Barbara Götz - TiHo Bibliothek elib

Aus dem Institut für Tierzucht und Tierverhalten in Mariensee
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Braunschweig
Kryokonservierung von Rinderembryonen mit verschiedenen
Einfrier- und Auftaumethoden unter Praxisbedingungen eine retrospektive Analyse
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Barbara Götz
aus Uedem
Hannover 2000
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Niemann
2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Weitze
Tag der mündlichen Prüfung: 29. November 2000
MEINEN ELTERN
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
2. Schriftum
4
2.1. Kryobiologische Grundlagen der Tiefgefrierung
4
2.1.1. Intrazelluläres und extrazelluläres Gefrieren
5
2.1.2. Schäden durch Gefrieren
9
2.2. Kryoprotektiva
2.2.1. Penetrierende Gefrierschutzmittel
13
15
2.2.1.1. Glycerin
16
2.2.1.2. Dimethylsulfoxid (DMSO)
22
2.2.1.3. Propanediol
25
2.2.1.4. Ethylenglykol
28
2.2.2. Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel
35
2.2.2.1. Sucrose
36
2.2.2.2. Trehalose
41
2.2.2.3. Ficoll
42
2.2.2.4. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohol (PVA)
43
2.3. Tiefgefrierverfahren
45
2.3.1. Konventionelle Gefrierverfahren
46
2.3.1.1. Langsames Tiefgefrieren
47
2.3.1.2. Schnelles Tiefgefrieren
47
2.3.2. Vitrifikation
52
2.3.3. Ultraschnelles Tiefgefrieren
61
2.3.4. Auftaumethoden
63
2.3.5. Ausverdünnungsmethoden
65
2.3.5.1. Schrittweises Ausverdünnen von Glycerin
65
2.3.5.2. One-Step-Methode
71
2.3.5.3. Direktes Ausverdünnen von Ethylenglykol
74
2.4. Überlebens- und Entwicklungsraten von in vivo gewonnenen und in vitro produzierten
Rinderembryonen
3. Material und Methoden
77
82
3.1. Datenmaterial
82
3.2. Spendertiere
84
3.2.1. Superovulation und künstliche Besamung
84
3.2.2. Spül- und Kulturmedium
86
3.2.3. Gewinnung von Embryonen
86
3.2.4. Aufsuchen und Beurteilung von Embryonen
87
3.3. Kryoprotektiva
90
3.3.1. Glycerin
90
3.3.2. Ethylenglykol
91
3.3.3. Säulenzahl in der Tiefgefrierpaillette bei Verwendung von Ethylenglykol
91
3.4. Tiefgefriervorgang
94
3.4.1. Tiefgefrieren auf Alkoholbasis
94
3.4.2. Tiefgefrieren auf Stickstoffbasis
94
3.5. Auftau- und Ausverdünnungsvorgang
95
3.5.1. Glycerin
95
3.5.1.1. 3 Ausverdünnungsschritte (Gly-3)
95
3.5.1.2. 1 Ausverdünnungsschritt (Gly-1)
95
3.5.2. Ethylenglykol
96
3.5.2.1. Direkttransfer (EG/DT)
96
3.5.2.2. Kontrollierte Ausverdünnungsverfahren
96
3.6. Empfängertiere
97
3.6.1. Vorbereitung der Empfängertiere
97
3.6.2. Transfervorgang
98
3.6.3. Trächtigkeitsuntersuchungen
98
3.7. Statistische Auswertung des Datenmaterials
4. Ergebnisse
4.1. Einflüsse auf die Trächtigkeitsrate
98
99
99
4.1.1. Gefrierschutzmittel
99
4.1.2. Embryonenqualität
103
4.1.3. Entwicklungsstadium
107
4.1.4. Gefriergerät
110
4.1.5. Empfängerqualität
112
4.1.6. Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh)
115
5. Diskussion
118
6. Zusammenfassung
134
7. Summary
137
8. Literaturverzeichnis
140
1
1. Einleitung
Die Kryokonservierung von Rinderembryonen wird im Rahmen des Embryotransfers heute in
der Rinderzucht routinemäßig angewendet. 1998 wurden bereits mehr als 50% aller
gewonnenen Rinderembryonen nach Tiefgefrierkonservierung übertragen (THIBIER 1999).
Ziel der Kryokonservierung ist die unbefristete Lagerung der Embryonen, ohne die
Entwicklungsfähigkeit nach dem Auftauen zu beeinträchtigen. Besonders kritische Schritte für
das Überleben der Embryonen sind das eigentliche Einfrieren und das Auftauen mit dem
Ausverdünnen des Gefrierschutzmittels.
Im Jahre 1971 gelang die erste erfolgreiche Kryokonservierung von Mäuseembryonen
(WHITTINGHAM 1971), und zwei Jahre später wurde das erste lebende Kalb nach Transfer
eines tiefgefrorenen Rinderembryos geboren (WILMUT u. ROWSON 1973). Von einer
praktischen Anwendung war man zu diesem Zeitpunkt jedoch noch weit entfernt. Viele
grundlegende Arbeiten zur Kryokonservierung von Mäuseembryonen haben wichtige Hinweise
für die Entwicklung eines praxisnahen Tiefgefrierverfahrens geliefert (WHITTINGHAM
1980).
Anfangs wurden die Rinderembryonen mit Dimethylsulfoxid (DMSO) (WILLADSEN et al.
1978; TERVIT u. ELSDEN 1981), später dann vorwiegend mit Glycerin als Kryoprotektivum
tiefgefroren (LEHN-JENSEN 1984). Beide Gefrierschutzmittel mußten aufgrund des hohen
osmotischen Gradienten stufenweise ausverdünnt werden, was zeitaufwendig und für die
praktische Anwendung häufig schwierig war. Durch den Einsatz von nicht penetrierenden
Kryoprotektiva (z. B. Sucrose) konnte das Ausverdünnungsverfahren verkürzt werden
(RENARD et al. 1983).
Zu Beginn der 90er Jahre wurde vermehrt über den Einsatz von Ethylenglykol bei der
Kryokonservierung von Rinderembryonen berichtet. Durch die geringere Toxizität und gute
Permeabilität mußte dieses Kryoprotektivum nach dem Auftauen nicht stufenweise
ausverdünnt werden, und der Embryo konnte per Direkttransfer auf den Empfänger übertragen
2
werden (VOELKEL u. HU 1992b; McINTOSH u. HAZELEGER 1994). Dies führte zu einer
weiteren Verbesserung und Vereinfachung der Methode beim kommerziellen Embryotransfer
(GÖRLACH 1996). Das Verfahren des Direkttransfers wurde schnell mit guten
Trächtigkeitsergebnissen von vielen Embryotransfer-Stationen auf breiter Basis eingesetzt.
Allerdings treten bei Anwendung dieser Methode unter Feldbedingungen immer noch starke
Schwankungen in den Ergebnissen auf. Dies wurde u.a. mit der fehlenden morphologischen
Kontrolle nach dem Auftauen begründet (BIELANSKY et al. 1986; JANOWITZ u.
HERMANNS 1995).
Neben dem Direkttransfer unter Verwendung von Ethylenglykol sind deshalb vereinfachte
Auftauverfahren unter Verwendung von Glycerin wieder häufiger eingesetzt worden. Als
Auftaumethode wird hier seit einiger Zeit das Ausverdünnen in einem Schritt mit Sucrose
angewandt (HRUSKA 1991).
Neben der Einfrier- und Auftaumethode werden die Trächtigkeitsergebnisse von weiteren
Faktoren beeinflußt. Bei einigen Faktoren, wie z. B. der Embryonenqualität (MASSIP et al.
1982; HASLER et al. 1987), der Qualität des Empfängertieres (SCHUBERTH 1984;
NOHNER 1986) und dem Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh) (JANOWITZ 1994;
MASSIP et al. 1995b) wurde ein deutlicher Einfluß auf die Überlebens- und Trächtigkeitsraten
nach der Kryokonservierung nachgewiesen. Der Einfluß des Entwicklungsstadiums wird von
einigen Autoren als geringer angesehen (LINDNER u. WRIGHT 1983; NELSON u. NELSON
1988). Andere Autoren hingegen konnten einen Einfluß einzelner Entwicklungsstadien
feststellen (NIEMANN 1982; MASSIP et al. 1984; KLING 1997)
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten in einer retrospektiven Untersuchung verschiedene
Variationen beim Einfrieren und Auftauen von Rinderembryonen unter Praxisbedingungen auf
ihren Einfluß auf die Trächtigkeitsraten analysiert werden. Es sollten die Ergebnisse nach
Direkttransfer
mit
Ethylenglykol
mit
denen
verschiedener
kontrollierter
Ausverdünnungsverfahren mit Ethylenglykol mit oder ohne Sucrose und denen unter
Verwendung von Glycerin verglichen werden.
3
Außerdem wurden die Einflüsse von Embryonenqualität, Entwicklungsstadium, Gefriergerät,
Empfängerqualität
und
Alter
des
Empfängertiers
(Rind
oder
Kuh)
auf
das
Trächtigkeitsergebnis in Abhängigkeit von den verschiedenen Einfrier- und Auftaumethoden
untersucht.
4
2. Schriftum
2.1. Kryobiologische Grundlagen der Tiefgefrierung
Gefrieren ist das Überführen von Wasser vom Lösungszustand in Eiskristalle (MERYMAN
1956). Eis bildet sich beim Kühlen von Embryonen auf Temperaturen unter 0°C zwischen -5
und -10°C zunächst im extrazellulären Medium.
Ziel der Kryokonservierung ist die zeitlich unbefristete Lagerung der Embryonen, ohne die
Entwicklungsfähigkeit nach dem Auftauen zu beeinträchtigen. Bei Temperaturen unter
-139°C ist keine ausreichende Energie mehr für die meisten zellulären Reaktionen der
Embryonen vorhanden. Bei weiterer Abkühlung auf -196°C ruht der metabolische
Stoffwechsel (LEIBO u. MAZUR 1971). Dies bietet die Möglichkeit für eine vollständige
Erhaltung der Ausgangseigenschaften des biologischen Materials (FRIEDLER et al. 1988;
BÜRKLE u. HAHN 1989).
Eine Langzeitlagerung bei -196°C scheint keinen Einfluß auf das Überleben der Embryonen zu
haben. Kalkulationen haben ergeben, daß Embryonen ca. 30000 Jahre gelagert werden müßten,
bevor eine akkumulierte ionisierende Strahlung einen Wert erreicht, bei dem die Embryonen
geschädigt würden (ASHWOOD-SMITH u. FRIEDMANN 1979).
Es treten drei Phänomene auf, wenn Embryonen auf Temperaturen unter 0°C gekühlt werden.
Eiskristalle werden gebildet, die Zelle dehydriert, und die Konzentration der gelösten Stoffe
steigt (MAZUR 1965). Dabei müssen die Embryonen während des Tiefgefrierens nicht nur
sehr
niedrige
Temperaturen
sondern
auch
das
zweifache
Durchschreiten
des
Temperaturbereichs zwischen -15 und -50°C während des Kühlens und während des Auftauens
überstehen (MAZUR 1980).
5
2.1.1. Intrazelluläres und extrazelluläres Gefrieren
Im Verlauf des Kühlprozeßes geht mehr und mehr des extrazellulären Mediums in Eis über.
Zwischen den Eiskristallen befindet sich die noch nicht gefrorene extrazelluläre Lösung, deren
Konzentration an gelösten Stoffen kontinuierlich auf multimolare Werte ansteigt. So bildet sich
ein wachsender Konzentrationsunterschied von gelösten Stoffen zwischen der unterkühlten
Lösung in den Zellen und der zunehmend konzentrierteren Lösung außerhalb der Zelle heraus
(MAZUR 1966; LEVIN u. CRAVALHO 1976; MAZUR u. SCHNEIDER 1986).
Es gibt zwei unterschiedliche Wege, um diese Differenz im chemischen Potential
auszugleichen. Wasser kann aus der Zelle herausfließen und extrazellulär gefrieren. Dabei wird
die intrazelluläre Lösung konzentriert. Der andere Weg ist, daß das intrazelluläre Wasser
gefriert und sich die intrazelluläre Lösung dabei konzentriert (MAZUR 1977; MAZUR 1980).
Bei einer niedrigen Kühlrate ist genügend Zeit für das Ausströmen des Wassers aus der Zelle
vorhanden. Die Zelle dehydriert und das Wasser gefriert extrazellulär (MAZUR 1965). Die
Permeabilität gegenüber Zellwasser ist größer als für gelöste Stoffe. Daher geschieht die
Equilibrierung (Anpassung an sich verändernde osmotische Bedingungen) des chemischen
Potentials zwischen Zytoplasma und extrazellulärem Eis vorwiegend durch Ausfluß von
Wasser und weniger durch Einfluß von extrazellulär gelösten Stoffen (FRIEDLER et al. 1988).
Bei einer schnellen Kühlung (hohe Kühlrate), dehydrieren die Zellen kaum und gefrieren
intrazellulär (MAZUR 1965). Bei hohen Kühlraten verläuft das Eiskristallwachstum schnell,
und es entstehen gleichzeitig viele kleine Kristalle (s. Abb.1). Bei niedrigen Kühlraten treten
weniger Kristalle auf, die aber größer sind (LEIBO et al. 1978). Kleine, bei hoher
Kühlgeschwindigkeit produzierte Kristalle, haben ein großes Oberflächen- / Volumenverhältnis
und eine größere Oberflächenenergie als große Kristalle und sind daher thermodynamisch
instabil (MAZUR 1965; MAZUR 1966).
6
7
Die Höhe der Kühlrate, bei der intrazelluläres Eis entsteht, hängt von dem Oberflächen- /
Volumenverhältnis der Zelle und ihrer Permeabilität für Wasser ab. Die Permeabilität einer
Membran gegenüber Wasser ist der bestimmende Faktor dafür, ob Zellen durch Dehydration
oder durch intrazelluläres Gefrieren bei niedrigen Temperaturen equilibrieren. Rote
Blutkörperchen haben eine hohe kritische Kühlgeschwindigkeit (5000°C/min). Dies ist Folge
der hohen Permeabilität für Wasser und dem großen Oberflächen- / Volumenverhältnis
(MAZUR 1970). Dementsprechend gefrieren sie nicht intrazellulär, wenn sie nicht mit einer
Rate gekühlt werden, die viel höher ist als die, die notwendig ist, um intrazelluläres Eis in
Hefezellen zu produzieren. Hefezellen besitzen eine geringere Permeabilität gegenüber Wasser
und ein kleineres Oberflächen- / Volumenverhältnis (LEIBO u. MAZUR 1971). Je größer das
Oberflächen- /Volumenverhältnis und je größer die Permeabilität, desto größer ist auch die
Kühlrate, die benötigt wird, damit intrazelluläres Eis entsteht (MAZUR 1965).
Der Inhalt einer Zelle bleibt beim Kühlen zunächst ungefroren, da die Zellmembran die Bildung
von Eiskristallen bei Temperaturen über -10°C verhindert. Der Zellinhalt wird aber zunehmend
unterkühlt. Diesen Vorgang nennt man „Supercooling“ oder Unterkühlung (MAZUR 1980).
Beim weiteren Kühlen der Lösung tritt eine spontane Kristallisation nicht an ihrem wahren
Gefrierpunkt, sondern bis zu 10°C und mehr darunter ein. Dadurch kommt es zur
Rückerwärmung des Systems bis nahe an den Gefrierpunkt und beim abschließenden
Temperaturabfall zur Erhöhung der Kühlrate. Dies kann wiederum beim Tiefgefrieren von
Embryonen zu einer verringerten Überlebensrate durch intrazelluläre Eisbildung führen
(WILLADSEN 1977).
Die Induktion der Eiskristallbildung, das sogenannte Seeding, reduziert den nachfolgenden
Temperaturanstieg, der durch Freisetzung latenter Wärme während des Phasenwechsels
geschieht und schützt damit vor exzessiven Supercooling (MAURER 1978). Allgemeine Praxis
beim Tiefgefrieren von Embryonen ist, die Eiskristallisation zu induzieren, wenn die
Temperatur 1 bis 3°C unter den wahren Gefrierpunkt gefallen ist. Dann ist eine osmotische
Reaktion der Zellen des Embryos möglich (LEHN-JENSEN 1984). Es ist günstig, die Seeding-
8
Temperatur noch für 2 bis 5 min zu halten, um ein thermisches und osmotisches Equilibrium zu
erreichen (LEIBO u. MAZUR 1978).
9
2.1.2. Schäden durch Gefrieren
Schäden während der Kryokonservierung von Embryonen resultieren aus den Interaktionen
einer großen Zahl von Faktoren. Die beiden wichtigsten Faktoren sind die Schäden, die mit der
Bildung von intrazellulärem Eis und verlängertem Ausgesetztsein in konzentrierten Lösungen
(Lösungseffekte) während des Tiefgefrierens zusammenhängen (DE LEUW et al. 1991).
Nach MAZUR (1966) treten bei Kühlgeschwindigkeiten über dem Optimum Schäden als Folge
intrazellulären Gefrierens, bei Kühlgeschwindigkeiten unterhalb des Optimums aber als Folge
der hochkonzentrierten Elektrolyten auf (s. Abb.2). Diese Hypothese wurde durch zahlreiche
Untersuchungen mit verschiedenen Zellen bestätigt. Die optimale Kühlrate ist die, die langsam
genug ist, um die Bildung von intrazellulärem Eis zu verhindern, aber schnell genug ist, um die
Zeitdauer, die die embryonalen Zellen den Lösungseffekten ausgesetzt sind, zu minimieren
(MAZUR 1970). Das Optimum liegt dort, wo beide Effekte minimal sind (MAZUR et al.
1972).
Überlebensrate (%)
Abb.2: Schematische Darstellung der
Beeinflussung der Überlebensrate durch die
Gefriergeschwindigkeit
Gefriergeschwindigkeit (°C/min)
10
Je schneller die Kühlung verläuft, desto geringer ist die Dehydration und desto größer ist die
Wahrscheinlichkeit des intrazellulären Gefrierens (MAZUR 1977; POLGE 1977). Zellen mit
großem Volumen verlieren Wasser bei einer gegebenen Kühlrate langsamer als kleinvolumigere
Zellen. Zellen mit großem Volumen werden daher stärker unterkühlt und neigen eher zum
intrazellulären Gefrieren (MAZUR 1966). MAZUR (1970), BANK u. MAZUR (1973) und
LEIBO (1977) wiesen eine mechanische Schädigung der Zellstrukturen durch große
Eiskristalle nach. Das Ausmaß der Schäden durch intrazelluläres Gefrieren korrelierte mit der
Gesamtmenge an Eis pro Zelle. Dabei sind auch die osmotischen Kräfte, die beim Schmelzen
des intra- und extrazellulären Eises auftreten, von Bedeutung (FARRANT et al. 1977).
Kleine Eiskristalle wachsen zusammen, wenn das Aufwärmen langsam genug ist, daß
ausreichend Zeit für diesen Vorgang vorhanden ist. Dieser Vorgang der Kristallbildung
während des Erwärmens wird Rekristallisation genannt und führt wie auch intrazelluläres
Gefrieren zum Tod der Embryonen (MAZUR et al. 1972; WHITTINGHAM 1980). Das
Ausmaß der Schäden während der Rekristallisation ist proportional zur Dauer des
Auftauprozesses, der wiederum indirekt proportional zur Auftaurate ist (DILLER et al. 1972).
Bei der Kühlung von Embryonen mit zu niedrigen Raten treten durch den Ausfluß von Wasser
aus den embryonalen Zellen Lösungseffekte auf (NIEMANN 1983). Die Konzentration der
gelösten Stoffe steigt an, das Zellvolumen wird verringert, und es kommt zur Ausfällung der
gelösten Stoffe. Dies gilt als Ursache für Zellschädigungen, die bis hin zur Zellysis führen
können (BÜRKLE u. HAHN 1989).
Nach LOVELOCK (1953) und MAZUR (1977) ist eine hohe Konzentration an Elektrolyten
die Ursache für Membranläsionen, die zur osmotischen Lysis der embryonalen Zellen während
des Gefrierens führen. Beobachtungen an humanen Erythrozyten zeigten, daß es zu
Lipidveränderungen in der Zellmembran kommt. Kationen können in die nun hypertonisch
werdende Zelle einströmen und beim Auftauen kommt es zur osmotischen Lysis (LOVELOCK
1953). Hohe Elektrolytkonzentrationen schädigen neben den inneren Zellmembranoberflächen
11
auch die intrazellulären Proteine. LEVIN u. MILLER (1981) sehen darin ebenfalls einen Grund
für die Lysis der embryonalen Zellen.
Schäden an den Membranen werden auch durch ein Unterschreiten des Mindestzellvolumens
ausgelöst. Erythrozyten können nicht auf weniger als 55% ihres normalen Volumens
schrumpfen. Entlang der Membran kommt es durch Druckgradienten zur Schädigung der
Membran. Es kommt zur Equilibrierung durch Wanderung der Elektrolyten in die Zelle und
zur osmotischen Lysis beim nachfolgenden Auftauen (MERYMAN 1968).
Faktoren, die die Größe der Schäden bestimmen, sind neben der tatsächlichen Konzentration
der gelösten Stoffe auch die Temperatur und die Zeit, die Embryonen dieser Konzentration
ausgesetzt sind (FARRANT 1965). So hat die Bildung von Eis bei großen Kühlraten ebenfalls
zur Folge, daß die intrazelluläre Konzentration von gelösten Stoffen ansteigt, wie dies bei der
Dehydration während des langsamen Tiefgefrierens geschieht, aber diese intrazelluläre,
hypertonische Lösung hat während des schnellen Tiefgefrierens keine Zeit, die Membranen zu
beeinflussen (FARRANT u. MORRIS 1973).
Die Fähigkeit der Zellen, Tiefgefrieren zu überleben, hängt nach MAZUR (1970) mehr vom
Schutz der Zelloberfläche als vom Schutz des Zellinneren ab. Das Zellinnere enthält
normalerweise hohe Konzentrationen an schützenden Makromolekülen. Auch die Ergebnisse
von FRIEDLER et al. (1988) deuteten auf eine Abhängigkeit der Überlebensfähigkeit vom
Schutz der Zelloberfläche hin. Sie wiesen nach, daß Kryoprotektiva auch ohne Penetration der
Zelle schützen können.
Kryomikroskopische Untersuchungen haben gezeigt, daß Risse in der Zona pellucida durch
Bruchstücke im Eis (fracture planes) entstehen können. Rapide Temperaturveränderungen in
der umgebenden Eismatrix gelten als Ursache für „fracture planes“. Die Zonaschäden treten
nur an solchen Stellen auf, wo „fracture planes“ den Embryo passieren. Dabei wird die
Überlebensfähigkeit der Embryonen nach dem Auftauen jedoch nicht unbedingt beeinträchtigt
und eine normale embryonale Entwicklung nach Transfer nicht ausgeschlossen. Teilweise wird
12
von in vitro-Entwicklungsraten bis zu expandierten Blastozysten von 91% berichtet (RALL u.
POLGE 1984). In vielen Fällen schrumpft der Embryo ausreichend und erlaubt ein Passieren
der „fracture planes“ durch den perivitellinen Raum. Dies erklärt das Vorhandensein von
normalen
Embryonen
mit
fehlender
oder
geschädigter
Zona pellucida nach der
Kryokonservierung (KANAGAWA et al. 1979; LEHN-JENSEN 1984; RALL u. MEYER
1989).
13
2.2. Kryoprotektiva
Gefrierschutzmittel (Kryoprotektiva) sind für das Überleben von tiefgefrorenen Zellen
notwendig. Sie werden in zwei Klassen eingeteilt, in penetrierende und nicht penetrierende
Gefrierschutzmittel (MERYMAN 1971).
Die genaue Wirkungsweise der Kryoprotektiva ist noch nicht ausreichend bekannt, aber
verschiedene Effekte werden diskutiert. Folgende Mechanismen der Schutzwirkung sind
wahrscheinlich. Durch die Kryoprotektiva kommt es zu einer Erniedrigung der Temperatur, bei
der intrazelluläres Gefrieren erfolgt. Sie reduzieren ferner die Schädigungen durch
Lösungseffekte und intrazelluläres Gefrieren und tragen so zu einer Stabilisierung der
Zellmembranen bei (NIEMANN 1983).
Vermutlich werden im Medium ohne Kryoprotektivum Kristalle gebildet, bis die
Zwischenräume beinahe verwischen, so daß Zellen einem beträchtlichen Druck ausgesetzt sind
und das Auftauen zu einem gewaltsamen und zerreißenden Prozeß wird. Wenn dem Medium
aber ein Kryoprotektivum zugefügt wird, bilden sich bei niedrigen Temperaturen kleinere
Kristalle, so daß Kanäle und Räume entstehen, in denen die Zellen geschützt sind und das
Auftauen einen glatten und stufenlosen Prozeß darstellt (SMITH et al. 1951).
Wenn die gesamte molare Fraktion aus Elektrolyten besteht, wird deren Konzentration durch
Zugabe von Nicht-Elektrolyten (in diesem Fall Kryoprotektiva) gesenkt (MAZUR 1970;
FARRANT
u.
MORRIS
1973).
Dies
geschieht
durch
die
kolligative
Wirkung
(Wasserbindungsfähigkeit) der Gefrierschutzmittel. Dadurch wird die Dehydrierung der Zellen
verzögert, und die intra- und extrazelluläre Ionenkonzentration steigt erst in einem niedrigeren
Temperaturbereich auf einen kritischen Wert, so daß zellschädigende Prozesse verzögert
ablaufen (LOVELOCK 1954; LEIBO 1977; MERYMAN et al. 1977; LEIBO u. MAZUR
1978; LEHN-JENSEN 1981; FRIEDLER et al. 1988). Kryoprotektiva schützen Zellen zwar
vor schädigenden Einflüßen durch hohe Elekrolytkonzentrationen, aber nicht vor der Bildung
von intrazellulärem Eis (WHITTINGHAM 1980).
14
Von
den
verschiedenen
Eigenschaften
hypertonischer
Lösungen
gehen
Membranveränderungen aus. Der kryoprotektive Effekt, sowohl der penetrierenden wie auch
der extrazellulären Bestandteile eines Kryoprotektivums, beruht während des Tiefgefrierens auf
einer Reduktion der Membranveränderungen verglichen mit Lösungen, denen wenig oder kein
Kryoprotektivum zugegeben wurde (FARRANT u. MORRIS 1973).
Nach FARRANT (1965) dürfen Kryoprotektiva während der Kühlung nicht toxisch wirken.
Aus diesem Grund müssen sie nach dem Tiefgefrieren aus den Zellen entfernt werden, da sie
bei wärmeren Temperaturen für die Zelle toxisch werden können (FRIEDLER et al. 1988).
15
2.2.1. Penetrierende Gefrierschutzmittel
Das Charakteristikum penetrierender Kryoprotektiva ist nach MERYMAN (1971) und LEIBO
(1988) die Fähigkeit, durch eine Zellmembran hindurchzuströmen. Dies wird durch ein
geringes Molekulargewicht ermöglicht. Penetrierende Kryoprotektiva dürfen auch in hohen
Konzentrationen, die notwendig sind, um eine exzessive Eisbildung zu verhindern, nicht
toxisch sein. Die Verbindung muß die Zelle penetrieren, um ihre kryoprotektive Wirkung zu
entfalten, denn ansonsten wird die Zelle osmotisch dehydriert. Hohe intrazelluläre
Elektrolytkonzentrationen wären die Folge (MERYMAN 1971).
Nach dem Hinzufügen des Kryoprotektivums besteht ein Osmolaritätsunterschied zwischen
intra- und extrazellulärer Lösung, denn das Kryoprotektivum erhöht die Osmolarität der
extrazellulären Lösung. Der Embryo schrumpft anfänglich durch das Ausströmen von Wasser,
um ein Equilibrium zwischen intra- und extrazellulärer Lösung zu erreichen. Das Schrumpfen
des Embryos wird so lange fortgesetzt, bis das Ausströmen von Wasser mit dem Einströmen
von Kryoprotektivum im Gleichgewicht steht (SCHNEIDER u. MAZUR 1984; LEIBO 1989).
Je permeabler ein Embryo gegenüber einem gegebenen Kryoprotektivum ist, desto geringer ist
das anfängliche Schrumpfen.
Der Grad der Penetration eines Kryoprotektivums in eine Zelle ist abhängig von deren
Permeabilitätskoeffizienten für das Kryoprotektivum, von dem Gradienten zwischen intra- und
extrazellulärer Konzentration des Kryoprotektivums, sowie von der Temperatur und der
Zelloberfläche. Zudem haben jeder Embryo, Spezies und Entwicklungsstadium eigene
Permeabilitätscharakteristika (SCHNEIDER u. MAZUR 1984; FRIEDLER et al. 1988).
Die Equilibrierung verläuft bei höheren Temperaturen schneller als bei niedrigen
Temperaturen. Die Equilibrierung von Rinderembryonen wird normalerweise bei 20-25°C
Raumtemperatur durchgeführt (DE LEEUW et al. 1991).
16
2.2.1.1. Glycerin
Glycerin (s. Tab.1) wurde erstmals von POLGE et al. (1949) als Kryoprotektivum beim
Tiefgefrieren von Geflügelsperma eingesetzt. Beim Vergleich der Überlebensraten (ÜR) nach
dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 1,0 M Glycerin und 1,5 M Dimethylsulfoxid
(DMSO) konnte kein signifikanter Einfluß des Kryoprotektivums entdeckt werden (BILTON
1980). Jedoch wurde Glycerin dem DMSO vorgezogen, da es auch in sehr hohen
Konzentrationen innerhalb von Zellen kaum toxisch wirkt (MERYMAN 1971).
Bei weiteren Versuchen sowohl mit Rinderembryonen (BOUYSSOU u. CHUPIN 1982;
PRATHER et al. 1987) als auch mit Mäuseembryonen (FALGE et al. 1982; RALL u. POLGE
1984; TAKEDA et al. 1987) wurde nachgewiesen, daß Glycerin in Konzentrationen von 1,31,4 M dem DMSO in Konzentrationen von 1,3-1,5 M als Kryoprotektivum beim
konventionellen Tiefgefrieren überlegen ist. RALL u. POLGE (1984) begründeten dies damit,
daß Glycerin-Lösungen eine höhere Viskosität als DMSO-Lösungen haben. Daher sei bei
Embryonen in Glycerin im Vergleich zu solchen in DMSO bei Temperaturen unter 0°C die
Bildung eines metastabilen, glasartigen Zustands wahrscheinlicher. Der mögliche schädigende
Effekt durch Bildung von intrazellulärem Eis wird dadurch verringert.
Glycerin wird beim konventionellen Tiefgefrieren gewöhnlich in Konzentrationen von 1-2 M
verwendet. MERRY et al. (1983) untersuchten die in vitro-ER (Entwicklungsrate) von
Mäuseembryonen nach dem Tiefgefrieren in drei verschiedenen Glycerin-Konzentrationen mit
schrittweisem Ausverdünnen. Dabei unterschieden sich die in vitro-ER der Embryonen (49, 44
und 52%) nach Tiefgefrieren in 1,0 M, 1,4€M und 1,8 M Glycerin nicht signifikant
voneinander.
LEHN-JENSEN (1986) verglich verschiedene Glycerin-Konzentrationen (0,5 M, 1,0 M und
1,4 M) beim Tiefgefrieren von Tag 6½-7½-Rinderembryonen. Dabei stellte er fest, daß die
Kryoprotektion bei einer Glycerin-Konzentration von 0,5 M nicht ausreichend war. Bei
Verwendung von 1,0 bzw. 1,4 M Glycerin war die Kryoprotektion gut, wobei kein
signifikanter Unterschied zwischen den beiden Konzentrationen entdeckt werden konnte.
