Das Saure Prostata Phosphatase Fragment 85
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Universitätsklinikum Ulm Institut für Molekulare Virologie Leiter: Prof. Dr. Frank Kirchhoff Das Saure Prostata Phosphatase Fragment 85-120 bildet Amyloidfibrillen und verstärkt die HIV-1 Infektion Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin (Dr. med.) der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Jacqueline Schnell aus Konstanz 2012 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Jan Münch 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Barbara Spellerberg Tag der Promotion: 11. Juli 2013 für meinen Mann Inhaltsverzeichnis I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS......................................................................................................... III 1 EINLEITUNG ............................................................................................................................. 1 1.1 ENTDECKUNG UND EPIDEMIOLOGIE DES HUMANEN IMMUNDEFIZIENZ VIRUS ........................... 1 1.2 MORPHOLOGIE, GENOMAUFBAU, REPLIKATIONSZYKLUS ........................................................ 2 1.3 INFEKTIONSWEGE UND ÜBERTRAGUNGSRATEN ..................................................................... 6 1.4 AMYLOID IM SAMEN VERSTÄRKT DIE HIV INFEKTION .............................................................. 7 1.4.1 Die saure Phosphatase der Prostata............................................................................ 8 1.4.2 PAP Fragmente formen Amyloid Fibrillen .................................................................... 8 1.4.3 Wirkmechanismus der SEVI vermittelten HIV-Infektionsverstärkung ........................ 10 1.5 AUFGABENSTELLUNG – CHARAKTERISIERUNG DES AUS SAMEN ISOLIERTEN AMYLOIDOGENEN PEPTIDS PAP85-120 ..................................................................................................................... 11 2 MATERIAL UND METHODEN................................................................................................ 13 2.1 2.1.1 Peptide........................................................................................................................ 13 2.1.2 Eukaryote Zelllinien .................................................................................................... 13 2.1.3 Bakterien..................................................................................................................... 14 2.1.4 Enzyme ....................................................................................................................... 15 2.1.5 Reagenzien und Laborhilfsmittel ................................................................................ 15 2.1.6 Reagenzsysteme (Kits)............................................................................................... 16 2.1.7 Medien ........................................................................................................................ 17 2.1.8 Lösungen und Puffer .................................................................................................. 18 2.2 3 MATERIAL ......................................................................................................................... 13 METHODEN ....................................................................................................................... 20 2.2.1 DNA Methoden ........................................................................................................... 20 2.2.2 Zellkultur ..................................................................................................................... 20 2.2.3 Bakterienkultur............................................................................................................ 21 2.2.4 Herstellung von Virusstocks ....................................................................................... 22 2.2.5 Bestimmung der viralen Infektiösität und Replikation................................................. 23 2.2.6 Bestimmung der TCID50 ............................................................................................ 25 2.2.7 Bestimmung der Virusbindung an die Zielzelle .......................................................... 26 2.2.8 Der MTT Test zur Ermittlung der Zytotoxizität............................................................ 26 2.2.9 GFP Fluoreszenzmikroskopie .................................................................................... 27 2.2.10 Peptidsynthese und Fibrilleninduktion.................................................................... 27 2.2.11 Computerprogramme ............................................................................................. 27 ERGEBNISSE ......................................................................................................................... 28 3.1 VORARBEITEN ................................................................................................................... 28 3.2 PAP85-120 BILDET AMYLOIDFIBRILLEN .............................................................................. 28 3.3 SEVI2 IST NICHT ZYTOTOXISCH .......................................................................................... 29 3.4 SEVI2 VERSTÄRKT DIE HIV-1 INFEKTION............................................................................ 30 Inhaltsverzeichnis 4 II 3.4.1 SEVI2 verstärkt die HIV-1 Infektion in Suspensionszellen ......................................... 32 3.4.2 SEVI2 verstärkt die Infektion aller gestesteten HIV-1 Varianten ................................ 33 3.4.3 SEVI2 verstärkt die HIV Infektion in primären Zellen ................................................. 34 3.5 SEVI2 ERNIEDRIGT DIE ZUR INFEKTION NÖTIGE VIRUSMENGE ............................................. 35 3.6 SEVI1 UND SEVI2 HABEN ADDITIVE EFFEKTE..................................................................... 38 3.7 SEVI2 VERSTÄRKT DIE HIV-1 PARTIKELBINDUNG AN DIE ZELLE ........................................... 39 3.8 EINFLUSS VON SEVI2 AUF WEITERE UMHÜLLTE VIREN ........................................................ 40 DISKUSSION .......................................................................................................................... 42 4.1 AMYLOIDE FIBRILLEN AUS DEM SPERMA- EIN SCHLÜSSELFAKTOR FÜR DIE SEXUELLE TRANSMISSION VON HIV-1?............................................................................................................ 42 4.2 4.2.1 SEVI2: EINFLUSS AUF DIE HIV-1 INFEKTION UND W IRKMECHNISMUS ................................... 44 Der infektionsverstärkende Effekt ist drastisch .......................................................... 46 4.3 W IRKUNG AUF ANDERE UMHÜLLTE VIREN............................................................................ 47 4.4 FRAGEN, BEDEUTUNG UND AUSSICHTEN ............................................................................ 48 5 ZUSAMMENFASSUNG .......................................................................................................... 51 6 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................................... 52 DANKSAGUNG ............................................................................................................................... 62 LEBENSLAUF ................................................................................................................................. 63 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Aß Amyloid beta Abb. Abbildung AIDS engl.: acquired immunodeficiency syndrome Amp Ampicillin AS Aminosäure APP Amyloid Precursor Protein ß-Gal ß- Galaktosidase bp Basenpaare °C Grad Celcius CA engl.: capside, dt.: Kapsid CCR5 CC-Motiv Chemokinrezeptor 5 CD engl.: cluster of differentiation CMV Cytomegalivirus CXCR4 CXC-Motiv Chemokinrezeptor 4 Da Dalton DCs engl.: dendritic cells, dt.: Dendritische Zellen DMEM engl.: Dulbecco´s modified aegle medium DNA Desoxyribonukleinsäure dt.: deutsch ELISA engl.: enzyme linked immunosorbent assay EMBL European Molecular Biology Laboratory engl. englisch env engl.: envelope E. coli Escherichia coli et al. lat.: et alii, dt.: und andere g Gramm gag engl.: group specific antigen GFP Grün floureszierendes Protein gp Glykoprotein HAART hochaktive antivirale Therapie HAD HIV assoziierte Demenz III IV Abkürzungsverzeichnis HIV Hummanes Immundefizienz Virus HLA engl.: human leucocyte antigen hPBMC engl.: human peripheral blood mononuclear cells h/ hr engl.: hours, dt.: Stunden kb Kilobasen l Liter lat. lateinisch LTR engl.: long terminal repeat m milli (10-3) µ mikro (10-6) MA Matrix MDM engl.: monocyte derived macrophages, dt.: aus Monozyten stimulierte Makrophagen Min Minute MLV engl.: mouse leukemia virus N Normalität NC engl.: nucleocapside, dt.:Nukleokapsid nef engl.: negative factor n nm nano (10-9) Nanometer PAP engl.: prostatic acidic phosphatase PBMC engl.: peripheral blood mononuclear cells PBS engl.: phosphate buffered saline PSA prostataspezifisches Antigen pol Polymerase rev engl.: regulator of expression of virion proteins RKI Robert Koch Institut RLU/s engl.: relative light units per second, dt.: relative Lichteinheiten pro Sekunde RNA Ribonukleinsäure rpm engl.: rounds per minute; dt.: Umdrehungen pro Minute RT Reverse Transkriptase SEVI engl.: semen derived enhancer of viral infection SIV engl.: simian immunodeficiency virus V Abkürzungsverzeichnis tat engl.: transactivation of transcription TCID 50 engl.: tissue culture infective dose 50 U engl.: unit, dt.: Einheit vgl. vergleiche vif engl.: viral infectivity factor vpr engl.: viral protein rapid vpu engl.: viral protein out VSV Vesikuläres Stomatitis Virus www engl.: world wide web A Ala Alanin I Ile Isoleucin R Arg Arginin C Cys Cystein K Lys Lysin S Ser Serin D Asp Asparaginsäure L Leu Leucin T Thr Threonin E Glu Glutaminsäure M Met Methionin V Val Valin F Phe Phenylalanin N Ans Asparagin W Trp Tryptophan G Gly Glycin P Pro Prolin Y Tyr H His Histidin Q Gln Glutamin Tyrosin 1 Einleitung 1 1.1 Einleitung Entdeckung und Epidemiologie des Humanen Immundefizienz Virus Im Jahr 1981 wurde in New York und Los Angeles das Krankheitsbild einer erworbenen, generellen Immunschwäche (AIDS, engl.: acquired immunodeficiency syndrome) vor allem bei jungen homosexuellen Männern beschrieben. Charakteristisch opportunistischen Infektionen war wie das Auftreten beispielsweise einer Vielzahl Pneumocystis von jirovecii Pneumonien, orale Candidainfektionen, Cytomegalievirus (CMV)-Retinitis sowie ein vermehrtes Vorkommen des Kaposi Sarkoms (Gottlieb et al., 1981; Masur et al., 1981). Bereits zwei Jahre später gelang es der Arbeitsgruppe um Françoise Barré-Sinoussi und Luc Montagnier, den Erreger zu identifizieren (Barré-Sinoussi et al., 1983), wofür sie 2008 mit dem Nobelpreis für Medizin geehrt wurden. Das Virus wurde schließlich der Familie der Lentiviren zugeordnet und als Humanes Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) bezeichnet (Coffin et al., 1986). Ebenfalls 1986 wurde aus Blutlymphozyten eines westafrikanischen AIDS Patienten ein weiteres HI-Virus isoliert (HIV Typ 2) (Clavel et al., 1986). Jüngere Forschungsergebnisse zeigen, dass der Ursprung der HIV/ AIDS Pandemie in mehreren unabhängigen akzidentiellen Übertragungen von AffenImmundefizienzviren (SIV, engl.: simian immunodeficiency virus) aus ihren natürlichen Wirten auf den Menschen liegt (Keele et al., 2006). Im Jahr 2010 sind laut der aktuellen Veröffentlichung des UNAIDS Reports (www.unaids.org) 34 Millionen Menschen mit HIV infiziert. In diesem Jahr kamen 2,7 Millionen Neuinfektionen hinzu. Allein südlich der Sahara leben 67% der HIV-Infizierten. Weltweit sind 2,1 Millionen der Infizierten Kinder, wobei 91% der Neuinfektionen ebenfalls auf die Gebiete südlich der Sahara entfallen. Außerdem ist eine zunehmende Prävalenz in Osteuropa und Zentralasien durch eine hohe Rate an Neuinfektionen zu verzeichnen. Seit dem Ausbruch der Pandemie sind 25 Millionen Menschen dem HI-Virus zum Opfer gefallen. Einleitung 2 Seit 1996 wird in Industrienationen zur Behandlung HIV infizierter Patienten das Schema der hochaktiven antiviralen Therapie (HAART) angewandt (ART Cohort Collaboration 2006). Grundlage dieser Behandlung ist die Kombination von mindestens drei antiretroviralen Medikamenten, welche die Lebenserwartung von Patienten mit HIV deutlich zu steigern vermag (Pallela et al., 1998, Abaasa et al., 2008). Die Therapie ist allerdings nicht unproblematisch und wird durch das Auftreten resistenter Viren, starker Nebenwirkungen und hohen Ansprüchen an die Compliance der Patienten erschwert. Ein weiteres Problem sind die immensen Kosten und nach wie vor ist das Millenniumziel (Millennium Development Goals Report 2009) des weltweiten Zugangs zu antiretroviraler Therapie, und somit ein Schritt, der Pandemie bis 2015 Einhalt zu gebieten, noch nicht erreicht. So ist es, um die Ausbreitung des HI-Virus zu stoppen, dringend erforderlich, präventive Strategien auszubauen und durch ein tiefer greifendes Verständnis der Virusübertragung, insbesondere des sexuellen Transmissionsmechanismus, neue Ansätze zur Ausbreitungshemmung zu finden. Ein von einigen Autoren als sehr vielversprechend beschriebener Ansatz ist die Entwicklung von sogenannten Mikrobiziden: lokal applizierbare Substanzen, die eine Infektion mit dem HI-Virus verhindern sollen (Hendrix et al., 2009, Klasse et al., 2008, Pope et al., 2003). Jedoch sind hierbei auch viele Probleme zu verzeichnen. So zeigten diverse klinische Studien bislang keinen oder nur moderate Effekte, die HIV Transmission zu vermeiden und für einige Substanzen, wie Nonoxynol-9, sogar ein erhöhtes Übertragungsrisiko (McGowan 2010). Des Weiteren steht die Entwicklung eines Impfstoffes im Fokus, wobei jedoch bislang keine dauerhafte B- und T-Zellantwort erreicht werden konnte und somit neue Ansätze zur Induktion einer schützenden Immunantwort notwendig sind (Watkins 2010, Sodora et al., 2009). 