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Aus der Klinik für Dermatologie und Venerologie
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
Zur Rolle CD11c+ dendritischer Zellen bei der Induktion
der Niedrigzonentoleranz im murinen Modell der
Kontaktallergie
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i.Br.
vorgelegt im Jahre 2016
von Maike Romer
geboren in Wiesbaden
Dekan: Prof. Dr. Kerstin Krieglstein
1. Gutachter: Prof. Dr. Thilo Jakob
2. Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang Kühn
Jahr der Promotion: 2016
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ................................................................................................ 1
2
Einleitung ............................................................................................................... 2
2.1
Allergisches Kontaktekzem ...................................................................................................... 2
2.2
Irritatives Kontaktekzem ........................................................................................................... 2
2.3
Murines Modell des allergischen Kontaktekzems .................................................................... 3
2.3.1
Kontaktallergene (Haptene) .............................................................................................. 4
2.3.2
Sensibilisierung ................................................................................................................. 5
2.3.3
Auslösephase (Effektorphase) .......................................................................................... 6
2.3.4
Regulationsphase.............................................................................................................. 6
2.4
2.4.1
Zentrale Toleranz .............................................................................................................. 8
2.4.2
Periphere Toleranz ............................................................................................................ 8
2.4.3
Regulatorische T-Zellen .................................................................................................... 9
2.5
Dendritische Zellen ................................................................................................................ 11
2.5.1
Subpopulationen dendritischer Zellen ............................................................................. 12
2.5.2
Funktion in der Immunität ................................................................................................ 13
2.5.3
Funktion in der Toleranzinduktion ................................................................................... 14
2.6
Experimentelle Toleranzmodelle ............................................................................................ 15
2.6.1
Orale Toleranz................................................................................................................. 15
2.6.2
UV-induzierte Toleranz.................................................................................................... 16
2.6.3
"Low Zone Tolerance" ..................................................................................................... 17
2.7
3
Immuntoleranz ......................................................................................................................... 7
Ziele der Arbeit ....................................................................................................................... 19
Material und Methoden ........................................................................................ 19
3.1
Material .................................................................................................................................. 20
3.1.1
Geräte und Plastikware ................................................................................................... 20
3.1.2
Chemikalien und Antikörper ............................................................................................ 21
3.1.3
Software .......................................................................................................................... 24
3.1.4
Versuchstiere .................................................................................................................. 25
3.2
Methoden ............................................................................................................................... 26
3.2.1
Versuchsdurchführung .................................................................................................... 26
3.2.2
Treg-Depletion in DEREG Mäusen ................................................................................. 28
3.2.3
Blutentnahme .................................................................................................................. 28
3.2.4
Lymphknotenpräparation................................................................................................. 29
3.2.5
MACS Isolierung CD11c DZ .......................................................................................... 29
3.2.6
Injektion der CD11c DZ.................................................................................................. 30
+
+
3.2.7
Haptenspezifische Restimulation .................................................................................... 31
3.2.8
3
3.2.9
Zytokin-ELISA ................................................................................................................. 32
H-Thymidin-T-Zell-Proliferationsassay ........................................................................... 31
3.2.10
3.3
4
Durchflusszytometrie..................................................................................................... 33
Statistische Analyse ............................................................................................................... 36
Ergebnisse ........................................................................................................... 37
4.1
+
Untersuchungen zur Rolle der CD11c DZ in der LZT ........................................................... 37
+
4.1.1
Transfer der LZT mit CD11c DZ .................................................................................... 37
4.1.2
Transfer der LZT mit CD8α Zellen ................................................................................. 39
4.1.3
Aktivierung des innaten Immunsystems durch SDS hebt tolerogene Wirkung auf ......... 42
4.1.4
Foxp3 regulatorische T-Zellen induzieren die Entwicklung des tolerogenen
+
+
+
Phänotyps der CD11c DZ in der LZT............................................................................. 46
+
4.1.5
Zellkontakt zwischen tolerogenen CD11c DZ und Tregs im Empfängertier .................. 49
4.1.6
Transfer der LZT mit tolerogenen CD11c DZ in Treg-depletierte Tiere ......................... 51
4.2
+
+
Untersuchungen zur Allergenspezifität der transferierten CD11c DZ ................................... 53
4.2.1
Allergenspezifität der LZT ............................................................................................... 53
4.2.2
Allergenspezifität der übertragenen DZ in der Kontaktallergie mit TNCB, DNFB und
Oxazolon ......................................................................................................................... 55
4.2.3
5
Kreuzreaktivität zwischen TNCB, DNFB und Oxazolon in vivo ....................................... 57
Diskussion ........................................................................................................... 60
5.1
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ....................................................................................... 60
5.2
Rolle der CD11c DZ in der LZT ............................................................................................ 60
5.3
Zusammenspiel der CD11c DZ und Foxp3 regulatorischer Tregs in der LZT ..................... 62
5.4
Treg-Depletion im DEREG-Mausmodell ................................................................................ 64
5.5
Antigenspezifität der LZT und der tolerogenen CD11c DZ ................................................... 65
5.6
Aktivierung des innaten Immunsystems bei Induktion der LZT .............................................. 67
5.7
Klinische Relevanz der Ergebnisse ........................................................................................ 68
+
+
+
+
6
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 70
7
Literaturverzeichnis.............................................................................................. 71
8
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................ 85
9
Publikationen und Kongressbeiträge ................................................................... 88
10 Lebenslauf ........................................................................................................... 89
11 Danksagung......................................................................................................... 91
1 Zusammenfassung
1
Zusammenfassung
Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der häufigsten, berufsbedingten Hauterkrankungen,
die durch die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen eines Kontaktallergens
ausgelöst wird. Für Analysen der pathophysiologischen Mechanismen der Entzündung
werden hauptsächlich Mausmodelle eingesetzt. Im murinen Modell der Kontaktallergie kann
durch wiederholte, epikutane Applikation von subimmunogenen Dosen eines Allergens die
Sensibilisierung unterdrückt und eine Niedrigzonentoleranz (engl.: low zone tolerance, LZT)
induziert werden. Für die Entwicklung dieser systemischen Toleranz sind CD4+CD25+
Foxp3+ regulatorische T-Zellen, CD8+ Suppressor T-Zellen und IL-10 notwendig. Aufbauend
auf diesen Ergebnissen sollte in der vorliegenden Arbeit die Rolle und Funktion der CD11c+
dendritischen Zellen und insbesondere ihre Interaktion mit den regulatorischen T-Zellen
während der LZT sowie ihre Allergenspezifität untersucht werden. Außerdem sollte der
Einfluss einer Aktivierung des innaten Immunsystems auf die Wirkung der LZT geprüft
werden.
In Zelltransferexperimenten konnten gezeigt werden, dass die protektive Wirkung der LZT
mittels CD11c+ dendritischer Zellen in naive Tiere übertragbar ist. Wurden während der
Induktion der LZT jedoch die Foxp3+ regulatorischen Zellen in einem DEREG-Mausmodell in
den Spendertieren depletiert, konnte keine Toleranz mehr mit dendritischen Zellen
transferiert werden und die Entwicklung eines tolerogenen Phänotyps der Zelle blieb aus. Ein
direkter Zellkontakt zwischen tolerogener dendritischer Zelle und regulatorischer T-Zelle im
Empfängertier konnte gezeigt werden, war für die Vermittlung der Toleranz jedoch nicht
notwendig. Ebenso konnte die LZT auch mit CD8a+ T-Zellen in naive Tiere übertragen
werden. Nach Induktion der Toleranz mit dem Kontaktallergen TNCB und der Übertragung
mittels dendritischer Zellen in das Empfängertier, konnte der Effekt der LZT auch bei
Sensibilisierung und Allergenprovokation mit DNFB beobachtet werden, nicht jedoch bei
Oxazolon. Eine Kreuzreaktivität der Kontaktallergene TNCB und DNFB als mögliche
Ursache dieser Beobachtung konnte in vivo jedoch nicht nachgewiesen werden. Ferner
wurde demonstriert, dass bei bereits bestehender Entzündung der Haut und Aktivierung des
innaten Immunsytems im Modell der Kontaktdermatitis keine Niedrigzonentoleranz induziert
werden kann.
1
2 Einleitung
2
2.1
Einleitung
Allergisches Kontaktekzem
Das allergische Kontaktekzem, auch bekannt als allergische Kontaktdermatitis (ACD), ist
eine der häufigsten entzündlichen Hauterkrankungen in den westlichen Industrienationen
und erlangt mit steigender Prävalenz immer größere Bedeutung. In Europa leiden derzeit
etwa 20% der Bevölkerung unter einer Kontaktallergie gegen mindestens ein Allergen, es
sind dabei zweimal so häufig Frauen wie Männer betroffen (Peiser et al. 2012). Auf der einen
Seite beeinträchtigt die Erkrankung, die häufig berufsassoziiert auftritt, die Lebensqualität
des Individuums beträchtlich, auf der anderen Seite resultieren daraus auch hohe Kosten für
das Gesundheitssystem und die Gesellschaft (Belsito 2000).
Es handelt sich beim allergischen Kontaktekzem um eine zellvermittelte Allergie vom Typ IV,
bei der es zunächst zu einer klinisch stumm verlaufenden Sensibilisierung des Patienten
kommt.
Das
Allergen
penetriert
in
dieser
Phase
die
Haut,
wird
dort
von
antigenpräsentierenden Zellen (APZ) internalisiert und prozessiert, um dann nach der
Wanderung der Zellen in den regionalen, hautdrainierenden Lymphknoten dort ansässigen,
naiven T-Zellen via MHC-Molekülen (engl.: major histocompatibility complex, MHC)
präsentiert zu werden. Die nun aktivierten T-Zellen differenzieren zu Gedächtnis-T-Zellen,
die erst bei erneutem Kontakt mit dem Allergen die Haut infiltrieren und dort ihr allergisches
Potenzial
mittels
Chemokin-
und
Zytokinausschüttung
als
auch
einer
direkten
Apoptoseinduktion in Keratinozyten entfalten (Übersicht in Martin et al. 2008a; Martin et al.
2011). Die allergische Reaktion, die sich 12 bis 72 Stunden nach dem zweiten Hautkontakt
mit dem Allergen manifestiert, äußert sich klinisch in Form einer ekzematösen Entzündung
mit Hautrötung, Ödemen, Bläschenbildung und Juckreiz an der Kontaktstelle (Murphy et al.
2007a,b), in schweren Fällen auch über diese hinaus (Übersicht in Martin et al. 2011). Schon
nach einem Zeitraum weniger Tage kommt es im Verlauf zu einem Abklingen der
allergischen Reaktion und dem Einsetzen regulatorischer Mechanismen (Übersicht in
Vocanson et al. 2009). Die pathophysiologischen Mechanismen des allergischen
Kontaktekzems sollen im Weiteren (siehe 2.3) genauer dargelegt werden.
Die Therapie des allergischen Kontaktekzems bedeutet für den Patienten in erster Linie die
Allergenkarenz,
Prävention).
insbesondere
Therapeutisch
nach
kommen
bereits
erfolgter
in
akuten
der
Sensibilisierung
Phase
der
(Sekundäre
Allergie
topische
Glukokortikoide zum Einsatz. Die systemische Gabe von Kortikoidsteroiden ist nur in
einzelnen, schwerwiegenden Fällen indiziert. Neuere, entzündungshemmende Wirkstoffe wie
Alitretinoin, ein Retinoidrezeptoragonist oder topische Calcineurininhibitoren wie Tacrolimus
oder Pimecrolimus bieten weitergehende therapeutische Optionen. Wirkstoffe, welche
spezifisch die Entstehungsmechanismen der Kontaktallergie inhibieren bzw. antagonisieren
2
2 Einleitung
könnten, sind zum jetzigen Zeitpunkt jedoch noch nicht verfügbar (Übersicht in Martin et al.
2011).
2.2
Irritatives Kontaktekzem
Von der allergischen Kontaktdermatitis sollte die irritative Kontaktdermatitis (engl.: irritative
contact dermatitis, ICD) abgegrenzt werden. Hierbei handelt es sich um eine primär
inflammatorische Reaktion der Haut gegenüber physikalischen oder chemischen Noxen, bei
deren Entstehung direkte toxische Effekte zu einer Destruktion der Keratinozyten an der
Kontaktstelle führen (Übersicht in Löffler et al. 2000; Martin et al. 2011). Die ICD ist eine
komplexe Reaktion, welche durch intrinsische und extrinsische Faktoren moduliert wird.
Intrinsische Faktoren, die vor allem die Anfälligkeit eines Individuums an einer ICD zu
erkranken, deutlich erhöhen, sind genetische Prädisposition, Alter, Geschlecht und die der
Noxe ausgesetzte Körperregion. Extrinsische Faktoren wiederum beinhalten die chemische
Zusammensetzung des Agens, die Dauer und Menge der Exposition sowie weitere
mechanische Faktoren (Übersicht in Lee et al. 2013). Im Vergleich zum allergischen
Kontaktekzem handelt es sich hierbei nicht um eine Aktivierung des erworbenen
Immunsystems, sondern um eine Aktivierung des angeborenen (innaten) Immunsystems.
Pathophysiologisch zeigt sich, dass es dabei zu einer Störung der Integrität der Hautbarriere,
zellulären Veränderungen sowie der Freisetzung einer Vielzahl proinflammatorischer
Zytokine kommt (Übersicht in Lee et al. 2013). Die Mechanismen, die zu der Zerstörung der
Hautbarriere führen, sind stark vom auslösenden Agens abhängig. Organische Lösungen
wie zum Beispiel Azeton entziehen dabei dem Stratum corneum Lipide und beeinträchtigen
so die Epidermis (Fartasch et al. 1997). Anionische Tenside wie SDS (engl.: sodium dodecyl
sulfate, SDS) präsentieren freie Wasserbindungsstellen und verursachen auf diesem Wege
eine Hyperhydratation des Stratum corneum und zerstören Proteinstrukturen wie Keratin,
Involucrin, Profilaggrin und Loricrin (Wilhelm et al. 1993, Ponec et al. 1995, Elias et al. 2002).
Schließlich führen diese Abläufe zu einer Induktion zellulärer Abwehrmechanismen des
innaten Immunsystems. Eine wichtige Rolle spielen hierbei insbesondere die Keratinozyten,
die auf die Zerstörung der Haut durch Irritantien mit der Freisetzung von IL-1α reagieren
(Übersicht in Lisby et al. 2006; de Jongh et al. 2007), welches zusätzlich im Rahmen einer
Signalkaskade zur Produktion von IL-1β, TFN-α, IL-6 und IL-8 aus umgebenden epidermalen
und dermalen Zellen führt (Barker et al. 1991; McKenzie et al. 1990). Im weiteren Verlauf
sind dann aus Fibroblasten, Endothelzellen, dendritischen Zellen sowie Lymphozyten
freigesetzte Chemokine und Zytokine an der Aufrechterhaltung der Inflammation beteiligt
(Newby et al. 2000; Eberhard et al. 2004; Ouwehand et al. 2010). Auch im Rahmen der ICD
konnte das Einsetzen regulatorischer Mechanismen wie die Freisetzung von IL-10 und IL-1-
3
2 Einleitung
Rezeptorantagonisten zur Limitation der Entzündung beobachtet werden (Kondo et al. 1994;
de Jongh et al. 2007).
Klinisch präsentiert sich die Erkrankung ähnlich wie das oben erwähnte allergische
Kontaktekzem mit Hautrötung, Ödemen und Juckreiz, so dass eine Unterscheidung nur
durch den Nachweis einer Abwesenheit (ICD) oder Anwesenheit (ACD) antigenspezifischer
T-Zellen möglich wäre. Gleichermaßen besteht für das irritative Kontaktekzem keine kausale
Therapie, womit auch hier in erster Linie die Vermeidung des Kontakts mit dem Irritans von
großer Bedeutung ist.
2.3
Murines Modell des allergischen Kontaktekzems
Um auch die zugrunde liegende immunologische Pathophysiologie des bereits aufgeführten
allergischen
Kontaktekzems
(siehe
2.1)
besser
verstehen
zu
können,
bietet
im
experimentellen Rahmen das Mausmodell der CHS (engl.: contact hypersensibility, CHS)
eine gute Möglichkeit. Klassischerweise wird die akute CHS genau wie die allergische
Kontaktdermatitis in drei aufeinanderfolgende Phasen unterteilt: die Sensibilisierung, die
Auslösung und die Regulation. Im Folgenden soll hier ein chronologischer Überblick der CHS
Reaktion in der Maus mit den wichtigsten beteiligten Zelltypen und Effektormolekülen
gegeben werden.
2.3.1
Kontaktallergene (Haptene)
Initial kommt es in der CHS zum ersten Kontakt des Allergens, auch Hapten genannt, mit der
Haut. Haptene sind lipophile, hochreaktive, kleine Moleküle mit einem niedrigen
Molekulargewicht (<1000 Da), das ihnen ermöglicht, die Hornhautbarriere der Epidermis zu
durchdringen und kovalente Bindungen mit den nukleophilen Resten kutaner Proteine
einzugehen (Übersicht in Christensen et al. 2012). Im Gegenteil zu den aufgrund ihrer
kleinen Größe nicht immunogenen Haptenen, erlangen diese Hapten-Protein-Konjugate
Immunogenität und wirken als Allergene. Experimentell im CHS Modell häufig verwendete
Kontaktallergene sind zum einen halogenierte Nitrobenzole wie TNCB (2,4,6-Trinitro-1Chlorbenzol) und DNFB (1-Fluoro-2,4.dinitrobenzene), zum anderen FITC (Fluorescein),
Oxazolon und anorganische Metallionen wie Nickel, Titan und Chrom.
Zusätzlich zur Immunogenität der Allergene ist für die nächste Phase der CHS, der
Sensibilisierung, jedoch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems über einen
unspezifischen Reizeffekt (Irritanseffekt) der Allergene und eine damit verbundene
entzündliche Reaktion des Gewebes essentiell. Hierbei zeigt sich, dass das irritative
Potential der Allergene im Rahmen der CHS genau wie Irritantien im Rahmen der ICD initial
4
2 Einleitung
zu einer Freisetzung von IL-1α und TNF-α führt (Übersicht in McFadden et al. 2000). Die
Aktivierung des innaten Immunsytems spielt also sowohl in der frühen Phase der CHS als
auch in der ICD eine große Rolle (siehe 2.2). Es kommt zu einer Zunahme
proinflammatorischer Zytokine (IL-6, IL-18, IL-1ß) und einer Abnahme antiinflammatorischer
Zytokine wie IL-10 (Übersicht in Martin et al. 2008a). Im Gegensatz zur Aktivierung der DZ
durch Pathogene, die TL-Rezeptoren triggern und eine eine MyD88- und TRIF-abhängige
Signalkaskade auslösen (Übersicht in Jeong et al. 2011), sind Analysen zur Aktivierung der
DZ durch Kontaktallergene bislang noch Gegenstand der aktuellen Forschung.
2.3.2
Als
Sensibilisierung
Folge
der
Aktivierung
des
angeborenen
Immunsystems
kommt
es
in
der
Sensibilisierungsphase zu einer Rekrutierung und Einwanderung von epidermalen
Langerhans Zellen und dermalen dendritischen Zellen. Nach der Aufnahme (Phagozytose)
und Verarbeitung (Prozessierung) des Haptens, beginnt die Ausreifung (Maturation) und
Auswanderung der nun gut differenzierten antigenpräsentierenden Zellen aus der Haut
entlang der afferenten Lymphbahnen in den regionalen Lymphknoten (siehe 2.5.2). Die
Aktivierung der hier ansässigen naiven T-Zellen erfordert die Kombination drei verschiedener
Signale. Das erste Signal beinhaltet die Interaktion des T-Zell-Rezeptors der CD4+ (engl.:
cluster of differentation 4, CD4) und CD8+ T-Zellen mit den Hapten-Protein-Konjugat
beladenen MHC I- und MHC II-Molekülen der antigenpräsentierenden Zellen (Übersicht in
Vocanson et al. 2009). Als zusätzliches zweites Signal ist die Kostimulation von Rezeptoren
auf den T-Zellen (CTLA-4, CD28, ICOS) durch die Bindung mit Molekülen der B7-Familie der
antigenpräsentierenden Zellen (CD80, CD86) erforderlich (Bour et al. 1995). Für die weitere
Differenzierung in die unterschiedlichen Subtypen der T-Effektor-Zellen ist ein drittes Signal
notwendig:
Hierbei
entscheidend
sind
die
während
der
Interaktion
zwischen
antigenpräsentierender Zelle und T-Zelle produzierten Zytokine, die als Differenzierungsund Proliferationsstimuli wirken (Übersicht in Christensen et al. 2012). Das Zusammenspiel
dieser drei immunologischen Signale ist der entscheidende Schritt in der Phase der
Sensibilisierung
und
führt
zu
einer
Aktivierung
und
klonalen
Expansion
der
haptenspezifischen T-Zellen (Übersicht in Kimber et al. 2002). Diese emigrieren aus den
hautdrainierenden Lymphknoten über die Blutbahn und rezirkulieren zwischen Haut und
Lymphgefäßen (Übersicht in Vocanson et al. 2009). Die Phase der Sensibilisierung ist mit
diesem Schritt beendet.
5
2 Einleitung
2.3.3
Auslösephase (Effektorphase)
Kommt es im Verlauf zu einem erneuten Kontakt der Haut mit dem selben Allergen, wird
dadurch die Auslösephase induziert. Die Allergenexposition führt erneut zu einer Aktivierung
des innaten Immunsystems (s.o.) und zu einer allergen-unspezifischen Entzündung, die
durch Keratinozyten, Mastzellen und Neutrophile vermittelt wird. Die Inflammation des
Gewebes bewirkt dabei die Einwanderung weiterer Zellen in die Haut, unter anderem der
allergen-spezifischen T-Zellen. Diese interagieren mit den lokalen antigenpräsentierenden
Zellen, die zuvor das Allergen aufgenommen und prozessiert haben (Honda et al. 2012). Für
den weiteren Verlauf der Reaktion sind nun die allergen-spezifischen CD8+ Effektor T-Zellen
entscheidend verantwortlich, die durch die Produktion von proinflammatorischen Zytokinen
und Chemokinen (INF-γ, TNF-α und Il-17) eine weitere Infiltration durch Entzündungszellen
wie neutrophile Granulozyten, Monozyten, NKT-Zellen oder γδ T-Zellen auslösen. Das
Signal für die Infiltration wird dabei hauptsächlich durch die direkte Fas/FasL- und Perforinvermittelte Zytotoxizität der CD8+ Effektor T-Zellen gegenüber den lokalen Keratinozyten
vermittelt (Übersicht in Vocanson et al. 2009). Diese lokale zelluläre Infiltration äußert sich
12-48
Stunden
nach
dem
Zweitkontakt
mit
dem
Allergen
klinisch
nun
als
Entzündungsreaktion in Form von Erythemen und Ödemen, gefolgt von Bläschenbildung und
Pruritus. Das allergische Kontaktekzem hat sich etabliert. Chronifiziert die Erkrankung,
kommt es im weiteren Verlauf zu einer Lichenifikation und Schuppung der Haut (Übersicht in
Saint-Mezard et al. 2004).
2.3.4
Einige
Regulationsphase
Tage
nach
dem
Zweitkontakt
mit
dem
Allergen
nimmt
die
Stärke
der
Entzündungsreaktion ab. Dieser Vorgang ist jedoch nicht alleine darauf zurückzuführen,
dass die Menge des Allergens in der Haut reduziert wird, sondern ist vielmehr Ausdruck
verschiedener regulatorischer Mechanismen, die zu einer Suppression der Entzündung
beitragen, um eine Schädigung des Gewebes zu verhindern (Übersicht in Vocanson et al.
2009).
Es
konnte
gezeigt
werden,
dass
hierbei
die
Entfernung
der
lokalen
antigenpräsentierenden dendritischen Zellen durch CD8+ Effektor T-Zellen (Yang et al. 2006)
von Bedeutung ist. Zusätzlich sind gewebeansässige Zellen mit nicht-MHC-Liganden (z.B.
Cadherine, PD-L1, RANK-L) an der Regulierung der Entzündung beteiligt (Lebbink et al.
2007; Keir et al. 2008; Loser et al. 2006). Eine weitere wichtige Rolle spielt die Produktion
antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 und TGF-ß durch Keratinozyten (Übersicht in
Cavani et al. 2007) sowie die Einwanderung und Aktivierung regulatorischer T-Zellen. Die
zeitlichen Abläufe sowie die genauen Mechanismen dieser Regulationsphase, die
6
2 Einleitung
letztendlich zum Abklingen der Kontaktallergie führen, sind Gegenstand laufender
Untersuchungen.
Abb. 1: Pathophysiologie des allergischen Kontaktekzems.
Sensibilisierungsphase: Allergene durchdringen die Epidermis und werden von APZ
aufgenommen (1). Diese migrieren in den hautrainierenden Lymphknoten (2) und
präsentieren das Allergen an T-Zellen (3). T-Zellen expandieren auf diesen Stimulus hin
klonal, wandern über die Blutbahn aus dem Lymphknoten aus und rezirkulieren zwischen
Haut und Lymphgefäßen (4). Auslösephase: Erneuter Allergenkontakt (5) führt zu
Stimulation allergenspezifischer T-Zellen durch APZ in der Haut und im Lymphknoten. Diese
vermitteln die klinisch apparente Entzündungsreaktion und Infiltration von Entzündungszellen
über IFN-γ, TNF-α, IL-17 und andere Mediatoren. Regulationsphase: Abschwächung der
Entzündungsreaktion durch Treg mittels IL-10 und TGF-β und weiterer Mediatoren (6)
(Übersicht in Vocanson et al. 2009; Martin et al. 2011; Pfender 2012).
2.4
Immuntoleranz
Die Fähigkeit körperfremde, pathogene Erreger als solche zu erkennen und abzuwehren ist
jedoch nur eine der Hauptaufgaben des Immunsystems. Ebenso bedeutend für das
Überleben des Individuums ist es, dass körpereigene Zellen identifiziert und nicht angegriffen
werden. Das Immunsystem muss lernen zwischen „Eigen und Fremd“ zu differenzieren, so
dass es weder zu einer überschießenden Reaktion des Immunsystems gegen eigene Zellen
(Autoimmunität)
noch
zu
einer
überschießenden
Reaktion
gegen
harmlose
Fremdorganismen (Allergische Reaktion) kommt.
7
2 Einleitung
Diese Selbsttoleranz des Immunsystems gegenüber körpereigenen Antigenen wird über
zwei unterschiedliche Mechanismen erreicht: die zentrale und die periphere Toleranz.
2.4.1
Zentrale Toleranz
Der Entstehungsort der zentralen Toleranz liegt im
Thymus. Hier wandern die
Vorläuferzellen der T-Lymphozyten aus dem Knochenmark ein und differenzieren zu reifen
T-Zellen während sie einen strengen Selektionsprozess durchlaufen. Für diesen Zweck wird
die Stärke der Bindung (Avidität) des T-Zell-Rezeptors (TZR) der heranreifenden T-Zellen
gegenüber körpereigenen, im Thymus exprimierten MHC/Peptid-Molekülen geprüft. Ist die
Avidität des TZR an die MHC-Allele des eigenen Organismus so hoch, dass es bei einer
reifen T-Zelle zur Aktivierung führen würde, erhält die Zelle ein Signal zur Apoptose und
stirbt (klonale Deletion). Auf diesem Weg werden autoreaktive Zellen aussortiert. Ist das
Signal zu schwach, wird jedoch auch kein Überlebenssignal an die Zelle vermittelt und sie
stirbt ebenfalls (Neglect). Nur so kann die MHC-Restriktion der T-Zell-Antwort garantiert
werden. In diesem Prozess der Negativselektion werden etwa 90% der Zellen aussortiert.
