrund der Toxizität der Wildtyp-Enzyme zeigten die transformierten Zellen unter
induzierten Bedingungen kein Wachstum. Für die ADP-Ribosyltransferase ModA ist
festzustellen, dass die Mutationen R72A, F127A und F129A erhebliche Auswirkungen auf die
75
Ergebnisse
Enzymaktivität haben, da in diesen Fällen kein Koloniegrößenunterschied zu den nicht
induzierten Zellen messbar war. Die Mutation E165A hat nur eine abgeschwächte Wirkung
auf die Toxizität, so dass Koloniegrößen von 60-70% der Vergleichsgrößen beobachtet
werden konnten. Die Mutanten R73A, F129A, Y131A, E173A und R73A/E173A hatten zur
Folge, dass kein Unterschied zwischen den nicht-induzierten und induzierten Kolonien
vorhanden war. Die ebenfalls als katalytisch aktiv postulierte Position S111 bewirkte mit
Koloniegrößen von 70-80 % keinen kompletten Ausfall der Enzymaktivität. Eine nicht so
große Wirkung hatten die Mutationen E171A und Q172A mit Koloniegrößen von 60-70 %.
Tabelle 3.3: Ergebnisse der Agaroseplattentests zur Überprüfung der
Toxizitätder ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB sowie
deren Mutanten. Der Grad der Toxizität wird durch den Vergleich
des Wachstums unter induzierten und nicht induzierten
Bedingungen ermittelt.
Mutation
Koloniegröße
(% von nicht induziert)
ModA
Wildtyp
R72A
F127A
F129A
E165A
0
100
100
100
60-70
Wildtyp
R73A
R73A/E173A
S111A
F129A
N130A
Y131A
E171A
Q172A
E173A
0
100
100
70-80
100
80-90
100
60-70
60-70
100
ModB
Zusammenfassend deuten diese Beobachtungen daraufhin, dass die Aminosäuren R72, F127
und F129 in ModA für die katalytische Aktivität des Enzyms relevant sind. Entsprechend
scheinen für ModB die Positionen R73, F129, Y131 und E173 entscheidend zu sein.
76
Ergebnisse
3.8.3 ELISA zur Charakterisierung der ModB Mutanten
Um eine genauere Charakterisierung der Mutanten der ADP-Ribosyltransferase ModB zu
ermöglichen, wurde ein ELISA als Testverfahren etabliert (2.12.4).
Zunächst sollte eine Mutante ausgewählt werden, die keine katalytische Aktivität mehr
aufwies und deshalb als Zielprotein für eine Autoribosylierung verwendet werden konnte,
ohne das Ergebnis durch eigene Aktivität zu verfälschen. Aufgrund der Ergebnisse des
Agarosetests zur Toxizitätsbestimmung stellte die Mutante ModB R73A einen möglichen
Kandidaten dar. Diese wurde deshalb in einem ADP-Ribosyltransferasetest auf ihre Aktivität
überprüft (Abb. 3.24). Während für den ModB Wildtyp bei steigender ModB-Konzentration
eine zunehmende Autoribosylierung festgestellt wurde (Spur 1-4), zeigte die Mutante ModB
R73A keinerlei nachweisbare Aktivität (Spur 5-8) und war deshalb für die weiteren
Experimente geeignet.
1
2
3
4
5
6
7
8
Abb. 3.24: ADP-Ribosylierungstests der ModB-Mutante R73A.
links: ADP-Ribosylierungstests mit dem ModB-Wildtyp
rechts: ADP-Ribosylierungstest mit der ModB Mutante R73A
Spur 1: Ansatz mit 15 µg ModB
Spur 2: Ansatz mit 30 µg ModB
Spur 3: Autoradiogramm von 1
Spur 4: Autoradiogramm von 2
Spur 5: Ansatz mit 15 µg ModB R73A
Spur 6: Ansatz mit 30 µg ModB R73A
Spur 7: Autoradiogramm von 5
Spur 8: Autoradiogramm von 6
Für die Durchführung des ELISA wurde das katalytisch nicht mehr aktive Enzym zunächst an
die Plastikoberfläche einer Mikrotiterplatte gebunden. Anschließend erfolgte ein ADPRibosylierungstest mit biotinyliertem NAD+ als Substrat, in dessen Verlauf die immobilisierte
Mutante ModB R73A durch das zu testende Enzym modifiziert werden konnte. Die darauf
folgende Inkubation mit HRP-Streptavidin ermöglichte einen zum Grad der ADPRibosylierung proportionalen Umsatz des anschließend hinzugefügten HRP Substrats TACSSapphire™. Die Aktivitäten des ModB Wildtyps sowie der Mutanten R73A, S111A, E171A,
77
Ergebnisse
Q172A, E173A und R73A/E173A wurden auf diese Weise getestet und grafisch dargestellt
(Abb. 3.25). Das ModB Wildtyp-Enzym zeigte eine Zunahme der OD630 mit steigender
Enzymkonzentration. In Relation zum Wildtyp waren bis auf S111A alle getesteten Mutanten
in ihrer Aktivität herabgesetzt. Die Mutanten R73A und E173A zeigten einen kompletten
Verlust ihrer katalytischen Aktivität und verhielten sich wie die Kontrolle ohne Enzym. Für
E171A und Q172A konnte eine deutliche Reduktion der Aktivität auf ca. 60 %, bzw. 64 %
festgestellt werden, während der Umsatz von S111A um ca. 24 % gesteigert wurde. Diese
Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen des Toxizitätstests im Wesentlichen überein.
A
B
0,3
0,3
O.D. wt
O.D. R73A
O.D. E173A
O.D. 630
0,25
O.D. R73/E173
O.D. E171A
0,2
0,2
O.D. Q172A
O.D. S111A
0 Kontrolle
0,15
0,1
0,1
0,05
0
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17
2A
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E1
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A
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wt
10
15
Enzym [µg]
R
73
A
5
0K
on
tro
lle
0
0
Abb. 3.25: Darstellung der Aktivität von ModB und verschiedenen ModB Mutanten. Die Messung der
Aktivität erfolgte im ELISA.
A) Aktivität in Abhängigkeit zur eingesetzten Enzymmenge
B) Säulendiagramm der ELISA-Werte bei eingesetzten 20 µg Enzym
3.8.4 Sekundärstrukturanalyse
Durch CD-Spektroskopie (2.13) sollte eine Analyse von ModB und der ModB Mutanten
durchgeführt werden, mit dem Ziel, die Auswirkungen der eingeführten Mutationen auf die
Sekundärstrukturverteilungen der Proteine zu untersuchen. Für die Messungen wurden
möglichst übereinstimmende Proteinkonzentrationen eingesetzt, um vergleichbare Spektren zu
erhalten. Die Abbildung 3.25 zeigt das CD-Spektrum des ModB Wildtyps (A) und der
ModB-Mutanten R73A, E171A, R173A und R73A/R173A (B). Die CD-Spektren der ModB
Mutanten verlaufen in allen Fällen parallel, wobei sich ein geringfügig unterschiedlicher
Amplitudenausschlag abzeichnete.
78
Ergebnisse
CD
Wellenlänge [nm]
Abb. 3.26: CD-Spektren von ModB und ModB-Mutanten
(---) ModB
(---) ModB R73A
(---) ModB E171A
(---) ModB R173A
(---) ModB R73A/E173A
Mit Hilfe eines Programms zur Sekundärstrukturvorhersage wurden aus den CD-Spektren die
Verteilungen von Sekundärstrukturen berechnet. Dabei dienten CD-Spektren von Proteinen
mit bekannter Struktur als Referenz. Am Beispiel des ModB Wildtyps ist das Ergebnis der
Sekundärstrukturvorhersage in Abbildung 3.27 dargestellt.
Abb 3.27: Berechnung der Sekundärstrukturvorhersage auf der
Grundlage des gemessenen CD-Spektrums des ModBWildtyps. Aufgetragen ist der Cirkulare Dichroismus (CD
[mdeg] gegen die Wellenlänge [nm]).
(––––) gemessenes CD-Spektrum
(------) berechnetes CD-Cpektrum
(ּּּּּּ) Differenz zwischen gemessenem und berechnetem CD-Spektrum
79
Ergebnisse
Die Differenz zwischen dem berechneten Spektrums (gestrichelte Linie) und dem gemessenen
Spektrum
(durchgezogene
Linie)
wird
durch
die
gepunktete
Linie
angezeigt.
Zusammengefasst sind die Sekundärstrukturverteilungen in Tabelle 3.5 angegeben. Die
ermittelten Anteile an α-Helices lagen für alle Mutanten im Bereich zwischen 14,6 % und
17,2 %. Damit war die höchste Abweichung vom Wildtyp mit 2,4 % im Rahmen der
Messungenauigkeit. Für die β-Faltblätter verhielt es sich mit Ausnahme der Mutante ModB
R73A, die einen β-Faltblatt-Anteil von 30, 6 % aufwies, ähnlich. Die Mutanten ModB E171A,
ModB E173A und ModB R73A/E173A wiesen hier mit einer maximalen Differenz von 5,5 %
ebenfalls eine geringe Divergenz auf.
Tabelle 3.5: Aufstellung der ermittelten Sekundärstrukturverteilungen von ModB
und den ModB-Mutanten. Aus den CD-Spektren wurde unter
Verwendung des Programms "Protein Secondary Structure
Estimation" die prozentuale Verteilungen von α-Helices und
β-Faltblättern berechnet.
α-Helix (%)
β-Faltblatt (%)
ModB wt
17,0
41,7
ModB R73A
17,2
30,6
ModB E171A
14,6
40,0
ModB E173A
15,2
36,5
ModB R73A/E173A
16,2
36,2
3.9 Temperatursensitivität von ModB
Der von Rohrer et al. (1975) beschriebene ADP-Ribosylierungstest wird bei einer
Inkubationstemperatur von 15 °C durchgeführt. Der Bakteriophage T4 findet seinen Wirt
E. coli aber auch in Umgebungen mit deutlich davon abweichenden Temperaturen. Dies lässt
vermuten, dass die vom Bakteriophagen kodierten Proteine diesen Temperaturbereichen
angepasst sind. Um zu überprüfen, bei welcher Temperatur die vom Bakteriophagen kodierte
ADP-Ribosyltransferase
ModB
die
größte
Aktivität
besitzt,
wurde
das
Enzym
unterschiedlichen Temperaturen und Inkubationszeiten ausgesetzt. Anschließend erfolgte die
Bestimmung der Aktivität in ELISA-Tests (2.12.4).
80
Ergebnisse
Die höchste Aktivität zeigte das Enzym nach einer Inkubation bei 20 °C für 1,5 h (Abbildung
3.28). Diese Aktivität verringerte sich auf 71 % bei Bedingungen von 4 °C für 1,5 h, bzw.
20 °C für 16 h. Eine annähernd komplette Inaktivierung wurde nach 1 h bei 37 °C erreicht.
Wurde das Enzym unter den normalen Lagerbedingungen bei -20 °C gehalten und direkt im
Test eingesetzt, konnte nur ca. 50 % der Maximal-Aktivität erreicht werden. Aufgrund der
Erkenntnisse dieser Experimente wurden die im späteren Verlauf der Arbeiten durchgeführten
ADP-Ribosylierungstests durch die Erhöhung der Inkubationstemperatur angepasst.