1.2 Morphologie, Genomaufbau, Replikationszyklus Das HIV-Virion hat einen Durchmesser von ca. 100nm (Abbildung 1). Eine Hüllmembran (Doppellipidschicht), die von der zellulären Zytoplasmamembran abgeleitet ist, umgibt das Viruskapsid. Eingelagert in die Zytoplasmamembran ist das virale Transmembranprotein gp41. Das äußere Hüllprotein gp120 ist nicht kovalent an gp41 gebunden. Matrixproteine (p17 MA) kleiden die Membran nach 3 Einleitung innen aus und haben über Myristinsäurereste sowohl Kontakt zum gp41 als auch zum konischen Kapsid (CA), welches aus Kapsidproteinen (p24) gebildet wird. Im Inneren des Viruskapsids befindet sich das virale Genom. Die Genomstränge sind mit den Enzymen Integrase, Reverse Transkriptase, Protease sowie einer speziellen tRNA Spezies (tRNALys3) zum Nukleokapsid (NC) assoziiert (DeVita et al., 1997). Abbildung 1: Aufbau eines HIV- Partikels Erläuterungen im Text. (Quelle: www.hiv- info.de/img/hiv_cut.jpg) HIV: Humanes Immundefizienz Virus Das Genom von HIV besteht aus zwei identischen, einzelsträngigen RNAMolekülen in Plus-Strang Orientierung mit einer Größe von etwa 9,5 kb, die mit der 5’-Cap-Struktur und der 3’-Polyadenylierung Eigenschaften eukaryotischer RNAs aufweisen. Lange terminale Sequenzwiederholungen (LTR, engl.: long terminal repeat) flankieren das provirale Genom am 3’- und 5’-Ende, wobei die 5´LTR der zellulären RNA-Polymerase II als Promoter dient (Abbildung 2). Wie alle Retroviren enthält auch das HIV-1 Genom das für Strukturproteine kodierende Gruppenspezifische Antigen gag, das für enzymatische Aktivitäten kodierende Gen pol und das für Glykoproteine kodierende Gen env. Zusätzlich finden sich bei HIV-1 die regulatorischen Gene tat und rev, sowie die akzessorischen Gene nef, vpr, vpu und vif. Während tat und rev für die Virusreplikation essentiell sind (Felber et al., 1989; Dayton et al., 1986), scheinen die übrigen Gene für die Replikation in den meisten Zellkulturen nicht relevant zu sein (DeVita et al., 1997). Tat und rev 4 Einleitung stimulieren die Transkription von HIV RNA und deren Elongation, fördern den Transport von HIV-RNA vom Zellkern ins Zytoplasma und sind wesentlich für die Translation. Vpr kann sowohl die HIV-LTR als auch eine Reihe von zellulären und viralen Promotern stimulieren und scheint für die Virusreplikation in nicht-teilenden Zellen von Bedeutung zu sein. Vpr ist für den Transport des viralen Präintegrationskomplexes zum Kern von Bedeutung (Miller und Sarver, 1997) und kann Zellen in der G2-Phase des Zellzyklus arretieren. Vpu spielt eine Rolle bei der Knospung der Viruspartikel (Varthakavi et al., 2008, McNatt et al., 2009) und ist an der Degradation von CD4-gp160-Komplexen im endoplasmatischen Retikulum beteiligt, damit genügend gp160 bei der Neubildung von Virionen bereit steht (Review Cullen, 1998). Vif hemmt durch Komplexbildung die antivirale Aktivität von APOBEC3G („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like 3G“) (Sheehy et al., 2002, Mariani et al., 2003). Nef wird ebenso wie Tat und Rev als regulatorisches Protein früh während des Replikationszyklus produziert. Nef induziert eine Herabregulation von CD4 und von HLA-Klasse-IAntigenen (Collins et al., 1998) an der Oberfläche infizierter Zellen, wodurch das Virus einer Immunantwort durch zytotoxische T-Zellen entgeht. Abbildung 2: Genomorganisation von HIV-1. Erläuterungen im Text. http://pathmicro.med.sc.edu/lecture/Image138.gif) HIV: Humanes Immundefizienz Virus (Quelle: 5 Einleitung Der Replikationszyklus (Abbildung 3) von HIV beginnt mit der Interaktion des viralen Hüllproteins gp120 mit dem Oberflächenmolekül CD4 (CD engl.: cluster of differentiation) der Zielzelle. CD4 ist der primäre Rezeptor für HIV, der bei der Aktivierung von T-Helferzellen eine essentielle Rolle einnimmt. Daneben bindet HIV an die Korezeptoren CCR5 (R5) und CXCR4 (X4) (Berger et al., 1999, Doms et al., 1997). R5 und X4 fungieren im menschlichen Organismus als Chemokinrezeptoren (Lu et al., 1997). Die Bindung des viralen Hüllproteins an das CD4 Molekül und den Korezeptor führt zu Konformationsänderungen im Hüllprotein und die Fusion der Virusmembran mit der Zytoplasmamembran der Zelle wird induziert, wodurch das Viruscore ins Innere der Zelle gelangt. Im Zytoplasma schreibt die Reverse Transkriptase in einem mehrstufigen Prozess die virale RNA in doppelsträngige DNA um. Im Zellkern vermittelt die virale Integrase die Integration der Virus-DNA ins Wirtszellgenom. Das so gebildete Provirus wird nun von der zellulären RNA Polymerase Typ II transkribiert, wobei in der frühen Phase nach der Integration mehrfach gespleißte mRNA Transkripte von rev, tat und nef gebildet werden. Zur Translation werden die Transkripte dann ins Zytoplasma exportiert. Die im Zytoplasma synthetisierten regulatorisch aktiven Proteine Tat und Rev werden anschließend wieder in den Zellkern zurücktransportiert. Dort wirkt Tat als Enhancer am viralen LTR-Promoter, während Rev den Export von einfachen und ungespleißten mRNAs sowie viralen RNA-Genomen vermittelt. Die mRNAs werden im Zytoplasma zur Translation der restlichen akzessorischen Proteine sowie der Strukturproteine verwendet. Die RNA Genome lagern sich an der Zytoplasmamembran mit den anderen Proteinkomponenten zusammen und werden in die unreifen Partikel verpackt. Erst nach der Knospung der unreifen Partikel erfolgt über die Spaltung des Gag/Pol Vorläuferproteins durch die virale Protease die Reifung des Viruspartikels außerhalb der Zelle. Während der Knospung wird freies gp120 in den Extrazellularraum sezerniert. 6 Einleitung Abbildung 3: Der Replikationszyklus von HIV. Die einzelnen nummerierten Schritte sind im Text erklärt 1: Bindung HIV an Zielzelle, 2: Membranfusion, 3: Viruscorefreisetzung, 4-6: Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom, 7: RNA Export, 8+9: Proteintranslation, 10: Knospung 11+12: Partikelreifung und Freisetzung von Gp120 (DeVita et al., 1997; Review: Freed, 2001) HIV: Humanes Immundefizienz Virus 1.3 Infektionswege und Übertragungsraten Die Ansteckung mit dem HI-Virus kann über kontaminiertes Blut, Sperma, Scheidensekret oder Muttermilch erfolgen. Weltweit werden mehr als 80% der HIV-1 Infektionen über Geschlechtsverkehr erworben (www.unaids.org) Die meisten Neuinfektionen resultieren aus der genitalen Exposition mit Samenflüssigkeit HIV-positiver Männer (Royce et al., 1997, Wawer et al., 2005). Frauen, die eine Infektion mit HIV-1 durch vaginalen Geschlechtsverkehr erleiden, machen fast 60% der Neuinfektionen in Afrika aus (Haase et al., 2005). In Deutschland ist die sexuelle Übertragung besonders wichtig, da andere Infektionsrisiken (z. B. Blutkonserven, Übertragungen bei der Geburt) durch gezielte Präventions- und Kontrollmaßnahmen minimiert werden konnten (RKI). Trotz der dramatischen Ausbreitung in der menschlichen Population ist die Effizienz der sexuellen Übertragung von HIV-1 erstaunlich gering. So wird das Übertragungsrisiko bei heterosexuellem intravaginalem Geschlechtsverkehr auf 1 7 Einleitung zu 1000-10000 beziffert (Gray et al., 2001). Faktoren, wie eine hohe Viruslast bei frischer Infektion (Pilcher et al., 2004) oder die Koinzidenz mit bestehenden anderen Geschlechtskrankheiten, in deren Folge es zu erhöhten Zahl aktivierter Leukozyten sowohl lokal als auch im Sperma selbst, sowie unspezifischen inflammatorischen Infiltraten kommt, können die Übertragungsrate steigern (Padian et al., 1994). Ebenso resultieren sexuelle Praktiken, die leicht mit Verletzungen der Schleimhaut einhergehen, in höheren Übertragungsraten (Galvin und Cohen, 2004). Zusammenfassend sind die Infektiösität von HIV-1 in männlicher Genitalflüssigkeit gemeinsam mit der Empfänglichkeit des Wirts, der sexuellen Praktik und der Viruslast, Hauptdeterminanten der sexuellen Übertragung (Chakraborty et al., 2001, Gupta et al., 1997, Pilcher et al., 2004). 1.4 Amyloid im Samen verstärkt die HIV Infektion Unter Berücksichtigung der Haupttransmissionswege in der menschlichen Population für HIV ist Sperma das Hauptvehikel des Virus. Jedoch ist wenig bekannt darüber, welche Faktoren im Sperma die HIV Infektion modulieren. Schon vor einigen Jahren beschäftigten sich Forschungsgruppen mit der Fragestellung, ob Sperma beziehungsweise einzelne Bestandteile hieraus als Wirtsfaktor das HIVirus bei der Infektion beeinflussen. So wurde beispielsweise beschrieben, dass Sperma ähnlich eines Superantigens an HLA-DR Rezeptoren auf Lymphozyten bindet, in diese Zielzellen eindringt, sie aktiviert und zu einer verstärkten Infektiösität des Virus führt (Scofield Review 1998). Andere Arbeitsgruppen beschrieben sogar einen antiviralen Effekt von Sperma auf das HI Virus (Martellini et al., 2009), was jedoch im Hinblick auf die zytotoxischen Effekte in der Zellkultur kritisch interpretiert werden muss (Kim et al., 2010). Die AG Kirchhoff/ Münch verfolgte den Ansatz möglicher Wirtsfaktoren im Sperma weiter und screente eine aus gepooltem Seminalplasma hergestellte Peptidbibliothek auf mögliche Effekte auf die HIV Infektion (Münch et al., 2007). Es stellte sich heraus, dass einige Fraktionen der Peptidbibliothek die HIV-1 Infektion signifikant verstärkten. Weitere Analysen zeigten, dass diese Fraktionen 34-40 Aminosäurereste lange Fragmente der sauren Prostataphosphatase (PAP engl.: prostatic acidic phosphatase) enthalten. 8 Einleitung 1.4.1 Die saure Phosphatase der Prostata Die humane saure Phosphatase der Prostata ist ein Glykoprotein mit einer Molekularmasse von ca. 41000 Da, welches zur Gruppe der Hydrolasen zählt und in den Epithelzellen der Prostata gebildet wird. Von dort wird es in großen Mengen (>200 U/Ejakulat) in das Prostatasekret sezerniert. Mit einem pH-Optimum von 4-6 ist sie als saure Phosphatase klassifiziert (Derechin et al., 1971, Rönnberg et al., 1981). Natürlicherweise kommt PAP als Dimer zweier nicht kovalent aneinander gebundener katalytisch inaktiver Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von je 50kDa vor, und bildet so das aktive Enzym (Luchter Wasyl und Ostrowski 1974, Kuciel 1996, Ostrowski 1994). Es existiert eine intrazelluläre und eine sezernierte Form. Bis zur Entdeckung des prostataspezifischen Antigens (PSA) wurde PAP auch als Tumormarker bei maligner Entartung der Prostata verwendet. Die physiologische Funktion ist noch nicht vollständig geklärt. Man vermutet eine wichtige Rolle bei der Fertilisation (Coffey und Pienta 1987). Aufgrund der Ergebnisse in Tumorzelllinien geht man davon aus, dass die zelluläre PAP für die Wachstumsregulation von Prostatazellen und der Kanzerogenese eine Rolle spielt. So führt eine hohe PAP Expression zu verlangsamtem Zellwachstum (Lin et al., 2000 und 2001). 1.4.2 PAP Fragmente formen Amyloid Fibrillen Die von Münch et. al isolierten Peptide stammen aus mehreren Regionen im PAP Protein und variieren in der Länge von 34 bis 40 Aminosäuren (AS). Die vorherrschende Form von 4551 Da korrespondiert mit den Aminosäuren der Positionen 248-286 der PAP (EMBL accession number AAB60640). Im Rahmen weiterer Analysen konnte gezeigt werden, dass der HIV-1 verstärkende Effekt von PAP248-286 abhängig von der Ausbildung fibrillärer Strukturen ist. Die aktive, also fibrilläre Form wurde als SEVI (engl.: semen derived enhancer of viral infection) bezeichnet. Diese fibrillären Strukturen weisen die Eigenschaften amyloider Fibrillen auf, wie sie für diverse krankheitsassoziierte Amyloidfibrillen, wie zum Beispiel Amyloid ß bei der Alzheimer Erkrankung, charakteristisch sind (Münch et al., 2007). Der Begriff Amyloid wurde historisch für extrazelluläre, krankheitsassoziierte Ablagerungen verwendet (Review Glenner, 1980) und rührt 9 Einleitung von der ursprünglichen Deutung als Stärke (amylum lat.: Stärke) her. Diese Ablagerungen, die mittlerweile auch intrazellulär nachgewiesen werden konnten, werden durch ihre färberischen, physikalischen und morphologischen Eigenschaften definiert (Nilsson 2004). Die assoziierten Erkrankungen zeichnen sich durch einen langsam progredienten, degenerativen Prozess aus. Nachgewiesene genetische Mutationen in Amyloid Vorläufer Proteinen, wie beispielsweise bei der früh auftretenden Alzheimererkrankung (Jarrett und Lansbury 1993, Teplow 1998, Selkoe 1999), stützen die Hypothese, dass die Fibrillenbildung den entscheidenden Schritt der Pathogenese darstellt. Unter dem Elektronenmikroskop stellen sich Amyloidfibrillen unabhängig ihres Ursprungs und ihrer AS Sequenz als gerade, rigide und unverzweigte Strukturen mit einem Durchmesser von 5 bis 13 nm dar (Teplow 1998) (vgl. Abbildung 4). Abbildung 4: Elektronenmikroskopische Aufnahme von PAP248-286. Links: Aufnahme von frisch gelöstem PAP248-286 zur Stunde 0. rechts: Aufnahme von PAP248-286, welches nach Lösen für 16 Stunden unter Schütteln inkubiert wurde (Münch et al., 2007). hr.: englisch.: hours, nm: nanometer PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase Röntgendiffraktionsanalysen weisen eine typische ß-Faltblattstruktur mit Fasern, die senkrecht zur Fibrillenachse stehen und einem parallel zur Achse verlaufenden Rückgrat mit Wasserstoffbrückenbindungen auf (Eanes und Glenner 1968). Generelle Eigenschaften von Amyloid sind die Anfärbbarkeit mit Kongorotfärbelösung- eine grüne Farbe bei Betrachtung mit doppelbrechendem Licht, die Bindung von Thioflavin und die charakteristische Streuung bei 0,4 und 1 nm bei Röntgendiffraktionsanalysen. All diese Eigenschaften werden auch zum Nachweis eingesetzt (Nilsson 2004). Die Möglichkeit Fibrillen auszubilden, scheint eine generelle Eigenschaft von Proteinen zu sein und ist nicht nur auf erkrankungsassoziierte amyloidogene 10 Einleitung Peptide beschränkt. So Denaturierungsbedingungen, wurde die für die einige Proteine Ausbildung unter von Wasserstoffbrückenbindungen und hydrophober Gruppen begünstigen, in vitro Fibrillenbildung nachgewiesen (Chiti et al., 1999). Und auch natürliche Prozesse scheinen an die Ausbildung von Fibrillen gebunden zu sein. So diskutieren Arbeiten von Berson und Chapman die Ausbildung von Amyloidfibrillen als einen evolutionär konservierten Prozess, um biologisch aktive Quartärstrukturen zu bilden. Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Escherichia coli (E. coli) zeigen die Bakterien von amyloiden Curli Fibrillen umgeben. Diese Fibrillen haben verschiedene Funktionen bei der Zelladhäsion, Zellaggregation und Biofilmbildung (Chapman et al., 2002, Review Barnhart und Chapman, 2006). Für Pmel17, ein Glykoprotein, welches für die Melaninsynthese in Säugerzellen eine Rolle spielt, konnte gezeigt werden, dass ein entscheidender Syntheseschritt abhängig von proteolytischen Proteinen ist, welche dazu führen, dass Pmel17 amyloide Fibrillen ausbildet (Berson et al., 2003). In der Arbeit von Münch et al., 2007 konnten für SEVI, die fibrilläre Variante von PAP248-286, all die genannten Eigenschaften, wie Kongorotfärbung, Thioflavinbindung und Elektromikroskopische Darstellung nachgewiesen werden. 1.4.3 Wirkmechanismus der SEVI vermittelten HIV- Infektionsverstärkung Es konnte gezeigt werden, dass lediglich die amyloide Form von PAP248286, also SEVI, einen infektionsverstärkenden Effekt besitzt (Münch et al., 2007). Dieser Effekt ist drastisch- eine bis zu 105-fache Infektionsverstärkung wurde beschrieben- und kann insbesondere bei niedrigen Infektionsdosen beobachtet werden. Bereits ein bis drei Viruspartikel sind ausreichend, um in Gegenwart von SEVI eine produktive Infektion zu etablieren wohingegen in Abwesenheit von SEVI ca. 1000 Partikel benötigt werden. (Münch et al., 2007). Dieser Effekt beruht auf einer Bindung von SEVI an Virionen und ist unabhängig vom HIV Hüllprotein (Münch et al., 2007). Zudem kommt es zu einer Bindung von SEVI an die Zielzelle. Ein Interaktionspartner oder spezifischer Bindungspartner (in der Membran der Zielzelle) konnte bislang noch nicht identifiziert werden. Als mögliche Struktur werden Heparan-Sulfat-Proteoglykane diskutiert, welche sich in 11 Einleitung der Zelloberfläche befinden (Roan et al., 2009, Roan et al., 2011). Es wurde gezeigt, dass nicht allein die Ausbildung amyloider Fibrillen für den infektionsverstärkenden Effekt ausreichend ist. So bildete eine Variante von SEVI bei der die acht Lysin- und Argininreste, welche zu einem hohen isoelektrischen Punkt (=10,21) führen, durch Alanin ersetzt wurden, zwar in vitro Amyloidfibrillen aus, die Infektionsverstärkung war jedoch stark abgeschwächt. Der infektionsverstärkende Effekt von SEVI scheint auf einem Ausgleich negativer Ladungen durch einen hohen Anteil positiver Ladungen zu beruhen. Virus und Zielzelle/ Zielstruktur werden durch den Ladungsausgleich näher zusammengebracht (Roan et al., 2009). Zusammenfassend verstärkt SEVI also das Attachment zwischen Virion und Zielzelle (Münch et al., 2007). Der Effekt von SEVI ist unabhängig vom viralen Geno- oder Phänotyp und auch von der Zielzelle (Münch et al., 2007). So konnte der infektionsverstärkende Effekt von SEVI für X4-, R5- und dualtrope Viren in immortalisierten Zellkulturlinien und humanen Blutlymphozyten und daraus ausdifferenzierte Makrophagen dargestellt werden. Mittlerweile konnte der infektionsverstärkende Effekt von SEVI auch durch Analysen von Sperma nachgewiesen werden (Kim et al., 2010). Unter Minimierung des zytotoxischen Effekts von Sperma konnte mittels spezifisch hergestellter Antikörper gezeigt werden, dass der Effekt von Sperma auf die HIV Infektion abhängig von der enthaltenen Konzentration von SEVI ist. 1.5 Aufgabenstellung – Charakterisierung des aus Samen isolierten amyloidogenen Peptids PAP85-120 HIV kontaminierte Samenflüssigkeit ist der wichtigste Überträger von HIV in der menschlichen Population und enthält amyloidogene Peptide (SEVI), welche die Infektiosität der HI Virionen erheblich steigern. Die AG Kirchhoff/Münch konnte in einer aus humanem Samen hergestellten Peptidbibliothek eine weitere Fraktion mit HIV verstärkender Aktivität identifizieren. Überraschenderweise enthielt diese Fraktion ebenfalls ein Fragment der Sauren Prostata Phosphatase, welches aber im Gegensatz zu PAP248-286/SEVI den Aminosäureresten 85-120 entspricht. Erste Ergebnisse zeigten, dass es sich bei PAP85-120 ebenfalls um ein amyloidogenes Peptid mit HIV verstärkenden Eigenschaften handelt. Somit wäre Einleitung 12 PAP das erste beschriebene Protein, das amyloide Strukturen aus zwei verschiedenen Bereichen bilden kann. Das Ziel dieser Arbeit war es deswegen, den Einfluss von PAP85-120 Amyloid auf HIV und andere Viren zu untersuchen. Material und Methoden 2 2.1 13 Material und Methoden Material 2.1.1 Peptide PAP85-120 IRKRYRKFLNESYKHEQVYIRSTDVDRTLMSAMTNL PAP248-286 GIHKQKEKSRLQGGVLVNEILNHMKRATQIPSYKKLIMY (VIRO Pharmaceuticals GmbH & Co. KG, Hannover) 2.1.2 Eukaryote Zelllinien 2.1.2.1 Suspensionszelllinien CEMx174 5.25M7: Zellhybrid aus humaner T- und B-Zelllinie, der zusätzlich CCR5 exprimiert. Enthält Gene für GFP und Luziferase unter Kontrolle des HIV-1 LTR Promotors (Hsu et al., 2003) hPBMC (engl.: human peripheral blood mononuclear cells): Periphere Blutlymphozyten abgeleitet aus peripherem Blut vom Menschen (Homo sapiens) 2.1.2.2 Adhärente Zelllinien 293T: Humane Nierenepithelzellen, die mit Adenovirus Typ 5 transformiert wurden und das SV40 (engl.: simian virus 40) large T-Antigen exprimieren. TZM-bl: Eine HeLa-Zelllinie, die zuverlässig große Mengen an CD4 und CCR5 exprimiert. Dabei auch CXCR4. Die Zellen tragen Luziferase und β-Galaktosidase Gene, die unter Kontrolle des HIV-1 Promotors stehen. (NIH AIDS Research and Reference Reagent Program catalogue no. 8129, TZM-bl) MDM (engl.: monocytederived macrophages): Aus hPMBCs mittels IL-2 und MCSF ausdifferenzierte Makrophagen. (siehe 3.2 Methoden) 14 Material und Methoden 2.1.3 Bakterien Escherichia coli XL2-BlueTM: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr) Amy Camr] (Stratagene; Heidelberg). 