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Aus dem Tierärztlichen Institut der Universität Göttingen und aus der Abteilung Tiermedizin und Primatenhaltung des Deutschen Primatenzentrums Göttingen Zum Vorkommen von Helicobacter spp. bei Hauskatzen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines DOCTOR MEDICINAE VETERINARIAE durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Uta Brandenburg aus Oldenburg Hannover 2000 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. E. Scupin Apl.-Prof. Dr. F.-J. Kaup 1. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. F.-J. Kaup 2. Gutachter: Prof. Dr. S. Wagner Tag der mündlichen Prüfung: 28.11.2000 Meiner Mutter Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Glossar 1 Einleitung 11 2 Literaturübersicht 13 2.1 2.2 2.2.1 2.2.2 2.2.3 Geschichtlicher Überblick und Taxonomie Eigenschaften verschiedener Helicobacter-Arten Morphologie, kulturelle und biochemische Eigenschaften von H. pylori Eigenschaften von H. felis und H. heilmannii Virulenzfaktoren und Pathogenese der H. pylori Infektion beim Menschen 2.2.3.1 Zellschädigungen durch H. pylori 2.2.4 H. heilmannii-Gastritis beim Menschen 2.3 Gastritisklassifikation und Graduierung 2.4 Helicobacter-Spezies bei verschiedenen Tierarten 2.5 Epidemiologie 2.6 Diagnostik einer Helicobacter-Infektion beim Tier 2.7 Therapiemöglichkeiten 2.8 Tiermodelle für die H. pylori- Infektion 19 22 25 25 26 30 32 34 35 3 Eigene Untersuchungen 37 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 Material und Methode Untersuchungsmaterial Bakteriologisch-kulturelle Untersuchung auf H. pylori Molekularbiologische Untersuchung auf H. pylori, H. felis und H. heilmannii Isolierung genomischer DNA aus Gewebeproben Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Agarosegelelektrophorese Hochauflösende Gelelektrophorese zum Nachweis von H. pylori Histologische Untersuchungen Anfertigung von Gewebeschnitten für die Histologie und Immunhistologie Immunhistologische Reaktionen 37 37 41 3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.3.3 3.1.3.4 3.1.4 3.1.4.1 3.1.4.2 13 16 16 18 42 42 43 44 45 48 48 49 3.1.4.3 Auswertung und Dokumentation der durchgeführten histologischen Reaktionen 3.1.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung 51 52 4 Ergebnisse 54 4.1 4.2 4.3 4.3.1 54 54 55 4.4 4.4.1 4.4.2 4.5 Auswertung des Vorberichtes und der pathologischen Untersuchung Bakteriologisch-kulturelle Untersuchung auf H. pylori Molekularbiologische Untersuchungen PCR und Agarosegelelektrophorese zum Nachweis der DNA von H. pylori, H. felis und H. heilmannii PCR und Polyacrylamidgelelektrophorese zum Nachweis von H. pylori Histologische Ergebnisse Pathohistologische Diagnosen Immunhistologische Reaktionen Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen 57 57 57 58 60 5 Diskussion 66 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.3 5.4 Probenmaterial Methodik Mikrobiologisch-kultureller Nachweis Molekularbiologische Untersuchung Histologische und ultrastrukturelle Untersuchung Ergebnisse Therapie 66 67 68 68 70 72 75 6 Zusammenfassung 76 7 Summary 78 8 Literaturverzeichnis 80 4.3.2 55 9 Anhang 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 Nährböden Testreagenzien Gram-Färbung der Objektträger (BÖCK, 1989) Enzyme, Nukleinsäuren und Nukleotide Protokolle für die Histologie und Elektronenmikroskopie Lösungen für die Immunhistochemie (IHC) 98 98 99 100 101 101 105 Abkürzungsverzeichnis Abb. APS Aqua dest. bp brit. Kurzh. BSA cagA DAB DNA EDTA EKH ELISA f. FIP FIV FLUTD ggr. GHLO H. h. H.-E. hgr. H. heilm. IFN γ IgG IHC Il 1 J. Kb KBE mgr. min. ml mm Mon. Nr. mM µm ng p. PBS PCR pmol PPI rRNA Abbildung Ammoniumperoxodisulfat destilliertes Wasser Basenpaar Britisch Kurzhaar Bovines Serumalbumin cytotoxin associated gene A (cagA-Gen) Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid Desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) Ethylendiamintetraessigsäure Europäisch Kurzhaar Enzyme linked immunosorbent-assay felis Feline infektiöse Peritonitis Felines Immunschwächevirus Feline lower urinary tract disease geringgradig gastric Helicobacter-like organisms Helicobacter heilmannii Hämalaun-Eosin hochgradig Helicobacter heilmannii Interferon γ Immunglobulin G Immunhistochemie Interleukin 1 Jahre Kilobasen Koloniebildende Einheiten mittelgradig Minuten Milliliter Millimeter Monate Nummer millimolar Mikrometer Nanogramm pylori Phosphate buffered saline Polymerase Kettenreaktion (PCR) Pikomol Protonenpumpeninhibitor ribosomale Ribonukleinsäure SABC SDS sek. sp. SPF spp. Tab. TBE TE TEM TNF α Todesurs. Tris vacA Vergr. Wo. WS Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex Sodium dodecyl sulfate (Natriumdodecylsulfat) Sekunden species (Singular) Spezifisch pathogen frei species (Plural) Tabelle Tris-Borat-EDTA-Puffer Tris-EDTA-Puffer Transmissionselektronenmikroskopie Tumornekrosefaktor α Todesursache Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan vacuolating cytotoxin gene A (vacA-Gen) Vergrößerung Wochen Wirbelsäule Glossar Das Prinzip der Polymerase Kettenreaktion (PCR) basiert auf der Denaturierung eines doppelsträngigen DNA-Abschnittes (templates), an welches sich am 5´- und 3´-Ende des zu amplifizierenden Bereiches spezifische Oligonukleotide (Primer) anlagern (annealing). Diese Primer werden von einer Polymerase in Anwesenheit freier Desoxynukleosid-Triphosphate (dNTP`s) verlängert (elongiert). Die DNA-Polymerase elongiert den entstehenden DNADoppelstrang solange, bis sie von der DNA abfällt oder die Reaktion unterbrochen wird. Die neu entstandenen Doppelstränge werden durch Erhitzen erneut in Einzelstränge zerlegt, die wiederum als Matritzen für die Synthese neuer Doppelstränge dient. Bei der ständigen Wiederholung der Reaktionsfolge aus Denaturierung, Annealing und Polymerasereaktion kommt es zu einer exponentiellen Vermehrungsrate der DNA (Amplifikation). Bei der Gelelektrophorese wird das unterschiedliche Wanderungsverhalten geladener Moleküle im elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt. Es werden i. d. R. Gele aus Agarose oder Polyacrylamid eingesetzt. Nukleinsäuren sind aufgrund ihres PhosphatRückgrats bei allen pH-Werten negativ geladen. So wandern sie immer zur Anode, und zwar je größer sie sind, um so langsamer. Bei der 1 Kb-Leiter handelt es sich um einen Marker, der parallel zu den Proben in die Geltaschen einpipettiert wird, um dann nach Abschluß der Elektrophorese die Basenpaarlänge der amplifizierten und markierten DNA-Abschnitte aufzuzeigen. Das Dimidiumbromid gehört zu den sequenzunspezifisch DNA-bindenden Substanzen, das zwischen den einzelnen Basenpaare eines doppelsträngigen DNA-Moleküls interkalieren kann. Nukleinsäuren können auf diese Weise angefärbt und die DNA so in einem Gel sichtbar gemacht werden. Nach Bestrahlung des Gels mit UV-Licht fluoresziert die DNA rot-orangefarbig. Die Silberfärbung, die im Anschluß an die Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt wird, ist eine hochempfindliche Färbetechnik für die Anfärbung von Nukleinsäuren. Für Nukleinsäuren ist der Nachweis bis zu 5-fach empfindlicher als mit der Dimidiumbromidfärbung, die bei der herkömmlichen Agarosegelelektrophorese durchgeführt wird. Einleitung 1 11 Einleitung Bakterien wurden im Magen von Menschen und Tieren schon Ende des 19. Jahrhunderts entdeckt. BIZZOZERO (1893) und SALOMON (1896) beobachteten das erste Mal spiralig geformte Bakterien im Magen von Tieren. Unklar blieb zunächst, ob die Bakterien als natürlicher Bewohner des Magens einzuordnen seien, oder ob es sich um einen pathologischen Befund handelte. Erst MARSHALL u. WARREN (1984) brachten die bis dahin kaum beachteten Stäbchenbakterien mit den gleichzeitig gefundenen entzündlichen Veränderungen der Magenschleimhaut in Verbindung und züchteten die Keime auch erstmalig an. Heute ist bekannt, daß der Magen, entgegen der früher vorherrschenden Lehrmeinung, eine Besiedlung mit Bakterien sei aufgrund des sauren Milieus nicht möglich, durch Bakterien der Gattung Helicobacter besiedelt werden kann. Damit wurde das Dogma umgestoßen, daß die Gastritis nur ein histologischer Befund sei, der durch lebenslange Belastung der Schleimhaut zustande käme und somit schicksalhaft und nicht zu beeinflussen sei (MUELLER, 1992). Helicobacterartige Bakterien, insbesondere Helicobacter pylori (H. pylori), sind beim Menschen die Hauptursache für chronische Gastritiden (Typ B Gastritis), Ulzera in Magen und Duodenum, B-Zell-Lymphomen und Adenokarzinomen des Magens (STOLTE, 1994; PARSONNET et al., 1991; NOMURA et al., 1991). Weltweit sind ca. 1 Milliarde Menschen mit dem Keim infiziert (MAI, 1988). Keimquellen und Infektionswege sind weitgehend unbekannt. Einerseits wird der Mensch als Erregerreservoir in den Vordergrund gestellt, andererseits existieren Berichte über Schlachthofarbeiter und Tierärzte, die einen deutlich höheren Antikörperspiegel gegen H. pylori hatten als Angestellte in der Verwaltung (VAIRA et al., 1988a). So wurden inzwischen im Rahmen der Untersuchungen an Tieren bis jetzt über 60 verschiedene Helicobacter spp., u. a. aus dem Magen von Frettchen, Hunden, Katzen, Affen, Hühnern und Mäusen isoliert (EATON et al., 1992; BRONSDON u. SCHOENKNECHT, 1988; CURRY et al., 1989; BURNENS et al., 1994; LEE et al., 1990; OTTO et al., 1994; HERMANNS et al., 1995; FOX et al., 1991a). Eine natürliche Infektion mit H. pylori konnte allerdings bis Einleitung 12 jetzt nur bei Untersuchungen an Katzen und Affen nachgewiesen werden (HANDT et al., 1994; CURRY et al., 1989). Interessant an den Untersuchungen am Tier ist dabei auch der Aspekt, welche Helicobacter-Arten bei den einzelnen Tierarten vorherrschen, und ob, wie beim Menschen, ein Zusammenhang zwischen Infektionsgrad und Magenschleimhautveränderungen besteht. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, ob Katzen aus dem Klientel verschiedener Tierarztpraxen in Göttingen Träger von H. pylori sind, welche anderen Helicobacter-Arten bei ihnen nachweisbar sind und welche Veränderungen die Bakterien an der Magenschleimhaut der infizierten Katzen verursachen. Folgende Methoden zum Nachweis verschiedener Helicobacter-Arten und Entzündungsreaktionen wurden gewählt: 1. Mikrobiologisch: Anzüchtung auf Spezialnährboden zum Nachweis von H. pylori 2. Molekularbiologisch: Nachweis der DNA von H. pylori, H. felis und H. heilmannii 3. Histologisch: Nachweis von Entzündungsreaktionen und von Helicobacter spp. mit Hilfe von Immunreaktionen 4. Transmissionselektronenmikroskopisch: Darstellung der Ultrastruktur der beteiligten Helicobacter spp. Neben dem Vorkommen der verschiedenen Helicobacter spp. bei Katzen im Göttinger Raum sollen die Untersuchungen insbesondere einen Beitrag zum diskutierten Zoonosepotential, insbesondere von H. pylori, leisten. Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Geschichtlicher Überblick und Taxonomie 13 Die Präsenz spiralförmiger, 3-8 µm langer, gramnegativer Bakterien in der Magenmukosa von Hunden und Katzen ist schon Ende des 19. Jahrhundert beschrieben worden (BIZZOZERO, 1893; SALOMON, 1896). Auch im Magen des Menschen wurden schon 1874 Bakterien entdeckt (BÖTTCHER, 1874, zitiert bei BLASER, 1987). Trotzdem dauerte es ca. 100 Jahre, um einen eindeutigen Zusammenhang zwischen der bakteriellen Besiedlung des Magens und einer Erkrankung herzustellen. KRIENITZ (1906) entdeckte Spirochäten bei Patienten mit Magenkarzinom. LUGER und NEUBERGER (1921) fanden Bakterien nur im Magen bei Patienten mit Magenkarzinom, bei gesunden Patienten und Patienten mit Magenulkus konnten keine Spirochäten gefunden werden. LUGER und NEUBERGER schlossen daraus, daß sich durch den Eiweißzerfall beim Karzinom das Magenmilieu so zu Gunsten der Bakterien, die für Saprophyten gehalten wurden, veränderte, daß sie sich stark vermehren konnten. Bei der ersten systematischen Untersuchung an Autopsiemägen des Menschen wurden bei 43 % der Patienten Spirochäten in den Magendrüsen nachgewiesen, diese konnten jedoch nicht angezüchtet werden (DOENGES, 1939). Es konnte dabei nicht geklärt werden, ob es sich um Saprophyten oder um eine postmortale Besiedlung handelte. FREEDBERG und BARRON (1940) verwarfen die These, daß es sich bei den Spirochäten um natürliche Bewohner des Magens handelte, denn sie fanden Bakterien häufiger in Mägen bei Patienten mit Ulkus, als bei Patienten ohne Erkrankung, allerdings sprachen sie ihnen trotzdem jegliche Pathogenität ab. Auch das Enzym Urease wurde im Magenschleim von Tieren und dem Menschen schon früh entdeckt, ein Zusammenhang zu den Bakterien wurde nicht hergestellt (LUCK u. SETH, 1924). PALMER (1954) überprüfte bei 1000 Patienten, die sowohl an Erkrankungen im oberen Gastroduodenalbereich, als auch unter völlig anderen Beschwerden litten, die Aussagen von DOENGES und FREEDBERG. Bei beiden Patientengruppen konnte er keine Spirochäten finden, weshalb er die Besiedlung für eine postmortale Kontamination aus der Mundhöhle hielt. DELLUVA et al. (1968) untersuchten bakterienfreie Tierfeten bei denen sie keine Urease feststellen konnten und so bewiesen, daß Literaturübersicht 14 Urease nicht bei der physiologischen Mukusproduktion entstanden sein konnte, sondern, daß es sich um ein Produkt des bakteriellen Stoffwechsels handelte. MARSHALL u. WARREN (1984) konnten im Rahmen einer Studie die Bakterien erstmalig isolieren und anzüchten, da im Labor versehentlich Platten im Brutschrank vergessen worden waren und so 5, statt der üblichen 2 Tage bebrütet wurden. Durch einen Selbstversuch wurde die Infektiosität bewiesen: MARSHALL trank, nach vorheriger Alkalisierung des Magensaftes, 109 KBE der Bakterien und entwickelte nach 10 Tagen eine Magenschleimhautentzündung. Eine Reisolierung der Keime aus einer Magenbiopsie war möglich (MARSHALL et al., 1985). So wurde erstmalig ca. 100 Jahre nach der Erstbeschreibung der Bakterien im Magenschleim der Beweis für eine bakterielle Ursache der Magenerkrankungen erbracht. Nachdem der Keim 1984 aufgrund seines Guanin-plus-Cytosin-Gehaltes (G+C), seiner kulturellen und phänotypischen Ähnlichkeit und seiner Lokalisation im Wirt die Bezeichnung Campylobacter pyloridis (MARSHALL et al., 1984) erhalten hatte, wurde er 1987 in die grammatikalisch korrekte Form Campylobacter pylori umbenannt (MARSHALL u. GOODWIN, 1987). Aufgrund der von der Campylobacter spp. abweichenden Ultrastruktur, zellulären Fettsäuren, Menaquinone und der Antibiotikaresistenzen, wurde eine neue Zugehörigkeit gesucht (WULFFEN, 1988; ROMANIUK et al., 1987; GOODWIN et al., 1985). Eine große Ähnlichkeit besteht zu Wollinella succinogenes, allerdings ergaben auch hier Untersuchungen große Unterschiede in der Morphologie, Wachstumscharakteristika, Enzymausstattung und Ultrastruktur, so daß die neue Gattung Helicobacter geschaffen (GOODWIN et al., 1989) wurde. Inzwischen wurden über 60 verschiedene Helicobacter-Arten, die teilweise saprophytisch leben, z.T. aber auch Gastritiden auslösen können, bei verschiedenen Tierarten nachgewiesen (BRONSDON u. SCHOENKNECHT, 1988; FOX et al., 1991a; FOX et al., 1991b). Bei der Katze wurden bis heute hauptsächlich H. felis und H. heilmannii (früher auch Gastrospirillium hominis) isoliert, aber auch H. pylori wurde schon nachgewiesen (HANDT et al., 1994; HANDT et al., 1995). Literaturübersicht 15 Taxonomische Einordnung: Reich: Procaryotae Klasse: Schizomycetes Stamm: Gracilicutes Ordnung: Pseudomonadales Familie: Spirillaceae Gattung: Helicobacter Tab. 1: Lokalisationen und Wirte verschiedener Helicobacter-Arten Arten Wirt Lokalisation H. pylori Mensch, Makaken, Katze Magen H. mustelae Frettchen, Nerz Magen H. acinonyx Leopard Magen H. heilmannii Hund, Katze, Mensch, Primaten Magen H. felis Katze, Hund Magen H. canis Hund, Mensch Darm, Leber (Hund) H. fenelliae Mensch Darm H. muridarum Maus, Ratte Darm, Magen (Maus) H. pametensis Vogel, Schwein Darm H. bizzozeroni Hund, Mensch Magen H. pullorum Huhn, Mensch Darm, Leber (Huhn) H. cinaedi Mensch, Hamster Darm H. hepaticus Maus Darm, Leber H. rappini Schaf, Hund, Mensch, Maus Darm, Leber (Schaf), Magen H. bilis Maus, Hund Darm, Leber, Magen (Hund) Anhand von molekulargenetischen Untersuchungen wurden bis heute weitere 55 Helicobacter-Arten identifiziert. Literaturübersicht 2.2 Eigenschaften verschiedener Helicobacter-Arten 2.2.1 Morphologie, kulturelle und biochemische Eigenschaften von H. pylori 16 Es handelt sich um gramnnegative, ureasepositive, bewegliche und gebogene oder spiralförmige Bakterien. H. pylori hat bei einer Länge von etwa 2,5-5 µm einen Durchmesser von etwa 0,5 µm, kann 3-6 Windungen aufweisen und ist unipolar begeißelt. Es besitzt 4-6 bescheidete Geißeln mit terminalen Verdickungen (MEGRAUD et al., 1985; WARRELMANN u. HAHN, 1987; RÜHL u. MORGENROTH, 1988; GOODWIN et al., 1989; ROHWEDDER, 1989; VANDAMME et al., 1991). H. pylori wächst in einer CO2-angereicherten, bzw. mikroaeroben Atmosphäre, aus 5 % O2, 10 % CO2 und 85 % N2, nicht jedoch unter aeroben oder anaeroben Bedingungen. Die optimale Wachstumstemperatur beträgt 37° C, schwaches Wachstum zeigt sich auch noch bei 42° C, bei 25° C findet kein Wachstum mehr statt (WARRELMANN u. HAHN, 1987; GOODWIN et al., 1989). Kolonien werden auf Brain-Heart-Infusion-Blut-Agar, Schokoladenagar, Müller-Hinton-Agar, Wilken-Chalgren-Agar oder Columbia-Agar mit Zusatz von 7-10 % Frischblut ausgebildet (MORGAN et al., 1987; GOODWIN et al., 1985; MEGRAUD et al., 1985; KASPER u. DICKGIESSER, 1986; BUCK u. SMITH, 1987; WARRELMANN u. HAHN, 1987; GOODWIN et al., 1989). Bei der Erstanzucht aus Magenbiopsien können bis zum Auftreten sichtbarer Kolonien bis zu 5 Tage vergehen, bei der Subkultur wachsen Kolonien nach 2-3 Tagen. Die Kolonien haben einen Durchmesser von 1-2 mm, sind glatt begrenzt, konvex, durchscheinend und nicht pigmentiert. Auf bluthaltigen Nährböden zeigen sie eine feine, unvollständige Hämolyse (GOODWIN et al., 1985; MARSHALL et al., 1985; MEGRAUD et al., 1985; KASPER u. DICKGIESSER, 1986; BUCK u. SMITH, 1987; WARRELMANN u. HAHN, 1987; LEHNHARDT, 1988). Zur Unterdrückung unerwünschter Begleitflora kann dem Nährboden ein antibiotikahaltiges Supplement nach "Skirrow" oder "Dent" (Fa. Unipath) zugesetzt werden. Alle bisher untersuchten H. pylori–Stämme sind resistent gegenüber Vancomycin, Literaturübersicht 17 Polymyxin, Cefsulodin und Amphotericin B (LENHARDT, 1988; McNULTY u. DENT, 1988). Unter dem morphologischen Polymorphismus, bzw. Dimorphismus versteht man kokkoide Rundformen, in die sich H. pylori bei ungünstigen Nährstoff- und Wachstumsbedingungen, unter Einfluß antibakterieller Substanzen und bei Alterungsvorgängen verwandelt (MEGRAUD et al., 1985; MAI u. OPFERKUCH, 1988; BÖRSCH u. LABENZ, 1989; VANDAMME et al., 1991; BODE u. MAUCH, 1992; NILIUS et al., 1993). Ob es sich hierbei um eine degenerierte Form oder, wahrscheinlicher um eine Art Überlebensform (Persisterform) handelt, ist noch nicht geklärt. Eine Anzüchtung dieser Rundformen in einer Kultur gelang CELLINI et al. (1994). Er infizierte Mäuse mit isolierten H. pylori-Stämmen von Patienten mit Duodenalulzera, nachdem er die Keime 20 Tage bebrütet hatte, um Keime mit kokkoiden Formen zu bekommen. Nach 2 Wochen konnten überlebensfähige H. pyloriKolonien nachgewiesen werden, es entwickelte sich eine milde Gastritis und im Serum der Mäuse konnten IgG Antikörper gegen H. pylori nachgewiesen werden. Somit kommt diesen Rundformen eine erhebliche epidemiologische Bedeutung zu. Zum Schutz gegen Abtötungsmechanismen der Phagozyten produziert H. pylori die Enzyme Katalase, Superoxid-Dismutase, Oxidase und alkalische Phosphatase (WARRELMANN u. HAHN, 1987). Im Unterschied zu den Campylobacter sp. zeigen Helicobacter sp. eine ausgeprägte Ureaseaktivität, durch die Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid hydrolysiert wird, die diagnostisch als Indiz für die Anwesenheit des Keimes herangezogen werden kann (MEGRAUD et al., 1985; HAZELL et al., 1987; WARRELMANN u. HAHN, 1987; McNULTY et al., 1989). Proteasen werden gebildet, die es dem Keim ermöglichen den Magenschleim besser zu durchdringen, um dann an der Magenschleimhaut zu haften (RAUWS et al., 1988). H. pylori kann Hippurat nicht hydrolysieren, Nitrat nicht reduzieren, Glukose und andere Zucker werden nicht fermentiert, Disulfidproduktion im 3-Zucker-EisenAgar erfolgt ebensowenig wie eine Indolreaktion (RAUWS et al., 1987; WARRELMANN u. HAHN, 1987). Literaturübersicht 2.2.2 18 Eigenschaften von H. felis und H. heilmannii H. felis und H. heilmannii wurden aus dem Magen von Hund und Katze, H. heilmannii auch beim Menschen nachgewiesen (STOLTE et al., 1994; OTTO et al., 1994; HERMANNS et al., 1995; FOX u. LEE, 1997). Beide Bakterienarten sind etwa 5,0-12,0 µm lang und 0,4 µm breit, mit 4-6 engen schraubenförmigen Windungen, unipolar 10-17 gebündelten Geißeln und periplasmatischen Fasern, die allein, paarweise oder auch dreifach dem Zellkörper anliegen (LEE et al., 1988; PASTER et al., 1991; SIMPSON et al., 2000). Lichtmikroskopisch lassen sich H. heilmannii und H. felis nicht unterscheiden (LECOINDRE et al., 1997; SIMPSON et al., 2000). Elektronenmikroskopisch sind die unterschiedlichen Fasern auf dem Kamm (H. felis), bzw. im Tal der Windungen (H. heilmannii) zu erkennen (NEIGER u. SIMPSON, 2000). H. felis, aus der Magenschleimhaut isoliert, bevorzugt bei 37° C erst eine anaerobe Atmosphäre, wächst dann in der Subkultur besser mikroaerob (LEE et al., 1988). Makroskopisch lassen sich die Kulturen nicht auf dem Nährboden erkennen, die einzige Möglichkeit ein Wachstum festzustellen ist, die verdächtigen Bereiche der Nährböden auf einen Objektträger aufzutragen und dann unter dem Phasenkontrastmikroskop zu betrachten (LEE et al., 1988). Eine Anzüchtung gelingt auf Brain-Heart-Infusion-Agar, supplementiert mit 5 % sterilem fetalem Kälberserum und einer Antibiotikakombination, bestehend aus Vancomycin, Polymyxin, Trimethoprim und Amphotericin B (PASTER et al., 1991). Biochemisch reagiert H. felis mit wenigen Ausnahmen, wie H. pylori. Allerdings besteht die Möglichkeit der Nitratreduktion, eine Resistenz gegenüber Nalidixinsäure und eine Empfindlichkeit gegenüber Cephalothin (PASTER et al., 1991). Biochemisch gemeinsam sind H. felis, H. heilmannii und H. pylori in der positiven Urease-, Katalase und Oxidasereaktion, Unterscheidungsmöglichkeiten bestehen in der Koloniemorphologie, in der Nitratreaktion, der Resistenzlage und der Ultrastruktur (Tab. 2) (LEE et al., 1988; PASTER et al., 1991; ANDERSEN et al., 1999; NEIGER u. SIMPSON, 2000). Laut ANDERSEN, der als erster und bis jetzt einziger H. heilmannii auf Nährböden angezüchtet hat, zeigt H. heilmannii Literaturübersicht 19 ähnliches Wachstum auf H. pylori-Selektivnährböden, wie H. pylori (ANDERSEN et al., 1999). Tab. 2: Eigenschaften von H. pylori, H. heilmannii und H. felis H. pylori H. heilmannii H. felis Urease + + + Katalase + + + Oxidase + + + Nitratreduktion - + + Ultrastruktur Wirt spiralförmig eng eng gewunden schraubenförmig schraubenförmig gewunden gewunden Mensch Katze Katze Affe Hund Hund Katze nonhumane Primaten Maus (exp) Hund (exp) Mensch Ratte (exp) Maus (exp) Resistenz zu Nalidixinsäure ( 30 µg) + + + Cepalothin (30 µg) - - - exp: experimentell infiziert 2.2.3 Virulenzfaktoren und Pathogenese der H. pylori Infektion beim Menschen Inzwischen gilt als gesichert, daß H. pylori der Erreger der chronischen Typ-B-Gastritis ist, daß die Infektion mit dem Keim eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der gastroduodenalen Ulkuskrankheit spielt, und daß sie durch die Unterhaltung einer chronischen Entzündung, mit Freisetzung von Toxinen und Radikalen, ein Kofaktor bei der Literaturübersicht 20 Entstehung von Malignomen des Magens (gastrisches Adenokarzinom und primäres Magenlymphom) ist (PARSONNET et al., 1991; NOMURA et al., 1991). Etwa 80-85 % aller Gastritiden werden mit einer Infektion durch H. pylori in Verbindung gebracht, dabei siedelt der