08 - Enzymkinetik - Ruhr

53
GRUNDLAGEN DER ENZYMKINETIK:
MICHAELIS-MENTEN-GLEICHUNG, HEMMTYPEN
BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN
Die katalytischen Eigenschaften eines Enzyms können durch verschiedene Faktoren
beeinflusst werden. Dazu gehören vor allem Temperatur, pH-Wert und Ionenstärke des
Reaktionsmilieus. Die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion ist in bestimmten
Grenzen auch von der Konzentration des Substrates [S] abhängig. In der Regel nimmt die
Reaktionsgeschwindigkeit mit steigender Substratkonzentration zu, bis bei hohen Konzentrationen ein Sättigungswert (Maximalgeschwindigkeit Vmax) erreicht wird. Das Erreichen dieser
Maximalgeschwindigkeit ist ein wesentliches Charakteristikum enzymatisch katalysierter
Reaktionen. Im einfachsten Fall, in dem nur ein Substrat umgesetzt wird, lässt sich die
Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substratkonzentration mit Hilfe der von
Michaelis und Menten angegebenen Gleichung beschreiben:
v
0

d[S]
dt

V
K
S 
 S 
max
m
Dabei bedeutet:
[S]:
Substratkonzentration bei Beginn der Reaktion
V0:
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion bei der entsprechenden Substratkonzentration [S]
t:
Zeit
Vmax:
Maximalgeschwindigkeit der Reaktion, die bei Substratsättigung erreicht wird
Beachte: Vmax ist proportional zur gesamten Enzymkonzentration [E]0: Vmax ~ [E]0
Km:
Michaelis-Konstante; bei dieser Substratkonzentration läuft die Reaktion mit
halbmaximaler Geschwindigkeit ab. Oft ist die Michaelis-Konstante ein Maß für
die Affinität des Enzyms zum Substrat.
Die Ermittlung der Michaelis-Konstante hat eine große praktische Bedeutung für die Beurteilung eines Enzyms und der Wirkungsweise von Enzyminhibitoren.
54
Die Bestimmung der Maximalgeschwindigkeit spielt im klinisch-chemischen Labor eine große
Rolle. Da die Maximalgeschwindigkeit Vmax proportional zur Enzymkonzentration ist, lässt
sich aus der Maximalgeschwindigkeit die Enzymkonzentration (z.B. im Blut) ermitteln.
Die Michaelis-Konstante lässt sich graphisch ermitteln, wenn man die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion bei verschiedenen Substratkonzentrationen unter sonst identischen Bedingungen misst und die Werte V0 gegen [S] aufträgt (Auftragung nach Michaelis und Menten).
Dabei
ergibt
sich
eine
Hyperbel,
die
bei
hohen
Substratkonzentrationen
der
Maximalgeschwindigkeit Vmax zustrebt. Im Bereich hoher Substratkonzentrationen ist also die
Reaktionsgeschwindigkeit praktisch unabhängig von der Substratkonzentration, im Bereich
niedriger Substratkonzentrationen ist V0 dagegen stark von der Substratkonzentration
abhängig. Aus der Kurve lässt sich die halbmaximale Geschwindigkeit und die zugehörige
Substratkonzentration, die der Michaelis-Konstante des Enzyms entspricht, ablesen.
S   K m
V
wenn v
0

max
2
Diese Methode zur Bestimmung der Michaelis-Konstante ist jedoch verhältnismäßig
ungenau, da sich Vmax in den wenigsten Fällen eindeutig festlegen lässt. Die graphische
Bestimmung wird wesentlich vereinfacht durch eine Auftragung nach Lineweaver und Burk,
der eine einfache Umformung der Michaelis-Menten-Gleichung zugrunde liegt:
K
1
1
m


