Reinigung, molekulargenetische und biochemische

Reinigung, molekulargenetische und biochemische Charakterisierung
der α-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4
Dissertation
zur Erlangung des Grades
eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie
der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt im
Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen
Arbeitsgruppe Molekulare Genetik
vorgelegt von
Nicole Sommer
aus
Recklinghausen
Bochum
2001
meiner Mutter und Reinhard gewidmet
Alles Wissen
und alle Vermehrung unseres Wissens
endet nicht mit einem Schlusspunkt
sondern mit Fragezeichen.
Hermann Hesse
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ............................................................................................ I
1.1 Medizinische Relevanz.....................................................................................................2
1.2 Klassifizierung von Glykosyltransferasen........................................................................3
1.3 Die Glukosyltransferasen der gradzahligen T-Phagen .....................................................5
1.4 Der Bakteriophage T4 ....................................................................................................11
1.4.1 Die Modifikationen der T4 DNA als Schutz- und Regulationsmechanismus.........13
1.5 Aufgabenstellung............................................................................................................15
2 Material und Methoden.....................................................................17
2.1 Chemikalien und Enzyme...............................................................................................17
2.2 Geräte und Verbrauchmaterialien...................................................................................17
2.3 Oligonukleotide ..............................................................................................................18
2.4 Bakterien und Phagen.....................................................................................................20
2.5 Plasmide..........................................................................................................................20
2.6 Nährmedien ....................................................................................................................21
2.7 Arbeiten mit Bakterien und Phagen................................................................................21
2.7.1 Anzucht von Bakterien ............................................................................................21
2.7.2 Herstellung kompetenter Zellen für die Hitzeschocktransformation mittels CaCl2
nach Dagert & Ehrlich (1979)...........................................................................................22
2.7.3 Transformation, modifiziert nach Cohen et al. (1972)............................................22
2.7.4 Anzucht und Induktion von Zellen zur Überexpression von Proteinen ..................22
2.7.5 Zellaufschluß mittels Ultraschall.............................................................................22
2.7.6 Anzucht von T4* Phagen ........................................................................................23
2.7.7 Anzucht T4 infizierter Zellen ..................................................................................24
2.8 DNA-Präparationen ........................................................................................................24
2.8.1 Isolierung von Phagen DNA....................................................................................24
2.8.2 Plasmidisolierung ....................................................................................................25
2.8.3. Enzymatische Modifikationen von DNA ...............................................................25
2.8.4 Agarosegelelektrophorese .......................................................................................25
2.8.5 DNA-Elution aus Agarosegelen ..............................................................................26
2.8.6 Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................................................26
2.8.7 Aufreinigung von PCR-Produkten ..........................................................................26
2.8.8 Mutagenese..............................................................................................................27
I
Inhaltsverzeichnis
2.8.9 DNA-Sequenzierung ...............................................................................................27
2.8.10 Herstellung von Vektoren mit T-Überhang nach Marchuk et al. (1991), verändert
nach Hadjeb & Berkowit (1996).......................................................................................28
2.9 Methoden zur Aufreinigung und Analyse von Proteinen...............................................28
2.9.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen ...............................................................28
2.9.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970)...............................29
2.9.3 Färbung von Polyacrylamidgelen mit Coomassie Brillant Blue .............................30
2.9.4 Färbung von Polyacrylamidgelen mit Silbernitrat nach Blum et al. (1987),
modifiziert nach Nesterenko et al. (1994)........................................................................30
2.9.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen und
Nachweis des “His-tag” (“Western Blot”)........................................................................31
2.9.6 Reinigung von Proteinen mittels zweistufiger Metallaffinitätschromatographie....32
2.9.7 Aktivitätstest............................................................................................................33
2.9.8 Nachweis von Proteininteraktionen über magnetische Agarose-Partikel................34
2.9.9 Nano-Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie..............................................35
2.9.10 Chromatographische Trennung von UDP und UDPG mittels HPLC ...................35
2.9.11 DNA-Retardation...................................................................................................36
2.9.12 Analyse von Proteinsekundärstrukturen mittels CD-Spektroskopie .....................36
2.9.13 Kristallisation.........................................................................................................37
2.9.14 Vorhersage dreidimensionaler Proteinstrukturen ..................................................37
2.10 Elektronische Datenverarbeitung .............................................................................38
3 Ergebnisse .........................................................................................39
3.1 Klonierung, Überexpression und Nachweis der α-Glukosyltransferase.........................39
3.2 Reinigung der α-Glukosyltransferase.............................................................................41
3.3 Versuch der Kristallisation .............................................................................................46
3.4 Kinetische Daten der α-Glukosyltransferase ..................................................................47
3.5 Untersuchung von Proteininteraktionen .........................................................................48
3.6 Sekundärstrukturalignment und Berechnung eines dreidimensionalen
Modells ......55
3.7 Identifikation katalytisch relevanter Aminosäuren.........................................................57
3.7.1 Ortsspezifische Mutagenese ....................................................................................58
3.7.2 Sekundärstrukturanalyse..........................................................................................59
3.7.3 Gesamtaktivität der Mutanten .................................................................................62
3.7.4 Experimente zur DNA-Retardation .........................................................................64
3.7.5 UDPG-Umsatz.........................................................................................................67
II
Inhaltsverzeichnis
4 Diskussion.........................................................................................72
4.1 Reinigung der α-Glukosyltransferase .............................................................................72
4.2 Die Regulation der α- und β-Glukosylierung bei T4......................................................74
4.3 Ansätze zur Aufklärung der α–Glukosyltransferase Struktur ........................................78
4.3.1 Aspekte zur Kristallisation ......................................................................................79
4.3.2 Strukturmodell .........................................................................................................79
4.4 Ortsspezifische Mutagenese ...........................................................................................82
4.4.1 Katalyse ...................................................................................................................84
4.4.2 Konformationsänderung ..........................................................................................85
4.4.3 UDPG-Bindung .......................................................................................................87
4.4.4 Interaktionen mit der DNA......................................................................................88
4.5 Rückschlüsse auf die Struktur und den Mechanismus der AGT ....................................90
4.6 Ausblick..........................................................................................................................91
5 Zusammenfassung.............................................................................93
6 Literatur.............................................................................................95
III
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen
A. dest.
destilliertes Wasser
AGT
α-Glukosyltransferase
APS
Ammoniumpersulfat
BGT
β-Glukosyltransferase
bp
Basenpaare
C
ungeordnete Proteinstruktur (“Coil”)
CD
cirkularer Dichroismus
DTT
Dithiothreitol
E
β-Faltblatt
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ΔG
Energiedifferenz
Gp
Genprodukt
H
α-Helix
HRP
Meerrettich Peroxidase
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalaktosid
kkat
katalytische Konstante
Km
Michaelis-Konstante
Ni-NTA
Nickel-Nitrilotriaceticsäure
O.D.
optische Dichte
PCR
Polymerasekettenreaktion
PEG
Polyethylenglykol
R
Gaskonstante
RNase
Ribonuklease
RSA
Rinderserumalbumin
SDS
Natriumdodecylsulfat
SV
Säulenvolumen
TCA
Trichloressigsäure
TEMED
N, N, N', N',-Tetramethylethylendiamin
UDP
Uridindiphosphat
UDPG
Uridindiphosphoglukose
Upm
Umdrehungen pro Minute
IV
Abkürzungsverzeichnis
UV-Licht
ultraviolettes Licht
v/v
Volumen pro Volumen
w/v
Gewicht pro Volumen
Maßeinheiten
A
Ampere
Å
Angström
C
Celsius
Ci
Curie
Da
Dalton
deg
Degree (Maßeinheit für Winkel)
g
Gramm
h
Stunde
J
Joule
m
Meter
M
Molarität
min
Minute
s
Sekunde
T
Temperatur in Kelvin
V
Volt
Maßeinheiten
K
kilo
M
milli
µ
mikro
n
nano
p
piko
V
Einleitung
1 Einleitung
Glykosyltransferasen spielen in vielen biologischen Prozessen eine zentrale Rolle (Dennis et
al., 1999; Verbert & Cacan, 1999). Sie katalysieren die Verknüpfung glykosidischer
Verbindungen, deren biologische Bedeutung neben ihrer strukturgebenden Funktion auch in
der Regulation vieler biochemischer Reaktionen liegt (Charnock & Davies, 1999). In
Eukaryonten sind die meisten Glykosyltransferasen im Endoplasmatischen Retikulum und im
Golgi Apparat lokalisiert und zeichnen sich durch eine gemeinsame Domänenstruktur aus
(Breton et al., 1998). Zu den Typ II Transmembranproteinen gehörend, bestehen sie aus
einem kurzen N-Terminus, gefolgt von einer Transmembrandomäne und einer Stammregion.
Die globuläre katalytische Domäne befindet sich am C-Terminus (Paulson & Colley, 1989;
Varki, 1993). Bakterielle Glykosyltransferasen hingegen weisen ganz unterschiedliche
Topologien auf und können entweder keine oder auch mehrere Transmembrandomänen
enthalten (Glucksmann et al., 1993; Liu et al., 1993).
Die Glykosylierung ist eine Modifikation, die meist bei Lipiden und Proteinen zu finden
ist; es gibt allerdings auch Beispiele für glykosylierte Nukleinsäuren. Glykoproteine sind
genauso wie die Glykolipide hauptsächlich an Zelloberflächen lokalisiert oder treten in Form
von Exoenzymen auf (Drickamer & Taylor, 1998; Schäfer et al., 2001). Der Zuckeranteil
dient dabei als Schlüsselelement in Prozessen der interzellulären Kommunikation wie der
Zell-Zell-Erkennung und Zelladhäsion, der Signaltransduktion und der Immunantwort
genauso wie bei bakteriellen und viralen Infektionen (Varki, 1993).
Glykosylierte Nukleinsäuren sind seit langem bekannt, aber vergleichsweise wenig
untersucht. Ein Beispiel für diese Art der Modifikation ist das Genom der gradzahligen E. coli
T-Phagen. Es enthält glykosyliertes 5’-Hydroxymethyl-Cytosin, wodurch eine Degradation
der Phagen DNA durch wirtseigene Nukleasen verhindert wird und gleichzeitig eine
Kontrolle der phagenspezifischen Genexpression stattfindet (Lehman & Pratt, 1960; Rüger,
1978; Revel, 1983). Das Genom der Kinetoplastiden weist glykosyliertes HydroxymethylUracil auf, das das Thymin in der DNA partiell ersetzt (Gommers-Ampt et al., 1993). Diese
Modifikation supprimiert möglicherweise die Rekombination repetitiver DNA Elemente und
erhöht so die Chromosomenstabilität (Cross et al., 1999). Zusätzlich erfolgt über den Gehalt
an glykosyliertem Hydroxymethyl-Uracil bei Trypanosoma brucei eine Regulation der
Antigenvarianz auf Transkriptionsebene (van Leeuwen et al., 1998). Auch im Genom von
Euglena gracilis wurde diese Modifikation nachgewiesen; ihre Funktion ist allerdings
unbekannt (Dooijes et al., 2000).
1
Einleitung
1.1 Medizinische Relevanz
Glykosyltransferasen und ihre Reaktionsprodukte sind sowohl in Pro- und Eukaryonten als
auch bei Viren zu finden (Schäfer et al., 2001). Vom medizinischen Standpunkt aus betrachtet
ist ihre Existenz in vielfacher Hinsicht interessant.
So ist beispielsweise das Peptidoglykan, das die bakterielle Zellwand aufbaut und die
Zelle so vor der Lyse durch osmotischen Druck schützt, von großem medizinischen Interesse.
Diese Zellwandbiosynthese, an der Glykosyltransferasen in essentieller Weise beteiligt sind,
stellt einen Angriffspunkt für Antibiotika zur Abwehr bakterieller Infektionen dar. Die
zunehmende Resistenz vieler Bakterien erfordert allerdings die stetige Entwicklung neuer
Medikamente. Dabei könnten detaillierte Kenntnisse über die Struktur und den
Reaktionsmechanismus der involvierten Glykosyltransferasen eine große Hilfe sein (Ha et al.,
2000).
Weitere medizinisch relevante Glykosyltransferasen sind die Cytotoxine der Clostridien.
Sie modifizieren kleine GTPasen der Rho Familie und treten als Hauptvirulenzfaktoren in
unterschiedlichen
Erkrankungen
wie
der
Antibiotika-assoziierten
Diarrhö,
der
pseudomembranösen Kolitis oder dem Gasbrand in Erscheinung (Hatheway, 1990; Kelly et
al., 1994; Busch et al., 1998 und 2000).
Einen ganz anderen medizinischen Gesichtspunkt stellt die Xenotransplantation dar, die
als eine mögliche Alternative zur allogenen Transplantation angesehen wird (Nature
Spezialausgabe 391, 1998). Die Problematik bei der Transplantation eines tierischen Organs
in den Menschen ergibt sich aus der Abstoßung des Transplantats aufgrund von
Glykosylresten, die auf den Endothelzellen des Spenderorgans präsentiert und von
menschlichen Antikörpern erkannt werden (Galili, 1991; Cooper et al., 1994). An der
Synthese dieser sogenannten Xeno-Antigene, die fast alle Säugetiere besitzen, ist die
Glykosyltransferase α3-GalT (UDP-Gal:β1-4GlcNAc-R α3-Galaktosyltransferase) beteiligt.
Auch hier ist die Strukturauflösung des Enzyms und die Entwicklung von Inhibitoren von
großem medizinischen Interesse (Imberty et al., 1999).
2
Einleitung
1.2 Klassifizierung von Glykosyltransferasen
Glykosyltransferasen katalysieren den Transfer eines Zuckers von einem aktivierten
Donormolekül auf spezifische Akzeptormoleküle. Die Variabilität der Substrate wird dabei
durch eine entsprechend große Diversität innerhalb der Enzymklasse reflektiert (Gagneux &
Varki, 1999).
Diese große strukturelle und funktionelle Divergenz erschwert die Klassifizierung der
Glykosyltransferasen, die nach unterschiedlichen Kriterien erfolgen kann. Sinnott (1991)
unterteilte die Proteine nach der Stereochemie der Substrate und der Reaktionsprodukte in
“invertierende” und “beibehaltende” Enzyme, wobei er nicht zwischen Glykosylhydrolasen
und Glykosyltransferasen unterschied. Diese beiden Enzymgruppen unterscheiden sich
hinsichtlich ihres Katalysemechanismus (siehe Abb. 1.1). Proteine, die die anomere
Konfiguration invertieren, also beispielsweise die Glukose aus UDP-Glukose β-glykosidisch
verbinden, folgen einem einfachen Verdrängungsmechanismus, in dem der Akzeptor das
C1-Atom des Nukleotid-Diphosphat-Donors nukleophil angreift. Die Retention der
Konfiguration, also exemplarisch der Transfer der Glukose von UDP-Glukose in eine
α-glykosidische Bindung, korreliert meist mit einem zweistufigen Mechanismus, in dem
zunächst ein Glykosyl-Enzym-Intermediat unter Freigabe des Nukleotidphosphats gebildet
wird und dann der Angriff des Akzeptors auf das Intermediat erfolgt (McCarter & Withers,
1994; Davies & Henrissat, 1995).
Abb. 1.1: Der postulierte Reaktionsmechanismus für a) invertierende und b) die Konfiguration erhaltende
Glykosyltransferasen (verändert nach Persson et al., 2001).
3
Einleitung
Ein anderes System, das Campbell und seine Mitarbeiter 1997 entwickelten und permanent
aktualisieren, klassifiziert Glykosyltransferasen nach ihren Aminosäuresequenz-Homologien
(Campbell et al., 1997; http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf.html). Diese Methodik hatte
sich bereits für Glykosidasen und Peptidasen bewährt, da die einer Familie zugeordneten
Proteine neben Homologien in ihrer dreidimensionalen Struktur auch konservierte
Reaktionsmechanismen aufwiesen (Gebler et al., 1992; Davies & Henrissat, 1995). Aufgrund
der erwähnten medizinischen Relevanz der Glykosyltransferasen sind genau diese
Informationen von besonderem Interesse (Imberty et al., 1999). Bisher konnte die
Röntgenstruktur nur von sehr wenigen Glykosyltransferasen gelöst werden. Die erste Struktur
stand 1994 zur Verfügung, als es Vrielink und Mitarbeitern gelang, die β-Glukosyltransferase
des Bakteriophagen T4 mittels Röntgenbeugung zu charakterisieren. Obwohl dieses Enzym
bezüglich seiner Aminosäuresequenz keiner Glykosyltransferase-Familie zugeordnet werden
kann, bestehen starke strukturelle Homologien zu den Glykosyltransferasen MurG von E. coli
und GtfB von Amycolatopsis orientalis (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf.html; Ha et
al., 2000; Mulichak et al., 2001). Inzwischen sind die Strukturen von insgesamt neun
Glykosyltransferasen bekannt (Tab. 1.1).
Tab. 1.1: Glykosyltransferasen, deren Struktur aufgeklärt werden konnte, mit Angabe des Organismus und
einer Referenz. Von den eukaryontischen Glykosyltransferasen (β-1-4-Galaktosyltransferase I,
N-Acetylglucosaminyltransferase I und Glukuronyltransferase I) wurde jeweils nur das katalytische
Fragment kristallisiert.
Enzym
Organismus
Referenz
β-Glukosyltransferase
T4
Vrielink et al., 1994
SpsA
Bacillus subtilis
Charnock & Davies,
1999
β-1-4-Galaktosyltransferase 1
Rind
Gastinel et al., 1999
MurG
Escherichia coli
Ha et al., 2000
UDP-N-Acetylglucosymin 2-Epimerase Escherichia coli
Campbell et al., 2000
N-Acetylglucosaminyltransferase I
Hase
Ünligil et al., 2000
Glukuronyltransferase I
Mensch
Pedersen et al., 2000
LgtC
Neisseria meningitis
Persson et al., 2001
GtfB
Amycolatopsis orientalis
Mulichak et al., 2001
4
Einleitung
1.3 Die Glukosyltransferasen der gradzahligen T-Phagen
DNA-modifizierende Glukosyltransferasen sind bei allen gradzahligen T-Phagen vertreten
(Lehman & Pratt, 1960). Sowohl T2, T4 als auch T6 besitzen eine α-Glukosyltransferase
(AGT), die die Glukose von UDPG α-glykosidisch mit dem 5’-Hydroxymethyl-Cytosin
(HMC) der Phagen-DNA verknüpft. Bei T4 wurde zusätzlich eine β-Glukosyltransferase
(BGT) nachgewiesen, ein Enzym, das die gleiche Reaktion katalysiert, dabei aber den Zucker
von der α- in eine β-glykosidische Verbindung invertiert. Das Genom der Phagen T2 und T6
kodiert hingegen neben der AGT für eine β−Glykosyl-HMC-α-Glukosyltransferase
(Gentioglukosyltransferase, GGT), die auf bereits α-glykosyliertes HMC noch einen zweiten
Zucker in der β-Konfiguration überträgt.
Jeder dieser drei Phagentypen hat sein eigenes, festgelegtes Glykosylierungsmuster
(Tab. 1.2). Bei T4 werden 70 % der Hydroxymethyl-Cytosine in der α-Konfiguration und die
restlichen 30 % in der β-Konfiguration modifiziert. Bei T2 und T6 bleiben sie hingegen zu
25 % unmodifiziert. α-glykosyliertes und β-glykosyl-α-glykosyliertes HydroxymethylCytosin liegen in der T2 DNA zu 70 % und 5 % bzw. im T6 Genom zu 3 % und 72 % vor.
Tab. 1.2: Verteilung der α- und β-Glykosylierung an 5’-Hydroxymethyl-Cytosinen in der DNA gradzahliger
T-Phagen (Revel, 1983). Angabe in %.
Bakteriophage
α-Glykosylierung
β-Glykosylierung
Gentioglykosylierung
T2
70
0
5
T4
70
30
0
T6
3
0
72
Während die drei α-Glukosyltransferasen in ihrer Primärsequenz sehr große
Übereinstimmungen aufweisen (die Enzyme der T4 und T6 Phagen unterscheiden sich nur in
4 Aminosäuren), bestehen keine signifikanten Homologien zur T4 β-Glukosyltransferase oder
den Gentioglukosyltransferasen (Gram, 1985; Tomaschewski et al., 1985). Trotzdem kann
eine Ähnlichkeit in der dreidimensionalen Struktur aufgrund der Gemeinsamkeiten bezüglich
der Substrat- und Donorspezifität nicht ausgeschlossen werden.
5
Einleitung
Die Kristallstruktur der β-Glukosyltransferase wurde inzwischen bis zu einer Auflösung
von 1,88 Å bestimmt (Vrielink et al., 1994; Moréra et al., 1999). Demnach besteht das
Protein aus zwei Domänen ähnlicher Topologie, deren Faltung einem Rossmann NukleotidBindemotiv gleicht (Rossmann et al., 1975). Die N-terminale Domäne wird aus sieben
α-Helices und sieben parallelen, zueinander verdrehten β-Faltblättern gebildet. In der
C-terminalen Domäne umgeben fünf α-Helices die sechs parallelen, verdrehten β-Faltblätter.
Verbunden werden die beiden Domänen durch einen “Linker” und eine α-Helix, so dass
zwischen ihnen ein zentraler Spalt entsteht. In der Abbildung 1.2 a ist die Struktur der
β-Glukosyltransferase mit gebundenem UDP dargestellt. Bis jetzt ist es noch nicht gelungen,
ein Co-Kristall der BGT zusammen mit dem Substrat UDPG zu züchten. Da das Enzym die
Glukose auch in Abwesenheit der Akzeptor-DNA vom Nukleotid-Diphosphat-Donor
abspaltet, enthalten die Kristalle immer nur den UDP-Anteil (Moréra et al., 1999).
Der Vergleich der Röntgenstrukturdaten der β-Glukosyltransferase in An- und
Abwesenheit von UDPG deckte signifikante Unterschiede auf (Vrielink et al., 1994; Moréra
et al., 2001). Durch die Bindung des Substrats wird eine Konformationsänderung des Enzyms
ausgelöst, die in einer rigiden Rotation der C-terminalen Domäne um 5° resultiert. Für diese
Bewegung ist die α-Helix, die die beiden Domänen miteinander verbindet, verantwortlich.
Wie ein Scharnier bewegt sie die Domänen aufeinander zu. Daher wird die Substrat-bindende
Form auch als geschlossene und die Substrat-freie Form als offene Konformation bezeichnet.
Im geschlossenen Zustand entstehen außerdem fünf Salzbrücken, die in der Substrat-freien
Form fehlen (Asp171-Lys28, Lys166-Glu272, Arg191-Asp100, Arg191-Asp258 und Arg195Asp258). Drei von ihnen werden jeweils von zwei Aminosäuren aus unterschiedlichen
Domänen gebildet und tragen so ebenfalls zur Konformationsänderung bei (Asp171−Lys28,
Lys166−Glu272 und Arg191-Asp100). Der Unterschied der beiden Enzymstrukturen wird in
der Abbildung 1.2 b deutlich, die das Aminosäurerückgrat der β-Glukosyltransferase in der
offenen und in der geschlossen Konformation zeigt.
6
Einleitung
a)
b)
Abb. 1.2: Die β-Glukosyltransferase in der Substrat-freien und der
Substrat-bindenden Konformation.
a) Darstellung
der
geschlossenen
Enzymkonformation
(“Ribbon”-Präsentation) mit gebundenem UDPG (schwarz).
α-Helices sind in rot, β-Faltblätter in blau abgebildet.
b) Das Aminosäurerückgrat der β-Glukosyltransferase in der
offenen (grün) und der geschlossenen (violett) Konformation. Dargestellt mit Rasmol (a) und Molscript (b).
Die Bindung des UDP erfolgt über die C-terminale Domäne in der zentralen Spalte.
Anhand der Röntgenstrukturdaten konnten inzwischen mehrere Interaktionen des Substrats
mit spezifischen Aminosäuren identifiziert werden. Die Abbildung 1.3 zeigt einen Ausschnitt
aus dem katalytischen Zentrum der β-Glukosyltransferase mit dem gebundenen, in gelb
dargestellten UDP. Die Positionen, für die eine katalytische Funktion nachgewiesen ist oder
7
Einleitung
zumindest postuliert wird, werden hervorgehoben. Die Aminosäuren Glu22 und Asp100
aktivieren vermutlich den nukleophilen Angriff der HMC-Gruppe auf das C1-Atom der
Glukose (Vrielink et al., 1994). Asp258 bildet zwei Salzbrücken mit Arg191 und Arg195 aus
und interagiert wahrscheinlich mit der Glukose. Ile238 bindet das Uridin, während Glu272
eine Wasserstoff-Brücke zur Ribose des Substrats ausbildet. Die Interaktion mit den beiden
Phosphatresten erfolgt über Ser189 und die Arginine 191, 195 und 269.
Abb. 1.3: Das katalytische Zentrum der β-Glukosyltransferase.
“Ribbon”-Präsentation der α-Helices (violett) und der
β-Faltblätter (türkis) mit gebundenem UDP (gelb). Die mit
dem Substrat interagierenden Aminosäuren sind in der “Ball
and Stick”-Präsentation hervorgehoben. Dargestellt mit
Molscript.
Die Berechnung des elektrostatischen Oberflächenpotentials der β-Glukosyltransferase
zeigt eine signifikant positiv geladene Region auf, in der eine Dominanz von Lysinen und
Argininen vorherrscht (Vrielink et al., 1994). Da die BGT keine spezifische DNA-Sequenz
erkennt,
sondern
innerhalb
der
Nukleotidabfolge
nur
die
modifizierte
Base
5’-Hydroxymethyl-Cytosin finden muss, ist eine Interaktion des Enzyms mit der DNA über
das Phosphatrückgrat der Nukleinsäure denkbar. Diese könnte an der positiv geladenen
Region der konkaven Enzymoberfläche, die auch den zentralen Spalt einschließt, erfolgen. Im
8
Einleitung
Kristall wurde die Bindung des UDP tief in dem Spalt nachgewiesen. Die daraus gefolgerte
Position der Glukose wäre für das HMC so allerdings nicht zugänglich; das Protein müsste
zunächst eine weitere Konformationsänderung durchlaufen. Alternativ wird für die
β-Glukosyltransferase ein sogenannter “Basenausklapp-Mechanismus” postuliert (Vrielink et
al., 1994). Nach dieser Hypothese würde die reaktive Base aus der helikalen DNA-Struktur in
den Proteinkanal ausklappen. Dort könnte dann der nukleophile Angriff auf die Glukose
erfolgen. Der Basenausklapp-Mechanismus wurde erstmals 1994 in einem Co-Kristall der
HhaI DNA Methyltransferase mit ihrem DNA-Substrat gezeigt (Klimasauskas & Roberts,
1995). Inzwischen konnte er in drei weiteren Systemen, der HaeIII DNA Methyltransferase,
der T4 Endonuklease V und der humanen Uracil DNA Glykosylase, beobachtet werden; für
viele andere Enzyme wird er bereits vermutet (Roberts & Cheng, 1998).
Nach der bekannten Enzym-DNA-Struktur der HhaI DNA Methyltransferase gelang
Moréra und Mitarbeitern (1999) die Modellierung einer doppelsträngigen DNA mit einer in
die Bindungstasche der BGT ausgeklappten Base. Diese hypothetische DNA-Interaktion der
β-Glukosyltransferase konnte zwar noch nicht bewiesen werden, ist aber zumindest
theoretisch möglich, da der zentrale Spalt mit gebundenem UDPG groß genug ist, um ein
ausgeklapptes 5’-HMC aufzunehmen. Die Abbildung 1.4 a zeigt eine Übersicht der
β-Glukosyltransferase mit der an der konkaven Enzymoberfläche gebundenen Doppelhelix.
Ein vergrößerter Ausschnitt der Protein-DNA Interaktion im Bereich der ausgeklappten Base
wird in Abbildung 1.4 b dargestellt. Die Aminosäuren Arg217 und Lys222, die in dem
ausgewählten Abschnitt mit der DNA interagieren könnten, werden hervorgehoben. Ser192
ist eventuell für die Bindung des Phosphodiesterrückgrats der ausgeklappten Base
verantwortlich.