Keim nicht nur in den Magenkrypten und an der Magenschleimhautoberfläche (MARSHALL, 1986) der Pylorus- und Antrum-Region, in der die Entzündung stärker ausgeprägt ist, sondern im gesamten Magen. Die Dichte der Besiedlung mit dem Keim bestimmt den Grad (Dichte der Infiltration der Schleimhaut mit Lymphozyten und Plasmazellen) und die Aktivität (Dichte der Infiltration mit neutrophilen Granulozyten) der Gastritis. In der Fundus- und Korpusregion herrscht eine höhere Aktivität als in den anderen Bereichen vor (STOLTE, 1992), trotzdem entstehen Ulzera bevorzugt in der Antrum-Region, wahrscheinlich, weil das produzierte Ammoniak im Fundus- und Korpusbereich durch die salzsäureproduzierenden Zellen neutralisiert wird und nicht, wie im Antrum, die entzündliche Reaktion durch die Zytotoxine verstärkt wird (STOLTE, 1992). Entscheidend für den Krankheitsverlauf nach der Infektion sind die Virulenzfaktoren des Erregers, die genetischen Voraussetzungen und das Alter des Infizierten sowie Umweltfaktoren (AXON, 1999). Der pathogene Effekt von H. pylori an der Magenschleimhaut entsteht durch eine Reihe von Virulenzfaktoren und der reaktiven entzündlichen Antwort der besiedelten Schleimhaut. Außerhalb des Magens (z. B. im Duodenum) wird dieser Pathomechanismus nur dort wirksam, wo aufgrund einer gastralen Metaplasie, die nach einer erhöhten Magensäureproduktion zustande kommt, die Bedingung für eine Besiedlung geschaffen wurde (MALFERTHEINER u. NILIUS, 1994a). Verschiedene H. pylori-Isolate produzieren unterschiedliche Mengen an zytotoxischer Substanz (LEUNK et al., 1988). Zytotoxinproduzierende Stämme wurden häufiger von Patienten mit einem peptischen Ulkus, als bei Patienten, die lediglich an einer chronischen Gastritis leiden, isoliert (FIGURA et al., 1989). Zytotoxine: Es besteht eine beachtliche genetische Variabilität zwischen verschiedenen H. pylori- Stämmen. Einige sind mehr mit schweren Entzündungreaktionen vergesellschaftet als andere. Diese Stämme werden ebenso mit einer größeren Wahrscheinlichkeit an der Literaturübersicht 21 Entwicklung von Magenulzera, doudenaler Metaplasie und Magenkrebs in Verbindung gebracht. Zu der sogenannten „Pathogenitätsinsel“, einem Segment der DNA, gehören die cagA- und vacA-Gene, die mit der Sekretion von Proteinen, die die Vakuolisierung der Zellen verursachen, in Verbindung gebracht werden. Mit einem Bluttest können die Infizierten, die Träger dieser virulenten Stämme sind, identifiziert werden. Bis jetzt wird noch kontrovers diskutiert, ob auch die klinisch unauffälligen Patienten, oder nur die, die mit den virulenten Stämmen infiziert sind, behandelt werden sollten (KONTUREK et al., 1999; SPECHLER et al., 2000; AXON, 1999). Urease: Ein charakteristisches phänotypisches Merkmal aller H. pylori-Stämme ist die Produktion großer Mengen Urease, durch die der in der Lamina propria des Magens gebildete Harnstoff in Ammoniak und Kohlendioxid gespalten werden kann, so daß die Magensäure in der unmittelbaren Umgebung des Bakteriums neutralisiert wird. So wird eine schützende Schicht aufgebaut, die dem Keim hilft zu überleben, bis er die schützende Mukusschicht mit dem weniger sauren pH-Wert erreicht hat (SUERBAUM, 1994; RAUWS et al., 1988; NEWELL, 1990). Beweglichkeit: Aufgrund seiner spiralförmigen Gestalt und den unipolar 3-7 bescheideten Geißeln ist es H. pylori möglich, das saure Milieu schnell zu verlassen und sogar die hochvisköse Schleimschicht des Magens zu durchdringen (NEWELL, 1990; EATON et al., 1992). Adhärenz: Eine wichtige Gruppe von bakteriellen Molekülen, die für die Adhärenz von H. pylori an den Schleim und an die Epithelzellen von Bedeutung sind, stellen z. B. das fibrilläre Hämagglutinin, das an Erythrozytenmembranen und Schleimbestandteile bindet (ROBINSON et al., 1990), und Heparan-Sulfat-spezifische Adhäsine (ASCENSIO et al., 1993) dar. Proteasen: Umstritten ist, ob die von H. pylori gebildeten Proteasen (SLOMIANY et al., 1987) durch ihre mukolytische Aktivität ein leichtere Beweglichkeit im Schleim erlauben (MALFERTHEINER u. BODE, 1988). Literaturübersicht 22 Proteasen, Phosphatasen und Phospholipasen bauen den Schleim und die hydrophobe Phospholipidschicht, die sich dem Keim als letzte Barriere vor den Epithelzellen der Magenmukosa entgegenstellt, ab (SIDEBOTHAM et al., 1991; RAEDSCH, 1991), so daß eine direkte Adhärenz an die Magenepithelzellen ermöglicht wird. 2.2.3.1 Zellschädigungen durch H. pylori Ist der Kontakt zur Zelloberfläche erst einmal hergestellt, findet H. pylori nicht nur optimale Wachstumsbedingungen, sondern entfaltet auch seine gewebsschädigende Wirkung (Abb. 1). Für die Zellschädigung werden spezifische Zytotoxine, verschiedene Enzyme (Urease, Phospholipasen, Phosphatasen), sowie die entzündliche Reaktion selbst verantwortlich gemacht (MALFERTHEINER u. NILIUS, 1994a). Nach Kontakt zu den kurzen Mikrovilli des Epithels wird die Annäherung erleichtert und ein enger Membrankontakt hergestellt (MALFERTHEINER u. BODE, 1988). Zusätzlich haftet H. pylori an den junktionalen Komplexen (tight junctions) und spaltet diese, so daß der Keim dann in die interzellulären Spalten eindringen kann und das Eindringen entzündlich irritierender Substanzen in das epitheliale Stroma begünstigt wird. Die Mikrovilli gehen vollständig zugrunde und die Epithelzellen unterliegen dem Zelltod (SCHAEFER, 1988). Das durch die Urease gebildete Ammoniak besitzt zusätzlich eine zytopathogene Wirkung (FIGURA et al., 1989; LEUNK et al., 1988; XU et al., 1990) und beeinflußt so außerdem die Permeabilität der Mukosa. Durch den Anstieg der Ammoniakkonzentration wird der pH-Gradient des Mukus zerstört und die Wasserstoffionen, die in den Belegzellen produziert werden, können die Schleimhaut in Richtung Magenlumen nicht passieren, sie diffundieren wieder zurück und führen zu einer Hypochlorhydrie. Dieser Umstand begünstigt die Ulkusentwicklung (HAZELL u. LEE, 1986). Entzündung und immunologische Reaktionen: Die Infektion mit H. pylori führt zu einer geringgradig bis schweren chronisch-aktiven Gastritis (Typ B), die sich durch eine starke Infiltration der Lamina propria durch Plasmazellen, T-Lymphozyten und je nach Aktivitätsgrad, Monozyten, bzw. Granulozyten auszeichnet (STOLTE, 1994). Trotz der ausgeprägten Antikörperbildung, die lokal und systemisch angeregt wird, kann H. pylori in Literaturübersicht 23 der Magenschleimhaut nicht beseitigt werden, es entsteht keine Immunität. Die Folge ist eine chronische Erkrankung. Die chronische Infektion wird durch immunologische Mechanismen unterhalten, die zwar nicht in der Lage sind den Keim zu vernichten, aber die Infektion unter Kontrolle halten. Der invasive Einstrom und die Aktivierung von polymorphkernigen Leukozyten, durch Freisetzung von TNF-α, Il-1 oder IFN-γ, bewirkt ebenfalls keine Elimination, sondern hat durch die Freisetzung von Sauerstoffradikalen und einer Reihe von aggressiven Enzymen (z. B. Elastase, Lysozym) einen zusätzlich schädigenden Einfluß auf die Mukosa (ERNST et al., 1997; MALFERTHEINER u. NILIUS, 1994a; SCHAEFER, 1988; BODE et al., 1988). Aufgrund der besonderen Virulenzeigenschaften sowie der begrenzten Effizienz der Immunantwort kann sich der Träger ohne spezifische Therapie nicht von der Infektion befreien. Bei einer chronischen Infektion kommt es zu einer Veränderung der Gastrin-, Somatostatin- und Salzsäuresekretion. Der Ausbreitungsmodus der H. pyloriInfektion entscheidet, ob es zu einer Hyperchlorhydrie oder zu einer verminderten Säuresekretion kommt. Bei der antrumbetonten Infektion wird durch Stimulation der Gastrinsekretion eher eine Hypersekretion ausgelöst, bei einer Infektion, die auf weite Teile der Korpusschleimhaut übergreift, führt eine Hemmung der Belegzellproduktion zu einer Achlorhydrie (NEIGER u. SIMPSON, 2000; MALFERTHEINER u. NILIUS, 1994a). Literaturübersicht 24 Helicobacter-Spezies direkt schädigende Wirkung indirekt schädigende Wirkung Enzyme Immunreaktion mit Lymphozyten Zytotoxine neutrophilen Granulozyten Adhärenz Plasmazellen Beweglichkeit Granulozyten Mediatoren TNF-α Epithelzellschädigung Il-1 Hypergastrinämie IFN-γ Hyperchlorhydrie Typ B Gastritis Magenulkus Magenlymphom Magenkarzinom Abb. 1: Pathogenitätsmechanismen einer Helicobacter-Infektion Literaturübersicht 2.2.4 25 H. heilmannii-Gastritis beim Menschen Inzwischen wird eine weitere Helicobacter-Art für Gastritiden beim Menschen verantwortlich gemacht. H. heilmannii (früher Gastrospirillium hominis) sitzt fast ausschließlich innerhalb der Grübchen herdförmig im Antrum, im Gegensatz zu H. pylori, der die Oberfläche der Magenschleimhaut diffus gleichmäßig besiedelt. Zahlreiche Keime wurden auch intrazellulär in den Belegzellen beobachtet (FOX u. LEE, 1997). Die durch H. heilmannii ausgelöste Gastritis ist im Vergleich zur H. pylori-Gastritis geringgradiger und sehr viel weniger aktiv. Das Oberflächenepithel wird nicht beeinflußt, so daß die Schleimproduktion nicht beeinträchtigt wird. Eine Übertragung durch Haustiere ist in diesem Fall sehr wahrscheinlich (STOLTE et al., 1994). Eine Doppelinfektion der beiden Keime wurde nur selten gesehen, so daß von einer Verdrängung von H. pylori durch H. heilmannii ausgegangen werden kann und somit evtl. ein Schutz vor einer Infektion mit H. pylori besteht (STOLTE, 1994). 2.3 Gastritisklassifikation und Graduierung Nach der Wiederentdeckung des H. pylori und der Erkenntnis, daß dieser Keim die Hauptursache der B-Gastritis ist, wurde erstmalig eine ätiopathogenetische Klassifikation der Gastritiden möglich, nachdem bis zu diesem Zeitpunkt weltweit unterschiedliche Gastritiseinteilungen existierten. Es erfolgte eine Einteilung in drei Hauptgruppen (WYATT u. DIXON, 1988; HEILMANN u. STOLTE, 1990): A-Gastritis = Autoimmungastritis B-Gastritis = Bakteriell-infektiöse Gastritis C-Gastritis = Chemisch induzierte Gastritis Sonstige Sonderformen der Gastritis Literaturübersicht 26 Dieser Vorschlag führte zum „Sydney-System“, in dem die verschiedenen Gastritiden nach endoskopischen und histologischen Kriterien beurteilt werden. Die histologische Klassifikation setzt sich aus einer Kombination aus Ätiologie, Topographie und Morphologie der Gastritis zusammen: 1. chronische Entzündung: Dichte der Infiltration der Tunica propria der Magenschleimhaut mit Lymphozyten und Plasmazellen 2. Aktivität der Entzündung: Dichte der Infiltration der Magenschleimhaut mit neutrophilen Granulozyten 3. Atrophie des Drüsenkörpers 4. intestinale Metaplasie 5. Dichte der H. pylori- Besiedlung Für diese Parameter wurde die Vierer-Graduierung: normal, geringgradig, mittelgradig und hochgradig vorgeschlagen (STOLTE, 1994). 