Nur in etwa 3-5 % der Fälle bindet der TZR nun mit mittlerer Avidität an die MHC-Moleküle
der Thymuszellen. Daraufhin erhält die Zelle ein Überlebenssignal, differenziert zur reifen
CD4+ oder CD8+ T-Zelle und wandert nach dieser Positivselektion in die Peripherie aus
(Übersicht in Stritesky et al. 2012).
Gleichwohl scheinen einige Zellen der klonalen Deletion im Rahmen der Negativselektion bei
einer zu starken Affinität gegenüber eigenen MHC/Peptid-Molekülen nicht nur zu entgehen,
vielmehr ist deren spezifische Funktion innerhalb des Immunsystems von genau diesen
„antagonistischen“ Interaktionen abhängig (Übersicht in Stritesky et al. 2012). Bei diesen
Zellen handelt es sich zum einen um natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen
(nTreg), die aus dem Thymus in die Peripherie auswandern und eine Brücke zwischen
zentraler und peripherer Toleranz bilden (Übersicht in Sakaguchi et al. 2010), zum anderen
um invariante natürliche Killerzellen (iNKT), natürliche CD8α+, intraepitheliale T-Zellen (nIEL)
und natürliche Th17-Helferzellen (nTh17), die alle regulatorische Funktionen im Organismus
wahrnehmen. Weshalb diese Zellen für ihre Funktion jedoch eine höhere Autoreaktivität
benötigen, wird kontrovers diskutiert (Übersicht in Stritesky et al. 2012).
2.4.2
Periphere Toleranz
Trotz der oben beschriebenen, zentralen Toleranzmechanismen durchbrechen autoreaktive
T-Zellen regelhaft diese Barriere und existieren in der Peripherie (Bouneaud et al. 2000).
Darüber hinaus sind dort weitere Autoantigene zu finden, die im Thymus nicht exprimiert
8
2 Einleitung
werden. Die Mechanismen der peripheren Toleranz kontrollieren die autoreaktiven T-Zellen
und regulieren bzw. limitieren überschießende Reaktionen gegen pathogene Erreger sowie
harmlose Fremdantigene. Im Folgenden sollen die wichtigsten peripheren Toleranzprozesse
dargestellt werden.
Das Konzept der Ignoranz beschreibt die Tatsache, dass die potentiellen Antigene entweder
nur in sehr geringer Dichte auf der Oberfläche der APZ präsentiert werden oder nur an
immunprivilegierten Orten wie Auge, Plazenta, Uterus oder Testis vorkommen (Jenkins et al.
1987). So treten die Zellen des Immunsystems nur singulär mit ihnen in Kontakt, die
Möglichkeit einer autoimmunen Reaktion wird stark reduziert.
Für das Prinzip der Anergie sind die antigenpräsentierenden Zellen, besonders dendritische
Zellen (DZ), von großer Bedeutung. In Abwesenheit von Infektion, Trauma oder Nekrose
verbleiben diese in einem unreifen Status und präsentieren kontinuierlich Autoantigene auf
ihrer Oberfläche, es fehlen jedoch die kostimulatorischen Moleküle (Mayer et al. 2012).
Dadurch kommt es nur zu einer unvollständigen Aktivierung der autoreaktiven Zellen, über
den Transkriptionsfaktor N-FAT werden zusätzlich CTLA-4 (Greenwald et al. 2001) und PD-1
(Freeman et al. 2000) hochreguliert. Die T-Zelle verbleibt in einem Status der Anergie mit
niedriger IL-2 Produktion und geringer Proliferation (Übersicht in Müller et al. 2010).
Gleichermaßen kann die Präsentation des Selbstantigens auf der dendritischen Zelle auch in
einem aktivierungsinduzierten Zelltod (engl.: activation-induced cell death, AICD) der T-Zelle
resultieren. Die klonale Deletion der T-Zelle wird hierbei durch Fas-, Bim- oder TNFabhängige Apoptose induziert (Weant et al. 2008, Luckey et al. 2011).
Von diesen drei intrinsischen, die passive Aktivierung des Immunsystems betreffenden
Mechanismen, muss die aktive Suppression durch professionelle regulatorische T-Zellen
(siehe 2.4.3) abgrenzt werden. Sind diese aktiviert, werden andere T-Zell-Subpopulationen
und Immunzellen durch unterschiedliche Mechanismen unterdrückt (Chen et al. 1994).
Die Interaktion aller zentraler und peripherer Toleranzmechanismen verhindert im gesunden
Individuum letztendlich die Entstehung von Autoimmunität, Allergie oder überschießender
Reaktionen gegen pathogene Erreger.
2.4.3
Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen spielen eine zentrale Rolle in den Mechanismen der peripheren
Toleranz (siehe 2.4.2.) und supprimieren aktiv autoreaktive T-Zellen, die den Mechanismen
der zentralen Toleranz entkommen sind und T-Zellen, die nach einer Aktivierung des
Immunsystems in der Peripherie entstanden sind. Damit regulieren sie das Auftreten und
den Schweregrad verschiedener Immunkrankheiten wie Autoimmunität, Allergien und
Infektionen (Übersicht in Hawrylowicz et al. 2005).
9
2 Einleitung
Unterteilt werden die regulatorischen T-Zellen in zwei Hauptklassen. Zum einen die natürlich
vorkommenden, im Thymus gereiften CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen (nTreg), die in
hohem Maße den Transkriptionsfaktor Foxp3 (engl.: forkhead box protein p3, Foxp3)
exprimieren, der entscheidend für ihre Entwicklung und Funktion ist. Zum anderen die
induzierbaren regulatorischen T-Zellen (iTreg), die sich unter den Bedingungen einer
Stimulation mit Antigenen in der Peripherie aus CD4+ Zellen entwickeln und sich in weitere
Subpopulationen unterteilen lassen (Übersicht in Hawrylowicz et al. 2005). Ferner
beschreiben Studien zudem regulatorische T-Zellen im CD8+ Zellkompartiment (Übersicht in
Smith et al. 2008).
In der Peripherie machen die, im Thymus herangereiften CD4+CD25+ nTreg ca. 5-10% der
Gesamtzahl der murinen CD4+ Zellen aus und supprimieren die Proliferation und
Zytokinproduktion der CD4+ und CD8+ T-Zellen (Übersicht in Shevach et al. 2009).
Charakterisierender Oberflächenmarker ist hier neben dem bereits 1995 erwähnten
Oberflächenmarker CD25 (α-Kette des IL-2 Rezeptors) (Sakaguchi et al. 1995), vor allem
der Transkriptionsfaktor Foxp3 im murinen System (Hori et al. 2003). Dieser spielt für die
Entwicklung und Funktion der Treg eine wichtige Rolle (Fontenot et al. 2003), im humanen
Immunsystem hingegen ist Foxp3 kein ausschließlicher Marker für Treg (Brunkow et al.
2001). Eine Genmutation dieses Transkriptionsfaktors führt zur Ausbildung der murinen
Autoimmunerkrankung,
der
„scurfy
mice“,
die
mit
schweren
autoimmunologischen
Symptomen einhergeht (Brunkow et al. 2001). Das humane Pendant dazu ist das IPEXSyndrom (engl.: immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked; IPEX),
bei dem ebenfalls durch eine Mutation im Foxp3-Gen schwere autoimmunologische Schäden
an verschiedenen Organen entstehen (Wildin et al. 2001). Kommt es zu einer Aktivierung der
nTreg durch einen Antigenstimulus über den TZR, so zeigen diese selbst eine geringe
Proliferation und IL-2 Produktion, supprimieren jedoch Zell-Zellkontakt abhängig und
antigenunspezifisch konventionelle CD4+ und CD8+ T-Zellen und regulieren über die
Inhibition der IL-2 Produktion die Immunantwort (Übersicht in Thornton et al. 2000).
Neben den konventionellen CD4+ und CD8+ T-Zellen können nTreg auch weitere
Zellpopulationen wie B-Zellen, Mastzellen, APZ, NK und NKT Zellen in ihrer Aktivierung,
Proliferation und Zytokinproduktion unterdrücken (Übersicht in Sakaguchi et al. 2010). Auch
für das Mausmodell der CHS konnte gezeigt werden, dass nTreg durch die Induktion einer
Toleranz die Effektor T-Zellen regulieren, deren Migration in die Haut beeinflussen und damit
allergische Hautreaktionen kontrollieren bzw. terminieren (Ring et al. 2006; Vocanson et al.
2010).
Induzierbare
regulatorische
T-Zellen
hingegen
entstehen
in
der
Peripherie
aus
konventionellen CD4+ T-Zellen durch einen Antigenstimulus; entweder im Milieu einer
Immunreaktion oder induziert durch den Kontakt mit z.B. tolerogenen dendritischen Zellen
10
2 Einleitung
(Übersicht in Buckner et al. 2004; Adler et al. 2007; Taylor et al. 2006). Hierbei können Tr1Zellen, die vor allem über IL-10 ihren regulatorischen Effekt ausüben, von TH3-Zellen, die
mittels TGF-ß regulativ wirken, unterschieden werden (Übersicht im Buckner et al. 2004).
Tr1-Zellen entstehen und proliferieren unter dem Einfluss von IL-10. Das im Anschluss von
ihnen selbst in großen Mengen produzierte IL-10 bewirkt dann eine Herabregulation der
kostimulatorischen Moleküle CD80, CD86 sowie eine Restriktion der MHCII-Moleküle auf
dendritischen Zellen und beeinflusst somit deren Potenzial konventionelle T-Zellen zu
aktivieren (Übersicht in Buckner et al. 2004). Auch hat IL-10 einen direkten Einfluss auf CD4+
T-Zellen und kann in diesen eine Anergie auslösen (Groux et al. 1996). Neben IL-10
produzieren diese Zellen zusätzlich TGF-ß und IFN-γ, jedoch kein IL-2 oder IL-4 (Levings et
al. 2002). Die TH3-Zellen hingegen entstehen in Gegenwart von TGF-ß, IL-4 und IL-10 und
vermitteln ihre regulatorischen Eigenschaften über die Produktion großer Mengen von TGF-ß
(Übersicht in Buckner et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass sie bei der Induktion der
oralen Toleranz (siehe 2.6.1), die durch die Gabe kleiner Antigendosen vermittelt wird, eine
Rolle spielen (Übersicht in Weiner et al. 2001). Neben diesen zwei Hauptpopulationen
regulatorisch wirkender T-Zellen ist die Abgrenzung weiterer Subpopulationen möglich;
insbesondere in der Population der iTreg gibt es anerge Zellen, die IL-10- und TGF-ßunabhängig induziert werden können, sowie Untergruppen, deren Abgrenzung gegenüber
den nTreg aufgrund ihres Phänotyps (CD4+CD25+Foxp3+) schwerfällt (Zheng et al. 2002;
Chen et al. 2003).
2.5
Dendritische Zellen
Bereits 1868 wurde die erste dendritische Zelle in der Haut, die sogenannte Langerhans
Zelle, von Paul Langerhans in der Epidermis entdeckt (Übersicht in Sato et al. 2007). Etwa
100 Jahre später, 1973, identifizierten Steinmann und Cohn murine Milzzellen mit einer sehr
individuellen Morphologie, den Dendriten, und nannten diese potenten Stimulatoren der
primären Immunantwort dendritische Zellen (DZ) (Steinman et al. 1973, 1974). Wie bereits in
den vorangegangenen Abschnitten erwähnt wurde, handelt es sich hierbei um professionelle
Antigen-präsentierende Zellen (APZ), die pathogene Erreger erkennen, internalisieren,
prozessieren
und
anschließend
naiven
T-Zellen
präsentieren
und
damit
eine
antigenspezifische T-Zell-Immunantwort gegenüber pathogenen Erregern oder veränderten
Körperzellen induzieren. Darüber hinaus spielen DZ jedoch auch eine entscheidende Rolle in
der Induktion und Aufrechterhaltung der zentralen und peripheren Toleranz gegen
körpereigene Antigene (siehe 2.4.1. und 2.4.2.), z.B. durch die Generierung regulatorischer
T-Zellen (Übersicht in Mellman et al. 2001). Neben ihrer Funktion für die adaptive
Immunantwort sind die DZ als sogenannte „Sentinels“ in der innaten Immunantwort von
11
2 Einleitung
großer Bedeutung (Übersicht in Sato et al. 2007). Diese diversen, teils gegensätzlichen
Funktionen der DZ hängen von ihrem Subtyp, der Lokalisation sowie ihrem Aktivierungstatus
ab (Übersicht in Takeuchi et al. 2007).
2.5.1
Subpopulationen dendritischer Zellen
Die Vorläuferzellen der DZ entwickeln sich aus einer hämatopoetischen Stammzelllinie im
Knochenmark, bilden dann jedoch sehr heterogene Populationen, die Unterschiede in den
exprimierten Oberflächenmarkern, im Migrationsverhalten, in der Zytokinproduktion und ihrer
Funktion aufweisen (Übersicht in Wu et al. 2004; Kushwah et al. 2011). Murine DZ werden
grundsätzlich durch die Expression von CD11c und MHCII-Molekülen charakterisiert und
können zusätzlich CD4, CD8α, CD11b und CD205 koexprimieren (Übersicht in Sato et al.
2007). In der Vergangenheit wurde hierbei zwischen zwei Untergruppen der DZ
unterschieden: CD8α+ myeloide DZ (mDZ) und CD8α- plasmazytoide DZ (pDZ), jeweils
benannt nach ihren Vorläuferzellen (Übersicht in Pansokaltsis et al. 2004). Aktuellere
Studien beweisen jedoch, dass die Generierung der DZ-Subpopulationen aus sowohl
lymphoiden als auch plasmazytoiden Vorläuferzellen möglich ist (Martin et al. 2000; Traver et
al. 2000). Demnach werden die DZ aktuell in die zwei Hauptkategorien der konventionellen
DZ (cDZ) und plasmazytoiden DZ (pDZ) eingeteilt (Übersicht in Takeuchi et al. 2007).
Konventionelle DZ exprimieren hohe Level an CD11c und können wiederum in 2
Untergruppen klassifiziert werden: Zum einen die migratorischen cDZ, die sich im peripheren
Gewebe entwickeln, konstitutionell in die Lymphknoten emigrieren sowie unabhängig von
einem inflammatorischen Stimulus einen maturen Phänotyp ausbilden (Walton et al. 2006;
Wilson et al. 2008; Übersicht in Villandangos 2007). Dieser Gruppe werden auch epidermale
Langerhans Zellen, pulmonale DZ (CD103+CD11b- bzw. CD103-CD11b+) und kürzlich
entdeckte dermale DZ (CD103+CD11b-Langerin+ bzw. CD103-CD11b+Langerin-) zugeordnet
(Hintzen et al. 2006; Bursch et al. 2007).
Zum anderen die residenten cDZ, die sich in den lymphatischen Geweben aus
Vorläuferzellen entwickeln und dort bis zu einem inflammatorischen Signal in ihrem unreifen
Status verbleiben. Ein Beispiel sind die als einzige auch in der Milz ansässigen CD8α+ und
CD8α- residenten cDZ (Bedoui et al. 2009).
Plasmazytoide DZ zeigen eine runde, plasmazytoide Morphologie und exprimieren TLR7 und
TLR9, die virale RNA und DNA erkennen und über eine PI3-Kinase vermittelte
Signalkaskade die Produktion von Typ 1 Interferon initiieren können (Guiducci et al. 2008;
Übersicht in Takeuchi et al. 2007; Kushwah et al. 2011). Als IFN- und IL-6-Quelle scheinen
pDZ auch eine Rolle in der Differenzierung von aktivierten B-Zellen zu Plasmazellen zu
spielen (Jego et al. 2003). Zusätzlich zeigen Studien im Modell der experimentellen
12
2 Einleitung
Autoimmunencephalitis (AIE), dass pDZ in die Lymphknoten migrieren, dort eine Expansion
regulatorischer T-Zellen hervorrufen und somit eine periphere Toleranz induzieren können
(Irla et al. 2010). Ferner konnte demonstriert werden, dass pDZ die Generierung IL-10
produzierender Tregs beeinflussen können (Ito et al. 2007). Die unterschiedlichen
Fähigkeiten der pDZ auf der einen Seite immunogen und auf der anderen Seite tolerogen zu
wirken und die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht vollständig geklärt.
Neben den hier beschriebenen 2 Hauptklassen existieren noch sogenannte Monozytenabgeleitete DZ, die im Gastrointestinaltrakt, in der Lunge, der Haut und den Nieren
vorkommen und ebenfalls die Fähigkeit besitzen, Antigene aufzunehmen und in die
drainierenden Lymphknoten zu migrieren (Übersicht im Kushwah et al. 2011).
2.5.2
Funktion in der Immunität
Im Folgenden soll nun die Rolle der dendritischen Zellen in ihrer Funktion für die Immunität
eines Organismus detaillierter dargestellt werden. Durch ihre Existenz in fast allen
peripheren
Geweben,
insbesondere
den
Körperoberflächen
(z.B.
der
Haut,
der
respiratorischen und gastrointestinalen Schleimhäute), bilden sie als sogenannte Wächter
(engl.: sentinel) eine erste Linie der Verteidigung gegenüber eindringenden Pathogenen
(Übersicht in Novak et al. 2008). Sie sind zunächst also ein wichtiger Bestandteil des
angeborenen Immunsystems. Die hier vorkommenden, immaturen dendritischen Zellen (iDZ)
sind
gekennzeichnet
durch
ein
niedrige
Oberflächenexpression
von
MHC-
und
kostimulatorischen Molekülen (Übersicht in Pasare et al. 2004). Vielmehr zeichnen sie sich
durch ihre Spezialisierung zur Antigenaufnahme über Phagozytose oder Pinozytose aus
(Übersicht in Novak et al. 2008). Immature DZ registrieren Erreger hierbei über pathogenassoziierte, molekulare Bestandteile (engl.: pathogen associated molecular patterns, PAMP)
wie Lipopolysaccharide (LPS), Peptidoglykane, Mannane oder bakterielle und virale
DNA/RNA. Diese binden an spezialisierte Rezeptoren auf der Oberfläche und im
Intrazellulärraum der iDZ, den sogenannten PRR (engl.: pattern recognition receptors, PRR).
Zu dieser Familie gehören u.a. TL-Rezeptoren (engl.: toll-like receptors, TLR) und MannoseRezeptoren (CD206) (Übersicht in Sato et al. 2007; Novak et al. 2010).
Detektiert eine iDZ ein pathogenes Protein, wird dieses internalisiert und zu Peptiden
prozessiert, die nun auf der Zelloberfläche via MHC I- und MHC II-Molekülen präsentiert
werden. Gleichzeitig entwickelt sie einen reifen (maturen) Phänotyp, das bedeutet den
Verlust der Fähigkeit zur Endozytose, die Hochregulation der MHC II-Expression an der
Zelloberfläche, eine vermehrte Produktion kostimulatorischer Moleküle wie CD40, CD80 und
CD86 sowie Veränderungen in der Morphologie mit Ausbildung der zelltypischen Dendriten
(Übersicht in Sato et al. 2007; Al-Alwan et al. 2001).
13
2 Einleitung
Darüber hinaus verliert die DZ ihr Sensitivität gegenüber inflammatorischen Chemokinen wie
CCL3, CCL5 und CCL20 über die Herabregulation oder Desensibilisierung der Rezeptoren
(z.B. CCR1, CCR5,CCR6) und steigert ihre Empfindlichkeit für homöostatische Chemokine
wie CCL19 und CCL21 (Übersicht in Sato et al. 2007). Infolgedessen migriert die DZ aus
dem entzündeten Gewebe über die drainierenden Lymphbahnen in den Lymphknoten
(Übersicht in Smits et al. 2005). Auf diesem Weg gelangen Antigene in zellgebundener Form
in die peripheren lymphatischen Organe, um dort den naiven, antigenspezifischen CD4+ und
CD8+ T-Zellen präsentiert werden zu können und deren Differenzierung zu Effektorzellen zu
induzieren (Übersicht in Sato et al. 2007; Wu et al. 2004). Hiermit bildet die dendritische
Zelle eine wichtige Verbindung zwischen angeborenem und erworbenem Immunsystem.
Die Aktivierung der naiven T-Zellen erfordert in der Interaktion mit der dendritischen Zelle,
wie bereits beschrieben, die Kombination 3 verschiedener Signale (siehe 2.3.2). Dadurch
können die maturen DZ eine TH1, -TH2- oder eine TH17-Antwort und damit eine primäre
Immunantwort initiieren.
2.5.3
Funktion in der Toleranzinduktion
Neben der Fähigkeit der dendritischen Zellen das Immunsystem zu aktivieren, spielen sie auf
der anderen Seite auch eine wichtige Rolle in der Induktion der Toleranz und der
Eindämmung der Immunantwort (Übersicht in Saei et al. 2013). Dabei vermitteln sie zum
einen in der Peripherie die Toleranz gegenüber Selbstantigenen in antigenspezifischen CD4+
T-Zellen (Hawiger et al. 2001) und in CD8+ T-Zellen (Bonifaz et al. 2002; Probst et al. 2003)
über die bereits beschriebenen Prinzipien der Anergie und des aktivierungsinduzierten
Zelltodes (siehe 2.4.2). Sie präsentieren dabei in Abwesenheit inflammatorischer Stimuli
kontinuierlich endozytotisch aufgenommene und prozessierte Selbstantigene (Übersicht in
Steinman et al. 2003). Vermitteln die DZ die Toleranz an CD8+ T-Zellen, spielt der
Mechanismus der Kreuzpräsentation eine wichtige Rolle. Kreuzpräsentation bedeutet, dass
extrazelluläre Antigene auf MHC I-Molekülen an CD8+ T-Zellen präsentiert werden können
und damit die Kreuztoleranz endogener autoreaktiver Zellen mediiert werden kann.
Funktioniert dieser Mechanismus nicht, akkumulieren diese autoreaktiven CD8+ T-Zellen in
peripheren lymphatischen Geweben (Luckashenak et al. 2008).
Zum anderen erfordert die Funktion der tolerogenen DZ auch die Anwesenheit
regulatorischer T-Zellen. Werden Foxp3+CD4+ Treg depletiert, so entwickeln die DZ einen
aktivierten Phänotyp und tolerisieren nicht mehr die peripheren CD8+ T-Zellen, sondern
induzieren eine zytotoxische T-Zell-vermittelte Immunantwort (Schildknecht et al. 2010).
Außerdem entwickeln Mäuse unter Treg-Depletion Autoimmunität (Übersicht in Kim et al.
14
2 Einleitung
2007; Lahl et al. 2007). Die Interaktion zwischen beiden Zellpopulationen scheint also
essentiell für die Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz zu sein.
2.6
2.6.1
Experimentelle Toleranzmodelle
Orale Toleranz
Das gastrointestinale Immunsystem (GALT, engl.: gut-associated immune system) wird als
das größte immunologische Organ des Körpers konstant mit zahlreichen Antigenen und
bakteriellen Bestandteilen aus der Nahrung konfrontiert. Dennoch entwickelt nur ein kleiner
Prozentsatz der Patienten eine Nahrungsmittelallergie, da innerhalb der Darmmukosa eine
Toleranz gegen diese Antigene ausgebildet wird (Übersicht in Chehade et al. 2005).
Entstehungsort der oralen Toleranz im Darm sind vor allem die Peyer’schen Plaques, die als
Lymphfollikel entlang des gesamten Dünndarms in der Submukosa liegen, sowie die
mesenterialen Lymphknoten. Unter dem Begriff der oralen Toleranz sind hierbei
unterschiedliche, antigenspezifische Mechanismen der Toleranz zusammengefasst. Niedrige
Antigendosen führen häufiger zur Induktion von Tr1, Th3 oder CD4+CD25+ T-Zellen, die über
TGF-ß und IL-10 regulatorisch wirken können; hohe Antigendosen vermitteln am ehesten
durch das Fehlen kostimulatorischer Moleküle auf APZs eine klonalen Anergie/Deletion der
Effektorzellen (Übersicht in Chehade et al. 2005; Faria et al. 2005), (siehe auch 2.4.2).
Im Folgenden sollen besonders die Mechanismen der oralen Toleranz gegenüber Haptenen
wie z.B. Kontaktallergenen dargestellt werden. Im Gegensatz zu der oralen Toleranz gegen
Proteine zeigt sich, dass die Peyer’schen Plaques bei der Administration von Allergenen
bzw. Haptenen zur Toleranzinduktion eine untergeordnete Rolle spielen (Fujihashi et al.
2001). Die Toleranz kann hier zum einen durch die orale Gabe einer sehr hohen
Haptendosis von z.B. DNFB oder TNCB induziert werden (Desvignes et al. 2000; Gautam et
al. 1989). Zum anderen führte auch die Gabe sehr niedriger, subimmunogener Dosen des
Haptens, hier TNCB, zur Entwicklung einer durch IL-10 produzierende CD4+ T-Zellen
induzierten Population von CD8+ Suppressor T-Zellen, die eine sogenannte „low zone
tolerance (LZT)“ hervorrufen (Seidel-Guyenot et al. 2006). Eine zentrale Rolle in der
Vermittlung der Toleranz spielen hier neben natürlich vorkommenden CD4+CD25+ Treg
(Dubois et al. 2003) vor allem plasmazytoide dendritische Zellen, welche in der Leber und in
den mesenterialen Lymphknoten die klonale Deletion der antigenspezifischen CD8+ Effektor
T-Zellen induzieren (Goubier et al. 2008; Dubois et al. 2009).
Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass im Rahmen der oralen Toleranz unterschiedliche
Mechanismen der Toleranzinduktion eine Rolle spielen und diese vom Ort der Induktion, der
Art des Antigens und dessen Dosierung abhängen.
15
2 Einleitung
2.6.2
UV-induzierte Toleranz
Es ist bekannt, dass ultraviolette (UV) Strahlung, insbesondere Strahlung im Bereich von
290–320 nm (UVB-Strahlung) eine Vielzahl biologischer Effekte, darunter die Induktion von
Hautkrebs, vorzeitige Hautalterung aber auch die Suppression bzw. Modulation des
Immunsystems verursachen kann (Übersicht in Schwarz 2005; Schwarz 2008).
Im Mausmodell der CHS konnte hierbei gezeigt werden, dass die Applikation sehr niedriger
Strahlungsdosen eine lokale und vor allem antigenspezifische, langanhaltende Toleranz
gegenüber dem Kontaktallergen erzeugt und dieser Mechanismus am ehesten auf eine
Reduktion der Langerhans Zellen im bestrahlten Hautareal einhergeht (Toews et al. 1980).
Auch ist wahrscheinlich eine eingeschränkte Funktion der Langerhans Zellen (Kripke et al.