9
Einleitung
a)
b)
Abb. 1.4: Die Interaktion der β-Glukosyltransferase mit der DNA.
a) Das Protein (“Ribbon”-Präsentation) bindet die DNA (“Ball and Stick” Präsentation)
über die konkave Enzymoberfläche. Das zu modifizierende 5'-HydroxymethylCytosin wird in die aktive Spalte des Enzyms ausgeklappt.
b) Vergrößerter Ausschnitt der Interaktion der β-Glukosyltransferase (grün) mit der
DNA (violett) im Bereich des ausgeklappten 5'-Hydroxymethyl-Cytosins (HMC) in
Anwesenheit von UDP (rot). Die in diesem Ausschnitt potentiell mit der DNA
interagierenden Aminosäuren (“Ball and Stick”-Präsentation) sind mit ihrer Position
gekennzeichnet. Dargestellt mit Rasmol (a) und Molscript (b).
10
Einleitung
Im Vergleich zur β-Glukosyltransferase ist über die α-Glukosyltransferase des
Bakteriophagen T4 nur verhältnismäßig wenig bekannt. Die mit 400 Aminosäuren um
49 Reste größere AGT modifiziert in bgt - Mutanten genauso wie im Wildtyp nur 70-75 % der
Hydroxymethyl-Cytosine. Diese unvollständige Glykosylierung beruht auf der Unfähigkeit
des Enzyms, nebeneinander liegende HMC-Reste zu glykosylieren (Lunt & Newton, 1965; de
Waard et al., 1967). Die β-Glukosyltransferase hingegen modifiziert auch HMC-reiche
Sequenzen und bewirkt in agt - Mutanten eine 100 %ige Glykosylierung (Georgopoulos &
Revel, 1971). Im Vermehrungszyklus des Wildtyp Phagen muss also ein anderer Faktor als
die Enzymspezifität für das festgelegte Glykosylierungsmuster verantwortlich sein. Obwohl
die Aktivitäten beider Enzyme gleichzeitig nachweisbar sind, ist die α-Glykosylierung bereits
8-10 min nach der Infektion vollständig erfolgt, während die β-Glykosylierung zu diesem
Zeitpunkt erst zu 20 % abgeschlossen ist (Kornberg et al., 1961; Revel, 1983). Welcher
Mechanismus dieser Regulation zugrunde liegt, ist noch unbekannt. Denkbar wäre aber eine
räumliche und funktionelle Trennung der beiden Glukosyltransferasen.
1.4 Der Bakteriophage T4
Der E. coli Phage T4 zeichnet sich durch einen sehr effizienten und komplex regulierten
Vermehrungszyklus aus. Das mit 168,9 kbp für einen Phagen recht große Genom liegt als
linearer DNA-Doppelstrang mit einer terminalen Redundanz von 3 kbp vor und kodiert für
die meisten zur Vermehrung notwendigen Proteine (Streisinger et al., 1964; Kutter et al.,
1994). T4 rekrutiert daher nur sehr wenige wirtseigene Genprodukte, wie die RNAPolymerase und die Ribosomen, die durch spezifische Modifikationen, z. B. in Form von
ADP-Ribosylierungen, ihrer Funktion innerhalb des Infektionszyklus angepasst werden.
Unmittelbar nach der Infektion kommt es zu einem kompletten Stillstand der Synthese
wirtseigener Makromoleküle, verbunden mit einer Degradation des E. coli Genoms durch
phageneigene Enzyme (Rabussay, 1982; Mathews et al., 1983). Die gleichzeitige Expression
viraler Gene unterliegt einer strengen Kontrolle auf Transkriptionsebene, die auf einer
sequentiellen Aktivierung verschiedener Promotorklassen basiert, wobei zwischen frühen,
mittleren und späten Promotoren unterschieden wird (Mosig & Hall, 1994; Wilkens & Rüger,
1994).
Zu den frühen und mittleren Genprodukten gehören Proteine, die für die Replikation und
Rekombination oder für den physiologischen Übergang in die folgenden Entwicklungsphasen
11
Einleitung
benötigt werden. Die frühen T4 Promotoren werden von der E. coli RNA-Polymerase als
Transkriptionsstartpunkte erkannt, stehen aber zunächst in Konkurrenz zu den wirtseigenen
Promotoren. Die RNA-Polymerase wird daher sehr schnell nach der Infektion durch die
phageneigene ADP-Ribosyltransferase Alt modizifiert (Koch et al., 1995). Alt gelangt mit der
injizierten DNA in die Wirtszelle und bewirkt eine gesteigerte Selektivität der
Transkriptionsinitiation zu Gunsten der frühen T4 Promotoren (Sommer et al., 2000). Die
ADP-Ribosylierung
betrifft
zunächst
nur
eine
der
beiden
α-Untereinheiten
der
RNA-Polymerase. Durch das frühe Genprodukt ModA erfolgt dann die Modifikation der
zweiten α-Untereinheit, wodurch wahrscheinlich die frühe Transkription beendet und die
mittlere Infektionsphase eingeleitet wird (Wilkens et al., 1997; Tiemann et al., 1999).
Unter der Kontrolle der späten T4 Promotoren stehen Gene, die beispielsweise für
strukturelle Komponenten des Phagencapsids kodieren (Mosig & Hall., 1994). Für die
Erkennung dieser Promotoren durch die E. coli RNA-Polymerase werden ein T4-kodierter
Co-Aktivator, Gp 33, und ein phageneigenener σ-Faktor, Gp 55, rekrutiert (Herendeen et al.,
1990; Sanders et al., 1997). Eine weitere Besonderheit der späten Transkription ist ihre
Kopplung an die DNA-Replikation, die über das T4 Protein Gp 45, die “sliding clamp” der
DNA Polymerase, vermittelt wird (Nossal, 1994).
Für die Replikation seines Genoms verwendet der Phage multiple Replikationsstartpunkte
und Initiationsmechanismen (Kreuzer & Morrical, 1994). Je nach Infektionsphase werden
dafür unterschiedliche Proteine rekrutiert, wobei einige von ihnen, wie die T4 eigene
DNA Polymerase und die mit ihr assoziierten Proteine Gp 44, Gp 45, und Gp 62, in allen
Formen der Replikation benötigt werden. Neben der Origin-abhängigen Replikation wird die
Initiation der DNA-Synthese im Verlauf der Infektion zunehmend von einer umfangreichen
Rekombination abhängig. Auf diese Weise entstehen verzweigte Konkatemere, aus denen für
die Verpackung in den Phagenkopf schließlich Einheitschromosomen ausgeschnitten werden.
Die Länge der DNA, die schließlich in einen Phagenpartikel eingebracht werden kann, ist
durch die Größe des Phagenkopfes determiniert (Mathews, 1994). Insgesamt werden ungefähr
102 % des Genoms verpackt, so dass eine terminale Redundanz entsteht. Nach einer
Selbstassemblierung der einzelnen Phagenbestandteile kommt es letztlich 25 min nach der
Infektion zur Lyse der Wirtszelle und der Freisetzung einiger hundert neuer Viren.
12
Einleitung
1.4.1 Die Modifikationen der T4 DNA als Schutz- und Regulationsmechanismus
Der Phage T4 hat ein komplexes Restriktions- und Modifikationssystem entwickelt, um seine
DNA gegen eine Restriktion durch E. coli Enzyme zu schützen und gleichzeitig die WirtsDNA zu degradieren. Der Abbau des E. coli Genoms stellt eine wichtige Quelle für
Desoxyribonukleotid-Monophosphate (dNMP) dar und wird durch mehrere phagenkodierte
Enzyme katalysiert (Mathews, 1972; Kutter et al., 1975; Snustad et al., 1983). Die
Effektivität dieses Systems zeigt sich in der Tatsache, dass bisher keine E. coli Mutanten
bekannt sind, die sich gegen die T4 Nukleasen denA und denB schützen können (Carlson et
al., 1994). Die so gewonnenen dNMP werden in einem dNTP Synthetase Komplex in die
entsprechenden Triphosphate konvertiert und der T4 Replikation zur Verfügung gestellt
(Greenberg et al., 1994). Auf diese Weise können pro Wirtsgenom ungefähr 20 Kopien der
T4 DNA
erstellt
werden.
Gleichzeitig
erfolgt
eine
de
novo
Synthese
von
Desoxyribonukleotid-Triphosphaten, so dass Phagenmutanten, die nicht zur Degradation des
Wirtsgenoms befähigt sind, keine detektierbaren Unterschiede in ihrem Infektionszyklus
aufweisen (Tomich et al., 1974). Trotzdem bietet die Wiederverwertung des genetischen
Materials dem Virus besonders unter Nährstoffmangelbedingungen, die in seiner natürlichen
Umgebung vorherrschen, unzweifelhaft einen evolutionären Vorteil.
Während Adenosin, Guanin und Thymin den dNTP Synthetase Komplex als
unmodifizierte
Triphosphate
verlassen,
wird
Cytosin
zunächst
als
Monophosphat
5’-hydroxymethyliert, um dann als präreplikativ modifizierte Base in die Phagen DNA
eingebaut zu werden. Zusätzlich liegen 0,5 % der Adenosine in der T4 DNA methyliert vor;
diese Veränderung erfolgt allerdings postreplikativ und wird durch eine T4 kodierte
Methyltransferase katalysiert (Hattman, 1970; Malygin et al., 1997). Diese erste Besonderheit
des T4 Genoms bietet einen Schutz vor Nukleasen, wie EcoK und EcoP1, die nur
unmodifizierte Sequenzen erkennen (Carlson et al., 1994).
Direkt nach der Replikation wird das 5’-Hydroxymethyl-Cytosin durch die beiden
phageneigenen Glukosyltransferasen AGT und BGT α- bzw. β-glukosyliert; die Reaktion ist
in der Abbildung 1.5 schematisch dargestellt.
13
Einleitung
alpha-Glykosyltransferase
alpha-Glykosyl-5'-hydroxymethyl-Cytosin Monophosphat
UDPG
5'-Hydroxymethyl Cytosin Monophosphat
beta-Glykosyltransferase
beta-Glykosyl-5'-hydroxymethyl-Cytosin Monophosphat
Abb. 1.5: Glykosylierung der 5'-Hydroxymethyl-Cytosin-haltigen
β-Glukosyltransferase.
Als
zweite
Stufe
der
DNA-Modifikation
DNA
stellt
die
durch
die
α-
bzw.
Glukosylierung
die
einen
Abwehrmechanismus gegen die HMC-spezifischen E. coli Restriktionssysteme RglA und
RglB dar. Unglukosylierte Phagen DNA wird als T4* DNA bezeichnet und kann auf zwei
unterschiedliche Weisen erzeugt werden (Revel, 1983). Da als Glukose-Donor für diese
Reaktion das vom Wirt synthetisierte UDPG dient, enthalten Phagen, die sich in galU
Wirtszellen multiplizieren, unglukosylierte HMC-Reste. Diese E. coli Mutanten tragen einen
Defekt im Gen der UDPG Pyrophosphorylase. Die neusynthetisierte DNA wird dabei durch
den T4 kodierten Inhibitor Arn, einen Antagonisten zu dem RglB Restriktionssystem, vor
einer Degradation geschützt. T4* Phagen können außerdem durch die Vermehrung von agt
-
bgt - Virusmutanten entstehen. Experimentell ist die unglukosylierte HMC-DNA von der T4
Wildtyp DNA durch einen Verdau mit der Endonuklease EcoRI unterscheidbar, die nur
unglukosylierte DNA restringiert (Kaplan & Nierlich, 1975).
Neben der schützenden Funktion scheint die Aktivität der beiden Glukosyltransferasen
auch auf anderer Ebene die Phagenentwicklung voranzutreiben. Während eine fehlende
Glukosylierung der DNA in der frühen Transkriptionsphase keinen Einfluss auf die
Genexpression nimmt, wird die von den späten Promotoren ausgehende Transkription stark
beeinträchtigt (Dharmalingam & Goldberg, 1979). In einem normal ablaufenden
14
Einleitung
Infektionszyklus ist die späte Genexpression, die durch Einzelstrangbrüche begünstigt wird,
an die Replikation gekoppelt (Tinker et al., 1994). Das verbindende Element ist Gp 45, das
als “sliding clamp” der T4 DNA-Polymerase für die Replikation essentiell ist, parallel aber
auch als Transkriptionsaktivator mit dem phageneigenen σ-Faktor Gp 55 interagiert
(Rabussay & Geiduschek, 1977). Die von unglukosylierter DNA ausgehende späte
Transkription hingegen verläuft unabhängig von der Replikation. Auch die Proteinsynthese an
sich ist verändert. So wird beispielsweise Gp 32, ein an der Replikation beteiligtes DNAEinzelstrang-bindendes Protein, übermäßig produziert (Revel, 1983).
Die Auswirkungen der Glukosylierung insbesondere auf die Replikation und die späte
Transkription werden auch in E. coli rifB2 Zellen sichtbar, die eine Mutation im Gen der
RNA Polymerase tragen und dadurch die T4 Vermehrung verzögern (Revel, 1983). Dieser
Effekt kann durch bestimmte T4 Mutanten supprimiert werden; dazu gehören Mutationen, die
die β-Glukosyltransferase oder die “sliding clamp” Gp 45 inaktivieren. Der Mechanismus, der
dieser Suppression zugrunde liegt, ist allerdings noch nicht verstanden.
An dieser Stelle wird deutlich, wie wenig eigentlich über die Funktion, den
Reaktionsmechanismus und die Regulation der α- und β-Glukosyltransferasen des
Bakteriophagen T4 bekannt ist.
1.5 Aufgabenstellung
Die Wirts-Parasit-Beziehung von E. coli und T4 ist ein Paradebeispiel für Angriff und
Verteidigung, das durch komplexe Regulationsmechanismen auf verschiedenen Ebenen
stattfindet. Einen wichtigen Aspekt des T4 Abwehrsystems stellt dabei die Glukosylierung der
Phagen DNA dar. Diese postreplikative Modifikation wird durch zwei phageneigene Enzyme,
die α- und die β-Glukosyltransferase (AGT und BGT), katalysiert. Sie verhindert eine
Degradation des T4 Genoms und greift außerdem regulierend in die Genexpression ein.
Während die β-Glukosyltransferase bezüglich ihrer Struktur und ansatzweise auch in ihrem
Reaktionsmechanismus beschrieben ist, sind über die α-Glukosyltransferase bisher nur
wenige Enzymdaten bekannt.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher eine genauere Charakterisierung der AGT erfolgen.
Um eine Aussage über die Struktur des Enzyms treffen zu können, wurden zwei Strategien
verfolgt. Die Kristallisation der α-Glukosyltransferase sollte eine anschließende Bestimmung
ihrer Röntgenbeugungsdaten ermöglichen. Dafür musste zunächst ein Reinigungsverfahren
15
Einleitung
etabliert werden, mit dem sich das Protein in der für diese Strukturanalyse erforderlichen
Qualität isolieren ließ. Parallel dazu sollte die Struktur des Enzyms durch die Berechnung
eines dreidimensionalen Modells vorhergesagt werden.
Auf der Grundlage dieser Daten könnte dann die ortsspezifische Mutagenese einzelner
Aminosäuren einen Beitrag zur Aufklärung des Reaktionsmechanismus der AGT leisten. Der
Vergleich mit Strukturdaten anderer Glykosyltransferasen sollte dabei die Auswahl der
auszutauschenden Positionen erleichtern. Insbesondere die T4 β-Glukosyltransferase kam
dafür in Frage, da dieses Enzym bereits mit seinem Substrat co-kristallisiert werden konnte.
Als zweite Problemstellung sollte die Regulation der DNA-Glukosylierung eingehender
betrachtet werden. Wie bei allen gradzahligen T-Phagen ist auch bei T4 das Verhältnis der αzur β-Glukosylierung strikt festgelegt. Wofür diese Regulation notwendig ist und welcher
Mechanismus ihr zugrunde liegt, ist bisher noch nicht verstanden. Die Beantwortung dieser
Fragen könnte die DNA-Modifikation möglicherweise in einen größeren Zusammenhang
innerhalb der streng kontrollierten Phagenentwicklung stellen.
16
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien und Enzyme
Soweit nicht anders angegeben, wurden Chemikalien der Firmen J. T. Baker (Groß-Gerau),
Boehringer (Mannheim), Biomol (Hamburg), BioRad (Richmond, USA), Biozym (Hessisch
Oldendorf), Gibco BRL (Gathersburg, USA), Merck (Darmstadt), Riedel-de Hæn (Hannover),
Pharmacia (Freiburg), Promega (Madison, USA), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und
Sigma (St.Louis, USA) verwendet.
Restriktionsenzyme, Taq-Polymerase, alkalische Phosphatase und T4 DNA Ligase wurden
von den Firmen Gibco BRL (Gathersburg, USA), MBI/Fermentas (St. Leon-Rot) und Qiagen
(Hilden) bezogen. Radiochemikalien stammten von der Firma NEN (Boston, USA).
2.2 Geräte und Verbrauchmaterialien
Chromatographie-Material
Talon Metal Affinity Resin (Clontech, Heidelberg), His⋅Bind Resin (Novagen, Schwalbach/
Ts.), Ni-NTA Magnetic Agarose Beads (Qiagen,
Hilden)
Dialyseschläuche
Ausschlussgröße 12-16 kDA, Membrantyp 20
(Biomol, Hamburg)
Elektrophoresegeräte
Agarosegel-Kammern und Zubehör (Werkstätten
der RUB)
Mini-Protean II (BioRad, Richmond, USA)
Power Pac 300 (BioRad, Richmond, USA)
Geltrockner
Gel AirDryer (BioRad, Richmond, USA)
HPLC
UVD 320 S, Degasys DG1310, Pumpe
Modell 480 (Gynkotek, Germering)
Inkubationsschüttler und -roller
New Brunswick Scientific G10, Gio Gyrotory
Shaker
(New
Brunswick
Scientific,
New
Brunswick, Can, Werkstätten der RUB)
IPG-Streifen
ReadyStrip pH 3 – 10, 7 cm lang (BioRad,
Richmond, USA)
17
Material und Methoden
Molekularbiologische Kits
Nucleospin Extract (Macherey-Nagel, Düren)
Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel, Düren)
Quickchange™ Site-Directed Mutagenesis Kit
(Stratagene, La Jolla, USA)
Molekulargewichtsmarker
100 bp Leiter (MBI/Fermentas, St. Leon-Rot)
10 kDa Leiter (Gibco BRL, Gathersburg, USA)
Nukleotide
(Peqlab, Erlangen)
PCR Mini-Cycler™
MJ Research PTC-150 (Biozym, H. Oldendorf)
pH-Meter
Typ pH 526 (WTW, Weilheim)
PVDF-Membran
Immobilon-P (Millipore, Bedford, USA)
Röntgenfilm
Fuji Medical X-Ray Film (Fuji, Tokyo, Japan)
Scintillationszähler
LS6000TA (Beckman, Fullerton, USA)
Scintillationsflüssigkeit
Ultima Gold (Packard, Groningen, Niederlande)
Spektrophotometer
Navaspec II, Pharmacia, Freiburg
Spektropolarimeter
J-715 (Jasco, Groß-Umstadt)
Ultraschallgerät
Branson Sonifier 250 (Branson, Ranbury, USA)
Videodokumentation
GelPrint 2000i (Uni Equip, München)
Western-Blot Apparatur
Mini
Trans-Blot
Transfer
Cell
(BioRad,
Richmond, USA)
Whatman-Filter
Whatman 540 (Whatman, Baston, UK)
Zentrifugen
Biofuge 13 (Heraeus, Osterode)
Sorvall® RC-5B (Du Pont, Bad Homburg)
Alle weiteren hier nicht aufgeführten Geräte und Verbrauchsmaterialien entsprachen dem
Laborstandard.
2.3 Oligonukleotide
Die Synthese der zur PCR verwendeten Oligonukleotide erfolgte von der Firma Gibco BRL
(Gathersburg, USA). Cy5-markierte Oligonukleotide wurden von Pharmacia (Freiburg)
bezogen.
18
Material und Methoden
Oligonukleotide zur Amplifikation und Klonierung
AGT-Kpn3’
5’-GGGGTACCCCTTATTTTGTAATAATGTC-3’
AGT-Bgl5’
5’-GAAGATCTATGCGTATTTGCATTTTTATGG-3’
ModA-Bam5’ 5’-GGATCCATGAAATACTCAGTAATG-3’
ModA-Xho3’ 5’-CCTCGAGTTATAGATTAAATCCTTC-3’
Oligonukleotide zur Mutagenese
Die Positionen, die zu einem Basenaustausch führten, sind unterstrichen.
E22A-sense
5’-GGTGTAACAAAATTCTCACTCGCTCAACGTGATTGG-3’
E22A-anti
5’-CCAATCACGTTGAGCGAGTGAGAATTTTGTTACACC-3’
S106A-sense 5’-GATAATATTAAACCTGCTATTCGTGTTGTAGTTTATCAGC-3’
S106A-anti
5’-GCTGATAAACTACAACACGAATAGCAGGTTTAATATTATC-3’
M231A-sense 5’-GCTGGTAAATCCACTGTAGCTGAAGGTCTGGAACGTTCC-3’
M231A-anti
5’-GGAACGTTCCAGACCTTCAGCTACAGTGGATTTACCAGC-3’
R236A-sense 5’-CTGTAATGGAAGGTCTGGAAGCTTCCCCTGCTTTTATTGC-3’
R236A-anti
5’-GCAATAAAAGCAGGGGAAGCTTCCAGACCTTCCATTACAG-3’
R256A-sense 5’-CGTATGAATATTACGGTAATGCTGAGATTGATAAAATGAATCTCG-3’
R256A-anti
5’-GAGATTCATTTTATCAATCTCAGCATTACCGTAATATTCATACG-3’
I276A-sense 5’-GCACAAATCCTAGATTGTTATGCTAATAGTGAAATGC-3’
I276A-anti
5’-GCATTTCACTATTAGCATAACAATCTAGGATTTGTGC-3’
N297A-sense 5’-GGATATCAGTTGAGTAAACTTGCTCAGAAATACTTACAACGC-3’
N297A-anti
5’-GCGTTGTAAGTATTTCTGAGCAAGTTTACTCAACTGATATCC-3’
E311A-sense 5’-CGAATATACTCATCTCGCTCTTGGTGCATGTGGAACAATTCC-3’
E311A-anti
5’-GGAATTGTTCCACATGCACCAAGAGCGAGATGAGTATATTCG-3’
Cy5-markierte Oligonukleotide
prob-forward
5’-TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC-3’
prob-back
5’-CAGGCTGAAAATCTTCTCTCATCC-3’
19
Material und Methoden
2.4 Bakterien und Phagen
Bakterienstamm Genotyp
Herkunft
E. coli XL1-blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 Stratagene
Referenz
(Bullock et al., 1987)
supE44 relA1 lac
[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]
E. coli BB
Wildtyp
Stammsammlung
E. coli W4597
galU- r+ rgl+
L. Snyder
(Runnels & Snyder,
1978)
Phagenstamm
Genotyp
Herkunft
T4
Wildtyp
Stammsammlung
T4*
Wildtyp
entsteht durch Vermehrung von
T4 Wildtyp Phagen in E. coli W4597
T4 alc
42- (amC87), 56- (amE51),
Stammsammlung
denB– (amS19), alc (unf39)
2.5 Plasmide
Vektor
relevante Eigenschaften
Herkunft
Referenz
pBluescript KS II
lacZ, Ampr
Stratagene
(Short et al., 1988)
pProEX HTb
Polyhistidin-kodierende
Gibco BRL (Sambrook et al.,1989)
Region, Promotor pTrc, Ampr
pProEX HTb-agt
pProEX HTb mit agt,
diese Arbeit
kloniert über BamHI und KpnI
20
Material und Methoden
2.6 Nährmedien
LB-Medium
2YT-Medium
1 % (w/v) Pepton
1,6 % (w/v) Pepton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v) Hefeextrakt
1 % (w/v) NaCl
0,5 % (w/v) NaCl
pH 7,5
pH 7,5
SOC-Medium
PAGFe-Medium
2 % (w/v) Pepton
50
mM
Na2HPO4
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
22
mM
KH2PO4
10 mM
NaCl
19
mM
NH4Cl
2,5 mM
KCl
27,5 mM
Glukose
10 mM
MgCl2
135 µM
MgSO4
20 mM
Glukose
0,01 mM
FeCl3
pH 7,0
TBY-Medium
1 % (w/v) Pepton
0,5 % (w/v) Hefeextrakt
0,5 % (w/v) NaCl
pH 7,5
Für die Herstellung von Festplattenagar wurde dem jeweiligen Medium 1,5 % (w/v) BactoAgar zugesetzt. Selektivmedien enthielten 50 µg/ml Ampicillin bzw. 10 µg/ml Tetracyclin.
2.7 Arbeiten mit Bakterien und Phagen
2.7.1 Anzucht von Bakterien
Die Anzucht von Übernacht-Flüssigkulturen erfolgte in 5 – 20 ml LB-Medium bei 37 °C im
Inkubationsroller oder –schüttler (180 Upm). Gegebenenfalls wurden dem Medium zur
Selektion Antibiotika zugesetzt.
21
Material und Methoden
2.7.2 Herstellung kompetenter Zellen für die Hitzeschocktransformation mittels CaCl2
nach Dagert & Ehrlich (1979)
400 ml LB-Medium wurden 1%ig mit einer Bakterienübernachtkultur angeimpft und bei
37 °C unter Schütteln (180 Upm) bis zu einer optischen Dichte O.D.590 von 0,375 angezogen.
Nach anschließender Sedimentation (7 min, 1600 g, 4 °C) erfolgte die Resuspension der
Zellen in 40 ml eiskalter CaCl2-Lösung. Es schloß sich eine weitere Zentrifugation (5 min,
1100 g, 4 °C) an. Nach Wiederholung dieses Waschschritts wurden die Zellen in 8 ml
eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert und in Aliquots von 200 µl bei –80 °C eingefroren.
2.7.3 Transformation, modifiziert nach Cohen et al. (1972)
100 µl hitzeschockkompetenter Zellen wurden mit ca. 1 µg Plasmid DNA bzw. 10 µl eines
Ligationsansatzes vermischt und 10 min auf Eis inkubiert. Daraufhin erfolgte ein 2 minütiger
Hitzeschock bei 42 °C und die sofortige Zugabe von 1 ml SOC-Medium. Nach
anschließender phänischer Expression (45 min, 37 °C) wurde der Transformationsansatz auf
geeignetem Selektionsagar ausplattiert .
2.7.4 Anzucht und Induktion von Zellen zur Überexpression von Proteinen
E. coli XL1-blue kompetente Zellen wurden mit dem entsprechenden Plasmid transformiert
(siehe 2.7.3), über Nacht angezogen (siehe 2.7.1) und dann in frischem Selektiv-2YT-Medium
(siehe 2.6) bis zu einer optischen Dichte O.D.590 von 0,4 – 0,6 bei 37 °C im
Inkubationsschüttler angezogen. Die Induktion der Überexpression erfolgte durch Zugabe von
0,5 mM IPTG. Nach einer weiteren Inkubation für 2 - 3 h wurden die Zellen durch
Zentrifugation (20 min, 4000 g, 4 °C) geerntet und anschließend bei –20 °C aufbewahrt.
2.7.5 Zellaufschluß mittels Ultraschall
Die geernteten Zellen (siehe 2.7.4) wurden in Talon Extraktionspuffer (6 ml / g Zellen)
aufgenommen und durch Ultraschall (90 Watt, 8 x 1 min im Minutenabstand) im Eisbad
22
Material und Methoden
aufgeschlossen. Daraufhin erfolgte die Trennung der löslichen Proteine von der unlöslichen
Fraktion durch Zentrifugation (14.000 x g,
30 min, 4 °C). Zur Aufreinigung des
überexprimierten Proteins aus der löslichen Fraktion wurde der Überstand filtriert
(Zellulosefilter (0,45 µm) der Firma Roth, Karlsruhe) und sofort dem nächsten
Reinigungsschritt unterzogen (siehe 2.9.6). Für die Analyse der Proteinverteilung in der
unlöslichen Fraktion mittels SDS-Polyacrylamid-Gelektrophorese (siehe 2.9.2) erfolgte eine
Resuspension des Zellsediments in Talon Extraktionspuffer.
