Virale Vektoren

Virale Vektoren
Moderne Methoden der Immunologie
Abteilung Virologie
Institut für Medizinische Mikrobiologie & Hygiene
Peter Stäheli
Virale Vektor-Systeme
Wo und wann gebraucht ?
! Gentherapie
! Vakzinierung
! Exp. Ansätze
Erwünschte Eigenschaften von Vektoren für Gentherapie:
! Langzeit-Expression ohne Zellzerstörung
! keine Immunantwort gegen Vektor oder Fremdgen-Produkt
! spezifische Infektion bestimmter Zelltypen
Erwünschte Eigenschaften von Vektoren für Vakzinierung:
! Gute Immunantwort gegen Fremdgen-Produkt
! Fulminante Kurzzeitexpression des Fremdgens mit Zytolyse
! Zelltyp-Selektivität unwichtig
Virale Vektor-Systeme
Virus
Genom
Spezifität
Integration
Titer
Kapazität
(IE/ml)
Retroviren
ja
9 kb ssRNA
proliferierende
Zellen
+ruhendeZellen
107-108
8 kb
Adenovirus
36 kb, dsDNA
viele Zelltypen
nein
1011
8 kb
Adeno-Assoziiertes
Virus (AAV)
6 kb, ssDNA
viele Zelltypen
ja
108
<5 kb
>20 kb
C-Typ Viren
Lentiviren
Herpes Simplex
Virus (HSV)
Pockenviren
Canary pox Virus
Vaccinia , MVA
Einzelstrang RNA
Viren
7 kb ssRNA
(v.a. Chr. 19q)
150 kb, dsDNA
Nervenzellen
nein
1010
200 kb, dsDNA
viele Zelltypen
nein
107
6-20 kb, ssRNA
(+ od. - Strang)
viele Zelltypen
nein
106-1011
>20 kb
ca. 5 kb
Erkrankungen die neue Impfstrategien erfordern
! HIV-induzierte Immunschwäche (AIDS)
! HCV-induzierte Lebererkrankung
! Papillomvirus-induzierte Warzen und Tumore
! Influenza
! Dengue-Fieber
! Ebola- & Marburg-Virus-induzierte Hämorrhagische Fieber
Verfügbare virale Vektoren für Vakzinierung
! Adenoviren
! Vaccinia-Virus und „modified Vaccinia Ankara“ (MVA)
! Gelbfiebervirus-Impfstamm
! Masernvirus-Impfstamm
Potenzielle Probleme:
• Immunität der Impflinge gegen Vektor
• Masernimpfstamm ist gefährlich für Immunschwache
! Aviäre Pockenviren
! VSV (Rindervirus, apathogen für Mensch)
! Togavirus-basierende Replikone
! Aviäre Paramyxoviren (Newcastle Disease Virus)
Adenovirus
Fiberprotein (IV)
Pentonbasis-Protein (III)
terminales Protein (TP)
Core-Proteine
dsDNA Genom (30-45 kb)
(quasizirkulär, Pfannenstiel)
!# Verpackungs- Signal
ITR: Invertiert Terminale Repeats
MLTU: major late transcription unit
MLTU
ITR
!"
E3
ITR
E1
E2
E4
Replikations-defiziente Adenoviren
ClaI
ITR
!E3
ITR
ClaI
!"
Fremdgen
Kotransfektion der Verpackungs-Zelllinie
Homologe Rekombination
MLTU
Zellkern
E1-exprimierende
293 VerpackungsZelllinie
E1a
E1b
Zytoplasma
Replikations-defizientes Adenovirus
" da fast alle Virusproteine noch vorhanden,
starke Immunantwort gegen Vektor
ITR
!E3
!"
Fremdgen
MLTU
ITR
„Gutless" replikations-defiziente Adenovirus
Helfer-Virus
ITR
ampR
ori
ampR
Reporter
!E1
ITR
!"$
ITR
Ausgeweideter "gutless"
Adenovirus-Vektor
ori
ITR
!"$
Fremdgen
!E3
loxP
Infektion
Transfektion
Zellkern
Cre
E1a
E1b
ITR
ITR
Zytoplasma
ITR
!"% !E1
ITR
!"$
Fremdgen
loxP
!E3
verpackt
nicht
verpackt
Traditionelle Vaccinia-Vektoren
Vaccinia-Virus
1796 Edward Jenner infiziert 8-jährigen Jungen mit Kuhpocken
und überimpft dann 2x echte Pocken:
Kuhpocken vermittelten Schutz!!