1977) und dadurch der Verlust der Fähigkeit Antigene aufzunehmen und zu prozessieren
(Aberer et al. 1981) für die Entstehung der lokalen Immuntoleranz verantwortlich. Ferner
konnte gezeigt werden, dass im Rahmen der Toleranzinduktion Tr1-ähnliche T-Zellen
generiert werden und diese via IL-10 die Funktion dendritischer Zellen regulieren (Alard et al.
2001).
Die Bestrahlung der Haut mit hohen UVB-Dosen hingegen erzeugt eine systemische
Immunsuppression (Noonan et al. 1981), wobei hier vermutlich andere pathophysiologische
Mechanismen der Entstehung der Toleranz zugrunde liegen. Dabei zeigen Analysen, dass
eine Bestrahlung der Haut mit UVB-Licht und die damit verbundenen DNA-Schäden (Kripke
et al. 1992) in murinen Keratinozyten die Produktion von immunsuppressiven Zytokinen wie
z.B. IL-10 steigern und damit auch eine systemische Immuntoleranz erzeugen können
(Nishigori et al. 1996). Ferner scheinen weitere immunmodulatorische Faktoren wie PAF
(engl. platelet-activating factor, PAF), PGE2 (Prostaglandin E2) und IL-4 eine entscheidende
Rolle in der immunsuppressiven Kaskade nach hohen Bestrahlungsdosen zu spielen
(Übersicht in Walterscheid et al. 2002; Shreedhar et al. 1998a). Auch die Entstehung von
reaktiven Sauerstoffspezies nach UVB-Bestrahlung hat potentiell einen Anteil an der
Modulation der APZ (Cacares-Dittmar et al. 1995). In Transfer- und Depletionsexperimenten
konnte gezeigt werden, dass CD4+, CD8-, IL-10+, IL-4- und IFN-γ- T-Zellen den Toleranzeffekt
antigenspezifisch und langanhaltend in naive Tiere übertragen können (Shreedhar et al.
1998b). Und diese Zellen die regulatorischen Oberflächenmarker der nTregs wie CD4,
CD25, CTLA-4 sowie Foxp3 auf ihrer Oberfläche exprimieren (Schwarz et al. 2000; Schwarz
et al. 2004; Schwarz et al. 2008). Weiterhin konnten in vitro DNFB-behandelte und UVbestrahlte Milz- und Lymphknotenzellen nach adoptivem Transfer in naive Mäuse eine
Toleranz gegen DNFB induzieren. Wurden dabei jedoch CD11c+ Zellen in den
Empfängertieren oder CD4+CD25+ Zellen in den Spendertieren depletiert, so wurde der
Toleranzeffekt aufgehoben (Maeda et al. 2005). Neuere Studien zeigen zudem, dass die
regulatorischen T-Zellen den Toleranzeffekt nur vermitteln können, wenn sie das
16
2 Einleitung
entsprechende Migrationsverhalten in die Haut nach Allergenprovokation aufzeigen, welches
durch APZ vermittelt wird (Schwarz et al. 2011).
2.6.3
„Low Zone Tolerance“
Die Haut und das Immunsystem des Menschen kommen im Alltag kontinuierlich mit kleinen
Mengen potentieller Allergene in Kontakt. Dennoch entwickeln nur sehr wenige eine
relevante Kontaktallergie gegen diese Substanzen. Der Großteil entwickelt eine aktive
Immuntoleranz, deren Mechanismus noch nicht vollständig erklärt werden kann. Das Modell
der Niedrigzonentoleranz (engl.: low zone tolerance, LZT) liefert einen Erklärungsansatz.
Hierbei
konnte
gezeigt
werden,
dass
die
wiederholte,
epikutane
Applikation
subimmunogener Dosen der Haptene TNCB und Oxazolon eine allergenspezifische
Toleranz gegenüber dem Allergen hervorruft und die CHS unterdrückt (Steinbrink et al.
1996b). Somit könnte das Modell der LZT einen grundlegenden pathophysiologischen
Mechanismus wiederspiegeln, wie der Körper auf fremde Substanzen, die in geringsten
Mengen die Hautbarriere überwinden, reagiert.
Eine Toleranzinduktion durch das Auftragen nicht immunogener Dosen eines Allergens auf
die Haut eines Meerschweinchens konnte bereits 1943 von Chase beobachtet werden
(Chase 1982). Später zeigte sich, dass die über diesen Weg epikutan mit Kontaktallergenen
induzierte Toleranz haptenspezifisch ist (Lowney 1964, 1965, 1967). In dem von der
Arbeitsgruppe um Prof. Steinbrink verwendeten Mausmodell der LZT konnte bestätigt
werden, dass es sich bei der, durch die wiederholte, epikutane Applikation sehr niedriger
Dosen der Kontaktallergene TNCB und Oxazolon induzierten Toleranz um einen
dosisabhängigen, allergenspezifischen und langanhaltenden Effekt handelt (Steinbrink et al.
1996b). Dieser ist abhängig von CD8+ T-Zellen, mit welchen die Toleranz haptenspezifisch in
Transferexperimenten in naive Tiere übertragen werden konnte. Dabei zeigte sich, dass die
CD8+ Suppressor T-Zellen die Toleranz via IL-10, IL-4 und IL-5 vermitteln (Steinbrink et al.
1996a). In IL-10 Knockout-Mäusen konnte gezeigt werden, dass die Toleranzinduktion sowie
die Generierung der CD8+ Suppressor T-Zellen von dem Zytokin IL-10 abhängig sind
(Maurer et al. 2003). Dabei werden im Lymphknoten ansässige CD4+ T-Zellen als relevante
Quelle des IL-10 beschrieben (Maurer et al. 2003). In aktuellen Experimenten zeigt sich,
dass CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische T-Zellen und IL-10 während der Phase der
Toleranzinduktion zwingend notwendig sind und sowohl in der Haut als auch in den
hautdrainierenden Lymphknoten vorkommen (Pfender 2012; Luckey et al. 2012). Neben den
regulatorischen T-Zellen und den CD8+ Suppressor T-Zellen spielen APZ, die als tolerogene
CD8+CD11c+ DZ in den drainierenden Lymphknoten ansässig sind, für die Induktion der LZT
eine entscheidende Rolle (Luckey et al. 2011). Diese tolerogenen APZ vermitteln ihren Effekt
17
2 Einleitung
über einen TNF-α abhängigen und TNF-α-Rezeptor-2 vermittelten Tötungsmechanismus
von CHS Effektor-T-Zellen und über die Generierung der CD8+ Suppressor T-Zellen (Luckey
et al. 2011). Inwieweit die Entwicklung dieses regulatorischen bzw. tolerogenen Phänotyps
der DZ vom Einfluss bzw. der Interaktion mit den CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen TZellen abhängig ist und ob sie möglicherweise das Bindeglied zwischen CD4+CD25+Foxp+
Treg und CD8+ Suppressor T-Zelle bildet, muss noch genauer untersucht werden.
Weitere Studien konnten demonstrieren, dass weder Langerhans Zellen noch B-Zellen bei
der Induktion der LZT beteiligt sind (Steinbrink et al. 1996; Seidel-Guyenot et al. 2004). Dass
es sich bei der LZT nicht nur um einen lokalen, sondern einen systemischen Effekt handelt,
konnte durch die Induktion der Toleranz über epikutane als auch intravenöse Applikation der
Allergene gesichert werden (Seidel-Guyenot et al. 2006). Darüber hinaus spielt ICAM-1
(engl.: inter cellular adhesion molecule 1, ICAM-1, CD54), nicht aber L-Selektin als Mediator
der Lymphozytenmigration in der Phase der Allergenprovokation eine entscheidende Rolle
für die Toleranzentwicklung (Komura et al. 2009).
Abb. 2: Pathophysiologisches Schema der LZT
Epikutane Applikaton subimmunogener Allergendosen (1) auf die Haut, Aufnahme des
Allergens durch DZ und Migration in den hautdrainierenden Lymphknoten (2). Hier findet nun
unter dem Einfluss von CD4+CD25+Foxp3+ Tregs, IL-10 und tolerogener CD8+CD11c+ DZ die
Generierung der LZT typischen CD8+ Supressor T-Zellen statt (3), wobei die Interaktion
zwischen Treg und DZ in dieser Phase noch untersucht werden muss. Die Entwicklung von
T-Effektorzellen bei erneutem Allergenkontakt in sensibilisierenden Dosen (4) wird dabei
18
2 Einleitung
durch die CD8+ Supressor T-Zellen mittels IL-10, IL-4 und TGF-β gehemmt (5). Im Falle
einer erneuten Allergenprovokation stehen nun weniger T-Effektorzellen zur Verfügung, um
eine allergische Reaktion auszulösen (6). Auch hier spielen Treg und IL-10 eine wichtige
Rolle in der Modulation der Auslösephase (Steinbrink et al. 1996a; Steinbrink et al. 1996b;
Maurer et al. 2003; Luckey et al. 2011; Pfender 2012).
2.7
Ziele der Arbeit
Die Ziele der vorliegenden Arbeit waren die Analyse der Rolle und Funktion der CD11c+
dendritischen Zellen im Mausmodell der LZT in der Phase der Toleranzinduktion. Ein
besonderer
+
+
Fokus
CD4 CD25 Foxp3
+
lag
dabei
auf
der
Interaktion
der
dendritischen
Zelle
mit
regulatorischen T-Zellen zum Zeitpunkt der Toleranzinduktion im
hautdrainierenden Lymphknoten.
Außerdem sollte der Einfluss einer Aktivierung des innaten Immunsystems mittels SDS auf
die Wirkung der LZT genauer geprüft werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollte darüber hinaus die Allergenspezifität innerhalb der LZT und
insbesondere die Allergenspezifität der Toleranz übertragenden dendritischen Zellen für die
Kontaktallergene TNCB, DNFB und Oxazolon analysiert werden.
Die Arbeit soll hiermit zu einem besseren Verständnis der an der Induktion der Toleranz
beteiligten Zellen und Mechanismen beitragen.
19
3 Material und Methoden
3
Material und Methoden
3.1
3.1.1
Material
Geräte und Plastikware
3.1.1.1 Geräte
Gerät
Hersteller
-20°C Gefrierschrank
Bosch, Liebherr
-80°C Gefrierschrank
Thermo Forma
+4°C Kühlschrank
Bosch
BD FACSCanto II
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Brutschrank HeraCell 240
Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
Eismaschine
Ziegra Eismaschinen GmbH, Isernhagen, Deutschland
Feinwaage (TE 64 - OCE) Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Filter Mate Harvester
Perkin Elmer, Waltham, USA
Haarschneider
Grundig Multimedia, Amsterdam, Niederlande
Laminar flow
Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
Lichtmikroskop
Axiovert Carl Zeiss AG, Feldbach, Schweiz
135
Magnetrührstäbe
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
MilliQ Synthesis A10
Millipore, Eschborn, Deutschland
Wasserfilter
Neubauerzählkammer
Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Deutschland
pH Meter (pH525)
WTW
Wissenschaftlich - Technische Werkstätten GmbH,
Weilheim, Deutschland
Pipetboy accu
Intergra Bio Sciences, Fernwald, Deutschland
Pocket Thikness Measure
Ames, Melrose, USA
25M
Schüttlerwasserbad 1083
GFL, Burgwedel, Deutschland
Top Count NXT
Packard Instrument Company, Meriden, USA
Top Seal A
Perkin Elmer, Waltham, USA
Transferpipette
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
Zentrifuge Megafuge 11R
Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
Zentrifuge Megafuge 3.0R Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
Zentrifuge Megafuge 40R
20
Heraeus Sepatech, Hanau, Deutschland
3 Material und Methoden
3.1.1.2 Plastikware
Ware
Hersteller
96 Well Zellkultur Rundbodenplatten mit
Greiner Bio-One, Kremsmünster, Österreich
Deckel
Eppendorfröhrchen mit Deckel 0,5ml,
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
1,5ml, 2ml
Falcon Röhrchen 15ml konisch
Becton Dickinson, Heidelberg, Schweiz
Falcon Röhrchen 50ml konisch
Becton Dickinson, Heidelberg, Schweiz
Falcon Röhrchen 5ml Rundboden
Becton Dickinson, Heidelberg, Schweiz
Kapillarpipetten Na-Hep.5UL
Hirschmann,
Laborgeräte,
Eberstadt,
Deutschland
LS Säulen
Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland
Maxi Sorb 96 well U-Form
Thermo Fisher Scienific, Schwerte, Deutschland
Pipettenspitzen 10µl, 200µl, 1000µl
ULPLAST, Warsaw, Polen
Plasmaröhrchen Li-Heparin
Kabe Labortechnik, Nürnbrecht-Elmshorn,
Deutschland
Probenfläschchen 2ml
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Spritzen 2 ml, 5 ml, 10 ml
B.
Braun
Melsungen
AG,
Melsungen,
Deutschland
Uni Filter 96 Well Platte
PerkinElmer, Waltham, USA
Zellsieb 40 µm, 70 µm, 100 µm
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
3.1.2
Chemikalien und Antikörper
3.1.2.1 Chemikalien/Enzyme
Reagenzien
3
(Methly- H) Thymidine (185MBq)
Hersteller
GE
Healthcare
Europe,
Freiburg,
Deutschland
2- Mercaptoethanol 99%
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Azeton
Merck, Darmstadt, Deutschland
Aqua dest.
Aufbereitung
mit
MilliQ
Synthesis
Wasserfilter A10
Blendzyme2
Roche, Mannheim, Deutschland
BSA
Dade Behring, Deerfield, USA
Citrat (Monohydrat)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Concanavalin A (ConA)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
21
3 Material und Methoden
Dihydrogensulfat (H2SO4)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Dimethylformamid
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Dinitrofluorobenzene (DNFB)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
DMSO (Dimethylsolfoxid)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
DNAse 1
Roche, Mannheim, Deutschland
DPBS (Dulbecco's PBS)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
EDTA Ultra Pure 0,5M
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Ethanol
Aoptheke
des
Universität-Klinikum
Freiburg
Ethanol 70%,99%
VWR
International
GmbH,
Darmstadt,
Deutschland
FACS clean solution
Becton
Dickinson,
Heidelberg,
Dickinson,
Heidelberg,
Deutschland
FACS flow solution
Becton
Deutschland
FCS (Fetal calf serum)
PAA Laboratories, Cölbe, Deutschland
Forene (Isofluran)
Abbot GmbH & co KG, Wiesbaden,
Deutschland
HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
HEPES 1M
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Kaliumchlorid (KCL)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Kaliumhydrogenphosphat (KH2PO4)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Kaliumhydroxid (KOH)
Merck, Darmstadt, Deutschland
L-Glutamin 200mM (100x)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Liberase Blendzyme 2 (10x)
Roche, Mannheim, Deutschland
LPS (Lipopolysaccharide, from E.coli)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
MEM NEAA (100x)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Microscint O
Perkin Elmer, Waltham, USA
mouseGM-CSF
PeproTech, Rocky Hill, USA
Natriumazid (NaN3)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Natriumcarbonat (Na2CO3)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumchlorid (NaCl)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Merck, Darmstadt, Deutschland
Natriumhydroxid (NaOH 1M)
Riedel-de Haen, Seelze , Deutschland
Natriumpyruvat 100 mM
Biochrom AG, Berlin, Deutschland
Olivenöl
Aoptheke Universitätsklinikum Freiburg
22
3 Material und Methoden
Oxazolone
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
PBS
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Pen/Strep (Penicillin 1000U/ml / Streptamycin Sigma-Aldrich, München, Deutschland
1000µg/ml)
Propidium Iodid (10mg/ml)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
RPMI 1640
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
SDS
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Streptavidin Peroxidase Konjugat
Merck, Darmstadt, Deutschland
TMB (Tetramehylbenzidine)
Fluka Chemie AG, Buchs, Schweiz
TNBS (Picrylsulfonic Acid Solution) 150mM
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
TNCB (2,4,6-Trinitro-1-Chlorbenzol)
Polysciences, Warrington, USA
Trypanblau 0,4%
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Tween 20 (Polysorbat 20)
Sigma-Aldrich, München, Deutschland
Alle nicht aufgelisteten Reagenzien sind Standardartikel der Firmen Sigma und Roth.
3.1.2.2 Antikörper
3.1.2.2.1
Durchflusszytometrie
Zielmolekül
Fluorochrom
Klon
Ursprung
Klasse
Hersteller
CD4
PerCP
L3T4
Ratte
IgG2a
BD Biosciences
CD11c
PE-Cy7
N418
Hamster
IgG
BD Biosciences
CD11c
PE-Cy7
N418
Hamster
IgG
BD Biosciences
CD16/CD32
purified
2.4G2
Ratte
IgG2b
BD Biosciences
CD3ε
APC
145-2C11
Hamster
IgG
BD Biosciences
CD8a
PerCP
53-6.7
Ratte
IgG2a
BD Biosciences
CD8a
PE
53-6.7
Ratte
IgG2a
BD Biosciences
Foxp3
PE
FJK-16s
Ratte
IgG2a
eBiosciences
Isotyp κ
PE
R35-95
Ratte
IgG2a
BD Biosciences
Isotyp κ
PE-Cy7
A19-3
Hamster
IgG
BD Biosciences
Isotyp κ
APC-Cy7
A95-1
Ratte
IgG2b
BD Biosciences
MHCII
APC-Cy7
M5/114.15.2
Ratte
IgG2b
eBiosciences
3.1.2.2.2
ELISA
Zielmolekül
Einsatz
Klon
Ursprung
Klasse
Hersteller
IL-2
Capture AK
JES6-1A12
Ratte
IgG2a
BD Biosciences
23
3 Material und Methoden
IL-2
IL-2 Standard
Rekombinant
BD Biosciences
IL-2
IL-2 Detektions AK
JES6-5H4
Ratte
IgG2b
BD Biosciences
IFN-γ
Capture AK
R4-6A2
Ratte
IgG1
BD Biosciences
IFN-γ
IFN-γ Standard
Rekombinant
IFN-γ
IFN-γ Detektions AK XMG1.2
Ratte
BD Biosciences
IgG1
BD Biosciences
3.1.2.3 Kits
Foxp3 Staining Buffer Set
eBioscience, Frankfurt, Deutschland
CD11c MicroBeads
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach
3.1.2.4 Zellkulturmedium
T-Zell Medium 500 ml RPMI, 10 ml Mausserum (hitzeinaktiviert), 12,5 ml HEPES, 5,6 ml
Natriumpyruvat, 5,6 ml NEAA, 5 ml Pen/Strep, 5 ml L-Glutamin, 500 µl Mercaptoethanol
50mM
3.1.2.5 Puffer und Lösungen
ELISA
Coating-Puffer 500 ml Aqua dest., 4,2 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3), 1,78 g
Dinatriumcarbonat (Na2CO3)
Waschpuffer PBS (1x), Tween 20 0,5 %
Assay-Diluent (AD) PBS (1x), FCS (hitzeinaktiviert) 10 %, NaN3 0,02 %
Substratpuffer 180 ml Aqua dest., 8,41 g Citrat, pH 3,95
MACS
MACS Puffer 500 mg BSA 0,5%, 0,4 ml EDTA, 100 ml PBS
FACS
FACS Puffer 1000 ml PBS, 20 ml FCS (hitzeinaktiviert), 0,02 % NaN3
Foxp3-Färbung
Erythrozytenlysepuffer 1000 ml Aqua dest., 150 mM Ammoniumchlorid (NH4Cl), 100 mM
Natriumhyddrogencarbonat (NaHCO3), 1 mM Disodium EDTA
Sonstige
PBS (10x) 900 ml Aqua dest., 80 g NaCl, 11,6 g Na2HPO4, 2 g KH2PO4, 2 g KCL, pH 7,4
PBS (1x) PBS (10x) 1:10 in Aqua dest. verdünnt
3.1.3
DIVA
24
Software
Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland
3 Material und Methoden
FlowJo Flow Cytometrie Analysis Software Tree Star Inc., Ashland, USA
GraphPad Prism 6 (Mac OS)
3.1.4
GraphPad Software Inc., La Jolla, USA
Versuchstiere
Es wurden weibliche und männliche (Geschlecht in den jeweiligen Versuchsgruppen
angeglichen) Mäuse des Inzuchtstammes C57BL/6 im Alter von 6-12 Wochen verwendet.
Die Mäuse wurden im BioMed Zentrum des Uniklinikums Freiburg (CEMT-FR) gezüchtet und
gehalten. Sie erhielten Wasser und Pelletnahrung zur freien Verfügung. Alle Eingriffe an
lebenden Tieren erfolgten in den Eingriffsräumen der Tierhaltung. Die Anzahl der Mäuse pro
Käfig
entsprach,
je
nach
Größe
des
Käfigs
und
Geschlecht,
dem
deutschen
Tierschutzgesetz. Eine Genehmigung für die Durchführung von Tierversuchen durch das
Regierungspräsidium Freiburg lag vor (Tierversuchsantrag: G11/100).
3.1.4.1 DEREG-Mäuse
DEREG (engl.: depletion of regulatory t-cells) -Mäuse sind BAC (engl.: bacterial artificial
chromosome) - transgene Tiere, die unter der Kontrolle des foxp3-Promotors ein
Fusionprotein aus humanem DTR (engl.: diphteria toxin receptor) und eGFP (engl.:
enhanced green fluorescent protein) exprimieren. BACs sind große Fragmente genomischer
DNA, die in bakterielle Vektoren geklont werden, um eine hohe Übertragungsrate zu
garantieren.
Abb. 3: BAC-Konstrukt der DEREG-Maus
Karte des BAC-Konstrukts, das für die Generierung der transgenen Mäuse verwendet wurde.
I und XI zeigen die Positionen der Exons I und XI des foxp3-Gens. 24bp des Exons I wurden
durch das Gen für DTR-eGFPpA durch homolge Rekombination mit einer 1-kb 5´und
3´homolgen Sequenz (Boxen A und B) ersetzt. (Lahl et al. 2007)
Hierbei wurde ein BAC verwendet, mithilfe dessen ein für das DTR-eGFP-Fusionprotein
kodierender Genabschnnitt in das Exon 1 des foxp3-Gens eingefügt werden konnte.
Aufgrund der Größe des kodierenden Fragmentes ist es möglich ganze regulatorische
Sequenzen eines Genes zu übertragen (Lahl et al. 2007). Dieses wiederum erlaubt zum
25
3 Material und Methoden
einen durch die Gabe von Diphtherietoxin eine selektive Depletion Foxp3+ regulatorischer TZellen mittels des DTR (siehe 3.2.2) und zum anderen eine einfache Visualisierung der
Tregs in der Durchflusszytometrie mittels des eGFP. Zum experimentellen Einsatz kamen
genotypisierte, heterozygote Mäuse im Alter von 6-12 Wochen.
3.2
3.2.1
Methoden
Versuchsdurchführung
Für die einzelnen Versuche wurden Gruppen aus je 5-6 Versuchstieren gebildet, die
bezüglich Alter und Geschlecht gleich verteilt waren. In einem Käfig wurden nur Mäuse mit
gleichem Behandlungsprotokoll gehalten, um eine Übertragung der epikutan applizierten
Kontaktallergene von Tier zu Tier zu verhindern.
3.2.1.1 Toleranzinduktion
Für die Induktion der Toleranz wurde auf der zuvor rasierten Rückenhaut 5-10-mal alle 24
Stunden bzw. bei DEREG-Depletionsexperimenten 7-mal alle 12 Stunden die LZTBehandlung durchgeführt. Eine Behandlung besteht aus der epikutanen Applikation von 4,5
µg TNCB in 15 µl Azeton-Olivenöl (3:1) (0,03%-Lösung), DNFB in 20 µl Azeton-Olivenöl (3:1)
(0,01%-Lösung) oder 7,5 µg Oxazolon in 15 µl Azeton-Olivenöl (4:1) (0,05%-Lösung). Eine
Kontrollgruppe wurde zum jeweiligen gleichen Zeitpunkt mit 15 µl Azeton-Olivenöl behandelt.
3.2.1.2 Sensibilisierung
Die Sensibilisierung der Versuchstiere erfolgte auf die zuvor rasierte Bauchhaut bzw. Haut
des rechten Ohres 24 bis 48 Stunden nach der letzten LZT-Behandlung. Bei DEREGDepletionsexperimenten erfolgte die Sensibilisierung 4 (Depletion vor LZT-Behandlung) bzw.
6 Tage (Depletion im Empfängertier) nach der letzten LZT-Behandlung, um eine
Rekonstitution
der
Treg
zum
Sensibilisierungszeitpunkt
zu
ermöglichen.
In
Transferexperimenten fand die Sensibilisierung 24 Stunden nach Transfer der Zellen ins
Empfängertier statt. Eine Sensibilisierungsdosis enthält 3 mg TNCB in 100 µl AzetonOlivenöl (3:1) (3%-Lösung), DNFB in 20µl Azeton-Olivenöl (3:1) (1%-Lösung) oder 1-3 mg
Oxazolon in 100 µl Azeton-Olivenöl (3:1) (1-3%-Lösung) für die Applikation am Bauch bzw.
750 µg Oxazolon in 15 µl Azeton-Olivenöl (5:1) (5%-Lösung) für die Applikation am rechten
Ohr.
26
3 Material und Methoden
3.2.1.3 Auslösung der Entzündungsreaktion
Die Auslösung der Kontaktallergie erfolgte 5 Tage nach Sensibilisierung an der dorsalen
Seite eines oder beider Ohren. Es wurden zunächst die Ohrdicken mittels eines Mikrometers
gemessen, im Anschluss wurde auf die dorsalen Ohrseiten je 90 µg TNCB in 15 µl Azeton
(0,6%-Lösung), DNFB in 20 µl Azeton-Olivenöl (3:1) (0,1%-Lösung) oder 30-90 µg Oxazolon
in 15µl Azeton (0,2-0,6%-Lösung) appliziert (bei vorherige Sensibilisierung des einen Ohres,
jeweils nur das andere Ohr). 24 Stunden nach erfolgter Allergieprovokation wurde erneut die
Ohrschwellung gemessen und den Tieren nach erfolgter Tötung mittels CO2-Inhalation die
für die ex vivo-Analysen vorgesehenen Organe entnommen (aurikuläre, brachiale, inguinale
Lymphknoten).
3.2.1.4 Adoptiver Transfer
Für den adoptiven Transfer wurden 40 Spendertiere nach verkürztem Protokoll tolerisiert (7mal alle 12 Stunden) und 40 Tiere mit AOO behandelt. Zusätzlich wurden 2 in-vivo
Kontrollgruppen mit je 5 Tieren nach Protokoll mit LZT oder AOO behandelt. 4 Tage nach
der letzten LZT-Behandlung wurden den Mäusen die drainierenden Lymphknoten
entnommen, aufgearbeitet (siehe 3.2.4) und aus den Zellsuspensionen die CD11c+ DZ
(siehe 3.2.5) bzw. die CD8α+ T-Zellen (siehe 3.10.2.3) isoliert. Die Zellen wurden dann in
naive Empfängertiere entweder i.v. oder s.c. transferiert. Jede Maus erhielt eine definierte
Anzahl an CD11c+ DZ bzw. CD8α+ T-Zellen in einem definierten Volumen (siehe 3.2.6 und
3.12.2.3).