Talon Extraktionspuffer
50
mM
300 mM
NaH2PO4, pH 7,0
NaCl
2.7.6 Anzucht von T4* Phagen
Die DNA von T4* Phagen enthält unglukosyliertes 5’-Hydroxymethyl-Cytosin (HMC),
während das HMC im Genom der T4 Wildtyp Phagen α- bzw. β-glukosyliert ist. T4* Phagen
können durch eine Vermehrung von Wildtyp Phagen in E. coli W4597 erzeugt werden
(Revel, 1983). Diese Wirtszellen tragen einen Defekt im Gen der UDPG Pyrophosphorylase,
die Uridintriphosphate zu UDPG konvertiert. Da aufgrund der Mutation kein UDPG
produziert wird, das als Substrat für die phagenkodierten Glukosyltransferasen dient, bleibt
die neusynthetisierte DNA unglukosyliert.
Eine E. coli W4597 Übernachtkultur in PAGFe-Medium (siehe 2.6) wurde 5 %ig in frisches
PAGFe-Medium überführt und bei 37 °C bis zu einer optischen Dichte O.D.590 von 0,2 im
Inkubationsschüttler angezogen. Bei erreichter Zelldichte erfolgte die Infektion mit T4
Wildtyp Phagen mit einer Multiplizität von 5 bei gleichzeitiger Zugabe von 0,001 %
Tryptophan. Während der folgenden 50 minütigen Inkubation wurde gegebenenfalls
0,0005 % Antischaum (Sigma, Deisenhofen) zugegeben. Die Zugabe von 0,025 %
Chloroform (Inkubation 16 h, 4 °C) bewirkte anschließend den Aufschluß der restlichen, noch
nicht durch Phagen lysierten Zellen. Nach der Sedimentation der Zellreste (10 min, 4000 g,
4 °C) konnten aus dem Überstand die Phagen abzentrifugiert (2 h, 12000 Upm, 4 °C) und in
einem möglichst kleinen Volumen WF-Puffer über Nacht bei 4 °C resuspendiert werden.
23
Material und Methoden
Gegebenenfalls wurde die Sedimentation von Zellresten wiederholt. Die Lagerung der
Phagensuspension erfolgte bei 4 °C.
WF-Puffer
10 mM
Tris-HCl, pH7,4
1
MgCl2
mM
17 mM
NaCl
2.7.7 Anzucht T4 infizierter Zellen
TBY-Medium wurde 1 %ig mit einer E. coli BB Übernachtkultur angeimpft und bis zu einer
optischen Dichte O.D.590 von 1 bei 37 °C bebrütet. Direkt vor der Infektion mit T4 Wildtyp
Phagen (Multiplizität von 10, gleichzeitige Zugabe von 0,001 % Tryptophan) wurde ein
Aliquot von 17 ml aus der Kultur entnommen (Zeitpunkt t = 0 min). Während der Infektion
erfolgten weitere Probenentnahmen in Minutenabständen (t = 1 min, t = 2 min, ..., t = 20 min,
t = 30 min), um in anschließenden Analysen die Proteinzusammensetzung infizierter Zellen in
verschiedenen Infektionsstadien untersuchen zu können. Durch sofortige Zugabe von 5 ml
NaN3-Puffer konnte die Infektion in den entnommenen Proben gestoppt werden.
Anschließend wurden die Zellen sedimentiert (20 min, 4000 g, 4 °C) und bei –20 °C gelagert.
NaN3-Puffer
10 mM
Tris-HCl, pH 7,3
5
MgCl2
mM
10 mM
NaN3
2.8 DNA-Präparationen
2.8.1 Isolierung von Phagen DNA
Die Phagensuspension (siehe 2.7.6) wurde mit dem gleichen Volumen neutralen Phenols
versetzt, 30 min bei 4 °C unter langsamem Drehen des Reaktionsgefäßes inkubiert und
anschließend zentrifugiert (10 min, 10000 Upm, 4 °C). Mit der oberen, DNA-haltigen Phase
24
Material und Methoden
wurde dieser Phenol-Extraktionsschritt zweimal wiederholt und die DNA dann gegen
Dialysepuffer unter mehrmaligen Wechseln des Puffers ca. 20 h dialysiert.
Die Ermittlung der DNA-Konzentration erfolgte photometrisch (O.D.260 = 1 ≙ 50 µg
DNA / ml). In einer anschließenden Restriktionsanalyse (siehe 2.8.3) mit EcoRI konnte
T4* DNA von T4 Wildtyp DNA unterschieden werden, da dieses Enzym nur unglukosylierte
DNA restringiert (siehe 2.7.6 und 2.8.3).
Dialysepuffer:
0,01 M
Tris-HCl, pH 7.4
0,5 mM
EDTA
2.8.2 Plasmidisolierung
Die Isolierung von Plasmid DNA aus Bakterien erfolgte über Silica-Säulen (NucleoSpin
Plasmid) der Firma Machery-Nagel unter Verwendung der mitgelieferten Puffer nach
Angaben des Herstellers.
2.8.3. Enzymatische Modifikationen von DNA
Restriktionen, Ligationen und die Behandlung mit alkalischer Phosphatase erfolgten mit
entsprechenden Enzymen der Firmen Gibco BRL (Gathersburg, USA) und MBI/Fermentas
(St. Leon-Rot) in den mitgelieferten Puffern nach Angaben der Hersteller.
2.8.4 Agarosegelelektrophorese
Die DNA-Proben wurden vor der Elektrophorese mit 10 x DNA-Probenpuffer versetzt.
Anschließend erfolgte die Trennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge und
Konformation zu analytischen oder präparativen Zwecken in 0,8 – 2 %igen Agarosegelen
(SeaKem GTG, Biozym) mit 1 x TAE als Gel- und Elektrophorese-Puffer (5 V / cm,
0,5 - 2 h). Die DNA konnte dann nach einer kurzen Färbung des Gels mit Ethidiumbromid
(1 µg / ml) unter UV-Licht detektiert werden.
25
Material und Methoden
10 x DNA-Probenpuffer
10 x TAE
12
Glycerin
400 mM
Tris-HCl, pH 7,6
Bromphenolblau
10
mM
Essigsäure
2
mM
EDTA
% (w/v)
0,02 % (w/v)
in 1 x TAE
2.8.5 DNA-Elution aus Agarosegelen
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der DNA (siehe 2.8.4) wurde das gewünschte
DNA-Fragment mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten und über eine Silica-Säule
(NucleoSpin Extract) von Macherey-Nagel nach Angaben des Herstellers gereinigt.
2.8.6 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Amplifikation der Gene modA und agt erfolgte mittels PCR. Als Matrize diente
genomische T4 alc DNA. Diese DNA enthält Cytosin anstelle von 5’-Hydroxymethyl-Cytosin
und wurde in unserer Arbeitsgruppe von Frau Aschke-Sonnenborn gereinigt. Die
Reaktionsansätze enthielten 20 ng der DNA-Matrize, 200 µM dNTP-Mix, je 25 pmol der
Startermoleküle (siehe 2.3), 2 mM MgCl2 und 2 Enzymeinheiten Taq-Polymerase (Qiagen,
Hilden) in 1 x PCR-Puffer in einem Reaktionsvolumen von 50 µl. Die Amplifikation erfolgte
nach folgendem Programm:
1)
30 s
95 °C
2)
1 min
30 °C (Amplifikation von agt) bzw. 64 °C (Amplifikation von modA)
3)
1 min
72 °C
4)
gehe zu 1)
25 mal
5)
10 min
72 °C
2.8.7 Aufreinigung von PCR-Produkten
Die PCR-Produkte wurden über Silica-Säulen (NucleoSpin Extract) der Firma MachereyNagel nach Angaben des Herstellers gereinigt. Die Qualität und Quantität der gereinigten
DNA wurde mittels Agarosegelelektrophorese (siehe 2.8.4) überprüft.
26
Material und Methoden
2.8.8 Mutagenese
Die ortsspezifische Mutagenese des Gens agt erfolgte mittels PCR unter Verwendung des
„Quickchange™ Site-Directed Mutagenesis Kit“ (Stratagene) nach Angaben des Herstellers.
Als Startermoleküle dienten die unter 2.3 aufgeführten Oligonukleotide zur Mutagenese,
deren Bezeichnung die durch den Basenaustausch ersetzte Aminosäure und die
Hybridisierung des Oligonukleotids an den “Sense”-Strang bzw. den “Antisense”-Strang
angibt. Die Hybridisierungstemperaturen lagen zwischen 54 °C und 60 °C, jeweils 5 °C unter
der Schmelztemperatur der Startermoleküle. Nach der Amplifikation des als Matrize
dienenden Vektors pProExHTb-agt (siehe 2.5) konnte die methylierte, nicht mutierte
Parental-DNA durch DpnI hydrolysiert und das Mutagenese-Produkt in E. coli XL1-blue
transformiert werden. Zur Identifizierung positiver Klone erfolgte eine Plasmidisolierung
(siehe 2.8.2) mit anschließender Sequenzierung (siehe 2.8.9).
Amplifikationsprogramm:
1)
30 s
95 °C
2)
1 min
54 °C – 60 °C
3)
12 min
68 °C
4)
gehe zu 1)
16 mal
2.8.9 DNA-Sequenzierung
Die DNA-Sequenzierung mittels eines A.L.F.-Express (Pharmacia, Freiburg) wurde von Frau
Tolle am Lehrstuhl für molekulare Neurobiochemie der Ruhr-Universität nach der
Didesoxymethode (Sanger et al., 1977) durchgeführt. Dabei wurden das „AutoRead
Sequencing Kit“ (Pharmacia, Freiburg) und die unter 2.3 aufgeführten MutageneseOligonukleotide bzw. die Cy5-markierten Oligonukleotide verwendet. Während der
Auftrennung
der
Fluoreszenz-markierten
Reaktionsprodukte
in
einem
5,5 %igen
Polyacrylamidgel mit 6 M Harnstoff erfolgte ihre Detektierung durch Anregung mit einem
Laserstrahl (Ansorge et al., 1986; Ansorge et al., 1987).
27
Material und Methoden
2.8.10 Herstellung von Vektoren mit T-Überhang nach Marchuk et al. (1991),
verändert nach Hadjeb & Berkowit (1996)
Mit
einer Taq-Polymerase amplifizierte PCR-Produkte besitzen 3’-terminal einen
A-Überhang und können daher effizient in einen Vektor mit einem T-Überhang am 3’-Ende
kloniert werden. Die Herstellung sogenannter „T-Vektoren“ erfolgte durch den Verdau des
Vektors pBKS mit EcoRV (Reaktionsvolumen 40 µl) und die Verlängerung des 3’-Endes um
ein Thymin durch Inkubation des Restriktionsansatzes mit 5 Units Taq-Polymerase (Qiagen,
Hilden) und 20 mM dTTP in PCR-Puffer (Qiagen) in einem Volumen von 100 µl (2 h,
72 °C). Daraufhin konnte die DNA durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion (Sambrook et
al., 1989) mit anschließender Ethanolfällung (Sambrook et al., 1989) von Proteinen gereinigt
werden. Mit der in 5 mM Tris-HCl, pH 8,5 resuspendierten DNA wurde eine Selbstligation
(siehe 2.8.3) durchgeführt, um dann in einer Agarosegelelektrophorese die T-Vektoren von
den religierten pBKS-Vektoren zu trennen (siehe 2.8.4) und aus dem Gel zu eluieren (siehe
2.8.5).
2.9 Methoden zur Aufreinigung und Analyse von Proteinen
2.9.1 Bestimmung von Proteinkonzentrationen
Die Bestimmung der Proteinkonzentration in Proteingemischen erfolgte kolorimetrisch nach
Bradford (1976). Dazu wurde die Probe mit Wasser in einem Volumen von 200 µl verdünnt,
mit 2 ml Bradford-Reagenz versetzt und die optische Dichte nach 10 minütiger Inkubation bei
einer Wellenlänge von 595 nm bestimmt. Die Proteinkonzentration konnte dann anhand einer
mit Rinderserumalbumin erstellten Eichgerade ermittelt werden.
Die Konzentration von gereinigtem Protein wurde mit dem BCA-200 Protein Assay Kit der
Firma Pierce (Illinois, USA) nach Angaben des Herstellers bestimmt.
Bradford-Reagenz
0,01 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G250
4,75 %
Ethanol
8,5 %
Phosphorsäure
28
Material und Methoden
2.9.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (1970)
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen erfolgte mit dem Mini Protean II System
der Firma BioRad (Richmond, USA) nach Angaben des Herstellers. Das diskontinuierliche
Gelsystem bestand aus einem 13 %igen Trenngel und einem 4 %igen Sammelgel. Zur
Denaturierung wurden die Protein-Proben in 1 x SDS-Probenpuffer 5 min gekocht; die
folgende Elektrophorese in SDS-Laufpuffer dauerte ca. 45 min bei 200 V. Anschließend
erfolgte die Färbung des Trenngels mit Coomassie Brillant Blue (siehe 2.9.3) oder mit
Silbernitrat (siehe 2.9.4).
4 %iges Sammelgel
13 %iges Trenngel
0,5 ml
Rotiphorese Gel 29:1 (Polyacrylamid 40 %)
2,6 ml
Rotiphorese Gel 29:1
1,25 ml
4 x Sammelgelpuffer
2 ml
4 x Trenngelpuffer
3,25 ml
A. dest
3,4 ml
A. dest.
40
µl
20 % (w/v) SDS
40 µl
20 % (w/v) SDS
40
µl
10 % (w/v) APS
40 µl
10% (w/v) APS
20
µl
TEMED
20 µl
TEMED
4 x Sammelgelpuffer:
4 x Trenngelpuffer:
0,5 M
1,5 M
Tris-HCl, pH 6,8
Tris-HCl, pH 8,8
SDS-Laufpuffer:
5 x SDS-Probenpuffer:
190 mM
Glycin
10
% (v/v)
Glyzerin
25
Tris
5
% (v/v)
β-Mercaptoethanol
0,1 % (w/v) SDS
3
% (w/v) SDS
mM
0,5 % (w/v) Bromphenolblau
62,5 mM
Tris-HCl, pH 6,8
29
Material und Methoden
2.9.3 Färbung von Polyacrylamidgelen mit Coomassie Brillant Blue
Zur Anfärbung der Proteinbanden im Polyacrylamidgel wurde das Gel nach der
Elektrophorese 10 min in der Coomassie-Färbelösung unter Schütteln inkubiert und der
Gelhintergrund anschließend mit der Entfärbelösung unter mehrmaligem Wechseln der
Lösung 1-2 h entfärbt.
Coomassie-Färbelösung:
Entfärbelösung:
0,25 % (w/v) Coomassie Brillant Blue G 250
30 % (v/v)
Methanol
9
7,5 % (v/v)
Essigsäure
% (v/v) Methanol
45,5 % (v/v) Essigsäure
2.9.4 Färbung von Polyacrylamidgelen mit Silbernitrat nach Blum et al. (1987),
modifiziert nach Nesterenko et al. (1994)
Es wurden zwei unterschiedliche Protokolle zur Silbernitrat-Färbung verwendet.
a)
Nach 5 minütiger Inkubation in der Fixierlösung wurde das Gel mit A. bidest gespült (3 x 5 s,
1 x 5 min, 3 x 5 s), dann mit 50 %igem (v/v) Aceton (5 min) und 0,017 %iger (w/v) Na2S2O3Lösung (1 min) vorbehandelt und wieder gespült (3 x 5 s). Anschließend erfolgte die Färbung
des Gels in der Färbelösung (8 min) und ein erneutes Spülen mit A. bidest (2 x 5 s). Die
Entwicklung in der Entwickler-Lösung dauerte 10 - 30 s und wurde mit 1 %iger Essigsäure
gestoppt.
Fixierlösung
50 %
Färbelösung
Aceton
1,25 % (w/v) TCA
0,0154 %
0,27 % (w/v) AgNO3
3,7 %
Formaldehyd
Formaldehyd
Entwickler-Lösung
1,6 % (w/v)
Na2CO3
0,0154 %
Formaldehyd
0,004 % (w/v) Na2S2O3
30
Material und Methoden
b)
Das Gel wurde für mindestens 1 h fixiert (40 % Methanol, 10 % Essigsäure), dann zweimal
mit 30 % Ethanol und einmal mit A. bidest jeweils 20 min gewaschen und anschließend 1 min
in 0,02 % (w/v) Na2S2O3 inkubiert. Nach erneutem Waschen mit A. bidest (3 x 20 s) erfolgte
die Färbung in 0,2 % (w/v) AgNO3, 0,0074 % Formaldehyd für 20 min, ein weiterer
Waschschritt (A. bidest, 3 x 20 s) und die Entwicklung des Gels (1 – 5 min in 3 % (w/v)
Na2CO3, 0,05 % Formaldehyd, 0,0005 % Na2S2O3). Anschließend wurde das Gel in A. bidest
gewaschen (1 x 20 s), die Entwicklungsreaktion dann mit 1 % Glycin gestoppt (5 min) und
das Gel schließlich noch mal in A. bidest inkubiert (3 x 10 min).
2.9.5 Transfer von Proteinen auf Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen und
Nachweis des “His-tag” (“Western Blot”)
Die in einem SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine (siehe 2.9.2) wurden in einer
Mini-Trans-Blot-Kammer (BioRad) auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Äquilibrierung
des SDS-Gels erfolgte für 5 min in Transferpuffer, während die Membran für 3 s in Methanol,
dann 1 – 2 min in A. dest und anschließend in Transferpuffer (2 - 3 min) getaucht wurde. Der
Proteintransfer auf die Membran wurde zuerst bei 150 mA für 15 min und dann bei 300 mA
für 30 min durchgeführt.
Der Nachweis von “His-tag”-Proteinen erfolgte mit Hilfe des “Ni-NTA HRP Konjugats” der
Firma Qiagen (Hilden). Dazu wurde die Membran in TBS-Puffer (2 x 10 min) gewaschen,
dann in Blocking Puffer inkubiert (1 h) und noch mal in TBS-Tween gewaschen (3 x 10 min).
Nach einstündiger Inkubation der Membran in “Ni-NTA HRP Konjugat” (Verdünnung
1:1000 in TBS-Tween, Qiagen) und erneutem Waschen (3 x 10 min TBS-Tween) erfolgte die
Detektion durch Zugabe von je 0,5 ml ECL-Lösung 1 und 2 (Amersham Pharmacia, Freiburg)
und eine anschließende Exposition auf einem Röntgenfilm.
Zur Färbung sämtlicher Proteine konnte die Membran schließlich in Blot-Färbelösung gefärbt
und danach entfärbt werden.
31
Material und Methoden
Transferpuffer (Dunn Carbonat Puffer)
TBS (Tween)
10 mM
NaHCO3
10
3 mM
Na2CO3
150 mM
NaCl
20 %
Methanol
(0,05 %
Tween 20)
mM
Tris-HCl, pH 7,5
Blocking Puffer
3 % (w/v)
RSA in TBS
Blot-Färbelösung
Entfärbelösung
0,1% (w/v) Coomassie Brillant Blue R 250
30 %
Methanol
45 %
Methanol
7,5 %
Essigsäure
10 %
Essigsäure
2.9.6 Reinigung von Proteinen mittels zweistufiger Metallaffinitätschromatographie
Die Metallaffinitätschromatographie nutzt die hohe Affinität der Aminosäure Histidin zu
zweiwertigen Ionen aus. Die Klonierung in spezielle Überexpressionsvektoren, die vor oder
hinter der multiplen Klonierungsstelle eine Polyhistidin-kodierende Region enthalten, erlaubt
die Überexpression sogenannter “His-tag”-Proteine, die am C- oder N-Terminus eine Abfolge
von 6 bis 10 Histidinen aufweisen.
Die Reinigung von Proteinen mit “His-tag” erfolgte über zwei Matrizes, zunächst über eine
Sepharose mit immobilisiertem Kobalt (“Talon Metal Affinity Resin” der Firma Clontech)
und anschließend über ein Nickel-enthaltendes Säulenmaterial (“His⋅Bind Resin” der Firma
Novagen).
Die aus induzierten Zellen extrahierte lösliche Proteinfraktion (siehe 2.7.4) wurde über die
Talon-Sepharose gegeben; nicht gebundene Proteine konnten mit einem pH-Gradienten (4 SV
(Säulenvolumina) Talon Waschpuffer pH 7,0; 4 SV Talon Waschpuffer pH 6,3; 2 SV Talon
Waschpuffer pH 6,2) entfernt werden. Die Elution des “His-tag”-Proteins erfolgte in
10 Fraktionen mit je 2 SV Talon Elutionspuffer pH 6,0. Die Reinigung wurde in SDSPolyacrylamid-Gelen überprüft (siehe 2.9.2), die das gewünschte Protein enthaltenden
Fraktionen vereinigt und über Nacht gegen 0,5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 7,9 dialysiert.
Anschließend erfolgte die weitere Reinigung des Dialysats nach Zugabe von 5 mM Imidazol
über die His⋅Bind-Sepharose. Nach drei Waschschritten mit einem Imidazolgradienten (je
32
Material und Methoden
10 SV His⋅Bind Waschpuffer mit 5 mM Imidazol; 20 mM Imidazol, bzw. 60 mM Imidazol)
wurde das gebundene Protein in 4 Fraktionen mit 100 mM Imidazol und 8 Fraktionen mit
200 mM Imidazol (His⋅Bind Elutionspuffer Fraktionsvolumen je 0,5 SV) eluiert. Über eine
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese konnte die Reinigung überprüft werden (siehe 2.9.2).
Die Fraktionen, die das aufzureinigende Protein enthielten, wurden vereinigt und über Nacht
gegen 50 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 50 % Glyzerin, pH 8,0 dialysiert. Die gewünschte
Proteinkonzentration konnte durch Einengen des Proteins in “Eppendorf Centrifugal Filter
Tubes” (MWCO 10 kD, Eppendorf, Hamburg) nach Angaben des Herstellers eingestellt
werden.
Talon Waschpuffer
Talon Elutionspuffer
50
NaH2PO4, pH 7,0; 6,3 und 6,2
50
NaCl
300 mM
mM
300 mM
mM
NaH2PO4, pH 6,0
NaCl
His⋅Bind Waschpuffer
His⋅Bind Elutionspuffer
20
mM
Tris-HCl, pH 7,9
20
mM
Tris-HCl, pH 7,9
500
mM
NaCl
500
mM
NaCl
Imidazol
100 – 200 mM
5 – 60 mM
Imidazol
2.9.7 Aktivitätstest
Die enzymatische Aktivität der gereinigten Proteine wurde anhand des Transfers von
14
C-Glukose von UDPG auf T4* DNA bestimmt. Ein Reaktionsansatz enthielt 0,01 – 2 µg
Protein, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM ß-Mercaptoethanol, 2,5 – 50 µM UDPG (davon
20 % radioaktives UDPG, spez. Aktivität 320 mCi/mmol) und 12 µg T4* DNA in einem
Volumen von 100 µl. Nach einer Inkubation für 15 min bei 30 °C wurde der Reaktionsansatz
unter Vakuum auf Whatman 540 Filter gesogen, der Filter 3 x 10 min in 0,5 M NaH2PO4,
pH 7,0 gewaschen und luftgetrocknet.
Anschließend konnte die Radioaktivität auf dem Filter in 8 ml Szintilationsflüssigkeit im
Szintilationszähler quantifiziert werden.
33
Material und Methoden
2.9.8 Nachweis von Proteininteraktionen über magnetische Agarose-Partikel
Genauso wie bei der Metallafinitätschromatographie (siehe 2.9.6) wird bei der Anwendung
der “Ni-NTA Magnetic Agarose Beads“ (Qiagen, Hilden) die Affinität von Histidinresten zu
zweiwertigen Ionen ausgenutzt. Diese Partikel enthalten einen magnetischen Anteil und mit
Nickel beladene NTA-Gruppen, an die Proteine über eine Poly-Histidin-Sequenz binden
können. Mit dieser Methode können Proteininteraktionen nachgewiesen werden, indem
interagierende Proteine an das an die Partikel gebundene Protein binden und dann gemeinsam
mit ihm durch eine hohe Imidazolkonzentration oder einen niedrigen pH-Wert eluiert werden.
Mit der α-Glukosyltransferase interagierende Proteine sollten aus T4 infizierten E. coli Zellen
(siehe 2.7.7) nachgewiesen werden. Dazu erfolgte ein Aufschluß der Zellen in 1 ml
Interaktionspuffer mittels Ultraschall (2 min, 4 °C, 50 % duty, 40 Watt) mit anschließender
Zentrifugation (14.000 x g, 30 min, 4 °C) zur Trennung der löslichen und unlöslichen
Proteinfraktionen.
20 µg der gereinigten α-Glukosyltransferase wurden in 200 µl Interaktionspuffer an 6 µg der
Partikel gebunden (1 h bei 4 °C, leichtes Schütteln). Überschüssiges Protein konnte entfernt
werden, indem die Komplexe magnetisch an die Wand des Reaktionsgefäßes gezogen wurden
(1 min, RT) und der Überstand abgenommen wurde. Nach dem gleichen Verfahren schloss
sich ein Waschschritt mit 200 µl Interaktionspuffer an. 200 µl der löslichen Proteinfraktion
aus dem Zellextrakt T4 infizierter Zellen (Proteingehalt: 2 mg / ml) wurden dann dem
Reaktionsansatz zugegeben und unter leichtem Schütteln für 1 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach drei Waschschritten mit je 200 µl Interaktionspuffer konnten anschließend die
AGT und mit ihr interagierende Proteine in 25 µl Elutionspuffer eluiert werden. In einer SDSPolyacrylamidgelelektrophorese (siehe 2.9.2) wurden die einzelnen Fraktionen schließlich
analysiert.
Die Interaktion der α -Glukosyltransferase mit rekombinanten Proteinen erfolgte nach dem
gleichen Verfahren. Anstelle des Zellextraktes wurden 20 µg des als Interaktionspartner
angebotenen Proteins eingesetzt.
Interaktionspuffer
Elutionspuffer
50
mM
NaH2PO4
50
mM
NaH2PO4
300
mM
NaCl
300
mM
NaCl
20
mM
Imidazol
250
mM
Imidazol
Tween
0,005 %
0,005 %
pH 8,0
Tween
pH 8,0
34
Material und Methoden
2.9.9 Nano-Elektrospray-Ionisation-Massenspektrometrie
Die massenspektrometrischen Untersuchungen zur Proteinidentifikation wurden von Dr.
Markus Piotrowski am Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie (Ruhr-Universität Bochum)
durchgeführt. Zunächst wurde aus einem SDS-Polyacrylamidgel (siehe 2.9.2) die Gelbande
des zu identifizierenden Proteins ausgeschnitten. Anschließend erfolgte die Proteinhydrolyse
mittels Trypsin im SDS-Polyacrylamidgel nach (Jensen et al., 1999). Die Peptide wurden
durch Umkehrphasen-Festphasenextraktion mit Zip-Tips C18 (Millipore) nach Angaben des
Herstellers entsalzt und mit 1 µl 60 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure eluiert. Die
Analyse erfolgte dann mit einem Quadrupol-Flugzeitmessungs-Hybrid-Massenspektrometer
(QTOF2, Micromass, Manchester, UK). Einzelne Peptide konnten im MS-MS-Modus
sequenziert und mit Hilfe einer Datenbankrecherche (www.matrixscience.com) identifiziert
werden (Perkins et al., 1999).