2.1.3.1 Plasmide Alle verwendeten Plasmide enthalten das Ampicillinresistenzgen zur Selektion in Bakterienstämmen. pBRNL4.3 Modifizierter pBR322-Vektor, der das gesamte provirale Genom des CXCR4 tropen HIV-1 pNL4-3 Klons enthält (Adachi et al., 1986). pBRNL4.3-Luc pBRNL4.3.-G-Luc-env* Derivat, in dem das env Gen nicht mutiert ist pBRNL4.3-G-Luc d1d2 pBRNL4.3 Derivat, welches anstelle von nef das Gen für die sekretierte Gaussia Princeps Luziferase codiert (nicht publiziert) pBRNL4.3-92TH014-12 Modifizierte pBR NL4-3-Vektor, der Veränderungen in der V3-Schleife des env-Gens aufweist und so einen R5 Korezeptortropismus vermittelt. (Papkalla et al., 2002). pBRNL4.3 92TH014-Luc pBRNL4.3-Luc Derivat, das die V3 Schleife des CCR5 tropen primären Isolates 92TH014-2 enthält (Münch et al., 2007) pBRNL4.3-G-Luc-92TH014-2 pBRNL4.3-G-Luc Derivat, das die V3 Schleife des CCR5-tropen Isolates 92TH014-12 primären enthält (nicht publiziert) pBRNL4.3-R*-E*-Luc pBRNL4.3 Derivat, welches anstelle des nef Gens das Gen für Firefly Luziferase enthält; zusätzlich führt eine in frame Deletion im env Gen zur Expression eines defekten Hüllproteins (He et al., 1995) pBRNL4.3.-G-Luc-env* pBRNL4.3-G-Luc Derivat, in dem eine in frame Deletion im env Zur Expression eines defekten Hüllproteins führt 15 Material und Methoden VSV-G eurkaryotischer Expressionsvektor für das G-Protein des VSV (Vesikuläres Stomatitis Virus) (pHIT-G). pHIT-MLV Expressionsplasmid kodierend für das Glykoprotein des Maus Leukämie Virus (MLV) 2.1.3.2 Längenstandard ″1-kb-Leiter″ Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) 2.1.4 Enzyme 2.1.4.1 Restriktionsendonukleasen Restriktionsendonukleasen wurden von Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) und New England Biolabs (Schwalbach, Traunstein) bezogen und in den von den Herstellern empfohlenen Puffersystemen verwendet. 2.1.4.2 Sonstige Enzyme Taq-DNA-Polymerase Stratagene Europe AG (Heidelberg) T4-DNA-Ligase Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) RNAse A aus Rinderpankreas Boehringer (Mannheim) Trypsin aus Rinderpankreas Stratagene Europe AG (Heidelberg) 2.1.5 Reagenzien und Laborhilfsmittel [α32P]-dTTP Amersham-Buchler (Braunschweig) [α35S]-dATP Amersham-Buchler (Braunschweig) Adenosintriphosphat Sigma (München) Agarose Invitrogen/Gibco (Karlsruhe Ammoniumpersulfat (APS) Sigma (München) Ampicillin Bayer (Leverkusen) 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Galaktopyranosid Roth (Karlsruhe) D-Luziferin Boehringer (Mannheim) Dimethylsulfoxid (DMSO) Fluka (Neu-Ulm) Ethidiumbromid (EtBr) Sigma (München) Ethylen-Diamin-Tetraacetat (EDTA) Sigma-Ark (München) Ficoll-Paque Amersham Pharmacia (Freiburg) 16 Material und Methoden Fötales Kälberserum (FKS) Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) Glycerin Merck (Darmstadt) Hydroxyethyl-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES)Serva (Heidelberg) Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck (Darmstadt) Interleukin-2 (IL-2) Sigma-Ark (München) Isopropanol Merck (Darmstadt) Kleenex Kimberley-Clark (Koblenz) Congo Red Solution Sigma Aldrich (Steinheim) L-Glutamin Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) MTT Sigma (München) Penicillin G Sigma (München) Phosphat-Buffered-Saline (PBS) Invitrogen/Gibco (Karlsruhe) Phytohämaglutinin (PHA) Murex (Burgwedel) Protein A-Sepharose-Perlen Pharmacia (Brüssel, Belgien) Reaktionsgefäße Eppendorf (Hamburg) Röntgenfilme Kodak (Stuttgart) Streptomycinsulfat Sigma (München) Tris-Hydroxymethyl-aminomethan Roth (Karlsruhe) Triton X-100 Sigma (München) Tween 20 Roth (Karlsruhe) Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck (Darmstadt) 2.1.6 Reagenzsysteme (Kits) Gal-Screen System Geneclean II Kit Applied Biosystems (Foster City, CA; USA) Dianova (Hamburg) HIV-1 p24 Kapsid-Antigen-ELISA AIDS Repository (Frederick, MD; USA) Luciferase Assay System Promega (Madison, WI; USA) Wizard™ Plus Midipreps Promega (Madison, WI, USA) QIAwell 8 Plasmid Kit Qiagen (Hilden) 17 Material und Methoden 2.1.7 Medien 2.1.7.1 Zellkulturmedien Suspensionszellen: RPMI-1640 Medium (Invitrogen/Gibco) mit 350µg/ml LGlutamin, 120µg/ml Streptomycinsulfat, 120µg/ml Penicillin und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS. Adhärente Zellen: DMEM (Dulbecco’s modified Eagle Medium; Invitrogen/Gibco) mit 350µg/ml L-Glutamin, 120µg/ml Streptomycinsulfat, 120µg/ml Penicillin und 10% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS. Aussähmedium für hPBMC: RPMI-1640 Medium (Gibco-BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin, 5% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS Stimulierungsmedium für zuerst infizierte hPBMC: RPMI-1640 Medium (Gibco-BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin, 200 Units/ml Interleukin 2,5µg/ml PHA und 30% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS Kultivierungsmedium für hPBMC: RPMI-1640 Medium (Gibco-BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin, 50 Units/ml Interleukin 2 und 15% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS Stimulierungsmedium für vorstimulierte hPBMC: RPMI-1640 Medium (Gibco-BRL, Eggenstein) mit 350 µg/ml L-Glutamin, 120 µg/ml Streptomycinsulfat, 120 µg/ml Penicillin, 100 Units/ml Interleukin 2, 2,5µg/ml PHA und 15% (v/v) hitzeinaktiviertem FKS 18 Material und Methoden 2.1.7.2Bakterienkulturmedien LB-Medium: 10g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 8g/l NaCl, 1g/l Glukose; Zugabe von 100mg/l Ampicillin vor Gebrauch. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,2 eingestellt LBAMPAgar: 15g/l Agar und 100mg/l Ampicillin in LB-Medium; SOC-Medium: 20g/l Bacto-Trypton, 5g/l Hefeextrakt, 2,5mM NaCl, 10mM MgCl2, 10mM, MgSO4, 20mM Glukose. 2.1.8 Lösungen und Puffer 2.1.8.1 Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien Resuspensionspuffer (P1), Lysispuffer (P2), Neutralisationspuffer (P3) (Qiagen, Hilden), 70% EtOH, 90% Isopropanol und LiChrosolv-H2O. 2.1.8.2 Calciumphosphattransfektion 2x HBS (10x Stock): 8,18% NaCl (w/v); 5,94% HEPES (w/v); 0,2% Na2HPO4 (w/v). Die Lösung wurde steril filtriert und der pH-Wert mit 1M NaOH auf 7,12 eingestellt. 2M CaCl2 2.1.8.3 HIV p24 Kapsid Antigen ELISA Lösung zur Lyse der Viruspartikel: 10ml Triton X-100 (Sigma, München), ad 100ml mQ-H2O; Waschpuffer: 25ml 20x Waschkonzentrat (KPL, Maryland), ad 500ml mQH2O; Probenpuffer: 10ml 10% BSA (KPL, Maryland, MD; USA), 0,2ml Tween 20, ad 100ml 1xPBS; Lösung für den ersten Antikörper: Anti-p24-AK aus Kaninchen (100ml): 2ml Normal Mouse Serum (NMS) (Sigma, München), 98ml Probenverdünnungspuffer; Lösung für den zweiten Antikörper: Anti-Kaninchen-AK aus Ziegen (100ml): 5ml Normal Goat Serum (NGS) (Gibco/BRL, Eggenstein), 0,01ml Tween 20, 95ml 1xPBS; 19 Material und Methoden Substrat: TMB Peroxidase Substrat System (KPL, Maryland); Stopplösung: 4N H2SO4 2.1.8.4 Reversetranskriptasetest Für 200ml RT-Arbeitslösung: 10ml 1M Tris-Lösung, pH 7,8; 5ml 3M KClLösung; 4ml 0,1M Dithiothreitol-Lösung; 6,6ml 0,15M MgCl2-Lösung; 10ml 100µg/ml poly-ALösung; 10ml 31,5µg/ml oligo-dT-Lösung; 200µl 10µCi/ml α-32P-dTTP-Lösung; 5ml 2% NP-40Lösung; 149,2ml ddH2O; 20x SSC: 3M NaCl; 0,3M Natriumcitrat. 2.1.8.5 Luziferase Test Luziferase-Extraktionspuffer: 100mM KHPO4 pH 7,8, 1mM DTT Test-Puffer: 100mM KHPO4 pH 7,8, 15mM MgSO4, 5mM ATP Luciferin-Stock: 10mg Luciferin in 713µl Test-Puffer Luziferin-Arbeitslösung: 50µl Luciferin-Stock auf 2,45ml Test-Puffer 2.1.8.6 Zelllysate RIPA-I-Puffer: 1% Triton X-100 (v/v), 0,15 M NaCl, 50 mM Tris Hcl (pH 7,4), 5 mM EDTA, 1 mM PMSF 2.1.8.7 Sonstige Lösungen und Puffer PBS: 137mM NaCl; 7,3mM Na2HPO4; 1,47mM K2HPO4; 1mM CaCl2; 2mM MgCl2 50x TAE-Puffer: 500mM Tris, 250mM Natriumacetat, 50mM Na2EDTA. 20 Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 DNA Methoden Standard Methoden Folgende Methoden wurden nach Protokollen von Maniatis et al., 1989, durchgeführt: - Isolierung von Plasmid-DNA nach alkalischer Lyse der Bakterien - Konzentrationsbestimmung der Nukleinsäuren - Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen - Auftrennen von Nukleinsäuren durch Gelelektrophorese 2.2.1.1 Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien Plasmid-DNA wurde durch alkalische Lyse von Bakterien und anschließende Isolierung und Reinigung der DNA gewonnen (Maniatis et al., 1989). Für die Transfektion eukaryoter Zellen wurden die Präparationen mit dem WizardTM Plus Midipreps Kit (Promega; Madsion, WI, USA) oder dem QIAwell 8 Minipräp Kit (Qiagen; Hilden) nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Die DNAKonzentrationen wurden in einem Spektralphotometer (Eppendorf) bestimmt. 2.2.2 Zellkultur 2.2.2.1 Kultur adhäranter Zellen Die adhärenten Zellen wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen in DMEM bei 37°C und 7% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet. 2.2.2.2 Kultur von Suspensionszellen Die Suspensions-Zellen wurden in 25 cm2 Zellkulturflaschen in RPMI-1640 bei 37°C und 7% CO2 kultiviert. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich 1:10 bis 1:20 gesplittet. 21 Material und Methoden 2.2.2.3 Präparation und Kultur humaner peripherer Blutlymphozyten Primäre Blutlymphozyten PBMCs (engl.: peripheral blood mononuclear cells) wurden aus Blut verschiedener freiwilliger Spender (Blutspendezentrale Ulm) mittels Dichtegradienten-Zentrifugation in Ficoll gewonnen. Zunächst wurden 20 ml Ficoll (Raumtemperatur) in einem Zentrifugengefäß vorgelegt, vorsichtig mit einer 1:1 (v/v) Verdünnung von Blut in PBS überschichtet und 45 min bei 1700 rpm zentrifugiert. Die durch diesen Schritt von Thrombozyten, Erythrozyten und Plasma abgetrennten, als weißer Ring sichtbare PBMCs wurden mit einer 5 ml Zellkulturpipette abgezogen, zweimal in 20 ml PBS gewaschen (5 min, 1200 rpm, 20°C) und in 5 ml RPMI (5% FKS/Glu/SP) aufgenommen. Anschließend wurde die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die so aufgereinigten PBMCs wurden in RPMI1640 mit 10% FCS und 1%Pen/Strep in einer Konzentration von 2*10^6 Zellen/ml aufgenommen. Zur Stimulation der Lymphozyten erfolgte die Zugabe von 10 ng/ml IL-2 und PHA für 3 Tage. 2.2.2.4 Herstellung von Makrophagen aus Lymphozytenkonzentrat Die aus einem Buffy Coat gewonnen Lymphozyten (unstimuliert) wurden in Zellkulturplatten ausgesät (500.000 Zellen/ Well in 100µl RPMI mit 10 ng/ml MCSF). Nach 2 Stunden wurden die nicht adhärierten Zellen mit warmem RPMI abgewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 10 ng/ml MCSF und 10 ng/ml IL-2 stimuliert. Die Infektion der Zellen erfolgte, sobald sich ein geschlossener Zellrasen ausgebildet hatte. 2.2.3 Bakterienkultur Alle verwendeten Plasmide enthalten ein Ampicillin-Resistenzgen, transformierte Bakterien wurden daher durch Zusatz von Ampicillin (100 µg/ml) zum Kulturmedium selektioniert. Verwendet wurde der Escherichia coli-Stamm Escherichia coli XL2TM-Blue. Die Kulturen wurden für mindestens 12 h bei 37 °C in LBamp-Flüssigmedium geschüttelt oder auf LBamp-Agarplatten inkubiert. Bakterienstocks wurden durch Vermischen von 500 µl Bakterienkultur mit 500 µl Glycerin erstellt und bei -80 °C eingefroren. 22 Material und Methoden 2.2.3.1 Transformation von Escherichia coli XL2TM-Blue Nach dem Auftauen der kompetenten Zellen auf Eis folgte die Zugabe von 3 µl des Ligationsansatzes zu jeweils 12 µl der Zellen. Im Anschluss wurden die Bakterien für 30 min auf Eis, für 30 sek bei 42 °C im Wasserbad und für weitere 2,5 min auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 200 µl SOC-Medium und einer Inkubation von 40 min bei 37 °C wurde die Bakteriensuspension auf LBampAgarplatten ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert. 2.2.4 Herstellung von Virusstocks 2.2.4.1 Virusstocks Folgende fertige Virusstocks wurden vom Labor zur Verfügung gestellt : HIV-1 NL4_3 mit Austauschen im V3 Loop des gp120 (P51-S, YU2, 93BR022, 92BR029, 92UG029, 92UG021, 93BR20, ARP173) HIV-1 Subytpen und Medikamenten-resistente Viren (HIV-1 Ca9, V1557, Zt3-1RT, X11PR) HIV-2 Varianten HIV-2 7312 und HIV-2 rod10 Affenimmundefizienzviren (SIV engl. : Simian Immunodeficiency Viruses) aus Schimpansen (SIVcpztan1B910, SIVcpztanEK505, SIVcpztan3), Makakken (SIVmac239), Halsbandmandgaben (SIVbpj) und Meerkatzen (SIVagmtan1) 2.2.4.2 Calciumphosphattransfektion von 293T Zellen Die Transfektion der 293T-Zellen wurde nach der Calcium-PhosphatPräzipitat-Methode durchgeführt. Am Tag vor der Transfektion wurden 0,2 x 106 293T Zellen in 25 cm2 Zellkulturflaschen ausgesät und über Nacht bei 37 °C und 7,5 %igen CO2-Gehalt inkubiert. Die Zellen waren zum Zeitpunkt der Transfektion zu 50-75 % konfluent. Für die DNA-Arbeitslösung wurden 5 µg DNA mit 13 µl 2M CaCl2 gemischt und mit H2O auf 100 µl aufgefüllt. Diese Lösung wurde tropfenweise zu 100 µl 2 x HBS zugegeben. Nach 5 min Inkubation bei Raumtemperatur bildete sich ein milchiges Präzipitat. Der Transfektionscocktail Material und Methoden 23 wurde auf das Medium der Zellkulturen getropft und die Zellen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurde das Medium (DMEM: 10 % FKS, Glutamin, SP) erneuert. Die Überstände wurden am dritten Tag abgenommen, 5 min bei 1500 rpm zentrifugiert, aliquotiert und bei -80 °C als Virusstocks eingefroren. Zur Herstellung pseudotypisierter Virus-Partikel wurden statt nur 5µg proviraler DNA, 5 µg provirale DNA und 5 µg der env-Expressionsplasmide gemischt. Ansonsten wurde wie oben beschrieben verfahren. 