Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zum

Aus der Abteilung Tiermedizin und Primatenhaltung
des Deutschen Primatenzentrums Göttingen
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zum
Nachweis von SIV (Simian Immunodeficiency Virus) im
Rektum experimentell infizierter Rhesusaffen
(Macaca mulatta)
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Karin Yvonne Bingger
aus Ottobeuren
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. G. Herrler
Tag der mündlichen Prüfung:
26.11.2002
Inhaltsverzeichnis:
1 Einleitung
9
2 Literaturübersicht
11
2.1 Die SIV-Infektion als Tiermodell
11
2.2 Die SIV-/HIV-Infektion des Gastrointestinaltraktes
13
2.2.1 Eintrittsmechanismen in die Darmschleimhaut
14
2.2.2 Pathogenese der SIV/HIV-Infektion
19
2.2.3 Klinik und Pathologie des Gastrointestinaltraktes bei SIV/HIV-Infektion
23
2.3 Nachweis von SIV im Darmtrakt
28
3 Material und Methoden
34
3.1 Zellkultur
34
3.2 Gewebematerial
34
3.3 Gewebepräparation, Einbettung und Schnittherstellung
37
3.3.1 Eponeinbettung
38
3.3.2 LR-White-Einbettung
39
3.4 SIV-Detektion am Semidünnschnitt
40
3.4.1 Immunogold-Silbertechnik
41
3.4.2 Fluoreszenzmarkierung
42
3.5 SIV-Detektion an Ultradünnschnitten
43
3.5.1 Immunogoldmethode
43
4 Ergebnisse
44
4.1 Vergleichende Untersuchung der Rektumschleimhaut von Rhesusaffen
mit und ohne SIV-Infektion
4.1.1 Lichtmikroskopie
44
44
4.1.2 Elektronenmikroskopie
50
4.2 Detektion von SIV-Antigen am Semidünnschnitt
57
4.3 Immunelektronenmikroskopischer Nachweis von SIV-Antigen
60
5 Diskussion
73
5.1 Vergleichende Untersuchung der Rektumschleimhaut von Rhesusaffen
mit und ohne SIV-Infektion
74
5.2 Detektion von SIV-Antigen an der Zellkultur
78
5.3 Detektion von SIV-Antigen in Rektumbiopsien
82
6 Zusammenfassung
84
7 Summary
85
8 Literaturverzeichnis
86
9 Anhang
122
9.1 Histologieprotokolle
122
9.1.1 Phosphatpuffer
122
9.1.2 Gepufferte Glutaraldehydlösung (2,5%ig)
122
9.2 Protokolle der elektronenmikroskopischen Präparation
123
9.2.1 Einbettungsprotokoll für Epon
123
9.2.2 Fixierungslösung nach KARNOVSKY (1965)
124
9.2.3 Eponmischung nach LUFT (1961)
124
9.2.4 Methylenblaufärbung nach RICHARDSON (1960)
125
9.3 Protokolle der immunelektronenmikroskopischen Präparation
125
9.3.1 Paraformaldehyd (4%ig) / Glutaraldehyd (0,25%ig) - Mischung (1:1)
125
9.3.2 Einbettungsprotokoll für LR-White
126
9.3.3 Verwendete Reagenzien für die Immunogold-Silber-Färbung
127
9.3.4 Immunogold-Silber-Färbung von Semidünnschnitten
128
9.3.5 Immunogold-Silber-Färbung von Ultradünnschnitten
130
9.4 Vorbereitung der Zellkultur für die morphologische bzw. immunelektronenmikroskopische Untersuchung
131
9.5 Protokoll der Fluoreszenzmarkierung
132
9.5.1 Mowiollösung
132
9.6 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
133
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
AIDS
Aquired Immunodeficiency Syndrome (Erworbenes Immundefizienzsyndrom)
BSA
Bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CCR
Chromotactic Cytocine Receptor (Chromotaktischer Zytokinrezeptor)
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
cDNA
komplementäre DNA
CXCR
Chemocine Receptor for X-strains of HIV
DC
Dendritic Cell (Dendritische Zelle)
DNA
Deoxyribonucleic Acid (Desoxyribonukleinsäure)
env
envelope (Genbereich, welcher für die hüllbildenden Glykoproteine
von Retroviren kodiert)
FAE
Follikelassoziiertes Epithel
FDC
Follicular Dendritic Cell (Follikulärdendritische Zelle)
GALT
Gut Associated Lymphoid Tissue (Darmassoziiertes lymphatisches
Gewebe)
GIT
Gastrointestinaltrakt
HIV
Human Immunodeficiency Virus (Humanes Immundefizienzvirus)
H.-E.
Hämatoxylin-Eosin
IEC
Intestinal Epithelial Cell (Intestinale Epithelzelle)
IEL
Intraepithelialer Lymphozyt
Ig
Immunglobulin
IHC
Immunhistochemie
ISH
In situ Hybridisierung
KK
Karen Kent
L.
Lamina
MHC
Major
Histocompatibility
Komplex)
Complex
MPBMC
Monkey Peripher
Affenblutzellen)
Mononuclear
nef
negative effective factor (regulatorisches Gen von HIV und SIV)
NIBSC
National Institute for Biological Standards and Control
PBMC
Peripher Blood
Blutzellen)
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion)
p. i.
post infectionem
RT-PCR
Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction
rev
regulator of transcription of viral protein (regulatorisches Gen von
HIV und SIV)
SABC
Streptavidin-Biotin-Enzymkomplex
SCID
Severe Combined Immunodeficiency
SHIV
Simian Human Immunodeficiency
Humanes Immundefizienzvirus)
sIg
lösliche Form des Immunglobulin
SIV
Simian Immunodeficiency Virus (Simianes Immundefizienzvirus)
sog.
sogenannte
Tab.
Tabelle
tat
transactivator of viral transcription (regulatorisches Gen von SIV/HIV)
TEM
Transmissionselektronenmikroskopie
u. a.
unter anderem
WRSC
Walter Reed Staging Classification (Walter Reed Klassifikation)
wpi.
Wochen post infectionem
v. a.
vor allem
z. T.
zum Teil
Blood
Mononuclear
Cells
(HaupthistokompatibilitätsCells
(Periphere
Virus
(Mononukleäre
mononukleäre
(Chimäres
Simianes-
Einleitung
9
1 Einleitung
Die durch HIV (Humanes Immundefizienz Virus) ausgelöste erworbene Immunschwäche stellt eine der wichtigsten Infektionskrankheiten des Menschen dar. Dies
spiegelt sich in der weltweiten Verbreitung der Infektion wieder. Das aus dieser
Infektion resultierende klinische Bild eines „Acquired Immunodeficiency Syndrome“
(AIDS) wurde erstmals vor 20 Jahren beschrieben (CENTERS FOR DISEASE
CONTROL AND PREVENTION, 1981; GOTTLIEB et al., 1981; MASUR et al., 1981).
Seither sind ca. 20 Millionen Menschen weltweit an AIDS gestorben, ungefähr 36
Millionen Menschen sind mit HIV infiziert (CENTERS FOR DISEASE CONTROL
AND PREVENTION, 2001; PIOT et al., 2001). Jedes Jahr treten ca. 6 Millionen
Neuinfektionen mit HIV auf (HAHN et al., 2000; LANSKA, 1999). Trotz intensiver
Forschung ist es bisher nicht gelungen der Ausbreitung der Infektion Einhalt zu
gebieten. Zahlreiche Therapie- und Vakzinestudien haben zur Entwicklung antiviraler
Kombinationstherapien beigetragen. Diese Therapien lindern die Symptome und
verlängern die Lebenserwartung der Infizierten, eine Heilung ist jedoch bisher nicht
möglich.
Die HIV-Infektion wird meistens durch Geschlechtsverkehr oder Blut übertragen. Seit
dem Auftreten der Erkrankung wurden die Übertragungsmechanismen intensiv
erforscht. Es konnten verschiedene potentielle Eintrittspforten identifiziert werden.
Bis heute wurden verschiedene Rezeptoren und Korezeptoren entdeckt. Dennoch ist
der Mechanismus, über den HIV in den Organismus eindringt und sich manifestiert,
noch nicht vollständig geklärt. Eines der Hauptzielorgane der HIV-Infektion stellt der
Gastrointestinaltrakt (GIT) dar. Hier kommt es sowohl zu direkten Veränderungen
durch die Infektion als auch zur Ansiedlung sekundärer opportunistischer Erreger.
Zudem stellt der Magen-Darm-Trakt eine mögliche Eintrittspforte für die Infektion dar.
Aufgrund dieser besonderen Bedeutung des GIT bei der HIV-Infektion wurden viele
Untersuchungen durchgeführt, unter anderem auch am Rhesusaffenmodell. Die
experimentelle intrarektale Infektion des Rhesusaffen mit dem Simianen Immundefizienz Virus (SIV), einem dem HIV eng verwandten Virus, führte zu einem der
HIV-Infektion ähnlichen Krankheitsverlauf.
10
Einleitung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Eindringen von SIV über die Rektumschleimhaut
bei Rhesusaffen (Macaca mulatta) untersucht. Ziel war die Entwicklung einer
immunelektronenmikroskopischen Methode, die es ermöglicht, SIV während des
Eintritts in die Schleimhaut sichtbar zu machen. Ein besonderes Augenmerk wurde
dabei auf die beschriebenen potentiellen Eintrittspforten in der Darmschleimhaut
gerichtet. Zudem wurde eine vergleichende Untersuchung zur Morphologie des
Rektums des Rhesusaffen mit und ohne SIV-Infektion vorgenommen, um direkte
Veränderungen durch SIV zu identifizieren.
Literaturübersicht
11
2 Literaturüb ersicht
2.1 Die SIV-Infe ktion als Tiermodell
Die AIDS - Forschung ist in vielen Bereichen auf Tiermodelle angewiesen. Insbesondere die Pathogenese der Frühphase der Infektion lässt sich am Menschen nur
bedingt erforschen. Für die Entwicklung von Therapeutika und Impfstoffen sind Tiermodelle ebenfalls unentbehrlich. In vitro Experimente mit Zellkulturen geben
nützliche Hinweise, allerdings können sie Tiermodelle nicht ersetzen, da das Virus
eng an die komplexen zellulären Interaktionen eines intakten Immunsystems
gebunden ist (STOTT und ALMOND, 1995). Laut LETVIN und KING (1990) wäre das
ideale Tiermodell die experimentelle HIV-Infektion eines kostengünstigen, leicht zu
beschaffenden Labortieres, das nachfolgend eine AIDS-ähnliche Erkrankung
entwickelt. Auf der Suche nach einem geeigneten Tiermodell wurde mit kleinen
Labortieren wie Kaninchen, transgenen und SCID (Severe Combined Immunodeficiency)
Mäusen
sowie
Katzen,
Schimpansen
und
Makaken
gearbeitet
(BENDINELLI et al., 1995; STOTT und ALMOND 1995; NICOL et al. 1989;
CHALIFOUX et al., 1987).
Das wichtigste Tiermodell ist die experimentelle Infektion nichthumaner Primaten mit
dem SIV. Das Virus gehört zur retroviralen Lentivirusfamilie, zu denen auch das antigenetisch, genetisch und biologisch eng verwandte HIV gehört (PEETERS et al.,
1989). Bei vielen verschiedenen Primatenspezies konnte natürlich vorkommendes
SIV isoliert werden, unter anderem bei Schimpansen (Pan troglodytes troglodytes)
SIVcpz und SIVcpzUS (GAO et al., 1999; HIRSCH et al., 1995; PEETERS et al.,
1992), bei Mandrills (Papio sphinx) SIVmnd (HIRSCH et al., 1995; TSUJIMOTO et
al., 1988), bei Diademmeerkatzen (Cercopithecus mitis) SIVsyk (HIRSCH et al.,
1995; EMAU et al., 1991) und bei der Grünen Meerkatze (Cercopithecus sabaeus
sowie aethiops) SIVagm (HIRSCH et al., 1995; ALLAN et al., 1991; DANIEL et al.,
1988), wobei bei diesen Spezies keine AIDS-ähnlichen Erkrankungen auftreten. Im
Gegensatz dazu stehen die Makakenarten, die keine natürliche Infektion mit SIV
aufweisen. Bei in Gefangenschaft gehaltenen Tieren konnte jedoch SIV nachgewiesen werden, unter anderem bei Rhesusaffen (Macaca mulatta) SIVmac (HIRSCH
et al., 1995; DANIEL et al., 1985). Die SIV-Infektion der Makaken geht mit einer
12
Literaturübersicht
AIDS-ähnlichen Erkrankung einher und ist letal (FULTZ et al., 1995). Rhesusaffen
bieten sich daher als Tiermodell für die AIDS-Forschung an, zudem gehören sie nicht
zu einer in der Wildnis bedrohten Tierart, lassen sich gut in Gefangenschaft züchten
und sind in ausreichender Anzahl verfügbar (DESROSIERS und RINGLER, 1989).
Unter Verwendung von SIV wurden Modelle für die pädiatrische, homo- und heterosexuelle HIV-Infektion entwickelt sowie intravenöse, intrarektale und intravaginale
Transmissionsrouten untersucht (SPIRA et al., 1996; LeGRAND et al., 1995;
KULLER et al., 1994; KLUMPP et al., 1993; MILLER et al., 1992). Ein gutes Modell
für die rektale Infektion des Menschen stellt laut KUHN und Mitarbeitern (1997) sowie
JACKSON und Mitarbeitern (1995) die experimentelle intrarektale Infektion des
Rhesusaffen dar. Sowohl bei der SIV-Infektion der Primaten als auch bei der HIVInfektion des Menschen beeinflussen virale Faktoren und Wirtsfaktoren die
Pathogenese und Klinik stark. Daher muss die Übertragung der im Tiermodell gewonnenen Erkenntnisse auf den Menschen kritisch erfolgen. Unter den viralen
Faktoren gilt dies besonders für die Unterschiede im Genom von SIV und HIV.
HAROUSE und Mitarbeiter (2001) weisen dabei auf die besondere Bedeutung der
strukturellen, antigenetischen und immunologischen Unterschiede der Hüllproteine
von SIV und HIV hin. In der Impfstoffentwicklung wird seit einiger Zeit mit Chimären
aus SIV und HIV, sogenannten SHIV (Simian Human Immunodeficiency Virus),
gearbeitet. Diese Chimären bestehen aus SI-Viren, die env, tat, rev und/oder vp
Gene aus HIV enthalten (HIMATHONGKHAM et al., 2000; HAROUSE et al., 1998;
REIMANN et al., 1996). Derartig konstruierte SHIV führten nach Übertragung zu
einer Infektion, jedoch nicht immer zu klinischen Symptomen (LU et al., 1998;
REIMANN et al., 1996; ALLAN et al., 1995; LI et al., 1995). Bei einigen Chimären
konnten durch mehrfache in vivo-Passagen AIDS-ähnliche Erkrankungen ausgelöst
werden (HAROUSE et al., 1998; JOAG et al., 1997; REIMANN et al., 1996). Somit
bieten sie die Möglichkeit einer Weiterentwicklung der Tiermodelle mit einer besseren
Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den Menschen. Laut IGARASHI und Mitarbeitern
(2001) sowie ÜBERLA und Mitarbeitern (1995) sind SHIV insbesondere für
Pathogenese- und Vakzinestudien gut geeignet. Allerdings konnten REIMANN und
Mitarbeiter (1999) in Untersuchungen mit verschiedenen SHIV Hinweise darauf
finden, dass Wirtsfaktoren eine große Rolle bei der Pathogenese spielen. Dies muss
bei der Auswertung und Übertragung der Ergebnisse von Tiermodellen auf den
Menschen stets berücksichtigt werden.
Literaturübersicht
13
2.2 Die SIV-/HIV -Infektion des Gastrointestinaltraktes
Der Gastrointestinaltrakt besitzt eine besondere Bedeutung als Eintrittspforte für die
HIV-Infektion des Menschen. Sexueller Kontakt stellt den wichtigsten Infektionsweg
und eine der Hauptursachen für die weltweite Verbreitung der HIV-Infektion dar
(LeGRAND et al., 1995). In diesem Zusammenhang scheint der ungeschützte anale
Geschlechtsverkehr eine besondere Rolle zu spielen. Das Risiko einer HIV-Infektion
ist bei analem Geschlechtsverkehr ca. 1,8-mal so hoch wie bei vaginalem
(FUJIMURA und OWEN, 1996; QUINN, 1989; FRIEDLAND und KLEIN, 1987).
Sowohl bei vaginalem als auch bei analem Geschlechtsverkehr bedarf es zur Manifestation der Infektion der Überwindung der Schleimhautbarriere (BUTOR et al., 1996;
AMERONGEN et al., 1991). Der Mechanismus, mit dem das Virus diesen Schutzwall
des Körpers überwindet ist, ebenso wie die Zellen, die möglicherweise als Eintrittspforte dienen könnten, Gegenstand vieler Untersuchungen (BOMSEL, 1997; MILLER
et al., 1992, AMERONGEN et al., 1991; BOURINBAIAR und PHILLIPS, 1991;
MILLER et al., 1990 und 1989; LORIAN, 1988; ADACHI et al., 1987). Viele dieser
Studien werden anhand des Rhesusaffenmodells der SIV-Infektion durchgeführt
(VEAZEY et al., 1998; HERRMANN, 1997; LeGRAND et al., 1995; KULLER et al.,
1994; PAUZA et al., 1993).
Die natürliche SIV-Infektion nichthumaner Primaten wird vor allem mittels Speichel
und Blut übertragen (GARDNER, 1996). Die SIV-Infektion bietet sich jedoch als
Modell für die rektale Übertragung an, da das Rektum der Rhesusaffen in weiten
Teilen dem des Menschen entspricht (BUTOR et al., 1996). Die experimentelle intrarektale Übertragung führt zu einer Infektion, die mit der des Menschen vergleichbar
ist (HERRMANN, 1997; KULLER et al., 1994; PAUZA et al., 1993; LEVY et al.,
1989).
Der Gastrointestinaltrakt ist nicht nur eine wichtige Eintrittspforte der Infektion, es
findet auch eine Selektion der Viren bei der Aufnahme über die Schleimhaut statt. Es
kommt zu einer persistenten oder transienten Virämie, die mit einem langsamen
Fortschreiten der Erkrankung einhergeht (TRIVEDI et al., 1996 und 1994). Im
Gastrointestinaltrakt finden sich bereits in einem sehr frühen Stadium der Infektion,
noch vor dem Auftreten erster klinischer Symptome, infizierte Zellen (KAUP et al.,
2001; HEISE et al., 1994). Kurz nach der Infektion treten häufig bereits erste gastro-
14
Literaturübersicht
intestinale Symptome auf, wie zum Beispiel hochgradiger zum Teil rezidivierender
Durchfall und Abmagerung (KNOX et al., 2000; KAUP et al., 1994b; HEISE et al.,
1994). Im weiteren Verlauf der Infektion stellt der Gastrointestinaltrakt das Hauptzielorgan für opportunistische Infektionserreger dar (ZEITZ et al., 1998a; KAUP et al.,
1994a; GREENSON et al., 1991; LETVIN und KING, 1990; DOBBINS und
WEINSTEIN, 1985).
2.2.1 Eintrittsme chanismen in die Darmschleimhaut
Die Schleimhaut ist eine wichtige Barriere, die den Organismus vor pathogenen Umwelteinflüssen schützt und gleichzeitig die Aufnahme lebensnotwendiger Nährstoffe
sowie geringer Antigenmengen zur Ausbildung einer spezifischen Immunität erlaubt
(HEYMAN und DESJEUX, 1996; BORSCH, 1984). Die Schutzfunktion der intestinalen Schleimhaut beruht auf morphologischen, spezifischen und unspezifischen
Faktoren (PABST, 1987).
Zu den morphologischen Faktoren zählen die mechanische Integrität der Epitheldecke (TIDBALL, 1971), die „tight junctions“ (BERIN et al., 1999) und die vorgelagerte 0,4 - 0,5 µm breite Glykokalix (NEUTRA, 1999; FREY et al., 1996). Bei den
unspezifischen Faktoren handelt es sich unter anderem um die Schleimproduktion
der Becherzellen (PABST, 1987; FORSTNER, 1978), die gastrointestinale Motilität
sowie die physiologische Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora (BORSCH
1984). Die spezifische Abwehrfunktion des Gastrointestinaltraktes wird gewährleistet
durch intestinales lymphatisches Gewebe, das sogenannte GALT („Gut Associated
Lymphatic Tissue“). Laut DOE (1989) handelt es sich hierbei um die größte Ansammlung lymphatischen Gewebes im gesamten Körper. Das GALT setzt sich zusammen aus lymphoiden Aggregaten und Einzellymphfollikeln in der Lamina propria
mucosae, sowie aus in der Tunica mucosa und in der Tela submucosa verteilten
einzelnen Lymphozyten (DOE, 1989). Die Einzellymphfollikel im Gastrointestinaltrakt
sind von einem follikelassoziierten Epithel (FAE) überzogen, welches strukturelle
Charakteristika aufweist. Es kommen gehäuft intraepitheliale Zellen vor, Becherzellen fehlen fast vollständig, die sekretorische Komponente fehlt oder nimmt ab und
eine spezialisierte Zellform, die sogenannte M-Zelle, tritt auf (BRANDTZAEG und
BJERKE, 1990). Das FAE des Rektums enthält Zellen, die den M-Zellen des Dünn-
Literaturübersicht
15
darmes ähneln. Es weist keine Becherzellen und zahlreiche intraepitheliale Zellen
auf (HERRMANN, 1997; FUJIMURA et al., 1992). Dem follikelassoziierten Epithel
kommt eine besondere Bedeutung bei der Aufnahme von Mikroorganismen zu, es
bietet sich daher als Eintrittspforte für Infektionserreger an (NEUTRA, 1998;
BORSCH, 1984).
Viele pathogene Noxen dringen über die Schleimhaut in den Organismus ein oder
infizieren direkt das Schleimhautepithel. Auch HIV und SIV können über die Rektumschleimhaut eindringen, wobei der genaue Mechanismus noch nicht vollständig
geklärt ist. Für den Antigeneintritt in die Tunica mucosa werden verschiedene
potentielle Wege beschrieben. Läsionen der Darmschleimhaut können als Eintrittspforten für die Viren dienen. SIV und HIV sind jedoch auch in der Lage durch intaktes
intestinales Epithel einzudringen (DAVIS und OWEN, 1997). Intestinale Epithelzellen
haben die Fähigkeit lösliches Antigen sowohl apikal als auch basolateral aufzunehmen (OWEN und JONES, 1974). Aber auch parazellulärer sowie transzellulärer Transport von Antigenen durch die Schleimhaut ist möglich (CAMPBELL et
al., 1999). Neben den oben genannten potentiellen Eintrittsmechanismen besteht
ebenfalls die Möglichkeit, dass SIV und HIV in Form von Virus-IgG Antikörperkomplexen, die an Fcγ2 oder Fcγ3 Rezeptoren im Rektum binden, die Schleimhautbarriere überwinden (POLYANSKAYA et al., 2001).
Die oben genannten M-Zellen spielen bei der Antigenaufnahme aus dem Darmlumen
sowie im Rahmen der Abwehrfunktion des GALT eine wichtige Rolle, da sie mittels
Transzytose Antigen durch das Schleimhautepithel transportieren können. Dies liegt
unter anderem in ihrer Morphologie begründet. Die Oberfläche der M-Zellen ist
unregelmäßig geformt, beim Menschen findet sich eine abgeflachte apikale Oberfläche mit Mikrofalten statt Zotten, bei anderen Spezies tragen M-Zellen kurze, breite
und irreguläre Mikrovilli (GEBERT et al., 2000; NEUTRA et al., 1999; DAVIS und
OWEN, 1997). Die Glykokalix ist im Vergleich zu den Epithelzellen geringer ausgeprägt (GEBERT et al., 2000; NEUTRA et al., 1999; FREY et al., 1996; OWEN, 1977).
Das oberflächliche Zytoplasma ist dünn und enthält viele Mitochondrien und Vesikel,
die an der Transzytose beteiligt sind (GEBERT et al., 2000; DAVIS und OWEN,
1997; KUHN und KAUP, 1994). Das zentrale Zytoplasma ist von basolateral eingestülpt und bildet eine Tasche in der Lymphozyten, Lymphoblasten, Makrophagen,
16
Literaturübersicht
Plasmazellen und/oder neutrophile Granulozyten liegen (DAVIS und OWEN, 1997).
Dadurch gewinnen diese Zellen eine besondere Nähe zum intestinalen Lumen, von
dem sie nur eine dünne Zytoplasmabrücke von z. T. nur 1-2 µm Stärke trennt
(GEBERT et al., 2000; KRAEHENBUHL und NEUTRA, 2000). M-Zellen enthalten
keine Lysosomen und weisen eine geringe Aktivität der sauren Phosphatase auf
(DAVIS und OWEN 1997).
Die M-Zellen sind aufgrund des weitgehenden Fehlens von Lysozym (GEBERT et
al., 2000) als Eintrittspforten interessant. Ihre Funktion scheint im Transport intakter
Antigene zu benachbarten Epithelzellen oder den Zellen der spezifischen Immunabwehr zu bestehen, da ihnen die Fähigkeit Antigen zu prozessieren und dieses
dann zu präsentieren weitgehend fehlt (GEBERT et al., 2000; BRANDTZAEG und
BJERKE, 1990). Andererseits wurden an der basolateralen Membran der M-Zellen
MHC Klasse II Moleküle gefunden. Dies weist daraufhin, dass sie doch in der Lage
sein könnten, Antigen zu prozessieren und immunkompetenten Zellen zu präsentieren. Allerdings fehlt der Nachweis dieser Funktion in vivo, zudem dauert der Transport durch das Zytoplasma nur 10-15 Minuten und es ist nicht bekannt, in welchem
Masse Antigene oder pathogene Noxen während des Transportes verändert oder
degradiert werden (GEBERT et al., 2000; KRAEHENBUHL und NEUTRA, 2000;
NICOLETTI, 2000; NEUTRA et al., 1999). In das Lumen sezerniertes IgA scheint
bevorzugt an die Oberfläche der M-Zellen zu binden. M-Zellen könnten durch
Aufnahme der IgA-Antigenkomplexe die sekretorische Immunantwort verstärken,
obwohl sie selbst nicht in der Lage sind lösliches IgA (sIgA) zu bilden und in das
Lumen zu sezernieren (NEUTRA et al., 1999).
Verschiedene Untersuchungen über die Aufnahme von Makromolekülen, bakteriellen
und viralen Erregern durch M-Zellen wurden in vivo und in vitro durchgeführt
(KERNEIS et al., 1997). Dabei wurde festgestellt, dass unter anderem Makromoleküle wie Hefen (BEIER und GEBERT, 1998), bakterielle Erreger wie
Salmonellen, Yersinien, Vibrio cholera und Shigellen (SCHULTE et al., 2000; JONES
et al., 1994; CLARK et al., 1994; GRUTZKAU et al., 1993 und 1990; WASSEF et al.,
1989; OWEN et al., 1986) und virale Erreger wie Reoviren und Polioviren (OWEN,
1998; AMERONGEN et al., 1994; SICINSKI et al., 1990; BASS et al., 1988) bei
verschiedenen Spezies über M-Zellen in den Organismus aufgenommen werden
Literaturübersicht
17
können. HEPPNER und Mitarbeiter (2001) wiesen in einem in vitro Modell ebenfalls
die Aufnahme von Prionen durch M-Zellen nach. Die Aufnahme von HIV-1 durch MZellen wurde von AMERONGEN und Mitarbeitern (1991) in einem in vitro Modell mit
explantierten Peyerschen Platten des Ileums von Kaninchen und Maus nachgewiesen. HIV heftet sich an die Oberfläche der M-Zellen und findet sich in Endosomen
innerhalb der oberflächlichen Zytoplasmaschicht ebenso wie in den intraepithelialen
Taschen (NEUTRA, 1999; FREY et al., 1996; AMERONGEN et al., 1991). Dabei
gelangt das Virus direkt zu seinen in den Invaginationen der M-Zellen gelegenen
Zielzellen, den CD4+ T-Lymphozyten und Makrophagen (MADARA, 1997).
Wie oben aufgeführt könnten HIV und SIV die Transportfunktion der M-Zellen ausnutzen, um über die Darmschleimhaut in den Organismus einzudringen. Im Vergleich
zu den Epithelzellen der Darmschleimhaut sind die M-Zellen jedoch in der Anzahl
verschwindend klein und auf umschriebene Regionen beschränkt. Vermutlich reicht
die geringe Zahl der M-Zellen funktionell aus, um eine Immunantwort auszulösen
(GEBERT et al., 2000). Dennoch ist es fraglich, ob die M-Zellen als alleinige Eintrittspforte für SIV und HIV im Gastrointestinaltrakt dienen.
Weitere Eintrittspforten für SIV und HIV könnten intestinale Epithelzellen („intestinal
epithelial cells“ - IEC) darstellen, da diese das Schleimhautimmunsystem durch
Steuerung des Antigendurchflusses regulieren. IEC können sowohl transzellulär als
auch parazellulär als Eintrittspforte für Erreger in die Darmschleimhaut dienen
(SHAO et al., 2001; CAMPBELL et al., 1999; MADARA, 1997).
Bei der transzellulären Antigenaufnahme wird lösliches Antigen von apikal nach
basolateral transportiert und dabei über Pinozytosevesikel, Endosomen und Lysosomen verarbeitet (SHAO et al., 2001; MAYER, 2000). Intestinale Epithelzellen
tragen einige bekannte bzw. potentielle Antigenrezeptoren, was auf ihre Bedeutung
als Antigen aufnehmende Zellen hinweist. Allerdings fehlen Daten, die die Funktion
dieser Rezeptoren in vivo belegen. Es sind allerdings prozessierende und präsentierende Wege der Antigenaufnahme für IEC nachgewiesen. Bedingt durch MHC
Klasse I und II bestehen verschiedene Wege Antigen aufzunehmen und zu bearbeiten (SHAO et al., 2001; MAYER, 2000; PITMAN und BLUMBERG, 2000; CAMPBELL
et al., 1999; HEYMAN und DESJEUX, 1996; PERDUE und McKAY, 1994). IEC wird
die Fähigkeit einer rezeptor-gesteuerten Endozytose ebenso wie die einer Flüssig-
18
Literaturübersicht
phasen-Pinozytose zugesprochen. Zudem sind für einige Organismen wie zum
Beispiel Salmonellen und Yersinien spezifische Aufnahmewege bekannt (SHAO et
al., 2001). Die intestinalen Epithelzellen stehen in engem Kontakt mit intraepithelialen
T-Zellen und kommen über basolaterale Projektionen durch die Basalmembran mit TZellen der Lamina propria in Kontakt. Dies lässt vermuten, dass IEC als antigenpräsentierende Zellen fungieren und möglicherweise die Immunantwort der T-Zellen
der intestinalen Schleimhaut regulieren. Diese Theorie wird unterstützt dadurch, dass
IEC auf ihrer Oberfläche verschiedene Moleküle tragen, die als Antigenrezeptoren
dienen können. Außerdem können die Rate und die Effizienz der Antigenaufnahme
und –verarbeitung durch die IEC über Entzündungsmediatoren moduliert werden
(HERSHBERG und MAYER, 2000). Für HIV konnte in vitro eine rasche Transzytose
durch eine Barriere aus menschlichen Epithelzellen nachgewiesen werden. Nach der
Infektion kommt es zu einer massiven und raschen Virusansammlung („budding“) am
Epithel und zur Aufnahme der Viren in epitheliale endosomähnliche Strukturen. Die
epitheliale Barriere ist 30 Minuten nach der Infektion mittels Transzytose überwunden
und es kommt zu einer produktiven Infektion subepithelialer mononukleärer Zellen
(HOCINI und BOMSEL, 1999; BOMSEL, 1997).