2.9.10 Chromatographische Trennung von UDP und UDPG mittels HPLC
Die Fähigkeit der gereinigten Proteine, UDPG zu spalten, wurde in Reaktionsansätzen mit
10 – 100 µg Protein, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM ß-Mercaptoethanol und 1 mM UDPG
in einem Volumen von 100 µl untersucht. Nach 16-stündiger Inkubation bei 30 °C wurden
20 µl eines Reaktionsansatzes auf eine HPLC C18-Säule (Nucleosil5 C18 100A, 250 x 4 mm,
Phenomenex, Aschaffenburg) gegeben. Die Elution erfolgte unter isokratischen Bedingungen
in 25 mM Kaliumphosphat, pH 6,4, 2 mM 11-Amidoundecansäure, 8 % Methanol und einer
Flussrate von 1 ml / min. UDP und UDPG konnten bei einer Wellenlänge von 265 nm
(Referenzwellenlänge 600 nm, Bandweite jeweils 2,0 nm) während einer Detektionszeit von
5 min nachgewiesen werden.
Für die Aufnahme eines Absorptionsspektrums von UDP und UDPG wurde über einen
Wellenlängenbereich von 200 nm bis 300 nm gemessen.
35
Material und Methoden
2.9.11 DNA-Retardation
In Metaphoragarosegelen (16 x 24 cm, 1,5 % Metaphor® Agarose (Biozym), 0,5 µg/ml
Ethidiumbromid) wurden die DNA-Bindungseigenschaften der gereinigten Proteine
untersucht. Dazu wurden 0,5 – 10 µg Protein in 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 80 mM
ß-Mercaptoethanol mit 50 ng DNA mit bzw. ohne 2 mM UDPG für 20 min bei 4 °C
inkubiert, mit DNA-Probenpuffer (siehe 2.8.4) versetzt und auf das Gel aufgetragen. Die
Elektrophorese erfolgte in TAE-Puffer (siehe 2.8.4) mit 0,5 µg / ml Ethidiumbromid zunächst
für 20 min bei 100 V und dann für 160 min bei 180 V. Unter UV-Licht konnte die DNA
anschließend detektiert werden.
2.9.12 Analyse von Proteinsekundärstrukturen mittels CD-Spektroskopie
Optisch aktive Substanzen haben für links- und rechtsdrehendes polarisiertes Licht
unterschiedliche Brechungsindizes, wobei die Drehung der Polarisationsebene von der
Schichtdicke und der Konzentration der Probe abhängig ist (Greenfield, 1996). Dieser Effekt
wird bei der Circulardichroismus (CD) Spektroskopie ausgenutzt.
Aufgrund ihrer Chiralität besitzen die Sekundärstrukturen in Proteinen sehr charakteristische
CD-Spektren, die in einem Spektralbereich von 160 bis 250 nm gemessen werden (Johnson,
1990). Die Verteilung der Sekundärstrukturen in einem Protein kann daher durch
mathematische Anpassung des CD-Spektrums an die CD-Spektren reiner α-Helices,
β-Faltblätter und reiner Knäuelstrukturen analysiert werden. Als Referenz können auch
CD-Daten von Proteinen mit bekannter Strukturverteilung dienen.
Vor der Aufnahme der CD-Spektren wurden die Proteine gegen 5 mM NaH2PO4, pH 8,0
dialysiert und auf eine Proteinkonzentration von 0,03 mg / ml eingestellt. Die Spektroskopie
erfolgte dann am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen (Prof. Dr. Rögner). Nach der
Äquilibrierung des Spektropolarimeters mit flüssigem Stickstoff erfolgte die Messung in einer
Quarzküvette (Schichtdicke: 0,2 cm) mit folgenden Parametern:
Wellenlängenbereich
250 – 190 nm
Auflösung
1 nm
Bandweite
1 nm
Empfindlichkeit
200 mdeg
36
Material und Methoden
Response
4s
Geschwindigkeit
100 nm / min
Messwiederholungen
10
Die Analyse der Sekundärstrukturverteilung erfolgte mit dem Programm “Protein Secondary
Structure Estimation” der Firma Jasco (Groß-Umstadt); als Referenzdaten dienten die
Spektren von Yang et al.(1986).
2.9.13 Kristallisation
Die Kristallisationsansätze wurden zusammen mit Dr. Solange Moréra und Laurent Larivière
im Labor für Enzymologie und strukturelle Biochemie am CNRS (Centre national de la
recherche scientifique, Gif-sur-Yvette, Frankreich) durchgeführt. Es wurden zunächst
verschiedene käufliche Puffer verwendet. Weitere Puffer basierten auf 100 mM Bicyn (pH 8,
pH 8,5 und pH 9) oder 100 mM Ethanolamin (pH 9, pH 9,5, pH 10) oder 100 mM Glycin
(pH 9,3, pH 9,6, pH 9,9) und enthielten als Additive 1 mM DTT oder 1 mM UDP. Als
Präzipitans
fanden
Ammoniumsulfat
und
Polyetyhlenglycol 400
in
verschiedenen
Konzentrationen Verwendung. Für die Kristallisation wurden schließlich 5 - 10 µg der
α-Glukosyltransferase nach der “hanging drop”-Methode in einem Tropfenvolumen von 3 –
5 µl bei ca. 16 °C eingesetzt.
2.9.14 Vorhersage dreidimensionaler Proteinstrukturen
Durch einen Aminosäuresequenz-Vergleich mit Proteinen bekannter Struktur durch den
Server 3D-pssm (www.bmm.icnet.uk/servers/3dpssm) erfolgte eine Sekundärstrukturvorhersage für die α-Glukosyltransferase (Kelley et al., 2000). Anschließend wurde in
Zusammenarbeit mit Dr. Paul Bates am ICRF (Imperial Cancer Research Fund, London) eine
dreidimensionale Struktur der α-Glukosyltransferase errechnet, wobei die bekannte
Kristallstruktur der β-Glukosyltransferase als Grundlage diente.
37
Material und Methoden
2.10 Elektronische Datenverarbeitung
Für die Auswertung der Ergebnisse und die Anfertigung dieser Arbeit wurden folgende
Computerprogramme verwendet:
-
Programme des MS Office 2000 Professional
-
Corel Draw 7
-
Photo Paint 7
-
Tina 2.09 (Raytest Isotopenmessgeräte GmbH)
-
Clone Manager (Scientific & Educational Software)
-
Enhance (Scientific & Educational Software)
-
Programmpaket DNA Star
-
PDB Betrachter: RasMol, Swiss PDB Viewer, Molscript
Zur Sekundärstrukturvorhersage und für Aminosäuresequenzvergleiche kamen folgende
Datenbanken zum Einsatz:
-
3D-pssm (www.bmm.icnet.uk/servers/3dpssm)
-
Matrix (www.matrixscience.com)
Die Abbildungen dieser Arbeit wurden elektronisch in das Dokument eingebunden; die
Originalgele wurden gescannt oder mit Hilfe einer Videodokumentationanlage digitalisiert.
Im Verlauf der Datenerfassung und -verarbeitung kam es zu keiner inhaltlichen Veränderung
der Abbildungen.
38
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Die Charakterisierung der Glukosyltransferasen des Bakteriophagen T4 ist schon seit längerer
Zeit von großem Interesse. Während die β-Glukosyltransferase bereits kristallisiert ist und
aufgrund dieser Daten fundierte Kenntnisse über ihre Interaktion mit dem Substrat UDPG
vorliegen (Vrielink et al., 1994; Moréra et al.,1999), konnte die Struktur der
α-Glukosyltransferase bisher noch nicht gelöst werden. Der Grund dafür mag in der
Reinigung des Enzyms liegen, die nach der Vorschrift von Tomaschewski et al. (1985)
erfolgte und den Ansprüchen einer Kristallisation möglicherweise nicht genügt.
Zu Beginn dieser Arbeit sollte daher eine Reinigungsstrategie etabliert werden, die die
Isolierung der α-Glukosyltransferase in einer für die Strukturanalyse ausreichenden Qualität
erlaubt. Als zweiter Gesichtspunkt war ein schnelles Protokoll wünschenswert, um im Zuge
einer Mutagenese eine Vielzahl an Mutanten in kurzer Zeit reinigen zu können.
3.1 Klonierung, Überexpression und Nachweis der α-Glukosyltransferase
Zunächst erfolgte die Klonierung des Gens der α-Glukosyltransferase in einen
Überexpressionsvektor, pProExHTb, der stromaufwärts der multiplen Klonierungsstelle für
eine Poly-Histidin-Sequenz kodiert. Die AGT sollte so mit einer N-terminalen Histdin-Folge
exprimiert und über eine Metallaffinitätschromatographie gereinigt werden können.
Das agt Gen konnte mittels PCR aus der genomischen T4 alc DNA amplifiziert (siehe
2.8.6) und in einen T-Vektor kloniert werden (siehe 2.8.3 und 2.8.10). Aus diesem Vektor
erfolgte anschließend die gerichtete Klonierung des Gens über die Restriktionsendonukleaseschnittstellen für BamHI und KpnI in das Plasmid pProExHTb (siehe 2.8.3 und 2.5). Die
korrekte Insertion des agt Gens in den dann als pProExHTb-agt bezeichneten Vektor wurde
anhand einer Sequenzierung überprüft (siehe 2.8.9). Die Abbildung 3.1 zeigt eine
schematische Darstellung des neuen Konstruktes.
39
Ergebnisse
StyI
NcoI
DsaI
NarI
KasI
EheI
BbeI
RsrII
AflII
HpaI
Bsp120I
ApaI
BstEII
SplI
pTrc
Ecl136
SacI
NdeI
Asp718
KpnI
agt
MluI
5000
pProExHTb-agt
5904 bps
BstAPI
PflMI
Ppu10I
NsiI
SphI
Bst1107
AccI
NgoMI
NaeI
DraIII
1000
lacI 4000
2000
3000
SapI
BspLU11
amp
ScaI
PvuI
FspI
AhdI
Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Überexpressionsvektors
pProExHTb-agt unter Angabe der wichtigsten Restriktionsschnittstellen.
pTrc: Promotor pTrc
His-tag: Kodierung von 6 Histidinen
agt: Gen der α-Glukosyltransferase
amp: Gen der β-Lactamase
lacI: Gen des lac-Repressors
Die durch IPTG induzierte Überexpression der α-Glukosyltransferase (siehe 2.7.4 und
2.7.5) wurde in einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (siehe 2.9.2) dokumentiert (Abb.
3.2 a). In der unlöslichen Fraktion des Zellextraktes nach der Induktion (Spur 3) konnte
eindeutig eine zusätzliche Bande bei 48 kDa beobachtet werden. Das überexprimierte Protein
schien also hauptsächlich in Einschlusskörpern vorzuliegen. In einem Western Blot dieses
Gels, in dem die Poly-Histidin-Sequenz der AGT über Ni-NTA Konjugat detektiert wurde
(siehe 2.9.5), ließ sich die α-Glukosyltransferase aber sowohl in der unlöslichen Fraktion als
auch, in geringerer Menge, in der löslichen Fraktion nachweisen (Abb. 3.2 b, Spuren 2 und 3).
Aufgrund der Unspezifität des Ni-NTA Konjugats wurden zusätzlich einige andere Proteine
markiert (Abb.3.2 b, Spuren 1 – 3). Die spezifische Erkennung der Histidin-Folge der
α-Glukosyltransferase ließ sich auch am gereinigten Protein nachweisen (Abb. 3.2 a und b,
Spur 4).
Für die folgende Reinigung des Enzyms wurde nur der lösliche Proteinextrakt weiter
verwendet. Die unlösliche Fraktion wurde verworfen, da die Renaturierung der
α-Glukosyltransferase aus den Einschlusskörpern geringe Fehlfaltungen des Proteins zur
Folge haben könnte, die dann einer Kristallisation entgegenwirken würden.
40
Ergebnisse
a)
b)
70 kDa 50 kDa - AGT
30 kDa -
Abb. 3.2: Überexpression der α-Glukosyltransferase.
Coomassie gefärbtes SDS-Polyacrylamidgel (a) und Western Blot (b):
AGT: α-Glukosyltransferase
M:
10 kDa Leiter
1:
Zellextrakt vor der Induktion
2:
lösliche Fraktion des Zellextrakts 2h nach der Induktion
3:
unlösliche Fraktion des Zellextrakts 2h nach der Induktion
4:
gereinigte α-Glukosyltransferase
3.2 Reinigung der α-Glukosyltransferase
Die Reinigung der α-Glukosyltransferase erfolgte über zwei unterschiedliche Säulenmatrizes
mit immobilisierten Metallionen, an die das Enzym über die N-terminale Poly-HistidinSequenz binden konnte. Die lösliche Proteinfraktion aus 2,5 g Zellsediment (siehe 2.7.5)
wurde zunächst über eine Kobalt-haltige Talon-Säule mit einem Säulenvolumen von 5 ml
gereinigt (siehe 2.9.6), wobei die Wasch- und Elutionsschritte auf einem abnehmenden
pH-Gradienten beruhten. Eine anschließende SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (siehe
2.9.2) diente der Demonstration der Proteinzusammensetzung in den einzelnen Fraktionen
(Abb. 3.3). Die meisten kontaminierenden Proteine konnten mit einem pH-Wert von 7,0
(Abb. 3.3, Spur W1), einige wenige bei pH 6,3 und 6,2 (Spuren W2 und W3) von der Säule
entfernt werden. Die folgenden Elutionsfraktionen (pH 6,0) enthielten dann neben der
α-Glukosyltransferase nur noch in sehr geringen Mengen zwei weitere Proteine von ca.
18 kDa und 26 kDa Größe (Spuren 1 – 10).
41
Ergebnisse
M
A
D
W1 W2 W3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 M
- 70 kDa
50 kDa -
- 50 kDa
30 kDa -
- 30 kDa
Abb. 3.3: Reinigung der α-Glukosyltransferase über eine Talon-Säule. Die Wasch- und Elutionsschritte erfolgten mit einem pH-Gradienten.
Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel:
M:
10 kDa Leiter
A:
Auftrag
D:
Durchlauf
W1 – W3: Waschfraktionen 1 - 3 (pH 7,0; pH 6,3; pH 6,2)
1-10:
Elutionsfraktionen 1-10 (pH 6,0)
Die Elutionsfraktionen 5 bis 9 wurden vereinigt, gegen Tris-Puffer dialysiert und auf eine
His⋅Bind-Säule (Säulenvolumen 2,5 ml) gegeben (siehe 2.9.6). Diese Matrix enthielt
immobilisiertes Nickel; die Reinigung der α-Glukosyltransferase erfolgte hier über einen
steigenden
Imidazolgradienten
(Abb. 3.4).
Aufgrund
der
geringen
Gesamtprotein-
konzentration konnte die erfolgreiche Entfernung der kontaminierenden Proteine in den
einzelnen Waschschritten trotz einer Silberfärbung des SDS-Polyacrylamidgels nicht
dokumentiert werden (Spuren W1 – W3). Die Fraktion des dritten Waschschritts enthielt
allerdings bereits geringe Mengen der α-Glukosyltransferase (Spur W3). Im ersten
Elutionsschritt mit 100 mM Imidazol eluierte zusätzlich zur AGT ein ca. 26 kDa großes
Protein (Spuren 1 – 4), während die Fraktionen mit 200 mM Imidazol nur noch die
α-Glukosyltransferase enthielten (Spuren 5 - 11).
Zur Lagerung des Enzyms wurden die Elutionsfraktionen 5 – 9 gegen einen glyzerinhaltigen Tris-Puffer dialysiert, gegebenenfalls eingeengt (siehe 2.9.6) und bei –20 °C
aufbewahrt.
42
Ergebnisse
M A
D
W1 W2 W3 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
M
- 70 kDa
50 kDa -
- 50 kDa
30 kDa -
- 30 kDa
Abb. 3.4: Reinigung der α-Glukosyltransferase. Dieser zweite Reinigungsschritt erfolgte über eine
His⋅Bind-Säule, die Wasch- und Elutionsschritte wurden mit einem Imidazol-Gradienten
durchgeführt
Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel:
M:
10 kDa Leiter
A:
Auftrag
D:
Durchlauf
W1 – W3: Waschfraktionen 1 - 3 (5 mM, 20 mM und 60 mM Imidazol)
1 - 4:
Elutionsfraktionen 1 - 4 (100 mM Imidazol)
5 - 12:
Elutionsfraktionen 5 - 12 (200 mM Imidazol)
In
beiden
Reinigungsschritten
enthielten
die
meisten
Elutionsfraktionen
der
α-Glukosyltransferase zusätzlich ein ca. 26 kDa großes Protein. Um festzustellen, ob es sich
dabei um ein kontaminierendes Protein oder um ein Abbauprodukt der α-Glukosyltransferase
handelt,
sollte
die
Aminosäuresequenz
dieses
Proteins
bestimmt
werden.
Die
Proteinhydrolyse aus dem SDS-Polyacrylamidgel und die massenspektrometrische Analyse
wurden von Herrn Dr. Markus Piotrowski (Lehrstuhl für Pflanzenphysiologie, RuhrUniversität Bochum) durchgeführt (siehe 2.9.9). Insgesamt wurden drei Peptide sequenziert,
deren Spektren mit der ermittelten Aminosäuresequenz in der Abbildung 3.5 dargestellt sind.
Mittels Datenbankrecherche (www.matrixscience.com) konnte anhand dieser Daten eindeutig
das E. coli Protein slyD identifiziert werden. Dieses Protein weist aufgrund seiner
histidinreichen Sequenz eine hohe Affinität zu Metallionen auf (Mitterauer et al., 1999). In
der Tabelle 3.1 sind die ermittelten Peptidsequenzen und die Sequenz von slyD vergleichend
dargestellt, wobei die übereinstimmenden Aminosäurefolgen markiert sind.
43
Ergebnisse
DL
V
R
V
V
S
Y
Q
L
A
Y
A
L
QVR
V V LD
S
836.19
y7
100
bM ax
yM ax
935.22
328.07
b3
%
565.12
y4
229.04
b2
201.05
a2
837.19
936.22
749.18
y6
632.16 637.13
427.11
b4
838.20
329.08
274.09
y2
133.04
636.13
y5
1034.24
750.18
751.18
510.12
989.20
1088.21
1000
1100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1112.03
1200
M /z
1300
Peptid 631.6, doppelt geladen
FN
V
R
E
I
V
AV
V A IR
V
E
686.19
y6
100
262.03
b2
V
785.24
y7
458.15
y4
120.04
a1
F
361.07
b3
263.03
786.24
687.20
558.19
445.06
688.19
524.13
559.21 668.18
760.34
0
100
200
bM ax
yM ax
F
557.19
y5
%
217.02
N
300
400
500
600
700
787.24
882.26
800
899.24
y8
910.19
900
1000
M /z
1100
Peptid 523.6, doppelt geladen
DV
R
F
M
F
G
Q
GV
V
D
L
ELQ V G M R
DV G FFV D
1103.14
E
100
bM ax
yM ax
947.14
1104.15
363.05
%
462.09
y4
215.02
120.04 b2
F
948.15
699.09
y12 2+
590.10
y5
703.15
y6
832.16
y7
1250.02
963.13
1119.13
1046.16
833.17
1120.13
1186.12
1251.03
1252.03
1253.02
0
1396.85
1399.80
M /z
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
1400
1500
1600
Peptid 806.1, doppelt geladen
Abb. 3.5: Sequenzierung des 26 kDa großen Proteins.
Massenspektren der drei sequenzierten Peptide, deren Bezeichnung sich aus ihrem Masse : Ladung Verhältnis ergibt, unter Angabe ihrer Ladung. Zur Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz wurden die
Peptide in einer Stoßzelle fragmentiert. Die Peptide brechen dabei vornehmlich im Bereich der
Peptidbindung, so dass N-terminale b-Ionen und C-terminale y-Ionen entstehen. Die Differenz der
Fragmentmassen entspricht jeweils der Masse der fehlenden Aminosäure. Die identifizierten
Aminosäuren sind sowohl für die y-Ionen als auch für die b-Ionen angegeben. In den Fällen, in denen
zwei Aminosäuren angegeben sind, konnte die Reihenfolge dieser beiden Reste in der Sequenz nicht
festgelegt werden.
44
Ergebnisse
Tab 3.1: Aminosäuresequenzvergleich der Peptide mit slyD. Die in slyD identifizierten Sequenzen
sind fett gedruckt und unterstrichen.
Protein
Sequenz
Peptid 631.6
(DL)VVSLAYQVR
Peptid 523.6
FNVEVVAIR
Peptid 806.1
(DV)FFGVDELQVGMR
slyD
MKVAKDLVVSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLH
GHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAYGQYDE
NLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEI
TAVEDDHVVVDGNHMLAGQNLKFNVEVVAIREATEEE
LAHGHVHGAHDHHHDHDHDGCCGGHGHDHGHEHGGE
GCCGGKGNGGCGCH
Die Tabelle 3.2 zeigt eine Zusammenfassung des Reinigungsprotokolls, in der die
Proteinmenge, das Volumen und die spezifische Aktivität angegeben werden. Die
spezifischen Aktivitäten nach den beiden Reinigungsschritten unterschieden sich nicht
wesentlich, da die α-Glukosyltransferase bereits nach der ersten Säulenreinigung sehr sauber
war.
Tab. 3.2: Protokoll zur Reinigung der α-Glukosyltransferase mittels zweistufiger Metallchelataffinitätschromatographie unter Angabe der spezifischen Aktivität.
Reinigungsschritt
Proteinmenge
Volumen
spez. Aktivität [µmol/h*mg AGT]
Rohextrakt
280 mg
20 ml
0,04
Talon-Säule
14 mg
50 ml
29
His⋅Bind-Säule
4 mg
6,25 ml
33,3
45
Ergebnisse
Die Reinheit der α-Glukosyltransferase konnte computergestützt mit dem Programm Tina
2.09 errechnet werden und lag demnach bei 96 %. Die densitometrische Auswertung der
gereinigten, im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten AGT ist in der Abbildung 3.6
dargestellt. Da keine Verunreinigung des Proteins ersichtlich ist, sollte die Probe nun den
Reinheitsansprüchen einer Kristallisation genügen.
[o
9000
1e+04
8000
7000
6000
d
[OD]
]
5000
4000
3000
2000
1000
AGT
0
M
0
5
10
[mm]
15
Abb. 3.6: Analyse der Reinheit der α-Glukosyltransferase durch
Densitometrie.
Die linke Bildhälfte zeigt das silbergefärbte SDSPolyacrylamidgel und die rechte Bildhälfte die densitometrische Auswertung entlang der AGT-Laufspur.
M:
10 kDa Leiter
AGT: 3 µg gereinigte α-Glukosyltransferase
3.3 Versuch der Kristallisation
In Zusammenarbeit mit Dr. Solange Moréra und Laurent Larivière wurden ca. 350
verschiedene Kristallisationsansätze mit der α-Glukosyltransferase durchgeführt (siehe
2.9.13). In Anwesenheit von Salzen oder Isopropanol fiel das Protein aus, so dass nur
Polyethylenglycol als Präzipitanz in Frage kam. Bei der Verwendung von PEG 400 blieb das
Enzym zum Teil in Lösung, so dass eine Optimierung der Pufferzusammensetzung mit PEG
400 weiter verfolgt wurde.
In
einem
Ansatz
mit
100 mM
Bicin
pH 8,
30 %
PEG 400
und
9,5 µg
α-Glukosyltransferase konnte eine leichte Trübung des Kristallisationstropfens beobachtet
werden. Dieser Befund deutete darauf hin, dass sich das Protein unter den gegebenen
Bedingungen nahe des Phasenübergangs vom löslichen in den unlöslichen Zustand befand.
46
Ergebnisse
Da dieser Übergang zur Kernbildung von Kristallen erreicht werden muss, wurde die
PEG 400 Konzentration in kleinen Schritten zwischen 27 % und 32 % variiert. Es kam aber
auch in diesen Ansätzen zu keiner Kristallbildung.
In Puffern mit Ethanolamin anstelle des Bicin fiel das Enzym aus, während seine
Löslichkeit in Glyzin so hoch war, dass bei zunehmender PEG 400 Konzentration das
Präzipitans anstelle des Proteins kristallisierte. Auch die Zugabe von Additiven wie UDP und
DTT führte zu keiner Kristallbildung der α-Glukosyltransferase.
Zur Zeit erfolgen noch weitere Kristallisationsversuche durch Dr. Solange Moréra.
3.4 Kinetische Daten der α-Glukosyltransferase
Für die Ermittlung der kinetischen Enzymdaten wurde die Aktivität der α-Glukosyltransferase
anhand der Transferrate
14
C-markierter Glukose von UDPG auf 5'-Hydroxymethyl-Cytosin-
haltige DNA bestimmt (siehe 2.9.7). Die Abbildung 3.7 stellt die Enzymaktivität in
Abhängigkeit von der Substratkonzentration nach Michaelis-Menten (a) und LinneweaverBurk (b) dar. Aus dem zweiten Graphen lässt sich die Affinität des Enzyms zum Substrat als
negativer Kehrwert des Schnittpunktes mit der x-Achse ablesen. Die α-Glukosyltransferase
hat somit für UDPG einen Km-Wert von 4,75 * 10-6M.
Der
Kehrwert
des
Schnittpunktes
mit
der
y-Achse
gibt
die
maximale
Reaktionsgeschwindigkeit des Enzyms an. Unter Berücksichtigung der eingesetzten
Enzymmenge kann so die spezifische Aktivität der α-Glukosyltransferase als Substratumsatz
von 33,33 µmol / h pro mg Enzym errechnet werden.
47
Ergebnisse
a)
b)
0,06
1 / UDPG-Umsatz [min / pmol]
Substratumsatz [pmol / min]
60
50
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
0,04
0,02
0
-0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1
0
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
-0,02
60
1 / Substratkonzentration [1 / µM]
Substratkonzentration [µM]
Abb. 3.7: Aktivität der α-Glukosyltransferase in Abhängigkeit von der UDPG-Konzentration. Graphische
Darstellung der Enzymaktivität nach (a) Michaelis-Menten und (b) Lineweaver-Burk. Bei einer
zunehmenden UDPG-Konzentration (2,5 µM -50 µM) wurden jeweils 0,1 µg α-Glukosyltransferase
eingesetzt.
3.5 Untersuchung von Proteininteraktionen
Das Genom des Bakteriophagen T4 kodiert für insgesamt zwei Glukosyltransferasen, die αund die β-Glukosyltransferase. Der Glukose-Akzeptor ist die Phagen DNA, wobei das
Glykosylierungsmuster aus α- und β-Glukosylierung strikt festgelegt ist. Obwohl beide
Enzyme bereits präreplikativ synthetisiert werden, muss die α-Glukosyltransferase die neu
synthetisierte DNA vor der β-Glukosyltransferase modifizieren. Dieser Ablauf wird während
der Phageninfektion durch einen bisher unbekannten Mechanismus reguliert. Eine denkbare
Erklärung wäre die räumliche Trennung der beiden Enzyme, die zum Beispiel durch ihre
Einbindung in Proteinkomplexe gewährleistet sein könnte.
Die α-Glukosyltransferase könnte sowohl mit phageneigenen als auch mit E. coli
Proteinen interagieren. Zur Analyse möglicher Proteininteraktionen wurden daher E. coli
Zellen nach unterschiedlichen Infektionszeiten geerntet (siehe 2.7.7) und die daraus
gewonnenen löslichen Proteinextrakte in Bindungsstudien eingesetzt (siehe 2.9.8). Für die
Experimente dienten magnetische Ni-NTA Agarose Partikel als Matrix, an die die
α-Glukosyltransferase über die Poly-Histidin-Sequenz bindet. Der magnetische Anteil bot den
Vorteil, daß die Komplexe magnetisch von der Lösung getrennt werden konnten, um Waschoder Elutionsschritte vorzunehmen.