2.4 Helicobacter-Spezies bei verschiedenen Tierarten Nach der Entdeckung von H. pylori beim Menschen 1983, wurden in den folgenden Jahren bis heute 70 verschiedene Helicobacter-Spezies aus verschiedenen Lokalisationen bei Säugetieren und Vögeln isoliert (Tab. 1). Sie sind unter bestimmten Bedingungen für eine lokale entzündliche Reaktion der Magenschleimhaut und möglicherweise für die Persistenz dieser Entzündung verantwortlich (FOX u. LEE, 1997; LECOINDRE et al., 1997). H. pylori wurde bei Pavianen (CURRY et al., 1989), Rhesusaffen (BRONSDON u. SCHOENKNECHT, 1988; NEWELL et al., 1988) und bei Laborkatzen (HANDT et al., 1994; HANDT et al., 1995) isoliert. Die Bakterien sind hauptsächlich im oberflächlichen Schleim und im Lumen der Magendrüsen, selten in den säuresezernierenden Zellen (CHEN et al., 1986) zu finden. Bei Laborkatzen war die Anwesenheit einer großen Anzahl von H. pylori, Literaturübersicht 27 die nicht mit der Invasion in die Zelle, oder einer Degeneration der Epithelzellen einherging (HANDT et al., 1995), mit einer lymphofollikulären Gastritis assoziiert. Diese Gastritis wurde charakterisiert durch Lymphozytenaggregate und eine diffuse Entzündung, hauptsächlich verursacht durch Lymphozyten, Plasmazellen, wenige neutrophile und eosinophile Granulozyten (HANDT et al., 1994) in der tiefen Mukosa und der Lamina propria. Die Entzündung war hauptsächlich auf das Antrum beschränkt, wo auch die meisten Bakterien gefunden wurden. Diese Katzen wiesen ansonsten keine anderen Helicobacter-Spezies auf. Eine Ulkusentwicklung konnte nicht nachgewiesen werden (ESTEVES et al., 2000). Bei H. pylori infizierten Katzen wurden die Bakterien mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bei 50 % der Tiere im Speichel, bei 91 % im Magensekret, bei 42 % im Zahnstein und bei 80 % der Katzen im Kot nachgewiesen. Dies läßt den Verdacht aufkommen, daß Heimtiere als Reservoir für die Übertragung auf den Menschen in Frage kommen (FOX et al., 1996a). H. heilmannii und H. felis (zusammengefaßt als GHLO = gastric Helicobacter-likeorganisms) werden zu 60-97 % in Mägen von Hunden und Katzen nachgewiesen (NORRIS et al., 1999; HERMANNS et al., 1995; OTTO et al., 1994; HAPPONEN et al., 1996). Die Infektion wird mit Magenläsionen bei Laborhunden in Verbindung gebracht, dabei wurde beobachtet, daß eine geringgradige Besiedlung unschädlich, eine große Anzahl von Keimen jedoch, wie man sie in der Kardia und am Übergang vom Fundus zum Pylorus gesehen hat, eine lymphoretikuläre Hyperplasie und frühzeitige Alterung der Belegzellen auslösen kann (HENRY et al., 1987). OTTO et al. (1994) und HENRY et al. (1987) fanden GHLO in den Belegzellen mit und ohne Veränderung der Zytostruktur. Weder eine massive Besiedlung des Drüsenlumens, noch eine intrazelluläre Besiedlung mit H. heilmannii führte, im Gegensatz zu H. felis, zu einem schweren Epithelschaden (LECOINDRE et al., 1997). Die Bakterien wurden im Schleim der Magengrübchen, in den Belegzellen und im Drüsenlumen (HERMANNS et al., 1995) nachgewiesen. OTTO et al. (1994) wiesen eine erhöhte Anzahl von Lymphfollikeln bei Katzen mit hochgradigem Befall von GHLO nach, dabei waren etwa 75 % der untersuchten Katzen GHLO positiv. FEINSTEIN und OLSSEN (1992) konnten bei neun Perserkatzen, die an einer schweren Gastroenterocolitis erkrankt waren, GHLO nachweisen und brachten sie mit histologischen Veränderungen und klinischen Literaturübersicht 28 Symptomen in Zusammenhang. In einer anderen Studie (EATON et al., 1996) wurden Laborhunde und in privaten Haushalten gehaltene Hunde untersucht. 100 % der Labor- und 67 % der privat gehaltenen Hunde wiesen GHLO auf. Bis auf einen zeigten alle Hunde eine gering- bis mittelgradige Gastritis. Die Anwesenheit der GHLO war oft kombiniert mit einer Reduktion von Schleim des Oberflächenepithels, einigen intraepithelialen Lymphozyten und einigen degenerierten Drüsen. Nur die Belegzellen wurden angegriffen. Fokale Akkumulationen von Lymphozyten und Lymphfollikeln waren ebenso nachweisbar, wobei der Grad der Kolonisation mit GHLO und die Anzahl der Lymphfollikel bei Katzen korrelierte, während bei Hunden eher kein Zusammenhang zu bestehen schien. Bei hochgradiger Infektion mit GHLO wurden eher bei Katzen als bei Hunden Degenerationen der Drüsenkörper beobachtet (HERMANNS et al., 1995). Früher wurden Lymphozytenaggregate als Normalbefund in der Magenschleimhaut angesehen, heutzutage muß man allerdings davon ausgehen, daß es sich um Zeichen einer lokalen Immunreaktion auf die bakterielle Infektion handelt (LEE et al., 1988). Klinische Symptome, Erbrechen und Durchfall als Zeichen der Infektion bei Haustieren können, müssen aber nicht vorhanden sein (HERMANNS et al., 1995). Da sowohl H. heilmannii, als auch H. felis in einem geringen Prozentsatz beim Menschen als Gastritiserreger nachgewiesen wurden und bis heute keine natürliche Quelle als Reservoir für diese Bakterien gefunden wurde, muß auch in diesem Fall von einem Zoonoserisiko ausgegangen werden (FOX u. LEE, 1997), zumal LAVELLE et al. (1994) nach einer elektronenmikroskopischen Untersuchung von einem Fall berichten, bei dem sowohl bei einem Laborassistenten mit Gastritissymptomatik, als auch bei Katzen, mit denen er arbeitete, GHLO der gleichen Morphologie gefunden wurden. Auch DIETERICH et al. (1998) untersuchten das Urease-B-Gen der H. heilmannii-Stämme, die sie bei einem Katzenbesitzer mit Gastritissymptomen und seinen zwei Katzen nachgewiesen hatten und bewiesen, daß die Stämme in über 97 % ihrer Nukleotidsequenz übereinstimmten. H. felis bewirkt bei infizierten Mäusen eine Gastritis und einen Anstieg der Serumantikörper (LEE et al., 1990; FOX et al., 1993). Nur bei mit H. mustelae infizierten Frettchen wurden sowohl Gastritis, Magenulzera, als auch spezifische IgG-Antikörper gegen den Keim diagnostiziert (FOX et al., 1991a; FOX Literaturübersicht 29 et al., 1988). Das Bakterium zeigt eine Affinität zum Magenepithel und -schleim und wurde, im Gegensatz zu H. pylori, auch intrazellulär beobachtet (FOX et al., 1989; O`ROURKE et al., 1992). H. acinonyx wurde bei in Gefangenschaft gehaltenen Raubkatzen mit Gastritissymptomatik im Magenschleim nachgewiesen (EATON et al., 1993a; EATON et al., 1993b). H. fennelliae und H. cinaedi werden mit Proktitis und Kolitis in immunsupprimierten Personen in Verbindung gebracht (FENNELL et al., 1984). H. cinaedi wurden aus dem Kot von Hunden, Katzen und Hamstern, allerdings ohne klinische Symptome oder Läsionen (GEBHART et al., 1989; KIEHLBAUCH et al., 1995), H. fennelliae aus dem Kot von Hunden und Makaken isoliert (KIEHLBAUCH et al., 1995). H. hepaticus und H. bilis fanden sich ebenso in der Leber von an Hepatitis erkrankten Mäusen, wie im Darm von Mäusen mit inflammatory bowel disease und klinisch unauffälligen Mäusen (FOX et al., 1994; FOX et al., 1995b). H. canis zeigt ebenso, wie H. pullorum, H. bilis und H. hepaticus eine Resistenz gegen Gallensäure, was ihm eine Besiedlung der Leber ermöglicht (FOX et al., 1994; FOX et al., 1995b; STANLEY et al., 1993; STANLEY et al., 1994; FOX u. LEE, 1997). FOX et al. berichten von einem Hund mit aktiver multifokaler Hepatitis, der mit H. canis infiziert war (FOX et al., 1996b). H. rappini (Flexispira rappini) wurde aus dem Darm eines infizierten Menschen und eines symptomlosen Hundes im selben Haushalt isoliert, ebenso konnte der Keim bei Mäusen nachgewiesen werden (SCHAUER et al., 1993; ROMERO et al., 1988). H. bizzozeronii wurde ebenfalls im Magen von Hunden nachgewiesen (HÄNNINEN et al., 1996). H. muridarum kolonisiert ebenso den hinteren Intestinaltrakt von Ratten und Mäusen und kann unter bestimmten Umständen eine Gastritis induzieren (LEE et al., 1992b; QUEIROZ et al., 1992). H. pametensis wurde bei Vögeln und Schweinen isoliert (DEWHIRST et al., 1994), eine Erkrankung bei Vögeln oder Menschen wurde in diesem Zusammenhang nicht nachgewiesen. H. pullorum wurde aus dem Blinddarm von symptomlosen Hühnern, aus dem Darm und der Literaturübersicht 30 Leber von an Hepatitis erkrankten Hühnern und aus dem Stuhl von Menschen mit Gastroenteritis isoliert (STANLEY et al., 1994; BURNENS et al., 1994). 2.5 Epidemiologie Weltweit handelt es sich bei der Infektion mit Helicobacter sp. um die häufigste Infektionskrankheit überhaupt. In Ländern der westlichen Welt nimmt die Durchseuchung mit dem Lebensalter zu (LABENZ u. BÖRSCH, 1994). Die Infektion mit H. pylori wird in den allermeisten Fällen in der frühen Kindheit erworben und persistiert dann bei Nichtbehandlung ein Leben lang (STONE, 1999; ROWLAND, 2000). Das Infektionsrisiko des Menschen durch H. pylori steht in umgekehrtem Verhältnis zur sozialen Stellung innerhalb der Gesellschaft und den damit verbundenen Lebensumständen (KLEIN et al., 1991). In den Industrieländern sind ungefähr 10 bis 50 % der Kinder infiziert, wobei auch hier sozial ärmerere Schichten eine erhöhte Infektionsrate zeigen (ROWLAND, 2000). In den Entwicklungsländern sind Kinder unter 10 Jahren bis zu 80 % infiziert. Quellen und Wege der Infektion sind bis heute ungeklärt und bleiben weiterhin Ziel verschiedener Untersuchungen. H. pylori wurde in Trinkwasser mittels PCR nachgewiesen (SCHAUER et al., 1995). Infektionen durch kontaminiertes Wasser wurden auch schon durch KLEIN et al. (1991) vermutet, da sich bei Untersuchungen in Peru herausstellte, daß Kinder mit gemeinschaftlicher Wasserversorgung außerhalb des Hauses wesentlich häufiger mit H. pylori infiziert waren, als eine vergleichbare Gruppe, die eine interne Wasserversorgung zur Verfügung hatte. WESTBLOM et al. (1993) wiesen mit Hilfe der PCR H. pylori in fäkalienverunreinigtem Wasser nach. Iatrogen bedingte Infektionen wurden ebenfalls beschrieben. Bei endoskopischen Untersuchungen blieben Bakterien an den Endoskopen haften und wurden bei der nachfolgenden Untersuchung an den nächsten Patienten übertragen (LANGENBERG et al., 1990). Gasteroenterologen selbst hatten durch vermehrten Kontakt mit Magensaft häufiger Antikörper gegen H. pylori als andere Mediziner (MITCHELL et al., 1989). Literaturübersicht 31 Helicobacter-Spezies wurden zwar bisher bei verschiedenen Säugetieren isoliert, doch scheint der Hauptbesiedlungsort für H. pylori die Magenschleimhaut des Menschen zu sein. Somit spielt der Mensch als Erregerreservoir für die Übertragung auch eine entscheidende Rolle. Eltern von Kindern, die mit Helicobacter-Spezies infiziert waren, wiesen deutlich höhere Antikörperspiegel auf, als Eltern von nicht infizierten (DRUMM et al., 1990). Fäkal-orale Infektion: BERKOWICS u. LEE (1987) fanden bei geistig behinderten Menschen, die als gefährdet für Schmierinfektionen gelten, einen wesentlich höheren Serumantikörperspiegel, als in einer Gruppe gleichaltriger gesunder Personen. THOMAS et al. (1992) untersuchten 23 zufällig ausgesuchte Kinder in Gambia und konnten aus 9 Stuhlproben H. pylori isolieren und anzüchten. Übertragungen durch einen Vektor werden ebenfalls für möglich erachtet. GRÜBEL et al. (1997) konnten H. pylori bei Fliegen sowohl von der Oberfläche des Körpers, als auch aus dem Darmtrakt nachweisen. Oral-orale Infektion: Sowohl im Speichel, als auch im Zahnstein von mit H. pylori infizierten Patienten, die an Verdauungsstörungen litten, konnte H. pylori nachgewiesen werden (FERGUSON et al., 1993; DESAI et al., 1991). Gastrisch-orale Infektion: Es wurde beobachtet, daß in Gruppen von Mäusen und Ratten, im Gegensatz zu Gruppen mit Hunden, in denen sowohl mit Helicobacter sp. infizierte, als auch nicht infizierte Tiere gehalten wurden, Helicobacter sp. nur bei den Hunden auf die nicht infizierten Tiere übertragen wurde (LEE et al., 1991). Dies wurde darauf zurückgeführt, daß Ratten und Mäuse, im Gegensatz zu Hunden nicht erbrechen und sich so trotz des engen Kontaktes zueinander, nicht infizieren konnten. Ebenso konnten Mäuse mit Magenschleim infizierter Katzen, aber nicht mit deren Kot infiziert werden. Trotz intensiver Forschung in über 10 Jahren, herrscht weiterhin Unklarheit, ob Tiere als Reservoir für Helicobacter sp. als Infektionserreger für den Menschen in Frage kommen können. Zahlreiche Helicobacter-Arten wurden inzwischen bei verschiedenen Tierarten nachgewiesen (Tab. 1) und stellen somit ein Infektionsrisiko dar, zumal inzwischen auch Infektionen beim Menschen nicht nur mit H. pylori, sondern auch mit verschiedenen anderen Literaturübersicht 32 Helicobacter-Arten nachgewiesen wurden (LAVELLE et al., 1994; BURNENS et al., 1994; FENNELL et al., 1984; FOX et al., 1995b; ROMERO et al., 1988). Einige Studien beschreiben bei Berufsgruppen mit vermehrtem Kontakt zu Tieren, z. B. Schlachtern oder auch Schäfern, erhöhte Serumantikörper gegen H. pylori (DORE et al., 1999b; VAIRA et al., 1989). Die Isolation von H. pylori bei Laborkatzen (HANDT et al., 1994) warf die Frage auf, ob Katzen nicht auch als ein Hauptüberträger für die Infektion in Frage kommen, zumal bei vielen Katzenbesitzern ein enger Kontakt zu den Tieren besteht und H. pylori bei Katzen in Speichel, Zahnstein, Magensaft und Kot nachgewiesen werden konnte (FOX et al., 1996a). Bei einer Umfrage an 2 Gruppen von Gastritis-Patienten und einem Vergleich der Gruppe der H. heilmannii-infizierten mit der Gruppe der H. pyloriinfizierten, stellte sich heraus, daß der Kontakt zu Hunden, Katzen, Schweinen oder Schafen ein eindeutiges Risiko für die Infektion mit H. heilmannii darstellt (MEINING et al., 1998; STOLTE et al., 1994). H. pylori wurde ebenfalls in Schafmilch nachgewiesen (DORE et al., 1999a). 