3.2.1.5 Messung der Ohrschwellung
Die Messung der Zunahme der Ohrschwellung im MEST (engl.: mouse ear swelling test,
MEST (Gad et al. 1986)) dient als etablierte Methode um den Grad des Ödems, der
Zellinfiltration und damit die Ausprägung der Hautentzündung (Dermatitis) fest zu stellen.
ToleranzInduktion
Sensibilisierung
Allergenprovokation
Analyse
d0#9
%%%%%%%%%%%%%%%%%d10%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%d15%%%%%%%%%%%%%%%d16%%
Abb. 4: Standard-Protokoll der LZT (Zeitstrahl)
Wiederholte, epikutane Applikation des Allergens (5-10x). Im Anschluss Sensibilisierung und
Allergenprovokation sowie Analyse der Ergebnisse in vivo und in vitro.
27
3 Material und Methoden
Gemessen wurde hierbei mit einem Mikrometer kurz vor und 24 Stunden (bzw. zum
angegebenen Zeitpunkt) nach Auftragung des Allergens an der Ohrmuschel (Pinna). Die
Ohrschwellung wurde als Δ mm 10-2 (Ohrdicke nach Allergenbehandlung – Ohrdicke vor
Allergenbehandlung) ausgedrückt.
3.2.1.6 Auslösung der Irritation mit SDS
Die Auslösung einer Hautirritation mittels SDS erfolgte durch die epikutane Applikation von 2
µg SDS in 20 µl DMF (1%-Lösung) jeweils 30 Minuten vor der LZT-Behandlung über 5 Tage.
In einem Kontrollexperiment wurden 5 Tage lang alle 24 Stunden auf das rechte Ohr je 2 µg
SDS in 20 µl DMF (1%-Lösung) und auf das linke Ohr 20 µl DMF alleine appliziert und je 24h
nach der letzten Applikation sowie kurz vor der nächsten die Ohrschwellung gemessen.
3.2.2
Treg-Depletion in DEREG Mäusen
Um eine effektive Treg-Depletion in DEREG-Mäusen (Lahl et al. 2007) durchzuführen, wurde
den Tieren 36 und 12 Stunden vor der ersten LZT-Behandlung 1 µg DT in 100 µl PBS i.p.
injiziert. Bei Treg-Depletion in Transferexperimenten wurde den Empfängertieren 24 Stunden
vor Zelltransfer 1 µg DT in 100µl PBS i.p. gespritzt. Mittels vor und 24 Stunden nach DTGabe durchgeführter, vergleichender durchflusszytometrischer Analysen (siehe 3.2.11)
wurde die Effektivität der Depletion im peripheren venösen Blut bestimmt. Die LZTBehandlung nach Zelldepletion folgte einem verkürzten Protokoll 7-mal alle 12 Stunden, um
im zeitlichen Rahmen der Treg-Depletion zu bleiben.
3.2.3
Blutentnahme
Für die Blutentnahme wurden die Mäuse durch Inhalation von Isofluran in Narkose versetzt.
Durch einen Nackengriff wird eine venöse Stauung im Kopfbereich erzeugt und mithilfe einer
0,8 mm dicken Glaskapillare aus dem retrobulbären Plexus Blut entnommen. Dabei wird die
Kapillare mit leichtem Druck und einer Drehbewegung durch die Bindehaut am nasalen
Augenwinkel eingeführt. Es können nun max. 200 µl Blut pro Maus in ein Heparin
beschichtetes Röhrchen aufgenommen werden. Um Einblutungen in das Gewebe zu
verhindern, sollte vor dem Herausziehen der Kapillare der venöse Stau im Kopfbereich
gelöst werden.
28
3 Material und Methoden
3.2.4
Lymphknotenpräparation
Für die Präparation der benötigten, hautdrainierenden Lymphknoten wurden die Mäuse
durch CO2-Begasung getötet und für den
3
H-Thymidin-T-Zell-Proliferationsassay die
aurikulären (Ohrhaut-drainierend), für die Isolation der CD11c+ dendritischen Zellen die
aurikulären, brachialen und inguinalen (hautdrainierend) Lymphknoten heraus präpariert.
Diese wurden gruppenweise zusammengefasst, in PBS auf Eis gelagert und in das Labor
zur weiteren Bearbeitung überführt. Mithilfe eines 2ml Spritzenstempels wurden die
Lymphknoten unter sterilen Bedingungen durch ein 40 µm Zellsieb gedrückt und dabei von
anhaftendem Bindegewebe getrennt und mechanisch zerkleinert. Im Anschluss wurden die
Zellsiebe mit 20 ml PBS gründlich nachgespült. Um eine größere Zellausbeute zu erreichen,
wurde für manche Experimente eine enzymatische Präparation gewählt. Hierbei wurden die
Lymphknoten mit einem Rührfisch und 200-400 µl Blendzyme in eine kleine Glasflasche
gegeben und bei 37°C im Inkubator für 15-20 min auf einem Magnetrührer verdaut.
Anschließend wurde die Zellsuspension über einem 40 µm Zellsieb nochmals gefiltert und
mit PBS nachgespült. Die gewonnenen Einzelzellsuspensionen wurden in beiden Fällen in
einem 50 ml Falcon bei 300 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert, die Überstände abgesaugt
und das Pellet in 3-10 ml T-Zell-Medium aufgenommen. Um die Viabilität und die Anzahl der
Zellen
zu
bestimmen,
wurden
diese
mithilfe
von
Trypanblaufärbung
(10
µl
Einzelzellsuspension in 190 µl Trypanblaulösung) in einer Neubauerzählkammer unter dem
Mikroskop gezählt. Dabei werden nur die toten Zellen aufgrund der höheren Permeabilität
ihrer Membran blau gefärbt, die lebenden Zellen nehmen kein Trypanblau auf. Für die
Auszählung wurde in 4 Quadranten mit je 16 Unterquadranten die Zellzahl bestimmt und
nach folgender Formel die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension berechnet:
(𝑔𝑒𝑧äℎ𝑙𝑡𝑒𝑍𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛)/4×(𝐾𝑎𝑚𝑚𝑒𝑟𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟)×(𝑉𝑒𝑟𝑑ü𝑛𝑛𝑢𝑛𝑔𝑠𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟)
×(𝑒𝑖𝑛𝑔𝑒𝑠𝑒𝑡𝑧𝑡𝑒𝑠𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛) = 𝐺𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑧𝑒𝑙𝑙𝑧𝑎ℎ𝑙
Kammerfaktor = 103
Verdünnungsfaktor = 20
Eingesetztes Volumen = 10 µl
3.2.5
MACS Isolierung CD11c+ DZ
Die Lymphknoten wurden nach dem bereits beschriebenen Protokoll entnommen und
enzymatisch aufgearbeitet (siehe 3.2.4), die Zellzahl jedoch hier bereits in 10 ml MACSPuffer ermittelt. Vor der Isolation der CD11c+ dendritischen Zellen wurden 1x106 Zellen für
durchflusszytometrische Analysen abgenommen (1). Die restlichen Zellen wurden erneut bei
29
3 Material und Methoden
300 x g und 4°C für 10 min zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das Zentrifugat
(Pellet) wurde in 400 µl kaltem MACS-Puffer pro 1x108 Zellen aufgenommen und 100 µl
CD11c Magnetbeads (MicroBeads) pro 1x108 Zellen hinzugegeben. Die Zellen wurden nun
zusammen mit den Magnetbeads für 15 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend einmal
mit 10ml MACS-Puffer pro 1x108 Zellen gewaschen, bei 300 x g und 4°C für 10 min
zentrifugiert und das Pellet in 500 µl MACS-Puffer resuspendiert. Anschließend wurde die
Zellsuspension über ein 40 µm Zellsieb auf die zuvor mit 3 ml MACS-Puffer kalibrierte LSSäule gegeben. Negative Zellen wurden mit 3x3 ml MACS-Puffer von der Säule gewaschen
und die Negativfraktion in 15 ml Falcons aufgefangen, gezählt und nach Abnahme von 1x106
Zellen für die durchflusszytometrische Analyse (2) verworfen. Um die Positivfraktion, die
CD11c+ Zellen, von der Säule zu eluieren, wurde diese vom Magneten entfernt, in ein 15ml
Falcon gestellt und mit 5 ml MACS-Puffer gefüllt. Im Anschluss wurden die Zellen mithilfe
des dazugehörigen Stempels durchgedrückt und im Falcon aufgefangen. Bei einigen
Experimenten wurden in diesem Schritt erneut 1x106 Zellen für die Durchflusszytometrie
entnommen (3). Um eine höhere Reinheit der Zellsuspension zu erhalten, wurden die Zellen
nun zentrifugiert und erneut in 400 µl MACS-Puffer und 100 µl CD11c+ Magnetbeads
aufgenommen und die Prozedur wiederholt. Nach der Bestimmung der Zellzahl wurden die
Zellen auf 2,5x106 Zellen/ml eingestellt und in naive Tiere i.v. injiziert, zuvor wurden wieder
Zellen für die Durchflusszytometrie entnommen (4). Alle für die durchflusszytometrischen
Analysen entnommenen Zellen (1,2,3,4) wurden zur Überprüfung der Reinheit der Zellen mit
anti-CD11c- und anti-MHCII-Antikörpern markiert (siehe 3.2.11).
3.2.6
Injektion der CD11c+ DZ
Für den adoptiven Transfer der CD11c+ DZ wurden diese nach MACS Isolation unter sterilen
Bedingungen erneut gezählt und in PBS auf eine Zellzahl von 2,5 x 106 Zellen/ml eingestellt.
Zum Transfer der Zellen in die naiven Empfängertiere wurden die Zellen auf Eis wieder in
den Mausstall überführt und dort den jeweiligen Tieren intravenös injiziert. Um die
Schwanzvene besser sichtbar zu machen, wurden die Tiere für wenige Minuten mit einer
Wärmelampe bestrahlt. Die intravenöse Injektion von 250.000 CD11c+ DZ in 100 µl PBS pro
Maus in die Schwanzvene erfolgte dann mithilfe einer 1ml Insulinspritze. In Experimenten,
die subkutane Injektion der DZ am Rücken oder der Pfote vorsahen, wurden je 50 µl PBS mit
125.000 Zellen rechts und links am Rücken bzw. 50 µl mit 250.000 Zellen in eine Hinterpfote
der Tiere subkutan gespritzt.
30
3 Material und Methoden
3.2.7
Haptenspezifische Restimulation
Bei der haptenspezifischen Restimulation wird die Gesamtheit der Lymphknotenzellen aus
sensibilisierten Mäusen in vitro mit dem entsprechenden Allergen restimuliert. Dabei sind in
der Zellsuspension sowohl die Stimulatorzellen (antigenpräsentierende Zellen) als auch die
Responderzellen (T-Zellen) eines Organismus enthalten. Im Anschluss kann nun die
spezifische Proliferation der Zellen auf das Antigen im Vergleich zu unspezifischen
Kontrollen quantifiziert werden.
Bei der Durchführung der Restimulation wurden die drainierenden Lymphknotenzellen wie
oben beschrieben gewonnen und aufgearbeitet (siehe 3.2.4). Nach der Bestimmung der
Zellzahl wurde ein Teil der Zellen (15x106) für unstimulierte Negativkontrollen abgenommen
und die restlichen Zellen 3-mal mit PBS gewaschen, um potentiell interagierende Proteine zu
eliminieren. Es erfolgte nun die Resuspension der Zellen in 1 ml einer 3 mM TNBS-Lösung
(in PBS) und die Inkubation der Zellen im Wasserbad bei 37°C für 7 min. Durch Zugabe von
warmem PBS mit 10% FCS wurde die Reaktion abgestoppt und ungebundenes TNBS durch
dreimaliges Waschen mit PBS mit 10% FCS entfernt. Die Zellen wurden nun in 2 ml T-ZellMedium aufgenommen, erneut gezählt und die Hapten-restimulierten sowie die nichthaptenisierten Zellen auf 10x106 Zellen/ml eingestellt. Daraufhin wurden die Zellen durch
eine 1:2 Verdünnungsreihe in 5 Schritten mit Medium verdünnt. In einer 96-well-Platte
wurden je 100 µl T-Zell-Medium pro Well vorgelegt und die Proben als Dreifachansatz in
folgenden Zellzahlen in 100 µl pipettiert: 1x106, 5x105, 2,5x105, 1,25x105, 6,25x104 und
3,125x104 Zellen. Die Platten wurden nun für 24 Stunden bei 37°C und 5%CO2 im
Brutschrank inkubiert. Nach 24 Stunden wurden je Well 100 µl Überstand abgenommen, die
Triplikate dabei zusammengefügt und für ELISA-Analysen im -20°C Schrank eingefroren.
Der entnommene Überstand wurde jeweils durch 100 µl frisches Medium ersetzt.
3.2.8
3
H-Thymidin-T-Zell-Proliferationsassay
Zur Quantifizierung der Zellproliferation kann der 3H-Thymidin-Proliferationsassay verwendet
werden. Hierbei bauen die Zellen das zur Verfügung gestellte, radioaktiv mit 3H (=Tritium,
HW 1,5 Jahre, β-Strahler) markierte Thymidin in ihre neu synthetisierte DNA ein. Nach einer
definierten Inkubationszeit kann nun das eingebaute
3
H-Thymidin mithilfe eines ß-
Szintillationscounters gemessen werden. Die gemessene Radioaktivität ist proportional zur
DNA-Synthese und zeigt damit die Proliferation einer definierten Zellzahl an.
Bei der Durchführung des
3
H-Thymidin-Proliferationsassays nach haptenspezifischer
Restimulation in vitro wurden die Lymphknotenzellen nach 24-stündiger Kultivierung im
31
3 Material und Methoden
Brutschrank mit 1 µCi 3H-Thymidin pro Well (in 20 µl RPMI) gepulst, für 18 Stunden im
Brutschrank inkubiert und im Anschluss mit Hilfe eines Zellerntegerätes auf eine Filterplatte
gesaugt. Diese wurde für ca. 2 Stunden bei 40°C getrocknet und dann die eingebaute
Radioaktivität mithilfe eines ß-Szintillationscounters gemessen und die Ergebnisse
ausgewertet.
3.2.9
Zytokin-ELISA
In einem Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) können biologisch aktive
Substanzen
mittels
einer
Antigen-Antikörper-Bindung
nachgewiesen
und
einer
enzymatischen Farbreaktion dargestellt werden. Bei dem Verfahren des Sandwich-ELISAs
kann hierbei die Zytokinausschüttung in den Überständen einer Zellkultur ermittelt werden.
Auf einer speziellen 96 well-Platte wird der erste Antikörper (engl.: capture antibody, CpA)
mit seinem unspezifischen Fc-Teil gebunden. Dieser Antikörper ist spezifisch für das zu
detektierende Antigen. Um eine unspezifische Bindung des zweiten Antikörpers auf der
Platte zu verhindern, werden die freien Bindungsstellen mit Blockierungspuffer gesättigt.
Anschließend wird die Probe mit dem zu detektierenden Antigen aufgetragen und spezifisch
vom ersten Antikörper gebunden. Es folgt die Zugabe des zweiten Antikörpers, auch
Detektionsantikörper (engl.: detection antibody, DA) genannt, der an eine andere
Bindungsstelle des Proteins bindet und das Antigen nun in einer Art „Sandwich“ zwischen
beiden Antikörpern komplexiert und eingeschlossen ist. Bei dem zweiten Antikörper handelt
es sich um einen biotinylierten Antikörper, sodass in einem weiteren Schritt Streptavidin, an
das das Enzym Meerettich-Peroxidase (engl.: horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt ist,
zugeben werden. Der Umsatz des Substrats durch das Enzym ist eine katalysierte Reaktion,
die nun einen Farbumschlag bewirkt. Um diesen Farbumschlag zu quantifizieren, muss eine
Verdünnungsreihe mit bekannten Proteinkonzentrationen durchgeführt werden und eine
Kalibrierungskurve daraus errechnet werden. Mithilfe dieser Kurve lässt sich nun die
photometrisch bestimmte optische Extinktion (emittierte Intensität) der Probe in eine
Antigenkonzentration umrechnen.
Bei der Durchführung des Sandwich-ELISAs für die Zytokine IL-2 und INF-γ wurden für die
24 Stunden Überstände je 100 µl aus den Ansätzen für die Proliferationsassays
abgenommen und die Triplikate zusammengefasst (siehe 3.2.7). Für die 48 Stunden
Überstände
wurden
Duplikate
Hapten-restimulierter
und
nicht-haptenisierter
Lymphknotenzellen in Konzentrationen von 1x106, 5x105 und 2,5x105 Zellen pro Well in TZell-Medium für 48 Stunden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Anschließend
wurden aus den Ansätzen je 150 µl Überstand entnommen und zusammengefügt. Fand
32
3 Material und Methoden
keine direkte Bearbeitung der Überstände statt, wurden diese bei -20°C eingefroren. Für die
Beschichtung der Platten mit dem ersten Antikörper (engl.: coating) wurden bei IL-2 50 µl
und bei INF-γ 100 µl pro Well des ersten Antikörpers 1:1000 in coating-Puffer verdünnt und
auf der mit Klebefolie abgedeckten Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach
sorgfältigem Ausklopfen der Platten wurden nun die freien Bindungsstellen mit 200 µl Assay
Diluent (AD) pro Well blockiert und die Platten erneut für 2 Stunden bei Raumtemperatur
inkubiert. Vor Zugabe der Proben, wurden diese im Verhältnis 1:2 und 1:10 in AD verdünnt
und dann je 50 µl bei IL-2 und je 100 µl bei INF-γ pro Well pipettiert. Für die
Standardmessungen wurde rekombinantes Maus IL-2 bzw. INF-γ auf 2000pg/ml bzw.
4000pg/ml in AD verdünnt und diese Konzentrationen erneut 6-mal hintereinander einer
Verdünnung im Verhältnis von 1:2 unterzogen und ausplattiert. Als Blanks (Leerwerte)
wurden 50 µl AD (IL-2) und 100 µl AD (INF-γ) eingesetzt. Es erfolgte die Inkubation der
abgedeckten Platten über Nacht bei 4°C. Nun wurden die Platten dreimal gewaschen und
anschließend der zweite Antikörper in einer Konzentration von 0,5 ng/ml in 50 µl, bei INF-γ in
100 µl µl AD darauf gegeben. Nach viermaligem Waschen erfolgte die Zugabe von 50 µl, bei
INF-γ 100 µl Streptavidinperoxidase, die zuvor 1:1000 in AD verdünnt wurde. Die Platten
werden erneut für 20 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Um das Enzym
auszuwaschen, wurden die Platten 5-mal hintereinander gewaschen, nach jedem
Waschschritt wurde nochmals 30 Sekunden inkubiert. Durch Zugabe des frisch angesetzten
Substrates (11 ml Citratpuffer, 5,1 µl kaltes H2O2, 110 µl TMB) mit je 100 µl pro Well wurde
die Farbreaktion gestartet und die Platten für 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur
inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion mit 50 µl 2 M H2SO4 in derselben Reihenfolge in der
zuvor das Substrat pipettiert wurde, erfolgte dann genau zu dem Zeitpunkt, an dem der am
niedrigsten dosierte Standard optisch dunkler als der Blank wurde. Die Messung der
Extinktion der Proben erfolgte in einem ELISA-Lesegerät bei 450 nm.
3.2.10 Durchflusszytometrie
Die Durchflusszytometrie (engl.: Fluorescence activated cell sorting, FACS) stellt ein
Verfahren
dar,
mit
welchem
die
physikalischen
Eigenschaften
einzelner
Zellen
(Oberflächenantigene, Zytokine vor der Freisetzung, Transkriptionsfaktoren) aus einer
heterogenen Zellsuspension bestimmt und die Zellen somit charakterisiert werden können.
Das Prinzip der Durchflusszytometrie besteht in der spezifischen Bindung eines
Fluorochrom-gekoppelten Antikörpers an ausgesuchte Proteine. Die in FACS-Puffer
aufgenommene Zellen passieren durch eine Kapillare einzeln die gebündelten Laserstrahlen.
Dabei
werden die Fluorochrome durch den Laserstrahl angeregt und je nach Größe
(Vorwärtsstreulicht, engl.: Forward Scatter, FSC) und Granularität (Seitwärtsstreulicht, engl:
33
3 Material und Methoden
Side Scatter = SSC) der Zellen sowie der unterschiedlichen Emissionsmaxima der
Fluorochrome entsteht ein spezifisches Streulicht. Dieses wird durch einen Detektor
(Fotomultiplier) quantifiziert und durch ein elektronisches System in ein digitales Signal
umgewandelt. Mittels dieser Parameter kann die Zielzelle nun einer Zelllinie zugeordnet und
bei Bedarf anhand dieser Kriterien sortiert werden.
3.2.10.1 Extrazelluläre FACS-Färbung (Standard-Messung)
Für die Messung spezifischer Oberflächenantigene (z.B. CD11c) wurden eine festgelegte
Anzahl der Zellen (z.B. 1-5x105 Zellen) in 150 µl FACS-Puffer aufgenommen und in eine 96
Well Platte gegeben. Nach der Zentrifugation bei 300 x g und 4°C für 10 Minuten wurde das
Pellet in 10 µl Fc-Block-Antikörper (1:100 in FACS-Puffer verdünnt) resuspendiert und für 5
Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 10 µl des entsprechend
verdünnten (1:100, bzw. abhängig von Rezeptordichte, Zellzahl, etc.) FACS-Antikörpers bzw.
des entsprechenden Isotyp-Kontollantikörpers zu den Zellen gegeben und diese erneut für
20-30 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubiert. Nachdem die Zellen zweimal mit je 150 µl
FACS-Puffer gewaschen wurden, folgte die Aufnahme in 150 µl FACS-Puffer und die
Messung der Zellen im FACS-Gerät. Wenige Minuten vor der Messung wurden die Zellen mit
je 10 µl DAPI-Lösung angefärbt, um tote Zellen sichtbar zu machen und diese aus der
Messung auszuschließen. Das Prinzip der DAPI-Färbung beruht auf dessen Eigenschaft die
instabile Zellmembran toter Zellen zu durchdringen und Nukleinsäuren im Inneren der Zelle
zu färben. Es folgte die Auswertung der Ergebnisse mit der FlowJo Flow Cytometrie Analysis
Software.
3.2.10.2 Intrazelluläre FACS-Färbung: Analyse der Blutproben von DEREG-Mäusen
Um die Effektivität der Treg-Depletion in DEREG-Mäusen zu untersuchen, wurde den Tieren
vor und nach DT-Injektion Blut aus dem retrobulbären Plexus (siehe 3.2.3.) entnommen und
in Heparin beschichteten Röhrchen in das Labor überführt. Die Vollblutproben wurden in 1 ml
Erythrozytenlysepuffer aufgenommen und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es
folgte ein Zentrifugationsschritt bei 300 x g, 4°C für 5 Minuten und die erneute Aufnahme der
Zellen in 600 µl Erythrozytenlysepuffer. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurden
die Zellen in 150 µl FACS-Puffer aufgenommen, in eine 96 Well Platte überführt, erneut mit
150 µl FACS-Puffer gewaschen (300 x g, 4°C, 3 Minuten) und das Pellet im Restvolumen auf
dem Schüttler resuspendiert. Zu den Zellen wurden 10 µl des 1:100 in FACS-Puffer
verdünnten Fc-Block-Antikörpers gegeben und diese dann für 5 Minuten im Dunkeln auf Eis
inkubiert. Anschließend wurden 10 µl des entsprechend verdünnten (1:100, bzw. abhängig
34
3 Material und Methoden
von Rezeptordichte, Zellzahl, etc.) FACS-Antikörpers bzw. des entsprechenden IsotypKontollantikörpers zu den Zellen gegeben und diese erneut für 20-30 Minuten auf Eis im
Dunkeln inkubiert (siehe Standard-Messung). Um nun die intrazellulär gelegenen Foxp3Antigene anzufärben, wurden die Zellen zweimal mit 150 µl FACS-Puffer gewaschen und
das Pellet in 150 µl „Fix/Perm“ (vorher 1:4 Konzentrat/Diluent verdünnt) aufgenommen. Nach
einer Inkubationszeit von 2 Stunden auf Eis im Dunkeln wurden die Zellen zweimal mit 150
µl Permeabilisierungspuffer gewaschen und dann mit der intrazellulären Färbung begonnen.
Dazu wurden erneut 10 µl des 1:100 in Permeabilisierungspuffer verdünnten Fc-BlockAntikörpers gegeben und diese dann für 5 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert. Es folgte
dann die Zugabe von 10 µl des 1:100 in Permeabilisierungspuffer verdünnten Foxp3Antikörpers bzw. dessen Isotyp-Kontrollantikörpers und eine Inkubation von 30 Minuten auf
Eis
im
Dunkeln.
Abschließend
Permeabilisierungspuffer
gewaschen
wurden
und
die
in
Zellen
150
µl
zweimal
mit
FACS-Puffer
150
für
µl
die
durchflusszytometrische Analyse resuspendiert.
3.2.10.3 FACS-Sorting-Verfahren: Isolation CD3+CD8a+ T-Zellen und MHC II+CD11c+ DZ
Zur optimierten Isolierung der CD3+CD8α+ T-Zellen und der MHC II+CD11c+ DZ wurde die
Technologie der Zellsortierung mittels FACS angewendet. Dafür wurden die entnommenen
Lymphknoten wie bereits beschrieben zu Einzelzellsuspensionen verarbeitet (siehe 3.2.4),
hierbei jedoch aufgrund der großen Menge des Materials mit 1000 µl Blendzyme verdaut und
in PBS aufgenommen. Für die Antikörperfärbung wurden sie unter sterilen Bedingungen
gezählt, zentrifugiert (300 x g, 4°C, 10 Minuten) und in FACS-Puffer auf eine Zellzahl von 1 x
106 – 1 x 107 Zellen/ml eingestellt. Anschließend wurden 0,5 µl (bzw. 0,1 µl, 0,2 µl) pro 106
Zellen des entsprechend verdünnten (1:100, bzw. abhängig von Rezeptordichte, Zellzahl,
etc.) FACS-Antikörpers zu den Zellen gegeben und diese für 20-30 Minuten auf Eis im
Dunkeln inkubiert. Nachdem die Zellen zweimal mit FACS-Puffer gewaschen wurden, folgte
die Aufnahme in FACS-Puffer mit einer Zellkonzentration von 1x107 Zellen/ml. Die Sortierung
der Zellen fand dann an der Core Facility des Uniklinikums Freiburg statt. Die Zellen wurden
in 15 ml Falcons sortiert, in die je 1 ml PBS/BSA (5%) vorgelegt wurde. Für den adoptiven
Transfer der CD3+CD8α+ T-Zellen und der MHC II+CD11c+ DZ wurden diese nach FACS
Isolation unter sterilen Bedingungen erneut gezählt und in PBS auf eine Zellzahl von 2,5 x
106 Zellen/ml (DZ) und 6 x 107 Zellen/ml (CD8α+ T-Zellen) eingestellt. Zum Transfer der
Zellen in die naiven Empfängertiere wurden die Zellen auf Eis wieder in den Mausstall
überführt und dort den jeweiligen Tieren intravenös injiziert. Um die Schwanzvene besser
sichtbar zu machen, wurden die Tiere für wenige Minuten mit einer Wärmelampe bestrahlt.
