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Im Rahmen dieser Arbeit wurden enzymkinetische und strukturelle Untersuchungen
an der α-Ketosäuredecarboxylase aus Mycobacterium tuberculosis (MtKDC), welche
den Schwerpunkt dieser Arbeit bilden, und an der Oxalyl-CoA Decarboxylase aus
Escherichia coli (EcyfdU ) durchgeführt.
Zunächst wurden die Gene rv0118c und rv0853c, welche für die mykobakterielle Oxalyl-CoA-Decarboxylase bzw. eine α-Ketosäuredecarboxylase codieren, aus
genomischer DNA kloniert. Trotz umfangreicher Variation der Expressionsbedingungen konnten die Enzyme nicht löslich exprimiert werden. Daher wurden
Rückfaltungsexperimente durchgeführt, um katalytisch aktive Enzyme zu erhalten.
Geeignete Rückfaltungsbedinungen wurden nur für die MtKDC, aber nicht für die
mykobakterielle Oxalyl-CoA-Decarboxylase gefunden. Kinetische und strukturelle
Untersuchungen der Oxalyl-CoA-Decarboxylase wurden deshalb für das homologe
Enzym aus Escherichia coli (EcyfdU ) durchgeführt. Sowohl für die MtKDC als auch
für die EcyfdU wurden Reinigungsprotokolle aufgestellt.
Kinetische Untersuchungen zeigten, dass die MtKDC ein breites Spektrum an
α-Ketosäuren decarboxyliert. Im Gegensatz zu den Pyruvatdecarboxylasen bevorzugt
die MtKDC aromatische und verzweigtkettige α-Ketosäuren, während Pyruvat mit
einer deutlich niedrigeren Effizienz umgesetzt wird. Sigmoide Abhängigkeiten der
katalytischen Aktivität von der Substratkonzentration und lag-Phasen in den Progresskurven zeigen, dass die MtKDC durch ihr Substrat allosterisch reguliert wird.
Ein Vergleich der Aktivierungseffizienzen der untersuchten α-Ketosäuren zeigte,
dass die MtKDC in Analogie zur Substratspezifität durch Pyruvat am schwächsten
und durch verzweigtkettige und aromatische α-Ketosäuren stärker aktiviert wird.
Weiterhin konnte demonstriert werden, dass die MtKDC nicht nur durch ihre
Substrate, sondern auch durch Aminosäuren allosterisch reguliert wird, wobei die
verzweigtkettigen Aminosäuren L-Leucin, L-Valin, L-Isoleucin und die aromatische
Aminosäure L-Phenylalanin die stärksten Aktivatoren sind. Unterschiede in der
Aktivierungspotenz von L- und D-Aminosäuren wiesen zudem darauf hin, dass
nicht nur die chemische Struktur der Seitenkette sondern auch die absolute
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Konfiguration am Cα-Atom für die optimale Bindung der Aktivatoren von Bedeutung
ist. Es konnte gezeigt werden, dass zwischen Substrat- und Aminosäurebindung
eine positive Kooperativität besteht und dass die Aminosäuren eine höhere Affinität zum regulatorischen Zentrum der MtKDC besitzen als die Substrate. Aus
Untersuchungen zur Geschwindigkeit der C2-H-Deprotonierung des Cofaktors und
der Verteilung der bei der Katalyse gebildeten Reaktionsintermediate in An- und
Abwesenheit von Aminosäure mittels 1 H-NMR-Spektroskopie geht hervor, dass vor
allem die C-C-Bindungsbildung zwischen Substrat und enzymgebundenem Cofaktor
in Gegenwart von Aminosäure beschleunigt wird.
Basierend auf den experimentellen Daten wurde ein Modell der MtKDC-Katalyse postuliert. Dieses Modell vermag die Aktivierung durch Aminosäuren und α-Ketosäuren,
die Anfangsaktivitäten als auch die positive Kooperativität zwischen Aminosäureund Substratbindung zu erklären. Das Modell besteht aus zwei Bereichen, dem
Substrataktivierungsteil und dem Aminosäureaktivierungsteil. Die Annahme einer
Enzymspezies mit geringer katalytischer Aktivität (El ) trägt den beobachteten
Anfangsaktivitäten Rechnung. Kooperative Effekte werden durch die Bindung des
Substrates sowohl im regulatorischen als auch im aktiven Zentrum erklärt.
Strukturelle Aspekte der Aminosäureaktivierung der MtKDC wurden mittels
CD-Spektroskopie, Röntgenkleinwinkelstreuexperimenten und Gelfiltrationsexperimenten analysiert. CD-spektroskopische Untersuchungen deuten darauf hin, dass
Aminosäuren Änderungen am oder in der unmittelbaren Umgebung des Cofaktors
induzieren.
