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Informationsübertragung im Tetrazyklin-Repressor als Grundlage für den allosterischen Induktionsmechanismus Der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Marcus Krüger aus Forchheim Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Tag der mündlichen Prüfung: 18.12.2009 Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Hillen Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Yves A. Muller meinen Eltern In der Wissenschaft gleichen wir alle nur den Kindern, die am Rande des Wissens hie und da einen Kiesel aufheben, während sich der weite Ozean des Unbekannten vor unseren Augen erstreckt. ISAAC NEWTON (1643-1727) Diese Arbeit wurde von März 2006 bis August 2009 am Lehrstuhl für Mikrobiologie, Department Biologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg angefertigt. Danksagung Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Wolfgang Hillen danke ich nicht nur für die Überlassung eines sehr interessanten Themas, sondern auch für die stets offene Tür, seine Diskussionsbereitschaft, die immer konstruktive Kritik sowie für die vielen Tipps und Anregungen während der letzten dreieinhalb Jahre. Danke auch für das entgegengebrachte Vertrauen und die Freiheit, Projekte selbständig gestalten zu können. Herrn Prof. Dr. Yves Muller möchte ich für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens danken sowie für die Gespräche über die „strukturelle“ Seite von TetR und die Zurverfügungstellung der Strukturdaten von TetRr1 und TetRi2 vor ihrer Veröffentlichung. Herrn Prof. Dr. Peter Gmeiner, Susanne Lochner und Igor Usai danke ich für die Bereitstellung von 4-ddma-ATc, 4-ddma-Dox, sowie der „IU-Derivate“. Danke auch an Herrn Prof. Dr. Tim Clark und Herrn Dr. Harald Lanig für Diskussionen über den Induktionsmechanismus von TetR und für einen kleinen Einblick in die Computerchemie. Den Mitgliedern der Tet-Arbeitsgruppe danke ich für Ratschläge, Diskussionen und Anregungen, insbesondere Chris Berens für sein unerschöpfliches Literaturwissen, Janko Daam für zahlreiche Unterhaltungen über Tip & Top, sowie Anja, Daggi, Sanya und Christoph für die gute Arbeitsatmosphäre. Nicht zu vergessen die bereits Ehemaligen Oliver Scholz und Eva Henßler. Olly möchte ich für die Heranführung an die TetR-Thematik danken und für unser geteiltes Interesse, herumzubasteln und neue Methoden auszuprobieren. Eva danke ich für die Einführung in die chromatographische Aufreinigung von TetR. Darüber hinaus möchte ich mich auch bei allen derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern des Lehrstuhls für die angenehme Zusammenarbeit bedanken. Danke auch an Klaus Pfleiderer für die Hilfe bei den Western-Blots und die lustigen Sondermüll-Entsorgungs-Aktionen. Dann wären da noch „meine“ Praktikant(inn)en und Diplomandinnen der letzten drei Jahre, Juliane Schmidt, Jasmin Popp, Daniela Kaspar, Sandra Grubmüller, Stephanie Platzer, René Pfeifle, Janine Arlt und Saskia Letz, die durch ihre engagierte und hilfreiche Mitarbeit an den jeweiligen Projekten auch wertvolle Beiträge zu dieser Arbeit geliefert haben. Herrn Dr. Alfons Rösch danke ich für die vielen spontanen Hilfen im Alltag, die Gummibärchen, die vielen (z.T. auch nicht-fachlichen) Gespräche und die gemeinsame Arbeit im Besucherlabor. Nicht zu vergessen sind die vielen organisatorischen Dienste, die ein Arbeiten am Lehrstuhl erst möglich gemacht haben. Besonders zu erwähnen sind dabei Markus Müller aus der Werkstatt, Manuela Hanuschik und Hildegard Stork aus der Spül- und Medienküche sowie unsere beiden Sekretärinnen Frau Donata Wehr und Julia Maresch. Danke auch an die CvDs, die bei Computerproblemen stets zur Stelle waren. Zum Thema „Organisatorisches“ möchte ich mich auch bei Christian Völk für das Weiterleiten von zahlreichen wissenschaftlichen Artikeln während des Zusammenschreibens bedanken. Freya Boggasch danke ich für die freundliche Erklärung der ChemiDoc-Anlage, dem Lehrstuhl für Tierphysiologie für die Möglichkeit, meine ganzen Proteingele auszuwerten. Und ganz besonders danke ich auch meinen Eltern, ohne deren Unterstützung die Arbeit nicht möglich gewesen wäre. INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................... I VERWENDETE ABKÜRZUNGEN ..................................................................................... V 1 ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................................. 1 1 ABSTRACT .....................................................................................................................2 2 EINLEITUNG ...................................................................................................................3 2.1 Allosterie – „Fernsteuerung“ für Proteine ............................................................................. 3 2.1.1 Die „alte“ und die „neue“ Sichtweise der Allosterie ............................................................. 3 2.1.2 Protein-Effektor-Wechselwirkungen bei allosterischen Proteinen....................................... 4 2.1.3 Allosterische Transkriptionsregulatoren .............................................................................. 5 2.2 Der Tetrazyklin-Repressor TetR als Modellsystem für einen allosterischen Regulator ... 6 2.2.1 Regulation der Tetrazyklin-Resistenz ................................................................................. 6 2.2.2 Struktur und Funktion von TetR .......................................................................................... 8 2.2.2.1 Dimerisierung von TetR .................................................................................................. 9 2.2.2.2 DNA-Bindung von TetR .................................................................................................. 9 2.2.2.3 Induktorbindung und Induktion von TetR...................................................................... 10 2.3 Das Tet-System: Anwendung und Modifikationen von TetR ............................................. 13 2.3.1 TetR-Varianten mit geänderter Induktorspezifität ............................................................. 15 2.3.2 TetR-Varianten mit geänderter Operatorspezifität ............................................................ 15 2.3.3 Umkehr des Regulationsverhaltens: Der reverse Tet-Repressor ..................................... 16 2.4 Motivation, Fragestellung und Zielsetzung ......................................................................... 17 3 ERGEBNISSE ............................................................................................................... 19 3.1 Untersuchung der Signalübertragung in TetR .................................................................... 19 3.1.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetR ........................................................................... 19 3.1.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne ......................................................................... 20 3.1.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper . 21 3.1.1.3 Austausche im Proteinkörper ....................................................................................... 24 -I INHALTSVERZEICHNIS 3.1.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche ........................................................................ 25 3.1.2 Erstellung einer Signalkarte aus den Ergebnissen der Alanin-Austauschmutagenese .... 27 3.1.3 Untersuchung der unterschiedlichen Kontakte in TetR(BD) und TetR(B) und deren Einfluss auf die Signalübertragung ................................................................................... 29 3.1.3.1 Alanin-Austauschmutagenese in der DNA-Bindedomäne von TetR(B) ....................... 29 3.1.3.2 Angleichung der Kontaktfläche von DNA-Bindedomäne und Proteinkörper zwischen TetR(B) und TetR(BD) .................................................................................................. 32 3.1.3.3 Stabilitätsuntersuchung von TetR(B) M59I H93Y ......................................................... 33 3.1.4 Einfluss des Induktors auf die Signalübertragung ............................................................. 34 3.1.4.1 TetR(BD): Tetrazyklin im Vergleich zu Anhydrotetrazyklin ........................................... 34 3.1.4.2 TetR(B): Tetrazyklin im Vergleich zu Tip ...................................................................... 35 3.1.5 Randomisierung von Aminosäure 49 ................................................................................ 37 3.1.6 Aufreinigung und Stabilitätsanalyse einer nicht-induzierbaren TetR-Mutante .................. 39 3.2 Untersuchung der Signalübertragung in revTetR............................................................... 40 3.2.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetRr2 ......................................................................... 40 3.2.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne ......................................................................... 41 3.2.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper . 42 3.2.1.3 Austausche im Proteinkörper ....................................................................................... 43 3.2.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche ........................................................................ 45 3.2.2 Erstellung einer Signalkarte von TetRr2 ............................................................................ 47 3.2.3 Konstruktion eines reversen TetR(B) ................................................................................ 49 3.3 Untersuchung der Signalübertragung eines TetR mit geänderter Induktorspezifität ..... 53 3.3.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetRi2 ......................................................................... 53 3.3.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne ......................................................................... 54 3.3.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper . 55 3.3.1.3 Austausche im Proteinkörper ....................................................................................... 56 3.3.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche ........................................................................ 57 3.3.2 Erstellung einer Signalkarte von TetRi2 ............................................................................. 58 3.3.3 Versuch der Übertragung der 4-ddma-ATc-Spezifität auf TetR(B) ................................... 61 3.4 4-de(dimetyhlamino)-Tetrazykline als Anti-Induktoren für TetR ....................................... 63 3.4.1 Verdrängungsexperimente mit verschiedenen 4-ddma-Derivaten .................................... 63 3.4.2 Limitierte Proteolyse in Anwesenheit von Induktoren und Anti-Induktoren ....................... 66 3.4.3 Stabilisierung von revTetR-Varianten durch 4-ddma-ATc................................................. 68 4 DISKUSSION ................................................................................................................ 69 4.1 Signalübertragung während der Induktion von TetR ......................................................... 69 - II INHALTSVERZEICHNIS 4.1.1 Induktion durch Tetrazyklin ............................................................................................... 70 4.1.1.1 Effektorbindung und Einleitung des Induktionsmechanismus ...................................... 70 4.1.1.2 Informationsübertragung zwischen den Domänen ....................................................... 71 4.1.2 Induktion durch das Oligopeptid Tip.................................................................................. 77 4.2 Der reverse Tetrazyklin-Repressor (revTetR) ...................................................................... 80 4.2.1 Die Destabilisierung erschwert eine Aussage über den Signalweg .................................. 80 4.2.2 Der reverse TetR(B): Hypothesen zur Erklärung des reversen Regulationsmechanismus‘ . .......................................................................................................................................... 83 4.2.2.1 Hypothese I: Die Mutationen E15A L17G L25V ändern den Signalweg ...................... 84 4.2.2.2 Hypothese II: In revTetR-Varianten ist die Signalübertragung unterbrochen ............... 86 4.2.3 Spezifische Effektoren für revTetR induzieren nicht ......................................................... 87 4.3 4-ddma-Derivate: Vom Anti-Induktor zum Induktor ............................................................ 88 4.3.1 4-ddma-Derivate als Anti-Induktoren von TetR ................................................................. 88 4.3.2 Einzelmutationen verwandeln 4-ddma-ATc in einen Induktor ........................................... 90 4.3.3 Die 4-ddma-spezifische Variante TetRi2 (TetR H64K S135L S138I)................................. 91 4.3.3.1 TetRi2 ist destabilisiert .................................................................................................. 91 4.3.3.2 Die Austausche H64K-S135L-S138I ändern den Induktionsmechanismus ................. 92 4.3.3.3 Tetrazyklin als Korepressor: TetRi2 zeigt reverses Regulationsverhalten .................... 95 4.4 Fazit und Ausblick ................................................................................................................. 96 5 MATERIAL UND METHODEN ...................................................................................... 98 5.1 Materialien .............................................................................................................................. 98 5.1.1 Chemikalien ...................................................................................................................... 98 5.1.2 Verbrauchsmittel ............................................................................................................... 99 5.1.3 Geräte ............................................................................................................................. 100 5.1.4 Kommerziell erhältliche Reagenziensysteme („Kit“-Systeme) ........................................ 101 5.1.5 Enzyme, Proteine und Antikörper ................................................................................... 101 5.1.6 Größenmarker für DNA-Fragmente und Proteine ........................................................... 102 5.1.7 Oligonukleotide ............................................................................................................... 102 5.1.8 Bakterienstämme ............................................................................................................ 104 5.1.9 Plasmide ......................................................................................................................... 105 5.2 Medien, Lösungen und Puffer ............................................................................................ 107 5.2.1 Allgemeine Puffer ............................................................................................................ 107 5.2.2 Bakteriennährmedien ...................................................................................................... 107 5.2.3 Puffer und Lösungen für DNA-Versuche......................................................................... 108 - III INHALTSVERZEICHNIS 5.2.4 Puffer und Lösungen für Protein-Versuche ..................................................................... 108 5.3 Methoden .............................................................................................................................. 110 5.3.1 Arbeiten mit Mikroorganismen ........................................................................................ 111 5.3.1.1 Anzucht, Handhabung und Lagerung von E. coli-Kulturen ........................................ 111 5.3.1.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli-Zellen .............................................. 111 5.3.1.3 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen ............................................................ 112 5.3.1.4 Transformation von E. coli .......................................................................................... 112 5.3.1.5 Elektroporation von E. coli .......................................................................................... 112 5.3.1.6 Präparation von Plasmid-DNA mittels TENS-Lyse ..................................................... 112 5.3.2 Arbeiten mit Nukleinsäuren ............................................................................................. 113 5.3.2.1 Restriktionsspaltung von DNA .................................................................................... 113 5.3.2.2 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden .................................................................... 113 5.3.2.3 Ligation von DNA-Fragmenten ................................................................................... 113 5.3.2.4 Gelelektrophorese von DNA ....................................................................................... 113 5.3.2.5 Elution von DNA aus Agarose-Gelen ......................................................................... 114 5.3.2.6 Ethanol-Fällung von DNA ........................................................................................... 114 5.3.2.7 Mutagenese mittels zweistufiger Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ......................... 114 5.3.2.8 Sequenzierung von Plasmid-DNA .............................................................................. 115 5.3.3 Arbeiten mit Proteinen..................................................................................................... 115 5.3.3.1 Überexpression und chromatographische Reinigung von TetR ................................. 115 5.3.3.2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen ................................................................... 116 5.3.3.3 Western-Blot Analyse ................................................................................................. 116 5.3.3.4 Quantifizierung der β-Galaktosidase-Aktivität im 96-Napfplatten-Format .................. 117 5.3.3.5 Limitierte Proteolyse ................................................................................................... 118 5.4 Computerprogramme und Internetdienste ........................................................................ 119 6 LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................ 120 7 EIGENE PUBLIKATIONEN......................................................................................... 130 8 ANHANG ..................................................................................................................... 131 8.1 Ergebnisse aus den β-Galaktosidase-Aktivitätsmessungen ........................................... 131 8.1.1 TetR(BD)-Varianten ........................................................................................................ 131 8.1.2 TetR(B) Varianten ........................................................................................................... 136 8.2 Bisher verfügbare Kristallstrukturen von TetR ................................................................. 138 - IV VERWENDETE ABKÜRZUNGEN VERWENDETE ABKÜRZUNGEN Abb. ApR APS ATP ATc BSA CmR CMV 4-ddma… DMSO DNA dNTP DTT E. coli EDTA EtBr EtOH HTH lacZ LB MIK n.b. oDx ONPG p.A. PAA persönl. rev. RF RT S. SAP SDS Tab. Tc TEMED tetO Tip Tris ÜNK ÜTK v w wt X-Gal Abbildung Ampicillin-Resistenz Ammoniumperoxodisulfat Adenosintriphosphat Anhydrotetrazyklin Rinderserumalbumin Chloramphenicol-Resistenz Cytomegalie-Virus 4-de(dimethylamino)… Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleinsäure Desoxyribonukleosidtriphosphat Dithiothreitol Escherichia coli Ethylendiamintetraacetat Ethidiumbromid Ethanol α-Helix-Turn-α-Helix Gen für β-Galaktosidase Luria-Bertani-Medium Minimale inhibitorische Konzentration nicht bestimmt optische Dichte bei x nm o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid ‘pro Analysis’ Polyacrylamid persönlich revers Regulationsfaktor Raumtemperatur Seite Shrimps alkalische Phosphatase Natriumdodecylsulfat Tabelle Tetrazyklin N, N, N’, N’-Tetramethylethylendiamin tet-Operator Transkription-induzierendes Peptid Trishydroxymethylaminomethan Über-Nacht-Kultur Über-Tag-Kultur Volumen Gewicht, Masse Wildtyp 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-galaktopyranosid -V Einheiten A Å bp °C D / Da F g h L m M mol min s U Upm V W Ω Ampere Ångström (=10-10 m) Basenpaar Grad Celsius Dalton Farad Gramm Stunde Liter Meter molar (mol/L) Mol Minute Sekunde Unit (Einheit d. Enzymaktivität) Umdrehungen pro Minute Volt Watt Ohm Vorsätze M k m µ n p f Mega Kilo Milli Mikro Nano Piko Femto Basen A (Ade) C (Cyt) G (Gua) T (Thy) N (106) (103) (10-3) (10-6) (10-9) (10-12) (10-15) Adenin Cytosin Guanin Thymin A, C, G, T Nukleoside Adenosin Cytidin Guanosin Thymidin VERWENDETE ABKÜRZUNGEN Aminosäuren-Nomenklatur nach IUPAC-IUB Vereinbarung von 1969 Ala A Alanin Leu L Leucin Arg R Arginin Lys K Lysin Asn N Asparagin Met M Methionin Asp D Aspartat (Asparaginsäure) Phe F Phenylalanin Cys C Cystein Pro P Prolin Gln Q Glutamin Ser S Serin Glu E Glutamat (Glutaminsäure) Thr T Threonin Gly G Glycin Trp W Tryptophan His H Histidin Tyr Y Tyrosin Ile I Isoleucin Val V Valin Protein AcrR AmtR BirA CamR CAP CcpA CheY CmeR Crh DhaS EbgR ErmC‘ FIS Hpr LacI MurD MurE PurR QacR SbmC TetA TetR TraR TreR TrpR TrxA Bezeichnung Acriflavin-Repressor Repressor des Ammonium-Aufnahmesystems Biotin-Repressor Repressor des Cytochrom P-450cam Hydroxylase Operons Katabolit-Aktivator-Protein Katabolit-Kontroll-Protein A Chemotaxis-Protein CheY Repressor des CmeABC Multidrug-Efflux-Systems (Campylobacter multidrug efflux) Hpr-ähnliches Protein der Katabolitenrepression (Catabolite repression HPr-like protein) Dihydroxyaceton-Aktivator Repressor des ebg-Operons (enhanced beta galactosidase) Erythromycin-Methyltransferase DNA-bindendes Protein für DNA-Inversion bei der Rekombination (factor-of-inversion stimulation) Phosphocarrier-Protein Hpr (Histidine-containing protein) Laktose-Repressor UDP-N-Acetylmuramoylalanin-D-glutamat-Ligase UDP-N-Acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamat-2,6diaminopimelat-Ligase Purin-Repressor Repressor eines Multidrug-Efflux-Systems (quarternary ammonium compound) DNA-Gyrase Inhibitor membranständiger [Tc•Me]+/H+-Antiporter Tetrazyklin-Repressor Regulator für konjugalen Transfer des Ti-Plasmids Trehalose-Repressor Tryptophan-Repressor Thioredoxin A - VI Herkunfts-Organismus Escherichia coli Corynebacterium glutamicum Escherichia coli Pseudomonas putida Escherichia coli Bacillus subtilis Escherichia coli Campylobacter jejuni Bacillus subtilis Lactococcus lactis Escherichia coli Bacillus subtilis Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus aureus Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli Agrobacterium tumefaciens Escherichia coli Escherichia coli Escherichia coli ZUSAMMENFASSUNG 1 ZUSAMMENFASSUNG Der Tetrazyklin-Repressor (TetR) ist eines der am besten untersuchten bakteriellen Regulatorproteine und schon seit Langem ein Modellsystem für die Effektor-gesteuerte Transkriptionsregulation. Nach der Bindung des Effektors Tetrazyklin (Tc) muss ein Signal von der Effektor-Bindetasche über 33 Å auf die N-terminale DNA-Bindedomäne übertragen werden, die daraufhin ihre Konformation ändert und so zu einer Dissoziation des TetR-Operator-Komplexes führt. In dieser Arbeit wurde durch eine Alanin-Austauschmutagenese die Bedeutung von 66 Aminosäuren für die Induktion von TetR analysiert. Aus den Aktivitäten der Einzelmutanten konnte unter Verwendung von Strukturdaten eine Signalkarte von TetR erstellt werden. Daraus ging hervor, dass durch die TcBindung zwei unabhängige Vorgänge ausgelöst werden: Eine spezifische Konformationsänderung (Induktionsbewegung), welche die beiden Helix-turn-Helix-Motive des TetR-Homodimers relativ zueinander verschiebt und eine zusätzliche Konformationsänderung, welche die induzierte Konformation stabilisiert und TetR in seiner nicht DNA-bindenden Form „fixiert“. Für die Induktionsbewegung wurden Asp95, Leu17 sowie weitere Aminosäuren innerhalb der hydrophoben Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6 ermittelt. Alanin-Austausche dieser Aminosäuren führen zu einer generellen Beeinträchtigung der Induzierbarkeit. Für andere Alanin-Substitutionsmutanten wie TetR R49A, bei welcher der stärkere Induktor Anhydrotetrazyklin (ATc) noch zu einer Rest-Induktion führt, zeigte sich durch limitierte Proteolyse in Anwesenheit von Tc oder ATc ein geringerer Stabilisierungseffekt als beim Wildtyp. Dass die beiden oben genannten Vorgänge unabhängig voneinander ausgelöst werden ist Voraussetzung, dass reverse Tet-Varianten (revTetR) überhaupt entstehen können. Für revTetR konnte kein durchgehender Signalweg ermittelt werden. Darüber hinaus haben Alanin-Austausche der für die Induktionsbewegung von TetR essentiellen Aminosäuren keinen oder nur geringen Effekt auf die Korepression von revTetR. Das führt zu der Annahme, dass in revTetR keine Induktionsbewegung ausgelöst wird und für die Korepression überwiegend die stabilisierenden Konformationsänderungen eine Rolle spielen. Eine durch die Mutationen M59I S92R H93Y verursachte Unterbrechung der Induktionsbewegung in TetR(B) E15A L17G L25V ermöglichte die Konstruktion einer reversen TetR(B)Variante. Desweiteren konnten 4-de(dimethylamino)-Tetrazykline als Anti-Induktoren für TetR identifiziert werden, die Tc aus der Bindetasche verdrängen und auf diese Weise eine durch Tc ausgelöste Induktion von TetR „abschalten“ können. Da durch limitierte Proteolyse gezeigt werden konnte, dass die Anwesenheit von 4-de(dimethylamino)-Anhydrotetrazyklin (4-ddma-ATc) die Proteaseanfälligkeit von TetR herabsetzt, wird davon ausgegangen, dass durch die Bindung von 4-ddma-ATc an TetR ebenfalls nur die stabilisierenden Konformationsänderungen ausgelöst werden, nicht jedoch die Induktionsbewegung. Durch eine Alanin-Austauschmutagenese der Variante TetRi2 (TetR H64K S135L S138I), die eine Spezifität für 4-ddma-Tetrazykline aufweist, wurde die Signalübertragung einer Induktorspezifitätsmutante untersucht. Hierbei wurden mehrere Mutanten gefunden, bei denen die schon bei TetRi2 auftretende Korepression durch Tc deutlich wird. Daher wird davon ausgegangen, dass es sich bei TetRi2 um eine „reverse“ TetR-Variante handelt, bei der die von Tetrazyklin abweichende Bindung von Anhydrotetrazyklinen (4-ddma-ATc, ATc) zu einer speziellen Anordnung der Aminosäuren in der hydrophoben Zone führt (insbesondere von Tyr93, Leu14, Leu55, deren Alanin-Austausche einen Verlust der Induzierbarkeit bewirkt). Die dadurch mögliche Interaktion zwischen Leu55 und Val45 löst wahrscheinlich die Induktionsbewegung aus. -1 ABSTRACT 1 ABSTRACT The tetracycline repressor (TetR) is one of the most intensely studied prokaryotic regulator proteins and has become an invaluable model system for the study of effector-mediated regulation of transcription. After the effector tetracycline (Tc) has bound to TetR, a signal must be transmitted from the effector binding pocket to the N-terminal DNA binding domain over a distance of 33 Å. This domain subsequently changes its conformation leading to a dissociation of the TetR-operator complex. In this work alanine scanning was used to analyze 66 residues in TetR for their importance for induction. By interpreting the activities of the single mutants in the light of structural data, it was possible to create a signalling landscape for TetR. From this, it was concluded that Tc binding triggers two independent movements: Firstly, a specific conformational change (induction movement) that moves both of the helix-turn-helix motifs against each other; and secondly, an additional conformational change that locks the induced conformation of TetR in a non DNAbinding conformation. For the induction movement, Asp95, Leu17 and several additional amino acids in the hydrophobic core between the helices α1, α4 and α6 are important. Alanine substitutions of these amino acids lead to a generally impaired inducibility. For further alanine substitution mutants, like in TetR R49A, the more potent inducer anhydrotetracycline (ATc) can mediate residual induction. Limited proteolysis of this mutant in the presence of Tc or ATc showed less stabilization than for the wild type. That both movements are initiated independently is a precondition for the formation of reverse TetR variants (revTetR). For revTetR, no continuous signalling pathway could be determined. In addition, alanine exchanges of amino acids that were important for the induction of TetR have no or only marginal effect on the corepression of revTetR. These observations suggest that revTetR has lost the ability to trigger the induction movement and that corepression of is mainly based on the stabilizing conformational changes. Disruption of the induction movement by introducing the mutations M59I S92R H93Y made it possible to construct a reverse TetR(B) out of TetR(B) E15A L17G L25V. Additional 4-de(dimethylamino)-tetracycline derivatives were identified as anti-inducers for TetR, in that they are able to replace Tc from the effector binding pocket. Thus, they can “switch off” induction mediated by Tc. As it was shown by limited proteolysis, the presence of 4-de(dimethylamino)-anhydrotetracycline (4-ddma-ATc) decreased the susceptibility of TetR to proteinase K. Hence it was assumed that binding of 4-ddma-ATc only triggers the stabilizing conformational changes, but not the induction movement. By alanine scanning of TetRi2 (TetR H64K S135L S138I), which mediates induction by 4-ddmaATc, signal transmission of a TetR variant with altered inducer specificity was explored. Here, several mutants were found for which Tc shows corepression, as it does for TetRi2 to a lower extent. So it is assumed that TetRi2 is a “reverse” TetR variant. In comparison to Tc, the different binding of anhydrotetracyclines (4-ddma-ATc, ATc) to TetRi2 results in a special arrangement of amino acids in the hydrophobic core (especially of Tyr93, Leu14, Leu55 whose alanine exchanges lead to a loss of inducibility). Facilitated by this new arrangement, the interaction of Leu55 and Val45 possibly triggers the induction movement. Thus, 4-ddma-ATc is able to induce TetRi2 whereas Tc mediates corepression. -2 EINLEITUNG 2 EINLEITUNG 2.1 Allosterie – „Fernsteuerung“ für Proteine Eine typische Bakterienzelle enthält ungefähr 250.000 Proteine, einschließlich unterschiedlicher Mengen von mehreren tausend Genprodukten (Goodsell, 1991). Auf das Zellvolumen hochgerechnet, sind die Proteine so dicht gepackt, dass zwischen zwei von ihnen nur ein Abstand von wenigen Wassermolekülen herrscht. In dieser beengten Umgebung ist eine präzise Regulation der Proteinaktivität notwendig, um ein Chaos im Stoffwechsel der Zelle zu vermeiden. Allosterie1 ist ein verbreiteter und effektiver Mechanismus, um die Proteinaktivität zu kontrollieren (Gao & Jacobson, 2006; Gunasekaran et al., 2004; Hardy & Wells, 2004; Lindsley & Rutter, 2006). 2.1.1 Die „alte“ und die „neue“ Sichtweise der Allosterie Bei allosterischen Proteinen führt die Bindung eines Effektors an einer Seite meist zu einer Affinitätsänderung (Regulatoren) oder katalytischen Aktivität (Enzyme) an einer anderen Seite. Die beiden „klassischen“ Modelle zur Beschreibung der Allosterie wurden in den 1960er Jahren von Monod et al. (MWC-Modell) (Monod et al., 1965) und von Koshland et al. (KNF-Modell) (Koshland et al., 1966) aufgestellt, die den physikalischen Übergang zwischen zwei festen Konformationen (R und T)2 durch die Bindung eines Effektors interpretiert haben. Während das MWC-Modell eine gemeinsame Konformationsänderung aller Untereinheiten vorschlägt („Symmetrie-Modell“), schlägt das KNF-Modell Konformationsänderung eine vor durch das erste („Sequenz-Modell“) Bindeereignis (Abb. 2.1). Erste schrittweise erfolgende Kristallstrukturen von allosterischen Proteinen, die im freien und effektorgebundenen Zustand einen klaren Konformationsunterschied auswiesen, unterstützten die beiden Modelle lange Zeit. Der Übergang zwischen nur zwei Konformationen impliziert allerdings, dass die Signalübertragung über einen einzigen, fest definierten Weg stattfinden muss, was einige experimentelle Studien auch belegen (Suel et al., 2003). Während Konformationsänderungen lange Zeit eine Voraussetzung für Allosterie waren, werden immer mehr Fälle bekannt, in denen Allosterie scheinbar auch ohne Konformationsänderungen auskommt (Cooper & Dryden, 1984; Popovych et al., 2006; Tsai et al., 2008). Neuere Modelle berücksichtigen daher auch thermodynamische Faktoren, in denen es neben der enthalpischen Komponente auch eine wachsende Bedeutung der entropischen Komponente gibt (Kern & Zuiderweg, 2003; Popovych et al., 2006; Swain & Gierasch, 2006). Nach der „neuen Sicht“ der 1 2 Von griech. allo (anders) und steros (Ort), d.h. „am anderen Ort“. Der induzierte Zustand wurde als R (engl. für relaxed = entspannt), der uninduzierte Zustand als T (engl. für tensed = angespannt) bezeichnet. -3 EINLEITUNG Allosterie sind Proteine durch ihre Flexibilität und Molekülschwingungen in komplexen Gruppen aus zahlreichen Konformeren organisiert. Die Bindung eines Effektors führt zu einer anteilsmäßigen Verschiebung einiger Konformere innerhalb dieser Gruppe („population shift“), wodurch aus Strukturdaten nicht unbedingt Konformationsänderung herauszulesen sind (Cui & Karplus, 2008; Pan et al., 2000). Das Vorhandensein von vielen (dynamischen) Konformationen ermöglicht auch eine Vielzahl an Signalwegen, über die das Signal der Effektorbindung übertragen werden kann. Forschungen an dem Chemotaxis-Protein CheY haben jedoch gezeigt, dass weder die „alte“ noch die „neue“ Sicht alleine den Allosterie-Mechanismus von CheY vollständig erklären können, sondern es sich um ein Zusammenwirken von lokalen Konformationsänderungen und einem „population shift“ handeln muss (Formaneck et al., 2006). Somit scheinen sich die Modelle der Allosterie zu ergänzen (Tsai et al., 2009). Lange Zeit wurde Allosterie als Merkmal oligomerer Proteine beschrieben. Neuere Studien zeigen aber, dass die Bindung eines Effektors auch bei vielen monomeren Proteinen Auswirkungen auf Protein/Substrat-, Protein/Ligand- oder Protein/Protein-Wechselwirkungen an einer anderen Stelle des Proteins haben kann (Volkman et al., 2001). A C 1 T T R R R R R R 0 1 B T T R T R R 0 Abb. 2.1: Vereinfachte Gegenüberstellung der unterschiedlichen Allosterie-Modelle für ein dimeres Protein. Die beiden Monomere sind in grau dargestellt. Die Quadrate stellen den inaktiven T-Zustand dar, die Kreise den aktivierten R-Zustand. Der Effektor ist als gelbes Dreieck dargestellt. (A) Nach dem MWC-Modell befinden sich die beiden Zustände TT und RR in einem Gleichgewicht. Die Bindung des Effektors stabilisiert eine dieser Formen und verschiebt dadurch das Gleichgewicht. Die Konformationsänderung durch die Effektorbindung findet gleichzeitig in allen Monomeren statt („Symmetrie-Modell“). (B) Nach dem KNF-Modell liegt das Protein im inaktiven TT-Zustand vor. Durch Bindung des Effektors erfolgt eine schrittweise Änderung der Konformation in den aktiven RR-Zustand (Sequenz-Modell“). (C) Das „population shift“-Modell ist eine Weiterentwicklung des MWC-Modells, bei der sich eine Vielzahl möglicher Konformationen im Gleichgewicht befindet. Die Effektorbindung führt zu einer anteilsmäßigen Verschiebung der Konformere. 2.1.2 Protein-Effektor-Wechselwirkungen bei allosterischen Proteinen Wie bereits oben beschrieben, sind für die Funktion vieler allosterischer Proteine physikalische Wechselwirkungen mit Subtanzen, sog. Effektoren, wichtig. Die kleinsten dieser Effektoren stellen -4 EINLEITUNG Protonen, wie z.B. bei pH-abhängigen Rezeptoren (Ludwig et al., 2003), oder Metallionen dar. Die Fur-Proteinfamilie (engl. für ferric uptake regulators) ist eine große Familie bakterieller Regulatorproteine, die durch Bindung zweiwertiger Metallionen wie Fe2+, Zn2+, Mn2+ oder Ni2+ reguliert wird (Lee & Helmann, 2007). Die Aktivierung des Laktose-Repressors LacI durch Allolaktose (Lewis, 2005) oder die Korepression des Tryptophan-Repressors TrpR durch LTryptophan (Somerville, 1992) sind zwei bekannte Beispiele, bei denen niedermolekulare Substanzen als Effektoren dienen. Zu den hochmolekularen Effektoren zählen andere Proteine wie Hpr-Ser46-P oder Crh-Ser46-P, die als Effektoren für den katabolischen Regulator CcpA aus Bacillus fungieren (Schumacher et al., 2004; Schumacher et al., 2006). Die Effektoren werden reversibel durch nicht-kovalente Bindungen mit der Proteinoberfläche verknüpft. Oft hängt eine effektive Bindung aber nicht nur von den direkten Kontakten zu dem Effektor ab, sondern auch von entfernten Resten in der Tertiärstruktur (Hedstrom, 1996; Perutz et al., 1998). Die Spezifität wird, je nach Art des Effektors, über ein Zusammenspiel von hydrophoben Kontakten, Wasserstoffbrücken und ionischen Wechselwirkungen vermittelt. Die Koordination verändert die Seiten- und Hauptketten-Positionen der kontaktierenden Aminosäuren. Durch die dichte Packung von Atomen in globulären Proteinen werden selbst kleine Positionsänderungen über die Tertiärund Quartärstruktur des Proteins übertragen und können so zu Konformationsänderungen an weit entfernten Orten des Proteins führen, was die Grundlage für zumindest einige allosterische Prozesse ist (Daily & Gray, 2009). Da Effektorbindestelle und Ort der Konformationsänderung bei einigen Proteinen mehrere zehn Ångström voneinander entfernt sind, ist es ein grundlegendes Ziel zu verstehen, wie das Signal innerhalb von Proteinen über so weite Strecken übermittelt wird. 2.1.3 Allosterische Transkriptionsregulatoren Organismen haben viele Mechanismen entwickelt, um auf innere und äußere Umwelteinflüsse zu reagieren und ihren Stoffwechsel an die Veränderungen anzupassen. Ein weit verbreiteter Regulationsmechanismus ist die strikte Kontrolle der Genexpression durch allosterische Transkriptionsfaktoren (Huffman & Brennan, 2002). Bei diesen Transkriptionsfaktoren führt die Bindung eines Effektors zu einer Affinitätsänderung des Proteins zur DNA. Dabei kann die Effektorbindung entweder die DNA-Bindung ermöglichen, wie beim Tryptophan-Repressor TrpR (Swint-Kruse & Matthews, 2009) oder verhindern, wie beim Laktose-Repressor LacI (Wilson et al., 2007). Diese beiden Transkriptionsfaktoren wurden zu bedeutenden Modellsystemen für die Effektor-gesteuerte Transkriptionsregulation. In Abwesenheit von Laktose bindet LacI an zwei spezifische Operatorsequenzen als „Dimer eines Dimers“ und reprimiert dadurch die Transkription des Laktose-Stoffwechsels (Wilson et al., 2007). Nach der Bindung der Induktoren Allolaktose oder Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) wird ein Signal von der Effektorbindetasche zur DNA-Bindedomäne mit dem Helix-turn-Helix-Motiv übertragen. Eine Konformationsänderung der Bindedomäne bewirkt die Dissoziation des LacI-5 EINLEITUNG Operator-Komplexes. Da in der IPTG-induzierten Form von LacI keine Elektronendichte in der DNA-Bindedomäne nachgewiesen werden konnte (Lewis et al., 1996), spricht das für eine IPTGinduzierte Entfaltung der Bindedomäne und erhöhte Mobilität im IPTG-gebundenen Zustand (Taraban et al., 2008). Bei TrpR ist der Regulationsmechanismus umgekehrt. Durch Bindung des Effektors Tryptophan wird die Transkription durch Operatorbindung reprimiert (Gryk et al., 1996). Es wurde gezeigt, dass die DNA-Bindedomäne in Abwesenheit von Tryptophan flexibel ist und einen schnellen AmidProton-Austausch besitzt (Gryk et al., 1995). Die Bindung von Tryotophan im Proteinkörper verstärkt die Operator-Bindung, indem sie die Zahl an möglichen Konformationen der Bindedomäne einschränkt. Mutationen in der Verbindungshelix zwischen Proteinkörper und DNABindedomäne verstärken diesen Effekt sogar, indem sie die DNA-Bindedomäne „versteifen“ (Gryk et al., 1996). Als Transkriptionsregulator der Tryptophan-Biosynthese muss TrpR an eine Vielzahl verschiedener Operatorsequenzen binden. Interessanterweise führen einige dieser Mutationen auch dazu, dass manche Operatoren besser gebunden werden und andere schlechter (Gryk et al., 1996). Das zeigt, dass die Evolution die richtige Balance aus „Steifheit“ und Flexibilität der TrpRDNA-Bindedomäne hervorgebracht hat, die für die korrekte Regulation benötigt wird. 2.2 Der Tetrazyklin-Repressor TetR als Modellsystem für einen allosterischen Regulator 2.2.1 Regulation der Tetrazyklin-Resistenz Die Zunahme bakterieller Resistenzen stellt sowohl Mediziner als auch Wissenschaftler vor immer neue Herausforderungen. Tetrazyklin (Tc) und seine Derivate galten seit ihrer Entdeckung in den 1940er und 1950er Jahren als wirkungsvolle Breitband-Antibiotika gegen Gram-negative und Gram-positive Bakterien, die darüber hinaus auch Wirkung gegen Chlamydien, Mykoplasmen und Rickettsien zeigten (Roberts, 2003). Tc inhibiert die Proteinbiosynthese, indem es, vermutlich als [Tc•Mg]+-Komplex, an die 16S rRNA der 30S-Untereinheit prokaryotischer Ribosomen bindet und so die Assoziation der Aminoacyl-tRNA mit dem Ribosom verhindert (Brodersen et al., 2000; Pioletti et al., 2001; Trieber & Taylor, 2002). Der extensive und zum Teil auch falsche Einsatz von Tc, sowie die Verwendung als Wachstumsförderer in der Tierzucht, führten mit der Zeit zur raschen Ausbreitung von Tc-Resistenzen unter den Bakterien (Mulvey & Simor, 2009; Neu, 1992). Mittlerweile sind über 80% der aus Fäkalien isolierten Keime tetrazyklinresistent (Madigan et al., 2008). Die Resistenzmechanismen reichen dabei von der Bildung ribosomaler Schutzproteine (Connell et al., 2003) über Mutationen der 16S-rRNA (Trieber & Taylor, 2002) bis hin zur aktiven Ausschleusung von Tc-Metall-Komplexen (Li & Nikaido, 2009). Auch eine oxidative Spaltung von Tc wurde beschrieben (Speer & Salyers, 1989). Die Efflux-Resistenz ist am weitesten verbreitet -6 EINLEITUNG und wird durch Gene vermittelt, die meist auf Resistenzplasmiden (R-Plasmiden), Transposons oder Integrons liegen und damit leicht auf andere Bakterien übertragen werden können (Chopra & Roberts, 2001). TetA ist das am besten untersuchte Efflux-Protein (Tamura et al., 2003). Es besteht aus 12 transmembranen α-Helices und fungiert als [Tc•Me]+-Proton-Antiporter. Eine konstitutive Expression von tetA führt zu einem Wachstumsnachteil (Nguyen et al., 1989), eine Überproduktion ist toxisch, da durch den unspezifischen Kationentransport das Membranpotential zusammenbricht (Eckert & Beck, 1989). Deshalb ist es notwendig, dass die Expression von tetA streng reguliert wird. Bei der Resistenzdeterminante Tet(B) auf dem Transposon Tn10 geschieht das durch den Transkriptionsregulator TetR, der sowohl die Expression von TetA als auch seine eigene reguliert. Hier sind das Resistenzgen tetA und das Regulatorgen tetR divergent um eine 81 bp lange Kontrollregion angeordnet (Abb. 2.2). Diese besteht aus dem Promotor für tetA (PA) und den zwei sich überlappenden Promotoren für tetR (PR1 und PR2), die durch zwei nahezu identische, palindrome Operatoren tetO1 und tetO2 überlagert werden (Bertrand et al., 1983). H+ Tc TetA N‘ C‘ Tc + Me2+ H+ + [Tc•Me]+ 50S 106 M-1 109 M-1 30S tetR tetO1 tetA tetO2 + + + + TetR Abb. 2.2: Genetische Organisation der Tetrazyklin-Resistenzdeterminante auf dem Transposon Tn10. Zwischen dem Resistenzgen tetA und dem Regulatorgen tetR befinden sich zwei Operatoren tetO1 und tetO2, die in Abwesenheit von Tc von je einem TetR-Dimer besetzt werden. Dadurch wird die Transkription sowohl des Membrantransportes TetA als auch des Repressors reprimiert. Tc (gelbe Dreiecke) diffundiert in seiner protonierten 2+ Form passiv durch die Cytoplamsamembran und wird im Cytoplasma mit zweiwertigen Metallionen Me 2+ + (hauptsächlich Mg ) komplexiert und bildet erst dadurch den biologisch aktiven Komplex [Tc•Me] . Noch bevor in der Zelle eine antibiotisch wirksame Konzentration an Tc erreicht wird, indem die Anlagerung von [Tc•Me]+ an die 30SUntereinheit des Ribosoms die Proteinbiosynthese inhibiert, induziert [Tc•Me]+ TetR, der sich daraufhin von den + Operatoren löst. Dadurch wird die Expression des Resistenzgens ermöglicht und [Tc•Me] kann aktiv aus der Zelle ausgeschleust werden. Die roten Zahlen geben die jeweiligen Bindekonstanten (KA) an. -7 EINLEITUNG Die Transkription der beiden Gene wird durch die Bindung von TetR an die Operatoren so lange reprimiert, bis Tc in die Zelle eindringt und den Repressor als [Tc•Mg]+-Komplex induziert (Hillen et al., 1983). So wird TetA nur in Anwesenheit von Tc gebildet. Die Bindung von [Tc•Mg]+ an TetR ist hochaffin und liegt mit einer Bindekonstante von 109 M-1 etwa drei Zehnerpotenzen über der Bindekonstante von Tc an die ribosomale 30S-Untereinheit (Lederer et al., 1996; Takahashi et al., 1986). Auf diese Weise wird sichergestellt, dass die Zelle bereits auf eingedrungenes Tc reagieren kann bevor das Antibiotikum die Proteinbiosynthese inhibiert. 