35
3 Material und Methoden
Die intravenöse Injektion von 250.000 CD11c+ DZ bzw. 6.000.000 CD8α+ T-Zellen in 100 µl
PBS pro Maus in die Schwanzvene erfolgte dann mithilfe einer 1ml Insulinspritze.
3.3
Statistische Analyse
Alle Ergebnisse sind für den jeweiligen Stichprobenumfang als arithmetische Mittelwerte +/Standardabweichung angegeben. Die statistischen Analysen wurden mit GraphPad Prism
5.0 für Windows sowie mit Microsoft Exel 2012 durchgeführt. Statistische Signifikanz wurde
mit dem Zweistichproben t-Test bzw. mit dem Wilcoxon-Rangsummentest für nicht
normalverteilte Datensätze berechnet. Als statistisch signifikant wurden Werte mit p<0,05
angesehen (* für p<0,05, ** für p<0,01, *** für p<0,001).
36
4 Ergebnisse
4
Ergebnisse
4.1
4.1.1
Untersuchungen zur Rolle der CD11c+ DZ in der LZT
Transfer der LZT mit CD11c+ DZ
Für die Untersuchung der Bedeutung der CD11c+ DZ in der Induktionsphase der LZT wurden
diese in Transferexperimenten (siehe 3.2.1.4) aus tolerisierten Mäusen isoliert und in naive
Tiere übertragen, in denen anschließend die allergische Kontakthypersensibilisierung (siehe
3.2.1.2 und 3.2.1.3) durchgeführt wurde. Des Weiteren sollte überprüft werden, ob der Ort
der Injektion der CD11c+ DZ und somit deren Route durch den Organismus des
Empfängertieres (i.v. oder s.c.) eine Rolle spielte. Als in vivo-Parameter diente die Zunahme
der
Ohrschwellung
nach
der
Auslösephase
(siehe
3.2.1.5),
in
vitro
wurde
die
allergenspezifische Lymphozytenproliferation (siehe 3.2.7) sowie die Produktion von IL-2 und
INF-γ in den Zellüberständen (siehe 3.2.9) gemessen. Als Kontrollgruppen dienten Tiere, die
während der LZT-Induktion nur mit Azeton-Olivenöl behandelt wurden. Eine weitere wichtige
Kontrolle waren Tiere, die nach LZT-Standardprotokoll behandelt, aus welchen jedoch keine
Zellen transferiert wurden, um den Erfolg der LZT im Allgemeinen zu überprüfen.
Die Induktion der LZT vor Sensibilisierung und Auslösephase zeigte in der LZTKontrollgruppe eine signifikante Abnahme der Entzündungsreaktion und damit der
Ohrschwellung um ca. 75 % verglichen mit der CHS-Kontrollgruppe, die keine LZTBehandlung erhalten hatte (Abb.5 B,C Kontrollen). Darüber hinaus kam es zu einer
Abnahme der allergenspezifischen Lymphozytenproliferation nach Restimulation der
Lymphknotenzellen aus tolerisierten Mäusen mit TNBS (Abb.5 D,E Kontrollen). Auch die
Produktion der Zytokine IL-2 und IFN-γ in den Zellüberständen der restimulierten
Lymphozytenkultur nach 24 und 48 Stunden war deutlich reduziert im Vergleich zur CHSKontrollgruppe (Abb.5 F,G Kontrollen).
Naive Tiere, denen 24 Stunden vor Sensibilisierung CD11c+ DZ aus tolerisierten Mäusen
gespritzt wurden, zeigten eine mit der LZT-Kontrollgruppe vergleichbare Reduktion der
Entzündungsreaktion der Haut in Form einer reduzierten Ohrschwellung, auch verglichen mit
Tieren, die CD11c+ DZ aus nicht tolerisierten Mäusen erhalten hatten (Abb.5 B,C Adoptiver
Transfer CD11c+ DZ). Diese Induktion der Toleranz in den naiven Tieren konnte unabhängig
vom Ort der Zell-Injektion durchgeführt werden: Sowohl die intravenöse Injektion der Zellen
in die Schwanzvene als auch die subkutane Injektion der Zellen in die Rücken- bzw.
Pfotenhaut führte zu einer Abnahme der Ohrschwellung. Die in vitro-Ergebnisse zeigten
auch hier, dass die Lymphozyten der Tiere, die tolerogene CD11c+ DZ vor Sensibilisierung
erhalten hatten, eine geringere Proliferation nach Restimulation mit TNBS (Abb.5 D,E
Adoptiver Transfer CD11c+ DZ) und eine ebenfalls geringere Zytokinproduktion von IL-2 und
37
4 Ergebnisse
IFN-γ im Vergleich zu den Kontrollgruppen aufweisen (Abb.5 F,G Adoptiver Transfer CD11c+
DZ).
A
Transfer von
CD11c+ DZ
Toleranzinduktion
Sensibilisierung
Allergenprovokation
Analyse
B
d7
d8d14d15
C
150
subkutan
Ohrschwellung (mm x 10-2)
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
intravenös
***
***
100
50
0
Kontrolle
D
***
***
100
50
0
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
Kontrolle
Adoptiver Transfer
CD11+DZ
E
intravenös
10000
[3H] Thymidin (cpm)
150
CHS
LZT
8000
6000
4000
2000
subkutan
8000
6000
4000
2000
0
0
6
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
24h
1500
CHS
LZT
1000
Kontrolle
G
500
150
Kontrolle
50
4000
2000
1000
0
n.d.
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
300
CHS
LZT
3000
n.d.
Kontrolle
48h
IL-2 [pg/ml]
IFN-gamma [pg/ml]
0
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
CHS
LZT
100
0
48h
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
24h
IL-2 [pg/ml]
IFN-gamma [pg/ml]
F
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
1
4. 0 6
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
6
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
6
Kontrolle
CHS
LZT
10000
[3H] Thymidin (cpm)
d0–d3
CHS
LZT
200
100
0
Kontrolle
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
Kontrolle
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
Abb.5: LZT Transfer mit tolerogenen CD11c+ DZ
Transfer von CD11c+ DZ aus mit LZT und ohne LZT behandelten Tieren in naive Tiere i.v.
oder s.c. und Kontrollgruppen ohne Transfer. A: Protokoll des Experimentes. B,C:
Ohrschwellung mit und ohne LZT behandelter Kontrollgruppen und Ohrschwellung mit LZTDZ (weiße Balken) und mit nicht-LZT-DZ (schwarze Balken) i.v. bzw. s.c. behandelter Tiere
nach Sensibilisierung und Allergenprovokation in absoluten Werten (µm). Dargestellt sind
Mittelwerte +/- SD. D,E: Allergenspezifische Restimulation und 24-stündige Inkubation der
Lymphozyten aus nach Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten mit TNBS.
Messung der 3H-Thymidininkorporation über 18 Std. als Maß für die Proliferation in
absteigender Zellzahl pro Well. Mit LZT-DZ behandelte Tiere in weiß und nicht-LZT-DZ
behandelte Tiere in schwarz dargestellt. F,G: Zellkulturüberstände von IFN-γ und IL-2 der
38
4 Ergebnisse
nach Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten nach 24-stündiger und 48stündiger Kultur aus s.c. behandelten Tieren. Messung der Zytokine im ELISA. Dargestellt ist
ein repräsentativer aus je 4 Versuchen (s.c und i.v.); n=6 Mäuse pro Gruppe; n.d.= nicht
detektierbar.
Im dargestellten Experiment konnte somit gezeigt werden, dass die Übertragung der LZT
mittels CD11c+ DZ nach der Induktionsphase eine effektive Tolerisierung der Empfängertiere
gegenüber dem Kontaktallergen TNCB bewirkte und in diesen Tieren die Auslösung einer
Allergie nicht mehr möglich war. Die Induktion der Toleranz in den naiven Tieren war dabei
unabhängig vom Ort der Injektion der übertragenen CD11c+ DZ.
4.1.2
Transfer der LZT mit CD8α+ Zellen
In vorherigen Studien konnte wiederholt gezeigt werden, dass die systemisch induzierte
Wirkung der LZT u.a. durch die Generierung von CD8α+ Suppressor-T-Zellen hervorgerufen
und auch von diesen in naive Tiere übertragen werden kann (Steinbrink et al. 2006;
Steinbrink et al. 2011). Für die Übertragung der LZT wurden hierbei jedoch sehr hohe
Mengen (2-3 x 107) der CD8α+ T-Zellen benötigt, wohingegen die Anzahl der für die
Übertragung der LZT notwendigen CD11c+ DZ sehr niedrig ist (2,5 x 106). Aus diesem
Grund sollte im nächsten Experiment überprüft werden, ob es sich bei dem oben genannten
Effekt eventuell um eine Kontamination der CD8+ T-Zell-Suspension mit CD11c+ DZ handelt
und diese für den adoptiven Transfer der LTZ verantwortlich sind. Für die Durchführung des
Experimentes wurde für die Transferexperimente die Zellsortierung mithilfe des FACSSorting-Verfahrens
optimiert
und
eine
Kontamination
der
Zellsuspension
damit
ausgeschlossen bzw. auf ein Minimum reduziert (siehe 3.3.10.3). Im Anschluss an die
Sortierung der Zellen mithilfe des Durchflusszytometers konnten somit isoliert CD3+CD8α+ TZellen (6 x 107) und isoliert MHCII+CD11c+ DZ (2,5 x 106) aus tolerisierten Mäusen in naive
Tiere übertragen und in diesen anschließend die CHS ausgelöst werden (siehe 3.2.1.2 und
3.2.1.3). Die Zunahme der Ohrschwellung diente erneut als in vivo-Parameter (siehe
3.2.1.5), in vitro die allergenspezifische Lymphozytenproliferation (siehe 3.2.7) sowie die
Produktion von IFN-γ in den Zellüberständen 24 und 48 Stunden nach Restimulation (siehe
3.2.9). Als Kontrollgruppen dienten Tiere, die während der LZT-Induktion nur mit AzetonOlivenöl behandelt wurden. Eine weitere wichtige Kontrolle waren Tiere, die nach LZTStandardprotokoll behandelt, aus welchen jedoch keine Zellen transferiert wurden, um den
Erfolg der LZT zu überprüfen.
In diesem Versuch konnte die Induktion einer Toleranz mittels der LZT erneut bestätigt
werden, die LZT-Kontrollgruppe zeigte hierbei eine signifikant erniedrigte Ohrschwellung
verglichen mit der CHS-Gruppe (Abb.6 B Kontrolle), eine deutliche Abnahme der
Lymphozytenproliferation (Abb.6 C Kontrollen) und der Interferonproduktion (Abb. 6 D
39
4 Ergebnisse
Kontrollen). Auch die aus tolerisierten Mäusen isolierten und übertragenen MHCII+CD11c+
DZ konnten, wie im vorherigen Experiment (siehe 4.1.1), die Toleranz in naive Tiere
übertragen (Abb.6 B,C,D Adoptiver Transfer CD11c+ DZ). Naive Tiere, die 24 Stunden vor
der Sensibilisierung CD8α+ Zellen aus tolerisierten Mäusen erhalten hatten, zeigten ebenfalls
eine reduzierte Ohrschwellung (Abb.6 B Adoptiver Transfer CD8+ Zellen) verglichen mit den
Tieren, die CD8α+ Zellen aus mit Azeton-Olivenöl behandelten Tieren erhalten hatten. Auch
die in vitro-Ergebnisse der allergenspezifischen Lymphozytenproliferation und die IFN-γProduktion der Lymphozyten der Tiere, die CD8+ Zellen aus tolerisierten Tieren erhalten
hatten, sind im Vergleich zur CHS-Kontrollgruppe signifikant reduziert (Abb.6 C,D Adoptiver
Transfer CD8+ Zellen).
Zusammenfassend konnte in diesem Experiment gezeigt werden, dass die LZT tatsächlich
ebenfalls von den CD8α+ T-Zellen in naive Tiere transferiert werden kann und es sich hierbei
nicht um eine Kontamination der T-Zell-Suspension mit CD11c+ DZ handelt. Dieser Versuch
unterstützt dabei weiter die Hypothese, dass die CD11c+ DZ die Generation der CD8α+
Suppressor-T-Zellen induzieren und beide Zellarten bei der Entstehung der LZT eine
essentielle Rolle spielen.
40
4 Ergebnisse
Abb.6: LZT Transfer mit CD8α+ T-Zellen
Transfer von CD8α+ Zellen und CD11c+ DZ aus mit LZT und ohne LZT behandelten Tieren in
naive Tiere und Kontrollgruppen ohne Transfer. A: Protokoll des Experimentes. B:
Ohrschwellung der mit und ohne LZT behandelten Kontrollgruppen und Ohrschwellung der
mit LZT-Zellen (weiße Balken) und der mit nicht-LZT-Zellen (schwarze Balken) behandelten
Tiere nach Sensibilisierung und Allergenprovokation in absoluten Werten (µm). Dargestellt
sind Mittelwerte +/- SD. C: Allergenspezifische Restimulation und 24-stündige Inkubation der
Lymphozyten aus nach Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten mit TNBS.
Messung der 3H-Thymidininkorporation über 18 Std. als Maß für die Proliferation in
absteigender Zellzahl pro Well. Mit LZT-Zellen behandelte Tiere in weiß und mit nicht-LZTZellen behandelte Tiere in schwarz dargestellt. D: Zellkulturüberstände von IFN-γ der nach
Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten nach 24- und 48-stündiger Kultur.
41
4 Ergebnisse
Messung der Zytokine im ELISA. Dargestellt ist ein repräsentativer aus 2 Versuchen; n=4-6
Mäuse pro Gruppe.
4.1.3
Aktivierung des innaten Immunsystems durch SDS hebt tolerogene Wirkung
auf
In der nachfolgenden Versuchsreihe sollte nun analysiert werden, welchen Einfluss eine
bereits bestehende dermale Entzündung auf die Induktion der LZT hat, das bedeutet
inwieweit eine LZT-Induktion nach der Aktivierung des innaten Immunsystems noch möglich
ist. Um eine zuverlässige Entzündungsreaktion hervorzurufen, wurde hierfür das anionische
Tensid Sodiumdodecylsulfat (engl.: sodium dodecyl sulfate, SDS) verwendet, das als
experimentelles Agens zur Induktion irritativer Reaktionen sehr häufig eingesetzt wird
(Übersicht in Lee et al. 1995) und alleine nicht in der Lage ist, eine allergische
Kontaktdermatitis zu induzieren (Wanner und Schreiner 2008). Dazu wurde 30 Minuten vor
der LZT-Behandlung SDS auf die Stelle der nachfolgenden LZT aufgetragen (siehe 3.2.1.6),
die Tiere in Folge sensibilisiert (siehe 3.2.1.2) und die Allergie ausgelöst (siehe 3.2.1.3). Ob
eine
bereits
bestehende
Entzündung
bewirkt,
dass
die
LZT-Dosierung
bereits
sensibilisierende Wirkung erlangt, wurde durch Weglassen der Sensibilisierung im Rahmen
dieser Experimente ebenfalls getestet.
Analysiert wurden die Ohrschwellung als in vivo-Parameter (siehe 3.2.1.5) sowie die
allergenspezifische Lymphozytenproliferation (siehe 3.2.7) nach Restimulation mit TNBS als
in vitro-Parameter. Als Kontrollgruppen dienten Tiere, die während der LZT-Induktion mit
oder ohne SDS nur mit Azeton-Olivenöl behandelt wurden, um den Erfolg der LZT zu
überprüfen, sowie Tiere die während der LZT-Induktion mit oder ohne SDS nur mit AzetonOlivenöl behandelt und nachfolgend nicht sensibilisiert wurden.
42
4 Ergebnisse
A"
ToleranzInduktion
+/- SDS
+/Sensibilisierung
Allergenprovokation
Analyse
d0"–"d4
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
B"
""""""""""""""""""d5"""""""""""""""""""""""""""""""""""d10""""""""""""""""d11""
120
100
CHS
LZT
ns
***
80
60
***
ns
40
20
0
SDS
-
-
+
+
Toleranzinduktion
-
+
-
+
Sensibilisierung
Allergenprovokation
TNCB
TNCB
1"
-
-
+
+
+
-
+
TNCB
TNCB
TNCB
TNCB
2"
3"
4"
C"
[3H] Thymidin (cpm)
80000
CHS
LZT
60000
40000
20000
6
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
6
4.
0×
1
6. 0 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
6
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
6
4.
0×
1
6. 0 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
0
Kontrolle
1"
+ SDS
2"
keine Sensibilisierung
keine Sensibilisierung + SDS
3"
4"
Abb.7: LZT bei Aktivierung des innaten Immunsytems mit SDS
LZT in mit SDS vorbehandelten Tieren mit und ohne nachfolgender Sensibilisierung und
Kontrollgruppen. A: Protokoll des Experimentes. B: Ohrschwellung der mit und ohne LZT
behandelten Kontrollgruppen und Ohrschwellung der mit SDS+LZT (weiße Balken) und der
mit SDS ohne LZT (schwarze Balken) behandelten Tiere nach Sensibilisierung und
Allergenprovokation (Gruppe 1 und 2); Ohrschwellung der mit und ohne LZT behandelten
Kontrollgruppen und Ohrschwellung der mit SDS+LZT (weiß) und der mit SDS ohne LZT
(schwarz) behandelten Tiere ohne Sensibilisierung und alleiniger Allergenprovokation
(Gruppe 3 und 4) in absoluten Werten (µm). Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. C:
Allergenspezifische Restimulation und 24-stündige Inkubation der Lymphozyten aus nach
Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten mit TNBS. Messung der 3HThymidininkorporation über 18 Std. als Maß für die Proliferation in absteigender Zellzahl pro
Well. Mit LZT behandelte Tiere in weiß und ohne LZT behandelte Tiere in schwarz
dargestellt. Dargestellt ist ein repräsentativer aus 4 Versuchen (Gruppe 1 und 2) und ein
repräsentativer aus 3 Versuchen (Gruppen 3 und 4); n=6 Mäuse pro Gruppe.
43
4 Ergebnisse
Die Versuche zeigen, dass die Induktion der Toleranz zu einer Abnahme der Ohrschwellung
(Abb.7, B Gruppe 1) und der allergenspezifischen Lymphozytenproliferation (Abb.7 C
Gruppe 1) im Vergleich zur Kontrollgruppe führt. Wurde vor der LZT-Behandlung SDS
aufgetragen, zeigte sich kein signifikanter Unterschied mehr hinsichtlich der Ohrschwellung
und der Lymphozytenproliferation im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne LZT (Abb.7 B,C
Gruppe 2). Das bedeutet es konnte bei gleichzeitiger Irritation der Haut keine Toleranz
induziert werden. Vielmehr führte die Irritation der Haut mit SDS zum Zeitpunkt der LZT auch
bei Weglassen der nachfolgenden Sensibilisierung und alleiniger Allergenprovokation zu
einer deutlichen Zunahme der Ohrschwellung im Vergleich zur Kontrollgruppe mit Tieren, die
mit SDS aber ohne LZT behandelt und nicht sensibilisiert wurden (Abb.7 B Gruppe 4). Eine
alleinige Induktion der Toleranz mit den subimmunogenen Konzentrationen des Allergens
ohne SDS führte hierbei ohne Sensibilisierung nicht zu einer signifikanten Zunahme der
Ohrschwellung nach Allergenprovokation im Vergleich zur Kontrollgruppe, in der weder eine
Toleranzinduktion noch eine Sensibilisierung, sondern nur die Allergenprovokation erfolgte
(Abb.7 B Gruppe 3). Analog dazu zeigten sich auch in den in vitro-Ergebnissen trotz
Auslassen der Sensibilisierung eine Zunahme der proliferierenden Lymphozyten nach
Allergenprovokation, wenn die LZT auf irritierte Haut aufgetragen wurde (Abb.7 C Gruppe 4),
nicht jedoch bei einer LZT-Behandlung auf gesunder Haut (Abb.7 C Gruppe 3).
Zusammengefasst konnte in dieser Versuchsreihe gezeigt werden, dass bei bereits
bestehender, durch SDS ausgelöster Irritation der Haut im Modell der Niedrigzonentoleranz
keine Toleranz gegenüber dem Antigen erreicht werden konnte. Zusätzlich wirkte die
Behandlung mit der LZT im vorliegenden Fall sogar gegenteilig: Es zeigte sich, dass die
sonst tolerogene LZT-Dosis des Allergens im Falle einer Aktivierung des innaten
Immunsystems mit einhergehender Inflammation der Haut eine sensibilisierende Wirkung
erreichte und eine Kontaktallergie induziert wurde, wohingegen die LZT-Dosis auf gesunder
Haut nicht zu einer Sensibilisierung der Tiere führte. Des Weiteren konnte hier gezeigt
werden, dass auch eine Verkürzung des LZT-Protokolls auf 5 Behandlungen alle 24 Stunden
ausreichte, um eine suffiziente Toleranzinduktion zu erlangen.
In
einer
weiteren
Versuchsreihe
sollte
abschließend
der
mögliche
Einfluss
des
Lösungsmittels Dimethylformamid (DMF) auf die Irritation der Haut analysiert werden.
Untersucht wurde dabei die Zunahme der Ohrschwellung nach Behandlung mit SDS und
LZT, DMF und LZT und mit DMF alleine unter Auslassung der Sensibilisierung und alleiniger
Allergenprovokation (Abb.8 A+B); sowie der Zeitverlauf der Ohrschwellung im Rahmen einer
wiederholten Gabe von einprozentigem SDS in DMF und DMF alleine (Abb.8 C).
Die Ergebnisse verdeutlichen erneut, dass die Allergendosis der LZT nach vorangegangener
SDS-Behandlung Sensibilisierungspotential erlangt und es trotz fehlender Sensibilisierung
44
4 Ergebnisse
nach Allergenprovoaktion zu einer signifikanten Ohrschwellung im Vergleich zu der
Kontrollgruppe ohne SDS kommt (Abb.8 B Gruppe 1, schwarzer und weißer Balken). Diese
Ohrschwellung ist vergleichbar mit einer normalen Entzündungreaktion nach Sensibilisierung
und Allergenprovokation (Abb.8 B, Gruppe 4, schwarzer Balken). Nach vorheriger
Applikation des Lösungsmittels DMF ohne SDS in Kombination mit LZT zeigt sich eine mit
der vorangegangenen Gruppe ohne SDS vergeichbare Ohrschwellung (Abb.8 A Gruppe 2,
dunkelgrauer Balken). Diese unterschied sich weiterhin immer noch signifikant von einer
alleinigen DMF-Applikation ohne LZT (Abb. 8 A Gruppe 3, hellgrauer Balken).
Abb.8:
LZT
bei
Aktivierung
des
innaten
Immunsytems
mit
SDS
und
dem
Lösungsmittel DMF
LZT in mit SDS oder DMF vorbehandelten Tieren zur Überprüfung des
Entzündungspotentials des Lösungsmittels DMF. A: Protokoll des Experimentes in B. B:
Ohrschwellung der mit LZT und SDS (schwarzer Balken) und ohne SDS (weißer Balken)
behandelten Tiere ohne Sensibilisierung und nach Allergenprovokation (Gruppe 1);
Ohrschwellung der mit DMF und LZT behandelten Tiere (Gruppe 2, dunkelgrauer Balken)
und Ohrschwellung der mit DMF und ohne LZT behandelten Tiere (Gruppe 3, hellgauer
45
4 Ergebnisse
Balken) ohne Sensibilisierung und alleiniger Allergenprovokation. Ohrschwellung der ohne
SDS, DMF oder LZT behandelten Tiere nach Sensibilisierung und Allergenprovokation
(Gruppe 4, schwarzer Balken) in absoluten Werten (µm). Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD.
C: Protokoll des zweiten Vesuches und Ergebnis mit Zeitverlauf der Ohrschwellung der mit
1% SDS in DMF behandelten Tiere (Ÿ) im Vergleich zu mit DMF behandelten Tieren (¢) in
absoluten Werten (µm). Gezeigt ist je ein einzelner Versuch. n=6 Mäuse pro Gruppe.
Folglich konnte gezeigt werden, dass das Lösungsmittel DMF in Kombination mit den
niedrigen Allergenkonzentrationen der LZT genau wie die LZT alleine einen leichten
irritativen Effekt vermittelte, dieser jedoch signifikant unterhalb des Irritationspotenzials von
SDS zurückblieb und eine isolierte DMF-Applikation zu einer vernachlässigbaren Schwellung
der Ohrhaut führte. Die gemessene Ohrschwellung im Zeitverlauf verdeutlicht hierbei, dass
eine unspezifische Irritation der Haut und eine damit einhergehender Schwellung nur durch
das Irritans SDS nicht aber durch DMF ausgelöst werden konnte (Abb. 8 C). Ein
maßgeblicher Einfluss oder sensibilisierendes Potential des Lösungsmittels für die
Hautirritation mit SDS konnte somit ausgeschlossen werden.
4.1.4
Foxp3+ regulatorische T-Zellen induzieren die Entwicklung des tolerogenen
Phänotyps der CD11c+ DZ in der LZT
Da in vorausgegangenen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass die Anwesenheit
regulatorischer T-Zellen unerlässlich für die Induktion der Toleranz ist und ein Fehlen dieser
Zellen während der Toleranzinduktion zu einer augmentierten Entzündungsreaktion nach
Kontakthypersensibilisierung führt (Pfender 2012; Luckey et al. 2012), sollte in den folgenden
Experimenten nun die Bedeutung der regulatorischen T-Zellen für die Entwicklung der
tolerogenen CD11c+ DZ und deren Zusammenspiel in der Induktionsphase der LZT
untersucht werden.
Dafür wurden in Transferexperimenten CD11c+ DZ aus zum Zeitpunkt der LZT-Behandlung
Treg-depletierten Tieren isoliert (siehe 3.2.1.4), in naive Empfängertiere übertragen und in
diesen die Kontaktallergie ausgelöst. Um eine effektive Depletion der regulatorischen TZellen in den Spendertieren zu erreichen, wurde das von Lahl et al. entwickelte DEREGMausmodell (siehe 3.1.6.1) verwendet (Lahl et al. 2007). Hierbei konnte gezeigt werden,
dass die Gabe von 1 µg DT (Diphtherietoxin) zu einer zeitabhängigen, sehr effektiven
Depletion der Tregs in den hautdrainierenden Lymphknoten, dem peripheren Blut sowie der
Haut führt. Die Rekonstitution der Tregs im peripheren Blut erfolgte dabei nach 4-5 Tagen; in
den hautdrainierenden Lymphknoten sowie in der Haut selber verlief diese deutlich
langsamer (Pfender 2012). Um die LZT-Behandlung in diesem Zeitfenster mit größtmöglicher
Treg-Depletion durchzuführen, wurde in den folgenden Experimenten aus diesem Grund mit
einem verkürzten Protokoll gearbeitet (siehe 3.2.1.1). Die Effektivität der Depletion wurde
hierbei mithilfe von FACS-Analysen der Foxp3+ T-Zellen im peripheren Blut überprüft (siehe
46
4 Ergebnisse
3.2.11.2). Darauffolgend wurde in den Empfängertieren nach Sensibilisierung und
Auslösephase wiederum die Ohrschwellung analysiert und die Lymphozytenproliferation
sowie die Zytokinproduktion nach Restimulation mit TNBS gemessen. Als Kontrollgruppen
dienten erneut Tiere, deren Zellen nicht transferiert wurden, um die Effektivität der LZTBehandlung zu überprüfen sowie eine CHS-Gruppe, in der die LZT-Behandlung durch die
Gabe von Azeton-Olivenöl ersetzt wurde. Eine weitere wichtige Kontrolle, waren Tiere, die
CD11c+ DZ aus tolerisierten aber nicht Treg-depletierten Spendertieren erhalten hatten, um
die Effektivität des LZT-Transfers mittels CD11c+ DZ in diesen Versuchen zu überprüfen.