Temperatursensitivität ModB
0,35
0,3
O.D. 630
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Kontrolle
ohne ModB
´-20 °C
1,5h 4°C
1,5h 20°C
16h 20°C
1h 37 °C
Abb. 3.28: Änderung der Aktivität von ModB in Abhängigkeit von der Temperatur. Der Test
wurde mit ModB durchgeführt das zunächst der angegebenen Temperatur ausgesetzt
wurde. Die Balken geben die im ELISA erreichte optische Dichte an.
81
Diskussion
4 Diskussion
Der Bakteriophage T4 kodiert für die drei ADP-Ribosyltransferasen Alt, ModA und ModB.
Rohrer et al. (1975) reinigten das Alt Protein aus Phagenköpfen und führten eine erste
biochemische Charakterisierung durch. Erst sehr viel später gelang es, das alt Gen zu
sequenzieren und in einen Überexpressionsvektor zu klonieren (Koch, 1993). Obwohl es
damit
möglich
wurde,
das
Protein
sehr
homogen
zu
reinigen
und
in
Kristallisationsexperimenten einzusetzen, ist die Struktur bis heute noch nicht aufgeklärt
(Koch et al., 1995; Koch, 1999). Die physiologische Funktion von Alt konnte mit der
koordinierten Transkriptionskontrolle durch den Bakteriophagen T4 in Verbindung gebracht
werden (Goff, 1974; Goff, 1984; Wilkens et al., 1997). Vernetzt mit dieser Funktion ist die
der zweiten ADP-Ribosyltransferase, ModA, da beide Enzyme teilweise die selben Proteine
modifizieren (Tiemann et al., 1999). Dass neben den bereits genannten Enzymen eine weitere
ADP-Ribosyltransferase durch T4 kodiert wird, ist eine vergleichsweise neue Erkenntnis. Im
Rahmen von Sequenzierungsarbeiten des modA Gens konnte ein weiterer offener Leserahmen
gefunden werden. Dieser wurde modB genannt; das durch ihn kodierte Protein ließ sich durch
ein Alignment (Abb. 4.1) mit den Sequenzen verschiedener ADP-Ribosyltransferasen
ebenfalls dieser Enzymklasse zuordnen (Bazan & Koch-Nolte, 1997; Wilkens et al., 1997).
ExoA
DT
hlET
CT
PT
Alt T4
Alt T6
ModA
ModB
G
.
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.
D
P
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P
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Y
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β6
Abb. 4.1: Alignment der Aminosäuresequenzen von verschiedenen prokaryontischen Toxinen und der der
Bakteriophagen T4 und T6 (verändert nach Wilkens et al., 1997).
ExoA: Pseudomonas Exotoxin A; DT: Diphtherie Toxin; hlET: Hitzelabiles Enterotoxin von
E. coli; CT: Cholera Toxin; PT: Pertussis Toxin; Alt T4: Alt Protein aus dem Phagen T4;
Alt T6: Alt-Protein aus dem Phagen T6; ModA: ModA Protein aus dem Phagen T4; ModB:
ModB Protein aus dem Phagen T4.
82
Diskussion
Sowohl für ModA als auch für ModB konnten die Leserahmen in Überexpressionsvektoren
kloniert werden (Tiemann, 1999). Eine umfassende Aufklärung der genauen physiologischen
Funktion dieser Enzyme und die Lösung ihrer dreidimensionalen Struktur wurde bis heute
allerdings noch nicht geleistet.
Die Reinigung der ADP-Ribosyltransferasen des Bakteriophagen T4 sollte als Grundlage für
die Erzeugung von Proteinkristallen und der damit möglichen Röntgenstrukturanalyse sowie
der Aufklärung der durch diese Enzyme modifizierten Zielproteine dienen.
Die Reinigung von Proteinen in großen Mengen setzt deren Expression in
Überexpressionsstämmen voraus.
Die Expression der Genprodukte ModA und ModB ist aufgrund ihrer Toxizität für E. coli nur
in stringent kontrollierten Expressionsvektoren möglich (Depping, 1998; Tiemann, 1999). Die
Toxizität beider Genprodukte erwies sich im Verlauf von Klonierungsarbeiten, da eine
Integration beider Gene in allgemeine Klonierungsvektoren wie z.B. pBlueskript nicht
möglich war (Tiemann et al., 1999). Diese Ergebnisse bestätigten die zuvor gemachte
Beobachtung von Mosig et al. (1998), dass nur inaktive ModA Mutanten klonierbar waren.
Die Expression von T4 Proteinen im homologen Wirt E. coli ist häufig mit erhöhter Toxizität
verbunden, wie es schon für verschiedene phagenkodierte Proteine gezeigt werden konnte
(Tomaschewski, 1988; Bouet et al., 1994). Das pET-Expressionssystem hingegen war für die
Überexpression von ModA und ModB gut geeignet (Studier & Moffat, 1986; Depping, 1998).
Die Stringenz dieser Vektoren wird durch den hier vorhandenen T7 Promotor erreicht, der
eine vorzeitige Transkription der zu exprimierenden Gene durch die E. coli RNA-Polymerase
verhindert (Dunn & Studier, 1983; Hawley & McClure, 1983).
Die exprimierten Proteine ModA und ModB lagen nach der Expression in
Einschlusskörpern vor, deren Bildung vermieden werden sollte.
Die extrem hohe Transkriptionsrate von Genen, die durch den T7 Promotor reguliert werden,
in Verbindung mit dem starken Translationsstartsignal der pET-Vektoren, könnte im Verlauf
der Expression von ModA und ModB zur Bildung von Einschlusskörpern geführt haben.
Wesentliche Anteile des vorhandenen Proteins waren damit einer Reinigung unter nativen
Bedingungen nicht zugänglich. Für die Reinigung eines Proteins können Einschlusskörper von
Vorteil sein, da durch deren Isolierung bereits Reinheitsgrade von bis zu 90 % erreicht werden
können (Langley et al., 1987). Dieses Verfahren setzt allerdings ein effektives
83
Diskussion
Renaturierungsprotokoll voraus, um das dann vorgereinigte Protein bis zur Homogenität
weiter zu reinigen.
Zu Beginn der Arbeiten wurde deshalb durch Variation der Expressionsbedingungen versucht,
die Bildung von Einschlusskörpern zu verhindern. Da der Bildungsprozess von
Proteinaggregaten bzw. Einschlusskörpern noch nicht vollständig aufgeklärt ist, müssen für
jedes Protein neue empirische Daten gewonnen werden. Die Hauptparameter sind durch
Wilkinson & Harrison (1991) mit der mittleren Ladung der Aminosäuren, dem Anteil an
schleifenbildenden Aminosäuren, dem Cystein- und Prolingehalt, der Hydrophobizität und der
Gesamtanzahl der Aminosäuren angegeben worden. Insbesondere die intermolekularen
Assoziationen von hydrophoben Domänen scheinen eine Rolle zu spielen (Rudolph et al.,
1979). Die Exposition von hydrophoben Oberflächen wird z.B. hervorgerufen durch die
Existenz vieler Faltungsintermediate und steht deshalb in Relation zu einer hohen
Translationsrate (Mitraki et al., 1987; Mitraki & King, 1989).
In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die Reduktion der Kultivierungstemperatur auf
30 °C eine Erhöhung des Anteils an nativen Proteinen in einer Überexpressionskultur
bewirken kann, da hierdurch die Syntheserate reduziert wird (Schein & Noteborn, 1988). Für
die ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB ließ sich innerhalb des getesteten
Temperaturbereichs zwischen 16 °C und 37 °C allerdings keine verbesserte Löslichkeit
ermitteln.
Die Annahme, dass die korrekte Faltung eines neusynthetisierten Polypeptids ein intrinsisches
Merkmal seiner Primärstruktur ist, ist ein Modell, das auf den Pionierarbeiten von Anfinsen et
al. (1973) mit gereinigter Ribonuklease A beruht. Die relativ hohe Proteinkonzentration im
Cytosol (ca. 300 mg/ml) führt allerdings zu verfrühten Interaktionen eines wachsenden
Polypeptides mit anderen Intra- oder Interpolypeptid-Domänen und damit zur Aggregation
bzw. Fehlfaltung (Georgopoulos et al., 2000). Um diesem Problem zu begegnen, existieren
eine Reihe von Proteinen, die Chaperone, mit der primären Funktion, die korrekte Faltung von
Polypeptiden sicher zu stellen (Ellis, 1991). Für E. coli scheinen insbesondere die Proteine
GroEL und GroES von herausragender Bedeutung zu sein, da deren Gene unter allen
getesteten Bedingungen essentiell sind (Fayet et al., 1989). Für die Annahme, dass auch die zu
exprimierenden Proteine ModA und ModB Chaperone als Faltungshelfer benötigen, sprechen
drei wesentliche Hinweise:
-
Es konnten E. coli GroE Mutanten isoliert werden, die das Wachstum des
Bakteriophagen T4 blockieren. Dieser Effekt zeigt die hohe Bedeutung von
84
Diskussion
Chaperonen für T4 und damit auch die grundsätzliche Möglichkeit, dass die
ADP-Ribosyltransferasen
Helferproteine
für
ihre
Faltung
benötigen
(Georgopoulos et al., 1972; 1979).
-
Co-Immunopräzipitationsexperimente zeigten, dass ca. 10 % aller neusynthetisierten
Polypeptide vorrübergehend mit GroEL assoziiert sind (Ewalt et al., 1997).
-
Der Bakteriophage T4 kodiert für verschiedene virion-spezifische Chaperone. Das
Gp31 kann das E. coli Co-Chaperon GroES komplett substituieren und ist essentiell
für die Faltung des Haupt-Capsidproteins Gp23 (Andreadis & Black, 1998). Das T4
Protein Gp40 besitzt Homologien zu den eukaryontischen Chaperonen Cyclofilin C
und CPN1, bei denen es sich um Analoga zu den E. coli Chaperonen Trigger Faktor
und GroEL handelt (Marusich et al., 1998). Gp 40 partizipiert an der Assemblierung
von Gp20 und damit der Formierung des Procapsids (Marusich et al., 1998). Das
Chaperon Gp57A ist essentiell für die Faltung und Oligomerisation der langen und
kurzen Schwanzfasern; zusammen mit Gp38 ist es beteiligt an der Bildung der distalen
Fasern. Das durch das wac (Whiskers Antigen Control) Gen kodierte Chaperon
Fibritin ist an der Assemblierung der langen Schwanzfasern beteiligt und außerdem ein
Bestandteil des Virions (Marusich et al., 1998).
Sollte die obengenannte Annahme zutreffen, wäre es denkbar, dass die zellulär vorhandenen
Chaperone im Verlauf einer Überexpression austitriert werden und somit nicht für die Faltung
von nativem ModA und ModB zur Verfügung stehen. Eine Co-Expression von Chaperonen
kann in diesen Fällen zu einer Erhöhung des Anteils an nativem Protein führen (Goloubinoff
et al., 1989; Buchner et al., 1991; Blum et al., 1992). Allerdings ist eine Vorhersage der
Chaperonwirkung nicht möglich und die entsprechende Substrat-Chaperon Kombination muss
experimentell bestimmt werden (Yasukawa et al., 1995).