17
Tab. 1: Physikalisch-chemische Eigenschaften penetrierender Kryoprotektiva
Glycerin
dreiwertiger Alkohol
mit 2 primären und
1 sekundären
OH-Gruppe 1
DMSO
Sulfoxid, das durch
Oxidation von
Dialkylsulfiden
entsteht 1
Ethylenglykol
zweiwertiger
Alkohol 3
Propanediol
zweiwertiger
Alkohol 1
CH2OH
H3C-SO-CH3
CHOH
CH2OH
2
HOH2C-CH2OH
2
CH3-CHOH-CH2OH
2
Molekulargewicht:
92,1 2
Molekulargewicht:
78,1 2
Molekulargewicht:
62,1 2
Molekulargewicht:
76,1 2
Siedepunkt:
290°C 2
Siedepunkt:
189°C 2
Siedepunkt:
198°C 2
Siedepunkt:
188°C 2
farblose, klare, sirupartige, süß
schmeckende
Flüssigkeit 1
farblose,
hygroskopische
(wasserbindende)
Flüssigkeit 1
farblose, visköse, süß
schmeckende
Flüssigkeit, stark
hygroskopisch 2
farb- und geruchlose,
ölige Flüssigkeit mit
süßlichem
Geschmack1
mit Wasser und
Ethanol in jedem
Verhältnis mischbar,
jedoch nicht in
Ether 1
mit Wasser und
Alkohol mischbar 1
mit Wasser und
Ethanol mischbar,
jedoch fast unlöslich
in Ether 1
in jedem Verhältnis
mit Wasser, Alkohol
und Ether mischbar 1
1
2
3
BEYER u. WALTER (1984)
NEUMÜLLER (1987)
CHRISTEN (1972)
2
18
Damit bestätigte er die Ergebnisse von KENNEDY et al. (1983), die ebenfalls keine
signifikanten Unterschiede bei den Überlebensraten zwischen den Glycerin-Konzentrationen
1,0 und 1,4 M fanden. WARE u. BOLAND (1987) verglichen verschiedene GlycerinKonzentrationen beim Tiefgefrieren von Schafembryonen mit anschließendem Ausverdünnen
mit dem nicht penetrierenden Kryoprotektivum Sucrose. Hierbei erwies sich eine GlycerinKonzentration von 2,8 M unabhängig von der Geschwindigkeit des Ausverdünnens mit
Sucrose als toxisch.
Kryoprotektiva wie Glycerin und DMSO permeieren die Zelle nicht so schnell wie Wasser
(VOELKEL u. HU 1992a). Die Zeit, die das Kryoprotektivum beim Influx bis zum Erreichen
einer bestimmten Konzentration in die Zelle mit Equilibration an die extrazellulären
Verhältnisse benötigt, wird als Equilibrierungszeit bezeichnet. LEHN-JENSEN (1986) verglich
die unterschiedlichen Diffusionsraten von DMSO und Glycerin bei 6½-7½ Tage alten
Embryonen. Er stellte fest, daß die Embryonen in PBS (Phosphat-Buffered-Solution) ca.
15 min zur Equilibrierung in 1,4 M Glycerin, aber 20 min in 1,5 M DMSO benötigen (bei
20°C). Die Rinderembryonen in 1,4 M Glycerin schrumpften dabei auf 45-50% ihres
isotonischen Ausgangsvolumen, wenn mit einer niedrigen Gefrierrate von < 0,8°C/min bis 25°C gekühlt wird.
PAVEL (1985) kam bei dem Vergleich zweier Equilibrierungszeiten von Rinderembryonen in
1,0 M Glycerin zu dem Schluß, daß eine Verlängerung von 10-15 min auf 20-35 min keinen
Einfluß auf die Überlebensraten nach Transfer hat.
Verschiedene Autoren untersuchten die Möglichkeit der Equilibrierung von Rinderembryonen
in 10% Glycerin (entspricht 1,4 M Glycerin) / PBS in einem Schritt. Nach CHUPIN u.
PROCUREUR (1984) ist es möglich, Rinderblastozysten in einem Schritt von 10-30 min in
1,4 M Glycerin zu equilibrieren. Ein starkes Schrumpfen der Embryonen wurde nach dem
Einsetzen in 1,4 M Glycerin beobachtet, dem eine Reexpansion durch den Influx von Wasser
innerhalb von 10-15 min folgte. Die Entwicklungsfähigkeit der Tag 7-Rinderembryonen wurde
durch die One-Step-Hinzugabe von 1,4 M Glycerin nicht gesenkt. Es wurde ein erhöhter Anteil
von Embryonen mit Schäden der Zona pellucida beobachtet, die aber anschließend keinen
weiteren Einfluß auf die Entwicklungskapazität in vivo und in vitro hatten (NIEMANN 1985).
19
Auch FRANKS et al. (1986) konnten keine Einfluß der Art des Hinzufügen des
Kryoprotektivums
(One
Step-Hinzufügen
oder
schrittweises
Hinzufügen)
auf
die
Überlebensfähigkeit der Embryonen feststellen.
THONON (1995) hingegen verglich die Überlebensraten von IVF-Embryonen (IVF = in vitroFertilisation) beim Tiefgefrieren in 10% Glycerin und erhielt beim schrittweisen Hinzufügen
höhere Überlebensraten als beim Hinzufügen in einem Schritt.
Die Permeabilität von Glycerin ist im Vergleich zu anderen penetrierenden Kryoprotektiva
geringer (SZELL et al. 1989; TACHIKAWA et al. 1993). Bei der Übertragung von in Glycerin
equilibrierten Embryonen in isotonischer PBS-Lösung kommt es zu einem Einströmen von
Wasser. Die Zellen schwellen an und lösen sich auf. Infolgedessen müssen die Embryonen nach
dem Auftauen in mehreren Schritten oder mit Hilfe eines nicht penetrierenden
Kryoprotektivums ausverdünnt werden (SCHNEIDER u. MAZUR 1984).
Die Trächtigkeitsraten nach Transfer von in 10% Glycerin tiefgefrorenen in vivo gewonnenen
Rinderembryonen lagen im Bereich von 40,5-69,6%, die von in vitro produzierten
Rinderembryonen deutlich niedriger (ELSDEN et al. 1982; NELSON u. NELSON 1988;
HRUSKA 1991; HASLER et al. 1995; KLING 1997). Einen Überblick der Überlebensraten
von Rinderembryonen nach kontrolliertem Tiefgefrieren mit Glycerin gibt Tabelle 2.
Glycerin wird aber auch in Kombination mit anderen Kryoprotektiva bei der Vitrifikation und
in multimolaren Konzentrationen beim ultraschnellen Gefrieren eingesetzt (BIELANSKY u.
HARE 1988; ALI u. SHELTON 1993b; GUITIERREZ et al. 1993a).
20
Tab. 2:
Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren bei Verwendung von Glycerin als
Kryoprotektivum und dem Ausverdünnen von Glycerin in mehreren Schritten mit oder ohne Sucrose oder in einem
Schritt mit Sucrose
Autoren
BOUYSSOU u.
CHUPIN 1982
NIEMANN et
al. 1982
KENNEDY et
al. 1983
Entwicklungsstadium oder
Embryonenalter
Blastozysten
Konzentration
des Glycerins
Ausverdünnungsschritte
Konzentration
der Sucrose
1,4 M
6 Schritte
0,0 M
56,0% ÜR (nach 24 h IVC)
Blastozysten
1,0 M
5 Schritte
0,0 M
53,6% ÜR (nach 24 h IVC)
1,0 M
1,0 M
3 Schritte
6 Schritte
0,5 M
0,0 M
83,3% ÜR (nach 24 h IVC)
60,0% ÜR (nach 12 - 14 h IVC)
1,4 M
1,4 M
6 Schritte
3 Schritte
0,0 M
0,3 M
52,0% ÜR (nach 12 - 14 h IVC)
51,0% TR
1,0 M
1,5 M
3 Schritte
6 Schritte
0,5 M
0,0 M
40,5% TR
17,0% ÜR (nach 24 h IVC)
1,5 M
1,5 M
1 Schritt
3 Schritte
1,0 M
0,3 M
32,0% ÜR (nach 24 h IVC)
79,0% ÜR (nach 24 h IVC)
1,5 M
1 Schritt
1,5 M
1 Schritt
d7 - d9Embryonen
NIEMANN
1985
BIELANSKY
et al. 1986
Morulae u.
Blastozysten
DEL CAMPO
et al. 1990
d7-Embryonen
HRUSKA 1991
d7-Embryonen
Überlebensraten
1,0, 0,5 u. 0,3 M 67,0, 72,0 bzw. 58,0% ÜR (nach
24 h IVC)
1,1 M
49,0% TR
21
LANDSVERK
et al. 1992
PALASZ et al.
1992
Morulae u.
Blastozysten
Morulae u. frühe
Blastozysten
HASLER et al.
1995
d7- u. d8-IVPEmbryonen
THONON et al.
1995
IVP-Blastozysten
LOONEY et al.
1996
d6,5 - d7,5Embryonen
KLING 1997
ARRESEIGOR
et al. 1998
Morulae u.
Blastozysten
1,4 M
3 Schritte
0,25 M
44,0% TR
1,4 M
1,5 M
1 Schritt
1 Schritt (in Paillette)
1,0 M
0,5 M
63,0% TR
39,2% ÜR
1,5 M
1,4 M
1 Schritt (in Paillette)
4 Schritte
1,0 M
0,3 M
43,5% ÜR
42,0 bzw. 20,0% TR
1,4 M (+ 0,25 M
Suc)
1,4 M
1,4 M
1 Schritt
0,25 M
27,7% ÜR (nach 24 h IVC)
4 Schritte
4 Schritte
0,0 M
0,3 M
60,7% ÜR (nach 24 h IVC)
69,6% TR
1,4 M
4 Schritte
0,3 M
49,02% TR
1,4 M
3 Schritte
0,3 M
45,9% TR
1,4 M
1 Schritt
1,0 M
47,2% TR
Abkürzungen:
IVP
Suc
ÜR
=
=
=
in vitro-Produktion
Sucrose
Überlebensraten (Anteil Embryonen ohne sichtbare morphologische
Schäden an Gesamtzahl der tiefgefrorenen / aufgetauten Embryonen
nach IVC (NIEMANN et al. 1982))
d
TR
IVC
=
=
=
Tag
Trächtigkeitsrate
in vitro-Kultur
22
2.2.1.2. Dimethylsulfoxid (DMSO)
Die Schutzwirkung von DMSO (physikalisch-chemische Eigenschaften s. Tab. 1) beim
Tiefgefrieren von Zellen wurde zum ersten Mal von LOVELOCK und BISHOP (1959)
beschrieben. Beim ersten erfolgreichen Tiefgefrierversuch, den WHITTINGHAM et al. (1972)
mit Mäuseembryonen durchführten, erschien DMSO dem Glycerin überlegen. BANK u.
MAURER (1974) und MAURER u. HASEMAN (1976) benutzten es erfolgreich zum
Tiefgefrieren von Kaninchenembryonen, WILLADSEN et al. (1978) und BILTON ( 1980)
zum Tiefgefrieren von Rinderembryonen und TROUNSON u. MOHR (1983) zum
Tiefgefrieren von humanen Embryonen.
DMSO dringt in die embryonalen Zellen nicht so schnell wie Wasser ein (VOELKEL u. HU
1992a), im Vergleich zum Glycerin jedoch schneller (TROUNSON u. MOHR 1983; AGCA et
al. 1997). Eine wichtige Eigenschaft des DMSO ist laut MERYMAN (1971) seine vollständige
Penetration in die Zellen. Dies ist nach MIYAMOTO et al. (1998) für die Kryoprotektion auch
notwendig, da DMSO seinen Schutz allein in der extrazellulären Lösung nicht entfalten kann.
Eine DMSO-Konzentration von 1 M bietet nach LEIBO u. MAZUR (1978) noch keine
ausreichende Kryoprotektion. Andere Autoren unterstützten mit ihren Ergebnissen diese
Aussage, in dem sie eine Konzentration von min. 1,5 M DMSO bei den verschiedenen Spezies
beim konventionellen Tiefgefrieren für notwendig halten (s.Tab.3) (BANK u. MAURER 1974;
FORGRAVE et al. 1977 und WILLADSEN 1980).
Die Veränderungen von Osmolarität und pH-Wert im Vergleich zu PBS zeigen, daß DMSO in
Konzentrationen, die für eine Kryoprotektion erforderlich sind, einen größeren osmotischen
Streß und größere Veränderungen des pH-Werts als Glycerin verursacht (LEHN-JENSEN
1980) und somit schneller als Glycerin toxisch wirkt (FRIEDLER et al. 1988). Bei
vergleichenden Untersuchungen von DMSO und Glycerin beim konventionellen Tiefgefrieren
konnte bei Mäuseembryonen (FALGE et al. 1982) und bei Rinderembryonen (WILLADSEN
23
1980; BOUYSSOU u. CHUPIN 1982; LEHN-JENSEN 1984) eine Verbesserung der
Überlebensraten durch den Einsatz von Glycerin erreicht werden.
DMSO besitzt eine große Fähigkeit zur Glasbildung (FRIEDLER et al. 1988; VALDEZ et al.
1992). Daher ist es eine bevorzugte Komponente in Vitrifikationslösungen (ISHIMORI et al.
1992 u. 1993; VICENTE u. GARCIA-XIMENEZ 1994).
24
Tab.3:
Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren mit Verwendung von Dimethylsulfoxid
(DMSO) als Kryoprotektivum
Autoren
Entwicklungsstadium o. Konzentration
Embryonenalter
expandierte Blastozysten 1,5 M DMSO
LEHN-JENSEN u.
GREVE 1978
WILLADSEN et al. späte Morulae u. frühe
1978
Blastozysten
BILTON 1980
Morulae u. frühe
Blastozysten
SCHNEIDER et al. d6½-8-Embryonen
1980
TERVIT u.
Morulae - expandierte
ELSDEN 1981
Blastozysten
BOUYSSOU u.
Blastozysten
CHUPIN 1982
FRANKS et al.
Blastozysten
1985
LEHN-JENSEN
kompakte Morulae 1986
expandierte Blastozysten
PRATHER et al.
späte Morulae 1987
expandierte Blastozyste
VOELKEL u. HU
d7-7½-Embryonen
1992a
Abkürzungen:
TR
Suc
ÜR
=
=
=
Ausverdünnungsmethode
Überlebensraten
43,8% TR
Bemerkungen
1,5 M DMSO
6 Schritte
1,5 M DMSO
6 Schritte
ER: 3/17
TR: 3/10
28,6% TR
1,5 M DMSO
6 Schritte
29,0% TR
1,5 M DMSO
6 Schritte
25,0% TR
1,5 M DMSO
6 Schritte
1,5 M DMSO
1 o. 3 Schritte
31,0 bzw. 16,0% nach 24 bzw.
ÜR
48 h IVC
25,4% ÜR
nach 12 h IVC
1,5 M DMSO
1 Schritt mit 1 M Suc
22,0% ÜR
1,5 M DMSO
6 Schritte o. 3 Schritte
mit 0,5 M Suc
direktes Ausverdünnen
in PBS
49,1% ÜR
1,5 M DMSO
Trächtigkeitsrate
Sucrose
Überlebensrate
ER
IVC
=
=
ÜR nach
12 h IVC
35, 35 bzw. 25% nach 24, 48 bzw.
ÜR
72 h IVC
Entwicklungsrate
in vitro-Kultur
25
2.2.1.3. Propanediol
Propanediol (s. Tab.1) besitzt eine höhere Tendenz zur Bildung eines glasartigen Zustands als
Glycerin oder DMSO. Dadurch senkt es die Menge an intrazellulärem Eis, die während des
langsamen Tiefgefrierens gebildet wird (RENARD u. BABINET 1984; FRIEDLER et al.
1988). Bei Embryonen werden überwiegend Konzentrationen von 1,5-1,6 M Propanediol
eingesetzt (SUZUKI et al. 1990).
Die Substanz kommt überwiegend bei Embryonen und Oozyten von Mäusen und Menschen
zur Anwendung, wo die Eignung als Kryoprotektivum bei Embryonen durch zahlreiche
Untersuchungen dokumentiert wurde (RENARD u. BABINET 1984; HERNANDEZLEDEZMA et al. 1988; KO u. THRELFALL 1988; HERNANDEZ-LEDEZMA u. WRIGHT
1990, SHAW et al. 1995).
Hingegen zeigen die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen nur eine geringe Eignung von
Propanediol für die Kryoprotektion von Rinderembryonen. Beim Vergleich verschiedener
Kryoprotektiva (Ethylenglykol, DMSO und Glycerin) mit Propanediol lagen die in vitroÜberlebensraten mit
Propanediol nach konventionellem Tiefgefrieren und direktem
Ausverdünnen
Rinderembryonen
von
sowie
nach
ultraschnellem
Tiefgefrieren
in
Konzentrationen von 3 M deutlich unter denen der anderen Kryoprotektiva (VOELKEL u. HU
1992a, GUTIERREZ et al. 1993b). Auch im Vergleich von Propanediol mit Ethylenglykol
beim Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen wurde mit Propanediol eine
deutlich niedrigere Schlupfrate als mit Ethylenglykol erzielt (TAKAGI et al. 1994b). Beim
Vergleich des Einflußes verschiedener Kryoprotektiva auf die Überlebensfähigkeit von ICM
(inner cell mass)-Zellen von in vitro produzierten Rinderembryonen erwies sich Propanediol
toxischer als Glycerin und Sucrose, Ethylenglykol und Methylcellulose (TAKAGI et al.
1994a). Die Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren mit
Propanediol finden sich in Tabelle 4.
26
Propanediol erwies sich auch bei alleiniger Verwendung in hohen Konzentrationen bei der
Vitrifikation von Mäuseembryonen als toxisch. Als Komponente in einer Vitrifikationslösung
(VS 1), die aus penetrierenden (DMSO, Acetamid, Propanediol) und nicht penetrierenden
Kryoprotektiva (Polyethylenglykol) bestand, trug es hingegen dazu bei, die Konzentration der
übrigen Kryoprotektiva zu senken (RALL u. FAHY 1985; FRIEDLER et al. 1988). Auch bei
IVF-Rinderblastozysten wurde nach Equilibrierung in 40% Propanediol, Ethylenglykol oder
Glycerin jeweils mit 30% Ficoll und 0,5 M Sucrose für 2 min mit Propanediol eine deutlich
niedrigere Schlupfrate (24%) als bei den anderen beiden Kryoprotektiva erreicht
(TACHIKAWA et al. 1993). GAJDA u. SMORAG (1993) hingegen konnten bei der
Vitrifikation von Kaninchenembryonen durch Erhöhung der Propanediol-Konzentration von 35
auf
50%
eine
Steigerung
Kaninchenembryonen erzielen.
der
Überlebensraten
von
1-Zell-
wie
auch
2-Zell-
27
Tab.4:
Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren mit Verwendung von Propanediol
(PROH) als Kryoprotektivum
Autoren
Entwicklungsstadium Konzentration des Ausverdünnungs- Überlebensraten
Bemerkungen
o. Embryonenalter Kryoprotektivums
methode
RENARD et al. d8-Blastozysten
2,0 M PROH
40,0% SR
SR nach 20 h IVC
1981a
SUZUKI et al.
1990
d7-Embryonen
1,6 M PROH
DT mit 0,2 M Suc 61,0% TR
in Paillette
SEIDEL et al.
1992
d7-Embryonen
1,0 M PROH
DT
40,0% TR
TAKAGI et al.
1993
Blastozysten u. expandierte Blastozysten
1,6 M PROH
direktes Ausverdünnen in PBS
31,0, 41,5 bzw.
40,0% SR
TAKAGI et al.
1994b
Blastozysten u. expandierte Blastozysten
1,6 M PROH
direktes Ausverdünnen in PBS
YAMAMOTO
et al. 1996
Blastozysten
1,6 M PROH
direktes Ausverdünnen in PBS
51,2 bzw. 40,0%
SR bei d7- bzw.
d8-Embryonen
94,0% ÜR bzw.
77,0% SR
Abkürzungen:
SR
IVC
DT
=
=
=
Schlupfrate
in vitro-Kultur
Direkttransfer
IVP
ÜR
PBS
=
=
=
IVP, nach 10, 20 u.
40 min Equilibrierung, SR
zu geschlüpften
Blastozysten
IVP
IVP
in vitro-Produktion
Überlebensrate
Phosphat-Buffered-Solution
28
2.2.1.4. Ethylenglykol
Ethylenglykol besitzt ein niedrigeres Molekulargewicht als Glycerin, DMSO und Propanediol
(s. Tab.1). Dies ist Voraussetzung für eine schnelle Penetration von Ethylenglykol in die Zelle
hinein und aus der Zelle heraus. Diese hohe Permeabilität und die darausfolgende geringere
Toxizität auch bei hohen Konzentrationen sind wichtige Vorteile gegenüber anderen
Kryoprotektiva (MAHMOUDZADEH et al. 1993; CSEH et al. 1997).
Die kryoprotektive Wirkung von Ethylenglykol wurde erstmals beim kontrollierten
Tiefgefrieren von 8-Zell-Mäuse- und Rattenembryonen gezeigt (MIYAMOTO u. ISHIBASHI
1977). In zahlreichen Untersuchungen wurden die Überlebensraten von Embryonen vom Rind
und auch vom Schaf nach konventionellen Tiefgefrieren mit Ethylenglykol oder Glycerin
verglichen. Dabei erhielt man bei Verwendung von Ethylenglykol im Vergleich zur
Verwendung von Glycerin gleichwertige oder höhere Überlebensraten (COCERO et al. 1988;
LANGE 1995; KLING 1997; BEAL et al. 1998).
VOELKEL u. HU (1992a; 1992b) verwendeten Ethylenglykolkonzentrationen zwischen 1,02,0 M beim konventionellen Tiefgefrieren von Rinderembryonen im Stadium von Morula bis
zur expandierten Blastozyste. Dabei erwies sich eine Konzentration von 1,5 M Ethylenglykol
als am geeignetsten. STREICHER (1998) erhielt nach konventionellem Tiefgefrieren von in
vitro produzierten Rinderembryonen ähnliche Ergebnisse. Er verwendete 10% (= 1,8 M) und
20% (= 3,6 M) Ethylenglykol. Nach in vitro-Kultur war die Schlupfrate bei Verwendung von
10% Ethylenglykol (46,3%) höher als bei Verwendung von 20% Ethylenglykol (24,5%).
SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) equilibrierten in vitro
produzierte Tag 7-
Rinderblastozysten für 10 min in Ethylenglykol-Lösungen mit Konzentrationen von 1,8 bis
8,9 M bei Raumtemperatur. Mit 98% wurde die höchste Schlupfrate nach 72 h in vitro-Kultur
bei einer Konzentration von 3,6 M Ethylenglykol erzielt. Nach Equilibrieren und
Ausverdünnen in einem Schritt erwies sich 3,6 M Ethylenglykol auch beim konventionellem
Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen als die optimale Konzentration.
29
Ethylenglykol diffundiert schneller als Glycerin durch die Zellmembran. Die in vitroÜberlebensraten von Schafembryonen wurden nach Tiefgefrieren mit 1,5 M Ethylenglykol
nicht durch die unterschiedliche Anzahl von Stufen bei der Equilibrierung und auch bei der
Ausverdünnung beeinflußt (McGINNIS et al. 1989). Da Ethylenglykol auch bei höheren
Temperaturen eine weitaus geringere toxische Wirkung als Glycerin aufwies, kann der
aufwendige und schrittweise Ausverdünnungsvorgang des Kryoprotektivums nach dem
Auftauen entfallen. Ein Direkttransfer der mit Ethylenglykol tiefgefrorenen Rinderembryonen
ist
möglich (VOELKEL u. HU 1992b). Die Praktikabilität (weniger Zeit- und
Materialaufwand) wurde in mehreren Untersuchungen bei Rinderembryonen mit guten
Ergebnissen bestätigt (Mc INTOSH u. HAZELAGER 1994; BRACKE et al. 1995; DOCHI et
al. 1995; JANOWITZ u. HERMANNS 1995; LANGE 1995). Tabelle 5 zeigt Überlebensraten
von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren bei Verwendung von Ethylenglykol.
Ethylenglykol wird sowohl beim konventionellen Tiefgefrieren wie auch bei der
Kryokonservierung durch direktes Überführen in flüssigen Stickstoff (Vitrifikation und
ultraschnelles Gefrieren) verwendet. Auch bei der Vitrifikation erwies es sich im Vergleich zu
anderen Kryoprotektiva als weniger toxisch. Bei Rinderembryonen konnten mit einer
Vitrifikationslösung, die Ethylenglykol enthielt (7,15 M Ethylenglykol, 2,5 M Ficoll und 0,3 M
Sucrose) und in einem Schritt hinzugefügt wurde, deutlich höhere in vitro-Überlebensraten als
mit anderen Vitrifikationslösungen, bestehend aus DMSO, Acetamid, Propanediol und
Polyethylenglykol bzw. Glycerin und Propanediol, erreicht werden (MAHMOUDZADEH et
al. 1993). Mit einer Lösung, die 40% Ethylenglykol enthielt und der ein Makromolekül (30%
Ficoll) sowie ein nicht penetrierendes Kryoprotektivum (0,5 M Sucrose) beigefügt wurden,
konnten
Mäuseembryonen
und
in
vitro
produzierte
Rinderembryonen
erfolgreich
kryokonserviert werden (KASAI et al. 1990; TACHIKAWA et al. 1993; MARTINEZ et al.
1998).
Die Verwendung
von Ethylenglykol als penetrierendes Kryoprotektivum in einer
Vitrifikationslösung, bestehend aus 6,0 M Ethylenglykol und 1,8 M Glycerin, wird als Grund
für die guten Überlebensraten nach Vitrifikation von Schafembryonen angesehen. Nach
30
Transfer von jeweils zwei Embryonen auf einen Empfänger lag die Trächtigkeitsrate bei 55%
für Morulae und 62% für Blastozysten (ALI u. SHELTON 1993a).
31
Tab.5:
Überlebensraten von Rinderembryonen beim konventionellen Tiefgefrieren mit Verwendung von Ethylenglykol als
Kryoprotektivum
Autoren
Entwicklungsstadium
Konzentration des
o. Embryonenalter
Kryoprotektivums
VOELKEL u. HU Morulae - expandierte
1,5 M EG
1992b
Blastozysten
Ausverdünnungsverfahren
DT
Überlebensraten
50,0% TR
McINTOSH u.
HAZELEGER
1994
BRACKE et al.
1995
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG
DT
59,0% TR
1,5 M EG
DT
57,7% TR
DOCHI et al.
1995
Morulae u. Blastozysten 1,8 M EG
DT
69,0% TR
1,8 M EG + 0,25 M Suc
1,8 M EG
DT
direkt in PBS
52,0% TR
40,0-73,6% ÜR
1,5 M EG
DT
55,8% TR
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG
DT
58,2% TR
CSEH et al. 1995 d7-d10-Embryonen
JANOWITZ u.
HERMANNS
1995
LANGE 1995
Bemerkungen
IVP
32
RODRIGUES et
al. 1995
1,5 M EG
direkt in PBS
68,0 bzw. 70,0% ÜR IVP
3,6 M EG
in 1,8 M EG + 1,0 M Suc
HASLER et al.
1996
1,5 M EG
direkt in PBS
87,0% ÜR,
73,0% ER
68,0 bzw. 60,0% ER IVP
LOONEY et al.
1996
1,5 M EG
DT
50,0% TR
KLING 1997
Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG
DT
50,8% TR
SOMMERFELD
1997
expandierte Blastozysten 3,6 M EG
DT
23,8% TR
IVP
YANG et al. 1997 Blastozysten u.
1,8 M EG
expandierte Blastozysten
1,8 M EG + 0,1 M Suc
ARRESEIGOR et Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG
al. 1998
direkt in PBS
60,9% SR
IVP
DT
45,8% SR
47,4% TR
BEAL et al. 1998
DT
59,6% TR
d7-u. d8-Blastozysten
33
LANE 1998
Blastozysten
STREICHER
1998
Blastozysten
1,5 M EG
1,8 M EG,
1,8 M EG + 0,2 M Suc,
3,6 M EG
MARTINEZ et al. Morulae u. Blastozysten 1,5 M EG (+ 0,1 M bzw.
1999
0,3 M Suc)
Abkürzungen:
EG
=
Ethylenglykol
DT
=
Direkttransfer
TR
=
Trächtigkeitsrate
Suc
=
Sucrose
ÜR
=
Überlebensrate
ER
=
Entwicklungsrate
IVP
=
in vitro-Produktion
SR
=
Schlupfrate
d
=
Tag
PBS
=
Phosphat-Buffered-Solution
DT
29,0% TR
IVP
in PBS + 0,3 M Suc
46,3% SR
37,5% SR
24,5% SR
29,0, 39,0 bzw
29,0% TR
IVP
DT
34
Andere Untersucher erreichten durch Kombination von Ethylenglykol mit DMSO gute
Überlebensraten bei der Vitrifikation von Embryonen verschiedener Spezies (ISHIMORI et al.
1992; ISHIMORI et al. 1993; VICENTE u. GARCIA-XIMENEZ 1994; VICENTE u.
VIUDES-DE-CASTRO 1997; LANE et al. 1998). Dabei wurden Ethylenglykol bzw. DMSO
in einer Konzentration von 20-25% eingesetzt.
Eine 40% (= 7,2 M) Ethylenglykol-Lösung erlaubte eine Vitrifikation von Rinderembryonen,
eine Lösung mit 37,5% gewährleistete jedoch keine ausreichende Vitrifikation (DARVELID et
al. 1994). Durch Hinzufügen eines Makromoleküls konnte dies verbessert werden. VAJTA et
al. (1996) hielten eine alleinige Verwendung von Ethylenglykol in hohen Konzentrationen, wie
sie bei der Vitrifikation notwendig ist, für zu toxisch. Dagegen erzielte SOMMERFELD
(1997) nach Vitrifikation von IVP-Rinderembryonen mit 7,2 M Ethylenglykol eine gute in
vitro-Entwicklungsrate.
Eine gute Kryoprotektion von Ethylenglykol konnte auch bei ultraschnellem Gefrieren von
Mäuse- und Rinderembryonen nachgewiesen werden. Hohe in vitro-Überlebensraten wurden
beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Ein-Zell-Mäuseembryonen nach 10 min Equilibrierung in
3 M Ethylenglykol mit 0,25 M Sucrose erreicht (RAYOS et al. 1992). Nach ultraschnellem
Gefrieren von expandierten Mäuseblastozysten waren die Schlupfraten bei Verwendung von
7 M Ethylenglykol im Vergleich zu 7 M Propanediol nach vorausgegangenem Dehydrieren mit
Sucrose deutlich höher (NOWSHARI u. BREM 1998). In vitro produzierte Rinderembryonen
wurden mit 20% Ethylenglykol und 0,3 M Sucrose bzw. Trehalose ultraschnell tiefgefroren
und anschließend direkt übertragen. Nach Transfer von je zwei Embryonen auf einen
Empfänger wurden zwei der vier Empfänger trächtig, und nach in vitro-Kultur lagen die
Schlupfraten bei 63 bzw. 64% (MATSUOKA et al. 1995).
35
2.2.2. Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel
Nicht penetrierende Gefrierschutzmittel dringen nicht in die Zellen ein, sondern üben ihre
Schutzwirkung im extrazellulären Raum aus. Dabei werden sie nur in niedrig molaren
Konzentrationen eingesetzt und sind deshalb auch weniger toxisch als penetrierende
Gefrierschutzmittel (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Diese nicht penetrierenden
Kryoprotektiva werden auch während der Equilibrierungsphase genutzt, um die Dehydration
zu unterstützen, aber auch während der Ausverdünnungsphase, um ein zelluläres Anschwellen
zu begrenzen (FRIEDLER et al. 1988).
Nach MERYMAN (1971) liegt der Einfluß der nicht penetrierenden Kryoprotektiva darin, die
Zellmembranen zu befähigen, gelöste Stoffe unter osmotischen Streß reversibel penetrieren zu
lassen.
SEIDEL (1989) sieht die Wirkung der nicht penetrierenden Kryoprotektiva schon vor Beginn
der Kühlung. Durch die Zugabe von 0,2-0,3 M Sucrose kommt es zu einer Vordehydrierung
und das Umsetzen in flüssigen Stickstoff kann schon bei höheren Temperaturen erfolgen, da
eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens notwendig ist.
Der Einsatz von nicht penetrierenden Kryoprotektiva soll besonders bei großen Kühlraten
effektiv sein, da hier eine schnelle Dehydrierung der Zellen notwendig ist (MERYMAN et al.
1977).
36
2.2.2.1. Sucrose
Sucrose gehört zur Gruppe der nicht penetrierenden Gefrierschutzmittel (physikalischchemische Eigenschaften s. Tab.6). Ein wichtiges Einsatzgebiet der Sucrose liegt im Entfernen
der penetrierenden Gefrierschutzmittel aus den aufgetauten Embryonen. Es kommt zum
Einströmen von Wasser in den Embryo, wenn die extrazelluläre Konzentration des
penetrierenden Kryoprotektivums verringert wird. Dies geschieht beim Umsetzen in eine
hypoosmolare Lösung, z. B. wenn Embryonen, equilibriert in 1,5 M Glycerin, direkt in PBS
(Phosphat-Buffered-Solution) umgesetzt werden. Wasser fließt dann sehr schnell in den
Embryo ein. Durch dieses Anschwellen kann der Embryo geschädigt werden. So lange das
maximal tolerierbare Volumen des Embryos nicht überschritten wird, kommt es jedoch zu
keiner Schädigung. Mäuseblastozysten tolerieren das ca. 2,7-fache ihres isotonischen
Volumens für 30 min bei 23°C (SCHNEIDER u. MAZUR 1984).