Neben dem transzellulären Antigeneintritt in die Darmschleimhaut besteht auch die
Möglichkeit der parazellulären Passage. Die Integrität der Epitheldecke und die „tight
junctions“ zwischen den Epithelzellen dienen dazu, einen parazellulären Antigentransit zu verhindern. Läsionen in der epithelialen Barriere oder Apoptosen einzelner
Epithelzellen können den parazellulären Eintritt von Antigen ermöglichen (SHAO et
al., 2001). Die „tight junctions“ stellen auch keine statische, absolut unüberwindbare
Barriere dar, sondern eine selektive semipermeable Eintrittspforte, die z. B. durch
entzündliche Zytokine oder Bakterientoxine reguliert werden kann (SHAO et al.,
2001). Untersuchungen von RESCIGNO und Mitarbeitern (2001) haben ergeben,
dass dendritische Zellen (DC) „tight junction“-Proteine exprimieren, die die Verbindungen zwischen den Epithelzellen öffnen und Mikroorganismen direkt aufnehmen,
ohne die Integrität der epithelialen Barriere zu zerstören. Follikulärdendritische Zellen
(„Follicular Dendritic Cells“, FDC) sind somit auch in der Lage Erreger direkt aus dem
Darmlumen aufzunehmen. Nach der Aufnahme des Antigens kommt es in
dendritischen Zellen zu Veränderungen, welche zu einer Migration der Zellen in
lymphatisches Gewebe, v. a. in T-Zellreiche Regionen, führen (MASCOLA et al.,
Literaturübersicht
19
2000). Für die Langerhanszellen der Genitalschleimhaut, die auch zur Gruppe der
dendritischen Zellen gehören, wiesen BLAUVELT und Mitarbeiter (2000) in einem ex
vivo Modell nach, dass diese als Hauptzelltyp an dem Transport von HIV zu lymphatischem Gewebe beteiligt sind.
NELSON und Mitarbeiter (1988) zeigten mittels in situ Hybridisierung (ISH), dass im
Gastrointestinaltrakt von HIV-infizierten Patienten das Rektum die höchste Anzahl
HIV-infizierter Zellen aufweist. Provirale DNA und HIV-1 RNA wurde in fast allen
untersuchten Rektumbiopsien von HIV-Infizierten gefunden (DiSTEFANO et al.,
2001). Dies und die Tatsache, dass die Transzytosefähigkeit des intestinalen
Epithels von proximal nach distal zunimmt (HEYMAN und DESJEUX, 1996), machen
das Rektum als Eintrittspforte und als Manifestationsort für die SIV/HIV-Infektion sehr
interessant.
2.2.2 Pathogenes e der SIV/HIV-Infektion
Nach Überwinden der Schleimhautbarriere gelangen SIV und HIV in Kontakt mit
ihren Zielzellen. Auch im Gastrointestinaltrakt sind dies vor allem CD4+ T-Lymphozyten und Makrophagen (ZEITZ et al., 1998a; KING, 1993). Aber ebenfalls in
Mastzellen, jejunalen Enterozyten, rektalen enterochromaffinen Zellen der Lamina
propria, mononukleären Zellen und intraepithelialen Lymphozyten in der Duodenum-,
Ileum- und Rektumschleimhaut fanden sich die Viren bzw. ihre RNA (SPRENGER et
al., 1995; KAAYA et al., 1993). Die Viren weisen einen Tropismus für CD4+ Zellen
auf (SATTENTAU und MOORE, 1993). CD4 dient als Hauptrezeptor und ermöglicht
über das Hüllprotein gp120 die Bindung der Viren an die Zellen, daneben werden
auch noch Korezeptoren benötigt. Zellen, die kein CD4 exprimieren, können ebenfalls infiziert werden. Dafür werden verschiedene Korezeptoren, wie z. B. CCR 5
(„Chemocine Receptor“ 5) und CXCR4 („Chemocine Receptor for X-strains of HIV“)
benutzt (LIU et al., 2000; REEVES et al., 1999). ZHANG und Mitarbeiter (1998)
fanden diese Korezeptoren vor allem auf T-Lymphozyten und Makrophagen, was die
Bedeutung dieser Zellen als Hauptzielzellen hervorhebt. Der Gehalt an Korezeptoren
im Magen-Darm-Trakt wird kontrovers diskutiert. LI und Mitarbeiter (1999) wiesen
nach, dass zur Infektion von intestinalen Makrophagen mit HIV-1 wesentlich höhere
Viruskonzentrationen nötig sind als z. B. für die Infektion von Makrophagen aus dem
20
Literaturübersicht
peripheren Blut. Sie führten diese Tatsache auf die geringe Ausprägung des
Korezeptors CCR5 an der Zelloberfläche intestinaler Makrophagen zurück. Im
Gegensatz dazu weisen viele CD4+ T-Zellen des Magen-Darmtraktes CCR5 auf
(VEAZEY et al., 2000b), was auf eine erhöhte Empfänglichkeit für eine HIV/SIVInfektion hinweisen könnte.
Sowohl die Rezeptor-vermittelte Endozytose (FACKLER und PETERLIN, 2000;
SATTENTAU und MOORE, 1993; MOORE et al., 1991) als auch die direkte Verschmelzung der Virushülle mit der Zellmembran (GREWE et al., 1990) werden als
Eintrittsmechanismen in die Zelle diskutiert. Beide Mechanismen können gleichzeitig
an einer Zelle ablaufen. Neben der Infektion von Zellen mittels zellfreien oder knospenden Viren besteht laut SATO und Mitarbeitern (1992) die Möglichkeit, dass HIV
und SIV über Zellfusion von Zelle zu Zelle weitergegeben werden.
Nach dem Eindringen in die Zellen findet die Vermehrung der Viren statt, was zu
einem Peak in der Plasmavirämie führt. Provirale DNA kann aus einem hohen
Prozentsatz der PBMC („Peripher Blood Mononuclear Cells“) isoliert werden, zudem
sind hohe p24 und p27 Werte messbar (PANTALEO und FAUCI, 1996; REIMANN et
al., 1994; GRAZIOSI et al., 1993; KOTLER et al., 1991). Das Virus verteilt sich über
das periphere Blut in die lymphatischen Kompartimente des Körpers. Sowohl nach
intravenöser als auch nach intrarektaler Infektion ist SIV bereits sieben Tage nach
der Infektion im lymphatischen Gewebe des Verdauungstraktes nachweisbar (KAUP
et al., 2001; HERRMANN, 1997; HEISE et al., 1994). Im akuten Stadium finden sich
infizierte Zellen in Lymphaggregaten, Peyerschen Platten und in der Lamina propria.
Bei Ausbildung von AIDS weisen alle Regionen des Gastrointestinaltraktes zahlreiche hochgradig infizierte T-Zellen und Makrophagen im Zotten- und Kryptepithel
sowie in der endothelialen Begrenzung der Zottenareale auf (HEISE et al., 1994).
Nach der Phase der initialen Virusvermehrung kommt es zu einem drastischen Abfall
der Plasmavirämie und der p24 bzw. p27 Werte im peripheren Blut (REIMANN et al.,
1994; PANTALEO et al., 1994). Gleichzeitig treten Antikörper gegen verschiedene
Virusproteine auf (REIMANN et al., 1994; DAAR et al., 1991; CLARK et al., 1991). Im
Gegensatz zum peripheren Blut finden sich im lymphatischen Gewebe provirale DNA
und virale RNA (VEAZEY et al., 2001; PAUZA et al., 1993; FOX et al., 1991). Dabei
spielen FDC eine wichtige Rolle. Diese Zellen sind in der Lage über Komplement-
Literaturübersicht
21
rezeptoren an Immunglobuline gebundene und Komplement-komplexierte Viren an
ihrer Oberfläche zu binden. Sie filtern sozusagen Erreger aus dem Blutkreislauf
(BURTON et al., 1997). FDC tragen ein zellspezifisches SIV/HIV Bindungsprotein,
das sogenannte DC-SIGN, dass das Virus einfängt und den Transport zu lymphatischen Organen erleichtert (GEIJTENBEEK et al., 2001 und 2000). Im Rektum des
Menschen und des Rhesusaffen fanden JAMESON und Mitarbeiter (2002) in der
Lamina propria des gesamten Darms eine hohe Anzahl von Zellen, die dieses
Bindungsprotein aufweisen. In solitären Lymphknoten des Rektums war dagegen nur
eine geringe Anzahl an DC-SIGN vorhanden. Im Rektum lagen DC-SIGN(+) Zellen
direkt unterhalb des Schleimhautepithels. Von produktiv infizierten FDC freigesetzte
Viren könnten während der Wanderung durch die Keimzentren der Lymphknoten
kontinuierlich CD4+ T-Zellen infizieren. SPRENGER und Mitarbeiter (1995) betonen,
dass es sich bei FDC um langlebige Zellen handelt, die die Infektion über Jahre
beherbergen können. FDC sind auch in der Lage Erreger über die „tight junctions“
direkt aus dem Darmlumen aufzunehmen (RESCIGNO et al., 2001). Ob diese
Mechanismen auch bei einer HIV- und SIV-Infektion zum Tragen kommen, wird
kontrovers diskutiert. So finden sich an der Oberfläche der FDC keine der oben
genannten Korezeptoren, die als Bindungsstellen für HIV und SIV fungieren könnten.
SPRENGER und Mitarbeiter (1995) zeigten, dass in vitro mit HIV-1 infizierte menschliche FDC provirale DNA enthalten, Virus produzieren und die Infektion auf T-Zellen
übertragen. Andere Untersuchungen haben dagegen ergeben, dass nur unreife
dendritische Zellen selektiv makrophagentropes HIV-1 replizieren und reife dendritische Zellen kein Virus produzieren sondern als Überträger fungieren (GRANELLIPIPERNO et al., 1998). BLAUVELT und Mitarbeiter (1997) stellten fest, dass der
produktiven Infektion von dendritischen Zellen mit HIV-1 und der Fähigkeit das Virus
einzufangen und zu transportieren verschiedene Mechanismen zugrunde liegen. All
diese Untersuchungen lassen eine besondere Bedeutung der dendritischen Zellen
während der SIV/HIV-Pathogenese vermuten, wobei die genauen Mechanismen
noch nicht eindeutig geklärt sind.
22
Literaturübersicht
Mit dem Fortschreiten der Infektion kommt es zu einer zunehmenden Zerstörung der
FDC, und die Architektur der Lymphknoten geht verloren. Dadurch wird vermehrt
Virus in die Peripherie freigegeben. Es wird ein Ausgleich zwischen der Virusbelastung des lymphatischen Gewebes und dem peripheren Blut erreicht. Das volle
Krankheitsbild von AIDS wird ausgebildet.
Die experimentelle intrarektale Infektion von Rhesusaffen mit hohen Dosen SIV geht
einher mit einer Infektion, die in vielen Punkten der intravenös infizierter Tiere gleicht.
Sie unterscheidet sich durch ein langsameres Fortschreiten der Erkrankung (PAUZA
et al., 1993). Bei niedrigen intrarektal applizierten Dosen kommt es zu einer inapparenten Infektion, d. h. die Tiere bleiben serologisch negativ. Das Virus lässt sich nicht
aus PBMC isolieren, virale DNA ist jedoch dauerhaft in den PBMC präsent und die
Infektion lässt sich mittels Transfusion auf andere Tiere übertragen (KULLER et al.,
1994; PAUZA et al., 1993). Das lymphatische Gewebe der Schleimhaut bietet HIV
und SIV ideale Bedingungen. Die Lymphozyten der intestinalen Lamina propria sind
zu ca. einem Drittel T-Zellen, von denen die meisten CD4 exprimieren und deren
Phänotyp dem der peripheren Memory-Zellen ähnelt. Zudem sind Lamina propria TLymphozyten stärker aktiviert als periphere T-Zellen (ZEITZ et al., 1998a). Verschiedene Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis, dass die optimale virale Replikation
von SIV und HIV nur in CD4+ T-Zellen stattfindet, die einen aktivierten und/oder
Memory-Phänotyp aufweisen (VEAZEY et al., 2000a und 1998). Sowohl die SIV- als
auch HIV-Infektion führen sehr früh im Infektionsverlauf zu einem starken Verlust der
CD4+ T-Zellen in der intestinalen Schleimhaut (VAJDY et al., 2000; KEWENIG et al.,
1999; SMIT-McBRIDE et al., 1998; VEAZEY et al., 1998; CLAYTON et al., 1997).
VAJDY und Mitarbeiter (2000) fanden den CD4+-Abfall bereits 21 Tage nach intrarektaler Infektion. Der CD4+-T-Zellverlust übersteigt die Depletion der CD4+ TLymphozyten im peripheren Blut, was VEAZEY und Mitarbeiter (2000b) auf das
verstärkte
Vorkommen
CCR5
tragender
CD4+
T-Lymphozyten
im
Gastro-
intestinaltrakt zurückführen. Sie zeigten, dass bereits 14 Tage nach der Infektion
keine CCR5 tragenden CD4+ T-Zellen mehr nachweisbar sind. Während der akuten
SIV-Infektion werden anscheinend speziell aktivierte CD4+ T-Lymphozyten mit dem
Memory-Phänotyp eliminiert (VEAZEY et al., 2000a). Gleichzeitig kommt es zu einem
Anstieg der Zahl der CD8+ T-Zellen (VEAZEY et al., 1998).
Literaturübersicht
23
JACKSON und Mitarbeiter (1995) zeigten, dass der Gastrointestinaltrakt SIVinfizierter Tiere ebenfalls eine starke Reduktion der IgA-enthaltenden Plasmazellen
einhergehend mit einem Anstieg der IgM-enthaltenden Zellen aufweist. Dies
korreliert auch mit dem Ergebnis einer Studie von SCHÄFER und Mitarbeitern
(2002), dass nach einer experimentellen SIV-Infektion keine SIV-spezifische IgA
Synthese im GIT stattfindet. Diese Veränderungen könnten für die starke und
schnelle SIV/HIV Replikation im GIT verantwortlich sein, ebenso könnten durch den
Mangel an sIgA das gehäufte Vorkommen opportunistischer Infektionen im GIT
während der SIV/HIV-Infektion erklärt werden.
2.2.3 Klinik und P athologie des Gastrointestinaltraktes bei SIV/HIV-Infektion
Die klinischen Veränderungen während der SIV-/HIV-Infektion lassen sich größtenteils auf eine massive Störung des Immunsystems, v. a. der T-Helferzellen und der
Zellen des mononukleären Phagozytensystems zurückführen. Der Verlust der THelferfunktion, sowohl beim Menschen als auch bei den Makaken, wurde von
verschiedenen Autoren beschrieben (KEWENIG et al., 1999; SMIT-McBRIDE et al.,
1998; MATAPALLIL et al., 1998; KING, 1993). Für den Verlauf der HIV-Infektion gibt
es unterschiedliche Klassifikationssysteme. Besonders hervorzuheben sind die
Walter Reed Staging Classification (WRSC) (ROYCE et al., 1991; REDFIELD et al.,
1986) beruhend auf dem Ausmaß des Immundefekts und die CDC-Klassifikation
(„Centers for Disease Control and Prevention“), der die klinische Symptomatik
zugrunde liegt (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1993).
Zudem existieren für die HIV-Infektion sogenannte „AIDS-Marker“, dabei handelt es
sich um Erkrankungen oder Tumoren, die in auffälliger Häufung bei AIDS-Patienten
auftreten (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1987).
Bezüglich des GIT kommt es im Rahmen der HIV-Infektion häufig zu einem
sogenannten „wasting-syndrome“, das mit Abmagerung bis hin zur völligen Auszehrung einhergeht. Im Rahmen dieses Syndroms treten chronische Durchfälle auf, bei
denen nicht immer opportunistische Erreger nachweisbar sind. Fälle ohne nachweisbare Erreger, sind auf direkt HIV assoziierte Enteropathien zurückzuführen, denen
ultrastrukturelle Veränderungen, Störungen der Zelldifferenzierung sowie Defekte bei
der Nährstoffabsorption durch die Enterozyten zugrunde liegen könnten (DELEZAY
et al., 1997; ASMUTH et al., 1994; SUTHERLAND et al., 1990). Darüber hinaus ist
24
Literaturübersicht
der GIT Hauptmanifestationsort für sekundäre opportunistische Infektionen und
Neoplasien (ZEITZ et al., 1998b; MUNCH, 1997; EDWARDS et al., 1990;
SUTHERLAND et al. 1990).
Die Mehrzahl der opportunistischen Erreger, die bei HIV-Infizierten beschrieben sind,
kommen auch bei SIV-infizierten Rhesusaffen vor. Es sind allerdings für das Tiermodell keine den sogenannten „AIDS-Markern“ des Menschen entsprechenden MarkerErkrankungen für das Endstadium der Erkrankung definiert (KAUP et al., 1994b). Zu
den klinischen Symptomen zählen häufig generalisierte Lymphadenopathie und
Splenomegalie, schwerer rezidivierender Durchfall, Kachexie mit Gewichtsverlust bis
zu 60% des Ausgangsgewichtes, respiratorische sowie zentralnervöse Störungen
(KAUP et al., 1998; KUHN et al., 1997; HEISE et al., 1994). Im Infektionsverlauf
fallen Blutbildveränderungen wie Anämie, Neutropenie, Lymphopenie, Thrombozytopenie, Monozytose, Hypogammaglobulinämie und eine Verschiebung des CD4+- zu
CD8+-T-Zell-Verhältnises zugunsten von CD8+ auf. Zudem finden sich häufig
multiple oder ungewöhnliche opportunistische Infektionen und/oder Neoplasien,
wobei es sich in erster Linie um Lymphome handelt (KAHNT et al., 2002; KAHNT,
2001; CAMPBELL und ROBINSON, 1998; HANNIG et al., 1997; GERETTI et al.,
1989). Die Endphase des Infektionsverlaufes wird als AIDS-ähnliche Erkrankung
bezeichnet (FULTZ et al., 1995). Im Gegensatz zur HIV-Infektion des Menschen
verläuft die Erkrankung der Affen in einem kürzeren Zeitrahmen. Die ersten
klinischen Symptome treten bereits innerhalb von zwei Monaten nach der Infektion
auf und das Endstadium wird meist innerhalb von zwei Jahren erreicht (CAMPBELL
und ROBINSON, 1998; KAUP et al., 1998; LETVIN und KING, 1990; GERETTI et al.,
1989). Ebenso wie beim Menschen besteht eine hohe Variationsbreite im Bezug auf
die Dauer des Krankheitsverlaufes, so dass auch bei der SIV-Infektion von slow-,
intermediate- und rapid-progression gesprochen werden kann (DIDIER, 2000;
HOLTERMAN et al., 2000). Es gibt außerdem den sehr seltenen Fall der long-term
nonprogression (SPRING et al., 1998; PANTALEO et al., 1996).
Der Magen-Darm-Trakt ist nicht nur eine wichtige mögliche Eintrittspforte für die
Infektion, sondern auch einer der Hauptmanifestationsorte. Er weist häufig bereits
vor dem Auftreten sekundärer Veränderungen funktionelle und morphologische
Alterationen auf, die der AIDS-Enteropathie entsprechen und als SIV-Enteropathie
bezeichnet werden (KAUP et al., 1998; KUHN et al., 1997; KAUP et al., 1994b).
Diese Veränderungen äußern sich klinisch in Form von Diarrhoe, verringerter Enzym-
Literaturübersicht
25
aktivität, Abmagerung und Dehydrierung (HEISE et al., 1993a; DESROSIERS,
1990). Die pathologisch-histologischen Veränderungen können in primäre und
sekundäre Alterationen unterteilt werden. Wobei die primären Veränderungen früh im
Infektionsverlauf und ohne nachweisbare Beteiligung opportunistischer Krankheitserreger auftreten. Sekundäre Veränderungen dagegen sind gekennzeichnet durch
die Anwesenheit opportunistischer Krankheitserreger.
Zu den primär SIV-induzierten Veränderungen zählen Lymphknoten- und Milzalterationen. Diese gehen im Verlauf der Infektion von einer follikulären Hyperplasie
über eine Follikeldepletion, granulomatöse Lymhadenitis bzw. Splenitis bis hin zu
einem lymphoproliferativen Syndrom (SIMON et al., 1992; LETVIN und KING, 1990;
RINGLER et al., 1989). Zudem finden sich als primäre Veränderungen die SIVEnzephalopathie (SCHMIDT, 2001; SIMON et al., 1992; LETVIN und KING, 1990),
die Riesenzellpneumonie (MÄTZ-RENSING et al., 1995; SIMON et al., 1992;
CHALIFOUX et al., 1992; LETVIN und KING, 1990), die „giant cell disease“ in Lunge,
ZNS, Lymphknoten, Milz, Thymus, Leber, Magen-Darmtrakt und kardiovaskulärem
System (KAUP et al., 1998; HÜNERBEIN et al., 1994; KAAYA et al., 1993; KLUMPP
et al., 1993; KING et al., 1990; McCLURE et al., 1989; RINGLER et al., 1989) sowie
im Endstadium der Erkrankung die Thymusatrophie (SIMON et al., 1992; LETVIN
und KING, 1990; McCLURE et al., 1989). Bezüglich des Gastrointestinaltraktes tritt
neben der oben bereits genannten „giant cell disease“ als primär SIV/HIV-induzierte
Veränderung die SIV/HIV-Enteropathie bzw. die AIDS-Enteropathie auf (KEWENIG
et al., 1999; BARTLETT et al., 1992; GREENSON et al., 1991). Diese beiden
Begriffe werden in der Literatur häufig synonym gebraucht. Die SIV/HIV-Enteropathie
ist charakterisiert durch eine gering- bis hochgradige Zottenatrophie sowie entzündliche Infiltrationen der Lamina propria mit Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen (ZEITZ et al., 1998b; KAUP et al., 1998; KUHN et al., 1997; HEISE et al.,
1993a), wobei keine klinischen Symptome wie Durchfall auftreten. Einige Autoren
zählen auch eine Krypthyperplasie zu den Charakteristika der SIV/HIV-Enteropathie
(BARTLETT et al., 1992). Zottenatrophie stellt eine unspezifische Reaktion der
intestinalen Schleimhaut auf verschiedene Einflüsse dar. Die HIV-Infektion geht mit
einer epithelialen Hypoproliferation einher. Diese Hypoproliferation und Fehlreifung
ist deutlich ausgeprägt bei HIV-infizierten Patienten ohne sekundäre Infektionen und
geht einher mit messbaren p24 Werten in der Lamina propria (ZEITZ et al., 1998b).
26
Literaturübersicht
SWAGGERTY und Mitarbeiter (2000) wiesen nach, dass SIV eine enterotoxische
Domaine auf der Oberfläche trägt, was eine mögliche Erklärung für das Auftreten des
sogenannte „wasting syndrome“ bei der SIV/HIV-Infektion darstellen könnte. Zudem
konnte in vitro nachgewiesen werden, dass gp120 über den basal an Epithelzellen
des Dünndarms gelegenen Korezeptor Bob/GPR15 ein Calciumsignal auslöst,
welches möglicherweise eine weitere Ursache für die HIV-Enteropathie darstellt
(CLAYTON et al., 2001). Wie hier dargestellt existieren zahlreiche Hinweise auf
mögliche Ursachen der primär SIV-/HIV-induzierten gastrointestinalen Veränderungen, der komplexe Mechanismus ist allerdings nicht bekannt.
Sekundäre Alterationen im Verlauf der HIV-/SIV-Infektion sind gekennzeichnet durch
das Auftreten ungewöhnlicher oder multipler opportunistischer Infektionen. Im
Gastrointestinaltrakt handelt es sich hierbei häufig um Balantidium coli, wobei die
Bedeutung als echter opportunistischer Infektionserreger umstritten ist. Das Auftreten
von B. coli ist meist nicht mit Durchfällen oder intestinalen histopathologischen Veränderungen gekoppelt. Die Infektion verläuft häufig asymptomatisch, teilweise findet
sich eine Invasion der Schleimhaut durch B. coli mit Erosionen und oberflächlichen
Ulzerationen (KAUP et al., 1998; KUHN et al., 1997). Ein klassischer AIDS Markerkeim ist dagegen Cryptosporidium sp., wobei die Infektion meist mit histopathologischen Schleimhautveränderungen und Durchfall einhergeht (BARTLETT et al.,
1992). Häufig trägt die Infektion mit Kryptosporidien einen systemischen Charakter,
wobei die Erreger sich vom Intestinaltrakt über Leber und Pankreas ausbreiten
(KAUP et al., 1998; KUHN et al., 1997; KAUP et al., 1994a). Oft können im Rahmen
der SIV-Infektion bei Tieren, die Kryptosporidien aufweisen, weitere opportunistische
Erreger wie Spironucleus sp. und Trichomonas sp. nachgewiesen werden. Tabelle 1
gibt eine Übersicht über häufige opportunistische Krankheitserreger, die im GIT
während der SIV/HIV-Infektion gefunden werden.
Literaturübersicht
27
Tabelle 1: Häufige opportunistische Erreger im Gastrointestinaltrakt bei HIV- bzw.
SIV-Infektion
Erreger-
Erreger bei HIV-Infektion
Erreger bei SIV-Infektion
gruppe
Bakterien Salmonella typhimurium 1,11
Shigella spp. 1,11
Mycobacterium avium 1,4,11,14
Shigella spp. 17
Mycobacterium avium/intracellulare 8,10,13
α-hämolysierende Streptokokken 5
Campylobacter spp. 1,11
Viren
Adenovirus 1,11
CMV9 1,2
Rotavirus 1,11
Adenovirus 3,12,13
CMV 2,3,5,6,16
Parasiten Cryptosporidium spp. 1,11,14,15
Cryptosporidium spp. 3,5,6,9,12,13,17
Balantidium coli 6,7
Microsporidia 1,11,15
Giardia lamblia 11
Entamoeba histolytica 1,11
Pilze
1
Histoplasma 1,4,11
Candida albicans 4
Candida albicans 17
JANOFF und SMITH, 2001; 2 KUHN et al., 1999; 3 KAUP et al., 1998; 4 HIRSCH und
CURRAN, 1996;
5
HEISE et al., 1994;
HEISE et al., 1993a;
al., 1992;
12
9
6
KAUP et al., 1994b;
HEISE et al., 1993b;
CHALIFOUX et al., 1992;
13
10
7
LACKNER, 1994;
KAAYA et al., 1993;
SIMON et al., 1992;
14
11
8
BARTLETT et
EDWARDS et al.,
1990; 15 FARTHING et al., 1990; 16 BASKIN, 1987, 17 OSBORN et al., 1984
Neben den in Tabelle 1 genannten sekundären Erregern, treten auch seltene Erreger
auf. So beschreiben zum Beispiel DIDIER et al. (1999) den Nachweis von Mycobacterium simiae als Ursache für eine chronische, behandlungsresistente Diarrhoe mit
progressivem Gewichtsverlust bei einem 9 jährigen weiblichen Rhesusaffen, der
intravenös mit SIV infiziert wurde. Es existieren eine Vielzahl an Publikationen
sowohl zu den sekundären Veränderungen nach einer SIV/HIV-Infektion und den
daran beteiligten opportunistischen Erregern als auch zu den primär SIV/HIVbedingten Veränderungen.
28
Literaturübersicht
2.3 Nachweis v on SIV im Darmtrakt
Im Rahmen der intensiven Untersuchungen des Gastrointestinaltraktes als potentielle Eintrittspforte für SIV/HIV und als Hauptmanifestationsort der Infektion wurden
zahlreiche Nachweismethoden für eine SIV/HIV-Infektion des Gastrointestinaltraktes
entwickelt. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über ausgewählte Methoden.
Tabelle 2: Nachweismethoden für SIV im Darmtrakt
Nachweismethode
Detektion von:
Nachweis im:
Immunhistochemie (IHC)
SIV-Antigen
Lichtmikroskop
In situ Hybridisierung (ISH)
SIV-Genen
Polymerasekettenreaktion (PCR und
RT-PCR)
Transmissionselektronenmikroskopie
Proviraler DNA
Lichtmikroskop
Agarosegel
und RNA
SIV-Partikeln
Elektronenmikroskop
(TEM)
Immunhistochemie (IHC)
Die Immunhistochemie dient, je nach Spezifität des gewählten Primärantikörpers,
dem Nachweis von SIV-Antigen bzw. von durch das Virus produzierten Proteinen.
Als Ausgangsmaterial dient in Paraffin eingebettetes Gewebe bzw. Kryostatmaterial.
Für den SIV-Nachweis im Darmtrakt kann z. B. mit einem zweistufigen Detektionssystem, der sog. Streptavidin-Biotin-Enzymkomplex (SABC)-Methode gearbeitet
werden. Diese Methode macht sich die Affinität von Streptavidin zu dem Glykoprotein
Biotin zunutze, nachdem vorhandene endogene Peroxidase blockiert wurde. Nach
der Bindung des Primärantikörpers wird ein kompatibler biotinylierter Sekundär- oder
Brückenantikörper benutzt, an den daraufhin der Streptavidin-Biotin-Enzymkomplex
bindet (NOLL und SCHAUB-KUHNEN, 2000). Als Primärantikörper für den Nachweis
von SIV im Darmtrakt kommt z. B. KK75 zum Einsatz, als Chromogen dient Diaminobenzidin (DAB) (HERRMANN, 1997). Die Reaktion kann lichtmikroskopisch als
Literaturübersicht
29
brauner Farbniederschlag im Gewebe detektiert werden, der sich in HämatoxylinEosin (H.-E.) gefärbten Präparaten gut abgrenzt. Diese Methode hat den Vorteil
einer sehr großen Sensitivität, allerdings kann die endogene Peroxidase eine Hintergrundreaktion auslösen. Mit der SABC-Methode konnten in der Rektumschleimhaut
SIV-infizierter Rhesusaffen v. a. in der Lamina propria SIV-infizierte Zellen, v. a.
Makrophagen, Lymphozyten und dendritische Zellen, nachgewiesen werden (KAUP
et al., 2001; HERRMANN, 1997). Die IHC ermöglicht es, SIV-infizierte Zellen lichtmikroskopisch zu identifizieren und ihre Verteilung im Darmtrakt zu studieren. Für die
parallele lichtmikroskopische Identifikation opportunistischer Krankheitserreger im
Gastrointestinaltrakt genügt nach Untersuchungen von MONKEMULLER und Mitarbeitern (2000) die H.-E. Färbung, durch Spezialfärbungen konnte keine bessere
Diagnostik erreicht werden.