2.2.4.3 HIV p24 Kapsidantigenelisa Die Konzentration viralen Antigens in Virusüberständen wurde mittels HIV p24 Kapsid Antigen-ELISA (AIDS Repository; Frederick, MD; USA) bestimmt. Das durch Lyse mit Triton X-100 freigesetzte HIV-Kapsidprotein p24 bindet an einen monoklonalen Maus-Antikörper. Ungebundenes Material wurde durch Waschen entfernt. Die Quantifizierung des Kapsidproteins erfolgt durch die sogenannte „sandwich“-ELISA Methode. Zuerst wurde ein polyklonaler Antikörper aus Kaninchen zugegeben, der an das Kapsid-Protein p24 bindet. Der gebundene Antikörper wurde daraufhin mit Anti-Kaninchen Antikörper aus Ziegen, der mit einer Peroxidase gekoppelt ist, inkubiert. Durch Zugabe des Substrates (TMB) kommt es zu einer Farbänderung der Lösung. Der Reaktionstop erfolgte durch Zugabe von 4N Schwefelsäure. Das gefärbte Produkt konnte dann bei den Wellenlängen 450 nm und 650 nm quantifiziert werden, wobei die gemessene Farbkonzentration proportional zu der Menge an Kapsidprotein ist. (Elisareader; Molecular Devices) 2.2.5 Bestimmung der viralen Infektiösität und Replikation 2.2.5.1Der ß-Galaktosidase Test TZM-bl-Zellen exprimieren CD4, R5 und X4 und enthalten das Gen für ßGalaktosidase unter Kontrolle der HIV-1-LTR. Nach der Virusinfektion kommt es zu einer Tat-vermittelten Expression von ß-Galaktosidase, die sich durch Lumineszenz-Messung nachweisen lässt. Die Menge an ß-Galaktosidase ist somit Maß für die Infektiosität. Um die Veränderung der Infektiosität in An- bzw. 24 Material und Methoden Abwesenheit von PAP85-120/ Amyloid aufzuzeigen, wurden etwa 105 Zellen/Well in 96-Well-Platten ausgesät und bei 37°C, 7% CO2 inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit den Virusstocks in einem konstanten Volumen infiziert und bei 37°C, 7% CO2 inkubiert. Nach 2 bis 3 Tagen wurde das Medium entfernt und die Zellen in 40µl einer 1:1 ß-Gal-Screen/PBSo-Lösung aufgenommen. Nach 60min Inkubation bei 37°C wurden 35 µl in Lumistripes überführt und anschließend im Luminometer (Berthold) vermessen. 2.2.5.2 Der Luziferase Test CEMX-M7 Zellen exprimieren CD4, R5 und X4 und enthalten das Gen für die Firefly Luziferase unter Kontrolle des HIV-1-LTR Promotors. Die Zellen wurden mit definierten Mengen Virusstocklösung (Infektionsdosen sind jeweils im Ergebnisteil angegeben) infiziert und für die jeweils angegebene Zeit bei 37°C und 5%CO inkubiert. Die Luziferase Aktivität wurde nach entsprechender Inkubationszeit im Zelllysat mithilfe des Luziferase Assay Systems (Promega) gemessen. Dazu wurden die Zellen für 5min bei 1500 rpm abzentrifugiert. Anschließend wurden die Mediumüberstände abgenommen und das Zellpellet in 30 µl Lysispuffer aufgenommen und in eine weißwandige Mikrotiter Luminometerplatte überführt. Die Detektion der Luziferaseaktivität erfolgte nach Zugabe von 50 µl Luziferasesubstrat im Luminometer, die Angabe erfolgt in relativen Lichteinheiten pro Sekunde (RLU/s engl.: relative light units per second). Für die Analyse der Infektiösität in PBMCs wurden Virusvarianten verwendet, in deren Genom das Gen für die Gaussia Luziferase eingefügt wurde. Die Gaussia Luziferase (Gluc) stammt vom marinen Ruderfußkrebs Gaussia princeps ab und wird im Gegensatz zur Firefly Luzferase von den Zellen ins Medium sekretiert. Sie katalysiert die Oxidation des Substrates Coelenterazin. Die Messung erfolgt bei 470 nm im Luminometer (Tannous et al., 2005). 2.2.5.3 Der Reverse Transkiptase Test Die Reverse Transkriptase verfügt über vier enzymatische Aktivitäten: Sie kann als RNAseH, RNA-Endonuklease, DNA abhängige DNA-Polymerase und RNA abhängige DNA-Polymerase aktiv sein. Ihre Aktivität als RNA-abhängige DNA-Polymerase wird im RT-Test als Maß für die virale Replikation quantifiziert. Die Komponenten des RT-Mix haben folgende Funktionen: SDS und NP-40 25 Material und Methoden schließen das Virus-Capsid auf. Die polyA Stränge dienen der RT als Matrize, während die Desoxythimidin-Oligomere die Primer für die Reverse Transkription bilden. Stabilisiert durch zweiwertige Ionen, nutzt die RT nun die radioaktiv markierten dTTPs zur Synthese des komplementären DNA Stranges. Um das Replikationsvermögen der einzelnen Virusvarianten zu untersuchen, wurde zu 6µl Virusstock 25 µl RT-Mix gegeben und dies für 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 6µl des Reaktionsgemisches auf Whatman Filterpapier aufgetropft und für 10-20 min bei Raumtemperatur getrocknet. Je nach Radioaktivität auf den Filtern wurden diese 3-5 mal mit 2 x SSC-Puffer gewaschen. Nach dem letzten Waschschritt sollte in der SSC-Lösung keine Radioaktivität nachweisbar sein. Danach wurden die Filter zweimal für 1min in 96% Ethanol gewaschen und für 1 h bei 60oC getrocknet. Die Aktivitäten der Proben wurden mit Hilfe eines Phospho-Imagers (BAS2000, Fuji Photo Film Co., Ltd.; Japan) ermittelt und mit Hilfe der Computerprogramme Basread, Aida und Excel ausgewertet. 2.2.6 Bestimmung der TCID50 Mittels dieser Methode wird die Menge replikationsfähiger Viruspartikel in einer Virus Stammlösung bestimmt, die notwendig ist, um 50% der Zielzellen zu infizieren. Die TCID50% (engl.: tissue culture infective dose) wurde analog dem vom ACTC Laboratory Technologist Committee herausgegebenen Protokoll bestimmt und berechnet (https://www.hanc.info/labs/labresources/procedures/ACTGIMPAACT%20Lab%20 Manual/TCID50%20Determination.pdf). Virusstocks wurden wie oben beschriebenen hergestellt und die p24 Antigen Konzentrationen bestimmt. Die Virusstocks wurden seriell vierfach verdünnt und mit PAP85-120 Amyloid oder PBS versetzt. Nach 10 Minuten wurden entweder 2x105 mit PHA/IL2 vorstimulierte PBMC Zellen oder 5x104 CEMx-M7 Zellen pro Well mit behandelten oder unbehandelten Viren infiziert. Alle zwei Tage wurde die Hälfte des Überstandes abgenommen und frisches Medium zugegeben. PBMC Überstände, die acht Tage nach Infektion gewonnen wurden, wurden mittels p24 Antigen ELISA vermessen. Eine produktive Infektion wurde für p24 Antigen Werte >0,4 ng/ml im zellfreien Überstand angenommen (Hintergrund <0,1 ng/ml p24 Antigen). CEMx-M7 Zellkulturen wurden an den Tagen 2, 5 und 7 nach Infektion mittels 26 Material und Methoden Luziferaseassay vermessen. Werte >500 RLU/s wurden als positiv gewertet (Luziferase Aktivität in Lysaten uninfizierter Zellen: <100 RLU/s). Die Auswertung erfolgt über die Spearman-Karber Methode. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A leer Leer leer leer leer leer leer leer leer leer leer leer B leer 4 -10 nicht infiziert leer -10 nicht infiziert leer -10 nicht infiziert leer -19 nicht infiziert leer -19 nicht infiziert leer -19 nicht infiziert leer leer leer C D E F leer leer leer leer -2 -2 4 -2 4 -11 4 -11 4 -11 -3 4 -3 4 -3 4 -12 4 -12 4 -12 -4 4 -4 4 -4 4 -13 4 -13 4 -13 -5 4 -5 4 -5 4 -14 4 -14 4 -14 -6 4 -6 4 -6 4 -15 4 -15 4 -15 -7 4 -7 4 -7 4 -16 4 -16 4 -16 -8 4 -8 4 -8 4 -17 4 -17 4 -17 -9 4 -9 4 -9 4 -18 4 -18 4 -18 4 4 4 4 4 G leer 4 4 4 4 4 4 4 4 4 H leer leer leer leer leer leer leer leer leer leer Abbildung 5: Darstellung der Versuchsanordnung auf einer Mikrotiterplatte 2.2.7 Bestimmung der Virusbindung an die Zielzelle TZM-bl Zellen wurden in einer Konzentration von 5x10³ Zellen/ Well und einem Volumen von 50 µl in Mikrotiterplatten ausgesät. Nach Zugabe von 40 µl 10fach verdünnten Virusstocks und 10µl aktiviertem Peptid in verschiedenen Konzentrationen folgte eine Inkubation von 4 Stunden bei 37°C. Danach noch ungebundenes Virus wurde mit warmem Medium ausgewaschen. Die Zellen wurden dann in DMEM mit 1% Triton X100 lysiert. Zellgebundenes HIV-1 Virushüllantigen wurde dann mittels p24 Antigen ELISA vermessen. Die Auswertung erfolgte durch Analyse der Ergebnisse in An- und Abwesenheit von PAP85-120 Amyloid. 2.2.8 Der MTT Test zur Ermittlung der Zytotoxizität Der MTT-Test wird zur Analyse der zellulären Aktivität verwendet und ist als Zytotoxizitätstest auswertbar. Dieser Proliferationstest basiert als kolorimetrischer Test auf der Umsetzung des in PBS-Lösung gelben Tetrazoliumsalzes MTT in das dunkelblaue, wasserunlösliche Formazan Produkt. Diese Umsetzung hängt von der enzymatischen Aktivität mitochondrialer Dehydrogenasen ab und erfolgt daher nur in lebenden, stoffwechselaktiven Zellen. Je 100.000 stimulierte PBMC wurden in Mikrotiterplatten in einem Volumen von 90µl ausgesät und am folgenden Tag Material und Methoden 27 mit Peptiden bzw. PBS oder H2O (10 µl) vermischt. Alle 2 Tage wurden 50µl Medium abgenommen und frisches Medium mit entsprechenden Mengen Peptid bzw. Kontrollen zugegeben. Am 8. Tag wurden pro Well 20µl einer MTT-Lösung (5 mg/ml in PBS) zugegeben und 4 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden 100µl einer sauren Isopropanolalkohol-Lösung (0,04N HCl) zupipettiert, 30 min bei Raumtemperatur inkubiert und im ELISA Reader die Absorption bei 560 nm und 650 nm gemessen. Der absolute Wert errechnete sich aus A560-A650. 2.2.9 GFP Fluoreszenzmikroskopie GFP exprimierende, infizierte CEMX-M7 Zellen wurden abzentrifugiert, das Medium abgezogen und die Zellen in 100 µl PBSo resuspendiert. Das Aufnehmen der Zellen in PBSo ist nötig, um die schwache Eigenfluoreszenz des Mediums auszuschließen. Die Zellen wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (Zeiss, Axiovert 25) betrachtet und fotografiert. 2.2.10 Peptidsynthese und Fibrilleninduktion Die Peptide wurden von VIRO Pharmaceuticals GmbH & Co. KG mittels Standard Fmoc Festphase Peptidsynthese hergestellt, mittels Umkehrphase Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC engl.: high performance liquid chromatograph) aufgereinigt und mit HPLC und Massenspektrometrie (MS) analysiert (VIRO Pharmaceuticals GmbH & Co. KG, Hannover). Die Peptide wurden in serumfreiem DMEM oder PBS in Konzentrationen von 5 mg/ml oder 10 mg/ml gelöst. Die Fibrillenbildung wurde durch Inkubation über Nacht bei 37°C und 1400 rpm in einem Tischrotator (Eppendorf Thermomixer) induziert und mittels Kongorotfärbung verifiziert. 2.2.11 Computerprogramme Zur Auswertung des RT Test wurde das Programm AIDA verwendet. Im Weiteren wurde zur Datenauswertung das Tabellenkalkulationsprogramm Excel des Betriebssystems Windows benutzt. 28 Ergebnisse 3 3.1 Ergebnisse Vorarbeiten In den Vorarbeiten der Arbeitsgruppe von Frank Kirchhoff und Jan Münch (Münch et al., 2007) wurde beschrieben, dass C- proximale, amyloidogene Fragmente der humanen sauren Prostataphosphatase (PAP engl.: prostatic acidic phosphatase) aus dem Sperma die HIV- Infektion dramatisch verstärken. Diese aktiven amyloiden Fibrillen wurden als SEVI (engl.: Semen-derived Enhancer of Virus Infection) bezeichnet. Um herauszufinden, ob neben SEVI weitere amyloidogene Peptide im Sperma vorliegen, haben Münch et al. erneut eine Peptid-Bibliothek bestehend aus gepooltem Ejakulat gescreent. Tatsächlich konnte wiederum eine Fraktion identifiziert werden, welche die Infektion von HIV-1 in Zellkultur verstärkte. Nach mehreren chromatographischen Aufreinigungsschritten dieser Fraktion konnte schließlich das bioaktive Peptid sequenziert werden. Es stellte sich überraschenderweise heraus, dass es sich ebenfalls um ein Fragment der PAP handelt, allerdings um ein N proximales Fragment, PAP85-120 (Abbildung 6). In ersten Experimenten konnte bereits gezeigt werden, dass synthetisch hergestelltes PAP85-120 nach Aktivierung ebenfalls die HIV Infektion verstärkt, allerdings wurde weder die PAP85-120 Amyloidogenese noch die Infektionsverstärkung genauer charakterisiert. Abbildung 6: Aminosäuresequenz der humanen sauren Prostataphosphatase. Die in fibrillärer Form aktiven Fragmente PAP85-120 (rot) und PAP248-286 (blau) sind hervorgehoben, die Ziffern geben die Aminosäureposition an. PAP englisch: prostatic acidic phosphatase 3.2 PAP85-120 bildet Amyloidfibrillen Um zu überprüfen, ob PAP85-120 ebenfalls Amyloidfibrillen ausbildet, wurde synthetisches PAP85-120 Peptid in PBS gelöst (10 mg/ml) und Ergebnisse 29 anschließend, wie bereits für die PAP248-286 Amyloid-Bildung beschrieben, bei 37°C in einem Thermomixer agitiert. Nach Inkubation über Nacht konnte eine Eintrübung der Lösung festgestellt werden, was auf die Bildung unlöslicher Amyloidfibrillen hindeutete. Elektronenmikroskopische Analysen dieser Lösung zeigten, dass sich nach Inkubation sowohl Fibrillen als auch sphärische Strukturen gebildet hatten (Abbildung 7). Um zu klären, ob es sich tatsächlich um Amyloid handelte, wurde sowohl frisch gelöstes als auch inkubiertes PAP85-120 mit den amyloidspezifischen Farbstoffen Kongorot und Thioflavin T behandelt (Nilsson 2004). Beide Farbstoffe reagierten spezifisch mit inkubiertem PAP85-120 aber nicht mit frisch gelöstem Peptid. Diese Ergebnisse belegen, dass es sich bei PAP85-120 um ein amyloidogenes Peptid handelt. Unter Berücksichtigung der aktuellen Literatur ist PAP das bisher erste beschriebene Protein, welches Amyloidprecursor in zwei unterschiedlichen Regionen des Proteins trägt. Im Folgenden wird zur einfacheren Unterscheidung zum monomeren Peptid, fibrilläres PAP85-120 Amyloid als SEVI2 bezeichnet. Abbildung 7: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von PAP85-120 und SEVI2: Die Abbildung zeigt links frisch in PBS gelöstes Peptid zum Zeitpunkt 0 und rechts nach 16 Stunden Agitation über Nacht bei 37°C und 1200 rpm. Nach Agitation werden die fibrillären Strukturen unter dem Elektronenmikroskop deutlich sichtbar. PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase, SEVI: englisch semen derived enhancer of viral infection, PBS: englisch: phosphate buffered saline h: englisch: hour, rpm: englisch: round per minute 3.3 SEVI2 ist nicht zytotoxisch Sowohl amyloide Peptide, wie zum Beispiel Amyloid ß, als auch Sperma selbst sind als zytotoxisch beschrieben (Allen und Roberts 1986). Die amyloidassoziierte Zytotoxizität wird bei den amyloid-assoziierten Erkrankungen wie beispielsweise der Alzheimer Erkrankung als entscheidender Faktor in der Pathogenese gewertet (Merlini et al., 2011). Um zu überprüfen, ob SEVI1 und SEVI2 zytotoxisch sind, wurde die metabolische Aktivität verschiedener Zelllinien 30 Ergebnisse unter Anwesenheit von Amyloid im MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromid) Test überprüft. Exemplarisch dargestellt sind die Ergebnisse in PBMCs (Abbildung 8). Meine Untersuchungen zeigen, dass keines der getesteten Peptide in Konzentrationen bis 100 µg/ml, die weit über den physiologischen Konzentration im Sperma und auch über den in den Versuchsreihen verwendeten Konzentrationen liegen, zytotoxisch ist. Abbildung 8: SEVI2 ist nicht zytotoxisch. Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBMC) wurden mit Phytohämagglutinin (2 µg/ml) und Interleukin 2 (10 µg/ml) für drei Tage stimuliert. Danach wurden die Zellen in Mikrotiterplatten ausgesät, die die angegebenen Konzentrationen von frisch gelöstem monomerem PAP85-120 oder fibrillärem SEVI2, bzw. PAP248-286 oder SEVI1 enthielten. Nach drei Tagen wurde die Stoffwechselaktivität im MTT Test (3-(4,5-Dimethylthiazol-2yl)2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromid) gemessen. Die Werte zeigen Mittelwerte aus Dreifachansätzen +/-Standardabweichung. Die Dehydrogenaseaktivität von Proben ohne Peptid wurde gleich 100% gesetzt. PBMC englisch: peripheral blood mononuclear cells, PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase, SEVI: englisch semen derived enhancer of viral infection 3.4 SEVI2 verstärkt die HIV-1 Infektion Die infektionsverstärkende Wirkung von SEVI1 ist von der Ausbildung von Amyloidfibrillen abhängig (Münch et al., 2007). In den folgenden Experimenten sollte überprüft werden, ob dies auch für das Peptidfragment PAP85-120 gilt. Nach Inkubation der frischen, klaren Peptidlösung bei 37°C und Schütteln über Nacht resultierte eine trübe Lösung, verursacht durch die Bildung nicht löslicher 31 Ergebnisse PAP85-120 (SEVI2) Fibrillen. Um den Einfluss auf die HIV Infektion zu testen, wurden CEMX-M7 Zellen unter Anwesenheit steigender Konzentrationen von frisch gelöstem oder inkubiertem Peptid infiziert. Die dargestellten Ergebnisse zeigen, dass monomeres PAP85-120 keinen Einfluss auf die Infektion hat, wohingegen die trübe, also fibrilläre, Peptidlösung zu einer deutlichen Infektionsverstärkung führt (Abbildung 9). Dieser Effekt lässt sich auch nach mehrmaliger Resuspension und Abzentrifugation der fibrillären Anteile nachweisen (Abbildung 10). Der Effekt ist konzentrationsabhängig und tritt bereits in Konzentrationen ab 2 µg/ml auf (Abbildung 9 und 10). Dies entspricht auch den zu erwartenden physiologischen PAP85-120 Konzentrationen im Sperma. Abbildung 9: PAP85-120 Amyloid (SEVI2) verstärkt die HIV Infektion. PAP85-120 wurde in PBS gelöst (5 mg/ml) und entweder unbehandelt gelassen oder über Nacht auf einem Tischrotator bei 1200 rpm und 37°C inkubiert. CEMx-M7 Zellen wurden dann entweder in der Anwesenheit der inkubierten oder unbehandelten Peptidlösung mit X4-tropem HIV-1 NL4-3 infiziert. 