Sucrose dient hier als osmotischer Puffer, in dem sie der anfangs hohen intrazellulären
Osmolarität des penetrierenden Kryoprotektivums entgegenwirkt. Durch die Verringerung der
extrazellulären Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums kontrolliert die SucroseLösung den Grad des Anschwellens des Embryos. Das Kryoprotektivum verläßt die Zelle.
Dadurch wird das osmotische Equilibrium aufrechterhalten. Währenddessen verliert der
Embryo Wasser und schrumpft. Beim Gebrauch von Sucrose kann der Embryo bis auf 25%
seines Ausgangsvolumens schrumpfen. Nach dem Umsetzen in physiologisches Medium oder
Kulturmedium erreicht er dann wieder sein ursprüngliches Volumen (SZELL u. SHELTON
1986; VOELKEL u. HU 1992a).
Die Reaktion der Embryonen auf die Sucrose-Lösung (Schrumpfen gefolgt von Reexpansion)
ist ein Zeichen für die normale Funktion der Zellmembran und kann als Indikator für die
Lebensfähigkeit der Embryonen gewertet werden (BIELANSKY et al. 1986).
Besonders häufig wird Sucrose in isomolarer Konzentration beim Ausverdünnen von Glycerin
eingesetzt. So ist z. B. eine 1,12 M Sucrose-Lösung isomolar zu einer 1,5 M Glycerin-Lösung
(SCHNEIDER u. MAZUR 1984)
37
Tab.6: Physikalisch-chemische Eigenschaften nicht penetrierender Kryoprotektiva
Sucrose
Trehalose
Ficoll
PVA
aus einem Glucose- und
Fructose-Molekül
bestehendes Disaccharid;
wirkt nicht reduzierend, da
beide Hydroxylgruppen
durch Glykosidbindungen
blockiert sind 1 (BEYER
Disaccarid, das aus zwei
Glucosebausteinen
besteht und wie Sucrose
nicht zu den
reduzierenden Zuckern
gehört (ARNI 1998)
aus Sucrose und
Epichlorhydrin
hergestelltes,
hydrophiles Polymer 2
WALTER 1984)
Polymerisate der
allgemeinen Formel:
-(CH(OH)-CH2)-n 2
u.WALTER 1984)
C12H22O11
2 (NEUMÜLLER 1987)
C12H22O11•2H2O
entsteht durch
Umesterung des
Polyvinylesters mit
Methanol 1 (BEYER u.
PVP
inertes (reaktionsträges)
Polymer (Wegner 1996)
mit der allgemeinen
Formel: 2
-(CH-CH2)-n
N
O
2
Molekulargewicht:
342,3 2
Schmelzpunkt:
185°C 2
Molekulargewicht:
378,3 2
Schmelzpunkt:
97°C 2
Molekulargewicht:
Molekulargewicht:
70000 (Ficoll 70) bzw. 18000-200000 2
400000 (Ficoll 400) 2
geruchloses, weißes,
kristallines Pulver,
schmeckt sehr süß 2
farblos, süß schmeckend schwach gelbe, nicht
2
ganz klare Flüssigkeit
(Produktinformation Ficoll 400, Fa.
mittleres relatives
Molekulargewicht:
25000 1
Glastemperatur
(Temperatur, bei der ein
amorpher Festkörper aus
handelsübliches PVA ist dem flüssigen in den
ein weißes bis elfenbein- Glaszustand übergeht
farbenes Pulver 2
und umgekehrt): 175°C 2
Sigma, St. Louis, USA)
leicht löslich in Wasser,
wenig löslich in Alkohol,
unlöslich in Ether 2
löslich in Wasser und
heißem Alkohol,
unlöslich in Ether 2
leicht in Wasser löslich,
bildet visköse Lösung, in
den meisten organischen
Lösungsmitteln nicht
löslich 2
weißes, hygroskopisches
Pulver; löst sich in
Wasser unter leicht
saurer Reaktion ebenso
wie in Alkohol gut,
jedoch nicht in Ether 2
38
Glycerin kann stufenweise mit oder ohne Sucrose ausverdünnt werden. Eine Vereinfachung
und zeitliche Verkürzung des Ausverdünnungsprozesses wird durch das Ausverdünnen mit
Sucrose in einem Schritt erreicht (NIEMANN 1983). Dies konnte mit gleich guten oder
besseren Ergebnissen durch Untersuchungen bei Rinderembryonen belegt werden (s. Tab.2).
Die Überlebensraten waren hoch, wenn eine Konzentration von 1,0 M Sucrose zum
Ausverdünnen des Glycerins in einem Schritt verwendet wurde. MERRY et al. (1983) erzielten
nach Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose nach dem Tiefgefrieren von Mäuseembryonen mit
1,0 M Glycerin in vitro-Entwicklungsraten zu expandierten Blastozysten von 60,5%. Beim
Tiefgefrieren mit 1,5 M Glycerin und Ausverdünnen mit 1,0 M Sucrose entwickelten sich
87,0% der frühen Mäuseblastozysten zu expandierten Blastozysten (HERNANDEZLEDEZMA et al. 1988b). DEL CAMPO et al. (1990) erreichten nach Ausverdünnen von
1,5 M Glycerin mit 1,0 M bzw. 0,5 M Sucrose in vitro-Überlebensraten von Rinderembryonen
von 64 bzw. 71%. In Versuchen von SUZUKI et al. (1990) überlebten in vitro 82 bzw. 88%
der Rinderembryonen das Ausverdünnen von 1,4 M Glycerin nach dem Tiefgefrieren mit 0,4
bzw. 0,8 M Sucrose. Bei niedrigeren Konzentrationen sanken auch die Überlebensraten.
MAPLETOFT et al. (1989) untersuchten den Einfluß verschiedener Sucrose-Konzentrationen
auf die in vitro-Überlebensfähigkeit von frisch gewonnenen Mäuseembryonen. Dabei wurde die
Temperatur (20 bzw. 35°C) und die Zeit (10 oder 30 min), die die Embryonen dieser Lösung
ausgesetzt waren, berücksichtigt. Der Einfluß von Temperatur und Zeit auf die
Überlebensfähigkeit der Embryonen war bei einer 0,5 M Sucrose-Lösung nur gering. Bei
Verwendung der 1,0 M Sucrose-Lösung nahmen die Überlebensraten bei Erhöhung der
Temperatur und Verlängerung der Equilibrierungszeit ab. Bei Equilibrierung in 2,0 M Sucrose
wurde die in vitro-Überlebensfähigkeit stark reduziert.
TAKEDA et al. (1987) stellten nach Ausverdünnen des Glycerins aus 8-Zell-Mäuseembryonen
mit zunehmender Sucrose-Konzentration (0,0-1,3 M) auch eine steigende Zahl von Embryonen
mit Schäden der Zona pellucida fest.
Eine weitere Vereinfachung der Methode des Ausverdünnens von Glycerin mit Sucrose wurde
von LEIBO (1983) beschrieben. In der Paillette befindet sich neben der Säule mit dem Embryo
39
im Tiefgefriermedium eine weitere Säule mit Sucrose. So kann das Ausverdünnen durch
Vermischen der beiden Säulen nach dem Auftauen in der Paillette erfolgen. Diese Methode
wird als One-Step-Methode bezeichnet. HOOGENKAMP (1984) und SCHUBERTH (1984)
variierten das Verhältnis von Glycerin und Sucrose in der Paillette und erreichten die besten
Überlebensraten bei Rinderembryonen mit einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:2. CSEH
et al. (1994) benutzten ein Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:9 und erhielten eine
Trächtigkeitsrate von 38% nach Transfer.
Sucrose wird auch zur Dehydration von Embryonen bei Raumtemperatur benutzt (LEHNJENSEN 1984). MASSIP et al. (1987) hielten bei alleiniger Verwendung von Glycerin ein
langsames Kühlen bis -35°C vor dem Umsetzen in flüssigen Stickstoff für notwendig. Durch
Hinzugabe von 0,2-0,3 M Sucrose zur Glycerin-Lösung konnte das Umsetzen bei höheren
Temperaturen und somit früher erfolgen, da die Embryonen durch die Sucrose bereits stark
dehydriert waren und eine geringere Dehydration während des langsamen Kühlens benötigten
(SEIDEL 1989). Nach LEIBO (1989) ist eine Dehydration durch Sucrose alleine nicht
ausreichend für das Überleben der Embryonen, da Sucrose alleine keine ausreichende
Kryoprotektion leistet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Rinder- und Mäuseembryonen wird die Fähigkeit
von Sucrose zur Dehydration von Zellen ausgenutzt. Dabei wird Sucrose in einer
Konzentration von 0,25 M in Kombination mit 3 M Ethylenglykol (RAYOS et al. 1992a;
RAYOS et al. 1992b) und in einer Konzentration von 0,5 M mit 3,5 M Glycerin (THOMAS et
al. 1989) eingesetzt. Nach dem Auftauen wird abermals in Sucrose ausverdünnt.
Sucrose findet als Bestandteil in Vitrifikationslösungen eine weitere Verwendung. Von KASAI
et al. (1990) und KASAI (1996) wurde eine Lösung beschrieben, die Agentien aus drei
verschiedenen Kategorien enthält: Ethylenglykol als penetrierendes Kryoprotektivum, das
Makromolekül Ficoll und 0,5 M Sucrose als nicht penetrierende Komponenten. Sucrose
reduziert in Kombination mit Ficoll die Toxizität der Lösung, da es ein schnelles Schrumpfen
der Embryonen und eine Reduktion der Ethylenglykol-Konzentration in den Zellen verursacht.
40
TADA et al. (1993) berichteten von einer Vitrifikationsmethode mit den beiden penetrierenden
Kryoprotektiva DMSO und Propanediol (je 2,75 M). Durch Zugabe von Sucrose bzw.
Raffinose (einem weiteren Disaccharid) konnte die Überlebensfähigkeit der 2-ZellMäuseembryonen gesteigert werden. SAITO et al. (1994) erhielten durch Zugabe von Sucrose
und Dextrose zu einer Vitrifikationslösung bestehend aus Glycerin und Ethylenglykol höhere
Überlebensraten nach Vitrifikation von IVP-Rinderblastozysten. KUWAYAMA et al. (1994a)
und KUWAYAMA (1995) fügten einer Vitrifikationslösung aus Glycerin und Ethylenglykol
Sucrose und Eigelb hinzu. Dadurch wurden hohe in vitro-Überlebensraten von in vitro
produzierten Rinderblastozysten (73%) nach Ausverdünnen in der Paillette erreicht.
41
2.2.2.2. Trehalose
Trehalose (s. Tab.6) ist neben der Sucrose ein weiteres Disaccharid, das in der
Kryokonservierung eingesetzt wird.
SMORAG et al. (1990) untersuchten den Einfluß von Sucrose und Trehalose auf die
Überlebensfähigkeit von Zwei-Zell-Kaninchenembryonen. Dabei waren die in vitroEntwicklungsraten zu Morula- und Blastozystenstadien sowohl bei 20°C wie auch 38°C bei
Verwendung von 1,45 M Trehalose deutlich höher (53,2 gegenüber 15,9% bzw. 55,5
gegenüber 0,0%) als bei Verwendung von 2,0 M Sucrose. Dies wurde auf einen besseren
stabilisierenden Einfluß der Trehalose auf die Zellmembranen zurückgeführt, der jedoch
spezies- und zellstadiumabhängig zu sein scheint.
Bei unreifen Rinderoozyten wurde eine Beeinträchtigung der Entwicklungsfähigkeit nach dem
Tiefgefrieren durch Trehalose und Sucrose beobachtet. Nur sehr wenige (6%) Oozyten
konnten nach Auftauen in vitro gereift werden (NIEMANN 1991a).
Bei der Vitrifikation von unreifen Rinderoozyten konnte die Konzentration von Trehalose ohne
Einfluß auf die Überlebensfähigkeit bis auf 1,0 M erhöht werden, während Sucrose in dieser
Konzentration zu einem erhöhten Anteil degenerierter Oozyten führte (ARAV et al. 1991).
Trehalose wurde als Komponente in der Vitrifikationslösung bei der Vitrifikation von IVFRinderblastozysten verwendet. Mit 40% Ethylenglykol, 0,3 M Trehalose und 20%
Polyvinylpyrrolidon konnten Schlupfraten von 43% erreicht werden (SAHA et al. 1996).
KRAG et al. (1985) setzten Sucrose oder Trehalose in Kombination mit Glycerin bei
Mäuseembryonen und MATSUOKA et al. (1995) in Kombination mit Ethylenglykol bei in
vitro produzierten Rinderembryonen ein. Es konnten keine Unterschiede bei den
Überlebensraten beim Gebrauch von Sucrose oder Trehalose festgestellt werden. Mit der
Kombination DMSO und Trehalose konnte ROBERTSON et al. (1989) beim ultraschnellen
Tiefgefrieren von Mäuseembryonen bessere Resultate erzielen als mit der Kombination DMSO
und Sucrose.
42
2.2.2.3. Ficoll
Ficoll ist ein nicht organisches Makromolekül (s. Tab.6). Es erlaubt eine Reduktion der
Konzentration des penetrierenden Kryoprotektivums bei der Vitrifikation, was toxische und
osmotische Effekte verringert. Durch Hinzugabe von Ficoll kann die für die Vitrifikation von in
vitro
produzierten
Rinderembryonen
benötigte
Konzentration
eines
penetrierenden
Kryoprotektivums gesenkt werden. Eine 40% v/v Ethylenglykol-Lösung erlaubt eine
Vitrifikation. Eine Lösung mit einer Ethylenglykol-Konzentration von 37,5% v/v erwies sich
für eine vollständige Vitrifikation als nicht ausreichend. Wird der Lösung jedoch ein
Makromolekül, z. B. 15% Ficoll hinzugefügt, ist bereits mit einer 37,5% v/v EthylenglykolLösung eine Vitrifikation möglich (DARVELID et al. 1984).
KASAI et al. (1990) und PALASZ et al. (1997) zeigten, daß durch Ficoll eine Rekristallisation
während des Erwärmens verhindert wird. Ficoll wurde besonders bei der Vitrifikation in
Kombination mit Ethylenglykol und Sucrose zuerst von KASAI et al. (1990) bei
Mäuseembryonen, später auch bei Rinderembryonen eingesetzt (MIYAKE et al. 1993; ZHU et
al. 1993; KASAI 1996; PALASZ et al. 1997). Dabei wurden Konzentrationen von 15-30%
verwendet.
Auch beim ultraschnellen Tiefgefrieren können Makromoleküle wie Ficoll (oder auch PVP
oder PVA) Serum erfolgreich ersetzen. Jedes Makromolekül beeinflußt die Penetrationsrate
des Kryoprotektivums anders, so daß unterschiedliche Equilibrierungszeiten gewählt werden
müssen (GUTIERREZ et al. 1993b).
43
2.2.2.4. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyvinylalkohol (PVA)
PVP und PVA sind Makromoleküle und gehören ebenfalls zu den nicht penetrierenden
Kryoprotektiva (s. Tab.6).
WHITTINGHAM (1971) hielt PVP für ein wirksames Kryoprotektivum beim Tiefgefrieren
von Mäuseembryonen. Er erzielte bei Verwendung von 8-Zell-Embryonen und frühen
Blastozysten Entwicklungsraten zum Blastozystenstadium von 69,1%. Bei anderen Autoren
galt PVP wegen seiner Toxizität in hohen Konzentrationen in Embryo-KryoprotektivumMischungen als nicht nutzbar (WILMUT 1972; FRIEDLER et al. 1988).
4% PVP bzw. 4% PVA wurden als Ersatz für eine Serumzugabe als chemisch definierte
Makromoleküle beim Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 10% Glycerin verwendet. Nach
schrittweisem Ausverdünnen mit Sucrose lag die Trächtigkeitsrate nach Zugabe von PVA und
PVP mit 31 bzw. 25% deutlich unter denen bei Verwendung von FCS (fetal calf serum) und
BSA (bovine serum albumin). Hier wurden Trächtigkeitsraten von 57 bzw. 58% erreicht. Die
Handhabung der Embryonen, die mit PVA und PVP tiefgefroren wurden, war schwieriger, da
diese leichter an den Pipetten klebten. Dadurch kam es beim Herausfließen der Embryonen aus
den Pailletten, besonders bei Verwendung von PVP, zu Verlusten oder Schäden der
Embryonen (SEIDEL et al. 1990).
Beim Einsatz von PVA statt Serum neben Ethylenglykol beim kontrollierten Tiefgefrieren und
bei der Vitrifikation beobachteten SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) ein Absinken der
Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen. Bei der Vitrifikation von in vitro
produzierten Rinderembryonen wurden neben 40% Ethylenglykol und 11,3% Trehalose PVP
in verschiedenen Konzentrationen (0-12%) eingesetzt. Dabei wurden bei Verwendung von
12% PVP die höchsten Entwicklungs- und Schlupfraten erzielt. Von Makromolekülen wie
PVP wird angenommen, daß sie ihre Schutzwirkung während der Vitrifikation und dem
Auftauen entfalten, obwohl sie die embryonalen Zellen nicht penetrieren können. Vermutlich
bedecken sie empfindliche Membranen und verhindern so die Denaturierung durch
konzentrierte Salzlösungen, verzögern das Eiswachstum und verringern die Eiskristallbildung,
da sie Wasser binden können (SAHA et al. 1996).
44
KOBAYASHI et al. (1994) setzten PVP bei der Kryokonservierung der extrem
kälteempfindlichen Schweineembryonen ein. Bei Verwendung von 7% PVP in Kombination
mit 8,0 M Ethylenglykol bei der Vitrifikation überlebten 41, 61 bzw. 23% der Blastozysten,
der expandierten bzw. der geschlüpften Blastozysten nach 24 h in vitro-Kultur.
45
2.3. Tiefgefrierverfahren
Bei den Tiefgefrierverfahren werden kontrollierte Tiefgefrierverfahren, ultraschnelles
Tiefgefrieren und die Vitrifikation unterschieden. Beim ultraschnellen Tiefgefrieren und bei der
Vitrifikation handelt es sich um eine Nonequilibrium-Kryokonservierung. Der Embryo wird
dem Kryoprotektivum nur für kurze Zeit ausgesetzt, so daß nicht genügend Zeit bleibt, ein
Equilibrium zwischen intra- und extrazellulärer Lösung zu erreichen. Die Embryonen werden
vor der Kühlung dehydriert, indem man sie einer Mischung aus penetrierenden und nicht
penetrierenden Kryoprotektiva aussetzt (LEIBO 1989).
Zunächst wurden Glasampullen zum Verpacken der Embryonen verwendet, die später dann
durch Plastikpailletten ersetzt wurden. Die Überlebensfähigkeit der Embryonen in
Plastikpailletten entsprachen denen in Glasampullen (BIELANSKY et al. 1985). Die Pailletten
erwiesen sich aber als geeigneter für Tiefgefrieren, Lagerung und Transfer von Embryonen
(MASSIP et al. 1982).
Dulbeccos Phosphat Buffered Saline (DPBS), beschrieben von WHITTINGHAM (1971), wird
meist als Basismedium für das Tiefgefrieren verwendet. Es werden häufig 20% Blutserum oder
BSA (bovines serum albumin) hinzugefügt (MOORE u. BILTON 1977; WILLADSEN 1980).
46
2.3.1. Konventionelle Gefrierverfahren
Bei konventionellen Gefrierverfahren werden Tiefgefriermedium und Embryo mit festgelegten
Raten heruntergekühlt. Dabei wird versucht, Schäden durch intrazelluläres Gefrieren oder
Lösungseffekte zu vermeiden, indem man möglichst optimale Kühlraten verwendet. Es werden
programmierbare Gefriergeräte verwendet, bei denen die gewünschten Kühlraten eingestellt
werden können.
Beim konventionellen Gefrierverfahren wird die Kristallisation des extrazellulären Mediums bei
-6 bzw. -7°C herbeigeführt. Dieser Vorgang wird Seeding genannt und soll die schädliche
Unterkühlung der Embryonen (Supercooling) verhindern. Die Seeding-Temperatur wird
anschließend noch 2-5 min gehalten, um ein osmotisches Equilibrium zu erreichen. Der
Gefrierpunkt der Tiefgefriermedien liegt bei ca. 3°C. Eine „spontane“ Kristallisation der
Tiefgefriermedien tritt aber meist erst 10°C unterhalb des Gefrierpunktes auf. Durch
Freisetzung von Wärme würde es zum Anstieg der Temperatur und nachfolgend zu einem
rapiden Temperaturabfall kommen. Dies würde zum Absterben der Embryonen infolge
intrazellulärer Eisbildung führen (WILLADSEN 1980; PAVEL 1985; SEIDEL 1989;
NIEMANN 1991; STREICHER 1998).
SOMMERFELD (1997) konnte eine Abhängigkeit der Seeding-Temperatur von der
Konzentration des Kryoprotektivums nachweisen. Bei einer Ethylenglykol-Konzentration von
3,6 M sank die Seeding-Temperatur auf -11°C. Bei einer höheren Temperatur wurde die
Kristallisation nicht aufrechterhalten.
Die Verwendung von Pailletten erwies sich gegenüber der von Ampullen auch für das Seeding
als geeigneter. Durch den kleinen Durchmesser der Pailletten, die dünnere Wand und die
geringere Flüssigkeitsmenge ist der manuelle Seedingprozeß genauer und kürzer durchführbar.
Dies erhöht die Überlebenschancen der Embryonen (NIEMANN 1983). Das Auslösen des
Seeding am Meniskus der Säule mit dem Embryo und nicht an der Säule selbst, stellte sich als
vorteilhaft heraus. Dadurch kann eine Schädigung des Embryos durch thermischen Streß
verhindert werden (DE PAZ et al. 1994).
47
Ein langsames Herunterkühlen des Tiefgefriermediums auf die Seeding-Temperatur ist nicht
notwendig. Ein direktes Einsetzen und sofortiges Seeding bewirken eine Verkürzung des
Tiefgefrierprogramms ohne nachteilige Auswirkungen für den Embryo (WILLADSEN 1980;
SCHNEIDER u. MAZUR 1984; PAVEL 1985).
2.3.1.1. Langsames Tiefgefrieren
Beim langsamen Tiefgefrieren (s. Tab.7) wird mit niedrigen Kühlraten von 0,1-0,3°C auf
Temperaturen zwischen -60 und -120°C heruntergekühlt (LEIBO et al. 1974; FALGE et al.
1982; NIEMANN 1983; LEHN-JENSEN 1984). Das erste erfolgreiche Überleben von
Säugetierembryonen (Mäuse) wurde von WHITTINGHAM et al. (1972) und WILMUT
(1972) erreicht. Man wählte niedrige Kühlraten, damit die Zelle das osmotische Equilibrium
mit dem extrazellulären Raum durch Dehydration aufrechterhalten konnte. Intrazelluläres
Gefrieren wurde so vermieden (MAZUR 1966; MAZUR u. SCHNEIDER 1986). Das
nachfolgende Auftauen wurde mit Raten von 2-10°C/min durchgeführt (NIEMANN 1991).
Wenn die Überlebensrate gegen die Kühlrate aufgetragen wird, zeigt sich ein umgekehrtes „U“
(s. Abb.2). Die Überlebensraten sind bei niedrigeren Kühlraten geringer. Sie steigen mit
zunehmender Kühlrate an und erreichen ein Maximum bei einer mittleren Rate. Beim weiteren
Anstieg der Kühlraten sinken die Überlebensraten wieder. Die optimale Rate ist die, die
langsam genug ist, um der Entstehung von intrazellulärem Eis vorzubeugen aber schnell genug,
um die Zeitdauer, die die Zellen den Lösungseffekten ausgesetzt sind, zu minimieren (MAZUR
1970; MAZUR 1980).
2.3.1.2. Schnelles Tiefgefrieren
Mit dem 2-stufigen oder schnellen Tiefgefrierverfahren fand man eine Methode, die weniger
zeitaufwendig und damit praktikabler als das langsame Tiefgefrieren war. WOOD u.
48
FARRANT (1980) waren die ersten, die berichteten, daß Mäuseembryonen langsames Kühlen
auf -20 oder -25°C und anschließendes Umsetzen in flüssigen Stickstoff überlebten. LEHNJENSEN u. GREVE (1980) stellten fest, daß die Überlebensraten von Rinderblastozysten,
tiefgefroren mit DMSO, nach schnellem, 2-stufigem Tiefgefrieren denen nach langsamem,
konventionellem Tiefgefrieren entsprachen. Beim langsamen Kühlen bis zum Umsetzen in
flüssigen Stickstoff können Embryonen Zellwasser an das noch nicht vollständig gefrorene,
extrazelluläre Medium abgeben (NIEMANN 1982). Beim Erreichen von -42°C ist ca. 74% der
Lösung kristallisiert. Erfolgt die weitere Kühlung bis -150°C schnell, so nimmt die Viskosität
in der restlichen Flüssigkeit schnell zu. Eine zusätzliche Eisbildung wird vermieden. Es kommt
zur Vitrifikation der verbleibenden Flüssigkeit (RALL 1981; RALL et al. 1984).
In zahlreichen Untersuchungen (s. Tab.7) wurde eine optimale Umsetztemperatur zwischen
-30 und -35°C festgestellt (BILTON 1980; LEHN-JENSEN u. GREVE 1982; FARRAND et
al. 1985; SCHIEWE et al. 1985). Rinderembryonen können ein Umsetzen bei -20 oder -25°C
überleben, jedoch sind die Überlebensraten reduziert, außer die Embryonen werden durch
Zugabe von Sucrose vor dem Tiefgefrieren dehydriert. Mit einer Mischung aus Glycerin und
Sucrose erreichten MASSIP et al. (1987) und NIBART u. HUMBLOT (1997) bei einer
Umsetztemperatur von -25°C gute Trächtigkeitsraten. Die Embryonen wurden bei
Raumtemperatur dehydriert, daher konnte das Kühlen bei höheren Temperaturen beendet
werden. Das Schicksal der Embryonen ist bei einer Umsetztemperatur zwischen -20 und -40°C
abhängig davon, ob nachfolgendes Auftauen schnell genug ist, um eine Rekristallisation zu
vermeiden (MAZUR 1990).
WOOD u. FARRANT (1980) und SMORAG et al. (1981) sahen eine Haltezeit bei der
Umsetztemperatur von 30-40 min als erforderlich an. FALGE et al. (1982) und NOHNER
(1986) zeigten, daß eine solche Haltezeit nicht notwendig ist und erreichten bei direktem
Umsetzen gleich gute bzw. bessere Überlebensraten. Ein direktes Einsetzen der Embryonen bei
einer Umsetztemperatur von -30°C war nicht so erfolgreich (BOUYSSOU u. CHUPIN 1982).
49
Tab.7: Überlebensraten nach langsamem und schnellem Tiefgefrieren von Rinderembryonen
Autoren
BILTON
(1980)
LEHNJENSEN u.
GREVE
(1980)
RENARD et
al. (1981b)
Entwicklungs
-stadium
d7-7½Embryonen
d6-7Blastozysten
Kryoprotektivum
Kühlrate
(°C/min) nach
Seeding
-0.3
Umsetztemperatur
(°C)
-36
0/4 (2/4)
-0.3
-48
1/4 (3/4)
-0.3 bis -60°C,
-1,0 bis-100°C
-0,3 bis -36°C,
-0,1 bis -60°C
-100
3/8
-60
-0,3 bis -30°C,
-0,1 bis -40°C
-40
1,0 M Glycerin + -0,3 bis -30°C,
0,5 M DMSO
-0,1 bis -40°C
1,5 M DMSO
-0,3
-40
73,0% (42,0%) ÜR nach 12 h IVC (TR),
Auftauen mit -4 bzw.
-8°C/min bis -10°C bei -60
67,0% (75,0%) bzw. -40°C Umsetztemperatur, dann in 20°C
Wasserbad
44,0%
-60
39,7% ÜR
Auftauen mit 12°C/min,
-0,3
-30
31,7% ÜR
-0,3
-30 (15 min
Haltezeit
28,0% ÜR
Auftauen in 37°C Wasserbad,
ÜR jeweils nach 8-12 h IVC
nach 48 h IVC
-1,3
-30 (30 min
Haltezeit)
18,0% ÜR
-30
25,0% ÜR
1,0 M Glycerin
1,5 M DMSO
1,5 M DMSO
Blastozysten
BOUYSSOU Blastozysten
u. CHUPIN
(1982)
1,4 M Glycerin
Einsetzen bei 30°C
Überlebensraten
Bemerkungen
ÜR nach 60 h IVC,
mit 12°C/min (360°C/min)
aufgetaut
50
ELSDEN et
al. (1982)
d6-8Embryonen
1,3 M Glycerin
-0,3
-0,3;
LEHNJENSEN u.
GREVE
(1982)
FRANKS et
al. (1985)
LEHNJENSEN
(1986)
LEHNJENSEN
(1986)
NOHNER
(1986)
d6½-7½Embryonen
1,4 M Glycerin
-0,3 bis-35°C,
dann -0,1°C bis
-38°C
-0,3
Blastozysten
1,5 M DMSO o.
1,4 M Glycerin
-0,3 bis -35°C,
-0,1 bis -38°C
kompakte
Morulae expandierte
Blastozysten
kompakte
Morulae expandierte
Blastozysten
d7Embryonen
-35 (30 min
Haltezeit)
-35
1/13 bzw 3/13
Trächtigkeiten,
Auftauen bei 25 bzw. 35°C
-38
6 /14 bzw.6/10
-15
-25
-35
-60
-38
11,0%
ÜR (TR),
71,0% (50,0%) Auftauen in 37°C Wasserbad,
78,0% (59,0%)
8,0%
14,6% ÜR
nach 24 h IVC
3/12 bzw. 3/12
-10 bis -30°C,
30 min Halten
-0,3 bis -36°C,
-0,1 bis -60°C
-30
7,3% ÜR
-60
22,0% TR
Auftaurate 4°C/min von -50
bis -10°C, dann in 20°C
Wasserbad
1,4 M Glycerin
-0,3
-0,3
0,0% ÜR
40,0% ÜR
50,0% ÜR
8,0% ÜR
43,9 bzw.
33,8% TR
Auftauen in 37°C Wasserbad,
ÜR nach 12-24 h IVC
1,0 M Glycerin
-15
-25
-35
-60
-32
1,5 M DMSO
direkt oder nach 30 min
Haltezeit bei -32°C
51
MASSIP et
al. (1987)
d6½-8Embryonen
HOCHI et al. Morulae u.
(1996)
Blastozysten
1,36 M Glycerin
-0,3-(-0,6)
1,36 M Glycerin
+ 0,25 M Sucrose
1,5 M EG
-0,3
-25
-35
12,5% TR
41,7% TR
-25
-35
-35
-0,5
-32
51,8% TR
18,2% TR
42,1% (25,9%)
SR;
19,0% (4,9%)
SR;
8,9% (1,9%)
SR;
69,6% TR
1,5 M Glycerin + -0,3
0,25 M Sucrose
-25
48,5% TR
1,5 EG
-35
50,5% TR
-0,9
-1,5
LOONEY et
al. (1996)
NIBART u.
HUMBLOT
(1997)
d6½-7½Embryonen
d7Embryonen
1,4 M Glycerin
Abkürzungen:
ÜR
=
Überlebensraten
TR
=
Trächtigkeitsraten
SR
=
Schlupfraten
IVC
=
in vitro-Kultur
IVP
=
in vitro-Produktion
EG
=
Ethylenglykol
d
=
Tag
-0,3-(-0,5)
Auftauen in 20°C Wasserbad
IVP-Embryonen,
SR nach Auftauen mit
>1000°C/min (250°C/min)
Auftauen für 10s in Luft,
dann in 27°C Wasserbad
Auftauen in Luft für 10s,
dann im 20-25°C Wasserbad
52
2.3.2. Vitrifikation
Die Vitrifikation ist ein physikalischer Prozeß, bei dem eine hochkonzentrierte KryoprotektivaLösung durch sehr schnelles Kühlen zunehmend viskös wird und in einen stabilen, amorphen
und glasartigen Zustand übergeht. Kennzeichen einer erfolgreichen Vitrifikation ist die fehlende
Eiskristallbildung im Vitrifikationsmedium. Das Vitrifikationsmedium bleibt auch nach dem
Eintauchen in flüssigen Stickstoff durch den glasartigen Zustand durchsichtig. Die
Eigenschaften der flüssigen Phase gehen in die solide Phase über. Die molekulare und ionische
Verteilung der flüssigen Phase bleibt erhalten. Die Lösungen werden nicht konzentrierter, da
sie nicht durch kristallines Eis getrennt werden. So können neben Schäden durch intrazelluläres
Gefrieren auch Schäden durch Lösungseffekte vermieden werden (FAHY et al. 1984;
FRIEDLER et al. 1988; NIEMANN 1991a; DOBRINSKY 1996; STREICHER 1998).