In situ Hybrididsierung (ISH)
Die in situ Hybridisierung ermöglicht es, Gensequenzen lichtmikroskopisch in 2-5 µm
dicken Gewebedünnschnitten nachzuweisen. Provirale DNA wird in der Zelle nachgewiesen. Zum Nachweis der Gensequenzen wird eine radioaktiv oder nichtradioaktiv markierte Sonde benötigt, die mit der gesuchten DNA-Sequenz hybridisiert. Die nicht radioaktive ISH ermöglicht eine unkomplizierte Arbeitstechnik sowie
eine rasche Entwicklung des Farbsignals. Zudem hat diese den Vorteil einer
besseren Gewebemorphologie als bei radioaktiver ISH (HÜNERBEIN, 1997). Nach
intravenöser Infektion konnten CANTO-NOGUES und Mitarbeiter (2001) 4 Tage
nach der Infektion sporadisch und 7 Tage nach der Infektion signifikant SIV im
Darmtrakt mittels ISH nachweisen. 28 Tage nach der Infektion war mittels ISH kein
SIV mehr nachweisbar. Dagegen wurden bei anderen Untersuchungen SIV-infizierte
Makrophagen und T-Zellen in der Lamina propria und dem Epithel der intestinalen
Schleimhaut, im GALT und in mesenterialen Lymphknoten frühestens 2 Wochen
nach der Infektion nachgewiesen (GERETTI, 1999). Andere Autoren konnten nach
intrarektaler Infektion SIV-DNA und -RNA im Rektum, Colon und Dünndarm nachweisen (VAJDY et al., 2001). Mit dieser Methode wurde auch das Verhältnis der
Viruslast von Blut zu Gewebe untersucht (REINHART et al., 1997).
30
Literaturübersicht
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) vervielfältigt eine
spezifische DNA-Sequenz durch eine enzymatische Reaktion mit einer thermostabilen DNA-Polymerase im Rahmen eines mehrstufigen Temperaturprogramms.
Dadurch können auch geringe Mengen DNA detektierbar gemacht werden. Im
Rahmen der SIV/HIV-Forschung kann die PCR dazu benutzt werden, provirale DNA
in Gewebe und Blut nachzuweisen (DIDIER, 2000). Die Reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR) vervielfältigt eine spezifische RNA-Sequenz, indem
diese in cDNA umgeschrieben wird, die dann wie bei der oben beschriebenen PCR
vermehrt wird. Die Produkte dieser Amplifizierung werden im Agarosegel als sogenannte Banden nachgewiesen, je nachdem ob radioaktiv und nicht-radioaktiv
markierte Nukleotide verwendet wurden geschieht dies über Autoradiographie oder
unter der UV-Bank. Die quantitative, kompetitive PCR bestimmt die Kopienzahl
viraler Nukleinsäuren was eine Prognose des Krankheitsverlaufs, v. a. wenn noch
keine klinischen Anzeichen vorhanden sind, ermöglicht. Das Problem bei der PCR
besteht in der Konstruktion geeigneter Sonden für die Amplifizierung, im DNA-Verlust
während der Aufarbeitung der Proben und der Effektivität der reversen Transkription.
Eine wichtige praktische Bedeutung hat die PCR zur Bestimmung der Plasmavirämie, einem prognostisch wichtigen Marker für den Krankheitsverlauf. DIDIER und
Mitarbeiter (2000) konnten bereits drei Tage nach experimenteller SIV-Infektion ein
SIV spezifisches Signal in intestinalen Biopsien nachweisen, unabhängig von der
Infektionsroute, wobei nie SIV spezifische RNA sondern stets nur provirale DNA
nachgewiesen wurde. Dagegen konnten mit der RT-PCR 7 und 21 Tage nach der
Infektion RNA in allen Schleimhäuten und peripheren Lymphknoten nachgewiesen
werden (VAJDY et al., 2001).
Literaturübersicht
31
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)
Die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ermöglicht den direkten
visuellen Nachweis von SIV-Partikeln im Untersuchungsmaterial. Für diese Methode
wird das Gewebe in Kunststoff wie z. B. Epoxyresin (Epon) eingebettet. Dabei
besteht die Möglichkeit der gerichteten Einbettung, wodurch je nach Ziel der Untersuchung entsprechende Anschnittsflächen gewährleistet sind. Nach Anfertigung von
Ultradünnschnitten und deren Kontrastierung kann im Transmissionselektronenmikroskop die Ultrastruktur sichtbar gemacht werden. SIV kann anhand seiner
charakteristischen Morphologie aufgefunden werden. Bei ausgiebigen transmissionselektronenmikroskopischen
Untersuchungen
am
Darmgewebe
SIV-infizierter
Rhesusaffen konnte KUHN (1995) nur äußerst selten SIV-Partikel finden. Gleichzeitig durchgeführte immunhistochemische Untersuchungen zeigten allerdings, dass
SIV-infizierte Zellen vorhanden waren. Dies zeigt den Nachteil der Methode im
Bezug auf den Nachweis von SIV auf. Die Ursache hierfür könnte darin begründet
sein, dass intrazellulär gelegenes SIV morphologisch nicht detektierbar ist
(GELDERBLOM et al., 1987), d. h. nur frei zwischen den Zellen bzw. in Vakuolen
intrazellulär liegendes Virus sowie Virusbudding kann im Elektronenmikroskop gesehen werden. Da sich in SIV-infizierten Zellkulturen bei starker Virusfreisetzung die
elektronenmikroskopische Detektion der Viruspartikel sehr einfach gestaltet, könnte
auch die Menge des im Gewebe vorhandenen freien SIV ausschlaggebend für den
Erfolg der TEM-Detektion sein. Im Bezug auf Alterationen des Darmtraktes im
Rahmen der SIV-Infektion hat sich die TEM-Untersuchung allerdings, ebenso wie bei
der HIV-Infektion, als sehr hilfreich erwiesen. OLOFINLADE et al. (2000) bewerteten
die diagnostische Bedeutung der elektronenmikroskopischen Untersuchung bei HIVpositiven Patienten mit gastrointestinalen Symptomen und kamen zu dem Ergebnis,
dass diese sehr nützlich zum Auffinden und zur Identifikation von Pathogenen im
Rahmen des AIDS Syndroms ist. Lichtmikroskopisch konnten nur die Hälfte der
Pathogene, die elektronenmikroskopisch identifiziert wurden, gefunden werden, dies
gilt z. B. für Mikrosporidien.
32
Literaturübersicht
Weitere potentielle Nachweismethoden
Für den ultrastrukturellen Nachweis von einigen Zellstrukturen (z. B. Gliafaserprotein
im Nervus opticus) (BRÜGMANN, 1994) existieren immunelektronenmikroskopische
Methoden. Aber auch zum Nachweis von Viren kann die Immunelektronenmikroskopie erfolgreich eingesetzt werden (BROOKE et al., 1994). Im Rahmen dieser
Arbeit sollte eine immunelektronenmikroskopische Methode zum SIV-Nachweis
im Darmgewebe entwickelt werden.
Im Folgenden wird ein kurzer Abriss über die Entwicklung der immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen sowie die Vor- und Nachteile dieser Detektionsmethode gegeben (nach einem Übersichtsartikel von BASCHONG und STIERHOF,
1998). Zu Beginn wurde hauptsächlich mit eisenhaltigen Partikeln, wie z. B. Ferritin,
sowie mit amorphen polymeren Ablagerungen durch enzymatische Reaktionen, wie
z. B. HRP („horse-radish-peroxidase“ Meerrettichperoxidase), gearbeitet. Beide
Methoden weisen eine hohe Sensitivität auf, haben allerdings den Nachteil einer
geringen Elektronendichte der Präzipitate und einer möglichen unspezifischen
Hintergrundreaktion. Eine Weiterentwicklung der immunelektronenmikroskopischen
Methoden stellte der Einsatz kolloidaler, nicht-kovalent an Proteinliganden gebundener Goldpartikel als rezeptorspezifische elektronendichte Marker dar. Dabei kamen
Goldpartikel mit einer Größe von 150 bis 1 nm zum Einsatz. Der Einsatz großer
Goldkolloide hatte den Vorteil, dass es sich hierbei um sphärische Partikel handelt,
die leicht von Zellstrukturen unterschieden werden können. Allerdings wiesen diese
eine geringe Sensitivität auf und wurden durch 4 bis 20 nm große Goldpartikel
abgelöst. Die Verbesserung der immunelektronenmikroskopischen Detektion ging
auch einher mit dem Fortschritt bei der Herstellung ultradünner Kryo- bzw. Kunststoffschnitte und deren Labelling sowie der Entwicklung effektiver Detektoren für
sekundäre Elektronen. Dies alles ermöglichte den Einsatz von Goldpartikeln mit einer
Größe von unter 20 nm. Kleinere Goldpartikel zeigten eine höhere Sensitivität und
eine präzisere Markierung und erwiesen sich somit als Marker der Wahl. Der Einsatz
von 4 bis 20 nm großen Goldpartikeln hatte allerdings auch Nachteile. Die negativ
geladenen Goldpartikel stießen sich gegenseitig ab und wurden von negativ
geladenen Gewebestrukturen wie z. B. Zellkernen infolge der dort vorhandenen
Nukleinsäure, abgestoßen. Die tatsächliche Partikelgröße war, bedingt durch die
zusätzliche Hydrathülle, größer als das kolloidale Gold selbst. Dies führte zu einem
eingeschränkten Eindringen in das Gewebe. Um diese Nachteile auszugleichen
Literaturübersicht
33
wurden kleinere Goldpartikel mit einer Größe von 1,5 bis 3 nm eingeführt („ultra
small“ Gold). Die kleine Größe geht allerdings mit einem geringeren Kontrast im EM
einher und macht zusätzliche Vergrößerungsschritte nötig. „Ultrasmall“ Goldpartikel
haben gegenüber den größeren Goldpartikeln den Vorteil, dass die negative
Oberflächenladung und die Größe der Hydrathülle reduziert ist, woraus eine
geringere sterische Behinderung und elektrostatische Abstossung folgt. Allerdings
besteht bei diesen kleinen Goldpartikeln das Problem, dass ohne hochauflösende
Elektronenmikroskope der geringe Kontrast des Goldes mit der Schwermetallkontrastierung der biologischen Strukturen nicht kompatibel ist. Zusätzliche
Vergrößerungsschritte sind nötig, um die Detektion der Goldpartikel zu erleichtern.
Es existieren zwei Methoden, das sog. Goldtoning und die Silberverstärkung. Beide
nutzen die Eigenschaft der Goldpartikel als Nuclei bei der photographischen Entwicklung zu agieren, ähnlich den Silbernuclei bei der lichtinduzierten Reduktion von
Silberbromid während der phototechnischen Entwicklung.
Mit der Immunogold-Silber-Methode steht eine Methode zur Verfügung, die das
Markieren von Antigenen bei der elektronemikroskopischen Untersuchung ermöglicht
und das Auffinden dieser Strukturen erleichtert. Dieser Vorteil soll im Rahmen dieser
Arbeit bei der Detektion von SIV in der rektalen Schleimhaut nutzbar gemacht
werden.
34
Material und Methoden
3 Material un d Methoden
3.1 Zellkultur
Zur Etablierung der Immunogoldmethode wurden verschiedene Antikörper und
unterschiedliche Protokolle ausgetestet. Hierfür standen SIVmac251 infizierte TLymphozytenzellkulturen C8166 aus der Abteilung Virologie und Immunologie des
Deutschen Primatenzentrums zur Verfügung. Die Zellen wurden am 8. Tag nach der
Infektion geerntet, da zu diesem Zeitpunkt mit einer starken Viruspartikelproduktion
gerechnet werden kann (HÜNERBEIN, 1997). Die Zellen wurden nach dem im Anhang unter Punkt 9.4 aufgeführten Protokoll vorbereitet, pelletiert und für die lichtund elektronenmikroskopischen Auswertungen in Epon (Protokoll unter 9.2.1) bzw.
LR-White (Protokoll unter 9.3.2) eingebettet.
3.2 Gewebema terial
Im Rahmen eines SIV Infektionsversuches wurden 5 Rhesusaffen (Macaca mulatta)
– alle ca. 4 Jahre alt – experimentell intrarektal mit SIVmac251 (MPBMC) infiziert
(Tab. 3). Das Virus wurde zuvor auf mononukleären Affenblutzellen (Monkey
Peripher Blood Mononuclear Cells, MPBMC) kultiviert. Die Tiere stammten aus der
Tierhaltung des Deutschen Primatenzentrums. Von diesen Tieren wurden Rektumbiopsien zu unterschiedlichen Zeitpunkten (1, 5, 15, 30, 60 Minuten sowie 1 und 2
Wochen) nach der Infektion (p. i., post infectionem) gewonnen und für die
lichtmikroskopischen und ultrastrukturellen Auswertungen nach den im Anhang unter
Punkt 9.2.1 bzw. 9.3.2 aufgeführten Protokollen in Epon bzw. LR-White eingebettet
(Tab. 3). Der Tierversuch ist unter 509.42502/08-13.98 von der Bezirksregierung
Braunschweig genehmigt worden.
Material und Methoden
35
Tabelle 3: Rektumproben von experimentell rektal SIV-infizierten Tieren
Tiermaterial
Lfd.
Tier-
Nr.
Nr.
1
9536
2
3
4
5
9538
9534
9542
9549
Alter
4 J.
4 J.
4 J.
4 J.
4 J.
Geschl.
w
m
w
w
m
Untersuchungsmaterial
Inf.-
Inf.-
Status
Datum
SIV+
SIV+
SIV+
SIV+
SIV+
Entnahme
Epon
LR-White
29.05.00 1 min p. i.
+
+
5 min p. i.
+
+
15 min p. i.
+
+
30 min p. i.
+
+
60 min p. i.
+
+
1 wpi.
+
+
2 wpi.
+
+
12.04.00 1 min p. i.
+
+
5 min p. i.
+
+
15 min p. i.
+
+
30 min p. i.
+
+
60 min p. i.
+
+
1 wpi.
-
+
2 wpi.
-
+
24.11.99 1 min p. i.
+
-
5 min p. i.
+
-
15 min p. i.
+
-
30 min p. i.
+
+
60 min p. i.
+
+
24.11.99 1 min p. i.
+
-
5 min p. i.
+
-
15 min p. i.
+
-
30 min p. i.
+
+
60 min p. i.
+
+
24.11.99 1 min p. i.
+
-
5 min p. i.
+
-
15 min p. i.
+
-
30 min p. i.
+
+
60 min p. i.
+
+
1 wpi.
+
-
36
Material und Methoden
Material zum Vergleich der unveränderten morphologischen Struktur des Rektums
sowie zur Kontrolle der Immunogoldmethode wurde von sieben nicht SIV-infizierten,
klinisch gesunden Tieren gewonnen. Es handelte sich um adulte Rhesusaffen
(Macaca mulatta) die zwischen 4 und 26 Jahre alt waren. Bei sechs dieser Tiere
wurden Gewebeproben aus verschiedenen Abschnitten des Rektums zum Zeitpunkt
der Sektion gewonnen und für die ultrastrukturelle Untersuchung in Epon eingebettet.
Bei einem Tier wurden Rektumbiopsien intra vitam über Endoskopie nach
HERRMANN (1997) entnommen und in Epon sowie in LR-White eingebettet (Tab. 4).
Die Protokolle der Epon- und LR-White-Einbettung finden sich im Anhang unter den
Punkten 9.2.1 und 9.3.2.
Tabelle 4: Rektumproben von nicht SIV-infizierten Tieren
Tiermaterial
Lfd.
Tier-Nr.
Alter
Untersuchungsmaterial
Inf.-
Geschl.
Nr.
Entnahme
Epon
LR-White
Status
6
2001
9 J.
w
SIV-
post mortem
+
-
7
9545
4 J.
m
SIV-
post mortem
+
-
8
8643
5 J.
m
SIV-
post mortem
+
-
9
1581
26 J.
m
SIV-
post mortem
+
-
10
8660
5 J.
m
SIV-
post mortem
+
-
11
8646
5 J.
m
SIV-
post mortem
+
-
12
2027
4 J.
m
SIV-
intra vitam
+
+
Die Proben für die morphologische Untersuchung des Rektums wurden an ausgewählten Stellen des ca. 7 cm langen Rektums entnommen (Tab. 5) und in Epon bzw.
LR-White eingebettet.
Tabelle 5: Lokalisation der entnommenen Proben
Lokalisation (Entfernung vom Anus)
Lfd. Nr.
Tier
6
2001
2 cm
-
5 cm
6 cm
7 cm
7
9545
2 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
8
8643
2 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
9
1581
2 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
10
8660
2 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
11
8646
2 cm
4 cm
5 cm
6 cm
7 cm
Material und Methoden
37
3.3 Gewebeprä paration, Einbettung und Schnittherstellung
Die Gewebeproben wurden bei den SIV-infizierten Tieren intra vitam durch Endoskopie mit einem flexiblen Gastroskop (UGI-FP7, Fa. Fujinon) entnommen bzw. nach
dem Tod des Tieres während der Sektion gewonnen. Die Entnahme erfolgte 1, 5, 15,
30 und 60 Minuten sowie 1 und 2 Wochen nach intrarektaler Infektion und nach der
Euthanasie des Tieres. Nähere Angaben zur Biopsietechnik und -entnahme finden
sich bei HERRMANN (1997).
Von jeder Lokalisation wurden zwei Bioptate gewonnen. Für die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung mit Epon-Einbettung wurden die Biopsien in
2,5%iger Glutaraldehydlösung fixiert (siehe Anhang Punkt 9.1.2), wohingegen die
Proben für die immunelektronenmikroskopische Untersuchung mit LR-WhiteEinbettung in eine 4%ige Paraformaldehyd / 0,25%ige Glutaraldehyd-Mischung (1:1)
gegeben wurden (siehe Anhang Punkt 9.3.1).
Neben den Epon-eingebetteten SIV-positiven Biopsien wurden Proben zur Beurteilung der Normalstruktur der Rektumschleimhaut während der Sektion nicht SIVinfizierter Tiere gewonnen. Hierbei wurde der Darm unmittelbar nach Eintritt des
Todes ca. 15 cm vom Anus entfernt abgebunden und mit 2,5%igem Glutaraldehyd
gefüllt (siehe Anhang Punkt 9.1.2). Nach der Entnahme wurde das Darmsäckchen
sofort in einen Behälter mit 2,5%iger Glutaraldehydlösung gegeben. Die jeweiligen
Lokalisationen wurden zur besseren Fixation in ca. 2 x 2 mm große Stücke zerteilt
und bis zur Einbettung in Karnovsky-Lösung (KARNOVSKY, 1965) aufbewahrt. Das
Rezept der Fixierungslösung nach KARNOVSKY findet sich im Anhang unter Punkt
9.2.2.
38
Material und Methoden
3.3.1 Eponeinbet tung
Im Anschluss an die Materialgewinnung und nach Fixation in 2,5%iger Glutaraldehydlösung bei 4°C wurden die Proben in Epon eingebettet. Die Einbettung in einem
Epon-Gemisch nach LUFT (1961) (siehe Anhang 9.2.3) erfolgte im LynxEinbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim) nach dem im Anhang unter Punkt 9.2.1
aufgeführten Protokoll. Danach wurden die Proben gerichtet in Flacheinbettungsformen aus Silikongummi eingebettet, um beim Anschnitt der Epon-Blöckchen den
Darmwandquerschnitt zu treffen. Dazu mussten die Gewebestücke und das Biopsiematerial unter Zuhilfenahme einer Stereolupe (Fa. Leica, Bensheim) mit der
Schleimhautoberfläche nach oben weisend ausgerichtet in den Flacheinbettungsformen positioniert werden. Es schloss sich eine 24stündige Polymerisation des
Epoxidharzes bei 60°C an.
Die auspolymerisierten Epon-Blöckchen wurden zunächst mit einer Fräse (Reichert
Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim) auf die Größe des Gewebestreifens zugetrimmt. Am
Ultramikrotom (Reichert, Ultracut S, Fa. Leica, Bensheim) erfolgte unter Verwendung
von Glasmessern die Anfertigung ca. 0,5 µm dicker Semidünnschnitte. Die dazu
benötigten Glasmesser wurden mit Hilfe eines Knifemakers (Reichert Knifemaker,
Fa. Leica, Bensheim) hergestellt. Anschließend wurden die Semidünnschnitte auf
einer Wärmebank nach RICHARDSON und Mitarbeiter (1960) (siehe Anhang 9.2.4)
gefärbt, mit Eukitt eingedeckt und sowohl zur histomorphologischen als auch
pathologisch-histologischen Beurteilung sowie zur Vororientierung für das Anfertigen
von Ultradünnschnitten lichtmikroskopisch ausgewertet.
Nach Auswertung und photographischer Dokumentation der Semidünnschnitte
schloss sich mittels einer zeichnerisch festgehaltenen Vororientierung eine weitere
Zutrimmung der Blöcke per Hand an. Daraufhin erfolgte am oben genannten
Ultramikrotom unter Verwendung eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne,
Schweiz) die Herstellung von 60-80 nm dicken Ultradünnschnitten von den zugetrimmten Blöcken, die auf Kupferobjektträgernetze bzw. Lochblenden (single slot 1 x
2, Fa. Plano, Wetzlar) aufgezogen und von Hand mit Uranylacetat und Bleicitrat
kontrastiert wurden.
Material und Methoden
39
Die transmissionselektronenmikroskopische Analyse erfolgte am ZEISS-Elektronenmikroskop (EM 10C, Fa. Zeiss, Oberkochem) bei einer Grundvergrößerung von
6.300 bis 50.000 und 60 kV. Zur Photodokumentation wurde Planfilmmaterial (Fa.
Agfa, Leverkusen) verwendet.
3.3.2 LR-White-E inbettung
Im Anschluss an die Materialgewinnung und nach Fixation in einer 4%igen Paraformaldehyd / 0,25%igen Glutaraldehyd-Mischung (1:1) (siehe Anhang 9.3.1) wurden die
Proben in LR-White (London Resin: LR-White medium grade, Fa. The London Resin
Co., Hampshire, UK) eingebettet (siehe Anhang 9.3.2).
Bei immunelektronenmikroskopischen Untersuchungen besteht die Problematik,
einerseits die Ultrastruktur des Gewebes zu erhalten und andererseits antigene
Strukturen weitgehend zu schonen. Übermäßige Fixierung, der Einsatz organischer
Lösungsmittel und hohe Polymerisationstemperaturen führen zur Denaturierung und
Maskierung des Antigens, welches nachgewiesen werden soll. Diese Nachteile der
konventionellen Kunstharz-Einbettung können durch die Niedrigtemperatureinbettung
bei -20°C mit polaren Einbettungsmedien wie LR-White weitgehend vermieden
werden (NEWMAN et al., 1983; GRÄBER u. KREUTZBERG, 1985).
Analog zu den Einbettungsprotokollen von NEWMAN und Mitarbeitern (1983)
wurden die Proben vollständig dehydriert, bei -20°C mit dem Kunststoff infiltriert und
anschließend auspolymerisiert. Das genaue Protokoll findet sich im Anhang unter
Punkt 9.3.2. Nach Auspolymerisation der Kunststoffblöcke erfolgte das Zutrimmen
der Proben und die Herstellung der Semi- und Ultradünnschnitte analog zum
Vorgehen bei Epon-eingebetteten Proben.
40
Material und Methoden
3.4 SIV-Detekti on am Semidünnschnitt
Für die SIV-Detektion wurden ausgewählte monoklonale Antikörper in verschiedenen
Verdünnungen als Primärantikörper für die licht- und elektronenmikroskopische
Untersuchung an der permanent SIVmac251 infizierten T-Zellkultur C8166 ausgetestet. Eine Übersicht über die verwendeten Antikörper gibt Tabelle 6. Die Antikörper
lagen als Ascitesflüssigkeit oder Kulturüberstand vor.
Tabelle 6: Übersicht über die verwendeten Antikörper
Antikörper
gerichtet gegen
Arbeits-
Herkunft
verdünnung
KK18
gp160/gp120
1:100
-
(env kodiertes glykoprotein 160/120)
KK7a
gp 41
Mrs. K. Kent
1:100
1:500
(env kodiertes glykoprotein 41)
KK63
p27
lineare Sequenz des
1:100
1:500
p28
(SIV)
(nef kodiertes Protein)
NIBSC*
Mrs. K. Kent
1:10
-
nef kodierten Protein
anti-p28
NIBSC*
Mrs. K. Kent
(gag kodiertes Protein)
KK75
NIBSC*
NIBSC*
Mrs. K. Kent
1:400
*NIBSC = National Institute for Biological Standards and Control
-
Intracel,
London
Material und Methoden
41
3.4.1 Immunogol d-Silbertechnik
Für die lichtmikroskopische Vororientierung wurde an Semidünnschnitten eine
Immunogold-Silber-Methode durchgeführt. Anhand der so behandelten Semidünnschnitte wurden Lokalisationen für die nachfolgende immunelektronenmikroskopische Untersuchung ausgewählt.
Zur Durchführung der Immunogold-Silber-Methode wurden LR-White-Semidünnschnitte mit einer Dicke von ca. 0,5 µm verwendet und ungefärbt auf Adhäsionsobjektträger (Histobond, Fa. Marienfeld) aufgezogen. Die Immunogold-SilberMethode wurde von Hand und im NEXES IHC FÄRBEMODUL (VENTANA,
Staßbourg) nach den unter 9.3.4 aufgeführten Protokollen durchgeführt. Bei der
Immunogold-Silber-Methode von Hand wurden die Semidünnschnitte auf den Objektträger mit einem Pap-Pen (Fa. DAKO, Hamburg) umrandet. Auf diese so abgegrenzte Fläche wurden die Lösungen aufgebracht und nach der Inkubationszeit auf
Filterpapier dekantiert. Dabei wurden die in Tab. 6 aufgeführten Antikörper in unterschiedlichen Arbeitsverdünnungen sowie 6, 10 oder 0,8 nm große Goldpartikel (Fa.
AURION, Holland) verwendet.
Prinzip der Immunogold-Silber-Methode:
Es wird ein spezifischer primärer Antikörper eingesetzt, um das Antigen im Gewebe
zu detektieren. Darauf folgt ein sekundärer goldabsorbierter Antikörper, der gegen
die Immunglobuline der Spezies, aus der der primäre Antikörper gewonnen wurde,
gerichtet ist. Die Markierung ist um so stärker, je kleiner die verwendeten Goldpartikel sind. Die an den sekundären Antikörper konjugierten Goldpartikel werden
durch eine Silberpräzipitationsreaktion sichtbar gemacht. Bei Anwesenheit eines
Reduktionsmittels bildet sich aus den Silberionen des zugegebenen Silberlaktats
eine Hülle aus metallischem, elementaren Silber um die als Katalysator wirkenden
Goldpartikel, die an den sekundären Antikörper gekoppelt sind (HACKER et al.,
1996; DANSCHER, 1981). Diese Hülle aus metallischem, elementarem Silber kann
lichtmikroskopisch als schwarzes Signal erkannt werden (NOLL und SCHAUBKUHNEN, 2000; DANSCHER, 1981).
42
Material und Methoden
3.4.2 Fluoreszen zmarkierung
Neben der Immunogold-Silber-Methode wurde zur Vororientierung auch eine
Fluoreszenzmarkierung durchgeführt. Anhand der so gefärbten Semidünnschnitte
wurden Lokalisationen für die nachfolgende immunelektronenmikroskopische Untersuchung ausgewählt.
Zur Durchführung der Fluoreszenzmarkierung wurden LR-White-Semidünnschnitte
mit einer Dicke von ca. 0,5 µm auf Adhäsionsobjektträger (Histo-Bond, Fa.
Marienfeld)
aufgezogen.
Das
in
dieser
Arbeit
angewendete
Protokoll
der
Fluoreszenzmarkierung findet sich im Anhang unter Punkt 9.5. Die Semidünnschnitte
wurden mit einem Pap-Pen (Fa. DAKO, Hamburg) umrandet, auf diese so abgegrenzte Fläche wurden die Lösungen aufgebracht und nach der im Protokoll der
Fluoreszenzmarkierung angegebenen Inkubationszeit auf Filterpapier dekantiert.
Prinzip der Fluoreszenzmarkierung:
Zur Detektion des Antigens im Gewebe wird ein spezifischer primärer Antikörper eingesetzt. Darauf folgt ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff, in diesem Fall FITC
(Fluoresceinisothiocyanat), markierter Sekundärantikörper. Als Gegenfärbung kommt
der Farbstoff DAPI (4,6-Diamino-2-Phenylindol Dihydrochlorid) zur Anwendung.
Dieser färbt die Kerne leuchtend blau. FITC leuchtet gelb-grün und weist ein Absorptionsspektrum bei 495 nm und ein Emissionsspektrum bei 528 nm auf. Die
Problematik bei der Fluoreszenzmarkierung besteht darin, dass das Signal bei Lichteinfall schnell verblasst. Dies bedeutet, dass bei der Präparation nach Zugabe des
Sekundärantikörpers möglichst kein Licht mehr auf das Präparat fallen sollte. Zudem
sollte die Auswertung kurz nach der Präparation erfolgen. Eine Photodokumentation
ist ebenfalls schwierig, da Photos beim ersten oder zweiten Versuch gelingen
müssen um das Signal nicht abzuschwächen. Eine Negativkontrolle sollte von jedem
Präparat mitgeführt werden, um unspezifischen Hintergrund und Autofluoreszenz
auszuschließen. Bei dieser Autofluoreszenz kommt es allein durch die Anregungsenergie zu einem Signal (NOLL und SCHAUB-KUHNEN, 2000).
Material und Methoden
43
3.5 SIV-Detekti on an Ultradünnschnitten
3.5.1 Immunogol dmethode
Die in der lichtmikroskopischen Vororientierung detektierten Areale der Semidünnschnitte, die eine starke Immunogoldmarkierung bzw. strukturelle Veränderungen
aufwiesen, wurden für die elektronenmikroskopische Untersuchung ausgewählt. Es
wurden von diesen Lokalisationen LR-White-Ultradünnschnitte mit einer Dicke von
60-80 nm angefertigt und auf Nickelgrids aufgebracht. Das hier verwendete Protokoll
der Immunogold-Silber-Markierung an Ultradünnschnitten findet sich im Anhang
unter Punkt 9.3.5. Die Nickelgrids wurden bei den einzelnen Schritten auf Tropfen
von 30-50 µl aufgebracht und flotierten während der Inkubationszeit. Zwischen den
einzelnen Schritten wurde überschüssige, an den Grids haftende Flüssigkeit
vorsichtig mit Filterpapier abgesaugt.
Prinzip der Immunogold-Markierung:
Das Prinzip der Immunogold-Markierung an Ultradünnschnitten entspricht dem der in
Kap. 3.4.1 genannten Immunogold-Silber-Methode, wobei auf eine Versilberung
aufgrund der elektronendichten Goldpartikel verzichtet werden kann. Dies gilt jedoch
nur für konventionelle Goldpartikel bei einer Größe von über 3 nm. Die Verwendung
von sogenannten „ultra small“ Goldpartikeln mit einer Größe von 0,8 nm hat gegenüber den konventionellen Goldpartikeln folgende Vorteile. Einerseits ist die Partikelgröße signifikant verringert, was dazu führt, das mehrere Goldpartikel pro sekundärem Antikörper binden. Im Gegensatz dazu werden bei größeren Goldpartikeln
mehrere sekundäre Antikörper von einem Partikel benutzt. Zudem ist bei 1,8 nm
großen Partikeln die sterische Behinderung durch die geringere negative Ladung
verringert und es finden sich mehr Goldpartikel in den markierten Gewebearealen.