v
V
 S  V
0
max
max
Bei einer Auftragung von 1/V0 gegen 1/[S] erhält man eine Gerade, die die Y-Achse im Punkt
1/Vmax und die X-Achse im Punkt -1/Km schneidet. Aus diesen Schnittpunkten lassen sich
sowohl die Maximalgeschwindigkeit als auch die Michaelis-Konstante bestimmen.
Im normalen Stoffwechsel spielt die Hemmung enzymatischer Reaktionen - ebenso wie die
Aktivierung - eine bedeutende Rolle bei der Regulation von metabolischen Prozessen.
Daneben lassen sich in vielen Fällen Vergiftungserscheinungen oder auch die Wirkung
bestimmter
Pharmaka
auf
eine
Hemmung
spezifischer
enzymatischer
Reaktionen
zurückführen. Grundsätzlich unterscheidet man bei der Hemmung von Enzymen zwischen
irreversibler und reversibler Hemmung. Im Gegensatz zur irreversiblen Hemmung kann bei
der reversiblen Hemmung der Inhibitor vom Enzym dissoziieren (z.B. durch Verdünnen).
55
REVERSIBLE HEMMTYPEN
Man unterscheidet drei Hemmtypen: kompetitive Hemmung, nichtkompetitive Hemmung und
unkompetitive Hemmung.
Bei der kompetitiven Hemmung wird der Inhibitor reversibel am aktiven Zentrum des Enzyms gebunden und verhindert so die Bindung des Substrats. Durch erhöhte Substratkonzentrationen kann der Inhibitor jedoch verdrängt werden, so dass bei sehr hohen Substratkonzentrationen die Maximalgeschwindigkeit der enzymatischen Reaktion erreicht werden
kann. Die scheinbare Michaelis-Konstante des Enzyms nimmt dagegen in Anwesenheit des
kompetitiven Inhibitors zu. Die Auftragung der Kehrwerte der Geschwindigkeit (1/V0) gegen
die Kehrwerte der Substratkonzentration (1/[S]) nach Lineweaver und Burk ergibt eine
Gerade, die die Gerade der ungehemmten Reaktion auf der Y-Achse im Punkt 1/Vmax
schneidet. Aus dem Schnittpunkt mit der X-Achse lässt sich die scheinbare (oder auch
apparente) Michaelis-Konstante (Km
app)
der gehemmten Reaktion errechnen, die mit der
Inhibitor-Konstante Ki über folgende Formel verknüpft ist:
K

m

app   1 

I  
K m
Ki 
Dabei ist [I] die molare Konzentration des Inhibitors. Die Inhibitor-Konstante Ki ist ein Maß für
die Affinität zwischen Enzym und Inhibitor. Sie gibt diejenige Konzentration des Inhibitors an,
bei der die apparente Michaelis-Konstante der gehemmten Reaktion gerade doppelt so groß
ist wie die Michaelis-Konstante der ungehemmten Reaktion.
Bei der nichtkompetitiven Hemmung wird der Inhibitor nicht am aktiven Zentrum, sondern
an einer anderen Stelle des Enzymproteins gebunden. Dadurch wird die Aktivität des
Enzyms herabgesetzt oder vollständig unterdrückt. Da in diesem Fall der Inhibitor nicht durch
das Substrat vom Enzym verdrängt werden kann, wird selbst bei sehr hohen
Substratkonzentrationen die Maximalgeschwindigkeit des Enzyms nicht erreicht. Für den
speziellen Fall, dass die Michaelis-Konstante für das Substrat unverändert bleibt, ergibt sich
bei der Kehrwertauftragung nach Lineweaver und Burk bei der nichtkompetitiven Hemmung
eine Gerade, welche die X-Achse im gleichen Punkt schneidet wie die Gerade der
ungehemmten Reaktion. Die Maximalgeschwindigkeit der gehemmten Reaktion lässt sich
aus dem Schnittpunkt mit der Y-Achse bestimmen. Die Dissoziationskonstante des EnzymInhibitor-Komplexes (Ki) berechnet man mit Hilfe der folgenden Formel:
V
V
app

max
1
I 
Ki
56
Hierbei ist Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Maximalgeschwindigkeit, [I] die
molare Konzentration des Inhibitors und Vmax die Maximalgeschwindigkeit der ungehemmten
Reaktion. Ki entspricht der Inhibitorkonzentration, bei der die Maximalgeschwindigkeit der
gehemmten Reaktion gerade halb so groß ist wie die Maximalgeschwindigkeit der nicht
gehemmten Reaktion.
Wird der Inhibitor nur von dem Enzym-Substrat-Komplex und nicht vom freien Enzym gebunden, handelt es sich um eine unkompetitive Hemmung. Bei diesem Hemmtyp wird der
Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex nicht oder nur verlangsamt zum Enzym-Produkt-Komplex
umgesetzt. In der Auftragung nach Lineweaver und Burk ergibt eine enzymatische Reaktion
in Gegenwart eines unkompetitiven Inhibitors eine Gerade, die parallel zur Geraden für die
ungehemmte Reaktion verläuft. Die Inhibitorkonstante lässt sich nach folgenden Formeln
ermitteln:
V
V
app