36 h nach Infektion wurde die Luziferaseaktivität in den Zelllysaten bestimmt. Die Werte repräsentieren die Durchschnittswerte aus Dreifachansätzen +/- Standardabweichung. PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase, PBS: englisch: phosphate buffered saline, SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus, RLE/s: relative Lichteinheiten pro Sekunde, rpm: engl.: rounds per minute. 32 Ergebnisse A B Abbildung 10: Das Präzipitat der SEVI2 Lösung enthält den Hauptanteil der HIV-1 verstärkenden Aktivität. Eine Fibrillen enthaltende Peptidlösung wurde bei 14000 rpm zentrifugiert, der Überstand wurde abgenommen und das Pellet wurde wiederum in PBS gelöst. Verdünnungsreihen des resuspendierten Pellets, der Überstände, und der ursprünglichen Lösung wurden zu TZM-bl Zellen hinzugefügt und diese mit einem R5- (A) und X4- (B) tropen HIV-1 infiziert. Nach drei Tagen wurden die Infektionsraten mittels ß Galaktosidase-Test bestimmt. Dargestellt sind die Durchschnittswerte aus Dreifachansätzen +/- Standardabweichung. SEVI: englisch semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus, PBS: englisch phosphate buffered saline, RLE/s: relative Lichteinheiten pro Sekunde, rpm: engl.: rounds per minute. 3.4.1 SEVI2 verstärkt die HIV-1 Infektion in Suspensionszellen Neben CD4 benutzt HIV-1 zum Eintritt in die Zelle einen der beiden Chemokinrezeptoren CCR5 oder CXCR4. Zur weiteren qualitativen Analyse des Effekts von SEVI2 auf die HIV-Infektion wurden CEMx-M7 Zellen mit einer X4tropen und einer R5-tropen HIV-1 Variante unter Anwesenheit von SEVI2 in verschiedenen Konzentrationen infiziert. CEMx-M7 Zellen enthalten das GFP Reportergen unter Kontrolle des viralen Promotors LTR (engl.: long terminal repeat), so dass die Infektion fluoreszenzmikroskopisch beurteilt werden kann. Mit steigender Peptidkonzentration wird eine vermehrte Anzahl von CEMx-M7 Zellen effektiv infiziert (Abbildung 11). Die abgebildeten Ergebnisse zeigen, dass SEVI2 konzentrationsabhängig die Infektion von Suspensionszellen durch X4- und R5trope Viren in physiologisch relevanten Mengen verstärkt. 33 Ergebnisse Abbildung 11: Fluoreszenzmikroskopische Darstellung der Infektionsverstärkung durch SEVI2: CEMx-M7 Zellen wurden unter Anwesenheit der angegebenen Peptidkonzentrationen entweder mit 0,5 ng p24 Antigen des X4-tropen HIV-1 NL4-3 (X4 HIV-1) oder dem R5 tropen 92Th014 V3 rekombinanten Virus (R5 HIV-1) infiziert. Nach drei Tagen wurden die Zellen abzentrifugiert, in 50 µl 2% Paraformaldehyd fixiert und mit dem Fluoreszenzmikroskop analysiert. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus 3.4.2 SEVI2 verstärkt die Infektion aller gestesteten HIV-1 Varianten Für SEVI1 wurde eine breite infektionsverstärkende Aktivität beschrieben (Münch et al., 2007). Um zu testen, ob SEVI2 ähnlich aktiv ist, wurden HIV-1 Varianten mit unterschiedlichem Korezeptortropismus (Abbildung 12) mit steigenden Konzentrationen von Amyloid inkubiert. Anschließend wurden CEMxM7 Zellen infiziert. Die Messung der Infektionsraten nach 3 Tagen zeigten, dass SEVI2 die Infektionsraten dosisabhängig um das 5 (Isolat 92TH014) bis 16 (Isolat P51-S) -fache verstärkte (Abbildung 12 a). Des Weiteren wurde SEVI2 mit Vertretern der HIV Untergruppen Gruppe M (engl.: major group), Gruppe O (engl.: outlier) und je einem gegen Reverse Transkriptaseinhibitoren resistenten Isolat (Zt3-1 RT) und einem gegen Proteaseinhibitor resistenten Isolat (X11 PR) getestet. Auch hier konnten die Effekte unabhängig von den Gruppen in ebenso starker Auswirkung nachgewiesen werden. Schwankungen des infektionsverstärkenden Effektes von SEVI2 erklären sich über Unterschiede in der primären Infektiösität der Virusisolate (Abbildung 12 b). Der Infektionsverstärkende Effekt von SEVI2 ist also unabhängig vom viralen Korezeptortropismus und von der getesteten HIV-1 Subgruppe. Ergebnisse 34 Abbildung 12: a) SEVI2 verstärkt die HIV-1 Infektion unabhängig vom Tropismus und HIV-1 Subtyp: CEMx-M7 Zellen wurden mit 1 ng p24 Antigen der angegebenen HIV-1 NL 4-3 Rekombinanten (Papkalla et al., 2002) unter steigenden Konzentrationen von SEVI2 infiziert. b) Effekt auf verschiedene HIV-1 Gruppen: Infektion von CEMx-M7 Zellen mit verschiedenen HIV-1 Subtypen unter Anwesenheit von jeweils 25 µg/ml SEVI2. a/b) Infektionsraten wurden nach drei Tagen mittels virusinduzierter Luziferaseaktivität bestimmt. Die Werte zeigen Mittelwerte aus Dreifachansätzen +/-Standardabweichung. Luziferaseaktivität in Zellen ohne Peptid wurde gleich 100% gesetzt. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus 3.4.3 SEVI2 verstärkt die HIV Infektion in primären Zellen Bisherige Untersuchungen zu SEVI2 wurden in immortalisierten CEMx-M7 Zellen oder TZM-bl Reporterzellen durchgeführt. Um zu untersuchen, ob SEVI2 auch die HIV Infektion von relevanten Primärzellen erhöht, wurden PBMCs und Makrophagen (MDM engl.: monocyte derived macrophages) verwendet. Dazu wurden Luziferase exprimierende X4- und R5-trope HIV-1 Varianten mit SEVI2 versetzt und damit PBMCs bzw. Makrophagen infiziert. Die Infektionsraten wurden 3 Tage später durch Nachweis der Luziferaseaktivität in den lysierten Zellen ermittelt. Meine Ergebnisse zeigen, dass SEVI2 die Infektion der X4- und R5tropen HIV-1 Variante um das bis zu 15-fache in PBMCs verstärkt. Der infektionssteigernde Effekt auf die X4-trope Virusinfektion ist in Makrophagen nicht ganz so stark ausgeprägt, wie für das R5-trope Virus. Makrophagen exprimieren überwiegend den Korezeptor CCR5. Dies legt nahe, dass der Effekt von SEVI2 zwar unabhängig vom benutzten Korezeptor ist, dass jedoch für das Eindringen Ergebnisse 35 des Virus in die Wirtszelle die Korezeptorbindung auch in der Anwesenheit von SEVI2 nicht umgangen werden kann (Abbildung 13). Abbildung 13: SEVI2 verstärkt die HIV-1 Infektion von PBMCs und Makrophagen: Die Zellen wurden mit 0,5 und 5 ng von Luziferase-codierenden X4- oder R5-tropen Varianten in der An- oder Abwesenheit der angegebenen Menge SEVI2 infiziert (weiße Balken: Infektion ohne Peptid). Drei Tage nach Infektion wurde die viral codierte Luziferase in den Zelllysaten mittels eines Chemoluminineszensassays gemessen. Die Werte repräsentieren die prozentualen Mittelwerte aus den Infektionen mit 0,5 und 5 ng, welche jeweils im Tripel angesetzt wurden +/Standardabeichung. Luziferaseaktivität in den Proben ohne Peptid wurde jeweils mit 100% gleichgesetzt. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus, PBMC: englisch: peripheral blood mononuclear cells, MDM: englisch: monocyte derived macrophages 3.5 SEVI2 erniedrigt die zur Infektion nötige Virusmenge Das Ausmaß der Infektionsverstärkung von SEVI1 und SEVI2 hängt von der eingesetzten Virusmenge bzw. der Infektiösität der Virusstocks ab (Münch et al., 2007). Hohe Virusdosen infizieren bereits in der nicht Amyloid enthaltenen Kontrolle alle Zellen. Verstärkende Effekte von SEVI2 sind deshalb unter diesen Bedingungen nicht messbar. Aus diesem Grund wurden in den oben stehenden Experimenten jeweils Virusmengen verwendet, die in Abwesenheit von Amyloid zwischen 0,5 bis 5 % der Zellen infizieren. Wie sich in ersten Versuchen ablesen lässt ist der infektionsverstärkende Effekt von SEVI2 drastisch. Schon in Konzentrationen von 2-10 µg/ml SEVI2 sieht man einen bis 200-fach infektionsverstärkenden Effekt. Werden also 0,5 % der Zellen auch ohne SEVI2 36 Ergebnisse infiziert, könnten in Gegenwart von SEVI2 theoretisch 100 % der Zellen infiziert werden, wenn man vom 200-fach verstärkenden Effekt ausgeht. (0,5%*200=100%). Sind 5 % der Zellen in der Kontrolle infiziert, kann SEVI jedoch die Infektion nur um das maximal 20-fache verstärken (100% / 5% = 20). Des Weiteren wurde beobachtet, dass bei sehr niedrigen Virusmengen eine Infektion nur in Gegenwart von SEVI2 stattfand, wohingegen die unbehandelten Kulturen nicht infiziert werden konnten. Die Steigerung der Infektion lässt sich unter diesen Bedingungen nicht berechnen (5% / 0% = ?). Daher ist die einzige sinnvolle Möglichkeit zu Ermittlung eines Wertes, der die Aktivität von SEVI2 auf die Virusinfektion exakt ausdrückt, eine Infektionsdosisschwellenanalyse (TCID 50 engl.: Tissue culture infective dose 50; Infektionsdosis, mit der 50% der Zellkultur infiziert werden). In diesen Experimenten werden Verdünnungsreihen der zu untersuchenden Viren hergestellt und anschließend Zellen infiziert. Nach 1 Woche werden die infizierten und uninfizierten Zellkulturen ermittelt und aus diesen Daten die Infektionsschwellendosis ermittelt. Um den Einfluss von SEVI2 auf die Infektionsschwellendosis zu testen, wurden CEMx-M7 Zellen oder PBMCs ohne Peptid und unter Anwesenheit einer konstanten Konzentration von SEVI2 mit Verdünnungsreihen von Virusstocks infiziert. Es wurden auch hier X4- und R5-trope Viren verwendet. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die Infektion eines Wells durch Nachweis der Luziferaseaktivität (bei CEMxM7 Zellen) beziehungsweise des p24 Antigens (bei PBMCs) ermittelt. Wie in Abbildung 14 und 15 gezeigt, führen in Anwesenheit von physiologisch relevanten Amyloidkonzentrationen bereits kleinste Virusmengen zu einer Infektion. Bereits in einer 107-fachen Virusstockverdünnung konnte in Anwesenheit von SEVI2 eine Infektion etabliert werden, wohingegen in der Kontrolle ohne Amyloid die Schwellendosis bei einer 104-fachen Verdünnung lag. Die Infektionsschwellendosis wird somit in Gegenwart von SEVI2 um drei Zehnerpotenzen herabgesenkt. Zur Kalkulation der zugefügten Viruspartikel wurde davon ausgegangen, dass ein Viruspartikel etwa 5000 p24 Kapsid Proteinen entspricht (Briggs et al., 2004). Es konnte gezeigt werden, dass bereits ein einziges Viruspartikel unter Anwesenheit von SEVI2 eine effektive Infektion etabliert (Abbildung 15). Weiter wird die Etablierung einer Infektion in Anwesenheit von SEVI2 beschleunigt (Abbildung 14 und 15). Ergebnisse 37 Abbildung 14: SEVI2 erniedrigt die für eine produktive Infektion nötige Virusmenge: Schwellentiteranalyse von HIV-1 in CEMx-M7 Zellen. Die Zellen wurden im Dreifachansatz mit 10fachen Verdünnungen eines X4- oder R5-tropen HIV-1 Virusstocks ohne Peptid oder in Anwesenheit von SEVI2 (50 µg/ml) infiziert. Nach 2, 5 und 7 Tagen wurden die Infektionsraten durch Luziferase Nachweis ermittelt. Angegeben ist die Anzahl positiver Kulturschalen (wells) am Tag 2, 5 und 7 nach Infektion (TnI: Tag nach Infektion). SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus Abbildung 15: In Gegenwart von SEVI2 ist fast jedes Viruspartikel infektiös. A) PBMCs wurden im Tripelansatz mit Vierfachverdünnungen eines R5-tropen HIV-NL4.3 Virusstocks in der Anwesenheit von 0, 5 oder 50 µg/ml SEVI2 infiziert. 8 Tage nach Infektion wurden Zellkulturüberstände im p24 ELISA vermessen. Angegeben ist die Anzahl der Kulturschalen, die nach 8 Tagen Inkubation infiziert waren, sowie die kalkulierte Zahl der enthaltenen Viruspartikel B) Effekt von SEVI2 auf die TCID 50 von HIV-1. Die Zahlen über den Balken geben die x-fache Ergebnisse 38 Infektionsverstärkung im Vergleich zu den ohne Peptid gemessenen Werten an. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, PBMC: englisch: peripheral blood mononuclear cells, HIV: humanes Immundefizienz Virus, ELISA: englisch: enzyme linked immunosorbent assay, TCID 50: englisch: tissue culture infective dose 50 3.6 SEVI1 und SEVI2 haben additive Effekte PAP248-286 und PAP85-120 kommen beide in Sperma vor. Um zu überprüfen, ob beide amyloiden Peptide einen additiven Effekt auf die HIV Infektion haben, wurden Infektionsassays unter Anwesenheit beider Peptide durchgeführt. In CEMxM7 Zellen konnte ein Trend eines additiven Effektes bei Verwendung beider Peptide in gleichen Konzentrationen beobachtet werden. In Anwesenheit einer konstanten Menge von SEVI1 führt SEVI2 schon in wesentlich geringeren Konzentrationen zu ausgeprägter Infektionsverstärkung als bei alleiniger Verwendung von SEVI2 (Abbildung 16). Abbildung 16: SEVI1 und SEVI2 haben additive Effekte auf die Verstärkung der HIV-1 Infektion. TZM-bl- Zellen wurden mit einem R5-tropen HIV-1 in Anwesenheit der angegeben Konzentrationen von SEVI2 allein (schwarze Balken) oder zusätzliche mit SEVI1 (2 µg/ml) infiziert. Die Analyse erfolgte mittel ß-Galaktosidaseassay 2 Tage nach Infektion. Die Infektionsraten sind in Relation zu denen in Abwesenheit von Peptid angegeben. Infektionsraten ohne Peptid wurden gleich 100% gesetzt. Gezeigt sind die Mittelwerte +/- Standardabweichung aus Tripelansätzen. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus Ergebnisse 3.7 39 SEVI2 verstärkt die HIV-1 Partikelbindung an die Zelle Um den der Infektionsverstärkung zugrunde liegenden Wirkmechanismus aufzuklären, wurde untersucht, ob Amyloid die Anheftung der Viren an die Zielzelle verstärkt. Hierzu wurden TZM-bl Zellen in An- und Abwesenheit von SEVI2 für 4h sowohl mit einem X4- als auch einem R5-tropen HI-Virus inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen mehrfach mit DMEM gewaschen, um ungebundenes Virus zu entfernen. Die Zellen wurden lysiert und die zellgebundene Virusmenge mittels p24 Antigen Elisa bestimmt. Meine Ergebnisse zeigen, dass mit steigenden Konzentrationen von SEVI2 mehr Viruspartikel an die Zielzellen binden (Abbildung 17). So ist in Gegenwart hoher SEVI2 Dosen fast alles Virus gebunden, wohingegen ohne SEVI2 lediglich 1-10% gebunden ist. Abbildung 17: SEVI2 verstärkt die Bindung von HIV-1 Viruspartikeln an die Zelle. TZM-bl Zellen wurden mit X4- und R5-tropem Virus in An- und Abwesenheit von SEVI2 versetzt und für 4 h bei 37°C inkubiert. Nach 4 h wurde das Inokulum zweimal mit DMEM ausgewaschen und die Zellen in 1%Triton lysiert. Die Menge an zellassoziierten Virus wurde mittels p24 ELISA gemessen. Und prozentual zur primär zugefügten Menge angegeben. Dargestellt sind die Mittelwerte aus Dreifachansätzen +/- Standardabweichung. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus, DMEM: englisch: Dulbecco´s modified aegle medium, ELISA: englisch: enzyme linked immunosorbent assay 40 Ergebnisse 3.8 Einfluss von SEVI2 auf weitere umhüllte Viren Wojtowicz beschrieb in seiner Veröffentlichung über einen möglichen infektionsverstärkenden Effekt von Amyloid ß auf die HIV-1 Infektion, ähnliche infektionsverstärkende Effekte auch für die HSV Infektion (Wojtowicz et al., 2002). So sollte im Weiteren auch untersucht werden, ob die Wirkung von SEVI2 auf HIV1 beschränkt ist, oder ob es sich um einen generellen infektionsverstärkenden Effekt auf umhüllte Viren handeln könnte. Hierzu wurden sowohl zwei HIV- 2 Varianten, als auch verschiedene SIV Varianten untersucht. Die Virusstocks wurden durch Transfektion von 293T Zellen mit proviraler DNA hergestellt und mittels Reverse Transkriptase (RT) Test vermessen. Anschließend wurden die Virusstocks auf gleiche RT- Aktivitäten eingestellt, mit Medium oder SEVI2 inkubiert und zur Infektion von TZM-bl Zellen verwendet. Es zeigte sich, dass SEVI2 die Infektionsraten von allen gestesteten Lentiviren verstärkte. Der infektionsverstärkende Effekt von SEVI2 ist somit nicht auf HIV-1 beschränkt (Abbildung 18). Abbildung 18: Fibrilläres PAP85-120 ist ein genereller Verstärker der HIV und SIV Infektion: Virusstocks wurden mittels transienter Infektion in 293T Zellen hergestellt und die Virusmenge wurde mittels des Reverse Transkriptase (RT) -Test bestimmt. Die Virusstocks wurden auf gleiche RT-Aktivität eingestellt und 10-fach verdünnt. Die Verdünnungen wurden verwendet, um TZM-bl Zellen in der An- und Abwesenheit von SEVI2 zu infizieren. Drei Tage nach der Infektion wurden die Infektionsraten mittels der ß Galaktosidaseaktivität bestimmt. Gezeigt sind die durchschnittlichen Werte aus Tripelansätzen +/- Standardabweichung. Die Mittelwerte der Infektionen ohne Peptid wurden mit 100% gleichgesetzt. PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase, HIV: humanes Immundefizienz Virus, SIV: englisch: simian immunodeficiency virus, SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection Ergebnisse 41 Die bisher dargestellten Ergebnisse lassen vermuten, dass der Effekt von SEVI2 nicht nur auf humane und simiane Immundefizienzviren beschränkt ist, sondern möglicherweise ein Einfluss auf weitere umhüllte Viren besteht. Um dies weiter zu überprüfen wurden mittels Kotransfektion pseudotypisierte HIViruspartikeln mit den Hüllproteinen des VSV (engl.: vesicular stomatitis virus) und MLV (engl.: mouse leukemia virus) hergestellt. Auch für diese Virusvarianten konnte ein der Wirkung auf das HI-Virus ähnlicher Effekt für SEVI2 nachgewiesen werden. Es kommt konzentrationsabhängig zu einer Infektionsverstärkung (Abbildung 19). Die Eigenschaft von SEVI2 die Interaktion von Viruspartikeln mit der Zelloberfläche zu beeinflussen ist unabhängig vom viralen Hüllprotein und somit nicht auf HIV- 1 beschränkt. Abbildung 19: Effekt von SEVI2 auf pseudotypisierte Viruspartikel Pseudopartikel wurden mittels Kotransfektion eines proviralen Env-defekten, luziferasekodierenden HIV-1 Konstruktes und den Expressionsplasmiden für das G-Protein des VSV oder das Envelope Glykoprotein des MLV hergestellt. 293T Zellen wurden mit purem (weiße Balken), 10fach (schwarze Balken) oder 100fach (graue Balken) verdünnten Virusstocks infiziert. Die VSV-G und MLV-env vermittelte Infektion wurden nach drei Tagen durch Analyse der Luziferaseaktivität ermittelt. Gezeigt sind die Durchschnittswerte +/-Standardabweichung, die sich aus den Mittelwerten der Tripelansätze ergeben. Die Luziferaseaktivität in den Kontrollinfektionen ohne Peptid wurde mit 100% gleichgesetzt. SEVI: englisch: semen derived enhancer of viral infection, HIV: humanes Immundefizienz Virus, VSV: Vesikuläres Stomatitis Virus, MLV: englisch: mouse leukemia virus, env: englisch: envelope 42 Diskussion 4 4.1 Diskussion Amyloide Fibrillen aus dem Sperma- ein Schlüsselfaktor für die sexuelle Transmission von HIV-1? Weltweit stellt die sexuelle Übertragung von HIV- insbesondere durch infizierte Männer auf nicht infizierte Frauen- den Hauptausbreitungsweg der Pandemie dar (Royce et al., 1997). Die weitere Aufklärung dieses Transmissionsweges und die Benennung wichtiger Schlüsselfaktoren bieten wichtige Ansätze, um der Verbreitung des HI-Virus Einhalt zu gebieten. Bislang fehlt jedoch noch ein vollständiges Verständnis darüber, welche Wirts- oder VirusFaktoren die Transmission genau beeinflussen und wie diese wiederum zusammenwirken. Bisher wurden die Viruslast im Sperma insbesondere zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion und genitale Läsionen aufgrund einer begleitenden Infektion mit anderen sexuell übertragenen Erkrankungen als Risikofaktor identifiziert. (Review Gupta et al., 2006). Die beschränkte Fähigkeit von HIV-1, die Schleimhaut des Genitaltrakts zu überwinden und genügend Zellen zu infizieren, um eine bleibende Infektion zu hinterlassen ist als Schlüsselmoment der sexuellen Übertragung anzusehen und vielfältige Virus- und Wirtsfaktoren spielen hierbei eine Rolle (Review Haase, 2005). Die kontinuierliche Ausbreitung der Pandemie und Ergebnisse, die verdeutlichen, wie multifaktoriell die Etablierung einer effektiven Infektion nach Exposition durch das Virus ist, legen nahe, nach weiteren Einflussfaktoren zu suchen. Einige Arbeiten konnten zeigen, dass Sperma selbst basische Amine wie Spermin, Spermidin und Cadaverin enthält, die die HIV Virionen vor Inaktivierung durch den sauren pH, welcher im Vaginaltrakt herrscht, schützen (Bouvet et al., 1997, Gupta et al., 2006, Tevi-Bénissan et al.,1997). Um weitere Faktoren zu identifizieren durch die Sperma Einfluss auf die HIV-1 Infektion nimmt untersuchten F. Kirchhoff und Mitarbeiter hierfür eine Peptidbank, welche sich aus Fraktionen zusammensetzte, die alle im Sperma vorkommenden Proteine und Peptide (<50kDa) einschloss. Im Rahmen dieser Untersuchungen zeigte sich, dass ein Peptidfragment der humanen sauren Prostataphosphatase (PAP) amyloide Fribrillen ausbildet, welche die HIV Infektion deutlich verstärken. Dieses 43 Diskussion aktive Peptidfragment wurde SEVI (engl.: semen-derived enhancer of virus infection) genannt (Münch et al., 2007). Diese Arbeit zeigt aufbauend auf den Ergebnissen zu SEVI, dass ein weiteres Fragment der sauren Prostataphosphatase PAP85-120 Amyloidfibrillen (SEVI2) ausbildet, die die Infektiösität von HIV-1 durch eine Unterstützung der Adhäsion der Virionen an die Zielzelle verstärken. Der infektionsverstärkende Effekt ist von der Ausbildung dieser Amyloidfibrillen abhängig. Soweit bislang bekannt, handelt es sich bei PAP um das erste beschriebene humane Protein, welches Amyloidprecursor aus verschiedenen Sequenzen besitzt. Neuere Daten zeigen, dass Amyloidfibrillen weit mehr verbreitet sind, als bisher angenommen. Bis heute sind etwa 30 humane Erkrankungen bekannt, welche mit Amyloidablagerungen assoziiert sind, wie etwa die Parkinsonerkrankung und Morbus Alzheimer. (Review Termussi et al., 2003, Westermark, 2005). Weiterhin konnten einige Arbeitsgruppen nachweisen, dass sich Amyloidfibrillen auch aus Proteinen bilden, die nicht mit Krankheiten in Verbindung gebracht werden, so beispielsweise bei der Melaninsynthese in Säugerzellen (Fowler et al., 2006). Ebenfalls gibt es bestimmte Bakterien, wie zum Beispiel E. coli, und Pilze, die Amyloidfibrillen ausbilden (Review Gebbink et al., 2005, Kelly und Balch, 2003). Neuropathologische Untersuchungen haben mehrfach gezeigt, dass Bereiche im zentralen Nervensystem, in denen das HI-Virus repliziert, mit ausgeprägten Ablagerungen von Amyloid ß Precursor Protein (APP), dem Precursor von Amyloid Aß 1-40 und Amyloid Aß 1-42, vergesellschaftet sind. Amyloid ß Ablagerungen sind charakteristisch für die Alzheimer Erkrankung. Das Auftreten APP-reicher Regionen im Bereich aktiver HIV Replikation ist koinzident mit klinischen Zeichen der HIV- assoziierten Demenz (HAD), welche sich mit kognitiven und motorischen Defiziten ähnlich der Alzheimer Demenz präsentiert (Adle-Biassette et al., 1999). Außerdem ließ sich post mortem nachweisen, dass die Prävalenz von Amyloid ß Placques in Hirnen HIV positiver Patienten größer als in nicht infizierten Kontrollen ist (Esiri et al., 1998). Aufbauend auf diesen Feststellungen wurden 2002 Ergebnisse von Wojtowicz veröffentlicht, die eine Infektionsverstärkende Wirkung von Aß 1-40, Aß 1-42, sowie weiteren Amyloidproteinen auf das HI-Virus und weitere umhüllte Viren beschreiben. Der 44 Diskussion infektionsverstärkende Effekt der HIV-1 Infektion unter Anwesenheit von Aß Fibrillen war dosisabhängig (Wojtowicz et al., 2002). Das nachgewiesene Zusammenwirken von Amyloidfibrillen und des HIVirus wirft die Frage auf, ob neben SEVI1/2 weitere Amyloidfibrillen, welche beispielsweise bei bestimmten genitalen bakteriellen Infektionen oder Pilzinfektionen vorhanden sein könnten, eine Rolle bei der Transmission von HIV oder anderen umhüllten Viren spielen. Mittlerweile konnten als weitere amyloide Peptide Semenogelin 1 und 2 aus Sperma isoliert werden, welche ebenfalls einen HIV-1 verstärkenden Effekt besitzen (Roan et al., 2011). Somit enthält Sperma neben SEVI1 und SEVI2 eine Vielzahl von HIV verstärkenden Amyloiden. Für PAP85-120 konnte bislang im Sperma selbst noch keine Konzentrationskorrelation des HIV verstärkenden Effekts gezeigt werden, da die bislang gegen SEVI2 gebildeten Antikörper kreuzreagierten und daher nicht für weitere Analysen verwendet werden konnten. Auch für Sperma selbst ist mittlerweile ein HIV-1 infektionsverstärkender Effekt nachgewiesen (Hauber et al., 2009, Kim et al., 2010, Roan et al., 2009, Roan et al., 2010, Roan et al., 2011), was frühere Veröffentlichungen relativiert, dass Sperma einen protektiven Effekt gegenüber einer HIV Infektion besitze. So berichten zwei Arbeitsgruppen um Balandya und Martellini, dass Sperma einen infektionsprotektiven Effekt habe und dieser Effekt dosisabhängig sei. Weiter sei dies auf im Sperma enthaltene cationische Polypeptide zurückzuführen (Balandya et al., 2010, Martellini et al., 2009). Allerdings sind diese Daten kritisch zu interpretieren, da Sperma in zytotoxischen Konzentrationen verwendet wurde. Vielmehr konnte gezeigt werden, das der Effekt der HIV Verstärkung durch Sperma selbst wiederum mit der Konzentration von SEVI korreliert und wiederum wirtsabhänig ist (Kim et al., 2010). 4.2 SEVI2: Einfluss auf die HIV-1 Infektion und Wirkmechnismus Die gemessenen Effekte von SEVI2 sind unabhängig vom verwendeten Korezeptor der Zielzelle und auch für diverse Subtypen der verschiedenen HIV-1 Gruppen nachweisbar. Ebenso besteht keine Begrenzung auf eine Zelllinie, sofern 45 Diskussion sie CD4 positiv ist und einen viralen Korezeptor exprimiert. Es handelt sich also um einen generellen infektionsverstärkenden Effekt, der jedoch den benötigten Korezeptor nicht umgehen kann. Die Abhängigkeit vom viral verwendeten Korezeptor wird deutlich durch die Messergebnissen in Makrophagen, welche mit X4-tropen Viren infiziert wurden. Hier war der infektionsverstärkende Effekt von SEVI2 deutlich geringer ausgeprägt, was durch eine nur schwache Expression des CXCR4 Korezeptors erklärt ist. Von besonderem Interesse sind die Ergebnisse mit humanen Blutlymphozyten und daraus ausdifferenzierten Makrophagen. Diese Zellen werden zumeist als erste Zellen im Wirt von HIV-1 in vivo attackiert (Review Haase, 2005). CD4 positive T-Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen finden sich in großer Menge im Geschlechtstrakt. Ein intaktes mukosales Epithel bietet eine starke physiologische Barriere für HIV-1 (Miller und Shattock, 2003). Jedoch ist die Schleimhaut nach sexuellem Kontakt sowie bei Vorhandensein von ulcerativen, sexuell übertragenen Erkrankungen häufig geschädigt. Außerdem kann Sperma selbst lokale Entzündungen und Schäden im Epithel verursachen und so eine Verlagerung von dendritischen Zellen (DCs engl.: dendritic cells) an die luminale Oberfläche verursachen (Sharkey et al., 2007). Es ist also häufig möglich, dass Sperma- und somit fibrilläre PAP Fragmente- in Kontakt mit CD4 positiven T-Zellen, Makrophagen und DCs in den subepithelialen Schichten kommt, um auf diesem Weg die Zielzellbindung von HIV-1, die Infektion und die Ausbreitung zu verstärken. So ist vorstellbar, dass amyloide Peptide im Sperma dem HI-Virus helfen können, den entscheidenden und limitierenden Schritt der Infektion über die Schleimhautbarriere zu durchlaufen, indem dem Virus erleichtert wird, sich an die Oberflächen des Genitaltraktes anzulagern und eine sich selbstunterhaltende Infektionen an der Eintrittsstelle zu initiieren. Wie bereits beschrieben kann auch unter Anwesenheit fibrillärer PAP Fragmente der Korezeptortropismus des HI-Virus nicht umgangen werden. Eine erste Annäherung zum potentiellen Wirkmechanismus von SEVI1/2 zeigen die Versuche zur Viruspartikelbindung an TZM-bl Zellen. Unter Anwesenheit von SEVI2 kommt es zu einer konzentrationsabhängigen Steigerung erfolgreicher Virus-Zell-Interaktionen. So werden bei Konzentrationen von 100 µg/ml SEVI2 nahezu alle Viruspartikel des Inokulums gebunden. Diese Daten sind konsistent zu den von Münch et al. zu SEVI1 publizierten Daten, welche schlussfolgern, dass 46 Diskussion SEVI Viruspartikel bindet und einer erfolgreichen physiologischen, rezeptorabhängigen Interaktion mit der Zielzelle zuführt (Münch et al., 2007). Weitere Hinweise auf den Wirkmechanismus von SEVI1 liefert eine Publikation von Roan. Aufgrund eines hohen Anteils positiver Ladungen durch Lysin- und Argininreste wird die natürliche Retropulsion des Virus von der Zielzelle gemindert, das Molekül fungiert als kationisches Polymer. Peptidvarianten, die Amyloidfibrillen ausbilden, jedoch Alaninreste statt der Lysin- und Argininreste besitzen zeigten keine Infektionsverstärkung. Die Autoren mutmaßen, der Effekt sei abhängig von den kationischen Eigenschaften von SEVI; zumal die Anwesenheit anionischer Polymere wie Heparin die Wirkung von SEVI inhibierte. (Roan et al., 2009). Ein möglicher Interaktionspartner in der Zelloberfläche könnten Bereiche von Heparan-Sulfat Proteoglykanen sein, welche stark anionisch sind. Zusammenfassend kommt es nicht nur zu einer Interaktion von SEVI mit den Virionen, sondern auch mit den Zielzellen selbst. Die Attachmentraten des Virus an die Zielzelle werden verstärkt und so die Fusionsraten erhöht. Dieser Wirkmechanismus wäre vergleichbar mit dem anderer kationischer Polymere wir Polybrene (Appay et al., 2001). SEVI ist jedoch wesentlich potenter als Polybrene (unveröffentlichte Ergebnisse). Die Wirkung von SEVI2 ist der Wirkung von SEVI1 nur geringfügig unterlegen und zeigt gemeinsam mit SEVI1 additive Effekte, obwohl seine Sequenz deutlich weniger Lysin- und Argininreste besitzt. Allerdings kann auch für SEVI2 ein hoher isoelektrischer Punkt von 9.99 bestimmt werden. 4.2.1 Der infektionsverstärkende Effekt ist drastisch Obwohl die gemessenen Effekte in Infektionsassays bereits bemerkenswert sind, unterschätzen sie doch das reale Potential von SEVI2 und SEVI1. Das Ausmaß der Infektionsverstärkung von SEVI1 und SEVI2 hängt von der eingesetzten Virusmenge bzw. der Infektiösität der Virusstocks ab. Hohe Virusdosen infizieren bereits in der nicht Amyloid enthaltenen Kontrolle alle permissiven Zellen. Verstärkende Effekte von SEVI2 sind unter diesen Bedingungen nicht messbar. Daher ist die einzige sinnvolle Möglichkeit zu Ermittlung eines Wertes, der die Aktivität von SEVI2 auf die Virusinfektion ausdrückt, eine Infektionsdosisschwellenanalyse (TCID 50). Quantitativere Grenzwert Verdünnungsanalysen (engl.: limiting dilution infection assays) zeigten, 47 Diskussion dass SEVI2 die TCID50 (engl.: 50% tissue culture infetctive dose) von HIV-1 bis zum über 600-fachen erhöhen. Diese dramatische Verstärkung unterstreicht die Wirkung von SEVI2 vor allem bei niedrigen Infektionsdosen in vitro. In Abwesenheit von SEVI2 war der Quotient von detektierbaren infektiösen Einheiten zu Viruspartikeln in der Größenordnung von 1:1000 bis 1:40000, was mit veröffentlichen Daten übereinstimmt (Dimitrov et al., 1993, Rusert et al., 2004). Im Gegensatz dazu waren unter Anwesenheit von SEVI2 in einer Konzentration von 5 beziehungsweise 50 µg/ml schon ein bis vier Viruspartikel ausreichend für eine Infektion. Jüngere Daten legen nahe, dass die scheinbar hohe Frequenz nicht infektiöser HIV-1 Partikel hauptsächlich auf die niedrige Rate erfolgreicher ZellVirusinteraktion zurückzuführen sind (Thomas et al., 2007). Übereinstimmend mit dieser Möglichkeit zeigen die Daten mit SEVI2, dass in Anwesenheit eines Adhäsionsfaktors schon wenige HIV-1 Partikel ausreichen, um eine Infektion zu initiieren. HIV-1 wird im Sperma und in der zellfreien Seminalflüssigkeit der meisten HIV-1 infizierten Männer nachgewiesen (Zhang et al., 1998). Jedoch liegt die Menge, die von HIV-1 während des sexuellen Kontakts normalerweise unter der für eine Infektion nötigen (Gray et al., 2001). Im Mittel wurden 11000 RNA Kopien/ ml im Sperma von HIV-1 infizierten Männern nachgewiesen (Gupta et al., 1997). Demzufolge entlässt ein Ejakulat von etwa 4ml Sperma ungefähr 5500 Viruspartikel in den Genitaltrakt, was ungefähr mit 1,25 pg p24 Antigen korreliert. Interessanterweise konnte eine produktive HIV-1 Infektion in PBMCs mit so niedrigen Virusdosen nur unter Anwesenheit von SEVI1/2 nachgewiesen werden. 