Zur Vitrifikation ist kein programmierbares Gefriergerät notwendig, da die schnelle Kühlung
(bis -2000°C/min) durch direktes Eintauchen in flüssigen Stickstoff erreicht wird. Durch
kontrollierte Equilibrierung in hoch konzentrierten Lösungen sind die Zellen schon vor dem
Abkühlen dehydriert. Die Dauer der Kryokonservierung kann dadurch verringert werden, da
Seeding und langsames Kühlen zur Dehydrierung entfallen. Sowohl bei der Equilibrierung wie
auch beim Ausverdünnen ist die Toxizität der hoch konzentrierten Kryoprotektiva bei
Raumtemperatur das Haupthindernis bei der Vitrifikation (FRIEDLER et al. 1988; DE
LEEUW et al. 1991; ISHIMORI et al. 1992; RALL 1992).
Es wird die Konzentration des Kryoprotektivums benötigt, die nicht toxisch für die Embryonen
ist. Der Gebrauch von Mischungen ist dabei vorteilhaft, da die vitrifizierenden Eigenschaften
eines Kryoprotektivums mit der niedrigeren Toxizität eines anderen Gefrierschutzmittels
kombiniert werden (MASSIP et al. 1987).
Die erste erfolgreiche Vitrifikation von Mäuseembryonen wurde von RALL und FAHY (1985)
beschrieben. Sie verwendeten als Vitrifikationslösung eine Mischung aus DMSO, Acetamid,
Propanediol und Polyethylenglykol und erreichten nach 48 h in vitro-Kultur eine
53
Entwicklungsrate von 87,8%. MASSIP et al. (1987) gebrauchten bei Rinderembryonen eine
Vitrifikationslösung bestehend aus Glycerin und Propanediol (38% Trächtigkeitsrate).
Neben der Kombination der Kryoprotektiva hat die Anpassungszeit der Embryonen in der
Vitrifikationslösung und die Temperatur, bei der die Equilibrierung durchgeführt wird, einen
großen Einfluß auf den Erfolg der Vitrifikation. Hierbei kann man die Toxizität der
Kryoprotektiva kontrollieren, in dem man die Equilibrierungstemperatur senkt und die
Expositionsdauer der Embryonen in der Vitrifikationslösung verkürzt. Die Embryonen werden
dabei zunächst in eine weniger hoch konzentrierte Equilibrierungslösung und dann für kurze
Zeit
(wenige Sekunden bis 0,5 min) bei niedrigen Temperaturen (4°C) in eine
hochkonzentrierte Vitrifikationslösung gegeben (FRIEDLER et al. 1988; NIEMANN u.
MEINECKE 1993). SAHA et al. (1997) untersuchten den Einfluß der Equilibrierungsschritte
bei der Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen, in dem sie die Embryonen in
einem oder in drei Schritten in der Vitrifikationslösung equilibrierten. Die Ergebnisse zeigten,
daß bei drei Equilibrierungsschritten gegenüber einem Equilibrierungsschritt die Schlupfraten
der Embryonen deutlich verbessert wurden. Die Überlebensraten nach Auftauen sind in Tabelle
8 aufgeführt.
FAHNING u. GARCIA (1992) und ALI u. SHELTON (1993a) hielten eine komplette
Equilibrierung für eine gute Kryoprotektion nicht notwendig. Die Expositionsdauer war somit
kurz und die notwendige Dehydration wurde durch Hinzufügen eines nicht penetrierenden
Kryoprotektivums wie Sucrose herbeigeführt.
KASAI et al. (1990) verwendeten erstmals Sucrose als Bestandteil einer Vitrifikationslösung
für Mäuseembryonen, die aus 40% Ethylenglykol, 30% Ficoll und 0,5 M Sucrose bestand.
Ethylenglykol penetriert die Zellen ausreichend in kurzer Zeit. Dadurch kann die Toxizität auch
beim Ausverdünnen der Embryonen gesenkt werden. Dies stellte eine Vereinfachung der
Vitrifikation mit hohen Überlebensraten da. Die Equilibrierung wurde in einem Schritt von 2
bzw. 5 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Es konnten Entwicklungsraten zu expandierten
Blastozysten von 97 bzw. 98% erreicht werden.
54
Tab.8: Überlebensraten von Embryonen verschiedener Spezies nach Vitrifikation
Autoren
Spezies Vitrifikationslösung
Equilibrierungsverfahren
2 Schritte,
1.Schritt: in 50% VS
Ausverdünnungs- Überlebensraten
verfahren
2 Schritte
39,0% TR
mit 0,5 M Suc
Bemerkungen
ISHIMORI et
al. (1993)
Rind
25% EG +
25% DMSO
TACHIKAWA
et al. (1993)
Rind
40% EG bzw. Gly
+ 30% Ficoll
+ 0,5 M Suc
1 Schritt bei
Raumtemperatur
2 Schritte
mit 0,5 M Suc
80,0 bzw. 50,0% IVP-Embryonen
TR
AGCA et al.
(1994)
Rind
25% Gly + 25% EG
4 Schritte
mit Suc
63,0% TR
IVP-Embryonen,
bilateraler
Zwillingstransfer
MAHMOUDZADEH et al.
(1995)
Rind
40% EG+
18% Ficoll +
10,26% Suc
3 Schritte,
2.Schritt: 10% Gly +
20% EG,
5 min bei 27°C
2 Schritte,
1. Schritt: 1 min in
EFS
2 Schritte
mit 0,25 M Suc
17,0, 38,0
bzw.69,0% SR
DELVAL et al.
(1996)
Rind
2 Schritte,
1.Schritt: 20% EG +
0,4% BSA
direkt in PBS
65,0% TR
PALASZ et al.
(1996)
Rind
VS 2 ( 40% EG +
18% Ficoll +
0,3 M Suc +
0,4% BSA)
40% EG +
0,3 M Suc
SR für kompakte
Morulae,
Blastozysten u.
expandierte
Blastozysten; IVPEmbryonen
Zwillingstransfer
2 Schritte,
1. Schritt: 1,5 M EG
2 Schritte
mit 0,5 M Suc
36,3% SR
IVP-Embryonen,
SR nach 72 h IVC
55
SAHA et al.
(1996)
Rind
VAJTA et al.
(1996)
Rind
MARTINEZ et
al. (1998)
Rind
VS 4 (40% EG +
11,3% Trehalose +
12% PVP)
25% EG +
25% DMSO
3 Schritte
60,0 bzw. 0,0%
SR
IVP-Embryonen
68,0% SR
IVP-Embryonen
25% EG + 25% Gly
3 Schritte
4 Schritte mit Suc, 59,6% SR
IVP-Embryonen
40% EG +
18% Ficoll+
0,3 M Suc
20% EG +
20% DMSO
2 Schritte
2 Schritte mit
0,5 M Suc
57,7% SR
2 Schritte,
1. Schritt: 10% EG
2. Schritt:
+ 10% DMSO
in Paillette
mit 0,2 M Suc
64,0% TR
2 Schritte
mit 1 M Suc
88,2% ÜR
1 min bei 22°C in
50% VS, dann 20 sec
bei 4°C in 100% VS
direkt in Paillette,
5 min bei 5 bzw.
20°C
direkt in PBS
LEWIS et al.
(1999)
Rind
ALI u.
SHELTON
(1993a)
DE PAZ et al.
(1994)
Schaf
VS 11 (6.0 M EG +
1,8 M Gly)
2 Schritte: Equi. in 30
und 100% VS
Schaf
25% Gly +
25% PROH
2 Schritte,
2 Schritte
1.Schritt: 10% Gly +
mit 1M Suc
20% PROH (18-20°C)
12,0 bzw. 19,0% für Morulae bzw.
ÜR
Blastozysten
TRALDI et al.
(1999)
Ziege,
Schaf
25% Gly + 25% EG
3 Schritte
1. Schritt: 10% Gly,
5 min
60,0 bzw. 41,0% für Ziege bzw.
ÜR,
Schaf,
30 bzw. 9% TR IVP-Embryonen
2 Schritte
mit 1,7 M
Galactose
IVP-Embryonen,
OPS-Methode,
nur wenige
Transfers
56
KASAI et al.
(1990)
Maus
40% EG +
30% Ficoll +
0,5 M Suc
1 Schritt, 2-5 min bei
Raumtemp.
3 Schritte mit
0,5 M Suc
VALDEZ et al.
(1992)
Maus
20% EG +
20% DMSO +
1,3-Butanediol
in 2 Schritten,
1. Schritt: 50% VS,
2 Schritte
54,2% TR
mit 1 M Trehalose
MIYAKE et al.
(1993)
Maus
40% EG +
18% Ficoll +
0,3 M Suc
ZHU et al.
(1996)
Maus
40% EG +
18% Ficoll +
0,3 M Suc
98,0% ER
Entwicklungsrate
(ER) zu
expandierten
Blastozysten.
1 Schritt
1 Schritt, 2-5 min bei
20°C
2 Schritte
mit 0,5 M Suc
45,0% TR
43,0 bzw. 56,0% TR für Morulae u.
TR
Blastozysten
1 Schritt: 0,5 o. 2 min
in VS
2 Schritte
mit 0,5 M Suc
51,0 bzw. 29,0% ÜR nach 24 h
ÜR,
IVC,
2 Schritte: in 20% EG,
in VS
46,0% ÜR
Abkürzungen:
EG
SR
OPS
Suc
VS
TR
ÜR
Gly
=
=
=
=
=
=
=
=
Ethylenglykol
Schlupfrate
open pulled straw-Methode
Sucrose
Vitrifikationslösung
Trächtigkeitsrate
Überlebensrate
Glycerin
IVC =
PROH =
BSA =
PBS =
EFS =
OPS =
IVP =
in vitro-Kultur
Propanediol
bovine serum albumin
phosphate buffered saline
Ethylenglykol-Ficoll-Sucrose-Lösung
Open pulled straw (-Methode)
in vitro-Produktion
57
Dieses Ergebnis wurde durch weitere Untersuchungen (MAHMOUDZADEH et al. 1993;
MIYAKE et al. 1993; MAHMOUDZADEH et al. 1995) bestätigt.
Der Zeitaufwand bei der Vitrifikation ist erheblich geringer als beim kontrollierten
Tiefgefrieren. Zahlreiche Untersucher führten einen Vergleich der Überlebensraten zwischen
Vitrifikation und konventionellem Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit unterschiedlichen
Ergebnissen durch (s. Tab.9).
In vitro produzierte Embryonen zeigen eine größere Kältesensibilität als in vivo gewonnenen
Embryonen. In zahlreichen Untersuchungen (s. Tab.9) waren die Überlebensraten nach
Vitrifikation von in vitro produzierten Embryonen denen nach konventionellem Tiefgefrieren
dieser Embryonen überlegen. Diese Beobachtungen unterstreichen die Annahme, daß bei der
Vitrifikation die Kältesensibilität der in vitro produzierten Embryonen besser überwunden wird
(AGCA et al. 1995; NIEMANN 1995).
DARVELID et al. (1994) verglichen die Ultrastruktur der embryonalen Zellen bei in vivo
gewonnenen und in vitro produzierten Rinderembryonen. Elektronenmikroskopisch wurden
nach Vitrifikation und Auftauen bei in vivo gewonnenen Embryonen osmotische
Veränderungen an der Ultrastruktur der Zellen festgestellt. Bei in vitro produzierten
Embryonen waren die Veränderungen der zellulären Ultrastruktur nach Vitrifikation und
Auftauen geringer. Die Überlebensraten von in vivo gewonnenen und in vitro produzierten
Embryonen waren jedoch nach 24 h in vitro-Kultur ähnlich. KUWAYAMA et al. (1994b)
verglichen die Ultrastruktur von in vitro produzierten Rinderembryonen nach 2-stufiger und
16-stufiger Equilibrierung. Sie beobachteten bei der 16-stufigen Methode geringere
ultrastrukturelle Schäden an den Plasmamembranen. TACHIKAWA et al. (1993) berichteten
über die erfolgreiche Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen mit einer Lösung
aus Ethylenglykol oder Glycerin in Kombination mit Ficoll und Sucrose in einem
Equilibrierungsschritt
bei
Raumtemperatur.
Die
Anwendung
der
gleichen
Vitrifikationsmethode wie bei in vivo gewonnenen Embryonen hielten MASSIP et al. (1995a)
bei in vitro produzierten Embryonen für die Ursache niedriger Überlebensraten. Daher
58
empfahlen sie eine Erhöhung der Zahl der Equilibrierungsschritte und die Anpassung von Zeit
und Temperatur der Equilibrierung. VAJTA et al. (1996) wendeten eine 2-stufige
Equilibrierung bei in vitro produzierten Rinderembryonen erfolgreich an. Im zweiten Schritt
wurden die Embryonen einer Vitrifikationslösung (25% Ethylenglykol und 25% DMSO) für
nur 20 sec bei 4°C ausgesetzt. Bei in vitro produzierten Embryonen war eine Equilibrierung in
zwei Schritten im Gegensatz zu den in vivo gewonnenen Embryonen notwendig.
Durch die Entwicklung der Open Pulled Straw-Methode (OPS) leisteten VAJTA et al. (1998)
einen
wichtigen
Beitrag
zur
weiteren
Minimierung
der
toxischen
Effekte
von
Vitrifikationslösungen auf Embryonen. Die Zeit, die die Embryonen den konzentrierten
Kryoprotektiva-Lösungen bei Temperaturen über -180°C ausgesetzt sind, reduziert sich auf
weniger als 30 sec. Die Kühlraten betragen mit mehr als -20000°C/min etwa das 10-fache der
Kühlraten wie bei der herkömmlichen Vitrifikation. Die in vitro-Entwicklungsraten von in vitro
produzierten Rinderembryonen (d3-d7) unterschieden sich nicht von denen unbehandelter
Kontrollgruppen.
59
Tab.9: Vergleich der Überlebensraten von Rinderembryonen nach Vitrifikation und nach konventionellem Tiefgefrieren
Autoren
BIELANSKY u.
HARE (1988)
Vitrifikation
25% Gly + 25% PROH,
Equilibrierung in 2
Schritten
WURTH et al. (1994) 6,5 M Gly + 6% BSA,
AGCA et al. (1995)
Equilibrierung in 4
Schritten
25% Glycerin +
25% Ethylenglycol
Überlebens- kontrolliertes
raten
Tiefgefrieren
20% ÜR
1,5 M Gly
Überlebensraten
25% ÜR
24% TR
1,2 M Gly
14% TR
44% TR
1,4 M Gly
23% TR
Bemerkungen
halbe Embryonen,
ÜR nach 24 h IVC
IVP-Embryonen,
bei Vitrifikation und TG
Ausverdünnen in 1 Schritt in
Paillette bzw. in 3 Schritten
IVP-Embryonen
DINNYES et al.
(1995)
6,5 M Gly + 6% BSA
65% SR
1,5 M Gly +
0,25 M Suc
39% SR
IVP-Embryonen,
Ausverdünnen mit 0,5 M Suc
AGCA et al. (1996)
25% Gly + 25% EG,
30% TR
1,4 M Gly
40% TR
IVP-Embryonen
Equilibrierung in 3
Schritten
6,5 M Gly + 6% BSA
50% SR
1,36 M Gly +
0,25 M Suc
46% SR
d 8-IVP-Embryonen,
Ausverdünnen mit 0,5 M Suc
DINNYES et al.
(1996)
60
VAN
44,5% TR
6,5 M Gly + 6% BSA,
WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. (1997) Equilibrierung in 3
Schritten,
LANE et al. (1998)
25% EG + 25% DMSO, 30% TR
O´KEARNEYFLYNN et al. (1998)
Equilibrierung in 2
Schritten
6,5 M Gly + 6% BSA
58% ER,
24% TR
10% Gly
45,1% TR
bei Vitrifikation und TG
Ausverdünnen in 1 bzw. 3
Schritten
1,5 M EG
29% TR
IVP-Embryonen,
Direkttransfer
1,5 M EG
86% ER,
28% TR
IVP-Embryonen
Abkürzungen:
Gly
=
Glycerin
ÜR
=
Überlebensrate
TR
=
Trächtigkeitsrate
PROH =
Propanediol
IVC
=
in vitro-Kultur
SR
=
Schlupfrate
IVP
=
in vitro-Produktion
ER
=
Entwicklungsrate
TG
=
Tiefgefrieren
BSA
=
Bovine Serum Albumin
Suc
=
Sucrose
61
2.3.3. Ultraschnelles Tiefgefrieren
Bei der ultraschnellen Methode werden die Embryonen wie bei der Vitrifikation direkt in
flüssigen Stickstoff eingetaucht. Jedoch werden hier im intra- und extrazellulären Medium
kleine Eiskristalle gebildet. Es werden penetrierende (2,0 - 3,5 M) und nicht penetrierende
Kryoprotektiva (0,2 - 0,5 M) verwendet (NIEMANN 1991b). Durch das nicht penetrierende
Kryoprotektivum im extrazellulären Medium werden die Zellen schon vor dem Tiefgefrieren
teilweise dehydriert und so eine intrazelluläre Eisbildung reduziert oder verhindert (MAZUR
1990).
Zunächst konnten nur Mäuseembryonen mit guten Überlebensraten tiefgefroren werden. Einen
Überblick gibt Tabelle 10. MATSUOKA et al. (1995) berichteten über die erfolgreiche
Anwendung bei in vitro produzierten Rinderembryonen. Bei einer Equilibrierungstemperatur
von 5°C konnten mit 20% Ethylenglykol und 0,3 M Trehalose bzw. 0,3 M Sucrose
Schlupfraten von 64 bzw. 63% erreicht werden.
GUTIERREZ et al. (1993a)
verglichen
den
Einfluß
verschiedener
penetrierender
Kryoprotektiva in einer Konzentration von 3,0 M in Kombination mit 0,25 M Suc auf die
Überlebensraten von Mäusemorulae. Die in vitro-Entwicklungsrate von Glycerin und
Ethylenglykol war signifikant höher (76,1 bzw. 79,5%) als die nach Verwendung von
Propanediol (43,6%).
NOWSHARI u. BREM (1998) verglichen die Entwicklungsraten von expandierten
Mäuseblastozysten beim alleinigen Gebrauch von Ethylenglykol oder Propanediol in
verschiedenen Konzentrationen. Eine Konzentration von 7,0 M erwies sich am effektivsten.
Die Schlupfraten beim Ethylenglykol waren dabei höher als beim Propanediol (84 bzw. 78%).
TROUNSON et al. (1987) hielten beim ultraschnellen Tiefgefrieren von Mäuseembryonen mit
einer Kombination von DMSO und Sucrose eine Equilibrierungszeit von 2-2½ min für
ausreichend.
RAYOS et al. (1992b) bestimmten die optimale Equilibrierungszeit von Mäuseembryonen in
3,0 M Ethylenglykol und 0,25 M Sucrose. Die höchsten Entwicklungsraten wurden bei einer
Equilibrierungsdauer von 10 min festgestellt. Bei längeren Equilibrierungszeiten von 20 bzw.
62
40 min sanken die Entwicklungsraten. Bei verlängerten Equilibrierungszeiten kam es zu
höheren intrazellulären Konzentrationen von Ethylenglykol. Eine osmotische Schädigung der
Embryonen
durch
den
schnellen
Einfluß
von
Wasser
beim
Ausverdünnen
des
Kryoprotektivums nach dem Auftauen wurde wahrscheinlicher (LEIBO 1989).
Mit 25% Propanediol und 0,25 M Sucrose konnten ZHIMING et al. (1990) Mäuseoozyten
ultraschnell tiefgefrieren. Eine anschließende in vitro-Reifung von morphologisch normalen
Oozyten war möglich.
63
Tab.10: Überlebensraten von Mäuseembryonen nach ultraschnellem Tiefgefrieren
Autoren
Embryonalstadien
REICHENBACH Morulae, frühe
u. RODRIGUES Blastozysten
(1988)
THOMAS et al. frühe Morulae
(1989)
Kryoprotektiva
Ausverdünnungs- ÜberlebensBemerkungen
methode
raten
2 Schritte,
60,0 bzw.
Implantationsrate (IR)
mit 0,5 M Suc
35,0% IR
bei Morulae bzw.
frühen Blastozysten
2 Schritte,
81,0% ER
ER zu expandierten
mit 0,5 M Suc
Blastozysten nach 72 h
2,5 M Gly + 0,5 M Suc
3,5 M Gly + 0,5 M Suc
TAKAHASHI u. Morulae
2,0 M Gly + 0,25 M Lactose
KANAGAWA
(1990)
RAYOS et al.
1-Zell-Embryonen 3,0 M EG + 0,25 M Suc
(1992a)
2 Schritte,
mit 0,5 M Suc
76,2 bzw.
86,0% ER
nach 3 bzw. 5 min
Equilibrierung
2 Schritte,
mit Suc
67,2% ER
GUTIERREZ et
al. (1993a)
Morulae
2 Schritte,
mit 0,5 M Suc
CSEH et al.
(1998)
Morulae, frühe
Blastozysten
3,0 M EG + 0,25 M Suc,
3,0 M Gly + 0,25 M Suc,
3,0 M PROH + 0,25 M Suc
3 M EG + 0,25 M Suc
86,3% ER
73,9% ER
53,6% ER
84,0% ÜR
ER zu expandierten
Blastozysten, 10 min
Equilibrierung
ER zu expandierten
Blastozysten, 2 min
Equilibrierung
NOWSHARI u.
BREM (1998)
expandierte
Blastozysten
7,0 M EG + 0,5 M Suc
3 Schritte,
mit Suc
direktes Ausverdünnen in PBS
7,0 M PROH + 0,5 M Suc
Abkürzungen: Gly =
Proh =
ER =
Glycerin
Propanediol
Entwicklungsrate
Suc =
PBS =
ÜR =
Sucrose
phosphate buffered saline
Überlebensrate
84,0% SR
78,0% SR
EG
IR
SR
=
=
=
Ethylenglykol
Implantationsrate
Schlupfrate
63
2.3.4. Auftaumethoden
Das Überleben der Embryonen hängt neben der Kühlrate ebenso von der Auftaurate ab.
Mäuseembryonen, langsam mit -0,3°C/min auf Temperaturen zwischen -78 und -269°C
gekühlt, wurden mit Raten von 4, 25, 215 und 450°C/min aufgetaut. Die höchsten
Überlebensraten der Embryonen wurden mit Auftauraten von 4 bzw. 25°C/min erreicht
(WHITTINGHAM et al. 1972). RIDHA u. DUKELOW (1985) verglichen die Überlebensraten
von Hamsterembryonen nach schnellem und langsamen Auftauen. Die Embryonen wurden
zunächst langsam mit
-0,33°C/min auf -85°C gekühlt und dann in flüssigen Stickstoff umgesetzt. Das Auftauen
erfolgte mit Raten von 90 bzw. 1,5°C/min. Die Überlebensraten der 1- bis 8-Zellembryonen
waren bei den langsam aufgetauten Embryonen signifikant höher als bei den schnell
aufgetauten Embryonen. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen auch WILMUT (1972) bei
Mäuseembryonen und WILLADSEN et al. (1976) bei Schafembryonen. Je langsamer
Embryonen gekühlt werden, um so langsamer müssen sie auch aufgetaut werden, um eine
maximale Überlebensfähigkeit zu erhalten (LEIBO u. MAZUR 1978).
Schnell tiefgefrorene, ultraschnell tiefgefrorene sowie vitrifizierte Embryonen benötigen auch
ein schnelles Auftauen (> 300°C/min). Die nach langsamen Kühlen auf -25 bis -45°C
verbleibende konzentrierte intrazelluläre Flüssigkeit geht beim Umsetzen in flüssigen Stickstoff
in einen metastabilen, glasartigen Zustand über. Beim langsamen Auftauen ist genügend Zeit
zur Kristallisation (Devitrifikation) der glasartigen intrazellulären Flüssigkeit. Dies führt zu
niedrigeren Überlebensraten. Beim schnellen Auftauen bleibt keine Zeit zur Kristallisation. 8Zell-Mäuseembryonen wurden in 1,5 M Glycerin equilibriert und nach dem Tiefgefrieren mit
unterschiedlichen Raten aufgetaut. Embryonen, die langsam auf Temperaturen von -20 bis
-40°C gekühlt wurden und anschließend in flüssigen Stickstoff umgesetzt wurden, überlebten
langsames Auftauen (2°C/min) nach 48 h in vitro-Kultur nur zu 4-25%. Es überlebten jedoch
74% der Embryonen, die langsam bis auf -25°C gekühlt wurden und anschließend schnell (mit
500°C/min) aufgetaut wurden (RALL u. POLGE 1984). Die Devitrifikation läuft auch beim
langsamen Auftauen nach der Vitrifikation ab.
64
Kleine Eiskristalle, wie sie beim schnellen oder ultraschnellen Tiefgefrieren entstehen, haben
eine größere Oberflächenenergie und sind thermisch instabil. Beim langsamen Auftauen
verwandeln sie sich in größere schädigende Kristalle. Dieser Vorgang wird als Rekristallisation
bezeichnet. Beim schnellen Auftauen schmelzen die instabilen kleinen Kristalle, bevor sie die
Chance zum Wachsen haben (MAZUR 1965; BANK 1973; RALL et al. 1980).
RALL et al. (1980) und RALL (1981) konnten drei wesentliche Ereignisse beim langsamen
Auftauen von schnell gekühlten Embryonen beobachten. Bei ca. -85°C konnte ein sogenanntes
„flashing“ (Devitrifikation), bei ca. -55°C eine weitere Verdunklung des Zytoplasmas
(Rekristallisation) und bei ca. -40°C ein Verschwinden des dunklen kristallinen Materials im
Zytoplasma (Schmelzen des Eises) beobachtet werden.
Das schnelle Auftauen der Pailletten geschieht meist im Wasserbad. ELSDEN et al. (1982)
verglichen die Trächtigkeitsraten nach dem Transfer von Rinderembryonen, die nach dem
Tiefgefrieren im 25 oder 37°C warmen Wasserbad aufgetaut wurden. Die Trächtigkeitsraten
lagen nach dem Auftauen bei 37°C über denen bei 25°C (36,5 bzw. 23,5%). Bei
Rinderembryonen, die mit Glycerin oder DMSO tiefgefroren und bei 27 bzw. 37°C im
Wasserbad aufgetaut wurden, konnten keine Unterschiede bei den Überlebensraten beobachtet
werden (PRATHER et al. 1987). SEIDEL et al. (1990) froren Rinderembryonen mit einem
Medium ein, dem Makromoleküle zugefügt wurden. Die Pailletten wurden 20 sec im
Wasserbad bei 37°C oder zunächst 6 sec in der Luft und dann 20 sec im Wasserbad bei 37°C
aufgetaut. Nach dem Auftauen in der Luft und im Wasserbad konnte mit 46% eine höhere
Trächtigkeitsrate als nach alleinigem Auftauen im Wasserbad (41% Trächtigkeitsrate) erzielt
werden.
Nach Tiefgefrieren von 8-Zell-Mäuseembryonen und schnellem Auftauen konnte eine
maximale Überlebensrate erreicht
werden, wenn das langsame Kühlen bei einer
Umsetztemperatur von -40°C beendet wurde. Dadurch wurde das Verfahren weniger
zeitaufwendig (WHITTINGHAM 1981).
65
2.3.5. Ausverdünnungsmethoden
Die meisten Kryoprotektiva müssen aufgrund ihrer Toxizität bei wärmeren Temperaturen vor
der Kultur oder vor dem Transfer aus den Embryonen entfernt werden. Aufgetaute Zellen
enthalten eine große Konzentration an Kryoprotektiva. Sie schwellen durch Wassereinfluß
osmotisch an, wenn sie in physiologisches Medium oder Kulturmedium zurückverbracht
werden. Ergebnisse in Bezug auf die Überlebensfähigkeit und das Volumen von
Mäuseembryonen zeigen, daß man eine Ausverdünnungsmethode wählen sollte, bei der das
Embryonenvolumen unter 200% und über 50% des isotonischen Volumens gehalten werden
kann (MAZUR u. SCHNEIDER 1986).
Dazu gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten. Beim schrittweisen Ausverdünnen reduziert
man die Konzentration des Kryoprotektivums im extrazellulären Medium durch Umsetzen der
Embryonen in Lösungen mit absteigender Konzentration des Kryoprotektivums. Dabei wird
das Anschwellen der Zellen in tolerierbaren Grenzen gehalten.
Das zweite Verfahren, das ein Überschreiten des isotonischen Zellvolumens verhindert, ist das
Ausverdünnen in einer hypertonischen Lösung mit nicht penetrierenden Kryoprotektivum. Die
nicht penetrierende Substanz hält die extrazelluläre Osmolarität konstant. Ein schädliches
Anschwellen der Zellen wird verhindert, und das intrazelluläre Kryoprotektivum strömt aus der
Zelle hinaus. Wenn ausreichend Kryoprotektivum die Zelle verlassen hat, kann diese wieder in
isotonisches physiologisches Medium gegeben werden, ohne daß das Volumen über die
tolerierbare Größe hinausgeht (LEIBO u. MAZUR 1978; MAZUR 1985).
2.3.5.1. Schrittweises Ausverdünnen von Glycerin
Embryonen besitzen eine geringe Permeabilität gegenüber Glycerin (SZELL et al. 1989).
Glycerin kann durch ein aufeinanderfolgendes Umsetzen der Embryonen in Lösungen mit
niedrigeren Glycerin-Konzentrationen ausverdünnt werden. So kann 1,5 M Glycerin in 6
Schrittem mit Konzentrationsunterschieden von je 0,25 M Glycerin (1,25 M, 1,0 M, 0,75 M,
66
0,5 M, 0,25 M und 0 M) aus dem Embryo entfernt werden (BIELANSKI et al. 1985).
Verschiedene Autoren verwendeten zwischen 3 und 6 Ausverdünnungsschritte (s. Tab.11).
Tab.11: Überlebensraten von Embryonen nach konventionellem Tiefgefrieren und
schrittweisem Ausverdünnen ohne Sucrose (1,4 M Glycerin = 10% Glycerin)
Autoren
Spezies Konzentration Anzahl der Überlebens- Bemerkungen
des
Ausverdünraten
Glycerins
nungsschritte
NIEMANN et
al. 1981a
Rind
1,0 M
5
50,0% ÜR
NIEMANN et
al. 1982
Rind
1,0 M
5
53,6% ÜR
MERRY et al.
1984
Schaf
1,4 M
6
69,0% ER
PETTIT 1985
Rind
10%
6
BIELANSKY et
al. 1986
Rind
1,5 M
6
56,0, 53,0
bzw. 58,0%
TR
17,0% ÜR
HERNANDEZLEDEZMA et
al. 1988a
NELSON u.
NELSON 1988
Maus
1,5 M
3
63,1% SR
Rind
1,4 M
6
61,0% TR
TG in
KunststoffRöhrchen
nach 24 h IVC
für Morulae,
frische Blasto
bzw. Blasto
nach 24 h IVC
d7-Embryonen
Abkürzungen:
ÜR
=
Überlebensrate
TG
=
Tiefgefrieren
ER
=
Entwicklungsrate
IVC
=
in vitro-Kultur
TR
=
Trächtigkeitsrate
Blasto =
Blastozysten
SR
=
Schlupfrate
d
Tag
=
67
Eine andere Möglichkeit ist es, den Embryo in eine Sucrose-Lösung zu überführen (s. Abb.3).
Der Embryo zeigt kein übermäßiges Anschwellen, schrumpft aber fortschreitend, wenn das
Kryoprotektivum den Embryo verläßt. Das Schrumpfen und Anschwellen von Embryonen
während des Ausverdünnens ist ein vorläufiges Anzeichen dafür, daß sie das Tiefgefrieren
überlebt haben. Es zeigt an, daß die Zellmembranen normal funktionieren (SCHNEIDER u.
MAZUR 1984).
Abb.3: Schematische Darstellung einer kalkulierten
Volumenveränderung von Rinderblastozysten bei
stufenweiser oder direkter (über Sucrose) Entfernung von
1,5 M Glyzerin (Nach SCHNEIDER und MAZUR, 1984; zit.
NIEMANN und MEINECKE, 1993)
Relatives Volumen
2,5
Schrittweise Glycerin-Entfernung
2
0,25
1,25 1,00
1,5
0,75
0,00
0,50
1
Embryo in 1 M Sucrose
0,5
Embryotransfer in Empfänger
0
0
10
20
Zeit (Min)
30
40
Gute Überlebensraten wurden beim Ausverdünnen des Embryos in mehreren Schritten in
Lösungen mit absteigenden Glycerin-Konzentrationen erreicht. Diese Lösungen enthielten
neben dem Glycerin Sucrose in Konzentrationen von 0,3-1,0 M. NIEMANN et al. (1981a;
1982) verglichen die in vitro-Überlebensraten von Rinderblastozysten nach Ausverdünnen in 5
Schritten ohne Sucrose und nach Ausverdünnen in zwei Schritten mit 0,5 M Sucrose. Die
68
Überlebensraten beim schrittweisen Ausverdünnen mit Sucrose (83,3%) waren denen beim
Ausverdünnen ohne Sucrose (53,6%) überlegen. Dies wurde auf irreversible Schäden durch
osmotische Veränderungen an den Membranen der Blastomeren zurückgeführt. Einen
Überblick der Überlebensraten beim schrittweisen Ausverdünnen mit Sucrose gibt Tabelle 12.