Durch die Reduktion des Molekulargewichtes bei „ultra small“ Goldpartikeln erhöht
sich die Diffusionsrate und die Partikel verhalten sich wie ungebundene Antikörper.
Ferner wird der Radius der Wasserdipole, die sich um die negativ geladenen Goldpartikel anlagern, verringert. Allerdings sollte bei Verwendung dieser „ultra small“
Goldpartikel eine Silberverstärkung durchgeführt werden, um das Signal zu
verstärken und besser auffindbar zu machen.
44
Ergebnisse
4 Ergebnisse
Als Ausgangspunkt wurde zunächst die epitheliale Barriere im Bereich des Rektums
morphologisch charakterisiert (4.1). An Kunststoffschnitten wurden danach Methoden
zur Darstellung von SIV-Antigen etabliert. Hierzu wurden entweder Semidünnschnitte
(4.2) oder Ultradünnschnitte zum immunelektronenmikroskopischen Nachweis von
SIV-Antigen über eine Immunogold-Silber-Methode unter Einsatz ultrakleiner Goldpartikel (4.3) verwendet. Ziel war die Darstellung einer möglichen transepithelialen
SIV-Passageroute im Bereich des Rektums.
4.1 Vergleichen de Untersuchung der Rektumschleimhaut von Rhesusaffen mit
und ohne SIV-Infektion
4.1.1 Lichtmikros kopie
Das Rektum stellt den distalen Anteil des Dickdarmes dar. Beim Rhesusaffen beginnt
es vor dem dritten oder vierten Kaudalwirbel und ist ca. 7-10 cm lang und relativ weit.
Der histologische Aufbau entspricht im Wesentlichen dem der anderen Darmabschnitte. Die Rektumwand gliedert sich von innen nach außen in die Tunica
mucosa, Tela submucosa, Tunica muscularis, Tela subserosa und Tunica serosa.
Die Tunica mucosa setzt sich zusammen aus Lamina (L.) epithelialis, L. propria und
L. muscularis mucosae. Die Tunica muscularis besteht aus einem Stratum circulare
und einem Stratum longitudinale.
Die untersuchten Rektumproben der nicht SIV-infizierten Tiere enthielten regelmäßig
L. epithelialis, L. propria, L. muscularis mucosae, Tela submucosa und gelegentlich
auch Tunica muscularis (Abb. 1a). In wenigen Proben waren Lymphfollikel
vorhanden, teils in der L. propria, teils in der Submukosa gelegen.
In den SIV-positiven Rektumbiopsien waren regelmäßig nur L. epithelialis und L.
propria vorhanden (Abb. 1b), gelegentlich fand sich auch die L. muscularis mucosae.
Bei diesen Proben handelte es sich ausschließlich im Biopsien, die im Gegensatz zu
den Rektumproben der nicht infizierten Tiere nur Teile der Rektumwand aufweisen
konnten.
Ergebnisse
45
a)
b)
1
1
2
3
2
4
Abb. 1: Übersicht Rektumschleimhaut:
a) Alle Abschnitte der Darmwand mit L. epithelialis (1), L. propria (2), L. muscularis
mucosae (3) und Tela submucosa (4) sind deutlich zu erkennen. Die L. propria besteht
hauptsächlich aus lockerem Bindegewebe, nur wenige mononukleäre Zellen liegen darin
eingebettet. Die Auflockerung im Bereich der L. propria (2) ist auf ein Ödem
zurückzuführen. Nicht SIV-infiziertes Tier, die Probe wurde post mortem ca. 6 cm vom
Anus entfernt gewonnen (Tier-Nr. 5913; Methylenblaufärbung; Scalebar = 53 µm).
b) Die Übersicht der Rektumbiopsie eines SIV-infizierten Tieres zeigt die Anteile der Tunica
mucosa mit L. epithelialis (1) und L. propria (2) (Tier-Nr. 9534, 5 min p. i.;
Methylenblaufärbung; Scalebar = 26 µm).
46
Ergebnisse
Die L. epithelialis des Rektums wies zahlreiche tiefe Krypten und, wie im Dickdarm
üblich, keine Zotten auf. Histologisch bestand sie aus einer kontinuierlichen oberflächlichen Schicht zylindrischer Epithelzellen mit basalem Kern und dazwischen
gelegenen Becherzellen. Im Kryptepithel waren Becherzellen zahlreich vorhanden.
Epithel- und Becherzellen machten den Hauptteil der Zellen des Epithels aus,
dazwischen fanden sich auch vereinzelt intraepitheliale Lymphozyten, Plasmazellen
und Makrophagen.
Die L. epithelialis war durch eine im Semidünnschnitt gerade noch zu erkennende
Basalmembran von der L. propria abgegrenzt. Diese Basalmembran war stellenweise von Zellen durchbrochen.
Die sich anschließende L. propria war geprägt durch lockeres Bindegewebe, in das
unter anderem Blutgefäße eingebettet waren. Perivaskulär fanden sich zahlreiche
Makrophagen mit intrazytoplasmatischen Einschlüssen, Plasmazellen und gelegentlich Lymphozyten und Granulozyten. In tieferen Schichten der L. propria fanden sich
weniger Makrophagen und zahlreiche Plasmazellen, gelegentlich auch Lymphozyten,
Mastzellen und Granulozyten. Gelegentlich waren auch Ansammlungen von mononukleären Zellen vorhanden, die Teil eines Lymphfollikel sein könnten (Abb. 2).
Eine gleichmäßig ausgebildete L. muscularis mucosa bestehend aus einer dünnen
zweischichtigen Lage glatter Muskelfasern schloss sich an. Diese wurde gelegentlich
von Blutgefäßen und Lymphfollikeln, die von der Tela submucosa in die L. propria
reichten, durchbrochen.
Die Tela submucosa bestand aus lockerem Bindegewebe, in das größere Blutgefäße, Nervenfasern, Neuronen und Mastzellen eingebettet waren. Hier lagen auch
die gelegentlich anzutreffenden Lymphfollikel.
Die sich anschließende Tunica muscularis fand sich nur selten in den untersuchten
Proben. Sie bestand aus einer inneren Ring- und einer äußeren Längsmuskelschicht.
Eine Übersicht über die bei der lichtmikroskopischen Untersuchung in der
Rektumschleimhaut gefundenen Auffälligkeiten gibt Tabelle 7.
Ergebnisse
47
Tabelle 7: Übersicht über Auffälligkeiten der Rektumschleimhaut in der lichtmikroskopischen Untersuchung
SIV negativ
SIV positiv
(Gewebeprobe, p. m.)
(Biopsie)
L. epithelialis
Epithelläsionen
Ausziehungen und Auflockerung der „tight junctions“
Vereinzelt
Vakuolen
in
den Zahlreiche große Vakuolen in
Epithelzellen
den Epithelzellen
L. propria
Ödeme, Hämorrhagien
Gelegentlich Makrophagen mit Zahlreiche
Makrophagen
mit
intrazytoplasmären Einschlüssen intrazytoplasmären Einschlüssen
L. muscularis
Durchbruch von Blutgefäßen und Zellen
mucosae
Tela
Lymphfollikel
submucosa
In den Rektumproben war die Kontinuität der L. epithelialis unabhängig vom Infektionsstatus
stellenweise
durchbrochen.
Dies
äußerte
sich
einerseits
durch
Ausziehungen mit Auflockerung der Verbindungen zwischen den Epithelzellen in
diesem Bereich sowie mit Zelldesquamation, andererseits durch großflächige
Epithelläsionen (Abb. 3, Abb. 4). Allerdings traten bei den SIV-infizierten Tieren
derartige Veränderungen deutlich häufiger auf als bei den nicht SIV-infizierten
Tieren. Zudem fanden sich in den SIV-positiven Rektumbiopsien häufig Epithelzellen
mit zahlreichen, z. T. sehr großen Vakuolen.
Die
L.
propria
wies
unabhängig
vom
Infektionsstatus
stellenweise
eine
Ödematisierung auf (Abb. 1a). Zudem fanden sich in den SIV-infizierten
Gewebeproben herdförmige Infiltrationen mit Plasmazellen, sowie häufig zahlreiche
Makrophagen mit intrazytoplasmären Einschlüssen direkt im Anschluss an das
oberflächliche Epithel (Abb. 3). Auch in den nicht SIV-infizierten Gewebeproben
konnten derartige Beobachtungen gemacht werden, allerdings wesentlich seltener. In
einigen der untersuchten Biopsien fielen Hämorrhagien in der L. propria auf.
48
Ergebnisse
a)
b)
Abb. 2: Im Bereich der L. propria zwischen den Krypten gelegene Ansammlung von mononukleären Zellen (Pfeile), die Teil eines Lymphfollikels sein könnten.
a) Tier-Nr. 9549, 5 min p. i.; Methylenblau-Färbung, Scalebar = 26 µm
b) Tier-Nr. 9549, 5 min p. i.; Methylenblau-Färbung, Scalebar = 17 µm
Ergebnisse
49
º
Abb. 3: Auflockerung der Interzellularverbindungen (breiter Pfeil), Zelldesquamation sowie
Ausziehung des Epithels (º). In der L. propria finden sich Makrophagen mit Einschlußkörperchen („tingible bodies“) (schmale Pfeile) sowie Plasmazellen (Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.;
Methylenblaufärbung; Scalebar = 17 µm).
º
Abb. 4: Im Bereich der L. epithelialis ist ein Auseinanderweichen der Epithelzellen mit Bildung von Zellzwischenräumen erkennbar (Kreis). An der Epitheloberfläche haften zahlreiche
Bakterien („bacterial overgrowth“) (Pfeile). In der L. propria ist eine Anhäufung mononukleärer Zellen (º) erkennbar (Tier-Nr. 9539, 30 min p. i.; Methylenblaufärbung; Scalebar = 26
µm).
50
Ergebnisse
4.1.2 Elektronen mikroskopie
Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung der Epon-eingebetteten SIVnegativen und SIV-positiven Rektumproben bestätigten sich die lichtmikroskopischen
Ergebnisse.
Die Epithelzellen waren zylindrisch, hatten einen basal gelegenen Kern und trugen
einen mehr oder weniger stark ausgeprägten Bürstensaum. In einigen Proben war
die den Epithelzellen anhaftende Glykokalix deutlich zu erkennen (Abb. 5). In den
Epithelzellen lagen unterschiedlich stark ausgeprägte Zellorganellen. In einigen
Zellen war ein deutlich ausgeprägtes rauhes endoplasmatisches Retikulum
vorhanden. Andere wiesen zahlreiche Vakuolen im apikalen Zytoplasma auf. Diese
Vakuolen fanden sich v. a. in Epithelzellen die von Bakterien besiedelt waren. An
einigen Stellen war die Oberfläche der Epithelzellen sehr stark von Bakterien
besiedelt, hierbei konnte von "bacterial overgrowth" gesprochen werden (Abb. 6). Die
Bakterien schoben sich zwischen die Mikrovilli und stülpten die apikalen Zellmembranen ein (Abb. 7). Einige Bakterien schienen in Vakuolen intrazellulär zu
liegen. An den Bakterien konnte je nach Anschnitt eine Geißel bzw. eine undulierende Membran (in Abb. 7 nicht gezeigt) erkannt werden. Im Lumen konnten
verschiedene bakterielle Strukturen nachgewiesen werden. In Bereichen, in denen
noch Ingesta an der Epitheloberfläche anlag, erschienen die Epithelzellen
stellenweise sehr flachgedrückt und es waren keine Mikrovilli mehr erkennbar. In
einer SIV-negativen Probe konnten sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch
Balantidien nachgewiesen werden. Die untersuchten SIV-positiven Proben zeigten
zu keinem Zeitpunkt Hinweise auf opportunistische Infektionserreger.
Im folgenden werden die bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung
gefundenen Auffälligkeiten besprochen, eine Übersicht gibt Tabelle 8.
Ergebnisse
51
Tabelle 8: Übersicht über Auffälligkeiten des Rektumepithels in der elektronenmikroskopischen Untersuchung
L. epithelialis
SIV negativ
SIV positiv
(Gewebeprobe, post mortem)
(Biopsie)
Dezente Dilatationen der
Auflockerung der Inter-
interzellulären Räume
zellularverbindungen
Vorwölbung in das Lumen
Degeneration einzelner oder mehrere Epithelzellen
Epithelzelldefekte unter Einbeziehung mehrere Enterozyten
vereinzelt Balantidiennachweis
v. a. SIV-ähnliche Strukturen
Die Kontinuität der Epitheldecke war in einigen Bereichen durchbrochen. Dazu
gehörte eine Auflockerung der Interzellularverbindungen („tight junctions“) mit
Bildung von Spalten (Abb. 6, Abb. 8). Diese Spalten wurden zum Teil nur durch eine
dünne Zytoplasmabrücke vom Lumen getrennt. Derartige Auflockerungen fanden
sich sehr häufig in den SIV-infizierten Biopsien, meist vergesellschaftet mit zahlreichen Bakterien, die die Epithelzellen besiedelten (Abb 6). Im zeitlichen Verlauf der
Biopsien fielen Auflockerungen der „tight junctions“ bereits 5 min nach der intrarektalen Infektion auf. In den nicht SIV-infizierten Proben dagegen waren Auflockerungen nur selten, geringgradig ausgeprägt und v. a. im Bereich der Krypten zu
finden.
Bei den untersuchten Proben zeigte sich weiterhin, dass die Epithelkontinuität durch
Ablösung von Epithelzellen aus dem Verband gestört war. Oft waren mehrere Zellen
in einem Bereich betroffen und ragten als Vorwölbung des Epithels in das Lumen. Im
basalen Bereich dieser Strukturen fanden sich in den Proben gelegentlich intraepithelial gelegene Makrophagen. Abgelöste Epithelzellen wiesen eine tropfenförmige Gestalt auf und trugen keinen Mikrovillisaum. Diese Zelldesquamation fand
sich sowohl in den SIV-negativen als auch in den SIV-positiven Proben.
52
Ergebnisse
Auffällig war auch, dass unabhängig vom Infektionsstatus die Kontinuität der L.
epithelialis durch Degeneration einzelner oder mehrerer Epithelzellen unterbrochen
war. Dies äußerte sich durch eine höhere Elektronendichte mit zahlreichen Vakuolen
und ein komprimiertes Zytoplasma.
Auch Defekte mit nekrotischen Epithelzellen oder Enterozyten mit zerstörten Mikrovillisäumen waren unabhängig vom Infektionsstatus vereinzelt zu beobachten.
In der Lamina propria fanden sich neben den üblichen Zelltypen des rektalen GALTSystems auffällige Zellen mit stark ausgeprägtem rauhem endoplasmatischen
Retikulum und zahlreichen Vakuolen. Trotz intensiver Suche in den zahlreichen
Biopsien konnten in keiner Probe eindeutig SIV-Partikel mit der für sie typischen
Lentivirus-Morphologie nachgewiesen werden. Allerdings fanden sich Strukturen die
Ähnlichkeit mit SIV-Partikeln aufwiesen zwischen den Mikrovilli bzw. Bakterien im
Lumen (Abb. 5, Abb. 7), im apikalen Zytoplasma der Epithelzellen und in Zellen der
Lamina propria. Für die Immunelektronenmikroskopie ergab sich daher die
Fragestellung, ob es sich dabei um Strukturen mit SIV-Antigencharakter handelte.
Ergebnisse
53
Abb. 5: Oberfläche einer Epithelzelle mit deutlich erkennbarer Glykokalix (Pfeile) und zahlreichen runden, SIV-verdächtigen Partikeln (Kreise) (Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.; Scalebar =
0,25 µm).
54
Ergebnisse
Abb. 6: Deutlich mit Bakterien besiedelter Bereich des Rektumepithels. Die Interzellularverbindungen sind gelockert und stellenweise vakuolig aufgetrieben (Pfeile). In den Epithelzellen finden sich gelegentlich große Vakuolen (Kreis) (Tier-Nr. 9542; 5 min p. i., Scalebar =
3,18 µm).
Ergebnisse
55
Abb. 7: Mikrovillisaum einer Epithelzelle. Einige Bakterien (Pfeil) finden sich an der Zelloberfläche bzw. zwischen den Mikrovilli. Zudem finden sich kreisrunde Strukturen, die eine
Ähnlichkeit mit SIV-Partikeln aufweisen (Kreis) (Tier-Nr. 9534; 1 min p. i.; Scalebar = 0,5
µm).
56
Ergebnisse
Abb. 8: Apikaler Bereich von zwei benachbarten Epithelzellen. Die Interzellularverbindung
ist gelockert, es bilden sich Zellzwischenräume (Pfeil) aus (Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.,
Scalebar = 0,5 µm).
Ergebnisse
57
4.2 Detektion v on SIV-Antigen am Semidünnschnitt
Zur Detektion von SIV-Antigen an Semidünnschnitten wurden zwei Methoden angewendet. Es wurden fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen nach dem unter 9.5
vorgestellten Protokoll durchgeführt und lichtmikroskopisch ausgewertet. Zudem
wurde eine Immunogold-Silber-Färbung nach dem unter 9.3.4 aufgeführten Protokoll
angefertigt und lichtmikroskopisch im Durchlicht ausgewertet.
Die Fluoreszenzmarkierung an der Zellkultur führte mit der protokollierten Methode
zu keinem deutlichen Signal. Es konnten lichtmikroskopisch nur vereinzelt gelb-grün
leuchtende Markierungen in der Zellkultur gefunden werden. Die Morphologie war in
der blauen Gegenfärbung mit DAPI (Diaminophenylindol) gut zu beurteilen.
Die Immunogold-Silber-Färbung wurde zunächst an der permanent SIVmac
infizierten T-Zellkultur C8166 durchgeführt. Dabei kamen verschiedene Antikörper in
unterschiedlichen Arbeitsverdünnungen sowie 6, 10 oder 0,8 nm große Goldpartikel
zur Anwendung. Mit dem monoklonalen Antikörper KK75, der sich bei der Untersuchung von paraffineingebettetem Gewebe bewährt hat, konnte in keiner der
ausgetesteten Verdünnungen (unverdünnt, 1:10 und 1:100) ein eindeutiges, lichtmikroskopisch detektierbares Signal in der SIV-infizierten Zellkultur erreicht werden.
Auch die Verwendung goldmarkierter Primärantikörper mit unterschiedlich großen
Goldpartikeln führte zu keinem eindeutigen Signal in der Zellkultur. Es fanden sich
bei den ausgetesteten Verdünnungen selten vereinzelt Markierungen im Zwischenzellraum. Allerdings traten gelegentlich auch unspezifische Markierungen in Form
von Goldpartikeln bzw. Gold-Silber-Komplexen auf, die keiner Struktur in der Zellkultur zuzuordnen waren und sich teilweise über den ganzen Schnitt erstreckten. In
der SIV-negativen Zellkultur und ebenso in den mitgeführten Negativkontrollen
fanden sich keine Goldmarkierungen. Dasselbe Bild zeigte sich bei den Antikörpern
KK18, KK7a und KK63. Einzig unter Verwendung von KK18 in einer Verdünnung
von 1:100 sowie KK7a in einer Verdünnung von 1:1000 konnten vereinzelt
Goldpartikel bzw. Gold-Silber-Komplexe im Zwischenzellraum beobachtet werden. In
allen untersuchten Semidünnschnitten lagen an den Schnittkanten und an z. T.
vorhandenen Rissen mehr oder weniger deutliche Niederschläge von Goldpartikeln
bzw. Gold-Silber-Präzipitaten vor, bei denen es sich um Artefakte handelte.
58
Ergebnisse
Unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers anti-p28 (SIV) konnte dagegen
mit allen ausgetesteten Protokollen eine eindeutige Markierung von SIV in der
Zellkultur erreicht werden. Stets fanden sich mehrere Goldpartikel bzw. Gold-SilberPräzipitate im Zwischenzellraum und an den Zellen und damit in den Bereichen, in
denen SIV-Partikel zu erwarten waren. Die beste und deutlichste Markierung wurde
mit einer Arbeitsverdünnung von 1:400 und 0,8 nm großen („ultra small“)
Goldpartikeln mit Silberverstärkung erzielt. Es fanden sich deutliche Signale an der
Oberfläche der Zellen und im Zwischenzellbereich (Abb. 9a-c). Die Markierungen an
der Zelloberfläche waren meist auf einen bestimmten Bereich beschränkt, selten
fanden sich Zellen deren gesamte Oberfläche markiert war (Abb. 9a). Das schwarze
Signal der Immunogoldsilber-Färbung war nicht bei allen Zellen gleich stark
ausgeprägt.
Als Gegenfärbung erwies sich Hämatoxylin als problematisch, da sich die Zellen im
Durchlicht nur sehr schwach darstellten und eine Zuordnung des sehr deutlich sichtbaren Signals zu Strukturen in der Zellkultur erschwert wurde. Dagegen stellten sich
die Zellen in der Methylenblau-Färbung nach RICHARDSON (1960) deutlich dar,
wobei die starken Markierungen weiterhin gut zu erkennen waren. Allerdings gingen
bei der Gegenfärbung mit Methylenblau die in der HE-Färbung noch deutlich zu
erkennenden schwachen Immunogoldsilber-Signale verloren.
Die anhand der Zellkultur unter Verwendung des Antikörpers anti-p28 (SIV) etablierte
Immunogoldsilber-Färbung wurde an Semidünnschnitten der Rektumbiopsien
angewendet. In allen Biopsien fanden sich starke, unspezifische Markierungen im
Bereich von Blutgefäßen und Erythrozyten. In einigen Fällen trat ein starker
unspezifischer Hintergrund, in Form von gleichmäßig über das gesamte Gewebe
verteilten Gold-Silber-Komplexen, auf. In einzelnen Fällen fanden sich mehrere GoldSilber-Präzipitate in Zellen der Lamina epithelialis der Biopsien. Ansonsten konnte
keine Vororientierung für die elektronenmikroskopische Untersuchung vorgenommen
werden, da keine Anhäufungen von Gold-Silber-Präzipitaten im Gewebe gefunden
werden konnte, die auf SIV hinwiesen.
Ergebnisse
59
b)
a)
c)
Abb. 9: Immuno-Gold-Silber-Färbung von der SIVmac251 infizierten Zellkultur (C8166):
Im Bereich der Zellzwischenräume und der Zelloberfläche finden sich deutliche schwarze
Goldmarkierungen (Pfeile), die bereits bei geringer Vergrößerung erkennbar sind. Gelegentlich ist die gesamte Oberfläche einer Zelle markiert (Kreis).
a) Zellkultur, p 28, Verd. 1:400, Scalebar = 53 µm
b) Zellkultur, p 28, Verd. 1:400, Scalebar = 26 µm
c) Zellkultur, p 28, Verd. 1:400, Scalebar = 17 µm
60
Ergebnisse
4.3 Immunelek tronenmikroskopischer Nachweis von SIV-Antigen
Die immunelektronenmikroskopische Untersuchung gliederte sich in zwei Abschnitte.
Als erster Schritt wurden die in der Zellkultur mit den verschiedenen Antikörpern in
der lichtmikroskopischen Untersuchung deutlich markierten Areale für die elektronenmikroskopische Untersuchung ausgewählt und die Zuordnung des Signals zu SIVPartikeln untersucht. Daraufhin folgte als zweiter Schritt die Anwendung der
gewonnenen Erkenntnisse auf Rektumbiopsien.
Etablierung der Immunogold-Technik an SIVmac251 infizierten Zellkulturen:
In der verwendeten SIVmac251 infizierten T-Lymphozytenkultur C8166 fanden sich
zahlreiche Retroviruspartikel unterschiedlicher Reifestadien. Die Partikel lagen zum
Teil nesterartig zwischen den Zellen vor. Es fanden sich auch frei liegende SIVAnsammlungen. Die lymphoiden Zellen wiesen Zellausläufer und Uropodien auf.
SIV-infizierte Zellen zeichneten sich im Vergleich zu den nicht SIV-infizierten durch
zahlreiche große, längliche Mitochondrien aus. Grundsätzlich zeigte sich die
Strukturerhaltung des LR-White-eingebetteten Gewebes gegenüber Epon-eingebetteten Proben deutlich herabgesetzt.
Für den immunelektronenmikroskopischen Nachweis wurden die in Kap. 3.4 Tabelle
6 aufgeführten Antikörper nach dem unter Punkt 9.3.5 aufgeführten Protokoll an im
Lichtmikroskop deutlich markierten Arealen ausgetestet. Je Durchgang wurden 2
Positivkontrollen (SIVmac251 infizierte Zellkultur) und Negativkontrollen (Reaktion
ohne Primärantikörper) sowie eine Gewebekontrolle (nicht SIV-infizierte Rektumbiopsie) mitgeführt. Es wurden 0,8 nm große Goldpartikel verwendet, da es bei
diesen als „ultra small“ bezeichneten Partikeln im Vergleich mit den konventionellen
Goldpartikeln (6 und 10 nm) zu geringeren sterischen Behinderungen bei der
Bindung kommt. Um trotz der geringen Größe eine gute Detektierbarkeit zu gewährleisten wurde eine Silberverstärkung durchgeführt, die die Partikelgröße auf ca. 10
nm anwachsen lässt.
Der für die Immunhistochemie an Paraffinschnitten gut etablierte monoklonale Antikörper KK75 führte wie bereits bei der lichtmikroskopischen Vororientierung zu
keiner verwendbaren Markierung des Virus. Vereinzelt fanden sich mehrere an ein
Ergebnisse
61
Viruspartikel gebundene Goldpartikel, wobei allerdings immer nur ein einzelnes Virus
inmitten mehrerer nichtmarkierter Viren betroffen war. Die Markierung befand sich im
Bereich des Überganges vom Core zur Hülle und war zudem sehr schwach, es
waren nie mehr als 2-3 Goldpartikel an ein SIV-Partikel gebunden (Abb. 10a). Zudem
befanden sich häufig Goldpartikel frei in den Zellzwischenräumen, ohne an eine
zytologische Struktur gebunden zu sein. Teilweise war dieser unspezifische Hintergrund so stark ausgeprägt, dass der Schnitt mehr oder weniger gleichmäßig mit
Goldpartikeln bedeckt war. Die mitgeführten Negativkontrollen wiesen keine signifikanten Markierungen auf.
Die Austestung des monoklonalen Antikörpers KK18 führte zu ähnlichen
Ergebnissen. Es fand kaum eine spezifische Markierung von Viruspartikeln statt. In
wenigen Schnitten konnten vereinzelt Viren mit maximal 2 gebundenen Goldpartikeln
gefunden werden (Abb. 10b). Die Markierung von SIV war im Bereich der Virushülle
lokalisiert. Es wurden aber auch Goldpartikel vermehrt innerhalb der Zellen
gefunden. Eine Zuordnung zu bestimmten Strukturen in der Zelle war jedoch nicht
möglich. In einzelnen Proben fand sich ein starker unspezifischer Hintergrund mit
einer gleichmäßigen Verteilung der Goldpartikel. In der Negativkontrolle waren keine
Goldmarkierungen zu sehen.
Der gegen das Glykoprotein 41 gerichtete monoklonale Antikörper KK7a führte zu
einer deutlichen Markierung. Es fanden sich wesentlich häufiger Goldpartikel auf den
Proben als bei den beiden zuvor genannten Antikörpern. In den Virusnestern zeigten
sich vereinzelt mehrere Viren die mit 2-4 Goldpartikeln markiert waren, wobei diese
Markierungen sich auf den Hüllbereich des Virus beschränkten (Abb. 10c). Der
größte Teil der Viren blieb jedoch unmarkiert. Auffällig war zudem, das gehäufte Auftreten von Goldpartikeln in den äußeren Zytoplasmabereichen bzw. der Zellmembran
an Stellen, an denen Virusbudding stattfand. Aber nicht nur dort, sondern auch in der
gesamten Zelle verteilt, waren Goldpartikel zu sehen, die jedoch auf keine bestimmte
Struktur in der Zelle beschränkt waren. Zudem waren auch immer wieder frei
liegende Markierungen in den Schnitten zu sehen, die sich auch in den Negativkontrollen wiederfanden.
62
Ergebnisse
Bei Untersuchungen mit dem monoklonalen Antikörper KK63 fanden sich vereinzelt
markierte SIV-Partikel, wobei jedoch nie mehr als 3 Goldpartikel an ein Virus
gebunden vorlagen (Abb. 10d). Die Goldpartikel waren im Bereich zwischen Core
und Hülle lokalisiert, es blieb jedoch der größte Teil der Viren unmarkiert (Abb. 11).
Markierungen fanden sich auch in den Zellen an der Kernmembran, im äußeren
Zytoplasmabereich und in der Umgebung von Mitochondrien. Der unspezifische
Hintergrund war in der Verdünnung 1:100 stärker ausgeprägt und an den SIVPartikeln fand sich keine Goldmarkierung. Bei der Verdünnung 1:500 wurden kaum
unspezifisch gebundene Goldpartikel aufgefunden. Die Negativkontrolle wies nur
eine geringe Anzahl unspezifisch gebundenen Goldes auf. Auch dieser Antikörper
führte somit zu einem schwachen spezifischen Signal und einer unspezifischen
Hintergrundreaktion.
Der mit anti-p28 (SIV) bezeichnete monoklonale Antikörper führte in der Verdünnung
1:400 zu einer starken und eindeutigen Markierung der Viruspartikel. In den Virusnestern wurde fast jedes Virus markiert. Meist waren pro SIV-Partikel zwischen 5 und
15 Goldpartikel gebunden (Abb. 12). Nicht nur freies Virus wurde markiert, sondern
auch Virusbudding. Die Goldpartikel waren zwischen Hülle und Core lokalisierbar
(Abb. 13). Es fanden sich auch Markierungen in den Zellen, bei denen es sich
möglicherweise um intrazellulär gelegenes SIV-Protein handelte (Abb. 13, Abb. 14).
Dies war aber elektronenmikroskopisch nicht zu klären, da Retroviren morphologisch
im Zytoplasma der Zelle nicht strukturell zu erkennen sind. Zum Teil waren die intrazellulär liegenden Goldpartikel an Zellstrukturen wie Mitochondrien, Kernmembran
und äußerem Zytoplasma zu finden. In einigen Schnitten fanden sich auch Goldpartikel, die keiner Struktur zuzuordnen waren und relativ gleichmäßig verteilt zu sein
schienen. In der Negativkontrolle fanden sich keine signifikanten Markierungen.
Somit erwies sich anti-p28 (SIV) als sehr spezifisch und gut geeignet für die
Untersuchung der Rektumbiopsien SIV-infizierter Tiere, obwohl auch hier eine
schwache unspezifische Hintergrundreaktion nicht ganz auszuschließen war.