max
1
I 
K
oder
K
m
app 
i
K
1
m
I 
K
i
wobei Km app bzw. Vapp die in Anwesenheit des Inhibitors erhaltene Michaelis-Konstante und
Maximalgeschwindigkeit, [I] die molare Konzentration des Inhibitors und Km und Vmax die
entsprechenden Konstanten der ungehemmten Reaktion sind. Ein unkompetitiver Inhibitor
reduziert in gleichem Maße sowohl Vmax als auch Km einer enzymatischen Reaktion.
Häufig wird auch das Auftreten von gemischten Hemmtypen beobachtet, die sich nicht eindeutig einer dieser drei Grundarten zuordnen lassen.
ALLGEMEINE FRAGESTELLUNGEN
Enzyme als Biokatalysatoren;
Substratspezifität, Klassifizierung der Enzyme;
Grundlagen der Messung einer Reaktionsgeschwindigkeit im optischen Test;
Michaelis-Menten-Gleichung;
Mechanismen der Hemmung von Enzymen;
Interpretation von Km, Vmax, Ki;
Medizinische Bedeutung der Enzyme.
57
58
ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE
1.
Bestimmung der Michaelis-Konstante der Lactatdehydrogenase aus
Kaninchen-Skelettmuskeln
Die Lactatdehydrogenase (L-Lactat: NAD Oxidoreductase, EC 1.1.1.27) (LDH) katalysiert
den letzten Schritt der anaeroben Glykolyse
LDH
CH3-CHOH-COO + NAD+
L (+) Lactat

CH3-CO-COO + NADH + H+
Pyruvat
Das Gleichgewicht dieser Reaktion liegt auf der Seite der Lactatproduktion.
Die Gleichgewichtskonstante K(25°C) =
 Pyruvat  NADH H  