Zunächst wurde die gereinigte α-Glukosyltransferase an die Partikel gebunden, um dann,
nach
Entfernung
überschüssigen
Proteins,
mit
Zellextrakten
unterschiedlicher
48
Ergebnisse
Infektionsstadien inkubiert zu werden (siehe 2.9.8). Anschließend erfolgten mehrere
Waschschritte, bevor die AGT zusammen mit eventuell interagierenden Proteinen eluiert
werden konnte. Parallel wies jeweils ein Kontrollansatz ohne α-Glukosyltransferase für jeden
Zellextrakt die mögliche Interaktion der zellulären Proteine mit der Matrix nach. In der
Abbildung 3.8 sind die in SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennten Fraktionen der
Bindungsstudien dargestellt, die mit Zellextrakten vor der Infektion und 6 min, 8 min, 11 min
und 13 min nach der Infektion durchgeführt wurden. “K” benennt jeweils den Kontrollansatz
ohne α-Glukosyltransferase und “R” den Reaktionsansatz mit dem Enzym. In den mit “D”
(Durchlauf) und “1” (Waschschritt 1) bezeichneten Fraktionen wurde die überschüssige
α-Glukosyltransferase aus den Ansätzen extrahiert; nach der Inkubation mit dem
entsprechenden Zellextrakt erfolgte dann in den Waschschritten 2 – 4 die Entfernung der nicht
gebundenen Proteine des Zellextraktes. Durch den Vergleich der Elutionsfraktionen der
Kontrolle und des Reaktionsansatzes (EK und ER) ließen sich diejenigen Proteine nachweisen,
die mit der α-Glukosyltransferase interagiert hatten.
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
AGT -
- 50 kDa
- 30 kDa
t = 0 min
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK E R M
- 50 kDa
AGT -
- 30 kDa
t = 6 min
49
Ergebnisse
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
- 50 kDa
AGT -
- 20 kDa
t = 8 min
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
- 50 kDa
AGT -
- 20 kDa
t = 11 min
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
- 50 kDa
AGT -
- 20 kDa
t = 13 min
Abb.3.8: Identifikation mit der α-Glukosyltransferase interagierender Proteine
aus T4-infizierten Zellextrakten. Es wurden Zellextrakte vor der
Phageninfektion und 6 min, 8 min, 11 min und 13 min nach der
Infektion eingesetzt. Proteinbanden, die in den Reaktionsansätzen im
Vergleich zur Kontrolle (ohne α-Glukosyltransferase) zusätzlich
auftraten, sind mit Pfeilen markiert.
Silbergefärbte SDS-Polyacrylamidgele:
AGT: α-Glukosyltransferase
M: 10 kDa Leiter
D:
Durchlauf
K: Kontrollansatz ohne AGT
1-4: Waschschritte 1-4
R: Reaktionsansatz
E:
Elution
t = 0 min
t = 6 min
t = 8 min
t = 11 min
t = 13 min
Zellextrakt vor der Infektion
Zellextrakt 6 min nach der Infektion
Zellextrakt 8 min nach der Infektion
Zellextrakt 11 min nach der Infektion
Zellextrakt 13 min nach der Infektion
50
Ergebnisse
In allen Reaktionsansätzen konnte die AGT erfolgreich an die Partikel gebunden und in
der Fraktion “ER” eluiert werden. Außerdem ließen sich in allen Elutionsfraktionen zwei
Proteinbanden bei 24 kDa und 26 kDa nachweisen. In den Bindungsstudien mit Zellextrakten
vor und 6 min nach der Infektion (t = 0 und t = 6) wurden im Vergleich zu der jeweiligen
Kontrolle keine zusätzlichen Proteine außer der α-Glukosyltransferase eluiert (vergleiche EK
und ER). 8 Minuten nach der Infektion traten allerdings im Reaktionsansatz zusätzliche
Proteinbanden bei 27 kDa, 31 kDa und 32 kDa auf (t = 8). Das 27 kDa große Protein war
auch nach 11 Minuten (t = 11) und nach 13 Minuten (t = 13) noch deutlich nachweisbar. Zur
Identifikation dieser Proteine wurden die entsprechenden Proteinbanden aus dem Gel
ausgeschnitten, mit Trypsin verdaut und die Aminosäuresequenzen der entstanden Peptide
mittels Massenspektrometrie bestimmt (siehe 2.9.9). Die Identifikation der beiden
Proteinbanden bei 31 kDa und 32 kDa misslang, da die Proben zu stark mit Keratin
verunreinigt waren. Von dem 27 kDa großen Protein konnten insgesamt vier Peptide
sequenziert werden, deren Spektren in der Abbildung 3.9 dargestellt sind. Die sich aus den
Massenunterschieden der Fragmente eines Peptides ergebende Aminosäuresequenz ist jeweils
über jedem Spektrum angegeben.
R
T
L
A
S
D
662.30
y6
100
E
V
yM ax
791.32
y7
%
201.11 229.10
a2
b2
84.07
0
144.15
547.28
y5
276.15
344.13 389.23
y2
y3
b3
460.26
y4 488.18
892.27
600.19 644.29
764.19 792.37
663.24
893.48
M /z
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
Peptid 445.72, doppelt geladen, MW: 904.48 Da, Sequenz VEDSA(L/I)TR
KN
F
G
D
L
693.31
y6
100
V
L
yM ax
906.44
%
580.24
y5
185.16
a2
86.09
a1
120.08
L
F
213.15
b2 261.14
y2
294.22
792.36
y7
453.27 465.22
907.35
692.34 694.26
y4
435.11
635.30
402.24
877.29
746.34
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
930.38
M /z
900
Peptid 453.25, doppelt geladen, MW: 889.42 Da, Sequenz (L/I)V(L/I)DG(F/M)(KN)
51
Ergebnisse
R
T
M
L
F
Q
G
S
yM ax
683.31
y5
100
957.34
619.32
536.24
y4
%
423.19
y3
101.07
Q
794.34
472.26
290.11
162.08
956.38
684.35
359.19
730.34
479.13 538.25
234.12
865.30 913.31
958.48
0
M /z
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
750
800
850
900
950
Peptid 478.21, doppelt geladen, MW: 954.40 Da, Sequenz SG(Q/K)(F/M)(L/I)(F/M)TR
R
L
L
Q
Q
L
D
885.53
y7
100
E
A
yM ax
657.40
a6
y5
529.35
a5
y4
%
316.12
b3
173.10
a2
401.29
a4
y3
201.09
b2
155.09
770.49
a7
y6
640.37
512.32
639.40
753.48
868.51 886.47
996.54 1024.55
1158.54
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1194.52
M /z
1200
Peptid 543.28, doppelt geladen, MW: 1084.54 Da, Sequenz AED(L/I)(Q/K)(Q/K)(L/I)(L/I)R
Abb.3.9: Sequenzierung des mit Trypsin verdauten 27 kDa großen Proteins.
Massenspektren von vier Peptiden, deren Bezeichnung sich aus dem Masse : Ladung - Verhältnis
ergibt. Unter jedem Spektrum sind außerdem die Ladung, das Molekulargewicht und die ermittelte
Aminosäuresequenz des Peptids angegeben. Zur Bestimmung ihrer Aminosäuresequenz wurden die
Peptide in einer Stoßzelle fragmentiert. Die Peptide brechen dabei vornehmlich im Bereich der
Peptidbindung, so dass N-terminale b-Ionen und C-terminale y-Ionen entstehen. Die Differenz der
Fragmentmassen entspricht jeweils der Masse der fehlenden Aminosäure. Die identifizierten
Aminosäuren sind hier für die y-Ionen angegeben. Einige Aminosäuren besitzen identische Massen und
können daher massenspektrometrisch nicht unterschieden werden; diese wurden gegebenenfalls unter
Angabe der beiden Alternativen in Klammern gesetzt. Im Peptid 453.25 konnte die Reihenfolge der
Aminosäuren K und N in der Peptidsequenz nicht festgelegt werden.
Anhand einer Datenbankrecherche (www.matrixscience.com) ließen sich diese Sequenzen
eindeutig dem DNA Polymerase assoziierten Protein 45 des Bakteriophagen T4 zuordnen.
Die Tabelle 3.3 zeigt die ermittelten Peptidsequenzen und die Sequenz des Proteins 45 im
Vergleich, wobei die identifizierten Sequenz-Abschnitte innerhalb des Proteins 45 markiert
sind.
52
Ergebnisse
Tab. 3.3: Vergleich der Aminosäuresequenzen der analysierten Peptide und des Proteins 45.
Innerhalb der Proteinsequenz sind die mit den Peptidsequenzen übereinstimmenden Abschnitte fett
gedruckt und unterstrichen.
Protein
Peptid 445.72
Peptid 453.25
Peptid 478.21
Peptid 543.28
Protein 45
Sequenz
VEDSA(L/I)TR
(L/I)V(L/I)DG(F/M)(KN)
SG(Q/K)(F/M)(L/I)(F/M)TR
AED(L/I)(Q/K)(Q/K)(L/I)(L/I)R
MKLSKDTTALLKNFATINSGIMLKSGQFIMTRAVNGTTYAEANIS
DVIDFDVAIYDLNGFLGILSLVNDDAEISQSEDGNIKIADARSTIFWR
AADPSTVVAPNKPIPFPVASAVTEIKAEDLQQLLRVSRGLQIDTIAI
TVKEGKIVINGFNKVEDSALTRVKYSLTLGDYDGENTFNFIINMA
NMKMQPGNYKLLLWAKGKQGAAKFEGEHANYVVALEADSTHDF
Die sequenzierten Aminosäureabfolgen korrelieren mit der Proteinsequenz aus der
Datenbank. Die einzige nicht übereinstimmende Aminosäure ist die Asparaginsäure (D) im
Peptid 453.25; an dieser Position enthält das Protein 45 ein Asparagin (N).
Eine Interaktionsstudie, in der die α-Glukosyltransferase und das Protein 45 in gereinigter
Form eingesetzt wurden (siehe 2.9.8), bestätigte die Affinität dieser Proteine zueinander
(Abb. 3.10). Im Reaktionsansatz ließen sich beide Proteine in der Elutionsfraktion
nachweisen, während das Protein 45 in der Kontrollreaktion bereits in den Waschschritten
vollständig entfernt wurde.
Das rekombinante Protein 45 wurde in unserer Arbeitsgruppe von Petra van der Heusen zur
Verfügung gestellt.
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
- AGT
- Gp 45
Abb. 3.10: Nachweis einer Interaktion der α-Glukosyltransferase mit
dem T4 Protein 45.
Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel:
AGT:α-Glukosyltransferase M: 10 kDa Leiter
D: Durchlauf
K: Kontrollansatz ohne AGT
1-4: Waschschritte 1-4
R: Reaktionsansatz
E: Elution
53
Ergebnisse
Eine Bindung der α-Glukosyltransferase an die β-Glukosyltransferase (BGT) konnte
durch einen weiteren Versuchsansatz, in dem die β-Glukosyltransferase als möglicher
Interaktionspartner angeboten wurde, ausgeschlossen werden (Abb. 3.11). Die BGT wurde
von Frau Aschke-Sonnenborn in unserer Arbeitsgruppe gereinigt und zur Verfügung gestellt.
Aus der Abbildung 3.10 ist ersichtlich, dass die β-Glukosyltransferase sowohl in der Reaktion
als auch in der Kontrolle bereits in der zweiten Waschfraktion eluierte. Bei dem ebenfalls in
dieser Fraktion enthaltenen 22 kDa großen Protein handelt es sich um eine Kontamination aus
der Aufreinigung der β-Glukosyltransferase.
AGT DK DR 1K 1R 2K 2R 3K 3R 4K 4R EK ER M
- AGT
- BGT
Abb. 3.11: Analyse einer möglichen Interaktion der α-Glukosyltransferase mit der β-Glukosyltransferase.
Silbergefärbtes SDS-Polyacrylamidgel:
AGT: α-Glukosyltransferase
M: 10 kDa Leiter
D:
Durchlauf
K: Kontrollansatz ohne AGT
1-4: Waschschritte 1-4
R: Reaktionsansatz
E:
Elution
54
Ergebnisse
3.6 Sekundärstrukturalignment und Berechnung eines dreidimensionalen
Modells
Die Kristallstruktur der α-Glukosyltransferase konnte bisher noch nicht aufgeklärt werden.
Um trotzdem eine gezielte molekulargenetische und biochemische Charakterisierung
vornehmen zu können, wurde ein theoretisches Modell des Enzyms entwickelt. Zunächst
erfolgte
ein
Sekundärstrukturalignment,
bei
dem
die
β-Glukosyltransferase
des
Bakteriophagen T4 durch den Server 3D-pssm als Protein mit der höchsten Homologie zur
α-Glukosyltransferase identifiziert wurde (siehe 2.9.14). In diesem Alignment wird möglichst
jeder Aminosäure der AGT eine entsprechende Aminosäure in der BGT zugeordnet, wobei
die entstehenden Lücken auf dem Größenunterschied der beiden Enzyme beruhen (Abb 3.12).
Die BGT ist mit 351 Aminosäuren um 49 Reste kürzer als die AGT. Jeweils ober- bzw.
unterhalb der Primärstruktur ist die für die AGT postulierte bzw. die für die BGT bekannte
Sekundärstruktur angegeben. Die Zeile zwischen den beiden Sequenzen zeigt im
Einbuchstabencode die in beiden Proteinen identischen Aminosäuren an und mit einem “+”
oder “-” die Konservierung bzw. Nichtkonservierung dieser Position. Aminosäuren, für die in
der BGT eine Beteiligung an der Substratbindung postuliert wird, werden durch Symbole in
der untersten Zeile hervorgehoben. Diese Zuordnung erfolgte aufgrund der 1994 und 1999
veröffentlichten Strukturdaten der BGT (Vrielink et al., 1994; Moréra et al., 1999) und
mündlicher Mitteilungen von Prof. Dr. Paul Freemont (Imperial College of Science,
Technology and Medicine, London). Von insgesamt zehn Resten, die an der GlukoseBindung beteiligt sein könnten (Symbol “•”), sind drei Aminosäuren in beiden Enzymen
identisch; vier übereinstimmende Reste sind unter den elf möglicherweise DNA-bindenden
Positionen (Symbol “Δ”) zu finden und von den sechs Aminosäuren, die für die UDPBindung relevant sein könnten (Symbol “◊”), entsprechen sich zwei Positionen. Zusätzlich
sind viele Aminosäuren an diesen möglicherweise für die Katalyse wichtigen Positionen
konserviert.
55
Ergebnisse
AGT__vSS
AGT__Seq
--------BGT__Seq
BGT__SS
1
CCEEEEECCC
MRICIFMARG
M+I+I+---+
MKIAIINMGN
CEEEEEECCC
1
AGT__vSS
AGT__Seq
--------BGT__Seq
BGT__SS
CCCCCCEEEE
LEGCGVTKFS
------T--S
NVINFKTVPS
CCCCCCCHHH
Δ ••
CCCCEEE...
LEQRDWF...
-E----F
SETIYLFKVI
HHHHHHHHHH
•
EEEEHHHHHH
PVILAKEYDK
-+-+++YD+
.EVDVNDYDR
.CCCHHHCCE
HHHHHCCCCE
ALKLVNDCDI
-+ V-+-+I
LI..VVNSSI
EE..EECCCC
•
EEECCCCCCC
LIINSVPATS
-+++++P--+
AFFGGAPNLA
CCHHHCCCHH
AGT__vSS CCC.......
AGT__Seq HSV.......
--------- -+V
BGT__Seq PNVKNRPWAY
BGT__SS
HHHHHCCCHH
110
HHHHHCCCCH
LSLRRNLGLE
L-++++L-++
LYTEEELLIK
HCCHHHCCCC
HHHHHHEEEE
ETVRRADVIF
+-++
++
SPIK....VI
CCEE....EE
AGT__vSS
AGT__Seq
--------BGT__Seq
BGT__SS
CEEEEEEECC
DIVKVRSTYW
D-V ++--Y+
DNV.IEFEYF
CCC.CEEEEC
CCCCEEECCC
KDVSEINMNI
+ ++++++++
P.IEQYKIHM
C.HHHHHHHC
CCCCCCEEEE
IKNGHEVTLV
-+-G-+V-++
SEMGLNVDII
HHCCCEEEEE
100
CEEEE..HHH
VQEAT..INN
+-+A- +-+
ILSAQKFMAK
HHHHHHHHHH
EECCCCCCCC
YAKDKSFTRT
--K+--+T
SLKNGVYT..
ECCCCCCE..
Δ
HHHHHCCCCC
YKKLLDNIKP
YK+-+--+-YKSKIYYLFT
CCCCEEEEEC
50
CCCCCCCCCE
SSHDHKSFSI
KSF+
.....KSFD.
.....EECC.
50
CEEEEEECCC
SIRVVVYQHD
+IR+---Q-DIRLPFSQSW
CCCCCCCCHH
• ••
Δ
150
AGT__vSS
AGT__Seq
--------BGT__Seq
BGT__SS
AGT__vSS
AGT__Seq
--------BGT__Seq
BGT__SS
CCCCCCCCCC
PTVYNFQPPM
+
.........V
.........C
ECCCCCCCCC CEECCCCCCC
SHSDNGDFNK VLMKEWYPET
S++-N-D+-K +--K+
SQGINLDIAK AAHKK.....
ECCCCHHHHH HHHCC.....
146 ΔΔ
200
CHHCCCCCCC
NRWIGRTTTW
NND........
CC........
CCCHHHHHHH
KGFYQMFDFH
+Q+---...FQLSKPT
...CCCCCCC
CCCCCCCCCC
VSLFDDIEEA
..........
..........
HHHCCCCCCC
EKFLKPAGKS
+K-L-----+
KKTLDVIYGG
CCCEEEEEEE
250
EEECCCCCCC CCEEECCCCC CEEECCCHHH HHHCCCCCCC ...CHHHHHC CCHHHHHHHH
TVMEGLERSP AFIAIKEKGI PYEYYGNREI DKMNLAPNQP ...AQILDCY INSEMLERMS
+--+G-++S+ ----+-+-G+ --E++GN-+ +K+---P+-P
A+++--- I--+M+++-+
SFRSGQRESK MVEFLFDTGL NIEFFGNAR. EKQFKNPKYP WTKAPVFTGK IPMNMVSEKN
CCHHHCCHHH HHHHHCCCCC CEEEEECCC. HHHCCCCCCC CCCCCEEECC CCCCHHHHHH
200
◊ •
◊
Δ Δ Δ
Δ ◊
• Δ
◊
HCCCCCCHHH
KSGFGYQLSK
+++++--+-SQAIAALIIG
HCEEEEEECC
250
300
HHHHHHHHHH
LNQKYLQRSL
+++Y-++-+
.DKNYNDNFI
.CHHHCCCCC
•Δ
CCCEEECCCC
EYTHLELGAC
-+---E+-ATLRVWETMAS
CHHHHHHHHC
◊ ◊
CCEEEEEECC
GTIPVFWKST
-++-++ +DAVMLI..DE
CCEEEE..EH
CCCEEEEECC
GENLKFRVDN
--++K-R+-N
EFDTKHRIIN
HHCCCCCCCC
CCCCCCCCCE
TPLTSHDSGI
------++-DARFYVNNRA
CCCCEECCHH
300
350
AGT___vSS
AGT___Seq
---------BGT___Seq
BGT___SS
EEECC.CCCH
IWFDE.NDME
--+D+ N+++
ELIDRVNELK
HHHHHHHHHH
400
HHHHHHHH.H
STFERIKE.L
-+----KE L
HSDVLRKEML
HCHHHHHHHH
HHHHHHHHHH
SSDRALYDRE
S-++-++++SIQHDILNKT
HHHHHHHHHH
HHHHHHHHCC
REKAYEFLYQ
R+K--E
RAKKAE....
HHHHHH....
CCCCCCCCCC
HQDSSFCFKE
-QD+
FK+
WQDA...FKK
HHHH...HHH
CCCCCC
QFDIIT
-+D+
AIDL..
HHCC..
350
Abb.3.12: Sekundärstrukturalignment der α-Glukosyltransferase (AGT) mit der β-Glukosyltransferase
(BGT). Die Aminosäuren sind im Einbuchstabencode angegeben. Die Sekundärstrukturen (SS;
vSS = vermutete SS) sind mit H (α-Helix), E (β-Faltblatt) und C (“Coil”) abgekürzt. Die in beiden
Proteinen identischen (Angabe der Aminosäure), konservierten (+) bzw. nicht konservierten (-)
Aminosäuren sind in der Mitte zwischen den Aminosäuresequenzen angegeben. Die für einige
Aminosäuren postulierten Funktionen werden durch die Symbole “•” (Glukose-Bindung), “Δ”
(DNA-Bindung) und “◊” (UDP-Bindung) angedeutet.
56
Ergebnisse
Da dieses Alignment insgesamt sehr vielversprechend aussah, wurde zusammen mit Dr.
Paul Bates (Imperial Cancer Research Fund, London) ein dreidimensionales Strukturmodell
der
α-Glukosyltransferase
errechnet.
Dabei
diente
die
Kristallstruktur
der
β-Glukosyltransferase als Grundlage (siehe 2.9.14). Nach dieser Vorhersage besteht die AGT,
aus zwei Domänen, die über einen “Linker” (Aminosäuren 198 – 221) und zwei α-Helices
(Aminosäuren 357 – 374) miteinander verbunden sind und zwischen sich einen zentralen
Spalt bilden (Abb. 3.13). Die N-terminale Domäne umfasst die Aminosäuren 1 – 197 und 375
– 400; sie besteht aus sieben parallelen, zu einander verdrehten β-Faltblättern, die von acht
α-Helices umgeben sind. Die C-terminale Domäne hat eine ähnliche Topologie. Sie wird aus
den Aminosäuren 222 – 356 gebildet und setzt sich aus sechs parallelen, zu einander
verdrehten β-Faltblättern und zehn die Faltblätter umgebenden α-Helices zusammen.
Abb 3.13: Dreidimensionales Strukturmodell der α-Glukosyltransferase in der “Ribbon”-Präsentation. α-Helices sind in rot
und β-Faltblätter in blau abgebildet. Dargestellt mit
RasMol.
3.7 Identifikation katalytisch relevanter Aminosäuren
Die Charakterisierung des katalytischen Zentrums der α-Glukosyltransferase sollte mit Hilfe
einer gerichteten Mutagenese erfolgen. Die Auswahl der auszutauschenden Aminosäuren
wurde dabei auf der Grundlage des Strukturmodells und des Sekundärstrukturalignments mit
der β-Glukosyltransferase getroffen. Eine anschließende biochemische Charakterisierung der
Mutanten könnte so Aufschluss über die katalytische Bedeutung einzelner Aminosäurereste
geben und eine Aussage über den Reaktionsmechanismus des Enzyms ermöglichen.
57
Ergebnisse
3.7.1 Ortsspezifische Mutagenese
Der Aminosäureaustausch sollte sowohl Positionen, die an der UDPG-Bindung und am
Glukose-Transfer beteiligt sind, als auch DNA-bindende Reste betreffen. Für die
β-Glukosyltransferase konnten anhand der Röntgenstrukturdaten bereits einige Aminosäuren,
die mit UDP interagieren, identifiziert werden (siehe 1.3, Abb. 1.3). Weitere Reste, die den
nukleophilen Angriff der HMC-Gruppe auf das C1-Atom der Glukose aktivieren, und
Positionen, die an der DNA-Bindung beteiligt sein könnten, werden bisher nur postuliert
(siehe 1.3, Abb. 1.4 b). Anhand des 3D-Modells wurde diesen Aminosäuren der
β-Glukosyltransferase jeweils eine Aminosäure in der α-Glukosyltransferase zugeordnet: Für
die Aktivierung des nukleophilen Angriffs könnten in der AGT demnach die Aminosäuren
Glu22 oder Ser106 verantwortlich sein. Die Bindung der Glukose erfolgt eventuell durch
Asn297 und die der Ribose durch Glu311. Ile276 bildet möglicherweise eine
Wasserstoffbrücke zum Uridin des UDPG aus. Während die Arginine 236 und 256 mit dem
Phosphatrückgrat der DNA interagieren könnten, wäre über Met231 die spezifische Bindung
der ausgeklappten Base möglich.
Um diese postulierten Funktionen überprüfen zu können, wurden die genannten
Positionen der AGT jeweils durch die nicht-reaktive Aminosäure Alanin ersetzt. Die Tabelle
3.4 stellt eine Übersicht der ausgetauschten Aminosäuren dar. Gleichzeitig wird hier die
entsprechende Position in der BGT und ihre mögliche Funktion angegeben. Die rechte Spalte
enthält jeweils die Bezeichnung des durch den Austausch mutierten Proteins.
Tab. 3.4: Gegen Alanin ausgetauschte Aminosäuren (AS) der α-Glukosyltransferase (AGT). Neben der
Position des Aminosäureaustausches in der AGT ist die entsprechende Position in der
β-Glukosyltransferase (BGT), die für sie postulierte Funktion und die Benennung der Mutanten
Proteine angegeben.
AS in der BGT
AS in der AGT mögliche Funktion
Mutante
Glu22
Glu22
Aktivierung des nukleophilen Angriffs
Glu22Ala
Asp100
Ser106
Aktivierung des nukleophilen Angriffs,
Salzbrücke in der geschlossenen Konformation
Ser106Ala
Ser192
Met231
Interaktion mit der ausgeklappten Base
Met231Ala
Lys222
Arg236
Interaktion mit dem DNA-Phosphatrückgrat
Arg236Ala
Arg217
Arg256
Interaktion mit dem DNA-Phosphatrückgrat
Arg256Ala
Ile238
Ile276
Bindung des Uridins
Ile276Ala
Asp258
Asn297
Bindung der Glukose,
Salzbrücke in der geschlossenen Konformation
Asn297Ala
Glu272
Glu311
Bindung der Ribose,
Salzbrücke in der geschlossenen Konformation
Glu311Ala
58
Ergebnisse
Die Mutagenese des agt Gens erfolgte mittels PCR, bei der die unter 2.3 aufgeführten
Oligonukleotide zur Mutagenese als Startermoleküle und der Vektor pProExHtb-agt als
Matrize verwendet wurden (siehe 2.8.8). Eine anschließende Sequenzierung der neuen
Plasmide bestätigte die gewünschten Basenaustausche (siehe 2.8.9); weitere Veränderungen
der Basensequenz traten nicht auf. Die mutierten Proteine konnten dann wie das Wildtyp
Enzym überexprimiert und gereinigt werden (siehe 2.7.4 und 2.9.6). Im Gegensatz zu allen
anderen Mutanten ließ sich Glu311Ala, quantitativ und qualitativ gesehen, wesentlich
schlechter isolieren als die Wildtyp α-Glukosyltransferase.
3.7.2 Sekundärstrukturanalyse
Bei der Mutagenese wurde immer nur eine einzelne Aminosäure ausgetauscht. Es ist eher
unwahrscheinlich, dass sich dadurch die Gesamtstruktur des Proteins verändert. Trotzdem
sollte diese Möglichkeit ausgeschlossen werden, da eine veränderte Aktivität des mutierten
Proteins nur bei gleichbleibender Struktur einen Rückschluss auf die katalytische Relevanz
der ausgetauschten Aminosäure zulässt. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie kann die
Sekundärstrukturverteilung innerhalb eines Proteins berechnet werden; das Ergebnis dieser
Analyse ist allerdings von der Probenkonzentration abhängig. Daher wurden die Spektren der
Mutanten und des Wildtyp Enzyms bei möglichst identischer Proteinkonzentration gemessen
(siehe 2.9.12). Die Spektren verliefen alle parallel zu einander und variierten nur in der
Amplitude (Abb. 3.14 a-c). Eine Ausnahme stellte die Mutante Glu311Ala dar, deren
Spektrum sich von den anderen deutlich unterschied (Abb. 3.14 c).
59
Ergebnisse
a)
b)
c)
Abb. 3.14: CD-Spektren der Mutanten und der Wildtyp α-Glukosyltransferase.
Dargestellt ist der circulare Dichroismus (CD [mdeg]) gegen die
Wellenlänge [nm].
a) Wildtyp
‫ــــــــــ‬
Glu22Ala -----Met231Ala ············
b) Ile276Ala ‫ــــــــــ‬
Arg236Ala -----Arg256Ala ············
c) Asn297Ala ‫ــــــــــ‬
Ser106Ala -----Glu311Ala ············
60
Ergebnisse
Aus diesen Daten konnte eine Sekundärstrukturverteilung berechnet werden, wobei CDSpektren von Proteinen mit bekannter Struktur als Referenz dienten (siehe 2.9.12). In der
Abbildung 3.15 ist exemplarisch die mathematische Anpassung des CD-Spektrums des
α-Glukosyltransferase Wildtyp Enzyms dargestellt. Die Differenz zwischen dem gemessenen
Spektrum (durchgezogene Linie) und dem daraus berechneten Spektrum (gestrichelte Linie)
wird durch eine punktierte Linie angegeben.