4.3 Wirkung auf andere umhüllte Viren Die Wirkung von SEVI2 ist nicht auf HIV-1 beschränkt. Die vergleichbaren Ergebnisse für HIV-2 und SIV Virusvarianten deuten auf einen generellen Effekt auf umhüllte Viren. Darüber hinaus ist die Fähigkeit, die Interaktion zwischen der Zielzellenoberfläche und dem Virus zu unterstützen, unabhängig vom viralen envGlykoprotein und so also auch nicht auf Retroviren beschränkt. Dies verdeutlichen die Ergebnisse mit VSV-G und MLV pseudotypisierten, env-defekten Viruspartikeln. Des Weiteren konnte in bisher nicht publizierten Daten ein 48 Diskussion infektionsverstärkender Effekt auf die Hepatitis C Virusinfektion nachgewiesen werden. Dieser Effekt kann auch zur effektiveren Transfektion in verschiedenen Zellsystemen genutzt werden. So beschreiben Wurm et al., dass SEVI die Transfektionsraten diverser pseudotypisierter Lenti- und Retroviren in hämatopoetischen- und nicht hämatopoetischen- sowie T-Zelllinien verstärkt. Ebenso wird SEVI zu Transduktion von humanen embryonalen Stammzellen in Kokultur mit Stromazellen erfolgreich eingesetzt (Wurm et al., 2010 und Wurm et al., 2011). 4.4 Fragen, Bedeutung und Aussichten Die Publikation der Daten zu SEVI förderte neue Denkansätze, wie der Ausbreitung des HI-Virus Einhalt zu gebieten sei. Eine erste Reaktion auf die Ergebnisse zu SEVI stellen die Daten von Hauber et al. dar. Epigallocatechin-3Gallat (EGCG), ein Bestandteil grünen Tees, inhibiert die Ausbildung der SEVI Fibrillen und wirkt so als Gegenspieler von SEVI (Hauber et al., 2009). Allerdings sind die Daten zu EGCG inkonsistent. Einige Autoren sprechen EGCG eine eigene antivirale Wirkung zu (Fassina et al., 2002), Haubers Arbeitsgruppe hingegen konnte dies nicht nachweisen. Des Weiteren ist EGCG, obwohl es als Bestandteil grünen Tees gut vertragen wird, in Zellkultur hoch zytotoxisch. Mittlerweile wurden bereits mehrere weitere mögliche Inhibitoren für SEVI identifiziert. Es handelt sich zumeist um kleine Moleküle, welche überwiegend anionische Eigenschaften besitzen. So konnten Olsen et al. Thioflavinderivate wie BTA-EG(6) und Roan et al. Surfen, welches ein Inhibitor von Heparan Sulfat Proteoglykanen- der möglichen zellulären Zielstruktur von SEVI- ist, als weitere Inhibitoren identifizieren (Olsen et al., 2010, Roan et al., 2010). Die Arbeitsgruppe um Roan stellte hierbei jedoch überraschenderweise fest, dass Surfen nicht zu einer kompetetiven Hemmung im Bereich der Zielzellen führt, sondern direkt mit SEVI interagiert. Weiter konnten oligovalente Derivate von Benzothiazol Anilin (BTA, bekannt als Amyloid bindendes Molekül) als mögliche Inhibitoren von SEVI identifiziert werden (Olsen et al., 2012). All die genannten möglichen SEVI Inhibitoren inhibieren auch den infektionsverstärkenden Effekt von Sperma selbst und bieten somit das therapeutische Potential den bislang frustranen Einsatz von Mikrobiziden zur Reduktion der HIV Transmission erfolgreicher zu machen. 49 Diskussion Weitere Studien sind nötig, um zu klären, unter welchen Bedingungen und in wie großen Mengen fibrilläre PAP Fragmente unter natürlichen Bedingungen oder durch das Vorhandensein weiterer Faktoren ausgebildet werden. Mittlerweile existieren Arbeiten, die klare Hinweise darauf liefern, dass sie PAP Fibrillen unter physiologischen Bedingungen ausbilden können, und dies teilweise sogar schneller als unter den bisher etablierten Bedingungen in vitro. So konnte nachgewiesen werden, dass seminales Plasma selbst die Fibrillenbildung initiiert und drastisch beschleunigt (Olsen et al., 2012). Dies unterstreicht die Bedeutung von SEVI und anderen amyloiden Peptiden für die HIV Transmission in vivo. Das genauere Verständnis hierüber bietet wiederum spannende neue Ansätze für präventive Maßnahmen, um das HI-Virus in seiner Ausbreitung zu stoppen. Die PAP als Precursor von SEVI1/2 wird in Mengen von 1-2 mg/ml in die Seminalflüssigkeit sekretiert (Rönnberg et al., 1981). Münch et al. konnten eine Konzentration von 35 µg/ml für PAP248-286 Fragmente und 39 µg/ml für PAP85120 Fragmente bestimmen (Münch et al., 2007, Arnold et al., 2012). Eine deutliche Verstärkung des HI-Virus konnte bemerkenswerterweise schon bei Konzentrationen von 2-5 µg/ml gemessen werden. Das physiologische Vorhandensein von aktiven Fibrillen wäre also durchaus möglich. Und mittels spezifischer Antikörper ist der Nachweis für SEVI1 bereits gelungen (Kim et al., 2010). Ein spezifischer Antikörper zum Nachweis von SEVI2 konnte bislang noch nicht erfolgreich etabliert werden. Es fehlt an weiteren Untersuchungen, die diese Vermutung bestätigen und die bisherigen Beobachtungen in vitro mit Ergebnissen in vivo korrelieren. Eine in vivo Wirkung von SEVI1 konnte bislang am Modell transgener Ratten, welche Makrophagen mit humanen CD4 und R5 Rezeptoren besitzen, für die Infektion über den Blutweg gezeigt werden (Münch et al., 2007). Außerdem stellt sich die Frage, ob amyloide PAP Fragmente generell eine Rolle für die Physiologie von Sperma und die Fortpflanzung spielen und ob sich dadurch auch Ansätze für die reproduktive Medizin ergeben. Das große Potential von SEVI1/2 bei der Unterstützung der viralen Infektion zusammen mit der relativ geringen Zytotoxizität legt nahe, dass es nicht nur bei der sexuellen Übertragung von HIV eine entscheidende Rolle spielt, sondern auch helfen könnte, Vakzinen oder Gentransfers mittels viraler Vektoren weiter zu entwickeln. 50 Zuvor sind jedoch noch einige Fragen zu klären. Noch ist nicht verstanden wie genau SEVI mit HIV und anderen Viren interagiert und auf welchem molekularen Mechanismus letzten Endes das verbesserte Virusattachment beruht. Die Ergebnisse zu den kationischen Eigenschaften von SEVI, sowie das Wissen darüber, dass es keine universale Sequenz der Amyloidprecursor gibt, lassen offen unter welchen Bedingungen sich Amyloidfibrillen aus PAP Fragmenten ausbilden. 51 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Sperma ist der Hauptvektor für die Transmission des Humanen Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1). Vorarbeiten konnten zeigen, dass das aus der sauren Prostataphosphatase (PAP: englisch: prostatic acidic phosphatase) isolierte Fragment PAP248-286 Amyloidfibrillen ausbildet und so die HIV-1 Infektion verstärkt. Durch das Screening einer aus Sperma hergestellten Peptidbibliothek konnte ein weiteres PAP Fragment mit der Aminosäuresequenz PAP85-120 isoliert werden, welches ebenfalls Amyloidfibrillen ausbildet und die HIV-1 Infektion vergleichbar beeinflusst. Dieser Einfluss wurde in der vorliegenden Arbeit weiter charakterisiert. Die Fibrillenbildung von PAP85-120 Peptiden wurde durch den Amyloidfarbstoff Kongorot mikroskopisch überprüft und Virusstocks wurden mittels Calciumphosphattransfektion proviraler DNA hergestellt. Das Ausmaß des infektionsverstärkenden Effektes wurde im Luziferasetest und ß-Galaktosidasetest ermittelt. Mittels Schwellentiteranalysen wurde zudem die TCID50 (englisch: tissue culture infective dose 50) bestimmt. Zur Bestimmung der Virus-Zielzellbindung wurde ein p24 Kapsid Antigen ELISA (englisch: enzyme linked immunosorbent assay) verwendet. Soweit bislang bekannt, ist PAP das einzige humane Protein, welches Amyloidprecursor in zwei Sequenzabschnitten besitzt. Die Infektionsverstärkung beider Fragmente ist von der Ausbildung dieser Amyloidfibrillen abhängig. Der infektionsverstärkende Effekt Attachment Zielzelle. an die beruht Dies auf einer erklärt Erleichterung sich durch des eine viralen positive Oberflächenladung der Fibrillen, so dass diese der natürlichen Retropulsion von negativ geladenen Virionen und Zielzelle entgegenwirkt. Dieser Effekt ist unabhängig vom viralen Geno- und Phänotyp und ist nicht auf HIV-1 beschränkt, sondern scheint ein genereller Effekt für umhüllte Viren zu sein. Es handelt sich hierbei um einen drastischen Effekt. So kann in Anwesenheit der Fibrillen bereits ein einziges Viruspartikel eine produktive Infektion etablieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass Amyloid Fibrillen im Sperma eine entscheidende Rolle bei der sexuellen Transmission von HIV-1 spielen könnten Möglichkeiten, der AIDS Pandemie Einhalt zu gebieten. und eröffnen neue Literaturverzeichnis 6 1. 52 Literaturverzeichnis Abaasa, A. M., J. Todd, K. Ekoru, J. N. Kalyango, J. Levin, E. Odeke, C. A. Karamagi (2008). "Good adherence to HAART and improved survival in a community HIV/AIDS treatment and care programme: the experience of The AIDS Support Organization (TASO), Kampala, Uganda." BMC Health Serv Res 8: 241-250. 2. Adachi, A., H. E. Gendelman, S. Koenig, T. Folks, R. Willey, A. Rabson, M. A. Martin (1986). "Production of acquired immunodeficiency syndromeassociated retrovirus in human and nonhuman cells transfected with an infectious molecular clone." J Virol 59: 284-291. 3. Adle-Biassette, H., F. Chretien, L. Wingertsmann, C. Hery, T. Ereau, F. Scaravilli, M. Tardieu, F. Gray (1999). "Neuronal apoptosis does not correlate with dementia in HIV infection but is related to microglial activation and axonal damage." Neuropathol Appl Neurobiol 25: 123-133. 4. Allen, R. D. and T. K. Roberts (1986). "The Relationship between the Immunosuppressive and Cytotoxic Effects of Human Seminal Plasma." American Journal of Reproductive Immunology and Microbiology 11: 59-64. 5. Appay, V. and S. L. Rowland-Jones (2001). "RANTES: a versatile and controversial chemokine." Trends Immunol 22: 83-87. 6. Arnold, F., J. Schnell, O. Zirafi, C. Sturzel, C. Meier, T. Weil, L. Standker, W.G. Forssmann, N.R. Roan, W. C. Greene, F. Kirchhoff, J. Munch (2012). "Naturally Occurring Fragments from Two Distinct Regions of the Prostatic Acid Phosphatase Form Amyloidogenic Enhancers of HIV Infection." J Virol 86: 1244-1249. 7. Balandya, E., S. Sheth, K. Sanders, W. Wieland-Alter, T. Lahey (2010). "Semen Protects CD4(+) Target Cells from HIV Infection but Promotes the Preferential Transmission of R5 Tropic HIV." J Immunol 185: 7596-7604. 8. Barnhart, M. M. and M. R. Chapman (2006). "Curli biogenesis and function." Annu Rev Microbiol 60: 131-147. 9. Barre-Sinoussi, F., J. C. Chermann, F. Rey, M. T. Nugeyre, S. Chamaret, J. Gruest, C. Dauguet, C. Axler-Blin, F. Vezinet-Brun, C. Rouzioux, W. Rozenbaum, L. Montagnier (1983). "Isolation of a T-lymphotropic retrovirus Literaturverzeichnis 53 from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS)." Science 220: 868-871. 10. Berger, E. A., P. M. Murphy, J. M. Farber (1999). "Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease." Annu Rev Immunol 17: 657-700. 11. Berson, J. F., A. C. Theos, D. C. Harper, D. Tenza, G. Raposo, M.S. Marks (2003). "Proprotein convertase cleavage liberates a fibrillogenic fragment of a resident glycoprotein to initiate melanosome biogenesis." J Cell Biol 161: 521-533. 12. Bouvet, J. P., G. Gresenguet, L. Belec (1997). "Vaginal pH neutralization by semen as a cofactor of HIV transmission." Clin Microbiol Infect 3(1): 19-23. 13. Briggs, J. A. G., M. N. Simon, I. Gross, H. G. Krausslich, S. D. Fuller, V.M. Vogt, M. C. Johnson (2004). "The stoichiometry of Gag protein in HIV-1." Nat Struct Mol Biol 11: 672-675. 14. Chakraborty, H., P. K. Sen, R. W. Helms, P.L. Vernazza, S.A. Fiscus, J.J. Eron, B.K. Patterson, R.W. Coombs, J. N. Krieger, M.S. Cohen (2001). "Viral burden in genital secretions determines male-to-female sexual transmission of HIV-1: a probabilistic empiric model." AIDS 15: 621-627. 15. Chapman, M. R., L. S. Robinson, J. S. Pinkner, R. Roth, J. Heuser, M. Hammar, S. Normark, S. J. Hultgren (2002). "Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation." Science 295: 851-855. 16. Chiti, F., P. Webster, N. Taddei, A. Clark, M. Stefani, G. Ramponi, C.M. Dobson (1999). "Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils." Proc Natl Acad Sci U S A 96: 3590-3594. 17. Clavel, F., M. Guyader, D. Guetard, M. Salle, L. Montagnier, M. Alizon (1986). "Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2." Nature 324: 691-695. 18. Coffey, D. S. and K. J. Pienta (1987). "New concepts in studying the control of normal and cancer growth of the prostate." Prog Clin Biol Res 239: 1-73. 19. Coffin, J., A. Haase, J. A. Levy, L. Montagnier, S. Oroszlan, N. Teich, H. Temin, K. Toyoshima, H. Varmus, P. Vogt (1986). "What to call the AIDS virus?" Nature 321: 10. Literaturverzeichnis 20. 54 Collins, K. L., B. K. Chen, S. A. Kalams, B.D. Walker, D. Baltimore (1998). "HIV-1 Nef protein protects infected primary cells against killing by cytotoxic T lymphocytes." Nature 391: 397-401. 21. Cullen, B. R. (1998). "HIV-1 auxiliary proteins: Making connections in a dying cell." Cell 93: 685-692. 22. Dayton, A. I., J. G. Sodroski, C. A. Rosen, W.C. Goh, W. A. Haseltine (1986). "The trans-activator gene of the human T cell lymphotropic virus type III is required for replication." Cell 44: 941-947. 23. Derechin, M., W. Ostrowski, M. Galka, E. A. Barnard (1971). "Acid phosphomonesterase of human prostate. Molecular weight, dissociation and chemical composition." Biochim Biophys Acta 250: 143-154. 24. DeVita, V. T., Hellmann S. and Rosenberg S. (1997). "AIDS." LipincottRaven Publishers, Philadelphia, New York. 25. Dimitrov, D. S., R. L. Willey, H. Sato, L. J. Chang, R. Blumenthal, M. A. Martin (1993). "Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics." J Virol 67: 2182-2190. 26. Doms, R. W. and S. C. Peiper (1997). "Unwelcomed guests with master keys: how HIV uses chemokine receptors for cellular entry." Virology 235: 179-190. 27. Eanes, E. D. and G. G. Glenner (1968). "X-Ray Diffraction Studies on Amyloid Filaments." J Histochem Cytochem 16: 673-7. 28. Esiri, M. M., S. C. Biddolph, C.S. Morris (1998). "Prevalence of Alzheimer plaques in AIDS." J Neurol Neurosurg Psychiatry 65: 29-33. 29. Fassina, G., A. Buffa, R. Benelli, O.E. Varnier, D.M. Noonan, A. Albini (2002). "Polyphenolic antioxidant (-)-epigallocatechin-3-gallate from green tea as a candidate anti-HIV agent." AIDS 16: 939-941. 30. Felber, B. K., M. Hadzopoulou-Cladaras, C. Cladaras, T. Copeland, G.N. Pavlakis (1989). "rev protein of human immunodeficiency virus type 1 affects the stability and transport of the viral mRNA." Proc Natl Acad Sci U S A 86: 1495-1499. 31. Fowler, D. M., A. V. Koulov, C. Alory-Jost, M. S. Marks, W.E. Balch, J. W. Kelly (2006). "Functional amyloid formation within mammalian tissue." PLoS Biol 4: e6. 32. Freed, E. O. (2001). "HIV-1 replication." Somat Cell Mol Genet 26: 13-33. Literaturverzeichnis 33. 55 Galvin, S. R. and M. S. Cohen (2004). "The role of sexually transmitted diseases in HIV transmission." Nat Rev Microbiol 2: 33-42. 34. Gebbink, M. F., D. Claessen, B. Bouma, L. Dijkhuizen, H. A. Wosten (2005). "Amyloids--a functional coat for microorganisms." Nat Rev Microbiol 3: 333-341. 35. Glenner, G. G. (1980). "Amyloid Deposits and Amyloidosis - the BetaFibrilloses .1." N Engl J Med 302: 1283-1292. 