2.2.2 Struktur und Funktion von TetR Der Tetrazyklin-Repressor (TetR) ist ein Mitglied der TetR/CamR-Familie von Transkriptionsregulatoren (Ramos et al., 2005) und liegt in seiner biologisch aktiven Form als 46 kDa großes Homodimer vor. Jedes Monomer besteht aus zehn α-Helices und kann in zwei Bereiche unterteilt werden: in die N-terminale DNA-Bindedomäne und in den C-terminalen Proteinkörper, der die Effektorbindetasche und die Dimerisierungsdomäne enthält (Abb. 2.3). Die DNA-Bindedomäne besteht aus einem Dreihelixbündel (α1-α3). Während α1 zur Konformation der globulären Domäne beiträgt, bilden die Helices α2 und α3 mit der dazwischenliegenden Schleife ein Helix-turn-Helix-Motiv (HTH-Motiv) aus, das isostrukturell zu den HTH-Motiven anderer regulatorischer Proteine wie CAP oder FIS ist. Allerdings ist die Erkennungshelix α3 vom N-Terminus her um eine Windung verkürzt, wodurch α3 invertiert wird und sich die N-terminalen Enden beider HTH-Motive gegenüberstehen (Kisker et al., 1995). Die DNA-Bindedomäne ist mit dem Proteinkörper durch Helix α4 verbunden (Orth et al., 2000). Der Proteinkörper selbst besteht aus den Helices α5 bis α10 (und α5‘ bis α10‘ für das zweite Monomer). In jedem Monomer bilden die antiparallelen Helices α8, α10 zusammen mit α5 eine flexible, tunnelartige Effektorbindetasche. Abb. 2.3: Struktur der DNAgebundenen Form von TetR. Helices der DNA-Bindedomäne sind blau, die Helices α4, α5, α7 und α9, die an der Konformationsänderung beteiligt sind, grün dargestellt. Gelb eingefärbt sind Helices, die ihre Position während der Induktion nicht verändern. Das Desoxyribose-Phosphat-Rückgrat von tetO ist in rot dargestellt, die Basen als graue Stabmodelle. Die Abbildung wurde aus (Orth et al., 2000) entnommen. -8 EINLEITUNG Bisher wurden 14 Tc-Resistenzdeterminanten identifiziert, die einen Repressor zur Transkriptionsregulation des Resistenzgens besitzen. Diese wurden verschiedenen Sequenzklassen zugeordnet (Klasse A bis E, G, H, J, Z, 30, 31, 33, 39 und 41) (Agersø & Guardabassi, 2005; Levy et al., 1999; Levy et al., 1989; Luo & Farrand, 1999; Thompson et al., 2007). Von den Repressoren sind TetR(B) und TetR(D) am besten untersucht. Die ersten Experimente wurden mit TetR(B) durchgeführt. Da sich am Anfang für TetR(B), im Gegensatz zu TetR(D), keine Kristallstruktur anfertigen ließ, wurde die Chimäre TetR(BD) konstruiert. Sie besteht aus 208 Aminosäuren und trägt die DNA-Bindedomäne von TetR(B), während der Proteinkörper von TetR(D) stammt. TetR(BD) vereint die guten Regulationseigenschaften von TetR(B) mit der Stabilität von TetR(D) (Schnappinger et al., 1998). 2.2.2.1 Dimerisierung von TetR Die beiden Monomere des TetR Dimers werden von hydrophoben Wechselwirkungen und Wasserstoffbrücken zusammengehalten. Die Dimerisierungsfläche, in welche die Helices α6 bis α10 involviert sind, macht 27% der gesamten TetR-Oberfläche aus (Kisker et al., 1995). Das Vierhelixbündel aus den antiparallelen Helices α8 und α10 beider Monomere bildet das zentrale Dimerisierungsmotiv (Kisker et al., 1995), was ein häufiges Strukturmotiv für die Oligomerisierung von Proteinen ist (Lin et al., 1995). Obwohl die Aminosäuresequenzen der beiden Repressoren TetR(B) und TetR(D) zu 63% übereinstimmen und die Proteine eine isomorphe Tertiär- und Quartärstruktur besitzen (Hillen & Berens, 1994), werden aufgrund der fehlenden strukturellen Komplementarität der Helices α10 und α10‘ keine Heterodimere gebildet. Austausche einzelner Aminosäuren in dieser Helix können jedoch die Dimerisierungsspezifität ändern (Schnappinger et al., 1998). Zusätzlich zu den hydrophoben Interaktionen im Proteinkern tragen solventsexponierte Reste zur Stabilität des Dimers bei. So wurde eine große Bedeutung von Aminosäure 128 sowie von der α9-α10-Schleife mit deren angrenzenden Resten (Aminosäuren 179-184) für die Stabilität des Dimers ermittelt (Schnappinger et al., 1999; Schubert et al., 2001). 2.2.2.2 DNA-Bindung von TetR Die kleinere N-terminale DNA-Bindedomäne beinhaltet ein klassisches Helix-turn-Helix-Motiv (HTH-Motiv), das von der Positionierungshelix α2, der Erkennungshelix α3 und der dazwischenliegenden Schleife gebildet wird. Über zwei dieser HTH-Motive bindet das TetR-Dimer an den palindromen tet-Operator, von dessen 19 bp langer Sequenz 12 bp spezifisch erkannt werden. Positioniert wird das HTH-Motiv über die Aminosäuren 26, 27, 37, 40, 42, 44 und 48, deren Seitenketten Wechselwirkungen mit den Phosphatgruppen der DNA eingehen. Die Aminosäuren Gln38, Pro39, Thr40, Tyr42, Trp43 und His44 sind für die spezifische Basenerkennung verantwortlich, welche über Wasserstoffbrücken und/oder Van-der-Waals-Kontakte erfolgt (Orth et al., 2000). Erkannt werden dabei die Basen 2 bis 6 jeder Operatorhälfte (Helbl et al., 1995). Vergleicht man die beiden tet-Operatoren miteinander, so unterscheiden sie sich nur in den -9 EINLEITUNG Positionen 0, 7, und 9. Die Bindung von TetR an tetO ist mit einer Bindekonstante1 von KA ≈ 1011 M-1 hochaffin (Lederer et al., 1995). Nach der ersten Bindung des ersten [Tc•Mg]+ verringert sich die Affinität um etwa zwei bis drei Größenordnungen, nach der Bindung des zweiten [Tc•Mg]+ um weitere vier bis sieben Größenordnungen (Lederer et al., 1995). 2.2.2.3 Induktorbindung und Induktion von TetR Während der ebenfalls gut erforschte Multi-Resistenz-Repressor QacR aus der TetR/CamRFamilie durch verschiedenste kationische, lipophile Moleküle induziert werden kann (QACs: Quaternary Ammonium Compounds) (Schumacher et al., 2001), interagiert TetR trotz einer ähnlichen Gesamtstruktur spezifisch mit Tetrazyklinen. Allerdings wurden in jüngster Zeit auch Oligopeptide und RNA-Aptamere gefunden, die in der Lage sind, eine Induktion von TetR zu bewirken (Hunsicker et al., 2009; Klotzsche et al., 2005). a) Induktion durch Tetrazykline Tetrazyklin (Tc) ist der natürliche Induktor von TetR. Erst durch Bindung an Mg2+ entsteht die biologisch aktive Form des Tetrazyklins [Tc•Mg]+. Auch für den durch Tc ausgelösten Induktionsvorgang sind zweiwertige Metallionen wie Mg2+, Co2+, Fe2+, Ca2+, Mn2+ oder Ni2+ essentiell2 (Palm et al., 2008). Es gibt jedoch Derivate wie Anhydrotetrazyklin (ATc), für das zumindest in vitro eine Mg2+-unabhängige Induktion gezeigt werden konnte (Scholz et al., 2000). In jeder der beiden Effektor-Bindetaschen des Homodimers, wird ein [Tc•Mg]+-Komplex mit hoher Affinität gebunden. Mit einer Bindekonstante von 3,3 • 109 M-1 (Takahashi et al., 1986) zählt die Bindung zu den stärksten, die bisher für eine Induktor-Repressor-Wechselwirkung gefunden wurden3. An der Bindung von [Tc•Mg]+ sind insgesamt 16 Aminosäuren aus beiden Monomeren beteiligt, die hydrophile oder hydrophobe Wechselwirkungen mit dem Komplex eingehen (Kisker et al., 1995) (Abb. 2.4). Die Aminosäuren His64, Asn82, Phe86 und Gln116 bilden Wasserstoffbrücken zu dem A-Ring von Tc aus, der in einer überwiegend hydrophilen Umgebung liegt. Als besonders wichtig hat sich dabei der Kontakt zwischen Asn82 und der 4-Dimethylaminogruppe herausgestellt. Der Verlust dieser Gruppe führt zu einer 5000-fach geringeren Affinität zu TetR (Lederer et al., 1996). Für die oktaedrische Koordination des Mg2+ sind die Aminosäuren His100, Thr103 und Glu147 wichtig. Während der Stickstoff des Imidazols von His100 nahe genug an Mg2+ liegt, um direkt mit diesem zu interagieren, tragen Thr103 und Glu147 aufgrund ihrer größeren Distanz zu Mg2+ vermutlich indirekt über Wassermoleküle zu der Koordination bei. His100 und Thr103 sind auch an der Signaltransduktion beteiligt. Durch die Bindung von [Tc•Mg]+ wird Thr103 um etwa 1 2 3 Assoziations-Gleichgewichtskonstanten (KA) werden der Einfachheit nur als „Bindekonstanten“ bezeichnet. In Bakterienzellen wird aufgrund der hohen Konzentration an Mg2+ im Vergleich zu den anderen zweiwertigen Metallionen hauptsächlich [Tc•Mg]+ gebildet. Andere gut charakterisierte bakterielle Repressoren wie LacI, TrpR, PurR oder TreR haben um zwei bis drei Größenordnungen geringere Ligandenaffinitäten (Dunaway et al., 1980; Hars et al., 1998; Joachimiak et al., 1983; Xu et al., 1998). - 10 EINLEITUNG 3,9 Å verschoben, was zu einer teilweisen Entwindung von Helix α6 führt. Ebenfalls wichtig hierfür ist Gly102, das die notwendige Bildung einer β-Schleifenstruktur ermöglicht. Die Ringe C und D befinden sich in einer hydrophoben Umgebung und werden von den Aminosäuren Arg104, Pro105, Val113, Leu131, Ile134, Leu170‘, Leu174‘ und Met177‘ über Vander-Waals-Wechselwirkungen kontaktiert. Zwischen Val113 und der 6-Hydroxy-Gruppe entsteht dabei eine abstoßende Wirkung. Die Eliminierung dieser Gruppe in Anhydrotetrazyklin (ATc) verstärkt die Affinität zu TetR um den Faktor 5001 (Scholz et al., 2000). Um das Signal der Tc-Bindung von der Effektor-Bindetasche auf die 33 Å entfernten DNAErkennungshelices zu übertragen, sind bestimmte Konformationsänderungen notwendig. Durch den Vergleich der Kristallstrukturen der induzierten und operatorgebundenen Form von TetR wurde ein Modell der Konformationsänderungen postuliert, die während des Induktionsvorgangs stattfinden (Hinrichs et al., 1994; Kisker et al., 1995; Orth et al., 2000): Zuerst wird der A-Ring mit Wasserstoffbrücken in der Bindetasche verankert. Die daran beteiligten Aminosäuren His64, Asn82, Phe86 und Gln116 behalten ihre Position während des gesamten Induktionsvorgangs bei. Die Koordination des Mg2+ erfordert eine Bewegung von His100 um 1,9 Å und von Thr103 um 3,9 Å (Orth et al., 2000), wodurch die α6-α7-Schleife um etwa 2,5 Å angehoben wird. Durch das Anheben wird zum einen Helix α6 in Richtung C-Terminus gezogen, zum anderen werden mehrere essentielle Reste der α6-α7-Schleife neu angeordnet, darunter Arg104, Pro105 und Gln109. Für die Feinausrichtung spielen Gly102, das die Entwindung des C-Terminus von α6 zu einer Typ II βSchleife ermöglicht, und Pro105, das durch seine Struktur einen „Knick“ in der α6-α7-Schleife verursacht, eine wichtige Rolle. Das führt dazu, dass Arg104 und Pro105 mit dem D-Ring von Tc wechselwirken können und den hydrophoben Erkennungsbereich der Effektorbindetasche vergrößern. Zusätzlich bewegt sich Helix α9 auf die α6‘-α7‘-Schleife zu, wodurch der Zugang zur Bindetasche teilweise verschlossen und damit ein Austreten von Tc verhindert wird (Orth et al., 1999a). Über Van-der-Waals-Kräfte zwischen Val99 und Thr103 zu Leu52 und Ala56 wird Helix α4 mit Helix α6 mitgezogen. Da der C-Terminus von α4 über den „Ankerrest“ His64 am Tc fixiert ist, führt das zu einer pendelartigen Bewegung, worauf der Abstand zwischen den Erkennungshelices α3 und a3‘ um etwa 3 Å auf etwa 39 Å vergrößert wird (Orth et al., 2000). Für eine Bindung der HTH-Motive an die großen Furchen der DNA ist dieser Abstand zu groß, sodass TetR vom Operator dissoziiert (die Bindekonstante sinkt durch die Abstandsänderung von 1011 M-1 auf 103 M-1 (Lederer et al., 1996)). b) Induktion durch Oligopeptide Über ein Phage Display wurde 2005 ein Oligopeptid aus 16 Aminosäuren isoliert, das TetR(B) ebenfalls induzieren kann und das als „Transkription induzierendes Peptid“ (kurz: Tip) bezeichnet wird (Klotzsche et al., 2005). Exprimiert wird Tip dabei als Fusion an den C- oder N-Terminus von 1 Mit einer Bindekonstante von ≈ 1012 M-1 für [ATc•Mg]+ stellt ATc bisher den am höchsten affinen Induktor dar (Scholz et al., 2000). - 11 EINLEITUNG Thioredoxin A (TrxA)1. Während die C-terminale Fusion von Tip an TrxA (Tip-TrxA) einen Induktionsfaktor von 12 aufweist, liegt der Induktionsfaktor von der N-terminale Fusion (TrxA-Tip) bei 40. Damit induziert TrxA-Tip ähnlich effektiv wie Tc (Klotzsche et al., 2005). Trotzdem ist die Affinität von TrxA-Tip zu TetR mit einer Bindekonstante von 1,6 • 106 M-1 etwa 1000-fach geringer als bei Tc (Klotzsche, 2005). Die Wechselwirkungen zwischen Tip und TetR unterscheiden sich erheblich von denen zwischen Tc und TetR. Während die ersten vier Aminosäuren von Tip mit Resten aus der Effektorbindetasche interagieren (Abb. 2.4), wechselwirken die Aminosäuren 5 bis 12 mit Resten an der Proteinoberfläche (Luckner et al., 2007). Repressor-Mutanten und Chimären zeigten, dass sowohl die Interaktionen mit den Seitenketten der Bindetasche, als auch die Kontakte zur Oberfläche für die Induktion durch Tip essentiell sind (Klotzsche et al., 2005). Die Spezifität für TetR(B) wird dabei durch die Helices α8, α9, sowie durch die dazwischenliegende Schleife (Aminosäuren 128-182) vermittelt (Klotzsche et al., 2005). Durch eine Randomisierung der ersten 12 Aminosäuren von Tip wurde herausgefunden, dass die ersten 4 Aminosäuren sowie der aromatische Rest an Position 8 essentiell für die Induktion durch Tip sind (Daam et al., 2008), während Positionen 5-7 verschiedene und 9-12 beinahe alle Austausche zulassen. Obwohl die Induktion durch Tip zu derselben Bewegung der DNABindedomäne führt, die auch bei der Induktion durch Tc auftritt, wird aufgrund der sehr unterschiedlichen Kontakte zwischen Tip und TetR ein anderer Induktionsmechanismus angenommen (Luckner et al., 2007). In der bisherigen Literatur werden zwei Möglichkeiten für die Tip-Induktion vorgeschlagen (Daam, 2008): 1) Die Bindung von Tip führt zu einer Wechselwirkung mit Thr103. In der Kristallstruktur von [TetR(B)•Tip] ist die Schleife zwischen α6 und α7 angehoben; eine ähnliche Konformationsänderung, wie sie auch bei der Tc-Induktion auftritt. Ob diese Verschiebung jedoch allein auf die Wasserstoffbrücke zwischen Thr103 und W1 von Tip zurückzuführen ist, dem einzigen Kontakt zwischen Tip und der α6-α7-Schleife (Luckner et al., 2007), kann mit den bisherigen Daten nicht beantwortet werden. Es wird auch ein Beitrag von His151‘ vermutet, das eine Wasserstoffbrücke zu Thr103 ausbildet. His151‘ liegt in Helix α8‘, die mehrere Tipkontaktierende Reste besitzt und durch die Bindung von Tip neu ausgerichtet wird. Durch die Anhebung der α6-α7-Schleife verschiebt sich Helix α6. Helix α4, die über hydrophobe Kontakte mit α6 verbunden ist, folgt dieser Bewegung, die dann auf die DNA-Bindedomäne übertragen wird. Dadurch entfernen sich α3 und α3‘ voneinander und TetR löst sich vom Operator. 2) Helix α4 wird nicht über die Kontakte zu Helix α6 verschoben, sondern über Wechselwirkungen mit Helix α8 und der Schleife zwischen α8 und α9. Die Bindung von Tip führt zu einer Verlängerung der Helix α8 um eine Windung und einer Neuordnung der Seitenketten in der 1 Es wurden auch Fusionen mit SbmC und Hpr hergestellt, die in der Lage sind, TetR(B) in vivo zu induzieren (Capek, 2005; Friedlein, 2006; Klotzsche et al., 2005). - 12 EINLEITUNG Schleife zwischen α8 und α9, vermutlich ausgelöst durch hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den Resten dieser Region und den essentiellen Aminosäuren W3 und F8 von Tip (Daam et al., 2008). Andere Reste aus dieser Schleife können in ihrer neuen Position direkt die N-terminalen Seitenketten von Helix α4 kontaktieren. Diese Kontakte führen zu einer Verschiebung von Helix α4 und der angrenzenden DNA-Bindedomäne, wodurch sich die beiden Erkennungshelices voneinander entfernen und sich TetR vom Operator löst. In der Zwischenzeit wurden weitere Peptide mit höherer Induktionseffizienz gefunden (D. Goeke, unveröffentlicht), sowie ein Oligopeptid, das neben TetR(B) auch TetR(D) und TetR(BD) induziert (Daam, 2008). c) Induktion durch RNA-Aptamere Die neueste Entdeckung ist ein RNA-Aptamer, das in der Lage ist, TetR genauso effizient wie Tc zu induzieren. Im Gegensatz zu den Tetrazyklinen und Peptiden bindet das Aptamer aber wahrscheinlich nicht in die Effektorbindetasche, sondern an die DNA-Bindedomäne (Hunsicker et al., 2009). Q116 Tc L113 I174‘ C D R104 H 2N OH O O OH A B - N F177‘ O P105 O OH OH N O W3 N82 R104 N82 A5 F86 T2 N4 W1 N O O O O H139 D148‘ T103 E147‘ H64 P105 P105 N N O Q116 L117 L131 L134 L113 L170‘ I174‘ F8 H 2N NH+ O H64 F86 D148‘ Q109 NH 2 OH P105 N N O L134 L131 F177‘ L170‘ L117 I174 F177 Tip Q109 H100 O H100 N H139 HO T103‘ E147‘ Abb. 2.4: Schematische Darstellung der Interaktionen zwischen Tc (links) und Tip (rechts) mit Aminosäuren der Effektorbindetasche von TetR(B). Die hydrophobe Kontaktregion der Effektorbindetasche ist hellgrau, die beiden hydrophilen Kontaktregionen sind dunkelgrau dargestellt. Tc und die ersten fünf Aminosäuren von Tip sind als Stabmodell dargestellt. Mg2+ ist als graue, die für die Mg2+-Koordination wichtigen Wassermoleküle als schwarze Kugeln eingezeichnet. Die schwarzen Pfeile deuten den Eintritt der Effektoren in die Bindetasche an. Für die Induktion wichtige Aminosäuren sind fett gedruckt, Aminosäuren, die keinen (bedeutenden) Kontakt ausüben sind normal gedruckt. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, gepunktete und hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien eingezeichnet. Die Abbildung wurde nach (Klotzsche et al., 2007) verändert. Für die Erstellung der Abbildungen wurden die Kristallstrukturen [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) und [TetR(B)•Tip] (PDB-Eintrag: 2NS8) verwendet. 2.3 Das Tet-System: Anwendung und Modifikationen von TetR Das Tet-System ist bisher eines der effiktivsten Systeme zur Transkriptionsregulation (Hillen & Berens, 2003). Das effiziente Eindringen von Tc in die meisten Zellen durch Diffusion und die hohe Affinität der Tetrazykline zu TetR ermöglichen den Einsatz von geringen, nicht-toxischen - 13 EINLEITUNG Induktorkonzentrationen. Durch die Entwicklung von Varianten mit geänderter Induktor- oder Operator-Spezifität, sowie der Möglichkeit, das Regulationsverhalten von TetR umzukehren, ist das Tet-System zu einer Art „Baukasten“ für kontrollierte Genexpression geworden. Aufgrund der hohen Affinität zu seiner spezifischen DNA-Erkennungssequenz sowie der niedrigen Affinität zu unspezifischer DNA, kann TetR auch für die gezielte Regulation einzelner Gene in eukaryotischen Zellen eingesetzt werden, die wesentlich größere Genome als Bakterien haben (Gossen et al., 1993). Erfolgreich angewendet wurde das System bereits in Pilzen (Nagahashi et al., 1997; Park & Morschhauser, 2005; Zarnack et al., 2006), Pflanzen (Gatz et al., 1991; Gatz & Quail, 1988; Schernthaner et al., 2003), Drosophila (Stebbins et al., 2001), Mäusen (Lewandoski, 2001) sowie in einigen Säugerzelllinien (Fussenegger, 2001; Gossen et al., 1995), wobei hier Doxyzyklin (Dox) der effektivste Induktor ist. Für die Anwendung in Säugetierzellen wird TetR meist mit Regulatordomänen fusioniert1. Fusionen mit Aktivatordomänen wie VP16 aus Herpes simplex oder p65 aus dem humanen NF-κB führen zu tetrazyklinabhängigen Transregulatoren (tTA) (Baron et al., 1997; Gossen et al., 1995; Urlinger et al., 2000b), Fusionen mit Repressordomänen Transsilencern wie (tTS) der humanen (Gossen & KRAB-Domäne Bujard, 2002) (Abb. führen zu 2.5). Ob tetrazyklinabhängigen diese Fusionen die Signalübertragung in TetR beeinflussen, ist nicht bekannt. Allerdings zeigen nicht alle bisher untersuchten TetR-Varianten in Prokaryoten und Eukaryoten dasselbe Regulationsverhalten (persönl. Mitteilung C. Berens). Aktivatordomänen - Dox VP16 p65 mRNA tTA Repressordomänen + Dox TATA Gen X TATA Gen X (tetO)7 KRAB tTS (tetO)7 Abb. 2.5: Regulation der Genexpression in Eukaryoten durch das tTA/tTS-basierte Tet-System. Die TetTransregulatoren bestehen aus dem TetR-Dimer (grau) und den daran fusionierten Aktivatordomänen (grün) [TetTransaktivatoren; tTA] bzw. Repressordomänen (rot) [Tet-Transsilencer; tTS]. Das Regulationsschema ist für einen tTA gezeigt. Die tTA-Bindestelle besteht aus sieben tet-Operatoren (tetO)7, die vor einer TATA-Box positioniert werden und eine Bindung der initialen Transkriptionsfaktoren ermöglicht. In Abwesenheit von Dox bindet tTA an (tetO)7. Durch Wechselwirkungen der Aktivatordomänen mit dem Transkriptions-Initiationskomplex wird Gen X exprimiert. In Anwesenheit von Dox (gelbe Dreiecke) führt die Konformationsänderung von TetR zur Dissoziation von tTA von den Operatoren, wodurch Gen X reprimiert wird. 1 Das kommerzielle T-REx™-System der Firma Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland) kommt ohne Fusion mit einer Regulatordomäne aus. Bei diesem System befinden sich zwischen der TATA-Box des CMV-Promotors und dem Transkriptionsstart des zu untersuchenden Gens zwei tet-Operatoren. Durch Bindung von TetR an tetO wird die Transkription des nachgeschalteten Gens so lange inhibiert, bis TetR durch Dox induziert wird. - 14 EINLEITUNG 2.3.1 TetR-Varianten mit geänderter Induktorspezifität Obwohl der Einsatz von Tetrazyklin in der Viehzucht von der EU verboten wurde, ist dieses durch den jahrelangen übermäßigen Einsatz als wachstumsförderndes Mittel oder als Antibiotikum bereits in vielen Lebensmitteln nachweisbar (Oka et al., 2000). Das könnte zu möglichen Komplikationen bei einem Einsatz des Tet-Systems in der Gentherapie führen. Daher wird seit einiger Zeit an alternativen Effektoren für TetR geforscht. Auch für die unabhängige Regulation von zwei Genen mit dem Tet-System werden zwei Repressoren mit unterschiedlicher Operator- und Induktorspezifität benötigt. Als Basis für neue Induktorspezifitäten werden schon seit Längerem Tc-Derivate ohne die 4-Dimethylaminogruppe verwendet, da diese Moleküle für TetR keine Induktoren darstellen (Lederer et al., 1996; Scholz et al., 2003). Durch in vitro Evolution wurde eine Doppelmutante H64K S135L identifiziert, die durch 4-de(dimethylamino)-Sanzyklin (4-ddma-San) induziert werden kann und eine 300-fach bessere Bindung für dieses Derivat zeigt (Scholz et al., 2003). Da diese Mutante auch noch durch starke Induktoren wie ATc und Dox induzierbar ist, wurde versucht, die Bindetasche soweit zu verkleinern, dass nur noch Derivate ohne 4-Dimethylamino-Gruppe als Induktor fungieren können. Dieses Ziel wurde durch die zusätzliche Mutation S138I in TetRi2 erreicht. TetRi2 ist nicht mehr durch Tc und Dox induzierbar und zeigt auch für ATc nur eine schwache Sensitivität (Henssler et al., 2004). Diese geänderte Induktorspezifität für 4-ddma-ATc/ 4-ddma-San konnte bisher nur für TetR(BD) etabliert werden. Für die Peptid-basierte Induktion wurde die Mutante TetR(B) N82A F86A hergestellt, die aufgrund fehlender Kontakte in der Effektorbindetasche nicht mehr durch Tetrazykline, sondern ausschließlich durch verschiedene Tip-Varianten induzierbar ist (Klotzsche et al., 2007). 2.3.2 TetR-Varianten mit geänderter Operatorspezifität Dass die DNA-Bindespezifität für bakterielle Regulatoren mit HTH-Motiv geändert werden kann, wurde bereits bei dem Tryptophan-Repressor TrpR oder dem katabolischen Gen-Aktivatorprotein CAP gezeigt (Ebright et al., 1984; Günes & Müller-Hill, 1996). Für die Operatorspezifität von TetR spielt die Erkennungshelix α3 eine wichtige Rolle, deren Aminosäuren die tetO-Nukleotide 2 bis 6 kontaktieren (Orth et al., 2000). Bei der Erforschung der DNA-Erkennung von TetR wurde bei einer ungerichteten Mutagenese die TetR-Variante TetRo1 (TetR E37A P39Q Y42M) gefunden, die spezifisch an den tetO-4C Operator bindet (Helbl & Hillen, 1998) und bereits zur Konstruktion von ersten Zwei-Schalter-Systemen verwendet wurde (Kamionka et al., 2004b; Krueger et al., 2004). Da auch der Wildtyp-TetR noch über eine Resterkennung von tetO-4C verfügt, wurde der weitere Nukleotidaustausch 5G in den Operator eingeführt. In vivo-Messungen zeigten, dass TetR nicht an tetO-4C5G binden kann (Krueger et al., 2007). Durch Randomisierung einzelner Positionen im HTH-Motiv von TetR, sowie gezielte Kombination von Aminosäureaustauschen wurden drei Varianten gefunden, die spezifisch an tetO-4C5G binden - 15 EINLEITUNG (Krueger et al., 2007). Die für die Spezifitätsänderung entscheidenden Aminosäuren konnten dabei auf Ala37 und Lys39 eingegrenzt werden. Während E37A essentiell ist, damit TetR andere Operatoren als die Wildtyp-Sequenz erkennen kann1 (Wissmann et al., 1991), vermittelt P39K durch direkte Wechselwirkungen mit der DNA die Spezifität für tetO-4C5G (Krueger et al., 2007). Diese Operatorspezifität für tetO-4C5G wurde für TetR(BD) entwickelt und lässt sich auch auf TetR(B) übertragen, wobei bei diesen Varianten die Repressionseigenschaften etwas schlechter sind (Letz, 2009). 2.3.3 Umkehr des Regulationsverhaltens: Der reverse Tet-Repressor Auf der Suche nach induktionsdefizienten TetR-Varianten wurde 1994 von Gerhard Müller eine Mutante gefunden (TetR E71K D95N L101S G102D), die nur in Anwesenheit von Tetrazyklin an den Operator binden kann, das in diesem Fall als Korepressor wirkt (Müller, 1995). Diese Variante wurde aufgrund ihres Phänotyps als „reverser“ Tet-Repressor (revTetR) bezeichnet. In den nachfolgenden Jahren wurden durch Mutagenese-Studien über 100 revTetR-Varianten mit z.T. viel besseren Regulationseigenschaften entdeckt, von denen die meisten Aminosäure-Austausche in den Helices α1, α4 und α6 tragen – der Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNABindedomäne. Bereits einzelne Mutationen wie L17G oder V99E sind in der Lage, TetR in revTetR umzuwandeln (Scholz et al., 2004). In vitro Untersuchungen der reversen Variante TetR G96E L205S bestätigten die Funktion von ATc als Korepressor. Die Bindekonstante für die Operator-Bindung stieg nach Zugabe von ATc um drei Größenordnungen von ≈105 M-1 auf ≈108 M-1 (Kamionka et al., 2004a). Stabilitätsanalysen des freien und ATc-gebundenen revTetR führen zu der Annahme, dass der Phänotyp von revTetR auf eine partielle Entfaltung und Destabilisierung der DNA-Bindedomäne zurückzuführen ist. Die Bindung von ATc initiiert – nach dem Prinzip eines „disorder-to-order“-Übergangs, wie er schon für die Transkriptionsregulatoren TraR oder BirA beschrieben wurde (Weaver et al., 2001; Zhu & Winans, 2001) – die Rückfaltung der Bindedomäne in eine vermutlich flexible Konformation, die es revTetR erlaubt, an den Operator zu binden (Resch et al., 2008) (Abb. 2.6). TetR ist zurzeit der einzige bakterielle Regulator, für den eine durch Mutationen ausgelöste Umkehrung des Regulationsverhaltens beschrieben wurde. Im Gegensatz hierzu war bisher nur bekannt, dass die Bindung unterschiedlicher Effektoren zu einem unterschiedlichen Regulationverhalten führen kann, wie es beim Laktose-Repressor LacI der Fall ist. Während LacI durch Allolaktose oder Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) induziert wird, stabilisiert orthoNitrophenyl-β-D-fukosid (ONPF) die DNA-gebundene Konformation (Bell & Lewis, 2000; Suckow et al., 1996) und wirkt dadurch als „Anti-Induktor“. 1 Die Verkürzung der Seitenkette von Glu37 führt vermutlich zu einer erhöhten Flexibilität, die ähnlich wie bei TrpR dazu führt, dass der Repressor an verschiedene DNA-Sequenzen binden kann (Gryk et al., 1996). - 16 EINLEITUNG Die Entdeckung des revTetR ermöglichte vor allem für die eukaryotische Genregulation ganz neue Möglichkeiten. Fusioniert mit der Aktivatordomäne VP16 ermöglichte die Vierfachmutante von Gerhard Müller als „reverser“ tTA (rtTA) in HeLa-Zellen das gezielte Anschalten von Genen durch Zugabe von Doxyzyklin (Berens & Hillen, 2003; Forster et al., 1999; Gossen et al., 1995; Kistner et al., 1996). Dies erwies sich als effizienter als das bisher übliche Anschalten von Genen durch den Entzug von Dox, da sich Dox in Membranen einlagert und dieses „Dox-Depot“ auch noch nach Absetzen der Effektor-Zugabe Dox freisetzen kann. Aufgrund eines geringen Regulationsfaktors, bedingt durch eine Restaffinität des rtTA für tetO in Abwesenheit von Dox, war das Anwendungsgebiet anfangs noch limitiert. Daher wurden durch gerichtete und ungerichtete Mutagenesen in einem Auswahlverfahren mit Saccharomyces cerevisiae als Wirtsorganismus verbesserte reverse Tet-Transaktivatoren der Klasse B hergestellt (Urlinger et al., 2000a), deren Phänotypen jedoch nicht mehr auf E. coli übertragbar waren (Schubert, 2001). A B revTetR mRNA TetR tetO tetO Gen X +Tc +Tc + + + + tetO + Gen X mRNA tetO Gen X Gen X + + mRNA tetO tetO Gen X + Gen X Abb. 2.6: Gegenüberstellung des Regulationsverhaltens von TetR und revTetR. (A) In Abwesenheit von Tc bindet TetR an den Operator und reprimiert die Transkription des nachgeschalteten Gens. Die Bindung von Tc (gelbes Dreieck) führt zu einer Konformationsänderung, in der sich die beiden Erkennungshelices in der DNA-Bindedomäne 3 Å voneinander entfernen. Durch diesen vergrößerten Abstand kann TetR nicht länger an die großen Furchen der DNA binden, was dazu führt, dass sich der Repressor vom Operator löst. (B) Bei revTetR ist die Bindedomäne im freien Zustand partiell entwunden, wodurch keine Repression möglich ist. Die Bindung des Effektors führt zu einer Rückfaltung der DNA-Bindedomäne, die in diesem Zustand wahrscheinlich noch recht flexibel ist und eine DNA-bindende Konformation einnehmen kann. Dadurch reprimiert revTetR nur in Anwesenheit von Tetrazyklin. 2.4 Motivation, Fragestellung und Zielsetzung Das Anwendungsgebiet des Tet-Systems konnte in den letzten 15 Jahren durch die Konstruktion neuer Aktivitätsvarianten mit geänderter Induktor- oder Operatorspezifität (Helbl & Hillen, 1998; Helbl et al., 1998; Henssler et al., 2004; Krueger et al., 2007; Scholz et al., 2003), sowie durch die Entdeckung von reversen Repressoren (revTetRs) (Scholz et al., 2004) erheblich erweitert werden. - 17 EINLEITUNG Obwohl TetR seit fast drei Jahrzehnten intensiv untersucht wird, ist über die intramolekulare Informationsübertragung noch wenig bekannt, ebenso über die Auswirkungen von den eingefügten Mutationen auf den allosterischen Regulationsmechanismus. Zu wissen, wie die Informationen innerhalb des Proteins übertragen werden, ist jedoch eine Grundlage um neue Varianten mit neuen oder verbesserten Eigenschaften zu entwickeln – nicht nur für TetR, sondern auch für die strukturell ähnlichen Mitglieder der TetR/CamR-Familie, die zurzeit die drittgrößte Familie von Transkriptionsregulatoren darstellt (Ramos et al., 2005). Durch den Vergleich der Kristallstrukturen im Operator-gebundenen und induzierten (Effektor-gebundenen) Zustand wurde bereits ein möglicher Induktionsmechanismus postuliert (Orth et al., 2000). Diese Theorie konnte in jüngster Zeit durch Computerberechnungen der Moleküldynamik ergänzt werden, wie sie bereits für TetR (Aleksandrov et al., 2008; Haberl et al., 2009; Lanig et al., 2006a) und revTetR (Seidel et al., 2007) durchgeführt wurden. In dieser Arbeit sollten nun erstmals in vivo-Daten zur Aufklärung der Signalübertragung herangezogen werden, welche die Bedeutung von einzelnen Aminosäuren für den Induktionsmechanismus aufzeigen sollten. 1. Durch eine Austauschmutagenese sollte herausgefunden werden, welche Aminosäuren wichtig sind, um das Signal der Tetrazyklin-Bindung von der Effektorbindetasche zu der 30 Å entfernten DNA-Bindedomäne zu übertragen. Da Glycine Einfluss auf die Sekundärstruktur haben können (Gunasekaran et al., 1998), wurde eine Alanin-Austauschmutagenese gewählt. Bei der Auswahl der Aminosäuren sollte ein besonderes Augenmerk auf solche gelegt werden, die mit ihren Seitenketten Wechselwirkungen zu anderen Aminosäuren ausüben. Auf Basis der Ergebnisse sollte eine Signalweiterleitungskarte von TetR erstellt und ein möglicher Signalweg ermittelt werden. 2. Analog zu Punkt 1 sollte die Signalübertragung eines reversen Tet-Repressors untersucht werden. Die Daten der beiden Austauschmutagenesen sollten dazu verwendet werden, um herauszufinden, inwieweit sich die Induktion von TetR und die Korepression von revTetR unterscheiden. 3. Da nachgewiesen wurde, dass Tetrazyklin-Derivate ohne 4-Dimethylamino-Gruppe zwar an TetR binden können, diesen jedoch nicht induzieren, sollte überprüft werden, ob es sich bei diesen Molekülen um mögliche Anti-Induktoren für TetR handelt. Desweiteren sollte durch eine Austauschmutagenese der Induktorspezifitätsmutante TetRi2 untersucht werden, auf welche Weise 4-de(dimethylamino)-Anhydrotetrazyklin diese Variante spezifisch zu induzieren vermag. - 18 ERGEBNISSE 3 ERGEBNISSE 3.1 Untersuchung der Signalübertragung in TetR 3.1.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetR Die inter- und intramolekularen Wechselwirkungen zwischen Aminosäure-Resten, von denen letztere auch für die Signalübertragung in einem Protein wichtig sind, werden hauptsächlich durch das gezielte Austauschen von Aminosäuren untersucht. Die Alanin-Austauschmutagenese, d.h. die Verkürzung von Seitenketten, ist eine der häufigsten Methoden, durch die bereits die Bedeutung der Tc-bindenden Reste von TetR und der an der Dimerisierung beteiligten Aminosäuren ermittelt wurde (Schubert, 2001). Diese Methode sollte nun dazu verwendet werden, um herauszufinden, welche Aminosäuren von TetR das Signal der Effektorbindung von der Bindetasche über etwa 30 Å zu der DNA-Bindedomäne übertragen. Hierfür wurde in den verfügbaren Kristallstrukturen von TetR (vergl. Tabelle im Anhang) nach Aminosäuren gesucht, die über ihre Seitenketten Wechselwirkungen mit anderen Aminosäuren ausüben oder in einer günstigen Position dafür stehen. Insgesamt wurden 66 Aminosäuren für die Austauschmutagenese ausgewählt, die Zwischenregion in vier Proteinbereiche zwischen eingeteilt werden DNA-Bindedomäne und können: Proteinkörper, DNA-Bindedomäne, Proteinkörper Effektorbindetasche (Tabelle 3.1). DNA-Bindedomäne Zwischenregion Proteinkörper Effektorbindetasche Leu4, Val9, Glu15, Leu16, Leu25, Leu30, Leu34, Leu41, His44, Val45, Asn47, Lys48 Ile10, Asn11, Leu14, Leu17, Asn18, Ile22, Glu23, Arg49, Leu51, Asp53, Leu55, Glu58, Ile59, Arg62, His63, Arg92, Tyr93, Arg94, Asp95, Lys98, Val99, Lys108, Glu150, Asp157, Arg158 Leu60, Tyr66, Ser85, Arg87, Leu90, Leu101, Ser135, Gln148, Asp181 His64, Ser67, Asn82, Phe86, His100, Thr103, Arg104, Pro105, Gln109, Thr112, Val113, Gln116, Leu117, Leu131, Ile134, Ser138, Glu147, Leu170, Leu174, Met177 Tabelle 3.1: Ausgewählte Aminosäuren für die Alanin-Austauschmutagenese. Die Lage der einzelnen Aminosäuren, die als Kalottenmodell dargestellt sind, ist für jeweils ein Monomer in der Kristallstruktur von [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) gezeigt. - 19 und ERGEBNISSE Durch zweistufige PCR-Mutagenesen wurden die Codons dieser Aminosäuren auf dem Plasmid pWH1925 (Scholz et al., 2004) einzeln in Alanin-Codons umgewandelt. Der veränderte Bereich wurde anschließend über benachbarte Restriktionsschnittstellen in den Ausgangsvektor zurückkloniert. Bevor die modifizierten tetR-Allele für weitere Experimente verwendet wurden, wurde die Sequenz überprüft, um mögliche Sekundärmutationen aus den PolymeraseKettenreaktionen auszuschließen. 3.1.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne Die für die Austauschmutagenese ausgesuchten Aminosäuren aus der Bindedomäne haben bis auf Glu15, His44, Asn47 und Lys48 hydrophobe Seitenketten und bewirken hauptsächlich die globuläre Struktur der DNA-Bindedomäne durch hydrophobe Kernpackung. Glu15 trägt mit der Carboxylat-Gruppe in der Seitenkette eine oberflächenlokalisierte, negative Ladung (Kisker et al., 1995). Lys48 bildet eine Salzbrücke zu Gua10-O1P, His44 eine Wasserstoffbrücke zu einem Wassermolekül zwischen den Operatornukleotiden 7 und 8 (Aleksandrov et al., 2008; Orth et al., 2000). Die Repressionseigenschaften und Induzierbarkeiten der hergestellten Alanin-Mutanten wurden in vivo in dem Stamm E. coli WH207λtet50 (Wissmann et al., 1991) ermittelt, welcher eine chromosomale tetA:lacZ-Fusion trägt. Dieser Stamm wurde mit den tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 transformiert; die Aktivitäten der Mutanten wurden durch Messung der β-GalaktosidaseAktivität bestimmt und sind in Tabelle 3.2 zusammengefasst. Alle Mutanten sind sowohl durch Tc als auch durch ATc induzierbar. TetR L30A und -K48A reprimieren schlechter als der Wildtyp, bei TetR L41A und -H44A konnte keine Repression nachgewiesen werden. Bis auf TetR E15A zeigen alle Varianten höhere Induktionswerte für Tc, was eventuell durch eine leichtere Induzierbarkeit erklärt werden könnte, die durch die Modifikationen an der DNA-Bindedomäne auftritt. Von den Alanin-Mutanten mit verringerter Repression wurden die intrazellulären Proteinmengen ermittelt, um auszuschließen, dass dieser Phänotyp durch einen Mengeneffekt zustande kommt. Die Anzucht der Zellen erfolgte dabei analog zu den Induktionsmessungen im Stamm E. coli WH207λtet50. Aus logarithmisch wachsenden Kulturen wurden Proteinextrakte hergestellt und die Proteinkonzentrationen der Extrakte bestimmt (Material und Methoden, Seite 117). Der Gehalt an TetR wurde mithilfe polyklonaler Antikörper in einem Western-Blot ermittelt. Wie aus Abb. 3.1 ersichtlich ist, gibt es zwischen den Mutanten TetR L41A, -H44A, -K48A und dem Wildtyp keine drastischen Unterschiede in den Proteinmengen. Da dieser Faktor bei der Erklärung des Phänotyps ausgeschlossen werden kann, hängt die schwächere Repression vermutlich mit einer Affinitätsänderung zum Operator zusammen. - 20 ERGEBNISSE β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc TetR 1.0 ± 0.0 59 ± 2 (59) 93 ± 3 (93) TetR L4A 1.0 ± 0.1 71 ± 7 (71) 93 ± 6 (93) TetR V9A 1.2 ± 0.2 85 ± 3 (71) 98 ± 5 (82) TetR E15A 1.0 ± 0.1 57 ± 4 (57) 89 ± 8 (89) TetR L16A 1.0 ± 0.1 83 ± 3 (83) 100 ± 4 (100) TetR L25A 1.3 ± 0.1 86 ± 4 (66) 100 ± 3 (77) TetR L30A 6.6 ± 0.3 88 ± 2 (13) 104 ± 3 (16) TetR L34A 0.8 ± 0.0 55 ± 1 (69) 98 ± 4 (123) TetR L41A 95 ± 1 112 ± 2 (1) 107 ± 4 (1) TetR H44A 90 ± 4 109 ± 2 (1) 92 ± 5 (1) TetR V45A 1.5 ± 0.1 93 ± 4 (62) 92 ± 5 (61) TetR N47A 1.6 ± 0.1 77 ± 5 (48) 92 ± 4 (58) TetR K48A 9.9 ± 0.2 90 ± 1 (9) 94 ± 3 (10) K48A H44A L41A wt 30 ng Tabelle 3.2: Induzierbarkeit von TetR(BD)-Varianten mit Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. Abb. 3.1: Western-Blot von ausgesuchten TetR-Varianten mit Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne und einem vom Wildtyp-Verhalten abweichenden Phänotyp. Die Blots wurden mit löslichem Protein aus Zellextrakten durchgeführt. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Die erste Spur enthält 30 ng von aufgereinigtem TetR. 3.1.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper Die meisten der für die Austauschmutagenese ausgewählten Aminosäuren liegen in der Zwischenregion zwischen der DNA-Bindedomäne und dem Proteinkörper, was die mögliche Bedeutung dieser Region für die Signalübertragung von TetR wiederspiegelt. Überwiegend handelt es sich um hydrophile, oftmals geladene Aminosäuren, die neben Wasserstoff- auch Salzbrücken untereinander ausbilden. Einige dieser Kontakte verbinden die DNA-Bindedomäne über Helix α1 mit der Verbindungshelix α4, sowie mit Helix α6 aus dem Proteinkörper. Die Aminosäuren Leu14, Leu17, Leu51 und Leu55 bilden eine hydrophobe Zone zwischen den Helices α1 und α4 (Abb. 3.2), die bereits in früheren Arbeiten zur Signalübertragung erwähnt wurde und welche die Region um Helix α4 in einer für die Tc-Bindung ungünstigen Konformation stabilisiert (Reichheld & Davidson, 2006). - 21 ERGEBNISSE Ein Alanin-Austausch von Leu14 oder Leu51 verringert die Repression, während Alanine an den Positionen 17 oder 55 die Induktion durch Tc beeinträchtigen (Tabelle 3.3). Auch TetR E23A, -D53A, -E150A und -R158A zeigen eine verschlechterte Induktion durch Tc. Die Varianten TetR L17A, -R49A und -D95A, die durch Tc nicht mehr induzierbar sind, können auch durch den stärkeren Induktor ATc nicht mehr vollständig induziert werden. Der Austausch L17A verwandelt Tc und ATc in Korepressoren, was man als „reversen Phänotyp“ bezeichnet. In einer Western-Blot-Analyse wurde die Expression der Alanin-Mutanten mit beeinträchtigter Induzierbarkeit überprüft. Alle getesteten Mutanten werden exprimiert und sind im Zellextrakt nachweisbar (Abb. 3.3). TetR L17A, -N18A, -E23A, -I59A und -D95A werden in einer etwas geringeren Menge als der Wildtyp hergestellt, was aber keinen Einfluss auf das Induktionsverhalten haben sollte. Bei den Mutanten TetR L55A und -I59A, bei denen die oben erwähnte hydrophobe Zone verändert ist, erkennt man auf den Blots eine zweite Bande unterhalb des TetR-Signals, was durch Abbau oder Abbruch zustande kommen könnte. So wurde zumindest für polare Substitutionen von Leu51, Leu52 oder Leu55 eine erhöhte Flexibilität der Region um Helix α4 beschrieben (Reichheld & Davidson, 2006). Auch in der Spur von TetR L14A ist eine zweite, schwache Bande direkt unter dem TetR-Signal zu erkennen. A B Tc α4 Tc Mg2+ Mg2+ H100 I59 R62 α6 V99 L55 L14 α8‘ N11 D53 94 N18 E150‘ D95 R49 R158‘ 22 α1 L17 L51 E23 Abb. 3.2: Position und Wechselwirkungen wichtiger Seitenketten an der Kontaktfläche zwischen von DNA-Bindedomäne und Proteinkörper. (A) Die als Kalottenmodell dargestellten Aminosäuren Leu14, Leu17, Leu51, Leu55 und zum Teil Ile59 bilden zusammen mit Val99 eine hydrophobe Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6. (B) Seitenketten mit hydrophilen Wechselwirkungen in dieser Region. Wasserstoffbrücken sind als grüne, gestrichelte Linien gezeichnet. Aminosäuren deren Austausch gegen Alanin die Tc-Induktion beeinträchtigt, sind fett gedruckt. Mit einem Apostroph gekennzeichnete Aminosäuren und Helices stammen vom zweiten Monomer des TetR-Dimers. Die Abbildung wurde mithilfe der Kristallstruktur von [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) erstellt. Die kleinen Skizzen zeigen den Blickwinkel, aus dem die Kristallstruktur betrachtet wird. - 22 ERGEBNISSE β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc TetR 1.0 ± 0.0 59 ± 2 (59) 93 ± 3 (93) TetR I10A 1.3 ± 0.3 84 ± 3 (65) 101 ± 2 (78) TetR N11A 1.1 ± 0.0 52 ± 4 (47) 89 ± 4 (81) TetR L14A 1.2 ± 0.2 21 ± 1 (18) 93 ± 4 (78) TetR L17A 3.5 ± 0.3 1.2 ± 0.1 (0.3) 1.8 ± 0.4 (0.5) TetR N18A 0.9 ± 0.1 29 ± 2 (32) 81 ± 2 (90) TetR I22A 1.1 ± 0.1 67 ± 5 (61) 96 ± 3 (87) TetR E23A 1.1 ± 0.0 11 ± 0 (10) 78 ± 2 (71) TetR R49A 1.0 ± 0.1 1.1 ± 0.1 (1) 47 ± 3 (47) TetR L51A 3.2 ± 0.2 82 ± 6 (26) 99 ± 5 (31) TetR D53A 0.9 ± 0.1 4.8 ± 0.6 (5) 77 ± 1 (86) TetR L55A 1.5 ± 0.0 15 ± 1 (10) 94 ± 3 (63) TetR E58A 1.2 ± 0.0 59 ± 4 (49) 91 ± 5 (76) TetR I59A 1.1 ± 0.0 26 ± 2 (24) 89 ± 1 (81) TetR R62A 1.0 ± 0.1 41 ± 4 (41) 92 ± 4 (92) TetR H63A 1.1 ± 0.1 61 ± 5 (56) 89 ± 2 (81) TetR R92A 1.0 ± 0.1 55 ± 5 (55) 90 ± 2 (90) TetR Y93A 1.1 ± 0.0 42 ± 4 (38) 93 ± 1 (85) TetR R94A 0.9 ± 0.0 30 ± 1 (33) 74 ± 6 (82) TetR D95A 0.8 ± 0.1 1.2 ± 0.1 (1) 17 ± 0 (21) TetR K98A 1.1 ± 0.0 54 ± 1 (49) 92 ± 4 (84) TetR V99A 1.0 ± 0.1 65 ± 7 (65) 93 ± 3 (93) TetR K108A 0.9 ± 0.0 70 ± 4 (78) 96 ± 3 (107) TetR E150A 1.0 ± 0.1 7.1 ± 0.3 (7) 74 ± 3 (74) TetR D157A 1.3 ± 0.0 21 ± 2 (16) 81 ± 3 (62) TetR R158A 0.8 ± 0.0 7.4 ± 0.8 (9) 47 ± 6 (59) L158A D157A E150A D95A I59A L55A wt 30 ng D53A R49A E23A N18A L17A L14A wt 30 ng Tabelle 3.3: Induzierbarkeit von TetR(BD)-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom WildtypVerhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. Abb. 3.3: Western-Blot von ausgesuchten TetR-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper und einem vom WildtypVerhalten abweichenden Phänotyp. Die Blots wurden mit löslichem Protein aus Zellextrakten durchgeführt. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Die erste Spur von jedem Blot enthält 30 ng von aufgereinigtem TetR. - 23 ERGEBNISSE 3.1.1.3 Austausche im Proteinkörper Auch innerhalb des Proteinkörpers ließen sich aus der Kristallstruktur Aminosäuren herauslesen, die möglicherweise für die Signalübertragung in Frage kommen, indem sie das Signal von der Effektorbindetasche zur Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne übertragen. Die Repression und Induzierbarkeit der Alanin-Mutanten ist in Tabelle 3.4 gezeigt. TetR L60A ist durch Tc nur zu 10% induzierbar. Obwohl alle Varianten durch Tc und ATc induziert werden, sind die Regulationsfaktoren – mit Ausnahme von TetR R87A – niedriger als beim Wildtyp. Das resultiert aus der durchweg schlechteren Repression der Alanin-Mutanten. TetR L101A und -S135A reprimieren besonders schlecht (51% bzw. 53% β-Gal-Basalaktivität in den Messungen ohne Induktor). Diese Mutanten sind auch nicht in einem Western-Blot nachweisbar (Abb. 3.4), was entweder durch eine stark verringerte Proteinmenge oder eine Änderung der Löslichkeit, zum Beispiel durch den Einschluss der Proteine in bakterielle Einschlusskörper (Wilkinson & Harrison, 1991) erklärt werden könnte. β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc TetR 1.0 ± 0.0 59 ± 2 (59) 93 ± 3 (93) TetR L60A 1.6 ± 0.0 10 ± 1 (6) 86 ± 2 (54) TetR Y66A 1.5 ± 0.1 27 ± 4 (18) 79 ± 6 (53) TetR S85A 1.3 ± 0.0 29 ± 1 (22) 85 ± 4 (65) TetR R87A 1.4 ± 0.1 88 ± 1 (63) 93 ± 6 (66) TetR L90A 2.2 ± 0.1 85 ± 2 (38) 91 ± 1 (41) TetR L101A 53 ± 2 103 ± 4 (2) 87 ± 4 (2) TetR S135A 51 ± 3 92 ± 5 (2) 101 ± 2 (2) TetR Q148A 1.5 ± 0.0 55 ± 2 (37) 70 ± 2 (47) TetR D181A 1.3 ± 0.1 32 ± 1 (25) 72 ± 3 (55) L101A S135A L90A L60A wt 30 ng Tabelle 3.4: Induzierbarkeit von TetR(BD)-Varianten mit Alanin-Austauschen im Proteinkörper durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. Abb. 3.4: Western-Blot von ausgesuchten TetR-Varianten mit AlaninAustauschen im Proteinkörper und einem vom Wildtyp-Verhalten abweichenden Phänotyp. Die Blots wurden mit löslichem Protein aus Zellextrakten durchgeführt. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Die erste Spur enthält 30 ng von aufgereinigtem TetR. Obwohl alle hier untersuchten Varianten ihre Mutationen weit entfernt von der DNA-Bindedomäne tragen, haben die Alanin-Substitutionen Einfluss auf die Repression. Das spricht für die Theorie von Reichheld & Davidson einer gegenseitigen, funktionellen Abhängigkeit der Domänen von - 24 ERGEBNISSE TetR, nach der Mutationen in der DNA-Bindedomäne die Effektorbindung und Mutationen im Proteinkörper die DNA-Bindung beeinträchtigen können (Reichheld & Davidson, 2006). Einen interessanten Phänotyp zeigt die Mutante TetR L90A, die ähnlich wie TetR S135L (Scholz et al., 2003) eine relaxierte Induktorspezifität besitzt und neben Tc und ATc auch mit dem Derivat 4-de(dimethylamino)-Anhydotetrazyklin (4-ddma-ATc) zu 57% induziert werden kann (Abb. 3.5). Da TetR L90A schlechter als TetR S135L reprimiert, erreicht diese Variante zwar höhere Induktionswerte, die Regulationsfaktoren für die drei getesteten Effektoren sind allerdings niedriger als bei TetR S135L. -Galaktosidase-Aktivität [%] 100 38 41 80 ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc + 0.4 µM 4-ddma-ATc 88 26 60 51 40 20 S1 35 L Te tR Te tR L9 0A 0 44 Abb. 3.5: Repression und Induzierbarkeit von zwei TetR-Mutanten mit relaxierter Induktorspezifität. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRAllelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Die Werte für TetR S135L stammen aus (Henssler, 2005). Die Regulationsfaktoren sind über die Balken des Diagramms geschrieben. . 3.1.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche Die Protein-Effektor-Wechselwirkungen zwischen TetR und Tc sind besonders wichtig, da sie den Induktionsvorgang einleiten. Es wurde bereits eine Alanin-Austauschmutagenese in der Bindetasche von TetR(D) durchgeführt, um zu klären, welche Seitenketten für die Erkennung von Tc und ATc wichtig sind (Schubert, 2001). Da in dieser Arbeit die Chimäre TetR(BD) untersucht wurde und nur wenige der vorhandenen Alanin-Mutanten durch Umklonierung aus den tetR(D)Allelen erhalten werden konnten, wurden die meisten Mutanten durch PCR-Mutagenesen direkt in tetR(BD) hergestellt. Die Repressionseigenschaften und Induzierbarkeiten der Alanin-Mutanten sind in Tabelle 3.5 gezeigt. Die meisten Mutanten sind nicht mehr durch Tc induzierbar. Da die Induktion durch ATc nur bei TetR N82A, -T103A, -P105A und -E147A beeinträchtigt ist, spricht das für die Beteiligung der Reste an der spezifischen Erkennung von Tc. Der Induktionsweg selbst scheint durch die Austausche nicht betroffen zu sein. Ein Alanin-Austausch von Ile134 führt, wie schon bei dem benachbarten Ser135 beobachtet, zu einer Verschlechterung der Repression (vgl. Tabelle 3.4). Darüber hinaus ist TetR I134A die einzige Alanin-Mutante der Effektorbindetasche, die sich auch zu 13% durch 4-ddma-ATc induzieren lässt. - 25 ERGEBNISSE β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc TetR 1.0 ± 0.0 59 ± 2 (59) 93 ± 3 (93) TetR H64A 1.2 ± 0.2 3.1 ± 0.1 (3) 85 ± 4 (71) TetR S67A 1.3 ± 0.1 43 ± 1 (33) 99 ± 5 (76) TetR N82A 1.0 ± 0.1 1.1 ± 0.1 (1) 14 ± 0 (14)* TetR F86A 1.0 ± 0.2 1.1 ± 0.1 (1) 64 ± 3 (64)* TetR H100A 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.1 (1) 64 ± 3 (64)* TetR T103A 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.2 (1) 5.9 ± 0.5 (6)* TetR R104A 1.0 ± 0.0 2.1 ± 0.1 (2) 87 ± 3 (87) TetR P105A 0.9 ± 0.0 1.0 ± 0.1 (1) 33 ± 1 (37)* TetR Q109A 1.1 ± 0.1 1.6 ± 0.3 (2) 89 ± 1 (81) TetR T112A 1.2 ± 0.0 43 ± 1 (36) 87 ± 1 (73) TetR V113A 1.3 ± 0.1 71 ± 3 (55) 95 ± 6 (73)* TetR Q116A 1.3 ± 0.0 9.6 ± 0.9 (7) 77 ± 5 (59)* TetR L117A 1.3 ± 0.1 1.3 ± 0.1 (1) 78 ± 5 (60)* TetR L131A 1.2 ± 0.0 14 ± 0 (12) 97 ± 0 (81)* TetR I134A 3.4 ± 0.2 93 ± 2 (27) 107 ± 3 (32)* TetR S138A 1.2 ± 0.2 49 ± 2 (41) 82 (68)* TetR E147A 1.0 ± 0.0 1.1 ± 0.3 (1) 3.8 ± 0.4 (4)* TetR L170A 1.3 ± 0.0 1.3 ± 0.1 (1) 77 ± 2 (59)* TetR L174A 1.3 ± 0.1 2.0 ± 0.2 (2) 83 ± 4 (64)* TetR M177A 1.3 ± 0.1 21 ± 1 (15) 91 ± 5 (70)* ± 0 M177A L174A L170A E147A L131A L117A Q116A Q109A wt 30 ng P105A R104A T103A H100A F86A N82A H64A wt 30 ng Tabelle 3.5: Induzierbarkeit von TetR(BD)-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Effektorbindetasche durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. *) Diese ATc-Messungen wurden von C. Wimmer im Rahmen der Diplomarbeit durchgeführt. Die Messwerte wurden übernommen. Abb. 3.6: Western-Blot von ausgesuchten TetR-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Effektor-Bindetasche und einem vom Wildtyp-Verhalten abweichenden Phänotyp. Die Blots wurden mit löslichem Protein aus Zellextrakten durchgeführt. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Die erste Spur enthält 30 ng von aufgereinigtem TetR. In einer Western-Blot-Analyse wurde die intrazelluläre Expression der Alanin-Mutanten mit beeinträchtigter Induzierbarkeit überprüft. Alle getesteten Mutanten werden exprimiert und sind im Zellextrakt nachweisbar (Abb. 3.6). Nur TetR N82A, -F86A und -L117A werden in geringerer - 26 ERGEBNISSE Menge als der Wildtyp exprimiert, bei -E147A ist aufgrund der Western-Blot-Daten eine erhöhte Expression anzunehmen. Die übrigen Mutanten zeigen im Vergleich zum Wildtyp keine drastischen Unterschiede in den Proteinmenge. 3.1.2 Erstellung einer Signalkarte aus den Ergebnissen der Alanin-Austauschmutagenese Um die Lage der für die Induktion wichtigen Aminosäuren in TetR darzustellen und daraus möglicherweise einen Signalweg herauszulesen zu können, wurde eine Signalkarte von TetR erstellt. Hierfür wurde die Kristallstruktur des Tc-induzierten TetR(D) verwendet (PDB-Eintrag: 2TRT). In Relation zu dem Induktionswert von Wildtyp-TetR, der den 100%-Wert darstellt, wurden die Induktionswerte der Alanin-Mutanten in eine Farbskala umgewandelt. Anschließend wurden die ausgetauschten Aminosäuren in der Kristallstruktur nach der Induzierbarkeit der jeweiligen AlaninMutanten eingefärbt (Abb. 3.7). Die Induktionen durch Tc und ATc wurden dabei getrennt behandelt. Bei der Karte für die Tc-Induktion ist zu erkennen (Abb. 3.7-A), dass sich ein Großteil der wichtigen Aminosäuren auf einer Seite des Monomers häuft (aufgrund der Dimer-Symmetrie entspricht die sichtbare „Vorderseite“ des rechten Monomers der „Rückseite“ des linken Monomers). Ausgehend von der Effektorbindetasche, die fast ausschließlich von rot eingefärbten (=wichtigen) Aminosäuren gebildet wird, scheint das Signal für die Induktion über Arg158, Arg49, Asp95, Leu17 und Glu23 zu der Bindedomäne übertragen zu werden. Die Signalkarte für die ATc-Induktion (Abb. 3.7-B) unterscheidet sich von der Karte für die TcInduktion. Da noch keine Struktur von TetR im Komplex mit ATc vorlag, wurde die Struktur von [TetR(D)•Dox] (PDB-Eintrag: 2O7O) zur Erstellung der Signalkarte verwendet. Dox(yzyklin) ist, wie ATc, ein stärkerer Induktor als Tc. Die stärkere Induktionswirkung von ATc führt dazu, dass ein Großteil der Aminosäuren, die bei der Tc-Induktion noch von Bedeutung waren, blau eingefärbt ist. Neben einigen wichtigen Aminosäuren in der Effektor-Bindetasche (Asn82, Thr103, Pro105 und Glu147), scheinen für die ATc-Induktion nur Leu17 und Asp95 essentiell zu sein. Andere Mutanten wie TetR R49A und -R158A lassen sich noch etwa halb so effektiv wie der Wildtyp durch ATc induzieren, so dass die jeweiligen Aminosäuren in der Karte grün eingezeichnet sind. Da keine Mutante gefunden wurde, die durch Tc besser induzierbar ist als durch ATc, ist anzunehmen, dass die beiden Tetrazykline bei der Induktion von TetR einen ähnlichen Signalweg verwenden. Der Vorteil der ATc-Signalkarte liegt darin, dass durch die stärkere Induktionswirkung von ATc Bindungseffekte besser kaschiert werden und sich so vor allem die für die Signalübertragung wichtigen Aminosäuren herauslesen lassen. - 27 ERGEBNISSE Effektorbindetasche A L170 D181 R87 R92 R94 L14 L17 R104 P105 N18 R158 E157 E23 D95 R49 Tc-Induktion + Tc Tc-Induktion B Effektorbindetasche E147 N82 R92 P105 R104 P105 T103 N18 R158 D95 L17 R49 + ATc ATc-Induktion Induzierbarkeit relativ zu TetR: 0% 100% Abb. 3.7: Signalweiterleitungs-Karten für die Induktion von TetR durch Tc und ATc. In Relation zu dem Induktionswert von Wildtyp-TetR, der den 100%-Wert darstellt, wurden die Induktionswerte der Alanin-Mutanten in eine Farbskala umgewandelt. In der Kristallstruktur von TetR sind die ausgetauschten Aminosäuren nach der Induzierbarkeit der jeweiligen Alanin-Mutanten eingefärbt. Die Bilder links wurden mithilfe der Kristallstruktur von [TetR•tetO] (PDBEintrag: 1QPI) erstellt und zeigen die Positionen der für die Induktion wichtigen Aminosäuren im DNA-gebundenen Zustand. Verschiebungen, die während der Induktion auftreten, sind als gelbe Pfeile eingezeichnet. (A) Die Position der wichtigen Aminosäuren für die Tc-Induktion im induzierten Zustand ist in der Kristallstruktur von [TetR(D)•Tc] (PDBEintrag: 2TRT) dargestellt. (B) Die Position der wichtigen Aminosäuren für die ATc-Induktion im induzierten Zustand ist in der Kristallstruktur von [TetR(D)•Dox] (PDB-Eintrag: 2O7O) gezeigt. - 28 ERGEBNISSE In Abb. 3.7 sind deutliche Positionsänderungen einzelner Aminosäuren, die während der Induktion durch Tc bzw. ATc auftreten, durch Pfeile angedeutet. Während auf der linken Seite des Homodimers vor allem Bewegungen von der Effektorbindetasche weg stattfinden (eingezeichnet für Arg92 und Asn18), werden auf der rechten Seite verschiedene Aminosäuren zur Effektorbindetasche hingezogen (eingezeichnet für Arg104 und Pro105). Dieses „pull & push“Prinzip ist für beide Induktoren weitestgehend gleich. Interessant ist auch, dass sich die Positionen von vielen für die ATc-Induktion essentiellen Resten (Leu17, Asn82, Asp95, Glu147) während der Induktion nicht oder nur geringfügig verändern. 3.1.3 Untersuchung der unterschiedlichen Kontakte in TetR(BD) und TetR(B) und deren Einfluss auf die Signalübertragung Obwohl TetR(B) und die Chimäre TetR(BD) isostrukturell sind, gibt es auf funktioneller Ebene einige Unterschiede. So sind beispielsweise die gefundenen oder konstruierten reversen TetRMutanten (revTetRs), bei denen Tc als Korepressor fungiert, sowie die Varianten mit geänderter Induktorspezifität nur in TetR(BD) funktionsfähig. Besonders interessant ist dieser Effekt bei einigen revTetRs, die Aminosäure-Austausche ausschließlich in der Bindedomäne tragen, die in beiden TetR-Varianten identisch ist. Während die TetR(BD)-Varianten durch Tc koreprimiert werden, sind die TetR(B)-Varianten repressionsdefekt (Genaueres dazu folgt in Kapitel 3.2.3). Um dieses Phänomen aufzuklären, sollte zuerst eine Alanin-Austauschmutagenese in der DNABindedomäne durchgeführt werden, um die für die Induktion wichtigen Aminosäuren von TetR(B) zu ermitteln und die Signalübertragung mit der von TetR(BD) zu vergleichen. Falls hierbei Unterschiede festgestellt werden, sollte durch gegenseitigen Austausch verschiedener Aminosäuren in der Kontaktregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper versucht werden, die Signalübertragungswege von TetR(BD) und TetR(B) aneinander anzugleichen. 3.1.3.1 Alanin-Austauschmutagenese in der DNA-Bindedomäne von TetR(B) Die in tetR(BD) vorliegenden Alanin-Codons im Bereich der DNA-Bindedomäne wurden durch Klonierung über die Restriktionsschnittstellen XbaI und BanII auf das tetR(B)-Allel von pWH1925(B) übertragen (Abb. 3.8). Die veränderten Codons für TetR(B) K48A und -R49A mussten wegen Überlappung mit der Erkennungssequenz von BanII über eine zweistufige PCRMutagenese in tetR(B) eingefügt werden. Nach Bestätigung der Sequenzen wurden die TetR(B)Mutanten ebenfalls auf ihre Induzierbarkeit durch Tc überprüft (Tabelle 3.6). Trotz der isostrukturellen Faltung der DNA-Bindedomänen von TetR(B) und TetR(BD), ist die Chimäre TetR(BD) sensitiver gegenüber Aminosäureaustauschen als TetR(B). Während die Austausche L17A, E23A, E14A und N18A in TetR(BD) die Induzierbarkeit durch Tc beeinträchtigen, haben diese Austausche in TetR(B) keinen Einfluss auf die Induktion. Gemeinsam - 29 ERGEBNISSE ist für beide TetR-Klassen der Verlust der Repression bei TetR L41A und -H44A, sowie die verschlechtere Induzierbarkeit von TetR R49A, wobei hier in TetR(B) neben der Tc-Induktion zusätzlich auch noch die ATc-Induktion beeinträchtigt wird (TetR(B) R49A: 5,3%, TetR(BD) R49A: 47% Induzierbarkeit in Anwesenheit von 0,4 μM ATc). TetR(BD) + 0.4 µM Tc Repression TetR-Variante TetR(B) Repression + 0.4 µM Tc 59 ± 2 (59) 1.0 ± 0.0 TetR 1.1 ± 0.0 76 ± 5 (68) 71 ± 7 (71) 1.0 ± 0.1 TetR L4A 1.1 ± 0.0 87 ± 3 (76) 85 ± 3 (71) 1.2 ± 0.2 TetR V9A 1.2 ± 0.0 88 ± 4 (74) 84 ± 3 (65) 1.3 ± 0.3 TetR I10A 1.1 ± 0.0 87 ± 4 (76) 52 ± 4 (47) 1.1 ± 0.0 TetR N11A 1.1 ± 0.0 53 ± 4 (48) 21 ± 1 (18) 1.2 ± 0.2 TetR L14A 1.1 ± 0.0 83 ± 5 (76) 57 ± 4 (57) 1.0 ± 0.1 TetR E15A 1.0 ± 0.0 60 ± 2 (58) 83 ± 3 (83) 1.0 ± 0.1 TetR L16A 1.1 ± 0.0 90 ± 5 (83) 1.2 ± 0.1 (0,3) 3.5 ± 0.3 TetR L17A 4.8 ± 0.0 51 ± 2 (11) 29 ± 2 (32) 0.9 ± 0.1 TetR N18A 1.3 ± 0.0 82 ± 2 (64) 67 ± 5 (61) 1.1 ± 0.1 TetR I22A 1.0 ± 0.0 78 ± 6 (75) 11 ± 0 (10) 1.1 ± 0.0 TetR E23A 1.1 ± 0.0 69 ± 3 (63) 86 ± 4 (66) 1.3 ± 0.1 TetR L25A 1.1 ± 0.0 86 ± 4 (76) 88 ± 2 (13) 6.6 ± 0.3 TetR L30A 2.2 ± 0.0 90 ± 1 (41) 55 ± 1 (69) 0.8 ± 0.0 TetR L34A 1.0 ± 0.1 65 ± 2 (66) 112 ± 2 (1) 95 ± 1 TetR L41A 89 ± 4 87 ± 5 (1) 109 ± 2 (1) 90 ± 4 TetR H44A 94 ± 5 93 ± 5 (1) 93 ± 4 (62) 1.5 ± 0.1 TetR V45A 1.7 ± 0.0 94 ± 0 (54) 77 ± 5 (48) 1.6 ± 0.1 TetR N47A 1.4 ± 0.1 90 ± 4 (65) 90 ± 1 (9) 9.9 ± 0.2 TetR K48A 2.3 ± 0.0 97 ± 3 (43) 1.1 ± 0.1 (1) 1.0 ± 0.1 TetR R49A 1.3 ± 0.1 1.4 ± 0.2 (1) Tabelle 3.6: Vergleich der Induzierbarkeit von TetR(BD)- und TetR(B)-Varianten mit AlaninAustauschen in der DNA-Bindedomäne. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. Abb. 3.9-A zeigt eine Überlagerung der DNA-Bindedomänen von TetR(B) und TetR(BD) mit den Seitenketten der Aminosäuren, deren Austausch gegen Alanin die Tc-Induktion von TetR(B) und/oder TetR(BD) beeinträchtigt. Während die Positionen der Seitenketten, die für die Induktion in beiden Klassen wichtig sind, in TetR(B) und TetR(BD) gleich sind, weichen die Positionen der übrigen Seitenketten, deren Austausch die Induktion nur in einer der beiden Repressor-Klassen beeinflusst, voneinander ab. Die unterschiedliche Ausrichtung der funktionellen Gruppen könnte die verschiedene Bedeutung dieser Reste für die Induzierbarkeit von TetR(B) und TetR(BD) erklären. Abb. 3.9-B zeigt die Signalübertragungskarten für beide DNA-Bindedomänen. - 30 ERGEBNISSE R92 M59 I59 A61 D61 Y93 S92 H93 TetR(B) TetR(BD) x Codon 1 2 50 XbaI 208 tetR(D) tetR(B)-x pWH1925 BanII pWH1925(B) tetR(B) tetR(B) Abb. 3.8: Klonierungsschema für die Alanin-Codons aus der DNA-Bindedomäne und Unterschiede in der Kontaktfläche zwischen Bindedomäne und Proteinkörper bei TetR(BD) und TetR(B). Die tetR-Allele auf dem Vektor pWH1925 sind als graue Balken dargestellt. Die Codons 2 bis 49 inkl. der Alanin-Mutationen (rotes Kreuz) wurden aus der Sequenz von tetR(BD) ausgeschnitten und in ein ebenfalls geschnittenes tetR(B)-Allel einkloniert. Die Unterschiede in der Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne sind als Strukturbilder gezeigt, die betroffenen Aminosäuren beschriftet. B A R49 L17 E23 L14 L14 N11 R49 L17 R49 N11 E23 N18 L17 E15 E15 TetR(BD) TetR(B) Abb. 3.9: Wichtige Aminosäuren für Signalübertragung in der DNA-Bindedomäne von TetR(BD) und TetR(B). (A) Überlagerung der DNA-Bindedomänen von TetR(B) (blau; PDB-Eintrag: 2NS7) und TetR(BD) (grün; PDB-Eintrag: 1A6I). Aminosäuren mit abweichender Orientierung in beiden TetR-Klassen sind unterstrichen. (B) Signalübertragungskarten der DNA-Bindedomänen von TetR(BD) und TetR(B). Die ausgetauschten Aminosäuren wurden auf Basis der Induzierbarkeit der Einzelmutanten eingefärbt. Es wurde dieselbe Farbcodierung wie in Abb. 3.7 verwendet. Als Kristallstruktur diente [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT), wobei die unterschiedlichen Aminosäuren für die Bindedomäne mit dem Programm SWISS PDB-Viewer 4.01 durch die entsprechenden TetR(B)-Aminosäuren in der energetisch günstigsten Position ausgetauscht wurden. In den Skizzen ist Tc ist als gelbes Dreieck, die unterschiedlichen Proteinkörper sind in verschiedenen Grautönen dargestellt. - 31 ERGEBNISSE 3.1.3.2 Angleichung der Kontaktfläche von DNA-Bindedomäne und Proteinkörper zwischen TetR(B) und TetR(BD) Von den Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne rief L17A den größten Aktivitätsunterschied in TetR(B) und TetR(BD) hervor. Während TetR(B) L17A normal durch ATc induzierbar ist, wirkt ATc bei TetR(BD) als Korepressor. Da die Bindedomänen beider Proteine identisch sind müssen folglich die unterschiedlichen Reste im Proteinkörper unterschiedliche besonderes Regulationsverhalten Augenmerk Zwischenregion verantwortlich wurde zwischen auch für das sein. Ein hier auf DNA-Bindedomäne die und L17A Proteinkörper gerichtet – die Region, die für die Signalübertragung in TetR eine entscheidende Rolle TetR(B) spielt. Daher wurden von den 61 Aminosäuren, in denen sich die Proteinkörper unterscheiden, 13 Bindedomäne und in von der TetR(B) Region und TetR(D) zwischen Effektor-Bindetasche DNA- ausgewählt (Tabelle 3.7, Abb. 3.10). Diese Aminosäuren wurden einzeln in TetR(BD) und TetR(BD) L17A gegen die TetR(BD) Abb. 3.10: Position der ausgesuchten Aminosäuren in TetR(B) und TetR(BD). Überlagerung der Strukturen vom TetR(B) (linkes Monomer, PDB-Eintrag: 2NS7) und TetR(BD) (rechtes Monomer, PDB-Eintrag: 1A6I). Ala17 ist in rot eingezeichnet, der Effektor als gelbe Ellipse angedeutet. jeweiligen (B)-Aminosäuren ausgetauscht. Position Protein 57 59 61 66 67 68 84 88 92 93 106 148 157 TetR(B) I M D H F C K C S H T D E TetR(D) V I A Y S L M R R Y D Q D Tabelle 3.7: Unterschiedliche Aminosäuren im Proteinkörper von TetR(B) und TetR(D), die in der Region zwischen DNA-Bindedomäne und Effektorbindetasche liegen. Die Mutanten wurden anschließend auf Repression und Induktionsverhalten überprüft. Die Austausche haben keinerlei Einfluss auf Repression und Induzierbarkeit von TetR(BD). Alle TetR(BD)-Einzelmutanten besitzen ein Wildtyp-Induktionsverhalten (Daten im Anhang). Die Ergebnisse der TetR(BD) L17A-Mutanten sind in Abb. 3.11 (oben) gezeigt. Obwohl keiner der Austausche den Phänotyp von TetR(B) L17A herstellen konnte, fielen vor allem die Austausche I59M und Y93H, aber auch A61D und R92S auf, bei denen das reverse Regulationsverhalten von TetR(BD) L17A zu einem induzierbaren Repressor invertiert ist. Tauscht man I59M und Y93H zusammen aus, so erhält man wieder einen reversen TetR, dessen Repression jedoch weitaus schwächer als bei TetR(BD) L17A ist. - 32 ERGEBNISSE Die umgekehrten Aminosäureaustausche M59I, H93Y, sowie der der M59I H93Y-Doppelaustausch wurden daraufhin in TetR(B) und TetR(B) L17A eingefügt. Wie bei TetR(BD) haben die Austausche keinen Einfluss auf das Regulationsverhalten des Wildtyps (Daten im Anhang). In Kombination mit TetR(B) L17A führt M59I zu einer Verschlechterung und H93Y zu einer Verbesserung der Repression. Beide Doppelmutanten sind durch ATc normal induzierbar. Die Dreifachmutante TetR(B) L17A M59I H93Y zeigt im Vergleich zu TetR(B) L17A eine niedrigere 120 ohne Effektor + 0,4 µM ATc 100 80 60 40 20 A )L 17 Te tR (B H Y9 3 ... I5 9M A D )L 17 120 100 80 Abb. 3.11: Repression und Induzierbarkeit von verschiedenen TetR-Varianten mit dem L17A-Austausch. Oben: TetR(BD)-Varianten mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen der Klasse B. Unten: TetR(B)-Varianten mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen der Klasse D. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. 60 40 20 ... A D )L 17 Te tR (B ... M 59 I H 93 Y H 93 Y ... M ... A Te tR (B )L 17 59 I 0 ... -Galaktosidase-Aktivität [%] Te tR (B ... I5 9M ... A6 1D ... Y6 6H ... S6 7F ... L6 8C ... M 84 K ... R 88 C ... R 92 S ... Y9 3H ... D 10 6T ... Q 14 8D ... D 15 7E 0 ... -Galaktosidase-Aktivität [%] Basalaktivität sowie eine auf 55% erniedrigte Induzierbarkeit. 3.1.3.3 Stabilitätsuntersuchung von TetR(B) M59I H93Y Inwiefern der Doppelaustausch M59I H93Y Auswirkungen auf die Stabilität von TetR(B) hat, sollte durch eine limitierte Proteolyse untersucht werden. Hierfür wurde das Allel in den Überexpressionsvektor pWH610 (Ettner et al., 1995) umkloniert und das Protein in dem Stamm E. coli RB791 (Brent & Ptashne, 1981) bei 37°C überexprimiert. Die Aufreinigung des Proteins erfolgte über Kationen-Austauschchromatographie und Gelfiltration (siehe Material und Methoden, Seite 115). Die Proteinaseanfälligkeit wurde durch 30-minütige Inkubation des aufgereinigten Proteins mit der subtilisinähnlichen Proteinase K in Anwesenheit von ATc bestimmt. Zum Vergleich wurden auch TetR(BD), TetR(B) einer limitierten Proteolyse unterzogen. Die Fragmente wurden anschließend auf einem 15%igen SDS-Gel analysiert (Abb. 3.12). - 33 ERGEBNISSE Während sich die Fragmentmuster von TetR(BD) und TetR(B) in Anzahl und Größe der Degradationsbanden unterscheiden, ist das Fragmentmuster von TetR(B) M59I H93Y identisch dem von TetR(B). Somit scheinen die beiden Aminosäure-Austausche keine Auswirkung auf die Faltungsweise bzw. Proteaseanfälligkeit von TetR(B) zu haben. Die in den Induktionsmessungen beobachteten Unterschiede müssen folglich auf Affinitätsänderungen zum Effektor/Operator oder TetR(B) M59I H93Y TetR(B) TetR(BD) TetR(BD) TetR(BD) auf Änderungen in der Signalübertragung zurückzuführen sein. + Proteinase K + ATc 25 kDa 20 kDa 15 kDa 10 kDa Abb. 3.12: Limitierte Proteolyse von verschiedenen TetR-Varianten. Für die Reaktion wurde eine Phosphat-gepufferte, 0,1 mM TetRLösung mit einem zehnfachen Überschuss an Mg2+ und ATc eingesetzt. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 0,25 µg/µL Proteinase K gestartet. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach Hitzeinaktivierung der Proteinase K wurden die Proben auf ein 15%iges SDS-Gel aufgetragen. Jede Spur enthält insgesamt 23 µg von partiell verdautem TetR. 3.1.4 Einfluss des Induktors auf die Signalübertragung 3.1.4.1 TetR(BD): Tetrazyklin im Vergleich zu Anhydrotetrazyklin In Abb. 3.13 sind die Induktionswerte der Alaninfür Tc und ATc gegeneinander aufgetragen. Es können drei Gruppen von Mutanten unterschieden werden: Mutanten, die weder durch Tc noch durch ATc induziert werden können (rot umrandet); Mutanten, die nur durch ATc induzierbar sind (grün umrandet) und Mutanten, die sowohl durch Tc als auch durch 100 Induktion durch ATc [%] Mutanten 120 80 Wildtyp 60 Ala-Austausch in: 40 Bindekopf Zwischenregion 20 Proteinkörper ATc induzierbar sind. Da ATc die TetR-Mutanten 0 hinaus keine Variante gefunden wurde, bei der dieselbe Signalübertragung für die Induktion - 34 40 60 80 100 120 Abb. 3.13: Gegenüberstellung der Induktionswerte der Alanin-Mutanten für Tc und ATc. verwenden. 20 Induktion durch Tc [%] Tc eine stärkere Induktionswirkung als ATc hat, ist anzunehmen, dass die beiden Tetrazykline Bindetasche 0 durchweg besser induziert als Tc und darüber ERGEBNISSE 3.1.4.2 TetR(B): Tetrazyklin im Vergleich zu Tip Um den Einfluss verschiedenartiger Induktoren auf die Signalübertragung in der DNABindedomäne zu klären, wurde neben der Tc-abhängigen Induktion von TetR(B) auch die Peptidbasierte Induktion durch Tip untersucht. Dafür wurde zuerst ein zu den pWH1925-Derivaten kompatibles Plasmid hergestellt. Die trxA-tip-Fusion wurde samt tac-Promotor über die Schnittstellen EcoRI und SphI aus pWH2201 (Klotzsche et al., 2005) ausgeschnitten und in den ebenfalls mit EcoRI und SphI geschnittenen Vektor pWH1411 (Baumeister et al., 1992) umkloniert. Um die größtmögliche Konzentration an Tip in der Zelle zu erreichen, wurden die Messungen weiterhin in E. coli WH207λtet50 (ein Stamm ohne Lac-Repressor) durchgeführt. Somit wurde auf eine Regulation der Tip-Expression durch LacI verzichtet. Das komplette Messsystem mit allen Komponenten ist in Abb. 3.14 dargestellt. Die Induzierbarkeiten der TetR(B)-Alanin-Mutanten durch Tc und Tip sind in Tabelle 3.8 gezeigt. CmR pWH1300 tetR ApR pWH1925 Plasmid-Serie p15A Ptac trxA-tip TrxA pMB1 Tip β-Gal-mRNA tetO lacZ Genom Abb. 3.14: Schematische Darstellung des in vivo Messsystems für die TipInduktion der AlaninMutanten. Der Stamm E. coli WH207λtet50 enthält eine chromosomale tetA:lacZFusion. Die TetR-Variante auf dem Plasmid pWH1925 wird konstitutiv exprimiert und bindet an tetO. Die TrxA-TipFusion wird ebenfalls konstitutiv von dem Plasmid pWH1300 exprimiert. Wird TetR von Tip induziert, kann das Reportergen lacZ transkribiert werden. Während sich alle Alanin-Mutanten bis auf TetR R49A durch Tc induzieren lassen, werden die Varianten TetR L17A und TetR E23A sehr schwach, die Varianten TetR N11A und TetR R49A nicht durch Tip induziert. Da für die Tc- und die Tip-basierte unterschiedliche Aminosäuren essentiell sind, können Unterschiede in der Bindeaffinität weitestgehend ausgeschlossen werden. Stattdessen sind unterschiedliche Signalübertragungswege wahrscheinlich, was bereits aufgrund der voneinander abweichenden Kontakte zwischen TetRTc und TetRTip vermutet wurde (Resch et al., 2008). Zusätzlich zu den Alanin-Mutanten aus der TetR(B)-Bindedomäne wurden die in Tabelle 3.7 aufgelisteten TetR(BD)-Mutanten mit einzelnen TetR(B)-Aminosäuresubstitutionen auf ihre Induzierbarkeit mit Tip überprüft. Die Zugabe von Tip hat bei keiner der Varianten einen Effekt (Daten im Anhang). Auch die Doppelmutante TetR(BD) I59M Y93H zeigt in Anwesenheit von Tip keine Änderung der Aktivität. Folglich muss mehr als nur eine Aminosäure in der Kontaktregion ausgetauscht werden, um die Tip-Induzierbarkeit auf TetR(BD) zu übertragen. Das lässt sich auch aus den Daten anderer Experimente ableiten, die sich mit den Kontakten zwischen Tip und TetR beschäftigten. Die TetR(B)-spezifische Induktion durch Tip erfordert zahlreiche - 35 ERGEBNISSE Wechselwirkungen mit Resten von TetR(B) und reagiert sehr sensitiv auf einzelne Aminosäureaustausche (pers. Mitteilung J. Daam). β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression TetR(B) 1.1 ± 0.0 50 ± 1 (44) 76 ± 5 (68) TetR(B) L4A 1.1 ± 0.0 70 ± 3 (62) 87 ± 3 (76) TetR(B) V9A 1.2 ± 0.0 89 ± 4 (75) 88 ± 4 (74) TetR(B) I10A 1.1 ± 0.0 99 ± 8 (86) 87 ± 4 (76) TetR(B) N11A 1.1 ± 0.0 1.4 ± 0.1 (1) 53 ± 4 (48) TetR(B) L14A 1.1 ± 0.0 47 ± 2 (43) 83 ± 5 (76) TetR(B) E15A 1.0 ± 0.0 58 ± 1 (57) 60 ± 2 (58) TetR(B) L16A 1.1 ± 0.0 76 ± 7 (70) 90 ± 5 (83) TetR(B) L17A 4.8 ± 0.0 7.8 ± 0.1 (2) 51 ± 2 (11) TetR(B) N18A 1.3 ± 0.0 68 ± 4 (53) 82 ± 2 (64) TetR(B) I22A 1.0 ± 0.0 65 ± 3 (62) 78 ± 6 (75) TetR(B) E23A 1.1 ± 0.0 6.5 ± 0.1 (6) 69 ± 3 (63) TetR(B) L25A 1.1 ± 0.0 76 ± 1 (67) 86 ± 4 (76) TetR(B) L30A 2.2 ± 0.0 82 ± 9 (38) 90 ± 1 (41) TetR(B) L34A 1.0 ± 0.1 59 ± 5 (60) 65 ± 2 (66) TetR(B) L41A 89 ± 4 98 ± 5 (1) 87 ± 5 (1) TetR(B) H44A 94 ± 5 97 ± 5 (1) 93 ± 5 (1) TetR(B) V45A 1.7 ± 0.0 90 ± 2 (52) 94 ± 0 (54) TetR(B) N47A 1.4 ± 0.1 64 ± 6 (46) 90 ± 4 (65) TetR(B) K48A 2.3 ± 0.0 94 ± 5 (41) 97 ± 3 (43) TetR(B) R49A 1.3 ± 0.1 1.8 ± 0.1 (1) 1.4 ± 0.2 (1) + Tip + 0.4 µM Tc Tabelle 3.8: Induzierbarkeit von TetR(B)-Varianten mit Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne durch Tc und Tip. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Tip wurde von dem Plasmid pWH1300 exprimiert. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. N11 R49 N11 L17 R49 L17 E23 E15 Tc-Induktion Tip-Induktion - 36 Abb. 3.15: Wichtige Aminosäuren in der DNABindedomäne TetR(B) für die Tc- und TipInduktion. Die ausgetauschten Aminosäuren wurden auf Basis der Induzierbarkeit der Einzelmutanten eingefärbt. Es wurde dieselbe Farbcodierung wie in Abb. 3.7 verwendet. Als Kristallstruktur für die Tc-Induktion wurde aus Mangel an TetR(B)-Strukturen [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) verwendet, wobei die unterschiedlichen Aminosäuren für die Bindedomäne mit dem Programm SWISS PDBViewer 4.01 durch die entsprechenden B-Aminosäuren in der energetisch günstigsten Position ausgetauscht wurden. Für die TipInduktion diente [TetR(B)•Tip] (PDB-Eintrag: 2NS8). In den Skizzen ist Tc ist als gelbes Dreieck, Tip als gelbes Kreuz dargestellt. ERGEBNISSE 3.1.5 Randomisierung von Aminosäure 49 Nachdem der Aminosäureaustausch R49A die Induktion in allen untersuchten TetR-Varianten verhindert, sollte über eine Randomisierung von Position 49 herausgefunden werden, welche Aminosäuren an dieser Position eine Signalweiterleitung erlauben. Dafür wurde das Codon für Aminosäure 49 mittels einer zweistufigen PCR-Mutagenese randomisiert und die PCR-Produkte in pWH1925 kloniert. Für das in vivo Auswahlverfahren wurde E. coli WH207λtet50 verwendet. Da sich die Selektion von induzierbaren Mutanten auf Platten mit X-Gal als zu sensitiv herausstellte, wurde auf McConkeyPlatten mit 0,4 µM Tc nach gelben Kolonien gesucht. Positive Kolonien wurden ein zweites Mal auf McConkey-Medium mit 0,4 µM Tc ausgestrichen und ein weiteres Mal vereinzelt. Nach Bestätigung des Phänotyps wurde das Plasmid präpariert und sequenziert. Zusätzlich wurden zufällig Kolonien ausgesucht und sequenziert, um die Variabilität in dem Mutantengemisch zu überprüfen. Aus den insgesamt 50 überprüften Kolonien (30 gelbe und 20 weiße) wurden 11 Varianten mit unterschiedlichen Aminosäuren an Position 49 erhalten (Abb. 3.16). Diese wurden in vivo auf ihre Induzierbarkeit mit Tc und ATc überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.9 dargestellt. Neben der Wildtyp-Aminosäure Arginin ermöglichen auch Leucin, Isoleucin, Tryptophan und Tyrosin an Position 49 eine Signalweiterleitung der Tc-Induktion. Bei TetR R49L ist die Affinität zum Operator verringert, so dass die β-Gal-Werte sowohl für die Repression als auch für die Induktion höher sind. Alle Mutanten sind durch ATc induzierbar, wobei TetR R49K mit 34% die schlechteste Induzierbarkeit besitzt. Das ist insofern interessant, als dass Lysin der Wildtyp-Aminosäure Arginin chemisch am ähnlichsten ist. R49... L I W Y R Stopp 30 gelbe Kolonien (25 Seq. auswertbar) + + X X tetO 20 weiße Kolonien (13 Sequenzen auswertbar) + + X McConkey-Agar + 0,4 µM Tc X X tetO X tetO A P N D E K 0 2 4 6 8 10 Anzahl gefundener Varianten Abb. 3.16: Ausstrich von Kolonien auf McConkey-Agar mit 0.4 µM Tc. Die Kolonien stammen aus einer Transformation von E. coli WH207λtet50 mit dem Mutantengemisch. Durch Tc induzierbare Mutanten erscheinen auf dem Medium gelb. Bei weißen Kolonien wird TetR nicht induziert, was entweder durch eine Unterbrechung im Signalweg oder eine drastische Verringerung der Effektorbindeaffinität zustande kommt. Von 30 gelben und 20 weißen Kolonien wurden die Plasmide präpariert und tetR sequenziert. Die Anzahl der erhaltenen TetR-Varianten ist als Balkendiagramm dargestellt. - 37 ERGEBNISSE β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR Variante Repression + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc TetR R49A 1.0 ± 0.1 1.1 ± 0.1 (1) 47 ± 3 (46) TetR R49L 4.3 ± 0.3 95 ± 5 (22) 101 ± 3 (23) TetR R49I 1.3 ± 0.1 70 ± 0 (54) 93 ± 1 (72) TetR R49P 1.3 ± 0.1 10 ± 1 (8) 95 ± 2 (71) TetR R49W 1.6 ± 0.2 87 ± 2 (53) 99 ± 2 (60) TetR R49N 1.3 ± 0.0 3.3 ± 0.5 (2) 63 ± 4 (47) TetR R49Y 1.3 ± 0.1 76 ± 1 (60) 101 ± 4 (79) TetR R49D 1.1 ± 0.1 1.7 ± 0.2 (2) 64 ± 1 (60) TetR R49E 1.4 ± 0.0 2.8 ± 0.1 (2) 71 ± 3 (51) TetR R49K 1.0 ± 0.1 0.7 ± 0.2 (1) 34 ± 3 (47) TetR R49 (wt) 1.0 ± 0.0 59 ± 2 (58) 88 ± 2 (87) Tabelle 3.9: Repression und Induzierbarkeit von TetR-Varianten mit unterschiedlichen Aminosäuren an Position 49. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Wie Abb. 3.17 zeigt, sind die Proteinmengen der Mutanten mit hydrophoben Aminosäuren an Position 49 verringert. Von TetR R49L wird weniger Protein als beim Wildtyp hergestellt, bei TetR R49P und TetR R49W sind die Proteinmengen stark verringert und von TetR R49I konnte kein lösliches Protein nachgewiesen werden. Der Austausch von Arg gegen hydrophile Aminosäuren hatte nur geringen Effekt auf die Proteinmenge. Während TetR R49E und TetR R49K eine etwas verringerte Proteinmenge zeigten, war von TetR R49D sogar etwas mehr - + TetR R49K TetR R49D TetR R49Y TetR R49N TetR R49W hydrophil TetR R49P TetR R49I TetR R49L hydrophob TetR R49A TetR R49* + Ladung Größe Löslichkeit h.phil TetR R49E als vom Wildtyp nachweisbar. Abb. 3.17: Western-Blot mit löslichem Protein aus Zellextrakten. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Der Wildtyp ist mit einem * gekennzeichnet. Zur besseren Übersicht wurden die wichtigsten Eigenschaften der Aminosäuren an Position 49 über dem Blot aufgelistet. - 38 ERGEBNISSE 3.1.6 Aufreinigung und Stabilitätsanalyse einer nicht-induzierbaren TetR-Mutante Zur Aufreinigung wurde die Mutante TetR R49A ausgewählt. Das entsprechende Allel wurde in den Überexpressionsvektor pWH610 (Ettner et al., 1995) umkloniert, das Protein in dem Stamm E. coli RB791 (Brent & Ptashne, 1981) bei 28°C überexprimiert. Die Aufreinigung erfolgte über Kationen-Austauschchromatographie und Gelfiltration (siehe Material und Methoden, Seite 115). Die Proteaseanfälligkeit wurde durch Inkubation des aufgereinigten Proteins mit der subtilisinähnlichen Proteinase K bei 37°C in Anwesenheit und Abwesenheit von Tc bzw. ATc bestimmt. Die Ergebnisse der limitierten Proteolyse sind in Abb. 3.18 dargestellt. Im Vergleich zu TetR ist TetR R49A sensitiver gegenüber der Behandlung mit Proteinase K (die TetR-Daten sind in Abb. 3.35, Seite 67 gezeigt). Sowohl die Bindung von ATc als auch die Bindung von Tc stabilisieren TetR R49A, obwohl Tc für die Mutante keinen Induktor darstellt. Das steht im Widerspruch zu dem allosterischen Modell der Davidson-Arbeitsgruppe (Universität Toronto), die bei nicht-induzierbaren TetR-Varianten (ninTetR, für „non inducible“ = nicht-induzierbarer TetR) wie TetR L146F (Müller et al., 1995) keine Änderung der Flexibilität des DNA-Bindedomäne beobachten konnten und die Einschränkung dieser Flexibilität für einen Teil Induktionsmechanismus halten (Reichheld et al., eingereicht). Inkubation mit Proteinase K 60‘ 15‘ 30‘ 60‘ 30‘ 15‘ 20‘ 10‘ 5‘ 1‘ Inkubation mit Proteinase K 2‘ TetR R49A + 10x Tc 60‘ 30‘ 15‘ 20‘ 10‘ 5‘ 2‘ 10‘ Inkubation mit Proteinase K TetR R49A ohne Effektor 1‘ 5‘ 1‘ 2‘ TetR R49A + 10x ATc 60‘ 15‘ 30‘ 10‘ 5‘ 2‘ 1‘ TetR R49A ohne Effektor Inkubation mit Proteinase K Abb. 3.18: Limitierte Proteolyse von TetR R49A in Abwesenheit und Anwesenheit der Effektoren Tc und ATc. Für die Reaktion wurde eine Phosphat-gepufferte, 0,1 mM TetR-Lösung mit einem zehnfachen 2+ Überschuss an Mg und des jeweiligen Effektors eingesetzt. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 0,25 µg/µL Proteinase K und anschließende Inkubation bei 37°C durchgeführt. Nach Hitzeinaktivierung der Proteinase K wurden die Proben auf ein 15%iges SDS-Gel aufgetragen. Jede Spur enthält insgesamt 23 µg von partiell verdautem TetR. - 39 des ERGEBNISSE 3.2 Untersuchung der Signalübertragung in revTetR Anders als der Widtyp-TetR reprimieren reverse TetR-Varianten (revTetRs) nur in Anwesenheit von Tc, das in diesem Fall als Korepressor fungiert. Die vollständig geänderte Allosterie der revTetRs macht diese Varianten besonders interessant, wobei die durch die Mutationen hervorgerufenen Änderungen bis heute noch nicht vollständig geklärt sind. Nach den neuesten Erkenntnissen scheinen bei revTetR-Varianten die DNA-Bindedomänen in der effektorfreien Form entwunden zu sein (Reichheld et al., eingereicht; Resch et al., 2008). Die Bindung des Korepressors Tc führt zu einer Faltung der Bindedomäne in eine – immer noch flexible – Konformation, die es revTetR erlaubt, an den Operator zu binden. Es wird angenommen, dass für diese allosterische Konformationsänderung ebenfalls ein Signal von der Effektorbindetasche zur DNA-Bindedomäne übertragen werden muss, worauf sich diese faltet (Reichheld & Davidson, 2006). In dem folgenden Teilprojekt sollte daher – analog zu TetR – durch eine AlaninAustauschmutagenese der Signalweg von revTetR ermittelt und herausgefunden werden, inwiefern sich die Signalübertragung von TetR und revTetR unterscheidet. 3.2.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetRr2 Für die Austauschmutagenese wurde die reverse Variante TetRr2 (TetR E15A L17G L25V) ausgewählt, da sich diese durch einen der besten Regulationsfaktoren (RF:102) unter den revTetRs auszeichnet (Scholz et al., 2004) und da sie aufgrund des L17G-Austausches1 strukturell ähnlich zu der Einfachmutante TetRr1 (TetR L17G) sein sollte, für die bereits Strukturdaten vorliegen (Resch et al., 2008). tetRr2 ApR pWH1925(r2) XbaI 25 15 17 Umklonierung x HindIII 35 NcoI 208 BanII PCR-Mutagenese pMB1 Abb. 3.19: Schema zum Einbringen der Alanin-Codons in tetRr2. tetRr2 ist als grauer Pfeil dargestellt, die Codons 15, 17 und 25 die für die Aminosäureaustausche des revTetR verändert wurden, sind als schwarze Kästchen in das Gen eingezeichnet. Während sich die modifizierten Codons für die Aminosäuren 35-208 umklonieren ließen, mussten die Codons für die Alanin-Austausche im Bereich der Aminosäuren 2 bis 34 durch zweistufige PCR-Mutagenese verändert werden. Die Primer sind als Pfeile dargestellt (Mutageneseprimer mit rotem Kreuz). 1 Die Mutation L17G trägt den Hauptteil zum veränderten Regulationsverhalten von TetRr2 bei. - 40 ERGEBNISSE Für die Herstellung der Alanin-Mutanten wurden zwei Strategien verfolgt: Die Punktmutationen außerhalb der DNA-Bindedomäne (Codons 35-208) wurden über die Schnittstellen HindIII und NcoI von tetR in ein tetRr2-Allel auf dem Plasmid pWH1925 umkloniert. Die Mutationen in der Bindedomäne (Codons 2-34) wurden mittels einer zweistufigen PCR-Mutagenese direkt in das tetRr2-Allel eingeführt. Der veränderte Bereich der Bindedomäne wurde anschießend über die Schnittstellen XbaI und BanII in den Ausgangsvektor pWH1925(r2) zurückkloniert (Abb. 3.19). Bevor die modifizierten tetRr2-Allele für weitere Experimente verwendet wurden, wurden die Sequenzen überprüft, um mögliche Sekundärmutationen aus der Polymerase-Kettenreaktion auszuschließen und die korrekte Klonierung zu überprüfen. 3.2.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne Die DNA-Bindedomäne von revTetR vollzieht während des Korepressions-Vorgangs die größte Konformationsänderung des Proteins. Eine Überlagerung verschiedener DNA-Bindedomänen aus diversen Kristallstrukturen von TetR zeigt, dass die rückgefaltete Bindedomäne von revTetR trotz ihrer DNA-Bindefähigkeit mehr Ähnlichkeit mit dem induzierten TetR besitzt als mit der DNAgebundenen Form (Abb. 3.20-A). Das könnte aber auch damit zu tun haben, dass die Struktur in einem Komplex ohne DNA hergestellt wurde und die anscheinend flexiblen Bindedomänen noch nicht die richtige Position für die Operatorbindung eingenommen haben. Vergleicht man die Bindedomäne des Tc-gebundenen TetR mit der von revTetR, so fallen vor allem unterschiedlichen Positionen der Seitenketten von Leu41 und His44 auf – Reste, die auch einen großen Einfluss auf die Repression von TetR haben (Abb. 3.20-B). Die übrigen Aminosäuren sind in [TetRr1•ATc] ähnlich positioniert wie in [TetR•Tc]. A B L41 H44 Abb. 3.20: Überlagerung der DNA-Bindedomänen von TetR und revTetR. (A) Das Peptidrückgrat von revTetR ist in rot, das von [TetR•Tc] in dunkelgrau und das von [TetR•tetO] in hellgrau dargestellt. Die Überlagerung wurde mit SWISS PDB-Viewer 4.01 unter Verwendung der Cα-Atome erstellt. (B) Positionen der Reste Leu41 und His44 in r1 [TetR •ATc] (orange) und [TetR•Tc] (grau). - 41 ERGEBNISSE In Tabelle 3.10 ist das Regulationsverhalten von TetRr2-Varianten mit Alanin-Substitutionen in der DNA-Bindedomäne gezeigt. Bis auf TetRr2 L34A, der mit ATc eine schwache Korepression zeigt, ist keine der Alanin-Mutanten durch Tc oder ATc koreprimierbar. Das legt die Vermutung nahe, dass alle untersuchten Reste der Bindedomäne eine entscheidende Rolle für die korrekte Rückfaltung dieser Domäne spielen, die durch Mutationen E15A L17G L25V destabilisiert wird. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc r2 98 ± 4 18 ± 1 (5) 1.4 ± 0.3 (70) r2 TetR L4A 96 ± 0 95 ± 2 (1) 77 ± 4 (1) r2 TetR V9A 94 ± 1 91 ± 5 (1) 88 ± 5 (1) r2 TetR V25A 97 ± 3 99 ± 4 (1) 75 ± 1 (1) TetRr2 L30A TetR 97 ± 5 103 ± 4 (1) 104 ± 5 (1) r2 110 ± 1 62 ± 7 (2) 36 ± 1 (3) r2 104 ± 4 99 ± 2 (1) 104 ± 3 (1) r2 104 ± 4 101 ± 4 (1) 101 ± 3 (1) r2 108 ± 5 93 ± 2 (1) 93 ± 5 (1) r2 98 ± 3 97 ± 5 (1) 72 ± 2 (1) r2 98 ± 1 99 ± 4 (1) 94 ± 3 (1) TetR L34A TetR L41A TetR H44A TetR V45A TetR N47A TetR K48A Tabelle 3.10: Korepression von TetRr2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne r2 durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR -Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. 3.2.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper Ein Großteil der bisher gefundenen revTetR-Varianten trägt Aminosäureaustausche in den Helices α1, α4 oder α6 – der Kontaktregion zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne (Scholz et al, 2004). Es wird angenommen, dass Mutationen in dieser Region eine Destabilisierung der DNABindedomäne und der Kontaktregion selbst bewirken. Welche Auswirkungen die drei Mutationen von TetRr2 auf die Signalweiterleitung in der Kontaktregion haben, sollte nun durch die Austauschmutagenese geklärt werden. Die meisten Alanin-Substitutionen führen zum Verlust der Korepression, was für die schon erwähnte Destabilisierung von revTetR spricht (Tabelle 3.11). Nur TetRr2 R92A, -Y93A, -V99A, -E150A, -D157A und -R158A zeigen keine Veränderung des TetRr2-Phänotyps. TetRr2 G17A kann auch in Abwesenheit eines Effektors schwach an den Operator binden und die Expression des Reportergens auf 21% senken. Somit hat der Rest an Position 17 vermutlich den größten Einfluss auf das veränderte Repressionsverhalten von TetRr2. TetRr2 I10A, -N11A, -I59A, -H63A, und -K108A sind weder durch Tc noch durch ATc koreprimierbar. Die übrigen Varianten lassen sich durch Tc nur schlecht oder gar nicht reprimieren. - 42 ERGEBNISSE TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc r2 98 ± 4 18 ± 1 (5) 1.4 ± 0.3 (70) r2 TetR I10A 100 ± 4 95 ± 1 (1) 88 ± 5 (1) r2 105 ± 4 91 ± 2 (1) 97 ± 4 (1) r2 21 ± 0 3.7 ± 0.9 (6) 3.0 ± 0.2 (7) r2 106 ± 5 90 ± 5 (1) 5.0 ± 0.1 (21) r2 102 ± 7 87 ± 9 (1) 3.8 ± 0.2 (27) r2 105 ± 6 98 ± 1 (1) 7.9 ± 0.2 (13) r2 95 ± 5 101 ± 8 (1) 6.7 ± 0.2 (14) r2 TetR I59A 98 ± 6 99 ± 5 (1) 27 ± 0 (4) r2 106 ± 9 90 ± 4 (1) 4.8 ± 0.3 (22) r2 85 ± 3 96 ± 6 (1) 33 ± 1 (3) r2 92 ± 7 19 ± 0 (5) 2.3 ± 0.1 (40) r2 98 ± 5 19 ± 2 (5) 2.5 ± 0.1 (38) r2 92 ± 7 59 ± 4 (2) 2.2 ± 0.2 (42) r2 95 ± 3 78 ± 1 (2) 6.0 ± 0.1 (16) r2 97 ± 7 110 ± 5 (1) 5.4 ± 0.2 (18) r2 102 ± 2 29 ± 2 (4) 6.0 ± 5.6 (17) r2 94 ± 5 97 ± 7 (1) 100 ± 5 (1) r2 87 ± 2 21 ± 0 (4) 2.1 ± 0.4 (41) r2 92 ± 2 17 ± 1 (5) 1.8 ± 0.1 (51) r2 102 ± 5 42 ± 0 (2) 3.3 ± 0.0 (31) TetR TetR N11A TetR G17A TetR R49A TetR D53A TetR L55A TetR E58A TetR R62A TetR H63A TetR R92A TetR Y93A TetR R94A TetR D95A TetR K98A TetR V99A TetR K108A TetR E150A TetR D157A TetR R158A Tabelle 3.11: Korepression von TetRr2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRr2-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. 3.2.1.3 Austausche im Proteinkörper Die Repressionseigenschaften der TetRr2-Varianten mit Alanin-Austauschen im Proteinkörper sind in Tabelle 3.12 gezeigt. Die Aminosäuren Gln148 und Asp181 haben keinen Einfluss auf die Korepression durch Tc und ATc und können ohne Veränderung des TetRr2-Regulationsverhaltens gegen Alanin ausgetauscht werden. Eine Alanin-Substitution von Leu60, Tyr66, Arg87 und Leu90 führt zum Verlust der Korepression durch Tc. TetRr2 L60A und -R87A sind weder durch Tc noch durch ATc koreprimierbar. Ein interessanter Aspekt sind die antagonistischen Effekte, die von dem Austausch L101A in TetR und revTetR verursacht werden. Während TetR L101A repressionsdefekt ist, verbessert der Alaninaustausch die Korepression durch Tc um das Zehnfache. Leu101 ist Teil einer hydrophoben „Packung“ im Bereich zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne und ist auch mit den - 43 ERGEBNISSE wichtigen Aminosäuren für die Mg2+-Koordination (His100, Thr103 und Glu147) benachbart (Abb. 3.21). Die durch L101A möglicherweise geänderten Kontakte in dieser Region könnten die Stellung der Bindedomäne feinausrichten. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc r2 98 ± 4 18 ± 1 (5) 1.4 ± 0.3 (70) r2 92 ± 0 105 ± 8 (1) 23 ± 1 (4) r2 90 ± 2 63 ± 1 (1) 3.7 ± 0.1 (24) r2 TetR S85A 99 ± 6 92 ± 3 (1) 12 ± 1 (8) TetRr2 R87A TetR TetR L60A TetR Y66A 93 ± 1 101 ± 2 (1) 44 ± 3 (2) r2 89 ± 1 91 ± 0 (1) 4.8 ± 0.8 (19) r2 100 ± 4 2.0 ± 0.2 (50) 1.4 ± 0.1 (71) r2 107 ± 7 21 ± 3 (5) 3.1 ± 0.6 (35) r2 98 ± 3 27 ± 3 (4) 3.7 ± 1.0 (27) TetR L90A TetR L101A TetR Q148A TetR D181A Tabelle 3.12: Korepression von TetRr2-Varianten mit Alanin-Austauschen im Proteinkörper durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRr2-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. -Galaktosidase-Aktivität [%] A TetR 120 TetRr2 100 ohne Effektor + 0,4 µM Tc + 0,4 µM ATc 80 60 40 20 0 wt L101A wt L101A B E147‘ L146‘ T103‘ L98‘ E150‘ L98 V99 R49 R158‘ Weitere beteiligte Aminosäuren: A97, H100, G102, L142, L146, G143‘ - 44 Abb. 3.21: Antagonistischer Effekt des Aminosäureaustausches L101A r2 in TetR und TetR . (A) Repression und Induzierbarkeit des Wildtyps und der L101A-Mutante durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli r2 WH207λtet50 mit tetR -Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. (B) Lage der Aminosäure Leu101 (rot) in revTetR. Die beiden Monomere von TetRr2 sind in blau und grün dargestellt. ERGEBNISSE Von ausgesuchten, nicht koreprimierbaren revTetR-Alanin-Mutanten wurden Western-Blots angefertigt, um festzustellen, ob die schwache Repression auf eine stark verringerte Proteinmenge zurückzuführen ist. Das Ergebnis ist in Abb. 3.22 gezeigt. Die Mutanten TetRr2 N11A und -K108A können im Zellextrakt nicht nachgewiesen werden, die Menge von TetRr2 R87A ist im Vergleich zum Wildtyp erheblich verringert. Auch TetRr2 I59A und -H63A zeigen eine erniedrigte Proteinmenge. Sowohl bei TetRr2 als auch bei TetRr2 R49A und -L60A erkennt man auf den Western-Blots eine zweite Bande direkt unterhalb der Haupt-Bande. Da diese beiden Varianten funktionsfähig sind, könnte dieses Ergebnis mit der verringerten Stabilität gegenüber dem WildtypTetR korrelieren. r2R87A r2L60A r2K108A r2H63A r2I59A r2R49A r2N11A r2I10A r2wt 30 ng Zwischenregion Proteinkörper Abb. 3.22: Western-Blot von ausgesuchten revTetR-Alanin-Mutanten mit ungewöhnlichem Phänotyp. Die Blots wurden mit löslichem Protein aus Zellextrakten durchgeführt. In jeder Spur wurden 30 µg Gesamtprotein aufgetragen. Die erste Spur enthält 30 ng von aufgereinigtem TetR. 3.2.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche In den Strukturdaten von TetRr1 sieht es so aus, als ob die Interaktionen zwischen [ATc-Mg]+ und TetRr1 sehr ähnlich zu denen zwischen [Tc-Mg]+ und TetR sind (Resch et al., 2008). In vivo wurden die Protein-Ligand-Wechselwirkungen eines reversen TetR bisher noch nicht untersucht. So war bislang unklar, ob für die Korepression von revTetR dieselben Reste in der Effektorbindetasche wichtig sind wie für die Induktion von TetR. Für den direkten Vergleich wurden alle Tckontaktierenden Reste in TetRr2 (analog zu Kapitel 3.1.1.4) einzeln durch Alanine ersetzt und auf ihre Regulationseigenschaften mit Tc und ATc überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3.13 gezeigt. Mit Ausnahme der Reste Val113, Leu131 und Ile134 spielen für die Korepression dieselben Reste in der Effektorbindetasche eine Rolle wie für die Induktion von TetR (Abb. 3.23). Die Seitenkette von Leu131 hat keine Bedeutung für die Korepression von TetRr2. Val113 und Ile134 sind bei der Alanin-Austauschmutagenese von TetR nicht aufgefallen, stellen aber wichtige Reste für die Korepression durch Tc dar. TetRr2 I134L ist darüber hinaus auch nicht durch ATc koreprimierbar, was allerdings mit einer allgemeinen Verschlechterung der Repression zu tun haben könnte, die der Austauch I134A auch in TetR bewirkt. Die Bedeutung der übrigen Aminosäuren ist ähnlich wie bei TetR, wobei Alanin-Austausche von His64, Phe86, Gln116 und Leu117 einen größeren Effekt und ein Austausch von Glu147 einen geringeren Effekt auf die Regulation von revTetR hat als auf - 45 ERGEBNISSE die von TetR. Damit konnten die experimentellen Daten bestätigen, wie aus den Strukturdaten schon vermutet wurde: Die Wechselwirkungen zwischen Tc und TetR sind ähnlich zu denen zwischen Tc und TetRr2 sind, wobei bei TetRr2 die Kontakte zur 6-Methyl-Gruppe (Leu117, Ile134), sowie zu der 3-Hydroxy- (His64) und 12a-Hydroxy-Gruppe (Phe86) wichtiger sind als bei TetR und die Wechselwirkung von Thr103 mit dem Mg2+-koordinierendem H2O bei der Tc-Korepression eine geringere Rolle spielt als bei der Tc-Induktion von TetR. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc r2 98 ± 4 18 ± 1 (5) 1.4 ± 0.3 (70) r2 98 ± 1 108 ± 1 (1) 43 ± 1 (2) r2 95 ± 5 18 ± 0 (5) 1.7 ± 0.2 (56) r2 100 ± 3 102 ± 5 (1) 101 ± 4 (1) r2 TetR F86A 102 ± 2 110 ± 3 (1) 94 ± 1 (1) TetRr2 H100A TetR TetR H64A TetR S67A TetR N82A 82 ± 6 83 ± 4 (1) 6.1 ± 0.1 (13) r2 95 ± 4 91 ± 4 (1) 8.4 ± 0.7 (11) r2 98 ± 2 102 ± 0 (1) 5.4 ± 0.3 (18) r2 97 ± 4 100 ± 3 (1) 63 ± 6 (2) r2 99 ± 1 100 ± 2 (1) 4.7 ± 0.2 (21) r2 100 ± 5 37 ± 6 (3) 2.3 ± 0.1 (44) r2 101 ± 5 81 ± 2 (1) 16 ± 0 (6) r2 96 ± 5 107 ± 3 (1) 40 ± 1 (2) r2 88 ± 5 96 ± 5 (1) 90 ± 5 (1) r2 TetR L131A 94 ± 1 50 ± 1 (2) 3.3 ± 0.3 (29) TetRr2 I134A TetR T103A TetR R104A TetR P105A TetR Q109A TetR T112A TetR V113A TetR Q116A TetR L117A 90 ± 4 97 ± 10 (1) 37 ± 3 (2) r2 92 ± 1 31 ± 3 (3) 2.2 ± 0.1 (42) r2 90 ± 3 99 ± 5 (1) 76 ± 4 (1) r2 97 ± 2 108 ± 5 (1) 27 ± 1 (3) r2 105 ± 5 94 ± 1 (1) 3.4 ± 0.9 (31) r2 105 ± 3 62 ± 1 (2) 3.0 ± 0.5 (35) TetR S138A TetR E147A TetR L170A TetR L174A TetR M177A Tabelle 3.13: Koreprimierkeit von TetRr2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Effektorbindetasche r2 durch Tc und ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR -Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. - 46 ERGEBNISSE TetR Q116 V113 I134 F177 L174‘ L117 M177‘ H 2N OH O P105 N R104 D C OH O NH+ OH O L174‘ O OH A B - I174 F177 H64 M177‘ N82 D C OH O H 2N O OH A B - NH+ OH O F86 OH N O N NH 2 O P105 N O OH R104 O Q109 I134 L117 V113 L170‘ P105 N H 2N Q116 L131 N NH 2 L170‘ P105 N O L131 I174 TetRr2 Q109 H64 H 2N O N82 F86 N OH O T103 N O N O T103 E147‘ H100 E147‘ H100 r2 Abb. 3.23: Gegenüberstellung wichtiger Effektor-kontaktierender Reste bei TetR und TetR . Die hydrophobe Kontaktregion der Effektor-Bindetasche ist hellgrau, die beiden hydrophilen Kontaktregionen sind dunkelgrau dargestellt. Tetrazyklin ist als graues Stabmodell gezeigt. Mg2+ ist als graue Kugel dargestellt, die an der Mg-Koordination beteiligten Wassermoleküle als schwarze Kugeln. Wasserstoffbrücken sind als grüne, Van-der-Waals Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien eingezeichnet. Fett gedruckte Aminosäuren sind für die Induktion durch Tc und ATc wichtig. Die schwarzen Pfeile deuten die Eintrittsbewegung von Tc in die Bindetasche an. Für die Erstellung der Abbildung wurden r1 die Kristallstrukturen [TetR•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) und [TetR •ATc] (PDB-Eintrag: 2VKV) verwendet. 3.2.2 Erstellung einer Signalkarte von TetRr2 Analog zu TetR wurde aus den Ergebnissen der Repressionstests der Alanin-Mutanten eine Signalkarte für die Signalweiterleitung in revTetR erstellt. Da bis zum Ende dieser Arbeit noch keine Kristallstruktur von TetRr2 zur Verfügung stand, wurde für die Karte die bereits veröffentlichte Struktur von TetRr1 (TetR L17G; PDB-Eintrag 2VKV) (Resch et al., 2008) verwendet, die – wie bereits erwähnt – wahrscheinlich recht ähnlich zu TetRr2 ist (persönl. Mitteilung Y. Muller) (Abb. 3.24). TetRr2 reagiert insgesamt sensitiver auf Aminosäureaustausche als TetR. Die meisten AlaninAustausche führen zu einem Verlust der Korepression durch Tc. Das spricht für die Destabilisierung des reversen TetR durch die Mutationen in der Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne. Da ein Großteil der Alanin-Mutanten nicht durch Tc koreprimierbar ist, lässt sich aus der Karte kein eindeutiger Signalweg herauslesen (Abb. 3.24-B). Auch bei der Korepression durch ATc, die durch Kaschierung von Bindeeffekten besser zwischen wichtigen und weniger wichtigen Resten differenziert, lässt sich kein durchgehender Signalweg herauslesen (Abb. 3.24-B). Sichtbar ist nur: für die Korepression von TetRr2 spielen andere Aminosäuren eine Rolle als für die Induktion von TetR. Während bei TetR die essentiellen Reste in der Region zwischen Effektorbindetasche und DNA-Bindedomäne zu finden sind, liegen diese bei revTetR scheinbar an der Oberfläche des Proteinkörpers (Lys108), der Zwischenregion zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne (Ile10, Asn11) und – sehr gehäuft – in der destabilisierten DNA-Bindedomäne. - 47 ERGEBNISSE A Effektorbindetasche L117 N82 K108 P105 H64 R92 R62 N11 F86 E147 R104 P105 K108 I10 N11 R94 N18 L34 V9 L30 L41 H44 V45 K48 V25 + ATc ATc-Korepression Abb. 3.24: Signalweiterleitungs-Karten für die Korepression von TetRr2 durch ATc und Tc. In Relation zu dem Korepressionswert von TetRr2, der den 100%-Wert darstellt, wurden die Korepressionswerte der Alanin-Mutanten in eine Farbskala umgewandelt. In der Kristallstruktur von r1 TetR wurden die ausgetauschten Aminosäuren nach der Induzierbarkeit der jeweiligen AlaninMutanten eingefärbt. Besonders wichtige Aminosäuren sind fett gedruckt. (A) Um die Position der für die Korepression wichtigen Aminosäuren im effektorfreien Zustand zu zeigen, wurde die Kristallstruktur von TetR(BD) (PDB-Eintrag: 1A6I) verwendet. Über die tatsächliche Faltung der Bindeköpfe von revTetR im freien Zustand kann keine Aussage gemacht werden. Verschiebungen, die während der Korepression durch ATc auftreten, sind als gelbe Pfeile eingezeichnet. Die Positionen der Aminosäuren im koreprimierten Zustand sind in r1 der Kristallstruktur von [TetR •ATc] (PDB-Eintrag: 2VKV) gezeigt. Wichtige Aminosäuren sind beschriftet. (B) Die Bedeutung der Aminosäuren für die Korepression durch Tc ist ebenfalls in die Kristallstruktur von [TetRr1•ATc] eingezeichnet. Beschriftet sind Aminosäuren, die bei der ATcKorepression nicht nicht aufgefallen sind. B Effektorbindetasche Y66 H63 R62 K98 D95 R94 R49 Tc-Korepression Korepression relativ zu TetRr2: 0% 100% Abb. 3.24-A zeigt die für die Korepression durch ATc wichtigen Aminosäuren im effektorfreien TetR(BD) (PDB-Eintrag: 1A6I), der, bis auf eine andere Faltung der DNA-Bindedomäne, am ehesten einem effektorfreien TetRr2 entsprechen sollte. Die Positionsänderungen einzelner Aminosäuren, die während der Korepression durch ATc stattfinden, sind durch Pfeile angedeutet. - 48 ERGEBNISSE Auch beim reversen TetR finden auf der linken Seite des Homodimers überwiegend Bewegungen von der Effektorbindetasche weg statt (eingezeichnet für Arg92, Arg62 und Asn11). Auf der rechten Seite werden Aminosäuren wie Arg104 und Pro105 zur Effektorbindetasche hingezogen. Insofern ähneln die Aminosäurebewegungen denen, die bei der Induktion von TetR durch ATc auftreten, mit einem Unterschied: auf der linken Seite des Dimers findet keine durchgehende „Schieb“-Bewegung von der Effektorbindetasche zur DNA-Bindedomäne statt, was durch den Austausch L17G und den damit verbundenen Änderungen in der hydrophoben Zone zusammenhängen könnte. 3.2.3 Konstruktion eines reversen TetR(B) Während es in Eukaryoten bislang einige funktionsfähige reverse Tet-Transaktivator-Varianten gibt, die aus einem TetR(B) konstruiert wurde (Gossen et al, 1995), sind in Prokaryoten nur revTetR-Varianten der Klasse BD bekannt. TetR(BD)-basierte Varianten sind jedoch, wenn sie in Eukaryoten verwendet werden, instabiler (persönl. Mitteilung C. Berens) und auch in Mykobakterien aufgrund niedriger intrazellulärer Proteinmengen wenig effiziente Regulatoren (Klotzsche et al., 2009). Zwar wurde versucht, die Mutationen, welche in TetR(BD) zur Umkehrung des Regulationsverhaltens führen, in TetR(B) zu überführen, aber die daraus erhaltenen TetRVarianten waren durch Tc und ATc entweder nur sehr schwach oder gar nicht koreprimierbar. Für die Konstruktion eines reversen TetR(B) wurden vier revTetR(BD)-Varianten mit Aminosäureaustauschen in der DNA-Bindedomäne ausgewählt, die durch einen hohen Regulationsfaktor gekennzeichnet sind: TetRr2 (E15A L17G L25V), TetRr6 (L17S E23K), TetRr8 (E15V L17A E19D) und TetRr9 (V20G G21R I22N) (Scholz et al., 2004). Da die DNABindedomänen bei TetR(B) und TetR(BD) identisch ist, sollten die eingeführten Mutationen in beiden Proteinen dieselbe Auswirkung haben: die Destabilisierung und partielle Entwindung der Bindedomäne. Die Allele wurden durch Umklonierung der Codons 2 bis 48 über die Schnittstellen XbaI und BanII erhalten. Die Proteine wurden anschließend auf ihre Regulationseigenschaften in Abwesenheit und Anwesenheit von ATc überprüft (Abb. 3.25). TetR(B)r6 reprimiert besser als TetR(BD)r6, sodass ohne Effektor schon nur eine Basalaktivität von 29% erreicht wird. Bis auf TetR(B)r9 zeigte keine der TetR(B)-Varianten ein reverses Regulationsverhalten. Das legte die Vermutung nahe, dass es eine Interferenz im Proteinkörper von TetR(B) gibt, die verhindert, dass es zu den allosterischen Konformationsänderungen für die Korepression kommt. Als Grund hierfür wurden die unterschiedlichen Seitenketten in der Region zwischen Effektor-Bindetasche und DNABindedomäne angenommen. 13 dieser Aminosäuren wurden bereits in TetR(BD) L17A einzeln gegen die jeweilige B-Aminosäure ausgetauscht, um das Regulationsverhalten dieser Variante an TetR(B) L17A anzugleichen (Kapitel 3.1.4) Dabei hatten die Austausche I59M und Y93H den größten Effekt. Deshalb wurden diese beiden Positionen ausgewählt und die reziproken Austausche M59I und H93Y, sowie der Doppelaustausch mit den TetR(B)r-Varianten kombiniert. - 49 ERGEBNISSE Dafür wurde der Gen-Bereich der Bindedomäne mit den r-Mutationen über XbaI und ApaI in tetR(B) umkloniert. Anschließend wurden die TetR(B)r-Varianten auf ihr Regulationsverhalten hin überprüft (Abb. 3.25). TetR(B) M59I TetR(BD) H93Y M59I H93Y TetRr2 100 100 100 100 100 (E15A L17G L25V) 60 60 60 60 60 20 20 20 20 20 1.2 TetRr6 (L17S E23K) 1.1 1.5 4.6 68.7 100 100 100 100 100 60 60 60 60 60 20 20 20 20 20 1.3 0.6 2.1 12.5 58.4 TetRr8 100 100 100 100 100 (E15V L17A E19D) 60 60 60 60 60 20 20 20 20 20 1.1 1.3 1.2 2.2 27.8 TetRr9 100 100 100 100 100 (V20G G21R I22N) 60 60 60 60 60 20 20 20 20 20 1.8 1.7 4.4 2.5 19.5 Abb. 3.25: Regulationsfaktoren von revTetR-Varianten in den Klassen B und BD. Dargestellt sind die β-Galaktosidase-Aktivitäten in Abwesenheit (weiße Balken) und Anwesenheit (schwarze Balken) von 0,4 µM ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Die Regulationsfaktoren sind unter die Diagramme geschrieben. Auf TetR(B)r2 hat der Austausch M59I keinen Effekt, H93Y verbessert die Regulation auf den Faktor 1,5. Der Doppelaustausch M59I H93Y führt zu einem reversen Regulationsverhalten mit dem Regulationsfaktor 4,6. Bei TetR(B)r6 führt der Austausch M59I zur Umkehrung des Regulationsverhaltens und verwandelt den Korepressor ATc in einen Induktor. Allerdings kann ATc die Mutante nicht vollständig induzieren. Der Austausch H93Y führt zu einer erhöhten Basalaktivität im effektorfreien Zustand. Daraus resultiert ein Regulationsfaktor von 2,1. Mit dem Doppelaustausch M59I H93Y verbessert sich die Korepression, sodass die Variante mit dem Doppelaustausch einen Regulationsfaktor von 12,5 besitzt. - 50 ERGEBNISSE Auf TetR(B)r8 haben die Einzelaustausche M59I und H93Y nur einen geringen Effekt. Erst der Doppelaustausch führt zu einem reversen Regulationsverhalten mit einem Regulationsfaktor von 2,2. Auch bei TetR(B)r9 hat M59I keinen Einfluss auf das Regulationsverhalten. H93Y verbessert die Korepression durch ATc (RF: 4,4). TetR(B)r9 ist die einzige Variante, bei der der Doppelaustausch keine weitere Verbesserung der Regulation mit sich bringt. Im Gegenteil: TetR(B)r9 M59I H93Y ist durch ATc sogar schlechter koreprimierbar (RF: 2,5) als TetR(B)r9 H93Y. Alle TetR(B)r-Varianten zeigen nach dem Austausch von den zwei Aminosäuren Met59 und His93 gegen die jeweiligen D-Aminosäuren ein reverses Regulationsverhalten. Die Regulationsfaktoren sind jedoch durchweg niedriger als bei den jeweiligen TetR(BD)r-Varianten. Daher wurde beschlossen, weitere Aminosäuren in der Region zwischen Effektorbindetasche und DNABindedomäne durch die TetR(D)-Aminosäuren auszutauschen. Hierfür kamen die Positionen 92 und 61 in Frage, deren DB-Austausche, wie in Abb 3.11 gezeigt, ebenfalls zu einer Umkehrung des Regulationsverhaltens von TetR(BD) L17A führen, wenn auch in schwächerer Form als es bei den Positionen 59 und 93 der Fall ist. Da TetR(B)r6 M59I H93Y mit 12,5 zwar den besten Regulationsfaktor besitzt, aber auch im effektorfreien Zustand reprimiert, wurde mit der Variante TetR(B)r2 M59I H93Y weitergearbeitet (TetRr2 besitzt überdies auch als BD-Variante ein besseres Regulationsverhalten als TetRr6). Zu der Variante TetR(B)r2 M59I H93Y wurden nun der Austausch S92R sowie der Doppelaustausch S92R D61A hinzugefügt und das Regulationsverhalten mit ATc überprüft (Abb. 3.26). Bereits die Variante TetR(B)r2 M59I S92R H93Y ist durch ATc 12-fach besser koreprimierbar als die Ausgangsmutante (RF: 61,8). Der zusätzliche Austausch von Asp61 durch Alanin erhöht den Faktor weiter auf 70,1. Damit reguliert die Mutante TetR(B)r2 M59I D61A S92R H93Y ähnlich gut wie TetR(BD)r2 und stellt damit eine der ersten reversen TetR(B)-Varianten mit guten Regulationseigenschaften dar (Klotzsche et al., 2009). Die Mutanten aus Abb. 3.26 wurden auch auf ihr Regulationsverhalten mit Tc und dem TetR(B)spezifischen Effektor Tip überprüft (Tabelle 3.14). TetR(B)r2 kann nicht durch Tc koreprimiert werden. Auch durch das Einfügen von H93Y (72%) und M59I H93Y (63%) wird die Korepression durch Tc kaum beeinflusst. Erst die Dreifachmutante TetR(B)r2 M59I S92R H93Y ist durch Tc koreprimierbar, mit 11% sogar besser als die BD-Variante. Die Vierfachmutante r2 TetR(B) M59I D61A S92R H93Y wird durch Tc auf 22% koreprimiert, was aber immer noch in der Größenordnung der Korepression von TetR(BD)r2 durch Tc liegt. Während bei TetR(B)r2 M59I S92R H93Y und TetR(B)r2 M59I D61A S92R H93Y eine Korepression durch Tc gezeigt werden konnte, wurde keine der TetR(B)r2-Varianten durch Tip koreprimiert, was wiederum für einen unterschiedlichen Induktionsmechanismus von Tc und Tip spricht. Ob die Verringerung der β-Gal-Expression von 104% auf 75% bei TetR(B)r2 M59I D61A S92R H93Y einen geringen Effekt von Tip darstellt, kann aus den vorliegenden Daten nicht geschlossen werden. - 51 ERGEBNISSE TetR(B) M59I H93Y TetR(BD) M59I S92R H93Y M59I D61A S92R H93Y TetRr2 100 100 100 100 100 (E15A L17G L25V) 60 60 60 60 60 20 20 20 20 20 1.2 4.6 61.8 70.9 68.7 Abb. 3.26: Verbesserung der Regulation von TetR(B)r2 M59I H93Y durch zusätzliche Aminosäureaustausche. Dargestellt sind die β-Galaktosidase-Aktivitäten in Abwesenkeit (weiße Balken) und Anwesenheit (schwarze Balken) von 0,4 µM ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Die Regulationsfaktoren sind unter die Diagramme geschrieben. TetR-Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] ohne Effektor + 0.4 µM Tc + 0.4 µM ATc + Tip TetR(B)r2 98 ± 3 91 ± 4 91 ± 6 102 ± 4 H93Y 100 ± 2 72 ± 4 67 ± 5 91 ± 5 M59I H93Y 99 ± 2 63 ± 2 23 ± 1 97 ± 2 M59I S92R H93Y 95 ± 5 11 ± 1 1.5 ± 0.0 87 ± 1 M59I D61A S92R H93Y 104 ± 4 22 ± 1 1.5 ± 0.0 75 ± 2 TetR(BD)r2 98 ± 4 18 ± 1 1.4 ± 0.3 104 ± 2 r2 Tabelle 3.14: Koreprimierkeit von verschiedenen TetR -Varianten durch Tc, ATc und Tip. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRr2-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Tip wurde von dem Plasmid pWH1300 exprimiert. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. - 52 ERGEBNISSE 3.3 Untersuchung der Signalübertragung eines TetR mit geänderter Induktorspezifität Durch ungerichtete Mutagenese wurde die Zweifachmutante TetR H64K S135L (TetRi1) erzeugt, die nicht mehr durch Tetrazyklin, sondern durch das Derivat 4-de(dimethylamino)-Sanzyklin1 induzierbar ist (Scholz et al., 2003). Da TetRi1 immer noch durch starke Induktoren wie ATc, Doxyzyklin (Dox) und Sanzyklin (San) induzierbar ist, wurde durch in vitro-Evolution die Dreifachmutante TetR H64K S135L S138I (TetRi2) konstruiert, die nach einer Verkleinerung der Effektor-Bindetasche durch Dox und San nicht mehr und durch ATc nur noch schwach induzierbar ist (Henssler et al., 2004). Inwiefern diese Mutationen die Signalübertragung von TetR beeinflussen, sollte durch eine Alanin-Austauschmutagenese herausgefunden werden. 3.3.1 Alanin-Austauschmutagenese von TetRi2 Aufgrund der Verteilung der i2-Mutationen und der begrenzten Anzahl an singulären Restriktionsschnittstellen in der Nähe der Codons 64, 135 und 138 mussten die meisten AlaninMutationen über PCR-Mutagenesen hergestellt werden. So konnten bis auf wenige Ausnahmen alle Alanin-Austausche von TetR auf TetRi2 übertragen werden. 64 135 138 PCR-Mutagenese 4 tetRi2 ApR 48 XbaI pWH1925(i2) BanII 82 102 FspI MluI 208 NcoI Umklonierung pMB1 Abb. 3.27: Schema zum Einbringen der Alanin-Codons in tetRi2. tetRi2 ist als grauer Pfeil dargestellt, die i2 Codons 64, 135 und 138, die für die Aminosäureaustausche von TetR verändert wurden, sind als schwarze Kästchen in das Gen eingezeichnet. Während sich die modifizierten Codons für die Aminosäuren 35-208 umklonieren ließen, mussten die Codons für die Alanin-Austausche im Bereich der Aminosäuren 2 bis 34 durch zweistufige PCR-Mutagenese verändert werden. Die Aktivitätsmessungen der TetRi2-Alanin-Mutanten wurden in Ab- und Anwesenheit von 4-ddmaATc bzw. Tc durchgeführt. Stichprobenartig wurden einige Mutanten zusätzlich mit ATc vermessen. Diese Daten befinden sich in der Gesamttabelle im Anhang. 1 4-ddma-Sanzyklin wurde in früheren Arbeiten oft als cmt3 (chemisch modifiziertes Tetrazyklin 3) oder col3 (abgeleitet von dem Hersteller CollaGenex) bezeichnet. - 53 ERGEBNISSE 3.3.1.1 Austausche in der DNA-Bindedomäne Obwohl die i2-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Struktur der DNA-Bindedomäne haben und sich aus den Strukturdaten für TetR und TetRi2 nur geringe Positionsunterschiede einzelner Aminosäuren in diesem Bereich herauslesen lassen, führen alle untersuchten AlaninSubstitutionen in der DNA-Bindedomäne zu einer Verschlechterung oder einem Verlust der Repression (Tabelle 3.15). Während TetRi2 L4A, -E15A, -L34A und -H44A noch schwach reprimieren und auch noch durch 4-ddma-ATc induziert werden, binden TetRi2 V9A, -L16A, -L25A, -L30A, -L41A, -V45A, -N47A, -K48A nicht mehr an den Operator. Die Variante TetRi2 E15A zeigt mit Tc ein reverses Verhalten, d.h. Tc agiert als Korepressor wohingegen die Zugabe von 4-ddmaATc eine Induktion bewirkt. Ein ähnliches Verhalten, wenn auch in stark abgeschwächter Form, wurde auch schon des Öfteren bei TetRi2 beobachtet. Das deutet darauf hin, dass es eventuell doch eine Bindung von Tc an TetRi2 geben muss1 und dass diese Bindung eine andere Konformationsänderung bewirkt als die Bindung von 4-ddma-ATc. Die starke Auswirkung von den Alanin-Substitutionen auf die Repression könnte, ähnlich wie beim reversen TetR, durch eine erhöhte Instabilität von TetRi2 erklärt werden. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] Repression + 0.4 µM 4-ddma-ATc + 0.4 µM Tc i2 2.3 ± 0.2 72 ± 4 (31) 1.9 ± 0.1 (1) TetRi2 L4A 25 ± 1 65 ± 2 (3) 21 ± 3 (1) i2 TetR V9A 83 ± 4 96 ± 5 (1) 89 ± 4 (1) i2 17 ± 1 76 ± 1 (5) 7.1 ± 0.7 (0.4) i2 83 ± 3 94 ± 3 (1) 84 ± 1 (1) i2 94 ± 5 95 ± 4 (1) 90 ± 2 (1) i2 98 ± 3 95 ± 2 (1) 93 ± 2 (1) i2 56 ± 4 77 ± 3 (1) 54 ± 1 (1) i2 100 ± 3 96 ± 3 (1) 81 ± 5 (1) i2 55 ± 4 75 ± 5 (1) i2 TetR V45A 87 ± 3 107 ± 2 (1) 78 ± 7 (1) TetRi2 N47A 96 ± 5 92 ± 1 (1) 92 ± 2 (1) 98 ± 5 88 ± 6 (1) 86 ± 6 (1) TetR TetR E15A TetR L16A TetR L25A TetR L30A TetR L34A TetR L41A TetR H44A i2 TetR K48A n.b. Tabelle 3.15: Induzierbarkeit von TetRi2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der DNA-Bindedomäne durch 4-ddma-ATc und Tc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRi2-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. n.b.: Diese Messwerte wurden nicht bestimmt. 1 In den Kristallen von [TetRi2•Tc] war keine Tc-Elektronendichte in der Effektorbindetasche vorhanden (Klieber, 2003). i2 Auch Fluoreszenztitrationen zeigten keine (starke) Bindung von Tc an TetR (Wimmer, 2007). - 54 ERGEBNISSE 3.3.1.2 Austausche in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper Auch viele der Alanin-Austausche an der Kontaktfläche zwischen Proteinkörper und DNABindedomäne verschlechtern die Repression von TetRi2 (Tabelle 3.16). TetRi2 I10A, -L55A, -Y93A und -V99A reprimieren schlechter als der Wildtyp, TetRi2 I22A und -L51A binden nicht mehr an den Operator. In Anwesenheit von 4-ddma-ATc zeigt sich keine Änderung der Aktivität. Die Bindung von Tc führt bei TetRi2 L55A und -V99A zu einer schwachen Korepression. Anders verhält es sich bei TetRi2 L14A, -L17A, -I59A, -R94A, -D95A und -K98A: bei diesen Varianten, die ebenfalls eine stark verringerte Repression aufweisen, wirkt 4-ddma-ATc als Korepressor. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] Repression + 0.4 µM 4-ddma-ATc + 0.4 µM Tc i2 2.3 ± 0.2 72 ± 4 (31) 1.9 ± 0.1 (1) i2 TetR I10A 94 ± 4 83 ± 6 (1) 72 ± 4 (1) i2 2.3 ± 0.1 68 ± 3 (30) i2 67 ± 2 30 ± 3 (0.5) 55 ± 5 (1) i2 89 ± 4 8.5 ± 2.0 (0.1) 83 ± 4 (1) i2 5.2 ± 0.1 19 ± 2 (4) 4.7 ± 0.3 (1) i2 TetR I22A 29 ± 2 91 ± 5 (3) i2 3.7 ± 0.1 34 ± 4 (9) 3.6 ± 0.0 (1) i2 4.0 ± 0.1 7.4 ± 1.8 (2) 3.3 ± 0.1 (1) i2 97 ± 5 101 ± 5 (1) 89 ± 7 (1) i2 4.4 ± 0.1 37 ± 2 (8) 3.5 ± 0.5 (1) i2 38 ± 1 42 ± 6 (1) 25 ± 3 (1) i2 11 ± 1 75 ± 4 (7) 11 ± 1 (1) i2 TetR I59A 63 ± 6 16 ± 2 (0.3) 67 ± 2 (1) i2 2.1 ± 0.1 48 ± 2 (23) 2.1 ± 0.0 (1) i2 40 ± 3 49 ± 1 (1) i2 37 ± 1 9.8 ± 0.5 (0.1) 31 ± 2 (1) i2 51 ± 1 3.6 ± 0.2 (0.1) 43 ± 2 (1) i2 66 ± 2 43 ± 0 (1) 44 ± 3 (1) i2 55 ± 2 49 ± 3 (1) 35 ± 2 (1) i2 3.1 ± 0.2 77 ± 3 (25) 2.1 ± 0.1 (1) i2 1.7 ± 0.0 13 ± 1 (8) 2.7 ± 0.0 (2) i2 1.2 ± 0.1 37 ± 1 (31) 1.0 ± 0.1 (1) TetR TetR N11A TetR L14A TetR L17A TetR N18A TetR E23A TetR R49A TetR L51A TetR D53A TetR L55A TetR E58A TetR R92A TetR Y93A TetR R94A TetR D95A TetR K98A TetR V99A TetR K108A TetR E150A TetR D157A n.b. n.b. n.b. Tabelle 3.16: Induzierbarkeit von TetRi2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper durch 4-ddma-ATc und Tc. Die Messungen wurden in i2 E. coli WH207λtet50 mit tetR -Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. n.b.: Diese Messwerte wurden nicht bestimmt. - 55 ERGEBNISSE Damit zeigen diese Mutanten ein 4-ddma-ATc-abhängiges, reverses Regulationsverhalten. Tc hat nur bei TetRi2 K98A einen Effekt, der durch dessen Bindung ebenfalls koreprimiert wird. TetRi2 R49A und -E150A sind zwei Mutanten, die zwar noch reprimieren, aber nicht mehr durch 4-ddma-ATc induzierbar sind. TetRi2 E150A und -D157A sind die einzigen Varianten mit Aminosäureaustauschen in der Zwischenregion zwischen Proteinkörper und DNA-Bindedomäne, die besser als der TetRi2-Wildtyp reprimieren. Allerdings sind diese Varianten, vermutlich aufgrund einer stärkeren Operator-Bindung oder einer erhöhten Stabilität, auch schlechter durch 4-ddmaATc induzierbar. 3.3.1.3 Austausche im Proteinkörper Von den TetRi2-Mutanten mit Alanin-Austauschen im Proteinkörper sind TetRi2 R87A, -L90A und -L101A repressionsdefekt. Während die Bindung von 4-ddma-ATc bei TetRi2 R87A und -L101A keinen Effekt hat, kann man bei TetRi2 L90A sowohl bei der Zugabe von 4-ddma-ATc als auch bei der Zugabe von Tc eine schwache Korepression erkennen. TetRi2 L60A reprimiert die Expression des Reportergens auf nur 18%. Die Zugabe von 4-ddma-ATc hat keinen Effekt auf das Regulationsverhalten, Tc wirkt als Korepressor und verstärkt die Operatorbindung. Damit ist TetRi2 L60A neben der bereits erwähnten TetRi2 E15A die zweite Variante, bei der die Korepressor-Wirkung von Tc deutlich wird. TetR Variante TetRi2 β-Galaktosidase-Aktivität [%] Repression + 0.4 µM 4-ddma-ATc + 0.4 µM Tc 2.3 ± 0.2 72 ± 4 (31) 1.9 ± 0.1 i2 18 ± 1 16 ± 2 (1) 7.3 ± 0.3 (0.4) i2 TetR S85A 4.4 ± 0.1 45 ± 2 (10) 7.0 ± 0.2 (2) TetRi2 R87A TetR L60A (1) 78 ± 4 95 ± 2 (1) 66 ± 1 (1) i2 91 ± 2 73 ± 2 (0.8) 64 ± 2 (0.7) i2 83 ± 6 85 ± 7 (1) 83 ± 4 (1) i2 3.8 ± 0.4 74 ± 5 (20) 2.7 ± 0.4 (1) i2 1.8 ± 0.0 93 ± 2 (52) 1.7 ± 0.0 (1) TetR L90A TetR L101A TetR Q148A TetR D181A Tabelle 3.17: Koreprimierkeit von TetRi2-Varianten mit Alanin-Austauschen im Proteinkörper durch 4-ddma-ATc und Tc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRi2-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Vom Wildtyp-Verhalten abweichende Messwerte sind fett gedruckt. TetRi2 D181A ist die einzige Alanin-Mutante von TetRi2, die ein besseres Regulationsverhalten als TetRi2 selbst besitzt. Sie zeichnet sich durch eine stärkere Repression und höhere Induzierbarkeit durch 4-ddma-ATc aus. Dieser Phänotyp könnte mit einer erhöhten Stabilität von TetRi2 D181A gegenüber TetRi2 erklärt werden. Asp181 liegt in einem Bereich mit mehreren kumulierten negativen Ladungen (Asp178, Asp180, Glu183). Ein Austausch von Asp181 gegen Glycin führt zumindest in TetR(D) zu einer Erhöhung der Stabilität, was entweder auf die Reduktion der - 56 ERGEBNISSE Ladungsdichte oder auf eine durch den D181G-Austausch verursachte, erhöhte Flexibilität1 der α8α9-Schleife zurückgeführt wurde (Schubert et al., 2001). 