Die reine Co-Expression von GroEL und Dnak bewirkte in den durchgeführten Arbeiten keine
verbesserte Löslichkeit. Mögliche Ursachen könnten in einer notwendigen spezifischen
Interaktionsreihenfolge mit verschiedenen Chaperonen liegen (Langer et al., 1992). Dieser
Fall wurde am Beispiel des humanen Lysozyms gezeigt, wo die Co-Expression von Trigger
Faktor und GroEL-GroES synergistisch auf die Produktion von löslichem Protein wirkte,
während die Co-Expression der einzelnen Chaperone nur eine geringe Ausbeute ermöglichte
(Nishihara et al., 2000). Es könnte sich für ModA und ModB möglicherweise um die falschen
Chaperone gehandelt haben und es wäre denkbar, dass eines der T4-eigenen Chaperone für
eine korrekte Faltung notwendig ist.
85
Diskussion
Die Löslichkeit von Proteinen kann grundsätzlich auch durch die Fusion mit dem hydrophilen
Protein Thioredoxin (Trx) oder dem Protein NusA erhöht werden (LaVallie et al., 1993;
Hlavac & Rouer, 1997; Harrison, 2000). Die Fusion von ModB mit Thioredoxin verbesserte,
genauso wie für ModA bereits beobachtet, die Löslichkeit des Proteins nicht (Tiemann, 1999).
Hier konnte auch der Wechsel des Fusionsanteils zu NusA keine positiven Effekte
hervorrufen. Möglicherweise ist die Aggregationsfähigkeit von ModA und ModB trotz keiner
besonders ausgeprägten Hydrophobizität ungewöhnlich hoch und liegt damit über der
Löslichkeit von Thioredoxin oder NusA.
Wie sich im weiteren Verlauf der Experimente herausstellte, ist auch die Wirkung der ADPRibosyltransferasen auf die Chaperone und Thioredoxin selbst als Ursache in Betracht zu
ziehen. Sowohl GroEL als auch Thioredoxin sind Ziel einer ADP-Ribosylierungsreaktion,
wodurch möglicherweise deren Funktion moduliert oder verhindert wird. Dieser Aspekt wird
im späteren Verlauf der Ausführungen noch genauer diskutiert.
Ungeklärt blieb, weshalb eine Expression der ADP-Ribosyltransferase Alt in einem
konstitutiv exprimierenden Vektor scheinbar ohne Wirkung auf E. coli durchgeführt werden
konnte (Koch et al., 1995). Diese Frage ist umso interessanter, da das Zielproteinspektrum
dieses Enzyms nicht nur deutlich größer ist, sondern auch teilweise mit ModA und ModB
übereinstimmt (Depping, 1998; Tiemann, 1999). Die Wahrscheinlichkeit, dass durch Alt ein
für E. coli essentielles Genprodukt modifiziert wird und damit eine Beeinträchtigung des
bakteriellen Stoffwechsels stattfindet, sollte deshalb eigentlich erheblich höher sein. Diese
Frage wird erst mit der umfassenden Kenntnis der Zielproteinspektren der drei Enzyme
erklärbar sein, welche allerdings zur Zeit nicht verfügbar sind.
Reinigung der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB
Obwohl die Einschlusskörperbildung bei der Expression von Proteinen ein weit verbreitetes
Phänomen ist, wurde über deren strukturelle Eigenschaften bisher nur wenig bekannt. Wie
Oberg et al. (1994) gezeigt haben, sind in Einschlusskörpern die zur Ausbildung der nativen
Struktur notwendigen Sekundärstrukturen teilweise vorhanden. Diese gehen im Prozess einer
Denaturierung mit Harnstoff oder GuHCl allerdings verloren, was als einer der Hauptgründe
für die schlechten Renaturierungsquoten aus Einschlusskörpern angesehen wird (Mitraki et
al., 1987; Dill & Shortle, 1991; Przybychien et al., 1994). Eine Renaturierung ohne die
Auflösung der schon gebildeten Sekundärstrukturen sollte sich deshalb als effektiver
86
Diskussion
erweisen. Khan et al. (1998) zeigten, dass Einschlusskörper in einem 2 M Harnstoff
enthaltenden Puffer mit einem pH Wert von 12,0 gelöst werden können, ohne die dem nativen
Zustand ähnlichen Sekundärstrukturen zu zerstören. Damit läßt sich die Rückfaltung deutlich
effizienter gestalten. Dieses Verfahren wurde deshalb auch für ModA und ModB angewendet
und erwies sich in beiden Fällen als sehr erfolgreich. Auch bei hohen Proteinkonzentrationen
von bis zu 3 mg/ml im Fall von ModA bzw. 5 mg/ml im Fall von ModB konnten die Proteine
mit guten Ausbeuten renaturiert werden. Damit war die Möglichkeit gegeben, große Mengen
aktives Protein zu erzeugen sowie eine zur Homogenität führende Reinigung durchzuführen.
Die eigentliche Reinigung von ModA und ModB erfolgte über eine immobilisierte
Metallchelat-Affinitätschromatographie (Porath et al., 1975; 1992). Beide Proteine verfügten
in den verschiedenen Konstrukten über Poly-Histidin Fusionsanteile und konnten deshalb über
deren relativ hohe Affinität zu zweiwertigen Metallionen wie z.B. Ni2+ an die verwendete NiNTA Säulenmatrix gebunden werden. Die entsprechenden Poly-Histidinsequenzen ließen sich
durch Western-Blot Experimente entweder mittels eines Poly-Histidin Antikörpers oder durch
Ni-NTA Konjugat eindeutig nachweisen. Eluiert man die Proteine anschließend mit Imidazol,
ist es möglich, das gewünschte Protein in einem Reinigungsschritt von einem
Gesamtproteinanteil < 1 % auf > 95 % Homogenität zu reinigen (Janknecht et al., 1991). Die
renaturierten Proteine wurden unter nativen Bedingungen gereinigt, wobei allerdings
festgestellt werden musste, dass die für das Säulenmaterial angegebene Bindekapazität von 510 mg Protein pro ml Säulenmaterial nicht erreicht wurde. Insgesamt war es mit dieser
Methode möglich, aus einer 500 ml Überexpressionskultur innerhalb von drei Tagen bis zu 7
mg, ca. 95 % homogen, gereinigtes ModA und ModB Protein zu erhalten. Der Verlauf der
Reinigung war dabei gut reproduzierbar und das gereinigte Protein von gleichbleibender
Qualität.
Außerdem
wiesen
die
gereinigten
ADP-Ribosyltransferasen
in
ADP-
Ribosylierungstests nach Rohrer et al. (1975) eine reproduzierbare enzymatische Aktivität auf.
Charakterisierung der ADP-Ribosyltransferasen mittels Inhibitorstudien
Um die genaue Funktion und Struktur von ADP-Ribosyltransferasen oder anderen Enzymen
zu erforschen, werden häufig Inhibitoren eingesetzt (Banasik & Ueda, 1994). Für Mono- und
Poly-ADP-Ribosyltransferasen wurden eine Reihe spezifischer Inhibitoren beschrieben
(Banasik & Ueda, 1994; Rankin et al., 1989). Die Klassifizierung der Proteine ModA und
ModB als argininspezifische Mono-ADP-Ribosyltransferasen erfolgte zuerst anhand
theoretischer Berechnungen (Wilkens et al., 1997). Dass es sich bei diesen beiden Proteinen
87
Diskussion
um ADP-Ribose übertragende Enzyme handelt, war mit Hilfe des Aktivitätstests nach Rohrer
et al. (1975) direkt nachweisbar. Durch den Einsatz von spezifischen Inhibitoren wurde der
Nachweis erbracht, daß es sich um Mono-ADP-Ribosyltransferasen handelt. Die Zugabe von
Novobiocin (50 mM), einem spezifischen Inhibitor für Mono-ADP-Ribosyltransferasen
(Banasik & Ueda, 1994), zeigte für ModA, ModB und Alt eine vollständige Inhibierung der
katalysierten Reaktion. Auch die dabei eingesetzte Konzentration entsprach einer
Größenordnung, wie sie für andere Mono-ADP-Ribosyltransferasen nachgewiesen wurde
(Banasik & Ueda, 1994). Für ModB wurden zusätzlich die Inhibitoren 3-Methoxybenzamid
und 1H,3H-Chinazolin-2.4-dion getestet, die für Poly-ADP-Ribosyltransferasen bzw. MonoADP-Ribosyltransferasen spezifisch sind. Die ermittelte 50 %-ige Abschwächung durch die
eingesetzte Konzentration an 1H,3H-Chinazolin-2.4-dion und die nicht feststellbare
Inhibierung durch 3-Methoxybenzamid unterstützt ebenfalls eine Eingliederung in die Klasse
der Mono-ADP-Ribosyltransferasen. Die noch etwas genauere Klassifizierung von ModB als
argininspezifisch erfolgte aufgrund der Experimente mit L-Arginin. Durch die Zugabe dieser
Aminosäure werden die Enzyme dieser ADP-Ribosyltransferase-Klasse gehemmt, da es zu
einer kompetitiven Verdrängung der Zielproteine kommt. Die komplette Inhibierung von
ModB durch Zugabe von 210 mM Arginin in die Aktivitätstests entsprach deshalb den
Erwartungen. Für ModA und Alt war diese Eingliederung schon durch frühere Experimente
gegeben (Goff, 1974; Rohrer et al. 1975).
Die ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase durch Alt und
ModA.
Die Enzyme Alt und ModA ADP-ribosylieren während der frühesten Phase einer T4 Infektion
die α-Untereinheit der E. coli RNA-Polymerase und sind damit an der Transkriptionsregulation der frühen T4 Gene beteiligt (Wilkens & Rüger, 1994). Dabei bewirkt diese
Modifikation eine Umschaltung der Transkription von bakteriellen Promotoren hin zu frühen
Phagenpromotoren (Wilkens et al., 1997). Da das Ziel der ADP-Ribosylierung die
Aminosäure Arg265 in der carboxyterminalen Domäne der α-Untereinheit ist, stellt sich die
Frage, welche genauen chemisch-physikalischen Folgen der Modifikation diese Umschaltung
bewirken. Statistische Analysen von allen bekannten Promotoren ermittelten konservierte
Hexanukleotide (-10 und –35 Regionen) sowie einige weitere spezifische Elemente, die durch
DNA-bindende Domänen der RNA-Polymerase erkannt werden (Rozkot et al., 1989; Liebig
& Rüger, 1989; Lisser & Margolit, 1993, Ross et al., 1993). Bei der Erkennung dieser
88
Diskussion
Elemente ist die α-carboxyterminale Domäne der RNA-Polymerase (αCTD) von besonderer
Bedeutung. So konnte die Interaktion mit stromaufwärtsliegenden Promotorelementen (UPElementen) für den ribosomalen Promotor rrnB P1 nachgewiesen werden (Ross et al., 1993;
1998). In diesem Zusammenhang zeigten Gaal et al. (1996), dass die Punktmutation R265A
der αCTD für die Transkription von UP-Element abhängigen Promotoren den gleichen Effekt
wie eine komplette Deletion des Carboxyterminus hat. Über diese Domäne findet auch die
Interaktion mit vielen Transkriptionsaktivatoren statt, wie z.B. den Klasse I Aktivatoren (Zou
et al., 1992; Ishihama, 1993; Gaal et al., 1996). Es lässt sich daher vermuten, dass die ADPRibosylierung am Arg265 die Transkriptionsaktivatoren und stromaufwärtsbefindlichen
Bereiche der ribosomalen Promotoren an der Stimulierung der Transkription hindert und
dadurch der schnelle Zusammenbruch der Wirtstranskription nach einer T4 Infektion
verursacht wird (Zou et al., 1992; Ross et al., 1993; Tang et al., 1994; Ishihama, 1993). Auch
für Promotoren ohne UP-Elemente ist die αCTD von Bedeutung, allerdings wird sie hier nicht
für die Transkriptionsinitiation benötigt sondern für die Bildung des offenen Transkriptionskomplexes (Igarashi & Ishihama, 1991; Burns et al.; 1999).