Abb. 3.15: Mathematische Anpassung des CD-Spektrums der α-Glukosyltransferase, berechnet
mit dem Programm “Protein Secondary Structure Estimation”.
Graphische Darstellung des circularen Dichroismus (CD [mdeg]) in Abhängigkeit von
der Wellenlänge [nm].
Die prozentualen Anteile an α-Helices und β-Faltblättern in allen gemessenen Enzymen
sind in der Tabelle 3.5 aufgelistet. Die Anzahl an α-Helices wich im Schnitt um 1 % vom
Wildtyp ab; die stärkste Abweichung lag bei Ile276Ala mit 4 % vor. Für die Verteilung der
β-Faltblätter betrug die Differenz zum Wildtyp durchschnittlich 2,5 %. Hier wies die Mutante
Glu22Ala mit 7 % den größten Unterschied auf. Die Mutante Glu311Ala, deren CD-Spektrum
sich von den anderen Spektren deutlich unterschied, zeigte in der prozentualen
Sekundärstrukturverteilung vergleichsweise geringe Abweichungen vom Wildtyp. Trotzdem
kann für diese Mutante eine vom Wildtyp abweichende Struktur nicht ausgeschlossen werden.
61
Ergebnisse
Tab. 3.5: Prozentuale Verteilung der α-Helices und der β-Faltblätter in den Mutanten und in der Wildtyp
α-Glukosyltransferase, berechnet mit dem Programm “Protein Secondary Structure Estimation”.
AGT Glu22Ala Ser106Ala Met231Ala Arg236Ala Arg256Ala Ile276Ala Asn297Ala Glu311Ala
12,1
14,5
13,9
12,4
12,1
12,1
16,1
13,9
12,5
β-Faltblatt 51,4
44,4
49,1
46,2
49,7
49,7
46
52,7
53,2
α-Helix
3.7.3 Gesamtaktivität der Mutanten
Die Gesamtaktivität der Mutanten wurde genauso wie die des Wildtyp Enzyms anhand der
Übertragung der
radioaktiven
14
C-Glukose von UDPG auf die T4* DNA ermittelt (siehe 2.9.7). Von der
Markierung der DNA konnte auf den Substratumsatz
pro Stunde
zurückgerechnet werden, der sowohl für die Mutanten als auch für den Wildtyp in der
Abbildung 3.16 in Abhängigkeit von der eingesetzten Substratkonzentration dargestellt ist.
60
AGT
UDPG-Umsatz [pmol/min]
50
Glu22Ala
Ser106Ala
40
Met231Ala
Arg236Ala
30
Arg256Ala
Ile276Ala
20
Asn297Ala
Glu311Ala
10
0
0
10
20
30
40
50
60
UDPG [µM]
Abb. 3.16: Aktivität der Mutanten und der Wildtyp α–Glukosyltransferase in
Abhängigkeit von der Substratkonzentration. Graphische Darstellung
der Enzymaktivität [pmol / min] gegen die UDPG-Konzentration [µM].
Es wurden jeweils 0,1 µg Enzym eingesetzt.
Die
prozentuale
Restaktivität
der
Mutanten
ließ
sich
aus
der
maximalen
Reaktionsgeschwindigkeit ablesen; die Aktivität der Wildtyp α-Glukosyltransferase wurde
dabei gleich 100 % gesetzt (Tab. 3.6). Außerdem wurden von jeder Mutante der Km-Wert für
UDPG und die spezifische Aktivität errechnet. Demnach ergab sich für die Mutanten
62
Ergebnisse
Met231Ala und Glu311Ala eine Restaktivität von 2 %. Glu22Ala mit einer Aktivität von
50 % wies einen um den Faktor 6,5 erhöhten Km-Wert auf und eine um 40 % reduzierte
spezifische Aktivität. Für Ser106Ala wichen diese Werte in geringerem Maße vom Wildtyp
ab, die Gesamtaktivität betrug 111 %. Arg236Ala hatte mit einem 27fach erhöhten Km-Wert
eine schlechte Affinität zu UDPG, die Aktivität der Mutante lag bei 27 %. Die Proteine
Arg256Ala, Ile276Ala und Asn297Ala wiesen mit 93 – 96 % eine dem Wildtyp
entsprechende Aktivität auf. Der Km-Wert nahm für Arg256Ala um den Faktor 67, für
Ile276Ala um den Faktor 15 zu. Die entsprechenden spezifischen Aktivität lagen 7fach bzw.
2fach höher als beim Wildtyp Enzym.
Tab. 3.6: Kinetische Daten der Mutanten. Angegeben wird ihre Aktivität in % bezogen auf die Aktivität der
Wildtyp α-Glukosyltransferase (100 %), der Km-Wert für UPDG und die spezifische Aktivität.
Enzym
Aktivität [%] Km-Wert [10-6M]
spez. Aktivität [µmol/h * mg Enzym]
ΑGT Wildtyp
100
4,75
33,33
Glu22Ala
50
30,92
20,27
Ser106Ala
111
12,88
38,7
Met231Ala
2
0,09
0,78
Arg236Ala
27
129
33
Arg256Ala
96
318
240
Ile276Ala
94
73,7
61,8
Asn297Ala
93
15,11
29,27
Glu311Ala
2
0,4
0,34
63
Ergebnisse
3.7.4 Experimente zur DNA-Retardation
Die Fähigkeit eines Proteins, DNA zu binden, kann in DNA-Retardationsexperimenten
nachgewiesen werden. Da die Bindung der α-Glukosyltransferase sequenzunabhängig sein
muß, erfolgte die Auswahl der DNA nur nach der Größe. Für den Nachweis einer Retardation
im Agarosegel kommen DNA-Fragmente im Bereich einiger hundert Basenpaare in Frage, so
dass sich das 600 bp große PCR-Produkt modA anbot (siehe 2.8.6). Um das geeignete
Protein : DNA – Verhältnis herauszufinden, wurden zunächst unterschiedliche Mengen an
α-Glukosyltransferase mit je 50 ng DNA in An- und Abwesenheit von UDPG inkubiert und
diese Komplexe über ein Agarosegel aufgetrennt (siehe 2.9.11). Aus der Abbildung 3.17 geht
hervor, dass bei einer Enzymmenge von 10 µg eine maximale DNA-Retardation gewährleistet
ist. Dieses Protein : DNA – Verhältnis wurde daher beibehalten. Bei gleicher Enzymmenge
unterschied sich die Migration der DNA in den Ansätzen mit und ohne UDPG nicht; die
DNA-Bindung der α-Glukosyltransferase scheint also vom Substrat UDPG unabhängig zu
sein.
M
K 0,5 1,25 2,5 5 7,5 10 0,5 1,25 2,5 5 7,5 10 M
1000 bp -
- 1000 bp
600 bp -
- 600 bp
ohne UDPG
mit UDPG
Abb. 3.17: Retardation unmodifizierter DNA durch die α-Glukosyl-transferase in
einem 1,5 %igen Metaphor Agarosegel. 0-10 µg Enzym wurden mit je
50 ng DNA mit bzw. ohne 2 mM UDPG 20 min bei 4 °C inkubiert.
linke Bildhälfte: ohne UDPG
rechte Bildhälfte: mit 2 mM UDPG
M: 100bp Leiter
K: Kontrolle (0 µg Enzym)
0,5 – 10: 0,5 – 10 µg Enzym
Diese ersten Retardationsexperimente wurden mit unmodifizierter DNA durchgeführt; in
vivo müsste die α-Glukosyltransferase jedoch 5'-Hydroxymethyl-Cytosin-haltige DNA
(T4* DNA) bzw. T4 Wildtyp DNA binden. Um die Affinität des Enzyms zu dieser
64
Ergebnisse
modifizierten DNA untersuchen zu können, erfolgte zunächst ein Verdau der T4 Wildtyp
DNA mit den Endonukleasen NdeI und EcoRV bzw. der T4* DNA mit EcoRV (siehe 2.8.3).
Nach einer elektrophoretischen Auftrennung der Reaktionsansätze (siehe 2.8.4) konnten ein
ca. 700 bp großes Fragment der T4* DNA und ein ca. 750 bp großes Fragment der Wildtyp
DNA aus dem Gel isoliert werden (siehe 2.8.5). Diese beiden Fragmente wurden daraufhin
zur DNA-Retardation eingesetzt (Abb. 3.18). Genauso wie bei der unmodifizierten DNA
wurden die Bindungseigenschaften der α-Glukosyltransferase von UDPG nicht beeinflusst.
Die Retardation der DNA entsprach wie im ersten Versuchsansatz dem Migrationsverhalten
eines um 400 bp größeren DNA-Fragmentes und war damit reproduzierbar und unabhängig
von einer Modifikation der DNA.
M
K
UDPG
K
UDPG
M
1100 bp -
- 1100 bp
700 bp -
- 700 bp
T4* DNA
T4 WT DNA
Abb. 3.18: Retardation von unglukosylierter (T4*) und glukosylierter
(T4 WT) 5'-Hydroxy-methyl-Cytosin-haltiger DNA in
einem 1,5 %igen Metaphor Agaroselgel. Je 10 µg
α-Glukosyltransferase wurden mit 50 ng DNA in An- und
Abwesenheit von 2 mM UDPG 20 min bei 4 ° inkubiert.
- UDPG: ohne UDPG
+ UDPG: mit 2 mM UDPG
M: 100 bp Leiter
K (T4* DNA):
Kontrolle (T4* DNA ohne Enzym)
K (T4 WT DNA): Kontrolle (T4 WT DNA ohne Enzym)
Für die Retardationsexperimente mit den Mutanten wurden je 10 µg Enzym und 50 ng
PCR-Produkt modA in An- und Abwesenheit von UDPG eingesetzt (Abb. 3.19). Als
Positivkontrolle diente ein Ansatz mit α-Glukosyltransferase Wildtyp Enzym (Spur 1). Die
Proteine zeigten sehr unterschiedliche DNA-Bindungseigenschaften, die zum Teil auch vom
Substrat UDPG beeinflusst wurden. Eine maximale DNA-Retardation durch Glu22Ala
erfolgte nur in Anwesenheit von UDPG (Spuren 2 und 10). Die Proteine Ser106Ala und
65
Ergebnisse
Arg236Ala interagierten ohne UDPG lediglich mit 50 % der DNA und retardierten diese dann
auch nur sehr schwach (Spuren 3 und 5). Mit UDPG erfolgte allerdings eine vollständige und
wesentlich stärkere Retardation (Spuren 11 und 13). Überhaupt keine DNA-Bindung zeigten
die Mutanten Met231Ala und Glu311Ala (Spuren 4 und 12, 9 und 17). Die Retardation des
PCR-Produktes durch Arg256Ala in Abwesenheit von UDPG entsprach dem Laufverhalten
eines 300 bp größeren DNA-Fragmentes und konnte durch UDPG etwas gesteigert werden
(Spuren 6 und 14). Ile276Ala und Asn297Ala verhielten sich wie die Wildtyp
α-Glukosyltransferase (Spuren 7 und 15, 8 und 16).
Zusammenfassend konnte also für die Mutanten Glu22Ala, Ser106Ala, Arg236Ala und
Arg256Ala eine UDPG - abhängige und im Vergleich zum Wildtyp schwächere
DNA-Bindung beobachtet werden. Met231Ala und Glu311Ala wiesen keine Affinität zur
DNA auf. Für die in diesen Proteinen ausgetauschten Aminosäuren wird entweder eine
katalytische bzw. strukturgebende Funktion postuliert (Glu22, Ser106 und Glu311) oder eine
Beteiligung an der DNA-Interaktion vermutet (Met231, Arg236 und Arg256) (vergleiche Tab.
3.4).
M K 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M
1000 bp -
- 1000 bp
600 bp -
- 600 bp
ohne UDPG
Abb. 3.19:
mit UDPG
Retardation unmodifizierter DNA durch die Mutanten und die Wildtyp
AGT in einem 1,5 %igen Metaphor Agarosegel. Je 10µg Enzym
wurden mit 50 ng DNA in An- und Abwesenheit von 2 mM UDPG
20 min bei 4 °C inkubiert.
M: 100bp Leiter
K: Kontrolle (ohne Enzym)
1: AGT
6 und 14: Arg256Ala
2 und 10: Glu22Ala
7 und 15: Ile276Ala
3 und 11: Ser106Ala
8 und 16: Asn297Ala
4 und 12: Met231Ala
9 und 17: Glu311Ala
5 und 13: Arg236Ala
1 - 9: ohne UDPG
10 - 17: mit UDPG
66
Ergebnisse
3.7.5 UDPG-Umsatz
Nachdem die Enzyme bereits hinsichtlich ihrer Gesamtaktivität und ihrer DNABindungseigenschaften charakterisiert worden waren, sollte nun auch die UDPG-Spaltung
isoliert betrachtet werden. Die chromatographische Trennung von UDPG und seinem
Spaltprodukt UDP erfolgte mittels HPLC über eine C18-Säule (siehe 2.9.10). Die Abbildung
3.20 zeigt das Absorptionsspektrum eines über die C18-Säule aufgetrennten UDPG / UDP –
Gemisches innerhalb eines Wellenlängenbereichs zwischen 200 nm und 300 nm. Bei 206 nm
und 265 nm erscheinen jeweils zwei Maxima, wobei die Maxima bei 265 nm größer und
deutlicher voneinander zu trennen sind. Eine Detektion der Einzelsubstanzen bei letzterer
Wellenlänge legte für diese Säule eine Retentionszeit des UDPG von 2,962 min und des UDP
von 3,804 min fest (Abb. 3.21).
Abb. 3.20: Absorptionsspektrum eines UDP / UDPG – Gemisches.
Isoplot-Darstellung der Absorption eines Gemisches aus je 1 mM UDP und UDPG in
Abhängigkeit von der Wellenlänge (200 – 300 nm) und der Retentionszeit (0 – 6 min).
67
Ergebnisse
mAU
265 nm
600
400
200
2
UDP
1
UDPG
-100
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
Abb. 3.21: Elutionsprofil von UDP und UDPG.
Graphische Darstellung der Absorption des Eluats von 1 mM UDP bzw. 1 mM
UDPG [mAU] über eine C18-Säule bei 265 nm gegen die Zeit [min].
Im Folgenden wurde die enzymatische Spaltung von UDPG analysiert, indem der
Reaktionsansatz über die Säule aufgetrennt und die Absorption des Eluats bei 265 nm über
einen Zeitraum von 5 min aufgezeichnet wurde (siehe 2.9.10). Nach einer 16-stündigen
Inkubation von 100 nMol UDPG mit 0 – 100 µg α-Glukosyltransferase konnte mit steigender
Enzymkonzentration in zunehmendem Maße UDP nachgewiesen werden (Abb. 3.22). Der
Kontrollansatz ohne Enzym zeigte, dass das UDPG über diesen langen Zeitraum stabil blieb.
10 µg der α-Glukosyltransferase setzten ca. 50 % des Substrats um, während 50 µg des
Enzyms bereits eine vollständige UDPG-Spaltung gewährleisteten.
800
WVL:265 nm
mAU
500
250
7
6
0
5
4
-250
3
2
1
-600
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
Abb. 3.22: UDPG-Spaltung in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration.
Es wurden 0 – 100 µg α-Glukosyltransferase mit je 100 nMol UDPG 16 h bei 30 °C
inkubiert. Jeder Ansatz wurde dann über eine C18-Säule getrennt. Dargestellt ist die
Absorption der Eluate [mAU] bei 265 nm gegen die Zeit [min].
68
Ergebnisse
Die enzymatische Aktivität der Mutanten wurde schließlich in jeweils zwei
Reaktionsansätzen mit 10 µg und 50 µg Enzym analysiert. Diese Doppelbestimmung schloss
die
Möglichkeit,
dass
aufgrund
der
langen
Inkubationszeit
eine
langsamere
Reaktionsgeschwindigkeit nicht detektiert würde, aus. In der Abbildung 3.23 sind die beiden
Elutionsspektren für jedes Enzym graphisch dargestellt. Die Ansätze mit Glu22Ala enthielten
nur bei der Verwendung von 50 µg Enzym eine geringe Menge UDP, während in den Proben
mit Ser106Ala bereits bei 10 µg des Proteins eine partielle Umsetzung des Substrats und bei
50 µg Enzym eine vollständige UDPG-Spaltung erfolgte (Abb. 3.23 a und b). Zu jeweils
gleichen Teilen ließen sich UDPG und UDP in dem Ansatz mit 10 µg Met231Ala detektieren;
die entsprechende Probe mit 50 µg Enzym enthielt nur noch UDP (Abb. 3.23 c). Die Analyse
der Reaktionen mit Arg236Ala, Ile276Ala und Asn297Ala ergab mit 10 µg Protein eine starke
und mit 50 µg der jeweiligen Mutante eine komplette Substratumsetzung (Abb. 3.23 d, f und
g). Arg256Ala spaltete UDPG in beiden Ansätzen zu 100 %, während Glu311Ala gar keine
Aktivität zeigte (Abb. 3.23 e und h).
Ein im Vergleich zum Wildtyp reduzierter UDPG-Umsatz konnte also nur durch den
Austausch der als katalytisch relevant postulierten Aminosäure Glu22 erreicht werden. Ein
Austausch der vermutlich strukturgebenden und an der UDPG-Bindung beteiligten
Aminosäure Glu311 bewirkte sogar den vollständigen Verlust der Fähigkeit, UDPG zu
spalten.
a)
mAU
265 nm
375
250
125
2
1
-50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
69
Ergebnisse
b)
mAU
265 nm
300
200
100
50 µg Ser106Ala
2
10 µg Ser106Ala
1
-50
0,00
c)
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
min
5,00
4,50
mAU
265 nm
375
250
125
50 µg Met231Ala
2
10 µg Met231Ala
1
-50
0,00
d)
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
min
5,00
4,50
mAU
265 nm
300
200
100
50 µg Arg236Ala
2
10 µg Arg236Ala
1
-50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
e)
mAU
265 nm
250
125
2
1
-50
0,00
50 µg Arg256Ala
10 µg Arg256Ala
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
70
Ergebnisse
f)
mAU
265 nm
250
125
2
50 µg Ile276Ala
1
10 µg Ile276Ala
-50
0,00
g)
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
mAU
min
5,00
265 nm
250
125
2
50 µg Asn297Ala
1
10 µg Asn297Ala
-50
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
h)
mAU
265 nm
400
200
2
50 µg Glu311Ala
1
10 µg Glu311Ala
-100
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
min
5,00
Abb. 3.23: UDPG-Spaltung durch die α-Glukosyltransferase Mutanten.
10 µg bzw. 50 µg Enzym wurden mit je 100 nMol UDPG 16 h bei
30 °C inkubiert. Anschließend erfolgte eine Auftrennung der Ansätze
über eine C18-Säule. Dargestellt ist die Absorption der Eluate [mAU]
bei 265 nm gegen die Zeit [min].
a) Glu22Ala
b) Ser106ala
c) Met231Ala d) Arg236Ala
e) Arg256Ala f) Ile276Ala
g) Asn297Ala h) Glu311Ala
71
Diskussion
4 Diskussion
4.1 Reinigung der α-Glukosyltransferase
Die α-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4 wurde erstmals von Josse und Kornberg
1962 gereinigt. Damals erfolgte ihre Isolierung aus T4 infizierten E. coli Zellen nach einem
Protokoll, das die gleichzeitige Reinigung der α- und der β-Glukosyltransferase erlaubte
(Josse & Kornberg, 1962). Die Klonierung der Gene beider Glukosyltransferasen ermöglichte
schließlich 1985 die Reinigung der rekombinanten Enzyme (Tomaschewski et al., 1985).
Während die Röntgenstruktur der BGT kurze Zeit später gelöst werden konnte, blieb die AGT
diesbezüglich uncharakterisiert (Freemont & Rüger, 1988; Vrielink et al., 1994). Die
Etablierung eines neuen Reinigungsprotokolls sollte die Strukturaufklärung und eine weitere
Analyse der α-Glukosyltransferase voranbringen.
Um die Isolierung des rekombinanten Proteins über eine Metallaffinitätschromatographie
durchführen zu können, wurde das agt Gen zunächst in den Überexpressionsvektor
pProExHtb kloniert, der vor der multiplen Klonierungsstelle für eine Poly-Histidin-Sequenz
kodiert. Die Fusion der AGT mit dieser Aminosäure-Folge sollte eine selektive Bindung des
Proteins an die Säulenmatrix ermöglichen und dadurch den Reinheitsgrad des isolierten
Enzyms im Vergleich zum ursprünglichen Reinigungsprotokoll erhöhen. Mit Hilfe dieses
Konstruktes ließ sich die α-Glukosyltransferase jedoch so stark exprimieren, dass ein Großteil
des Proteins als Einschlusskörper vorlag. Die Reinigung von Einschlusskörpern muss immer
mit einer Renaturierung des Proteins einhergehen, deren Effektivität von vielen Parametern
beeinflusst wird und nur empirisch ermittelt werden kann (Kopetzki et al., 1989). Außerdem
könnte die De- und anschließende Renaturierung zu Fehlfaltungen des Enzyms führen, was
nicht nur einen Aktivitätsverlust des Proteins zur Folge hätte sondern auch der Kristallisation
entgegenwirken würde. Um diese Problematik zu umgehen, erfolgte die Isolierung der
α-Glukosyltransferase nur aus dem löslichen Anteil des E. coli Zellextraktes. Hier lag das
Enzym lediglich in geringen Mengen vor, die aber über die Detektion der Poly-HistidinFusion im Western Blot eindeutig nachweisbar waren.
Die α-Glukosyltransferase wurde säulenchromatographisch in zwei Schritten gereinigt,
denen beiden das Prinzip der reversiblen Interaktion von Histidinen mit Metallionen zugrunde
lag (Porath, 1985; Zhao et al., 1991). An der Talon-Säule mit immobilisiertem Kobalt konnte
die AGT sehr selektiv gebunden und bereits im ersten Waschschritt fast vollständig von den
restlichen
Proteinen
des
Zellextrakts
getrennt
werden.
Die
Entfernung
weiterer
72
Diskussion
Kontaminationen und die anschließende Elution der AGT erfolgte über einen abnehmenden
pH-Gradienten, der eine Protonierung der Histidine und so ihre Abstoßung von den positiv
geladenen Metallionen bewirkte. Die AGT wies leider ein sehr breites Elutionsspektrum auf,
das möglicherweise durch eine weitere Herabsetzung des pH-Wertes hätte eingeengt werden
können. Um aber die Stabilität und Aktivität des Enzyms nicht zu beeinträchtigen, wurde der
vom Hersteller empfohlene pH von 6,0 nicht unterschritten.
Durch die Verwendung einer zweiten Säulenmatrix mit immobilisiertem Nickel konnte
das Enzym schließlich gänzlich von kontaminierenden Proteinen gereinigt und gleichzeitig
aufkonzentriert werden. Die Elution erfolgte hier durch Imidazol, das identisch zur HistidinSeitenkette ist und das gebundene Protein kompetitiv verdrängt.
Densitometrisch wurde für die isolierte α-Glukosyltransferase eine Reinheit von 96 %
errechnet; in einem silbergefärbten SDS-Polyacrylamidgel konnten neben dem gereinigten
Enzym keine weiteren Proteine nachgewiesen werden. Da der größere Anteil des exprimierten
Enzyms in Einschlusskörpern vorlag, die für die Reinigung nicht verwendet wurden, war die
Ausbeute mit 4 mg AGT aus 280 mg Gesamtproteinextrakt erwartungsgemäß geringer als
nach dem 1985 etablierten Protokoll (12 mg aus 304 mg Rohextrakt). Mit einem geringeren
Zeitaufwand konnte so allerdings eine größere Reinheit des Proteins erzielt werden
(vergleiche Tomaschewski et al., 1985; Gram, 1985).
Die Elutionsfraktionen beider Reinigungsschritte enthielten meist ein 26 kDa großes
Protein, das sich erst auf der zweiten Säule mit einer Imidazolkonzentration von 100 mM von
der α-Glukosyltransferase trennen ließ. Es konnte sich hier entweder um ein histidinreiches
kontaminierendes Protein handeln, das eine hohe Affinität zur Säulenmatrix hat, oder um ein
Abbauprodukt der AGT, das die Qualität des gereinigten Proteins in Frage gestellt hätte. Um
Letzteres ausschließen zu können, wurde das 26 kDa Protein mit Trypsin verdaut und
anschließend massenspektrometrisch untersucht. Die Sequenzen der drei analysierten Peptide
ließen sich eindeutig dem E. coli Protein SlyD zuordnen. SlyD ist als beharrliche
Kontamination in Metallaffinitätschromatographien bekannt und wird aufgrund seiner
Sequenz auch als WHP (“wonderous histidine-rich protein” - erstaulich histidinreiches
Protein) bezeichnet (Wülfing et al., 1994).
Als ein Maß für die Qualität der rekombinanten Expression und der anschließenden
Proteinisolierung gelten auch die kinetischen Eigenschaften des gereinigten Enzyms, die in
73
Diskussion
diesem Fall mit der nativen α-Glukosyltransferase aus T4 infizierten E. coli Zellen verglichen
werden können. Josse und Kornberg (1962) bestimmten für die AGT einen Km-Wert für
UDPG von 6,7 * 10-6 M, der gut mit dem für das rekombinante Enzym festgelegten Km-Wert
von 4,75 * 10-6 M übereinstimmt. Die T4 α-Glukosyltransferase verhält sich demnach
genauso wie typische Glykosyltransferasen, die ihr Substrat mit Km-Werten im
Millimol-Bereich eher schwach binden (Takayama et al., 1999).
4.2 Die Regulation der α- und β-Glukosylierung bei T4
Das Verhältnis der α- zur β-Glukosylierung ist bei T4 mit 70 % : 30 % streng festgelegt
(Revel, 1983). Da beide Enzyme während des Infektionszyklus gleichzeitig aktiv sind und die
β-Glukosyltransferase theoretisch 100 % der 5’-Hydroxymethyl-Cytosine glukosylieren kann,
muss
ein
bisher
unbekannter
Mechanismus
die
zeitliche
Reihenfolge
der
DNA-Modifikationen regulieren. Dabei wäre die Einbindung eines der beiden Proteine in
einen Proteinkomplex, der zuerst der α-Glukosyltransferase den Zugang zur DNA gewährt,
eine
denkbare
Erklärung.
Die
Untersuchung
möglicher
Proteininteraktionen
der
α-Glukosyltransferase sollte dieser Hypothese nachgehen.
Proteininteraktionen können auf unterschiedliche Weise nachgewiesen werden. Eine
klassische Methodik ist die Immunpräzipitation, bei der ein Antikörper gegen das
interagierende Protein (Antigen) dem entsprechenden Proteingemisch zugegeben wird
(Phizicky & Fields, 1995). Das Antigen präzipitiert daraufhin, und die an ihm gebundenen
Proteine können anschließend analysiert werden. Bei der Verwendung von Zellextrakten
liegen die Proteine in ihrer natürlichen, eventuell posttranslational modifizierten Form vor
und treten mengenmäßig im richtigen Verhältnis zueinander auf. Diese Vorzüge müssen
gegen die Nachteile dieser Methodik, wie beispielsweise ihre mangelnde Sensitivität
abgewogen werden.
Eine andere, ebenfalls verbreitete Methode ist das chemische “Cross-Linking” (de
Gunzburg et al., 1989). Hier werden interagierende Proteine durch ein bifunktionelles
Reagenz kovalent miteinander verknüpft. Ein Vorteil dieses Ansatzes liegt darin, dass bereits
sehr schwache Interaktionen nachweisbar sind. Außerdem können membran-permeable
“cross-linking” Reagenzien auch in vivo eingesetzt werden. Nachteilig ist allerdings, dass
74
Diskussion
möglicherweise auch Proteine detektiert werden, die nur sehr nah beieinander lokalisiert sind,
ohne direkt miteinander zu interagieren.