36. Gottlieb, M. S., R. Schroff, H. M. Schanker, J. D. Weisman, P.T. Fan, R.A. Wolf, A. Saxon (1981). "Pneumocystis carinii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular immunodeficiency." N Engl J Med 305: 1425-1431. 37. Gray, R. H., M. J. Wawer, R. Brookmeyer, N. K. Sewankambo, D. Serwadda, F. Wabwire-Mangen, T. Lutalo, X. Li, T. vanCott, T. C. Quinn (2001). "Probability of HIV-1 transmission per coital act in monogamous, heterosexual, HIV-1-discordant couples in Rakai, Uganda." Lancet 357: 1149-1153. 38. Gupta, K. and P. J. Klasse (2006). "How do viral and host factors modulate the sexual transmission of HIV? Can transmission be blocked?" PLoS Med 3: e79. 39. Gupta, P., J. Mellors, L. Kingsley, S. Riddler, M. K. Singh, S. Schreiber, M. Cronin, C. R. Rinaldo (1997). "High viral load in semen of human immunodeficiency virus type 1-infected men at all stages of disease and its reduction by therapy with protease and nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors." J Virol 71: 6271-6275. 40. Haase, A. T. (2005). "Perils at mucosal front lines for HIV and SIV and their hosts." Nat Rev Immunol 5: 783-792. 41. Hauber, I., H. Hohenberg, B. Holstermann, W. Hunstein, J. Hauber (2009). "The main green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate counteracts semen-mediated enhancement of HIV infection." Proc Natl Acad Sci U S A 106: 9033-9038. 42. He, J. L., S. Isakoff, N. R. Landau (1995). "Construction and Use of an Hiv1 Reporter Virus Expressing Human-Placental Alkaline-Phosphatase." J Cell Biochem: 191-191. 43. Hendrix, C. W., Y. J. Cao, E. J. Fuchs (2009). "Topical microbicides to Literaturverzeichnis 56 prevent HIV: clinical drug development challenges." Annu Rev Pharmacol Toxicol 49: 349-375. 44. Hsu, M., J. M. Harouse, A. Gettie, C. Buckner, J. Blanchard, C. ChengMayer, C. (2003). "Increased mucosal transmission but not enhanced pathogenicity of the CCR5-tropic, simian AIDS-inducing simian/human immunodeficiency virus SHIV(SF162P3) maps to envelope gp120." J Virol 77: 989-998. 45. Jarrett, J. T. and P. T. Lansbury (1993). "Seeding One-Dimensional Crystallization of Amyloid - a Pathogenic Mechanism in Alzheimers-Disease and Scrapie." Cell 73: 1055-1058. 46. Keele, B. F., F. Van Heuverswyn, Y. Li, E. Bailes, J. Takehisa, M.L. Santiago, F. Bibollet-Ruche, Y. Chen, L. V. Wain, F. Liegeois, S. Loul, E.M. Ngole, Y. Bienvenue, E. Delaporte, J. F. Brookfield, P.M. Sharp, G.M. Shaw, M. Peeters, B. H. Hahn (2006). "Chimpanzee reservoirs of pandemic and nonpandemic HIV-1." Science 313: 523-526. 47. Kelly, J. W. and W. E. Balch (2003). "Amyloid as a natural product." J Cell Biol 161: 461-462. 48. Kim, K. A., M. Yolamanova, O. Zirafi, N. R. Roan, L. Staendker, W.G. Forssmann, A. Burgener, N. Dejucq-Rainsford, B. H. Hahn, G.M. Shaw, W. C. Greene, F. Kirchhoff, J. Munch (2010). "Semen-mediated enhancement of HIV infection is donor-dependent and correlates with the levels of SEVI." Retrovirology 7: 55-66. 49. Klasse, P. J., R. Shattock, J.P. Moore (2008). "Antiretroviral drug-based microbicides to prevent HIV-1 sexual transmission." Annu Rev Med 59: 455-471. 50. Kuciel, R., A. Mazurkiewicz, W.S. Ostrowsk (1996). "The folding intermediate of reversibly denatured human prostatic acid phosphatase." Int J Biol Macromol 18: 167-175. 51. Lin, M. F., M. S. Lee, R. Garcia-Arenas, F.F. Lin (2000). "Differential responsiveness of prostatic acid phosphatase and prostate-specific antigen mRNA to androgen in prostate cancer cells." Cell Biol Int 24: 681-689. 52. Lin, M. F., X. Q. Zhang, J. Dean, F.F. Lin (2001). "Protein kinase C pathway is involved in regulating the secretion of prostatic acid phosphatase in human prostate cancer cells." Cell Biol Int 25: 1139-1148. 57 Literaturverzeichnis 53. Lu, Z., J. F. Berson, Y. Chen, J. D. Turner, T. Zhang, M. Sharron, M. H. Jenks, Z. Wang, J. Kim, J. Rucker, J. A. Hoxie, S. C. Peiper, R. W. Doms (1997). "Evolution of HIV-1 coreceptor usage through interactions with distinct CCR5 and CXCR4 domains." Proc Natl Acad Sci U S A 94: 64266431. 54. Luchter-Wasyl, E. and W. Ostrowski (1974). "Subunit structure of human prostatic acid phosphatase." Biochim Biophys Acta 365: 349-359. 55. Maniatis T., J. Sambrook and E. F. Fritsch (1989). "Molecular Cloning." Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 56. Mariani, R., D. Chen, B. Schrofelbauer, F. Navarro, R. Konig, B. Bollman, C. Munk, H. Nymark-McMahon, N. R. Landau (2003). "Species-specific exclusion of APOBEC3G from HIV-1 virions by Vif." Cell 114: 21-31. 57. Martellini, J. A., A. L. Cole, N. Venkataraman, G.A. Quinn, P. Svoboda, B.K. Gangrade, J. Pohl, O.E. Sorensen, A.M. Cole (2009). "Cationic polypeptides contribute to the anti-HIV-1 activity of human seminal plasma." Faseb J 23: 3609-3618. 58. Masur, H., M. A. Michelis, J. B. Greene, I. Onorato, R.A. Stouwe, R.S. Holzman, G. Wormser, L. Brettman, M. Lange, H.W. Murray, S. Cunningham-Rundles (1981). "An outbreak of community-acquired Pneumocystis carinii pneumonia: initial manifestation of cellular immune dysfunction." N Engl J Med 305: 1431-1438. 59. McGowan, I. (2010). "Microbicides for HIV prevention: reality or hope?" Curr Opin Infect Dis 23: 26-31. 60. McNatt, M. W., T. Zang,T. Hatziioannou, M. Bartlett, I. Ben Fofana, W.E. Johnson, S.J. D. Neil, P.D. Bieniasz (2009). "Species-Specific Activity of HIV-1 Vpu and Positive Selection of Tetherin Transmembrane Domain Variants." Plos Pathogens 5. 61. Merlini, G., D. C. Seldin, M.A. Gertz (2011). "Amyloidosis: pathogenesis and new therapeutic options." J Clin Oncol 29: 1924-1933. 62. Miller, C. J. and R. J. Shattock (2003). "Target cells in vaginal HIV transmission." Microbes Infect 5: 59-67. 63. Miller, R. H. and N. Sarver (1997). "HIV accessory proteins as therapeutic targets." Nat Med 3: 389-394. Literaturverzeichnis 64. 58 Munch, J., E. Rucker, L. Standker, K. Adermann, C. Goffinet, M. Schindler, S. Wildum, R. Chinnadurai, D. Rajan, A. Specht, G. Gimenez-Gallego, P.C. Sanchez, D.M. Fowler, A. Koulov, J.W. Kelly, W. Mothes, J.C. Grivel, L. Margolis, O.T. Keppler, W.G. Forssmann, F. Kirchhoff (2007). "Semenderived amyloid fibrils drastically enhance HIV infection." Cell 131: 10591071. 65. Munch, J., L. Standker, K. Adermann, A. Schulz, M. Schindler, R. Chinnadurai, S. Pohlmann, C. Chaipan, T. Biet, T. Peters, B. Meyer, D. Wilhelm, H. Lu, W. Jing, S. Jiang, W.G. Forssmann, F. Kirchhoff (2007). "Discovery and optimization of a natural HIV-1 entry inhibitor targeting the gp41 fusion peptide." Cell 129: 263-275. 66. Nilsson, M. R. (2004). "Techniques to study amyloid fibril formation in vitro." Methods 34: 151-160. 67. Olsen, J. S., C. Brown, C.C. Capule, M. Rubinshtein, T.M. Doran, R.K. Srivastava, C.Y. Feng, B.L. Nilsson, J. Yang, S. Dewhurst (2010). "Amyloidbinding Small Molecules Efficiently Block SEVI (Semen-derived Enhancer of Virus Infection)- and Semen-mediated Enhancement of HIV-1 Infection." J Biol Chem 285: 35488-35496. 68. Olsen, J. S., J. T. M. DiMaio, T.M. Doran, C. Brown, B.L. Nilsson, S. Dewhurst (2012). "Seminal Plasma Accelerates Semen-derived Enhancer of Viral Infection (SEVI) Fibril Formation by the Prostatic Acid Phosphatase (PAP(248-286)) Peptide." J Biol Chem 287: 11842-11849. 69. Ostrowski, W. S. and R. Kuciel (1994). "Human prostatic acid phosphatase: selected properties and practical applications." Clin Chim Acta 226: 121129. 70. Padian, N. S., E. Vittinghoff, S. Shiboski (1994). "Heterosexual transmission of HIV." N Engl J Med 331: 1718; author reply 1718-1719. 71. Palella, F. J., Jr., K. M. Delaney, A.C. Moorman, M.O. Loveless, J. Fuhrer, G.A. Satten, D.J. Aschman, S.D. Holmberg (1998). "Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV Outpatient Study Investigators." N Engl J Med 338: 853-860. 72. Papkalla, A., J. Munch, C. Otto, F. Kirchhoff (2002). "Nef enhances human immunodeficiency virus type 1 infectivity and replication independently of viral coreceptor tropism." J Virol 76: 8455-8459. Literaturverzeichnis 73. 59 Pilcher, C. D., H. C. Tien, J.J. Jr. Eron, J. J., P.L. Vernazza, S.Y. Leu, P.W. Stewart, L.E. Goh, M.S. Cohen (2004). "Brief but efficient: acute HIV infection and the sexual transmission of HIV." J Infect Dis 189: 1785-1792. 74. Pope, M. and A. T. Haase (2003). "Transmission, acute HIV-1 infection and the quest for strategies to prevent infection." Nat Med 9: 847-852. 75. Roan, N. R., J. A. Muller, H.C. Liu, S. Chu, F. Arnold, C.M. Sturzel, P. Walther, M. Dong, H.E. Witkowska, F. Kirchhoff, J. Munch, W.C. Greene (2011). "Peptides Released by Physiological Cleavage of Semen Coagulum Proteins Form Amyloids that Enhance HIV Infection." Cell Host Microbe 10: 541-550. 76. Roan, N. R., J. Munch, N. Arhel, W. Mothes, J. Neidleman, A. Kobayashi, K. Smith-McCune, F. Kirchhoff, W.C. Greene (2009). "The cationic properties of SEVI underlie its ability to enhance human immunodeficiency virus infection." J Virol 83: 73-80. 77. Roan, N. R., S. Sowinski, J. Munch, F. Kirchhoff, W.C. Greene (2010). "Aminoquinoline surfen inhibits the action of SEVI (semen-derived enhancer of viral infection)." J Biol Chem 285: 1861-1869. 78. Ronnberg, L., P. Vihko, E. Sajanti, R. Vihko (1981). "Clomiphene citrate administration to normogonadotropic subfertile men: blood hormone changes and activation of acid phosphatase in seminal fluid." Int J Androl 4: 372-378. 79. Royce, R. A., A. Sena, W. Jr. Cates, M.S. Cohen (1997). "Sexual transmission of HIV." N Engl J Med 336: 1072-1078. 80. Rusert, P., M. Fischer, B. Joos, C. Leemann, H. Kuster, M. Flepp, S. Bonhoeffer, H.F. Gunthard, A. Trkola (2004). "Quantification of infectious HIV-1 plasma viral load using a boosted in vitro infection protocol." Virology 326: 113-129. 81. Scofield, V. L. (1998). "Sperm as infection-potentiating cofactors in HIV transmission." J Reprod Immunol 41: 359-372. 82. Selkoe, D. J. (1999). "Hot papers - Alzheimer's disease - Mutant presenilins of Alzheimer's disease increase production of 42-residue amyloid beta protein in both transfected cells and transgenic mice by M. Citron, D. Westaway, W.M. Xia, G. Carlson, T. Diehl, G. Levesque, K. Johnson-Wood, M. Lee, P. Seubert, A. Davis, D. Kholodenko, R. Motter, R. Sherrington, B. Literaturverzeichnis 60 Perry, H. Yao, R. Strome, I. Lieberburg, J. Rommens, S. Kim, D. Schenk, P. Fraser, P.S. Hyslop, D.J. Selkoe - Comments." Scientist 13: 16-16. 83. Sharkey, D. J., A. M. Macpherson, K.P. Tremellen, S.A. Robertson (2007). "Seminal plasma differentially regulates inflammatory cytokine gene expression in human cervical and vaginal epithelial cells." Mol Hum Reprod 13: 491-501. 84. Sheehy, A. M., N. C. Gaddis, J.D. Choi, M.H. Malim (2002). "Isolation of a human gene that inhibits HIV-1 infection and is suppressed by the viral Vif protein." Nature 418: 646-650. 85. Sodora, D. L., J. S. Allan, C. Apetrei, J.M. Brenchley, D.C. Douek, J.G. Else, J.D. Estes, B.H. Hahn, V.M. Hirsch, A. Kaur, F. Kirchhoff, M. MullerTrutwin, I. Pandrea, J.E. Schmitz, G. Silvestri (2009). "Toward an AIDS vaccine: lessons from natural simian immunodeficiency virus infections of African nonhuman primate hosts." Nat Med 15: 861-865. 86. Tannous, B. A., D. E. Kim, J.L. Fernandez, R. Weissleder, X.O. Breakefield (2005). "Codon-optimized Gaussia luciferase cDNA for mammalian gene expression in culture and in vivo." Mol Ther 11: 435-443. 87. Temussi, P. A., L. Masino, A. Pastore (2003). "From Alzheimer to Huntington: why is a structural understanding so difficult?" EMBO J 22: 355361. 88. Teplow, D. B. (1998). "Structural and kinetic features of amyloid betaprotein fibrillogenesis." Amyloid 5: 121-142. 89. Tevi-Benissan, C., L. Belec, M. Levy, V. Schneider-Fauveau, A. Si Mohamed, M.C. Hallouin, M. Matta, G. Gresenguet (1997). "In vivo semenassociated pH neutralization of cervicovaginal secretions." Clin Diagn Lab Immunol 4: 367-374. 90. Thomas, J. A., D. E. Ott, R.J. Gorelick (2007). "Efficiency of human immunodeficiency virus type 1 postentry infection processes: evidence against disproportionate numbers of defective virions." J Virol 81: 43674370. 91. Varthakavi, V., E. Heimann-Nichols, R.M. Smith, Y. Sun, R.J. Bram, S. Ali, J. Rose, L. Ding, P. Spearman (2008). "Identification of calcium-modulating cyclophilin ligand as a human host restriction to HIV-1 release overcome by Vpu (Retracted article. See vol. 16, pg. 238, 2010)." Nat Med 14: 641-647. 61 Literaturverzeichnis 92. Watkins, D. I. (2010). "HIV vaccine development." Top HIV Med 18: 35-36. 93. Wawer, M. J., R. H. Gray, N.K. Sewankambo, D. Serwadda, X. Li, O. Laeyendecker, N. Kiwanuka, G. Kigozi, M. Kiddugavu, T. Lutalo, F. Nalugoda, F. Wabwire-Mangen, M. P. Meehan, T.C. Quinn (2005). "Rates of HIV-1 transmission per coital act, by stage of HIV-1 infection, in Rakai, Uganda." J Infect Dis 191: 1403-1409. 94. Westermark, P. (2005). "Aspects on human amyloid forms and their fibril polypeptides." FEBS J 272: 5942-5949. 95. Wojtowicz, W. M., M. Farzan, J. L. Joyal, K. Carter, G.J. Babcock, D.I. Israel, J. Sodroski, T. Mirzabekov, T. (2002). "Stimulation of enveloped virus infection by beta-amyloid fibrils." J Biol Chem 277: 35019-35024. 96. Wurm, M., B. Gross, M. Sgodda, L. Standker, T. Muller, W.G. Forssmann, P.A. Horn, R. Blasczyk, T. Cantz (2011). "Improved lentiviral gene transfer into human embryonic stem cells grown in co-culture with murine feeder and stroma cells." Biol Chem 392: 887-895. 97. Wurm, M., A. Schambach, D. Lindemann, H. Hanenberg, L. Standker, W.G. Forssmann, R. Blasczyk, P.A. Horn (2010). "The influence of semenderived enhancer of virus infection on the efficiency of retroviral gene transfer." JGene Med 12: 137-146. 98. Zhang, H., G. Dornadula, M. Beumont, L.Jr. Livornese, L., B. Van Uitert, K. Henning, R.J. Pomerantz (1998). "Human immunodeficiency virus type 1 in the semen of men receiving highly active antiretroviral therapy." N Engl J Med 339: 1803-1809. 99. Aufbau des HI-Virus URL: www.hiv-info.de/img/hiv_cut.jpg (Stand 01.11.2012) 100. Genomorganisation des HII Virus URL: http://pathmicro.med.sc.edu/lecture/Image138.gif (Stand 01.11.2012) 101. Protokoll zur TCID50 Bestimmung URL: https://www.hanc.info/labs/labresources/procedures/ACTGIMPAACT%20La b%20Manual/TCID50%20Determination.pdf (Stand 03.11.2012) Danksagung 62 Danksagung Ich möchte mich bei all denjenigen bedanken, die mich während der Arbeit an meiner Dissertation unterstützt und gefördert haben und zu ihrem Gelingen beigetragen haben: Prof. Dr. Frank Kirchhoff und Prof. Dr. Thomas Mertens für die Möglichkeit, diese Arbeit am Institut für Molekulare Virologie (vormals AG Kirchhoff) am Universitätsklinikum Ulm durchzuführen. Prof. Dr. Jan Münch für die erstklassige Betreuung und Förderung meiner Arbeit. Die stete Bereitschaft Ergebnisse zu diskutieren und die unzähligen konstruktiven Anregungen haben diese Arbeit möglich gemacht. Daniela Krnavek, Kerstin Regensburger, Martha Meyer und besonders Dr. Anke Heigele für die technische Unterstützung und Beratung und Eure gute Laune, die einen den Weg ins Labor gerne hat gehen lassen. Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Molekulare Virologie für die gute und immer kollegiale Atmosphäre im Labor. Dem Promotionsprogramm Experimentelle Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm, das den finanziellen Rahmen gab, mich auf die Laborarbeit zu konzentrieren und mit dem begleitenden Rahmenprogramm den Einstieg in die wissenschaftliche Diskussion gab. Meinem Mann danke ich für sein „geduldig-forderndes“ Durchhaltevermögen, das nötig war, um diese Arbeit zu einem Abschluss zu bringen. Lebenslauf Lebenslauf Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt 63 Lebenslauf Lebenslauf Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt 64