3.3.1.4 Austausche in der Effektorbindetasche Die Effektorbindetasche von TetRi2 wurde dem Induktor 4-ddma-ATc durch Einfügen der großen, positiv geladenen Aminosäure Lys64 sowie der hydrophoben Aminosäuren Leu135 und Ile138 angepasst. Erste Strukturdaten des [TetRi2•4-ddma-ATc]-Komplexes lassen, mit Ausnahme von Lys64, ähnliche Wechselwirkungen wie zwischen TetR und Tc vermuten (Klieber et al., 2009). Durch die Alanin-Austauschmutagenese sollte nun die Bedeutung der einzelnen Effektorkontaktierenden Reste für die Induktion von TetRi2 ermittelt werden. Die Induzierbarkeiten der Alanin-Mutanten durch 4-ddma-ATc sind in Tabelle 3.18 gezeigt. TetR Variante β-Galaktosidase-Aktivität [%] Repression + 0.4 µM 4-ddma-ATc + 0.4 µM Tc i2 2.3 ± 0.2 72 ± 4 (31) 1.9 ± 0.1 (1) i2 2.5 ± 0.1 2.7 ± 0.2 (1) 2.3 ± 0.1 (1) i2 2.0 ± 0.1 72 ± 5 (36) 1.3 ± 0.2 (1) i2 89 ± 1 95 ± 1 (1) 90 ± 5 (1) i2 31 ± 2 13 ± 3 (0.4) 22 ± 2 (1) i2 0.9 ± 0.1 0.9 ± 0.0 (1) 1.3 ± 0.0 (1) i2 TetR T103A 1.3 ± 0.1 1.1 ± 0.1 (1) 1.9 ± 0.1 (2) TetRi2 R104A TetR TetR K64A TetR S67A TetR N82A TetR F86A TetR H100A 2.0 ± 0.1 10 ± 1 (5) i2 1.7 ± 0.1 1.7 ± 0.7 (1) 1.6 ± 0.3 (1) i2 1.3 ± 0.1 19 ± 0 (15) 1.9 ± 0.1 (2) i2 4.8 ± 0.3 67 ± 3 (14) 4.0 ± 0.3 (1) i2 1.9 ± 0.1 2.1 ± 0.1 (1) 2.0 ± 0.0 (1) i2 3.6 ± 0.1 74 ± 2 (21) 1.8 ± 0.1 (1) i2 1.4 ± 0.1 69 ± 2 (49) 1.7 ± 0.1 (1) i2 0.9 ± 0.1 83 ± 3 (92) 2.4 ± 0.1 (3) i2 2.7 ± 0.3 3.8 ± 0.2 (1) 4.0 ± 0.1 (2) i2 TetR L170A 6.4 ± 0.2 38 ± 2 (6) 4.0 ± 0.2 (1) TetRi2 M177A 2.2 ± 0.1 75 ± 1 (34) 1.7 ± 0.0 (1) TetR P105A TetR Q109A TetR T112A TetR Q116A TetR L131A TetR I134A TetR I138A* TetR E147A n.b. Tabelle 3.18: Induzierbarkeit von TetRi2-Varianten mit Alanin-Austauschen in der Effektorbindetasche i2 durch 4-ddma-ATc und Tc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR -Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Regulationsfaktoren sind in Klammern gesetzt. Auffällige Phänotypen sind fett gedruckt. n.b.: Diese i2 Messwerte wurden nicht bestimmt. *) Die Messungen von TetR I138A wurden bereits von Eva-Maria Henßler im Rahmen ihrer Doktorarbeit durchgeführt. Die Messwerte wurden übernommen. 1 Es wurde vermutet, dass sich Gly leichter in eine linksgedrehte, helikale Peptidrückgratstruktur einpassen kann, wodurch der D181G-Austausch zu mehr Freiheitsgraden in der Polypeptidkette führt (Schubert et al., 2001). - 57 ERGEBNISSE Obwohl es nach den Strukturdaten so aussieht, als ob die Wechselwirkungen zwischen TetRi2 und 4-ddma-ATc denen von TetR und Tc sehr ähnlich sind (Klieber et al., 2009), gibt es bei den in vivoDaten einige Unterschiede (Abb. 3.28). Die Mutanten TetRi2 K64A, -H100A, -T103A, -R104A, -P105A, -Q109A, -Q116A und -E147A sind nicht mehr durch 4-ddma-ATc induzierbar. Die für die Tc-Induktion von TetR wichtigen Aminosäuren Leu131 und Met177 können in TetRi2 ohne Auswirkungen auf die Induktion durch 4-ddma-ATc gegen Alanin ausgetauscht werden. Damit entsprechen die essentiellen Aminosäuren für die 4-ddma-ATc-Induktion – bis auf His100 und Gln116 – denen, die für die Tc-Induktion von TetR wichtig sind. Die Alanin-Substitution von Asn82 oder Phe86 führt zu einem Repressionsdefekt von TetRi2. Während die Bindung von 4-ddma-ATc bei TetRi2 N82A keine Auswirkung hat, wirkt der Effektor bei TetRi2 F86A als Korepressor und führt zu einem reversen Regulationsverhalten. TetR Q116 V113 I134 L131 I174 F177 L174‘ N O L117 M177‘ H 2N OH O P105 N P105 R104 D C OH O NH+ OH O Q109 I134 L170‘ L131 L117 H64 NH 2 H3 N M177‘ K64 P105 H 2N R104 O O V113 L174‘ O OH A B - N NH 2 L170‘ Q116 TetRi2 Q109 D C OH O - N82 A B O O O OH N O O H2N F86 OH OH N82 F86 N OH O T103 N O N O T103 E147‘ H100 E147‘ H100 i2 Abb. 3.28: Gegenüberstellung wichtiger Effektor-kontaktierender Reste bei TetR und TetR . Die hydrophobe Kontaktregion der Effektor-Bindetasche ist hellgrau, die beiden hydrophilen Kontaktregionen sind dunkelgrau dargestellt. Tc (links) und 4-ddma-ATc (rechts) sind als graue Stabmodelle gezeigt. Mg2+ ist als graue Kugel dargestellt, die an der Mg2+-Koordination beteiligten Wassermoleküle als schwarze Kugeln. Wasserstoffbrücken sind als grüne, Van-der-Waals Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien eingezeichnet. Besonders wichtige Kontakte sind fett gedruckt. Die schwarzen Pfeile deuten die Eintrittsbewegung des Effektors in die Bindetasche an. Für die Erstellung der Abbildung i2 wurden die Kristallstrukturen [TetR•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) und [TetR •4-ddma-ATc] (PDB-Eintrag: 3FK7) verwendet. Die Bedeutung der kursiv gedruckten Reste konnte bisher noch nicht untersucht werden. 3.3.2 Erstellung einer Signalkarte von TetRi2 Wie schon für TetR und revTetR geschehen, wurde für TetRi2 aus den Ergebnissen der AlaninAustauschmutagenese eine Karte der Signalweiterleitung erstellt. Hierfür wurden die Kristallstrukturen von TetRi2 im freien Zustand (PDB-Eintrag: 3FK6) und im Komplex mit [4-ddmaATc•Mg]+ (PDB-Eintrag: 3FK7) verwendet (Klieber et al., 2009) (Abb. 3.29-A). Wie bereits erwähnt, wurde aufgrund der zu schlechten Induktionseigenschaften von ATc und Tc nur die Induktion durch 4-ddma-ATc betrachtet. - 58 ERGEBNISSE Wie schon beim Wildtyp-TetR, häuft sich ein Großteil der wichtigen Aminosäuren auf der rechten Seite des Dimers (was aufgrund der Symmetrie der „Rückseite“ des linken Monomers entspricht). Ausgehend von der Effektor-Bindetasche, wo vor allem die Kontakte zu der unteren Hälfte von 4-ddma-ATc wichtig sind (Lys64, Asn82, Phe86, His100, Thr103, Pro105, Gln116, Glu147), wird das Signal für die Induktion vermutlich über Aminosäuren wie Val99, Leu55 und Arg49 zur DNABindedomäne übertragen. Auch das zu Arg49 benachbarte Asp53 trägt einen Teil zur Signalübertragung bei. Ein Austausch gegen Alanin verhindert die Induktion zwar nicht, beeinträchtigt sie jedoch (D53 ist grün eingefärbt). Die Seitenkette von Asn18, die einen Teil der Kontaktfläche der DNA-Bindedomäne zum Proteinkörper bildet, wird ebenfalls für den Induktionsvorgang benötigt, obwohl hier kein „Gegenkontakt“ ermittelt werden konnte. Somit ist anzunehmen, dass es sich vielleicht um eine Wechselwirkung mit dem Peptidrückgrat handelt, wie es auch in der Kristallstruktur von TetR zwischen Asn18 und Arg94 der Fall ist (Hinrichs et al., 1994). Auch eine Alanin-Substitution von Glu23, das eine Art „Kontaktfläche“ zwischen den beiden DNA-Bindeköpfen bildet, beeinträchtigt die Induktion und stellt damit eine weitere Parallele zur Induktion von TetR mit Tc dar. In Abb. 3.29-A sind durch Pfeile sichtbare Positionsänderungen einzelner Aminosäuren angedeutet, die während der Induktion durch 4-ddma-ATc auftreten. Man erkennt, dass sich die Reste auf der rechten Seite des Homodimers nach unten in Richtung DNA-Bindedomäne bewegen, während sich auf der linken Seite ein Teil der Aminosäuren zur Bindedomäne (z.B. Tyr93) und ein anderer Teil davon weg bewegt (z.B. Arg92). Im Unterschied zur Alanin-Austauschmutagenese in TetR, beeinflussen viele Alanin-Substitutionen die Repression von TetRi2. Abb. 3.29-B zeigt die Positionen, bei denen eine Alanin-Substitution die Repression beeinträchtigt. Bei einigen der Einzelmutanten fungiert 4-ddma-ATc als Korepressor (orange dargestellt), bei den Alanin-Mutanten der grau dargestellten Positionen hat die Bindung von 4-ddma-ATc keinen Effekt auf die Repression von TetRi2. Man erkennt, dass Austausche in der DNA-Bindedomäne meist zu einem Repressionsdefekt von TetRi2 führen und Austausche im Bereich zwischen Effektorbindetasche und DNA-Bindedomäne das Regulationsverhalten umkehren und den Induktor 4-ddma-ATc in einen Korepressor verwandeln. Erwähnenswert ist dabei, dass alle Aminosäuren, deren Alanin-Substitution das Regulationsverhalten umkehrt, auf der gegenüberliegenden Seite von den Aminosäuren liegen, die für die Induktion wichtig sind und vermutlich den Signalübertragungsweg bilden. - 59 ERGEBNISSE Effektorbindetasche A D181 R92 L90 D106 E107 V57 K98 A56 Y93 L55 D53 V99 E23 N18 R49 R94 E23 L155 + 4-ddma-ATc Induzierbarkeit relativ zu TetRi2: 0% 4-ddma-ATc-Induktion 100% B Abb. 3.29: Signalweiterleitungs-Karte für die Induktion von TetRi2 durch 4-ddma-ATc. In Relation zu dem Induktionswert von TetRi2, der den 100%-Wert darstellt, wurden die Induktionswerte der AlaninMutanten in eine Farbskala umgewandelt. In der i2 Kristallstruktur von TetR wurden die ausgetauschten Aminosäuren nach der Induzierbarkeit der jeweiligen Alanin-Mutanten eingefärbt. (A) Die Kristallstruktur von i2 TetR (PDB-Eintrag: 3FK6) zeigt die Positionen der für die Induktion wichtigen Aminosäuren im uninduzierten Zustand. Verschiebungen, die während der Induktion durch 4-ddma-ATc auftreten, sind als gelbe Pfeile eingezeichnet und mit den betroffenen Aminosäuren beschriftet. Die Positionen der wichtigen Aminosäuren im induzierten Zustand sind in der Kristallstruktur von i2 [TetR •4-ddma-ATc] (PDB-Eintrag: 3FK7) gezeigt. Besonders wichtige Aminosäuren sind beschriftet. Kursiv gedruckte Aminosäuren wurden nicht untersucht. (B) Darstellung der Postionen von Aminosäuren, deren Alanin-Austausch gegen Alanin zum Repressionsdefekt führt (grün) oder 4-ddma-ATc in einen Korepressor verwandelt (orange). Alanin-Substitutionen mit Einfluss auf die Repression - 60 ERGEBNISSE 3.3.3 Versuch der Übertragung der 4-ddma-ATc-Spezifität auf TetR(B) Die 4-ddma-ATc/San-Spezifität der Dreifachmutante TetR 64K 135L 138I (TetRi2) wurde in TetR(BD) entwickelt und lässt sich durch einfaches Einbringen der drei Aminosäureaustausche bisher weder auf TetR(B) noch auf TetR(E) übertragen (pers. Mitteilung C. Berens). Es wurde bereits nachgewiesen, dass 4-ddma-ATc und 4-ddma-San sowohl an TetR(BD) als auch an TetR(B) binden, aber keine Induktion des Tet-Repressors auslösen, was aller Voraussicht nach ein Signalübertragungsproblem darstellt. In TetR(BD) konnte die Informationsübertragung für eine Induktion durch Einfügen von drei Aminosäureaustauschen H64K S135L S138I hergestellt werden. Abb. 3.30 zeigt die Positionen der Aminosäuren 64, 135 und 138, die für die Variante TetRi2 ausgetauscht wurden. His64 ist in allen bisher gefundenen Tet-Repressoren konserviert. Auch die Position in TetR(B) und TetR(BD) ist nahezu identisch. Darüber hinaus besitzen beide Repressoren ein Ser135, das sich nur geringfügig in der Ausrichtung der Seitenkette unterscheidet. Unterschiedlich ist einzig der Rest an Position 138: in TetR(B) befindet sich an dieser Stelle ein Glycin, während TetR(BD) ein Isoleucin besitzt. TetR(B) TetR(BD) Ser135 Abb. 3.30: Position der Aminosäuren 64, 135 und 138 in TetR(B) und TetR(BD). Für die Abbildung wurden die Strukturen von TetR(BD) (PDB-Eintrag: 1A6I) und dem cysteinfreien TetR(B) (PDB-Eintrag: 2NS7) überlagert. Das Peptidrückgrat von TetR(B) ist in hellblau, das von TetR(BD) in hellgrün dargestellt. Die Aminosäuren von TetR(B) sind in dunkelblau, die von TetR(BD) in dunkelgrün eingezeichnet. Die Position des Effektors ist als gelbe Ellipse angedeutet. Gly138 Ile138 His64 Trotz der ähnlichen Ausrichtung der drei Aminosäuren reagiert die Variante TetR(B) H64K S135L G138I (=TetR(B)i2) anders auf die Effektoren als TetRi2 (Abb. 3.31). Während TetRi2 durch 4-ddmaATc gut und durch ATc schwach induzierbar ist, verhält sich TetR(B)i2 genau andersherum. Gemeinsam ist bei den beiden Varianten, dass Tc keine induktorische Wirkung besitzt. Wie schon bei der Konstruktion des reversen TetR(B), wurde angenommen, dass die unterschiedlichen Induktionsphänotypen von TetRi2 und TetR(B)i2 durch die unterschiedlichen Aminosäuren in der Region zwischen Effektorbindetasche und DNA-Bindedomäne zustande kommen. Daher wurden die Austausche M59I S92R H93Y und D61A M59I S92R H93Y, die bei der Konstruktion des revTetR(B) zu Erfolg führten, über PCR-Mutagenesen in TetR(B)i2 eingefügt. - 61 ERGEBNISSE Die Induzierbarkeit der TetRi2-Varianten ist in Abb. 3.31 dargestellt. Die Spezifität für 4-ddma-ATc ließ sich durch die zusätzlichen Aminosäureaustausche nicht auf TetR(B) übertragen. Weder TetR(B)i2 M59I S92R H93Y noch -D61A M59I S92R H93Y ist spezifisch durch 4-ddma-ATc induzierbar, bei TetR(B)i2 M59I S92R H93Y ist die Induzierbarkeit durch 4-ddma-ATc im Vergleich zu TetR(B)i2 sogar verschlechtert. TetR(B)i2 D61A M59I S92R H93Y wird durch 4-ddma-ATc zwar zu 19% induziert, jedoch führt die Bindung von ATc zu einer doppelt so starken Induktion. Durch das Einbringen der zusätzlichen Aminosäureaustausche lassen sich jedoch zwei Dinge beobachten: Zum einen haben die Austausche einen negativen Effekt auf die Induktion durch ATc, zum anderen auf die Repression, was sich durch eine erhöhte Basalaktivität zeigt (derselbe Effekt wie bei TetRi2, der im Vergleich zu TetR auch schlechter reprimiert). Zusätzlich fungiert Tc bei den beiden neuen Varianten als Korepressor. Das ist ein Effekt, der zwar bei TetR(BD)i2 beobachtet wurde, den aber TetR(B)i2 nicht zeigt, was jedoch unter Umständen auch mit der niedrigen 80 ohne Effektor + 0,4 µM Tc + 0,4 µM ATc + 0,4 µM 4-ddma-ATc 60 40 20 H D 61 A Te tR S9 2R R 92 IS M 59 ... M 59 ... (B D )i 2 93 Y 93 H )i 2 (B tR Te Y 0 ... -Galaktosidase-Aktivität [%] Basalaktivität dieser Mutante zusammenhängen könnte. Abb. 3.31: Repression und Induzierbarkeit von verschiedenen TetRi2-Varianten mit einzelnen Aminosäuresubstitutionen der Klasse D. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRAllelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Diese Experimente haben gezeigt, dass sich durch das schrittweise Anpassen der Kontaktfläche von TetR(B) an TetR(BD) nicht alle Aktivitätsvarianten von TetR(BD) auf TetR(B) übertragen lassen. Da sich die beiden TetR-Klassen in insgesamt 62 Aminosäuren unterscheiden und es zahlreiche Ansätze mit ungewissen Erfolgsaussichten gibt, wurde der Versuch, Induktorspezifität auf TetR(B) zu übertragen, im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt. - 62 die ERGEBNISSE 3.4 4-de(dimetyhlamino)-Tetrazykline als Anti-Induktoren für TetR Seit den ersten biochemischen Untersuchungen von Tetrazyklin-Derivaten ist bekannt, dass TcDerivate ohne die 4-Dimethylaminogruppe zwar an TetR binden, diesen jedoch nicht induzieren können (Lederer et al., 1996). Als effektiver Anti-Induktor kommen jedoch nur Substanzen in Frage, die von ihrer Affinität vergleichbar mit dem Induktor sind und so eine eingeleitete Induktion durch ihre Bindung „abschalten“ können. Da für 4-ddma-ATc eine 100-fach geringere Bindekonstante (KA) für die TetR-Bindung als für Tc ermittelt wurde und die Affinität von 4-ddmaTc für TetR zu gering für die Bestimmung einer Bindekonstante war (Lederer et al., 1996), hat man 4-ddma-Derivate bei der Suche nach möglichen Anti-Induktoren nicht weiter beachtet. Durch neuere Fluoreszenz-Titrationen hat sich herausgestellt, dass das Derivat 4-ddma-ATc mit derselben Effizienz an TetR(BD) binden müsste wie Tetrazyklin (Wimmer, 2007). Mit dieser Kenntnis wurde nochmals überprüft, ob 4-de(dimethylamino)-Derivate für TetR als Anti-Induktor fungieren können, obwohl dies – zumindest für das Beispiel 4-ddma-ATc – in früheren Arbeiten bereits ausgeschlossen wurde (Wimmer, 2007). 3.4.1 Verdrängungsexperimente mit verschiedenen 4-ddma-Derivaten Wenn 4-ddma-Derivate Anti-Induktoren darstellen, müssen sie die Eigenschaft besitzen, Tc aus der Bindetasche von TetR verdrängen zu können. Dies wurde für drei Substanzen getestet: 4-ddma-Anhydrotetrazyklin (4-ddma-ATc), 4-ddma-Sanzyklin (4-ddma-San) und 4-ddma- Doxyzyklin (4-ddma-Dox) (Abb. 3.32). 4-ddma-Tetrazyklin selbst wurde aufgrund einer nicht feststellbaren Bindung an TetR nicht berücksichtigt (Lederer et al., 1996). CH 3 CH 3 OH O OH OH O NH 2 4-ddma-Doxyzyklin (4-ddma-Dox) O O O OH OH OH OH OH OH O OH O NH 2 4-ddma-Anhydrotetrazyklin (4-ddma-ATc) OH O OH OH O NH 2 4-ddma-Sanzyklin (4-ddma-San) Abb. 3.32: Strukturvergleich der verwendeten 4-ddma-Derivate. Die Verdrängungsexperimente wurden in vivo durchgeführt. Aufgrund der schlechten Aufnahmebedingungen von 4-ddma-Tetrazyklinen über die äußere Membran von gram-negativen Zellen, wurden die Messungen in dem Stamm E. coli NR698λtet50 durchgeführt (Wimmer, 2007), der durch eine Mutation im imp-Gen (engl. für increased membrane permeability) eine gestörte Anordnung der Lipopolysaccharide in der äußeren Membran besitzt (Ruiz et al., 2005; Ruiz et al., 2006). Dadurch wird die Aufnahme sowohl von hydrophilen als auch von hydrophoben Substanzen - 63 - 64 0 20 40 60 80 OH OH O O NH 2 ohne Effektor + 0,4 µM Tc + 0,4 µM Tc + 0,2 µM 4-ddma-Dox + 0,4 µM Tc + 0,4 µM 4-ddma-Dox + 0,4 µM Tc + 0,6 µM 4-ddma-Dox TetR(BD) 4-ddma-Dox O TetR(B) OH OH B 0 20 40 60 80 O OH O O NH 2 OH ohne Effektor + 0,4 µM Tc + 0,4 µM Tc + 0,2 µM 4-ddma-ATc + 0,4 µM Tc + 0,4 µM 4-ddma-ATc + 0,4 µM Tc + 0,6 µM 4-ddma-ATc TetR(BD) 4-ddma-ATc OH TetR(B) OH CH 3 0 20 40 60 80 C OH OH O O NH 2 ohne Effektor + 0,4 µM Tc + 0,4 µM Tc + 0,2 µM 4-ddma-San + 0,4 µM Tc + 0,4 µM 4-ddma-San + 0,4 µM Tc + 0,6 µM 4-ddma-San TetR(BD) 4-ddma-San O TetR(B) OH OH Abb. 3.33: Verdrängung von Tetrazyklin durch 4-ddma-Derivate. Die Messungen wurden in E. coli NR698λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. -Galaktosidase-Aktivität [%] OH -Galaktosidase-Aktivität [%] CH 3 -Galaktosidase-Aktivität [%] A ERGEBNISSE ERGEBNISSE erleichtert. Dieser Stamm wurde mit den tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 transformiert. Die Übernachtkultur wurde mit 0,4 µM Tc versetzt. Zu den Kulturen, die für die Messungen verwendet wurden, wurden zusätzlich verschiedene Konzentrationen (von 0,2 µM bis 0,6 µM) des 4-ddmaDerivats zugegeben. Die Repression von TetR wurde durch Messung der β-GalaktosidaseAktivität bestimmt (Abb. 3.33). Aus den Messungen geht hervor, dass 4-ddma-ATc Tetrazyklin aus der Effektorbindetasche verdrängen kann. Die Aktivität sinkt durch Zugabe einer äquimolaren Konzentration an 4-ddma-ATc auf 50% der Tc-Induktion. Dieser Effekt ist sowohl bei TetR(B) als auch bei TetR(BD) zu beobachten, wobei TetR(BD) in dem Stamm E. coli NR698λtet50 generell schlechter durch Tc induzierbar ist als TetR(B). Auch 4-ddma-San verdrängt Tc erfolgreich aus der Bindetasche, wobei hier der Effekt bei TetR(B) deutlicher ist als bei TetR(BD). 4-ddma-Dox besitzt die geringste Verdrängungswirkung. Durch Zugabe von 0,4 µM 4-ddma-Dox wird die Induktion von TetR(B) nur auf 24% und die von TetR(BD) auf 20% verringert. Damit ist für alle untersuchten 4-ddma-Derivate eine anti-induktorische Wirkung zu erkennen. Die Effizienz als Anti-Induktor hängt anscheinend mit der Anzahl der funktionellen Gruppen an der „Oberseite“ der Derivate (C5- und C6-Substituenten) und deren Wechselwirkungen mit den Resten der Effektorbindetasche zusammen. Da Messungen mit der durch 4-ddma-Derivate induzierbaren Variante TetRi2 (TetR H64K S135L S138I) ergaben, dass die Bindung von Tc zu einer stärkeren Repression führt, wurde zur Vollständigkeit mit TetRi2 ein Verdrängungsexperiment von 4-ddma-ATc durch Tc durchgeführt. Allerdings wurde die Verdrängung in dem „normalen“ Stamm E. coli WH207λtet50 durchgeführt, da Tc scheinbar ungehindert durch die äußere Membran gram-negativer Zellen -Galaktosidase-Aktivität [%] transportiert wird. Das Ergebnis ist in Abb. 3.34 gezeigt. 80 ohne Effektor + 0,4 µM 4-ddma-ATc + 0,4 µM 4-ddma-ATc + 0,2 µM Tc + 0,4 µM 4-ddma-ATc + 0,4 µM Tc + 0,4 µM 4-ddma-ATc + 0,6 µM Tc 60 40 20 0 TetR-i2 Abb. 3.34: Verdrängung von 4-ddma-ATc durch Tetrazyklin an TetRi2. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetRAllelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Durch Zugabe von Tc ist ab einer Konzentration von 0,6 µM eine schwache Verdrängung von 4-ddma-ATc aus der Effektorbindetasche zu erkennen. Im Vergleich zu der Verdrängung von Tc durch 4-ddma-ATc bei TetR ist dieser Effekt aber sehr gering, was vermutlich mit der sehr niedrigen Affinität von TetRi2 für Tc zu tun hat, die schon in Fluoreszenztitrationen von TetRi2 mit - 65 ERGEBNISSE Tc aufgefallen ist (Wimmer, 2007). Bindekonstanten von Tc an TetRi2 wurden bisher nicht bestimmt. Desweiteren können 4-ddma-Derivate im Gegensatz zu Tc die äußere Membran gramnegativer Zellen nicht ungehindert passieren (Wimmer, 2007). Dadurch ist die intrazelluläre Konzentration des Induktors vermutlich weit geringer als 0,4 µM und es bedarf mit 0,6 µM einem sehr großen Überschuss an Tc, um überhaupt einen geringen Effekt zu sehen. In der „Leaky“Mutante, in der die Messung nicht mehr durchgeführt werden konnte, würde man bei den oben verwendeten molaren Verhältnissen vermutlich keinen Effekt sehen und höhere Tc- Konzentrationen sind wegen der Toxizität von Tetrazyklin nicht einsetzbar. Das macht die Verwendung von Tc als Anti-Induktor für TetRi2 uninteressant. 3.4.2 Limitierte Proteolyse in Anwesenheit von Induktoren und Anti-Induktoren Die Bindung eines Induktors hat einen stabilisierenden Effekt auf die Struktur von TetR, insbesondere auf die DNA-Bindedomäne (Reichheld & Davidson, 2006; Reichheld et al., eingereicht; Resch et al., 2008). TetR ist im induzierten Zustand unanfälliger gegenüber dem Verdau mit Proteasen, was durch eine Einschränkung der Flexibilität zustande kommt. Diese Stabilisierung wird nur vollwertigen Induktoren zugeschrieben und als Teil des Induktionsmechanismus‘ angenommen (Reichheld et al., eingereicht). Demnach dürfte die Bindung eines Anti-Induktors wie 4-ddma-ATc keine Stabilisierung bewirken. Um dies zu überprüfen, wurde TetR ohne Effektor, mit den Induktoren Tc, ATc und dem AntiInduktor 4-ddma-ATc einer limitierten Proteolyse unterzogen. Nach verschiedenen Zeitabständen wurden Proben entnommen und diese auf einem 15%igen SDS-Gel analysiert. Mithilfe der Software QuantityOne von Bio-Rad war es möglich, die Menge an nicht verdautem Protein aus dem Gel zu quantifizieren und als Grafik darzustellen (Abb. 3.35). Nach einer 30-minütigen Behandlung mit Proteinase K sind von TetR nur noch 10% an unverdautem Protein vorhanden. Die Bindung von 4-ddma-ATc stabilisiert die Proteinstruktur, so dass nach 30 Minuten noch 51% unverdautes Protein vorhanden sind. Die Induktoren Tc haben einen stärkeren Stabilisierungseffekt auf TetR (Tc: 82%, ATc: 79% unverdautes Protein nach 30-minütiger Inkubation). Dieses Experiment hat gezeigt, dass TetR nicht nur durch die Bindung eines Induktors, sondern auch durch die eines Anti-Induktors stabilisiert werden kann. - 66 ERGEBNISSE B 100 Menge an unverdautem TetR [%] TetR 100 80 60 20 60 WH207 NR698 Menge an unverdautem TetR [%] A -Gal Aktivität [%] 40 20 0 0 10 20 30 40 50 TetR + 10x 4-ddma-ATc 100 80 60 100 40 60 20 20 -Gal Aktivität [%] 0 60 0 10 20 Inkubatioszeit [min] 0 1 2 5 10 15 20 30 60 0 40 50 60 1 2 5 10 15 20 30 60 25 20 25 20 15 15 10 kDa kDa 10 C D TetR + 10x Tc 100 Menge an unverdautem TetR [%] Menge an unverdautem TetR [%] 30 Inkubatioszeit [min] 80 60 100 40 60 20 20 -Gal Aktivität [%] 0 0 10 20 30 40 50 60 TetR + 10x ATc 100 80 60 100 40 60 20 20 -Gal Aktivität [%] 0 0 10 20 Inkubatioszeit [min] 0 1 2 5 10 15 20 30 30 40 50 60 Inkubatioszeit [min] 60 0 15 15 10 10 1 2 5 10 15 20 30 60 kDa 25 20 kDa 25 20 Abb. 3.35: Limitierte Proteolyse von TetR in Ab- und Anwesenheit der Effektoren 4-ddma-ATc, Tc und ATc. Für 2+ die Reaktion wurde eine Phosphat-gepufferte, 0,1 mM TetR-Lösung mit einem zehnfachen Überschuss an Mg und des jeweiligen Effektors eingesetzt. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von 0,25 µg/µL Proteinase K und anschließende Inkubation bei 37°C durchgeführt. Nach Hitzeinaktivierung der Proteinase K wurden die Proben auf ein 15%iges SDSGel aufgetragen. Jede Spur enthält insgesamt 23 µg von partiell verdautem TetR. Die Menge der Hauptbanden wurde mit dem Programm QuantityOne (Bio-Rad) ermittelt und grafisch aufgetragen. Die kleinen Bilder zeigen die Aktivität von TetR in Anwesenheit von 0,4 µM des jeweiligen Induktors in E. coli WH207λtet50 (graue Balken) und E. coli NR698λtet50 (schwarze Balken). - 67 ERGEBNISSE 3.4.3 Stabilisierung von revTetR-Varianten durch 4-ddma-ATc Nachdem durch Proteolyse-Experimente gezeigt wurde, dass auch die Bindung eines AntiInduktors einen stabilisierenden Effekt auf TetR hat, wurde die Wirkung von 4-ddma-ATc auf verschiedene reverse Tet-Repressoren getestet. Für diesen Versuch wurden die Varianten TetRr2 (E15A L17G L25V), TetRr6 (L17S E23K), TetRr8 (E15V L17A E19D) und TetRr9 (V20G G21R I22N) (Scholz et al., 2004) ausgewählt, die bereits für die Konstruktion einer reversen TetR(B)-Variante zum Einsatz kamen. Zusätzlich wurden auch die TetR(B)-Varianten dieser Mutanten in der Messung eingesetzt, die nur schlecht oder gar nicht durch ATc koreprimierbar sind. Da angenommen wurde, dass die TetR(B)-Varianten durch ATc „induziert“ werden (wodurch auch in Anwesenheit von ATc eine Repression verhindert wird), sollte auf diese Weise überpüft werden, welchen Effekt die Bindung eines nicht-induzierenden Tc-Derivats auf die revTetR hat. Für die Messung wurde E. coli WH207λtet50 mit den tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 transformiert. Die Aktivität der TetR-Varianten wurde in Ab- und Anwesenheit von 1,0 µM 4-ddmaATc bestimmt (Abb. 3.36). Die Anwesenheit von 4-ddma-ATc verbessert bei allen vier TetR(BD)rVarianten die Repression, wobei der Effekt bei TetR(BD)r6 mit einem Regulationsfaktor von 3,5 am stärksten ist. Auch bei TetR(B)r2, TetR(B)r8 und TetR(B)r6 führt die Anwesenheit von 4-ddma-ATc zu einer besseren Repression, die sogar stärker als nach Zugabe von 0,4 µM ATc ist (und MIKMessungen haben gezeigt, dass die Aufnahme von ATc in gram-negative Zellen nicht in dem Ausmaß beeinträchtigt wird, wie es bei 4-ddma-ATc der Fall ist; Wimmer, 2007). Einzig auf die Variante TetR(B)r9 hat 4-ddma-ATc keinen Effekt. Die Ergebnisse aus dieser Messung lassen vermuten, dass auch die Bindung von 4-ddma-ATc zu einer Konformationsänderung der revTetRDNA-Bindedomäne führt, was sich durch eine verbesserte Repression zeigt. -Galaktosidase-Aktivität [%] TetR(BD) TetR(B) 120 100 80 60 40 20 0 r2 r6 r8 r2 r9 r6 r8 r9 ohne Effektor + 1,0 µM 4-ddma-ATc Abb. 3.36: Aktivitäten verschiedener revTetR-Varianten in Abwesenheit und Anwesenheit von 1,0 µM 4-ddma-ATc. Die Messungen wurden in E. coli WH207λtet50 mit tetR-Allelen auf dem Plasmid pWH1925 durchgeführt. Die Expression der β-Galaktosidase in Abwesenheit von TetR wurde als 100% gesetzt. Die transparenten Balken mit dem dickeren Umriss deuten die Aktivität in Anwesenheit von 0,4 µM ATc an. - 68 DISKUSSION 4 DISKUSSION 4.1 Signalübertragung während der Induktion von TetR TetR ist eines der am intensivsten untersuchten bakteriellen Regulatorproteinen und stellt mittlerweile ein Musterbeispiel für einen prokaryotischen, genetischen Schalter dar (Berens & Hillen, 2003; Bertram & Hillen, 2008; Saenger et al., 2000). Anders als bei TrpR, bei dem der Effektor L-Tryptophan in eine Tasche direkt unter den C-terminalen Helix-turn-Helix-Motiven bindet und sogar selbst zur DNA-Bindung beiträgt, indem die Indolgruppen Wasserstoffbrücken zu den DNA-Phosphaten ausbilden (Otwinowski et al., 1988; Zhang et al., 1987), ist bei TetR die Effektorbindetasche von der N-terminalen DNA-Bindedomäne über 30 Å entfernt. Somit ist eine direkte Beteiligung des Effektors an der Konformationsänderung des Helix-turn-Helix-Motivs nicht möglich, sondern es muss ein Signal über die Proteinstruktur übertragen werden, um die für die Induktion notwendigen Konformationsänderungen auszulösen. Den Informationsweg zu kennen, über den dieses Signal von der Effektorbindetasche zu der DNA-Bindedomäne übermittelt wird, ist eine Voraussetzung, um verschiedene Aktivitätsvarianten von TetR zu verstehen und Varianten mit neuen Eigenschaften zu konstruieren. Während alle bisherigen Untersuchungen auf diesem Gebiet auf Computersimulationen, Berechnungen der Moleküldynamik (Aleksandrov et al., 2008; Haberl et al., 2009; Lanig et al., 2006a) oder dem einfachen Vergleich von DNA- und Effektorgebundenen Kristallstrukturen (Orth et al., 1998; Orth et al., 2000) beruhen, wurden in dieser Arbeit zum ersten Mal experimentelle Daten verwendet, um einzelne Aminosäuren zu ermitteln, die für die Signalübertragung in TetR von Bedeutung sind. Die so erhaltenen SignalweiterleitungsKarten ermöglichen einen tieferen Einblick in den Induktionsmechanismus von TetR. Von „dem Mechanismus der Induktion“ zu sprechen, ist allerdings irreführend. Wie bereits von Haberl et al. vorgeschlagen, gibt es für TetR mehrere Möglichkeiten der Induktion (Haberl et al., 2009). Die einfachste ist partielle Denaturierung (Resch et al., 2008). Auch thermodynamische Effekte können Einfluss auf die Repression haben. Peter Schubert verglich in seiner Doktorarbeit die Repression von Alanin-Einzelmutanten bei 28°C und 37°C. Die Repression bei 37°C war durchweg zwei- bis zehnfach schwächer als bei 28°C (Schubert, 2001), was einer Induktion durch Temperaturerhöhung gleichkommt. Neben der Induktion durch den natürlichen Induktor Tetrazyklin und seinen Derivaten ist seit Kurzem auch die induktorische Wirkung des Oligopeptids Tip (Klotzsche et al., 2005; Luckner et al., 2007) und eines RNA-Aptamers (Hunsicker et al., 2009) bekannt. Da sich diese synthetischen Effektoren strukturell sehr stark von Tetrazyklin unterscheiden, geht man davon aus, dass sie TetR auch auf unterschiedliche Weise induzieren. Im Folgenden wird vor allem auf die Tetrazyklin-abhängige sowie die Peptid-basierte Induktion von TetR eingegangen, die durch die Alanin-Austauschmutagenese untersucht wurden. - 69 DISKUSSION 4.1.1 Induktion durch Tetrazyklin 4.1.1.1 Effektorbindung und Einleitung des Induktionsmechanismus Während andere Repressoren der TetR/CamR-Familie, wie QacR aus Staphylococcus aureus, AcrR aus Escherichia coli oder CmeR aus Campylobacter jejuni, verschiedene Effektoren binden können (Routh et al., 2009; Schumacher et al., 2001), ist die Erkennung von Tetrazyklin durch TetR ziemlich spezifisch. Bei der variablen Effektorbindung von QacR spielen überwiegend Tyrosin- und Tryptophanreste eine Rolle, die über Van-der-Waals-Interaktionen die aromatischen Ringsysteme der Effektoren binden, sowie Glutamin- und Glutamatreste, die hydrophile oder ionische Interaktionen zum quartären Stickstoff der Effektoren ausbilden (Peters et al., 2008; Schumacher et al., 2001). Aus der Tc-gebundenen Kristallstruktur von TetR geht hervor, dass die funktionellen Gruppen des Tetrazyklins durch hydrophile und hydrophobe Interaktionen mit den Resten in der Effektorbindetasche völlig abgesättigt sind, was zum einen die hochaffine Bindung und zum anderen die oben genannte spezifische Erkennung des Effektors erklärt (Abb. 4.1). QacR Y123 W61 TetR Q116 L131 L174‘ E120 F162‘ Q109 N82 H64 M177‘ P105 Q96 I99 F86 Mg2+ Y103 E147‘ H100 T103 Abb. 4.1: Vergleich der Effektor-kontaktierenden Reste von QacR (links) und TetR (rechts). Die Effektoren sind in grün dargestellt, das Peptidrückgrat der beiden Proteine in orange. Hydrophile Wechselwirkungen sind als dünne, hydrophobe als dicke, gestrichelte Linien eingezeichnet. Während bei QacR überwiegend Van-der-WaalsInteraktionen mit den aromatischen Ringen der Effektoren (hier: Malachitgrün) gebildet werden, spielen bei der spezifischen Erkennung von Tetrazyklin durch TetR sowohl hydrophile als auch hydrophobe Wechselwirkungen eine Rolle, die alle funktionellen Gruppen des Tetrazyklins absättigen. Zur Wahrung der Übersicht wurden nur die 2+ wichtigsten Reste aus den Bindetaschen dargestellt. Die Mg -Koordination von TetR ist nur angedeutet. Zur Erstellung der Abbildung wurden die Kristallstrukturen von [QacR•Malachitgrün] (PDB-Eintrag: 3BQZ) (Brooks et al., eingereicht) und von [TetR(D)•Tc] (PDB-Eintrag: 2TRT) verwendet. Von den 20 Resten der Effektorbindetasche konnten nur 5 (Ser67, Thr112, Val113, Ile134 und Ser138) durch Alanin ausgetauscht werden, ohne die Induzierbarkeit von TetR durch Tc zu beeinflussen. Die übrigen Alanin-Substitutionsmutanten zeigten verminderte Induktion, was in den meisten Fällen mit einer starken Verringerung der Tc-Bindeaffinität einhergeht. So liegen zum Beispiel die Bindekonstanten für TetR(D) F86A, -H100A und -T103A etwa 50-fach, die für -H64A und -P105A etwa 10-fach unter der des Wildtyps (Scholz et al., 2000). Somit wird durch die Verkürzung der Seitenketten scheinbar nicht der Signalübertragungsweg unterbrochen, sondern - 70 DISKUSSION nur die Bindung von Tc verschlechtert. Dafür spricht, dass die singulären Alanin-Mutanten durch den stärkeren Binder und Induktor ATc besser induziert werden können als durch Tc. Strukturdaten eines [TetR•ATc]-Komplexes liegen bisher noch nicht vor, jedoch haben Modellierungsrechnungen gezeigt, dass ATc etwas anders als Tc in der Bindetasche liegt und im Vergleich zu diesem leicht „nach hinten gekippt“ ist (persönl. Mitteilung H. Lanig). Ob die in der Simulation gesehenen unterschiedlichen Wechselwirkungen von Gln109 mit Tc und ATc (Tc: Gln109 interagiert mit der 6-OH-Gruppe; ATc: Gln109 interagiert mit O1 und dem Sauerstoff der Amidgruppe) allerdings wirklich einer der Gründe für die stärkere Induktionswirkung von ATc sind (Lanig et al., 2006b), kann durch die experimentellen Daten aus der Austauschmutagenese nicht bestätigt werden. Der Alanin-Austausch von Gln109 hat keinerlei Auswirkungen auf die Induktion durch ATc. Die geänderte Lage von ATc in der Effektorbindetasche erklärt aber eventuell andere Effekte. In der etwas nach hinten gedrehten Position bleiben zwar die wichtigen Kontakte zur „Unterseite“ von ATc erhalten (Asn82, Thr103, Pro105, Glu147), die Kontakte zur „Oberseite“, wie sie durch Val113, Gln116, Leu117, Leu131, Ile134 sowie Leu170‘, Leu174‘ und Met177‘ vom zweiten Monomer gebildet werden, können von denen zu Tc abweichen. Das würde erklären, warum Alanin-Austausche dieser Aminosäuren gegen Alanin keinen Effekt auf die Induktion durch ATc in vivo haben. Einige Austausche setzen jedoch die Affinität für ATc herab. Die Bindekonstanten der Mutanten TetR(D) V113A und -Q116A sind 8-fach bzw. 34-fach niedriger als beim Wildtyp (Scholz et al., 2000), wobei die Bindung hier trotzdem noch um den Faktor 25 bzw. 5 stärker ist als die Bindung von Tc an TetR. 4.1.1.2 Informationsübertragung zwischen den Domänen Die Bindung von Tc führt zu einer Verschiebung mehrerer angrenzender Helices von revTetR (Abb. 4.2). Die Anhebung der α6-α7-Schleife, ausgelöst durch die Mg2+-Koordination von His100 und Thr103, ist eines der Schlüsselereignisse während der Induktion. Durch das Anheben werden mehrere Reste der α6-α7-Schleife neu angeordnet, darunter auch Arg104, das in der neuen Position eine Salzbrücke mit Asp178‘ aus Helix α9‘ bildet. Das Induktionsverhalten der in der Austauschmutagenese hergestellten Variante TetR R104A wirft die Frage auf, ob diese Salzbrücke nur zur Stabilisierung zwischen der α6-α7-Schleife und α9‘ beiträgt (Aleksandrov et al., 2008) oder ob erst durch die Ausbildung dieser Wechselwirkung Tc-kontaktierende Reste von α9‘ wie Met177‘ (und Arg104 selbst) in eine günstigere Position für die Interaktion mit Tc gebracht werden. TetR R104A ist nicht durch Tc induzierbar. Der Austausch hat in vivo keinen Effekt auf die ATcInduktion. Für die koordinierende Wirkung spricht, dass die Austausche R104A und D178G (Müller et al., 1995) einen viel stärkeren Einfluss auf die Induktion als beispielsweise M177A haben. Der geringe Effekt auf die ATc-Induktion könnte auf die oben erwähnte andere Ausrichtung des ATcMoleküls in der Bindetasche zurückzuführen sein. Da auch Alanin-Austausche von Leu170, Leu174 oder Met177 keine Auswirkung auf die ATc-Induktion haben, dürfte auch eine fehlende „Feinausrichtung“ dieser Seitenketten, wie es durch den Wegfall der Salzbrücke zwischen Arg104 - 71 DISKUSSION und Asp178‘ vermutet wird, keinen Einfluss haben. Dies konnte durch Aktivitätsmessungen von TetR R104A gezeigt werden. α7 α4 Q116 α9' H64 L170‘ L174‘ H100 M177‘ R104 α6 T103 D178‘ Abb. 4.2: Einfluss der TetrazyklinBindung auf angrenzende Helices von TetR. Die Position der Helices im DNA-gebundenen Zustand ist in hellgrau, die im induzierten Zustand in dunkelgrau dargestellt. Der Induktor (hier: Doxyzyklin) ist gelb eingezeichnet. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien dargestellt. Aminosäuren und Helices vom zweiten Monomer sind mit einem Apostroph gekennzeichnet. Für die Abbildung wurden die Strukturen [TetR(D)•tetO] (PDB-Eintrag: 1QPI) und [TetR(D)•Dox] (PDB-Eintrag: 2O7O) überlagert. Nach dem Induktionsmodell wird durch die Bewegung von Helix α6 in C-terminaler Richtung Helix α4, die mit α6 über hydrophobe Kontakte verbunden ist (Leu52••Val99, Ala56••Thr103), mitgezogen, worauf sich die für die Induktion nötigen Konformationsänderungen in der DNABindedomäne ergeben (Orth et al., 2000). Die Alanin-Austauschmutagenese hat allerdings noch weitere wichtige Aminosäuren wie Arg49, Asp53, Asp95, Asp157 oder Arg158 aufgedeckt, deren Bedeutung für den Induktionsvorgang mit diesem Modell nicht erklärt werden kann. Desweiteren hat auch eine der letzten Computersimulationen ergeben, dass die Bewegung von α6, die nach 15 ps auftritt, zu einer Unterbrechung der Kontakte zwischen α6 und α4 führt. Erst nach weiteren 80 ps werden die hydrophoben Kontakte zwischen beiden Helices wieder ausgebildet und beide Helices wieder aneinander fixiert (Aleksandrov et al., 2008). Obwohl hier Kinetik und Thermodynamik aufeinander treffen, lässt sich nicht ausschließen, dass neben der hydrophoben Interaktion zwischen α4 und α6 noch weitere Kräfte für die Verschiebung und die daraus resultierenden Konformationsänderungen in der DNA-Bindedomäne verantwortlich sind. In den Liganden-gebunden Strukturen von TetR, sowohl im Komplex mit einem Effektor als auch im Komplex mit DNA, erkennt man eine Entwindung des N-Terminus von Helix α7, die in der freien Struktur von TetR nicht auftritt (Abb. 4.3). Anders als beim DNA-gebundenen TetR ist das N-terminale Ende von Helix α7 in den induzierten Strukturen nach außen gedrückt, vermutlich ausgelöst durch die Wechselwirkung von Gln109 und Val113 mit Tetrazyklin. Dabei verschiebt sich der N-Terminus von α7 in dieselbe Richtung, in die sich auch α4 bewegt. Ob dies nur zur Stabilisierung der angehobenen α6-α7-Schleife beiträgt, oder ob Reste in dieser Region (z.B. Asp106, Lys108) ebenfalls an der Verschiebung von α4 beteiligt sind (z.B. über Glu58), kann mit den vorliegenden Daten nicht beantwortet werden. Fakt ist: die Seitenkette von Gln109 ist für die Induktion durch Tc wichtig und der Austausch K108A führt zumindest beim reversen TetR zu - 72 DISKUSSION einem vollständigen Verlust der Korepression, sodass eine mögliche Interaktion zwischen Helix α4 und dem N-terminalen Ende von Helix α7 nicht ausgeschlossen werden kann. A B α7 C K108 V113 Q109 E58 K108 H100 Dox K108 D106 H100 Q116 Q109 Tc K108 D106 E58 V113 Q116 Q109 V113 Q109 D106 V113 Q116 Q116 D E58 H100 D106 E58 H100 α6 α4 Abb. 4.3: Partielle Entwindung von Helix α7 bei der Bindung eines Liganden. Die Abbildung zeigt wichtige Reste am N-terminalen Ende von Helix α7 sowie von benachbarten Helices im freien TetR (PDB-Eintrag: 1BJZ) (A), im DNA-gebundenen TetR (PDB-Eintrag: 1QPI) (B), im Tc-induzierten TetR (PDB-Eintrag: 2TRT) (C) und im Dox-induzierten TetR (PDB-Eintrag: 2O7O) (D). Bei den Liganden-gebundenen Strukturen (dunkelgrau) ist zum Vergleich das Peptidrückgrat des freien TetR (hellgrau) angedeutet. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, gestrichelte Linien eingezeichnet. Die Effektoren sind gelb dargestellt. Aminosäuren, welche die Induktion durch Tc beeinträchtigen, sind fett gedruckt. Durch die Tc-Bindung wird das C-terminale Ende von Helix α8‘ in Richtung α4 geschoben. Die molekulare Ursache, die zu dieser Verschiebung führt, ist nicht bekannt. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Bindung von ATc die Flexibilität der α8-α9-Schleife erhöht (Vergani et al., 2000). Polyalanin-Studien der α8-α9-Schleife zeigten, dass die Induzierbarkeit erhöht wird, wenn die konservierten Reste Asp157‘ und Arg158‘ vorhanden sind. Damals lag noch keine Kristallstruktur mit einer aufgelösten α8-α9-Schleife vor und so vermutete man, dass diese Reste für die Repositionierung von α9‘ während des Induktionsvorgangs wichtig sind (Scholz et al., 2001). Lanig et al. diskutierten eine magnesiumkoordinierende Wirkung von Glu157‘, das nach der Bindung von Tc eine Wechselwirkung mit Glu23 ausbildet (Lanig et al., 2006a). Es wurde auch ein möglicher Kontakt zwischen Glu150‘ und Lys98 beschrieben (Aleksandrov et al., 2008), der α8‘ an Helix α6 fixiert. Die Kristallstrukturen, die nur Anfangs- und Endpunkt einer Molekülbewegung darstellen, können diese Theorien weder bestätigen noch widerlegen. Aktivitätsmessungen der AlaninMutanten zeigten aber, dass sowohl E23A als auch D157A die Induktion durch Tc (nicht jedoch durch ATc) beeinträchtigen. Auch der Austausch E150A verschlechtert die Induktion durch Tc. Der Alanin-Austausch von Lys98 hat keinen Einfluss auf die Induzierbarkeit. Damit konnte gezeigt werden, dass Glu23, Glu150 und Asp157 zumindest für die Induktion durch Tc von Bedeutung sind. - 73 DISKUSSION A H64 H100 Dox α4 L60 V99 I59 D95 L14 E23 L17 K98 L55 R62 N18 α6 E150 D95 L14 N11 L17 E23 α1 B α4 E147‘ E150‘ R158‘ D53 R49 H64 L60 Dox H100 α8' V99 N18 L55 A 90° R62 R158‘ D53 E157‘ α1 N11 R49 Abb. 4.4: Position und Wechselwirkungen wichtiger Seitenketten für die Induktion von TetR(BD) durch Tetrazykline. Die Abbildungen links sind Ausschnitte aus den Signalkarten und zeigen die Position und Bedeutung der durch die Alanin-Austauschmutagenese untersuchten Aminosäuren. Das Peptidrückgrat des DNA-gebundenen TetR (PDB-Eintrag: 1QPI) ist in hellgrau, das des induzierten TetR (PDB-Eintrag: 2O7O) in dunkelgrau dargestellt. Doxyzyklin ist gelb eingezeichnet. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien gezeichnet. Alanin-Austausche der fett gedruckten Aminosäuren verhindern die Induktion durch Tc und ATc. (A) Detailansicht der Zwischenregion zwischen DNA-Bindedomäne und Proteinkörper. Glu23, Lys98 und Glu150 stabilisieren die induzierte Form durch Wasserstoffbrückenbindungen zu strukturell wichtigen Wassermolekülen (als Kalottenmodell dargestellt). (B) Seitenansicht der DNA-Bindedomäne mit den benachbarten Helices α4 und α8‘. Der schwarze Pfeil deutet die Induktionsbewegung an. - 74 DISKUSSION In der Struktur von TetR mit Dox (PDB-Eintrag: 2O7O), das wie ATc einen starken Induktor darstellt, ist Helix α8‘ am C-Terminus um eine Windung verlängert, was bisher nur in der Tipinduzierten Struktur von TetR beobachtet wurde (Luckner et al., 2007). In den beiden Tckomplexierten Strukturen, in denen die α8‘-α9‘-Schleife vollständig aufgelöst ist, ist diese zusätzliche Windung entweder gar nicht ([TetR•Tc]; PDB-Eintrag: 2TRT1) (Hinrichs et al., 1994) oder nur ansatzweise vorhanden ([TetR•7-Chlor-Tc]; PDB-Eintrag: 2FJ1) (Palm et al., 2008). Durch die Verlängerung von α8‘ steht Arg158‘ mit nur noch 2,9 Å Abstand in einer Position, welche die Ausbildung einer Salzbrücke zu Asp53 ermöglicht. Die Bildung der Salzbrücke wird unterstützt, indem Arg49, das in der DNA-gebundenen Struktur von TetR mit Asp53 interagiert, sich mit Val99 einen neuen Interaktionspartner sucht (Abstandsänderung Arg49Val99 von 8,1 Å auf 3,2 Å) (Hinrichs et al., 1994), zu dessen Peptidrückgrat es eine Wasserstoffbrücke ausbildet. Damit gäbe es eine weitere, stabilisierende Interaktion zwischen dem N-Terminus von α4 und der verschobenen Helix α6. Aktivitätsmessungen der Alanin-Mutanten zeigten, dass sowohl R158A als auch D53A zu einer erheblichen Verschlechterung der Tc-Induktion führen. R49A unterbricht die Tc-Induktion vollständig. Die Austausche R158A und R49A beeinträchtigen darüber hinaus auch noch die Induktion durch ATc. Damit sind die Aminosäuren Arg49, Asp53 und Arg158 ein wichtiger Teil des Induktionsvorgangs. Da die Positionsänderung von Arg49 oder Asp53 zu gering ist, um die Induktionsbewegung der DNA-Bindedomäne zu verursachen, und Computerberechnungen ergeben haben, dass Tyr49 oder Ile49 (in den ebenfalls induzierbaren Varianten TetR R49Y und -R49I) keine Wechselwirkung zu Helix α6 ausbilden, wurde TetR R49A auf eine Stabilitätsänderung hin überprüft. Proteolyse-Experimente bestätigten eine Beteiligung von Aminosäure 49 auf die Gesamtstabilität von TetR: Die Mutante TetR R49A ist im uninduzierten Zustand etwas und im induzierten Zustand erheblich instabiler als der Wildtyp. Damit scheint die Wechselwirkung von Arg49 TetR während der Induktion zu stabilisieren. Einen ähnlichen Effekt könnte auch die Wechselwirkung von Arg158 mit Asp53 haben, da der R158A-Austausch die Induktion von ATc nicht komplett verhindert und diese Interaktion somit kein essentieller Bestandteil der Induktionsbewegung zu sein scheint. Als weitere wichtige Aminosäuren wurden durch die Alanin-Austauschmutagenese Asp95 und Leu17 ermittelt. Asp95 ist ein Kontakt zwischen Helix α6 und der DNA-Bindedomäne. Fehlt dieser Kontakt, wird die Induktion durch Tc vollständig verhindert, die durch ATc deutlich verschlechtert. Aus den Strukturdaten lässt sich eine Wechselwirkung mit dem Peptidrückgrat von Ile22 herauslesen. Da dieser Kontakt sowohl in der induzierten, als auch in der DNA-gebundenen Struktur vorhanden ist, wird davon ausgegangen, dass es sich hier um eine Fixierung von α6 an α1 handelt und α1 bei der Bewegung von α6 an diese gekoppelt ist. Eine ähnliche Funktion hat wohl auch der Kontakt von Asn18 zu dem Peptidrückgrat von Arg94, wobei N18A die Induktion durch Tc nur geringfügig beeinträchtigt. Essentiell dagegen ist Leu17 aus α1, das Teil der 1 Von 2TRT stand eine Version mit modellierter α8-α9-Schleife zur Verfügung (Hinrichs et al., 1994). - 75 DISKUSSION hydrophoben Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6 ist (Abb. 4.4). TetR L17A kann weder durch Tc noch durch ATc induziert werden. Im Gegensatz zu Leu14, Leu55 und Ile59, deren Alanin-Austausche die Induzierbarkeit durch Tc und ATc nur verringern, scheint die Seitenkette von Leu17 für die Stabilität der hydrophoben Zone besonders wichtig zu sein. Wie bereits beschrieben, führen Mutationen in der hydrophoben Zone, die für die Übertragung der α6Bewegung auf die DNA-Bindedomäne wichtig ist, zu einer Änderung der Flexibilität in diesem Bereich, wodurch es zur Umkehrung des Regulationsverhaltens und damit zur Ausbildung von „reversen“ TetR-Varianten kommen kann (Resch et al., 2008), wie das auch bei TetR L17A (schlecht regulierbar) bzw. TetR L17G oder -V99E (gut regulierbar) Fall ist (Henssler, 2005; Scholz et al., 2004). Zusammengefasst besteht der Induktionsvorgang also scheinbar aus zwei unabhängigen Vorgängen, die durch die Tetrazyklinbindung ausgelöst werden: 1) Konformationsänderung (Induktionsbewegung): Die Bindung von Tc führt durch die Mg2+Koordination zu einer Verschiebung von Helix α6. Diese Bewegung wird durch einen essentiellen Kontakt zwischen Asp95 und dem Peptidrückgrat von Ile22 auf Helix α1 übertragen. Zusätzlich folgt Helix α4 dieser Bewegung, die durch hydrophobe Kontakte mit α1 und α6 verbunden ist. Hier haben sich Leu14, Leu17, Leu55 und Ile59 als wichtig herausgestellt, deren Alanin-Austausche zu einer generellen Verschlechterung der Induzierbarkeit führen. Die Bewegung wird über α4 direkt auf die DNA-Bindedomäne übertragen, was dazu führt, dass sich wichtige Protein-DNA-Kontakte wie Lys48••Gua10 lösen (Aleksandrov et al., 2008) und der TetR-Operator-Komplex dissoziiert. Die DNA-Bindedomäne ist in der geänderten Position vermutlich immer noch flexibel genug, um erneut eine DNAbindende Konformation anzunehmen und wieder an den Operator zu binden. Dies wird beispielsweise für TetR R49A vermutet. 2) Stabilisierung der geänderten Konformation: Durch die Tetrazyklin-Bindung werden weitere Konformationsänderungen ausgelöst, die u.a. zu einer Annäherung von Helix α8‘ an Helix α4 führen. Diese ist bei starken Induktoren wie Dox (und evtl. auch ATc) ausgeprägter als bei Tc. Über Wechselwirkungen zwischen den Resten am C-terminalen Ende von α8‘ (Arg158, Asp157) und dem N-terminalen Ende von α4 (Arg49, Asp53) sowie einer Interaktion zwischen Arg49 und dem Peptidrückgrat von Val99 wird die DNA-Bindedomäne in der nicht DNAbindefähigen Position fixiert, wodurch die beiden Erkennungshelices α3 und α3‘ in ihrem um 3 Å vergrößerten Abstand bleiben. Sowohl Arg49 als auch Asp53 und Arg158 konnten als wichtige Aminosäuren identifiziert werden, deren Alanin-Substitutionsmutanten nicht durch Tc induzierbar sind, bei denen ATc aber noch eine Rest-Induktion zeigt. Bei TetR R49A konnte durch limitierte Proteolyse in Anwesenheit von Tc und ATc ein geringerer Stabilisierungseffekt als beim Wildtyp nachgewiesen werden. - 76 DISKUSSION Für eine erfolgreiche Induktion von TetR sind beide Vorgänge wichtig (Abb. 4.5). Da die Bewegung der Bindedomäne bei der Induktion durch Tc und ATc gleich ist, setzt diese Theorie allerdings voraus, dass sich die beiden Effektoren durch ihre stabilisierende Wirkung auf TetR unterscheiden. Das wird zumindest durch die Ergebnisse aus der limitierten Proteolyse gestützt, die z.B. bei TetR R49A, bei dem einer der Stabilisierung-vermittelnden Reste ausgetauscht ist, nach Zugabe von ATc eine stärkere Degradation gezeigt haben. A Induktionsbewegung + Tc TetR + + tetO Induktionsbewegung + Tc TetR-R49A + + + + tetO tetO B x x Stabilisierung des induzierten Zustands keine Stabilisierung des induzierten Zustands + + x x x x x x tetO tetO tetO Abb. 4.5: Schematische Darstellung des Induktionsvorgangs von TetR. (A) Im freien Zustand ist die DNA-Bindedomäne flexibel wodurch TetR eine DNA-bindende Konformation annehmen kann und an tetO + bindet. Die Bindung von [Tc•Mg] (gelbe Dreiecke) löst die spezifische Induktionsbewegung aus, wodurch sich TetR vom Operator löst. Auch nach dieser Konformationsänderung sind die DNA-Bindedomänen noch flexibel genug, um erneut an die DNA zu binden. Erst in Kombination mit einer zusätzlichen Konformationsänderung, die den induzierten Zustand stabilisiert (durch rote Striche gekennzeichnet), wird TetR erfolgreich induziert. (B) Bei einigen nicht-induzierbaren Varianten wie TetR R49A verhindern Mutationen die Stabilisierung des induzierten Zustands, wodurch sich TetR nicht dauerhaft von Operator lösen kann. 4.1.2 Induktion durch das Oligopeptid Tip Während TetR zur Zeit das einzige Protein aus der TetR/CamR-Familie ist, das durch ein Peptid induziert werden kann1, ist die Idee, durch Phage-Display isolierte Peptide zur Regulation und Modulation von Proteinaktivitäten (meistens von Enzymen) zu verwenden, nicht neu. So wurden bereits Peptide dazu verwendet, Resistenz-Enzyme wie die Erythromycin-Methyltransferase ErmC‘ aus Bacillus subtilis oder verschiedene Lactamasen aus Bacillus anthracis zu inhibieren (Giannattasio & Weisblum, 2000; Huang et al., 2003). Es wurden mittlerweile auch Oligopeptide gefunden, die Zellwandsynthese-Enzyme wie MurD oder MurE inhibieren und so neue antimikrobielle Agenzien darstellen (Bratkovic et al., 2008). Peptidische Effektoren haben aufgrund ihrer großen Variabilität und der zahlreichen Interaktionsmöglichkeiten ein sehr breites Anwendungsspektrum, das bisher erst in Ansätzen erschlossen ist. 1 Ausgenommen sind hiervon Regulatoren, die durch (hochmolekulare) Protein-Effektoren induziert werden, wie beispielsweise AmtR oder DhaS (Beckers et al., 2005; Christen et al., 2006). - 77 DISKUSSION Obwohl das aus 16 Aminosäuren bestehende Peptid Tip TetR mit gleicher Effizienz wie Tc induziert und die die Bindung beider Effektoren dieselbe Bewegung der DNA-Bindedomäne auslöst, wird aufgrund der sehr unterschiedlichen Kontakte zwischen TetR und Tip, bei der neben der Effektor-Bindetasche auch die Proteinoberfläche involviert ist, ein anderer Induktionsmechanismus angenommen (Klotzsche et al., 2005; Luckner et al., 2007). Da diese Arbeit schwerpunktmäßig die Signalübertragung von TetR(BD) zur Aufgabe hatte, standen für die Untersuchung der Tip-Induktion von TetR(B) nur die Alanin-Mutanten der DNA-Bindedomäne (Aminosäuren 4-49) zur Verfügung. Dennoch ließen sich aus den Messungen wichtige Erkenntnisse für die Interpretation des Induktionsvorgangs gewinnen. Für die Induktion durch Tip spielen Asn11, Leu17, Glu23 und Arg49 eine wichtige Rolle. Ein Austausch dieser Aminosäuren gegen Alanin führt zu einem vollständigen Verlust der Induzierbarkeit, die für die Mutanten einem Alles-oder-Nichts-Prinzip zu folgen scheint. Die Bedeutung von Arg49 ist dabei die einzige Gemeinsamkeit zur Tc-Induktion. Allerdings interagiert Arg49 in der Tip-induzierten Struktur nicht mit α6 (Val99), sondern mit Glu150‘ und Glu157‘ in der Schleife zwischen α8‘ und α9‘ (Abb. 4.6-B). Durch diese Wechselwirkung könnte Helix α4 näher an Helix α8 herangezogen werden und dadurch entscheidend zur Induktionsbewegung beitragen. Verstärkt wird die Interaktion zwischen der α8‘-α9‘-Schleife und Helix α4 durch eine Salzbrücke zwischen Arg158‘ und Asp53, die analog zur Dox-induzierten Struktur ausgebildet wird. Die Mutante TetR(B) R158A ist ebenfalls nicht mehr durch Tip induzierbar (persönl. Mitteilung J. Daam). Auch TetR(B) N11A kann nicht durch Tip induziert werden. Asn11 bildet zu Arg62 eine Wasserstoffbrücke und stabilisiert damit die N-terminale Region von Helix α1 relativ zu Helix α4 (Abb. 4.6). Diese Fixierung scheint eine entscheidende Rolle für die Konformationsänderung der Bindedomäne zu spielen. Dass TetR(B) E23A nicht durch Tip induzierbar ist, könnte durch eine verringerte Stabilisierung erklärt werden. Glu23 bildet zusammen mit Lys98 und Glu150 über strukturell wichtige Wassermoleküle ein Netzwerk an Wasserstoffbrücken, das die induzierte Konformation stabilisiert (Kisker et al., 1995). TetR(B) L17A ist durch Tc, nicht jedoch durch Tip induzierbar. Leu17 liegt im Zentrum der hydrophoben Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6, der auch die Aminosäuren Leu14, Ile22, Leu55, Met59 und Val99 angehören und die in TetR(BD) sowohl wichtig für die Induktion, als auch für die Stabilität der DNA-Bindedomäne ist (Kapitel 4.1.1). Da sich die Positionen der hydrophoben Seitenketten zueinander während des Induktionsvorgangs nicht oder nur kaum ändern, wird hier von einer Stabilisierung bzw. Fixierung der Helices α6, α4 und α1 ausgegangen. Durch den Austausch L17A wird die hydrophobe Zone wahrscheinlich durch den Wegfall von hydrophoben Wechselwirkungen destabilisiert (wie es auch bei L17G der Fall ist; Resch et al., 2008), wodurch die drei Helices während des Induktionsvorgangs nicht in ihrer relativen Position zueinander verankert sind. Die im Vergleich zur Tc-Induktion geringere Verschiebung von Helix α6 könnte dabei für die unterschiedliche Induzierbarkeit von TetR(B) L17A durch Tip und Tc verantwortlich sein. - 78 DISKUSSION A N11 W1 L17 α4 T103 E23 M59 V99 α6 K98 R62 E150 L55 L14 N11 L17 I22 E23 α1 B α4 R158‘ W1 N4 R49 R62 T103 N11 D148 ‘ α6 A 90° N11 H151‘ E150‘ N12 α1 E156‘ E157‘ R49 α8' Abb. 4.6: Position und Wechselwirkungen wichtiger Seitenketten für die Induktion von TetR(B) durch Tip. Die Abbildungen links sind Ausschnitte aus den Signalkarten und zeigen die Position und Bedeutung der durch die AlaninAustauschmutagenese untersuchten Aminosäuren. In den Detailansichten ist das Peptidrückgrat von TetR (PDB-Eintrag: 1QPI) ist hellgrau, das des Tip-induzierten TetR (PDB-Eintrag: 2NS8) in dunkelgrau dargestellt. Tip ist gelb eingezeichnet. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien dargestellt. Alanin-Austausche der fett gedruckten Aminosäuren führen zum Verlust der Tip-Induktion, kursiv gedruckte Aminosäuren wurden nicht untersucht. (A) Detailansicht der hydrophoben Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6. Glu23, Lys98 und Glu150 stabilisieren die induzierte Form durch Wasserstoffbrückenbindungen zu strukturell wichtigen Wassermolekülen (als Kalottenmodell dargestellt). (B) Seitenansicht der DNA-Bindedomäne mit den benachbarten Helices α4 und α8‘. Der schwarze Pfeil deutet die Induktionsbewegung an. Die Salzbrücke zwischen Arg158‘ und Asp53 wurde in de Detailzeichnung zur Wahrung der Übersicht weggelassen. - 79 DISKUSSION Die Bedeutung von Arg49 und Arg158 für die Induktion von TetR durch Tip und die Tatsache, dass die stärkste Verschiebung von Helix α4 an ihrem N-terminalen Ende (bei Arg49) stattfindet sowie die nur geringe Positionsänderung von Helix α6 würden für den zweiten vorgeschlagenen Induktionsmechanismus sprechen, bei dem die Induktionsbewegung durch Kontakte zwischen den Helices α4 und α8‘ ausgelöst wird (Kapitel 2.2.2.3). Allerdings scheint die alleinige Verschiebung von Helix α4 durch die „ziehenden“ Kontakte zu Helix α8‘ nicht ausreichend für eine erfolgreiche Induktion zu sein. Wie Aktivitätsmessungen der Mutanten TetR(B) L17A sowie -E23A gezeigt haben, spielen auch weitere (stabilisierende) Wechselwirkungen innerhalb der hydrophoben Zone sowie zwischen den beiden DNA-Bindedomänen eine Rolle. Die Zugbewegung von Helix α8‘ führt in Kombination mit der relativen Fixierung der Helices α1, α4 und α6 während des Induktionsvorgangs vermutlich zu einer Konformationsänderung innerhalb der DNA-Bindedomäne, bei der Helices α1 bis α3 in eine andere, starrere Anordnung gebracht werden, die es TetR nicht mehr ermöglicht, an den Operator zu binden. 4.2 Der reverse Tetrazyklin-Repressor (revTetR) 4.2.1 Die Destabilisierung erschwert eine Aussage über den Signalweg Die meisten Alanin-Substitutionen in der reversen Variante TetRr2 (TetR L15A L17G L25V)1 führen zu einem Verlust der Korepression durch Tc. Das spricht für die von Reichheld & Davidson publizierte These einer Destabilisierung. Die beiden Forscher vermuten, dass revTetR durch Mutationen in der hydrophoben Zone eine destabilisierte DNA-Bindedomäne besitzt, durch die eine Repression nicht möglich ist (Reichheld & Davidson, 2006). Eine erste Bestätigung dafür erbrachten zwei unabhängige Studien, die durch limitierte Proteolyse zeigen konnten, dass revTetR-Varianten anfälliger für Proteasen sind als der Wildtyp-TetR (Reichheld et al., eingereicht; Resch et al., 2008). Bei den Protein-Effektor-Kontakten gibt es nur wenige Unterschiede zwischen TetR und revTetR. Eine Ausnahme ist Thr103, das bei TetR wichtiger Bestandteil der Signalübertragung ist und in revTetR nur Bedeutung für die Korepression durch ATc hat, nicht für die durch Tc. Wichtiger als bei TetR sind hingegen die „Ankerreste“ His64, Phe86, Gln116, sowie die hydrophoben Kontakte von Leu117 und Ile134. Auch der Austausch von Val113 gegen Alanin führt in revTetR nicht wie bei TetR zu einer Verbesserung, sondern zu einer Verschlechterung der Regulation. Die erhöhte Bedeutung einzelner Effektor-kontaktierender Reste könnte mit der geringeren Affinität von revTetR für Tetrazykline zusammenhängen (Henssler, 2005), die bei vielen TetR-Mutanten mit destabilisierter DNA-Bindedomäne auftritt (Reichheld & Davidson, 2006). Dass ATc bei der Korepression von revTetR anders in der Effektorbindetasche bindet (wie ONPF bei LacI), konnte 1 TetRr2 wird in den folgenden Kapiteln meist als „revTetR“ bezeichnet. - 80 DISKUSSION die Auflösung der Struktur von [TetRr1•ATc] widerlegen (Resch et al., 2008). Wie auch beim induzierten TetR tritt beim ATc-gebundenen revTetR eine Anhebung der α6-α7-Schleife, eine Entwindung des N-Terminus von Helix α7 und die Erweiterung von Helix α8‘ um eine Windung auf. Auch die Verschiebung von α6 und α4 ist vergleichbar mit dem Dox-induzierten TetR (Abb. 4.7). Bis auf eine etwas andere Anordnung der variablen α8-α9-Schleife, sowie eine andere Ausrichtung von α9, unterscheidet sich der koreprimierte revTetR nur in der Konformation der DNABindedomäne vom induzierten TetR (Resch et al., 2008). Helix α4 ist wie beim induzierten TetR durch die stabilisierenden Wechselwirkungen zwischen Arg49, Asp53 und Arg158‘, Glu157‘ mit dem C-Terminus der erweiterten Helix α8‘ verbunden. R49A und D53A führen zu einer Verschlechterung der Korepression durch Tc. Als zusätzlicher Kontakt tritt eine Wasserstoffbrücke zwischen Asn47 und dem Peptidrückgrat von Asp157‘ auf, welche die α3-α4-Schleife zusammen mit Helix α3 stärker an α8‘ heranzieht (Abb. 4.7-B). Die Bedeutung dieses Restes zeigt sich auch bei dem Regulationsverhalten der Alanin-Mutante: TetRr2 N47A ist vollständig repressionsdefekt. Asn11 im N-terminalen Ende von Helix α1 steht in Kontakt mit Arg62 aus Helix α4. Das C-terminale Ende von Helix α1 ist über Asn18 mit dem Peptidrückgrat von Arg94 verbunden und gleichzeitig kontaktiert Asp95 das Peptidrückgrat von Ile22 – diese Kontakte sind ebenfalls identisch zu TetR und koppeln Helix α1 an α6. Ein Austausch von Arg94 und Asp95 gegen Alanin führt zum Verlust der Korepression durch Tc. Eine mögliche Interaktion von Glu23 ließ sich aus den Strukturdaten nicht herauslesen. Der Hauptunterschied zum induzierten TetR liegt bei revTetR in dem größeren Abstand zwischen α1 und α4/α6, durch den die hydrophobe Zone teilweise „unterbrochen“ wird und die DNA-Bindedomäne nicht die vollständige Verschiebung von α4 mitmacht (Abb. 4.7-A). Zusammengefasst gibt es also zwei Unterschiede zum induzierten TetR: Die zusätzliche Wechselwirkung von Asn47 mit der Peptidgruppe von Glu157‘ zieht Helix α3 in Richtung α8‘. Die r2-Mutationen führen zu einer Destabilisierung der hydrophoben Zone, wodurch α1 weiter von α4/ α6 entfernt ist. Durch die fehlende Zugbewegung der hydrophoben Zone wird das C-terminale Ende von α1 bei der Bewegung von α4/α6 nicht vollständig mitgezogen. Das führt zu einer anderen Anordnung des Helix-turn-Helix-Motivs innerhalb der Bindedomäne (Abb. 4.7), die es revTetR erlaubt, an die DNA zu binden. Die Empfindlichkeit dieser Anordnung wird deutlich, wenn man bedenkt, dass alle Alanin-Austausche in der DNA-Bindedomäne zum Verlust der Koreprimierbarkeit führen. Außerhalb der DNA-Bindedomäne führen nur wenige Alanin-Substitutionen zu einem generellen Verlust der Koreprimierbarkeit. Die Bedeutung von Lys108 lässt sich aus den Strukturdaten alleine nicht erklären. Eine Western-Blot-Analyse hat jedoch ergeben, dass TetRr2 K108A nicht als lösliches Protein in der Zelle vorliegt. So könnte Lys108 auch zur Faltung von TetRr2 beitragen. Ähnlich verhält es sich bei Asn11. TetRr2 N11A, ebenfalls nicht als lösliches Protein im WesternBlot nachweisbar, lässt sich weder durch Tc noch durch ATc koreprimieren. N11A könnte Einfluss - 81 DISKUSSION H64 A K108 H63 I59 ATc α4 H63 I10 V99 I59 N11 α6 L55 I22 I10 α1 L14 D95 G17 B K108 α4 ATc α8' N11 N47 K108 D53 R62 E58 R49 V9 N11 L34 A 90° V45 α1 D157‘ N47 H44 α3 Abb. 4.7: Position und Wechselwirkungen wichtiger Seitenketten für die Korepression von revTetR durch Tetrazyklin. Die Abbildungen links sind Ausschnitte aus den Signalkarten und zeigen die Position und Bedeutung der durch die Alanin-Austauschmutagenese untersuchten Aminosäuren. In den Detailansichten ist das Peptidrückgrat von [TetRr1•ATc] (PDB-Eintrag: 2VKV) in dunkelgrau dargestellt. Zum Vergleich ist das Peptidrückgrat von [TetR•Dox] (PDBEintrag: 2O7O) überlagert (hellgrau). ATc ist gelb dargestellt. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien gezeichnet. Alanin-Austausche der fett gedruckten Aminosäuren verhindern die Korepression durch Tc und ATc, kursiv gedruckte Aminosäuren wurden nicht untersucht. Die schwarzen Pfeile deuten eine die Verschiebung gegenüber der Dox-induzierten Struktur an. (A) Detailansicht der hydrophoben Zone zwischen den Helices α1, α4 und α6. Das Volumen, das die Leucin-Seitenkette an Position 17 in etwa einnehmen würde, ist schwarz umrandet. Wechselwirkungen von Leu17 sind angedeutet. (B) Seitenansicht der DNA-Bindedomäne mit den benachbarten Helices α4 und α8‘. Die Wechselwirkung zwischen Asn47 und dem Peptidrückgrat von Asp157‘ ist in der induzierten Struktur von TetR nicht vorhanden und vermutlich der Grund für eine andere Ausrichtung der DNAErkennungshelix α3. - 82 DISKUSSION auf die Faltung der DNA-Bindedomäne haben, was sich möglicherweise durch eine geänderte Löslichkeit äußert. Aufgrund dieser Sensitivität gegenüber den Alanin-Austauschen ist es schwierig, aus den Daten der Austauschmutagenese einen Signalweg für revTetR zu erstellen. Die Messungen haben ergeben, dass ein Großteil Alanin-Mutanten nicht durch Tc koreprimierbar ist. Dass ATc, das nach dem vorgeschlagenen Induktionsmodell durch seine Bindung eine stärkere Stabilisierung von TetR als Tc bewirkt, viele dieser Mutanten koreprimieren kann, spricht dafür, dass die Stabilisierung durch den Effektor auch bei der Korepression eine entscheidende Rolle spielt. 4.2.2 Der reverse TetR(B): Hypothesen zur Erklärung des reversen Regulationsmechanismus‘ Die Mutationen L15A L17G L25V, die den Regulationsmechanismus von TetR(BD) umkehren, zeigen nicht denselben Effekt, wenn sie in TetR(B) eingeführt werden. TetR(B) L15A L17G L25V (=TetR(B)r2) wird weder durch Tc noch durch ATc koreprimiert. Erst durch den zusätzlichen Austausch von drei (M59I S92R H93Y) bzw. vier (M59I D61A S92R H93Y) weiteren Aminosäuren in der Region zwischen DNA-Bindedomäne und Effektor-Bindetasche durch die jeweiligen Aminosäuren aus TetR(D) lässt sich das reverse Regulationsverhalten auf TetR(B)r2 übertragen1 (Abb. 4.8). Zur Erklärung dieses Verhaltens können zwei Hypothesen aufgestellt werden: Hypothese I: Es wird angenommen, dass für die Korepression, analog zur Induktion, ebenfalls ein Signal von der Effektorbindetasche zu der DNA-Bindedomäne übertragen werden muss (Reichheld & Davidson, 2006). Das Signal für die Korepression in TetR(B)r2 wird durch die TcBindung zwar erzeugt, aber kann im Gegensatz zu der BD-Variante nicht zu der Bindedomäne übertragen werden. Da beide Proteine, TetR(B) und TetR(BD), durch Tc induzierbar sind, aber nur TetR(BD)r2 durch Tc koreprimierbar ist, müssen die Mutationen den Signalweg von TetR ändern. Dieser geänderte Signalweg ist in TetR(B) durch die unterschiedliche Interaktionsfläche zwischen B-Bindedomäne und B-Proteinkörper unterbrochen (Abb. 4.9-A). Hypothese II: Die Rückfaltung der DNA-Bindedomäne und die Induktionsbewegung von TetR sind zwei unterschiedliche, voneinander unabhängige Vorgänge. In diesem Fall könnte die Bindung von Tc auch in TetR(B)r2 eine Rückfaltung der DNA-Bindedomäne bewirken. Unabhängig davon wird jedoch auch ein Signal für die Induktionsbewegung zu der DNA-Bindedomäne übertragen. Das führt dazu, dass die Bindedomäne in einer nicht DNA-bindenden Konformation stabilisiert wird und TetR(B)r2 nicht reprimieren kann. revTetR-Varianten dürften in diesem Fall keine „Induktionsbewegung“2 besitzen (Abb. 4.9-B). 1 2 Parallel zu dieser Arbeit hat auch eine andere Arbeitsgruppe einen reversen TetR(B) entwickelt, der dieselben Austausche besitzt (Klotzsche et al., 2009). Da revTetR eigentlich nicht „induziert“ werden kann, wird der eingeführte Begriff „Induktionsbewegung“ im Zusammenhang mit revTetR in Anführungszeichen gesetzt. - 83 DISKUSSION Diese beiden Hypothesen werden im Folgenden anhand der Strukturdaten und Erkenntnissen aus der Alanin-Austauschmutagenese einzeln diskutiert. 4.2.2.1 Hypothese I: Die Mutationen E15A L17G L25V ändern den Signalweg Nach dem Austausch von Met59, Ser92 und His93 durch die entsprechenden Aminosäuren von TetR(D) kann TetR(B)r2 in gleicher Effizienz wie TetR(BD)r2 durch Tc und ATc koreprimiert werden. Durch limitierte Proteolyse konnte gezeigt werden, dass der Doppelaustausch M59I H93Y keinen Effekt auf die Proteinaseanfälligkeit von TetR(B) hat, wie er zum Beispiel durch unterschiedliche Faltungsweisen oder Stabilität zustandekommen kann. Das legt die Vermutung nahe, dass diese Mutationen nur Einfluss auf die Signalübertragung haben, die für den Korepressionsvorgang von B A H64 I59 A61 R92 Y93 S92 H63 D61 R92 M59 H93 D95 R62 N11 TetR(BD) I59 A61 L14 Y93 TetR(B) Abb. 4.8: Aminosäuren an der Kontaktfläche von DNABindedomäne und Proteinkörper bei TetR(BD) und TetR(B). (A) Überlagerung der Kristallstrukturen von TetR(D) (linkes Monomer) und TetR(B) (rechtes Monomer). Die Aminosäuren Ala15, Gly17 und Val25, die zum reversen r2 Regulationsverhalten von TetR(BD) führen, sind in hellrot eingezeichnet. Die übrigen als Kalottenmodell dargestellten Aminosäuren wurden einzeln zwischen den Klassen TetR(D) und TetR(B) ausgetauscht (zur Wahrung der Übersicht wurde die Gesamtzahl der Aminosäuren nur in das linke Monomer eingezeichnet). Für die Übertragung des reversen r2 Regulationsverhaltens auf TetR(B) hat ein Austausch der Aminosäuren 59 und 93 (dunkelgrün/dunkelblau) den größten Effekt und ein Austausch von 61 und 92 (hellgrün/hellblau) einen unterstützenden Effekt. (B) Detailübersicht der Wechselwirkungen von Ile59, Ala61, Arg92 und Tyr93 in TetR(BD). (C) Detailübersicht der Wechselwirkungen von Met59, Asp61, Ser92 und His93 in TetR(B). Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien dargestellt. - 84 C H64 D61 H63 S92 M59 R62 H93 D95 L14 N11 DISKUSSION revTetR offenbar geändert ist und nur über die Kontaktfläche des D-Proteinkörpers zur B-Bindedomäne stattfinden kann. Tyr93 bildet in TetR(BD) nach der Bindung von ATc über die Hydroxy-Gruppe der Seitenkette eine Wasserstoffbrücke zu His63 aus, welche das Signal der Effektorbindung von His64 möglicherweise weiterleitet (Abb. 4.8-B). Desweiteren steht der aromatische Ring in hydrophobem Kontakt mit Ile591 und Leu14 und stellt somit sowohl Wechselwirkungen von Helix α6 zu α4 als auch von α6 zu α1 her. Die Seitenkette von His93 in TetR(B) kann keine dieser Interaktion ausbilden. Die beiden positiven Ladungen der Histidin-Seitenketten 93 und 63 könnten sogar zu einer abstoßenden Wechselwirkung zwischen den beiden Aminosäuren führen. Andere Interaktionen, wie zwischen Arg62 und Asn11 oder zwischen Asp95 und Ile22, sind davon nicht betroffen. Diese fehlende Wechselwirkung zwischen den Helices α4, α6 und α1 könnte aber zur Unterbrechung eines Korepressions-Signalweges in TetR(B) führen. Auf der anderen Seite konnte jedoch gezeigt werden, dass der Austausch Y93A, d.h. der Wegfall der Interaktion von Tyr93, in TetR(BD)r2 alleine keinen Effekt auf die Korepression hat. A Signalübertragung für Rückfaltung + Tc + + Signalübertragung unterbrochen Stabilisierung + + + Tc + + tetO tetO tetO + + TetR(B)r TetR(BD)r B „Induktionsbewegung“ Stabilisierung + Tc + + tetO + + + Tc + + + + tetO tetO TetR(BD)r Stabilisierung des „induzierten“ Zustands TetR(B)r Abb. 4.9: Schematische Gegenüberstellung der beiden Hypothesen für das unterschiedliche Regulationsverhalten von TetR(BD)r2 und TetR(B)r2. TetR ist in grau, [Tc•Mg]+ als gelbes Dreieck dargestellt. (A) In Hypothese I gibt es analog zu TetR eine Signalübertragung, die zu einer spezifischen Konformationsänderung der DNA-Bindedomäne führt (roter Pfeil), die sich aufgrund der r2-Mutationen nur anders auf die Bindedomäne auswirken. Das führt einmal zur Induktion (TetR) und einmal zur Repression (revTetR). Durch die unterschiedlichen Kontaktflächen von DNA-Bindedomäne und Proteinkörper in TetR(BD) und TetR(B) ist diese Signalübertragung bei TetR(B)r2 unterbrochen. (B) In Hypothese II ist die Signalübertragung, die zu einer spezifischen Konformationsänderung der DNA-Bindedomäne führt, unterbrochen. Die Rückfaltung der DNA-Bindedomäne basiert hier nur auf den ungerichteten, stabilisierenden Konformationsänderungen, die auch durch die Effektorbindung ausgelöst r2 werden. In TetR(B) funktioniert zusätzlich auch noch die Signalübertragung für die „Induktionsbewegung“, wodurch r2 TetR(B) direkt von einem nicht-DNA-bindenden in einen induzierten Zustand übergeht und dadurch keine Korepression feststellbar ist. 1 Aufgrund sterischer Behinderung von Met59 und Tyr93 müssen die beiden Austausche H93Y und M59I immer zusammen vorgenommen werden. - 85 DISKUSSION 4.2.2.2 Hypothese II: In revTetR-Varianten ist die Signalübertragung unterbrochen Diese Hypothese basiert darauf, dass die Signalübertragung für eine gerichtete Konformationsänderung der DNA-Bindedomäne („Induktionsbewegung“) unterbrochen sein muss und die Korepression überwiegend auf die ungerichteten, stabilisierenden Konformationsänderungen zurückzuführen ist. Zwar wurde angenommen, dass nicht-induzierbare TetRVarianten (ninTetRs) nicht durch die Effektorbindung stabilisiert werden (Reichheld et al., eingereicht), dies konnte jedoch sowohl durch die stabilisierende Wirkung von Tc auf den nichtinduzierbaren TetR R49A als auch durch die Stabilisierung von TetR und revTetR durch den AntiInduktor 4-ddma-ATc widerlegt werden. Darüber hinaus wurde ebenfalls eine korepressorische Wirkung von Tc bei der Induktorspezifitätsvariante TetRi2 (TetR H64K S135L S138I) festgestellt, die nicht mehr durch Tc induzierbar ist (Henssler et al., 2004; Klieber et al., 2009; Telorack, 2008). Auf dieses Phänomen wird in dem folgenden Kapitel noch genauer eingegangen. Für diese Hypothese spricht, dass durch die Alanin-Austauschmutagenese kein Signalweg von TetR(BD)r2 ermittelt werden konnte und dass Alanin-Substitutionen, die in TetR zum Verlust der Induzierbarkeit geführt haben (R49A, D95A, R158A), keinen Einfluss auf die Korepression von TetR(BD)r2 haben. In TetR(B)r2 bildet Ser92 zwei Wasserstoffbrücken: eine zum Peptidrückgrat von Ala89, die andere zum Imidazol-Ring von His93. Auf diese Weise wird die Schleife zwischen den Helices α5 und α6 stabilisiert und etwas an Helix α1 herangezogen. Diese Wechselwirkungen gehen verloren, wenn Ser92 durch Arginin ersetzt wird. Vermutlich stoßen sich in diesem Fall die positiv geladenen Reste von Arg92 und His63 sogar gegenseitig ab und drücken auf diese Weise die Helices α4 und α6 auseinander (Positionierungen einer Arg92-Seitenkette in der Kristallstruktur von TetR(B) reichen von direkten sterischen Hinderungen mit His63 bis hin zu einem Abstand von 3,5 Å). Der größere Abstand könnte zu einer Unterbrechung in der hydrophoben Zone führen, wodurch die Signalübertragung für eine „Induktionsbewegung“ verhindert wird. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass TetR(B)r2 weder die „Induktionsbewegung“ ausführen, noch eine Stabilisierung bewirken kann. TetR(D) (KA: 9,1 • 1011 M-1) besitzt für [ATc•Mg]+ eine höhere Bindekonstante als TetR(B) (KA: 2,3 • 1011 M-1). Durch die Austausche I57V M59I A61R wird die Bindekonstante auf 7,6 • 1011 M-1 erhöht (Schubert et al., 2004). Falls dieser Effekt auch in Kombination mit den r2-Mutationen auftritt, könnte erst die durch die zusätzlichen Aminosäureaustausche erreichte stärkere Bindung des Effektors die nötige Stabilisierung von TetR bewirken, die für die Korepression notwendig ist. Die Hypothese geht mit dem in Kapitel 4.1.1.2 aufgestellten Induktionsmodell einher. Bei revTetR ist Signalübertragung für die „Induktionsbewegung“ durch die eingebrachten Mutationen in der hydrophoben Zone beeinträchtigt. Die Stabilisierung, ausgelöst durch die Effektorbindung, funktioniert aber weiterhin. Dafür sprechen zahlreiche Stabilitätsanalysen, die mit verschiedenen revTetR-Varianten in Ab- und Anwesenheit eines Effektors durchgeführt wurden (Reichheld et al., - 86 DISKUSSION eingereicht; Resch et al., 2008). Desweiteren hat der stärkere Induktor ATc, für den eine stärkere Stabilisierung vermutet wird (Kapitel 4.1.1.2), eine höhere Korepressionswirkung als Tc, wie Messungen mit zahlreichen Alanin-Einzelmutanten gezeigt haben (Kapitel 3.2). Dass TetR(B)r2 zwar nicht durch Tc oder ATc, aber durch 4-ddma-ATc (einen Effektor, der TetR nicht induzieren kann) koreprimiert werden kann, spricht ebenfalls für die Vermutung, dass in TetR(B)r2 sowohl Stabilisierung als auch Konformationsänderung der DNA-Bindedomäne funktionieren und dass die „Induktionsbewegung“ der Bindedomäne durch die zusätzlichen Aminosäureaustausche verhindert wird. 4.2.3 Spezifische Effektoren für revTetR induzieren nicht Wie Messungen von revTetR mit 4-ddma-ATc sowie frühere Untersuchungen mit den Derivaten IU127 und IU129 gezeigt haben (Pfeifle, 2008), scheinen Effektoren, die spezifisch revTetR koreprimieren, die Induktionsbewegung in TetR nicht auslösen zu können (Abb. 4.10). CH 3 OH 4-ddma-ATc ( 1 | 1,5 | --- | --- ) O OH OH O OH O NH 2 CH 3 H N H2N O N N N H3C CH 3 OH N OH O IU127 ( 1,8 | 1,7 | 1,1BD 1,7B | 10BD 34B ) N H O OH O OH OH O NH 2 Abb. 4.10: 4-ddma-ATc und IU127 stellen zwei Effektoren dar, die spezifisch revTetR koreprimieren. Aufgrund der schlechten Aufnahmebedingungen der beiden Substanzen in gram-negative Zellen, ist der Effekt allerdings nur bei Messungen in der „Leaky“-Mutante E. coli NR698λtet50 ausgeprägt. Die Zahlen in Klammen geben die Regulationsfaktoren an: (TetR in E. coli WH207λtet50 | revTetR in E. coli WH207λtet50 | TetR in E. coli NR698λtet50 | revTetR in E. coli NR698λtet50). BD = TetR(BD)-Variante, B = TetR(B)-Variante. Aktivitätsmessungen in einem System mit niedriger TetR-Expression haben ergeben, dass TetRr2 bei verringerter Proteinmenge keine Korepression durch Tc zeigt (Pimenta, 2007) und TetR(BD) ab 4 µM 4-ddma-ATc eine schwache Induktion vermuten lässt1 (Wimmer, 2007). Daher müsste noch durch Bestimmung von Bindekonstanten geklärt werden, inwieweit bei diesen Effektoren die Affinität zu TetR eine Rolle spielt und ob jeder Effektor bei genügend hoher Konzentration als Induktor wirken kann. 1 Hier lässt sich allerdings nicht genau sagen, ob der Induktionseffekt durch eine synthesebedingte, geringfügige Verunreinigung durch ATc zurückzuführen ist. - 87 DISKUSSION Falls dies zutrifft, ließe sich daraus ableiten, dass die Stabilisierung beim Induktionsvorgang schon bei schwächerer Effektorbindung (bzw. niedrigerer Konzentration) auftritt als die Induktionsbewegung. Vielleicht trägt dieser Effekt auch dazu bei, dass revTetR bereits auf geringere Effektor-Konzentrationen mit Korepression anspricht als TetR mit Induktion1 (wobei sich bei TetR aufgrund der geringen Basalaktivität im DNA-gebundenen Zustand in vivo keine Stabilisierung erkennen lässt) (Henssler, 2005; Wimmer, 2007). Die Stabilisierung von TetR durch 4-ddma-ATc konnte zumindest in vitro durch Proteolyse-Experimente bestätigt werden. 4.3 4-ddma-Derivate: Vom Anti-Induktor zum Induktor 4.3.1 4-ddma-Derivate als Anti-Induktoren von TetR Obwohl durch die Bestimmung von Bindekonstanten gezeigt wurde, dass TetR(BD) im Vergleich zu Tc (KA: 530 • 107 M-1) eine 1000- bis 1750-fach geringere Affinität zu 4-ddma-ATc (KA: 0,3 • 107 M-1) und 4-ddma-San (KA: 0,5 • 107 M-1) besitzt (Henssler et al., 2004; Scholz et al., 2003), sind 4-ddma-ATc, 4-ddma-San und auch 4-ddma-Dox dennoch in der Lage, Tc aus der Effektorbindetasche zu verdrängen und eine durch Tc-Bindung ausgelöste Induktion abzuschalten. Auf diese Weise funktionieren diese Moleküle als Anti-Induktoren für TetR. Die Seitenketten von His64, Asn82 und Phe86 bilden Wasserstoffbrücken zum A-Ring von Tc. Asn82 kontaktiert zusätzlich die 4-Dimethylamino-Gruppe (Kisker et al., 1995; Orth et al., 2000). Diese Kontakte sind essentiell, um die Induktion von TetR durch Tc einzuleiten (Abb. 4.11-A). Die Eliminierung der 4-Dimethylaminogruppe vergrößert den Abstand von His64 und Asn82 und beeinflusst eventuell auch die Wechselwirkungen mit Phe86. Vermutlich aufgrund dieser geänderten Interaktionen können 4-ddma-Tetrazykline zwar an TetR binden, diesen aber nicht induzieren. Ein ähnlicher Effekt wurde auch für die tetrazyklinähnlichen Substanz GR30076X beschrieben (Abb. 4.11-B), deren Bindung an TetR(B) basierte Tet-Transaktivatoren (tTAs) die Repression des TetR-Anteils verstärkt (Chrast-Balz & Hooft van Huijsduijnen, 1996). Dies konnte auch einer weiteren Studie mit tTAs in Gewebekulturen der Tabakpflanze Nicotiana tabacum nachgewiesen werden (Love et al., 2002). Bei der Variante TetR V99G, die von Ralph Bertram und Eva-Maria Henßler untersucht und beschrieben wurde, verstärkt die Bindung von 4-ddma-ATc die Repression. Diese Wirkung als Korepressor konnte jedoch bei den Alanin-Mutanten, die stichpunktartig mit 4-ddma-ATc überprüft wurden, nicht beobachtet werden. Die Varianten V9A und L16A, die in der 4-ddma-ATcdurchlässigeren „Leaky“-Mutante E. coli NR698λtet50 auf ihre Induzierbarkeit mit 4-ddma-ATc überprüft wurden, sind durch dieses schwach induzierbar, was von den meisten TetR-Varianten 1 Dieses Phänomen lässt sich über das Massenwirkungsgesetz erklären: Die (Ko)Repression der ReportergenExpression zeigt schneller einen Effekt als die Induktion, da sich ein Großteil von TetR in der induzierten Form befinden muss, damit genügend Genprodukt für eine Quantifizierung vorhanden ist, bzw. da wenige DNA-bindende Repressoren bereits für eine effiziente Repression genügen (Bertrand et al., 1984). - 88 DISKUSSION vermutet wird. So bewirkt die Bindung von 4-ddma-ATc bei TetR L90A, -S135L oder -I134A auch keine verbesserte Repression, sondern eine Induktion. Auch bei dem zur Eliminierung der 4-Dimethylgruppe entgegengesetzten Fall, wenn die Seitenketten der „Ankerreste“ His64, Asn82 oder Phe86 durch eine Alanin-Substitution verkürzt sind, kann TetR nicht mehr durch Tc induziert werden. Obwohl ein stabilisierender Effekt nur vollwertigen Induktoren zugeschrieben wurde (Reichheld et al., eingereicht), konnten partielle Proteolyse-Experimente zeigen, dass TetR auch durch die Bindung von 4-ddma-ATc stabilisiert wird, wenn der Effekt auch geringer als bei den Induktoren Tc und ATc ist. Dies lässt sich auch in das vorgeschlagene Induktionsmodell eingliedern. Demnach führt die Bindung des Anti-Induktors zwar nicht zu der nötigen Induktionsbewegung der DNABindomäne, die durch ungerichtete Konformationsänderungen ausgelöste Stabilisierung von TetR findet aber dennoch statt. Der umgekehrte Fall, dass die Bindung von 4-ddma-ATc die Bindedomäne in eine nicht DNA-bindende Stellung verschiebt (Induktionsbewegung), diese Konformation aber nicht durch die stabilisierende Wirkung anderer Aminosäuren „fixiert“ werden kann, lässt sich durch Messungen mit revTetR-Varianten wiederlegen. Hier führt die Bindung von 4-ddma-ATc lediglich zu einer Korepression, was eine Induktionsbewegung ausschließt (Kapitel 4.2.2.2). A B Q116 H 3C H 3C OH 7 D 10 6 C 11 5 B 12 OH O OH N 4 A 1 OH O CH 3 OH O NH 2 Tetrazyklin N82 CH 3 H64 OH A B C D O OH OH O OH O NH 2 4-ddma-ATc F86 O OH H100 O OH O OH O GR33076X O CH3 Abb. 4.11: (A) Verankerung von Tetrazyklin in der Effektor-Bindetasche von TetR. Das Peptidrückgrat ist in grau angedeutet. Tetrazyklin ist gelb, hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, gestrichelte Linien gezeichnet. Asn82 (fett gedruckt) kontaktiert die 4-Dimethylamino-Gruppe von Tetrazyklin. (B) Vergleich der chemischen Strukturen von Tc, 4-ddma-ATc und GR33076X. Bei Tc sind einige Kohlenstoff-Atome, sowie die vier Ringe des Tetrazyklin-Grundgerüstes nach der IUPAC-Nomenklatur nummeriert. - 89 DISKUSSION 4.3.2 Einzelmutationen verwandeln 4-ddma-ATc in einen Induktor Obwohl die Reste der Aminosäuren 135 oder 90 nicht in direktem Kontakt mit dem Effektor stehen, können Modifikationen wie S135L oder L90A dazu führen, dass TetR durch 4-ddma-Derivate induziert werden kann (Scholz et al., 2003; Wimmer, 2007). Erklärt werden kann die relaxierte Induktorspezifität durch geänderte Wechselwirkungen der ausgetauschten Aminosäuren mit Effektor-kontaktierenden Aminosäuren. So wurde von Michael Klieber, der die Kristallstruktur von TetRi2 im Rahmen seiner Diplomarbeit aufklärte, eine mögliche Interaktion des hydrophoben Leu135 mit Met177‘ vermutet, das in Kontakt mit dem D-Ring von Tc steht (Klieber, 2003). Tatsächlich steht Met177‘ in der Kristallstruktur von TetRi2 (TetR H64K S135L S138I) in einer anderen Position als in der Struktur des Wildtyp-TetR (Klieber et al., 2009). Der Austausch von Ser135 durch das zu Leucin chemisch ähnliche Isoleucin wurde als globaler Suppressor für induktionsdefekte TetR(B)-Mutanten beschrieben und eine direkte Beeinflussung der Konformationsänderung bei der Induktion postuliert (Biburger et al., 1998). Ähnliches wird auch für S135L vermutet. Wie bei S135I führt der S135L-Austausch zu einer Erhöhung der Effektorbindeaffinität. Die Bindekonstante für [4-ddma-ATc•Mg]+ ist in TetR S135L im Vergleich zum Wildtyp um den Faktor 250 erhöht (Henssler, 2005). Somit ist denkbar, dass durch die Interaktionen zwischen Leu135 und Met177‘ die Form der Effektorbindetasche etwas geändert und dadurch die Bindung von 4-ddma-ATc (z.B. durch andere Interaktionen mit den übrigen Resten der Bindetasche) soweit verstärkt wird, dass das Molekül durch Bindung an TetR nicht nur die wichtigen Konformationsänderungen für die Stabilisierung, sondern auch jene für die Verschiebung der DNABindedomäne auslösen kann. Da bisher weder Strukturdaten von [TetR•4-ddma-ATc] noch von [TetR S135L•4-ddma-ATc] vorliegen, lässt sich diese Vermutung jedoch nicht bestätigen. Q116 N82 L135 H64 M177‘ F86 H100 L90 Abb. 4.12: Position und Wechselwirkungen von Aminosäuren, die 4-ddma-ATc in einen Induktor verwandeln. Sowohl S135L als auch L90A oder L90Q sind durch 4-ddma-ATc induzierbar. Dargestellt sind die möglichen Wechselwirkungen von Leu135 mit Met177‘ sowie von Leu90 und Phe86. Der Bereich der Seitenkette, der durch den L90A-Austausch wegfällt ist schwarz umrandet. