Promotionsprojekt (Prof.Deitmer) Charakterisierung des

Promotionsprojekt (Prof.Deitmer)
Charakterisierung des Aminosäuretransporters SNAT3 in Xenopus-Oocyten,
Koexpression mit Carboanhydrase und dem Monokarboxylat-Transporter MCT!
Das Membrantransportprotein SNAT3 wird im Gehirn (Astrocyten, Retina), in der Leber, in der
Niere und im Fettgewebe exprimiert. Es ist Teil des Glutamat-Glutamin-Shuttels, der die Zellen
mit Stickstoff, Energie oder den für die Peptidsynthese erforderlichen Aminosäuren versorgt.
SNAT3, ein N-Aminosäuretransporter (Substrat sind neutrale Aminosäuren), wird in der
Nomenklatur der löslichen Carrier-Genfamilie mit SLC38A3 bezeichnet. Die Stöchiometrie des
Transports wird als elektroneutral angenommen. Dabei wird eine Aminosäure (Glutamin,
Asparagin oder Histidin) im Cotransport mit einem Na+-Ion gegen ein Proton ausgetauscht.
Zusätzlich weist SNAT3 einen kleinen Kationenstrom auf, unabhängig vom elektroneutralen
Substrat-Transport (Chaudhry et al., 2001). Carboanhydrase ist ein Enzym, das die
Gleichgewichtseinstellung von CO2 und H2O mit H+ und HCO3- katalysiert. Insgesamt kennt man
14 Subtypen, am bekanntesten ist CAII im Cytosol und CAIV und CAXIV im extrazellulären
Raum. In unseren Experimenten wird CA injiziert oder koexprimiert um den Effekt des Enzyms
auf die Transportaktivität von SNAT3 und auf den Membranstrom zu analysieren. CRNA von
SNAT3 wird zur heterologen Expression in Xenopus-Oocyten injiziert. Zur Koexpression wird die
cRNA für Carboanhydrase zugegeben. Die Änderungen des intrazellulären pH-Wertes werden
mit Hilfe von Ionen-sensitiven Mikroelektroden aufgezeichnet. Der Membranstrom (im Bereich
von nano-Ampere) und die Änderung der Leitfähigkeit nach Zugabe von Aminosäuren (I/V
Beziehung) wird elektrophysiologisch untersucht. Die Experimente werden in HEPES und
CO2/HCO3- - gepufferten Lösungen durchgeführt. Für Flussmessungen werden radioaktiv
markierte Substrate eingesetzt und die Transportaktivitäten von SNAT3 exprimierenden Oocyten
mit und ohne CA werden miteinander verglichen.
In weiteren Experimenten wird der Effekt einer anderen CA-Isoform (CAIV) auf den SNAT3Transport in Oocyten untersucht. Mit Hilfe der
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O-Austausch-Methode wird außerdem der
Unterschied zwischen Oocyten, die SNAT3 exprimieren zu Oocyten, die SNAT3-CAII- /SNAT3CAIV koexprimieren, erfasst. Durch die Koexpression von SNAT3 und MCT1 in XenopusOocyten wollen wir die gegenseitigen Wechselwirkungen der Transporter untersuchen.
Außerdem soll auch hier der Effekt von CA analysiert werden.