Bei der Proteinaffinitätschromatographie wird das zu untersuchende Protein kovalent an
eine Matrix, beispielsweise Sepharose, gebunden (Phizicky & Fields, 1995). Interagierende
Proteine können dann aus einem Proteinextrakt, der über die Säule gegeben wird, selektiert
werden. Ihre Elution erfolgt schließlich durch hohe Salzkonzentrationen. Der wichtigste
Vorteil dieser Technik ist ihre extrem hohe Sensitivität (Formosa et al., 1991). Gleichzeitig
kann es aber auch zu falsch-positiven Ergebnissen kommen, wenn Proteine beispielsweise nur
aufgrund ihrer Ladung miteinander interagieren, oder die Bindung gar nicht direkt erfolgt,
sondern von einem weiteren Faktor vermittelt wird. Auf der Säule können auch Proteine
miteinander interagieren, die sich unter physiologischen Bedingungen in der Zelle niemals
begegnen. Ein prominentes Beispiel dafür ist die hohe Affinität von Aktin zu DnaseI
(Lazarides & Lindberg, 1974).
Die Suche nach Proteinen, die mit der α-Glukosyltransferase interagieren, sollte über eine
modifizierte Proteinaffinitätschromatographie erfolgen. Da das Enzym in gereinigter Form
mit einer N-terminalen Polyhistidinsequenz vorlag, bot es sich an, diese Studie mit Hilfe
magnetischer Nickel-NTA Partikel durchzuführen. Die Verwendung dieser Partikel erlaubte
es, die an die Matrix gebundenen Proteine nicht in einer starren Säule sondern in Lösung
interagieren zu lassen und sie für Wasch- und Elutionsschritte magnetisch aus der Lösung zu
entfernen. Ein weiterer Vorteil waren die kleinen Reaktionsvolumina von minimal 20 µl, in
denen entsprechend hohe Proteinkonzentrationen erreichbar waren.
Die gereinigte α-Glukosyltransferase wurde zunächst selektiv an die Partikel gebunden
und dann entweder mit Proteinextrakten aus uninfizierten E. coli Zellen oder mit T4
infizierten Zellen aus unterschiedlichen Infektionsphasen inkubiert. Bei der Elution der AGT
durch Imidazol ließen sich schließlich die an das Enzym bindenden Proteine isolieren und
über eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese nachweisen. Vor und sechs Minuten nach der
Infektion konnten keine mit der AGT interagierenden Proteine beobachtet werden. Daraus ist
zu schließen, dass es sich bei potentiellen Interaktionspartnern nicht um E. coli Proteine
handelt. Viele T4 Genprodukte, die in der frühen Infektionsphase exprimiert werden, sind
bereits sechs Minuten nach der Infektion nicht mehr nachweisbar und stehen einer Analyse zu
diesem Zeitpunkt also nicht mehr zur Verfügung (Cowan et al., 1994). Es ist allerdings auch
sehr unwahrscheinlich, dass eine essentielle Bindung der α-Glukosyltransferase an diese
Proteine vorliegt, da die Aktivität des Enzyms frühestens während der Synthese neuer
T4 DNA benötigt wird. Die Replikation beginnt jedoch erst parallel zur späten Transkription
75
Diskussion
ca. sechs Minuten nach der Injektion der Phagen DNA (Mathews, 1994). In dieser
Infektionsphase wurden schließlich auch drei mit der AGT interagierende Proteine
nachgewiesen. Eines dieser Proteine konnte massenspektrometrisch als das mittlere Phagen
Genprodukt 45 identifiziert werden. Die Sequenzen der analysierten Peptide stimmten nur in
einer einzigen Position nicht mit der für das Gp 45 veröffentlichten Aminosäuresequenz
überein. Es handelte sich dabei um eine Asparaginsäure, die anstelle eines Asparagins
ermittelt wurde. Während der Probenvorbereitung kam es möglicherweise zu einer Hydrolyse
dieses Restes. Alternativ könnte auch die publizierte Sequenz des Phagenproteins fehlerhaft
sein bzw. sich auf ein Genprodukt eines anderen T4 Serotyps beziehen. Grundsätzlich ist die
Identität dieses Proteins nicht in Frage zu stellen, da in einer weiteren Interaktionsstudie auch
die Bindung des rekombinanten Gp 45 an die Glukosyltransferase nachgewiesen werden
konnte.
Gp 45 bildet zusammen mit der T4 DNA Polymerase das DNA Polymerase Holoenzym
und ist damit ein essentieller Bestandteil des T4 Replisoms (Kaboord & Benkovic, 1995).
Gleichzeitig ist dieses als “sliding clamp” bezeichnete Protein an der Aktivierung der späten
Transkription beteiligt (Xu & Hoover, 2001). Ein weiterer essentieller Bestandteil der
Replikation ist der Gp 44/62 Komplex, der als Chaperon die Bindung von Gp 45 an die DNA
und die Assoziation des DNA-Polymerase Holoenzyms bewirkt (Kaboord & Benkovic,
1996). Dazu katalysiert er unter ATP Hydrolyse zunächst die Bildung eines Gp 45
Homotrimers, das dann eine Konformationsänderung vollzieht und schließlich die DNA als
ringförmiger Komplex umschließt (Latham et al., 1996; Pietroni et al. 1997). Gp 44/62
entfernt sich daraufhin und erlaubt so die Bindung der T4 DNA Polymerase an die “sliding
clamp” (Kaboord & Benkovic, 1995; Berdis & Benkovic, 1996). Für die Replikation der
Phagen DNA werden außerdem das einzelstrangbindende Protein Gp 32, eine DNA Helikase
(Gp 41)
und
die
Primase
(Gp 61)
benötigt.
Die
Röntgenstrukturauflösung
der
DNA Polymerase, von Gp 45 und Gp 32 des T4 ähnlichen Phagen RB69 ermöglichte die
Berechnung eines theoretischen Modells, das die räumliche Orientierung dieser drei Proteine
an der DNA zeigt (Abb. 4.1 a). Die Abbildung 4.1 b zeigt außerdem eine schematische
Anordnung aller an der Replikation beteiligten Phagenproteine in der Replikationsgabel.
Diese Vorstellung muss nun um die Interaktion der α-Glukosyltransferase mit Gp 45 erweitert
werden. Bei den beiden nicht identifizierten, an die AGT bindenden Proteinen liegt die
Vermutung nahe, dass es sich hier ebenfalls um Proteine handelt, die an der Replikation
beteiligt sind. Aufgrund ihres Laufverhaltens im SDS-Polyacrylamidgel bei 31 kDa und
32 kDa kann ihnen allerdings kein bekanntes Genprodukt mit entsprechender Größe
76
Diskussion
zugeordnet werden. Das Protein, das diesem Molekulargewicht noch recht nahe kommt, ist
Gp 44 mit 35,8 kDa. Möglicherweise gehören die beiden Proteine zu den 150 noch nicht
charakterisierten Genprodukten des Phagen.
Abb. 4.1: Hypothetisches Modell der DNA Polymerase Interaktionen und
schematische Darstellung des Replikationskomplex.
a) DNA Polymerase (orange) mit Gp 32 (grün) und Gp 45 (blau)
an der “Template” DNA (rot) mit einem “Primer” (gelb)
(Karam & Königsberg, 2000).
b) Schematische Anordnung der an der Replikation beteiligten
Proteine (DNA Polymerase, Gp 41, Gp 61, Gp 45, Gp 44/62
und Gp 32) an der Replikationsgabel (Nossal, 1994).
Die Einbindung der AGT in das T4 Replisom ermöglicht die α-Glukosylierung der DNA
sofort nach ihrer Synthese. Aufgrund der phageneigenen Nukleasen, die unmodifizierte DNA
degradieren, ist diese Anordnung auch sinnvoll. Gleichzeitig erklärt sich hier die strikte
Verteilung der Glukosereste in der α- bzw. der β-Konfiguration an der T4 DNA. Wenn die
neu synthetisierte Nukleinsäure den Replikationskomplex verlässt, ist sie bereits durch die
α-Glukosyltransferase modifiziert, so dass der β-Glukosyltransferase nur noch die 30 % der
5’-Hydroxymethyl-Cytosine zugänglich sind, die die AGT aus sterischen Gründen nicht
erreichen konnte. Es ist natürlich denkbar, dass auch die BGT im Replikationskomplex
77
Diskussion
lokalisiert ist. Über mögliche Interaktionen der BGT mit anderen Proteinen ist nichts bekannt;
eine Bindung der BGT an die AGT kann aufgrund der Interaktionsstudien jedoch
ausgeschlossen werden.
Warum kodiert der Phage für zwei Glukosyltransferasen, wenn die β-Glukosyltransferase
die DNA auch allein vollständig modifizieren könnte? Möglicherweise wurde die BGT im
Laufe der Evolution als zusätzliches Enzym entwickelt, das dann eine Erweiterung des
Wirtsspektrums ermöglichte. Ohne die Aktivität der BGT ist die T4 DNA genauso wie das
Genom der anderen gradzahligen T-Phagen, T2 und T6, nur zu 75 % glukosyliert; trotzdem
sind diese Viren vermehrungsfähig (Revel, 1983). T2 und T6 besitzen allerdings neben einer
α- auch eine Gentio-Glukosyltransferase, die auf bereits glukosyliertes 5'-HydroxymethylCytosin einen zweiten Zucker überträgt. Eventuell werden hier unglukosylierte Reste durch
eine benachbarte Gentioglykosylgruppe verdeckt, so dass eine vollständige Glukosylierung
der DNA nicht notwendig ist. Es wäre außerdem denkbar, dass die β-Glukosyltransferase als
Reparaturenzym agiert. Da die Phagen DNA während der Replikation einer vielfältigen
Rekombination unterliegt, müssen viele Schnittstellen in den DNA Strängen repariert und
möglicherweise fehlende Glykosylierungen nachträglich eingefügt werden. Letztere Funktion
könnte von der BGT übernommen werden.
4.3 Ansätze zur Aufklärung der α–Glukosyltransferase Struktur
Informationen über die Struktur eines Proteins können auf unterschiedliche Weise erhalten
werden. Eine wichtige Methode zur Strukturaufklärung ist die Röntgenbeugung (Ollis &
White, 1990); sie setzt allerdings zunächst die Kristallisation des Proteins voraus. Eine andere
Technik beruht auf der computergestützten Berechnung von Enzymkoordinaten, die durch
Sequenz- und Strukturvergleiche mit anderen Proteinen ermittelt werden. Mit dieser Methode
können qualitativ hochwertige, allerdings nur theoretische Strukturmodelle erzielt werden
(Sternberg et al., 1999). Für die Charakterisierung von Glykosyltransferasen spielt dieser
Ansatz eine besonders wichtige Rolle, da bisher nur insgesamt neun Proteine dieser
Enzymklasse kristallisiert werden konnten. Die erste Röntgenstruktur wurde anhand der
T4 β-Glukosyltransferase gelöst; daher dient die BGT besonders häufig als Grundlage für die
Modellierung bisher unbekannter Glykosyltransferasestrukturen (Breton & Imberty, 1999;
Imberty et al., 1999).
78
Diskussion
4.3.1 Aspekte zur Kristallisation
Die chemischen und physikalischen Voraussetzungen für die Kristallisation eines Proteins
können nur empirisch ermittelt werden (McPherson, 1990). Ganz entscheidend ist aber
generell die Homogenität der Probe. Dazu gehört einerseits die Reinheit, andererseits aber
auch die einheitliche Faltung des zu analysierenden Proteins. Obwohl die gereinigte
α-Glukosyltransferase keine detektierbaren Kontaminationen aufwies, ließ sie sich nicht
kristallisieren. Eine Heterogenität der Probe beispielsweise durch die Denaturierung eines
Teils der Proteine kann nicht ausgeschlossen werden, ist aber unwahrscheinlich, da für das
Enzym keine Aktivitätsverluste nachgewiesen werden konnten. Es wäre allerdings möglich,
dass die α-Glukosyltransferase aufgrund einer dynamischen Struktur eine instabile bzw.
variable Konformation besitzt. Die AGT ist in vitro ohne weitere Co-Faktoren oder andere
Proteine aktiv. In vivo interagiert sie allerdings mit dem Gp 45 und mit mindestens zwei
weiteren, nicht identifizierten Proteinen. Das bedeutet, dass neben der DNA-Bindung auch für
eine Reihe anderer Interaktionen spezifische Strukturen auf der Proteinoberfläche exponiert
sein müssen. Unter der Annahme, dass die AGT ähnlich wie die BGT für die DNA-Bindung
eine Konformationsänderung durchläuft, sollten diese Domänen recht flexibel sein. Das
würde sich allerdings nachteilig auf die Strukturanalyse auswirken, da kompakte Moleküle
einfacher kristallisieren (Ollis & White, 1990). Inhibitoren, die die α-Glukosyltransferase in
einer unbeweglicheren Form halten, könnten eventuell die Kristallbildung unterstützen. Ein
Beispiel für die erfolgreiche Strukturauflösung einer Glykosyltransferase im Komplex mit
einem unspaltbaren Donoranalogon ist die Röntgenbeugung der Galaktosyltransferase LgtC
(Persson et al., 2001). Für die Inhibition der α-Glukosyltransferase kämen Substanzen in
Frage, deren hemmende Wirkung auf die β-Glukosyltransferase bereits nachgewiesen ist und
mit denen inzwischen Co-Kristalle der BGT charakterisiert werden konnten (Bhattacharya et
al., 2001; noch nicht veröffentlichte Daten Solange Moréra).
4.3.2 Strukturmodell
Wenn die Kristallstruktur eines Proteins nicht zur Verfügung steht, kann die theoretische
Berechnung der Struktur und ihre anschließende Verifizierung durch ortsspezifische
Mutagenese eine attraktive Alternative darstellen (Bates et al., 1992). Der Vergleich der
Aminosäuresequenz bzw. der darauf beruhenden, möglichen Sekundärstrukturen der
79
Diskussion
α-Glukosyltransferase mit Proteinen bekannter 3D-Struktur ermittelte starke Homologien der
AGT zur β-Glukosyltransferase von T4. Auf dieser Grundlage konnte dann ein theoretisches
Strukturmodell der AGT errechnet werden (siehe 3.6). Die AGT und die BGT entstammen
nicht
nur
demselben
Organismus,
sondern
besitzen
auch
dieselbe
Donor-
und
Akeptorspezifität; lediglich die Konformation des übertragenen Zuckers differiert. Holm und
Sander (1995) vermuteten bereits eine divergente evolutionäre Verwandtschaft der α- und der
β-Glukosyltransferase, deren geringe Sequenzhomologie (ca. 16 %) vielen strukturellen
Gemeinsamkeiten gegenübersteht. Sie errechneten für die beiden Enzyme ein ähnliches
Hydrophobizitätsmuster und ein erstaunlich übereinstimmendes elektrostatisches Feld.
Außerdem wurde eine Konservierung der Aminosäure Glu272 in der BGT postuliert. Diese
Aussagen sollten allerdings aufgrund einer fehlenden experimentellen Grundlage als rein
spekulativ verstanden werden (Holm & Sander, 1995).
Die Struktur der β-Glukosyltransferase zeigt nicht nur zu anderen Glykosyltransferasen
charakteristische Homologien, sondern darüber hinaus auch zur Glykogenphosphorylase
(Artymiuk et al., 1995; Ünligil & Rini, 2000). Die strukturellen Übereinstimmungen enthalten
dabei immer die Region der Substratbindung. Im Fall der Glykogenphosphorylase kann sogar
die gesamte Struktur der BGT mit dem katalytischen Kern des Glykogen abbauenden Enzyms
überlagert werden (Holm & Sander, 1995). Die Homologien gehen hier soweit, dass
einzelnen Aminosäuren äquivalente Funktionen zugeordnet werden (Artymiuk et al., 1995).
Strukturelle Homologien wurden außerdem zwischen der β-Glukosyltransferase und den
Glykosyltransferasen GtfB und UDP-N-Acetylglukosamin 2-Epimerase nachgewiesen
(Campbell et al., 2000; Mulichak et al., 2001). Auch die membran-assoziierte
Glykosyltransferase MurG weist große Übereinstimmungen mit der BGT auf (Ha et al.,
2000). In der Abbildung 4.2 sind die Strukturen der BGT, GtfB und MurG und das Modell
der α-Glukosyltransferase vergleichend dargestellt. Besonders auffällig ist die konservierte
Anordnung der β-Faltblätter (Mulichak et al., 2001).
80
Diskussion
Abb. 4.2: Kristallstrukturen der Glykosyltransferasen β-Glukosyltransferase (BGT),
GtfB und MurG und das Modell der α-Glukosyltransferase (AGT) in der
“Ribbon”-Präsentation (verändert nach Mulichak et al., 2001).
Für BGT, MurG und GtfB wird ein gemeinsamer evolutionärer Ursprung postuliert. Obwohl
sie unterschiedlichen Glukosyltransferasefamilien angehören, werden sie einer gemeinsamen
Superfamilie zugeordnet (Ünligil & Rini, 2000; Mulichak et al., 2001). Unter der Annahme,
dass die theoretische Struktur der α-Glukosyltransferase generell ihren tatsächlichen
Enzymdaten entspricht, könnte die AGT ebenfalls hier eingruppiert werden.
Bei einem Vergleich des aktiven Zentrums in der BGT Struktur und im AGT Modell muss
berücksichtigt werden, dass die BGT, genauso wie MurG und GtfB, eine invertierende
Glykosyltransferase ist, während die von der AGT katalysierte Reaktion zu einer Retention
der Zuckerkonfiguration führt. Diesen beiden katalytischen Mechanismen liegen, wie
einleitend erläutert, unterschiedliche chemische Reaktionen zugrunde (siehe 1.2). Die einzige
kristallisierte Glykosyltransferase, die die Übertragung eines Zuckers unter Retention
katalysiert, ist die Galaktosyltransferase LgtC. Der Vergleich mit bekannten Strukturen
invertierender
Glykosyltransferasen
zeigt
einen
deutlichen
Unterschied
in
der
81
Diskussion
donor-bindenden Spalte (Persson et al., 2001). In der LgtC ist diese Struktur wesentlich tiefer
und weniger exponiert als beispielsweise bei SpsA, BGT oder der bovinen β-1-4Galaktosyltransferase I. Dieser Befund reflektiert möglicherweise die Notwendigkeit in den
die Konfiguration erhaltenden Enzymen, das aktive Zentrum vom Außenmilieu abzugrenzen,
um ein reaktives Glykosyl-Enzym Intermediat bilden zu können. Trotzdem liegen auch hier
signifikante Strukturhomologien im Nukleotid-Bindemotiv vor, insbesondere zwischen LgtC
und
der
β-1-4-Galaktosyltransferase I
bzw.
SpsA
(Persson
et
al.,
2001).
Die
Allgemeingültigkeit dieses Motivs bei nukleotid-bindenden Enzymen wird auch in der
Homologie des aktiven Zentrums der Nukleotidylyltransferase EP zur entsprechenden Struktur
der Glykosyltransferase SpsA deutlich (Barton et al., 2001).
4.4 Ortsspezifische Mutagenese
Das Strukturmodell eines Proteins kann lediglich Hinweise darauf geben, wie das Protein
theoretisch aussehen und welchem Reaktionsmechanismus es folgen könnte (Imberty et al.,
1999). Selbst anhand einer Röntgenstruktur wird nur eine rigide Zustandsform des Proteins
dargestellt, die zwar, wie im Fall der β-Glukosyltransferase, Interaktionen einzelner
Aminosäuren mit dem Substrat aufzeigen kann, jedoch keine definitive Aussage über den
katalytischen Vorgang zulässt (Moréra et al., 1999). Auf diesen Grundlagen basierende
Hypothesen hinsichtlich der Reaktionsweise eines Enzyms müssen daher durch kinetische
Untersuchungen verifiziert werden.
Für einige Aminosäuren der β-Glukosyltransferase konnte eine spezifische Interaktion mit
dem UDP-Anteil des Substrats nachgewiesen werden; bezüglich der an der Katalyse und an
der DNA-Bindung beteiligten Positionen erlaubt die Röntgenstruktur allerdings nur eine
hypothetische Aussage (siehe Abb. 1.3 und 1.4). Anhand des Sekundärstrukturalignments der
AGT mit der BGT fiel besonders die Konservierung dieser möglicherweise essentiellen
Aminosäuren auf, so dass deren potentielle Funktion auch für die entsprechenden Positionen
in der AGT angenommen wird. Anhand einer ortsspezifischen Mutagenese sollte diese
Vorhersage bestätigt werden. Insgesamt wurden acht Aminosäuren jeweils einzeln
ausgetauscht; drei von ihnen sollten in der DNA-Bindung, drei weitere in der
UDPG-Interaktion involviert sein. Zwei Mutationen betrafen die für die Katalyse als
essentiell postulierten Positionen.
82
Diskussion
Bei der Modifikation einer Aminosäuresequenz muss die Möglichkeit einer Veränderung
der Enzymstruktur in Betracht gezogen werden, wodurch dann nur noch auf eine
strukturgebende Funktion der mutierten Position, nicht aber auf eine Beteiligung an der
Katalyse geschlossen werden könnte. Der Austausch einer einzelnen Aminosäure beeinflusst
eher selten die Struktur eines Enzyms. Für die RnaseA konnte allerdings gezeigt werden, dass
schon die Mutation einer einzigen Position die Stabilität der Enzymkonformation drastisch
beeinträchtigen kann (Quirk et al., 1998).
Die Sekundärstrukturanalyse eines Proteins kann mittels CD-Spektroskopie erfolgen, die
empfindlich auf eine veränderte Strukturverteilung reagiert (Greenfield et al., 1998; Wang et
al., 2001). Auf diese Weise ist der direkte Vergleich eines mutierten Proteins mit dem
entsprechenden Wildtyp Enzym möglich (Baskakov & Bolen, 1998). Die CD-Spektren der
α-Glukosyltransferase Mutanten wichen nur in einem Fall, Glu311Ala, von dem Spektrum
des Wildtyps ab (siehe 3.7.2). Da sich Glu311Ala im Gegensatz zu allen anderen
AGT Derivaten auch wesentlich schlechter reinigen ließ, kann eine veränderte Gesamtstruktur
für dieses Enzym nicht ausgeschlossen werden. Für alle anderen Mutanten wird davon
ausgegangen, dass der Aminosäureaustausch die Proteinstruktur nicht beeinträchtigt.
In vivo katalysiert die α-Glukosyltransferase den Transfer eines Glukoserestes von UDPG
auf ein 5’-Hydroxymethyl-Cytosin (HMC) der Phagen DNA. In vitro kann diese Reaktion
anhand der Transferrate von radioaktiver Glukose auf HMC-haltige DNA gemessen werden.
Auf diese Weise wird allerdings nur die möglicherweise vom Wildtyp abweichende
Gesamtaktivität der Mutanten detektiert. Es kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob
diese auf veränderten Enzymeigenschaften bezüglich der UDPG-Spaltung oder der
Interaktion mit DNA beruht. Für eine differenziertere Betrachtung bietet sich daher zusätzlich
die Methode der DNA-Retardation im Agarosegel an, mit der Enzym-DNA Interaktionen
analysiert werden können (Goyard & Bertin, 1997). Ferner ist die Untersuchung des
UDPG-Umsatzes der α-Glukosyltransferase durch die chromatographische Trennung von
UDPG und seinem Spaltprodukt UDP möglich (Fischer, 1995). Die AGT und ihre Derivate
wurden daher allen drei Analysemethoden unterzogen (siehe 3.7.3 – 3.7.5). Die Eigenschaften
der Proteine hinsichtlich ihrer Gesamtaktivität und ihrer Fähigkeit, UDPG zu spalten bzw.
DNA zu binden, sind in der Tabelle 4.1 stichwortartig zusammengefasst.
83
Diskussion
Tab. 4.1: Die Restaktivität der α-Glukosyltransferase Mutanten und ihre Eigenschaften hinsichtlich der
UDPG-Spaltung und der DNA-Bindung bezogen auf das Wildtyp Enzym.
Mutante
Restaktivität [%]
UDPG-Umsatz
DNA-Bindung
ohne UDPG
mit UDPG
Glu22Ala
50
reduziert
reduziert
unverändert
Ser106Ala
111
unverändert
sehr schwach
unverändert
Met231Ala
2
unverändert
keine
keine
Arg236Ala
27
unverändert
sehr schwach
reduziert
Arg256Ala
96
unverändert
reduziert
unverändert
Ile276Ala
94
unverändert
gut
unverändert
Asn297Ala
93
unverändert
gut
unverändert
Glu311Ala
2
kein
keine
keine
4.4.1 Katalyse
Für
die
Glykosyltransferasen
werden
analog
zu
den
Glykosylhydrolasen
zwei
Reaktionsmechanismen postuliert, ein einfacher Verdrängungsmechanismus für invertierende
Enzyme und ein zweifacher Verdrängungsmechanismus für “beibehaltende” Enzyme.
Demnach sollte die α-Glukosyltransferase die Übertragung des Glukoserestes von UDPG auf
die DNA mit einer zweifachen Inversion der Zuckerkonformation katalysieren. Daraus ergibt
sich letztlich dann die Verknüpfung einer neuen glykosidischen Verbindung unter Retention.
An dieser zweistufigen Katalyse müssten zwei Carboxylsäuren auf gegenüberliegenden
Seiten des Substrats beteiligt sein (McCarter & Withers, 1994). Zunächst protoniert die erste
Carboxylgruppe die β-Phosphatgruppe des UDPG. Gleichzeitig erfolgt ein nukleophiler
Angriff der zweiten Carboxylgruppe auf das C1-Atom der Glukose, wodurch ein GlykosylEnzym-Intermediat entsteht. Im zweiten Schritt aktiviert dann die erste Carboxylgruppe das
5’-Hydroxymethyl-Cytosin der DNA, das dann das C1-Atom der an die zweite
Carboxylgruppe gebundenen Glukose nukleophil angreift (siehe Abb. 1.1).
Nach den Erkenntnissen über die Struktur der β-Glukosyltransferase und das Modell der
α-Glukosyltransferase kam in der AGT die Position Glu22 für die kovalente Bindung der
Glukose
in
Frage.
Diese
Vorhersage
konnte
durch
einen
entsprechenden
Aminosäureaustausch allerdings nicht bestätigt werden. Die Mutante Glu22Ala wies noch
eine Restaktivität von 50 % auf. In Analogie zu Mutationsstudien an anderen die
84
Diskussion
Konfiguration erhaltenden Enzymen wäre aber ein absoluter Aktivitätsverlust zu erwarten
gewesen (Juncosa et al., 1994). Trotzdem lässt sich für diese Aminosäure eine relevante
katalytische Funktion annehmen. Da der Km-Wert für UDPG von Glu22Ala im Vergleich
zum Wildtyp um den Faktor 6,5 erhöht ist, scheint die Mutante eine reduzierte Affinität zum
Substrat zu haben, worauf auch der geringe UDPG-Umsatz zurückzuführen ist (siehe
Tab. 4.1). Möglicherweise deprotoniert sie die 5’-Hydroxymethylgruppe, oder sie stabilisiert
den positiv geladenen Übergangszustand, indem sie die Elektronegativität der 2’Hydroxylgruppe des Zuckers reduziert (Roujeinikova et al., 2001).
4.4.2 Konformationsänderung
Analog zur BGT kann die AGT wahrscheinlich eine “offene” UDPG-freie und eine
“geschlossene” UDPG-bindende Konformation einnehmen (siehe Abb. 1.2 b). Dabei ist die
“geschlossene” Form vermutlich nicht nur für die Spaltung von UDPG sondern auch für die
Interaktion des Enzyms mit der Nukleinsäure essentiell. Stabilisiert wird sie in der BGT durch
insgesamt fünf Salzbrücken, die in der “offenen” Form fehlen (Vrielink et al., 1994). Der
Austausch einer der beteiligten Aminosäuren müsste die Deletion einer dieser Brücken zur
Folge haben, wodurch die strukturelle Veränderung dann nur noch erschwert stattfinden
könnte.