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien gezeichnet. 4-ddma-ATc ist gelb dargestellt. Für die in der Alanin-Austauschmutagenese gefundene Variante TetR L90A liegen bisher nur in vivo-Daten vor. Leu90 könnte über Van-der-Waals-Wechselwirkungen in Kontakt mit Phe86 stehen - 90 DISKUSSION und bei dessen Feinausrichtung eine Rolle spielen. Der Austausch L90A erlaubt möglicherweise eine höhere Flexibiliät der Seitenkette von Phe86, was entweder für die Verankerung von 4-ddmaDerivaten wichtig sein könnte oder die Form der Bindetasche soweit ändert, dass 4-ddma-ATc mit den übrigen kontaktierenden Resten der Bindetasche „besser“ interagieren kann. Ganz verzichtet werden kann auf die Seitenkette jedenfalls nicht. Die Mutante TetR F86A ist weder durch Tc, ATc, noch durch 4-ddma-ATc induzierbar. Oliver Scholz fand bei einer ungerichteten Mutagenese bereits eine andere Substitution von Leu90, die eine relaxierte Induktorspezifität besitzt: die Variante TetR L90Q ist ebenfalls durch Tc und 4-ddma-San induzierbar (Scholz et al., 2003). Eine beinahe spezifische Induktion von TetR durch 4-ddma-Derivate kann durch Kombination von drei Aminosäureaustauschen H64K S135L S138I (=TetRi2) erreicht werden, welche die Bindetasche an das kleinere 4-ddma-ATc anpassen (Henssler et al., 2004; Klieber et al., 2009), und somit die Induktion von Tc und ATc weitestgehend verhindern. Die Tripelmutante und ihre Eigenschaften werden im Folgenden näher besprochen. 4.3.3 Die 4-ddma-spezifische Variante TetRi2 (TetR H64K S135L S138I) Dass die Induktorspezifität bakterieller Repressoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren erweitert werden werden kann, wurde schon Ende der 1970er Jahre für EbgR, den Repressor des EBG-Operons aus E. coli (engl. für: enhanced beta galactosidase), gezeigt. Es wurden neun Varianten von EbgR beschrieben, die durch Laktulose induzierbar sind, während der Wildtyp keine Sensitivität dafür aufweist (Hall, 1978). Durch in vitro Evolution wurde das Spektrum an möglichen Induktoren für EbgR bis heute erheblich erweitert (Hall, 2003). Bei TetR konnte die Induktorspezifität durch Einzelaustausche von Aminosäuren, die in direktem Kontakt oder zu Tckontaktierenden Aminosäuren stehen, nicht nur erweitert, sondern geändert werden. Durch Kombination des Aminosäureaustausches S135L, der die Induktion durch 4-ddma-Tetrazykline ermöglicht, mit H64K (=TetRi1) wurde eine Variante erhalten, die zwar durch 4-ddma-ATc und 4-ddma-San, aber nicht mehr durch den natürlichen Induktor Tc induzierbar ist (Scholz et al., 2003). Die von Eva-Maria Henßler weiterentwickelte Variante TetRi2 weist sogar eine stringente Spezifität gegenüber 4-ddma-ATc auf, da durch den zusätzlichen Austausch von Ser138 gegen Isoleucin zusätzlich auch noch die Induzierbarkeit durch starke Induktoren wie ATc und Dox weitestgehend unterbunden wurde (Henssler et al., 2004). In dem in dieser Arbeit verwendeten Messsystem ist TetRi2 allerdings noch zu etwa 20% durch ATc induzierbar. 4.3.3.1 TetRi2 ist destabilisiert Ein Großteil der Alanin-Substitutionen in TetRi2 hat einen negativen Einfluss auf die Repression, was für eine Destabilisierung des Proteins, ähnlich wie bei revTetR, spricht (Abb. 4.13). Worin genau diese Destabilisierung begründet ist, lässt sich auch durch Verwendung der Strukturdaten - 91 DISKUSSION nicht genau interpretieren. Die effektorfreie Struktur von TetRi2 (PDB-Eintrag: 3FK6) hat, bis auf eine andere Anordnung des Helix-turn-Helix-Motivs, mehr Ähnlichkeit mit dem induzierten TetR als mit dem freien TetR(BD) oder TetR(D) (PDB-Einträge: 1A6I, 1BJZ). Das wird zum Beispiel durch eine partielle Entwindung der Helix α6 und Anhebung der α6-α7-Schleife, sowie durch eine verstärkte Verschiebung des C-terminalen Endes von Helix α4 in Richtung α8-α9-Schleife deutlich, was bisher nur in den induzierten Strukturen vorkam. Desweiteren ist der C-Terminus von α7 entwunden, was bisher nur bei Liganden-gebundenen TetR-Strukturen nachgewiesen wurde (Abb. 4.3). Die effektorfreie Struktur von TetRi2 wurde zwar in Anwesenheit von Tc hergestellt, jedoch war keine Tc-Elektronendichte in der Effektorbindetasche vorzufinden (Klieber, 2003). Dies wurde dadurch erklärt, dass TetRi2 für [Tc•Mg]+ nur eine sehr geringe Affinität aufweist (Henssler, 2005). Da man davon ausging, dass Konformationsänderungen nur mit gebundenem Effektor ausgelöst werden, wurde diese Struktur als „uninduzierter“ TetRi2 behandelt. Mittlerweile weiß man, dass bei TetRi2 und einigen der TetRi2-Alanin-Mutanten die Bindung von Tc die DNA-bindende Konformation stabilisiert und Tc in diesem Fall als Korepressor fungiert (Kapitel 4.3.3.3). Ob diese strukturellen Eigenheiten nun durch eine mögliche Beeinflussung durch Tc zustandekamen oder ob TetRi2 in seiner freien Form wirklich mehrere Eigenschaften eines induzierten TetR aufweist, kann zum jetzigen Zeitpunkt nicht beantwortet werden. Eine Anlehnung an die induzierte Form könnte aber die schlechteren Repressionseigenschaften der TetRi2-Varianten erklären. Demnach müssten während der DNA-Bindung von TetRi2 weitaus größere Konformationsänderungen stattfinden als bei der Repression des Wildtyp-TetR. Abb. 4.13: Einfluss der AlaninSubstitutionen auf die Repression i2 von TetR und TetR . Die Basalaktivität der Alanin-Einzelmutanten wurde in eine Farbskala umgewandelt, bei der Blautöne für eine unveränderte und Rottöne für verschlechterte Repression stehen. In der Kristallstruktur von TetR wurden die ausgetauschten Aminosäuren nach der Basalaktivität der jeweiligen Alanin-Mutanten eingefärbt. TetR TetRi2 Repression der Alanin-Mutanten: 100% 0% 4.3.3.2 Die Austausche H64K-S135L-S138I ändern den Induktionsmechanismus Überlagert man die 4-ddma-ATc-induzierte Struktur von TetRi2 (PDB-Eintrag: 3FK7) mit anderen vorhandenen Strukturen von TetR, so zeigt diese besonders im Bereich der Bindedomäne eher Ähnlichkeit mit der des koreprimierten revTetR (PDB-Eintrag: 2VKV) als mit der eines induzierten TetR (PDB-Einträge: 2TRT, 2O7O). Dass TetRi2, im Gegensatz zu revTetR, in diesem Zustand nicht reprimieren kann, könnte mit einer eingeschränkten Flexibilität der DNA-Bindedomäne durch - 92 DISKUSSION A K64 4-ddma-ATc H100 α4 R92 L14 H63 Y93 V99 α6 R92 Y93 I59 N18 D95 L55 R94 α1 B L14 K64 E147‘ E150‘ R49 N18 L17 K64 R92 L60 H100 α8' 4-ddma-ATc α4 E150‘ N18 R49 L55 N47 A Y93 L55 L51 V45 90° L14 α1 α3 Abb. 4.14: Position und Wechselwirkungen wichtiger Seitenketten für die Induktion von TetRi2 durch 4-ddmaATc. Die Abbildungen links sind Ausschnitte aus den Signalkarten und zeigen die Position und Bedeutung der durch die i2 Alanin-Austauschmutagenese untersuchten Aminosäuren. Das Peptidrückgrat von [TetR •4-ddma-ATc] (PDB-Eintrag: 3FK7) ist in dunkelgrau dargestellt. Zum Vergleich ist das Peptidrückgrat von [TetR•Dox] (PDB-Eintrag: 2O7O) überlagert (hellgrau). 4-ddma-ATc ist gelb dargestellt. Hydrophile Wechselwirkungen sind als grüne, hydrophobe Wechselwirkungen als rote gestrichelte Linien dargestellt. Alanin-Austausche der fett gedruckten Aminosäuren führen zum Verlust der Induktion durch 4-ddma-ATc, Alaninaustasche der unterstrichenen Aminosäuren führen zu Korepression durch 4-ddma-ATc. Kursiv gedruckte Aminosäuren wurden nicht untersucht. Die Pfeile deuten die Unterschiede gegenüber der Dox-induzierten Struktur an. (A) Vorderansicht einer DNA-Bindedomäne mit den benachbarten Helices α4 und α6. Die andere Positionierung der Tyr93-Seitenkette führt zu anderen Wechselwirkungen innerhalb der hydrophoben Zone. (B) Seitenansicht der DNA-Bindedomäne mit den benachbarten Helices α4 und α8‘. Durch die andere Ausrichtung von Tyr93 werden Leu14, Leu55 und Leu51 verschoben, wodurch ein Kontakt zwischen Val45 und Leu51 möglich wird. - 93 DISKUSSION andere Wechselwirkungen zwischen dem Proteinkörper und der DNA-Bindedomäne erklärt werden, die nach Bindung von 4-ddma-ATc in einer nicht-DNA-bindenden Konformation fixiert wird (Strukturanalysen führen zu der Vermutung, dass im reversen TetR die Bindedomäne – ausgelöst durch Mutationen in der hydrophoben Zone – auch in der Effektor-gebundenen Form flexibel genug ist, dass revTetR an den Operator binden kann (Resch et al., 2008)). Bei TetRi2 sind einige Reste zwischen den Helices α4 und α5 anders angeordnet als bei TetR. Durch die Wechselwirkungen zwischen Asn82 und 4-ddma-ATc wird Helix α5 etwas in Richtung des N-Terminus geschoben. Die Seitenkette von Arg92 ist in Richtung Proteinkörper gerichtet und bildet eine Wasserstoffbrücke zur Peptidgruppe von His63, was bisher noch in keiner bekannten Struktur von TetR beobachtet wurde. Durch diese Wechselwirkung wird die α5-α6-Schleife stärker an Helix α4 gezogen. Die geänderte Position dieser Schleife zwingt die Seitenkette von Tyr93, nach unten in Richtung DNA-Bindedomäne auszuweichen (Abb. 4.14-A). Da Tyr93 vermutlich in hydrophobem Kontakt zu Leu14 steht, wird durch diese Bewegung die ganze Helix α1 etwas nach unten gedrückt (was in ähnlicher Weise auch bei revTetR passiert, allerdings wird es hier durch Aminosäureaustausche in der hydrophoben Zone verursacht). Diese Verschiebung beeinflusst auch Leu55, das nun über das hydrophobe Leu51 eine Zugbewegung auf Val45 ausübt. Dadurch wird Helix α3 in Richtung Proteinkörper gezogen und in dieser Position evtl. durch Interaktionen von Asn47 fixiert (Abb. 4.14-B). Alanin-Austausche von Leu55, Leu51 und Val45 verschlechtern nicht nur die Repression von TetRi2, die Einzelmutanten zeigen auch bei Bindung von 4-ddma-ATc keinerlei Änderung der Aktivität. Die andere Anordnung von der DNA-Erkennungshelix α3 könnte der Grund sein, warum TetRi2 im Gegensatz zu revTetR im Effektor-gebundenen Zustand nicht reprimieren kann. Wichtig für die Induktionsbewegung sind Arg94 und Asp95 die über ihre Seitenketten das Peptidrückgrat von Asn18 und Ile22 kontaktieren. Ein Alaninaustausch der beiden Aminosäuren führt zu einer verschlechterten Repression, was durch eine andere Faltung der Bindedomäne zustandekommen könnte. Da die Varianten TetRi2 R94A und -D95A durch Bindung von 4-ddmaATc nicht induziert sondern koreprimiert werden, deutet das auch auf eine Inhibierung der Konformationsänderung für die Induktion hin. Der Austausch von Leu14, Leu17 oder Ile59 gegen Alanin hat einen ähnlichen Effekt, was auch eine Beteiligung der hydrophoben Zone bei der Induktionsbewegung vermuten lässt. Die genaue Beteiligung von Arg49 und Asp53 bei der Stabilisierung des induzierten Zustands, wie es bei TetR durch Wechselwirkungen mit Asp157‘ oder Arg158‘ der Fall ist, kann durch die Strukturdaten nicht beantwortet werden, da diese Region in den beiden vorliegenden Strukturen von TetRi2 nicht aufgelöst ist. Eine herabgesetzte Induktion bei TetRi2 R49A, -D53A, -E150A und -D157A spricht aber dafür, dass es bei TetRi2 eine ähnliche Stabilisierung geben muss, wie bei TetR. - 94 DISKUSSION Als weiterer Unterschied zur Induktion von TetR spielen bei der 4-ddma-ATc-abhängigen Induktion von TetRi2 die Reste Leu170, Met177, Leu131, Ile134, die bei TetR hydrophobe Kontakte zu dem D-Ring bzw. der 6-Methylgruppe von Tc ausüben, keine Rolle. Der Induktionsmechanismus von TetRi2 läuft also scheinbar folgendermaßen ab: Das Signal der Effektorbindung löst eine Verschiebung von Helix α6 in N-terminale Richtung aus. Diese Bewegung wird anschließend sowohl über hydrophile Wechselwirkungen zwischen α6 und α1 wie Asp95••Ile22 oder Arg94••Asn18 als auch über die hydrophobe Zone zu der DNA-Bindedomäne übertragen. Die besondere Bindung von 4-ddma-ATc führt zu einigen veränderten Interaktionen zwischen α4 und α5, wodurch sich die Seitenketten von Tyr93, Leu14, Leu55 in Richtung α4 verschieben und so über eine Wechselwirkung mit Leu51 und Val45 die DNA-Erkennungshelix α3 anheben. Stabilisiert wird dieser „induzierte“ Zustand möglicherweise über Wechselwirkungen von Glu23, Asn47, Arg49, Asp53 mit Resten aus Helix α8‘ (wie Glu150‘) und der α8‘-α9‘-Schleife (wie Asp157‘). 4.3.3.3 Tetrazyklin als Korepressor: TetRi2 zeigt reverses Regulationsverhalten Bereits bei TetRi2 zeigt sich in Anwesenheit von Tc eine Verbesserung der DNA-Bindung (ohne Effektor 2,3% β-Gal-Aktivität, mit Tc: 1,9% β-Gal-Aktivität). Dieser Effekt wird deutlicher, wenn man die Repression durch Einfügen weiter Mutationen verringert. Die Mutanten TetRi2 E15A und -L60A besitzen eine Basalaktivität von 17% bzw. 18%. Die Zugabe von Tc führt zu einer Verringerung der Aktivität um etwa 60%, ausgehend von dem Wert ohne Effektor. Somit wirkt Tc als Korepressor für TetRi2, der zumindest wenn man von der Tc-abhängigen Regulation ausgeht, eine revTetRVariante darstellt. Da keine der Varianten TetR H64K S135L, -H64K S138I oder -S135L S138I durch Tc koreprimierbar ist, die Bindung von Tc sogar scheinbar zu einer schwachen Induktion führt (Henssler, 2005), muss die Umkehrung des Regulationsverhaltens durch Zusammenwirken der drei Aminosäureaustausche zustandekommen. Allerdings wird auch erst durch die Kombination der drei Austausche die Repression von TetR soweit verringert (von 1,1% auf 2,9% Basalaktivität) (Henssler, 2005), dass eine anti-induktorische Wirkung eines Effektors mit dem verwendeten Messsystem, dessen untere Messgrenze bei etwa 1% liegt, überhaupt sinnvoll detektierbar ist. Da es keine Strukturdaten eines Tc-gebundenen TetRi2 gibt, lässt sich nur vermuten, inwiefern die i2-Austausche Auswirkungen auf den Effekt von Tc haben. Tc wird durch den H64K-Austausch vermutlich etwas anders gebunden als im Wildtyp-TetR. Zumindest eine Überlagerung der Strukturen des Tc-induzierten TetR mit der des 4-ddma-ATc-induzierten TetRi2 zeigt eine Verringerung des Abstandes Lysin und Tc, woraus andere Wechselwirkungen resultieren können. Die Bindung von Tc könnte zu anderen Konfomationsänderungen in TetRi2 führen, sodass Tyr93 nicht die oben beschriebene Verschiebung der Erkennungshelix Konformationsänderungen, die zur Stabilisierung von TetR - 95 i2 α3 auslöst. Andere führen, verstärken die Operator- DISKUSSION Bindung, sodass Tc in diesem Fall als Korepressor fungiert. Das wäre ein weiteres Indiz dafür, dass reverse TetR-Varianten ihre Effektoren zwar binden können, dass die Korepression aber überwiegend auf ungerichteten, stabilisierenden Konformationsänderungen beruht. Dass Tc als Anti-Induktor für TetRi2 eingesetzt werden kann, ist eher unwahrscheinlich. Für [ATc•Mg]+ wurde eine beinahe 100-fach schwächere Bindung an TetRi2 ermittelt, als für [4-ddmaATc•Mg]+ (Henssler, 2005). Die Bindekonstante für [Tc•Mg]+ an TetRi2 wurde bisher nicht zwar bestimmt, wenn man der Berechnung aber, rein hypothetisch, einen ähnlichen Affinitätsunterschied wie bei TetR zu Grunde legen würde (Scholz et al., 2000), wäre diese vermutlich um den Faktor 5000 niedriger als für [4-ddma-ATc•Mg]+ – und damit wäre die Bindung für eine eventuelle Verwendung als Anti-Induktor zu schwach. Darüber hinaus konnte in gramnegativen Zellen, die das Konzentrationsverhältnis von 4-ddma-ATc und Tc zugunsten von Tc verschieben, auch nur eine sehr schwache Verdrängung von Tc durch 4-ddma-ATc festgestellt werden. Während Tc für TetRi2 und viele der Alanin-Mutanten als Korepressor fungiert, hat ATc, das sich von Tc nur durch das Fehlen der 6-Hydroxy-Gruppe unterscheidet, immer die gleiche Wirkung auf die TetRi2-Varianten wie 4-ddma-ATc, nur in abgeschwächter Form. Eine zu 4-ddma-ATc entgegengesetzte Wirkung von ATc konnte bei den getesteten Alanin-Mutanten nicht beobachtet werden. Dieser Effekt wurde bisher nur einmal für die Mutante TetRi2 V99T beschrieben, bei der 4-ddma-ATc als Induktor und ATc als Korepressor fungiert (Henssler et al., 2005). Demnach scheint die zu Tc abweichende Bindung von Anhydrotetrazyklinen (4-ddma-ATc, ATc) in der Effektorbindetasche (Kapitel 4.1.1.1) für die unterschiedliche Wirkung auf TetRi2 verantwortlich zu sein. 4.4 Fazit und Ausblick Seit der Veröffentlichung des Induktionsvorgangs von TetR im Jahr 2000 (Orth et al., 2000), der damals noch auf dem schlichten Vergleich von zwei Kristallstrukturen beruhte, wurde die Theorie stetig durch Resultate biochemischer Untersuchungen, neue Erkenntnisse aus der Moleküldynamik, sowie die Interpretation weiterer Strukturdaten ergänzt. Die in vivo Daten aus dieser Arbeit sind eine weitere Komponente, um den allosterischen Regulationsmechanismus eines sehr „wandlungsfähigen“ Repressors zu verstehen. TetR besitzt einen extrinsischen Induktionsmechanismus, d.h. eine relative Verschiebung der DNA-Bindedomänen zueinander bewirkt die Dissoziation von der DNA. Dies wird sowohl durch Computersimulationen als auch durch experimentelle Daten gestützt (Aleksandrov et al., 2008; Haberl et al., 2009; Seedorff et al., 2009). Die geänderten Signalwege bei der Tip-Induktion von TetR(B) oder der Induktion von TetRi2 durch 4-ddma-ATc haben gezeigt, dass das Signal auf verschiedene Weisen zu der DNA-Bindedomäne übertragen werden kann. Ähnliches könnte auch - 96 DISKUSSION für die Induktion von QacR durch verschiedene Effektoren zutreffen, die in verschiedenen Regionen der Effektor-Bindetasche binden (Schumacher & Brennan, 2003). Die Ergebnisse aus dieser Arbeit zeigen auch, dass die Tc-Bindung bei TetR nicht nur eine spezifische Konfomationsänderung, die Induktionsbewegung, einleitet, sondern auch weitere Konformationsänderungen, die zu einer Stabilisierung des Proteins führen und TetR damit in seiner induzierten Form „fixieren“. Stabilisierung durch Effektorbindung ist eine Eigenschaft, die für verschiedene Regulationssysteme beschrieben wird. So wird TrpR durch die Bindung von Tryptophan stabilisiert (Fernando & Royer, 1992) oder das Katabolit-Aktivator-Protein CAP durch Bindung des Koaktivators cAMP (Polit et al., 2003). Da beide Vorgänge scheinbar unabhängig voneinander ausgelöst werden, ist es möglich, dass „reverse“ TetR-Varianten überhaupt entstehen können oder der 4-ddma-ATc/San-spezifische TetRi2 durch Tc koreprimiert werden kann. Reverse Tet-Repressoren können durch eine Unterbrechung in der Signalübertragung keine Induktionsbewegung auslösen. Die Korepression dieser Varianten kommt wahrscheinlich überwiegend durch die ungerichteten, stabilisierenden Konformationsänderungen zustande. Nur da sich die beiden Vorgänge durch Mutationen entkoppeln lassen, war es möglich, dass das Tet-System um verschiedene Aktivitätsvarianten erweitert werden konnte. Bei der Variante TetRi2, die, wenn man von Tc ausgeht, ebenfalls „revers“ ist, wurde durch eine Modifikation im Signalweg erreicht, dass die Bindung von Anhydrotetrazyklinen eine Induktionsbewegung auslösen kann und auf diese Weise eine neue Induktorspezifität konstruiert (Henssler et al., 2004). Durch die Unterbrechung der Signalübertragung für die Induktionsbewegung in TetR(B) E15A L17G L25V durch drei zusätzliche Aminosäureaustausche (M59I S92R H93Y), konnte eine im Rahmen dieser Arbeit reverse TetR(B)-Variante hergestellt werden. Basierend auf diesen neuen Erkenntnissen des Induktionsmechanismus‘ werden sich in Zukunft bestimmt weitere Aktivitätsphänotypen erklären oder vielleicht sogar weitere TetR-Varianten mit neuen Eigenschaften konstruieren lassen. - 97 MATERIAL UND METHODEN 5 MATERIAL UND METHODEN 5.1 Materialien 5.1.1 Chemikalien Die wichtigsten verwendeten Chemikalien sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Alle übrigen Chemikalien wurden von Merck, Darmstadt, Roth, Karlsruhe oder Sigma, München in p.A.-Qualität bezogen. Chemikalie Bezugsquelle Aceton Roth, Karlsruhe (D) Acrylamid : Methylenbisacrylamid (19:1), 40% Roth, Karlsruhe (D) Adenosintriphosphat (ATP) Boehringer, Mannheim (D) Agar Oxoid, Heidelberg (D) Agarose PeqLab, Erlangen (D) Ammoniumperoxodisulfat (APS) Sigma, München (D) Ammoniumsulfat Merck, Darmstadt (D) Ampicillin (Ap) Sigma, München (D) Anhydrotetrazyklin-Hydrochlorid (ATc) Acros, Belgien (D) 4-de(dimethylamino)-Anhydrotetrazyklin (4-ddma-ATc) S. Lochner, Uni Erlangen (D) Borsäure Roth, Karlsruhe (D) Bromphenolblau Serva, Heidelberg (D) Calciumchlorid-Dihydrat Merck, Darmstadt (D) Chloramphenicol (Cm) Roth, Karlsruhe (D) Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) PeqLab, Erlangen, D Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe (D) N,N-Dimethylformamid (DMF) Sigma, München (D) Dithiothreitol (DTT) Roth, Karlsruhe (D) 4-de(dimethylamino)-Doxyzyklin (4-ddma-Dox) I. Usai, Uni Erlangen (D) Essigsäure Roth, Karlsruhe (D) Ethanol (EtOH) Roth, Karlsruhe (D) Ethidiumbromid (EtBr) Roth, Karlsruhe (D) Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Roth, Karlsruhe (D) Formamid, deionisiert Sigma, München (D) 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Galaktopyranosid (X-Gal) PeqLab, Erlangen (D) Glycerin Roth, Karlsruhe (D) L-Glycin Roth, Karlsruhe (D) Hefeextrakt Oxoid, Heidelberg (D) Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) Roth, Karlsruhe (D) Isopropanol (2-Propanol) Roth, Karlsruhe (D) Kaliumchlorid Merck, Darmstadt (D) - 98 MATERIAL UND METHODEN Kaliumhydroxid Merck, Darmstadt (D) Kanamycin (Km) Sigma, München (D) Laktose Roth, Karlsruhe (D) Magermilchpulver Roth, Karlsruhe (D) Magnesiumchlorid Roth, Karlsruhe (D) McCONKEY Bouillon Merck, Darmstadt (D) β-Mercaptoethanol Merck, Darmstadt (D) Methanol (MeOH) Roth, Karlsruhe (D) Natriumacetat Merck, Darmstadt (D) Natriumcarbonat Roth, Karlsruhe (D) Natriumchlorid Merck, Darmstadt (D) Natriumdihydrogenphosphat Roth, Karlsruhe (D) Natriumdodecylsulfat (SDS) Serva, Heidelberg (D) di-Natriumhydrogenphosphat Roth, Karlsruhe (D) Natriumhydroxid Roth, Karlsruhe (D) o-Nitrophenyl-β-D-galaktopyranosid (ONPG) Sigma, München (D) Salzsäure Roth, Karlsruhe (D) 4-de(dimethylamino)-Sanzyklin (4-ddma-San) CollaGenex, Ft. Worth (USA) Stickstoff, flüssig Linde, Höllriegelskreuth (D) N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Merck, Darmstadt (D) Tetrazyklin-Hydrochlorid Sigma, München (D) Trichlormethan (Chloroform) Roth, Karlsruhe (D) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris Base) Roth, Karlsruhe (D) Triton X-100 Serva, Heidelberg (D) Trypton Oxoid, Heidelberg (D) Tween 20 Roth, Karlsruhe (D) Xylencyanol Merck, Darmstadt (D) 5.1.2 Verbrauchsmittel Hilfsmittel und Verbrauchsgüter Bezugsquelle 8-Kanal-Pipette Research pro Eppendorf, Hamburg (D) 96-Napfplatten Greiner, Nürtingen (D) 96-Tiefnapfplatten (1,2 mL, 2,0 mL) PeqLab, Erlangen (D) Atmungsaktive Abdeckfolie („Breathseal“) für 96-Napfplatten Greiner, Nürtingen (D) Dispenser (mechanisch) LKB Instruments, Mt. Waverley (USA) ® Dispenser Multipette stream (elektronisch) Eppendorf, Hamburg (D) Einmalspritzen Becton Dickinson, Heidelberg (D) Elektroporationsküvetten PeqLab, Erlangen (D) Entwickler und Fixierer für Röntgenfilme Tetenal, Norderstedt (D) Eppendorf Reaktionsgefäße (1,5 mL, 2 mL) Eppendorf, Hamburg (D) Erlenmeyerkolben Schott Duran, Jena (D) Filterpapier GE Healthcare, München (D) Glaspipetten Brand, Wertheim (D) - 99 MATERIAL UND METHODEN Halbmikroküvetten, Kunststoff Greiner, Nürtingen (D) Makro-Pipettierhelfer Brand, Wertheim (D) MF-Millipore Membran Filter (0,025 µm) Millipore, Schwalbach (D) Mikroliterpipetten PIPETMAN (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) Gilson, Limburg-Offheim (D) PCR-Reaktionsgefäße Applied Biosystems, Weiterstadt (D) Petrischalen, Kunststoff (rund, eckig) Greiner, Nürtingen (D) Pipettenspitzen, Kunststoff Greiner, Nürtingen (D) Polypropylenröhrchen (15 mL, 50 mL) Greiner, Nürtingen (D) PVDF-Membran Pall, East Hills (USA) Reagenzgläser Schott Duran, Jena (D) Röntgenfilm X-AR-5 Eastman Kodak, Rochester (USA) Röntgenfilmkasetten Goos, Heidelberg (D) Schikanekolben Schott Duran, Jena (D) Sterilfilter Filtropur S 0,2 Sarstedt, Nümbrecht (D) Zentrifugenbecher (JA10, JA14) Nalgene, Rochester (USA) Beckman Coulter, Krefeld (D) 5.1.3 Geräte Gerät Bezugsquelle Äkta FPLC UPC-900 Amersham Bioscience (U.K.) Autoklav Systec 5075 EL Systec GmbH, Wettenberg (D) Biofuge (pico, pico17, fresco und primoR) Heraeus-Christ, Osterode (D) Bio-Print Video-Geldoku-System Mod. 215 PeqLab, Erlangen (D) Blotkammer EBX-700 C.B.S. Scientific, Del Mar (USA) Eismaschine Ziegra Kurt Hilbinger, Heßdorf (D) Elektrophoreseapparaturen, horizontal, für Agarose-Gele M. Müller, Uni Erlangen (D) Elektrophoreseapparatur Mini-PROTEAN® Tetra Cell BioRad, München (D) Feinwaage Sartorius Analytic Sartorius, Göttingen (D) Heizblock Dri Block DB3 Techne, Cambridge (U.K.) Horizontalschüttler Gio Gyrotory Shaker New Brunswick, Neu Isenburg (D) Konstanträume (4°C, 28°C, 37°C) Zimmermann, Nürnberg (D) Kühlschrank mit Gefrierfächern (+4°C/-20°C) Liebherr, Ochsenhausen (D) Kühlzentrifuge Avanti J-25 Beckman Coulter, Krefeld (D) Kulturschüttler Modell G25 New Brunswick, Neu Isenburg (D) Labofuge A Heraeus-Christ, Osterode (D) ® Magnetrührer IKAMAG REO Magnet-Heizrührer IKAMAG® RET IKA-Labortechnik, Staufen (D) Mikrotiterplattenschüttler Bühler TiMix 5 (beheizbar) Bühler, Tübungen (D) Mikrowellengerät Micromat AEG, Frankfurt/M. (D) © Milli-Q PF Plus Millipore, Eschborn (D) pH-Meter 766 Calimatic Knick, Berlin (D) Reaktionsgefäßeschüttler Sequenzierer ABI PRISM TM Eppendorf, Hamburg (D) 310 Genetic Analyzer - 100 Applied Biosystems, Weiterstadt (D) MATERIAL UND METHODEN Spannungsnetzgerät TN 300-120 Heinzinger, Rosenheim (D) SpeedVac Concentrator Bachofer, Reutlingen (D) Spektralphotometer Novaspec II, Ultrospec 4000 UV/VIS Pharmacia Biotech, Freiburg (D) SpectraFluor Plus Tecan, Crailsheim (D) Thermocycler Primus 96 advanced PeqLab, Erlangen (D) Tiefkühltruhe (-70°C) Heraeus-Christ, Osterode (D) Ultraschallgerät Sonoplus HD 2070 / HD 2200 Bandelin electronic, Berlin (D) Ultrazentrifuge L7-55 Beckman Coulter, Krefeld (D) UV-Schirm 366 nm Vetter, Wiesloch (D) TM Geldokumentationssystem ChemiDoc XRS BioRad, München (D) Vortexer VF2 IKA Labortechnik, Staufen (D) Wasserbad 5M Julabo, Seelbach (D) Wasserbad Eco Temp TW 12 Julabo, Seelbach (D) Wippe GFL (D) 5.1.4 Kommerziell erhältliche Reagenziensysteme („Kit“-Systeme) System Bezugsquelle Anwendung Big Dye Terminator Mix Perkin Elmer, Waltham (USA) DNA-Sequenzierung Bio-Rad Protein Assay BioRad, München (D) Bestimmung von Proteinkonzentrationen ECL+plus Kit GE Healthcare, München (D) Western Blot GFX™ PCR Kit GE Healthcare, München (D) DNA-Elution aus Agarose, Aufreinigung von PCRs Nucleobond® AX 20, 100 Macherey-Nagel, Düren (D) Plasmidpräperation ® NucleoSpin Extract II Macherey-Nagel, Düren (D) DNA-Elution aus Agarose, Aufreinigung von PCRs NucleoSpin® Plasmid Macherey-Nagel, Düren (D) Plasmidpräperation PhastGel Blue R Pharmacia, Freiburg (D) Färbung von Proteingelen puRE™Taq Ready-To-Go™ PCR Beads GE Healthcare, München (D) PolymerasekettenReaktion ® 5.1.5 Enzyme, Proteine und Antikörper Enzym Bezugsquelle anti-Kaninchen-IgG-AP-Konjugat GE Healthcare, München (D) anti-TetR-IgG, polyklonal, FBZ 3091 MoBiTec, Göttingen (D) Phusion DNA-Polymerase Finnzymes, Espoo (FIN) Restriktionsendonukleasen NEB, Frankfurt/M. (D) MBI Fermentas, St. Leon-Rot (D) Rinderserumalbumin (BSA) BioRad, München (D) Proteinase K Ribonuclease A Serva, Heidelberg (D) Shrimps Alkalische Phosphatase Roche, Mannheim (D) T4 DNA-Ligase, QuickLigase NEB, Frankfurt/M. (D) - 101 MATERIAL UND METHODEN 5.1.6 Größenmarker für DNA-Fragmente und Proteine Marker Bezugsquelle peqGOLD DNA Leiter-Mix PeqLab, Erlangen (D) (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 bp) peqGOLD Protein-Marker II PeqLab, Erlangen (D) (10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 85, 100, 120, 150, 200 kDa) Precision Plus Protein™ Dual Color Standards BioRad, München (D) (10, 15, 20, 25, 37, 50, 75, 100, 150, 250 kDa) 5.1.7 Oligonukleotide Die folgenden Oligonukleotide wurden von Eurofins MWG (Ebersberg, Deutschland) bezogen und in Wasser mit einer Konzentration von 100 pmol/µL gelöst: Name Sequenz (von 5’ nach 3’) Verwendung (D)N82A CA TTT CTG CGC AAT GCT GCA ATG AGT TTC PCR-Mutagenese (D)F86A C AAT AAT GCA ATG AGT GCT CGC CGC GCG C PCR-Mutagenese (D)R94A CTG CGT TAC GCT GAC GGG GCA AAA G PCR-Mutagenese (D)N95A CGT TAC CGT GCT GGG GCA AAA G PCR-Mutagenese (D)P105A G TTT TTC ATC AGC ACG CGT GCC PCR-Mutagenese (D)V113A G TAA CTG GGT TTC AGC CGT ATC ATA CTG PCR-Mutagenese (D)L117A CAT AAA GCG AGC CTG GGT TTC PCR-Mutagenese (D)E147A GT ATG CTC CTG CTG AGC CAG TAC GGC ACC PCR-Mutagenese 610gv GGA TAA CAA TTT CAC ACA G Sequenzierung 1925gv GGG CGA TCG GTG CGG GCC Sequenzierung, PCR-Mutagenese B_64K_bwd A GCT TTC CCC TTC TAA AGG GCA AAA GTG AGT TTT GTG CCT ATC PCR-Mutagenese B_135L-138I_bwd AC GCA ACC TAA GGT AAA ATG GAT CAC AGC TAA GAG TGC ATA TAA CG PCR-Mutagenese B>D_59 GCC ATT GAG ATC TTA GAT AGG C PCR-Mutagenese B>D_59-61 GCC ATT GAG ATC TTA GCG AGG CAC CAT AC PCR-Mutagenese B>D_92-93 GCT TTA CTA CGT TAC CGC GAT GGA GC PCR-Mutagenese BD_4A ATG ATG TCT AGA GCA GAT AAA AG PCR-Mutagenese BD_9A AAA AGT AAA GCG ATT AAC AGC PCR-Mutagenese BD_10A AGT AAA GTG GCC AAC AGC GC PCR-Mutagenese BD_11A AAA GTG ATT GCC AGC GCA TTA G PCR-Mutagenese BD_14A AAC AGC GCA GCA GAG CTG C PCR-Mutagenese BD_15A AGC GCA TTA GCG CTG CTT AAT GAG G PCR-Mutagenese BD_16A GCA TTA GAG GCG CTT AAT GAG PCR-Mutagenese BD_17A TTA GAG CTG GCA AAT GAG GTC PCR-Mutagenese BD_18A GAG CTG CTT GCT GAG GTC GG PCR-Mutagenese BD_22A GAG GTC GGA GCC GAA GGT TTA AC PCR-Mutagenese BD_23A GTC GGA ATC GCA GGT TTA AC PCR-Mutagenese BD_25A ATC GAA GGT GCA ACA ACC CG PCR-Mutagenese - 102 MATERIAL UND METHODEN BD_30A ACC CGT AAA GCC GCC CAG AAG C PCR-Mutagenese BD_34A GCC CAG AAG GCT GGT GTA GAG PCR-Mutagenese BD_41A CAG CCT ACA GCG TAT TGG CAT G PCR-Mutagenese BD_44A TTG TAT TGG GCT GTA AAA AAT AAG PCR-Mutagenese BD_45A TAT TGG CAT GCA AAA AAT AAG PCR-Mutagenese BD_47A CAT GTA AAA GCT AAG CGG GCC PCR-Mutagenese BD_48A GTA AAA AAT GCG CGG GCC PCR-Mutagenese BD_49A AAA AAT AAG GCG GCC CTA CTG PCR-Mutagenese BD_49X_bwd CAA GAT CTC CAC CGC CAG CGC ATC CAG TAG GGC NNN CTT ATT TTT TAC PCR-Mutagenese BD_51A AAG CGG GCC GCA CTG GAT GC PCR-Mutagenese BD_53A GCC CTA CTG GCT GCG CTG GCG PCR-Mutagenese BD_55A_bwd C CAA GAT CTC CAC CGC CGC CGC ATC CAG PCR-Mutagenese BD_58A CTG GCG GTG GCG ATC TTG GCG PCR-Mutagenese BD_59A GCG GTG GAG GCC TTG GCG CG PCR-Mutagenese BD_60A GTG GAG ATC GCG GCG CGT CAT C PCR-Mutagenese BD_62A GTG GAG ATC TTG GCG GCG CAT CAT G PCR-Mutagenese BD_63A GTG GAG ATC TTG GCG CGT GCG CAT GAT TAT TC PCR-Mutagenese BD_64A GTG GAG ATC TTG GCG CGT CAT GCG GAT TAT TC PCR-Mutagenese BD_66A CAT CAT GAT GCG TAT TCG CCT G PCR-Mutagenese BD_67A GAT TAT GCA CTG CCT GCG GCG PCR-Mutagenese BD_82A TTT CTG CGC AAT GCT GCA ATG AGT TTC CGC PCR-Mutagenese BD_85A_bwd TTT CTG CGC AAT AAT GCA ATG GCA TTC CGC PCR-Mutagenese BD_87A ATG AGT TTC GCC CGC GCG CTG PCR-Mutagenese BD_90A CGC CGC GCG GCG CTG CGT TAC PCR-Mutagenese BD_92A CGC CGC GCG CTG CTG GCA TAC CGT G PCR-Mutagenese BD_93A CGC CGC GCG CTG CTG CGT GCC CGT GAC PCR-Mutagenese BD_98A GAC GGG GCA GCA GTG CAC PCR-Mutagenese BD_100A GGG GCA AAA GTC GCT CTC GGC ACG CG PCR-Mutagenese BD_101A AAA GTG CAC GCT GGC ACG PCR-Mutagenese BD_103A C ATC AGG ACG AGC GCC GAG GTG PCR-Mutagenese BD_104A G TTT TTC ATC AGG AGC CGT GCC GAG PCR-Mutagenese BD_108A GGC ACG CGT CCT GAT GAA GCA CAG TAT G PCR-Mutagenese BD_109A GAT GAA AAA GCG TAT GAT AC PCR-Mutagenese BD_112A CAG TAT GAT GCG GTG GAA ACC PCR-Mutagenese BD_116A GTG GAA ACC GCG TTA CGC TTT ATG PCR-Mutagenese BD_131A CTG CGC GAC GGG GCA TAT GCG PCR-Mutagenese BD_134A TAT GCG GCT TCA GCG GTC AGT C PCR-Mutagenese BD_148A CC GTA CTG GAG GCG CAG GAG C PCR-Mutagenese BD_150A GAG GCG CAG GCG CAT ACT GCC PCR-Mutagenese BD_157A GCC CTG ACC GCC CGC CCT G PCR-Mutagenese BD_158A CTG ACC GAC GCG CCT GCA GCA CCG PCR-Mutagenese - 103 MATERIAL UND METHODEN BD_170A CCG CCG CTA GCT CGG GAA GCG PCR-Mutagenese BD_174A CGG GAA GCG GCG CAG ATT ATG PCR-Mutagenese BD_177A CTG CAG ATT GCG GAC ATG GAT G PCR-Mutagenese BD_181A GAC ATG GAT GCT GGT GAG CAG PCR-Mutagenese D>B_66 CAT CAT GAT GAT TCA CTG CCT G PCR-Mutagenese D>B_67 CAT GAT TAT TTT CTG CCT GCG PCR-Mutagenese D>B_68 GAT TAT TCA TGT CCT GCG GCG PCR-Mutagenese D>B_84 AAT AAT GCA AAA AGT TTC CGC PCR-Mutagenese D>B_88 AGT TTC CGC TGT GCG CTG CTG PCR-Mutagenese D>B_148 GTA CTG GAG GAC CAG GAG CAT AC PCR-Mutagenese D>B_157 GCC CTG ACC GAA CGC CCT GCA G PCR-Mutagenese DP4 CGG TCG GTC AGG GCG GC Sequenzierung DP6 CTC GAC ATC TTG GTT ACC Sequenzierung DP9 GTG AAA AGC CGT TTT CTG TC Sequenzierung r2_9A AAA AGT AAA GCG ATT AAC AGC PCR-Mutagenese r2_10A AGT AAA GTG GCC AAC AGC GC PCR-Mutagenese r2_11A AAA GTG ATT GCC AGC GCA TTA G PCR-Mutagenese r2_14A ATT AAC AGC GCA GCA GCG CTG GG PCR-Mutagenese r2_16A GCA TTA GCG GCG GGT AAT GAG G PCR-Mutagenese r2_17A TTA GCG CTG GCG AAT GAG GTC GG PCR-Mutagenese r2_18A GCG CTG GGT GCG GAG GTC GGA ATC G PCR-Mutagenese r2_22A GAG GTC GGA GCC GAA GGT GTA ACA ACC PCR-Mutagenese r2_23A GTC GGA ATC GCA GGT GTA ACA ACC C PCR-Mutagenese r2_51A AAG CGG GCC GCA CTG GAT GC PCR-Mutagenese tyr93his CGC CGC GCG CTG CTG CGT CAC CGT GAC GGG GCA AAA PCR-Mutagenese * Restriktionsschnittstellen sind unterstrichen, eingeführte Mutationen fett gedruckt. 5.1.8 Bakterienstämme Stamm relevante genetische Marker Referenz E. coli DH5α recA1, endA1, gyrA96, thi, relA1; hsdR17(rK-, mK+), supE44, Φ80dlacZ∆Μ15; ∆(lacZYA-argF)U169 (Hanahan, 1983) E. coli RB791 IN[rrnD-rrnE]l, lacIq, L8 (Brent & Ptashne, 1981) E. coli NR698λtet50 MC4110 imp4213; Tn10 tetA:lacZTranskriptionsfusion, bet+, gam+, clII+, cl+, lacZ+ (Wimmer, 2007) E. coli WH207λtet50 galK, rpsL, thi, ∆lacX74, recA13; Tn10 tetA:lacZ-Transkriptionsfusion, bet+, gam+, clII+, cl+, lacZ+ (Wissmann et al., 1991) - 104 MATERIAL UND METHODEN 5.1.9 Plasmide Verwendete Plasmide aus anderen Arbeiten: Plasmid relevante Sequenz(en) und Charakteristika R Referenz pWH610 Ap , ori pMB1; tetR unter transkriptioneller Kontrolle des tac-Promotors (Ettner et al., 1996) pWH1411 pACYC177-Derivat; CmR, ori p15A, tetR(B); TetR(B) wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Baumeister et al., 1992) pWH1925 pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD); TetR(BD) wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Scholz et al., 2004) pWH1925∆ pUC19 Derivat; ApR, ori pMB1 (Scholz et al., 2004) R pWH1925(B) pUC19-Derivat; Ap , ori pMB1, tetR(B); TetR(B) wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert pWH1925(i2) pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD)-H64K-S135LS138I; TetR(BD)-H64K-S135L-S138I wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Henssler et al., 2004) pWH1925(r2) pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD)-E15A-L17GL25V; TetR(BD)-E15A-L17G-L25V wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Scholz et al., 2004) pWH1925(r6) pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD)-E17S-E23K; TetR(BD)-E17S-E23K wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Scholz et al., 2004) pWH1925(r8) pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD)-E15V-L17AE19D; TetR(BD)-E15V-L17A-E19D wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Scholz et al., 2004) pWH1925(r9) pUC19-Derivat; ApR, ori pMB1, tetR(BD)-V20G-G21RI22N; TetR(BD)-V20G-G21R-I22N wird konstitutiv auf mittlerem Niveau exprimiert (Scholz et al., 2004) pWH2201 pWH610-Derivat; ApR, ori pMB1; trxA(N)-tip unter transkriptioneller Kontrolle des tac-Promotors (Klotzsche et al., 2005) Im Rahmen dieser Arbeit konstruierte Plasmide: Plasmid relevante Sequenz(en) und Charakteristika pWH610(BD)-X X = R49A; R49E; R49L; R49P; R49W pWH610(B)-X X = M59I-H93Y Kapitel 3.1.6 3.1.3.3 R pWH1300 pWH1411-Derivat; Cm , trxA-tip; TrxA-Tip unter transkriptioneller Kontrolle des tac-Promotors 3.1.4.2 pWH1925-X X = L4A; V9A; E15A; L16A; L25A; L30A; L34A; L41A; H44A; V45A; N47A; K48A 3.1.1.1 X = I10A; N11A; L14A; N18A; I22A; E23A; R49A; L51A; D53A; L55A; E58A; I59A; R62A; H63A; R92A; Y93A; R94A; D95A; K98A; V99A; K108A; E150A; D157A; R158A 3.1.1.2 X = L60A; Y66A; S85A; R87A; L90A; L101A; Q148A; D181A 3.1.1.3 X = H64A; S67A; N82A; F86A; H100A; T103A; R104A; P105A; Q109A; T112A; V113A; Q116A; L117A; L131A; I134A; S138A; E147A; L170A; L174A; M177A 3.1.1.4 X = V57I; I59M; A61D; Y66H; S67F; L68C; M84K; R88C; R92S; Y93H; D106T; Q148D; D157E; I59M-Y93H 3.1.3.2 X = L17A-V57I; L17A-I59M; L17A-A61D; L17A-Y66H; L17AS67F; L17A-L68C; L17A-M84K; L17A-R88C; L17A-R92S; L17A-Y93H; L17A-D106T; L17A-Q148D; L17A-D157E - 105 MATERIAL UND METHODEN X = R49L; R49I; R49P; R49W; R49N; R49Y; R49D; R49E; R49K pWH1925(B)-X 3.1.5 X = L4A; V9A; I10A; N11A; L14A; E15A; L16A; L17A; N18A; I22A; E23A; L25A; L30A; L34A; L41A; H44A; V45A; N47A; K48A; R49A 3.1.3.1 X = M59I; H93Y; M59I-H93Y 3.1.3.2 X = L17A-M59I; L17A-H93Y; L17A-M59I-H93Y X = E15A-L17G-L25V; E15A-L17G-L25V-M59I; E15A-L17GL25V-H93Y; E15A-L17G-L25V-M59I-H93Y; E15A-L17GL25V-M59I-S92R-H93Y; E15A-L17G-L25V-M59I-D61AS92R-H93Y 3.2.3 X = E17S-E23K; E17S-E23K-M59I; E17S-E23K-H93Y; E17SE23K-M59I-H93Y X = E15V-L17A-E19D; E15V-L17A-E19D-M59I; E15V-L17AE19D-H93Y; E15V-L17A-E19D-M59I-H93Y X = V20G-G21R-I22N; V20G-G21R-I22N-M59I; V20G-G21RI22N-H93Y; V20G-G21R-I22N-M59I-H93Y X = H64K-S135L-G138I; H64K-S135L-G138I-M59I-S92RH93Y; H64K-S135L-G138I-M59I-D61A-S92R-H93Y pWH1925(r2)-X 3.3.3 X = L4A; V9A; V25A; L30A; L34A; L41A; H44A; V45A; N47A; K48A 3.2.1.1 X = I10A; N11A; G17A; R49A; D53A; L55A; E58A; I59A; R62A; H63A; R92A; Y93A; R94A; D95A; K98A; V99A; K108A; E150A; D157A; R158A 3.2.1.2 X = L60A; Y66A; S85A; R87A; L90A; L101A; Q148A; D181A 3.2.1.3 X = H64A; S67A; N82A; F86A; H100A; T103A; R104A; P105A; Q109A; T112A; V113A; Q116A; L117A; L131A; I134A; S138A; E147A; L170A; L174A; M177A 3.2.1.4 X = Y93H; I59M-Y93H 3.2.3 pWH1925(r6)-X X = Y93H; I59M-Y93H 3.2.3 pWH1925(r8)-X X = Y93H; I59M-Y93H 3.2.3 pWH1925(r9)-X X = Y93H; I59M-Y93H 3.2.3 pWH1925(i2)-X X = L4A; V9A; E15A; L16A; L25A; L30A; L34A; L41A; H44A; V45A; N47A; K48A 3.3.1.1 X = I10A; N11A; L14A; N18A; I22A; E23A; R49A; L51A; D53A; L55A; E58A; I59A; R92A; Y93A; R94A; D95A; K98A; K108A; E150A; D157A 3.3.1.2 X = L60A; S85A; R87A; L90A; L101A; Q148A; D181A 3.3.1.3 X = K64A; S67A; N82A; F86A; H100A; T103A; R104A; P105A; Q109A; T112A; Q116A; L131A; I134A; E147A; L170A; M177A 3.3.1.4 - 106 MATERIAL UND METHODEN 5.2 Medien, Lösungen und Puffer Medien und Puffer wurden mit Millipore- oder deionisiertem Wasser angesetzt und bei Bedarf für 25 min bei 121°C und 2 bar autoklaviert. Lösungen mit hitzelabilen Stoffen wurden durch Filter mit einer Porengröße von 0,2 µm sterilisiert. Puffer für säulenchromatographische Experimente wurden sterilfiltriert und im Ultraschallwasserbad 15 min entgast. Puffer für Gelelektrophoresen und Western-Blots wurden nicht sterilisiert. 5.2.1 Allgemeine Puffer 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 1 mM EDTA TE-Puffer TENS-Puffer 10 mM 1 mM 0,1 M 0,5% (w/v) Tris-HCl, pH 8,0 EDTA NaOH SDS 5.2.2 Bakteriennährmedien für Platten: 5 g/L 10 g/L 10 g/L 15 g/L für Platten: 60 g/L McConkey-Bouillon 7 g/L Laktose 15 g/L Agar LB-Medium (Luria Bertani-Medium) McConkey-Medium Hefeextrakt Trypton Natriumchlorid Agar Fakultative Zusätze Fakultative Zusätze wurden bei Plattenmedien nach dem Abkühlen auf etwa 50°C zugegeben, bei Flüssigmedien nach Erkalten. Antibiotika wurden in 1000-fach konzentrierter Lösung angesetzt und bei -20°C gelagert (Sambrook & Russel, 2001). Antibiotika Stammlösungen Ampicillin 100 mg/mL in H2O Kanamycin 60 mg/mL in H2O 30 mg/L oder 60 mg/L Chloramphenicol 25 mg/mL in 70% (v/v) EtOH 25 mg/L Effektoren für TetR Stammlösungen Endkonzentration (für E. coli) 4-ddma-ATc 8 mM in DMSO 0,4 µM (bei Titration: 0,2-0,6 µM) 4-ddma-Dox 4 mM in DMSO 0,4 µM (bei Titration: 0,2-0,6 µM) 4-ddma-San 4 mM in DMSO 0,4 µM (bei Titration: 0,2-0,6 µM) Anhydrotetrazyklin 20 mM in 70% (v/v) EtOH 0,4 µM 20 mM in 70% (v/v) EtOH 0,4 µM (bei Titration: 0,2-0,6 µM) 1 Tetrazyklin Endkonzentration (für E. coli) 100 mg/L Platten für E. coli NR698tet50: 10 mg/L 1 Tetrazyklin-Lösungen wurden immer frisch hergestellt. - 107 MATERIAL UND METHODEN sonstige Zusätze Stammlösungen Endkonzentration IPTG 500 mM in H2O 0,5 mM X-Gal 20 mg/mL in Dimethyl-Formamid 40 µg/mL IPTG diente zur Induktion der Expression von Genen unter Kontrolle des tac-Promotors, X-Gal für Farbplattentests. 