In zahlreichen Untersuchungen konnte nachgewiesen werden, daß Glycerin mit Hilfe von
Sucrose auch in einem Schritt ausverdünnt werden kann. Die beste Überlebensfähigkeit der
Embryonen wurde dabei mit Konzentrationen von 1 M Sucrose erreicht. Bei Konzentrationen
kleiner als 0,8 M war die Überlebensfähigkeit nicht mehr zufriedenstellend (MERRY et al.
1983; HERNANDEZ-LEDEZMA et al. 1988b; DEL CAMPO et al. 1990; SUZUKI et al.
1990).
Nach Ausverdünnen in einem Schritt mit Sucrose oder in mehreren Schritten ohne Sucrose war
die Überlebensrate bei der Ein-Schritt-Methode bei Rinderembryonen höher (BIELANSKY et
al. 1985). MAPLETOFT et al. (1987) verglichen die Ein-Schritt-Methode mit dem
schrittweisen Ausverdünnen mit Sucrose bei Mäuseembryonen und LANDSVERK et al.
(1992) und ARRESEIGOR et al. (1998) bei Rinderembryonen. Die zeitaufwendigere Methode
in drei Schritten hatte keine Vorteile gegenüber der in einem Schritt. Die Überlebensraten nach
dem Ausverdünnen mit Sucrose in einem Schritt bei Rinderembryonen sind in Tabelle 13
dargestellt.
THONON et al. (1995) froren in vitro produzierte Rinderembryonen in einer 10% Glycerinund 0,25 M Sucrose-Lösung ein und verdünnten sie entweder in einem Schritt mit 0,25 M
Sucrose oder in 4 Schritten ohne Sucrose aus. Sie stellten eine deutliche Steigerung der in
vitro-Überlebensrate beim schrittweisen Ausverdünnen fest.
69
Tab.12: Überlebensraten von Embryonen nach konventionellem Tiefgefrieren und
schrittweisem Ausverdünnen mit Sucrose
Autoren
Spezies
GlycerinAusKonzen- verdünnungstration
schritte
1,0 M
3
SucroseKonzentration
0,5 M
Überlebensraten
NIEMANN et al.
1981a
Rind
NIEMANN et al.
1982
Rind
1,0 M
3
0,5 M
MAPLETOFT et al.
1987
Maus
1,5 M
3
1,0 M
DEL CAMPO et al.
1990
Rind
1,5 M
3
0,3 M
FALGE et al. 1990
Rind
1,4 M
3
0,7 M
83,3% ÜR
(nach 24 h
IVC)
37,2% ÜR
(nach 24 h
IVC)
79,0% ÜR
(nach 24 h
IVC)
49,0% TR
LANDSVERK et al.
1992
Rind
1,4 M
3
0,25 M
44,0% TR
LANGE 1995
Rind
1,4 M
3
-
48,9% TR
VAN
WAGTENDONK-DE
LEEUW et al. 1997
ARRESEIGOR et al.
1998
Rind
1,4 M
3
0,3 M
45,1% TR
Rind
1,4 M
3
0,3 M
45,9% TR
Abkürzungen:
TR
=
Trächtigkeitsrate
ÜR
=
Überlebensrate
IVC
=
in vitro-Kultur
41,7%TR
70
Tab.13: Überlebensraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren
und Ausverdünnen in einem Schritt mit Sucrose
Autoren
RENARD et al.
1983
GlycerinSucroseÜberlebensKonzentration Konzentration
raten
1,5 M
0,25 M
70,9% ÜR
Bemerkungen
nach 48 h IVC
MASSIP u. VAN
DER ZWALMEN
1984
BIELANSKY et
al. 1986
1,36 M
1M
38,0%TR
1,5 M
1M
32,0% ÜR
DEL CAMPO et
al. 1990
1,5 M
1,0, 0,5 bzw.
0,3 M
67,0, 72,0 bzw. nach 24 h IVC
58,0% ÜR
SUZUKI et al.
1990
1,4 M
0,4 bzw. 0,8 M 82,0 bzw.
88,0% ÜR
HRUSKA 1991
1,5 M
1,1 M
49,0%TR
Landsverk et al.
1992
1,4 M
1M
63,0%TR
ARRESEIGOR et
al. 1998
1,4 M
1M
47,2%TR
Abkürzungen:
ÜR
=
Überlebensrate
TR
=
Trächtigkeitsrate
IVC
=
in vitro-Kultur
nach 24 h IVC
nach 24 h IVC
71
2.3.5.2. One-Step-Methode
Eine weitere Vereinfachung des Ausverdünnens ist die von LEIBO (1983) und RENARD et al.
(1983) vorgestellte One-Step-Methode. Bei dieser Methode wird der in Glycerin eingefrorene
Embryo in der Paillette vor dem Transfer ausverdünnt.
CHUPIN et al. (1984) und HOOGENKAMP (1984) zogen in der Paillette vor dem
Tiefgefrieren je drei Säulen auf. Die mittlere Säule bestand aus der Glycerin-Lösung mit dem
Embryo. Sie war durch je eine Luftblase von den äußeren Säulen getrennt. Diese äußeren
Säulen bestanden entweder beide aus einer Sucrose-Lösung oder eine aus Sucrose-Lösung und
die andere aus Medium. CHUPIN et al. (1984) konnten zwischen den Trächtigkeitsraten nach
Direkttransfer bei den beiden Varianten keinen signifikanten Unterschied feststellen.
HOOGENKAMP (1984) erzielte mit Embryonen in Pailletten, die zwei Säulen Sucrose
enthielten, eine höhere Trächtigkeitsrate (46%) als mit Embryonen in Pailletten, die eine Säule
Medium und eine Säule Sucrose enthielten (21%).
SCHUBERTH (1984) und PAVEL (1985) wählten Pailletten mit unterschiedlichen Anteilen
des Einfriermediums mit Glycerin und Embryo und des Ausverdünnungsmediums mit Sucrose.
Sie verwendeten Pailletten, in denen Glycerin- und Sucroselösung im Verhältnis 1:9 oder 1:2
aufgezogen wurden. SCHUBERTH (1984) erreichten mit Rinderembryonen, die in Pailletten
mit dem Verhältnis 1:2 (1 Anteil Glycerin- und 2 Anteile Sucrose-Lösung) tiefgefroren
wurden, nach Transfer mit 52,9% eine höhere Trächtigkeitsrate als solche, die in Pailletten mit
dem Verhältnis 1:9 tiefgefroren wurden (31,3% Trächtigkeitsrate). PAVEL (1985) hingegen
erhielt mit der Paillettenfüllung im Verhältnis 1:9 (1 Anteil Glycerin- und 9 Anteile SucroseLösung) mit 47% eine höhere Trächtigkeitsrate als mit einer Paillettenfüllung im Verhältnis 1:2
(31%). CSEH et al. (1994) froren ebenfalls Rinderembryonen in Pailletten mit einer Füllung im
Verhältnis Glycerin : Sucrose-Lösung von 1:9 ein. Nach Transfer der Embryonen erzielten sie
eine Trächtigkeitsrate von 38%.
Tabelle 14 zeigt Überlebensraten bei Rinderembryonen, die mit der One-Step-Methode
kryokonserviert wurden. PAVEL (1985) und NOHNER (1986) warteten nach dem Auftauen
und Schütteln der Pailletten zur Durchmischung der Medien bis zum Transfer unterschiedlich
72
lange, um den Einfluß der Zeit, die die Embryonen dem Gemisch der beiden Medien bei 37°C
ausgesetzt waren, zu untersuchen. Bei PAVEL (1985) betrug nach einer Wartezeit von
weniger als 10 min die Trächtigkeitsrate nur 18,5%. Sie stieg nach einer Wartezeit von mehr
als 10 min auf 100% an. NOHNER (1986) hingegen stellte fest, daß mit steigender Wartezeit
nach dem Ausverdünnen die Trächtigkeitsergebnisse sanken. So betrugen sie bei 5 - 15 min
Wartezeit noch 44,4% hingegen bei 30 - 60 min Wartezeit nur 28,6%.
NIBART u. HUMBLOT (1997) fügten der 1,5 M Glycerin-Lösung mit Embryo 0,25 M
Sucrose vor dem Tiefgefrieren hinzu und kühlten langsam bis -25°C und setzten die Pailletten
dann in flüssigen Stickstoff um. Der Transfer direkt nach dem Auftauen ergab eine
Trächtigkeitsrate von 48,5%.
Obwohl bei Feldversuchen mit der One-Step-Methode Trächtigkeitsraten von ca. 25% bis über
45% erreicht werden konnten, wurde sie beim kommerziellen Embryotransfer nicht im großen
Rahmen eingesetzt (VOELKEL u. HU 1992a; STREICHER 1998).
73
Tab.14: Trächtigkeitsraten von Rinderembryonen nach der One-Step-Methode
Autoren
GlycerinKonzenTration
1,5 M
SucroseKonzentration
1,08 M
Trächtigkeitsraten
RENARD et al.
1983
CHUPIN et al.
1984
HOOGENKAMP
1984
LEIBO 1984
1,5 M
0,25 M
46,8%
1,4 M
0,25 M
41,4%
1,4 M
0,3 M
46,0%
1,5 M
1,08 M
26,0%
SCHUBERTH
1984
1,0 M
0,5 M
31,3 bzw.
52,9%
PAVEL 1985
1,0 M
0,5 M
47,0 bzw.
31,0%
LEIBO 1986
1,5 M
1,08 M
42,4%
LANDSVERK et
al. 1992
CSEH et al. 1994
1,4 M
1,0 M
63,0%
1,4 M
1,0 M
38,0%
MOORE 1994
1,4 M
0,6 M
53,0%
LEIBO 1983
Bemerkungen
36,7%
verschiedene
Füllungen der Paillette
Volumenverhältnis
Glycerin : Sucrose in
Paillette 1:9 bzw. 1:2
Volumenverhältnis
Glycerin : Sucrose in
Paillette 1:9 bzw. 1:2
0,7% BSA (bovine
serum albumin) in
Gefrierlösung
Filter auf halber Länge
der Paillette
74
2.3.5.3. Direktes Ausverdünnen von Ethylenglykol
Ethylenglykol hat den Vorteil bei höheren Temperaturen eine weitaus geringere toxische
Wirkung als Glycerin zu haben. Außerdem diffundiert Ethylenglykol viel schneller als Glycerin
durch die Zellmembranen. VOELKEL u. HU (1992a) verglichen die in vitro-Überlebensraten
von
Rinderembryonen
nach
konventionellem
Tiefgefrieren
in
vier
verschiedenen
Kryoprotektiva und direktem Ausverdünnen nach Auftauen in PBS. Die Überlebensraten von
Embryonen in Ethylenglykol waren denen in Glycerin, DMSO und Propanediol überlegen. Das
aufwendige schrittweise Ausverdünnen des Kryoprotektivums nach dem Auftauen kann
entfallen. Es besteht die Möglichkeit, den Embryo nach dem Auftauen direkt zu übertragen
(JANOWITZ u. GÖRLACH 1994).
Nach Direkttransfer von in Ethylenglykol tiefgefrorenen Embryonen erreichte LANGE (1995)
höhere Trächtigkeitsraten (58,2%) als mit Glycerin tiefgefrorenen Embryonen, die schrittweise
mit Sucrose aufgetaut wurden (48,9% TR). In Untersuchungen von ARRESEIGOR et al.
(1998) entsprachen die Trächtigkeitsraten nach Direkttransfer von Rinderembryonen mit
Ethylenglykol denen mit Glycerin tiefgefrorenen Embryonen, die in drei Schritten oder einem
Schritt mit Sucrose ausverdünnt worden waren (47,4% TR gegenüber 45,9 bzw. 47,2% TR).
DOCHI et al. (1995) und NIBART u. HUMBLOT (1997) übertrugen sowohl in Ethylenglykol
tiefgefrorene Rinderembryonen wie auch in 1,5 M Glycerin + 0,25 M Sucrose tiefgefrorene
Embryonen direkt. Die Trächtigkeitsraten waren bei beiden Methoden gleich.
Beim Tiefgefrieren von in vitro produzierten Rinderembryonen in 3,6 M Ethylenglykol mit
anschließendem Direkttransfer erzielten SOMMERFELD u. NIEMANN (1999) mit
expandierten Tag 7-Blastozysten eine Trächtigkeitsrate von 43,5%.
VOELKEL u. HU (1992a) und LANGE (1994) zogen in Pailletten drei Säulen auf. Die
mittlere bestand aus Ethylenglykol und Embryo, die beiden äußeren, durch eine Luftblase von
der mittleren Säule getrennt, aus PBS. Das PBS hat dabei zwei Funktionen. Es soll das
Ethylenglykol vom Embryo waschen und dafür Sorge tragen, daß ein geringeres Volumen an
75
Kryoprotektivum-Lösung in den Uterus des Empfängers gelangt und somit lokale Effekte auf
das Endometrium reduziert werden.
Die Vorteile des Direkttransfers mit Ethylenglykol liegen wie beim One-Step-Verfahren in der
Zeitersparnis und darin, daß ein Minimum an Ausrüstung benötigt wird. Einen Überblick über
die Überlebensraten von in Ethylenglykol konventionell tiefgefrorenen Rinderembryonen nach
Direkttransfer gibt Tabelle 15.
Auch bei der Vitrifikation von in vitro produzierten Rinderembryonen in einer Lösung, die
Ethylenglykol enthält, ist ein direktes Ausverdünnen nach dem Auftauen möglich. Dies zeigten
SAHA et al. (1994) mit einer Vitrifikationslösung bestehend aus 40% Ethylenglykol und 0,3 M
Sucrose und MAHMOUDZADEH et al. (1995) mit einer Lösung bestehend aus 40%
Ethylenglykol, 18% Ficoll und 10,26% Sucrose. Mit in vitro produzierten Rinderembryonen,
die in einer Lösung mit 25% Ethylenglykol und 25% DMSO vitrifiziert wurden, erzielte man
nach Direkttransfer eine Trächtigkeitsrate von 30% (LANE et al. 1998).
KUWAYAMA et al. (1994a) vitrifizierten in vitro produzierte Rinderembryonen in einer
Lösung mit 30% Ethylenglykol und 1 M Sucrose und anschließender Ausverdünnung mit
0,5 M Sucrose in der Paillette. Durch Zugabe von Eigelb zum Ausverdünnungsmedium
konnten die in vitro-Überlebensraten verbessert werden. Nach dem Direkttransfer von 5
Blastozysten auf Empfängertiere konnten 3 Trächtigkeiten erzielt werden.
76
Tab.15: Trächtigkeitssraten von Rinderembryonen nach konventionellem Tiefgefrieren
mit Ethylenglykol und Direkttransfer
Autoren
EthylenglykolKonzentration
Trächtigkeitsraten
Auftaumethode
VOELKEL u. HU
1992a
1,5 M
39,0%
10 sec in 30°C Wasserbad
VOELKEL u. HU
1992b
1,5 M
50,0%
30°C Wasserbad
JANOWITZ u.
GÖRLACH 1994
1,5 M
72,0%
LANGE 1994
1,5 M
61,5%
10 sec in 30°C Wasserbad
McINTOSH u.
HAZELEGER 1994
1,5 M
59,0%
Wasserbad bei 20°C
BRACKE et al. 1995
1,5 M
57,7%
Wasserbad bei 20-30°C
DOCHI et al. 1995
1,8 M
69,0%
37°C Wasserbad
JANOWITZ u.
HERMANNS 1995
1,5 M
55,8%
5-10 sec in Luft, dann 20 sec in
30°C Wasserbad
LANGE 1995
1,5 M
58,2%
10 sec in 30°C Wasserbad
KLING 1997
1,5 M
50,77%
NIBART u.
HUMBLOT 1997
1,5 M
50,5%
10 sec in Luft, 10-20 sec in 30°C
Wasserbad
10 sec in Luft, dann 20 sec in
20-25°C Wasserbad
SOMMERFELD u.
NIEMANN 1999
3,6 M
43,5%
ARRESEIGOR et al.
1998
1,5 M
47,4%
1 min bei Raumtemp. im
Wasserbad, (in vitro produzierte
Embryonen)
für 10 sec in 30°C Wasserbad
77
2.4. Überlebens- und Entwicklungsraten von in vivo gewonnenen und in vitro
produzierten Rinderembryonen
1982 wurde das erste Kalb aus in vitro-Fertilisation (BRACKETT et al. 1982) und 1987 das
erste Kalb aus einer tiefgefrorenen, in vitro produzierten Rinderblastozyste geboren
(FUKUDA et al. 1990). Doch die Trächtigkeitsraten von in vitro produzierten Embryonen
nach Kryokonservierung sind weiterhin niedriger als die von in vivo gewonnenen Embryonen
nach Kryokonservierung. Es stellte sich heraus, daß die Tiefgefrierverfahren, die für in vivo
gewonnene Embryonen entwickelt wurden, nicht auf in vitro produzierte Embryonen
übertragen werden können. In vitro produzierte Embryonen, besonders kompakte Morulae,
zeigen eine extreme Empfindlichkeit gegenüber langsamem Kühlen (MAHMOUDZADEH et
al. 1994). Daher müssen die Verfahren den Anforderungen der in vitro produzierten
Embryonen angepaßt werden, um die Überlebensraten nach dem Auftauen zu erhöhen. Die
Gründe für die größere Gefriersensibilität werden in erheblichen Unterschieden zwischen in
vitro produzierten und in vivo gewonnenen Embryonen bei morphologischen und
biochemischen Eigenschaften vermutet (LEIBO u. LOSKUTOFF 1993; MASSIP et al.
1995a).
Die Zell-zu-Zell-Kontakte der ICM-Zellen (ICM = inner cell mass) von Embryonen nach in
vivo-Fertilisation sind fester als bei solchen aus in vitro-Fertilisation. Auch die Anzahl der
ICM-Zellen beim Schlüpfen der Blastozysten nach in vivo-Fertilisation ist größer als nach in
vitro-Kultur. Beides könnte die niedrigeren Trächtigkeitsraten von Embryonen nach in vitroFertilisation erklären (IWASAKI et al. 1990; WRIGHT u. ELLINGTON 1995). DINNYES et
al. (1996) ermittelten bei in vitro produzierten Embryonen weniger und kürzere
Verbindungskomplexe zwischen den Zellen als bei in vivo gewonnenen Embryonen. Gleichfalls
zeigten die von ihnen untersuchten in vitro produzierten Embryonen meist mehr Vakuolen und
eine deutlich geringere Kompaktheit als die untersuchten in vivo gewonnenen Embryonen.
Bei in vitro produzierten 8-Zellembryonen vom Rind erschienen die Blastomeren bei
Untersuchung von MASSIP et al. (1995a) unregelmäßig, und auch die Morulae waren weniger
kompakt als die in vivo gewonnenen Morulae. Die in vitro produzierten Blastozysten hatten
78
ein dunkles Erscheinungsbild mit unregelmäßigen Formen, während die in vivo gewonnenen
Blastozysten eine gut definierte innere Zellmasse zeigten.
OHBOSHI et al. (1995) konnten mit Ausnahme beim rauhen endoplasmatischen Retikulum
(rER) keine großen Unterschiede in der Ultrastruktur zytoplasmatischer Organellen von in vivo
gewonnenen und in vitro produzierten Blastozysten entdecken. Das rER war im Vergleich zu
den in vivo gewonnenen Embryonen bei den in vitro produzierten Embryonen nicht
ausreichend entwickelt. Dies kann von Nachteil für die Entwicklung sein, denn das rER ist an
der Proteinsynthese der Zellen beteiligt.
Nach POLLARD u. LEIBO (1993) sinken in vivo gewonnene Morulae, wenn sie in einer
2,35 M Sucrose-Lösung suspendiert sind, auf den Boden der Kulturschale ab. Ihre Dichte liegt
über 1,30. Im Gegensatz dazu schwimmen in vitro produzierte Morulae auch in SucroseLösung von 1,6 M und mehr. Ihre Dichte liegt bei nur 1,14. Eine mögliche Erklärung dafür ist,
daß das Lipid-Protein-Verhältnis bei in vitro produzierten Embryonen größer ist. LEIBO et al.
(1995) halten einen erhöhten Anteil intrazellulärer Lipide zumindest teilweise verantwortlich
für die größere Kühl- und Tiefgefriersensibilität, die für in vitro produzierte Embryonen im
Morulastadium charakteristisch ist. DIEZ et al. (1996) und USHIJIMA et al. (1996) entfernten
intrazelluläre Lipide aus Zygoten und konnten keinen abträglichen Effekt auf die in vitro- und
in vivo-Überlebensraten von Rinderembryonen feststellen. Jedoch verbesserte sich die
Gefriertoleranz der in vitro produzierten Embryonen.
Ein weiteres biochemisches Merkmal, in dem sich in vivo gewonnene und in vitro produzierte
Embryonen unterscheiden, ist die Zeitdauer bis zur enzymatischen Auflösung der Zona
pellucida durch Pronase. Dieser Vorgang dauert bei in vivo gewonnenen Embryonen länger als
320 sec, bei in vitro produzierten Embryonen hingegen nur ca. 130 sec (POLLARD u. LEIBO
1993). MASSIP et al. (1995a) vermuteten einen Einfluß auf die Permeabilität der Zona
gegenüber Wasser und Kryoprotektiva durch diese Eigenschaft.
Der Metabolismus von in vitro produzierten und in vivo gewonnenen Rinderembryonen ist
ähnlich, jedoch zeigen in vitro produzierte Embryonen höhere metabolische Aktivität und im
Gegensatz zu in vivo gewonnenen Embryonen eine Produktion von Lactat. Die höhere
metabolische Aktivität der Embryonen im in vitro-Produktionssystem deuten LUCAS-HAHN
u. ECKERT (1996) als eine Streßantwort, die jedoch keine irreversiblen Schäden hinterläßt.
79
Nicht nur die Verhältnisse in den Zellen sondern auch Faktoren in der Umgebung der
Embryonen können einen Einfluß auf die Überlebensfähigkeit haben. Einige dieser Faktoren
sind vergleichend in Tabelle 16 aufgeführt.
Tab.16: Vergleich der Umgebung von präimplantatorischen Embryonalstadien in vivo
und in vitro (zitiert nach MASSIP et al. (1995a), modifiziert nach RIEGER u.
BETTERIDGE (1989))
in vivo
keine Temperaturschwankungen
in vitro
thermischer Schock
keine Lichteinwirkung
Exposition im Tages- oder
mikroskopischen Licht
kontrollierte 02 und CO2-Spannung
direkte Exposition in
atmosphärischem Gas
physiologisches Volumen der
großes Volumen an umgebender
umgebenden Genitalsekrete
Flüssigkeit
permanenter, dynamischer Austausch statische Kulturbedingungen mit
zwischen Embryo und Mutter
Mangel an Metaboliten
Bei der Embryonalentwicklung bis Tag 6 in vivo in der Kuh oder in vitro mit Eileiter-Zellkultur
konnten keine Unterschiede in der Anzahl der Zellen oder in der Anzahl als transfertauglich
klassifizierter Embryonen festgestellt werden (WRIGHT u. ELLINGTON 1995). Trotzdem
waren die Trächtigkeitsraten nach Transfer von Embryonen ohne Tiefgefrierung für in vivo
gewonnene Embryonen höher (79%) als für in vitro produzierte Embryonen (37%). Die
embryonale oder fetale Mortalität war für in vivo gewonnene Embryonen Klasse 1 und 2 und
in vitro produzierte Embryonen der Klasse 1 ähnlich. Bei in vitro produzierten Embryonen der
Klasse 2 war sie deutlich erhöht (FARIN u. FARIN 1995).
POLLARD u. LEIBO (1993; 1994) stellten fest, daß fast alle in vivo gewonnenen Morulae
sich nach langsamem Kühlen bis 0°C zu Blastozysten entwickelten, hingegen keine der in vitro
produzierten Morulae die Kühlung unter 15°C überlebten. Bei den in vitro produzierten
80
Blastozysten überlebten 60% eine langsame Kühlung bis auf 0°C. In vivo gewonnene Morulae
sind widerstandsfähiger gegenüber Kühlung als in vitro produzierte Morulae. BRACKETT u.
ZUELKE (1993) erzielten bessere Ergebnisse beim Transfer, wenn sie die in vitro produzierten
Morulae nach dem Tiefgefrieren für mindestens 4 h kultivierten.
Bei der Analyse eines kommerziellen IVF-Programms über 2,5 Jahre erhielten HASLER et al.
(1995) beim konventionellen Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit 10% Glycerin,
ausverdünnt in vier Schritten Trächtigkeitsraten von 76% bei frischen und von 67% bei
tiefgefrorenen in vivo gewonnenen Embryonen. Bei frischen Tag 7- bzw. Tag 8-in vitro
produzierten Embryonen lagen die Trächtigkeitsraten bei 59 bzw. 48%. Am niedrigsten war
die Trächtigkeitsrate bei tiefgefrorenen Tag 7-in vitro produzierten Embryonen (42%).
PAVASUTHIPAISIT et al. (1993) froren in vitro produzierte Embryonen langsam in 1,5 M
Glycerin ein und verdünnten sie nach dem Auftauen in 0,5 M Sucrose aus. Mit
Trächtigkeitsraten von 64% bei frühen Blastozysten, 45% bei kompakten Morulae und 33%
bei Blastozysten hielten sie diese Kryokonservierungsmethode ähnlich wie bei in vivo
gewonnenen Embryonen auch für in vitro produzierte Embryonen geeignet.
LEIBO u. LOSKUTOFF (1993) beobachteten bei in vivo gewonnenen Embryonen eine
maximale Trächtigkeitsrate, wenn Donor und Empfänger synchron waren. Hingegen waren die
Trächtigkeitsraten bei in vitro
produzierten Embryonen am höchsten, wenn das
Embryonenalter dem Zyklusstand des Empfängers ca. einen Tag voraus war.
Nach konventionellem Tiefgefrieren und in vitro-Kultur erhielten LEIBO u. LOSKUTOFF
(1993) eine Schlupfrate von 80% bei in vivo gewonnenen aber nur 20% bei in vitro
produzierten Embryonen. Nach der Vitrifikation hingegen schlüpften 80% der in vitro
produzierten Embryonen. Unabhängig vom Vitrifikationsmedium zeigten in vitro produzierte
Embryonen im Gegensatz zu in vivo gewonnenen Embryonen eine bessere Ultrastruktur nach
der Vitrifikation.
Da in vitro produzierte Embryonen andere morphologische und biochemische Eigenschaften
besitzen als in vivo gewonnene Embryonen, schlußfolgerten MASSIP et al. (1995a), daß es
81
notwendig sei, die weitgehend standardisierten Kryokonservierungsmethoden für in vivo
gewonnene Embryonen den Anforderungen von in vitro produzierten Embryonen anzupassen.
Dies kann durch eine Erhöhung der Zahl der Equilibrierungsschritte und eine Anpassung von
Zeit und Temperatur der Equilibrierung erfolgen und die Überlebensraten von in vitro
produzierten Embryonen nach dem Auftauen erhöhen.
THONON et al. (1995) verglichen die Überlebensraten von in vitro produzierten Embryonen
beim konventionellen Tiefgefrieren, in dem sie zum einen die Embryonen in einem Schritt in
10% Glycerin equilibrierten und in einem Schritt mit 0,25 M Sucrose ausverdünnten, zum
anderen 4 Schritte für die Equilibrierung und für das Ausverdünnen (ohne Sucrose)
gebrauchten. Nach schrittweisem Hinzufügen und Ausverdünnen des Glycerins wurde eine
deutliche Steigerung der in vitro-Überlebensraten der in vitro produzierten Embryonen erzielt.
VAJTA et al. (1996) wendeten bei der Vitrifikation in vitro produzierter Embryonen eine
modifizierte 2-stufige Methode an. Zunächst wurden die Embryonen bei 20-22°C für 60 sec in
einer 50% Vitrifikationslösung (12,5% Ethylenglykol und 12,5% DMSO) equilibriert.
Anschließend wurden sie bei nur 4°C der 100% Vitrifikationslösung (25% Ethylenglykol und
25% DMSO) für 20 sec ausgesetzt. Aus den guten Ergebnissen (63-69% Schlupfraten)
schlußfolgerten sie, daß eine Inkubation von in vitro produzierten Embryonen in Ethylenglykol
/ DMSO bei niedrigen Temperaturen (4°C) notwendig ist. Bei in vivo gewonnenen Embryonen
hielten sie dies für nicht notwendig.
Die OPS (open pulled straw) -Methode ist ein weiterer Schritt, die höhere Kühlsensibilität von
in vitro produzierten Embryonen zu überwinden. Die Kühlschäden werden durch sehr hohe
Kühlraten verringert und toxische Effekte durch nur kurze Exposition der Embryonen in
Vitrifikationslösungen minimiert. Die Schlupfraten von in vitro produzierten Rinderembryonen
(d6 und d7) lagen nach 48 bzw. 72h in vitro-Kultur bei 94 bzw. 70%. Nach Transfer von
Rinderblastozysten, die im Oozyten- und Blastozystenstadium mit der OPS-Methode vitrifiziert
wurden, waren 3 von 14 Empfängern tragend (VAJTA et al. 1998). LEWIS et al. (1999)
vitrifizierten in vitro produzierte Rinderembryonen sehr guter Qualität mit der OPS-Methode.
Nach Ausverdünnen in der Paillette und Transfer von zwei Embryonen pro Empfänger
erzielten sie eine Trächtigkeitsrate von 64%.
82
3. Material und Methoden
3.1. Datenmaterial
Für die Auswertung der Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit der verschiedenen
Einflußfaktoren wurden die Daten der Transfers von 1066 kryokonservierten und aufgetauten
Rinderembryonen und deren Empfängertiere verwendet. Diese tiefgefrorenen / aufgetauten
Embryonen sind von Oktober 1996 bis Juni 1998 vom Embryo-Transfer-Team der
Rinderunion West, Kleve, im Rahmen eines kommerziellen Embryotransferprogramms
übertragen worden.
Die hier verwendeten Daten wurden dem jeweiligen Spülprotokoll, dem Verschlußstick der
Paillette bei der Kryokonservierung und dem Transferprotokoll entnommen.
Dort war jeweils dokumentiert:
• auf dem Spülprotokoll
− Protokollnummer
− Datum der Spülung
− Besitzer Spendertier
− Anpaarung
− laufende Nummer des Embryos aus dieser Spülung
− Entwicklungsstadium des Embryos
− Embryonenqualität
− verwendetes Kryoprotektivum
− Anordnung der Flüssigkeitssäulen in der Paillette bei Verwendung von
Ethylenglykol
− Gefriergerät
83
• auf dem Verschlußstück der Paillette
− Datum Kryokonservierung
− Besitzer Spendertier
− Anpaarung
− Spülprotokollnummer
− Kryoprotektivum
− Entwicklungsstadium Embryo
− Embryonenqualität
− laufende Nummer des Embryos aus der jeweiligen Spülung
• auf dem Transferprotokoll
− Transferdatum
− Besitzer Empfängertiere
− Empfängertier (Rind oder Kuh)
− Ohrmarkennummer Empfängertier
− Empfängerqualität
− Anpaarung
− Embryonenqualität vor und nach der Kryokonservierung
− Trächtigkeitsergebnisse
84
3.2. Spendertiere
Die Spender in diesen ET-Programmen gehörten überwiegend zur Rasse „Deutsche
Schwarzbunte“ aber auch zur Rasse „Deutsche Rotbunte“. Es wurden überwiegend Kühe, aber
auch Jungrinder gespült.
Bei Kühen, die als Spender verwendet wurden, fand vor Einleitung der Superovulation eine
gynäkologische Untersuchung statt, die keine von der Norm abweichenden Befunde (z.B.
Endometritiden, Zysten etc.) ergeben durfte.
Voraussetzungen für die Spülung bei Jungrindern waren ein regelmäßiger Zyklus und eine
entwicklungsbedingte Größe, die eine manuelle transrektale Manipulation erlaubte.
3.2.1. Superovulation und künstliche Besamung
Nach einer meistens natürlichen oder auch synchronisierten, durch Prostaglandin-Injektion (2
ml Pronilen, Intervet, Tönisvorst) induzierten Brunst wurde zwischen dem 8. und 14.
Zyklustag mit der Superovulationsbehandlung begonnen (Abb.4).
Dazu wurde den Spendern 4 Tage lang täglich morgens und abends FSH (Folltropin,
Vetrepharm, Kanada) in abfallenden Dosierungen injiziert. Dabei unterschieden sich die Superovulationsregimes von Kühen und Rindern hinsichtlich der Dosierung. Beide sind nachfolgend
aufgeführt.