Ergebnisse
63
a)
b)
c)
d)
Abb. 10: Immunelektronenmikroskopischer SIV-Nachweis in der Zellkultur (C8166) in
zweifelhaften Fällen und mit schwach positiver Reaktion. Zwischen den Zellen zeigen sich
extrazellulär SIV-Partikel, die unterschiedlich mit Gold markiert sind. Mäßige
Strukturerhaltung aufgrund der LR-White-Einbettung.
a) SIV-Viren mit schwacher Markierung (Kreis). Neben Virus assoziierten Goldpartikeln
finden sich auch unspezifische Goldablagerungen, die keiner Struktur zuzuordnen sind
(KK75, Verd. 1:10, Scalebar = 0,25 µm).
b) SIV-Viren mit Goldpartikelablagerung in der Virusperipherie (Kreis). Zusätzlich finden
sich intrazellulär Goldpartikel (Pfeil) (KK18, Verd. 1:100, Scalebar = 0,1 µm).
c) Neben Goldpartikeln im Bereich der Viren (Kreis) finden sich auch Markierungen an den
Zelluropodien (Pfeil) (KK7a, Verd. 1:500, Scalebar = 0,14 µm).
d) Extrazelluläre Ansammlung von SIV-Strukturen, bei denen sowohl Gold markierte (Kreis)
als auch nicht markierte Viruspartikel vorkommen können. Zusätzlich finden sich intrazellulär Goldansammlungen (Pfeil) (KK63, Verd. 1:100, Scalebar = 0,14 µm).
64
Ergebnisse
Abb. 11: Infolge der LR-White Einbettung deutlich herabgesetzte Strukturerhaltung einer
Kulturzelle C8166. Dennoch lassen sich zwischen den Uropodien (Pfeil) zahlreiche SIVPartikel finden, von denen nur einzelne eine schwache Goldmarkierung (Kreise) aufweisen
(KK63, Verd. 1:500, Scalebar = 0,25 µm).
Ergebnisse
65
Abb. 12: Mit dem Antikörper p28 gelingt eine ausgeprägte silberverstärkte Goldmarkierung
von SIV-Strukturen, die extrazellulär zwischen den Zellen einer C8166-Kultur liegen. Die
Goldpartikel arrangieren sich kreis- oder haufenförmig (Kreise). Einzelne Goldpartikel
können keiner entsprechenden Struktur zugeordnet werden (Pfeile). Zusätzlich finden sich
auch intrazelluläre Goldmarkierungen (p28, Verd. 1:400, Scalebar = 0,08 µm).
66
Ergebnisse
Abb. 13: Stark positive Reaktion im Bereich einer C8166-Kulturzelle unter Verwendung des
monokonalen Antikörpers p28. Hochgradige Ansammlung von SIV-Strukturen, die größtenteils goldmarkiert sind. Die Markierungen bedecken die Partikel oder finden sich überwiegend im Bereich zwischen Core und Virushülle (Pfeile). Neben extrazellulären SIVAnsammlungen finden sich auch intrazellulär goldmarkierte Partikelstrukturen (Kreise) (p28,
Verd. 1:400, Scalebar = 0,14 µm).
Ergebnisse
67
Abb. 14: Ultrastruktur einer Zelloberfläche einer C8166-Kulturzelle mit entsprechenden Uropodien (gerader Pfeil). SIV-Partikel finden sich überwiegend extrazellulär (gekrümmter Pfeil)
und in intrazellulären Vakuolen (Kreis). Wegen der Nähe zur Oberfläche ist nicht auszuschließen, dass es sich bei den Vakuolen um Invaginationen der Zelloberfläche handelt. Die
Viren sind überwiegend mit Gold markiert (p28, Verd. 1:400, Scalebar = 0,33 µm).
68
Ergebnisse
Anwendung der Immunogold-Technik bei Rektumbiopsien:
Das unter Verwendung der permanent SIVmac251 infizierten T-Lymphozytenkultur
C8166
und
des
Antikörpers
anti-p28
(SIV)
erarbeitete
immunelektronen-
mikroskopische Protokoll wurde anschließend bei ausgewählten Rektumbiopsien
angewendet. Die Auswahl der Biopsien erfolgte anhand der Ergebnisse der
lichtmikroskopischen Vororientierung. Es wurden Stellen ausgewählt, die im Lichtmikroskop deutliche Immunogold-Silber-Färbungen aufwiesen. Gleichzeitig wurden
auch Areale, in denen Veränderungen auffielen, ausgewählt.
Die so ausgewählten Ultradünnschnitte wurden systematisch im Elektronenmikroskop durchgemustert, um virales Protein darzustellen. Dabei konnten haufenförmige
Aggregationen von Goldpartikeln in verschiedenen Lokalisationen nachgewiesen
werden. Diese Ansammlung der Goldpartikel war größtenteils kreis- bzw. ringförmig,
wobei allerdings morphologisch keine SIV-Partikel unter diesen Markierungen zu
erkennen waren (Abb. 15, Abb. 16). Abhängig von den Zeitpunkten der Biopsieentnahme, fanden sich unterschiedliche Verteilungsmuster dieser Markierungen.
Aufgrund der schlechten Strukturerhaltung des Gewebes, bedingt durch das
Einbettmedium LR-White, konnten die Goldmarkierungen nicht immer eindeutig
Strukturen im Gewebe zugeordnet werden. Es fanden sich aber Markierungen
sowohl im Zytoplasma, z. B. an Mitochondrien, als auch am Zellkern, so dass die
Spezifität der Markierung in vielen Fällen zweifelhaft blieb. Tabelle 9 gibt eine
Übersicht über die gefundenen Verteilungen in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der
Biopsieentnahme.
Biopsie
post infectionem
9536
1 min
9536
5 min
9538
15 min
9542
30 min
9536
1 wpi
9538
2 wpi
++
Schleimhautoberfläche
++
Enterozyten, apikales
Zytoplasma
+++
+
++
+
+
+
++
++
+
+
++
++
+
++
++
++
+
+
+
+
+
+
Zellzwischenräume
Becherzellen
+
+
Zellkern
Mitochondrien
+
9538
7 wpi
Lumen
Zytoplasma
+
9536
60 min
Ergebnisse
Tabelle 9: Verteilung der Goldpartikel im Epithel der Rektumbiopsien
+
+
++
++
+
+
+ = geringe, ++ = mittelgradige, +++ = hohe Häufigkeit der gefundenen Goldmarkierung
69
70
Ergebnisse
In den Biopsien, die 1 min und 15 min nach intrarektaler Infektion entnommen
worden waren, fanden sich gehäuft Goldmarkierungen im Lumen, an der
Schleimhautoberfläche bzw. im apikalen Zytoplasma (Abb. 16). Die Markierungen
waren deutlich dem Schleimhautepithel zuzuordnen. In der L. propria und
Submukosa fanden sich dagegen, außer unspezifisch an den Erythrozyten, keine
Goldmarkierungen. Diese Häufung der Goldmarkierungen im Bereich des Epithels,
nahm bei den Biopsien die 30 min, 60 min und 1 Woche nach intrarektaler Infektion
gewonnen worden waren, deutlich ab. Die in diesen Biopsien gefundenen
Goldmarkierungen waren eher in der L. propria und Submukosa lokalisiert. Die
Markierungen waren im Zytoplasma (30 min und 1 Woche p. i.) (Abb. 15) bzw. in den
Zwischenzellräumen (60 min p. i.) zu finden. Bei den zu späteren Zeitpunkten (2 und
7 wpi) gewonnenen Biopsien trat wieder eine deutliche Häufung der Goldmarkierungen im apikalen Zytoplasma der Epithelzellen und vereinzelt auch im
Lumen auf.
In den jeweils mitgeführten Negativkontrollen fanden sich in wenigen Proben an
einigen Lokalisationen vereinzelt Ablagerungen von Goldpartikeln. Diese waren
allerdings diffus verteilt, die in den untersuchten Biopsien gefundenen charakteristischen Anhäufungen und kreisförmigen Ablagerungen konnten nicht gefunden
werden. Die als Positivkontrollen mitgeführten SIV-negativen Rektumproben
enthielten viele einzelne Goldpartikel, die allerdings keiner Struktur zugeordnet
werden konnten. In allen untersuchten Proben fand sich eine starke Goldansammlung an den Erythrozyten. Diese war auch in Negativkontrollen und Positivkontrollen vorhanden.
Viruspartikel wurden in keinem Fall festgestellt, so dass die Zuordnung von Goldpartikeln zum Gewebe nur ein Hinweis für das Vorhandensein von SIV-Antigen sein
kann.
Ergebnisse
71
N
Abb. 15: Ausgeprägte typische Goldmarkierung im Zytoplasma einer mononukleären Zelle
der Lamina propria (N = Nukleus). Die Goldpartikelansammlung findet sich zum einen in der
Nähe der dilatierten Schläuche des endoplasmatischen Retikulums (Kreis), zum anderen
dicht bei einer mitochondrialen Struktur (Quadrat) (Tier-Nr. 9538, 30 min p. i., p28, Verd.
1:400, Scalebar = 0,17 µm; Inset Scalebar = 0,05 µm).
72
Ergebnisse
Abb. 16: Enterozytenoberfläche bei sehr starker Vergrößerung mit charakteristischen Goldpartikelansammlungen im apikalen Zellbereich. Teilweise liegen die Markierungen direkt im
Bereich des Mikrovillisaumes (Kreise). Immunogold-Silber-Reaktion, PostembeddingTechnik (Tier-Nr. 9542, 30 min p. i., p28, Verd. 1:400, Scalebar = 0,08 µm).
Diskussion
73
5 Diskussion
Ziel dieser Arbeit war es eine Immunogold-Silber-Färbung zu etablieren um SIVAntigen sowohl lichtmikroskopisch im Semidünnschnitt als auch elektronenmikroskopisch im Ultradünnschnitt sichtbar zu machen. Daneben sollten morphologische
Auffälligkeiten an der normalen rektalen Darmbarriere dokumentiert werden, die sich
möglicherweise an einem transepithelialen Transport von SIV beteiligen. Zu diesem
Zweck wurden Enddärme bzw. Schleimhautbiopsien des Rektums von klinisch
gesunden, nicht SIV-infizierten als auch SIV-infizierten Rhesusaffen in Epon bzw.
LR-White eingebettet und licht- sowie transmissionselektronenmikroskopisch untersucht. Gleichzeitig wurde unter Verwendung einer SIVmac251-infizierten Lymphozytenzellkultur C 8166 eine Immunogold-Silber-Färbung etabliert. Dieses Detektionssystem wurde dann an Rektumbiopsien, die von 5 intrarektal SIVmac251 infizierten
Rhesusaffen zu verschiedenen Zeitpunkten gewonnen wurden, angewandt und lichtsowie transmissionselektronenmikroskopisch die Verteilung der Immunogold-SilberPräzipitate untersucht. Die Verteilung der Präzipitate zu verschiedenen Zeitpunkten
kurz nach intrarektaler Infektion wurden verglichen, um so die Bedeutung der
rektalen Schleimhaut als Eintrittspforte für die Infektion zu beurteilen.
Für diese Studie wurde die intrarektale Infektion von Rhesusaffen mit SIV gewählt,
da bekannt ist, dass sich Rhesusaffen als Tiermodell für die HIV-Infektion aufgrund
des ähnlichen Krankheitsbildes eignen, und der intrarektale Infektionsweg auch beim
Menschen von Bedeutung ist. Zudem entspricht das Rektum des Rhesusaffen dem
des Menschen (BUTOR et al., 1996). Nach intrarektaler Infektion entwickelt sich ein
Krankheitsbild, das der HIV-Infektion des Menschen entspricht, wobei rektale
Biopsieentnahmen bereits zu frühen Zeitpunkten Verlaufsuntersuchungen ermöglichen (HERRMANN, 1997). Die Bedeutung des Gastrointestinaltraktes im Rahmen
der SIV/HIV-Infektion wird dadurch unterstrichen, dass noch vor dem Auftreten erster
klinischer Symptome infizierte Zellen im GIT gefunden werden können (HEISE et al.,
1994). Es ist bekannt, dass die Infektionsgefahr bei analem Geschlechtsverkehr
höher ist als bei vaginalem (FUJIMURA und OWEN, 1996; LORIAN, 1988) und dass
die Transzytosefähigkeit der intestinalen Epithelzellen von proximal nach distal
zunimmt (HEYMAN und DESJEUX; 1996). Dies weist auf eine besondere Bedeutung
des Rektums bei der Infektion hin.
74
Diskussion
5.1 Vergleichen de Untersuchung der Rektumschleimhaut von Rhesusaffen mit
und ohne SIV-Infektion
Wie von EIDELMAN und LAGUNOFF (1972) für menschliche Rektumbiopsien
beschrieben, waren auch bei den untersuchten SIV-positiven Rektumbiopsien regelmäßig Lamina epithelialis und Lamina propria entnommen worden. Nur gelegentlich
war anders als beim Menschen L. muscularis mucosae vorhanden. Die Tatsache,
dass in den untersuchten Biopsien häufig nur L. epithelialis und L. propria vorhanden
waren könnte dadurch bedingt sein, dass durch den mechanischen Stress der
Endoskopie die Krypten auseinander treten und sich von der Muscularis mucosae
lösen, wie von GOLDMAN und ANTONIOLI (1982) beschrieben. Die post mortem,
während der Sektion gewonnenen Rektumproben der nicht SIV-infizierten Tiere
wiesen dagegen alle Schichten der Rektumwand auf, so dass die Entnahmetechnik
beim Vergleich SIV-infizierter und nicht infizierter Tiere in der vorliegenden Arbeit
Berücksichtigung finden muss.
Der histologische Aufbau der untersuchten Rektumproben entspricht dem des
Menschen und anderer Säugetiere, d. h. die oberflächlichen Epithelzellen des Rektums sind zylindrisch und haben einen basalen normochromen Kern sowie ein
homogenes eosinophiles Zytoplasma. Das Kryptepithel ist ebenfalls zylindrisch mit
basalem normochromen Kern sowie homogenem eosinophilem Zytoplasma,
dazwischen finden sich Panethzellen und enteroendokrine Zellen mit argentophilen
Granula (SHCHERBAKOV et al., 1988; HAMILTON, 1984). Insgesamt konnten in
den untersuchten Rektumproben keine Abweichungen von dem beim Menschen und
anderen Säugetieren beschriebenen histologischen Aufbau der Schleimhaut
gefunden werden.
Bei den untersuchten Rektumproben konnten lichtmikroskopisch histopathologische
Befunde unabhängig vom Infektionsstatus in Form von einer Schädigung der Epitheldecke sowie Ödeme und Hämorrhagien in der L. propria festgestellt werden. In den
SIV-positiven Rektumbiopsien konnten als weitere Befunde zahlreiche große
Vakuolen in den Epithelzellen sowie zahlreiche Makrophagen mit intrazytoplasmatischen Einschlüssen festgestellt werden.
Diskussion
75
Die in den untersuchten Biopsien gefundenen Hämorrhagien und Ödeme wurden
auch bei menschlichen Rektumbiopsien von GOLDMAN und ANTONIOLI (1982)
beschrieben. Die Autoren führen diese Veränderungen auf traumatische Effekte der
Endoskopie sowie auf mechanischen Stress während der Vorbereitung für die Endoskopie zurück. Ebenfalls beschreiben sie eine abgeflachte Oberfläche und eine
Depletion der Becherzellen. Laut GOLDMAN und ANTONIOLI (1982) kommt es
durch den mechanischen Stress bei der Biopsieentnahme zu einem fokalen
Zusammenballen der in der L. propria vorhandenen Zellpopulation; dies könnte eine
mögliche Ursache für die Anhäufung subepithelialer Zellen in einigen Bereichen der
Rektumbiopsien darstellen. Auch der stellenweise in den untersuchten Biopsien
gefundene Verlust der Epithelkontinuität durch Auflockerungen, Zelldesquamationen
und großflächige Läsionen könnte durch die Entnahme bedingt sein. Warum ähnliche
Beobachtungen auch bei postmortem gewonnenen Proben vorlagen, ist aber in
diesem Zusammenhang nicht zu klären.
In den untersuchten Rektumproben fanden sich gelegentlich Lymphfollikel in der
Lamina propria bzw. in der Tela submucosa, wie auch beim Menschen von oben
genannten Autoren beschrieben. Die Häufigkeit dieser Lymphfollikel wird kontrovers
diskutiert. BURKL (1957) beschrieb, dass im Rektum des Rhesusaffen weniger und
kleinere Lymphfollikel vorhanden sind als in den anderen Darmabschnitten. Andere
Autoren kommen dagegen zu dem Ergebnis, dass das Rektum des Rhesusaffen
besonders viele lymphatische Einrichtungen in Form von solitären und aggregierten
Lymphfollikeln enthält (HERRMANN, 1997). Bei den hier vorliegenden Untersuchungen war aufgrund der geringen Größe der untersuchten Proben keine
Aussage über Häufigkeit und Verteilung der lymphatischen Einrichtungen im Rektum
des Rhesusaffen möglich. Nur in wenigen Proben konnten Lymphfollikel gefunden
werden, wobei keine Abhängigkeit vom Infektionsstatus bestand.
Das gehäufte Vorkommen von großen apikalen Vakuolen in den Epithelzellen spricht
für einen gesteigerten Membranturnover an der apikalen Oberfläche. Dies kann
bedingt sein durch Zellschädigung oder durch eine gesteigerte Sekretion (DOBBINS
und WEINSTEIN, 1985). Das gehäufte Vorkommen derartiger Vakuolen in den SIVpositiven Rektumbiopsien lässt einen Zusammenhang mit der Infektion vermuten.
DELÉZAY und Mitarbeiter (1997) konnten in vitro nachweisen, dass HIV einen
76
Diskussion
Einfluss auf die Morphologie und Differenzierung von Enterozyten hat. Sie stellten
eine Akkumulation von Fettvakuolen in den Zellen sowie intrazelluläre Zysten in den
Epithelzellen fest. Dies stimmt überein mit den zahlreichen Vakuolen, die sich apikal
in den Epithelzellen der SIV-positiven Rektumbiopsien fanden. Allerdings ist diese
Vakuolenbildung ein unspezifisches Kennzeichen einer Zellschädigung bzw. weist
auf eine gesteigerte Sekretion der Zelle hin. Die Bedeutung im Rahmen der SIVInfektion bleibt somit unklar.
Das gehäufte Vorkommen von Makrophagen mit intrazytoplasmären Einschlüssen in
den SIV-positiven Biopsien korreliert mit den Ergebnissen von BISHOP und Mitarbeitern (1987), dass die Anzahl mononukleärer Zellen in HIV-positiven Rektumbiopsien zunimmt. Die Bewertung dieser Infiltration der Rektumschleimhaut mit
mononukleären Zellen im Bezug auf die HIV-Infektion ist allerdings unsicher, da es
sich hierbei um ein unspezifisches Zeichen mit Aktivierung der Schleimhautabwehr
handelt. In einer anderen Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass bereits 3 Tage
nach SIV-Infektion das Regulatorprotein nef in Makrophagen-ähnlichen Zellen diffus
in der Lamina propria verteilt vorlag (KAUP et al., 2001). Dies weist auf eine
besondere Bedeutung der Makrophagen bzw. der monozytären Zellen bei der
Pathogenese und Verbreitung der SIV-Infektion hin. Zu beachten ist allerdings, dass
es sich bei dem verwendeten SIV-Infektionsstamm um einen makrophagotropen
Virusstamm handelt. Die Aufgabe der Makrophagen im Abwehrsystem der Schleimhaut besteht in der Phagozytose von untergehenden Zellen, Partikeln und Mikroorganismen (LEFEVRE et al., 1979), was zu zahlreichen, intrazytoplasmatisch
gelegenen, sich dunkel anfärbenden Strukturen führt. Daher deutet die bei SIVpositiven
Biopsien
gefundene
Anhäufung
von
Makrophagen
mit
intrazyto-
plasmatischen Einschlüssen auf einen gesteigerten Zelluntergang bzw. auf ein
gesteigertes Eindringen von Partikeln in die L. propria hin. Inwiefern dies durch die
SIV-Infektion bedingt wird, ist kritisch zu beurteilen, da es sich um eine unspezifische
Reaktion des Schleimhautimmunsystems auf unterschiedliche Noxen handeln
könnte.
Andererseits passen die oben genannten Veränderungen, wie Ödeme, Hämorrhagien, Entzündungszellinfiltration in der L. propria sowie Defekte der L. epithelialis
auch in das Bild der HIV-Enteropathie (GRIFFIN, 1993), wobei diese Enteropathie in
Diskussion
77
frühen Zeitpunkten nach der Infektion eher von untergeordneter Bedeutung ist. Diese
Veränderungen sind allerdings nicht spezifisch und selbst das Vorhandensein von
HIV im GIT spricht nicht zwangsläufig dafür, dass dieses eine pathogenetische Rolle
spielt (KOTLER et al., 1991). Inwiefern die gefundenen Veränderungen mit der
experimentellen intrarektalen SIV-Infektion in Verbindung stehen bleibt somit offen.
Einflüsse durch die Biopsieentnahme spielen sicher eine große Rolle.
Die elektronenmikroskopische Untersuchung bestätigte die lichtmikroskopischen
Ergebnisse. Zusätzlich fanden sich SIV-ähnliche Strukturen in den SIV-positiven
Biopsien die nicht eindeutig interpretiert werden konnten.
Dass im Rahmen der ausführlichen elektronenmikroskopischen Untersuchungen
keine SIV-Partikel gefunden wurden, scheint dadurch bedingt zu sein, dass Viruspartikel nur im Extrazellularraum und kurz nach dem „budding” sichtbar werden
(HÜNERBEIN, 1997). Es ist gut möglich, dass in keiner der untersuchten Proben
dieses punktuelle Auftreten von Partikeln vorlag. Bei den SIV-ähnlichen Strukturen
handelte es sich wahrscheinlich um quergetroffene Bakteriengeißeln, ohne dass dies
eindeutig erkennbar war. Nie konnten diese Strukturen anhand der morphologischen
Charakteristika eindeutig als SIV identifiziert werden. Im Rahmen der elektronenmikroskopischen Untersuchung blieb somit offen, ob SIV-Partikel oder SIV-Antigen
im Gewebe vorhanden waren, obwohl nur wenige Minuten zuvor eine SIV-Infektion
stattgefunden hatte.
Die Auflockerung der „tight junctions” ist an sich nichts ungewöhnliches, da die „tight
junctions” keine statische, absolut unüberwindbare Barriere darstellen, sondern eine
selektive semipermeable Eintrittspforte (SHAO et al., 2001). DELÉZAY und Mitarbeiter (1997) konnten in einem in vitro Modell belegen, dass HIV einen direkten
Einfluss auf die Epithelbarriere hat. Sie wiesen darauf hin, dass eine veränderte
Permeabilität der „tight junctions” zu Entzündungen und zu Diarrhoe führen könnte.
Die Permeabilität der „tight junctions” wird von Bakterientoxinen und entzündlichen
Cytokinen beeinflusst. In HIV-positiven Rektumbiopsien stellten DiSTEFANO und
Mitarbeiter (2001) einen erhöhten Spiegel an proinflammatorischen Cytokinen fest.
Dies könnte im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit gefundenen Auflockerungen
der „tight junctions” stehen. Eine gesteigerte Permeabilität der Rektumschleimhaut
im Verlauf der SIV-Infektion könnte einerseits das Eindringen von SIV in den
78
Diskussion
Organismus begünstigen und andererseits das Anheften bzw. Eindringen sekundärer
opportunistischer Infektionen begünstigen, wie sie sich im Verlauf der SIV-/HIVInfektion entwickeln.
Sowohl licht- als auch elektronenmikroskopisch konnten Hinweise auf opportunistische Erreger nur in den SIV-negativen Proben nachgewiesen werden. Dabei
handelte es sich um Balantidien, die nach Untersuchungen von KUHN (1995) bei
Rhesusaffen unabhängig vom Infektionsstatus häufig zu finden sind, und damit
wahrscheinlich als echte Opportunisten kaum gelten können. Meist verläuft ein Befall
des Rektums mit Balantidien beim Rhesusaffen asymptomatisch. Bei den sehr früh
im Infektionsverlauf gewonnenen Biopsien wäre es überraschend gewesen,
sekundäre Alterationen durch die SIV-Infektion vorzufinden. Zudem stellt sich bei der
geringen Größe der gewonnenen Biopsien das Problem, dass nur ein geringer
Ausschnitt der Rektumschleimhaut zur Untersuchung kam, und die Ergebnisse nur
einen punktuellen Einblick in das Geschehen bieten.
5.2 Detektion v on SIV-Antigen an der Zellkultur
Die mit dem Antikörper anti-p28 (SIV) an LR-White eingebettetem Gewebe
durchgeführte
Immunfluoreszenzmethode
führte
zu
keinem
auswertbaren
Ergebnis. Eine Ursache hierfür könnte eine Inkompatibilität des verwendeten
fluoreszenzmarkierten Antikörpers mit dem Primärantikörper anti-p28 (SIV) sein. Im
Gegensatz dazu erwies sich anti-p28 (SIV) in der Immunogoldsilbermethode an
Semidünnschnitten hervorragend geeignet. Zudem konnten keine Beschreibungen
zu Immunfluoreszenzuntersuchungen an LR-White eingebettetem Gewebe in der
Literatur gefunden werden.
Die Immunogold-Methode zum Nachweis von HIV bzw. zur Darstellung bestimmter
Zusammenhänge in der Pathogenese von HIV wurde in verschiedenen Studien verwendet (RAKOWICZ-SZULCZYNSKA et al., 1998; CORNET et al., 1992). In dieser
Arbeit sollte mit der Immunogold-Silber-Methode SIV in Rektumbiopsien zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der intrarektalen Infektion nachgewiesen werden.
Die unterschiedlichen Ergebnisse bei den verwendeten Primärantikörpern könnte in
den unterschiedlichen Angriffspunkten begründet sein. So sind die beiden Antikörper
Diskussion
79
KK7a und KK18 gegen Hüllglykoproteine von SIV gerichtet, KK63 dagegen ist gegen
ein Protein gerichtet, dass von gag kodiert wird. Die beiden Antikörper KK75 und
anti-p28 (SIV) sind gegen nef kodierte Proteine gerichtet. In unserer Arbeitsgruppe
sind bisher gute Ergebnisse bei der Immunhistochemie unter Verwendung von KK75
an paraffineingebetteten Gewebe erzielt worden (KAUP et al., 2001; HERRMANN,
1997; HÜNERBEIN, 1997). Keiner der oben genannten Antikörper war bisher an LRWhite eingebettetem Gewebe ausgetestet worden. Je nach Art der Einbettung
kommt es zu unterschiedlichen Vernetzungen durch das Einbettmedium, d. h.
verschiedene Zellstrukturen und potentielle Bindungsstellen werden je nach
Einbettung unterschiedlich beeinflusst. Verschiedene Untersuchungen zum Einfluss
der Fixation und Einbettung auf die Antigenität und Struktur des Gewebes haben
ergeben, dass eine Kombination von Paraformaldehyd und Glutaraldehyd bzw. einer
niedrigen Konzentration Glutaraldehyd sowie eine niedrige Temperatur bei der
Einbettung eine gute Antigenität und Strukturerhaltung fördern (TIMMS, 1986;
WEIBULL und CHRISTIANSSON, 1986). Andere Autoren haben festgestellt, dass es
bei der Einbettung mit LR-White zu Extraktionen, Artefakten und Schrumpfungen des
Gewebes kommen kann. Zudem beschreiben diese, dass die Vernetzung innerhalb
des Gewebes geringer ist, wenn die Temperatur während der Einbettung 60°C nicht
überschreitet (NEWMAN und HOBOT, 1987). Die Verwendung von LR-White und
einem Akzelerator bei der Einbettung führt gelegentlich zu brüchigen Schnitten und
zu Gewebeschädigungen wobei allerdings eine Fixation mit einem Gemisch aus
Paraformaldehyd und Glutaraldehyd wiederum die Morphologie des Gewebes schont
(GOCHT, 1992). Die Einbettung in LR-White hat somit viele Vorteile für die
Immunogold-Silber-Färbung, es sind jedoch auch einige negative Einflüsse möglich.
Es muss für jedes Gewebe und jeden Antikörper die Verwendbarkeit dieser
Einbettung für die Immunogold-Silber-Färbung untersucht und bewertet werden, wie
es auch in dieser Arbeit geschehen ist.
Nicht nur die Einbettung hat Einfluss auf die Antigenität des Gewebes und den unspezifischen Hintergrund, sondern auch die Konzentration und Inkubationszeit des
Blockreagenz. BRORSON (1997) beschreibt, dass eine erhöhte Konzentration bzw.
eine verlängerte Inkubationszeit mit BSA (Bovinem Serumalbumin) den unspezifischen Hintergrund bei der Immunogoldreaktion senkt, allerdings hat eine erhöhte
BSA-Konzentration bzw. eine verlängerte Inkubationszeit einen geringen negativen
80
Diskussion
Einfluss auf das Immunogold-Labeling. Da mit der von AURION angegebenen BSAKonzentration und Inkubationszeit ein geringer unspezifischer Hintergrund und mit
anti-p28 (SIV) auch eine deutliche spezifische Markierung erzielt wurden, sahen wir
uns nicht genötigt verschiedene Konzentrationen und Zeiten auszutesten.
Im Falle von KK75 scheint eine Einbettung in LR-White, im Gegensatz zur
Einbettung in Paraffin, die für diesen Antikörper vorhandenen Bindungsstellen und
Epitope im Gewebe stark zu beeinflussen, was die Bindung von KK75 an das nefkodierte Protein verhindert. Auch die von GOCHT (1982) empfohlenen Verwendung
der 10 fachen Konzentration des Antikörpers im Vergleich zu paraffineingebettetem
Gewebe führte zu keiner Verbesserung der Immunogold-Silber-Färbung. Im Gegensatz dazu wird die Bindungsstelle von anti-p28 (SIV) an das nef-kodierte Protein
anscheinend nicht beeinflusst und somit die Bindung des Antikörpers nicht behindert.
Die restlichen drei Antikörper wurden von unserer Arbeitsgruppe erstmals
ausgetestet, für sie ist eine gute Bindungseigenschaft im ELISA, Western blot bzw.
Immunfluoreszenz beschrieben (KENT et al., 1991), für LR-White eingebettetes
Gewebe trifft dies allerdings nicht zu. Eine andere Ursache für die unterschiedlichen
Ergebnisse mit den verschiedenen Antikörpern könnte darin liegen, dass bei LRWhite eingebetteten Geweben nur die Oberfläche des Schnittes markiert wird, es
findet nur eine geringe Antikörperpenetration in das Gewebe statt (GOCHT, 1992;
TIMMS, 1986). Dadurch ist die Anzahl der für die Antikörper erreichbaren
Bindungsstellen und Epitope im Vergleich zu in Paraffin eingebetteten Geweben
stark verringert. Allerdings kann bei der in der Zellkultur vorhandenen großen Menge
an SIV davon ausgegangen werden, dass genügend Bindungsstellen an der
Schnittfläche vorhanden sein müssten. Das Versagen einzelner Antikörper bei der
Immunogold-Silber-Färbung kann somit nicht allein durch die geringe Eindringtiefe in
LR-White eingebettetes Gewebe erklärt werden. Bei den an den Schnittkanten und
Rissen gefundenen Goldablagerungen handelt es sich um unspezifische Niederschläge, die bei der Behandlung des Schnittes während des Dekantierens der
Reagentien
hängen
geblieben
sind.