5.2.3 Puffer und Lösungen für DNA-Versuche Puffer für die DNA-Gelelektrophorese: 2 M Tris Base 1 M Natriumacetat 62,5 mM EDTA 50x TAE–Puffer 0,89 M Tris Base 0,89 M Borsäure 20 mM EDTA 10x TBE-Puffer 5x DNAAuftragepuffer 0,05% (w/v) 0,05% (w/v) 0,2% (w/v) 0,1 mM 50% (v/v) 2% (v/v) Bromphenolblau Xylencyanol SDS EDTA Glycerin 50x TAE 0,5 mg/L Ethidiumbromid Färbelösung für DNA-Gele 5.2.4 Puffer und Lösungen für Protein-Versuche Puffer für die Protein-Gelelektrophorese: 6,9 mL 3,5 mL 1,3 mL 1,5 mL 800 µL 400 µL 5 µL Trenngel (10%|15%) (denaturierend) H2O 40% Acrylamid-Lsg. 1M Tris-HCl, pH 8,8 1M Tris-Borat, pH 8,8 2% SDS 10% APS TEMED H2O 40% Acrylamid-Lsg. Tris-HCl, pH 6,8 2% SDS 10% APS TEMED Sammelgel (4%) (denaturierend) 10,7 mL 1,5 mL 1,3 mL 750 µL 750 µL 7 µL 10x ProteinLaufpuffer 1,92 M Glycin 0,5 M Tris-HCl, pH 8,8 1% (w/v) SDS - 108 5,1 mL 5,3 mL 1,3 mL 1,5 mL 800 µL 400 µL 5 µL H2O 40% Acrylamid-Lsg. 1M Tris-HCl, pH 8,8 1M Tris-Borat, pH 8,8 2% SDS 10% APS TEMED MATERIAL UND METHODEN 5x ProteinAuftragepuffer 250 mM 250 mM 10% (w/v) 5% (w/v) 50% (v/v) Waschlösung 10% (v/v) Essigsäure 45% (v/v) Methanol für Proteingele Färbelösung für Proteingele Entfärbelösung Tris-HCl, pH 6,8 β-Mercaptoethanol SDS Bromphenolblau Glycerin 0,2% (w/v) PhastGel® Blue R 60% (v/v) Methanol 10% (v/v) Essigsäure für Proteingele Puffer für die Proteinaufreinigung und -lagerung: 250 mM Na2HPO4 250 mM NaH2PO4 pH 6,8 mit NaOH einstellen 0,5 M Phosphat-Puffer Puffer A (Niedrigsalzpuffer) Puffer B (Hochsalzpuffer) Zellaufschluss-Puffer (ZAP) 50 mM NaCl 20 mM Phosphat-Puffer für TetR(B): + 2 mM Dithiothreitol (DTT) 1 M NaCl 20 mM Phosphat-Puffer für TetR(B): + 2 mM Dithiothreitol (DTT) 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 200 mM NaCl für TetR(B): + 2 mM Dithiothreitol (DTT) 1x ZAP 50% (v/v) Glycerin 2 mM Dithiothreitol (DTT) Proteinlagerpuffer Puffer für immunologische Experimente: Transferpuffer für Western-Blots (WB) 10x PBS-Puffer Waschpuffer (PBS-T) für WB-Membranen Blockierlösung für WB-Membranen Waschlösung für WB-Membranen 10 mM NaHCO3 3 mM Na2CO3 20% (v/v) Methanol 580 mM Na2HPO4 170 mM NaH2PO4 680 mM NaCl 1x PBS 0,1% (v/v) Tween 20 1x PBS 0,1% (v/v) Tween 20 5% (w/v) Magermilchpulver 50% (v/v) Blockierlösung 50% (v/v) Waschpuffer Puffer für die β-Galaktosidase-Aktivitätsmessung: 5x Z-Puffer 300 mM 200 mM 50 mM 5 mM 250 mM pH 7,0 Na2HPO4 NaH2PO4 KCl MgCl2 β-Mercaptoethanol mit NaOH einstellen - 109 MATERIAL UND METHODEN Lyse-Lösung 1x Z-Puffer Start-Lösung 1x Z-Puffer 4 mg/mL ONPG Stopp-Lösung 1 M Na2CO3 5.3 Methoden Die in dieser Arbeit verwendeten allgemeinen und gängigen Methoden sind in der folgenden Tabelle aufgelistet. Sofern Abweichungen von diesen Protokollen vorgenommen wurden, wird dies im entsprechenden Kapitel angegeben. Proteine DNA Methode Referenz Präparation von Plasmid-DNA mittels „Kit“-Systemen Protokoll des Herstellers Photometrische Mengenbestimmung von DNA (Sambrook & Russel, 2001) Präzipitation von DNA - mittels Ethanol - mittels PEG (Ausubel et al., 1995) (Ausubel et al., 1995) Ethidiumbromid-Färbung von DNA (Sambrook & Russel, 2001) Gelelektrophorese von DNA (Sambrook & Russel, 2001) Elution von DNA - aus Agarosegelen - aus nativen PAA-Gelen (Sambrook & Russel, 2001) (Sambrook & Russel, 2001) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Mullis & Faloona, 1987) Sequenzierung von DNA nach der Kettenabbruch-Methode (Sanger et al., 1977) Denaturierende Gelelektrophorese von Proteinen (Laemmli, 1970) ® PhastGel Blue R Färbung von Proteinen in PAA-Gelen Protokoll des Herstellers Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford Protokoll des Herstellers Bestimmung von β-Galaktosidase-Aktivitäten - in 96-Napfplatten (Miller, 1972) (Griffith & Wolf, 2002) Autoklavieren Die zu autoklavierenden Substanzen wurden in geeigneten Gefäßen im entsprechenden Autoklaviergerät (Systec, Sitram) mindestens 20 min unter Druck feuchter Hitze von 121°C ausgesetzt. Dadurch war die notwendige Keimfreiheit für die meisten molekularbiologischen Arbeiten gewährleistet. Sterilfiltration Lösungen mit hitzeinstabilen Komponenten, wie z.B. Antibiotika-Lösungen, wurden durch Sterilfiltration keimfrei gemacht. Anschließend konnten sie als sterile Komponenten den schon autoklavierten und heruntergekühlten Medien zugesetzt werden. - 110 MATERIAL UND METHODEN 5.3.1 Arbeiten mit Mikroorganismen 5.3.1.1 Anzucht, Handhabung und Lagerung von E. coli-Kulturen Anzucht, Inkubation und Lagerung von Flüssigkulturen Sofern nicht anders vermerkt, wurde das benötigte Volumen an Flüssigmedium in Reagenzgläsern oder Schikanekolben mit einer einzelnen Kolonie von einer Agarplatte angeimpft und bei der gewünschten Temperatur auf einem Rundschüttler inkubiert. Über-Nacht-Kulturen (ÜNK) wurden 10 bis 16 h bei 37°C oder 20 bis 24 h bei 28°C inkubiert. Über-Tag-Kulturen (ÜTK) wurde maximal 1:100 mit einer ÜNK angeimpft und bis zu einer oD600 von 0,4-0,6 inkubiert. Flüssigkulturen wurden nicht gelagert. Falls nötig wurden die Zellen abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellpellet bei -20°C gelagert. Anzucht, Inkubation und Lagerung von Kulturen auf Festmedium Vereinzelungen von Bakterienkolonien wurden mit einer sterilen Impföse auf Agar-haltigem Medium (ggf. versetzt mit Induktoren und/oder SelektionsAntibiotika) ausgestrichen (Abb. 5.1). Aliquots von Flüssigkulturen oder Transformationsansätzen wurden auf dem angegebenen Medium ausplattiert. Kulturen auf Festmedium wurden entweder 10 bis 16 h bei 37°C oder bis zu 48 h bei 28°C inkubiert. Abb. 5.1: Skizze der verwendeten Vereinzelungsmethode. Die Abbildung wurde nach (Madigan et al., 2008) modifiziert und erweitert. Sofern das Medium lichtempfindliche Induktoren (wie Tetrazykline) oder X-Gal enthielt, wurden die Platten in einem lichtundurchlässigen Karton oder im Brutschrank bebrütet. Die Lagerung erfolgte im Kühlschrank bei 4°C. Kulturen auf Festmedium, die für Messungen bestimmt waren, wurden maximal eine Woche aufgehoben. 5.3.1.2 Herstellung Calciumchlorid-kompetenter E. coli-Zellen modifiziert nach (Hanahan, 1983) LB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli Über-Nacht-Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer Zelldichte von oD600 ≈ 0,5 geschüttelt. Das Wachstum der Zellen wurde durch 30-minütiges Abkühlen auf Eis gestoppt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (15 min, 5000 Upm, 4°C) geerntet und in einem halben Volumen der ursprünglichen Kultur kalter 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und 1 h auf Eis gestellt. Anschließend wurden die Zellen erneut abzentrifugiert, in einem Zehntel Volumen kalter 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und zur Aufbewahrung mit sterilem Glycerin (Endkonzentration 15%) versetzt. Die Zellsuspension wurde in 1,5 mLReaktionsgefäße aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C bis -80°C aufbewahrt. - 111 MATERIAL UND METHODEN 5.3.1.3 Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen modifiziert nach (Sambrook & Russel, 2001) LB-Medium wurde 1:100 mit einer E. coli Über-Nacht-Kultur angeimpft und bei 37°C bis zu einer Zelldichte oD600 ≈ 0,4 geschüttelt. Wachstum der Zellen wurde durch 30-minütiges Abkühlen auf Eis gestoppt, die Zellen durch Zentrifugation (10 min, 5000 Upm, 4°C) geerntet und in einem halben Volumen1 kaltem Millipore resuspendiert. Nach erneutem Abzentrifugieren wurden die Zellen in einem Viertel Volumen kalter 10% Glycerin-Lösung gewaschen. Die gelösten Zellen wurden nochmals abzentrifugiert und anschließend in einem Tausendstel Volumen kaltem 10%igem Glycerin gelöst. Die Zellsuspension wurde in 1,5 mL-Reaktionsgefäße aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -70°C bis -80°C aufbewahrt. 5.3.1.4 Transformation von E. coli modifiziert nach (Sambrook & Russel, 2001) CaCl2-kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut. 100 μL Zellen wurden mit 50-100 ng DNA oder einem Ligationsansatz versetzt und 60 min auf Eis inkubiert. Nach einer Hitzeschock-Behandlung von 30 s bei 42°C wurde 1 mL auf 37°C vorgewärmtes LB-Flüssigmedium zugegeben und die Zellen für 30 min bei 37°C auf einem Eppendorf-Schüttler inkubiert. Auf entsprechende Selektionsplatten wurden anschließend Aliquots von 100 μL und der abzentrifugierte, im Rücklauf resuspendierte Rest ausplattiert. 5.3.1.5 Elektroporation von E. coli modifiziert nach (Sambrook & Russel, 2001) Jeweils 40 μL elektrokompetente Zellen wurden mit etwa 50 ng Plasmid-DNA oder einem halben Ligationsansatz vermischt und in eine gekühlte Elektroporationsküvette zwischen die Kondensatorplatten (Abstand 2 mm) unter Vermeidung von Luftblasen gefüllt. Das Spannungsfeld (Einstellungen am Bio-Rad Gene Pulser®: U = 2,5 kV / R = 200 / C = 25 μF) wurde 3,5 bis 4,5 s aufrechterhalten. Anschließend wurden die Zellen sofort mit 2 mL vorgewärmtem LB-Medium versetzt und 30 min bei 37°C auf einem Eppendorf-Schüttler inkubiert. Von einer 1:100Verdünnung der Ansätze wurden jeweils 100 µL auf die entsprechenden Selektionsmedien ausplattiert. 5.3.1.6 Präparation von Plasmid-DNA mittels TENS-Lyse Bei dieser alkalischen Lyse wurden die Zellen von jeweils 4 mL Flüssigkultur durch Zentrifugation (3 min, 13000 Upm) geerntet und das Pellet im Rückfluss des Überstandes durch Vortexen resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit 300 µL TENS-Puffer versetzt und mehrmals invertiert. Anschließend wurden 150 µl 3 M Natriumacetat zugegeben und vorsichtig invertiert. Nach mind. 30-minütiger Zentrifugation (13000 Upm, 4°C) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und die Plasmid-DNA durch die Zugabe von 900 µL 96% Ethanol (EtOH) und Zentrifugation (15 min, 13000 Upm) gefällt. Die ausgefällte DNA wurde mit 500 µL 70% EtOH gewaschen und erneut abzentrifugiert (13000 Upm, 5 min). Das Pellet wurde in der Vakuumzentrifuge etwa 15 min getrocknet und anschließend in 50 µl TE mit RNase (10 µg/mL) aufgenommen. 1 Bezogen auf die ursprüngliche Kultur. - 112 MATERIAL UND METHODEN 5.3.2 Arbeiten mit Nukleinsäuren 5.3.2.1 Restriktionsspaltung von DNA Die Restriktion von DNA mit Endonukleasen wurde in dem jeweiligen vom Hersteller empfohlenen Puffersystem durchgeführt. Die Menge an Enzym und die Inkubationsdauer richteten sich dabei nach der eingesetzten DNA-Menge und der Anzahl an Schnittstellen im Plasmid. Zur Vermeidung von Star-Aktivität bei zu hoher Glycerin-Konzentration betrug das Gesamtvolumen eines Restriktionsansatzes mindestens dem Zehnfachen des Enzymvolumens. Vektor-DNA wurde meist 60 min verdaut, lineare und kleinere Fragmente 90 min. Die Inaktivierung der Enzyme wurde, falls möglich, nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. 5.3.2.2 Dephosphorylierung von 5’-DNA-Enden Zur Vermeidung der Religation kompatibler Enden von linearisierten Vektoren wurden, falls notwendig, die 5’-Phosphat-Gruppen mittels Shrimps Alkalischer Phosphatase (Gibco BRL, Life Technologies) entfernt. Dazu wurde die DNA-Lösung nach Angaben des Herstellers auf 1x SAPPuffer eingestellt und mit der empfohlenen Menge an Enzym versetzt. Nach 10-minütigem Inkubation bei 37°C wurde das Enzym 15 min bei 65°C inaktiviert. 5.3.2.3 Ligation von DNA-Fragmenten modifiziert nach (Sambrook & Russel, 2001) Durch Ligasen können DNA-Fragmente kovalent verknüpfen, sofern die Enden kompatibel sind. In dieser Arbeit wurde entweder die T4-DNA-Ligase (NEB) oder die QuickLigase (NEB) in dem vom Hersteller gelieferten Puffer verwendet. Zusätzlich wurden 10 µM ATP zu den Ligationsansätzen gegeben. In die Ligation wurden jeweils 50-200 ng Vektor mit Insert in den molaren Verhältnissen 1:2, 1:3 oder 1:5 eingesetzt. Die Ligation erfolgte im Dunkeln. Bei überhängenden Enden wurde 30 min bei Raumtemperatur oder 2 bis 3 h bei 15°C ligiert, bei glatten Enden über Nacht bei 4°C. 5.3.2.4 Gelelektrophorese von DNA modifiziert nach (Sambrook & Russel, 2001) Um die Größe von DNA-Fragmenten zu bestimmen und zur präparativen Auftrennung derselben wurden Gelelektrophoresen durchgeführt, wobei je nach Fragmentgröße 1, 2 oder 3%ige (w/v) Agarosegele bzw. 8%ige native PAA-Gele verwendet wurden. Die Agarose wurde auf rechteckige Kunststoffplatten bis zu einer Schichtdicke von 2-3 mm gegossen; vor ihrem Erstarren wurden mit einem Kunststoffkamm Taschen ausgespart, in welche dann die mit DNA-Auftragepuffer (DAP) versetzten DNA-Lösungen pipettiert wurden. Die Auftrennung erfolgte meist 1 h bei 100 V horizontal in einer mit TAE-Puffer gefüllten Kammer. Die Acrylamid-Lösung ließ man senkrecht zwischen zwei Glasplatten, die unten mit einem Agarosestopfen abgedichtet waren, polymerisieren; die Auftrennung der mit DAP versetzten DNA erfolgte wiederum meist 1 h bei 100 V senkrecht in einer Elektrophoreseapparatur mit oberem und unterem Reservoir für den TBE-Puffer. Zur Sichtbarmachung der DNA wurden die Gele 10 min in einem Ethidiumbromidbad (ca. 5 µg/mL) gefärbt und unter UV-Licht (254 nm) fotografiert. - 113 MATERIAL UND METHODEN 5.3.2.5 Elution von DNA aus Agarose-Gelen Zur Elution bestimmte DNA-Fragmente wurden elektrophoretisch aufgetrennt, mit Ethidiumbromid gefärbt und mit langwelligem UV-Licht (366 nm) sichtbar gemacht. Die Bande der entsprechenden Größe wurde mit einem Skalpell ausgeschnitten. Die Elution aus Agarosegelen erfolgte mit dem GFX™ PCR-Kit (GE Healthcare) oder dem NucleoSpin® Extract II (Macherey-Nagel) gemäß den Angaben des Herstellers. Eluiert wurde die DNA mit 25-30 µL auf etwa 50°C vorgewärmten TEPuffer. 5.3.2.6 Ethanol-Fällung von DNA modifiziert nach (Ausubel, et al, 1995) Die DNA-Lösung wurde mit einem Zehntel des Volumens 3 M Natriumacetat (pH 5,2) versetzt. Anschließend wurden drei Volumina 96%iger Ethanol zugegeben. Nach Zentrifugation (30 min, 13000 Upm) wurde der Überstand abgenommen, 1 mL 70% Ethanol zum Rückstand gegeben und erneut für 10 min zentrifugiert. Nach Abziehen des Überstandes wurde der Niederschlag in der Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in TE-Puffer aufgenommen. 5.3.2.7 Mutagenese mittels zweistufiger Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Einführung der Mutation erfolgt im ersten PCR-Schritt, wobei das jeweilige Ausgangsplasmid als Matrize diente. Als hitzestabile DNA-Polymerase wurde die mit Fehlerkorrektur ausgestattete Phusion-Polymerase (Finnzymes) in dem vom Hersteller gelieferten Puffersystem verwendet. Für die zweite Stufe der PCR-Mutagenese wurde das mittels Gelelektrophorese gereinigte und durch das NucleoSpin® Extract II-Kit (Macherey-Nagel) bzw. GFX™ PCR Kit (GE Healthcare) isolierte Produkt der ersten PCR als Primer eingesetzt. Um die optimale Annealing-Temperatur zu bestimmen, wurde ein Temperaturgradienten-PCR-Gerät verwendet. Reaktionsansatz PCR-Stufe I PCR-Stufe II Matrizen-DNA 300 ng 300 ng Oligonukleotid I 10 pmol 10 µL PCR-Produkt Stufe I Oligonukleotid II 10 pmol 10 pmol 10 mM dNTP-Stammlösung 1 µL 1 µL 5x Polymerase-Puffer 5 µL 5 µL Polymerase 1 µL 1 µL ad 25 µL ad 25 µL Millipore-Wasser Für die PCR-Mutagenese wurde folgendes Programm verwendet: Denaturierung Hybridisierung Elongation 94°C 52-60°C 72°C 30 s 30 s 20 s 25-30 Zyklen Nach Abschluss des Programms wurde auf 4°C abgekühlt. - 114 MATERIAL UND METHODEN 5.3.2.8 Sequenzierung von Plasmid-DNA modifiziert nach (Sanger et al., 1977) Das verwendete Verfahren zur Sequenzierung von DNA beruht auf der Kettenabbruch-Methode nach Sanger. Als Terminatoren der Sequenzierreaktion dienten unterschiedlich fluoreszenzmarkierte di-Desoxynukleotide, die als vorgefertigtes Reagenz bezogen wurden (Big Dye Terminator Mix, Perkin Elmer). Die Durchführung der Sequenzierreaktion erfolgte nach den Empfehlungen des Herstellers. Ein Ansatz von 10 μL enthielt dabei 400-500 ng Matrizen-DNA, 10 pmol eines Oligonukleotides sowie 3 μL des Terminator-Mixes. Die Sequenzierreaktion erfolgte im Thermocycler bei folgendem Programm: Denaturierung Hybridisierung Elongation 96°C 55°C 60°C 10 s 5s 4 min 25 Zyklen Nach Abschluss des Programms wurde der Reaktionsansatz auf 4°C abgekühlt. Anschließend wurde eine Ethanolfällung durchgeführt und der Niederschlag in 10 μL Formamid aufgenommen. Analysiert wurden die Produkte der Sequenzierreaktion mit dem ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer, die Auswertung erfolgte am Computer mithilfe des Programms SeqMan II von DNASTAR. 5.3.3 Arbeiten mit Proteinen 5.3.3.1 Überexpression und chromatographische Reinigung von TetR Anzucht und Überexpression Zur Überexpression von Proteinen wurde E. coli RB791, transformiert mit pWH610 Derivaten, bei 20°C oder 28°C angezogen und bei einer Optischen Dichte oD600 zwischen 0,4 und 0,6 mit einer Endkonzentration von 0,5 mM IPTG induziert und für mindestens 3 Stunden weiter inkubiert. Für Überexpressionstests wurden 20 mL LB-Medium 1:100 mit einer Übernachtkultur angeimpft. Es wurden 10 mL vor der Induktion und 10 mL der Kultur nach der Induktion durch Zentrifugation geerntet und in Puffer A resuspendiert. Für die Aufreinigung von Protein wurden mindestens 3 L LB-Medium verwendet. Die Kulturen wurden in JA10 Zentrifugenbecher überführt und in einer Beckmann Zentrifuge 10 min bei 4°C mit 5000 Upm sedimentiert. Aufschluss der Zellen Die sedimentierten Zellen wurden in einem Hundertstel des Ausgangsvolumens Puffer A resuspendiert und unter Verwendung der Ultraschallsonde Sonoplus HD 2200 aufgeschlossen (30% Leistung, Intervall 0.9 s, 5 x 30 s). Durch Kühlung mit Eiswasser wurde verhindert, dass die Temperatur der Zellsuspension während der Beschallung 10°C überstieg. Nach dem Zellaufschluss wurden die löslichen Bestandteile von den unlöslichen durch Ultrazentrifugation abgetrennt. Säulenchromatographische Reinigung Die säulenchromatographische Reinigung erfolgte über eine Kationenaustauschersäule (Poros HS/M 20 mL Volumen - Applied Biosystems) und eine Gelfiltrationssäule (Superdex G75, 1,6 x 60 cm) an einer Äkta FPLC Anlage. Die Proteine, die sich nach Zellaufschluss und Zentrifugation im Überstand befanden, wurden auf den Kationentauscher aufgetragen und durch einen linearen NaCl-Gradienten eluiert. Die Flussgeschwindigkeit betrug zwischen 4 und 20 mL/min. Protein - 115 MATERIAL UND METHODEN enthaltende Fraktionen wurden auf einem 10%-SDS-PAA-Gel analysiert und die Fraktionen mit den geringsten Verunreinigungen vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden mit einer Endkonzentration von 60% Ammoniumsulfat gefällt und das Pellet nach der Zentrifugation in 2 bis 5 mL ZAP-Puffer resuspendiert. Die Gelfiltration wurde mit einer Flussgeschwindigkeit zwischen 0,5 und 1 mL/min durchgeführt. Die Fraktionen mit dem meisten Protein wurden vereinigt und in einem Mikrokonzentrator (Filtron centrifugal concentrator, 30 kDa) auf Volumina zwischen 300 μL und 1 mL eingeengt. Das so erhaltene Protein wurde zu einem Endgehalt von 50% Glycerin und 1x ZAP verdünnt und bei -20°C gelagert. 5.3.3.2 Bestimmung von Proteinkonzentrationen Bestimmung der Gesamtproteinkonzentration Die Bestimmung der Proteinkonzentration für Überexpressionstests oder Western Blots wurde nach der Methode von Bradford (Bradford, 1976) mit einem vorgefertigten Reagenz (Bio-Rad, München) durchgeführt. Die Messungen wurden in 96-Napfplatten im TECAN Plattenleser vorgenommen. Als Referenz diente eine BSA-Lösung, deren Konzentration spektralphotometrisch bestimmt wurde und die zur Erstellung einer Kalibriergeraden verwendet wurde. Anhand dieser wurden die Proteinkonzentrationen der Proben ermittelt. Bestimmung der Konzentration an aufgereinigtem TetR Die Konzentration an aufgereigigtem TetR wurde durch Messung der Absorption bei 280 nm bestimmt. Nach Lambert-Beer lässt sich aus der Absorption die Konzentration c einer Proteinlösung bestimmen, wenn der Extinktionskoeffizient ε bekannt ist: c= A ε·d A ist dabei Absorption bei 280 nm und d die Schichtdicke, die bei Küvetten normalwerweise 1 cm beträgt. Der Extinktionskoeffizient ε lässt sich durch folgende Gleichung theoretisch bestimmen: ε = x · εTrp + y · εTyr Dabei entspricht εTrp = 5700 M-1 und εTyr = 1300 M-1. x steht für die Anzahl der Tryptophane (Trp) und y für die Anzahl der Tyrosine (Tyr) in einem TetR-Monomer. 5.3.3.3 Western-Blot Analyse E. coli WH207λtet50 Zellen wurden in einem Volumen von 100 mL bis zu einer Zelldichte von oD600 ≈ 0,5 angezogen: Die Zellen wurden bei 4°C mit 8500 Upm 10 min pelletiert. Die Pellets wurden in 300 μL 1x ZAP aufgenommen und 1 x 30 s bei 40% mit der kleinen Ultraschallsonde aufgeschlossen. Die Gesamt-proteinkonzentration wurde mittels Bradford bestimmt und dann je 30 bis 50 μg Proteinrohextrakt auf das Gel aufgetragen. Als Kontrolle wurden jeweils 30 ng bereits aufgereinigter Tet-Repressor verwendet. Der Proteintransfer wurde nach der Methode von Towbin (Towbin et al., 1979) mit folgenden Modifikationen durchgeführt: Nach der Elektrophorese wurde das Gel 30 min in Transferpuffer geschwenkt, während die PVDF-Transfermembran für 10 min in Methanol eingelegt und anschließend in Transferpuffer gewaschen wurde. Die Übertragung der Proteine aus dem PAA-Gel auf die PVDF-Membran erfolgte über Nacht in Transferpuffer in einer EBX-700 Blotkammer (C.B.S. Scientific) bei 4°C und 120 mA. - 116 MATERIAL UND METHODEN Nach dem Blot-Vorgang wurden die Membranen bei RT auf einem Schwenkbad in Kunststoffpetrischalen mit folgenden Lösungen behandelt: 2 x 10 min 1-2 h 20 min 2 x 10 min 30 min 3 x 10 min 5 min Waschpuffer Blockierlösung 1 : 20.000-Verdünnung eines Gemisches polyklonaler TetRAntikörper in Waschlösung Waschlösung 1 : 5000-Verdünnung eines anti-Kaninchen-IgG-AP-Konjugats in Waschlösung Waschlösung ECL+plus-Kit-Lösung Nach der Inkubation der PVDF-Membran mit der ECL+plus-Kit-Lösung wurde auf die Membranen ein Röntgenfilm aufgelegt und dieser nach unterschiedlicher Belichtungszeit entwickelt. 5.3.3.4 Quantifizierung der β-Galaktosidase-Aktivität im 96-Napfplatten-Format modifiziert nach (Griffith & Wolf, 2002; Miller, 1972) Für die Messungen wurde der Stamm E. coli WH207λtet50, der ein chromosomales lacZ unter TetKontrolle besitzt, mit dem TetR-Expressionsvektor pWH1925 transformiert. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte durch die Reaktionseigenschaft der β-Galaktosidase, das farblose Substrat ONPG in Galaktose und gelbes o-Nitrophenol zu spalten. o-Nitrophenol kann bei 420 nm photometrisch bestimmt werden. Anzucht der Zellen Die Vertiefungen einer sterilen 96-Tiefnapfplatte (Napfvolumen 2,2 mL) wurden mit jeweils 1 mL LB-Medium befüllt, das bereits das Selektionsantibiotikum und ggf. einen Effektor enthielt. Jeder Napf wurde mit einer einzelnen Kolonie angeimpft. Anschließend wurde die Napfplatte mit einer atmungsaktiven Klebefolie („Breathseal“, Greiner, Nürtlingen) verschlossen und für 12-16 Stunden auf einem temperierten, abgedunkelten1 Mikrotiterplatten-Schüttler (Bühler TiMix 5) bei 37°C und 1000 Upm inkubiert. Diese Kulturen, die sich nach der Inkubationszeit alle in der stationären Phase des Wachstums befinden sollten, dienten dem Animpfen der Kulturen für die Messung. Von einer zweiten, analog befüllten 96-Tiefnapfplatte, wurde jeder Napf mit 20 µL der Flüssigkultur angeimpft und bei denselben Bedingungen in dem Mikrotiterplattenschüttler inkubiert. Beim Erreichen einer oD600 von 0,4-0,5 wurde das Wachstum durch eine einstündige Inkubation im Kühlschrank gestoppt. Von jeder Kultur wurden 200 µL in einer 96-Napf-Flachbodenplatte überführt und die Absorption bei 595 nm im TECAN Plattenleser bestimmt. Lyse der Zellen Parallel dazu wurden von jeder Kultur 60 µL eine 1,2 mL-96-Tiefnachpflatte transferiert, in der bereits 340 µL Lyse-Lösung und 35 µL Chloroform vorgelegt waren. Durch zweiminütiges Vortexen auf einem für 96-Napfplatten modifizierten Heidolph-Schüttler wurden die Zellen lysiert. Nach der Lyse wurden die Zellen für 30 min bei 28°C inkubiert, damit sich zum einen Zelltrümmer absetzen können und zum anderen die Temperatur des Zelllysats auf die für die Messung benötigten 28°C äquilibriert. 1 Die Abdunklung ist wichtig, um die lichtempfindlichen Effektoren zu schützen. - 117 MATERIAL UND METHODEN Start und Stopp der β-Galaktosidase-Reaktion, Bestimmung der Aktivität Die Messung erfolgte in einem 28°C-Konstantraum. Eine 96-Napf-Flachbodenplatte wurde mit 270 µL Start-Lösung befüllt. Der Start der Reaktion erfolgte durch Hinzufügen von 50 µL des Zellysats, das durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit der Startlösung vermischt wurde. Mithilfe einer 8-Kanal-Pipette konnten immer 8 Reaktionen auf einmal gestartet werden. Die Hälfte jedes Reaktionsansatzes (160 µL) wurde in eine zweite 96-Napf-Flachbodenplatte umgefüllt. Um eine Diffusion des gelben o-Nitrophenols zu verhindern, wurde jede Achterreihe der 96-Napfplatte sofort nach dem Umfüllen mit einer zurechtgeschnittenen Noppenfolie abgedeckt. Die Reaktionen der ersten Napfplatte wurden nach 10 Minuten, die der zweiten nach 2-3 Stunden durch Zugabe von 75 µL Na2CO3-Lösung gestoppt. Von beiden Platten wurde im TECAN Plattenleser die Absorption bei 420 nm und 550 nm bestimmt. Zusammen mit der bereits bestimmten Zelldichte (oD595), der Reaktionszeit ∆t und dem Reaktionsvolumen V lässt sich die Aktivität der β-Galaktosidase nach Methode von Miller (Miller, 1972) berechnen: U = oD oD420 oD550 oD595 1,754 - 1,754 · oD oD · V · ∆t V ∆t Absorption von o-Nitrophenol Absorption der Zelltrümmer Zelldichte der Kultur Korrekturfaktor für die Lichtstreuung durch Zelltrümmer Probenvolumen in mL Reaktionszeit in min (Zeitdifferenz zwischen Reaktionsstart und -stopp) Für jede Mutante wurden zweimal 3 unabhängige Messungen durchgeführt. Die Aktivitäten aus den drei Messungen wurden jeweils gemittelt. 5.3.3.5 Limitierte Proteolyse 0,1 mM aufgereinigter TetR wurden mit 0,25 µg/µL der unspezifischen, Subtilisin-ähnlichen SerinProtease Proteinase K (Merck, Darmstadt) in Puffer A versetzt. Zusätzlich wurden 1 mM MgCl2 und bei Bedarf 1 mM eines Effektors (Tc, ATc, 4-ddma-ATc) zu dem Reaktionsansatz (Gesamtvolumen 200 µL) gegeben. Die Inkubation erfolgte im Wasserbad bei 37°C. Nach unterschiedlichen Inkubationszeiten wurden jeweils 10 µL des Ansatzes entnommen, mit 5 µL SDS-Protein-Auftragepuffer versetzt und zur Inaktivierung der Proteinase K sofort für 20 Minuten in ein 95°C heißes Wasserbad gestellt. Anschließend wurden die Reaktionsansätze auf einem 15%igen SDS-Gel aufgetrennt, die Proteine mit Coomassie angefärbt und analysiert. Die relative Quantifizierung der Proteinbanden auf den Gelen erfolgte mithilfe einer Bio-Rad ChemiDoc™ XRS Videodokumentationsanlage und der Software QuantityOne. - 118 MATERIAL UND METHODEN 5.4 Computerprogramme und Internetdienste Die für diese Arbeit genutzten Computerprogramme, Datenbanken und Internetdienste sind in den folgenden zwei Abschnitten tabellarisch aufgeführt. Programm Anwendung DNASTAR SeqManTM II 4.00 Analyse von Elektropherogrammen SciEd CloneManager 5.1 Erstellung von Plasmidkarten SciEd Enhance 3.1 Aufbereitung von Plasmidkarten BioRad QuantityOne Quantifizierung von Proteinbanden Corel PaintShopPro Photo 12.5 Bildbearbeitung PovRay 3.61c Erstellung von Struktur-Abbildungen SWISS PDB-Viewer 4.01 Betrachtungsprogramm und Editor für Kristallstrukturen Systat SigmaPlot Erstellung von Diagrammen Microsoft® Office Professional 2007 Erstellung von Dokumenten und Abbildungen, sowie Durchführung von Tabellenkalkulationen EndNote Verwaltung des Literaturverzeichnis‘ URL Anbieter Anwendung http://www.ncbi.nlm.nih.gov (http://www.pubmed.com) National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Literaturrecherche, Datenbank http://www.rcsb.org Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, USA Suche von Kristallstrukturen - 119 LITERATURVERZEICHNIS 6 LITERATURVERZEICHNIS Agersø Y., Guardabassi L. 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Kursiv gedruckte Messwerte lagen bereits vor. 8.1.1 TetR(BD)-Varianten β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR(BD)… Repression + Tc + ATc Wldtyp 1.0 ± 0.0 59 ± 2 93 ± 3 L4A 1.0 ± 0.1 71 ± 7 93 ± 6 V9A 1.2 ± 0.2 85 ± 3 98 ± 5 I10A 1.3 ± 0.3 84 ± 3 101 ± 2 N11A 1.1 ± 0.0 52 ± 4 89 ± 4 L14A 1.2 ± 0.2 21 ± 1 93 ± 4 E15A 1.0 ± 0.1 57 ± 4 89 ± 8 L16A 1.0 ± 0.1 83 ± 3 100 ± 4 L17A 3.5 ± 0.3 1.2 ± 0.1 L17A V57I 16 ± 0 1.4 ± 0.0 L17A I59M 52 ± 2 90 ± 2 L17A I59M Y93H 98 ± 1 52 ± 3 L17A A61D 3.7 ± 0.3 9.4 ± 0.4 L17A Y66H 1.4 ± 0.1 1.4 ± 0.0 L17A S67F 6.6 ± 0.1 3.2 ± 0.0 L17A L68C 19 ± 2.4 ± 0.1 L17A M84K 5.1 ± 0.3 2.2 ± 0.1 L17A R88C 12 ± 5.4 ± 0.5 L17A R92S 6.4 ± 0.3 10 ± 0 L17A Y93H 53 ± 64 ± 3 L17A D106T 2.2 ± 0.1 1.1 ± 0.4 L17A Q148D 30 ± 1.8 ± 0.0 1 1 1 2 1.8 ± 0.4 L17A D157E 5.1 ± 0.2 N18A 0.9 ± 0.1 29 ± 2 81 ± 2 I22A 1.1 ± 0.1 67 ± 5 96 ± 3 E23A 1.1 ± 0.0 11 ± 0 78 ± 2 L25A 1.3 ± 0.1 86 ± 4 100 ± 3 L30A 6.6 ± 0.3 88 ± 2 104 ± 3 L34A 0.8 ± 0.0 55 ± 1 98 ± 4 L41A 95 ± 112 ± 2 107 ± 4 1 3.2 ± 0.1 - 131 + 4-ddmaATc + Tip 1.0 ± 0.0 1.4 ± 0.0 1.3 ± 0.1 3.5 ± 0.1 2.6 ± 0.1 ANHANG H44A 90 ± V45A 4 109 ± 2 92 ± 5 1.5 ± 0.1 93 ± 4 92 ± 5 N47A 1.6 ± 0.1 77 ± 5 92 ± 4 K48A 9.9 ± 0.2 90 ± 1 94 ± 3 R49A 1.0 ± 0.1 1.1 ± 0.1 47 ± 3 R49D 1.1 ± 0.1 1.7 ± 0.2 64 ± 1 R49E 1.4 ± 0.0 2.8 ± 0.1 71 ± 3 R49I 1.3 ± 0.1 70 ± 93 ± 1 R49K 1.0 ± 0.1 0.7 ± 0.2 34 ± 3 R49L 4.3 ± 0.3 95 ± 101 ± 3 R49N 1.3 ± 0.0 3.3 ± 0.5 63 ± 4 R49P 1.3 ± 0.1 10 ± 1 95 ± 2 R49W 1.6 ± 0.2 87 ± 2 99 ± 2 R49Y 1.3 ± 0.1 76 ± 1 101 ± 4 6 0 5 1.2 ± 0.0 1.6 ± 0.0 L51A 3.2 ± 0.2 82 ± 99 ± 5 D53A 0.9 ± 0.1 4.8 ± 0.6 77 ± 1 L55A 1.5 ± 0.0 15 ± 94 ± 3 V57I 0.9 ± 0.0 84 ± 4 E58A 1.2 ± 0.0 59 ± 4 91 ± 5 I59A 1.1 ± 0.0 26 ± 2 89 ± 1 I59M 0.9 ± 0.1 84 ± 2 1.6 ± 0.1 I59M Y93H 1.2 ± 0.2 93 ± 2 1.5 ± 0.3 L60A 1.6 ± 0.0 86 ± 2 A61D 0.8 ± 0.1 91 ± 3 R62A 1.0 ± 0.1 41 ± 4 92 ± 4 H63A 1.1 ± 0.1 61 ± 5 89 ± 2 H64A 1.2 ± 0.2 3.1 ± 0.1 85 ± 4 Y66A 1.5 ± 0.1 27 ± 79 ± 6 Y66H 1.4 ± 0.0 69 ± 2 S67A 1.3 ± 0.1 99 ± 5 S67F 1.4 ± 0.0 87 ± 3 1.7 ± 0.0 L68C 1.4 ± 0.0 86 ± 5 1.6 ± 0.0 N82A 1.0 ± 0.1 M84K 1.4 ± 0.1 S85A 1.3 ± 0.0 29 ± F86A 1.0 ± 0.2 R87A 1.4 ± 0.1 R88C 1.4 ± 0.0 L90A 2.2 ± 0.1 85 ± 2 R92A 1.0 ± 0.1 55 ± 5 R92S 1.0 ± 0.1 Y93A 1.1 ± 0.0 Y93H 0.9 ± 0.1 R94A 0.9 ± 0.0 30 ± D95A 0.8 ± 0.1 K98A 1.1 ± 0.0 10 ± 43 ± 1 1 4 1 1.1 ± 0.1 14 ± 0 91 ± 5 85 ± 4 1.1 ± 0.1 64 ± 3 88 ± 93 ± 6 84 ± 0 91 ± 1 1 1 90 ± 2 91 ± 5 93 ± 1 97 ± 4 74 ± 6 1.2 ± 0.1 17 ± 0 54 ± 92 ± 4 42 ± 4 1 1 - 132 1.3 ± 0.1 1.7 ± 0.0 1.7 ± 0.1 1.3 ± 0.0 1.6 ± 0.0 1.3 ± 0.0 1.3 ± 0.0 1.5 ± 0.1 1.5 ± 0.0 1.6 ± 0.0 57 ± 3 1.5 ± 0.2 1.7 ± 0.2 1.1 ± 0.1 ANHANG V99A 1.0 ± 0.1 65 ± H100A 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.1 L101A 53 ± 103 ± T103A 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0.2 5.9 ± 0.5 1.2 ± 0.1 R104A 1.0 ± 0.0 2.1 ± 0.1 87 ± 3 1.2 ± 0.0 P105A 0.9 ± 0.0 1.0 ± 0.1 33 ± 1 1.2 ± 0.0 D106T 1.0 ± 0.1 79 ± 4 K108A 0.9 ± 0.0 70 ± 96 ± 3 1.4 ± 0.1 Q109A 1.1 ± 0.1 1.6 ± 0.3 89 ± 1 1.1 ± 0.1 T112A 1.2 ± 0.0 43 ± 1 87 ± 1 1.2 ± 0.0 V113A 1.3 ± 0.1 71 ± 3 95 ± 6 1.2 ± 0.0 Q116A 1.3 ± 0.0 9.6 ± 0.9 77 ± 5 1.2 ± 0.1 L117A 1.3 ± 0.1 1.3 ± 0.1 78 ± 5 1.1 ± 0.0 L131A 1.2 ± 0.0 14 ± 0 97 ± 0 1.2 ± 0.0 I134A 3.4 ± 0.2 93 ± 2 107 ± 3 13 ± 1 S135A 51 ± 92 ± 5 101 ± 2 76 ± 3 S138A 1.2 ± 0.2 49 ± 2 82 ± 0 1.3 ± 0.1 E147A 1.0 ± 0.0 1.1 ± 0.3 3.8 ± 0.4 Q148A 1.5 ± 0.0 55 ± 70 ± 2 Q148D 1.5 ± 0.1 84 ± 2 E150A 1.0 ± 0.1 7.1 ± 0.3 74 ± 3 D157A 1.3 ± 0.0 21 ± 81 ± 3 D157E 1.5 ± 0.1 102 ± 5 R158A 0.8 ± 0.0 7.4 ± 0.8 47 ± 6 L170A 1.3 ± 0.0 1.3 ± 0.1 77 ± 2 1.1 ± 0.0 L174A 1.3 ± 0.1 2.0 ± 0.2 83 ± 4 1.2 ± 0.0 2 3 7 4 4 2 2 93 ± 3 64 ± 3 87 ± 4 1.3 ± 0.0 1.5 ± 0.1 1.2 ± 0.1 1.6 ± 0.0 1.6 ± 0.1 M177A 1.3 ± 0.1 21 ± 1 91 ± 5 1.2 ± 0.0 D181A 1.3 ± 0.1 32 ± 1 72 ± 3 1.2 ± 0.1 i2 (H64K S135L S138I) 2.3 ± 0.2 1.9 ± 0.1 20 ± 1 72 ± 4 i2 L4A 25 ± 1 21 ± 3 65 ± 2 i2 V9A 83 ± 4 89 ± 4 96 ± 5 i2 I10A 94 ± 4 72 ± 4 83 ± 6 i2 N11A 2.3 ± 0.1 68 ± 3 i2 L14A 67 ± 2 55 ± 5 30 ± 3 i2 E15A 17 ± 1 7.1 ± 0.7 76 ± 1 i2 L16A 83 ± 3 84 ± 1 94 ± 3 i2 L17A 89 ± 4 83 ± 4 i2 N18A 5.2 ± 0.1 i2 I22A 29 ± i2 E23A 3.7 ± 0.1 i2 L25A 94 ± 5 i2 L30A 98 ± i2 L34A 4.7 ± 0.3 55 ± 5 8.5 ± 2.0 19 ± 2 91 ± 5 3.6 ± 0.0 34 ± 4 90 ± 2 95 ± 4 3 93 ± 2 95 ± 2 56 ± 4 54 ± 1 77 ± 3 i2 L41A 100 ± 3 81 ± 5 96 ± 3 i2 H44A 55 ± 4 75 ± 5 i2 V45A 87 ± 3 107 ± 2 2 78 ± 7 - 133 ANHANG i2 N47A 96 ± 5 92 ± 2 92 ± 1 i2 K48A 98 ± 5 86 ± 6 88 ± 6 i2 R49A 4.0 ± 0.1 3.3 ± 0.1 i2 L51A 97 ± 89 ± i2 D53A 4.4 ± 0.1 i2 L55A 38 ± i2 E58A i2 I59A 5 3.5 ± 0.3 7.4 ± 1.8 101 ± 5 3.5 ± 0.5 37 ± 2 1 25 ± 3 42 ± 6 11 ± 1 11 ± 1 75 ± 4 63 ± 6 67 ± 2 16 ± 2 i2 L60A 18 ± 1 7.3 ± 0.3 16 ± 2 i2 K64A 2.5 ± 0.1 2.3 ± 0.1 2.7 ± 0.2 i2 S67A 2.0 ± 0.1 1.3 ± 0.2 22 ± 1 72 ± 5 i2 N82A 89 ± 90 ± 99 ± 4 95 ± 1 i2 S85A 4.4 ± 0.1 7.0 ± 0.2 45 ± 2 i2 F86A 31 ± 22 ± 13 ± 3 1 2 7 5 2 29 ± 1 i2 R87A 78 ± 4 66 ± 1 95 ± 2 i2 L90A 91 ± 2 64 ± 2 73 ± 2 i2 R92A 2.1 ± 0.1 48 ± 2 i2 Y93A 40 ± 3 49 ± 1 i2 R94A 37 ± 1 31 ± 2 11 ± i2 D95A 51 ± 1 43 ± 2 8.5 ± 0.2 i2 K98A 66 ± 2 44 ± 3 43 ± 0 i2 V99A 55 ± 2 35 ± 2 49 ± 3 i2 H100A 0.9 ± 0.1 1.3 ± 0.0 i2 L101A 83 ± 83 ± i2 K108A 3.1 ± 0.2 2.1 ± 0.1 i2 T103A 1.3 ± 0.1 1.9 ± 0.1 1.3 ± 0.2 6 2.1 ± 0.0 1 1.3 ± 0.0 4 9.8 ± 0.5 3.6 ± 0.2 0.9 ± 0.0 85 ± 7 77 ± 3 1.1 ± 0.1 i2 R104A 2.0 ± 0.1 1.8 ± 0.4 10 ± i2 P105A 1.7 ± 0.1 1.6 ± 0.3 1.9 ± 0.1 1.7 ± 0.7 i2 Q109A 1.3 ± 0.1 1.9 ± 0.1 1.4 ± 0.0 19 ± 0 i2 T112A 4.8 ± 0.3 4.0 ± 0.3 67 ± 3 i2 Q116A 1.9 ± 0.1 2.0 ± 0.0 i2 L131A 3.6 ± 0.1 1.8 ± 0.1 74 ± 2 i2 I134A 1.4 ± 0.1 1.7 ± 0.1 69 ± 2 i2 I138A 0.9 ± 0.1 2.4 ± 0.1 80 ± 83 ± 3 i2 E147A 2.7 ± 0.3 4.0 ± 0.1 3.8 ± 0.3 i2 Q148A 3.8 ± 0.4 2.7 ± 0.4 74 ± 5 i2 E150A 1.7 ± 0.0 2.7 ± 0.0 13 ± 1 i2 D157A 1.2 ± 0.1 1.0 ± 0.1 37 ± 1 i2 L170A 6.4 ± 0.2 4.0 ± 0.2 38 ± 2 i2 M177A 2.2 ± 0.1 1.7 ± 0.0 75 ± 1 i2 D181A 1.8 ± 0.0 1.7 ± 0.0 93 ± 2 r2 (E15A L17G L25V) 98 ± 4 18 ± 1 1.4 ± 0.3 67 ± 4 r2 L4A 96 ± 0 95 ± 2 77 ± 4 r2 V9A 94 ± 1 91 ± 5 88 ± 5 r2 I10A 100 ± 4 95 ± 1 88 ± 5 r2 N11A 105 ± 4 91 ± 2 97 ± 4 - 134 2.0 ± 0.1 2 1 2.1 ± 0.1 3.8 ± 0.2 104 ± 2 ANHANG r2 G17A 21 ± 0 3.7 ± 0.9 3.0 ± 0.2 r2 V25A 97 ± 3 99 ± 4 75 ± 1 r2 L30A 97 ± 5 103 ± 4 104 ± 5 r2 L34A 110 ± 1 62 ± 7 36 ± 1 r2 L41A 104 ± 4 99 ± 2 104 ± 3 r2 H44A 104 ± 4 101 ± 4 101 ± 3 r2 V45A 108 ± 5 93 ± 2 93 ± 5 r2 N47A 98 ± 3 97 ± 5 72 ± 2 r2 K48A 98 ± 1 99 ± 4 94 ± 3 r2 R49A 106 ± 5 90 ± 5 5.0 ± 0.1 r2 D53A 102 ± 7 87 ± 9 3.8 ± 0.2 r2 L55A 105 ± 6 98 ± 1 7.9 ± 0.2 r2 E58A 95 ± 5 101 ± 8 6.7 ± 0.2 r2 I59A 98 ± 6 99 ± 5 27 ± r2 I59M 98 ± 1 11 ± 1 r2 I59M Y93H 96 ± 0 83 ± 1 r2 L60A 92 ± 0 105 ± 8 23 ± 1 r2 R62A 106 ± 9 90 ± 4 4.8 ± 0.3 r2 H63A 85 ± 3 96 ± 6 33 ± 1 r2 H64A 98 ± 1 108 ± 1 43 ± 1 r2 Y66A 90 ± 2 63 ± 1 3.7 ± 0.1 r2 S67A 95 ± 5 18 ± 0 1.7 ± 0.2 r2 N82A 100 ± 3 102 ± 5 101 ± 4 r2 S85A 99 ± 6 92 ± 3 12 ± 1 r2 F86A 102 ± 2 110 ± 3 94 ± 1 r2 R87A 93 ± 1 101 ± 2 44 ± 3 0 r2 L90A 89 ± 1 91 ± 0 4.8 ± 0.8 r2 R92A 92 ± 7 19 ± 0 2.3 ± 0.1 r2 Y93A 98 ± 5 19 ± 2 2.5 ± 0.1 r2 Y93H 91 ± 2 r2 R94A 92 ± 7 59 ± 4 2.2 ± 0.2 r2 D95A 95 ± 3 78 ± 1 6.0 ± 0.1 r2 K98A 97 ± 7 110 ± 5 5.4 ± 0.2 r2 V99A 102 ± 2 29 ± 2 6.0 ± 5.6 r2 H100A 82 ± 6 83 ± 4 6.1 ± 0.1 r2 L101A 100 ± 4 2.0 ± 0.2 1.4 ± 0.1 r2 T103A 95 ± 4 91 ± 4 8.4 ± 0.7 r2 R104A 98 ± 2 102 ± 0 5.4 ± 0.3 r2 P105A 97 ± 4 100 ± 3 63 ± 6 r2 K108A 94 ± 5 97 ± 7 100 ± 5 r2 Q109A 99 ± 1 100 ± 2 4.7 ± 0.2 r2 T112A 100 ± 5 37 ± 6 2.3 ± 0.1 r2 V113A 101 ± 5 81 ± 2 16 ± 0 r2 Q116A 96 ± 5 107 ± 3 40 ± 1 r2 L117A 88 ± 5 96 ± 5 90 ± 5 r2 L131A 94 ± 1 50 ± 1 3.3 ± 0.3 56 ± - 135 2 ANHANG r2 I134A 90 ± 4 97 ± 10 37 ± r2 S138A 92 ± 1 31 ± 3 2.2 ± 0.1 r2 E147A 90 ± 3 99 ± 5 76 ± r2 Q148A 107 ± 7 21 ± 3 3.1 ± 0.6 r2 E150A 87 ± 2 21 ± 0 2.1 ± 0.4 r2 D157A 92 ± 2 17 ± 1 1.8 ± 0.1 r2 R158A 102 ± 5 42 ± 0 3.3 ± 0.0 r2 L170A 97 ± 2 108 ± 5 27 ± r2 L174A 105 ± 5 94 ± 1 3.4 ± 0.9 r2 M177A 105 ± 3 62 ± 1 3.0 ± 0.5 r2 D181A 98 ± 3 27 ± 3 3.7 ± 1.0 r6 (L17S E23K) 80 ± 3 1.4 ± 0.2 r6 I59M 96 ± 3 6.5 ± 0.1 r6 I59M Y93H 93 ± 4 15 ± 3 4 1 23 ± 5 69 ± 2 55 ± 1 2 r6 Y93H 77 ± 4 7.5 ± 0.3 r8 (E15V L17A E19D) 94 ± 2 3.4 ± 0.1 r8 I59M 97 ± 6 37 ± 1 r8 I59M Y93H 99 ± 2 81 ± 3 r8 Y93H 99 ± 4 76 ± 5 r9 (V20G G21R I22N) 97 ± 4 5.0 ± 0.1 r9 I59M 95 ± 3 6.7 ± 0.1 r9 I59M Y93H 93 ± 4 45 ± 6 r9 Y93H 102 ± 3 11 ± 0 8.1.2 TetR(B) Varianten β-Galaktosidase-Aktivität [%] TetR(B)… Repression Wildtyp 1.1 ± 0.0 76 ± 5 L4A 1.1 ± 0.0 87 ± V9A 1.2 ± 0.0 I10A 1.1 ± 0.0 + Tc + ATc 101 ± 5 + 4-ddma-ATc + Tip 50 ± 1 3 70 ± 3 88 ± 4 89 ± 4 87 ± 4 99 ± 8 N11A 1.1 ± 0.0 53 ± 4 1.4 ± 0.1 L14A 1.1 ± 0.0 83 ± 5 47 ± 2 E15A 1.0 ± 0.0 60 ± 2 58 ± 1 L16A 1.1 ± 0.0 90 ± 5 76 ± 7 L17A 4.8 ± 0.0 51 ± 2 L17A M59I 10 ± 1 101 ± 5 89 ± 3 7.8 ± 0.1 L17A M59I H93Y 1.8 ± 0.1 55 ± 4 L17A H93Y 2.0 ± 0.1 91 ± 8 N18A 1.3 ± 0.0 82 ± 2 68 ± 4 I22A 1.0 ± 0.0 78 ± 6 65 ± 3 E23A 1.1 ± 0.0 69 ± 3 6.5 ± 0.1 L25A 1.1 ± 0.0 86 ± 4 76 ± 1 L30A 2.2 ± 0.0 90 ± 1 82 ± 9 L34A 1.0 ± 0.1 65 ± 2 59 ± 5 - 136 ANHANG L41A 89 ± 4 87 ± 5 98 ± 5 H44A 94 ± 5 93 ± 5 97 ± 5 V45A 1.7 ± 0.0 94 ± 0 90 ± 2 N47A 1.4 ± 0.1 90 ± 4 64 ± 6 K48A 2.3 ± 0.0 97 ± 3 94 ± 5 R49A 1.3 ± 0.1 1.4 ± 0.2 M59I 1.1 ± 0.0 97 ± 4 M59I H93Y 1.6 ± 0.0 102 ± 3 H93Y 1.0 ± 0.0 i2 (H64K S135L S138I) 2.1 ± 0.2 25 ± i2 M59I S92R H93Y 2.7 ± 0.0 i2 M59I D61A S92R H93Y 89 ± 4 56 ± 1 13 ± 1.8 ± 0.1 34 ± 1 3.8 ± 0.7 7.7 ± 0.2 26 ± 0 37 ± 2 19 ± r2 (E15A L17G L25V) 105 ± 2 91 ± 4 91 ± 6 62 ± 10 r2 M59I 104 ± 1 94 ± 4 r2 M59I H93Y 99 ± 2 63 ± 2 23 ± 1 r2 H93Y 100 ± 2 72 ± 5 67 ± 5 r2 M59I S92R H93Y 95 ± 5 11 ± 1 1.5 ± 0.0 92 ± r2 M59I D61A S92R H93Y 104 ± 4 22 ± 1 1.5 ± 0.0 r6 (L17S E23K) 29 ± 0 22 ± 1 r6 M59I 13 ± 0 22 ± 1 r6 M59I H93Y 59 ± 2 4.7 ± 0.3 r6 H93Y 58 ± 3 28 ± 1 r8 (E15V L17A E19D) 103 ± 3 91 ± 3 r8 M59I 97 ± 4 73 ± 2 r8 M59I H93Y 88 ± 1 41 ± 1 r8 H93Y 92 ± 2 74 ± 2 r9 (V20G G21R I22N) 105 ± 2 59 ± 1 r9 M59I 105 ± 2 62 ± 2 r9 M59I H93Y 97 ± 4 38 ± 1 r9 H93Y 97 ± 2 22 ± 1 0 1.8 ± 0.1 - 137 66 ± 0 1 4 102 ± 4 97 ± 2 91 ± 5 6 87 ± 1 71 ± 2 75 ± 2 17 ± 2 71 ± 2 103 ± 0 ANHANG 8.2 Bisher verfügbare Kristallstrukturen von TetR TetR(D)•Tc TetR(D)•7-Chlor-Tc TetR(BD) PDB-Eintrag: 2TRT Veröffentlichung: 04.03.1994 Auflösung: 2.50 Å Aminosäuren: 2-155, 165-208 PDB-Eintrag: 2TCT Veröffentlichung: 02.03.1995 Auflösung: 2.10 Å Aminosäuren: 2-155, 165-208 PDB-Eintrag: 1A6I Veröffentlichung: 25.02.1998 Auflösung: 2.40 Å Aminosäuren: 2-151, 166-208 (Hinrichs et al., 1994) (Kisker et al., 1995) (Orth et al., 1998) TetR(D)-A2S•9-DMG1 TetR(D)-A2S•7-Chlor-Tc PDB-Eintrag: 1ORK Veröffentlichung: 21.05.1998 Auflösung: 2.40 Å Aminosäuren: 2-154, 165-208 PDB-Eintrag: 1BJY Veröffentlichung: 29.06.1998 Auflösung: 2.70 Å Aminosäuren: 2-208 PDB-Eintrag: 1BJZ Veröffentlichung: 29.06.1998 Auflösung: 2.20 Å Aminosäuren: 2-151, 165-208 (Orth et al., 1999b) (Orth et al., 1999a) (Orth et al., 1999a) TetR(D)-A2S•7-Chlor-Tc TetR(D)•tetO TetR(D)-A2S•epi-Tc PDB-Eintrag: 1BJ0 Veröffentlichung: 29.06.1998 Auflösung: 2.40 Å Aminosäuren: 2-151, 166-208 PDB-Eintrag: 1QPI Veröffentlichung: 25.05.1999 Auflösung: 2.50 Å Aminosäuren: 4-155, 164-206 PDB-Eintrag: 1DU7 Veröffentlichung: 14.01.2000 Auflösung: 2.51 Å Aminosäuren: 4-153, 163-208 (Orth et al., 1999a) (Orth et al, 2000) (Orth et al, 2000) 1 TetR(D)-A2S 9-(N,N-Dimethylglycylamido)-6-demethyl-6-deoxy-tetrazyklin - 138 ANHANG TetR(D)-A2S•7-Chlor-Tc TetR(B) TetR(B)•Tip B(1-187)D(188-208) B(1-187)D(188-208) PDB-Eintrag: 2FJ1 Veröffentlichung: 30.12.2005 Auflösung: 2.20 Å Aminosäuren: 2-208 PDB-Eintrag: 2NS7 Veröffentlichung: 03.11.2006 Auflösung: 2.40 Å Aminosäuren: 5-155, 162-206 PDB-Eintrag: 2NS8 Veröffentlichung: 03.11.2006 Auflösung: 2.55 Å Aminosäuren: 3-207 (Palm et al., 2008) (Luckner et al., 2007) (Luckner et al., 2007) TetR(D)•Dox TetR(D)•Tc (+Co2+) TetRr1•ATc PDB-Eintrag: 2O7O Veröffentlichung: 11.12.2006 Auflösung: 1.89 Å Aminosäuren: 2-208 PDB-Eintrag: 2VKE Veröffentlichung: 18.12.2007 Auflösung: 1.62 Å Aminosäuren: 2-156, 164-208 PDB-Eintrag: 2VKV Veröffentlichung: 02.01.2008 Auflösung: 1.74 Å Aminosäuren: 6-205 (Aleksandrov et al., 2007) (Palm et al., 2008) (Resch et al., 2008) TetR(H)•ATc PDB-Eintrag: 2VPR Veröffentlichung: 03.03.2008 Auflösung: 2.49 Å Aminosäuren: 2-157, 165-205 (Aleksandrov et al, 2008) TetRi2 TetRi2•4-ddma-ATc PDB-Eintrag: 3FK6 Veröffentlichung: 16.12.2008 Auflösung: 2.10 Å Aminosäuren: 4-155, 165-204 PDB-Eintrag: 3FK7 Veröffentlichung: 16.12.2008 Auflösung: 2.06 Å Aminosäuren: 7-154, 161-204 (Klieber et al, 2009) (Klieber et al, 2009) Als Veröffentlichung wurde das Ablage-Datum (Deposition) aus PDB verwendet. - 139 Lebenslauf Persönliche Daten Marcus Krüger geboren am 09.05.1980 in Forchheim ledig Schulausbildung 09.1986 – 07.1990 Grundschule Hallerndorf 09.1990 – 06.2000 Ehrenbürg-Gymnasium Forchheim, Abitur Hochschulausbildung 10.2000 – 10.2005 Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Diplomarbeit am Lehrstuhl für Mikrobiologie bei Prof. Dr. Wolfgang Hillen zum Thema: „Ein Tet-Repressor mit neuer Operator-Spezifität“ Abschluss: Diplom-Biologe 01.2006 – 03.2006 Weiterführende Arbeiten zum Thema der Diplomarbeit als wissenschaftlicher Angestellter am Lehrstuhl für Mikrobiologie seit 03.2006 Promotion am Lehrstuhl für Mikrobiologie bei Prof. Dr. Wolfgang Hillen zum Thema: „Signalübertragung im Tetrazyklin-Repressor als Grundlage für den allosterischen Induktionsmechanismus“ Erlangen, den 06.10.2009