Auch hier konnte in den Kontrollgruppen eindeutig die Entwicklung der LZT bzw. CHS
anhand
der
Ohrschwellungsreaktionen
(Abb.9
B
Kontrolle),
der
unterschiedlichen
Lymphozytenproliferation nach haptenspezifischer Restimulation (Abb.9 C Kontrolle) und der
Zytokinproduktion von IL-2 und IFN- γ in den Zellüberständen (Abb.9 D,E Kontrolle) belegt
werden. Darüber hinaus wurde erneut in zwei weiteren Kontrollgruppen bestätigt, dass die
Übertragung der CD11c+ DZ aus tolerisierten bzw. Azeton-Olivenöl behandelten Tieren zu
einer wirksamen Toleranzinduktion bzw. CHS-Reaktion gegenüber dem Kontaktallergen
TNCB in den Empfängertieren führt (Abb. 9 C,D,E Adoptiver Transfer CD11c+ DZ).
Im Gegensatz dazu konnte die Toleranz mit CD11c+ DZ aus Mäusen, die in Abwesenheit der
Foxp3+ Zellen tolerisiert wurden, nicht in die naiven Empfängertiere übertragen werden,
sondern es entstand eine ausgeprägte CHS-Entzündungsreaktion mit deutlich erhöhter
Ohrschwellung (Abb.9 B Adoptiver Transfer CD11c+ +DT, rot dargestellt). Verglichen mit den
Kontrollgruppen (Abb.9 B Adoptiver Transfer CD11c+ -DT) war diese Reaktion zudem
wesentlich augmentiert, wenn die Toleranzinduktion in Abwesenheit der Tregs durchgeführt
wurde.
Entsprechend dieser in vivo-Ergebnisse zeigte sich auch in der in vitro-gemessenen T-ZellProliferation ein ähnliches Bild (Abb.9 C). Lymphozyten aus Tieren, die mit CD11+ DZ aus
tolerisierten Mäusen substituiert wurden (Abb. 9 C Adoptiver Transfer CD11c+ DZ), zeigten
eine sichtlich geringere Proliferation als die Lymphozyten aus Tieren, die mit CD11c+ DZ aus
Azeton-Olivenöl behandelten bzw. Treg-depletierten Mäusen behandelt wurden (Abb.9 C
Adoptiver Transfer CD11c+ DZ +DT, rot dargestellt). Auch die gemessene Zytokinproduktion
in den Überständen der Zellkulturen nach haptenspezifischer Restimulation nach 24 und 48
Stunden bestätigte durch eine Abnahme der IL-2 und IFN-γ Produktion die Induktion der LZT
bzw. durch eine Zunahme der IL-2 und IFN-γ Produktion die Induktion der CHS in den
Empfängertieren nach Zellerhalt (Abb.9 D,E Adoptiver Transfer CD11c+ DZ). Wiederum
konnte hier gezeigt werden, dass die CD11c+ DZ aus Treg-depletierten Tieren keine
Induktion der LZT in den Empfängertieren ermöglichen, messbar in der Zunahme der
Zytokinproduktion (Abb.9 D,E Adoptiver Transfer CD11c+ +DT, rot dargestellt).
47
4 Ergebnisse
A)
Transfer von
CD11c+ DZ
Toleranzinduktion
DT
Allergenprovokation
Sensibilisierung
Analyse
P12/36h))))))))))))))d0)–)d3))))))))))))))))))d7
C)
ns
***
150
***
***
100
CHS
LZT
LZT + DT
50
0
60000
[3H] Thymidin (cpm)
CHS
LZT
DT + LZT
40000
20000
Adoptiver Transfer von CD11c+ DZ
nach Behandlung mit
DT
6
0
Kontrolle
4.
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
1
4. 0 6
0×
6. 10 4
3×
1. 10 4
0×
1. 10 5
6×
2. 10 5
5×
4. 10 5
0×
6. 10 5
3×
1. 10 5
0×
10
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
B)
))))))))))))))))))))))))))))d8))))))))))))))))))))))d14))))))d15)))
Kontrolle
E)
24h
IFN-gamma [pg/ml]
5000
CHS
LZT
LZT + DT
4000
3000
2000
1000
48h
25000
IFN-gamma [pg/ml]
D)
CHS
LZT
LZT + DT
20000
15000
10000
5000
0
0
Adoptiver Transfer von CD11c+ DZ
nach Behandlung mit
DT
24h
800
CHS
LZT
LZT + DT
600
400
200
Kontrolle
AdoptiverTtransfer von CD11c+ DZ
nach Behandlung mit
DT
48h
250
CHS
LZT
LZT + DT
200
IL-2 [pg/ml]
Kontrolle
IL-2 [pg/ml]
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
150
100
50
n.d.
0
Kontrolle
Adoptiver Transfer von CD11c+ DZ
nach Behandlung mit
DT
n.d.
0
Kontrolle
n.d.
Adoptiver Transfer von CD11c+ DZ
nach Behandlung mit
DT
Abb.9: LZT Transfer mit CD11c+ DZ bei Depletion der Foxp3+ Tregs
Transfer von CD11c+ DZ aus Treg-depletierten und LZT behandelten Tieren in naive Tiere.
A"Protokoll"B"7x))alle)12h)epikutane)Applika4on)(Rücken))von)15µl)0,03%)TNBC)in)AOO)(LZT))oder)AOO)alleine(Vehikel),)
Kontrollgruppen
mit CD11c+ DZ aus mit und ohne LZT behandelten Tieren und
Deple4on)der)regulatorischen)FOXP3+)TPZellen)in)DEREG)Mäusen)mit)DT)1µg/Maus)36h)und)12h)vor)LZT,))Transfer)von)
Kontrollgruppen
ohne Transfer. A: Protokoll des Experimentes. B: Ohrschwellung mit und
250.000)CD11c+)DCs/Maus)in)naive)Tiere)i.v.$an)d7)bzw.)Kontrollen)ohne)Transfer,)Sensibilisierung)(Bauch))an)d8)mit)
ohne
LZT behandelter Kontrollgruppen, Ohrschwellung mit LZT-DZ (weiße Balken) und mit
100µl)3%)TNCB)in)AOO,)Challenge)(Ohr))an)d14)mit)15µl)0,6%)TNCB)in)Aceton,)Ohrschwellung$gemessen)24h)nach)
Challenge.)C"T1Zell1Prolifera7on)nach))Res4mula4on)mit)TNBS)D"IL12$und$IFN1gamma$ELISA$aus)24h)und)48h)
nicht-LZT-DZ
(schwarze Balken) behandelter Tiere und Ohrschwellung mit LZT-DZ aus
Überständen,)n=6,)ein)Experiment)aus)4)unabhängigen)Experimenten)gezeigt;)n.d$=$under$detec7on$limit$
Treg-depletierten
Mäusen behandelter Tiere (roter Balken) nach Sensibilisierung und
)
Allergenprovokation
in absoluten Werten (µm). Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. C:
)
Allergenspezifische Restimulation und 24-stündige Inkubation der Lymphozyten aus nach
Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten mit TNBS. Messung der 3HThymidininkorporation über 18 Std. als Maß für die Proliferation in absteigender Zellzahl pro
Well. Mit LZT-DZ behandelte Tiere in weiß, nicht-LZT-DZ behandelte Tiere in schwarz und
LZT-DZ aus Treg-depletierten Tieren in rot dargestellt. D,E: Zellkulturüberstände von IFN-γ
und IL-2 der nach Behandlungsgruppen zusammengeführten Lymphknoten nach 24stündiger und 48-stündiger Kultur. Messung der Zytokine im ELISA. Dargestellt ist ein
48
4 Ergebnisse
repräsentativer aus 5 Versuchen mit vergleichbarem Ergebnis; n=4-6 Mäuse pro Gruppe;
n.d.= nicht detektierbar.
Zusammenfassend konnte in diesem Experiment dargestellt werden, dass durch den
adoptiven Transfer von CD11c+ DZ aus Treg-depletierten und tolerisierten Mäusen die LZT
nicht in naive Empfängertiere übertragen werden konnte. Damit wurde belegt, dass Foxp3+
regulatorische T-Zellen unerlässlich für die Entwicklung des tolerogenen Phänotyps der
CD11c+ DZ in der LZT sind.
4.1.5
Zellkontakt zwischen tolerogenen CD11c+ DZ und Tregs im Empfängertier
In einem darauffolgenden Experiment sollte untersucht werden, ob die Interaktion zwischen
Foxp3+ Tregs und den tolerogenen CD11c+ DZ einen direkten Zellkontakt beinhaltet. Dazu
wurden in einem kongenen Mausmodell CD11c+ DZ in Transferexperimenten (siehe 3.2.1.4)
aus tolerisierten Mäusen (Ly5.2) isoliert und in naive Tiere (Ly5.1) übertragen. 24 Stunden
nach Transfer wurden nun die regionalen Lymphknoten entnommen und mittels
immunhistochemischer Färbung die einzelnen Gewebssektionen analysiert. Als Kontrolle
dienten dabei Tiere, die während der LZT-Induktion ausschließlich mit Azeton-Olivenöl
behandelt wurden (Abb.10 A).
Hierbei zeigte sich, dass nach dem Transfer tolerogener DZ in naive Tiere eine signifikant
höhere Anzahl Foxp3+ Tregs aus dem Empfängertier in direktem Kontakt mit den injizierten
dendritischen Zellen steht, als nach dem Transfer der DZ aus der Kontrollgruppe (Abb.10
B,C LZT,CHS). Die bereits gezeigte Übertragung der LZT mit CD11c+ DZ (siehe 4.1.1)
konnte hier zuverlässig wiederholt werden und wurde sowohl in den Ohrschwellungsdaten
(Abb.10 D), als auch in vitro mittels Lymphozytenproliferation und Zytokinproduktion (Daten
nicht gezeigt) bestätigt.
Diese Ergebnisse liefern einen Hinweis darauf, dass es nach Übertragung der tolerogenen
CD11c+ dendritischen Zellen zu einem direkten und vermehrten Zellkontakt mit den Foxp3+
Tregs kommt und die Toleranz unter anderen darüber vermittelt werden könnte.
49
4 Ergebnisse
A!
ToleranzLy5.2& induktion
Transfer von
CD11c+ DZ
Ly5.1&
Allergenprovokation
Analyse/
Sensibilisierung
Analyse
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d0!–!d3!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d7
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d8!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d14!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d15!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
C!
Anzahl Foxp3+ T-Zellen/DZ
B!
CHS!
CHS
LZT
Ohrschwellung (mm x 10-2)
D!
LZT!
150
***
***
CHS
LZT
100
50
0
Kontrollen
Adoptiver Transfer
CD11+DZ
Foxp3+&Tregs!
Ly5.2+&DZ!
Abb.10: Zellkontakt zwischen tolerogenen CD11c+ DZ und Tregs
Transfer von CD11c+ DZ. aus mit LZT und ohne LZT behandelten Ly5.2 Tieren s.c in naive
Ly5.1 Empfänger und wt Tiere und immunhistochemische Färbung der Ly5.2 DZ und der
Foxp3+ Tregs im hautdrainierenden Lymphknoten der Ly5.1 Tiere. A: Protokoll des
Experimentes. B: Foxp3 (rot) und Ly5.2 (grün) Färbung in Gewebssektionen der regionalen
Lymphknoten 24 Stunden nach Transfer von Ly5.2 DZ aus mit bzw. ohne LZT behandelten
Tieren. C: Dargestellt ist die Anzahl der Foxp3+ Treg pro DZ in 20 high-power fields. D:
Ohrschwellung der mit LZT-DZ (weiße Balken) und der mit nicht-LZT-DZ (schwarze Balken)
behandelten und sensibilisierten Tiere vor vs. 24 Std. nach Allergenprovokation in µm.
Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. Dargestellt ist ein einzelner Versuch. Ly5.1 Tiere n=2 pro
Gruppe, wt n=6 pro Gruppe.
Anm.: Die immunhistochemische Färbung der Lymphknoten und die statistische Auswertung
erfolgte im Anschluss an das Experiment durch die Forschungsgruppe Prof. Steinbrink in
Mainz (s. Luckey et al. 2012).
50
4 Ergebnisse
4.1.6
Transfer der LZT mit tolerogenen CD11c+ DZ in Treg-depletierte Tiere
Ob der Zellkontakt zwischen Foxp3+ Tregs und CD11c+ DZ im Empfängertier tatsächlich eine
funktionelle Relevanz für die Übertragung der LZT aus tolerisierten Mäusen in naive
Empfängertiere hat, sollte im folgenden Experiment überprüft werden. Dazu wurden CD11c+
DZ aus tolerisierten bzw. Azeton-Olivenöl behandelten Mäusen in, zum Zeitpunkt des
Transfers Treg-depletierte, naive Empfängertiere übertragen (siehe 3.2.6. und 3.2.2.). Um
eine effektive Depletion der Foxp3+ Tregs zum Zeitpunkt des Transfers in den
Empfängertieren zu erreichen, wurde das bereits zuvor beschriebene DEREG-Mausmodell
(siehe 4.1.1.) verwendet.
Dazu wurde den Empfängertieren 1 µg DT 72 Stunden vor
Transfer injiziert, sodass zum Zeitpunkt des Transfers eine größtmögliche Depletion der
Tregs erreicht werden konnte. Die Effektivität der Depletion wurde hierbei erneut mithilfe von
FACS-Analysen im peripheren Blut überprüft (siehe 3.2.11.2). Die Sensibilisierung der mit
tolerogenen DZ behandelten und Treg-depletierten Tieren erfolgte dann in einem zeitlichen
Abstand von 13 Tagen zur DT-Injektion, um eine möglichst vollständige Rekonstitution der
Tregs im peripheren Blut, den drainierenden Lymphknoten sowie der Haut zu diesem
Zeitpunkt zu erreichen. Darauffolgend wurde in den Empfängertieren nach Sensibilisierung
und Auslösephase wiederum die Ohrschwellung analysiert. Als Kontrollgruppen dienten
erneut eine CHS- und LZT-Kontrollgruppe, um die Effektivität der Toleranzinduktion zu
überprüfen. Des Weiteren wurden CD11+DZ aus tolerisierten bzw. Azeton-Olivenöl
behandelten Tieren in naive, Treg-kompetente Empfänger transferiert, um den Erfolg des
adoptiven Transfers der LZT zu überprüfen. Eine weitere wichtige Kontrollgruppe waren
Tiere, in denen die Tregs depletiert, jedoch keine Zellen übertragen wurden, um die
Rekonstitution der Tregs in den Empfängertieren zum Zeitpunkt der Sensibilisierung zu
überwachen.
Die Kontrollgruppen in diesem Versuch zeigten erneut deutlich die Entwicklung der LZT bzw.
CHS anhand der Ohrschwellungsreaktion (Abb.11, B Gruppe 1). Die Depletion der
regulatorischen T-Zellen führte in Tieren, die keine LZT, im Anschluss jedoch die
Sensibilisierung
und
Allergenprovokation
erhielten,
nicht
zu
einer
augmentierten
Entzündungsreaktion (Abb.11, B Gruppe 4), sodass von einer vollständigen Rekonstitution
der Tregs zu diesen Zeitpunkten ausgegangen werden kann. Auch die Übertragung der LZT
mit CD11c+ DZ aus tolerisierten Tieren in Treg-kompetente Empfängertiere konnte im
Vergleich zu Kontrolltieren, die mit DZ aus Azeton-Olivenöl behandelten Tieren substituiert
wurden, erneut bestätigt werden (Abb.11 B Gruppe 2). Wurden die regulatorischen T-Zellen
zum Zeitpunkt des Transfers der CD11c+ DZ aus LZT behandelten Tieren im Empfängertier
depletiert, so zeigte sich auch hier eine deutliche Abnahme der Ohrschwellung verglichen mit
Treg-depletierten Tieren, die CD11c+ DZ aus nicht LZT behandelten Spendern erhielten
(Abb.11, B Gruppe 3).
51
4 Ergebnisse
Es kann also vermutet werden, dass die Anwesenheit der Foxp3+ Tregs und insbesondere
deren Zellkontakt mit CD11c+ DZ nach Transfer der Zellen in das Empfängertier funktionell
nicht notwendig ist, um die Toleranz zu induzieren.
A!
Transfer von
CD11c+ DZ
Toleranzinduktion
!d0!–!d3!!!!!!!!!!!!!!!!!!d4!
DT
Sensibilisierung
Allergenprovokation
Analyse
!!!!!!"72h!!!!!!!!!!!!d4!!!!!!!!!!!!!!!!!!d10!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!d16!!!!!!!!!d17!
Ohrschwellung (mm x 10-2)
B!
200
CHS
LZT
DT allein
ns
**
***
150
***
100
50
0
Toleranzinduktion
-
+
-
+
-
+
-
DT
-
-
-
-
+ +
+
Adoptiver Transfer
CD11c+ DZ
-
-
+ +
+ +
-
1"
2"
3"
4"
Abb. 11.: Transfer der LZT mit tolerogenen CD11c+ DZ in Treg-depletierte Tiere
Substitution von CD11c+DZ aus mit LZT und ohne LZT behandelten Tieren in zu diesem
Zeitpunkt Treg-depletierte DEREG-Tiere. Kontrollgruppen ohne Transfer, ohne Transfer mit
DT-Applikation und mit Transfer in Treg-kompetente Tiere. A: Protokoll des Experimentes.
B: A"Protokoll!B"Gruppen!à!6!Tiere,!7x!!alle!12h!epikutane!Applika=on!(Rücken)!von!15µl!0,03%!TNBC!in!AOO!(LZT)!oder!
Ohrschwellung der mit (weiße Balken) und ohne (schwarze Balken) LZT behandelten
AOO!alleine!(Vehikel)!,Deple=on!der!regulatorischen!Foxp3+!T"Zellen!in!DEREG!Mäusen!mit!DT!1µg/Maus!!72h!vor!
Kontrollgruppe (Gruppe 1) und Ohrschwellung der mit 1 µg DT Treg-depletierten DEREGZelltransfer,!Transfer!von!250.000!CD11c+!DCs/Maus!i.v.$!bzw.!Kontrollen!ohne!Transfer,!Sensibilisierung!(Bauch)!nach!
Mäuse
(grauer Balken, Gruppe 4); Ohrschwellung der mit LZT-DZ (weiße Balken) und der
Foxp3+!Treg!Recover!13!Tage!(d10)!nach!DT!Gabe!mit!100µl!3%!TNCB!in!AOO,!Challenge!(Ohr)!an!d16!mit!15µl!0,6%!
mit TNCB!in!Aceton,!Ohrschwellung$gemessen!24h!
nicht-LZT-DZ (schwarze Balken) behandelten Tiere (Gruppe 2) und Ohrschwellung der
mit !nach!Challenge.!
LZT-DZ (weiße Balken) und der nicht LZT-DZ (schwarze Balken) substituierten, Treg!
depletierten
Tiere (Gruppe3) in absoluten Werten (µm). Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD.
Ein einzelner Versuch gezeigt. wt n=6 pro Gruppe, DEREG n=4 pro Gruppe.
52
4 Ergebnisse
4.2
Untersuchungen zur Allergenspezifität der transferierten CD11c+ DZ
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Induktion der Toleranz durch
die LZT allergenspezifisch wirkt oder sich zur Vermeidung einer Allergie gegen andere
Kontaktallergene eignet.
Hierbei konnte bereits gezeigt werden, dass die LZT mittels CD4+CD25+Foxp3+ Tregs
haptenunspezifisch in naive Empfängertiere übertragen werden kann (Luckey et al. 2012).
Die Übertragung der LZT mittels CD8α+ Suppressor T-Zellen hingegen folgte in diesen
Versuchen einem haptenspezifischen, nicht auf andere Kontaktallergene übertragbarem
Muster (Luckey et al. 2012). Inwieweit die Übertragung der Toleranz durch CD11c+ DZ, die
als mögliche Verbindung zwischen den CD4+CD25+Foxp3+ Tregs und den CD8α+
Suppressor T-Zellen dienen, einem haptenspezifischen Muster folgt, sollte in den weiteren
Versuchen überprüft werden. Da in den oben erwähnten Experimenten mit DNFB ein
strukturell dem TNCB sehr ähnliches Kontaktallergen verwendet wurde, sollten die Versuche
im Folgenden durch das Kontaktallergen Oxazolon erweitert werden.
4.2.1
Allergenspezifität der LZT
Zunächst wurde hierfür die Allergenspezifität der LZT im Allgemeinen analysiert, indem mit
TNCB tolerisierte Mäuse (siehe 3.2.1.1) mit DNFB bzw. Oxazolon 24 Stunden später
sensibilisiert (siehe 3.2.1.2) und 5 Tage danach ebenfalls mit DNFB bzw. Oxazolon die
Allergie provoziert wurde (Protokoll in Abb.12 A), (siehe 3.2.1.3). Gemessen wurden hierbei
die Unterschiede der Ohrschwellung im Zeitverlauf über 6 Tage.
Dabei zeigte die Gruppe, die Tolerisierung, Sensibilisierung und Allergenprovokation mit
TNCB erhalten hatte, erneut eine effektive LZT, verglichen mit der Gruppe ohne
Toleranzinduktion, die eine „normale“ Kontaktdermatitis entwickelte (Abb.12 B,C TNCB).
Wurden Sensibilisierung und Allergenprovokation im selben Versuchsaufbau (LZT mit
TNCB) mit DNFB durchgeführt, so zeigte sich, dass auch hier die Toleranz induziert werden
konnte und die Ohrschwellung der LZT-Gruppe im Vergleich zur CHS-Gruppe signifikant
verringert war (Abb.12 B,C DNFB). Erfolgten nach LZT Induktion mit TNCB Sensibilisierung
und Allergenprovokation mit Oxazolon, so konnte dieser Effekt interessanterweise nicht
beobachtet werden. Die Zunahme der Ohrschwellung innerhalb der LZT-Gruppe unterschied
sich nicht von derjenigen der CHS-Gruppe (Abb.12 B,C OXA). Für alle Kontaktallergene war
der Höhepunkt der Ohrschwellung nach erfolgter Allergenprovokation bei 24 Stunden
messbar und somit gut vergleichbar.
Es konnte somit gezeigt werden, dass die Induktion der Toleranz mittels TNCB im Falle von
DNFB auch auf dieses Kontaktallergen übertragen werden konnte. Für Oxazolon konnte hier
keine Toleranz induziert werden.
53
4 Ergebnisse
Sensibilisierung
A"
DNFB
ToleranzInduktion
DNFB
Oxazolon
Oxazolon
TNCB
TNCB
AllergenProvokation
TNCB
Analyse
d0"–"d9
150
CHS AOO-TNCB-TNCB
LZT TNCB-TNCB-TNCB
TNCB
Ohrschwellung (mm x 10-2)
100
50
100
50
14
4h
12
0h
h
Kinetik
150
CHS AOO-OXA-OXA
Oxazolon
LZT TNCB-OXA-OXA
100
50
C"
Ohrschwellung (mm x 10-2)
Kinetik
96
h
72
24
h
14
4h
12
0h
h
96
h
72
48
24
h
0
h
0
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
CHS AOO-DNFB-DNFB
LZT TNCB-DNFB-DNFB
DNFB
h
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
150
48
B"
""""""""""""""""""d10"""""""""""""""""""""""""""""""""d15""""""""""""""""d16""
***
150
CHS
LZT
ns
***
100
50
0
Kinetik
14
4h
12
0h
h
96
h
72
h
48
24
h
0
Toleranzinduktion
(TNCB)
Sensibilisierung/
Allergenprovokation
-
+
TNCB
-
+
DNFB
-
+
Oxa
A"Protokoll"B"Gruppen"à"6"Tiere,"10x"alle"24h"epikutane"Applika?on"(Rücken)"von"15µl"0,03%"TNBC"in"AOO"(LZT)"oder"
AOO"alleine"(Vehikel),""Sensibilisierung"(Bauch)"an"d11"mit"100µl"3%"TNCB"in"AOO,20"µl"1%"DNFB"in"AOO"oder"100µl"
Abb.12:
Untersuchungen zur Allergenspezifität der LZT
3%"Oxazolon"in"AOO,"Challenge"(Ohr)"an"d16"mit"15µl"0,6%"TNCB"in"Aceton,"20µl"0,1%"DNFB"in"AOO"oder"15µl"0,6%"
Oxazolon"in"Aceton,"Ohrschwellung"gemessen"24hX144h"nach"Challenge."C"Ohrschwellung"gemessen"24h"nach"
Induktion
der Toleranz mittels epikutaner Applikation subimmunogener Konzentrationen von
TNCBChallenge."
gefolgt von Sensibilisierung (24 Stunden danach) und Allergenprovokation (5 Tage
"
danach) mit TNCB, DNFB oder Oxazolon.
A: Versuchsprotokoll. B: Kinetik der Ohrschwellung der mit (weißer Punkt) und ohne
(schwarzer Punkt) LZT behandelten Tiere, Sensibilisierung und Allergenprovokation mit
TNCB (gelb), DNFB (grün) oder Oxazolon (blau). Gemessen in absoluten Werten (µm) 24144 Stunden nach Allergenprovokation. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. C:
Ohrschwellung der mit LZT (weißer Balken) und ohne LZT (schwarzer Balken) behandelten
Tiere 24 Stunden nach Allergenprovokation mit TNCB, DNFB oder Oxazolon in absoluten
Werten (µm). Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. Einer aus zwei Versuchen mit
vergleichbarem Ergebnis dargestellt.
54
4 Ergebnisse
4.2.2
Untersuchungen zur Allergenspezifität der übertragenen DZ in der
Kontaktallergie mit TNCB, DNFB und Oxazolon
Inwieweit die im Lymphknoten ansässigen CD11c+ DZ die Toleranz im Rahmen der LZTInduktion haptenspezifisch oder -unspezifisch vermitteln, sollte in Transferexperimenten
überprüft werden. Dabei wurden erneut die CD11c+ DZ aus den Lymphknoten TNCBtolerisierter Tiere isoliert (siehe 3.2.1.4) und an Tag 7 in naive Tiere adoptiv transferiert.
Diese wurden 24 Stunden später mit TNCB, DNFB oder Oxazolon sensibilisiert (siehe
3.2.1.2) und die Allergie 5 Tage später mit TNCB, DNFB oder Oxazolon ausgelöst (siehe
3.2.1.3). Gemessen wurde hier wie in vorherigen Experimenten der in-vivo Parameter der
Ohrschwellung nach der Auslösephase alle 24 Stunden über 5 Tage (Abb.13 A Protokoll).
Als Kontrollgruppen dienten Tiere, die während der LZT-Induktion nur mit Azeton-Olivenöl
behandelt und diese Zellen als CHS-DZ in naive Tiere transferiert wurden. Eine weitere
wichtige Kontrolle waren Tiere, die nach LZT-Standardprotokoll behandelt, jedoch keine
Zellen transferiert wurden, um den Erfolg der LZT im Allgemeinen zu überprüfen.