Bei
der
elektronenmikroskopischen
Untersuchung bestätigten sich die Ergebnisse der Lichtmikroskopie, obwohl mit
KK75, KK7a, KK18 und KK63 vereinzelt wenige Goldpartikel an SIV-Partikeln
gefunden wurden. Dies könnte darin begründet sein, dass die geringe Anzahl der an
SIV gebundenen Goldpartikel (2-4) im Lichtmikroskop nicht erkennbar sind. Ebenso
Diskussion
81
könnte die geringe Dichte der Markierungen, es waren stets nur einzelne SIV
markiert, zu schwach für die lichtmikroskopische Detektion gewesen sein. Ein
weiterer Nachteil dieser Antikörper war die mehr oder weniger stark ausgeprägte
Hintergrundreaktion sowohl bei der lichtmikroskopischen als auch bei der
elektronenmikroskopischen Untersuchung. Diese Hintergrundreaktion steht im
Gegensatz
zu
der
für
LR-White
postulierten
Eigenschaft
eines
niedrigen
unspezifischen Hintergrundes (TIMMS, 1986).
Anti-p28 (SIV) erwies sich von den an der Zellkultur verwendeten Antikörpern
als einziger als geeignet für den Nachweis von SIV.
In der lichtmikroskopischen Untersuchung von Semidünnschnitten konnten unter
Verwendung von anti-p28 (SIV) in einer Arbeitsverdünnung von 1:400 und
sogenannten „ultra small“-Goldpartikeln eindeutig Markierungen im Zwischenzellraum gefunden werden. Viren lagen, wie auch von HÜNERBEIN (1997)
beschrieben, nesterartig zwischen den Zellen, Knospungs- und Reifungsprozesse
konnten gesehen werden. anti-p28 (SIV) führte auch in der elektronenmikroskopischen Untersuchung zu einer starken Markierung der Viruspartikel.
Stets waren mehrere (5-15) Goldpartikel an eine SIV-Struktur gebunden, obwohl
einige Partikel unmarkiert blieben. Im Semidünnschnitt äußerte sich dies als deutlich
zu erkennende schwarze Ablagerungen im Zwischenzellbereich und an der
Zelloberfläche, wobei allerdings nur ein Teil der Zelle markiert war. Nur sehr selten
erstreckte sich die Markierung auf die gesamte Zelloberfläche. Dieses Ergebnis
korreliert mit der von HÜNERBEIN (1997) beschriebenen Verteilung der Viren an
Zellen, die Virus produzieren, bzw. mit der Anlagerung von Virionen an die äußere
Zellmembran. Die deutlich besseren Markierungen unter Verwendung von sehr
kleinen („ultra small“) Goldpartikeln liegen in der besseren Penetration und
geringeren sterischen Behinderung begründet (LACKIE et al., 1985).
82
Diskussion
5.3 Detektion v on SIV-Antigen in Rektumbiopsien
Die lichtmikroskopische Vororientierung zur Auswahl positiver Ausschnitte für die
Elektronenmikroskopie gelang nur in vereinzelten Fällen. Dabei fanden sich
Goldmarkierungen v. a. in der L. epithelialis im Bereich der Kryptbasis.
Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung wurden keine SIV-Partikel
gefunden. Ursache hierfür könnte einerseits die geringe Anzahl des im Gewebe
vorhandenen SIV bedingt durch die geringe Größe des untersuchten Areals sein.
Andererseits
sind
intrazellulär
gelegene
SIV-Partikel
morphologisch
nicht
detektierbar (GELDERBLOM et al., 1987). Allerdings fanden sich charakteristische
kreisförmige Goldmarkierungen wie sie auch in der Zellkultur an den SIV-Partikeln
gefunden wurden. Da die Immunogoldmarkierung in der SIV-infizierten Zellkultur
eindeutig SIV-Partikeln zuzuordnen war, weisen die gefundenen Markierungen auf
mögliche Lokalisationen von SIV im Rektum hin. Zahlreiche Untersuchungen haben
mit unterschiedlichen Detektionsmethoden nachgewiesen, dass das Rektum eine der
Hauptlokalisationen von SIV darstellt (KAUP et al., 2001; VAJDY et al., 2001;
DIDIER, 2000; HERRMANN, 1997).
Die Goldmarkierungen ließen in Abhängigkeit vom Entnahmezeitpunkt der Biopsie
ein Verteilungsmuster erkennen. In den früh nach der Infektion entnommenen
Biopsien (1, 5, 15 und 30 Minuten) befanden sich die Markierungen hauptsächlich im
oberen Bereich der Schleimhaut, d. h. an der Schleimhautoberfläche, apikal in den
Epithelzellen sowie im Lumen. Dass sich die Markierungen bereits 60 Minuten nach
der Infektion hauptsächlich in der Lamina propria und nicht mehr im Bereich der
Epithelzellen finden, korreliert mit Ergebnissen von in vitro Studien, in denen die
epitheliale Barriere innerhalb von 30 Minuten überwunden wurde und es zu einer
produktiven Infektion subepithelialer mononukleärer Zellen kam (HOCINI und
BOMSEL, 1999; BOMSEL, 1997). 2 und 7 Wochen nach der Infektion entnommene
Biopsien wiesen dagegen wieder Markierungen im oberen Bereich der Schleimhaut
auf, ohne dass eine Erklärung gegeben werden kann.
Diskussion
83
Im Hinblick auf potentielle Eintrittspforten für SIV in der Rektumschleimhaut lassen
sich aus den Ergebnissen einige Folgerungen ableiten. Zum einen war die
mechanische Integrität des Epithels in einigen Biopsien geschädigt. Nach TIDBALL
(1971) könnten diese Läsionen als mögliche Eintrittspforten für SIV dienen, da diese
als intestinale Eintrittspforten gelten. Die Entstehung der Läsionen könnte allerdings
auch präparationsbedingt sein. Die Auflockerung der „tight junctions” in einigen Bereichen könnte ebenfalls einen Hinweis auf eine mögliche Passage der epithelialen
Barriere darstellen (BERIN et al., 1999). Ursachen für dieses Auseinanderweichen
der „tight junctions” könnten mechanische Belastungen während der Biopsieentnahme bzw. der Präparation sein. Es ist aber auch bekannt, dass die „tight
junctions” keine starre Barriere darstellen, sondern durch verschiedene Faktoren
geöffnet werden können (SHAO et al., 2001; RESCIGNO et al., 2001).
Eine intakte Mikroflora gehört zu den Faktoren, die die Schleimhautbarriere des GIT
beeinflussen (BORSCH, 1984). In den untersuchten Rektumbiopsien fand sich häufig
eine Überwucherung des Epithels mit zahlreichen Bakterien, ein sog. „bacterial
overgrowth“. Inwiefern dieses „bacterial overgrowth“ Einfluss auf das Eindringen von
SIV hat, konnte nicht eindeutig geklärt werden. Auffällig war allerdings, dass in
diesen Bereichen die Auflockerung der „tight junctions” sehr häufig und sehr stark
ausgeprägt zu finden war. Teilweise war nur noch eine dünne Brücke vorhanden, die
die Zwischenzellräume vom Darmlumen trennte, was ein Eindringen pathogener
Erreger erleichtern könnte. Zudem fanden sich im Bereich der aufgelockerten „tight
junctions” zu allen Entnahmezeitpunkten gelegentlich charakteristische Goldmarkierungen.
Über weitere Faktoren, die die Schleimhautbarriere beeinflussen, wie die Glykokalix,
die Schleimproduktion der Becherzellen und die Motilität des Verdauungstraktes, und
deren mögliche Einflüsse auf das Eindringen von SIV konnten in dieser Studie keine
Erkenntnisse gewonnen werden. Ebenso konnten in keiner der Rektumbiopsien MZellen gefunden werden. In zahlreichen Literaturstellen wird auf die Bedeutung
dieser Zellen für den Antigeneintritt über die Schleimhaut berichtet. M-Zellen werden
von einigen Autoren (u. a. FREY et al., 1996; AMERONGEN et al., 1991) als
mögliche Haupteintrittspforten für SIV und HIV über den Darmtrakt diskutiert. Diese
Frage muss allerdings offen bleiben.
84
Zusammenfassung
6 Zusammen fassung
Karin Bingger: Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen zum
Nachweis von SIV (Simian Immunodeficiency Virus) im Rektum experimentell
infizierter Rhesusaffen (Macaca mulatta).
1) Die normale Morphologie des Rektums unterscheidet sich nicht wesentlich von
anderen Darmabschnitten, wobei allerdings Läsionen zu beobachten sind, die
möglicherweise den SIV-Eintritt erleichtern. In den Biopsien waren Lymphfollikel
mit assoziiertem Epithel selten und unvollständig vorhanden, so dass die Frage,
ob SIV diese Strukturen zum Eintritt in die Rektumschleimhaut nutzt, offen blieb.
2) Von den für die Immunogold-Silber-Färbung verwendeten Antikörpern ist anti-p28
(SIV) in der Lage sowohl bei licht- als auch bei elektronenmikroskopischen
Untersuchungen SIV eindeutig zu markieren. In der SIV-infizierten Zellkultur stellte
sich dies lichtmikroskopisch als schmale schwarze Umrandungen der Zellen dar.
Elektronenmikroskopisch konnten die Markierungen eindeutig SIV-Partikeln
zugeordnet werden. Dabei war auffällig, dass neben goldmarkierten intrazellulären
SIV-Partikeln auch Goldpartikel in der Zelle anzutreffen waren, die keiner
bestimmten Struktur zuzuordnen waren. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die
Immunogoldmethode dazu geeignet ist, unabhängig vom Vorhandensein viraler
Partikel, SIV-Antigen immunelektronenmikroskopisch nachzuweisen.
3) Die Anwendung der Immunogold-Silber-Färbung an Biopsien, die 1, 5, 15, 30, 60
Minuten sowie 2 und 7 Wochen nach intrarektaler SIV-Infektion gewonnen
wurden, ist auf lichtmikroskopischer Ebene nicht in der Lage SIV-Antigen eindeutig
nachzuweisen. Bei elektronenmikroskopischen Untersuchungen zeigten sich
zweifelhafte Ergebnisse, da in keinem Fall SIV-Partikel morphologisch nachweisbar waren. Allerdings konnten Goldpartikel-Ansammlungen ähnlich denen in der
Zellkultur gefunden werden, die ein Indikator für das Vorhandensein von SIVAntigen sein könnten.
Zusammenfassend ist die Immunelektronenmikroskopie hervorragend geeignet,
SIV spezifisch auf ultrastruktureller Ebene nachzuweisen. Der monoklonale Antikörper anti-p28 (SIV) (anti-nef) zeigt ideale Markierungen in der Immunogold-SilberMethode unter Verwendung von „ultra small” Goldpartikeln. Da aber in keiner
Rektumbiopsie, anders als in der Zellkultur, Viruspartikel eindeutig goldmarkierten
Antikörpern zugeordnet werden konnten, ist die Frage nach dem transepithelialen
Weg von SIV im Bereich des Rektums weiterhin nicht geklärt.
Summary
85
7 Summary
Karin Bingger: Light- and electronmicroscopical examinations for detection of
SIV (simian immunodeficiency virus) in the rectum of experimentally infected
rhesus macaques (Macaca mulatta)
1) The normal morphology of the rectum is not substantially different from other
regions of the GIT, however, lesions are observed which might make SIV-entry
easier. Lymphfollicles with an associated epithelium were rare and incomplete in
the biopsies. Thus the question if SIV uses these structures for its entry into the
epithelium of the rectum remains unanswered.
2) Among the antibodies used for Immunogold-Silver-Staining, anti-p28 (SIV) is able
to clearly mark SIV in light- and electronmicroscopical examinations. Within the
SIV-infected cell culture this appeared lightmicroscopically as small black edging
of the cells. Electronmicroscopically these gold markings could clearly be
associated to SIV-particles. Besides goldmarked intracellular SIV-particles there
were gold particles within the cell, which could not be assigned to a specific
structure. This points out that the immunogold staining is suitable for the
immunelectronmicroscopical detection of SIV-antigen, independent of the
existence of viral particles.
3) Using Immunogold-Silver-Staining at biopsies, gained 1, 5, 15, 30 and 60 minutes
as well as 2 and 7 weeks after intrarectal SIV-infection, SIV-antigen could not be
detected clearly on lightmicroscopical level. In electronmicroscopy the results were
doubtful as SIV-particles could never be detected morphologically. However,
clusters of gold particles similar to those seen within the cell culture could be
found, they might indicate the presence of SIV-antigen.
In summary, immunelectronmicroscopy is suitable to detect SIV on the ultrastructural level. The monoclonal antibody anti-p28 (SIV) (anti-nef) shows ideal markings in
the Immunogold-Silver-Staining when ultra small gold particles are used. Differing
from the cell culture it was not possible to clearly associate virus particles to
goldmarked antibodies in any of the rectum biopsies. Thus the question on the
transepithelial way of SIV in the rectum remains still unsolved.
86
Literaturverzeichnis
8 Literaturve rzeichnis
ADACHI A., S. KOENIG, H. E. GENDELMAN, D. DAUGHERTY, S. GATTONI-CELLI,
A. S. FAUCI und M. A. MARTIN (1987)
Productive, persistent infection of human colorectal cell lines with HIV.
J. Virol. 61, 209-213
ALLAN J. S., M. SHORT, M. E. TAYLOR, S. SU, V. M. HIRSCH, P. R. JOHNSON, G.
M. SHAW und B. H. HAHN (1991)
Species-specific diversity among simian immunodeficiency virus from african green
monkey.
J. Virol. 65, 2816-2828
ALLAN J. S., P. RAY, S. BROUSSARD, E. WHITEHEAD, G. HUBBARD, T.
BUTLER, K. BRASKY, P. LUCIW, C. CHENG-MAYER und J. A. LEVY (1995)
Infection of baboons with simian/human immunodeficiency viruses.
J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 9, 429-441
AMERONGEN H. M., G. A. WILSON, B. N. FIELDS und M. R. NEUTRA (1994)
Proteolytic processing of reovirus is required for adherence to intestinal M cells.
J. Virol. 68, 8428-8432
AMERONGEN H. M., R. WELTZIN, C. M. FARNET, P. MICHETTI, W. A.
HASELTINE und M. R. NEUTRA (1991)
Transepithelial transport of HIV-1 by intestinal M cells: a mechanism for transmission
of AIDS.
J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 4, 760-765
ASMUTH D. M., S. M. HAMMER und C. A. WANKE (1994)
Physiological effects of HIV infection on human intestinal epithelial cells: an in vitro
model for HIV enteropathy.
AIDS 8, 205-211
Literaturverzeichnis
87
BARTLETT J. G., P. C. BELITSOS und C. L. SEARS (1992)
AIDS enteropathy.
Clin. Infect. Dis. 15, 726-735
BASCHONG W. und Y. D. STIERHOF (1998)
Preparation, use, and enlargement of ultrasmall gold particles in immunoelectron
microscopy.
Microsc. Res. Tech. 42, 66-79
BASKIN G. B. (1987)
Disseminated cytomegalovirus infection in immunodeficient rhesus monkeys.
Am. J. Pathol. 129, 345-352
BASS D. M., J. S. TRIER, R. DAMBRAUSKAS und J. L. WOLF (1988)
Reovirus type I infection of small intestinal epithelium of suckling mice and its effects
on M cells.
Lab. Invest. 58, 226-235
BEIER R. und A. GEBERT (1998)
Kinetics of particle uptake in the domes of Peyer´s Patches.
Am. J. Physiol. 275, G130-G137
BENDINELLI M., M. PISTELLO, S. LOMBARDI, A. POLI, C. GARZELLI, D.
MATTEUCCI, L. CECCHERINI-NELLI, G. MALVALDI und F. TOZZINI (1995)
Feline Immunodeficiency virus: an interesting model for AIDS studies and an
important cat pathogen.
Clin. Microbiol. Rev. 8, 87-112
BERIN M. C., D. M. McKAY und M. H. PERDUE (1999)
Immune-epithelial interactions in host defense.
Am. J. Trop. Med.Hyg. 60 (Suppl. 4), 16-25
BISHOP P. E., A. McMILLAN und H. M. GILMOUR (1987)
Immunological study of the rectal mucosa of men with and without human
immunodeficiency virus infection.
Gut 28, 1619-1624
88
Literaturverzeichnis
BLAUVELT A., S. GLUSHAKOVA und L. B. MARGOLIS (2000)
HIV-infected human Langerhans cells transmit infection to human lymphoid tissue ex
vivo.
AIDS 14, 647-651
BLAUVELT A., H. ASADA, M. W. SAVILLE, V. KLAUS-KOVTUN, D. J. ALTMAN, R.
YARCHOA und S. I. KATZ (1997)
Productive infection of dendritic cells by HIV1 and their ability to capture virus are
mediated through separate pathways.
J. Clin. Investigation 100, 2043-2053
BOMSEL M. (1997)
Transcytosis of infectious human immunodeficiency virus across a tight human
epithelial cell line barrier.
Nature Med. 3, 42-47
BORSCH G. (1984)
Der Gastrointestinaltrakt als Immunorgan: Das darmassoziierte Immunsystem.
Klin. Wochenschr. 62, 699-709
BOURINBAIAR A. S. und D. M. PHILLIPS (1991)
Transmission of human immunodeficiency virus from monocytes to epithelia.
J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 4, 56-63
BRANDTZAEG P. und K. BJERKE (1990)
Immunomophological characteristics of human Peyer´s Patches.
Digestion 46 (Suppl. 2), 262-273
BROOKE A., W. DROMMER, F.-J. KAUP, H. ROBENEK, U. TRUYEN, I.
GREISRER-WILKE und O.-R. KAADEN (1994)
Demonstration of Sindbis virus antigen in Lowicryl-embedded cultured cells by
immunogold staining.
J. Vet. Med. B 41, 35-41
Literaturverzeichnis
89
BRORSON S.-H. (1997)
Bovine serum albumin (BSA) as a reagent against non-specific immunogold labeling
on LR-White and epoxy resin.
Micron 28, 189-195
BRÜGMANN M. (1994)
Retinadegenerationen des Pferdes und Expression des sauren Gliafaserproteins in
der equinen Retina.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
BURKL M. (1957)
Mikroskopische Anatomie des Ösophagus, des Magens und des Darmes; Aufbau der
Darmwand.
In: HOFER, SCHULTZ und STARCK (Hrsg.): Primatologia.
Basel und New York, Band III/1, 272-375
BURTON G. F., A. MASUDA, S. L. HEALTH, B. A. SMITH, J. G. TEW und A. K.
SZAKAL (1997)
Follicular dendritic cells (FDC) in retroviral infection: host/pathogen perspectives.
Immunol. Rev. 156, 185-197
BUTOR C., A. COUEDEL-COURTEILLE, J.-G. GUILLET und A. VENET (1996)
Differential distribution of galactosylceramide,H antigen and carcinoembryonic
antigen in rhesus macaque digestive mucosa.
J. Histochem. Cytochem. 44, 1021-1031
CAMPBELL N., X. Y. YIO, L. P. SO, Y. LI und L. MAYER (1999)
The intestinal epithelial cell: processing and presentation of antigen to the mucosal
immune system.
Immunol. Rev. 172, 315-324
CAMPBELL R. S. F. und W. F. ROBINSON (1998)
The comparative pathology of lentiviruses.
J. Comp. Path. 119, 333-395
90
Literaturverzeichnis
CANTO-NOGUES C., S. JONES, R. SNGSTER, P. SILVERA, R. HULL, R. COOK,
G. HALL, B. WALKER, E. J. STOTT, D. HOCKLEY und N. ALMOND (2001)
In situ hybridisation and immunolabelling study of the early replication of simian
immunodeficiency virus (SIVmacJ5) in vivo.
J. Gen. Virol. 82, 2225-2234
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (2001)
The global HIV/AIDS epidemic, 2001.
Morb. Mort. Weekly Rep. 50, 434-440
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (1993)
From the Centers for Disease Control and Prevention. 1993 revised cassification
system for HIV infection and expanded surveillance case definition for AIDS among
adolescents and adults.
JAMA 269, 729-730
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (1987)
Classification system for human T-lymphotropic virus type III / lymphadenopathyassociated virus infections.
Morb. Mort. Weekly Rep. 35, 334-339
CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (1981)
Pneumocystis pneumonia – Los Angeles.
Morb. Mort. Weekly Rep. 30, 250-252
CHALIFOUX L. V., M. A. SIMON, D. R. PAULEY, J. J. MacKEY, M. S. WYAND und
D. J. RINGLER (1992)
Arteriopathy in macaques infected with simian immunodeficiency virus.
Lab. Invest. 67, 338-349
CHALIFOUX L. V., D. J. RINGLER, N. W. KING, P. K. SEHGAL, R. C.
DESROSIERS, M. D. DANIEL und N. L. LETVIN (1987)
Lymphadenopathy
in
macaques
immunodeficiency virus (SIV).
Am. J. Pathol. 128, 104-109
experimentally
infected
with
the
simian
Literaturverzeichnis
91
CLARK M. A., M. A. JEPSON, N. L. SIMMONS und B. H. HIRST (1994)
Preferential interaction of Salmonella typhimurium with mouse Peyer´s patch M cells.
Res. Microbiol. 145, 543-552
CLARK S. J., M. S. SAAG, W. D. DECKER, S. CAMPBELL-HILL, J. L.
ROBERTSON, P. J. VELDKAMP, J. C. KAPPES, B. H. HAHN und G. M. SHAW
(1991)
High titers of cytopathic virus in plasma of patients with symptomatic primary HIV-1
infection.
N. Engl. J. Med. 324, 954-960
CLAYTON F., D. P. KOTLER, S. K. KUWADA, T. MORGAN, C. STEPAN, J.
KUANG, J. LE und J. FANTINI (2001)
Gp120-induced Bob/GPR15 activation: a possible cause of human immunodeficiency
virus enteropathy.
Am. J. Pathol. 159, 1933-1939
CLAYTON F., G. SNOW, S. REKA und D. P. KOTLER (1997)
Selective depletion of rectal Lamina propria rather than lymphoid aggregate CD4
lymphocytes in HIV infection.
Clin. Exp. Immunol. 107, 288-292
CORNET B., E. DECROLY, D. THINES-SEMPOUX, J. M. RUYSSCHAERT und M.
VANDENBRANDEN (1992)
Properties of HIV membrane reconstituted from ist recombinant gp160 envelope
glycoprotein.
AIDS Res. Hum. Retroviruses 8, 1823-1831
DAAR E. S., T. MOUDGIL, R. D. MEYER und D. D. HO (1991)
Transient high levels of viremia in patients with primary human immunodeficiency
virus type 1 infection.
N. Engl. J. Med. 324, 961-964
92
Literaturverzeichnis
DANIEL M. D., Y. LI, Y. M. NAIDU, P. G. DURDA, D. K. SCHMIDT, C. D: TROUP, P.
D. SILVA, J. J. MacKEY, H. W. KESTLER, P. K. SEHGAL, N. W. KING, Y. OHTA, M.
HAYAMI und R. C. DESROSIERS (1988)
Simian immunodeficiency virus from African green monkey.
J. Virol. 62, 4123-4128
DANIEL M. D., N. L. LETVIN, N. W. KING, P. K. SEHGAL und R. D. HUNT (1985)
Isolation of T-cell tropic HTLV-III-like retrovirus from macaques.
Sience 228, 1201-1204
DANSCHER G. (1981)
Localisation of gold in biological tissue. A photochemical method for light and
electronmicroscopy.
Histochem. 71, 81-88
DAVIS I. C. und R. L. OWEN (1997)
The immunopathology of M cells.
Springer Semin. Immunopathol. 18, 421-448
DELEZAY O., N. YAHI, C. TAMALET, S. BAGHDIGUIAN, J.-A. BOUDIER und J.
FANTINI (1997)
Direct effect of type 1 human immunodeficiency virus (HIV-1) on intestinal epithelial
cell differentiation: relationship to HIV-1 enteropathy.
Virology 238, 231-242
DESROSIERS R. C. (1990)
The simian immunodeficiency virus.
Annu. Rev. Immunol. 8, 557-578
DESROSIERS R. C. und D. J. RINGLER (1989)
Use of simian immunodeficiency viruses for AIDS research.
Intervirology 30, 301-312
Literaturverzeichnis
93
DIDIER A. (2000)
Etablierung einer quantitativen kompetitiven PCR und RT-PCR zum Nachweis von
proviraler DNA und viraler RNA in Instestinalbiopsien SIV infizierter Rhesusaffen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
DIDIER A., H. PETRY, C. STAHL-HENNIG, M. SCHÄFER, U. ZEITZ, T.
SCHNEIDER, J. A. BOGA, K. MÄTZ-RENSING, K. HERRMANN und F.-J. KAUP
(2000)
Long-term follow-up study on SIV intestinal proviral load in rhesus macaques.
J. Med. Primatol. 29, 136-142
DIDIER A., K. MÄTZ-RENSING, E.-M. KUHN, E. RICHTER und F.-J. KAUP (1999)
A
case
of
intestinal
Mycobacterium
simiae
infection
in
an
SIV-infected
immunosuppressed rhesus monkey.
Vet. Pathol. 36, 249-252
DiSTEFANO M., A. FAVIA, L. MONNO, P. LOPALCO, O. CAPUTI, A. C.
SCARDIGNO, G. PASTORE, J. R. FIORE und G. ANGARANO (2001)
Intracellular and cell-free (infectious) HIV-1 in rectal mucosa.
J. Med. Virol. 5, 637-643
DOBBINS W. O. und W. M. WEINSTEIN (1985)
Electron microscopy of the intsestine and rectum in acquired immunodeficiency
syndrome.
Gastroenterology 88, 738-749
DOE W. F. (1989)
The intestinal immune system.
Gut 30, 1679-1685
EDWARDS P., A. WODAK, D. A. COOPER, I. L. THOMPSON und R. PENNY (1990)
The gastrointestinal manifestation of AIDS.
Aust. N. Z. J. Med. 20, 141-148
94
Literaturverzeichnis
EIDELMAN S. und D. LAGUNOFF (1972)
The morphology of the normal human rectal biopsy.
Human Pathology 3, 389-401
EMAU P., H. M. McCLURE, M. ISAHAKIA, J. G. ELSE und P. N. FULTZ (1991)
Isolation from sykes monkeys (Cercopithecus mitis) a lentivirus related to human and
simian immunodeficiency virus.
J. Virol. 65, 2135-2140
FACKLER O. T. und B. M. PETERLIN (2000)
Endocytic entry of HIV-1.
Curr. Biol. 10, 1005-1008
FARTHING M. J., M. P. KELLY und A. M. VEITCH (1990)
Recently recognised microbial enteropathies and HIV infection.
J. Antimicrob. Chemother. 37 (Suppl. B), 61-70
FORSTNER J. F. (1978)
Intestinal mucins in health and disease.
Digestion 17, 234-263
FOX C. H., K. TENNER-RACZ, P. RACZ, A. FIRPO, P. A. PIZZO und A. S. FAUCI
(1991)
Lymphoid germinal centers are reservoirs of human immunodeficiency virus type 1
RNA.
J. Infect. Dis. 164, 1051-7
FREY A., K. T. GIANNASCA, R. WELTZIN, P. J. GIANNASCA, H. REGGIO, W. I.
LENCER und M. R. NEUTRA (1996)
Role of the glycocalyx in regulating access of microparticles to apical plasma
membranes of intestinal epithelial cells: Implications for microbial attachment and oral
vaccine targeting.
J. Exp. Med. 184, 1045-1059
Literaturverzeichnis
95
FRIEDLAND G. H.und R. S. KLEIN (1987)
Transmission of the human immunodeficiency virus.
N. Eng. J. Med. 317, 1125-1135
FUJIMURA Y. und R. L. OWEN (1996)
M cells as portals of infection: clinical and pathophysiological aspects.
Infect. Agents Dis. 5, 144-156
FUJIMURA Y., M. HOSBOE und T. KIHARA (1992)
Ultrastructural study of M cells from colonic lymphoid nodules obtained by
colonoscopic biopsy.
Dig. Dis. Sciences 37, 1089-1098
FULTZ P. N., R. SCHWIEBERT und J. STALLWORTH (1995)
AIDS-like disease following mucosal infection of pig-tailed macaques with
SIVsmmPBJ14.
J. Med. Primatol. 24, 102-107
GAO F., E. BAILES, D. L. ROBERTSON, Y. CHEN, C. M. RODENBURG, S. F.
MICHAEL, L. B. CUMMINS, L. O. ARTHUR, M. PEETERS, G. M. SHAW, P. M.
SHARP und B. H. HAHN (1999)
Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes.
Nature 397, 436-441
GARDNER M. B (1996)
The history of simian AIDS.
J. Med. Primatol. 25, 148-157
GEBERT A., M. GÖKE, H. J. ROTHKÖTTER und Chr. F. DIETRICH (2000)
Mechanismen der Antigenaufnahme im Dünn- und Dickdarm: die Rolle der M-Zellen
für die Initiierung von Immunantworten.
Z. Gastroenterol. 38, 855-872
96
Literaturverzeichnis
GEIJTENBEEK T. B., G. KOOPMAN, G. C. VanDUIJNHOFEN, S. J. VanVLIET, A.
C. VanSCHINDEL, A. ENGERING, J. L. HEENEY und Y. VanKOOYK (2001)
Rhesus macaques and chimanzee DC-SIGN act as HIV/SIV gp120 trans-receptors,
similar to human DC-SIGN.
Immunol. lett. 79, 101-107
GEIJTENBEEK T. B., D. S. KWON, R. TORENSMA, S. J. VanVLIET, G. C.
VanDUIJNHOVEN, J. MIDDel, I. L. CORNELISSEN, H. S. NOTTET, V. N. KEWALRAMANI, D. R. LITTMAN, C. G. FIGDOE und Y. VanKOOYK (2000)
DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection
of T cells.
Cell 100, 587-597
GELDERBLOM H R., E. H. S. HAUSMANN, M. ÖZEL, G. PAULI und M. A. KOCH
(1987)
Fine structure of HIV and immunolocalization of structural proteins.
Virology 156, 171-176
GERETTI A. M. (1999)
Simian immunodeficiency virus as a model of human HIV disease.
Rev. Med. Virol. 9, 57-67
GERETTI A. M., E. HULSKOTTE und A. D. OSTERHAUS (1989)
Cytotoxic T lymphocytes in AIDS pathogenesis: lessons to be learned from the
macaque model of simian immunodeficiency virus infection.
J. Gen. Virol. 79, 415-421
GOCHT A. (1992)
Use of LR-White Resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue.
Acta Nat. 145, 327-339
GOLDMAN H. und D. A. ANTONIOLI (1982)
Mucosal biopsy of the rectum, colon, and distal ileum.
Hum. Path. 13, 981-1012
Literaturverzeichnis
97
GOTTLIEB M. A., R. SCHROFF, H. M. SCHANIER, J. D. WEISMANN, P. T. FAN, R.
A. WOLF und A. SANYON (1981)
Pneumocystis carnii pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy
homosexual men: evidence for a new acquired cellular immunodeficiency.