Am 4. Tag der Behandlung wurde jeweils morgens und abends zusätzlich zur FSH-Injektion
ein Prostaglandin (2,0 ml Pronilen, Fa. Intervet) zur Auslösung der superovulatorischen
Brunst injiziert.
Die Spender wurden ca. 36 Stunden nach der letzten FSH-Injektion beginnend und nur bei
deutlicher Brunst besamt. Dies geschah 3 x im Abstand von ca. 12 Stunden.
85
Abb.4: Vorbereitungsplan für den ET
Spenderkühe
(insges. 400 mg FSH /
Superovulation)
Spenderrinder
(insges. 280 mg FSH /
Superovulation)
Tag 1
morgens
abends
3,5 ml Folltropin
3,5 ml Folltropin
2,5 ml Folltropin
2,5 ml Folltropin
Tag 2
morgens
abends
3,0 ml Folltropin
3,0 ml Folltropin
2,0 ml Folltropin
2,0 ml Folltropin
Tag 3
morgens
abends
2,0 ml Folltropin
2,0 ml Folltropin
1,5 ml Folltropin
1,5 ml Folltropin
Tag 4
morgens
1,5 ml Folltropin +
2,0 ml Pronilen
1,5 ml Folltropin +
2,0 ml Pronilen
1,0 ml Folltropin +
2,0 ml Pronilen
1,0 ml Folltropin +
2,0 ml Pronilen
abends
Tag 5
Tag 6
morgens
abends
1. Besamung
2. Besamung
1. Besamung
2. Besamung
Tag 7
morgens
3. Besamung
3. Besamung
Spülung
Spülung
Tag 13
(Tag 7 nach
1.Besamung)
86
3.2.2. Spül- und Kulturmedium
Zur Gewinnung der Embryonen wurde als Spülmedium das im Handel erhältliche DPBS
(Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline; Bio Whittaker, Belgium) verwendet. In 1000 ml
Flaschen abgefüllt, wurde es zur Spülung auf ca. 30°C erwärmt. Diese Temperatur wurde auch
während der Spülung im Stall in einem Wasserbad aufrechterhalten.
Dem Spülmedium wurden 10 ml OCM (Emcare - Embryo holding solution, ImmunoChemical Products LTD) zugefügt, um das Kleben der Embryonen an Pipetten, Boden etc. zu
verhindern.
Als Kulturmedium wurde OCM (Emcare) ohne weitere Zugaben verwendet, das auf einer
Wärmeplatte bei einer Temperatur von ca. 28°C warmgehalten wurde.
3.2.3. Gewinnung von Embryonen
Die Spülungen der Spendertiere fanden ausschließlich im Stall des jeweiligen Besitzers statt.
Dort wurde das Spülmedium in einer Styroporbox bei 30°C im Wasserbad warmgehalten.
Der silikonisierte Spülkatheter (Modell Wörrlein, Nr.18, oder Modell Neustadt / Aisch, Nr.15)
wurde unter rektaler Kontrolle durch Cervix und Uteruskörper in das kraniale Drittel des
Uterushorns geschoben, dort durch Aufblasen des Ballons (12-18 cm3) fixiert und das
Uterushorn gegen das Uteruslumen abgedichtet.
I.d.R. wurden 240 ml Spülflüssigkeit pro Uterushorn eingegeben. Die einzelnen Fraktionen
wurden in Spritzen aufgezogen und in der Reihenfolge 2 x 30 ml, 2 x 40 ml und 2 x 50 ml
infundiert. Nach jeder Spritze wurde die zurücklaufende Flüssigkeit mit einer Spülflasche
aufgefangen.
Um die restliche Spülflüssigkeit zu gewinnen, wurde noch 1-2 x Luft insuffliert und das
Uterushorn möglichst weit nach dorsal angehoben.
87
Bei der Spülung des zweiten Uterushorns wurde genauso verfahren. Die zuvor gewonnene
Spülflüssigkeit wurde im Wasserbad bei ca. 30°C warmgehalten.
Nach Beendigung der Spülung erhielten die Spender eine Prostaglandin-Injektion (2,5-3 ml
â
Pronilen , Intervet) zum Abbau der vorhandenen Gelbkörper und somit zur Einleitung der
nächsten Brunst.
3.2.4. Aufsuchen und Beurteilung von Embryonen
Die Spülflüssigkeit wurde mit einem Embryonenfilter (Fa. Emcon, USA) filtriert. Der
Überstand wurde in eine Petrischale mit Zählgitter (∅ = 100 mm) gegossen und bei 10-facher
Vergrößerung mit einem Stereomikroskop untersucht. Die Spülflüssigkeit eines jeden
Uterushorns wurde getrennt gefiltert und untersucht.
Die gefundenen Embryonen oder unbefruchteten Eizellen wurden mit Hilfe einer Insulinspritze
und Unopette in eine kleine Petrischale (∅ = 35 mm) mit OCM (Emcare) umgesetzt.
Anschließend wurden die unbefruchteten Eizellen von den Embryonen getrennt und die
Embryonen in die einzelnen Qualitätsklassen eingeteilt. Dies geschah mit einem
Stereomikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
Dabei richtete man sich nach der ADR-Empfehlung Nr.71 / Anlage 2 vom 10.04.1991
(Arbeitsgemeinschaft Deutscher Rinderzüchter e.V., Bonn):
∗ Klasse 1 = sehr gute Qualität:
− keine Veränderungen, scharfrandiger und kompakter Zellverband, helle Farbe,
intakte Zona pellucida
88
∗ Klasse 2 = gute Qualität:
− wenig ausgestoßene bzw. degenerierte Blastomeren, scharfrandiger und kompakter
Zellverband, helle Farbe, intakte Zona pellucida
∗ Klasse 3 = mäßige Qualität:
− größerer Anteil ausgestoßener bzw. degenerierter Blastomeren, kleiner und noch
kompakter Zellverband, helle bis dunkle Farbe, z.T. retardierte Entwicklung oder
beschädigte Zona pellucida
∗ Klasse 4 = schlechte Qualität:
− überwiegender Anteil degenerierter Blastomeren, vorwiegend lockerer Zellverband,
häufig dunkle Farbe, z. T. stark retardierte Entwicklung oder beschädigte Zona
pellucida (ohne Zona pellucida)
Die Embryonen wurden hinsichtlich ihres Entwicklungsstadiums nach der Definition von
LINDNER und WRIGHT (1983) eingeteilt:
∗ kompaktierte Morula (M):
• Zusammenschluß der einzelnen Blastomeren zu einem kompakten Verband
• embryonale Zellen nehmen 60-70% des Raums innerhalb der Zona pellucida
ein
∗ beginnende Blastozyste (BB):
• Embryo hat flüssigkeitsgefülltes Blastocoel gebildet, das weniger als die
Hälfte des Volumens der Blastozyste einnimmt
• embryonale Zellen nehmen 70-80% des Raums innerhalb der Zona pellucida
ein
89
∗ Blastozyste (B):
• deutliche
Differenzierung
zwischen
äußerer
Trophoblastschicht
und
dunkleren, kompakten, inneren Zellmasse
• deutliche Blastocoelbildung
• glatte Abgrenzung zum nur noch schmalen perivitellinen Raum
∗ expandierte Blastozyste (EB):
• Durchmesser des Embryos vergrößert sich bis auf das 1,5-fache mit
gleichzeitiger Ausdünnung der Zona pellucida
• die gewonnenen Embryonen sind in diesem Stadium oft kollabiert
Zur Kryokonservierung wurden überwiegend und nach Möglichkeit nur Embryonen der
Klasse 1 und 2 verwendet. Wenn jedoch nicht genügend Empfängertiere für den Frischtransfer
zur Verfügung standen, mußten gelegentlich auch Embryonen schlechterer Qualität eingefroren
werden.
Vor der Konfektionierung wurden die Embryonen 10 x in OCM gewaschen.
90
3.3. Kryoprotektiva
3.3.1. Glycerin
Die Embryonen wurden für 10 min auf einer Wärmeplatte bei 28°C in 10% Glycerin
ä
(Emcare , Immuno-Chemical-Products LTD) equilibriert. Anschließend wurden die
Embryonen mit einer Insulinspritze und einem Verbindungsstück in eine weiße Paillette
aufgezogen. Die Paillette enthielt durch Luftblasen getrennte, etwa gleich große Säulen
(Abb.5). Die mittlere enthielt den Embryo.
Abb.5: Füllung der Paillette bei Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum
Stopfen
Glycerin + Embryo
Luftblase
Glycerin
Glycerin
Verschlußstick
91
3.3.2. Ethylenglykol
Die Pailletten wurden bei Verwendung von Ethylenglykol mit unterschiedlichen Volumina an
Ethylenglykol-Lösung gefüllt, um den Einfluß der sich hieraus ergebenden unterschiedlichen
Konzentrationen an Ethylenglykol, welches beim Direkttransfer in den Uterus des
Empfängertieres gelangt, auf die Trächtigkeitsraten zu untersuchen.
ä
Die Embryonen wurden 10 min in 1,5 M Ethylenglykol (Emcare , ICP) equilibriert,
anschließend in gelben Pailletten mit einer unterschiedlichen Anzahl an Säulen aufgezogen.
3.3.3. Säulenzahl in der Tiefgefrierpaillette bei Verwendung von Ethylenglykol
− 3 Säulen:
Zunächst wurde eine Säule mit Kulturmedium aufgezogen und nur durch eine Luftblase von
der nachfolgenden Säule mit dem Embryo in Ethylenglykol-TG-Medium getrennt (Abb.6).
Wiederum durch eine Luftblase getrennt, wurde nochmals Kulturmedium aufgezogen. Das
Verhältnis von Ethylenglykol-TG-Medium zu Kulturmedium betrug bei Pailletten mit drei und
vier Säulen ca. 1:2.
92
Abb.6: Füllung der Paillette mit drei Säulen bei Verwendung von Ethylenglycol als
Kryoprotektivum
Ethylenglykol + Embryo
Stopfen
Luftblase
OCM
OCM
Verschlußstick
− 4 Säulen:
Zunächst wurde eine Säule mit OCM, dann durch eine Luftblase getrennt eine nur wenige mm
lange Säule des Ethylenglykol-TG-Medium aufgezogen (Abb.7). Wiederum
durch eine
Luftblase getrennt, folgten dann Ethylenglykol-TG-Medium mit dem Embryo und
Kulturmedium. Bei der Variante mit drei Säulen wurden die Paillettenwände vor dem
Aufziehen der Säule mit Ethylenglykol-TG-Medium nur von OCM benetzt. Dadurch konnte es
zur Verdünnung des Ethylenglykol-TG-Mediums und damit zur Verringerung der
Ethylenglykol-Konzentration kommen. Durch das Aufziehen einer kurzen Säule mit
Ethylenglykol-TG-Medium bei der Variante mit vier Säulen wurden die Paillettenwände mit
Ethylenglykol-TG-Medium gewaschen. Damit wurde sichergestellt, daß das den Embryo
umgebende Ethylenglykol-TG-Medium eine Endkonzentration von 1,5 M Ethylenglykol
aufwies.
93
Abb.7: Füllung der Paillette mit vier Säulen bei Verwendung von Ethylenglykol als
Kryoprotektivum
Ethylenglykol + Embryo
Stopfen
Luftblase
OCM
Ethylenglykol
OCM
Verschlußstick
− 5 Säulen:
Hierbei bestand die mittlere Säule aus Ethylenglykol-TG-Medium und Embryo, durch
Luftblasen von den beidseits gelegenen Säulen Ethylenglykol-TG-Medium getrennt, die
ebenfalls durch Luftblasen von den äußeren OCM-Säulen getrennt waren (Abb.8). Das
Verhältnis von Ethylenglykol-TG-Medium zum Kulturmedium betrug hier ca. 3:2.
Abb.8:
Füllung der Paillette mit fünf Säulen bei Verwendung von Ethylenglykol
als Kryoprotektivum
Ethylenglykol + Embryo
OCM
Stopfen
Luftblase
Ethylenglykol
OCM
Ethylenglykol
Verschlußstick
94
3.4. Tiefgefriervorgang
Die Pailletten mit Embryo in Glycerin-TG-Medium wurden bei +4°C in das Gefriergerät
gegeben und mit -1°C/min auf -6°C gekühlt.
Pailletten mit Embryo in Ethylenglykol-TG-Medium wurden direkt bei -6°C in das Gefriergerät
eingesetzt.
Anschließend wurde sowohl bei Verwendung von Glycerin als auch von Ethylenglykol mit
Hilfe einer in flüssigem Stickstoff vorgekühlten Pinzette das Seeding ausgelöst. Die Haltezeit
betrug 5 min und anschließend wurde mit -0,5°C/min auf -32,5°C heruntergekühlt. Dann
erfolgte das Umsetzen in flüssigen Stickstoff.
3.4.1. Tiefgefrieren auf Alkoholbasis
Für das Tiefgefrieren im Alkoholbad stand ein computergesteuertes Gerät der Firma „Haake“
mit Alkoholbad (SK 91), Programmgeber (PG 20) und Computer (F 53) zur Verfügung.
3.4.2. Tiefgefrieren auf Stickstoffbasis
Dieses erfolgte mit dem Gefriergerät „Cryocell 1200“ der Firma „Sylab“, das auf einen
Stickstoffcontainer aufgesetzt wurde.
95
3.5. Auftau- und Ausverdünnungsvorgang
Die Paillette mit dem Embryo wurde dem Stickstoffbehälter entnommen und für 10 sec in der
Luft und für 15 sec im Wasserbad bei 30°C aufgetaut.
3.5.1. Glycerin
3.5.1.1. 3 Ausverdünnungsschritte (Gly-3)
Zum Ausverdünnen wurde das Embryo Thawing System 1234 von emcare verwendet:
∗ Auftaulösung 1 (6% Gly + 0,3 M Suc)
∗ Auftaulösung 2 (3% Gly + 0,3 M Suc)
∗ Auftaulösung 3 (0,3 M Suc)
Der Embryo wurde unter mikroskopischer Kontrolle aus der Paillette in eine kleine Petrischale
überführt und in den einzelnen Auftauschritten in die jeweilige Auftaulösung gesetzt, dort
5 min belassen und anschließend in die nächste Auftaulösung umgesetzt.
Anschließend wurden 5 min abgewartet, dann wurde der Embryo in OCM umgesetzt, die
Qualität beurteilt und der Embryo mit Kulturmedium zum Transfer in einer Paillette
aufgezogen.
Die Handhabung der Embryonen erfolgte mit einer Insulinspritze und aufgesetzter Unopette.
3.5.1.2. 1 Ausverdünnungsschritt (Gly-1)
Der Inhalt der Paillette wurde in eine Petrischale entleert, der Embryo in eine 0,5 M SucrosePBS-Lösung von emcare umgesetzt.
96
Nach 5 min wurde der Embryo in OCM umgesetzt, die Qualiät beurteilt und der Embryo für
den Transfer vorbereitet.
3.5.2. Ethylenglykol
3.5.2.1. Direkttransfer (EG/DT)
Der Embryo verblieb nach dem Auftauen in der Einfrierpaillette und wurde ohne vorherige
mikroskopische Kontrolle möglichst bald auf das Empfängertier übertragen.
3.5.2.2. Kontrollierte Ausverdünnungsverfahren
Im Unterschied zum Direkttransfer wurden die Embryonen hier vor dem Transfer
mikroskopisch kontrolliert.
− OCM (EG/OCM): Nach Entleeren der Paillette wurde der Embryo in OCM umgesetzt, die
Qualität beurteilt und für den Transfer vorbereitet.
− 1 M Sucrose, OCM (EG/1,0 Suc): Der Embryo wurde in 1 M Sucrose-PBS-Lösung von
emcare umgesetzt. Nach 5 min wurde er in OCM umgesetzt, die Qualität beurteilt und
zum Transfer vorbereitet.
− 0,5 M Sucrose, OCM (EG/0,5 Suc): Statt 1 M Sucrose-PBS-Lösung wurde hier 0,5 M
Sucrose-PBS-Lösung verwendet, ansonsten wurde wie oben verfahren.
97
3.6. Empfängertiere
3.6.1. Vorbereitung der Empfängertiere
Es wurden überwiegend Empfängertiere mit natürlicher Brunst verwendet, aber auch solche,
â
deren Brunst mit Prostaglandin F2α (Pronilen , Intervet) oder einer Vaginalspirale
(Chronopartâ, Intervet) in Kombination mit einer Prostaglandin-Injektion induziert worden
war.
Am Tag 7 nach der Brunst wurden die Empfänger gynäkologisch untersucht und mit Hilfe des
Befundes in Hinsicht auf ihre Qualität eingestuft:
− Klasse 1:
als sehr gut geeignet erscheinende Empfänger (3 Punkte)
Brunst deutlich, zyklusgerechter Gelbkörper, Interöstrus entsprechende
Gebärmutterkonsistenz,
− Klasse 2:
als gut geeignet erscheinende Empfänger (2 ½ Punkte)
geringgradige Abweichung vom optimalen Befund,
− Klasse 3:
als mäßig oder gerade noch für den ET geeignet erscheinende Empfänger
(2 Punkte)
unterschiedliche Abweichungen vom optimalen Befund, z.B. undeutlich zu
palpierender Gelbkörper oder / und kontrahierte Gebärmutter,
(GÖRLACH 1997)
Die zum Transfer geeignet erscheinenden Empfängertiere erhielten ca. 10 min vor dem
Transfer ein Tokolytikum („Uterusrelaxans“, Fa. WDT) i.m. injiziert.
98
3.6.2. Transfervorgang
Das Transfergerät „Modell Minitüb“ wurde mit gefüllter Paillette geladen und mit einer
Schutzhülle überzogen. Anschließend wurde es durch die Vagina eingeführt, die Schutzhülle
zurückgezogen, unter rektaler Kontrolle die Cervix passiert und bis in das kraniale ipsilaterale
Uterushorn vorgeführt. Dort wurde der Embryo unter leichtem Zurückziehen des
Transfergerätes abgesetzt.
3.6.3. Trächtigkeitsuntersuchungen
Die Tiere wurden ab der 6. Woche nach Transfer rektal auf Trächtigkeit untersucht. Allerdings
wurden teilweise Tiere, die 2 Wochen nach dem Transfer eine deutliche Brunst zeigten,
wiederum für einen Transfer oder für eine künstliche Besamung verwendet.
3.7. Statistische Auswertung des Datenmaterials
Die statistische Auswertung wurde am Institut für Biometrie und Epidemiologie an der
Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt. Mit dem SAS-Programm wurden anhand
von Chi-Quadrat-Homogenitätstests die Signifikanzen der einzelnen Einflüsse geprüft. Dazu
wurde die Häufigkeitsverteilung des qualitativen Merkmals „Trächtigkeit“ in den einzelnen
Einflußgruppen,
z.B.
Ausverdünnungsmethoden oder
Embryonenqualität, miteinander
verglichen. Der Unterschied zwischen den Einflüssen, z.B. zwischen zwei verschiedenen
Gefrierschutzmitteln, war signifikant, wenn der errechnete p-Wert < 0,05 war.
Eine Varianzanalyse war bei dem vorhandenen Datenmaterial nicht möglich, da keine
quantitativen Merkmale vorhanden waren.
99
4. Ergebnisse
Im Zeitraum von Oktober 1996 bis Juni 1998 wurden 1066 tiefgefrorene / aufgetaute
Embryonen übertragen, von denen 514 (48,2%) zu einer Trächtigkeit führten.
4.1. Einflüsse auf die Trächtigkeitsrate
4.1.1. Gefrierschutzmittel
Von 1039 Embryonen war das Gefrierschutzmittel bekannt, 573 Embryonen wurden mit 10%
Glycerin (Gly) und 466 mit 1,5 M Ethylenglykol (EG) tiefgefroren.
Wie aus Abbildung 9 ersichtlich, wurde bei Verwendung von Glycerin mit 51,3% eine
signifikant (p < 0,05) bessere Trächtigkeitsrate als bei Verwendung von Ethylenglykol (43,8%)
erreicht.
Abb.9: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom
Gefrierschutzmittel
600
52
51,3A
573
50
466
500
48
400
46
300
43,8
B
44
200
100
204
294
42
0
40
10 % Glycerin
1,5 M Ethylen-glykol
Gefrierschutzmittel
A,B; = p < 0,05
Trächtigkeitsergebnis
(%)
Anzahl Embryonen /
Anzahl trächtige
Empfänger
700
Embryonen
trächtige Empfänger
Trächtigkeitsergebnis (%)
100
Die Veränderung der Embryonenqualität durch Tiefgefrieren in Abhängigkeit vom
verwendeten Gefrierschutzmittel wurde untersucht.
Bei in Glycerin tiefgefrorenen Embryonen nahm die Qualität bei 6,1% (35 von 573) und bei in
Ethylenglykol tiefgefrorenen Embryonen bei 3,6% (17 von 466) ab. Der Unterschied war nicht
signifikant (Tab.17).
Tab.17: Anzahl Embryonen, deren Qualität während der Kryokonservierung in
Abhängigkeit vom Gefrierschutzmittel abnahm
Gefrier-
Embryonen gesamt
schutzmittel
Embryonen, deren
Qualität abnahm
%
n
n
Glycerin
573
35
6,1
EG
466
17
3,6
Die Pailletten wurden bei Verwendung von Ethylenglykol unterschiedlich gefüllt (siehe 3.3.2.),
um den Einfluß unterschiedlicher Volumina an Ethylenglykol beim Direkttransfer zu
untersuchen. Die Anzahl der Säulen in der Paillette war ein Hilfsmittel, um die
unterschiedlichen Füllungen zu beschreiben.
101
Die beste Trächtigkeitsrate wurde mit 47,7% mit fünf Säulen gegenüber 44,7% mit drei und
42,1% mit vier Säulen erreicht (s.Tab.18). Die Unterschiede sind jedoch nicht signifikant
(p > 0,05).
Tab.18: Trächtigkeitsergebnisse bei Verwendung von Ethylenglykol und verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen
Anzahl Säulen
Embryonen gesamt
trächtige Empfänger
%
n
n
n
3
141
63
44,7
4
57
24
42,1
5
268
117
47,7
Es wurden sechs verschiedene Ausverdünnungsmethoden miteinander verglichen, fünf
Methoden mit mikroskopischer Kontrolle und eine Direkttransfermethode (EG/DT).
Hierbei konnten zwischen einzelnen Ausverdünnungsmethoden signifikante Unterschiede
festgestellt werden. Einen Überblick gibt Tabelle 19.
102
Tab.19: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von verschiedenen Ausverdünnungsmethoden
Ausverdünnungs-
Embryonen
trächtige Empfänger
methode
gesamt
n
%
n
Gly-3 1
150
82
54,7A
Gly-1 2
427
215
50,4A
EG/DT 3
274
136
49,6A
EG/OCM 4
129
50
38,8B
EG/1 Suc 5
13
2
15,4B
EG / 0.5 Suc 6
74
27
36,5B
1
= Tiefgefrieren mit Glycerin, drei Ausverdünnungsschritte (drei Schritte mit abnehmender Glycerin-Konzentration und 0,3 M
Sucrose, anschl. Umsetzen in OCM)
2
= Tiefgefrieren mit Glycerin, ein Ausverdünnungsschritt (in 0,5 M Sucrose, dann in OCM)
3
= Tiefgefrieren mit Ethylenglykol, Direkttransfer
4
= Tiefgefrieren mit Ethylenglykol, Ausverdünnen in OCM
5
= Tiefgefrieren mit Ethylenglykol, Ausverdünnen mit 0,5 M Sucrose
6
= Tiefgefrieren mit Ethylenglykol, Ausverdünnen mit 1 M Sucrose
A,B; = p < 0,05
Wie aus Tabelle 19 zu ersehen ist, wurde mit den in Glycerin tiefgefrorenen Embryonen die
höchsten Trächtigkeitsraten erreicht. Die Trächtigkeitsraten bei Gly-3 und Gly-1 unterschieden
sich signifikant von den Trächtigkeitsraten mit Embryonen bei Verwendung von Ethylenglykol,
die unter mikroskopischer Kontrolle ausverdünnt worden sind (EG/OCM, EG/1,0 Suc und
EG/0,5 Suc). Hier wurden Trächtigkeitsergebnisse von 38,8, 15,4 und 36,5% erreicht
Bei EG/DT waren die Trächtigkeitsraten mit 49,6% ähnlich wie bei Verwendung von Gly-3
und Gly-1 und signifikant höher als bei den unter mikroskopischer Kontrolle ausverdünnten
Embryonen, die mit Ethylenglykol tiefgefroren wurden.
103
4.1.2. Embryonenqualität
Bei Klasse 1-Embryonen waren die Trächtigkeitsraten in Abhängigkeit
von der
Embryonenqualität vor dem Einfrieren mit 51,8% höher als bei Klasse 2- und Klasse 3Embryonen mit 26,1 bzw. 21,7% (Abbildung 10). Der Unterschied war signifikant.
Das Trächtigkeitsergebnis der Embryonen der Klasse 4 wurde auf Grund der kleinen
Gruppengröße statistisch nicht verglichen.
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
60
893
51,8
A
50
33,3
463
26,1B
40
30
21,7B
20
142
37
1=
sehr gut
2=
gut
23 5
3=
mäßig
Embryonenqualität
10
3 1
Trachtigkeitsergebnis (%)
Anzahl Embryonen /
Anzahl trächtige
Empfänger
Abb.10: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von
der Embryonenqualität vor dem Einfrieren
0
4=
schlecht
Embryonen
trächtige Empfänger
Trächtigkeitsergebnis (%)
A,B; = p < 0,05
Beim Vergleich der Trächtigkeitsraten in Abhängigkeit von der Embryonenqualität nach dem
Auftauen ergibt sich ein ähnliches Bild (Tab.20). Von 799 Embryonen war die
Embryonenqualität nach dem Auftauen bekannt. Mit Embryonen der Klasse 1 wurde eine
signifikant höhere Trächtigkeitsrate (51,5%) als mit Embryonen der Klasse 2 und 3 (33,0 bzw.
17,5%) erzielt.
104
Tab.20: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von der Embryonenqualität nach
dem Auftauen
Embryonenqualität
Embryonen
trächtige Empfänger
nach Auftauen
gesamt
n
%
n
1
633
326
51,5A
2
103
34
33,0B
3
57
10
17,5B
4
6
1
-
A,B; = p < 0,05
Die Veränderung der Embryonenqualität durch Tiefgefrieren in Abhängigkeit von der
Embryonenqualität vor dem Einfrieren wurde untersucht.
Bei Klasse 1-Embryonen vor dem Einfrieren nahm die Qualität von 29 der 663 Embryonen ab
(Tab.21). Dies entspricht 4,3% und ist im Vergleich mit Embryonen der Klasse 2 (20 = 19,2%)
und der Klasse 3 (3 = 15,8%) ein signifikant geringerer Anteil.
Tab.21: Anzahl Embryonen, deren Qualität während der Kryokonservierung in
Abhängigkeit von der Embryonenqualität vor dem Einfrieren abnahm
Embryonenqualität
Embryonen gesamt
vor Einfrieren
Embryonen, deren
Qualität abnahm
%
n
n
Klasse 1
663
29
4,3A
Klasse 2
104
20
19,2B
Klasse 3
19
3
15,8B
A,B; = p < 0,05
105
Wie aus Tabelle 22 ersichtlich, waren bei Verwendung von Glycerin als Kryoprotektivum bei
allen Embryonenqualitäten (Klasse 1-3) vor dem Tiefgefrieren die Trächtigkeitsraten höher als
bei Verwendung von Ethylenglykol. Dieser Unterschied war bei Embryonen der Klasse 2
signifikant (33,8 gegenüber 19,2%).
Tab.22: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von der Embryonenqualität vor
dem Tiefgefrieren und dem Gefrierschutzmittel
Embryonenqualität
Gefrier-
Embryonen
trächtige Empfänger
vor dem Einfrieren
schutzmittel
gesamt
n
%
n
1
10 % Gly
494
271
54,9
1
1,5 M EG
377
188
49,9
2
10 % Gly
68
23
33,8A
2
1,5 M EG
73
14
19,2B
3
10 % Gly
8
3
37,5
3
1,5 M EG
14
2
14,3
A,B; = p < 0,05
Die Trächtigkeitsraten bei Verwendung von Ethylenglykol mit verschiedenen Füllungen der
Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen (drei, vier oder fünf Säulen) waren bei
Embryonen der Klasse 1 (54,2, 45,8 bzw. 48,6%) und 2 (19,2, 22,2 bzw.18,4%) ähnlich
(Tab.23).
106
Tab.23: Trächtigkeitsraten in Abhängigkeit von der Embryonenqualiät vor dem
Tiefgefrieren und verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen bei Verwendung von Ethylenglykol
Anzahl der
Klasse 1-
trächtige
Klasse 2-
trächtige
Säulen
Embryonen
Empfänger
Embryonen
Empfänger
n
n
n
n
n
3
107
58
54,2
26
5
19,2
4
48
22
45,8
9
2
22,2
5
222
108
48,6
38
7
18,4
%
%
Bei den Trächtigkeitsraten der Embryonen Klasse 1 wurden zwischen den einzelnen
Ausverdünnungsmethoden signifikante Unterschiede gefunden (Tab.24).
Tab.24: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von der Embryonenqualität und
der Ausverdünnungsmethode
Ausverdünnungs-
Klasse 1-
trächtige
Embryonen Empfänger
%
Klasse 2-
trächtige
Embryonen
Empfänger
n
n
%
methode
n
n
Gly-3
125
72
57,6A,B
17
4
23,5
Gly-1
369
192
52,0A
51
19
37,3
EG/DT
233
126
50,1A
38
9
23,7
EG/OCM
92
45
48,9A
24
3
12,5
EG/1 Suc
10
1
10,0C
3
1
-
EG/0,5 Suc
64
26
40,6D
9
1
-
(Anzahl der Embryonen Klasse 3 zu gering)
A,C; B,D; = p < 0,05
107
Bei Klasse 1-Embryonen unterschieden sich Gly-3 (TR 57,6%), Gly-1 (TR 52,0%), EG/DT
(TR 50,1%) sowie EG/OCM (TR 48,9%) signifikant (p < 0,05)) von EG/1 Suc (TR 10,0%),
ebenso wie Gly-3 von EG/0,5 Suc (TR 40,6%).
Bei den Embryonen der Klasse 2 waren die Unterschiede nicht signifikant. Die Gruppen
EG/1 Suc und EG/0,5 Suc wurden wegen zu kleiner Größe nicht berücksichtigt.
4.1.3. Entwicklungsstadium
Mit Morulastadien (M) wurde im Vergleich der verschiedenen Entwicklungsstadien mit 53,6%
die
höchste
Trächtigkeitsrate
erzielt
(Abbildung
11).
Der
Unterschied
zu
den
Trächtigkeitsraten mit beginnenden Blastozysten (BB) mit 46,1% und Blastozysten (B) mit
42,8% war aber nicht signifikant.
Expandierte Blastozysten (EB) wurden wegen zu kleiner Gruppengröße nicht berücksichtigt.
Abb.11: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom
Embryonenstadium
750
60
53,6
734
50
46,1
42,8
600
40
395
450
300
30
20
206
95
150
10
14
6
0
M = Morulae
Embryonen
BB =
Beginnende
Blastozysten
B=
Blastozysten
trächtige Empfänger
Trächtigkeitsergebnis (%)
Embryonenstadium
2
0
1
EB =
Expandierte
Blastozysten
0
Trächtigkeitsergebnis
(%)
Anzahl Embryonen /
Anzahl trächtige
Empfänger
900
108
Mit Glycerin als Kryoprotektivum wurde bei Morulastadien eine signifikant höhere
Trächtigkeitsrate (52,2%) als mit Ethylenglykol als Kryoprotektivum (44,5%) festgestellt
(Tab.25). Bei Blastozystenstadien waren die Trächtigkeitsraten mit Glycerin (48,2%) ebenfalls
höher als bei Ethylenglykol, aber der Unterschied war nicht signifikant (p > 0,05).
Tab.25: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von Entwicklungsstadium und
Gefrierschutzmittel
Gefrierschutz-
Morulae
mittel
trächtige
Empfänger
%
beginnende
trächtige
Blastozysten
Empfänger
n
n
%
n
n
10 % Gly
450
235
52,2A
112
54
48,2
1,5 M EG
380
169
44,5B
84
35
41,7
A,B; = p < 0,05
Gefrierschutz-
Blastozysten
mittel
trächtige
Empfänger
n
%
n
10 % Gly
11
5
45,5
1,5 M EG
3
1
33,3
109
Zwischen den verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen
(drei, vier und fünf Säulen) beim Ethylenglykol ergaben sich sowohl bei den Morulastadien als
auch bei den Blastozystenstadien keine signifikanten Unterschiede (Tab.26).
Bei einzelnen Stadien (Blastozysten und expandierte Blastozysten) waren die Zahlen für die
Auswertung zu gering.
