E Zusammenfassung

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Calystegine sind polyhydroxylierte Nortropanalkaloide, ihre Biosynthese ist in Solanaceae und
Convolvulaceae untersucht. Sie leitet sich von der Tropanalkaloidbiosynthese ab, einzelne Schritte wie zum Beispiel N -Demethylierung und Hydroxylierung sind nicht aufgeklärt. Calystegine
hemmen verschiedene Glykosidasen. Potentielle Einsatzgebiete für Glykosidasehemmstoe sind
Diabetes mellitus, Krebserkrankungen oder virale Infektionen. Sowohl die Synthese als auch die
Isolierung aus biologischem Material sind kompliziert und aufwendig. Ein Verständnis der biosynthetischen Schritte kann die Voraussetzung für die Gewinnung gröÿerer Mengen schaen.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit standen die Untersuchung der Verbreitung von Calysteginen in
verschiedenen Panzenfamilien und biosynthetischer Schritte in Cochlearia ocinalis
L. Die Fa-
milien Moraceae, Erythroxylaceae und Brassicaceae wurden auf Calystegine untersucht.
In allen Familien wurden Calystegine gefunden. Während in Moraceae nur Morus Spezies und
Ficus carica L. calysteginhaltig sind, enthielt bei Erythroxylaceae und Brassicaceae die Mehrzahl
der untersuchten Spezies Calystegine. In Brassicaceae dominierten Calystegine vom Typ A.
Mit Cochlearia ocinalis
L. wurde ein geeigneter Kandidat für die Untersuchung der an der
Biosynthese beteiligten Enzyme gefunden. Die Panze enthält sowohl Calystegine als auch Tropinester, wie zum Beispiel Cochlearin. Sie erwies sich als leicht kultivierbar, auch eine Wurzelkultur war problemlos zu etablieren.
Es gelang die Amplikation eines tr-homologen Fragmentes mit Hilfe von RT-PCR und degenerierten Primern. Das Fragment wurde mit RACE-PCR vervollständigt. Die resultierende
cDNA-Sequenz weist alle Merkmale einer kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase (SDR) auf.
Der Vergleich mit Tropinonreduktasen aus Solanaceae zeigt auf Aminosäureebene eine durchschnittlich 57%-ige Identität, aufgrund der Unterschiede im substratbindenden Bereich sind Aussagen zur Substrat- und Stereospezität des Enzyms auf Basis der Primärstruktur nicht möglich.
Die COTR wurde in E. coli rekombinant exprimiert und mit Hilfe des sechsfachen C-teminalen
Histidin-tags anitätschromatographisch gereinigt. Das Enzym katalysiert sowohl die Reduktion von Tropinon als auch die Oxidation von Tropin und Pseudotropin. Bei der Reduktion von
Tropinon entstehen sowohl Tropin als auch Pseudotropin, keines der Produkte wird bevorzugt
gebildet. Eine Abhängigkeit der Reduktion von Tropinon von pH-Wert oder Zeit besteht nicht.
Die Anität zu Tropinon ist geringer als die der Tropinonreduktasen von Solanaceae. In seinen
Eigenschaften ist das Enzym vergleichbar der TRI von Calystegia sepium
L. : dazu zählen die
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geringere Anität zu Tropinon und der stärkere Umsatz von Cyclohexanonen und Piperidinonen
im Vergleich zu Tropinonr.
Um Erklärungsansätze für dieses ungewöhnliche Verhalten des Enzyms zu erhalten wurde ein
molekulares Modell des Enzyms erstellt. Als Vorlage für die Modellierung diente die Struktur
der kristallisierten TRII von Datura stramonium
L. Das Modell war von guter Qualität und er-
füllte die Spezikation einer SDR. Mit Dockingversuchen wurde die bewegliche Seitenkette eines
Tyrosins im aktiven Zentrum des Enzyms als mögliche Einuÿgröÿe auf die Reduktionsrichtung
ausgemacht. Die Mutation dieses Tyrosins zu Serin vernichtete jegliche TR-Aktivität, die Reduktaseaktivität wurde verändert, blieb jedoch erhalten.
Zu Vergleichszwecken wurde eine der 15 putativen` TR aus Arabidopsis thaliana
L. mit gen-
spezischen Primern ampliziert, kloniert, in E. coli überexprimiert, gereinigt und biochemisch
charakterisiert. Dieses Enzym war der COTR sehr ähnlich. Es war jedoch nicht in der Lage,
die Reduktion von Tropinon zu katalysieren. Analog zur COTR wurde ein molekulares Modell
des Enzyms erstellt. Beim Vergleich der aktiven Zentren beider Modelle wurde ein augenfälliger
Unterschied festgestellt. Dieser wurde zum Gegenstand eines Mutageneseexperiments.
Die eingeführte Punktmutation von Serin zu Tyrosin stellte im Prinzip den Umkehrversuch zur
Mutation der COTR dar. Die mutierte ATSDR war als Reduktase aktiv, eine TR-Aktivität
konnte durch die Punktmutation nicht generiert werden.
Mit degenerierten Primern aus bekannten pmt und spds-cDNA-Sequenzen wurde durch RT-PCR
ein spds-homologes Fragment gefunden. Durch PCR-basiertes Screening einer cDNA-Bank von
Cochlearia ocinalis L. wurde ein vollständiger spds-homologer cDNA-Klon isoliert. Die Zuord-
nung erfolgte aufgrund der hohen Ähnlichkeit zu bekannten SPDS. Weiterhin fanden sich in der
Sequenz die dcSAM-Bindungsstelle und die katalytische Domäne der SPDS.
Zur Bestätigung der biochemischen Funktion wurde die Sequenz in E. coli als His-tag-Fusions-
protein exprimiert. Das resultierende Protein war löslich und zeigte keine spezische Aktivität,
die gefundene SPDS-Aktivität war nicht reproduzierbar und eine enzymkinetische Auswertung
nicht möglich. Zusätzlich wurde mit dem PMT-Cosubstrat SAM wiederholt ein Produkt gefunden, das in UV-Spektrum und Retentionszeit N -Methylputrescin entspricht.
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