 2 ,7  10 12

 Lactat NAD 
Unter den Reaktionsbedingungen in diesem Versuch liegt das gesamte Enzym in Form eines
LDH-NADH Komplexes vor. Die Michaelis-Konstante Km für Pyruvat beschreibt in diesem
Falle die Wechselwirkung zwischen Pyruvat und dem LDH-NADH Komplex.
Die Reaktionsgeschwindigkeit wird mit dem photometrischen Test nach Otto Warburg
gemessen, wobei der Unterschied im Absorptionsmaximum von NAD+ und NADH
ausgenutzt wird.
Nikotinamid-Adenin-Dinukleotide (NAD) sind als Coenzyme von Dehydrogenasen in der
Übertragung von Reduktionsequivalenten beteiligt. Dabei geht die oxidierte Form, NAD+, in
die reduzierte Form, NADH, über:
RH2 + NAD+
R + NADH + H+
59
Bei der Dehydrogenierung wird ein H-Hydridion (1 Proton + 2 Elektronen) auf die C4-Position
des Pyridinringes übertragen. Der zweite Substratwasserstoff wird als Proton H+ freigesetzt.
Dieser Prozess ist schematisch am Beispiel der LDH-Reaktion dargestellt:
NADH besitzt neben dem Absorptionsmaximum bei 260 nm ein zusätzliches Maximum bei
340 nm, das der oxidierten Form, dem NAD+, fehlt.
In der Praxis wird die Messung statt bei 340 nm oft bei 366 nm durchgeführt, da
Wolframdraht-Glühlampen in diesem Bereich benutzt werden können.
60
Der Extinktionskoeffizient  für NADH beträgt in Abhängigkeit von der Wellenlänge:
340 = 6,2 · 103
(ℓ · mol-1 · cm-1)
366 = 3,3 · 103
(ℓ · mol-1 · cm-1)
(Bei Verwendung von  zur Berechnung ist neben der verwendeten Wellenlänge die Dimension von  unbedingt zu berücksichtigen.)
HEMMUNG DER LACTATDEHYDROGENASE DURCH OXAMAT
In diesem Versuch wird die Hemmung des Lactatdehydrogenase-NADH – Komplexes durch
Oxamat untersucht. Substrat ist dabei Pyruvat.
Man kann aber auch NADH als Substrat der Lactatdehydrogenase betrachten. Entsprechend
könnte auch die Hemmung des Umsatzes von NADH durch Oxamat untersucht werden. Aus
rein praktischen Gründen ist dieses Experiment mit den im Praktikum zur Verfügung
stehenden Mitteln nicht möglich: Wegen der hohen Affinität von NADH, also dem niedrigen
Km-Wert für die Bindung von NADH an Lactatdehydrogenase, müssten die Messungen bei
NADH-Konzentrationen durchgeführt werden, die so niedrig sind, dass ein photometrische
Bestimmung nicht möglich ist. Bei geeigneter Versuchsanordnung (Messung der NADHKonzentrationen durch Fluoreszenz) würde sich herausstellen, dass Oxamat nur an den
Lactatdehydrogenase–NADH–Komplex, aber nicht an die Lactatdehydrogenase bindet.
Oxamat (Halbamid der Oxalsäure)
Fragen:
Vergleichen Sie die Struktur des Inhibitors Oxamat mit der Struktur der Substrate Pyruvat
und NADH
Welchen Hemmtyp erwarten Sie für die Hemmung der Lactatdehydrogenase durch Oxamat
a) bezüglich Pyruvat?
b) bezüglich NADH?
61
VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL
Mitbringliste: 30cm langes Lineal, Taschenrechner, Kittel
Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der LDH-Reaktion in Abhängigkeit von der
Pyruvat-Konzentration
1.
In Abwesenheit von Oxamat:
Pipettierplan A
Küvette Nr.
ml Na-Phosphat-Puffer
(Glaskolben)
(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)
ml NADH
(gelbes Eppendorf-Gefäß)
(5 mmol/ℓ)
ml Na-Pyruvat
(blaues Eppendorf-Gefäß)
(10 mmol/ℓ)
ml H2O
1
2
3
4
5
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
0,15
0,15
0,15
0,15
0,15
0,02
0,05
0,10
0,20
0,40
0,81
0,78
0,73
0,63
0,43
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
START der Reaktion
ml LDH*
(rotes Eppendorf-Gefäß)
Die Messung erfolgt gegen eine mit 3ml Wasser gefüllte Küvette.
Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm
verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec
wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer
herausgenommen. Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der
Küvetteninhalt wird sofort mit Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der
Küvette gemischt. Nach Entfernen des Parafilms wird die Küvette in das Photometer
eingesetzt. Für einen Zeitraum von 2 min wird in Abständen von 15 sec die Extinktion
abgelesen.
62
2.
In Anwesenheit von Oxamat:
Pipettierplan B
Küvette Nr.
ml Na-Phosphat-Puffer
(Glaskolben)
(0,1 mol/ℓ, pH 7.4)
ml NADH
(gelbes Eppendorf-Gefäß)
(5 mmol/ℓ)
ml Na-Pyruvat
(blaues Eppendorf-Gefäß)
(10 mmol/ℓ)
ml Oxamat
(grünes Eppendorf-Gefäß)
(1 mmol/ℓ)
ml H2O
6
7
8
9
10
2,00
2,00
2,00
2,00
2,00
0,15
0,15
0,15
0,15
0,15
0,02
0,05
0,10
0,20
0,40
0,24
0,24
0,24
0,24
0,24
0,57
0,54
0,49
0,39
0,19
0,02
0,02
0,02
0,02
0,02
START der Reaktion
ml LDH*
(rotes Eppendorf-Gefäß)
Der Küvetteninhalt wird durch dreimaliges Umdrehen der Küvette (bitte vorher mit Parafilm
verschließen) gründlich gemischt und die Anfangsextinktion (E0) gemessen. Nach 30 sec
wird überprüft, ob E0 unverändert bleibt. Die Küvette wird aus dem Photometer
herausgenommen. Das Enzym (jeweils 0,02 ml) wird in die Küvette pipettiert. Der
Küvetteninhalt wird sofort mit Parafilm verschlossen und durch dreimaliges Wenden der
Küvette gemischt. Nach Entfernen des Parafilms wird die Küvette in das Photometer
eingesetzt. Für einen Zeitraum von 2 min wird in Abständen von 15 sec die Extinktion
abgelesen.
63
Messergebnisse zu Pipettierplan A
Zeit
Küvette
1
2
3
4
5
Vor Zugabe von LDH
0
30“
Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)
15“
30“
45“
1’
1’15“
1’30“
1’45“
2'
Messergebnisse zu Pipettierplan B
Zeit
Küvette
6
7
8
9
Vor Zugabe von LDH
0
30“
Start durch Zugabe von LDH (0,02 ml/Küvette; mischen)
15“
30“
45“
1’
1’15“
1’30“
1’45“
2'
10
64
AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION
Die Anfangsgeschwindigkeiten (NADH Verbrauch pro Zeiteinheit) werden mit Hilfe des
Lambert-Beer Gesetzes errechnet:
E =  · c · d
E =
ermittelte Extinktionsänderung