Tab.26: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von Entwicklungsstadium und
verschiedenen Füllungen der Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen
bei Verwendung von Ethylenglykol
Anzahl
Morulae
Säulen
trächtige
Empfänger
%
beginnende
trächtige
Blastozysten
Empfänger
n
n
%
n
n
n
3
125
57
45,6
15
6
40,0
4
41
15
36,5
15
8
53,3
5
214
97
45,3
54
21
38,9
Wie aus Tabelle 27 ersichtlich, waren die Trächtigkeitsraten mit Morulastadien bei Gly-3, Gly1 und EG/DT ähnlich (52,0, 52,3 und 49,3%).
Sie lagen über den Ergebnissen bei EG/OCM, EG/1 Suc und EG/0,5 Suc (42,0, 20,0 und
32,1%), wobei der Unterschied zum EG/0,5 Suc bei allen (Gly-3, Gly-1 und EG/DT)
signifikant war.
110
Tab.27: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von Entwicklungsstadium und
Ausverdünnungsmethode
Ausverdünnungs- Morulae
methode
trächtige
Empfänger
%
beginnende
trächtige
Blastozysten
Empfänger
n
n
%
n
n
Gly-3
125
65
52,0A
22
15
68,2ac
Gly-1
325
170
52,3A
90
39
56,7ad
EG/DT
215
106
49,3A
59
30
50,8a
EG/OCM
112
47
42,0
15
2
13,3b
EG/1 Suc
10
2
20,0
2
EG/0,5 Suc
56
18
32,1B
17
Morulae:
A,B; = p < 0,05
beginnende Blastozysten:
a,b; c,d; = p < 0,05
8
47,1
Bei beginnenden Blastozysten wurden mit Glycerin die besten Trächtigkeitsergebnisse erzielt,
wobei der Unterschied zwischen Gly-3 und Gly-1 (68,2 bzw 56,7%) signifikant war.
Die Trächtigkeitsrate bei Gly-3 (68,2%), Gly-1 (56,7%) und EG/DT (50,8%) lag bei diesem
Entwicklungsstadium signifikant höher als bei EG/OCM (13,3%).
4.1.4. Gefriergerät
902 Embryonen wurden mit dem Gerät auf Stickstoffbasis (N2-Gerät) und 134 mit dem
Alkoholgerät tiefgefroren (Tab.28).
Bei Embryonen, die mit dem Gerät auf Stickstoffbasis tiefgefroren wurden, lag der Anteil der
Transfers, die zur Trächtigkeit führten, mit 48,6% höher als bei Embryonen, die mit dem
111
Alkoholgerät tiefgefroren wurden (42,5%), jedoch war der Unterschied nicht signifikant
(p>0,05).
Tab.28: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom Gefriergerät
Embryonen gesamt
trächtige Empfänger
n
n
Stickstoff
902
438
48,6
Alkohol
134
60
42,5
Gerät
%
Die Veränderung der Embryonenqualität durch Tiefgefrieren in Abhängigkeit vom
verwendeten Gefriergerät wurde untersucht. Wie aus Tabelle 29 ersichtlich, nahm die Qualität
beim Tiefgefrieren mit dem Alkoholgerät bei 17 von 134 Embryonen (12,7%) ab. Dies war ein
signifikant höherer Anteil als mit dem Gerät auf Stickstoffbasis, bei dessen Verwendung die
Qualität bei 32 von 902 Embryonen (3,5%) abnahm.
Tab.29: Anzahl Embryonen, deren Qualität während der Kryokonservierung in
Abhängigkeit vom Einfriergerät abnahm
Embryonen gesamt
Einfriergerät
Embryonen, deren
Qualität abnahm
%
n
n
Alkohol
134
17
12,7A
Stickstoff
902
32
3,5B
A,B; = p < 0,05
112
Nach dem Tiefgefrieren im Alkoholgerät wurde bei Verwendung von Glycerin mit 45,6% eine
höhere Trächtigkeitsrate als bei Verwendung von Ethylenglykol mit 23,8% erzielt (Tab.30).
Signifikant war der Unterschied beim Gerät auf Stickstoffbasis. Hier war die Trächtigkeitsrate
bei Verwendung von Glycerin mit 52,6% höher als bei Verwendung von Ethylenglykol mit
42,9%.
Tab.30: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von Gerät und Gefrierschutzmittel
Gerät
Alkohol
Stickstoff
Gefrierschutz-
Embryonen
trächtige
mittel
gesamt
Empfänger
n
n
Glycerin
114
52
45,6
Ethylenglykol
21
5
23,8
Glycerin
441
232
52,6A
Ethylenglykol
464
199
42,9B
%
A,B; = p < 0,05
4.1.5. Empfängerqualität
Die Trächtigkeitsrate sank mit abnehmender Empfängerqualität (Abbildung 12). Dabei war die
Trächtigkeitsrate bei Klasse 1-Empfängern mit 55,7% am höchsten. Der Unterschied zu
Klasse 2- und Klasse 3-Empfängern (40,8 bzw. 29,6%) war signifikant.
113
Abb.12: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von
der Empfängerqualität
Anzahl Embryonen /
Anzahl trächtige
Empfänger
526
55,7A
60
512
500
50
40,8
400
B
40
29,6B
300
30
293
200
20
209
100
27
10
8
0
Trächtigkeitsergebnis ( % )
600
0
Klasse 1
Klasse 2
Empfängerqualität
Klasse 3
Embryonen
trächtige Empfänger
Trächtigkeitsergebnis (%)
A,B; = p < 0,05
Mit Klasse 1-Empfängern, die einen Embryo erhielten, der mit Gly-3 bzw. Gly-1 ausverdünnt
wurde, wurde mit 67,1 bzw. 57,3% die höchste Trächtigkeitsrate erhalten (Tab.31).
Mit EG/DT wurde bei Klasse 1-Empfängern eine Trächtigkeitsrate von 55,3% erzielt.
Bei den kontrollierten EG-Ausverdünnungsmethoden wurde mit Klasse 1-Empfängern, die
einen Embryo erhielten, der mit der Methode EG/0,5 Suc ausverdünnt wurde, eine
Trächtigkeitsrate von 50,0% erzielt. Mit Klasse 1-Empfängern, die einen Embryo erhielten, der
mit der Methode EG/OCM ausverdünnt wurde, erreichte man eine Trächtigkeitsrate von nur
40,0%. Die Trächtigkeitsrate von 40,0% war signifikant schlechter als die Trächtigkeitsrate bei
Klasse 1-Empfängern, die einen mit Glycerin tiefgefrorenen Embryo erhalten hatten.
114
Tab.31: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von der Ausverdünnungsmethode bei
Klasse 1-Empfängern
Ausverdünnungs-
Embryonen gesamt
trächtige Empfänger
%
methode
n
n
Gly-3
82
55
67,1A
Gly-1
218
125
57,3A
EG/DT
132
73
55,3
EG/OCM
55
22
40,0B
EG/1 Suc
7
2
28,6
EG/0,5 Suc
32
16
50,0
A,B; = p < 0,05
Bei Klasse 2-Empfängern wird mit Gly-1 eine höhere Trächtigkeitsrate (84,6%) als mit Gly-3
(38,7%) erreicht (Tab.32). Die Trächtigkeitsrate bei EG/DT betrug 45,5%. Bei EG/0,5 Suc
war die Trächtigkeitsrate mit 24,3% signifikant schlechter als bei Gly-1 und EG/DT (84,6 bzw.
45,5%)
115
Tab.32: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von der Ausverdünnungsmethode
bei Klasse 2-Empfängern
Ausverdünnungs-
Embryonen gesamt
trächtige Empfänger
methode
n
n
Gly-3
62
24
38,7
Gly-1
104
88
84,6A
EG/DT
132
60
45,5A
EG/OCM
72
28
38,0
EG/1 Suc
5
-
-
EG/0,5 Suc
37
9
%
24,3B
A,B; = p < 0,05
4.1.6. Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh)
Wie aus Abbildung 13 ersichtlich wurden 863 Embryonen auf Rinder übertragen, 179 auf
Kühe.
Bei Rindern wurde mit 50,5% eine signifikant bessere Trächtigkeitsrate erzielt als bei Kühen
(35,8 %).
116
Anzahl Embryonen/
Anzahl trächtige
Empfänger
1000
60
863
50,5A
800
600
50
35,8
436
40
B
30
400
20
179
200
64
10
0
0
Rind
Trächtigkeitsergebnis
(%)
Abb.13: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom
Empfängertier (Rind oder Kuh)
Kuh
Empfängertier
Embryonen
trächtige Empfänger
Trächtigkeitsergebnis (%)
A,B; = p<0,05
Vergleicht man die Trächtigkeitsraten beim Empfängertier zwischen Glycerin und
Ethylenglykol (Tab.33), so findet man beim Rind (53,3 bzw. 46,9%) eine höhere
Trächtigkeitsrate als bei der Kuh (40,4 bzw. 31,1%).
Tab.33: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit vom Gefrierschutzmittel und
Empfängertier (Rind / Kuh)
Gefrierschutz-
Rind / Kuh
Embryonen gesamt
trächtige Empfänger
n
n
Rind
486
259
53,3
Kuh
89
36
40,4
Rind
377
177
46,9
Kuh
90
28
31,1
mittel
Glycerin
EG
%
117
Differenziert man beim Ethylenglykol zwischen den verschiedenen Füllungen der Pailletten mit
unterschiedlichem Mediumvolumen
(Anzahl von
Säulen)
(Tab.34),
so
waren die
Trächtigkeitsraten bei Rindern höher als bei Kühen. Nur bei einer Füllung der Paillette mit drei
Säulen und einem Volumenverhältnis Kulturmedium zu Tiefgefriermedium von 2:1 waren die
Trächtigkeitsraten bei Rind und Kuh ähnlich (45,4 bzw. 43,6%).
Tab.34: Trächtigkeitsergebnisse in Abhängigkeit von den verschiedenen Füllungen der
Pailletten mit unterschiedlichem Mediumvolumen (Anzahl der Säulen) bei Verwendung
von Ethylenglykol und Empfängertier (Rind / Kuh)
Anzahl der Säulen
Rind / Kuh
n
Embryonen
trächtige Empfänger
gesamt
n
%
n
3
4
5
Rind
108
49
45,4
Kuh
32
14
43,6
Rind
45
21
46,7
Kuh
12
3
25,0
Rind
224
107
47,8
Kuh
46
11
23,9
118
5. Diskussion
Die Kryokonservierung von Rinderembryonen wird in der Praxis im Rahmen des
Embryotransfers als ein etabliertes biotechnologisches Verfahren eingesetzt. Der Anteil
tiefgefrorener Rinderembryonen an den Transfers betrug 1998 weltweit mehr als 50%
(THIBIER 1999).
Dabei wurde im Laufe der
Gefrierschutzmittel
verwendet.
Mit
diesem
Jahre überwiegend Glycerin als
Kryoprotektivum
konnten
stabile
Trächtigkeitsraten von ca. 50% erreicht werden, die denen nach Frischtransfer nahe kommen.
Zunächst wurde das Glycerin schrittweise mit abnehmenden Konzentrationen ausverdünnt.
Eine Stabilisierung der Überlebensraten konnte durch das Hinzufügen von Sucrose zum
Ausverdünnungsmedium erreicht werden (NIEMANN 1985; LOONEY et al. 1996).
Von LEIBO (1983) und RENARD et al. (1983) wurde die One-Step-Methode eingeführt. Bei
dieser Methode wird der in der Paillette mit Glycerin eingefrorene Embryo nach dem Auftauen
mit der bis dahin getrennt gehaltenen Sucrose-Lösung vermischt und anschließend direkt
übertragen. Die Ergebnisse des Versuchs führten zu einem verstärkten Einsatz dieser Methode
in der Praxis. Sie konnten jedoch nicht immer bestätigt werden, woraufhin sich diese Methode
nicht durchsetzen konnte (GÖRLACH 1997b; JANOWITZ 1997).
Glycerin wird mit Erfolg in einem Schritt mit Sucrose unter mikroskopischer Kontrolle
ausverdünnt. (HRUSKA 1991; LANDSVERK et al. 1992; ARRESEIGOR et al. 1998).
VOELKEL u. HU (1992a) entwickelten ein Verfahren zum Direktransfer von Embryonen,
wobei mit Ethylenglykol als Gefrierschutzmittel eingefroren wurde. Diese Methode wurde von
den Embryotransfer-Einrichtungen aufgrund der guten Ergebnisse, der Praktikabilität und
geringeren Kosten angenommen. Jedoch kommt es beim Einsatz dieses Verfahrens unter
Feldbedingungen zu größeren Variationen bei den Trächtigkeitsergebnissen (GÖRLACH
1997a, POKORNY u. POKORNY 1997).
Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine retrospektive Analyse verschiedener
Ausverdünnungsmethoden von Kryoprotektiva bei Rinderembryonen nach dem Tiefgefrieren.
Ziel der Arbeit war es, Variationen des Ausverdünnens von Ethylenglykol nach dem
Tiefgefrieren mit den Ergebnissen nach Verwendung von Glycerin zu vergleichen. Neben dem
119
Direkttransfer wurden Methoden ausgewählt, in denen das Ethylenglykol direkt in Medium
oder in einem Schritt mit 0,5 M oder 1 M Sucrose ausverdünnt wurde. Der Einfluß
ausgewählter
Parameter
wie
Embryonenqualität,
Entwicklungsstadium,
Gefriergerät,
Empfängerqualität und Alter des Empfängertiers (Rind / Kuh) wurde auch untersucht.
Die Daten von 1066 tiefgefrorenen und übertragenen Embryonen wurden im Rahmen eines
kommerziellen Embryotransferprogramms unter Praxisbedingungen gewonnen. Es wurden
keine weiteren Embryonen nach einer Methode aufgetaut, wenn sich bereits bei einer kleinen
Gruppengröße besonders schlechte Trächtigkeitsraten zeigten (z.B. beim Ausverdünnen des
Ethylenglykols mit 1 M Sucrose), da es sich um ein kommerzielles Embryotransfer-Programm
handelte. Es gab keine echten Versuchsbedingungen, jedoch stützen sich die Ergebnisse auf ein
relativ großes Datenmaterial.
Insgesamt konnte bei den 1066 Transfers unabhängig vom Gefrierschutzmittel eine
Trächtigkeitsrate von 48,2% erzielt werden. Diese lag knapp unter den für Morulae und
Blastozysten angestrebten 50-60% (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Es wurden jedoch im
Rahmen des kommerziellen Programms auch Embryonen mäßiger und schlechter Qualität
übertragen. Aus dieser Sicht erscheint das Ergebnis zufriedenstellend.
Bei Verwendung von Glycerin wurde das Gefrierschutzmittel nach dem Auftauen entweder in
drei Schritten (Gly-3) oder in einem Schritt
(Gly-1) mit Sucrose ausverdünnt.
ARRESEIGOR et al. (1998) erzielten beim schrittweisen Ausverdünnen des Glycerins mit je
0,3 M Sucrose eine nahezu gleiche Trächtigkeitsrate (45,9%) wie beim Ausverdünnen in einem
Schritt mit 1 M Sucrose (47,2%). Dieser Befund stimmt mit dem der eigenen Untersuchungen
überein, denn die Trächtigkeitsraten beim Ausverdünnen des Glycerins in drei Schritten und in
einem Schritt waren ähnlich (s. Tab.19).
Beim Ausverdünnen des Glycerins in einem Schritt wurde eine Sucrose-Konzentration von
0,5 M verwendet. DEL CAMPO et al. (1990) verwendeten ebenfalls 0,5 M Sucrose zum
Ausverdünnen in einem Schritt. Sie erzielten hierbei nach 24 h in vitro-Kultur (IVC) eine
120
Überlebensrate von 72% und konnten keinen signifikanten Unterschied zur Verwendung von
1,0 M Sucrose bei dieser Methode feststellen. Hingegen beobachteten MERRY et al. (1983)
und HERNANDEZ-LEDEZMA et al. (1988b), daß die Überlebensraten beim Ausverdünnen
von Glycerin mit Sucrose in einem Schritt aus Mäuseembryonen bei einer Konzentration
kleiner als 1,0 M Sucrose sanken. Sie schlugen eine Sucrose-Konzentration von 1,0 - 1,8 M
bzw. 1,0 oder 1,25 M Sucrose vor.
Die Trächtigkeitsrate mit Glycerin, ausverdünnt in drei Schritten (Gly-3), unterschied sich nicht
signifikant von der bei Verwendung von Ethylenglykol mit Direkttransfer (EG/DT) (54,7 bzw.
49,6%). Dies stimmt mit den Ergebnissen von LANGE (1995), KLING (1997) und
ARRESEIGOR et al. (1998) überein, die ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen
den beiden Methoden feststellten. VOELKEL u. HU (1992b) und LOONEY et al. (1996)
erzielten jedoch mit Glycerin, ausverdünnt in drei Schritten, eine signifikant bessere
Trächtigkeitsrate als nach dem Direkttransfer von Rinderembryonen mit Ethylenglykol als
Kryoprotektivum (62 bzw. 39% und 69,6 bzw. 50,0%).
In den eigenen Untersuchungen war kein Unterschied beim Trächtigkeitsergebnis nach
Ausverdünnen mit der Methode Gly-1 und EG/DT (50,4% bzw. 49,6%) festzustellen. Dies
entspricht dem Ergebnis von ARRESEIGOR et al. (1998), die beim Ausverdünnen von
Glycerin in einem Schritt eine Trächtigkeitsrate von 47,2% und beim EG/DT eine
Trächtigkeitsrate von 47,4% erreichten.
Beim Tiefgefrieren von Schafembryonen mit Ethylenglykol erwies sich ein Ausverdünnen mit
Sucrose
in
mehreren
Schritten
als
förderlich
(TERVIT
u.
GOOLD
1984).
McGINNIS et al. (1993) wendeten es ebenfalls bei Schafembryonen an und erzielten auch beim
Ausverdünnen in einem Schritt mit 1,0 M Sucrose gute Ergebnisse. Diese Ergebnisse stehen im
Widerspruch zu den eigenen Resultaten beim Ausverdünnen des Ethylenglykols mit 0,5 bzw.
1,0 M Sucrose bei Rinderembryonen. Hier sanken die Trächtigkeitsraten bei Verwendung von
0,5 M Sucrose und noch deutlicher bei Verwendung von 1,0 M Sucrose im Vergleich zum
Direkttransfer ab. STREICHER (1998) erreichte nach dem Tiefgefrieren von in vitro-
121
Rinderembryonen mit 1,8 M Ethylenglykol und Ausverdünnen in einem Medium, dem 0,3 M
Sucrose zugefügt wurden, eine Schlupfrate von 46,3%. Die Schlupfrate sank auf 37,5%, wenn
dem Ethylenglykol bereits vor dem Tiefgefrieren 0,2 M Sucrose zugefügt und mit 0,3 M
Sucrose ausverdünnt wurde. Den Grund dafür vermutete er in einem Wirkungsverlust des
eigentlichen
Kryoprotektivums
Ethylenglykol
durch
die
zunehmende
Osmolarität.
DOCHI et al. (1995) fügten dem Ethylenglykol vor dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen
Sucrose hinzu und verglichen die Trächtigkeitsrate nach Direkttransfer (52%) mit der von
Embryonen, die nur mit Ethylenglykol tiefgefroren wurden (69%). Das Hinzufügen von
Sucrose hatte keinen positiven Effekt. SOMMERFELD (1997) konnte nachweisen, daß ein
Ausverdünnen von Ethylenglykol-Konzentrationen bis zu 3,6 M bei in vitro-Embryonen ohne
Sucrose in einem Schritt möglich ist. Bei der Vitrifikation von in vitro-Embryonen in einer
Lösung mit Ethylenglykol und Sucrose hatte das Ausverdünnen mit Sucrose unter Zusatz von
Eigelb einen positiven Einfluß auf die in vitro-Überlebensraten (KUWAYAMA et al. 1994a).
Auch ein Ausverdünnen in der Paillette soll mit diesem Verfahren möglich sein.
Beim Gebrauch von Ethylenglykol wurden drei verschiedene Füllungen der Pailletten
verwendet (s. Kap. 3.3.3., Abb.: 6, 7 und 8), um so den Einfluß der unterschiedlichen
Volumina an Ethylenglykol-Lösung, die beim Direkttransfer in den Uterus des Empfängers
gelangen, und die daraus resultierenden unterschiedlichen Konzentrationen des Ethylenglykols
beim Ausverdünnen während des Direkttransfers auf die Trächtigkeitsraten zu untersuchen.
Ein größeres Volumen des Kulturmediums in der Paillette hat ein geringeres Volumen an
Ethylenglykol-Lösung
zur
Folge.
Das Kulturmedium soll beim Direkttransfer die
Ethylenglykol-Konzentration nach dem Auftauvorgang im Embryo und seiner Umgebung
herabsetzen und dafür sorgen, daß eine geringer konzentrierte Ethylenglykol-Lösung in den
Uterus des Empfängers gelangt und dort lokale Effekte auf das Endometrium reduziert werden
(VOELKEL u. HU 1992a).
Beim Tiefgefrieren der Embryonen mit Ethylenglykol konnte kein signifikanter Einfluß der
unterschiedlichen Paillettenfüllungen und Volumina an Kulturmedium und EthylenglykolLösung auf die Trächtigkeitsraten festgestellt werden. Es konnten keine signifikanten
Unterschiede bei den Trächtigkeitsergebnissen zwischen den unterschiedlichen Füllungen der
122
Pailletten in Abhängigkeit von der Embryonenqualität, dem Entwicklungsstadium und dem
Alter des Empfängertieres (Rind oder Kuh) gefunden werden. VOELKEL u. HU (1992b)
verwendeten beim Tiefgefrieren mit Ethylenglykol und anschließendem Direkttransfer
unterschiedliche Füllungen der Pailletten. Im Gegensatz zur vorliegenden Untersuchung wurde
bei einer Variante nur Ethylenglykol in der Paillette aufgezogen. Die andere Variante entspricht
der Paillettenfüllung mit drei Säulen in der vorliegenden Untersuchung. Bei der Variante mit
einer Ethylenglykol-Säule wurden 39% und bei der mit Mediumsäulen in der Paillette 50%
Trächtigkeiten nach Transfer erreicht. Auch bei der Anwendung der One-Step-Methode
dokumentierten SCHUBERTH (1984) und PAVEL (1985) einen Einfluß der unterschiedlichen
Volumenverhältnisse von Glycerin-Tiefgefriermedium zum Sucrose-Ausverdünnungsmedium
(1:9 bzw. 1:2) auf die Trächtigkeitsraten. Bei einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:2 lag
die Trächtigkeitsrate bei 52,9%, bei einem Glycerin / Sucrose-Verhältnis von 1:9 bei nur
31,3% (SCHUBERTH 1984). Im Gegensatz dazu erhielt PAVEL (1985) bei gleichen
Volumenverhältnissen nahezu gegensätzliche Ergebnisse (1:2 = 31% Trächtigkeitsrate; 1:9 =
47% Trächtigkeitsrate).
Zahlreiche
Autoren
untersuchten
den
Einfluß
der
Embryonenqualität
auf
die
Überlebensfähigkeit von Embryonen. NIEMANN (1983) und GODKIN et al. (1987) stellten
für sehr gute Embryonen signifikant bessere Trächtigkeitsraten fest. PRATHER et al. (1987)
stellten unabhängig von den verwendeten Kryoprotektiva (Glycerin oder DMSO) und den
Ausverdünnungsmethoden ebenfalls eine höhere in vitro-Überlebensrate für Klasse 1- und 2Embryonen gegenüber Klasse 3-Embryonen fest (64,8 bzw. 67,8% gegenüber 29,1%). Bei
einem Vergleich von konventionellem Tiefgefrieren mit Vitrifikation wurde über signifikant
bessere Überlebensraten beim konventionellem Tiefgefrieren für Embryonen der Klasse 1 als
für Embryonen der Klasse 2 und 3 berichtet (DE LEEUW et al. 1991). Diese Ergebnisse
stimmen mit denen der eigenen Untersuchungen überein, bei denen für Klasse 1-Embryonen
signifikant höhere Trächtigkeitsraten als für Klasse 2-Embryonen erzielt wurden. Bei einem
Feldversuch von ARRESEIGOR et al. (1998) wurden 1070 Embryonen mit 1,4 M Glycerin
bzw. 1,5 M EG tiefgefroren und in einem oder drei Schritten ausverdünnt bzw. direkt
123
übertragen. Auch hier wurde ein deutlicher Einfluß der Embryonenqualität auf die
Trächtigkeitsrate von tiefgefrorenen Embryonen durch Trächtigkeitsraten von über 50% bei
Klasse 1- und 2-Embryonen aber nur 31,2% bei Klasse 3-Embryonen nachgewiesen. Bei in
vitro-produzierten Rinderblastozysten wurden durch HAN et al. (1994) unabhängig vom
verwendeten Kultursystem nach konventionellem Tiefgefrieren mit 10% Glycerin mit sehr
guten und guten Embryonen signifikant bessere in vitro-Überlebensraten als bei mäßigen und
schlechten Embryonen erzielt.
Mit den Trächtigkeitsergebnissen in Abhängigkeit von der Embryonenqualität der eigenen
Untersuchungen konnten die Aussagen von LINDNER u. WRIGHT (1983) und LEHNJENSEN (1986), eine morphologische Beurteilung von Embryonen vor dem Tiefgefrieren
ermögliche eine Vorhersage der Ergebnisse nach Kryokonservierung und Transfer, bestätigt
werden.
Eine in vitro-Kultur nach dem Auftauen (24 bzw. 48 h) stellt eine andere Möglichkeit zur
Beurteilung
der
Lebensfähigkeit
der
Embryonen dar.
Der
Übergang
von einem
Entwicklungsstadium in das nächste, z. B. Weiterentwicklung zur geschlüpften Blastozyste,
zeugt von einer guten Vitalität der Embryonen (WHITTINGHAM 1980). Jedoch nehmen die
Trächtigkeitsraten nach einer in vitro-Kultur der Embryonen vor dem Transfer ab (HAHN et
al. 1978; RENARD et al. 1978).
Färbetechniken mit Fluoreszenzfarbstoffen sind eine weitere Möglichkeit zur Analyse der
Embryonenqualität nach dem Auftauen. Hierzu zählen die Färbung mit membranpermeablen
3´6´-Fluorescein-Diacetyl (FDA) und 4´6´-Diamidino-2-Phenylindol (DAPI), das intakte
Zellmembranen nicht passieren kann. Mit dieser Technik ist die Unterscheidung lebender und
toter Zellen möglich, und bei sachgerechter Anwendung tritt keine Beeinträchtigung der
Entwicklungsfähigkeit der Embryonen auf (NIEMANN et al. 1981b). Mit der von
SOMMERFELD (1997) angewandten Färbemethode mit Ethidium homodimer und Calcein
nach HAUGLAND u. LARISO (1994) war eine genaue Bestimmung der Gesamtzellzahl sowie
von Zellen mit oder ohne Zellmembrandefekte möglich. Die morphologische Klassifizierung
der Embryonen kann durch diese Fluoreszenztests erheblich objektiviert werden (NIEMANN
et al. 1981b). Die Durchführbarkeit unter Praxisbedingungen erscheint jedoch sehr schwierig.
124
Ein Ziel der eigenen Untersuchungen war es den Einfluß verschiedener methodischer
Parameter auf die Embryonenqualität und damit auf die Überlebensfähigkeit der Embryonen
während des Tiefgefrierens zu beurteilen. Dazu wurde auch die Veränderung der
Embryonenqualität durch das Tiefgefrieren in Abhängigkeit von der Embryonenqualität vor
dem Einfrieren untersucht.
Beim Betrachten der Veränderung während des Tiefgefrierens konnte ein signifikanter Einfluß
der Embryonenqualität vor dem Einfrieren aufgezeigt werden. Der Anteil der Embryonen, die
nach dem Auftauen eine schlechtere Qualität aufwiesen als vor dem Einfrieren war bei
Embryonen der Klasse 2 und 3 signifikant höher als bei Embryonen der Klasse 1. Dies
unterstreicht die Aussage von KENNEDY et al. (1983), daß Embryonen sehr guter Qualität
das Tiefgefrieren besser überleben als solche mit nur guter bzw. mäßiger Qualität. In ihren
Versuchen wiesen mehr Klasse 3-Embryonen (65%) als solche der Klasse 2 und 1 (25 bzw.
9%) nach dem Auftauen eine schlechtere Qualität (Klasse 4) auf. Die Ergebnisse zeigen, daß
infolge des Tiefgefrierens bei Klasse 2- und 3-Embryonen kaum Trächtigkeitsraten zu erzielen
sind, die mit denen beim Frischtransfer vergleichbar sind.
Nach LEHN-JENSEN (1984), SREENAN u. DISKIN (1987) und MUNAR et al. (1989) lagen
die Trächtigkeitsraten nach Transfer von tiefgefrorenen Embryonen um 10% niedriger als die
nach Transfer von frischen Embryonen. MUNAR et al. (1989) erzielten nach Transfer von ca.
3000 Embryonen beim Frischtransfer eine Trächtigkeitsrate von 65,8% und beim Transfer von
tiefgefrorenen Embryonen eine Trächtigkeitsrate von 55,0%. In neueren Arbeiten konnten nach
dem Tiefgefrieren von Rinderembryonen Trächtigkeitsraten von 50-60% erreicht werden, die
denen nach Frischtransfer nahekommen (NIEMANN 1995).
Wenn man die Trächtigkeitsraten in Abhängigkeit vom verwendeten Kryoprotektivum und der
Embryonenqualität betrachtet (Tab.22), so verschlechterten sie sich bei Verwendung von
Glycerin und Ethylenglykol mit Abnahme der Embryonenqualität. Möglicherweise könnten die
Trächtigkeitsraten von 33,8 bzw. 37,5% mit nur guten bzw. mäßigen Embryonen nach dem
Tiefgefrieren mit Glycerin ein Hinweis dafür sein, daß Glycerin bei diesen Embryonenqualitäten
eine bessere Kryoprotektion entfaltet als Ethylenglykol. Das Tiefgefrieren mit 10% Glycerin
und anschließendem Ausverdünnen mit 0,5 M Sucrose in einem Schritt scheint für qualitativ
125
nicht sehr gute Embryonen ein schonendes Verfahren zu sein. Ethylenglykol und die
zugehörigen Ausverdünnungsverfahren erwiesen sich dagegen für das Tiefgefrieren von
Embryonen der Klasse 2 und 3 als nur bedingt geeignet. Dies widerspricht den Ergebnissen
von KLING (1997), der bei seinen Ergebnissen zwischen guten und mäßigen Embryonen
unterschied. Während die Trächtigkeitsraten mit guten Embryonen bei Verwendung von
Glycerin 62,6% und bei Verwendung von Ethylenglykol 51,0% betrugen, lagen sie mit
mäßigen Embryonen bei Verwendung von Ethylenglykol mit 51,2% deutlich höher als bei
Verwendung von Glycerin (43,5%).
Die Frage der Überlebensfähigkeit unterschiedlicher Entwicklungsstadien nach Tiefgefrieren
und Auftauen wird in der Literatur nicht einheitlich beantwortet. Nach LINDNER u. WRIGHT
(1983) hat das Entwicklungsstadium der Embryonen nur einen geringen Einfluß auf die
Trächtigkeitsrate.
Andere Untersucher konnten ebenfalls keinen signifikanten Einfluß des Entwicklungsstadiums
auf die Trächtigkeitsrate feststellen (NELSON u. NELSON 1988), auch wenn jüngere Stadien
(Morulae bzw. beginnende Blastozysten) eine höhere Trächtigkeitsrate als Blastozysten (49,9
bzw. 50,0% gegenüber 44,2%) aufwiesen (FALGE et al. 1990). Bei den eigenen
Untersuchungen war kein signifikanter Einfluß des Entwicklungsstadiums auf die
Trächtigkeitsraten feststellbar, auch wenn mit Morulae eine etwas höhere Trächtigkeitsrate als
mit beginnenden Blastozysten und Blastozysten erzielt wurde (s. Abb.11). Nach KLING
(1997) sind Morulae für die Gefrierkonservierung zu bevorzugen, da sowohl bei Verwendung
von Glycerin wie auch bei Verwendung von Ethylenglykol mit Morulastadien höhere
Trächtigkeitsraten erreicht wurden. MARTINEZ et al. (1999) erzielten beim Tiefgefrieren von
Rinderembryonen mit Ethylenglykol und Sucrose ebenfalls höhere Trächtigkeitsraten mit
Morulae. Beim Tiefgefrieren von Mäuseembryonen erhielten MASSIP et al. (1984) höhere
Überlebensraten bei Morulae als bei beginnenden Blastozysten, Blastozysten und expandierten
Blastozysten. Sie vermuteten als Ursache strukturelle Unterschiede zwischen Morulae und
Blastozysten. Blastozysten besitzen eine mit Flüssigkeit gefüllte Blastocoelhöhle. Diese mit der
Entwicklung
von
der
beginnenden
zur
expandierten
Blastozyste
zunehmende
126
Flüssigkeitsmenge kann einen Einfluß auf die Überlebensrate nach dem Auftauen haben.