Röntgenkleinwinkelstreuexperimente
und
Gelfiltrationsexperimente
zeigen, dass die Aktivierung der MtKDC mit globalen strukturellen Änderungen und
einer Verschiebung des Dimer-Tetramer-Gleichgewichtes in Richtung des Tetramers
verbunden ist. Versuche, die dreidimensionale Struktur der MtKDC in An- und
Abwesenheit von Aktivator aufzuklären, blieben erfolglos.
Die Ergebnisse zeigen, dass sich die MtKDC sowohl in ihrer Substratspezifität als
auch in ihrem Aktivierungsverhalten deutlich von den substrataktivierten Pyruvatdecarboxylasen unterscheidet und dass die MtKDC am Abbau von verzweigtkettigen
und aromatischen Aminosäuren entsprechend des Ehrlichwegs beteiligt ist.
Für die kinetische Charakterisierung der EcyfdU wurde das Substrat Oxalyl-CoA
chemisch synthetisiert und ein direkter optischer Test etabliert, der es ermöglichte,
die enzymatische Decarboxylierung von Oxalyl-CoA zu Formyl-CoA zu verfolgen. Die
kinetischen Konstanten des Substratumsatzes der EcyfdU wurden bestimmt und
es wurde gezeigt, dass die katalytische Aktivität der EcyfdU durch CoA und AcCoA
kompetetiv inhibiert und durch ADP leicht erhöht wird. Im Gegensatz zur Oxalyl-
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CoA-Decarboxylase aus Oxalobacter formigens (Ofoxc) stellt ADP nur einen schwachen Aktivator der EcyfdU dar.
Weiterhin gelang es, die Kristallstruktur der EcyfdU im Komplex mit ThDP, ThDPAcCoA und ThDP-ADP aufzuklären. Die Struktur der EcyfdU ist nahezu identisch
zur Struktur der Ofoxc. ADP bindet in einem Rossmann Faltungsmotiv. Im Gegensatz
zu anderen allosterisch regulierten ThDP-Carboxylyasen wird in den Kristallstrukturen durch die Gegenwart von Aktivator keine signifikante Änderung der Anordnung
der Dimere im Tetramer beobachtet und die strukturellen Aspekte der Aktivierung
der Oxalyl-CoA-Decarboxylasen durch ADP bleibt zu klären.
Ausblicke
In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass eine ThDP-abhängige
durch
α-Ketosäuredecarboxylase
Es
wäre
interessant
Aminosäuren
herauszufinden,
α-Ketosäuredecarboxylasen,
welche
ein
ob
allosterisch
auch
andere
vergleichbares
aktiviert
wird.
ThDP-abhängige
Substratspektrum
wie
die MtKDC haben, allosterisch reguliert sind und die Aminosäureaktivierung somit
eine Möglichkeit zur Regulation von Enzymen ist, die am Aminosäurekatabolismus
über den Ehrlichweg beteiligt sind. In diesem Zusammenhang sei nochmals darauf
hingewiesen, dass unter den ThDP-abhängigen α-Ketosäuredecarboxylasen, die
eine Rolle im Aminosäureabbau spielen, nicht nur nichtregulierte Vertreter (KdcA,
EcIPDC) sondern auch substrataktivierte Enzyme (AbPPDC) beschrieben worden
sind. Sollte sich herausstellen, dass die AbPPDC in gleicher Weise wie die MtKDC
allosterisch durch Aminosäuren aktiviert werden, könnte durch Kristallstrukturen
der AbPPDC mit Aminosäuren weitere Einblicke in den Aktivierungsmechanismus
ThDP-abhängiger α-Ketosäuredecarboxylasen erhalten werden.
Die Untersuchungen, welche an der EcyfdU durchgeführt wurden, zeigen, dass
die Aktivierung von Oxalyl-CoA-Decarboxylasen durch ADP unterschiedlich stark
ausgeprägt sein kann. Die Frage, warum die EcyfdU -Aktivität nur schwach und
die Ofoxc-Aktivität dagegen deutlich durch ADP beeinflusst wird, blieb unklar.
Um weitere Einblicke in die molekulare Ursache der ADP-Aktivierung zu erhalten
und ein Aktivierungsmodell aufzustellen, als auch die physiologische Bedeutung
der ADP-Aktivierung besser zu verstehen, sind weitere strukturelle und vor allem
kinetische Untersuchungen (stopped-flow-Messungen, H/D-Austauschexperimente
und Intermediatanalysen mit Wildtyp und Enzymvarianten) an den Oxalyl-CoADecarboxylasen aus Oxalobacter formigens, E. coli sowie anderen Organismen
nötig.