=
molarer Extinktionskoeffizient von NADH bei 366 nm = 3,3·103 l · mol-1· cm-1
d
= Schichtdicke, 1 cm
c = Änderung der NADH-Konzentration
Für die mit Hilfe des Steigungsdreiecks für ein Zeitintervall von t min ermittelte
Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion, v0, ergibt sich dann:
v 
0
c
t

E
  d  t

E
  mol    1  min - 1 
3,3  103  t 

Für t = 1 min folgt daraus:
v
0

 E  0 , 30  µmol  ml 1  min 1

65
Aufgaben:
1.
Stellen Sie die Zeitverläufe der Extinktion der Versuche 3 und 8 jeweils in einem
Graphen dar.
2.
Bestimmen Sie Extinktionsabnahme pro min ab dem Messpunkt 15sec.
3.
Stellen Sie die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeiten von den Substratkonzentrationen in An- und Abwesenheit des Inhibitors jeweils in einem Graphen nach
Michaelis-Menten
(Anfangsgeschwindigkeit
gegen
Substratkonzentration)
und
Lineweaver-Burk (1/Anfangsgeschwindigkeit gegen 1/Substratkonzentration) dar.
Bestimmung der Substratkonzentrationen [S] (Pyruvatkonzentrationen):
Die Konzentration der Na-Pyruvat-Lösung beträgt 10 mmol/ℓ (siehe Pipettierplan A und B).
Diese Na-Pyruvat-Lösung wird durch das Pipettieren um folgenden Faktor verdünnt:
𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 − 𝐿ö𝑠𝑢𝑛𝑔
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑠 𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑒𝑛 𝐾ü𝑣𝑒𝑡𝑡𝑒𝑛𝑖𝑛ℎ𝑎𝑙𝑡𝑒𝑠 (= 3 𝑚𝑙)
Folglich beträgt die Konzentration [S] der Na-Pyruvat-Lösung in den einzelnen Küvetten:
[𝑆] = 𝐾𝑜𝑛𝑧𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝑁𝑎 − 𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 − 𝐿ö𝑠𝑢𝑛𝑔
= 10 𝑚𝑚𝑜𝑙/ℓ ∙
𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 − 𝐿ö𝑠𝑢𝑛𝑔
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑑𝑒𝑠 𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡𝑒𝑛 𝐾ü𝑣𝑒𝑡𝑡𝑒𝑛𝑖𝑛ℎ𝑎𝑙𝑡𝑒𝑠
𝑃𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡 − 𝐿ö𝑠𝑢𝑛𝑔 (𝑚𝑙)
3 𝑚𝑙
4.
Ermitteln Sie für die ungehemmte und die gehemmte Reaktion jeweils Vmax, Km und Km app
5.
Welcher Typ der Enzymhemmung durch Oxamat liegt vor?
6.
Berechnen Sie mit Hilfe der im Text für den jeweiligen Hemmtyp angegebenen
Formel die Inhibitor-Konstante, Ki.
66
Tabelle
Küvette
Nr.
Extinktionsabnahme
pro Minute
Anfangsgeschwindigkeit
30“ – 1‘30“
v
0

E
min
1
v0
 0 , 30 *
Substratkon
-zentration
[S]
(in der
Küvette)
1
[S]
E
min
µmol
ml  min
ml  min
µmol
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
* siehe Berechnung
mmol/ 

mmol
67
BERECHNUNGEN
68
HÄUFIGSTE FEHLER BEIM EXPERIMENT UND SEINER AUSWERTUNG
1.
Experiment
-
Photometer nicht gemäß der Anleitung am Arbeitsplatz eingestellt
-
Mangelhafte Pipettierung (Merke: Pipettenspitze soll bei Entnahme aus dem Vorrat
und beim Pipettieren in die Küvette schräg aufstehen. Pipetten senkrecht halten,
Küvetten schräg!
-
Durchmischung des Küvetteninhalts vergessen
-
Ungenaue Ablesung vom Photometer (zu früh oder zu spät)
2.
Auswertung
-
Messpunkte nicht vollständig, unklar oder falsch eingetragen
-
Dimension nicht angegeben, Koordinatenbezeichnung in Abbildungen ungenügend.
69
SCHLUSSFOLGERUNGEN