Beginnende Blastozysten mit weniger Flüssigkeit überlebten besser als expandierte
Blastozysten mit großem Blastocoel. In Morulastadien befindet sich das Wasser intrazellulär.
Diese Eigenschaft kann ein anderes Verhalten beim Tiefgefrieren bedingen. Während
WILLADSEN (1980) als Grund für geringere Überlebensraten der expandierten Blastozysten
ebenfalls ein großes Blastocoel vermutete, sah NIEMANN (1982; 1983) die Ursache für
deutlich niedrigere Trächtigkeitsraten der expandierten Blastozysten in einer erhöhten
Empfindlichkeit der peripher gelegenen einschichtigen Trophoblastzellage gegenüber dem
schnellen Tiefgefrier- und Auftauprozeß.
Zu einem anderen Ergebnis kam NOHNER (1986), der nach Tiefgefrieren und Transfer von
Rinderembryonen mit Blastozysten ein besseres Trächtigkeitsergebnis als mit Morulae erzielte.
HAN et al. (1994)
untersuchten
die
Überlebensraten
von
in
vitro
produzierten
Rinderembryonen nach Tiefgefrieren mit 10% Glycerin und Ausverdünnen mit Sucrose. Die
Überlebensraten von expandierten Blastozysten waren höher als die von beginnenden
Blastozysten und Blastozysten. Auch bei einem Vergleich von konventionellem Tiefgefrieren
mit der Vitrifikation stiegen die Überlebensraten von in vitro produzierten Rinderembryonen
beim konventionellen Tiefgefrieren mit dem Entwicklungsstadium. Mit geschlüpften
Embryonen wurde eine höhere Überlebensrate als mit Blastozysten und expandierten
Blastozysten erreicht (DINNYES et al. 1995).
In den eigenen Untersuchungen konnte bei den Trächtigkeitsergebnissen in Abhängigkeit vom
Entwicklungsstadium und vom Gefrierschutzmittel ein signifikanter Unterschied festgestellt
werden. Bei Verwendung von Glycerin wurden mit Morulae höhere Trächtigkeitsraten als bei
Verwendung
von
Ethylenglykol
erzielt
(s. Tab.25).
Die
Differenz
zwischen
den
Trächtigkeitsraten bei Verwendung der beiden Kryoprotektiva ist vergleichbar mit der in der
Arbeit von KLING (1997), auch wenn hier die Trächtigkeitsraten für Morulae höher liegen.
Bei Verwendung von Glycerin wurde in diesem Entwicklungsstadium eine Trächtigkeitsrate
von 75,8% und bei Verwendung von Ethylenglykol eine Trächtigkeitsrate von 63,3% erzielt.
LE GAL et al. (1993) verglichen die Überlebensraten von Blastozysten und Morulae bei
Ziegen mit Ethylenglykol und Glycerin als Kryoprotektiva. Bei Morulae wurde die in vitro-
127
Entwicklungsrate durch das Ausverdünnen des Ethylenglykols mit Sucrose gesenkt. Die in
vitro-Entwicklungsrate betrug 14% mit Sucrose und 41% ohne Sucrose. Bei Blastozysten
hingegen hatte das Ausverdünnen des Ethylenglykols mit Sucrose keinen Einfluß auf die in
vitro-Entwicklungsrate. Sie betrug mit Sucrose 64% und ohne Sucrose 67%. Bei Verwendung
von Morulae und dem Ausverdünnen des Ethylenglykols mit 0,5 M Sucrose war die
Trächtigkeitsrate bei den eigenen Untersuchungen signifikant niedriger als beim Direkttransfer
nach Verwendung von Ethylenglykol. Dieser Einfluß war bei den beginnenden Blastozysten
nicht nachweisbar.
Neben den zuvor genannten Einflußfaktoren wurde auch der Einfluß der verwendeten
Gefriergeräte untersucht. Sowohl das Gerät der Firma „Haake“ auf Alkoholbasis wie auch
„Cryocell
1200“
der
Firma
„Sylab“
auf
Stickstoffbasis
werden
regelmäßig
zur
Funktionsüberprüfung an die Hersteller eingeschickt.
WARE u. BOLAND (1987) fanden beim Vergleich eines Gerätes auf Stickstoffbasis mit einem
Alkoholgerät beim Tiefgefrieren von Schafembryonen und anschließender in vitro-Kultur keine
Unterschiede zwischen den Überlebensraten. Auch NIEMANN (1991a) berichtete von fast
gleich hohen Trächtigkeitsraten nach Tiefgefrieren von Rinderembryonen mit transportablen
Gerät auf Stickstoffbasis (59,4%) und einem Alkoholgerät (60,0%). Auch in den eigenen
Auswertungen konnte kein signifikanter Unterschied bezüglich der Ergebnisse zwischen den
beiden Geräten festgestellt werden. Die Trächtigkeitsraten bei der Verwendung des Gerätes
auf Stickstoffbasis lagen mit 48,6% etwas höher als die bei Verwendung des Alkoholgerätes
(42,5%). Die etwas niedrigeren Trächtigkeitsraten beim Alkoholgerät können durch veränderte
Gefrierraten bedingt sein. Die Gefrierraten können durch Bildung von Kondenswasser und
durch einen nicht exakten Alkoholspiegel beeinflußt werden. Der Alkoholspiegel muß immer
wieder überprüft werden, da der Alkohol mit der Zeit verdampft (NIEMANN 1991a).
Der Vergleich der Anteile an Embryonen, deren Qualität sich während des Tiefgefrierens im
Alkoholgerät oder im Gerät auf Stickstoffbasis verschlechterte, ergab hingegen einen
signifikanten Unterschied (s. Tab.29). Die Anzahl der Embryonen, deren Qualität während der
128
Kryokonservierung abnahm, war im Gerät auf Stickstoffbasis signifikant niedriger als im
Alkoholgerät. Dies hatte jedoch keinen Einfluß auf die Trächtigkeitsraten.
Betrachtet man die Ergebnisse bezüglich der Korrelation von Kryoprotektivum und
Gefriergerät, so ergaben sich für Glycerin-Embryonen im Gerät auf Stickstoffbasis signifikant
bessere Ergebnisse als für Ethylenglykol-Embryonen (s. Tab.30). Ergebnisberichte zu dem in
der vorliegenden Arbeit angestellten Vergleich liegen im Schriftum nicht vor. Der einzige
Unterschied beim Tiefgefrieren von Embryonen mit Glycerin bzw. Ethylenglykol im Gerät auf
Stickstoffbasis bestand in der Temperatur, bei der die Embryonen in das Gefriergerät
eingesetzt wurden. Bei Verwendung von Ethylenglykol herrscht ein strengeres Zeitregime als
bei Verwendung von Glycerin. Aus den Erfahrungen verschiedener Embryotransfer-Teams
geht hervor, daß vom Umsetzen der Embryonen in die Ethylenglykol-Lösung bis zum
Erreichen der Seeding-Temperatur höchstens 10 min vergehen sollten. Beim Glycerin ist die
Zeittoleranz größer, daher ist ein langsames Abkühlen bis auf die Seeding-Temperatur möglich
(AET-d Jahrestagung 19./20.6.1997, Neustadt a.d.Aisch) Bei Verwendung von Glycerin
wurden die Embryonen bei +4°C eingesetzt und dann mit -1°C/min auf -6°C gekühlt. Bei
Verwendung von Ethylenglykol wurden die Embryonen direkt bei -6°C eingesetzt. In dieser
unterschiedlichen Vorgehensweise muß der Grund für die schlechteren Trächtigkeitsraten bei
Verwendung von Ethylenglykol beim Gerät auf Stickstoffbasis liegen. Die Paillette wird beim
Alkoholgerät unmittelbar und vollständig vom Kühlmedium umschlossen. Beim Gerät auf
Stickstoffbasis befindet sich die Paillette in einer Kühlkammer. Eventuell ist die Umschließung
der Paillette mit dem Kühlmedium und dadurch auch die Übertragung der Kammertemperatur
nicht immer vollständig. Eine kontinuierliche Übertragung der Kühltemperatur ist aber beim
Ethylenglykol aufgrund der geringeren Zeittoleranz besonders wichtig. Ist diese Voraussetzung
nicht erfüllt, kann dies nach dem Tiefgefrieren der Embryonen mit Ethylenglykol mit dem
Gerät auf Stickstoffbasis zu niedrigeren Überlebensraten führen. NIEMANN u. MEINECKE
(1993) empfahlen beim Gebrauch eines Gefriergeräts auf Stickstoffbasis das Herunterkühlen
der
Pailletten mit
den Embryonen von Raumtemperatur bis auf -7°C, da die
Temperaturangleichung bei diesen Geräten langsamer als im Alkoholbad erfolgt.
129
Ein weiterer Einflußfaktor auf das Trächtigkeitsergebnis ist die Qualität der Empfängertiere.
JANOWITZ (1994) kam zu dem Ergebnis, daß eine rektale Voruntersuchung der Empfänger
mit Beurteilung nach einem Punkteschema eine verläßliche Methode ist und eine Vorhersage
des Transfererfolges erlaubt. Auch eine deutliche Brunstausprägung soll die Erfolgsrate des
Transfers positiv beeinflussen. NELSON u. NELSON (1985) haben gezeigt, daß eine
beobachtete Brunst und ein normaler Gelbkörper zu hohen Trächtigkeitsraten beim
Frischtransfer beitrugen. Eine nicht beobachtete Brunst und ein palpierbarer Gelbkörper oder
eine beobachtete Brunst und ein fraglicher bzw. nicht palpierbarer Gelbkörper führten beim
Frischtransfer zu Trächtigkeitsraten, die denen beim Transfer von tiefgefrorenen Embryonen
mit beobachteter Brunst und palpierbaren Gelbkörper entsprachen.
Hingegen vertraten NIEMANN et al. (1985) den Standpunkt, daß die palpatorische Qualität
des Gelbkörpers in keiner Beziehung zur Trächtigkeitsrate nach Transfer stehe. Auch
HASLER et al. (1987) hielten eine manuelle rektale Palpation und eine Beurteilung des
Empfängers hinsichtlich der Eignung zum Transfer für kein sicheres Kriterium.
Die uterine Umgebung muß geeignet sein, einen Embryo aufzunehmen, um eine Trächtigkeit
durch Embryotransfer zu erzielen. Progesteron ist dazu und zur Aufrechterhaltung einer
Trächtigkeit unabdingbar. Der Progesteronwert zum Zeitpunkt des Transfers wird
üblicherweise durch die Messung der Serumprogesteronkonzentration bestimmt. Der
diagnostische Wert der Serumprogesteronbestimmung wird in der Literatur kontrovers
diskutiert.
REMSON et al. (1982) bestimmten den Serumprogesteronwert unmittelbar vor dem Transfer
und teilten die Empfänger in 3 Klassen ein: <2 ng/ml; 2-5 ng/ml; >5 ng/ml. In der Klasse 25 ng/ml wurde mit 74% die höchste Trächtigkeitsrate nachgewiesen. WEBER et al. (1991)
ermittelten, daß für Empfänger mit Serumprogesteronwerten zwischen 2,0 und 5,5 ng/ml unter
Berücksichtigung der Befunde der rektalen bzw. ultrasonographischen Ovarbeurteilung die
günstigsten
Erfolgsaussichten für
eine Trächtigkeit
bestehen.
Die Autoren dieser
Untersuchungen sehen in der Serumprogesteronbestimmung ein sinnvolles Hilfsmittel bei der
Auswahl der Empfänger und stimmen darin mit SPRECHER et al. (1989), GEIM (1990) und
TENHUMBERG et al. (1991) überein.
130
Die von NIEMANN et al. (1985) und JANOWITZ (1994) am Tag des Transfers ermittelten
Serumprogesteronwerte unterschieden sich bei Empfängern, die konzipierten, und solchen
Empfängern,
die
nicht
konzipierten
nicht
signifikant.
Diese
Autoren
sowie
KITZIG et al. (1986) schlußfolgerten, daß der Serumprogesteronwert zum Zeitpunkt des
Transfers nur einen begrenzten diagnostischen Wert aufweist.
TENHUMBERG et al. (1991) empfahlen die Progesteronbestimmung vor dem Transfer bei
Tieren, deren gynäkologischer Befund fraglich ist. JANOWITZ (1994) gab zu bedenken, daß
diese Methode zur Einordnung von Empfängertieren mit zweifelhaftem Befund einen
erheblichen
zusätzlichen
Zeit-
und
Materialaufwand
verursacht
und
daher
unter
Praxisbedingungen nicht erfolgreich eingesetzt werden kann. Aus diesem Grund hat die
Ermittlung der Empfängerqualität mittels Progesterontest auch keine Bedeutung in der
Embryotransfer-Praxis erlangt (JANOWITZ, NOHNER, PAVEL u. POKORNY 1999).
Das Ergebnis der eigenen Untersuchungen unterstützt die Aussage, daß eine gynäkologische,
rektale Voruntersuchung und eine genaue Brunstbeobachtung eine Vorhersage des
Transfererfolges ermöglicht. Bei den eigenen Untersuchungen
konnte bei Klasse 1-
Empfängern eine Trächtigkeitsrate erzielt werden, die signifikant höher war als die bei
Klasse 2- und Klasse 3-Empfängern (s. Abb.13). Dies belegten ebenfalls SCHUBERTH (1984)
und NOHNER (1986) mit ihren Untersuchungen zum Einfluß der Empfängerqualität auf das
Trächtigkeitsergebnis. Sie erzielten Trächtigkeitsraten von 49,9 bzw. 41,3% für sehr gute, von
29,6 bzw. 38,1% für gute und von nur 20,0 bzw 13,3% für mäßige Empfänger.
Bei Klasse 2-Empfängern sanken die Trächtigkeitsraten ab. Eine Ausnahme stellt die Methode
Gly-1 dar. Hier stieg die Trächtigkeitsrate auf 84,6% an. KLING (1997) verglich in seiner
Arbeit die Trächtigkeitsraten bei den verschiedenen Empfängerqualitäten beim Glycerin. Bei
Verwendung dieses Kryoprotektivums wies er ebenfalls ein Ansteigen der Trächtigkeitsraten
von 51,3% bei guten auf 54,8% bei nur mäßigen Empfängern nach. Die hier übertragenen
Embryonen wurden allerdings nach der Gly-3-Methode ausverdünnt. Das Tiefgefrieren mit
Glycerin und Ausverdünnen mit 0,5 M Suc in einem Schritt stellte sich bei nicht optimalen
Bedingungen bei den eigenen Untersuchungen als das erfolgversprechenste Verfahren heraus.
Dies zeigt sich sowohl bei Verwendung von Klasse 2-Embryonen wie auch bei Empfängern
von nicht sehr guter Qualität.
131
Als Empfänger wurden nur d7-Empfänger verwendet, also solche Tiere, die synchron mit dem
Spender in Brunst waren. Nach HASLER et al. (1987) erreichten d7-Empfänger höhere
Trächtigkeitsraten als die Empfänger mit einer Asynchronität von einem Tag in jede Richtung
(d6 und d8). JANOWITZ (1994) unterstrich dies mit seinen Resultaten zur Untersuchung der
Einflußfaktoren auf den Transfererfolg. Er berichtete von noch befriedigenden Ergebnissen,
wenn die Empfänger 24 h vor oder 24 h nach dem Spender in Brunst waren. LINDNER u.
WRIGHT (1983) beobachteten, daß eine Asynchronität von bis zu 2 Tagen zwischen Spender
und Empfänger die Trächtigkeitsrate nur wenig beeinflußte. Ihnen erschien die Synchronität
zwischen Empfänger und Entwicklungsstadium des Embryos bedeutsamer als die Synchronität
zwischen Spender und Empfänger.
In der vorliegenden Arbeit wurde der mögliche Einfluß des Alters des Empfängertiers (Rind
oder Kuh) auf das Trächtigkeitsergebnis untersucht. ARAVE et al. (1987) übertrugen frische
Embryonen auf Kühe und Rinder und erzielten 45% bzw. 59% Trächtigkeiten. Ein ähnliches
Ergebnis beschrieb auch JANOWITZ (1994), der hoch signifikant unterschiedliche
Trächtigkeitsraten für Rinder (57,5%) und Kühe (44,1%) nachwies. Auch für tiefgefrorene
IVF-Rinderblastozysten lagen die Trächtigkeitsraten nach Transfer nach Angaben von
MASSIP et al. (1995b) bei Rindern höher als bei Kühen. Bei den eigenen Untersuchungen
wurde ebenfalls beim Empfängertier „Rind“ eine signifikant höhere Trächtigkeitsrate (50,5%)
als beim Empfängertier „Kuh“ (35,8%) erzielt. GODKIN et al. (1987) hingegen ermittelten bei
Transfers von tiefgefrorenen Rinderembryonen keine signifikanten Unterschiede zwischen
Rind, Färse und Kuh als Empfängertier.
Die Trächtigkeitsergebnisse wurden auch in Abhängigkeit von Empfängertier und der
Einfriermethode ausgewertet. Dabei konnten sowohl bei Verwendung von Glycerin wie auch
von Ethylenglykol beim Rind höhere Trächtigkeitsraten beobachtet werden. Dieses Ergebnis
stimmt tendenziell mit dem von KLING (1997) überein, der ebenfalls beim Empfängertier
132
„Rind“ sowohl bei Verwendung von Glycerin wie auch bei Ethylenglykol höhere
Trächtigkeitsraten als beim Empfängertier „Kuh“ erhielt.
Zusammenfassend ist feststellbar, daß die retrospektive Analyse der verschiedenen
Ausverdünnungsmethoden von Glycerin und Ethylenglykol nach dem Tiefgefrieren von
Rinderembryonen und unterschiedlicher Einflußfaktoren folgendes ergeben hat:
− Das kontrollierte Ausverdünnen des Ethylenglykols in OCM oder mit Sucrose stellt keine
zufriedenstellende Alternative zum Direkttransfer nach dem Tiefgefrieren mit Ethylenglykol
dar.
− Beim Tiefgefrieren der Embryonen mit 10% Glycerin und anschließendem Ausverdünnen in
3 Schritten mit abnehmenden Glycerin-Konzentrationen und Sucrose oder in 1 Schritt mit
Sucrose konnten unter Feldbedingungen stabile Trächtigkeitsergebnisse von über 50%
erreicht werden.
− Beim Tiefgefrieren mit Ethylenglykol hat die Variation der Anzahl der Säulen und die damit
verbundenen Volumenveränderung der einzelnen Medien keinen Einfluß auf die
Trächtigkeitsraten.
− Durch die Embryonenqualität, die Empfängerqualität und das Alter des Empfängertiers
(Rind oder Kuh) wurde das Trächtigkeitsergebnis signifikant beeinflußt. Mit jeweils sehr
guten Qualitäten bzw. Rindern als Empfänger konnten auch die höchsten Trächtigkeitsraten
erzielt werden.
− Bei reduzierten Embryonen- und Empfängerqualitäten (Klasse 2-Embryonen oder Klasse 2Empfängern) wurden mit der Gly-1-Methode (Tiefgefrieren mit 10% Glycerin und
133
anschließendes Ausverdünnen mit Sucrose in einem Schritt) tendentiell die besten
Ergebnisse erzielt.
− Das Entwicklungsstadium der Embryonen und das verwendete Gefriergerät hatten keinen
signifikanten Einfluß auf die Trächtigkeitsergebnisse. Jedoch konnten tendentiell bessere
Ergebnisse bei jüngeren Entwicklungsstadien (Morulae) beobachtet werden.
− Wenn Morulae mit Glycerin anstatt mit Ethylenglykol tiefgefroren wurden, konnten
signifikant höhere Trächtigkeitsraten erzielt werden.
− Die Wahrscheinlichkeit einer Abnahme der Embryonenqualität während des Tiefgefrierens
stieg an, wenn die Embryonen bereits vor dem Tiefgefrieren eine nur gute (Klasse 2) oder
mäßige Qualität (Klasse 3) aufwiesen.
Sowohl das Tiefgefrieren bei Verwendung von 10% Glycerin mit anschließendem
Ausverdünnen mit 0,5 M Sucrose in einem Schritt unter mikroskopischer Kontrolle wie auch
das Tiefgefrieren mit 1,5 M Ethylenglykol mit anschließendem Direkttransfer stellen nach
dieser
Auswertung
die
optimalen
Tiefgefrierverfahren
für
Rinderembryonen
unter
Praxisbedingungen dar. Dabei sollten möglichst nur Embryonen sehr guter Qualität und Rinder
als Empfänger verwendet werden. Das Tiefgefrieren kann mit dem Gerät auf Stickstoffbasis
oder auch mit dem Alkoholgerät erfolgen.
134
6. Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, in einer retrospektiven Untersuchung den Einfluß
verschiedener Variationen beim Einfrieren und Auftauen von Rinderembryonen unter
Praxisbedingungen auf die Trächtigkeitsraten zu analysieren. Dabei wurden 1066 tiefgefrorene
/ aufgetaute Embryonen übertragen. Die Ergebnisse nach Direkttransfer mit Ethylenglykol
sollten mit denen verschiedener kontrollierter Ausverdünnungsverfahren mit Ethylenglykol mit
oder ohne Sucrose und denen unter Verwendung von Glycerin verglichen werden.
Die gewonnenen Embryonen wurden mit 1,5 M Ethylenglykol oder 10% Glycerin tiefgefroren.
Beim Einsatz von Ethylenglykol wurden die Pailletten unterschiedlich gefüllt. Es wurden
unterschiedliche Volumina an Ethylenglykol-Lösung gewählt und die Anzahl der einzelnen
Säulen in den Pailletten (3, 4 oder 5) wurden variiert. Bei Verwendung von Ethylenglykol
wurden die Embryonen unter mikroskopischer Kontrolle direkt in Kulturmedium, in 1,0 M
Sucrose oder in 0,5 M Sucrose ausverdünnt. Bei Verwendung von Glycerin wurden die
Embryonen in 3 Schritten mit abnehmender Glycerin-Konzentration mit 0,3 M Sucrose bzw. in
einem Schritt mit 0,5 M Sucrose ausverdünnt.
Die Embryonen wurden auf Empfänger übertragen, die ab der 6.Woche auf Trächtigkeit
untersucht wurden.
Einflüsse von Embryonenqualität, Entwicklungsstadium, Gefriergerät, Empfängerqualität und
Alter des Empfängertieres (Rind oder Kuh) auf das Trächtigkeitsergebnis wurden in
Abhängigkeit von den verschiedenen Einfrier- und Auftaumethoden untersucht. Außerdem
wurde die Veränderung der Embryonenqualität durch das Tiefgefrieren in Abhängigkeit vom
verwendeten Kryoprotektivum, der Embryonenqualität und dem Gefriergerät ermittelt.
Die statistische Auswertung wurde mit dem SAS-Programm durchgeführt. Anhand von ChiQuadrat-Homogenitätstests wurden die Signifikanzen der einzelnen Einflüsse geprüft.
135
Folgende Ergebnisse wurden ermittelt:
1. Die Gesamtträchtigkeitsrate für alle Embryonen betrug 48,2%.
2. Nach dem Tiefgefrieren der Embryonen mit Glycerin und Ausverdünnen in drei bzw. einem
Schritt mit Sucrose sowie mit Ethylenglykol und anschließendem Direkttransfer war die
Trächtigkeitsrate (54,7, 50,4 bzw. 49,6%) signifikant höher als nach Tiefgefrieren mit
Ethylenglykol und Ausverdünnen unter mikroskopischer Kontrolle in Kulturmedium
(OCM), 1 M Sucrose oder 0,5 M Sucrose (38,8, 15,4 bzw. 36,5%).
3. Beim Tiefgefrieren mit Ethylenglykol hat die Variation der Anzahl der Säulen und die damit
verbundene Volumenveränderung der einzelnen Medien (Ethylenglykol-Lösung und
Kulturmedium) keinen Einfluß auf die Trächtigkeitsrate.
4. Mit Embryonen der Klasse 1 wurde eine signifikant bessere Trächtigkeitsrate als mit
Embryonen der Klasse 2 erreicht (51,8 bzw. 26,1%).
5. Die Anzahl der Embryonen, deren Qualität während der Kryokonservierung in Abhängigkeit
von der Embryonenqualität vor dem Tiefgefrieren abnahm, war bei Klasse 1-Embryonen
signifikant geringer als bei Klasse 2- und Klasse 3-Embryonen (4,3% gegenüber 19,2 bzw.
15,8%)
6. Das Entwicklungsstadium der Embryonen und das verwendete Gefriergerät hatten keinen
signifikanten Einfluß auf die Trächtigkeitsergebnisse. Jedoch konnten tendentiell bessere
Ergebnisse bei jüngeren Entwicklungsstadien (Morulae) beobachtet werden.
7. Durch die Empfängerqualität und das Alter des Empfängertiers (Rind oder Kuh) wurde das
Trächtigkeitsergebnis signifikant beeinflußt. Mit Klasse 1-Empfängern wurde eine
Trächtigkeitsrate von 55,7% gegenüber 40,8% bzw. 29,6% bei Klasse 2- und Klasse 3-
136
Empfängern erreicht. Die Trächtigkeitsrate bei Rindern, die als Empfänger verwendet
wurden, lag bei 50,5%, die von Kühen bei 35,8%.
8. Bei reduzierten Embryonen- und Empfängerqualitäten (Klasse 2-Embryonen oder Klasse 2Empfängern) wurden nach dem Tiefgefrieren mit Glycerin und dem Ausverdünnen in einem
Schritt mit Sucrose tendenziell die besten Ergebnisse erzielt. Sie unterschieden sich jedoch
nicht signifikant von denen nach Tiefgefrieren mit Glycerin und Ausverdünnen in drei
Schritten und nach Tiefgefrieren mit Ethylenglykol und anschließendem Direkttransfer.
Das kontrollierte Ausverdünnen des Ethylenglykols in Kulturmedium oder mit Hilfe von
Sucrose stellt keine zufriedenstellende Alternative zum Direkttransfer nach dem Tiefgefrieren
mit Ethylenglykol dar. Beim Tiefgefrieren der Embryonen mit 10% Glycerin und
anschließendem Ausverdünnen in drei Schritten mit abnehmenden Glycerin-Konzentrationen
und Sucrose oder in 1 Schritt mit Sucrose konnten unter Feldbedingungen stabile
Trächtigkeitsergebnisse von über 50% erreicht werden.
Sowohl das Tiefgefrieren mit 10% Glycerin und dem anschließendem Ausverdünnen mit 0,5 M
Sucrose in einem Schritt unter mikroskopischer Kontrolle wie auch das Tiefgefrieren mit 1,5 M
Ethylenglykol und anschließendem Direkttransfer stellen gut geeignete Tiefgefrierverfahren für
Rinderembryonen nach dem derzeitigen Wissensstand unter Praxisbedingungen dar. Dabei
sollten möglichst nur Embryonen und Empfänger sehr guter Qualität verwendet werden.
Rinder sind Kühen als Empfängertiere bezüglich der Trächtigkeitsraten vorzuziehen.
137
7. Summary
Barbara Götz
Cryopreservation of bovine embryos with different variations of freezing and defrosting under
practical conditions - a retrospective analysis
The objective of this study was a retrospective analysis of the influence of different variations
of freezing and defrosting of bovine embryos on the pregnancy rates under practical
conditions. For this purpose, 1066 frozen / defrosted embryos were transferred. The results
after direct transfer with ethylene glycol were then compared to the results of various
controlled dilution methods with ethylene glycol with or without sucrose and to those using
glycerol.
The obtained embryos were frozen with 1.5 M ethylene glycol and 10% glycerol, respectively.
When ethylene glycol was used the straws were differently filled. Differing quantities of
ethylene glycol solutions were applied and the respective number of columns in the straw (3, 4,
or 5) was varied. Moreover, with the use of ethylene glycol the embryos were directly
rehydrated in culture medium, 1.0 M sucrose or 0.5 M sucrose, under microscopic control.
When glycerol was used the embryos were rehydrated in three steps with decreasing glycerol
concentrations and 0.3 M sucrose, or in one step with 0.5 M sucrose.
The embryos were transferred to recipients which had been examined for pregnancy from the
sixth week onwards.
The influences of embryo quality, developmental stage, freezing apparatus, recipient quality,
and age of the recipient (heifer or cow) on the pregnancy rate were examined in dependency on
the different freezing and defrosting methods. In addition, the differences of the embryo quality
after deep freezing was investigated in dependence on the used cryoprotectant, the embryo
quality, and the freezing apparatus.
The statistical evaluation was done with the SAS program. The significance of each respective
influence was tested by means of the Chi-Quadrat-Test.
138
The following results were attained:
1. The overall pregnancy rate of all embryos was 48.2%.
2. After freezing the embryos with glycerol in combination with a three or one step
rehydration, as well as after freezing them with ethylene glycol with subsequent direct
transfer, the pregnancy rate (54.7, 50.4, or 49.6%) was significantly higher than after
freezing them with ethylene glycol in combination with a rehydration under microscopic
control in culture medium (OCM), 1 M sucrose or 0.5 M sucrose ( 38.8, 15.4, or 36.5%).
3. In the case of deep freezing with ethylene glycol a variation of the number of columns and,
in connection with that, the change of quantity of the respective medium (ethylene glycol
solution and culture medium) had no influence on the pregnancy rate.
4. The use of class 1 embryos resulted in a significantly better pregnancy rate than the use of
class 2 embryos (51.8 and 26.1%, respectively).
5. The number of embryos whose quality diminished during the cryopreservation depending on
the embryo quality prior to the freezing process was significantly lower when using class 1
embryos as compared to class 2 or class 3 embryos (4.3% against 19.2 and 15.8%)
6. The embryos’ developmental stage and the used freezer had no significant influence on the
pregnancy results. However, the results that could be observed when using younger
developmental stages (Morulae) tended to be better.
7. The pregnancy rate was significantly affected by the quality and age of the recipient (heifer
or cow). The pregnancy rate achieved by class 1 recipients was 55.7% compared to 40.8%
and 29.6% in the case of class 2 and class 3 recipients. The pregnancy rate of heifers used as
recipients was 50.5%, that of cows was 35.8%.
139
8. When the quality of embryos and recipients were reduced (class 2 embryos or class 2
recipients) the best results could be achieved by freezing with glycerol and rehydrating in
one step with sucrose. However, they did not differ significantly from the results after
freezing with glycerol in combination with a three step rehydration and those after freezing
with ethylene glycol with subsequent direct transfer.
The controlled rehydration of ethylene glycol in culture medium or with sucrose is no
satisfactory alternative for the direct transfer after freezing with ethylene glycol. When freezing
the embryos with 10% glycerol in combination with a subsequent rehydration in three steps
with decreasing glycerol concentrations and sucrose or in one step with sucrose stable
pregnancy rates of over 50% could be achieved under field conditions.
Both the freezing with 10% glycerol in combination with subsequent rehydration with 0.5%
sucrose in one step under microscopic control and the freezing with 1.5 M ethylene glycol and
subsequent direct transfer are, to the present knowledge, the optimal deep freezing procedures
bovine embryos under practical conditions. If possible, only high quality embryos and
recipients should be used here. Heifers as recipients should be preferred to cows with regard to
pregnancy rates.
140
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Danksagungen
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. H. Niemann für die Überlassung des Themas und
die freundliche Unterstützung.
Herrn Dr. Albert Görlach danke ich für die Möglichkeit, die Arbeit an der ET-Station Kleve
der RUW durchführen zu können.
Ganz besonders danken möchte ich Dr. Ulrich Janowitz. Er hat die Arbeit angeregt und mir
jederzeit Unterstützung bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit gewährt.
Weiterhin gilt mein Dank den Mitarbeitern des ET-Teams in Kleve Ludwig Hermanns und Dr.
Jakob Westfal für die freundliche Aufnahme und Zusammenarbeit bei der Durchführung der
vielen Spülungen, Kryokonservierungen und Transfers, die die Grundlage für das
Datenmaterial dieser Arbeit geliefert haben.
Herrn Dr. Rohn und Herrn Dr. Meyer vom Institut für Biometrie und Epidemiologie der
Tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich für die große Hilfestellung bei der statistischen
Auswertung.
Frau Isabel Tebartz-Janowitz und Herrn Norbert Hoffmanns danke ich für die Hilfe bei der
Erstellung der Graphiken, Herrn Frank Born für die Hilfe bei der englischen Übersetzung
sowie Herrn Halim Mouhajer für die tatkräftige Unterstützung bei der Korrektur der Arbeit.
Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei Herrn Christian Bodden und Herrn Herbert
Klingbeil für die tatkräftige und seelische Unterstützung bei der Erstellung der Arbeit
bedanken.