Es ist augenscheinlich, dass neben der Promotor-Primärstruktur auch weitere physikalischchemische Charakteristika, wie die Gesamtgeometrie, die Verformbarkeit und dynamische
Eigenschaften, eine wichtige Rolle bei der Interaktion von Enzym und Promotor spielen
(De Haseth & Helmann; 1995; Kamzolova et al., 1999). Eine fundamentale Eigenschaft, die
die Interaktion von Makromolekülen mit verschiedenen Liganden beeinflusst, ist die
Verteilung des elektrostatischen Potentials der Umgebung (Kamzolova et al., 2000). Die DNA
ist ein stark geladenes Polyelektrolyt, dessen elektrostatisches Potential möglicherweise eine
der Haupteigenschaften ist, durch die DNA-bindende Proteine sie erkennen.
Verschiedene Ursachen kommen für die veränderte Promotorspezifität der ADP-ribosylierten
RNA-Polymerase in Betracht:
-
Der relativ große und sperrige ADP-Ribosylrest am Arg265 könnte konformationelle
Änderungen der α-Untereinheit oder sogar des Holoenzyms bewirken.
-
Der Austausch einer positiven Ladung am Arginin durch zwei negative
Sauerstoffladungen verändert die elektrostatischen Eigenschaften der α-Untereinheiten
und damit die DNA-Erkennung.
In Abbildung 4.2 ist die dreidimensionale Struktur der αCTD dargestellt. Eine sichtbare
Änderung der dreidimensionalen Struktur durch die ADP-Ribosylierung ist nicht feststellbar,
da die Struktur der αCTD fast identisch mit der unmodifizierten αCTD ist (Kamzolova et al.,
89
Diskussion
2000). Dieser Faktor sollte deshalb nicht für die veränderten regulatorischen Eigenschaften
der modifizierten RNA-Polymerase verantwortlich sein.
Abb. 4.2: 3D-Darstellung des Aminosäure-Rückgrats der CTDStruktur der α-Untereinheit der E. coli RNAPolymerase. Die native (blau) und die ADP-ribosylierte
(rot) Struktur weichen nur geringfügig voneinander ab.
Die Modifikation der α-Untereinheit der RNA-Polymerase führt durch die Addition einer
negativ geladenen ADP-Ribose im C-Terminus zu einer substantiellen Änderung des
elektrostatischen Potentials. Abbildung 4.3 zeigt die Ladungsverteilung der RNA-Polymerase
α-Untereinheit im nativen und ADP-ribosylierten Zustand und die damit verbundene
spezifische Änderung im Profil der elektrostatischen Potentialverteilung. Die Modifikation
betrifft
insbesondere
die
Topologie
des
elektrostatischen
Potentials
der
an der
Promotorerkennung beteiligten Region, so dass hier die Ursache für die veränderte Selektivität
der RNA-Polymerase zu sehen ist (Kamzolova et al., 2000).
90
Diskussion
A
B
Abb. 4.3: Verteilung des elektrostatischen Potentials der CTD der α-Untereinheit der RNA-Polymerase (aus
Kamzolova et al., 2000).
A) nativer Zustand
B) ADP-ribosylierter Zustand
Die Zielproteine der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt
Neben der beschriebenen ADP-Ribosylierung der α-Untereinheit der RNA-Polymerase durch
ModA und Alt werden durch die drei ADP-Ribosyltransferasen noch weitere E. coli Proteine
modifiziert. Tiemann (1999) zeigte, dass die einzelnen Modifikationen unabhängig
voneinander ablaufen. Aus diesem Grund muss für jedes Enzym das Zielproteinspektrum
getrennt von den anderen beiden betrachtet werden. In einem in vitro ADP-Ribosylierungstest
nach Rohrer et al. (1975) konnte durch eine Übertragung des ADP-Ribose-Anteils vom
32
PNAD+ auf die Zielproteine eine radioaktive Markierung durchgeführt werden, die
anschließend durch Autoradiographie nachgewiesen wurde. Auf diese Weise ließ sich das
Zielproteinspektrum der drei Enzyme eindimensional darstellen.
Die
Zielproteine
von
allen
drei
Enzymen
kommen
jeweils
in
einem
weiten
Molekulargewichtsbereich von ca. 10 kDa bis ca. 120 kDa vor. Bei der Auftrennung der
Proteine
eines
ADP-Ribosylierungstests
mit
E. coli-Gesamtzellextrakt
in
einer
eindimensionalen Gelelektrophorese ist es statistisch möglich, daß vier bis fünf verschiedene
Proteine in einer Bande vorliegen. Damit ist die eindeutige Identifizierung eines markierten
Zielproteins häufig nicht möglich. Um eine bessere Auftrennung der Proteine zu erreichen,
wurde deshalb die Methode der hochauflösenden, zweidimensionalen Gelelektrophorese
eingeführt (O´Farrell, 1975; Görg et al., 1985; 2000). Hiermit war die Möglichkeit gegeben,
die radioaktiv markierten Proteine nach ihrem isoelektrischen Punkt und ihrem
Molekulargewicht zu trennen und damit die Kontaminationen in den lokalisierten Proteinspots
weiter zu minimieren. Dies war eine Voraussetzung für die anschließend durchgeführten
91
Diskussion
Protein-Identifizierungen, die mittels N-terminaler Sequenzierung oder verschiedener
massenspektrometrischer Methoden erfolgten.
Für ModB war bereits bekannt, dass durch dieses Enzym das ribosomale Protein S1
modifiziert wird (Depping, 1998; Tiemann et al., 1999). S1 ist als Teil der 70S Ribosomen an
der Bindung der mRNAs und der korrekten codonabhängigen Selektion der AminoacyltRNAs beteiligt (Subramanian, 1983; Potapov & Subramanian, 1992). Die ADPRibosylierung dieses Proteins durch ModB lässt deshalb auf eine Beteiligung der ADPRibosyltransferasen an der Translationskontrolle schließen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte
das Zielproteinspektrum von ModB um den E. coli Trigger Faktor, den Elongationsfaktor
EF-Tu und mit großer Wahrscheinlichkeit Thioredoxin erweitert werden. Allerdings erfolgte
der Nachweis der Modifikation beim Thioredoxin in abweichender Weise, nämlich durch eine
ADP-Ribosylierung des vom ModB-Thioredoxin-Fusionsprotein proteolytisch abgespaltenen
Thioredoxin. Bei diesen drei identifizierten Proteinen handelt es sich ebenfalls um wichtige an
der Translation beteiligte Proteine.
Der Trigger Faktor und EF-Tu dienen auch als Zielproteine für Alt. Weitere durch Alt
modifizierte E. coli Proteine sind die Dihydrolipoamid Acetyltransferase, das Chaperon
GroEL, die Pyruvat Kinase I, die MTA/SAH Nukleosidase, die Ribose-5-Phosphat-Isomerase
und die 3-Oxoacyl-Synthase. Da in einigen Spots zwei Proteine identifiziert wurden, ließen
sich folgende Zielproteine nicht eindeutig bestimmen: die Prolyl-tRNA-Synthetase, die
NADPH-Sulfit Reduktase, die Dihydrolipoamid Dehydrogenase, der schon für ModB
eindeutig identifizierte Trigger Faktor, das ribosomale Protein L1 und das ThiF Protein. In
diesen Fällen kann eines der identifizierten oder auch beide Proteine als Zielprotein in Frage
kommen. Eine Bestätigung, welcher Fall für die einzelnen Proteine zutrifft, wird man erst
nach einer Klonierung, Reinigung und anschließender in vitro ADP-Ribosylierung erhalten.
Der Trigger Faktor, das Produkt des tic Gens, ist ein molekulares Chaperon mit einigen
bemerkenswerten Eigenschaften (Kandror et al., 1997). Im Gegensatz zu anderen Chaperonen
wird der Trigger Faktor verstärkt nach einem Kälteschock synthetisiert (Kandror & Goldberg,
1997). Die Funktion als Kälteschockprotein wird auch durch die katalysierte cis/trans
Isomerisation von Peptidbindungen in Polypeptiden gestützt (Callebaut & Mornon; 1995).
Diese Reaktion ist häufig der limitierende Schritt bei der Faltung von Proteinen, z.B.
RnaseT1, bei niedrigen Temperaturen (Stoller et al., 1995). Der Trigger Faktor ist dagegen
kein Hitzschockprotein und auch nicht essentiell für die Überlebensfähigkeit bei hohen
Temperaturen. Er bewirkt teilweise sogar das Entgegengesetzte, nämlich die Reduktion der
92
Diskussion
Überlebensrate bei 50 °C (Kandror & Goldberg; 1997). Außerdem haben variierende Trigger
Faktor Konzentrationen bei 37 °C keine Auswirkungen auf die Wachstumsrate der Zellen und
auch andere wichtige physiologische Konsequenzen konnten nicht gezeigt werden (Guthrie &
Wickner, 1990). Obwohl dieses Chaperon unter Normal-Bedingungen nicht essentiell ist,
wurde gezeigt, daß es mit DnaK in kooperativer Weise an der Faltung von neusynthetisierten
Proteinen beteiligt ist (Deuerling et al., 1999). Die Existenz von insgesamt sechs PeptidylProlyl-cis/trans-Isomerasen gleicht möglicherweise das Fehlen des Trigger Faktors in
entsprechenden Mutanten aus (Hesterkamp et al., 1996). Der Trigger Faktor unterstützt
cotranslational die Proteinfaltung, indem er mit den Ribosomen und der naszierenden
Polypeptidkette assoziiert, so daß man auch unter Normal-Bedingungen eine reguläre
Funktion im Faltungsprozess annehmen kann (Hesterkamp et al., 1996). Neben der
Beteiligung an diesen proteinaufbauenden Synthesen konnte auch eine Funktion in der
Degradation von Proteinen nachgewiesen werden. Der Trigger Faktor interagiert mit GroEL
und dieser Komplex bindet anschließend das fehlgefaltete Substrat (Hesterkamp & Bukau,
1996).