N. Eng. J. Med. 114, 1426-1431
GRÄBER M. B. und G. W. KREUTZBERG (1985)
Immunogold staininig (IGS) for electron microscopical demonstration of glial fibrillary
(GFA) protein in LR-White embedded tisue.
Histochem. 83, 497-500
GRANELLI-PIPERNO A., E. DELGADO, V. FINKEL, W. PAXTON und R. M.
STEINMAN (1998)
Immature dendritic cells selectively replicate macrophagetropic (M-tropic) human
immunodeficiency virus type 1, while mature cells efficiently transmit both M- and Ttropic virus to T cells.
J. Virol. 72, 2733-2737
GRAZIOSI C., G. PANTALEO, L. BUTINI, J. F. DEMAREST, M. S. SAAG, G. M.
SHAW und A. S. FAUCI (1993)
Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) DNA and RNA synthesis
during primary HIV-1 infection.
AIDS 7 (Suppl. 2), S53-S58
GREENSON J. K., P. C. BELITSOS, J. H. YARDLEY und J. G. BARTLETT (1991)
AIDS enteropathy: occult enteric infections and duodenal mucosal alterations in
chronic diarrhea.
Ann. Intern. Med. 114, 366-372
GREWE C., A. BECK und H. R. GELDERBLOM (1990)
HIV: early virus-cell interactions.
J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 3, 965-974
98
Literaturverzeichnis
GRIFFIN G. E. (1993)
The intestine and human immunodeficiency virus.
J. Med. Microbiol. 38, 1-2
GRUTZKAU A., C. HANSKI und M. NAUMANN (1993)
Comparative study of histopathological alterations during intestinal infection of mice
with pathogenic and non-pathogenic strains of Yersinia enterocolitica serotype O:8.
Virch. Arch. A., Pathol. Anat. Histopathol. 423, 97-103
GRUTZKAU A., C. HANSKI, H. HAHN und E. O. RIECK (1990)
Involvement of M cells in the bacterial invasion of Peyer´s patches: a common
mechanism shared by Yersinia enterocolitica and other enteroinvasive bacteria.
Gut 31, 1011-1015
HACKER G. W., W. H. MUSS, C. HAUSER-KRONBERGER, G. DANSCHER, R.
RUFNER, J. GU, H. SU, A. ANDREASEN, M. STOLTENBERG und O. DIETZE
(1996)
Electron microscopical autometallography: Immunogold-Silver staining (IGSS) and
Heavy-Metal histochemistry.
Methods 10, 257-269
HAHN B. H., G. M. SHAW, K. M. DeCOCK und P. M. SHARP (2000)
AIDS as a zoonosis: scientific and public health implications.
Science 287, 607-614
HAMILTON S. R. (1984)
Structure of the colon.
Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 93, 13-23
HANNIG H., K. MÄTZ-RENSING, E. M. KUHN, C. STAHL-HENNIG, F.-J. KAUP, G.
HUNSMANN und W. BODEMER (1997)
Cytokine gene transcription in simian immunodeficiency virus and human
immunodeficiency virus-associated non-Hodgkin Lymphomas.
AIDS Res. Hum. Retroviruses 13, 1589-1596
Literaturverzeichnis
99
HAROUSE J. M., A. GETTIE, T. ESHETU, R. C. HOW TAN, R. BOHM, J.
BLANCHARD, G. BASKIN und C. CHENG-MAYER (2001)
Mucosal transmission and induction of simian AIDS by CCR5-specific simian/human
immunodeficiency virus SHIV(SF162P3).
J. Virol. 75, 1990-1995
HAROUSE J. M., R. C. TAN, A. GETTIE, P. DAILEY, P. A. MARX, P. A. LUCIW und
C. CHENG-MAYER (1998)
In vitro infection of primate PBMC with simian/human immunodeficiency virus SHIV
(SF 33A): correlation to in vivo outcome.
J. Med. Primatol. 27, 81-86
HEISE C., C. J. MILLER, A. LACKNER und S. DANDEKAR (1994)
Primary acute simian immunodeficiency virus infection of intestinal lymphoid tissue is
associated with gastrointestinal dysfunction.
J. Infect. Dis. 169, 1116-1120
HEISE C., P. VOGEL, C. J. MILLER, C. H. HALSTED und S. DANDEKAR (1993a)
Simian immunodeficiency virus infection of the gastrointestinal tract of rhesus
macaques. Functional, pathological and morphological changes.
Am. J. Pathology 142, 1759-1771
HEISE C., P. VOGEL, C. J. MILLER, A. LACKNER und S. DANDEKAR (1993b)
Distribution of SIV infection in the gastrointestinal tract of rhesus macaques at early
and terminal stages of AIDS.
J. Med. Primatol. 22, 187-193
HEPPNER L. F., A. D. CHRIST, M. A. KLEIN, M. PRINZ, M. FRIED, J.-P.
KRAEHENBUHL und A. AGUZZI (2001)
Transepithelial prion transport by M cells.
Nature Medicine 7, 976-977
100
Literaturverzeichnis
HERRMANN K. (1997)
Morphologie des rektalen GALT-Systems bei Rhesusaffen und Nachweis retroviralen
Antigens an endoskopisch entnommenen Probeexcissionen im Infektionsverlauf SIVinfizierter Rhesusaffen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
HERSHBERG R. M. und L. F. MAYER (2000)
Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells – polarity and
complexity.
Immunol. Today 21, 123-128
HEYMAN M. und J.-F. DESJEUX (1996)
Antigen handling by intestinal epithelial cells.
in Antigen presentation by intestinal epithelial cells, Ed. D. KAISERLIAN, Springer
R.G. Landes Company
HIMATHONGKHAM S., N. S. HALPIN, J. LI, M. W. STOUT, C. J. MILLER und P. A.
LUCIW (2000)
Simian-human immunodeficiency virus containing a human immunodeficiency virus
type 1 subtype-E envelope gene: persistent infection, CD4+ T-cell depletion, and
mucosal membrane transmission in macaques.
J. Virol. 74, 7851-7860
HIRSCH M. S. und J. CURRAN (1996)
Human Immunodeficiency Viruses.
in FIELDS Virology Eds. B. N. FIELDS, D. M. KNIPE, P. M. HOWLEY et al.
Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1960, 1953-1975
HIRSCH V. M., G. DAPOLITO, R. GOEKE und B. J. CAMPBELL (1995)
Phylogeny and natural history of the primate lentiviruses, SIV and HIV.
Curr. Op. Gen. Dev. 5, 798-806
Literaturverzeichnis
101
HOCINI H. und M. BOMSEL (1999)
Infectious human immunodeficiency virus can rapidly penetrate a tight human
epithelial barrier by transcytosis in a process impaired by mucosal immunoglobulins.
J. Inf. Dis. 179, S448-S453
HOLTERMAN L., H. NIPHUIS, W. KOORNSTRA, R. DUBBES, P. TenHAAFT und J.
L. HEENEY (2000)
The rate of progression to AIDS is independent of virus dose in simian
immunodeficiency virus-infected macaques.
J. Gen. Virol. 81, 1719-1726
HÜNERBEIN P. (1997)
Morphologische Methoden zum Nachweis von SIV und ihre Anwendungen in
Zellkultur und Gewebe von experimentell infizierten Rhesusaffen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
HÜNERBEIN P., E.-M. KUHN, K. MÄTZ-RENSING, C. STAHL-HENNIG, H. PETRY,
W. BODEMER, G. HUNSMANN und F.-J. KAUP (1994)
SIV-induzierte Riesenzellbildungen bei Rhesusaffen (M. mulatta).
AIFO 2, 604
IGARASHI T., C. R. BROWN, Y. ENDO, A. BUCKLER-WHITE, R. PLISHKA, N.
BISCHOFBERGER, V. HIRSCH und M. A. MARTIN (2001)
Macrophage are the principal reservoir and sustain high virus loads in rhesus
macaques after the depletion of CD4+ T cells by a highly pathogenic simian
immunodeficiency virus / HIV type 1 chimera (SHIV): Implications for HIV-1 infections
of humans.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 658-663
JACKSON S., Z. MOLDOVEANU, J. MESTECKY, A. M. PITTS, J. H. ELDRIDGE, J.
R. McGHEE, C. J. MILLER und P. A. MARX (1995)
Decreased IgA-producing cells in the gut of SIV-infected rhesus monkeys.
Advances in Mucosal Immunology, Ed. J. MESTECKY et al., Plenum Press, New
York, 1035-1038
102
Literaturverzeichnis
JAMESON B., F. BARIBAUD, S. POHLMANN, D. GHAVIMI, F. MORTARI, R. W.
DOMS und A. IWASAKI (2002)
Expression of DC-SIGN by dendritic cells of intestinal and genital mucosae in
humans and rhesus macaques.
J. Virol. 76, 1866-1875
JANOFF E. N. und P. D. SMITH (2001)
Emerging concepts in gastrointestinal aspects of HIV-1 pathogenesis and
management.
Gastroenterol. 120, 607-621
JOAG S. V., I. ADANY, Z. LI, L. FORESMAN, D. M. PINSON, C. WANG, E. B.
STEPHENS, R. RAGHAVAN und O. NARAYAN (1997)
Animal model of mucosally transmitted human immunodeficiency type 1 disease:
intravaginal and oral deposition of simian/human immunodeficiency virus in
macaques results in systemic infection, elimination of CD4+ T cells, and AIDS.
J. Virol. 71, 4016-4023
JONES B. D., N. GHORI und S. FALKOW (1994)
Salmonella typhimurium initiates murine infection by penetrating and destroying the
specialized epithelial M cells of the Peyer´s patches.
J. Exp. Med. 180, 15-23
KAAYA E., S.-L. LI, H. FEICHTINGER, I. STAHMER, P. PUTKONEN, E.
MANDACHE, E. MGAYA, G. BIBERFELD und P. BIBERFELD (1993)
Accessory cells and macrophages in the histopathology of SIVsm-infected
cynomolgus monkeys.
Res. Virol. 144, 81-92
KAHNT K., K. MÄTZ-RENSING, P. HOFMANN, C. STAHL-HENNIG und F. J. KAUP
(2002)
SIV-associated lymphomas in rhesus monkeys (macaca mulatta) in comparison with
HIV-associated lymphomas.
Vet. Pathol. 39, 42-55
Literaturverzeichnis
103
KAHNT K. J. (2001)
SIV-assoziierte Lymphome bei Rhesusaffen (Macaca mulatta).
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
KAUP F.-J., J. A. BOGA, S. F. BRUNO, A. DIDIER, K. HERMANN, P. HOFMANN, K.
MÄTZ-RENSING und C. STAHL-HENNIG (2001)
Immunohistochemical detection of simian immunodeficiency virus (SIV) in rectal
mucosa of experimentally infected rhesus macaques (Macaca mulatta).
Acta Histochem. 103, 79-88
KAUP F.-J., K. MÄTZ-RENSING, E. M. KUHN, P. HÜNERBEIN, C. STAHL-HENNIG
und G. HUNSMANN (1998)
Gastrointestinal pathology in rhesus monkeys with experimental SIV infection.
Pathobiol. 66, 159-164
KAUP F.-J., E. M. KUHN, B. MAKOSCHEY und G. HUNSMANN (1994a)
Cryptosporidiosis of liver and pancreas in rhesus monkeys with experimental SIV
infection.
J. Med. Primatol. 23, 304-308
KAUP F.-J., E. M. KUHN, K. MÄTZ-RENSING, B. MAKOSCHEY und C. STAHLHENNIG (1994b)
Opportunistische
Infektionen
am
Gastrointestinaltrakt
bei
SIV-infizierten
Rhesusaffen.
Verh. Ber. Erkrg. Zootiere 36, 217-224
KENT K. A., L. GRITZ, G. STALLARD, M. P. CRANAGE, C. COLLIGNON,
C.THIRIART, T. CORCORAN, P. SILVERA und E. J. STOTT (1991)
Production of monoclonal antibodies to simian immunodeficiency virus envelope
glykoproteins.
AIDS 5, 829-836
104
Literaturverzeichnis
KERNEIS S., A. BOGDANOVA, J. P. KRAEHENBUHL und E. PRINGAULT (1997)
Conversion by peyer´s pathc lymphocytes of human enterocytes into M cells that
transport bacteria.
Science 277, 949-952
KEWENIG S., SCHNEIDER T., HOHLOCH K., LAMPE-DREYER K., ULLRICH R.,
STOLTE N., STAHL-HENNIG C., KAUP F.-J., STALLMACH A. und ZEITZ M. (1999)
Rapid mucosal CD4+ T-cell depletion and enteropathy in simian immunodeficiency
virus-infected rhesus macaques.
Gastroenterol. 116, 1115-1123
KING N. W. (1993)
Simian immunodeficiency virus infections.
in Nonhuman Primates I, Eds. JONES T. C. et al., Springer-Verlag Berlin,
Heidelberg, New York, 5-20
KING N. W., L. V. CHALIFOUX, D. J. RINGLER, M. S. WYAND, P. K. SEHGAL, M.
D. DANIEL, N. L. LETVIN, R. C. DESROSIERS, B. J. BLAKE und R. D. HUNT (1990)
Comparative biology of natural and experimental SIVmac infection in macaque
monkeys: a review.
J. Med. Primatol. 19, 109-118
KLUMPP S. A., F. J. NOVEMBRE, D. C. ANDERSON, M. A. SIMON, D. J. RINGLER
und H. M. McCLURE (1993)
Clinical and pathologic findings in infant rhesus macaques infected with SIVsmm by
maternal transmission.
J. Med. Primatol. 22, 169-176
KNOX T. A., D. SPIEGELMAN, S. C. SKINNER und S. GORBACH (2000)
Diarrhea and abnormalities of gastrointestinal function in a cohort of men and women
with HIV infection.
Am. J. Gastroenterol. 95, 3482-3489
Literaturverzeichnis
105
KOTLER D. P., S. REKA, A. BORCICH und W. J. CRONIN (1991)
Detection, localization and quantitation of HIV-associated antigens in intestinal
biopsies from patients with HIV.
Am. J. Pathol. 139, 823-830
KRAEHENBUHL J. P. und M. R. NEUTRA (2000)
Epithelial M cells: Differentiation and function.
An. Rev. Cell Dev. Biol. 16, 301-331
KUHN E. M., N. STOLTE, K. MÄTZ-RENSING, C. STAHL-HENNIG, G. HUNSMANN
und F.-J. KAUP (1999)
Immunohistochemical studies of productive rhesus cytomegalovirus infection in
rhesus monkeys (Macaca mulatta) infected with simian immunodeficiency virus.
Vet. Pathol. 36, 51-56
KUHN E. M., K. MÄTZ-RENSING K., C. STAHL-HENNING, B. MOKOSCHEY, G.
HUNSMANN und F.-J. KAUP (1997)
Intestinal manifestations of experimental SIV-infection in rhesus monkeys (Macaca
mulatta): A histological and ultrastructural study.
J. Vet. Med. B 44, 501-512
KUHN E. M. (1995)
Intestinale Alterationen bei SIV-infizierten Rhesusaffen (Macaca mulatta).
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
KUHN E. M. und F.-J. KAUP (1994)
Ultrastructural characteristics of the ileal Peyer´s patches in the rhesus macaque.
ICEM 13, 1109-1110
KULLER L., R. E. BENVENISTE, C. C. TSAI, E. A. CLARK, P. POLACINO, R.
WATANABE, J. OVERBAUGH, M. G. KATZE und W. R. MORTON (1994)
Intrarectal inoculation of macaques by the simian immunodeficiency virus, SIVmne
E11S: CD4+ depletion and AIDS.
J. Med. Primatol. 23, 397-409
106
Literaturverzeichnis
LACKIE P. M., R. J. HENNESSY, G. W. HACKER und J. M. POLAK (1985)
Investigation of immunogold-silver staining by electron microscopy.
Histochem. 83, 545-550
LACKNER A. A. (1994)
Pathology of simian immunodeficiency induced disease.
In: N. L. LETVIN u. R. C. DESROSIERS (Hrsg.): Simian immunodeficiency virus.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, S. 35-64
LANSKA D. J. (1999)
Epidemiology of human immunodeficiency virus infection and associated neurologic
illness.
Sem. Neurol. 19, 105-111
LEFEVRE M. E., A. M. BOCCIO und D. D. JOEL (1979)
Macrophages of the mammalian small intestine: a review.
J. Reticuloendothel. Soc. 26, 553-573
LeGRAND R., M. NADAL, A. CHERET, P. ROQUES, B. VASLIN, F. MATHEUX, F.
THEODORO, G. GRAS, L. GAUTHIER und A. M. AUBERTIN (1995)
Infection of macaques after vaginal exposure to a primary isolat of SIVmac251.
AIDS 9, 308-309
LETVIN N. L. und N. W. KING (1990)
Immunologic and pathogenetic manifestation of the infection of rhesus monkeys with
SIVmac.
J. AIDS 3, 1023-1040
LEVY J. A., W. MARGARETTEN und J. NELSON (1989)
Detection of HIV in enterochromaffin cells in the rectal mucosa of an AIDS patient.
Am. J. Gastroenterol. 84, 787-789
LI L., G. MENG, M. F. GRAHAM, G. M. SHAW und P. D. SMITH (1999)
Intestinal macrophages display reduced permissiveness to human immunodeficiency
virus 1 and decreased surface CCR5.
Gastroenterol. 116, 1043-1053
Literaturverzeichnis
107
LI J. T., M. HALLORGAN, C. I. LORD, A. WATSON, J. RANCHALIS, M. FUNG, N. L.
LETVIN und J. G. SODROSKI (1995)
Persitent infection of macaques with simian-human immunodeficiency viruses.
J. Virol. 69, 7061-7071
LIU H., Y. SODA, N. SHIMIZU, Y. HARAGUCHI, A. JINNO, Y. TAKEUCHI und H.
HOSHINO (2000)
CD4-dependent and CD4-independent utiliziation of coreceptors by human
immunodeficiency virus type 2 and simian immunodeficiency virus.
Virol. 278, 276-288
LORIAN V. (1988)
AIDS, anal sex and heterosexuals.
The Lancet 1, 1111
LU Y., C. D. PAUZA, X. LU, D. C. MONTEFIORI und C. J. MILLER (1998)
Rhesus macaques that become systemically infected with pathogenic SHIV 89.6-PD
after intravenous, rectal, or vaginal inoculation and fail to make an antiviral antibody
response rapidly develop AIDS.
J. Acquir. Immune Defic. Synd. 19, 6-18
LUFT J. H. (1961)
Improvements in epoxy resin embedding methods.
J. Biophys. Biochem. Cytol. 9, 409-414
MADARA J. L. (1997)
The chameleon within: improving antigen delivery.
Science 277, 910-911
MÄTZ-RENSING K., E.-M. JUHN, P. HÜNERBEIN, C. STAHL-HENNIG und F.-J.
KAUP (1995)
Primäre und sekundäre Lungenalterationen bei SIV infizierten Rhesusaffen.
Verh. Ber. Erkrg. Zootiere 37, 121-128
108
Literaturverzeichnis
MASCOLA J. R., S. SCHLESINGER FRANKEL und K. BROLIDEN (2000)
HIV-1 entry at the mucosal surface: role of antibodies in protection.
AIDS 14 (Suppl. 3), 167-174
MASUR H., M. A. MICHAELIS und J. B. GREENE (1981)
An outbreak of community-acquired Pneumocystis carnii pneumonia.
N. Engl. J. Med. 305, 1431-1438
MATAPALLIL J. J., Z. SMIT-McBRIDE, M. McCHESNEY und S. DANDEKAR (1998)
Intesstinal intraepithelial lymphocytes are primed for gamma interferon and MIP-1β
expression and display antiviral cytotoxic activity despite severe CD4+ T-cell
depletion in primary simian immunodeficiency virus infection.
J. Virol. 72, 6421-6429
MAYER L. (2000)
Mucosal immunity and gastrointestinal antigen processing.
J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30 (Suppl.), S4-S12
McCLURE H. M., D. C. ANDERSON, P. N. FULTZ, A. A. ANSARI, E. LOCKWOOD
und A. BRODIE (1989)
Spectrum of disease in macaque monkeys chronically infected with SIV/smm.
Vet. Immunol. Immunpathol. 21, 13-24
MILLER C. J., N. J. ALEXANDER, P. VOGEL, J. ANDERSON und P. A. MARX
(1992)
Mechanism of genital transmission of SIV: A hypothesis based on transmission
studies and the localisation of SIV in the genital tract of chronically infected female
rhesus macaques.
J. Med. Primatol. 21, 64-68
MILLER C. J., N. J. ALEXANDER, S. SUTJIPTO, S. M. JOYE, A. G. HENDRICKX,
M. JENNINGS und P. A. MARX (1990)
Effect of virus dose and nonxynol-9 on genital transmission of SIV in rhesus
macaques.
J. Med. Primatol. 19, 401-409
Literaturverzeichnis
109
MILLER C. J., N. J. ALEXANDER, S. SUTJIPTO, A. A. LACKNER, A. GETTIE, A. G.
HENDRICKX, L. J. LOWENSTINE, M. JENNINGS und P. A. MARX (1989)
Genital mucosal transmission of simian immunodeficiency virus: animal model for
heterosexual transmission of human immunodeficiency virus.
J. Virol. 63, 4277-4284
MONKEMULLER K. E., A. H. BUSSIAN, A. J. LAZENBY und C. M. WILCOX (2000)
Special histologic stains are rarely beneficial for the evaluation of HIV-related
gastrointestinal infections.
Am. J. Clin. Pathol. 114, 387-394
MOORE J. P., J. A. McKEATING, W. A. NORTON und Q. J. SATTENTAU (1991)
Direct measurement of soluble CD4 binding to human immunodfeociency virus type
1 virions: gp120 dissociation and its implications for virus-cell binding and fusion
reactions and their neutralization by soluble CD4.
J. Virol. 65, 1133-1140
MUNCH R. (1997)
Intestinal diseases in HIV-infection.
Schweizer Rundsch. Med. Prax. 86, 1151-1153
NELSON J. A., C. A. WILEY, C. REYNOLDS-KOHLER, C. E. REESE, W.
MARGARETTEN und J. A. LEVY (1988)
Human Immunodeficiency virus detected in bowel epithelium from patients with
gastrointestinal symptoms.
The Lancet 1, 259-262
NEUTRA M. R. (1999)
Interactions of viruses and microparticles with apical plasma membranes of M cells:
implications for human immunodeficiency virus transmission.
J. Inf. Dis. 179 (Suppl 3), 441-443
110
Literaturverzeichnis
NEUTRA M. R., N. J. MANTIS, A. FREY und P. J. GIANNASCA (1999)
The composition and function of M cell apical membranes: Implications for microbial
pathogenesis.
Sem. Immunol. 11, 171-181
NEUTRA M. R. (1998)
Current concepts in mucosal immunity V. Role of M cells in transepithelial transport
of antigens and pathogens to the mucosal immune system.
AJP – Gastrointestinal and Liver Physiology 274, G785-G791
NEWMAN G. R. und J. A. HOBOT (1987)
Modern acrylics for post-embedding immunostaining techniques.
J. Histochem. Cytochem. 35, 971-981
NEWMAN G. R., B. JASANI und E. D. WILLIAMS (1983)
A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens
under the electron microscope.
Histochem. J. 15, 543-555
NICOL I., D. MESSINGER, P. DUBOUCH, J. BERNARD, I. DESPORTES, R.
JOUFFRE, R. SNART, P. NARA, R. C. GALLO und D. ZAGURY (1989)
Use of old world monkeys for acquired immunodeficiency syndrome research.
J. Med. Primatol. 18, 227-236
NICOLETTI C. (2000)
Unsolved mysteries of intestinal M cells.
Gut 47, 735-739
NOLL S. und S. SCHAUB-KUHNEN (2000)
Praxis der Immunhistochemie.
Urban & Fischer Verlag, München, 114-118 und 96-101
Literaturverzeichnis
111
OLOFINLADE O., O. ADEONIGBAGBE, M. KAROWE, J. ROBILOTTI, N.
GUALTIER, A. CACCIARELLI, I. BERLIN und C. GUERRIERI (2000)
The diagnostic value of electron microscopy in human immunodeficiency viruspositive patients with gastrointestinal disease.
Scand. J. Gastroenterol. 35, 329-332
OSBORN K. G., S. PRAHALADA, L. J. LOWENSTINE, M. B. GARDNER, D. H.
MAUL und R. V. HENRICKSON (1984)
The pathology of an epizootic of acquired immunodeficiency in rhesus macaques.
Am. J. Pathol. 114, 94-103
OWEN R. L. (1998)
M cells as portals of entry for HIV.
Pathobiol. 66, 141-144
OWEN R. L., N. F. PIERCE, R. T. APPLE und W. C. CRAY Jr. (1986)
M cell transport of vibrio cholerae from the intestinal lumen into peyer´s patches: a
mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration.
J. Infect. Dis. 253, 1108-1118
OWEN R. L. (1977)
Sequential uptake of horseradish peroxidase by lymphoid follicle epithelium of
peryer´s patches in the normal unobstructed mouse intestine: An ultrastructural
study.
Gastroenterol. 72, 440-451
OWEN R. L. und A. L. JONES (1974)
Epithelial cell specialization within human peyer´s patches: An ultrastructural study of
intestinal lymphoid follicles.
Gastroenterol. 66, 189-203
PABST R. (1987)
The anatomical basis for the immune function of the gut.
Anat. Embryol. 176, 135-144
112
Literaturverzeichnis
PANTALEO G. und A. S. FAUCI (1996)
Immunopathogenesis of HIV infection.
Annu. Rev. Microbiol. 50, 825-854
PANTALEO G., M. VACCAREZZA, C. GRAZIOSI, O. J. COHEN und A. S. FAUCI
(1996)
Antiviral immunity in HIV-1 infected long-term non-progressors (LTNPs).
Sem. Virol. 7, 131-138
PANTALEO G., C. GRAZIOSI, F. J. DEMAREST, L. BUTINI, M. MONTRONI, C. H.
FOX, J. M. ORENSTEIN, D. P. KOTLER und A. S. FAUCI (1994)
Role of lymphoid organs in the pathogenesis of human immunodeficiency virus (HIV)
infection.
Immunol. Rev. 140, 106-130
PAUZA C. D., P. EMAU, M. S. SALVATO, P. TRIVEDI, D. MacKENZIE, M.
MALKOVSKY, H. UNO und K. T. SCHULTZ (1993)
Pathogenesis of SIVmac251 after atraumatic inoculation of the rectal mucosa in
rhesus monkeys.
J. Med. Primatol. 22, 154-161
PEETERS M., K. FRANSEN, E. DELAPORTE, M. Van Den HAESVELDE, G.-M.
GERSHY-DAMET, L. KESTENS, G. Van Der GROEN und P. PIOT (1992)
Isolation
and
characterization
of
a
new
chimpanzee
lentivirus
(simian
immunodeficiency virus isolate cpz-ant) from a wild-captured chimpanzee.
AIDS 6, 447-451
PEETERS M., C. HONORÉ, T. HUET, L. BEDJABAGA, S. OSCAR, P. BUSSI, R. W.
COOPER und E. DELAPORTE (1989)
Isolation and partial characterization of an HIV-related virus occuring naturally in
chimpanzees in Gaboon.
AIDS 3, 625-630
Literaturverzeichnis
113
PERDUE M. H. und D. M. McKAY (1994)
Integrativ immunophysiology in the intestinal mucosa.
Am. J. Physiol. 267, G151-G165
PIOT P., M. BARTOS, P. D. GHYS, N. WALKER und B. SCHWARTLADER (2001)
The global impact of HIV/AIDS.
Nature 410, 968-973
PITMAN R. S. und R. S. BLUMBERG (2000)
First line of defense: the role of the intestinal epthilium as an active component of the
mucosal immune system.
J. Gastroenterol. 35, 805-814
POLYANSKAYA N., L. A. BERGMEIER, S. A. SHARPE, N. COOK, S. LEECH, G.
HALL, M. DENNIS, P. TenHAAFT, J. HEENEY, F. MANCA, T. LEHNER und M. P.
CRANAGE (2001)
Mucosal exposure to subinfectious doses of SIV primes gut-associated antibodysecreting cells and T cells: Lack of enhancemet by noneutralizing antibody.
Virol. 279, 527-538
QUINN T. C. (1989)
The epidemiology of the acquired immune deficiency syndrome and the
immunological responses to the human immunodeficiency virus.
Curr. Op. Immunol. 1, 502-512
RAKOWICZ-SZULCZYNSKA E. M., B. JACKSON, A. M. SZULCZYNSKA und S.
McCLURE (1998)
Human immunodeficiency virus type 1-like DNA sequences and immunoreactive viral
particles with unique association with breast cancer.
Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5, 645-653
REDFIELD R. R., D. C. WRIGHT und E. C. TRAMONT (1986)
The Walter Reed staging classification for HTLV-1/LAV infection.
N. Eng. J. Med. 314, 131-132
114
Literaturverzeichnis
REEVES J. D., S. HIBBITTS, G. SIMMONS, A. McKNIGHT, J. M. AZEVEDOPEREIRA, J. MONIZ-PEREIRA und P. R. CLAPHAM (1999)
Primary human immunodeficiency type 2 (HIV-2) isolates infect CD4-negative cells
via CCR5 and CXCR4: comparison with HIV-1 and simian immunodeficiency virus
and relevance to cell tropism in vivo.
J. Virol. 73, 7795-7804
REIMANN K. A., A. WATSON, P. J. DAILEY, W. LIN, C. I. LORD, T. D.
STEENSBEKE, R. A. PARKER, M. K. AXTHELM und G. B. KARLSSON (1999)
Viral burden and disease progression in rhesus monkeys infected with chimeric
simian-human immunodeficiency viruses.
Virol. 256, 15-21
REIMANN K. A., J. T. LI, R.VEAZEY, M. HALLORAN, I.-W. PARK, G. B.
KARLSSON, J. SODROSKI und N. L. LETVIN (1996)
A chimeric simian/human immunodeficiency virus expressing a primary patient HIV-1
isolate env causes an AIDS-like disease after in vivo passage in rhesus monkeys.
J. Virol. 70, 6922-6928
REIMANN K. A., K. TENNER-RACZ, P. RACZ, D. C. MONTEFIORI, Y. YASUMOTI,
W. LIN, B. J. RANSIL und N. L. LETVIN (1994)
Immunopathogenic events in acute infection of rhesus monkeys with simian
immunodeficiency virus of macaques.
J. Virol. 68, 2362-2370
REINHART T. A., M. J. ROGAN, D. HUDDLESTON, D. M. RAUSCH, L. E. EIDEN
und A. T. HAASE (1997)
Simian immunodeficiency virus burden in tissues and cellular compartments during
clinical latency and AIDS.
J. Infect. Dis. 146, 1198-1208
Literaturverzeichnis
115
RESCIGNO M., M. URBANO, B. VALZASINA, M. FRANCOLINI, G. ROTTA, R.
BONASIO, F. GRANUCCI, J. P. KRAEHENBUHL und P. RICCARDI-CASTAGNOLI
(2001)
Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers
to sample bacteria.