2.6 Diagnostik einer Helicobacter-Infektion beim Tier Sowohl beim Menschen als auch beim Tier können nach Entnahme einer Biopsie, invasive (Urease-Schnelltest, Elektronenmikroskopie, Kultur, PCR, Histopathologie, Immunhistologie, Abklatschzytologie) und nicht-invasive (Serologie, Harnstoff-Atemtest und HarnstoffBluttest) Methoden durchgeführt werden. Urease-Schnell-Test: Aufgrund der starken Ureaseproduktion, die alle gastrischen Helicobacter sp. aufweisen, kommt es bei diesem Test, bei dem eine Gewebebiopsie in einer Harnstoff-Nährlösung inkubiert wird, sehr rasch zu einem Farbumschlag von gelb nach rot. Der Zusatz eines pH-Indikators bewirkt den Farbumschlag bei Anstieg des pH-Wertes, der durch die Spaltung von Harnstoff in Ammoniak bewirkt wird (OWEN et al., 1985; NEIGER, 1998b). Literaturübersicht 33 Histopathologie: Verschiedene Färbemethoden, wie z. B. die Warthin-Starry Silber, Giemsa oder Toluidinblau ermöglichen das Erkennen von spirillenförmigen Bakterien in Biopsieproben, dabei sollten mehrere Proben entnommen werden, da die Verteilung der Bakterien in der Magenschleimhaut unregelmäßig ist (GEYER et al., 1993; HERMANNS, et al., 1995). Immunhistologie: Mit Hilfe von Antikörpern werden bakterielle Antigene im histologischen Präparat nachgewiesen, dabei nutzen immunenzymatische Färbemethoden eine EnzymSubstratreaktion, um farblose Chromogene in ein gefärbtes Endprodukt umzuwandeln und somit Antigene sichtbar werden zu lassen. Bei der Immunperoxidasemethode wird ein mit dem Enzym Meerrettich-Peroxidase markierter Antikörper verwendet, um das Antigen zu identifizieren. Durch Zugabe eines H2O2-haltigen Substrates und eines Chromogens wird die immunologische Bindung lichtmikroskopisch sichtbar (BOENISCH, 1989). Abklatschzytologie: Mit einer Bürste wird ein Abstrich der Magenschleimhaut vorgenommen und nach Gram oder Diff-Quick gefärbt (NEIGER, 1998b). Eine Beurteilung des Entzündungsgrades kann leider nicht stattfinden. Bakterielle Kultur: Magenbiopsien werden auf Selektivnährböden verbracht, ausgestrichen und unter mikroaeroben Bedingungen bei 37° C bis zu 7 Tagen inokuliert. Alle Helicobacter sp. sind in vitro schwierig anzuzüchten (NEIGER, 1998b). Polymerase-Kettenreaktion (PCR): Bestimmte Abschnitte der Desoxyribonukleinsäure (DNS) (meistens das Ureasegen oder das 16S rRNA-Gen) verschiedener Helicobacter sp., isoliert aus biopsierten Gewebestücken oder Magensaft, können mit Hilfe der PCR vermehrt werden (HO et al., 1991), und ermöglichen so die Bestimmung einzelner Helicobacter-Arten auch bei geringem Befall. Allerdings ergeben auch abgestorbene Keime ein positives Resultat (NEIGER, 1998b). 13 C-Harnstoff Atem- und Bluttest: In der Humanmedizin schon lange etabliert, wurde dieser Test jetzt auch für Hund und Katze evaluiert. Markierter Harnstoff (z. B. 13C) wird oral eingegeben und von der bakteriellen Urease zu Ammoniak und H13CO‾3 hydrolysiert. Literaturübersicht Letzteres wird zu 13 Das Verhältnis von 34 CO2 umgewandelt und kann in der Ausatmungsluft aufgefangen werden. 12 CO2 zu 13 CO2 kann mittels Massenspektrographie gemessen werden. Einzelne Helicobacter sp. können dabei nicht unterschieden werden, allerdings kann der Test verwendet werden, um einen Therapieerfolg festzustellen (CORNETTA et al., 1998; NEIGER, 1998a). Beim 13 oraler Einnahme kann 13 C-Serumtest werden ebenfalls stabile Isotope verwendet. Nach C-markierter Harnstoff zur 13 C-Serum-Bicarbonat-Bestimmung genutzt werden (MOULTON-BARRETT et al., 1993). Serologie: Beim Menschen werden spezifische Antikörper, die gegen H. pylori gebildet werden, zur Bestimmung der Prävalenz und zur Identifikation von Risikofaktoren durch einen Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) genutzt (NEIGER, 1998b). Auch Tiere bilden sowohl bei natürlicher, als auch experimenteller Infektion Antikörper gegen Helicobacter sp. (LEE et al., 1992a; FOX et al., 1995b; FOX et al., 1996b), die mit den Antigenepitopen reagieren. Allerdings weisen Studien darauf hin, daß es aufgrund von Kreuzreaktionen nicht möglich ist, mit Hilfe des Tests zwischen den verschiedenen Helicobacter-Arten zu unterscheiden (SEIDEL u. BAUER, 1999). 2.7 Therapiemöglichkeiten Das National Institute of Health hat für die Behandlung von Menschen festlegt, daß nur Patienten mit Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwüren, die außerdem mit H. pylori infiziert sind, mit antibakteriell wirksamen Medikamenten behandelt werden sollten. Da die vollständige Eradikation von H. pylori beim Menschen u. U. schwierig sein kann, wurden über Jahre verschiedene Therapiekombinationen erforscht. Dabei wurde kein Medikament gefunden, das eine ausreichende Wirkung hätte erzielen können. So wurde eine Kombinationstherapie entwickelt, die aus einer antisekretorisch wirkenden Substanz (z. B. ein Histamin-H2-Antagonist oder ein Protonen-Pumpen-Inhibitor) und einem oder mehreren Antibiotika besteht. Die Wismuth-Triple-Therapie, über Jahre als „GoldStandard“ gepriesen, zeigte nicht immer die erhofften Wirkungen und war mit unerwünschten Nebenwirkungen behaftet. Die Dual-Therapie, die einen Protonenpumpeninhibitor (PPI) und Literaturübersicht 35 ein Antibiotikum aufweist, erzielte unsichere Resultate und Eradikationsraten von weniger als 60 %. Heutzutage wird bei Mensch und Tier ein PPI mit zwei Antibiotika kombiniert, wie z. B. Metronidazol, Clarithromycin und Amoxycillin. Diese Therapie zeigt eine Eradikationsrate bis zu 100 % (BAZZOLI, 1999). Ob eine antimikrobielle Therapie bei Helicobacter-infizierten Haustieren mit Gastritis durchgeführt werden soll, ist zur Zeit noch unklar, da Helicobacter sp. im Magen von Hunden und Katzen zwar sehr häufig vorkommen, über deren Pathogenität aber noch Unklarheit herrscht (SIMPSON u. BURROWS, 1997; BAZZOLI, 1999). 2.8 Tiermodelle für die H. pylori-Infektion Um die pathogenen Wechselwirkungen zwischen Wirt und Agens bei Magenerkrankungen besser zu verstehen, wurden verschiedene Tiermodelle mit verschiedenen Spezies, wie z. B. gnotobiotisch aufgewachsenen Ferkeln, keimfrei gehaltenen Hunden, Ratten, Gerbils und Mäusen beschrieben (HONDA et al., 1998; KRAKOWKA et al., 1987; RADIN et al., 1990; FOX u. LEE, 1997). Die Gastritis, die von H. pylori in den meisten dieser Modelle induziert wurde, zeigte sehr häufig eine lymphozytäre Entzündung, wie sie auch bei Kindern, aber nicht bei Erwachsenen, bei denen sich häufig nach langer Krankheitsgeschichte eine chronisch aktive Gastritis mit Invasion von neutrophilen Granulozyten entwickelt, beobachtet wurde (LEE, 1998). Der mongolische Gerbil stellt ein vielsagendes Modell für eine experimentelle Infektion mit H. pylori dar. Nach einer Infektion mit H. pylori wird bei Gerbils eine polymorphkernige Gastritis induziert, die sich zu einem gastrischen Ulkus, mit präneoplastischen Läsionen und u. U. Magenadenokarzinom entwickeln kann (HONDA et al., 1998). Das H. pylori Maus-Modell, wurde sowohl für Vaccine-, als auch für Pathogenesestudien genutzt (LEE et al., 1997). Für die Erforschung der verschiedenen Mechanismen, die für die Literaturübersicht 36 Entwicklung von Magenerkrankungen in Frage kommen und für mögliche Formen neuer Therapieansätze konnten diese Tiermodelle erfolgreich eingesetzt werden. Letztendlich sind die Wechselwirkungen zwischen Wirtsimmunität, Virulenzfaktoren und die daraus resultierende Krankheitsentstehung schwierig einzuschätzen, da keines der Modelle eine Erkrankung bei Tieren nach natürlicher Infektion darstellt (ESTEVES et al., 2000). Eine natürliche Infektion wurde bis jetzt nur bei domestizierten Katzen und Makaken festgestellt (DUBOIS, 1998). Bei einer Studie über die Auswirkungen einer H. pyloriInfektion bei Katzen, die über einen längeren Zeitraum andauerte, wurde festgestellt, daß die Verteilung der Läsionen bei Mensch und Katzen sehr ähnlich sind, mit schwerwiegenderen Veränderungen im Magenantrum und leichteren in Kardia und Korpus (FOX et al., 1995a; ESTEVES et al., 2000). Bei Mensch und Katze war auffällig, daß trotz der Ähnlichkeiten beim Grad der Kolonisation von H. pylori in verschiedenen Bereichen des Magens, die Intensität der Entzündung im Antrum wesentlich stärker war als in anderen Bereichen. Unterschiede zeigten sich im Bereich der Kardia, wo beim Menschen der Entzündungsgrad dem des Antrums ähnelte, während sich bei der Katze, wie auch bei Kindern, die Läsionen im Antrum wesentlich schwerwiegender als in der Kardia darstellten. Bei der Katze stellt man vornehmlich eine mononukleäre Einwanderung ohne Ulkusbildung fest, bei Erwachsenen beobachtet man eher eine neutrophile Reaktion mit Beteiligung von Lymphozyten. Auch bei Katzen konnte, wie beim Menschen bei chronischer Infektion, eine deutliche Mukusatrophie und eine Dysplasie des Antrums nachgewiesen werden. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit zum Menschen stellen diese Befunde, kombiniert mit Zellproliferation und Apoptosis in Bereichen mit schwerer chronischer Gastritis bei länger infizierten Katzen, ein passendes Modell für die Entwicklung von Magenkrebs dar (ESTEVES et al., 2000). Eigene Untersuchungen 3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material und Methode 3.1.1 Untersuchungsmaterial 37 In der Zeit von Januar 1998 bis Juni 1999 kamen 100 (Tab. 3) frisch verstorbene und euthanasierte Katzen zur Untersuchung, die von verschiedenen Tierärzten aus dem Raum Göttingen zur Verfügung gestellt wurden. Die Katzen wurden höchstens 4 Stunden nach Eintritt des Todes seziert, dabei wurde der Magen entnommen und unter sterilen Bedingungen aus 3 verschiedenen Lokalisationen (1, 2 und 3, Abb. 2) Magenschleimhautproben von durchschnittlich 0,3-0,5 mm² gewonnen. Abb. 2: Darstellung des eröffneten Magens mit Biopsieentnahmestellen (nach LEE et al., 1992a) Eigene Untersuchungen 38 Für die molekularbiologische Untersuchung wurden die Proben vorübergehend bei –80 °C in Eppendorftubes gelagert. In 2,5%igem Glutaraldehyd und 4%igem Formaldehyd (s. Anhang) wurden die Proben für die elektronenmikroskopische und histologische Untersuchung fixiert und bei 4 °C aufbewahrt. Tab. 3: Rasse, Alter, Geschlecht, Todesursache und Erkrankung der biopsierten Katzen Nr. Rasse Alter Geschlecht Todesurs. Erkrankung 1 EKH 7 J. männl. Euthanasie Lebertumor 2 EKH 5 J. männl. Euthanasie Inappetenz, Kachexie 3 EKH 9 Mon. weibl. Euthanasie Nierenversagen 4 Brit. Kurzh. 