Eine ADP-Ribosylierung des Trigger Faktors durch die ADP-Ribosyltransferasen ModB und
Alt könnte sich aufgrund der differenzierten Eigenschaften auf ganz unterschiedliche Art
auswirken. Festzustellen ist, dass der früher schon vermutete Einfluss auf die Translation bzw.
Proteinfaltung sich mittlerweile relativ eindeutig darstellt. Für den Bakteriophagen scheint es
unter bestimmten Umweltbedingungen ein Vermehrungsvorteil zu sein, die Proteinsynthese
durch die wirtseigenen Proteine zu beeinflussen. Eine wichtige Frage in diesem
Zusammenhang ist, ob der Phage eine modifizierte Aktivität des Trigger Faktors benötigt oder
ob durch die ADP-Ribosylierung eine Inaktivierung stattfindet. Es wäre denkbar, dass sich die
Substratspezifität durch eine Änderung des elektrostatischen Potentials ändert, wie es sich
auch im Fall der α-Untereinheit der RNA-Polymerase vollzieht. Möglicherweise wird aber
auch die Bindung an einen oder mehrere seiner Interaktionspartner unterbunden. Dafür kämen
die Proteine EF-Tu und GroEL als mögliche Ziele in Frage, da beide ebenfalls durch ADPRibosylierung modifiziert werden. Die Interaktion des Trigger Faktors mit EF-Tu findet über
eine acht Aminosäuren umfassende konservierte Region statt, in der ein Arginin vorkommt
(Prof. Dr. B. Bukau, persönliche Mitteilung). Im Falle einer ADP-Ribosylierung an dieser
Position würde die Bindung an EF-Tu wahrscheinlich inhibiert. Für eine Aussage über die
genaue Funktion der Modifikationen der Zielproteine wäre die Kenntnis der betroffenen
Aminosäure von großem Wert. Um diese Positionen zu ermitteln, sind Experimente geplant,
93
Diskussion
die in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. B. Bukau (Universität Freiburg)
durchgeführt werden sollen.
Eine ADP-Ribosylierung von EF-Tu wäre auch im Sinne einer Abwehrstrategie gegen das
"Bacteriophage Exclusion System" durch den Phagen denkbar. Dabei handelt es sich um einen
altruistischen Mechanismus, durch den Bakterien nach einer Phageninfektion "Selbstmord"
begehen und damit die Vermehrung des Phagen einschränken (Yu & Snyder, 1994; Snyder,
1995; Yarmolinsky, 1995). Nach einer Infektion von E. coli K12 durch den Bakteriophagen
T4 wird EF-Tu durch die Metalloprotease Lit (Late Inhibitor of T4), die durch den defekten
Prophagen e14 kodiert wird, spezifisch innerhalb des RGITI-Motivs zwischen Gly59 und
Ile60 gespalten. Das führt zu einer kompletten Inhibition der E. coli Translation (Yu &
Snyder, 1994). Eine ADP-Ribosylierung des Arg58 würde mit großer Wahrscheinlichkeit die
proteolytische Spaltung an dieser Stelle sterisch behindern und damit das System ausschalten.
Denkbar wäre auch die Stimulierung der Translation von mRNAs des Phagen. Für den
Bakteriophagen
T7
Elongationsfaktors
wurde
EF-G
gezeigt,
eine
dass
verbesserte
aufgrund
einer
Phagenreproduktion
Phosphorylierung
unter
des
suboptimalen
Bedingungen ermöglicht wird (Robertson et al., 1994). Hier würde sich eine weitere Parallele
zwischen den Phagen T4 und T7 finden, denn in ähnlicher Weise, wie T4 das ribosomale
Protein S1 ADP-ribosyliert, katalysiert T7 dessen Phosphorylierung (Robertson & Nicholson,
1992). Eine weitere Funktion von EF-Tu ist die eines putativen Chaperons im Verlauf der
Phagenkopf-Assemblierung durch die Bindung von Gp23, bevor dieses mit GroEL und Gp31
interagiert (Ang et al., 2000). Die generelle Bedeutung von EF-Tu im Verlauf der
Entwicklung von prokaryontischen und eukaryontischen Viren zeigen auch die Beispiele des
Phagen Qβ und des "Vesikular Stomatitis Virus". Die RNA-Polymerase vom Phagen Qβ
interagiert mit EF-Tu, die des "Vesikular Stomatitis Virus" analog mit EF-1α (Blumenthal et
al., 1972; Das et al., 1998).
Auch die Modifikation des Chaperons GroEL kann durch mehrere Interpretationsansätze
erklärt werden. Die E. coli Proteine GroEL und GroES formen die an vielen
Proteinfaltungsprozessen beteiligte sogenannte GroE "Chaperon Maschine" (Lorimer, 1997;
Bukau & Horwich, 1998). Sowohl GroEL als auch GroES sind unter allen getesteten
Bedingungen essentiell für die Lebensfähigkeit der bakteriellen Zellen (Fayet et al., 1989).
Auch der Bakteriophage T4 ist von der Funktion des wirtseigenen GroEL abhängig, um die
Faltung des "Major Capsid Proteins" Gp23 zu gewährleisten. T4 kodiert allerdings zusätzlich
für ein GroES ähnliches Protein, das Gp31 (Ang et al., 2001). Vergleichsstudien haben
94
Diskussion
gezeigt, dass eine Substitution von GroES durch Gp31 möglich ist, während GroES das
T4-kodierte Protein nicht ersetzen kann (van der Vies et al., 1994). Ohne ein funktionsfähiges
Gp31 aggregiert das Capsid Protein Gp23 an der inneren E. coli Membran (Laemmli et al.,
1970). Obwohl die beiden Proteine eine ähnliche Funktion und Struktur besitzen, ist die
Sequenzhomologie nur sehr gering ausgeprägt (Nivinskas & Black, 1988; Keppel et al.,
1990). Eine begrenzte Sequenzhomologie existiert allerdings im Bereich des "mobilen
Loops", über den die Bindung an GroEL ermöglicht wird (Landry et al., 1993; Koonin & van
der Vies, 1995; Richardson et al. 1998). Da die Komplexbildung GroEL/Gp31 essentiell für
die Vermehrung des Phagen T4 ist, wäre es denkbar, dass durch eine ADP-Ribosylierung von
GroEL eine Spezifizierung zu Gunsten von Gp31 erfolgt. Der Phage würde damit verhindern,
dass durch eine Interaktion von GroES mit GroEL eine Konkurrenz zu der gewollten
Komplexbildung entsteht. Braig et al. (1994) haben gezeigt, dass in der geschlossenen GroEL
Form die Aminosäure Arg322 eine Salzbrücke zum Glu178 bildet. Diese Salzbrücke kommt
nicht in der offenen Form vor (Xu et al., 1997; Brocchieri & Karlin, 2000). Die Arg322Gly
Substitution verhindert die Bildung der genannten Salzbrücke und damit der geschlossenen
GroEL Form. Die in diesem Fall bevorzugte offene Form ermöglicht eine verbesserte Bindung
an verschiedene Co-Chaperone (Klein & Georgopoulos, 2001). Möglicherweise findet an
dieser Position auch die ADP-Ribosylierung statt, um eine verbesserte Interaktion zwischen
GroEL und Gp31 zu erzielen. Dies würde auch die von Ang et al. (2000) aufgeworfene Frage
beantworten, ob der Bakteriophage T4 GroES inaktiviert und/oder GroEL modifiziert, so dass
dieses besser mit Gp31 wechselwirkt.
Einen Einfluss auf die Translation hätte die ADP-Ribosylierung des Proteins L1 des 50S
Untereinheit der Ribosomen. Hier besteht eine Parallele zu dem durch ModB modifierten
ribosomalen Protein S1 (Tiemann et al., 1999). Die Wirkung dieser Modifikationen besteht
möglicherweise in einer Spezifizierung für T4 eigene mRNAs. Das ebenfalls durch ModB
modifizierte Thioredoxin fungiert als Elektronen-Träger und dient so in verschiedenen
Reaktionen als Elektronen-Donor. Zwei weitere mögliche Zielproteine der ADPRibosyltransferase Alt sind die Komponenten Dihydrolipoamid-Acetyltransferase und
Dihydrolipoamid-Dehydrogenase
des
Pyruvat-Dehydrogenase
Komplexes.
Dieser
Multienzym-Komplex katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Pyruvat zu Acetyl-CoA.
Die Prolyl-tRNA Synthetase katalysiert die Verknüpfung eines Prolyl-Restes mit der richtigen
tRNA. Das parallel zu L1 identifizierte ThiF Protein ist an der Thiamin-Biosynthese beteiligt
und wird für die Synthese von Thiazol benötigt. Die Spaltung von gykosidischen Bindungen
95
Diskussion
in 5´-Methylthioadenosin und S-Adenosylhomocystein wird durch die MTA/SAH
Nukleosidase katalysiert. Die Ribose-5-Phosphat Isomerase bewirkt innerhalb des nichtoxidativen Pentosephosphatweges die Umsetzung von Ribulose-5-Phosphat zu Ribose-5Phosphat. Ebenfalls am Energiestoffwechsel beteiligt ist die Pyruvat-Kinase 1, die die
Reaktion von Phosphoenolpyruvat und ADP zu Pyruvat und ATP katalysiert. Die
Auswirkungen der Modifikationen der zuletzt beschrieben Zielproteine lassen sich zur Zeit
noch nicht eindeutig beschreiben. Um genauere Aussagen über die Vorteile des
Bakteriophagen durch die ADP-Ribosylierung dieser Proteine zu treffen, müssen weitere
Experimente unternommen werden (siehe Ausblick). Allerdings sollte beachtet werden, dass
einige der aufgeführten Proteine für ihre normale Funktion NAD+ oder ATP als Substrat
verwenden. Aus diesem Grund muss ausgeschlossen werden, dass es sich bei den radioaktiven
Markierungen dieser Proteinen um Artefakte handelt, obwohl dies unter den angewandten
experimentellen Bedingungen nicht zu erwarten ist. So sollten z.B. die Pufferbedingungen der
durchgeführten zweidimensionalen Gelelektrophoresen eine nicht-kovalente Bindung von
NAD+ in einer Bindetasche verhindern, da die aufgetrennten Proteine in denaturierter Form
vorlagen.
Versuch der Strukturaufklärung der ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt
Für die dreidimensionale Strukturaufklärung von Proteinen werden unterschiedliche
Methoden eingesetzt, wobei sich vor allem die Röntgenstrukturanalyse von Einkristallen als
das bedeutendste Verfahren zur detaillierten Beschreibung der Struktur großer Biomoleküle
herausgestellt hat (McPherson, 1990; Ollis & White, 1990). Eine notwendige Voraussetzung
für die Anwendbarkeit dieser Methodik ist das Kristallisieren des gewünschten Proteins.
Für die ADP-Ribosyltransferasen ModA, ModB und Alt konnte in keinem Fall ein für eine
Strukturaufklärung ausreichender Einkristall gezüchtet werden. Lediglich die Versuche mit
der enzymatisch nicht mehr aktiven ModB Mutante R73A resultierten in sehr kleinen, fragilen
Kristallen. Da es sich bei den eingesetzten Proteinen um sehr komplexe Moleküle handelt und
deren Eigenschaften durch eine Reihe von Faktoren, wie z.B. Temperatur, pH-Wert und
Kontaminationen,
variieren
können,
ist
eine
exakte
Aussage
über
deren
Kristallisationsmöglichkeit und die zu verwendenden Bedingungen nahezu unmöglich
(McPherson, 1990).