Die Induktion der LZT vor Sensibilisierung und Auslösephase zeigte in der LZTKontrollgruppe eine signifikante Abnahme der Entzündungsreaktion und damit der
Ohrschwellung verglichen mit der CHS-Kontrollgruppe, wenn sowohl LZT, Sensibilisierung
als auch Auslösephase mit TNCB durchgeführt wurden. (Abb.13 B TNCB CHS und LZT).
Naive Tiere, denen 24 Stunden vor Sensibilisierung CD11c+ DZ aus mit TNCB tolerisierten
Mäusen gespritzt wurden, zeigten eine, mit der LZT-Kontrollgruppe vergleichbare Reduktion
der Entzündungsreaktion der Haut in Form einer reduzierten Ohrschwellung, auch verglichen
mit Tieren, die CD11c+ DZ aus nicht tolerisierten Mäusen erhalten haben (Abb.13 B TNCB
AT CHS-DZ und LZT-DZ). Wurden die Empfängertiere mit DNFB sensibilisiert und
provoziert, so konnten die aus TNCB-tolerisierten Mäusen transferierten DZ auch hier eine
Toleranz induzieren und eine deutliche Reduktion der Ohrschwellung im Vergleich zur
Kontrollgruppe bewirken (Abb.13 B DNFB AT CHS-DZ und LZT-DZ). Naive Tiere, die mit
DNFB sensibilisiert und im Anschluss die Allergie ebenfalls mit DNFB ausgelöst wurde
(Abb.13 B DNFB DNFB-DNFB, schwarzes Dreieck), zeigten eine mit der Kontrollgruppe
(CHS-DZ) vergleichbare Ohrschwellung. Erneut zeigte sich, dass in Empfängertieren, die mit
Oxazolon sensibilisiert und provoziert wurden, die aus LZT-Tieren übertragenen DZ keine
Toleranz induzieren konnten (Abb.13 B Oxazolon AT CHS-DZ und LZT-DZ). Naive Tiere, die
mit Oxazolon sensibilisiert und im Anschluss die Allergie ebenfalls mit Oxazolon ausgelöst
wurde (Abb.13 B Oxazolon OXA-OXA, schwarzes Dreieck), zeigten eine mit der
Kontrollgruppe (CHS-DZ) vergleichbare Ohrschwellung. Die Übertragung der DZ in die
Empfängertiere
hatte
demzufolge
keinen
Einfluss
auf
die
absoluten
Werte
der
Ohrschwellung bei der Kontakthypersensibilisierung mit DNFB oder Oxazolon.
55
4 Ergebnisse
Zusammengefasst liefern diese Experimente keine eindeutige Antwort auf die Frage nach
der Allergenspezifität der Toleranz übertragenden CD11c+ DZ. Auch hier zeigt sich, wie im
vorherigen Experiment (siehe 4.2.1), dass im Falle des strukturähnlichen Haptens DNFB
eine Toleranz induziert werden konnte, im Falle von Oxazolon eine Induktion der Toleranz
nicht möglich war.
Sensibilisierung
A#
DNFB
ToleranzInduktion
AllergenProvokation
DNFB
Oxazolon
Transfer von
CD11c+ DZ
Oxazolon
TNCB
TNCB
TNCB
Analyse
d0#–#d3
150
150
CHS AOO-TNCB-TNCB
LZT TNCB-TNCB-TNCB
100
50
AT CHS-DZ TNCB-TNCB
AT LZT-DZ TNCB-TNCB
TNCB
Ohrschwellung (mm x 10-2)
TNBC
0
100
50
Kinetik
14
4h
12
0h
h
Kinetik
AT CHS-DZ DNFB-DNFB
AT LZT-DZ DNFB-DNFB
DNFB-DNFB
DNFB
100
50
0
150
AT CHS-DZ OXA-OXA
AT LZT-DZ OXA-OXA
OXA-OXA
Oxazolon
Ohrschwellung (mm x 10-2)
150
100
50
Kinetik
14
4h
12
0h
h
96
h
72
h
48
h
14
4h
12
0h
h
96
h
72
h
48
24
h
0
24
Ohrschwellung (mm x 10-2)
96
h
72
24
h
14
4h
12
0h
h
96
h
72
h
48
24
h
0
h
Ohrschwellung (mm x 10-2)
####d16###############d17*22##
48
B#
########d7#########################d8################
Kinetik
Abb.13: Untersuchungen zur Allergenspezifität der Toleranz übertragenden CD11c+ DZ
Induktion der Toleranz mittels epikutaner Applikation subimmunogener Konzentrationen von
TNCB. Adoptiver Transfer der CD11c+ DZ aus mit LZT und ohne LZT behandelten
Spendertieren in naive Empfänger, gefolgt von Sensibilisierung (24 Stunden danach) und
Allergenprovokation (5 Tage danach) mit TNCB, DNFB oder Oxazolon. Kontrollgruppe ohne
Transfer. A: Protokoll des Versuches. B: Zeitverlauf der Ohrschwellung der mit (weißer
Punkt) und ohne (schwarzer Punkt) LZT behandelten Kontrollgruppe, Kinetik der
A"Gruppen#à#6#Tiere,#7x##alle#12h#epikutane#Applika=on#(Rücken)#von#15µl#0,03%#TNBC#in#AOO#(LZT)#oder#AOO#alleine#
Ohrschwellung
der mit (weißer Punkt) und mit nicht (schwarzer Punkt) LZTDZ substituierten
(Vehikel),##Transfer#von#250.000#CD11c+#DCs/Maus#in#naive#Tiere#i.v.$an#d7#bzw.#Kontrollen#ohne#Transfer,#
Tiere, Sensibilisierung und Allergenprovokation mit TNCB (gelb), DNFB (grün) oder
Sensibilisierung#(Bauch)#an#d8#mit#100µl#3%#TNCB#in#AOO,20#µl#1%#DNFB#in#AOO#oder#100µl#1%#Oxazolon#in#AOO,#
Oxazolon
(blau). Außerdem Ohrschwellung unbehandelter Tiere nach Sensibilisierung und
Challenge#(Ohr)#an#d16#mit#15µl#0,6%#TNCB#in#Aceton,#20µl#0,1%#DNFB#in#AOO#oder#15µl#0,6%#Oxazolon#in#Aceton,#
Allergenprovokation
mit DNFB und Oxazolon (schwarzes Dreieck). Gemessen in absoluten
Ohrschwellung$gemessen#24h#nach#Challenge.#B"Darstellung#des#Zeitverlaufes#bei#TNCB,DNFB,Oxazolone.#
n=1# (µm) 24-144 Stunden nach Allergenprovokation. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD.
Werten
Einer aus zwei Versuchen mit vergleichbarem Ergebnis dargestellt.
56
4 Ergebnisse
4.2.3
Kreuzreaktivität zwischen TNCB, DNFB und Oxazolon in vivo
Aufgrund
der
Ergebnisse
der
vorherigen
Experimente
sollte
im
Folgenden
als
Erklärungsansatz eine möglicherweise vorhandene Kreuzreaktivität zwischen TNCB und
DNFB im Rahmen des allergischen Kontaktekzems in vivo überprüft werden. Dafür wurden
naive Tiere mit DNFB, Oxazolon oder TNCB auf der rasierten Bauchhaut sensibilisiert (siehe
3.2.1.2), 5 Tage danach an den Ohren die Kontaktallergie mit jeweils DNFB, Oxazolon oder
TNCB ausgelöst (siehe 3.2.1.3) und 24 Stunden später die Zunahme der Ohrschwellung
sowie deren Kinetik im Verlauf über 4 Tage gemessen (siehe 3.2.1.5), (Abb.14 A Protokoll).
Dabei konnte gezeigt werden, dass die Sensibilisierung und Allergenprovokation mit TNCB
(schwarz)
zu
einer
deutlichen
Zunahme
der
Ohrschwellung
um
ca.
90%
des
Ausgangswertes führte (Abb.14 B TNCB-TNCB). Wurden mit TNCB sensibilisierte Tiere
jedoch mit DNFB (dunkelgrau) bzw. Oxazolon (hellgrau) provoziert, konnte keine signifikante
Zunahme der Ohrschwellung gemessen werden (Abb.14 B TNCB-DNFB und TNCB-Oxa).
Wurden mit DNFB sensibilisierte Tiere mit DNFB (schwarz), TNCB (dunkelgrau) bzw.
Oxazolon (hellgrau) provoziert, so konnte auch hier nur durch die Verwendung des gleichen
Haptens (DNFB) eine deutliche CHS-Reaktion ausgelöst werden (Abb.14 B DNFB-DNFB,
DNFB-TNCB und DNFB-Oxa). Auch bei Einsatz des Kontaktallergens Oxazolon konnte
keine Kreuzreaktivität für eines der anderen Kontaktallergene (TNCB und DNFB)
nachgewiesen werden (Abb.14 B Oxa-Oxa, Oxa-TNCB und Oxa-DNFB). Für jedes Hapten
wurde
zusätzlich
die
Irritanswirkung
nach
alleiniger
Allergenprovokation
ohne
Sensibilisierung anhand der Ohrschwellung überprüft (Abb.14 B TNCB, DNFB, Oxa weiße
Balken). Somit konnte gezeigt werden, dass die vorherige Sensibilisierung mit einem
ungleichen Allergen in keiner der dargestellten Messungen zu einer über den Irritanseffekt
des Allergens hinaus reichenden Ohrschwellung führte.
Auch hier konnte das Maximum der Ohrschwellung für alle Allergene 24 Stunden nach
Allergenprovokation ermittelt werden, sodass die gemessenen Werte gut vergleichbar waren
(Abb.14 C). Eine verspätete CHS-Reaktion konnte bei der Betrachtung der Ohrschwellung
über 4 Tage ausgeschlossen werden (Abb.14 C alle Graphen).
Zusammengefasst konnte keine Kreuzreaktivität der verwendeten Kontaktallergene im
Rahmen einer in vivo Messung der Ohrschwellung festgestellt werden. Mit den vorliegenden
Ergebnissen
konnte
somit
keine
hinreichende
Erklärung
für
die
sich
deutlich
unterscheidenden Messungen zur Allergenspezifität der LZT (siehe 4.2.1) und der
transferierten CD11c+ DZ (siehe 4.2.2) für die Kontaktallergene DNFB und Oxazolon
gefunden werden.
57
4 Ergebnisse
A+
Sensibilisierung
AllergenProvokation
DNFB
DNFB
Oxazolon
Oxazolon
TNCB
TNCB
Analyse
++d0
B+
+++++++d6++++++++++++++++++++d7+++++++++
150
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
***
***
***
***
***
***
***
***
100
***
50
0
TNCB
Oxa
100
50
DNFB
Oxa
150
DNFB-DNFB
DNFB-TNCB
DNFB-Oxa
keine SensibilisierungDNFB
100
50
h
0
Oxa-Oxa
Oxa-TNCB
Oxa-DNFB
keine SensibilisierungOxa
100
50
12
0h
h
96
h
72
48
24
h
0
h
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
TNCB
Kinetik nach Allergenprovokation
Kinetik nach Allergenprovokation
150
Oxa
24
h
12
0h
96
h
72
48
24
h
0
DNFB
Oxa
12
0h
DNFB
TNCB-TNCB
TNCB-DNFB
TNCB-Oxa
keine SensibilisierungTNCB
150
h
C+
TNCB
Oxa
h
Oxa
Oxa
96
DNFB
DNFB
h
TNCB
DNFB
72
Allergenprovokation
DNFB
h
TNCB
48
TNCB
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
TNCB
Ohrschwellung (mm x 10 -2)
Sensibilisierung
Kinetik nach Allergenprovokation
A"Sensibilisierung+(Bauch)+an+d0+mit+100µl+3%+TNCB+in+AOO,20+µl+1%+DNFB+in+AOO,+100+µl+2%+Oxazolon+in+AOO,+
Abb.14:
Untersuchungen zur Kreuzreaktivität zwischen TNCB, DNFB und Oxazolon in
Challenge+(Ohr)+an+d6+mit+15µl+0,6%+TNCB+in+Aceton,+20µl+0,1%+DNFB+in+AOO,+15µl+0,6%+Oxazolon+in+Azeton,+
Ohrschwellung+gemessen+24h+nach+Challenge.+B"Verlauf/der/Ohrschwellung/über+120h.+n=5+.+Ein+unabhängiges+
vivo
Experiment+aus+3+gezeigt.+
+
Sensibilisierung mit TNCB, DNFB oder Oxazolon und Allergenprovokation (5 Tage danach)
mit TNCB, DNFB oder Oxazolon. Kontrollgruppen ohne Sensibilisierung. A: Protokoll des
Versuches. B: Erster Abschnitt: Ohrschwellung der mit TNCB sensibilisierten und jeweils mit
TNCB (schwarz) ,DNFB (hellgrau) und Oxazolon (dunkelgrau) provozierten Tiere.
Kontrollgruppe ohne Sensibilisierung (weiß). Zweiter Abschnitt: Ohrschwellung der mit DNFB
sensibilisierten und jeweils mit DNFB (schwarz), TNCB (hellgrau) und Oxazolon (dunkelgrau)
provozierten Tiere. Kontrollgruppe ohne Sensibilisierung (weiß). Dritter Abschnitt: Mit
Oxazolon sensibilisierte und jeweils mit Oxazolon (schwarz), TNCB (hellgrau) und DNFB
(dunkelgrau) provozierte Tiere. Kontrollgruppe ohne Sensibilisierung (weiß). C: Zeitverlauf
58
4 Ergebnisse
der Ohrschwellung. Gemessen in absoluten Werten (µm) 24-120 Stunden nach
Allergenprovokation. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SD. Einer aus drei Versuchen mit
vergleichbarem Ergebnis dargestellt.
59
5 Diskussion
5
5.1
Diskussion
Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
In der vorliegenden Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass CD11c+ dendritische Zellen
eine wichtige Rolle in der Induktion der Niedrigzonentoleranz (engl.: low zone tolerance,
LZT) im Mausmodell der allergischen Kontaktdermatitis (engl.: contact hypersensitivity, CHS)
spielen. So konnte die Wirkung der LZT mittels der CD11c+ DZ in naive Empfängertiere
transferiert werden. Weiterhin zeigte sich, dass Foxp3+ regulatorische T-Zellen unerlässlich
für die Entwicklung des tolerogenen Phänotyps der CD11c+ DZ in der LZT sind und ein
Transfer der LZT nach vorheriger Treg-Depletion nicht mehr möglich ist. Ein direkter
Zellkontakt zwischen CD11+ DZ und Foxp3+ Tregs nach Zelltransfer schien hingegen für die
Übertragung der Toleranz nicht notwendig. Ebenso konnte die LZT mit CD8α+ T-Zellen in
naive Empfängertiere übertragen werden.
Ferner konnte demonstriert werden, dass bei bereits bestehender Irritation der Haut im
Modell der Niedrigzonentoleranz keine Toleranz gegenüber dem Antigen induziert werden
kann. Vielmehr entwickelt die sonst tolerisierende Dosierung der LZT in Kombination mit der
Irritation eine sensibilisierende Wirkung.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Allergenspezifität der Toleranz übertragenden CD11c+
DZ untersucht. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass die Induktion der Toleranz mit
TNCB sowie die Übertragung der LZT mittels CD11c+ DZ im Falle des Kontaktallergens
DNFB Wirksamkeit zeigte, sodass hier von einer Kreuztolerogenität ausgegangen werden
kann. Dies gilt jedoch nicht für Oxazolon. Eine direkte Kreuzreaktivität der verwendeten
Kontaktallergene TNCB und DNFB hingegen konnte in vivo nicht nachgewiesen werden.
5.2
Rolle der CD11c+ DZ in der LZT
Dendritische Zellen haben eine essentielle Bedeutung im Netzwerk der Immunregulation.
Aus diesem Grund sollte in dieser Arbeit die Funktion der CD11c+ DZ für die Induktion der
Niedrigzonentoleranz analysiert werden.
Im Modell der oralen Toleranz konnten plasmazytoide, dendritische Zellen, die in der Leber
und in den mesenterialen Lymphknoten eine klonale Deletion antigenspezifischer CD8+
Effektor T-Zellen induzieren und auf diese Weise Toleranz vermitteln, nachgewiesen werden
(Übersicht in Goubier et al. 2008; Dubois et al. 2009). Der Effekt einer UV-induzierten
Toleranz gegen DNFB wurde durch die Depletion CD11c+ DZ aufgehoben, so dass diesen
auch hier eine entscheidende Rolle für die Generierung der Toleranz zukam (Maeda et al.
2005). Ebenso waren IL-10 produzierende DZ in der Lage, die experimentelle
60
5 Diskussion
Autoimmunencephalitis (EAE) zu unterdrücken (Yang et al. 2000; Legge et al. 2000) oder
eine Toleranz gegen intranasale Antigene zu administrieren (Akbari et al. 2001).
Im Bereich der Niedrigzonentoleranz wurde demonstriert, dass Effektor T-Zellen über die
Freisetzung von TNF-α aus tolerogenen DZ in die Apoptose getrieben werden, und den DZ
dabei erstmals eine wichtige Rolle in der Vermittlung der LZT zugesprochen (Luckey et al.
2011). Langerhans Zellen und dermale DZ, die als essentiell für die Auslösung der
Kontaktallergie beschrieben wurden (Kripke et al. 1990), waren in Experimenten für die
Induktion der LZT nicht erforderlich (Steinbrink et al. 1996). Weiterhin konnten NK Zellen als
wesentliche Vermittler der LZT ausgeschlossen werden (Luckey et al. 2011). Auch für BZellen, die ebenfalls als APZ eine antigenspezifische Toleranz in naive CD4+ und CD8+ TZellen induzieren können (Eynon et al. 1992; Fuchs et al. 1992), konnte keine relevante
Rolle nachgewiesen werden (Seidel-Guyenot et al. 2004).
In Experimenten mit CD11c-DTR-Mäusen, in denen eine selektive Depletion der CD11c+ DZ
mittels Diphtherietoxin zum Zeitpunkt der Toleranzinduktion möglich ist, führte das transiente
Fehlen der CD11c+ DZ zu einer kompletten Inhibition der Toleranz. Unterschiede in der
Anzahl der CD11c+MHCII+ DZ waren zu keinem Zeitpunkt der LZT messbar (Luckey et al.
2012). In Batf3-/- Mäusen, die einen Mangel an CD8+CD11c+ DZ in Lymphgeweben haben
(Hildner et al. 2008), jedoch eine normale CHS Antwort zeigen (Edelson et al. 2010), war
gleichermaßen keine LZT-Induktion möglich (Luckey et al. 2012). Die Bedeutung der CD11c+
dendritischen Zelle für die LZT konnte in der vorliegenden Arbeit dadurch zusätzlich bestätigt
werden, dass in adoptiven Transferexperimenten die Übertragung von CD11c+ DZ aus den
Lymphknoten tolerisierter Mäuse zu einer Induktion der Toleranz in naiven Empfängern
führte (siehe 4.1.1; Luckey et al. 2012). Zusammengenommen kann den CD11c+ DZ damit
eine Schlüsselfunktion in der Induktion der LZT zugesprochen werden.
Der Verlust der sensibilisierenden Kapazität der DZ und die Entwicklung eines tolerogenen
Phänotyps könnte hierbei mit einer Veränderung der Expression von Oberflächenmarkern,
vor allem die DZ/T-Zell-Interaktionen betreffend, assoziiert sein. So exprimierten DZ nach
der Ko-Inkubation mit UV-induzierten Tregs weniger MHC II- und B7-Moleküle (Schwarz et
al. 2010). Im Modell der Niedrigzonentoleranz wurde eine signifikante Reduktion des
Oberflächenmoleküls CD80 beschrieben, eine Veränderung anderer Oberflächenmarker wie
CCR7, CD103, CD86, CD273, CD274, CD275, CD276, B7-H4 und DEC-205 konnte
hingegen nicht beobachtet werden. Interessanterweise kam es unter Depletion der
regulatorischen T-Zellen nicht zu einer Reduktion der CD80 (B7.1) Expression auf CD11c+
DZ, was auf eine Interaktion zwischen Treg und DZ im Rahmen der Toleranzinduktion
hindeutet (Luckey et al. 2012). Dieser Zusammenhang soll im Folgenden weiter ausgeführt
werden.
61
5 Diskussion
5.3
Zusammenspiel der CD11c+ DZ und Foxp3+ regulatorischer Tregs in der LZT
Ein zentraler Aspekt dieser Arbeit war die Charakterisierung des Zusammenspiels der
CD11c+ DZ und der Foxp3+ regulatorischen T-Zellen in der LZT und die Analyse der Rolle
der Tregs für die Induktion eines tolerogenen Phänotyps der CD11c+ DZ. Die Bedeutung von
CD4+CD25+ Tregs für die haptenspezifische Immunantwort konnte im murinen Modell der
Kontaktallergie bereits bewiesen werden (Ikezawa et al. 2005; Kish et al. 2005). Ferner
konnte gezeigt werden, dass das Zusammenspiel von Treg und DZ zur Induktion und
Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz beiträgt (Morelli et al. 2007; Suffner et al. 2010).
Dabei induzieren Treg tolerogene DZ in peripheren Organen über Zellkontakt abhängige und
Zellkontakt unabhängige Mechanismen (Übersicht in Saei et al. 2013). Im Modell der UVinduzierten Toleranz wurde gezeigt, dass die Ko-Kultivierung regulatorischer T-Zellen aus
UV-bestrahlten Tieren mit DNFB-beladenen DZ die Fähigkeit der APZ, eine Kontaktallergie
auszulösen, aufhebt (Schwarz et al. 2010). Zusätzlich generieren TGF-β-induzierte Foxp3+
Tregs bei Kollagen-induzierter Arthritis einen tolerogenen Phänotyp der DZ, die wiederum
die Entwicklung weiterer Foxp3+ Tregs initiieren (Yang et al. 2014).
Im Rahmen des Modells der Niedrigzonentoleranz sind CD4+CD25+Foxp3+ regulatorische TZellen zwingend notwendig für die Entwicklung der LZT wie es in Experimenten mit AntiCD25-Antikörpern bzw. in Depletionsexperimenten in DEREG-Mäusen nachgewiesen
werden konnte (Luckey et al. 2012). Dort konnte ebenfalls demonstriert werden, dass die
LZT mittels der regulatorischen T-Zellen in naive Tiere übertragen werden kann (Luckey et
al. 2012). Eine weitere wichtige Zellart für die Induktion der LZT konnte in CD8+
regulatorischen (Suppressor) T-Zellen gefunden werden (Steinbrink et. al 1996), mit denen
eine Übertragung der LZT in naive Tiere ebenfalls möglich war (Ergebnisse der vorliegenden
Arbeit; Maurer et al. 2003; Steinbrink et al. 2006); deren Potential die LZT zu vermitteln in
Abwesenheit der CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen und von diesen freigesetztem
IL-10 jedoch verloren ging (Luckey et al. 2012; Pfender 2012).
Auf Basis dieser Ergebnisse und der bereits diskutierten Rolle der dendritischen Zelle in der
LZT (siehe 5.2) sollte nun der Frage nachgegangen werden, ob die tolerogenen CD11c+ DZ
möglicherweise die Verbindung zwischen CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischen T-Zellen und
der LZT-typischen CD8+ Suppressor T-Zellen darstellen. So konnte in der vorliegenden
Arbeit gezeigt werden, dass es in Abwesenheit der CD4+CD25+Foxp3+ Treg nicht zur
Generierung des tolerogenen Phänotyps der CD11c+ DZ kam, die LZT in Folge nicht in naive
Tiere transferiert werden konnte und sich eine normale CHS-Reaktion darstellte (siehe
4.1.2). Die Interaktion zwischen beiden Zellarten ist demzufolge für die Induktion der LZT
unerlässlich. Darüber hinaus konnte in anderen Versuchen die These unterstützt werden,
dass die CD11c+DZ notwendig für die Generierung der CD8+ Suppressor T-Zellen sind:
CD8+ T-Zellen aus CD11c+ DZ-depletierten Tieren waren gleichermaßen nicht in der Lage,
62
5 Diskussion
die LZT in naive Empfänger zu transferieren (Luckey et al. 2012). Weiterhin zeigten
CD8+CD11c+ DZ die Fähigkeit zur Kreuzpräsentation an CD8+ T-Zellen und viele Studien
lassen darauf schließen, dass CD11c+CD8+ DZ eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung
der peripheren Toleranz spielen (Übersicht in Shortman et al. 2012; Dudziak et al. 2007; Belz
et al. 2002; Scheinecker et al. 2002).
Zusammengefasst erlauben die dargestellten Ergebnisse die Schlussfolgerung, dass
Interaktionen zwischen aktivierten regulatorischen T-Zellen und CD11c+ DZ einen
tolerogenen Phänotyp der antigenpräsentierenden Zelle prägen, der wiederum die Kapazität
inne hat, die Entwicklung der CD8+ regulatorischen (Suppressor) T-Zellen zu induzieren
(Ergebnisse der vorliegenden Arbeit; Luckey et al. 2012; Pfender 2012).
Ob in der Interaktion zwischen Treg und DZ bei der Vermittlung der Toleranz direkte ZellZellkontakte eine entscheidende Rolle spielen, soll im Folgenden diskutiert werden. Da beide
Zellarten u.a. über einen Gap Junction (engl.: Zell-Zell-Kanal) vermittelten, direkten
Zellkontakt miteinander interagieren (Ring et al. 2010) und der Farbstoff Calcein über Gap
Junctions übertragen werden kann (Bopp et al. 2007; Übersicht in Fonseca et al. 2006),
konnte
in
Transferexperimenten
mit
Calcein-markierten
CD4+CD25+
Tregs
mittels
durchflusszytometrischer Analysen der Lymphknotenzellen gezeigt werden, dass nach
Toleranzinduktion eine deutlich erhöhte Anzahl ebenfalls Calcein-positiver CD11c+ DZ auftrat
(Luckey et al. 2012). Ebenso wurde für das Modell der UV-induzierten Toleranz ein direkter
Zell-Zellkontakt
zwischen
UVR-Tregs
und
DZ
in
vitro
in
Transwell-Experimenten
nachgewiesen (Schwarz et al. 2010). Diese Ergebnisse untermauern die Theorie, dass die
aktivierten Tregs Zellkontakt vermittelt den tolerogenen Phänotyp der DZ prägen.
In der vorliegenden Arbeit konnten nun erstmals auch vermehrte Zellkontakte zwischen
Tregs
und
bereits
tolerogenen
DZ
in
einem
kongenen
Mausmodell
mittels
immunhistochemischer Färbung nachgewiesen werden (siehe 4.1.4; Luckey et al. 2012).