Nat. Immunol. 2, 361-367
RICHARDSON K. C., L. JARETT und E. H. FINKE (1960)
Embedding in epoxy resins for ultrathin sectioning in electron microscopy.
Stain Techn. 35, 313-317
RINGLER D. J., M. S. WYAND, D. G. WALSH, J. J. MacKEY, L. V. CHALIFOUX, M.
POPOVIC, A. A. MINASSIAN, P. K. SEHGAL, M. D. DANIEL, R. C. DESROSIERS
und N. W. KING (1989)
Cellular localization of simian immunodeficiency virus in lymphoid tissues. I.
Immunohistochemistry and electron microscopy.
Am. J. Pathol. 134, 373-383
ROYCE R. A., R. S. LUCKMANN, R. E. FUSARO und W. WINKELSTEIN (1991)
The natural history of HIV-1 infection: staging classifications of disease.
AIDS 5, 355-364
SATO H., J. ORENSTEIN, D. DIMITROV und M. MARTIN (1992)
Cell-to-cell spread of HIV-1 occurs within minutes and may not involve the
participation of virus particles.
Virology 186, 712-724
SATTENTAU Q. J. und J. P. MOORE (1993)
The role of CD4 in HIV binding and entry.
Phil. Trans. R. Soc. London B 342, 59-66
116
Literaturverzeichnis
SCHÄFER F., S. KEWENIG, N. STOLTE, C. STAHL-HENNIG, A. STALLMACH, F.-J.
KAUP, M. ZEITZ und T. SCHNEIDER (2002)
Lack of simian immunodeficiency virus (SIV) specific IgA response in the intestine of
SIV infected rhesus macaques.
Gut 50, 608-614
SCHMIDT K., 2001
Neuropathologische Veränderungen bei SIV-infizierten Rhesusaffen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Dissertation
SCHULTE R., S. KERNEIS, S. KLINKE, H. BARTELS, S. PERGER, J. P.
KRAEHENBUHL, E. PRINGAULT und I. B. AUTENRIETH (2000)
Translocation of Yersinia enterocolitica across reconstituted intestinal epithelial
monolayers is triggered by Yersinia invasin binding to beta 1 integrins apically
expressed on M-like cells.
Cell Microbiol. 2, 173-185
SHAO L., D. SERRANO und L. MAYER (2001)
The role of epithelial cells in immune regulation in the gut.
Sem. Immunol. 13, 163-175
SHCHERBAKOV I. T., I. G. FRIDOVSKAIA, A. V. NOVIKOVA, I. I. DASHEVSKI und
V. I. LEVENSON (1988)
Structure of the mucous membrane of the distal part of the large intestine in the
monkey.
Arkh. Anat. Histol. Embriol. 94, 61-63
SICINSKI P., J. ROWINSKI, J. B. WARCHOL, Z. JARZABEK, W. GUT, B.
SZCZGIEL, K. BIELECKI und G. KOCH (1990)
Poliovirus type 1 enters the human host through intestinal M cells.
Gastroenterol. 98, 56-58
Literaturverzeichnis
117
SIMON M. A., L. V. CHALIFOUX und D. J. RINGLER (1992)
Pathologic features of SIV-induced disease and the association of macrophage
infection with disease evolution.
AIDS Res. Hum. Retroviruses 8, 327-337
SMIT-McBRIDE Z., J. J. MATAPALLIL, M. McCHESNEY, D. FERRICK und S.
DANDEKAR (1998)
Gastrointestinal T lymphocytes retain high potential for cytokine responses but have
severe CD4+ T-cell depletion at all stages of simian immunodeficiency virus infection
compared to peripheral lymphocytes.
J. Virol. 72, 6646-6656
SPIRA A. I., P. A. MARX, B. K. PATTERSON, J. MAHONEY, R. A. KOUP, S. M.
WOLINSKY und D. D. HO (1996)
Cellular targets of infection and route of viral dissemination after an intravaginal
inoculation of simian immunodeficiency virus into rhesus macaques.
J. Exp. Med. 183, 215-225
SPRENGER R., K.-M. TOELLNER, C. SCHMETZ, W. LÜKE, C. STAHL-HENNIG, M.
ERNST, G. HUNSMAN, H. SCHMITZ, H.-D. FLAD, J. GERDES und J. P. ZIMMER
(1995)
Follicular dendritic cells productively infected with immunodeficiency viruses transmitt
infection to T cells.
Med. Microbiol. Immunol. 184, 129-134
SPRING M., C. STAHL-HENNIG, T. NIßLEIN, C. LOCHER, D. FUCHS, W.
BODEMER, G. HUNSMANN und U. DITTMER (1998)
Suppression of viral replication in a long-term nonprogressing rhesus macaque
experimentally infected with pathogenic simian immunodeficiency virus (SIV).
Clin. Immunol. Immunpath. 87, 101-105
STOTT J. und N. ALMOND (1995)
Assesing animal models of AIDS.
Nature Med. 1, 295-297
118
Literaturverzeichnis
SUTHERLAND L. R., D. L. CHURCH, M. J. GILL, J. K. KELLY, W. S. HWANG und
H. E. BRYAN (1990)
Gastrointestinal function and structure in HIV-positive patients.
CMAJ 143, 64646
SWAGGERTY C. L., A. A. FROLOV, M. J. McARTHUR, V. W. COX, S. TONG, R. W.
COMPANS und J. M. BALL (2000)
The envelope glycoprotein of simian immunodeficiency virus contains an enterotoxin
domain.
Virol. 277, 250-261
TIDBALL C. S. (1971)
The nature of the intestinal epithelial barrier.
Dig. Dis. 16, 745-767
TIMMS B. G. (1986)
Postembedding immunogold labeling for electron microscopy using “LR white” resin.
Am. J. Anat. 175, 267-275
TRIVEDI P., D. HOREJSH, S. B. HINDS, P. W. HINDS II, M. S. WU, M. S. SALVATO
und C. D. PAUZA (1996)
Intrarectal transmission of simian immunodeficiency virus in rhesus macaques:
Selective amplification and host responses to transient or persistent viremia.
J. Virol. 70, 6876-6883
TRIVEDI P., K. K. MEYER, D. N. STREBLOW, B. L. PREUNINGER, K. T. SCHULTZ
und C.D. PAUZA (1994)
Selective amplification of simian immunodeficiency virus genotypes after intrarectal
inoculation of rhesus monkeys.
J. Virol. 68, 7649-7653
Literaturverzeichnis
119
TSUJIMOTO H., R. W. COOPER, T. KODAMA, M. FUKASAWA, T. MIURA, Y.
OHTA, K. ISHIKAWA, M. NAKAI, E. FROST und G. E. ROELANTS (1988)
Isolation and characterization of simian immunodeficiency virus from mandrills in
africa and its relationship to other human and simian immunodeficiency viruses.
J. Virol. 62, 4044-4050
ÜBERLA K., C. STAHL-HENNIG, D. BÖTTINGER, K. MÄTZ-RENSING, F.-J. KAUP,
J. LI, W. A. HASELTINE, B. FLECKENSTEIN, G. HUNSMANN, B.ÖBERG und J.
SODROSKI (1995)
Animal model for the therapy of acquired immunodeficiency syndrome with reverse
transcriptase inhibitors.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8210-8214
VAJDY M., R. VEAZEY, I. THAM, C. DeBAKKER, S. WESTMORELAND, M.
NEUTRA und A. LACKNER (2001)
Early immunologic events in mucosal and systemic lymphoid tissues after intrarectal
inoculation with simian immunodeficiency virus.
J. Inf. Dis. 184, 1007-1014
VAJDY M., R. S. VEAZEY, H. K. KNIGHT, A. A. LACKNER und M. R. NEUTRA
(2000)
Differential effects of simian immunodeficiency virus infection on immune inductive
and effector sites in the rectal mucosa of rhesus macaques.
Am. J. Pathol. 157, 485-495
VEAZEY R. S., M. C. GAUDIN, K. G. MANSFIELD, I. C. THAM, J. D. ALTMAN, J. D.
LIFSON, A. A. LACKNER und R. P. JOHNSON (2001)
Emergence and kinetics of simian immunodeficiency virus-specific CD8 (+) T-cells in
the intestine of macaques during primary infection.
J. Virol. 75, 10515-10519
120
Literaturverzeichnis
VEAZEY R. S., I. C. THAM, K. G. MANSFIELD, M. DeMARIA, A. E. FORAND, D. E.
SHVETZ, L. V. CHALIFOUX, P. K. SEHGAL und A. A. LACKNER (2000a)
Identifying the target cell in primary simian immunodeficiency virus (SIV) infection:
highly activated memory CD4(+) T cells are repidly eliminated in early SIV infection in
vivo.
J. Virol. 74, 57-65
VEAZEY R. S., K. G. MANSFIELD, I. C. THAM, A. C. CARVILLE, D. E. SHVETZ, A.
E. FORAND und A. LACKNER (2000b)
Dynamics of CCR5 expression by CD4+ T cells in lyphoid tissue during simian
immunodeficiency infection.
J. Virol. 74, 11001-11007
VEAZEY R. S., M. DeMARIA, L. V. CHALIFOUX, D. E. SHVETZ, D. R. PAULEY, H.
L. KNIGHT, M. ROSENZWEIG, R. P. JOHNSON, R. C. DESROSIERS und A. A.
LACKNER (1998)
Gastrointestinal tract as a major site of CD4+ T cell depletion and viral replication in
SIV infection.
Science 280, 427-431
WASSEF J. S., D. F. KEREN und J. L. MAILLOUX (1989)
Role of M cells in initial antigen uptake and in ulcer formation in the rabbit intestinal
loop model of shigellosis.
Infect. Immun. 57, 858-863
WEIBULL C. und A. CHRISTIANSSON (1986)
Extraction of proteins and membrane lipids during low temperature embedding of
biological material for electron microscopy.
J.Micrsoc. 142, 79-86
ZEITZ M., R. ULLRICH, T. SCHNEIDER, S. KEWENIG und E.-O. RIECKEN (1998a)
Mucosal immunodeficiency in HIV/SIV infection.
Pathobiol. 66, 151-157
Literaturverzeichnis
121
ZEITZ M., R. ULRICH, T. SCHNEIDER, S. KEWENIG, K. HOHLOCH und E.-O.
RIECKEN (1998b)
HIV/SIV enteropathy.
Ann. N. Y. Acad. Sci. 859, 139-148
ZHANG L., T. HE, A. TALAL, G. WANG, S. S. FRANKEL und D. D. HO (1998)
In vivo distribution of the human immunodeficiency virus/simian immunodeficiency
virus coreceptors: CXCR4, CCR3 and CCR5.
J. Virol. 72, 5035-5045
122
Anhang
9 Anhang
9.1 Histologiep rotokolle
9.1.1 Phosphatp uffer
Stammlösung A (0,2 M)
Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6346)
Aqua bidest.
27,6 g
ad 1000 ml
Stammlösung B (0,2 M)
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6580)
Aqua bidest.
35,6 g
ad 1000 ml
Die Stammlösungen jeweils bei Raumtemperatur auf einem Magnetrührgerät gut
lösen.
Gebrauchslösung (0,1 M; pH 7,4-7,6)
Stammlösung A
10 ml
Stammlösung B
40 ml
Aqua bidest.
50 ml
9.1.2 Gepufferte Glutaraldehydlösung (2,5%ig)
Aqua dest.
400 ml
25%iges Glutaraldehyd
100 ml
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 1.04239)
Phosphatpuffer Lösung A
100 ml
Phosphatpuffer Lösung B
400 ml
Anhang
123
9.2 Protokolle der elektronenmikroskopischen Präparation
9.2.1 Einbettung sprotokoll für Epon
•
Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4)
90 Minuten/4°C
(3 x 30 Minuten)
•
Nachfixieren in 1%iger Osmiumtetroxidlösung
in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,2)
•
Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4)
2 Stunden/4°C
90 Minuten/4°C
(3 x 30 Minuten)
•
•
Dehydrieren in einer aufsteigenden Äthanolreihe
30%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
50%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
70%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
90%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
100%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
100%iges Äthanol
15 Minuten/4°C
Isopropanol
15 Minuten/4°C
Infiltration mit Propylenoxid
30 Minuten/4°C
(2 x 15 Minuten)
•
Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2:1
1 Stunde/10°C
•
Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:1
2 Stunden/10°C
•
Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:2
4 Stunden/10°C
•
Infiltration mit reinem Epon
über Nacht/20°C
•
Infiltration mit reinem Epon
3 Stunden/20°C
124
Anhang
9.2.2 Fixierungsl ösung nach KARNOVSKY (1965)
3 %iges Paraformaldehyd (3 g Paraformaldehyd in 40 ml Aqua dest. lösen)
2,5 %iges Glutaraldehyd (10 ml 25%iges Glutaraldehyd)
0,1 M Phosphatpuffer (50 ml 0,2 M Phosphatpuffer pH 7,4)
Paraformaldehyd bei ca 60 °C lösen, am Ende ein paar Tropfen NaOH zum Klären
zugeben.
In folgender Reihenfolge Filtrieren und Zusammengießen:
1. Phosphatpuffer
2. filtriertes Glutaraldehyd
3. filtriertes PFA langsam zugeben
9.2.3 Eponmisch ung nach LUFT (1961)
Mischung A
Glycid ether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045)
71,3 g
DDSA (2-Dodecenylsuccinicacidanhydrid) (Fa. Serva,
Heidelberg, Nr. 20755)
115,0 g
auf dem Magnetrührer 1 h rühren
Mischung B
Glycid ether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 21045)
MNA (Methylenadicanhydrid) (Fa. Serva, Heidelberg, Nr. 29452)
100,0 g
89,0 g
auf dem Magnetrührer 1 h rühren
Mischungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen und 30 min rühren.
1,8% Beschleuniger DMP (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol, Fa. Serva.
Heidelberg, Nr. 36975) dazugeben und auf dem Magnetrührer 15 min rühren.
Anhang
125
9.2.4 Methylenbl aufärbung nach RICHARDSON (1960)
Lösung A
Azur II für die Lichtmikroskopie (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 9211)
1,0 g
in 100 ml Aqua dest. lösen
Lösung B
di-Natriumtetraborat p. a. (Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 6306)
1,0 g
in 100 ml Aqua dest. lösen
Methylenblau für die Lichtmikroskopie
(Fa. Merck, Darmstadt, Nr. 15943)
1,0 g
darin lösen
Lösungen A und B im Verhältnis 1:1 mischen und filtrieren.
Schnitte auf der Wärmebank (60°C) 1 min mit dieser Mischung färben.
9.3 Protokolle der immunelektronenmikroskopischen Präparation
9.3.1 Paraformal dehyd (4%ig) / Glutaraldehyd (0,25%ig) - Mischung (1:1)
4%iges Paraformaldehyd
(Fa. Riedel-de Haen, Seelze; Nr. 16.5, Ch.-Lot.: 02880)
490 ml
25%iges Glutaraldehyd
(Fa. Merck, Darmstadt; Nr. 4239)
10 ml
Phosphatpuffer (0,2 M)
500ml
126
Anhang
9.3.2 Einbettung sprotokoll für LR-White
•
Spülen mit Phosphatpuffer (pH 7,4)
•
Dehydratation durch aufsteigende Äthanolreihe:
•
4 x 15 Minuten
- 30% Alkohol, 4°C
30 Minuten
- 50% Alkohol, -20°C
30 Minuten
- 70% Alkohol, -20°C
30 Minuten
- 90% Alkohol, -20°C
30 Minuten
- 100% Alkohol, -20°C
30 Minuten
- 100% Alkohol, -20°C
30 Minuten
Infiltration mit -20°C gekühltem Kunststoff/Alkoholgemisch:
- 100% Alkohol : LR-White im Verhältnis 2:1, -20°C
30 Minuten
- 100% Alkohol : LR-White im Verhältnis 1:1, -20°C
30 Minuten
•
Inkubation in LR-White rein bei -20°C
über Nacht
•
Polymerisation: Einbettung der Proben in Probengefäße in LR-White rein unter
Zusatz eines Akzelerators (1 Tropfen pro 10 ml LR-White), anschließend luftblasenfreier Verschluß und Polymerisation über Nacht bei -20°C.
Anhang
127
9.3.3 Verwendete Reagenzien für die Immunogold-Silber-Färbung
Goldmarkierte Primärantikörper:
AURION 6 nm Goat-anti-rabit IgG (Fa. Biotrend, Köln; Code 106.011)
AURION 10 nm Goat-anti-rabit IgG (Fa. Biotrend, Code 110.011)
Die Goat-anti-rabit Antikörper weisen auch eine Kreuzreaktivität mit Maus auf.
AURION 0,8 nm („ultra small“) Goat-anti-mouse IgG (Fa. Biotrend, Köln; Code
100.022)
Reagenzien zur Silberverstärkung:
AURION R-Gent SE-LM (Fa. Biotrend, Köln; Code 500.011)
AURION R-Gent SE-EM (Fa. Biotrend, Köln; Code 500.033)
Reagentien für Puffer- und Blocklösungen:
Glycin 0,05 M in PBS (Fa. Merck, Darmstadt; Nr. 1.04201)
Ziegenserum (normal) (Fa. DAKO, Nr. X0907)
AURION BSAc (Fa. Biotrend, Köln; Code 900.022)
AURION CWFS (Fa. Biotrend, Köln; Code 900.033)
128
Anhang
9.3.4 Immunogol d-Silber-Färbung von Semidünnschnitten
a) von Hand:
•
Aldehydblockierung mit 0,05 M Glycin in PBS
•
Spülen mit PBS
•
Blockierungsschritt mit 5%igem Normalserum (Ziegenserum)
15 Minuten
2x
in PBS + 5% BSA und 0,1% CWFS Gelatine
•
5 Minuten
30 Minuten
Inkubation mit Primärantikörper:Arbeitsverdünnung in
Inkubationspuffer (PBS + 0,8% BSA + 0,1% CWFS Gelatine)
bei 4°C
•
Waschen mit Inkubationspuffer
•
Immunogoldkonjugation: Inkubation mit Gold-gekoppeltem
über Nacht
3x
Sekundärantikörper in der Arbeitsverdünnung 1:40
5 Minuten
2 Stunden
•
Waschen mit Inkubationspuffer
4x 10 Minuten
•
Waschen mit PBS
3x
•
Postfixation mit 2,5%igem Glutaraldehyd in PBS
5 Minuten
•
Waschen mit PBS
5 Minuten
•
Waschen mit Aqua dest.
•
Silberverstärkung durch Zugabe von Developer und
5x 2 Minuten
Enhancer im MischungsVerhältnis 1:1 (Aurion R-GENT)
•
Waschen mit Aqua dest.
5 Minuten
20 Minuten
3x
5 Minuten
Es schloss sich eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin bzw. Methylenblau an.
•
Gegenfärben mit Hämatoxylin
•
Bläuen mit PBS oder Leitungswasser
•
Waschen mit Aqua dest
30 Sekunden
2,5 Minuten
5 Minuten
bzw.
•
Gegenfärben mit Methylenblau
1 Minute
Anhang
129
b) im NexES IHC Färbemodul (VENTANA):
(Die entsprechende Software wurde uns freundlicherweise von der Firma VENTANA
zur Verfügung gestellt.)
•
Aldehydblockierung mit 0,05 M Glycin in PBS
•
Blockierungsschritt mit 5%iges Normalserum (Ziegenserum)
10 Minuten
in PBS + 5% BSA und 0,1% CWFS Gelatine
30 Minuten
•
Inkubationspuffer
12 Minuten
•
Inkubation mit Primärantikörper:Arbeitsverdünnung in
Inkubationspuffer (PBS + 0,8% BSA + 0,1% CWFS Gelatine)
•
32 Minuten
Immunogoldkonjugation: Inkubation mit Gold-gekoppeltem
Sekundärantikörper in der Arbeitsverdünnung 1:40
•
32 Minuten
Postfixation mit 2,5%iges Glutaraldehyd in PBS
Allen
Inkubationsschritten
Waschschritte.
Auf
die
im
NexES
Behandlung
IHC
im
2 Minuten
Färbemodul
folgten
Färbeautomaten
definierte
folgten
weiter
Inkubationsschritt, die von Hand (wie unten aufgeführt), durchgeführt wurden.
•
Waschen mit Aqua dest.
•
Silberverstärkung durch Zugabe von Developer und
5x 2 Minuten
Enhancer im MischungsVerhältnis 1:1 (Aurion R-GENT)
•
Waschen mit Aqua dest.
25 Minuten
3x
5 Minuten
Es schloss sich eine Gegenfärbung mit Hämatoxylin bzw. Methylenblau an.
•
Gegenfärben mit Hämatoxylin
•
Bläuen mit PBS oder Leitungswasser
•
Waschen mit Aqua dest
30 Sekunden
2,5 Minuten
5 Minuten
bzw.
•
Gegenfärben mit Methylenblau
1 Minute
130
Anhang
9.3.5 Immunogol d-Silber-Färbung von Ultradünnschnitten
•
Aldehydblockierung mit 0,05 M Glycin in PBS
•
Blockierungsschritt mit 5%igem Normalserum (Ziegenserum)
15 Minuten
in PBS + 5% BSA und 0,1% CWFS Gelatine
•
Waschen mit Inkubationspuffer
30 Minuten
3x
5 Minuten
(PBS + 0,1 % BSAc + 20mM NaN3)
•
Inkubation mit dem Primärantikörper
verdünnt in Inkubationspuffer bei 4°C
•
Waschen mit Inkubationspuffer
•
Immunogoldkonjugation:
1 Stunde
6x
5 Minuten
Inkubation mit Gold-gekoppeltem Sekundärantikörper in der Arbeitsverdünnung 1:50
2 Stunden
•
Waschen mit Inkubationspuffer
6x 5 Minuten
•
Waschen mit PBS
3x 5 Minuten
•
Postfixation mit 2,5%igem Glutaraldehyd in PBS
5 - 10 Minuten
•
Waschen mit PBS
•
Waschen mit Aqua dest.
•
Silberverstärkung mit AURION R-Gent SE-EM
•
Waschen mit Aqua dest.
•
Kontrastieren mit 2%igem Uranylacetat in Aqua dest.
•
Waschen mit Aqua dest.
5 Minuten
5x 2 Minuten
25 Minuten
5x 2 Minuten
10 Minuten
5x 2 Minuten
Anhang
131
9.4 Vorbereitun g der Zellkultur für die morphologische bzw. immunelektronenmikroskopische Untersuchung
•
Zellkultursuspension 5-10 min bei 2000 x g zentrifugieren und Überstand
dekantieren
•
Auflösen der Zellpellets in PBS
•
Zellkultursuspension 5-10 min bei 2000 x g zentrifugieren
•
Inkubation in Fixans
•
Abzentrifugieren der Fixationslösung
•
Aufnehmen der Zellpellets in 50-100 µl warmem Agar (2%ig w/v Agarose)
•
Erstarren des Agars, max. 24 h bei 4°C lagern
•
Zerteilen der Pellets in Blöcke
•
Einbetten in LR-White nach o.g. Protokoll
132
Anhang
9.5 Protokoll d er Fluoreszenzmarkierung
•
Maskierung unspezifischer Bindungsstellen
mit 0,5%iges BSAc in PBS
•
10 Minuten
Inkubation mit Primärantikörper
(Arbeitsverdünnung in PBS)
•
6 x Waschen mit PBS
•
Inkubation mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper
(FITC, Fluoresceinthiocyanat) 1:100 in PBS
•
6 x Waschen mit PBS
•
Gegenfärbung mit DAPI 1:2000
•
Spülen mit Aqua dest.
•
Eindecken mit Mowiol-Lösung
45 Minuten
45 Minuten
5 Minuten
9.5.1 Mowiollösu ng
5 g Mowiol 4.88 von Höchst in 20 ml 100mM TRIS pH 8,0 lösen
16 Stunden rühen
10 ml Glycerin (Fa. Merck, Nr. 4092) zugeben
16 Stunden rühren
Ungelöstes Mowiol abzentrifugieren, in Aliquods abfüllen und diese einfrieren.
Anhang
133
9.6 Tabellen- u nd Abbildungsverzeichnis
Tabellen:
Tabelle 1: Häufige opportunistische Erreger im Gastrointestinaltrakt bei HIVbzw. SIV-Infektion
27
Tabelle 2: Nachweismethoden für SIV im Darmtrakt
28
Tabelle 3: Rektumproben von experimentell rektal SIV-infizierten Tieren
35
Tabelle 4: Rektumproben von nicht SIV-infizierten Tieren
36
Tabelle 5: Lokalisation der entnommenen Proben
36
Tabelle 6: Übersicht über die verwendeten Antikörper
40
Tabelle 7: Übersicht über Auffälligkeiten der Rektumschleimhaut in der lichtmikroskopischen Untersuchung
47
Tabelle 8: Übersicht über Auffälligkeiten des Rektumepithels in der elektronenmikroskopischen Untersuchung
Tabelle 9: Verteilung der Goldpartikel im Epithel der Rektumbiopsien
51
69
134
Anhang
Abbildungsverzeichnis (mit Negativ-Nummern):
Abb. 1: a) Tier-Nr. 5913 Vergr. 188 x * (Negativ-Nr. 35/02 17)
b) Tier-Nr. 9534, 5 min p. i.; Vergr. 376 x * (Negativ-Nr. 21/00 22)
45
Abb. 2: Tier-Nr. 9549, 5 min p. i.; Vergr. 376 x * (a), Vergr. 592 x * (b)
(Negativ-Nr. 48/00 18 (a), 24/00 11 (b))
48
Abb. 3: Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.; Vergr. 592 x * (Negativ-Nr. 21/00 23)
49
Abb. 4: Tier-Nr. 9539, 30 min p. i.; Vergr. 376 x * (Negativ-Nr. 47/00 27)
49
Abb. 5: Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.; Vergr. 40.000 x * (Negativ-Nr. 262/00)
53
Abb. 6: Tier-Nr. 9542, 5 min p. i.; Vergr. 3.150 x * (Negativ-Nr. 362/00)
54
Abb. 7: Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.; Vergr. 20.000 x * (Negativ-Nr. 306/00)
55
Abb. 8: Tier-Nr. 9534, 1 min p. i.; Vergr. 20.000 x * (Negativ-Nr. 305/00)
56
Abb. 9: a) Vergr.188 x * (Negativ-Nr. 11/01 34)
b) Vergr. 376 x * (Negativ-Nr. 11/01 18)
c) Vergr. 592 x * (Negativ-Nr. 11/01 21)
59
Abb. 10: a) KK75, Verd. 1:10, Vergr. 40.000 x * (Negativ-Nr. 180/01)
b) KK18, Verd. 1:100, Vergr. 100.000x * (Negativ-Nr. 062/01)
c) KK7a, Verd. 1: 500, Vergr. 70.000x * (Negativ-Nr. 021/01)
d) p 27, Verd. 1:100, Vergr. 70.000 x * (Negativ-Nr. 251/01)
63
Abb. 11: Zellkultur, p 27, Verd. 1:500, Vergr. 40.000 x * (Negativ-Nr. 242/01)
64
Abb. 12: Zellkultur, p28, Verd. 1:400, Vergr. 120.000 x * (Negativ-Nr. 115/01)
65
Abb. 13: Zellkultur, p28, Verd. 1:400, Vergr. 70.000 x * (Negativ-Nr. 168/01)
66
Abb. 14: Zellkultur, p28, Verd. 1:400, Vergr. 30.000 x * (Negativ-Nr. 118/01)
67
Abb. 15: Tier-Nr. 9538, 30 min p. i., p28, Verd. 1:400, Vergr. 60.000 x *,
Inset 200.000 x * (Negativ-Nr. 710/01, Inset 711/01)
71
Abb. 16: Tier-Nr. 9542, 30 min p. i., p28 1:400, Vergr. 120.000 x *
(Negativ-Nr. 457/01)
72
* Die in diesem Verzeichnis angegebenen Vergrößerungen beziehen sich auf das
Dokument im A4-Format. In der Druckversion (A5) reduziert sich dieser Wert um den
Faktor 7 x 10-1.
Göttingen, den 26.08.2002
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Licht- und
elektronenmikroskopische
Untersuchungen
zum
Nachweis
von
SIV
(Simian
Immunodeficiency Virus) im Rektum experimentell infizierter Rhesusaffen (Macaca
mulatta)“ selbständig verfaßt habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen und
Hilfsmittel in Anspruch genommen:
•
Technisch-methodische Einweisungen durch technische Assistentinnen der
Abteilung Tiermedizin und Primatenhaltung, Deutsches Primatenzentrum
Göttingen.
•
Redaktionelle Überarbeitung durch wissenschaftliche Mitarbeiter und Leiter
der Abteilung Tiermedizin und Primatenhaltung, Deutsches Primatenzentrum
Göttingen.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegeten Dissertation stehen.
Die Dissertation wurde in der Abteilung Tiermedizin und Primatenhaltung des
Deutschen Primatenzentrums Göttingen unter Leitung von Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup
angefertigt und bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig
und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.
Karin Bingger
Danke
Mein besonderer Dank gilt meinem Dotorvater, Herrn Univ. Prof. Dr. F.-J. Kaup, für
die Bereitstellung des Themas dieser Arbeit und die sehr guten Arbeitsbedingungen
sowie für die uneingeschränkte motivierende Unterstützung bei der Anfertigung der
Dissertation.
Sehr herzlich bedanke ich mich bei Frau Dr. K. Mätz-Rensing für ihre geduldig
gewährten Hilfestellungen bei der Fertigstellung der Doktorarbeit. Mein Dank gilt
auch Frau Dr. P. Hofmann und Frau Dr. A. Floto, die jederzeit ein offenes Ohr für
meine Fragen hatten.
Besonderen Dank schulde ich Frau K. Kaiser-Jarry, Frau N. Knöchelmann und Frau
E. Nicksch für die unermüdlichen Hilfestellungen und die Einarbeitung in die
verschiedenen Methoden sowie für das Anfertigen der Ultrasdünnschnitte und des
zahlreichen Photomaterials. Ebenso danke ich Frau M. Hampe für die Hilfe bei der
Anfertigung und elektronischen Bearbeitung des Bildmaterials.
Allen nicht namentlich erwähnten Mitarbeitern der Abteilung Tiermedizin und
Primatenhaltung danke ich für die freundliche Atmosphäre und das gute Arbeitsklima, ohne das ich mich nicht so wohl gefühlt hätte.
Nicht vergessen möchte ich natürlich die Firma VENTANA, v.a. Herrn Dr. R. Kröger,
die mir freundlicherweise ein spezielles Softwareprogramm für die ImmunogoldSilber-Färbung an ihrem Färbemodul zur Verfügung gestellt hat.
Bedanken möchte ich mich bei der Deutschen Forschungsgesellschaft (DFG) für die
Unterstützung der Anfertigung dieser Dissertation durch ein Stipendium im Rahmen
des Graduiertenkollegs „Perespektiven der Primatologie“.
Nicht zuletzt aber gilt mein Dank meiner Familie, die die Verwirklichung meines
Berufswunsches stets unterstützt hat und mir den Rückhalt gab den ich während des
Studiums und der Anfertigung der Doktorarbeit benötigte. Bei C. Köster-Patzlaff und
C. Kott bedanke ich mich für das Interesse an meiner Arbeit und die Durchsicht des
Manuskriptes.