Einige entscheidende Parameter wirken sich jedoch negativ auf die Kristallisation von
Proteinen aus und sind deshalb grundsätzlich zu überprüfen. Die verwendeten Proteinproben
96
Diskussion
sollten einen hohen Grad an Reinheit aufweisen. Im Allgemeinen gelten Proteine als
ausreichend rein, wenn sie auf einem sehr sensitiv gefärbten Polyacrylamidgel als eine
einzelne Bande zu detektieren sind (Ollis & White, 1990). Für alle verwendeten Proteine
konnte dieser Reinheitsgrad mittels silbergefärbter Polyacrylamidgele gezeigt werden.
Zusätzlich erfolgte durch isoelektrische Fokussierung die Überprüfung und Bestätigung der
Homogenität des Proteins ModB. In speziellen Fällen ist der so erreichbare Status allerdings
noch nicht ausreichend; es müssen dann weitere Reinigungsschritte, beispielsweise durch
HPLC, angeschlossen werden (Bott et al., 1982; Pathak et al., 1988). Diese Experimente sind
für die hier besprochenen Proteine nicht durchgeführt worden und würden sich als eine
Möglichkeit zur Lösung des Kristallisationsproblems anbieten.
Ein weiterer wesentlicher Parameter, der zu einem negativen Kristallisationsexperiment
führen kann, ist die eventuell vorhandene Mikroheterogenität einer Probe (Ollis & White,
1990). Ursachen für die analytisch schwer erfassbare Mikroheterogenität können u.a. sein:
Proteolytische
Modifikationen
posttranslationale
während
Modifikationen
der
Isolation
(Adenylierung,
oder
der
Kristallisation,
Phosphorylierung,
Methylierung),
Variationen des C- oder N-Terminus oder eine partielle Denaturierung der Probe (McPherson,
1990). Häufig bewirkt eine äußerst geringe Variation in der Aminosäuresequenz eines
Proteins bereits drastische Unterschiede im Kristallisationsverhalten (McPherson, 1990).
Das verwendete Reinigungsprotokoll beeinhaltet die Renaturierung von Einschlusskörpern.
Dieser Schritt könnte Mikroheterogenität hervorgerufen haben, da nicht ausgeschlossen
werden kann, dass noch denaturiertes oder nur teilweise renaturiertes Protein in den Proben
vorhanden war. Die wahrscheinlichste Ursache für entstehende Mikroheterogenität in den
verwendeten Proteinproben ist jedoch deren Möglichkeit zur Autoribosylierung. Alle
phagenkodierten ADP-Ribosyltransferasen führen diese Reaktion durch und übertragen dabei
mindestens eine ADP-Ribose. Es erscheint allerdings wahrscheinlich, dass diese Reaktion
mehr als einmal pro Enzymmolekül katalysiert wird, da für ModB gezeigt werden konnte,
dass das Enzym bereits ADP-ribosyliert aufgereinigt wurde und trotzdem eine weitere zeitund
substratabhängige
Autoribosylierung
erfolgte.
Der
Unterschied
zwischen den
verschiedenen ADP-Ribosylierungsgraden führt dann zur Mikroheterogenität. Auch dass die
Mutante ModB R73A nachweisbare Kristalle bildet, unterstützt diese Annahme. Diese
Mutante ist enzymatisch inaktiv, so dass weder während der Expression noch bei der
Reinigung ADP-Ribosereste übertragen werden können und diese als Ursache für
Mikroheterogenität ausscheiden. Die z.Zt. mit der Mutante durchgeführten Experimente zur
97
Diskussion
Verbesserung der Kristallisationspufferbedingungen ermöglichen deshalb eventuell ein
stärkeres Kristallwachstum und die Strukturaufklärung dieser Mutante.
Ortsspezifische in vitro Mutagenese der ADP-Ribosyltransferasen ModA und ModB zur
näheren Charakterisierung der katalytischen Zentren
Neben der Strukturaufklärung hat sich die ortspezifische Mutagenese als eine probate
Methodik zur Aufklärung der genauen Funktion von Proteinen, insbesondere von Enzymen,
erwiesen. Durch den gezielten Austausch einzelner Aminosäuren lassen sich die für die
Katalyse essentiellen Positionen experimentell bestimmen.
Wie einleitend bereits erläutert, konnten beim Vergleich der Primärstrukturen verschiedener
ADP-Ribosyltransferasen keine konservierten Sequenz-Bereiche ermittelt werden. Es ist
lediglich eine minimale Strukturkonservierung für die NAD+-Bindung und die Katalyse
vorhanden (Domenighini & Rappuoli, 1996; Bazan & Koch-Nolte, 1997). In der als NAD+Bindetasche fungierenden Kavität befinden sich zwei invariable Aminosäuren (Abb. 4.4).
Abb. 4.4: Schematische Darstellung der für alle ADPRibosyltransferasen postulierten Kavität zur NAD+Bindung. Der Nikotinamidring interagiert mit dem
konservierten Arginin bzw. Histidin des jeweiligen
Enzyms. Auf der anderen Seite der Kavität ist die
katalytisch essentielle Glutaminsäure dargestellt (aus
Domenighini et al., 1994).
Eine essentielle Glutaminsäure innerhalb des β-Faltblattes β5 flankiert die eine Seite der
Kavität, während sich dieser gegenüberliegend ein konserviertes Arginin befindet
(Domenighini & Rappuoli, 1996).
98
Diskussion
Aus Kristallstrukturen lässt sich ableiten, dass das Arginin an der Bindung des NAD+ beteiligt
ist, während die Glutaminsäure entscheidend für die Katalyse ist (Aktories et al., 1995; Bell &
Eisenberg, 1997). Für Diphtherie Toxin wurde in "Crosslinking"-Experimenten gezeigt, dass
sich die homologe Glutaminsäure in unmittelbarer Nähe zum NAD+ befindet und dadurch mit
der negativ geladenen Carboxylgruppe ein im Verlauf einer SN1-Reaktion entstehendes
positives Oxocarboniumion stabilisiert (Oppenheimer & Bodley, 1981; Carroll & Collier,
1984). Alle argininspezifischen ADP-Ribosyltransferasen besitzen zusätzlich zu der
konservierten Glutaminsäure zwei Positionen weiter N-terminal eine zweite sehr polare
Aminosäure, nämlich Glutaminsäure oder Glutamin (Glx). Diese Positionen wurden für das
hitzelabile Enterotoxin LT und für Iotatoxin ebenfalls als essentiell nachgewiesen (Lobet et
al., 1991; Bohmer et al., 1996). Es wurde deshalb für die ADP-Ribosyltransferasen das
Konsensus-Motiv Glx-X-Glu postuliert. Einige Enzyme (u.a. Alt) besitzen ein weiteres Motiv,
dabei handelt es sich um die Sequenz: Arom (aromatische Aminosäure)-pH (hydrophobe
Aminosäure)-Ser-Thr-Ser-pH.
Für bestimmte ADP-Ribosyltransferasen konnten durch ortspezifische Mutagenesen die in
Tabelle 4.1 dargestellten essentiellen Aminosäuren bestätigt werden. In Anlehnung an diese
Experimente sollten nicht-konservierte Mutationen an als essentiell postulierten Positionen
erzeugt werden. Mit Hilfe der PCR-gestützten Mutagenese wurden die einzelnen
Aminosäuren jeweils gegen Alanin ausgetauscht und durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Für
die Auswahl der zu mutierenden Positionen ist ein theoretisches Modell der Sekundär- oder
Tertiärstruktur notwendig; sie erfolgte hier anhand der in Abbildung 4.1 (Sekundärstruktur
Threading) dargestellten Vorhersagen. Erste Anhaltspunkte über die enzymatische Aktivität
der Mutanten wurden mit Hilfe eines modifizierten Plasmidstabilitätstests ermittelt (Studier &
Moffatt, 1986; Studier et al., 1990; Tiemann, 1999). Dabei wird der auch schon für Cholera
Toxin gezeigte Effekt genutzt, dass die Reduktion der Toxizität proportional zur Abnahme der
enzymatischen Aktivität ist (Jobling & Holmes, 2001). Aufgrund ihrer Toxizität verhindern
die in den Überexpressionsstamm C41 (DE3) transformierten ModA- bzw. ModB-Plasmide
unter induzierten Bedingungen eine Koloniebildung. Die Auswirkung der Mutation auf die
katalytische Aktivität steht deshalb in einem reziproken Verhältnis zur Bildung von Kolonien
unter induzierten Bedingungen.
Tab. 4.1: Biochemische und Mutagenese Experimente identifizierten katalytisch aktive Aminosäuren, deren
Modifikation den Verlust der ADP-Ribosylierungsaktivität nach sich zieht (Domenighini et al., 1996
(verändert)).
Enzym
katalytisch essentielle
Referenz
99
Diskussion
Aminosäure
Diphtherie Toxin (C. diphtheriae)
Glu148
Carroll & Collier, 1984
Diphtherie Toxin (C. diphtheriae)
Glu553
Carroll & Collier, 1987
Diphtherie Toxin (C. diphtheriae)
His21
Papini et al., 1990
Cholera Toxin (V. cholerae)
Arg7
Burnette et al., 1991
Cholera Toxin (V. cholerae)
Glu112
Tsuji et al., 1990
Pertussis Toxin (B. pertussis)
Arg9
Burnette et al., 1988
Pertussis Toxin (B. pertussis)
His35
Kaslow et al., 1989
Pertussis Toxin (B. pertussis)
Glu129
Pizza et al., 1988
Iotatoxin (C. perfringens)
Arg295
Perelle et al., 1996
Iotatoxin (C. perfringens)
Glu378
Perelle et al., 1996
Iotatoxin (C. perfringens)
Glu380
Perelle et al., 1996
Enterotoxin LT (E. coli)
Arg7
Lobet et al., 1991
Enterotoxin LT (E. coli)
Glu110
Cieplak et al., 1995
Enterotoxin LT (E. coli)
Glu112
Tsuji et al., 1990
C2 Toxin (C. botulinum)
Arg299
Barth et al., 1998
C3 Toxin (C. botulinum)
Glu174
Jung et al., 1993
Exotoxin A (P. aeruginosa)
Glu553
Kulich et al., 1994
Exotoxin A (P. aeruginosa)
His440
Han & Galloway, 1995
MART (Kaninchen)
Glu240
Takada et al., 1995
PARP1 (Mensch)
Glu988
Marsischky et al., 1995
Ein Vergleich der Koloniegröße unter induzierten und nicht-induzierten Bedingungen
ermöglicht so Rückschlüsse auf die Bedeutung der mutierten Aminosäure für die
enzymatische Aktivität (Tab. 3.3).