Impfvirus: Vacciniavirus (vacca = Kuh)
Edward Jenner
(1746-1823)
Komplikationen bei Pockenimpfung:
~50 pro 1 Million Erstimpfungen
Ungefährliche Vaccinia-Vektoren: MVA
MVA = Modifiziertes Vaccinia Virus Ankara
möglicher Einsatz als Vorimpfstoff für Pockenimpfung
! reduziert Nebenwirkungen von Standard-Vacciniavirus
! scheint Wirksamkeit der Standardimpfung nicht zu reduzieren
MVA
! Patienten-Isolat, serielle Passage in Hühner-Embryofiboblasten (~300x)
! Repliziert gut in Hühnerzellen, aber schlecht in Säugerzellen
! Virusgenom weist große Deletionen auf
! Ende 70-iger Jahre in Deutschland in Gebrauch (~150’000 Geimpfte)
! Als Vorimpfung gegen Vaccinia-Impfung wieder im Gespräch
Herstellung rekombinanter Vaccinia-Viren
Virusgenom = ~190 kb lineare ds DNA
Genetische Manipulation mit Standardtechnik nicht möglich
Genetische Manipulation durch In vivo-Rekombination
Infektion
+
Transfektion
VV-Promotor
TK-Gen …
&-Gal
VV-Promotor
Fremdgen
Targeting Plasmid
TK = Thymidine-Kinase
..... TK-Gen
Selektion für TK-neg. mit BrdU
Selektion für &-Gal positiv
Vesikuläres Stomatitis Virus (VSV)
Eigenschaften
! Vertreter der Rhabdoviridae
! Mehrere Serotypen bekannt
! Endemisch in Amerika, Indien, Iran
! Infiziert Säugetiere (z.B. Rinder) und
Insekten (z.B. Stechmücken)
! Selten pathogen für Menschen (milde Grippe)
! Hohe Prävalenz für anti-VSV Antikörper bei
Menschen die in endemischen Gebieten
! Nicht-segmentiertes (-) Strang RNA-Genom
! Genomgröße 12 kb
! Repliziert im Zytoplasma
3'
N
P
M
G
L
Nukleoprotein N
Glykoprotein G
Phosphoprotein P
Polymerase L
5'
Matrixprotein M
Herstellung von rekombinantem VSV
T7 Promotor
Ribozym
Anti-genomische (+) Strang cRNA
pT7-N
pT7-P
VV-T7-Pol
Transfektion
Infektion
pT7-L
+
3'
N
P
M
G
Fremdgen
L
5'
HIV-Vakzine basierend auf rekombinantem VSV
extrazellulär
gp120
[TM]
zytoplasmatisch
gp41
HIV gp160
VSV-G Zytoplasmatischer Teil
HIV gp160-G
3'
N
P
M
G
HIV gp160-G
L
5'
Rose et al, 2001 Cell 106:539
Semliki Forest Virus (SFV)
Eigenschaften:
! Vertreter der Togaviridae
! Endemisch in Afrika und Süd-Ostasien
! Übertragung durch Stechmücken
! Natürlicher Wirt: Pferde
! Selten pathogen für Menschen
! Genom ist (+) RNA (~12 kb)
! Replikation im Zytoplasma
! Infiziert viele Zelltypen
Semliki Forest Virus Replikon System
Cap
!
Cap
Replikase Gene
!
Strukturgene
AAA
SFV Replikon
Replikase Gene
Fremdgen
AAA
SFV Replikation
Replikase / Transkriptase
nsP3
nsP1 nsP4
nsP2
Strukturproteine
Proteolytische Spaltung
E3
nsP1
nsP2
nsP3
nsP4
C
Translation
Cap
nsP1
!
nsP2
nsP3
nsP4
Replikase Gene
E2
C
P62
6K E1
Strukturgene
AAA
P62
6K
E1
Proteolytische Spaltung
C
P62 6K E1
Replikation
Translation
Cap
3’
5’
C
P62 6K E1
AAA
Semliki Forest Virus Replikon System
Cap
!
Cap
AAA
Strukturgene
Replikase Gene
SFV Replikon
!
Replikase Gene
Fremdgen
AAA
Verpackungs-Konstrukte
Cap
C
Cap
2A
Cap
C
p62
p62
**6K*
6K
AAA
E1
E1
AAA
AAA
*
Protease-Schnittstelle mutiert
2A Protease von MKSV
Verpackung des SFV-Replikons und Transduktion von Zielzellen
Cap
!
Replikase Gene
Cap
** *
6K
p62
C
Fremdgen
E1
AAA
AAA
Replikon
Verpackungs-Konstrukt
Transfektion
Amplifikation von
Replikons- und
Verpackungs-Konstrukt
Zellkern
Zellkern
Cap
AAA
Virale Transduktion
Cap
Cap
3’
!
***
AAA
AAA
Virus-Aktivierung
durch Chymotrypsin
Cap
5’
AAA
!
Amplifikation des Replikons
Zielzelle
Vektor-produzierende Zelle
nicht-gespaltenes
Spike-Protein
Cap
!
Replikase Gene
Fremdgen
AAA