Das Resultat dieser Experimente spräche für eine wichtige Rolle der Interaktion zwischen DZ
und Treg bei der Übertragung der Toleranz im Empfängertier. Die Notwendigkeit der
Interaktion zwischen DZ und Foxp3+ Treg nach bereits erfolgter, tolerogener Prägung der
CD11c+ DZ konnten jedoch weitere Experimenten dieser Arbeit nicht bestätigen. So war ein
Transfer der Toleranz mittels der CD11c+ DZ auch in Foxp3+ Treg-depletierte Tiere möglich
(siehe 4.1.6). Es kann vermutet werden, dass hierbei die CD11c+ DZ zwar mit Foxp3+ Tregs
in Kontakt treten, dieser Kontakt jedoch funktionell nicht notwendig ist, um die LZT zu
übertragen. Einen möglichen Erklärungsansatz liefert die Theorie, dass es sich bei dieser
Interaktion um eine Art „Feedback“-Mechanismus handelt, innerhalb dessen Tregmodifizierte DZ weitere regulatorische T-Zellen induzieren können (Übersicht in Mahnke et
al. 2007), dieser jedoch für die Vermittlung der LZT nicht unbedingt erforderlich ist. Dieses
Ergebnis stützt weiterhin die Vermutung, dass es im Rahmen der Induktion der
63
5 Diskussion
Niedrigzonentoleranz zu Beginn zu einer Generierung des tolerogenen Phänotyps der DZ
durch Foxp3+ Tregs kommt, im weiteren Verlauf die CD11c+ DZ ihr tolerogenes Potential
dann jedoch an CD8+ regulatorische T-Zellen vermitteln.
Eine weitere Möglichkeit der Interaktion zwischen den Zellarten und einer Treg vermittelten
Suppression sind Mechanismen, die über lösliche Faktoren wie IL-10 vermittelt werden
(Übersicht in Shevach et al. 2009; Vocanson et al. 2010; Schwarz et al. 2010). In Mäusen mit
LZT konnte hierbei eine erhöhte Anzahl IL-10+CD4+CD25+ Treg sowohl in vivo in Vert-XMäusen (transkriptionelle IL-10-Reportermäuse) als auch in vitro nach Restimulation der TZellen beobachtet werden (Luckey et al. 2012; Pfender 2012). Überdies konnte die LZT in TZell-defizienten Tieren erst nach Rekonstitution dieser mit CD4+IL10+ T-Zellen induziert
werden. Die Entwicklung der LZT in Experimenten mit anti-IL-10-Antikörpern war hingegen
nicht möglich (Luckey et al. 2012). Zusammengefasst kann neben dem direkten Zellkontakt
also auch einem Zellkontakt unabhängigem Weg, dem löslichen Faktor IL-10 aus Foxp3+
Tregs, eine Schlüsselfunktion für die Induktion der Nierdrigzonentoleranz zugesprochen
werden.
Ein weiterer denkbarer Mechanismus für die Vermittlung von Toleranz konnte in neueren
Studien in Mikrovesikeln wie z.B. Exosomen gefunden werden. Dendritische Zellen stehen
hierbei vor allem bei der Induktion einer Toleranz im Bereich der Transplantationsmedizin im
Fokus der Forschung. So konnte demonstriert werden, dass die intravenöse Injektion von
Exosomen aus den Überständen tolerogener DZ das Überleben allotransplantierter Ratten
durch die Induktion einer Toleranz in CD4+ T-Zellen signifikant verlängerte (Peche et al.
2003). Für das murine Modell der Kontaktallergie zeigte sich, dass im Rahmen der
Hochdosistoleranz aus den Überständen der CD8+ Suppressor T-Zellen antigenspezifische,
exosomen-ähnliche Nanovesikel isoliert werden konnten, die in der Lage waren die
Kontaktallergie zu inhibieren (Bryniarski et al. 2013). Eine mögliche Bedeutung der Exosome
für die Induktion und Vermittlung der LZT bleibt bislang ungeklärt.
5.4
Treg-Depletion im DEREG-Mausmodell
Im Hinblick auf die Untersuchungen zur Interaktion zwischen Treg und DZ in der
Induktionsphase der LZT war die Analyse des Immunsystems bei Depletion der Tregs
nützlich (siehe 4.1.4). Grundsätzlich gibt es verschiedene Modelle, die eine Treg-Depletion
erlauben. Prinzipiell können komplette Knockout-Mäuse verwendet werden. Es konnte
jedoch gezeigt werden, dass sich in diesen, wie auch in den natürlichen Knockout-Tieren der
„scurfy mice“ bereits spontan eine Reihe letaler Entzündungen manifestieren (Brunkow et al.
2001). Aus diesem Grund sind sie für Analysen zur Toleranzinduktion gegenüber Antigenen
ungeeignet. Um eine geringere Rate der spontanen Entzündungssyndrome zu erreichen,
64
5 Diskussion
wurden weitere Verfahren, die eine temporäre Depletion der Treg ermöglichen, beschrieben.
Zum einen wurden hierfür anti-CD25-Antikörper wie Klone PC61, 7D4 und Daclizumab in
klinischen Studien (Tanaka et al. 2002; Kohm et al. 2006; Golovina et al. 2010; Luckey et al.
2012) und zum anderen das Zytostatikum Cyclophosphamid (Lutsiak et al. 2005; Luckey et
al. 2012) verwendet. An dieser Stelle muss jedoch beachtet werden, das CD25 kein
selektiver Marker regulatorischer T-Zellen ist, sondern auch auf aktivierten T- und B-Zellen
exprimiert wird (Lowenthal et al. 1985a; Lowenthal et al. 1985b). Für Cyclophosphamid
konnte nur eine geringe und eher unspezifische Reduktion der Treg-Anzahl nachgewiesen
werden (Übersicht in Golovina et al. 2010).
Eine wesentlich spezifischere und vor allem transiente Depletion der Tregs durch Gabe von
Diphtherietoxin konnte hingegen im Modell der DEREG-Mäuse (Lahl et al. 2007) und in
Foxp3DTR Mäusen (Kim et al. 2007; Kim et al. 2009) über die Zielstruktur Foxp3 demonstriert
werden. Ferner wurde gezeigt, dass die hier induzierte Depletion sowohl im peripheren Blut,
in den hautdrainierenden Lymphknoten als auch in der Haut höchst effektiv ist, jedoch
maximal für einen Zeitraum von 72 Stunden anhält (Pfender 2012). Als möglicher Einfluss
der Treg-Depletion auf die Immunantwort wurde eine verstärkte T-Zellstimulation nach
beschleunigter DZ-Maturation beschrieben (Kim et al. 2007). Dieser Effekt konnte jedoch in
Modellen mit nur inkompletter Treg-Depletion nicht beobachtet werden (Suffner er al. 2010;
Luckey et al. 2012).
Vor diesem Hintergrund wurde in der vorliegenden Arbeit bei Untersuchungen des
Zusammenspiels zwischen Treg und DZ ebenfalls im Modell der DEREG-Maus gearbeitet,
da dieses die besten Bedingungen für Analysen der Bedeutung der Tregs zu einem
bestimmten Zeitpunkt liefert.
5.5
Antigenspezifität der LZT und der tolerogenen CD11c+ DZ
Die Frage nach der Antigenspezifität ist bedeutsam für die klinische Relevanz der LZT.
Diesbezüglich sollte geklärt werden, ob es sich um einen allergenspezifischen Effekt handelt
oder die Toleranz auch Schutz gegen andere Kontaktallergene bietet und welche Bedeutung
den tolerogenen DZ in diesem Zusammenhang zukommt.
Bereits früh wurde eine Antigenspezifität der LZT durch Experimente mit Oxazolon und
TNCB dokumentiert. In diesem Modell einer Oxazolon-induzierten Niedrigzonentoleranz
konnte nur bei Sensibilisierung mit dem gleichen Allergen die Zunahme der Ohrschwellung
und damit die allergische Entzündung verhindert werden (Steinbrink et al .1996). Die in der
vorliegenden Arbeit gewonnenen Ergebnisse bezüglich einer TNCB- und Oxazoloninduzierten Toleranz sind mit den oben beschriebenen vergleichbar. So konnte eine
Allergenspezifität der TNCB-induzierten LZT bei Sensibilisierung und Auslösung der
65
5 Diskussion
Kontaktdermatitis
mit
Oxazolon
für
TNCB
bestätigt
werden
(siehe
4.1.7).
Überraschenderweise zeigte sich hier zum ersten Mal, dass eine mit DNFB ausgelöste
Kontaktdermatitis durchaus mit einer TNCB-induzierten LZT verhindert werden konnte (siehe
4.1.7). Mögliche Erklärungsansätze sollen nachfolgend diskutiert werden.
Betrachtet man zunächst die an der Induktion der LZT beteiligten Zellarten, so wurde in
dieser Arbeit nicht adressiert, inwiefern die Suppression der Kontaktallergie durch Treg
einem antigenspezifischen Muster folgt. Es konnte jedoch schon dargelegt werden, dass
eine von aktivierten CD25+CD4+ Treg vermittelte, TNCB-induzierte LZT für TNCB und DNFB
antigenunspezifisch wirkt (Luckey et al. 2012). Ob diese Darstellung auch für eine Oxazoloninduzierte Toleranz gilt, ist noch ungeklärt. Dass aktivierte Treg jedoch antigenunspezifisch
funktionieren, konnte auch in verschiedenen Modellen für in vivo Analysen der Treg Funktion
berichtet werden (Übersicht in Sakaguchi et al. 2009).
Im Gegensatz dazu vermitteln CD8+ Suppressor T-Zellen die TNCB-induzierte LZT als eine
antigenspezifische Immunreaktion wie Transferexperimente mit CD8+ T-Zellen und
Allergieprovokation mit TNCB bzw. DNFB demonstrierten (Luckey et al. 2012).
In der vorliegenden Arbeit wurde nun die Antigenspezifität der tolerogenen DZ und die
Frage, ob diese die von Tregs vermittelte, unspezifische Toleranz in Richtung einer
antigenspezifischen Immunsuppression verschieben, adressiert. In Transferexperimenten mit
CD11c+ DZ aus TNCB-tolerisierten Mäusen stellte sich heraus, dass diese in vivo eine
Toleranz gegenüber TNCB und DNFB, nicht jedoch für Oxazolon induzieren (siehe 4.1.8)
und sich somit konform mit der oben dargestellten, allgemeinen Antigenspezifität der LZT
verhalten.
Diesbezüglich gibt es Hinweise darauf, dass auch in der Kontaktallergie zwischen den DNFB
und TNCB Systemen auf der einen Seite und dem Oxazolon System auf der anderen Seite
eine Diskrepanz besteht. So konnte gezeigt werden, dass in IL-4 Knockout-Mäusen die
Auslösung einer Kontakthypersensibilisierung durch TNCB oder DNFB nicht mehr möglich
war, die Tiere jedoch eine normale allergische Reaktion gegen Oxazolon entwickelten (Dieli
et al. 1999; Weigman et al. 1997). Ein ähnliches Bild ergab sich in Experimenten mit IL-1β
Knockout-Mäusen, die keine Entzündungsreaktion gegenüber TNCB, jedoch deutlich
gegenüber Oxazolon bekamen (Shornick et al. 1996). So ist es denkbar, dass aufgrund von
Unterschieden bei der Potenz der Haptene, der Dichte der Haptendeterminanten auf den
APZ und den zellulären Bestandteilen Abweichungen zwischen beiden Systemen bestehen.
Die genauen zugrunde liegenden Mechanismen bleiben noch ungeklärt; die hier
vorliegenden Ergebnisse deuten jedoch auf ähnliche Unterschiede zwischen TNCB/DNFB
und Oxazolon im Modell der LZT hin.
Eine mögliche Kreuzreaktivität der Kontaktallergene TNCB und DNFB aufgrund der
strukturellen Verwandtschaft der TNP- und DNP-Haptene wird hingegen kontrovers
66
5 Diskussion
diskutiert. Bereits früh wurde beschrieben, dass die Auslösung einer Kontaktallergie mit TNP
bzw. DNP in vivo nur haptenspezifisch funktioniert (Fleischmann et al. 1975) und T-ZellRezeptoren auf zytotoxischen T-Zellen hoch selektiv zwischen TNP- und DNP-Molekülen
unterscheiden können (Forman 1977). Diese Ergebnisse bestätigen die hier gewonnenen
Erkenntnisse, dass im murinen Modell der Kontaktallergie keine Kreuzreaktivität zwischen
TNCB und DNFB besteht (siehe 4.1.9). In Experimenten mit TNP-modifizierten Milzzellen
konnten diese eine Toleranz gegenüber TNP- und DNP-Haptenen vermitteln (Cowdery et al.
1982). Wurde jedoch mithilfe von IL-10 eine Toleranz gegen TNCB induziert, so konnte diese
nicht auf DNFB übertragen werden. Die Tiere zeigten weder eine reduzierte Ohrschwellung
in vivo noch konnte in Lymphknotenzellen eine Abnahme der T-Zell-Proliferation nach
Restimulation mit DNBS in vitro erzielt werden (Enk et al. 1994). Im hier verwendeten Modell
der Niedrigzonentoleranz, in dem ebenfalls IL-10 abhängig eine Toleranz induziert wird,
konnte im Gegensatz dazu die TNCB-Toleranz jedoch auf DNFB ausgeweitet werden (siehe
4.1.7 und 4.1.8).
Möglicherweise zeigen die T-Zellrezeptoren der für die LZT verantwortlichen Treg auch eine
höhere Promiskuität als die der Effektorzellen der CHS und induzieren auf diesem Weg eine
kreuzreaktive Toleranz. Weiterer Schritte zur Aufklärung zugrunde liegender Mechanismen
wie die in vitro Analyse der T-Zell-Proliferation nach Kontakt mit antigenpräsentierenden
Zellen sind hierbei notwendig.
Zusammengefasst weisen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit zum ersten Mal
darauf hin, dass auch in den Mechanismen, die zur Induktion der Niedrigzonentoleranz
führen, ein möglicher Unterschied zwischen den Kontaktallergenen TNCB und DNFB auf der
einen Seite und Oxazolon auf der anderen Seite besteht. Es wurde hierbei in vivo eine
eindeutige Kreuztoleranz zwischen TNCB und DNFB nachgewiesen.
5.6
Aktivierung des innaten Immunsystems bei Induktion der LZT
Die Aktivierung des innaten Immunsytems durch eindringende, potentiell immunogene
Antigene ist notwendig für die Induktion der Kontaktallergie. Entscheidend für die
Sensibilisierung ist eine ausreichend hohe Konzentration des Allergens (Grabbe et al. 1996),
um über die Aktivierung von DZ und die Freisetzung proinflammatorischer Zytokine einen
Entzündungsreiz auszulösen (siehe 2.3.1; Watanabe et al. 2007).
In
der
nun
ablaufenden
Signalkaskade,
die
schließlich
zur
Aktivierung
antigenpräsentierender DZ führt, konnte für IL-1β eine zentrale Rolle nachgewiesen werden.
IL-1β-defiziente
Mäuse
entwickelten
eine
deutlich
abgeschwächte
Kontakthypersensibilisierung gegenüber TNCB (Enk et al. 1994; Shornick et al. 1996). Ein
weiterer wichtiger Schritt zur Induktion des innaten Immunsystems ist die Aktivierung des
Inflammasoms (Übersicht in Drenth et al. 2006). So konnten ASC- und NALP3- (beides
67
5 Diskussion
Komponenten des Inflammasoms) defiziente Tiere ebenfalls keine adäquate Immunreaktion
ausbilden (Sutterwala et al. 2006). Zusätzlich werden für die CHS-Induktion eine Aktivierung
von
TLR2
und
TLR4
über
endogene
Liganden
(Martin
et
al.
2008),
reaktive
Sauerstoffspezies und Hyaluronsäure benötigt (Esser et al. 2012). Eine mögliche Option das
angeborene Immunsystem in einem murinen Modell zu aktivieren, ist dabei die epikutane
Applikation des anionischen Tensids SDS (siehe 2.2; Watanabe et al. 2008).
Bei der Induktion der LZT kommen dagegen nur sehr geringe Konzentrationen des
Kontaktallergens TNCB zum Einsatz. So kann vermutet werden, dass die hier verwendete
Dosierung nicht zu einer Aktivierung des innaten Immunsystems über die oben genannten
Mechanismen führt und dieses unter Ausbildung einer Toleranz „umgangen“ wird. In der
Phase der Sensibilisierung überwiegen dann bereits regulatorische Komponenten und es
kann keine CHS ausgelöst werden. Diese Theorie wurde in der vorliegenden Arbeit
adressiert
und
es
konnte
erstmals
gezeigt
werden,
dass
bei
synchroner
Entzündungsreaktion, ausgelöst durch SDS, keine LZT induziert werden kann (siehe 4.1.3).
Vielmehr erlangt die subimmunogene/tolerisierende Allergendosis bei Entzündung der Haut
und damit einhergehender Aktivierung des innaten Immunsystems dann sensibilisierende
Potenz. Dies deutet darauf hin, dass es während der Behandlung mit der LZT nicht zu einer
Aktivierung des innaten Immunsystems kommt und regulatorische Mechanismen unabhängig
davon induziert werden. Unterstützt wird dieses Ergebnis durch die Beobachtung, dass bei
aktiviertem Immunsystem auch das Toleranz auslösende Allergen DNTB sensibilisierend
wirkt (Watanabe et al. 2008). Zusätzlich wurde beobachtet, dass in Abwesenheit
proinflammatorischer Stimuli eine Aktivierung der DZ ausblieb und diese vielmehr einen
tolerogenen Phänotyp mit hoher endozytotischer Aktivität zeigten (Steinman et al. 1998).
5.7
Klinische Relevanz der Ergebnisse
Abschließend soll ein Ausblick darüber gegeben werden, inwiefern die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit und das Modell der Niedrigzonentoleranz allgemein einen Beitrag zur
Weiterentwicklung immuntherapeutischer Behandlungsmethoden leisten. In den Bereichen
der Autoimmunität, der Transplantationsmedizin und der Allergie stellt sich dabei die Frage,
ob eine Toleranz induziert werden kann und diese das Potential bietet, die Immunantwort
deutlich antigenspezifischer zu modulieren als bisher. Aktuelle Behandlungsmethoden
bedürfen momentan meist noch antigenunspezifischer Immunsuppressiva, die eine
Aktivierung des Immunsystems und die Freisetzung inflammatorischer Zytokine komplett
unterdrücken,
dabei
jedoch
Nebenwirkungen generieren.
68
jede
Zelle
des
Körpers
beeinflussen
und
deutliche
5 Diskussion
Die LZT gibt hierbei als experimentelles Mausmodell einen Vorgang wieder, der sich in
gesunden
Individuen
andauernd
abspielt.
So
führt
der
wiederholte
Kontakt
mit
subimmunogenen Konzentrationen potentiell durchaus immunogener Substanzen zur
Entwicklung einer Toleranz gegenüber dem jeweiligen Allergen. Um dieses Phänomen bei
Patienten im Sinne einer gezielten „Tolerisierung“ gegen bestimmt Allergene einsetzen zu
können, ist die Analyse der zugrunde liegenden Physiologie unerlässlich.
Prinzipiell könnten verschiedene Zellpopulationen eine Grundlage für diesen Ansatz liefern.
Beispielsweise könnte T-Zell-basiert eine ex vivo Expansion regulatorischer T-Zellen oder
antigenspezifischer CD8+ Suppressor T-Zellen des Patienten durchgeführt und die Zellen in
Zusammenhang mit dem Allergen zurück infundiert werden. Dieser Idee folgen auch
Untersuchungen
in
allogenen
Transplantationsmodellen
und
in
Modellen
zu
Autoimmunerkrankungen (Sakaguchi et al. 2010; Fan et al. 2011; Lombardi et al. 2011).
Mindestens ebenso vielversprechend sind Ansätze, in denen das tolerogene Potential
dendritischer Zellen für die Induktion einer Toleranz therapeutisch genutzt werden soll.
Deshalb haben auch Untersuchungen zur Rolle der tolerogenen DZ in der LZT und deren
Antigenspezifität eine große klinische Relevanz. In experimentellen Tiermodellen konnten
transferierte tolerogene DZ bereits die Manifestation eines Typ I Diabetes mellitus verhindern
(Marin-Gallen et al. 2010) und auch eine Abstoßungsreaktion nach Allotransplantation
konnte mit DZ-induzierten Treg blockiert werden (Sela et al. 2011). Nur in wenigen
Bereichen ist es bereits möglich, antigenspezifische tolerogene DZ zur Behandlung
autoimmuner Erkrankungen, z.B. in Patienten mit Typ 1 Diabetes mellitus (Giannoukakis et
al. 2011) im Menschen einzusetzen. Weitere Möglichkeiten regulierend auf Immunantworten
einzuwirken, eröffnet z.B. das Modell der UV-induzierten Toleranz, das mittels einer
physikalischen Modulation in vivo die Ausbildung einer Allergie verhindert (Schwarz et al.
2011). Zusätzlich könnte auch die klassische Vakzinierung mit Adjuvantien durchgeführt
werden (Pulendran et al. 2006).
Die vorliegende Arbeit vermag im Kontext mit anderen Studien zum Modell der LZT hierbei
einen Beitrag zum Verständnis der Grundlagen vermitteln. Neben einer Fortführung der
Untersuchungen zu den zellulären und molekularen Mechanismen der LZT, ist jedoch die
Ausweitung der Analysen hin zu klinisch relevanten Kontaktallergenen und therapeutischen
Ansätzen erforderlich.
69
6 Abbildungsverzeichnis
6
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Pathophysiologie des allergischen Kontaktekzems
Abb. 2: Pathophysiologisches Schema der LZT
Abb. 3: BAC-Konstrukt der DEREG-Maus
Abb. 4: Standard-Protokoll der LZT (Zeitstrahl)
Abb. 5: LZT Transfer mit tolerogenen CD11c+ DZ
Abb. 6: LZT Transfer mit CD8α+ T-Zellen
Abb. 7: LZT bei Aktivierung des innaten Immunsytems mit SDS
Abb. 8: LZT bei Aktivierung des innaten Immunsytems mit SDS und dem Lösungsmittel DMF
Abb. 9: LZT Transfer mit CD11c+ DZ bei Depletion der Foxp3+ Tregs
Abb. 10: Zellkontakt zwischen tolerogenen CD11c+ DZ und Tregs
Abb. 11: Transfer der LZT mit tolerogenen CD11c+ DZ in Treg-depletierte Tiere
Abb. 12: Untersuchungen zur Allergenspezifität der LZT
Abb. 13: Untersuchungen zur Allergenspezifität der Toleranz übertragenden CD11c+ DZ
Abb. 14: Untersuchungen zur Kreuzreaktivität zwischen TNCB, DNFB und Oxazolon in vivo
70
7 Literaturverzeichnis
7
Literaturverzeichnis
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84
8 Abkürzungsverzeichnis
8
Abkürzungsverzeichnis
ACD
"Allergic contact dermatitis"
AD
"Assay diluent"
AICD
"Activation-induced cell death"
AK
Antikörper
AOO
Azeton-Olivenöl
APC
Allophycocyanin
APZ
Antigenpräsentierende Zelle
ATP
Adenosintriphospat
BAC
"Bacterial artificial chromosome"
BE
Blutentnahme
bp
Basenpaare
CCR
C-Chemokinrezeptor
CD
"Cluster of differentiation"
cDZ
konventionelle Dendritische Zelle
CHS
"Contact hypersensibility"
CTLA-4
"Cytotoxic T lymphocyte antigen" (CD152)
Da
Dalton
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNFB
Dinitrofluorobenzene
DT
Diphtherietoxin
DTR
Diphtherietoxinrezeptor
DZ
Dendritische Zelle
EAE
Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
eGFP
"enhanced green fluorescent protein"
ELISA
"Enzyme linked immunosorbent assay"
FACS
"Fluorescence activated cell sorting”
gemeint ist Durchflusszytometrie als allgemeine Methode
FasL
Fas Ligand (CD95L)
FCS
"Fetal calf serum"
FITC
Fluorescein
Foxp3
"Forkhead box protein 3"
FSC
"Forward scatter"
GFP
"Green fluorescent protein"
HBSS
"Hank`s balanced salt solution"
85
8 Abkürzungsverzeichnis
i.p.
intraperitoneal
i.v.
intravenös
ICAM-1
"Inter cellular adhesion molecule 1" (CD54)
ICD
"Irritant contact dermatitis"
ICOS
"Inducible co-stimulator"
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
INF-γ
Interferon-γ
IPEX
"Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked"
iTreg
induzierbare regulatorische T-Zelle
LK
Lymphknoten
LPS
Lipopolysaccharide
LZT
"Low zone tolerance" (Niedrigzonentoleranz)
MACS
"Magnetic cell separation"
mDZ
migratorische Dendritische Zelle
MEST
"Mouse ear swelling test"
MHC
"Major histocompatibility complex"
N-FAT
"nuclear factor of activated T-cells"
NEAA
"Non essential amino acids"
nIEL
CD8α intestinale intraepitheliale Lymphozyten
NK Zelle
Natürliche Killerzelle
NKT Zelle Natürliche Killer T-Zelle
NLR
"NOD-like receptor"
nTreg
natürlich vorkommende regulatorische T-Zelle
PAMP
"Pathogen associated molecular patterns"
PBS
"Phosphate buffered saline"
PD-1
"Programmed death 1"
PD-L1
"Programmed death-ligand 1" (CD274, B7-H1)
pDZ
plasmazytoide Dendritische Zelle
PE
Phycoerythrin
PerCP
Peridin chlorophyll protein
PRR
"Pattern recognition receptors"
RANK-L
"Receptor activator of NF-κB ligand"
RNA
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
s.c.
subkutan
SSC
"Side scatter"
86
8 Abkürzungsverzeichnis
TGF-β
"Transforming growth factor β"
TH Zelle
T-Helferzelle
TLR
"Toll-like receptor"
TNBC
2-4-6-Trinitro-1-Chlorbenzol
TNBS
2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
TNF-α
Tumornekrosefaktor α
Treg
regulatorische T-Zelle
TZM
T-Zellmedium
TZR
T-Zellrezeptor
UVB
Ultraviolettstrahlung im Wellenlängenbereich von 215-280 nm
wt
Wildtyp
87
9 Publikationen und Kongressbeiträge
9
9.1
Publikationen und Kongressbeiträge
Originalarbeiten
Luckey, U., Schmidt, T., Pfender, N., Romer, M., Lorenz, N., Martin, S.F., Bopp, T., Schmitt,
E., Nikolaev, A., Yogev, N., Waisman, A., Jakob, T. and Steinbrink, K. (2012).
Crosstalk of regulatory T cells and tolerogenic dendritic cells prevents contact allergy
in subjects with low zone tolerance. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 781-797.
9.2
Abstracts mit Vortrag
Romer, M., Schmitd, T., Luckey, U., Pfender, N., Lorenz, N., Martin, S., Bopp, T., Schmitt,
E., Nikolaev, A., Yogev, N., Waisman, A., Steinbrink, K. and Jakob,T. (2012). Cross
talk of Tregs and tolerogenic CD11c+ dendritic cells in low zone tolerance. 7.
Deutscher Allergiekongress der DGAKI, München.
9.3
Abstracts mit Posterpräsentation
Romer, M., Schmitd, T., Luckey, U., Pfender, N., Lorenz, N., Martin, S., Bopp, T., Schmitt,
E., Nikolaev, A., Yogev, N., Waisman, A., Steinbrink, K. and Jakob,T. (2012). Cross
talk of Tregs and tolerogenic CD11c+ dendritic cells in low zone tolerance. 7.
Deutscher Allergiekongress der DGAKI, München.
88
10 Lebenslauf
10 Lebenslauf
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89
10 Lebenslauf
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90
11 Danksagung
11 Danksagung
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