Die ModA Mutation R72A im postulierten β-Faltblatt β1 bewirkte eine komplette
Inaktivierung des Enzyms und damit Koloniegrößen von 100 %. Dieselbe Wirkung hatten
auch die Aminosäureaustausche der Positionen Phe127 und Phe129 im β3 Faltblatt. Weniger
bedeutend scheint die Position Glu165 zu sein. Diese Mutante weist mit Koloniegrößen von
60-70 % auf eine relativ hohe Restaktivität hin.
Im Fall von ModB konnte ebenfalls die Unverzichtbarkeit des Arginins im β1 Faltblatt
bestätigt werden. Eine komplette Inaktivierung des Enzyms und damit 100% Koloniegröße
bewirkten auch die Mutationen der Positionen Arg73, Phe129, Tyr131 und Glu173 in ModB.
Aufgrund dieser Ergebnisse war der Aktivitätsverlust der ModB Doppelmutante R73A/E173A
zu erwarten und wurde auch bestätigt. Wie auch für ModA scheint die in beiden Enzymen gut
konservierte Sequenz Phe-Asn-Phe/Tyr für die Aktivität von ModB von großer Bedeutung zu
sein. Sowohl der Austausch des Phe129 als auch der von Tyr131 führte zur Inaktivierung des
100
Diskussion
Enzyms. Eine annähernd gleiche Relevanz für ModB besitzt die Position Asn130, deren
Mutation immerhin zu Koloniegrößen von 80-90 % führte. Die im Glx-X-Glu Motiv neben
Glu173 vorhandenen Positionen Glu171 und Gln172 scheinen für die Katalyse von ModB
vergleichsweise weniger wichtig zu sein, was sich aufgrund der für ihre Mutanten ermittelten
Koloniegrößen von 60-70 % ableiten lässt. Der Austausch des im β2 Faltblatt konservierten
Serins (Ser111) bewirkte Koloniegrößen von 70-80 %, so dass nur noch eine sehr niedrige
Restaktivität vorhanden war. Interessanterweise bewirkt die Mutation dieser Position in ModA
eine vollständige Inaktivierung (Tiemann, 1999).
Einführung eines ELISA zur Charakterisierung der Mutanten
Die Charakterisierung der Mutanten mit Hilfe des modifizierten Plasmidstabilitätstests
ermöglicht nur eine tendenzielle Beurteilung ihrer enzymatischen Restaktivität. Um eine
verbesserte Klassifizierung der graduellen Abstufungen zwischen verschiedenen ModBMutanten zu ermöglichen, wurde ein ELISA-Test etabliert. Eine der beiden Voraussetzungen,
um einen solchen Test durchzuführen, ist die Eigenschaft der T4-kodierten ADPRibosyltransferasen, eine Autoribosylierung zu katalysieren. Außerdem musste eine ModBMutante eindeutig identifiziert werden, die keine katalytische Aktivität aufweist und sich
deshalb als mögliches Zielprotein für die Autoribosylierung anbietet. Die ModB Mutante
R73A wurde durch den modifizierten Plasmidstabilitätstest als Kandidat ermittelt. Die
Verifikation, dass diese Mutante keine Autoribosylierung katalysiert, erfolgte mit
aufgereinigtem Enzym in einem ADP-Ribosyltransferase-Aktivitätstest nach Rohrer et al.
(1975).
Im ELISA wurde zunächst das inaktive Enzym an die Mikrotiterplatten-Oberfläche gebunden
und anschließend der Testansatz mit der zu überprüfenden ModB-Variante dazugegeben. Im
Anschluss an den Test war dann der photometrisch messbare Umsatz eines Farbstoffes durch
HRP proportional zum Grad der katalysierten Autoribosylierung, da pro übertragenem ADPRibosylrest ein Molekül Streptavidin-HRP bindet.
Die Positionen Arg73 und Glu173 konnten als essentiell bestätigt werden. Im Vergleich zum
Wildtyp war bei den entsprechenden Mutanten keine messbare ADP-RibosyltransferaseAktivität
vorhanden.
Diese
Ergebnisse
bestätigen
die
schon
für
andere
ADP-
Ribosyltransferasen, z.B. Pertussis Toxin und Alt, mit den homologen Positionen
durchgeführten Mutagenese-Experimente (Burnette et al., 1988; Koch, 1999). Die beiden
zusätzlichen Mutationen im Glx-X-Glu Motiv, Glu171 und Gln172, wiesen eine Restaktivität
101
Diskussion
von 60 % bzw. 64 % auf. Die Resultate des modifizierten Plasmidstabilitätstests (s.o.),
stimmen mit denen des ELISA im Wesentlichen überein. Es kann deshalb angenommen
werden, dass das Glx-X-Glu Motiv für die beiden Schwesterenzyme ModA und ModB nicht
die gleiche Bedeutung hat. Die übereinstimmenden Ergebnisse dieser beiden Testmethoden
zeigten aber auch, dass mit dem ELISA jetzt eine Methodik zur schnellen quantitativen
Charakterisierung von Mono-ADP-Ribosyltransferasen eingeführt wurde. Der ELISA bietet
sich deshalb auch für eine eingehendere Charakterisierung von ModA Mutanten an.
Von dem in Alt und den bakteriellen Toxinen vorhandenen zweiten Konsensus-Motiv ArompH-Ser-Thr-Ser-pH ist in ModA und ModB nur das erste Serin vorhanden. Die Bedeutung
dieser Position kann nicht exakt benannt werden, da sich durch die beiden angewandten
Testmethoden teilweise widersprüchliche Resultate ergaben. Die ermittelte katalytische
Aktivität der Mutante S111A wurde im ELISA mit einer Zunahme der Aktivität um 24 % im
Vergleich zum Wildtyp festgestellt, während der modifizierte Plasmidstabilitätstest
Koloniegrößen von 70-80 % und damit eine relativ hohe Aktivitätsabnahme zeigte.
Eine Mutation kann sich auf unterschiedliche Weise auf ein Enzym auswirken. Durch den
Austausch einer Aminosäure kann die strukturelle Integrität eines Proteins gestört sein, so
dass seine native Tertiärstruktur verloren geht. Das Protein nimmt dann eine andere
Konformation ein und ist möglicherweise auch nicht mehr aktiv. Dieser Fall wurde z.B. für
die RNase A gezeigt, bei der eine einzelne Punktmutation erheblichen Einfluss auf die
Stabilität der Enzymstruktur hatte (Quirk et al., 1998). Ein Rückschluss von der modifizierten
Position im Enzym auf eine eventuelle Beteiligung dieser Aminosäure an der Katalyse ist in
diesen Fällen nicht mehr möglich. Wenn keine zusätzlichen Strukturdaten z.B. durch
Kristallisation oder NMR verfügbar sind, ist die CD-Spektroskopie ein geeignetes Mittel.
Diese Methode ermöglicht die Messung des cirkularen Dichroismus einer Probe und damit die
Berechnung der Sekundärstrukturverteilung in einem Protein (Greenfield et al., 1998; Wang et
al., 2001). Somit eignet sie sich insbesondere für vergleichende Analysen, wie z.B. von
Mutante und Wildtyp (Flanders, 1984; Strezelecka-Golaszewska et al., 1985). Weichen die
Sekundärstrukturverteilungen der untersuchten Mutanten deutlich von denen des Wildtyps ab,
ist es sehr wahrscheinlich, dass ebenfalls die Tertiärstruktur der Mutante beeinträchtigt ist
(Baskakov & Bolen, 1998).
Die CD-Spektren des ModB Wildtyps und der ModB Mutanten R73A, E171A, R173,
R73A/E173A verlaufen parallel zueinander. Die Amplitude des Wildtyp-Spektrums war
insgesamt etwas niedriger als die der Mutanten, was auf eine geringfügig abweichende
102
Diskussion
Proteinkonzentration zurückzuführen sein könnte. Die Berechnung der entsprechenden
Sekundärstrukturverteilungen war für alle CD-Spektren nahezu identisch und wich um
maximal 2,4 % für die α-Helices bzw. 5,5 % für die β-Faltblätter vom Wildtyp ab. Es konnte
also postuliert werden, dass es durch die Mutationen zu keiner Änderung in der Konformation
der Proteine gekommen war.
Die Phagenproteine ModA und ModB weisen also tatsächlich die theoretisch vorhergesagten
essentiellen, konservierten Bereiche auf, wie sie für einige bakterielle Toxine bereits bestätigt
wurden. Sie besitzen die Merkmale der postulierten NAD+-Bindetasche mit den Aminosäuren
Glutaminsäure und Arginin. Das Glx-X-Glu Motiv ist in ModB zwar ebenfalls vorhanden,
eine komplette Konservierung scheint allerdings nicht notwendig zu sein, da die
entsprechenden Glx- und X-Mutanten weiterhin eine relativ hohe Restaktivität aufweisen.
Demgegenüber ist das in ModA und ModB konservierte Motiv Phe-Asn-Phe/Tyr im β3
Faltblatt für die Katalyse essentiell, da beide Enzyme auf Mutationen in diesem Bereich mit
einer starken Aktivitätsabnahme reagieren.
Ausblick
Zur Überprüfung, ob sich mit Hilfe von T4 eigenen Chaperonen die Bildung von
Einschlusskörpern vermeiden lässt, bietet sich für spätere Arbeiten die Co-Expression des
phagenkodierten Chaperons Gp31 an. Eine mögliche Überexpression von löslichem ModA
und ModB Protein könnte sich positiv sowohl auf die Reinigung als auch auf die im Anschluß
folgende Kristallisierung auswirken.
Unter Verwendung der im Verlauf der Arbeiten eingeführten Methoden zur Identifizierung der
Zielproteine von ADP-Ribosyltransferasen wäre es notwendig, die noch nicht identifizierten
Zielproteine von ModA zu ermitteln.
Um die Identifizierung von eventuell noch nicht erfassten weiteren Zielproteinen von ModB
und Alt zu ermöglichen, müssten auch die nicht-löslichen E. coli Proteine untersucht werden.
Eine denkbare Strategie wäre die Verwendung des E. coli Zellextraktes ohne vorherige
Zentrifugation und im Anschluss an den Aktivitätstest eine Fraktionierung der Proteine durch
die Solubilisierung in einem jeweils angepassten Puffer.
103
Diskussion
Ein wichtiges Ziel zukünftiger Experimente wäre die Bestätigung der in dieser Arbeit
beschriebenen Zielproteine der ADP-Ribosyltransferasen ModB und Alt. In Analogie zu dem
in früheren Arbeiten als Zielprotein von ModB identifizierten Protein S1 sollten die Gene der
genannten Zielproteine kloniert werden. Dies würde dann die Überexpression der jeweiligen
Proteine und damit die Verifizierung der Ergebnisse in einem in vitro ADP-Ribosylierungstest
ermöglichen. In diesem Zusammenhang ist bereits eine Kooperation mit der Arbeitsgruppe
Prof. Dr. Bukau (Universität Freiburg) verabredet, die über die bereits gereinigten Proteine
Trigger Faktor und GroEL verfügt. Diese Experimente würden dann auch die Bestimmung der
modifizierten Aminosäuren in den einzelnen Zielproteinen mittels massenspektrometrischer
Methoden ermöglichen. Die Kenntnis dieser Positionen lässt dann wahrscheinlich
Rückschlüsse über den genauen Wirkmechanismus der jeweiligen Modifikation zu.