3 J. weibl. Euthanasie FIP 5 EKH 5 J. weibl. Euthanasie Nierenversagen 6 EKH 6 Mon. weibl. Euthanasie FIP, FIV 7 EKH 12 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 8 EKH adult männl. Euthanasie Unfall, WS-Fraktur 9 EKH 8 Woch. weibl. Unfall Leberblutung 10 EKH 1 J. männl. Euthanasie Lebertumor 11 Perser adult männl. Euthanasie Leber-, Gekrösetumor 12 EKH > 10 J. weibl. Euthanasie Kiefersperre 13 EKH >10 J. männl. Euthanasie Leukose 14 EKH 13 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 15 EKH 15 J. männl. Euthanasie chron. Durchfall 16 EKH 6 Mon. weibl. Unfall Blutungen 17 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Ascites, Leberdegeneration 18 EKH > 10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 19 EKH > 10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 20 EKH > 10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 21 EKH > 10 J. männl. Euthanasie FIP 22 EKH adult männl. Euthanasie Mammatumor 23 EKH adult weibl. Euthanasie Darmtumor 24 EKH adult weibl. Unfall Blutungen, Fraktur 25 EKH > 10 J. männl. Euthanasie FIP 26 EKH adult männl. Euthanasie Blutungen 27 EKH adult weibl. Unfall Blutungen 28 EKH 9 Mon. männl. Euthanasie FIP 29 Perser adult weibl. Euthanasie FIP 30 EKH adult weibl. Euthanasie Anorexie, Leberdegeneration Eigene Untersuchungen 31 EKH adult männl. Euthanasie Ballengeschwüre 32 EKH > 10 J. männl. Euthanasie Lungentumor 33 EKH > 10 J. weibl. Euthanasie offene Fraktur 34 EKH adult männl. Euthanasie WS-Fraktur 35 EKH adult männl. Kardiomyo- Kardiomyopathie, pathie Lungenödem 36 EKH adult weibl. Euthanasie Hautveränderungen 37 EKH adult männl. Euthanasie Nierenversagen 38 EKH adult weibl. Pleuralerguß Pleuralerguß 39 EKH 14 J. männl. Schock FIP 40 EKH adult männl. Euthanasie Leberentzündung 41 EKH adult weibl. Euthanasie Aggression 42 EKH >10 J. männl. Euthanasie LeberLungenveränderungen 43 Perser adult weibl. Euthanasie multiple Tumoren 44 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Leber-, Nierenversagen 45 EKH >10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 46 EKH adult weibl. Schock Kippfenstersyndrom 47 EKH >10 J. männl. Euthanasie Pankreasinsuffizienz 48 EKH >10 J. männl. Euthanasie Mammatumor mit Metastasen 49 EKH adult männl. Euthanasie Kardiomyopathie 50 EKH 23 J. weibl. Euthanasie Pleural-, Abdominalerguß 51 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Mammatumor 52 EKH adult weibl. Unfall Schädelbruch 53 EKH 10 Wo weibl. Septikämie Abszeß, Septikämie 54 EKH adult männl. Euthanasie FLUTD 55 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Leberdegeneration 56 EKH >10 J. männl. Schock FIP 57 EKH 4 J. weibl. Euthanasie Epilepsie 58 EKH >10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 59 EKH adult weibl. Euthanasie Unfall, Nierenquetschung 60 EKH >10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 61 EKH adult weibl. Euthanasie Mammatumor mit Metastasen 62 EKH adult männl. Euthanasie FIV 63 EKH adult weibl. Euthanasie Lymphosarkom 64 EKH adult weibl. Euthanasie Nierenversagen 65 EKH adult männl. Euthanasie FIV 66 EKH adult männl. Euthanasie Harnröhrenobstruktion 39 Eigene Untersuchungen 67 EKH 1,5 J. männl. Herzversagen in Narkose verstorben 68 EKH >10 J. männl. Euthanasie Septikämie 69 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Nierenversagen, Tumor 70 EKH >10 J. männl. Euthanasie Nierenversagen 71 EKH adult männl. Euthanasie FIP 72 EKH adult männl. Euthanasie FIP 73 EKH adult weibl. Euthanasie Unfall 74 EKH adult männl. Euthanasie Unfall 75 EKH >10 J. männl. Nierenversagen Tumor, Nierenversagen 76 EKH >10 J. männl. Euthanasie FIP 77 Perser >10 J. männl. Euthanasie Lebertumor, Nierenversagen 78 EKH adult weibl. Euthanasie Epilepsie 79 EKH >10 J. männl. Euthanasie ZNS-Störung 80 EKH adult weibl. Euthanasie Tetanus 81 EKH adult männl. Euthanasie Leukose 82 EKH adult weibl. Euthanasie FIP 83 EKH 5 J. weibl. Schock Schock 84 EKH adult weibl. Erguß Pleural-, Pericarderguß 85 Perser adult weibl. Euthanasie Nierenversagen 86 EKH adult weibl. Unfall multiple Frakturen 87 Siam 8 J. männl. Euthanasie Chylothorax 88 EKH 6 Wo. männl. Euthanasie Mißbildung 89 EKH 6 Wo. weibl. Euthanasie ZNS-Störung 90 EKH adult weibl. Euthanasie Räude 91 EKH adult männl. Euthanasie Chronische Rhinitis 92 EKH adult weibl. Euthanasie Leberdegeneration 93 EKH adult weibl. Euthanasie Nierenversagen 94 EKH 7 Wo. männl. Euthanasie Rhinitis, Parasitose 95 Maine Coon 15 J. weibl. Euthanasie Leberdegeneration 96 EKH >10 J. männl. Euthanasie Lungentumor 97 EKH >10 J. weibl. Euthanasie Leberdegeneration, Nierenversagen 98 EKH adult männl. Euthanasie FIP 99 EKH adult weibl. Euthanasie FIV 100 EKH >10 J. männl. Unfall Blutungen 40 Eigene Untersuchungen 3.1.2 41 Bakteriologisch-kulturelle Untersuchung auf H. pylori Für die kulturell-bakteriologische Untersuchung wurde die Schleimhautoberfläche der Proben mit einem sterilen Skalpell in etwa 0,05-0,1 mm großen Abständen in alle Richtungen eingeschnitten. Dann wurde die neu geschaffene Oberfläche auf H. pylori-Selektivnährböden nach WARRELMANN und HAHN (1987) (Fa. Oxoid, Wesel) aufgetragen und Verdünnungsausstriche angeschlossen. Diese Platten wurden für 5-7 Tage bei 37° C in Anaerobiertöpfen (Fa. Oxoid, Wesel) bei einer mikroaeroben Atmosphäre, die durch Zugabe von entsprechenden Begasungsbeuteln (Campygen Beutel, Fa. Oxoid, Wesel) erzeugt wurde, bebrütet (Brutschrank Fa. Ehret, Emmendingen). Bei der Auswertung wurden H. pylori verdächtige Kolonien mikroskopisch und biochemisch untersucht. Nativpräparate der Bakterien wurden mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskopes bei 1000-facher Vergrößerung auf Beweglichkeit und Erscheinungsform überprüft. Für in der Gramfärbung als negativ beurteilte, bewegliche und gebogene, spiralige oder gewundene Stäbchen erfolgte eine weiterführende biochemische Differenzierung. Die Ureasereaktion von H. pylori galt als positiv, wenn das suspendierte Koloniematerial in einem Reagenzröhrchen mit 1 ml Urease-Reagenz (Fa. Oxoid, Wesel) innerhalb von 60 Minuten zu einem Farbumschlag von gelb nach violett führte (CHRISTENSEN, 1946; MASLEN, 1952; OWEN et al., 1985). Die Katalasereaktion von H. pylori wurde als positiv bewertet, wenn das eingeriebene Koloniematerial in 3%iger Wasserstoffperoxidlösung (Oxysept 1, Fa. Pharm-Allergan, Ettlingen) innerhalb von wenigen Sekunden Bläschen bildete. Zur Beurteilung der Oxidasereaktivität wurde Oxidasereagenz (Fa. Merck, Darmstadt) auf ein mit der Bakterienkolonie verriebenes Filterpapier getropft. Bei einer Verfärbung nach dunkelblau-violett innerhalb von 10 Sekunden galt die Reaktion als positiv. Auf die kulturelle Anzüchtung von H. felis und H. heilmannii wurde verzichtet, da eine Anzüchtung aus Gewebe nicht immer möglich ist und die Kultivierung aufgrund der Empfindlichkeit der Keime als sehr schwierig gilt (HANDT et al., 1994). Eigene Untersuchungen 3.1.3 42 Molekularbiologische Untersuchung auf H. pylori, H. felis und H. heilmannii Um die molekularbiologischen Untersuchungen durchführen zu können, wurde zunächst die gesamte genomische DNA aus den Magenschleimhautproben isoliert und gereinigt. Anschließend wurde eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt, um darin enthaltene Helicobacter-DNA nachzuweisen. Dabei wurde ein jeweils für H. pylori, H. heilmannii und H. felis spezifisches DNA-Fragment amplifiziert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches ist das amplifizierte, spezifische Fragment als Bande zu erkennen. Außerdem wurde zum Nachweises eine Nachweis von H. pylori Polyacrylamidgelelektrophorese aufgrund der höheren Spezifität des mit anschließender Silberfärbung durchgeführt. Bei jeder Reaktion wurden Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt. 3.1.3.1 Isolierung genomischer DNA aus Gewebeproben Die Isolierung und Reinigung der Magenschleimhautproben erfolgte mit dem DNeasy™ Tissue Kit (Fa. Qiagen, Hilden). Durch dieses Verfahren kann in einem Schritt das Schleimhautgewebe gelöst, die DNA isoliert und von Verunreinigungen befreit werden. Die Proben werden dabei lysiert und dann in einen Filter mit Membran überführt, an den die DNA bindet, die restlichen Schritte werden an einem Filter durchgeführt, in dem die Puffer filtriert und dann jeweils mit dem Auffanggefäß verworfen werden. Die in Eppendorfreaktionsgefäßen eingefrorenen Magenschleimhautproben wurden angetaut, mit 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Proteinase K versetzt und dann über Nacht im Wasserbad (Fa. Köttermann, Schütt, Göttingen) bei 55° C inkubiert, um das Gewebe zu lösen. Nach der Inkubationszeit wurden dem Gemisch 200 µl AL-Puffer und 210 µl Äthanol zugesetzt, das Ganze wurde kurz geschüttelt und dann zentrifugiert. Die Lösung wurde in eine spezielle Filtersäule mit Auffanggefäß umgefüllt und dann bei 600 Umdrehungen 2 min. zentrifugiert. Der flüssigkeitsgefüllte Auffangbehälter wurde verworfen (DNA befindet sich im Filter) und durch einen neuen ersetzt. Es folgten zwei weitere Zugaben von Puffer (AW-Puffer 1 und 2) mit jeweiliger Zentrifugation und Verwerfen der Auffangbehälter und ein Durchgang ohne Eigene Untersuchungen 43 Zugabe von Reagenzien, um die restliche Flüssigkeit aus dem Filter zu entfernen. Zuletzt wurden 100 µl auf 65° C erhitzter AE-Puffer zugegeben und noch einmal 2 min. bei 600 Umdrehungen zentrifugiert, nachdem der Filter mit der DNA auf ebenfalls erhitzte Eppendorfgefäße gesetzt wurde. Durch den letzten Vorgang wird die DNA aus dem Filter herausgelöst und gelangt in das Eppendorfgefäß. 3.1.3.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Um Amplifikationen unerwünschter DNA-Abschnitte zu vermeiden, wurden sehr spezifische Primerpaare ausgesucht (Tab. 4), diese sollten möglichst nur an die entsprechende Bakterienart binden, am 5´ Ende mit Guanin/Cytosinbasen beginnen und insgesamt kein zu großes Molekulargewicht aufweisen. Diese Anforderungen erfüllten die Primerpaare für H. heilmannii von NEIGER et al. (1998), für H. pylori und H. felis wurden geeignete Primerpaare (Fa. MWG Biotech, Ebersberg) mit dem Computerprogramm primer v 1.0 ermittelt (Richard Resnick, Ashland, MA, 1996). Tab. 4: Urease B Basensequenz der verwendeten Primerpaare Spezies Sequenz H. heilmannii F, 5`-CTA GCC AAA CAA CGC AAA G-3` Amplifikatlänge (bp) 580 R, 5`-CTT TTT TGG TGA TGT TGC G-3` H. pylori F, 5`-GCG AGA CGT GGT AAA AAG AC-3´ 1024 R, 5`-CTG TAG GGA TTT GTT GGG G-3` H. felis F, 5`-CCC TCA GCC CGT CTA TTA C-3` R, 5`-CAA CGC GGT ATA AAA CAC G-3` 416 Eigene Untersuchungen 44 Ein Standardansatz enthielt in 160 µl Gesamtvolumen je 1000 pmol Primer (100 pmol/µl), 10 µl Puffer (s. Anhang) und 130 µl Aqua ad injectabulum. 32 µl dieser Lösung wurden zu einem PCR-Bead gegeben (s. Anhang) und 8 µl von dieser Lösung mit 5 µl der gereinigten DNA-Lösung vermischt. 2 Tropfen Öl überschichteten das Ganze. Im Thermocycler (Omnie Gene, Fa. Hybaid Limited, Großbritannien) erfolgte die Amplifikation (Tab. 5): Tab. 5: Temperaturen und Zyklenanzahl für die Amplifikation H. heilmannii H. felis H. pylori 94° C 3 min 95° C 10 min 95° C 10 min 57° C 2 min D 72° C 3 min 94° C 30 sek 95° C 30 sek 95° C 30 sek 57° C 30 sek 31 Zyklen 55° C 30 sek 72° C 1 min 72° C 30 sek 72° C 30 sek 72° C 5 min 72° C 10 min 72° C 10 min 40 Zyklen 60° C 30 sek D 40 Zyklen A P D: Denaturierung A: Annealing P: Polymerisation 3.1.3.3 Agarosegelelektrophorese Es wurden 2%ige Agarosegele zur gelelektrophoretischen Auftrennung verwendet. 1 g GibcoAgarose (Fa. Gibco BRL Life technologies, Schottland) wurden mit 49 ml 0,5 x TBE-Laufpuffer vermischt und unter Aufkochen gelöst. Nach Abkühlen auf 50-60° C wurden 5 µl einer Dimidiumbromid-Lösung (12 mg/ml) (Fa. Merck, Darmstadt) darunter gemischt. Diese Lösung wurde daraufhin in eine entsprechende Gelform gegossen, mit einem passenden Kamm zur Entstehung der gewünschten Taschen versehen und eine halbe Stunde bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach Erstarren des Geles wurde der Kamm entfernt und das Gel in einer Elektrophoresekammer (Fa. MWG Biotech, Ebersberg) mit 0,5 x TBEPuffer bedeckt. Jeweils 20 µl der DNA-Lösung wurden mit dem Auftragpuffer Orange-G Eigene Untersuchungen 45 versetzt und in die Vertiefung des Gels gegeben. Als Längenmarker eignete sich eine 1KbLeiter (1 Kb DNA ladder, 1000 µg, Fa.Gibco, BRL). Bei einer Spannung von 120 Volt (Power Supply für Elektrophorese EPS 3500, Fa. Pharmacia Biotech, Freiburg) und 30 min. Dauer erfolgte die Elektrophorese. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung des Reaktionsgemisches konnte das gewünschte DNA-Fragment mit Hilfe des fluoreszierenden, in die DNA eingelagerten Dimidiumbromids bei 312 nm oder 366 nm auf einem UV-Transilluminator (Fa. Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen) als Bande sichtbar gemacht werden. Zur Dokumentation wurden die Gele mit einer CCD-Kamera (Fa. Stratagene, Heidelberg) aufgenommen und die Bilder über einen Videoprinter ausgedruckt. 