Die Wildtyp α-Glukosyltransferase scheint die “geschlossene” Konformation in
Anwesenheit von DNA unabhängig vom Glukose-Donor vollziehen zu können. Der
Aminosäureaustausch von Glu22 führt allerdings zu einer Herabsetzung der Affinität zur
DNA, die durch UDPG deutlich erhöht wird (siehe Tab. 4.1). Möglicherweise fehlt in der
Mutante Glu22Ala eine stabilisierende Salz- oder Wasserstoffbrücke. In Anwesenheit von
UDPG wird die DNA-bindende Konformation schließlich durch das Substrat begünstigt.
Diese Vermutung wird gestützt durch die Energiedifferenz zwischen der Interaktion des
Wildtyps und Glu22Ala mit dem Substrat, die nach folgender Formel berechnet wird (Fang &
Ford, 1998):
∆(∆G) = -RTln[(kcat / Km)Mutante / (kcat / Km)Wildtyp]
Für Glu22Ala beträgt ∆(∆G) = 5,95 kJ/mol. Da Wasserstoffbrücken zwischen neutralen
Partnern einen Energiebeitrag von 6,3 kJ/mol leisten, könnte in der Mutante durchaus eine
85
Diskussion
wichtige Wasserstoffbrücke fehlen (Namchuk & Withers, 1995). In der BGT kann die
Beteiligung von Glu22 an einer strukturgebenden Aminosäureinteraktion ausgeschlossen
werden (persönliche Mitteilung Solange Moréra). Für die Aminosäure Asp100 der BGT ist
diese Funktion hingegen nachgewiesen. Asp100 ist in der “geschlossenen” Konformation an
einer Salzbrücke beteiligt, so dass die Mutation dieser Position sich auf die Struktur
auswirken sollte. Tatsächlich sind die Kristalle der BGT-Mutante Asp100Ala sehr fragil
(persönliche Mitteilung Laurent Larivière).
Die entsprechende AGT-Mutante Ser106Ala weist keine reduzierte Gesamtaktivität auf
und zeigt eine sehr gute UDPG-Spaltung; sie bindet DNA in Abwesenheit von UDPG aber
erstaunlich schlecht. Obwohl die Energiedifferenz von 2 kJ/mol etwas zu niedrig ist, lässt
diese Beobachtung darauf schließen, dass Ser106 analog zu Asp100 an einer für die
“geschlossene” Form strukturgebenden Interaktion beteiligt ist. Auch hier wird diese
Konformation durch UDPG stabilisiert, so dass die Glukosylierung der DNA ungehindert
erfolgen kann.
Diejenigen
Aminosäuren
der
α-Glukosyltransferase,
für die in Analogie zur
β-Glukosyltransferase eine Beteiligung an stabilisierenden Salz- oder Wasserstoffbrücken
postuliert werden kann, sind in der folgenden Darstellung des AGT Modells farbig
hervorgehoben (Abb. 4.3).
Abb. 4.3: Potentielle Wasserstoff- bzw. Salzbrücken in der α-Glukosyltransferase (“Ribbon”-Präsentation). Die jeweils gleichfarbigen
Aminosäuren (“Ball and Stick”-Präsentation) könnten
theoretisch in Analogie zur β-Glukosyltransferase eine
Wasserstoff- bzw. Salzbrücke ausbilden.
86
Diskussion
Alternativ zu Glu22 postulierten Moréra und Mitarbeiter Asp100 als die den nukleophilen
Angriff aktivierende Base. Mutationsanalysen der entsprechenden Position in der
Glykosyltransferase GtfB lassen daran allerdings zweifeln (Mulichak et al., 2001). In der
AGT kommt diese Position für die genannte Funktion ohnehin nicht in Frage, da der
Aminosäure Serin (Ser106) die dafür typische Carboxylgruppe fehlt. Mit wenigen
Ausnahmen konnten bisher nur Aspartat oder Glutamat für die Aktivierung dieser Reaktion
nachgewiesen werden (Juncosa et al., 1994). Der Km-Wert für UDPG ist bei Ser106Ala um
den Faktor 2,7 erhöht. Die geringere Affinität zum Zucker-Donor ist wahrscheinlich auf die
mangelnde Stabilisierung der substrat-bindenden Konformation aufgrund einer fehlenden
Salzbrücke zurückzuführen.
4.4.3 UDPG-Bindung
Nach der Strukturvorhersage könnte die Aminosäure Ile276 der α-Glukosyltransferase das
Uridin des Substrats binden. Die Mutante Ile276Ala verhielt sich aber bezüglich der UDPGSpaltung
und
der
DNA-Bindung
genauso
wie
das
Wildtyp
Enzym.
In
der
β-Glukosyltransferase erfolgt die Interaktion mit Uridin über die dem Ile276 entsprechende
Position Ile238, allerdings über die Hauptkette der Aminosäure (Vrielink et al., 1994). Wenn
die Konservierung dieser Position also nur zufällig ist und diese Verbindung in der AGT
ebenfalls über das Aminosäurerückgrat besteht, dann würde ein Austausch des Isoleucins
gegen Alanin die Substratbindung nicht beeinträchtigen. Es kann daher nicht ausgeschlossen
werden, dass Ile276 diese Funktion tatsächlich übernimmt. Auch der um den Faktor 15
erhöhte Km-Wert weist auf eine geringere Affinität der Mutante zum UDPG hin.
Für die Glutaminsäure 311 der AGT wurde die Bindung der Ribose postuliert. Die
entsprechende Mutante erwies sich in allen Aktivitätstests als inaktiv. Aufgrund ihres vom
Wildtyp Enzym abweichenden CD-Spektrums und der geringen Proteinausbeute bei der
Reinigung muss allerdings eine veränderte Gesamtstruktur des Proteins angenommen werden.
Die Position Glu311 übernimmt daher ohne Zweifel eine essentielle strukturgebende Funktion
in der α-Glukosyltransferase. Die entsprechende Aminosäure der β-Glukosyltransferase
Glu272 bildet in der “geschlossenen” Konformation mit Asn195 eine Salzbrücke aus. Da
diese beiden Aminosäuren tief in der katalytischen Spalte in unterschiedlichen Domänen
lokalisiert sind, ist diese Verbindung für die Stabilität des Enzyms möglicherweise von
87
Diskussion
besonderer Bedeutung. Ähnlich könnte dies auch für Glu311 in der α-Glukosyltransferase der
Fall sein. Eine gleichzeitige Involvierung in die Substratbindung ist nicht auszuschließen.
Da die β-Glukosyltransferase nur mit dem UDP-Anteil des Substrates kristallisiert wurde,
ist die Lokalisation der Glukose nur zu vermuten (Moréra et al., 1999). Postuliert wird für
diese Funktion die Aminosäure Asp258, in der α-Glukosyltransferase entsprechend Asn297
(persönliche Mitteilung Paul Freemont). Diese Vermutung ist allerdings sehr spekulativ, da
außerdem berücksichtigt werden muss, dass die beiden Enzyme die Glukose in
unterschiedlichen Konformationen transferieren und daher vielleicht auch schon in einer
anderen Orientierung binden. Es also nicht verwunderlich, dass die Mutationsanalyse eine
Substratbindung
durch
Asn297
nicht
bestätigen
konnte.
Die
Betrachtung
des
UDPG-Umsatzes mittels HPLC und der unveränderte kcat-Wert deuten auf eine schnelle, dem
Wildtyp entsprechende Substratspaltung hin. Der Km-Wert für UDPG ist um den Faktor 3
erhöht. Insgesamt lassen diese Beobachtungen auf keine relevante substrat-bindende oder
strukturgebende Funktion der Aminosäure Asn297 schließen.
Die meisten Glykosyltransferasen enthalten ein sogenanntes DXD Motiv, dessen
Aspartate (D) direkt in die Nukleotid-Zucker-Bindung involviert sind und deren
Aminosäureaustausch zu einem drastischen Aktivitätsverlust dieser Enzyme führt (GarinotSchneider et al., 2000). Der β-Glukosyltransferase fehlt eine solche konservierte Sequenz
(Wiggins & Munro, 1998). Die α-Glukosyltransferase weist hingegen die Aminosäurefolge
74
DCD76 auf, die diesem Motiv entsprechen könnte. Diese Hypothese müsste allerdings durch
eine Mutationsanalyse bestätigt werden.
4.4.4 Interaktionen mit der DNA
Die β-Glukosyltransferase scheint die DNA über eine positiv geladene konkave Region der
Enzymoberfläche zu binden, die den Bereich der Spalte zwischen den beiden Domänen
einschließt (siehe 1.3). Es ist allerdings eher fragwürdig, ob die Interaktion der
α-Glukosyltransferase mit der DNA auf ähnliche Weise erfolgt, da die AGT im
Replikationskomplex integriert ist und daher keine so großflächige Affinität zur Nukleinsäure
benötigt. Es wurden daher diejenigen potentiell DNA-bindenden Aminosäuren auf ihre
Funktion hin überprüft, die nach der Vorhersage in direkter Nachbarschaft zur
“ausgeklappten” Base liegen. In diesem Bereich sollte auf jeden Fall eine Affinität des
88
Diskussion
Enzyms zur Nukleinsäure nachweisbar sein. Die Mutationsanalysen konnten dies auch für
Arg236 und Arg256 bestätigen. Beide Positionen partizipieren nicht an der UDPG-Spaltung,
beeinflussen allerdings die DNA-Bindung. In Retardationsexperimenten fiel dieser Effekt für
Arg256 eher gering aus und die Gesamtaktivität des Proteins war durch den
Aminosäureaustausch nicht beeinträchtigt. Der Anstieg des Km-Werts für UDPG um den
Faktor 67 weist allerdings auf eine Kopplung der UDPG-Bindung an die DNA-Interaktion
hin, da der Wegfall dieser DNA-bindenden Position dazu führt, dass UDPG schlechter
erkannt wird. Die Mutante Arg236Ala zeigte ohne UDPG nur eine sehr schwache Affinität
zur DNA; ihre Aktivität sank auf 27 %. Auch hier ist der Km-Wert für UDPG um den Faktor
29 erhöht. Die Vermutung, dass die DNA- und die UDPG-Bindung gegenseitig voneinander
abhängig sind, wird auch durch die Analysen des UDPG-Umsatzes gestützt. Die
entsprechenden Reaktionsansätze enthielten keine DNA und mussten wesentlich länger
inkubiert werden als die Ansätze zur radioaktiven Markierung der 5’-HMC-DNA.
Möglicherweise ist die reduzierte Enzymaktivität nicht nur auf den fehlenden GlukoseAkzeptor zurückzuführen. Es wäre denkbar, dass schon allein die Bindung der DNA die
Interaktion des Enzyms mit UDPG sterisch begünstigt.
Analog zu anderen DNA modifizierenden Enzymen wird für die β-Glukosyltransferase
ein “Basenausklapp-Mechanismus” postuliert (Patel et al., 2001; Roberts & Cheng, 1998;
Vrielink et al., 1994). Die zu modifizierende Base wird dabei aus der DNA-Helix in eine
extrahelikale Position überführt, die auf unterschiedliche Weise stabilisiert werden kann.
Einige Methyltransferasen verbiegen die gebundene DNA um bis zu 57° (Raskó et al., 2000).
In der 3D-Struktur von M·TaqI mit der gebundenen DNA konnte gezeigt werden, dass die
DNA hier lokal komprimiert wird, gleichzeitig schiebt sich die komplementäre Base in den
Strang der ausgeklappten Base (Goedecke et al., 2001). Darüber hinaus findet eine
Stabilisierung des Komplexes durch eine Proteinschleife statt, die durch die Bindung der
DNA eine Konformationsänderung durchläuft. Ähnlich könnte die DNA auch von mehreren
exponierten Schleifen der β-Glukosyltransferase gebunden werden. Phe72, das in einer dieser
Schleifen lokalisiert ist, interkaliert möglicherweise in die beim Ausklappen des HMC
entstehende Lücke der DNA (Moréra et al., 1999). Für die Interaktion mit der ausgeklappten
Base wird in der BGT die Aminosäure Ser192 postuliert. In der α-Glukosyltransferase könnte
diese Funktion von Met231 übernommen werden. Tatsächlich verlor das Enzym durch den
Austausch dieser Aminosäure gegen Alanin jegliche Affinität zur DNA; UDPG hingegen
wurde normal umgesetzt. Insgesamt zeigte die Mutante eine Restaktivität von 2 %. Wenn
89
Diskussion
Met231 also wirklich mit dem Phosphatrückgrat der ausgeklappten Base interagiert, dann
würde das bedeuten, dass ohne das Ausklappen der Base gar keine DNA-Bindung stattfinden
kann.
Daraus
müsste
außerdem
geschlossen
werden,
dass
nicht
selektiv
das
5’-hydroxymethylierte Cytosin extrahelikal gebunden wird, da die DNA Retardationsanalysen
der AGT Mutanten mit unmodifizierter DNA durchgeführt wurden. Dieser Befund steht in
Einklang mit Untersuchungen an der β-Glukosyltransferase, nach denen die BGT das
komplementäre Guanin spezifisch zu erkennen scheint und nicht das HMC selbst (persönliche
Mitteilung Jürgen Kurzeck). Auch in der Methyltransferase HhaI wird die Spezifität des
Enzyms durch die der Zielbase benachbarten Nukleotide determiniert (Klimasauskas &
Roberts, 1995). Hier findet die Bindung der ausgeklappten Base unspezifisch, die
Modifikation jedoch spezifisch nur am Cytosin statt (Roberts & Cheng, 1998).
4.5 Rückschlüsse auf die Struktur und den Mechanismus der AGT
Dem
Strukturmodell
der
T4 α-Glukosyltransferase
liegt
die
Kristallstruktur
der
β-Glukosyltransferase zugrunde. Da die AGT nachweisbar mehrere Proteine bindet, muss das
Enzym für diese Interaktionen bestimmte Oberflächenstrukturen aufweisen, die in dieser
Form in der BGT sicher nicht vorhanden sind. Zumindest in diesem Aspekt unterscheiden
sich die beiden Proteine also. Das schließt allerdings nicht aus, dass sie im Bereich der
Donor-Bindetasche und der DNA-Interaktion große Übereinstimmungen aufweisen können.
Solange von der α-Glukosyltransferase keine genaueren Strukturdaten bekannt sind, kann
diese Hypothese allerdings nur anhand von Mutationsstudien bestätigt oder widerlegt werden.
Die Auswahl einzelner Positionen, für die eine relevante Funktion in der Katalyse oder
der Substratbindung postuliert werden kann, wird erschwert durch die Tatsache, dass in der
BGT nur von sehr wenigen Aminosäuren die spezifische Aufgabe wirklich bekannt ist.
Trotzdem kann für die Aminosäure Glu22 in der AGT eine indirekte Beteiligung an der
Katalyse angenommen werden. Die Restaktivitäten der Mutanten Glu22Ala in der AGT und
der BGT liegen bei 50 % (persönliche Mitteilung Jürgen Kurzeck), so dass es sich hier um
eine gleichwertige Funktion in beiden Enzymen handeln könnte. Es ist allerdings zu
berücksichtigen, dass die AGT die Übertragung des Zuckers wahrscheinlich über einen
zweifachen, die BGT nur über einen einfachen Verdrängungsmechanismus katalysiert.
90
Diskussion
Außerdem benötigt die β-Glukosyltransferase Magnesium für diese Reaktion (Kornberg et
al., 1961). Abweichend von den meisten nukleotidphosphat-bindenden Enzymen aktiviert das
Metall hier allerdings nicht die Katalyse, sondern spielt wahrscheinlich eine sekundäre Rolle
in der Produktfreilassung (Moréra et al., 2001).
Bezüglich der DNA-Bindung konnten in der AGT mehrere Aminosäuren identifiziert
werden, deren Austausch einen partiellen oder sogar absoluten Aktivitätsverlust bewirkte. In
diesem Punkt scheinen die beiden Glukosyltransferasen eine besonders hohe Homologie
aufzuweisen. Gleichzeitig deuten die Analysen auf eine sehr ähnliche Anordnung der
stabilisierenden Wasserstoff- bzw. Salzbrücken hin. Zusammengefasst kann für die
α-Glukosyltransferase daher angenommen werden, dass ihre Struktur im Bereich der aktiven
Spalte gut mit der β-Glukosyltransferase übereinstimmt. Die Relevanz der Salzbrücken für
die Enzymaktivität und die essentielle Funktion der Aminosäure Met231 für die
DNA-Interaktion deuten außerdem darauf hin, dass sich die beiden Domänen der AGT für die
Substratbindung zu einer “geschlossenen” Konformation aufeinander zu bewegen und die
Nukleinsäure nach dem für die BGT postulierten “Basenausklapp-Mechanismus” modifiziert
wird.
4.6 Ausblick
Neben der Kristallisation der α-Glukosyltransferase, die als Voraussetzung für eine
Röntgenbeugung des Enzyms weiter verfolgt werden sollte, könnte die Struktur des Proteins
alternativ auch mittels kernmagnetischer Resonanz (NMR) aufgeklärt werden.
Für eine weitere detaillierte Untersuchung des Strukturmodells der AGT wären zunächst
Mutationsanalysen an der β-Glukosyltransferase hilfreich. So könnte die postulierte Funktion
einer Aminosäure vorab in der BGT verifiziert werden, bevor die entsprechende Position in
der AGT mutagenisiert wird. Für eine Analyse der strukturgebenden Positionen sowie der an
der DNA-Bindung beteiligten Aminosäuren ist der Vergleich der AGT mit der BGT sehr
vielversprechend. Weiterführende DNA Retardationsexperimente mit Oligonukleotiden, die
unterschiedlich modifizierte Basen enthalten, könnten genauere Informationen über den
Basenausklappmechanismus liefern. Die Aufklärung, welche Base spezifisch vom Enzym
erkannt wird, sollte über Bindungsstudien mit DNA Fragmenten unterschiedlicher Sequenz
möglich sein.
91
Diskussion
Die
Interaktion
der
β-Glukosyltransferase
mit
UDPG
scheint
augrund
der
unterschiedlichen Katalysemechanismen im Detail nicht auf die α-Glukosyltransferase
übertragbar zu sein . Diesbezüglich sollten eher Parallelen zu einer die Konformation des
übertragenen Zuckers erhaltenden Glykosyltransferase, beispielsweise LgtC, gesucht werden.
Insbesondere eine Mutationsanalyse des für die α-Glukosyltransferase postulierten
DXD Motivs könnte zu neuen Erkenntnissen über die Interaktion des Enzyms mit UDPG
führen. Mit der Etablierung der Tryptophan-Fluoreszenz-Spektroskopie wäre hier eine
kinetische Analyse der UDPG Bindung durch die AGT möglich.
92
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Die Glykosylierung als kovalente Modifikation von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren
steht aufgrund ihrer vielseitigen intra-, extra- und interzellulären Funktionen im allgemeinen,
wissenschaftlichen Interesse. Aus medizinischer Sicht ist insbesondere die Aufklärung der
Struktur und des Reaktionsmechanismus der Glykosyltransferasen von Bedeutung, um auf
diesem Wege krankheitsauslösende Prozesse zu verstehen und ihnen durch die Entwicklung
von Inhibitoren entgegentreten zu können. Bisher konnten nur neun Glykosyltransferasen in
ihrer Röntgenstruktur gelöst werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollte mit der
α-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4 (AGT) ein weiteres Mitglied dieser
Enzymklasse charakterisiert werden. Dieses DNA-modifizierende Protein katalysiert den
Glukose-Transfer von UDPG auf die 5’-Hydroxymethyl-Cytosine des Phagen Genoms.
Die α-Glukosyltransferase wurde bis zu einem hohen Reinheitsgrad ohne ersichtliche
Kontaminationen isoliert. Ihre Röntgenkristallstruktur ließ sich allerdings nicht lösen, da das
Enzym unter den getesteten Bedingungen keine Kristalle bildete. Anhand eines
Sekundärstrukturalignments wurde schließlich ein dreidimensionales Modell des Enzyms
berechnet, das durch Mutationsanalysen in großen Teilen bestätigt werden konnte. Die für die
Katalyse des Glukosetransfers essentiellen Aminosäuren der α-Glukosyltransferase wurden
auf diese Weise nicht identifiziert, für die Position Glu22 kann aber zumindest eine indirekte
Beteiligung an der Katalyse postuliert werden. Die Energiedifferenz der entsprechenden
Mutante zum Wildtyp Enzym deutet außerdem daraufhin, dass Glu22 an einer für die
Proteinstruktur wichtigen Wasserstoff-Brücke partizipiert.
Die Aminosäure Ser106 scheint ebenfalls eine Wasserstoff- oder Salzbrücke auszubilden.
Analog zur β-Glukosyltransferase (BGT) vollzieht die AGT wahrscheinlich eine
Konformationsänderung, die für die UDPG und DNA Bindung essentiell ist. Die
geschlossene, substrat-bindende Form wird dabei vermutlich durch Wasserstoff- und
Salzbrücken stabilisiert, an denen Ser106, Glu22 und Glu311 beteiligt sind.
Die zweite Funktion der Position Glu311, die Interaktion mit der Ribose des UDPG,
konnte nicht untersucht werden. Die Mutante wies, wahrscheinlich aufgrund der fehlenden,
struktur-gebenden Aminosäureinteraktion, eine vom Wildtyp abweichende Proteinfaltung auf
und zeigte keine Aktivität.
Für die Aminosäuren Ile276 und Asn297, für die ebenfalls eine Bindung des
Zucker-Donors vorhergesagt wurde, konnte keine relevante Funktion nachgewiesen werden.
93
Zusammenfassung
Die Bindung der DNA durch Arg236 und Arg256 erfolgt vermutlich über das PhosphatRückgrat der Nukleinsäure. Die Aminosäure Met231 interagiert wahrscheinlich explizit mit
der ausgeklappten, zu glykosylierenden Base. Die Essentialität dieser Position weist darauf
hin, dass das Ausklappen der Base für die Bindung der DNA unerlässlich ist. Darüber hinaus
scheint die α-Glukosyltransferase nicht spezifisch das zu modifizierende 5’-HydroxymethylCytosin zu erkennen, sondern möglicherweise das komplementäre Guanin.
Über Interaktionsstudien konnten drei Proteine nachgewiesen werden, die an die
α-Glukosyltransferase binden. Eines wurde als das phageneigene Gp 45 identifiziert, das für
die Neusynthese der T4 DNA essentiell ist. Die AGT ist demnach im Replikationskomplex
lokalisiert, wodurch sich auch das strikte Glykosylierungsmuster des T4 Genoms erklären
lässt. Die Nukleinsäure wird direkt während ihrer Synthese zu 70 % α-glukosyliert. Erst wenn
die DNA den Replikationskomplex verlässt, kann eine weitere Modifikation durch die
β-Glukosyltransferase erfolgen, die dann die restlichen 30 % der 5’-Hydroxymethyl-Cytosine
glukosyliert, welche für die AGT aus sterischen Gründen nicht zugänglich waren.
Insgesamt wurde das Modell der α-Gluksoyltransferase insofern bestätigt, dass das
Enzym aus den postulierten zwei Domänen besteht, die zwischen sich einen Spalt mit dem
aktiven Zentrum bilden. Die Lokalisation der Katalyse kann auf die nähere Umgebung der
Aminosäure Glu22 festgelegt werden, in der auch die DNA essentiell über Met231 gebunden
wird. Die Struktur der α-Glukosyltransferase wird durch mehrere Wasserstoff- bzw.
Salzbrücken stabilisiert, die entweder für das Enzym generell unerlässlich sind oder für die
zur Substratbindung essentielle Konformationsänderung benötigt werden. Analog zur
β-Glukosyltransferase katalysiert die AGT die Modifikation der DNA vermutlich über einen
Basenausklappmechanismus, der die zu modifizierende Base zum Zucker-Donor hin in den
aktiven Spalt ausklappt. Erkannt wird dabei nicht spezifisch das 5’-Hydroxymethyl des
Cytosins. Die AGT und BGT unterscheiden sich hingegen in der Orientierung der
UDPG-Bindung, möglicherweise weil ihnen unterschiedliche Katalysemechanismen, die
Retention bzw. Inversion, zugrunde liegen. Die α-Glukosyltransferase geht außerdem
Interaktionen mit anderen Proteinen ein, die für die β-Gluksoyltransferase nicht zu erwarten
sind.
94
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104
Lebenslauf
Persönliche Daten
Nicole Sommer
geboren am 07. März 1973 in Recklinghausen
ledig
Schulausbildung
1979 - 1983
Roncalli-Grundschule, Dortmund
1983 - 1987
Immanuel-Kant-Gymnasium, Dortmund
1987 - 1992
Mallinckrodt-Gymnasium, Dortmund
16. Juni 1992
Schulabschluß: Allgemeine Hochschulreife
Studium
1992 – 1998
Biologiestudium an der Ruhr-Universität Bochum
05.1997 – 07.1998
Diplomarbeit am Lehrstuhl Biologie der Mikrooganismen mit dem
Thema“ Die Stärke früher T4 Promotoren und ihrer Mutanten vor und
nach ADP-Ribosylierung der Wirtspolymerase durch das T4 Geprodukt
Alt”
13. August 1998
Studienabschluß: Diplom
berufliche Tätigkeit
1996 – 1998
diverse studentische Hilfskraftstellen
09. 1998 – 03. 1999 wissenschaftliche
Hilfskraft
am
Lehrstuhl
Biologie
der
Biologie
der
Mikroorganismen, Ruhr-Universität Bochum
seit 03.1998
wissenschaftlicher
Mitarbeiter
am
Lehrstuhl
Mikroorganismen, Ruhr-Universität Bochum
Veröffentlichungen und Tagungsbeiträge
Kaetzke, A., Koch, H., Drosten, M., Kleinfeld, C., Sommer, N. & Rüger, W. (1998) Die
bakteriologische
Charakterisierung
des
C.E.B.A.S.
Minimoduls
mit
Hilfe
konventioneller und molekularbiologischer Analyseverfahren. Wissenschaftliche
Projektführung,
RWTH
Aachen,
Bilanzsymposium
Forschung
unter
Weltraumbedingungen (M.H. Keller und P. Sahm, Hrsg.), Druckerei R. Thierbach
GmbH, Mühlheim, 417-426.
Sommer, N., Salniene, V., Gineikiene, E., Nivinskas, R.& Rüger, W. (2000) T4 „early“
promoter strengths probed in vivo with E. coli RNA polymerase and its ADPribosylated derivative: a mutation analysis. Microbiology, 146, 2643-2653.
Sommer, N., Depping, R. & Rüger, W. (2001) Computer modeling and mutation analysis of
the T4 α-glucosyltransferase. Biol Chem, 382, special supplement, S169.
Danksagung
An erster Stelle gilt mein Dank meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. W. Rüger für die
Überlassung
des
Themas,
sein
Interesse
an
dieser
Arbeit
und
seine
stete
Diskussionsbereitschaft. Ich möchte ihm insbesondere dafür danken, dass er mir einen
Auslandsaufenthalt und die Teilnahme an Fortbildungsveranstaltungen ermöglicht hat.
Herrn Prof. Dr. M. Rögner danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Frau Dr. Solange Moréra möchte ich für ihre Unterstützung bezüglich der Kristallisationsexperimente und ihre Gastfreundschaft danken.
Bei allen Mitarbeitern (auch den ehemaligen) der Arbeitsgruppe Molekulare Genetik bedanke
ich mich für das gute Arbeitsklima. Mein spezieller Dank gilt Ursula Aschke-Sonnenborn für
ihre ständige Hilfsbereitschaft und ihr allzeit offenes Ohr.
Ein besonderer Dank gilt meiner Mutter, die sich meiner kleinen und großen Probleme immer
angenommen und mir während meiner gesamten Ausbildung in vielfältigster Weise geholfen
hat.
Schließlich danke ich meinem Freund Reinhard für seine uneingeschränkte Unterstützung,
seine Geduld und sein Verständnis. Er hat mich immer wieder ermutigt und mit seiner
Computer-spezifischen Hilfe einen besonderen Beitrag zu dieser Arbeit geleistet.