Die Annahme, es könnte sich bei der ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors EF-Tu um
eine Abwehrstrategie gegen das "Bacteriophage Exclusion System" handeln, könnte durch
zwei Experimente getestet werden. Die Überexpression von Alt oder ModB müsste in einem
Expressionsstamm mit lit Gen erfolgen; das Resultat sollte dann eine normal verlaufende
Infektion sein. Das zweite Experiment wäre die Infektion von E. coli lit+ mit einer alt-, modAmodB- Tripelmutante. In diesem Fall dürfte keine Phagenvermehrung stattfinden.
Die weiteren Arbeiten zur Ermittlung der Kristallstruktur sollten mit den im ELISA
ermittelten inaktiven Mutanten durchgeführt werden, da bei diesen die Wahrscheinlichkeit
einer Mikroheterogenität der Proteinprobe durch Vermeidung der Autoribosylierung geringer
ist. Eine andere Strategie wäre die Verwendung einer Glycohydrolase, um die durch AutoRibosylierung übertragenen ADP-Ribosylreste wieder zu entfernen.
104
5 Zusammenfassung
Die ADP-Ribosylierung ist eine posttranslationale Modifikation, bei der eine kovalente
Bindung durch den Transfer eines ADP-Ribosylrestes von NAD+ auf das Zielprotein erreicht
wird. Die diese Reaktion katalysierenden ADP-Ribosyltransferasen sind in Bakteriophagen,
Prokaryonten und Eukaryonten identifiziert worden und zur Zeit Gegenstand intensiver
Forschung. Der Bakteriophage T4 kodiert für die drei ADP-Ribosyltransferasen Alt, ModA
und ModB. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der molekularbiologischen und
biochemischen Charakterisierung dieser drei Enzyme mit dem Ziel der Beschreibung ihrer
Funktionen im Infektionszyklus des Bakteriophagen sowie der Lokalisation katalytisch aktiver
Aminosäure-Positionen und der Aufklärung der dreidimensionalen Struktur.
Die Funktion der ADP-Ribosyltransferasen im Infektionszyklus des Phagen definiert sich
durch die Rolle der modifizierten Zielproteine. Es wurden deshalb Experimente zur
Identifikation der jeweils ADP-ribosylierten Proteine durchgeführt. Die dafür zunächst
eingeführte Methode der hochauflösenden, zweidimensionalen Gelelektrophorese ermöglichte
die Auftrennung der in einem in vitro Test ADP-ribosylierten Wirtsproteine. Die Lokalisation
der modifizierten Proteine erfolgte anhand des im Verlauf der Reaktion übertragenen
32
P markierten ADP-Ribosylrestes. Die anschließende Identifikation der selektierten E. coli
Proteine wurde mit den massenspektrometrischen Verfahren MALDI-TOF und ESI-MS,
sowie dem Edman-Abbau durchgeführt. Die ADP-Ribosyltransferase ModB katalysiert, neben
der schon bekannten Modifikation des ribosomalen Proteins S1, die ADP-Ribosylierung des
Elongationsfaktors EF-Tu, des Chaperons Trigger Faktor und des Thioredoxins. Für Alt und
ModA wurde bereits nachgewiesen, dass sie die α-Untereinheit der RNA-Polymerase
modifizieren. Die weiteren durch ModA modifizierten Proteine zeigten nach der
zweidimensionalen Auftrennung eine zu geringe radioaktive Markierung, so dass keine
Zielproteine lokalisiert werden konnten. Demgegenüber erzeugte Alt insgesamt 27 markierte
Proteinspots, von denen zehn einer Proteinidentifizierung zugänglich waren. Das ZielproteinSpektrum dieses Enzyms konnte damit um EF-Tu, das Chaperon GroEL, die Pyruvat Kinase I,
die 3-Oxoacyl-Synthase, die MTA/SAH Nukleosidase, die Ribose-5-Phosphat-Isomerase und
die Dihydrolipoamid Acetyltransferase erweitert werden. Weiterhin kommen als Zielproteine
die Prolyl-tRNA-Synthetase, die NADPH-Sulfit Reduktase, der Trigger Faktor, die
Dihydrolipoamid Dehydrogenase, das ThiF Protein und das 50 S ribosomale Protein L1 in
105
Frage. Diese Proteine wurden jeweils paarweise in einem Proteinspot identifiziert, so dass
eine endgültige Bestätigung als Zielproteine erst nach deren Klonierung und anschließendem
Einsatz im Aktivitätstest erfolgen kann. Die identifizierten Zielproteine von ModB und Alt
weisen insgesamt auf einen erheblichen Einfluss des Bakteriophagen auf die Translations- und
Proteinfaltungsmaschinerie seines Wirtes hin. Die Ergebnisse stimmen deshalb mit der schon
vorher diskutierten Modulation der Translation durch die ADP-Ribosylierung des ribosomalen
Proteins S1 überein. Insbesondere die Identifikation der verschiedenen Zielproteine von Alt
impliziert die Möglichkeit einer Regulation des Wirtsstoffwechsels durch den Bakteriophagen
T4, die weit über das bisher angenommene Mass hinausgeht.
Erkenntnisse über die Struktur eines Proteins können durch die Analyse von
Röntgenbeugungsmustern gewonnen werden. Die notwendige Voraussetzung für deren
Durchführung ist die Kristallisation des Proteins und deshalb dessen Aufreinigung in
möglichst homogener Weise. ModA und ModB lagen nach ihrer Expression als
Einschlußkörper vor. Kulturbedingungen, die die Synthese von nativem Protein durch E. coli
ermöglichen, konnten nicht gefunden werden. Deshalb erfolgte die Reinigung von ModA und
ModB nach einer Vorreinigung der Einschlußkörper und deren Renaturierung mittels
immobilisierter Metallchelat-Affinitätschromatographie. Die gereinigten Proteine wiesen
reproduzierbar eine Homogenität von ca. 95 % auf. Die Kristallisationsexperimente mit Alt,
ModA, ModB und verschiedenen ModA und ModB Mutanten resultierten nur im Fall der
ModB Mutante R73A in einer Kristallbildung. Diese Kristalle waren allerdings äußerst klein
und fragil und ermöglichten deshalb keine Auflösung der Röntgenstruktur.
Aufgrund von Inhibitorstudien ließen sich ModA und ModB als argininspezifische MonoADP-Ribosyltransferasen charakterisieren. Ein Alignment dieser beiden Enzyme mit anderen
ADP-Ribosyltransferasen ermöglichte die Vorhersage katalytisch essentieller Aminosäuren,
die im Rahmen von ortsspezifischen Mutagenese-Experimenten verifiziert werden konnten.
Die postulierte NAD+-Bindetasche der ADP-Ribosyltransferasen enthält ein essentielles an der
Bindung des NAD+ beteiligtes Arginin, das auch für ModA (R72) und ModB (R73) in der
vorhergesagten Position nachgewiesen wurde. Das in ADP-Ribosyltransferasen konservierte
Glx-X-Glu Motiv ist auch in der Primärstruktur von ModA und ModB vorhanden.
Insbesondere die Glutaminsäure an der dritten Position dieses Motivs ist für die Katalyse der
ADP-Ribosyltransferasen notwendig und wurde für ModA (E165) und ModB (E173)
106
ebenfalls bestätigt. Ein zweites in den beiden Proteinen gut konserviertes Motiv, Phe-AsnPhe/Tyr, ist für deren enzymatische Aktivität ebenfalls essentiell, da der Austausch einzelner
Positionen dieses Motivs eine komplette Inaktivierung von ModA und ModB bewirkt. Das
Phenylalanin (ModA) bzw. Tyrosin (ModB) in der dritten Position repräsentiert dabei eine in
allen ADP-Ribosyltransferasen vorhandene aromatische Aminosäure oder Leucin.
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Lebenslauf
Name
Geburtsdatum
Geburtsort
Familienstand
Reinhard Depping
01.November 1970
Detmold
ledig
Schulbildung
1977-1981
1981-1991
Grundschule Detmold-Klüt
Gymnasium Leopoldinum Detmold
Abschluß: Allgemeine Hochschulreife
Ausbildung
Oktober 1991 bis Juni 1998
Studium der Biologie an der Ruhr-Universität
Bochum mit dem Abschluß Diplom-Biologe.
Thema der Diplomarbeit: ADP-Ribosylierung als
ein Mittel der Regulation: Versuch der biochemischen Charakterisierung von Zielproteinen
der Transferase ModB des Bakteriophagen T4.
seit Juli 1998
Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl
Biologie der Mikroorganismen, Arbeitsgruppe
Molekulare Genetik und Promotion.
Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge
Tiemann,B, Depping,R. & Rüger,W.: The ADP-ribosyltransferases of bacteriophage T4,
12TH Evergreen International Phage Biology Meeting, 16.-20. Juli 1998.
Tiemann,B.,
Depping,R.
&
Rüger,W.:
Overexpression,
purification,
and
partial
characterization of ADP-ribosyltransferases modA and modB of bacteriophage T4.
Gene Expr. 8, 187-196 (1999).
Sommer,N., Depping,R. & Rüger,W.: Computer modeling and mutation analysis of the T4 αglycosyltransferase. Biol. Chem., 382, special supplement, S169 (2001).
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. W. Rüger für die Bereitstellung des sehr
interessanten und herausfordernden Themas, sein Interesse am Fortgang der Arbeit und seine
wissenschaftliche Unterstützung. Besonders möchte ich meinen Dank dafür aussprechen, dass
er mir mehrere sehr interessante und lehrreiche Forschungsaufenthalte im In- und Ausland
ermöglicht hat, die mir immer in guter Erinnerung bleiben werden.
Herrn Prof. Dr. M. Rögner danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Molekulare Genetik gilt mein Dank für das freundliche
Arbeitsklima und ihre Unterstützung, insbesondere Frau U. Aschke-Sonnenborn für ihre
ständige Hilfsbereitschaft und die sehr schönen "Arbeitstreffen" in ihrem Garten, meinen
Laborkollegen Herrn Dr. Bernd Tiemann und Herrn Dr. Thomas Hansner für viele wertvolle
Ratschläge und private Gespräche.
Bei allen Mitarbeitern des zentralen Isotopenlabors, insbesondere Herrn Dr. M. Roth und
Herrn P. Bodczian, möchte ich mich für die gute Zusammenarbeit bedanken. Ihre
Bemühungen zur Bereitstellung von Laborausstattungen haben die Durchführung einiger
Experimente erheblich erleichtert.
Herrn Prof. Dr. P. Freemont und seinen Mitarbeitern möchte ich für die überaus freundliche
Aufnahme und Betreuung während der Aufenthalte am ICRF in London danken.
Meiner Familie möchte ich für ihre große und vielfältige Unterstützung im Verlauf der letzten
Jahre herzlich danken, besonders meine Mutter hat sich immer wieder helfend angeboten und
war mir mit ihrem großen Engagement eine bedeutende Hilfe.
Ein umfassendes Danke möchte ich Nicole aussprechen. Sie hat mich in jeder Situation
vorbehaltlos unterstützt und war mir in allen wissenschaftlichen und privaten Belangen eine
unersetzliche Hilfe.