0,5 TBE-Laufpuffer: 6,05 g Tris 2,57 g Borsäure 0,186 g EDTA ad 1000 ml H2O bidest Orange G Laufpuffer: 0,5 % Orange G (Fa. Sigma, USA) 15,0 % Ficoll 400 (Fa. Merck, Darmstadt) 84,5 % H2O 3.1.3.4 Hochauflösende Gelelektrophorese zum Nachweis von H. pylori Um die negativen Ergebnisse des H. pylori-Durchgangs zu bestätigen, wurde zusätzlich zu den herkömmlichen Agarosegelen noch stichprobenartig für 40 Proben eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Silberfärbung, die bis zu 5-fach empfindlicher als die Dimidiumbromidfärbung reagiert, durchgeführt. Dabei wurde der gleiche Versuchsansatz für die PCR gewählt. Eigene Untersuchungen 46 Zwei Glasscheiben (41x33 und 39x33 cm) wurden sorgfältig gereinigt, getrocknet und, durch zwei 0,4 mm dicke Spacer getrennt, aufeinandergelegt. Ein Klebeband dichtete die beiden Glasplatten am Ende ab. Die Gellösung wurde zwischen die beiden Platten gegossen und ein Sägezahn-Kamm dazwischen geschoben. Nach zwei Stunden war das Gel auspolymerisiert. 5 µl der Proben wurden nach der PCR mit 5 µl Stop Solutio und 5 µl SDS EDTA versehen, für 10 min. auf 95° C erhitzt, auf Eis gestellt und dann in die vorgefertigten Taschen des Gels gegossen, nachdem der Kamm entfernt und das Gel mit den Glasscheiben in der entsprechenden Elektrophoresekammer justiert worden war. Nach Auffüllung der Kammer mit 1 x TBE-Laufpuffer und Anschluß an die Elektroden erfolgte die Elektrophorese bei 120 Volt. Nach 4,5 Stunden wurde der Vorgang mindestens eine halbe Stunde in 7%igem Eisessig gestoppt. Es folgte 3maliges Waschen in Wasser, ein 30minütiges Bad in einer Silbernitrat/Formaldehydlösung, 1maliges Waschen in Wasser und dann Gelentwicklung auf Eis. Bei Erscheinen der Banden erfolgte wieder ein Stop mit 7%igem Eisessig. Das Gel konnte dann, in Alkohollösung fixiert und in Folie eingelegt, archiviert werden. Gellösung: APS 10%: SDS-EDTA : TBE 10x 625 µl H2O 3,5 ml Acrylamidlösung 2,1 ml Tetramethylethylenediamine 8,3 µl APS 10% 31,5 µl Ammoniumperoxodisulfat 0,5 g Aqua dest 5,0 ml SDS 20% 5,0 µl EDTA 0,2 M, pH 8,0 5,0 µl Aqua dest. 945 µl Eigene Untersuchungen Stop Solutio: Bromphenol Blue 10 EDTA 0,2 M, pH 8,0 250 µl Formamid 5,0 Silbernitrat/Formaldehydlösung: 47 µg ml 200 ml Silbernitratlösung 400 µl 37% Formaldehydlösung Gelentwicklung: 200 ml Natriumcarbonat 400 µl 37% Formaldehyd 31,2µl Moderatorlösung Moderatorlösung: 10 mg Natriumthiosulfat ad 1,0 ml H2O Bei jeder PCR wurden, soweit möglich, zusätzlich zu den Proben Positiv- und Negativkontrollen mitgeführt. Für H. pylori wurde als Kontrollstamm und Positivkontrolle ein vom staatlichen Medizinaluntersuchungsamt Göttingen zur Verfügung gestellter Stamm verwendet, der aus einem Magenbioptat eines Menschen isoliert worden war. Nach Anzüchtung wurden die Bakterienkolonien, ebenso wie die von H. felis, jeweils mit physiologischer Kochsalzlösung von den Agarplatten abgeschwemmt und dann mit dem Gewebekit (Fa. Qiagen, Hilden) (s. 3.1.3.1) gereinigt und isoliert. Für H. felis wurden freundlicherweise von Frau Dr. Seidel vom Lehrstuhl für Tierhygiene, Technische Universität München, Spezialagarplatten mit angezüchteten Kolonien, die originär von Adrian Lee und Jani O`Rourke stammen, zur Verfügung gestellt. Da H. heilmannii bis jetzt erst einmal (ANDERSEN et al., 1999) auf Nährböden angezüchtet wurde, existierte auch keine genomische DNA, die für Positivkontrollen hätte eingesetzt werden können. Deshalb wurden verdächtige Signale, die nach der Untersuchung von Probenmaterial entstanden waren, sequenziert, d. h., die gefundene DNA-Sequenz wurde mit der Sequenz der H. heilmannii-DNA verglichen. Dafür wurden die Banden des Gels bei Eigene Untersuchungen 48 580 bp unter UV-Licht sichtbar gemacht und mit einem Skalpell herausgeschnitten. Mit einem spezifischen Gelkit (Qiaex, Fa. Qiagen, Hilden) wurde die DNA dann aus dem Gel isoliert und gereinigt. Qiaex: 1. herausgestanztes Gelstück mit dreifacher Volumeneinheit QX 1 und 10 µl QX 2 mischen, 10 min. bei 50° C inkubieren und gelegentlich schütteln 2. 30 sec. zentrifugieren, Überstand abgießen 3. mit 500 µl QX 1 mischen, schütteln, 2-3 min. bei 50° C inkubieren 4. zentrifugieren, Überstand abgießen 5. mit 500 µl PE 1 mischen, schütteln, 6. zentrifugieren, Überstand abgießen 7. Schritt 5. und 6. wiederholen 8. 10 min. trocknen 9. 20 µl TE zugeben 10. 5 min. bei 50° C inkubieren 11. zentrifugieren TE: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1,0 mM EDTA (pH 8,0) Im Überstand befindet sich die DNA. Ebenso wurden für die positiven Befunde von H. pylori und H. felis zur Kontrolle Sequenzierungen durchgeführt. 3.1.4 Histologische Untersuchungen 3.1.4.1 Anfertigung von Gewebeschnitten für die Histologie und Immunhistologie Für die morphologische Untersuchung wurden die Gewebeproben sofort nach Zuschnitt bis zur Präparation in 4%iger gepufferter Formaldehydlösung (s. Anhang) fixiert. Vor der Eigene Untersuchungen 49 Einbettung wurde das Gewebe makroskopisch beurteilt und geeignet zugeschnitten. Die Entwässerung und Einbettung der Präparate in Paraplast erfolgte mit Hilfe eines Gewebeeinbettungsautomaten (Hypercenter XP, Fa. Shandon, Frankfurt). Dabei erfolgte zunächst eine ca. zweistündige Wässerung der Proben mit entmineralisiertem Wasser bei Raumtemperatur. Danach wurden die Proben jeweils eine Stunde zunächst bei aufsteigenden Äthanolkonzentrationen (50%ig, 70%ig, 80%ig, 96%ig, 96%ig) und anschließend zweimal in Isopropanol bei 36° C entwässert. Als Zwischenmedium zur Paraplasteinbettung diente Chloroform, in dem die Proben zweimal für je eine Stunde bei Zimmertemperatur unter Vakuum lagen, bevor das Material zweimal für je zwei Stunden bei 60° C im Vakuum in Paraplast überführt wurde. Die Schnittherstellung erfolgte mit einem Schlittenmikrotom (Schlittenmikrotom HM 400R, Fa. Microm, Walldorf, FRG). Dabei wurden die ca. 4 µm dicken Paraplastschnitte in einem 42° C warmen Wasserbad gestreckt und auf Objektträger aufgezogen. Die Präparate zur lichtmikroskopischen Beurteilung wurden mit Hämalaun-Eosin (s. Anhang) in einem Färbeautomaten (Varistain, Fa. Shandon, Frankfurt, FRG) gefärbt. Unmittelbar nach der Herstellung wurden alle Paraplastschnitte über Nacht bei 37° C in einem Wärmeschrank getrocknet. 3.1.4.2 Immunhistologische Reaktionen Zur Darstellung des eingesetzten Antikörpers wurde die Streptavidin-Biotin-KomplexMethode (SABC) angewendet. Um unspezifische Bindungen zwischen Sekundärantikörper und Gewebeantigenen zu unterdrücken, erfolgte zunächst eine Inkubation der Gewebeproben mit Normalserum derjenigen Spezies, von der der Sekundärantikörper stammt. Hierzu wurde das Normalserum unmittelbar vor Gebrauch im Verhältnis 1:5 mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Zusatz von bovinem Serumalbumin verdünnt. Als Primärantikörper wurde ein Antikörper gegen H. pylori (NCL-H-Pylori, Fa. Novocastra) in einer Verdünnung von 1:250 verwendet, der sowohl mit H. pylori wie auch mit H. felis und H. heilmannii reagiert. Der Nachweis antigener Strukturen erfolgte mit Hilfe des zweistufigen Detektionssystems StreptAB-Komplex/HRP-Duett-Kit Diagnostika, Hamburg). (Kat.-Nr. K 492, Fa. Dako Eigene Untersuchungen 50 Als Sekundärantikörper enthält dieser Kit einen biotinylierten Ziegenantikörper, der sowohl mit Maus- wie auch mit Kaninchenimmunglobulinen reagiert. Nach Inkubation mit diesem Sekundärantikörper wird anschließend biotinylierte Meerrettichperoxidase und Streptavidin hinzugefügt, die beide frisch nach Anweisung des Herstellers angesetzt wurden. Als Chromogen dient Diaminobenzidin (DAB), das eine braune Farbreaktion hervorruft. Bei der immunhistochemischen Reaktion wurden Kontrollschnitte mitgeführt, mit denen das Auftreten unspezifischer Bindungen ausgeschlossen werden kann. Zur Herstellung der Negativkontrollen wurde anstelle das Primärantikörpers PBS verwendet, um unspezifische Bindungen des Sekundärantikörpers auszuschließen. Als Positivkontrolle für den Nachweis des Helicobacter-Antigens wurden Magenschnitte von nachweislich Helicobacter-positiven Tieren mitgeführt. Die Durchführung der Streptavidin-Biotin-Komplex-Methode erfolgte nach folgendem Muster: 1. Aufziehen der Gewebeschnitte auf beschichtete Adhäsionsobjekträger. 2. Entparaffinieren der Schnitte für je 10 min. in Xylol-1 und Xylol-2. 3. Rehydrieren für je 4 min. in absteigender Alkoholreihe bis in Aqua dest. 4. Inkubation für 5 min. in Citratpuffer-Gebrauchslösung (s. Anhang); 250 ml weiterer Citratpuffer werden in der Mikrowelle zum Kochen gebracht. Schnitte darin 2 x 5 min. kochen; nach den ersten 5 min. wird der Flüssigkeitsverlust mit heißem Citratpuffer ersetzt. Abkühlen der Schnitte in Citratpuffer bei Raumtemperatur für ca. 20 min. 5. Inaktivierung der endogenen Peroxidase mit 1,5%iger Wasserstoffperoxidlösung (190 ml Aqua bidest. + 10 ml H2O2); Inkubation der Schnitte bei Raumtemperatur für 30 min. 6. 2x Spülen der Schnitte in TRIS-Puffer + 2 % Milchpulver; Schnitte vorsichtig trocken tupfen und mit PAP-Pen umranden. 7. Inkubation der Schnitte in der feuchten Kammer bei Raumtempartur mit 1:5 durch PBS verdünntem Ziegenserum für 20 min. 8. Normalserum dekantieren und Auftragen des Primärantikörpers in Gebrauchsverdünnung; Inkubation der Schnitte über Nacht in der feuchten Kammer. der Eigene Untersuchungen 9. 51 Spülen der Schnitte 2 x 5 min. in TRIS-Puffer + 2 % Milchpulver. 10. Auftragen des biotinylierten Sekundärantikörpers in der Gebrauchsverdünnung; Schnitte für 20 min. in der feuchten Kammer inkubieren. 11. Spülen der Schnitte 2 x 5 min. in TRIS-Puffer + 2 % Milchpulver. 12. Auftragen des StreptAB-Komplexes in der Gebrauchsverdünnung; Schnitte für 20 min. in der feuchten Kammer inkubieren. 13. Spülen der Schnitte 2 x 5 min. in TRIS-Puffer. 14. Schnitte in DAB-Gebrauchslösung für 7 min. inkubieren. 15. Spülen der Schnitte 2 x 5 min. in TRIS-Puffer. 16. Spülen der Schnitte 2 x 5 min. in Leitungswasser. 17. Gegenfärben der Schnitte in frisch filtriertem Hämalaun für 1 min.; 30 sek. spülen in Aqua dest. 18. Bläuen der Schnitte 10 min. unter fließendem Leitungswasser. 19. Dehydrieren der Schnitte für je 4 min. in aufsteigender Alkoholreihe; abschließend je 5 min. in Xylol-1 und Xylol-2. 20. Eindecken der Schnitte mit Eukitt. 3.1.4.3 Auswertung und Dokumentation der durchgeführten histologischen Reaktionen Die Auswertung der immunhistochemischen und pathohistologischen Färbungen erfolgte lichtmikroskopisch unter einem Standard-Biokular-Lichtmikroskop "Axioskop" (Fa. Carl Zeiss, Oberkochen). Für die pathohistologische Untersuchung wurden für die drei Magenabschnitte (Kardia, Korpus/Fundus, Antrum/Pylorus) vier Entzündungsgrade eingeteilt: 0: keine vermehrten Entzündungszellansammlungen I: schwache, diffuse Infiltration von Entzündungszellen II: vermehrte Ansammlung von Entzündungszellen, z. T. Follikelanbildung III: hochgradige Ansammlung von Entzündungszellen, Lymphfollikel unterschiedliche Eigene Untersuchungen 52 Für die immunhistologischen Diagnosen wurde zunächst in der Übersichtsvergrößerung die Anzahl der positiven Reaktionen der einzelnen Antikörper ausgewertet. Sie wurden wie folgt semiquantitativ ausgewertet: 0: kein Nachweis von Bakterien 1: geringgradiger Nachweis von Bakterien 2: mittelgradiger Nachweis von Bakterien 3: hochgradiger Nachweis von Bakterien Zusätzlich wurde die Verteilung der Bakterien im Magenschleim, den Magengrübchen und -drüsen beurteilt. 3.1.5 Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung In der elektronenmikroskopischen Untersuchung wurde die Ultrastruktur der Bakterien genauer untersucht. Dafür wurden die Gewebeproben in 2,5%igem, phosphatgepuffertem Glutaraldehyd fixiert und bei 4° C aufbewahrt. Die Einbettung in einem EPON-Gemisch nach LUFT (1961, siehe Anhang) erfolgte im Lynx Einbettautomaten (Fa. Leica, Bensheim) nach folgendem Protokoll: 1. Spülen in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,6) über 1 Stunde (2x Pufferwechsel) bei 4° C. 2. Nachfixieren in 1%igem Osmiumtetroxid in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,6) für 2 Stunden bei 4° C. 3. Dehydrieren in einer aufsteigenden Äthanolreihe (5 Stufen, je Stufe 30 min.), Isopropanol (30 min.). 4. Propylenoxid als Intermedium 2 x 30 min. bei 4° C. 5. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 2:1 für 2 Stunden bei 10° C. 6. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:1 für 2 Stunden bei 10° C. 7. Infiltration mit Propylenoxid-Epon 1:2 für 4 Stunden bei 10° C. 8. Infiltration mit reinem Epon für 4 Stunden bei 20° C. 9. Infiltration mit reinem Epon für 24 Stunden mit 2x Wechsel des Epons bei 20° C. 10. Infiltration in reinem Epon für 4 bis 6 Stunden. Eigene Untersuchungen 53 Die Proben wurden in Flacheinbettungsformen aus Silikongummi derartig eingebettet, daß beim Anschnitt der Epon-Blöckchen der Schleimhautquerschnitt getroffen wird. Dazu mußte das Biopsiematerial unter Zuhilfenahme einer Stereolupe (Fa. Leica, Bensheim) mit der Schleimhautoberfläche nach oben weisend ausgerichtet und so in den Flacheinbettungsformen positioniert werden. Es schloß sich eine 24-stündige Polymerisation des Epoxidharzes im Wärmeschrank bei 60° C an. Die auspolymerisierten Epon-Blöckchen wurden zunächst mit einer Fräse (Reichert Ultratrim, Fa. Leica, Bensheim) auf Biopsiegröße zugetrimmt. Von diesen Blöcken wurden am Ultramikrotom (Reichert Ultracute, Fa. Leica, Bensheim) unter Verwendung von Glasmessern 0,5 µm dicke Semidünnschnitte angefertigt. Die dazu benötigten Glasmesser wurden mit Hilfe eines "Knifemakers" (Reichert Knifemaker, Fa. Leica, Bensheim) hergestellt. Anschließend wurden die Semidünnschnitte auf einer Wärmebank nach RICHARDSON et al. (1960, siehe Anhang) gefärbt, mit Eukitt eingedeckt und sowohl lichtmikroskopisch beurteilt als auch zur Vororientierung für das Anfertigen von Ultradünnschnitten genutzt. Nach Auswertung und Anfertigung einer Skizze der Lokalisation, die anschließend im Transmissionelektronenmikroskop genauer beurteilt werden sollte, schloß sich eine weitere Zutrimmung der Blöcke per Hand an. Am oben genannten Ultramikrotom wurden unter Verwendung eines Diamantmessers (Fa. Diatome, Bienne, Schweiz) von den zugetrimmten Blöcken 50-80 nm dicke Ultradünnschnitte geschnitten, die auf Kupferobjektträgernetze bzw. Lochblenden (single slot 1 x 2, Fa. Science Services, Seelze) aufgefangen wurden und anschließend per Hand mit Uranylacetat und Bleicitrat kontrastiert wurden. Die transmissionselektronenmikroskopische Auswertung erfolgte am ZEISS- Elektronenmikroskop (EM 10 C, Fa. Zeiss, Oberkochen) bei einer Grundvergrößerung von 2.500 bis 20.000-fach und 60 kV. Zur Fotodokumentation wurde Planfilmmaterial 6,5 x 9 cm (Fa. Agfa, Leverkusen) verwendet. Ergebnisse 54 4 Ergebnisse 4.1 Auswertung des Vorberichtes und der pathologischen Untersuchung Es wurden von jeweils 100 Katzen (Tab. 3, Kap. 3.1.1) aus drei verschiedenen Regionen (Kardia, Fundus/Korpus und Antrum/Pylorus) Magenschleimhautproben gewonnen und für die mikrobiologische, molekulargenetische und histologische Untersuchung vorbereitet. 54 der untersuchten Katzen waren männlichen, 46 weiblichen Geschlechtes. Das Alter variierte zwischen 6 Wochen und 23 Jahren, häufig konnte das genaue Alter nicht festgestellt werden. Meistens handelte es sich um Europäische Kurzhaarkatzen, selten um Rassekatzen, wie z. B. Perser oder Maine Coon. Bis auf eine (U.-Nr. 15, chronischer Durchfall), wies keine der Katzen vorberichtlich Magen-Darm-Probleme auf. Bei allen 100 sezierten Katzen stellte sich die Magenschleimhaut makroskopisch im Rahmen der Sektion als unverändert heraus. Die meisten Katzen wurden aufgrund chronischer, infauster Erkrankungen, z. T. nach langer Vorbehandlung, euthanasiert. Nur wenige Katzen waren spontan verstorben oder aufgrund einer perakuten Krankheit euthanasiert worden. Häufigste Diagnose waren Tumoren mit 14 %, Nierenversagen mit 19 % und unheilbare Infektionskrankheiten, wie z. B. FIV (Feline Immunschwächevirus), FIP (Feline infektiöse Peritonitis) und Leukose zu 19 %. 4.2 Bakteriologisch-kulturelle Untersuchung auf H. pylori Von allen 100 Katzen wurde jeweils eine Schleimhautprobe aus den drei verschiedenen Magenregionen auf Helicobacter-Selektivnährböden bis zu 7 Tagen bebrütet und dann untersucht. Verdächtige Kolonien wurden nach GRAM gefärbt, nativ betrachtet und auf Oxidase-, Katalase- und Ureasereaktion getestet. Schleimhautproben wurde H. pylori nachgewiesen. In keiner der untersuchten Ergebnisse 55 4.3 Molekularbiologische Untersuchungen 4.3.1 PCR und Agarosegelelektrophorese zum Nachweis der DNA von H. pylori, H. felis und H. heilmannii Die 300 tiefgefrorenen Schleimhautproben wurden für die PCR vorbereitet, die DNA amplifiziert und dann durch die Agarosegelelektrophorese (Abb. 3) sichtbar gemacht. Es wurden Primer für das Urease B Gen von H. heilmannii, H. pylori und H. felis ausgesucht. H. pylori konnte bei keiner Katze in Kardia, Fundus/Korpus oder Pylorus/Antrum nachgewiesen werden. H. felis ließ sich aus der Kardia in 9 % der Fälle, aus Fundus/Korpus zu 12 % und aus Pylorus/Antrum zu 11 % nachweisen. Insgesamt waren 20 % der Katzen mit H. felis infiziert. 84 % der Katzen erwiesen sich als mit H. heilmannii infiziert, dabei wurde H. heilmannii in der Kardia zu 51 %, in Fundus/Korpus zu 63 % und im Pylorus/Antrumbereich in 58 % der Fälle nachgewiesen (Tab. 6). In den meisten Fällen handelte es sich um Doppelinfektionen, nur eine Katze wies nur eine Infektion mit H. felis auf und erwies sich als H. heilmannii negativ. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Abb. 3: PCR-Amplifikate nach gelelektrophoretischer Auftrennung Spur 1 u. 15: 1000 bp-Marker, Spur 2-5: H. heilmannii-DNA, Spur 7-10: H. felis-DNA, Spur 13: H. pylori-DNA, Spur 2-5, 7-9 u. 12 Magenbiopsiematerial, 10 u. 13 Positivkontrollen, 6, 11 u. 14 Negativkontrollen Ergebnisse Tab. 6 : Nachweis von H. felis und H. heilm.-DNA mit Hilfe der PCR Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 H. felis K K K K K - F F F F F F F F F F - H. heilm. P P P P P P - K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K - F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F - P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P - Nr. 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 H. felis K K K K - F F - H. heilm. P P P P P - K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K K - F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F - K: Kardia, F: Fundus/Korpus, P: Pylorus/Antrum positiv, -: kein Nachweis von Helicobacter-DNA P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P P 56 Ergebnisse 4.3.2 57 PCR und Polyacrylamidgelelektropohorese zum Nachweis von H. pylori Um die negativen Ergebnisse für H. pylori zu bestätigen, wurde im Anschluß an die Agarosegelelektrophorese zusätzlich noch eine empfindlichere Methode durchgeführt, in dem stichprobenartig mit 40 Proben für den Nachweis von H. pylori eine Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließender Silberfärbung durchgeführt wurde. Diese Methode ist bis zu 5-fach so empfindlich, wie die Färbung mit Dimidiumbromid nach der Agargelelektrophorese. Auch mit dieser Methode wurde in keinem Magenschleimhautabschnitt DNA von H. pylori nachgewiesen. 4.4 Histologische Ergebnisse 4.4.1 Pathohistologische Diagnosen Das Auftreten von Alterationen in Kardia, Korpus/Fundus und Pylorus/Antrum wurde bei den 100 Tieren über histologische Untersuchungen an H.-E. gefärbten Schnitten festgestellt (Abb. 5b). Histologische Reaktionen variierten von unveränderten Schleimhautbefunden bis zu verschiedenen Graden einer Gastritis. Es wurde der Grad der Gastritis anhand der Infiltration der Tunica mucosa mit Lymphozyten, Plasmazellen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten beurteilt, wobei die letztgenannten als Anzeichen von aktiven Vorgängen gewertet wurden. Um die unterschiedlichen Entzündungsgrade festzuhalten, wurde folgende Einteilung gewählt: 0: o.b.B. I: schwache, diffuse Infiltration von Entzündungszellen in der Lamina propria II: vermehrte Ansammlung von Entzündungszellen, die sich z. T. zu Follikeln zusammenfinden, in der Lamina propria III: hochgradige Ansammlung von Entzündungszellen, Bildung von Lymphfollikeln, sowohl in der Lamina propria, als auch in der Submukosa. Ergebnisse 58 28 Katzen zeigten in keinem Magenabschnitt eine Gastritis, bei 40 Katzen war in einem oder mehreren Magenabschnitten eine mittelgradige bis hochgradige Entzündung nachweisbar, wobei eine hochgradige Signifikanz zwischen dem Grad der Entzündung mehrerer Schleimhautabschnitte bestand (P < 0,024). 32 Katzen zeigten eine geringgradige Entzündung. Eine Katze (Probe 24, Fundus) wies einen geringgradigen Befall mit neutrophilen Granulozyten auf. Bei 37 der untersuchten Katzen kam es zur Ausbildung von Lymphfollikeln (Abb. 5a) in einem oder mehreren Schleimhautabschnitten. 4.4.2 Immunhistologische Reaktionen Der Nachweis oder die Abwesenheit von Bakterien wurde mit Hilfe von markierten Antikörpern, die spezifisch mit Helicobacter-Spezies reagieren, festgestellt. Helicobacter sp. wurden gefunden im Magenschleim (Abb. 4a), in den Magengrübchen, in den Magendrüsen (Abb. 4b), und sowohl im Kardia-, Fundus/Korpus-, als auch im Pylorus/Antrumbereich und variierten in der Dichte von nicht nachweisbar (-) bis zu hochgradigem (3) Befall in Magenschleim und Magendrüsen. Eine Katze wurde als infiziert angesehen, wenn eines der Testergebnisse positiv war. 18 % der Katzen erwiesen sich als negativ, 82 % wiesen entweder H. felis oder H. heilmannii zumindest im Kardia, Fundus/Korpus- oder Antrum/Pylorusbereich oder in mehreren Abschnitten auf (Tab. 7). Nur längliche, gewundene Bakterien, die morphologisch für H. felis oder H. heilmannii sprechen, wurden entdeckt, kurze Stäbchen, wie etwa bei H. pylori, wurden nicht nachgewiesen. Die meisten Bakterien wurden in der Fundusregion gefunden (77 von 100 Katzen), wobei eine Signifikanz in der Besiedlung mehrerer Magenschleimhautabschnitte bestand (P < 0,01). So wurde bei Katzen mit Befall der Pylorusoder/und Fundusschleimhaut oft auch ein Befall in der Kardiaschleimhaut festgestellt. Ergebnisse 59 Tab. 7: Immunhistologischer Nachweis von H. felis und H. heilm. und korrespondierende Entzündung Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 H.f./H.h. K F P 1 1 3 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 2 2 2 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 2 2 1 1 2 2 2 1 2 2 3 2 1 1 Gastritisgrad K F P l lll ll l lll 0 l 0 lll 0 ll 0 0 0 ll 0 l ll l ll 0 0 lll l 0 ll l ll 0 0 l l 0 0 0 l 0 0 ll 0 0 0 0 0 ll 0 l 0 l lll l 0 0 0 l 0 0 0 0 0 l l 0 l ll 0 0 lll 0 l l 0 l l l l 0 0 l 0 0 ll 0 0 0 0 0 0 ll l 0 0 l l ll 0 0 l 0 l ll lll l 0 l lll ll ll lll ll l l 0 l ll ll ll lll 0 ll ll 0 lll 0 0 ll ll 0 l 0 l ll ll lll ll l 0 0 ll ll l 0 l l l 0 l lll l lll Nr. H.f./H.h. K F P 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 1 2 2 3 1 1 1 2 1 1 2 2 1 3 1 2 2 2 1 1 Gastritisgrad K F P 0 l 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 l 0 l 0 0 l 0 l 0 0 0 0 0 l 0 ll l 0 0 ll 0 l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0 0 0 l l 0 0 l 0 0 0 l 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 l 0 0 0 0 l l 0 l ll ll 0 ll 0 0 0 0 0 0 ll l 0 0 l 0 0 0 0 l l 0 l 0 ll 0 ll l 0 0 0 l ll 0 0 0 l 0 0 0 l l 0 l l ll K: Kardia F: Fundus/Korpus P: Pylorus/Antrum, 0: keine Entzündungsanzeichen, I-III: ggr-hgr.e Gastritis -: kein Nachweis, 1-3: ggr.-hgr.er Nachweis von H. felis und H. heilmannii Ergebnisse 60 Es wurde die Dichte der Besiedlung der Schleimhaut mit H. felis und H. heilmannii beurteilt. Die Auswertung zeigte, daß für die drei Magenregionen kein Zusammenhang zwischen der Dichte der Besiedlung mit Helicobacter sp. und dem Grad und der Aktivität der Gastritis bestand. 8 Katzen, bei denen keine Helicobacter sp. isoliert wurden, wiesen trotzdem eine gering- bis hochgradige Gastritis auf. Dagegen wurden z. T. bei Katzen, bei denen gering- bis hochgradig Bakterien nachgewiesen wurden, keine Gastritissymptome beobachtet (Tab. 8). Bei hochgradigem Befall mit GHLO wurden zudem häufig dilatierte Drüsenkörper beobachtet. Tab. 8: Vorkommen von Entzündungserscheinungen bei nicht Helicobacter-infizierten und Helicobacter-infizierten Katzen nicht infizierte Tiere (n =18) Entzündungsgrad K F P K F P 0 16 15 10 49 54 29 I 2 2 6 18 23 23 1 1 10 4 23 1 5 1 7 II III K: Kardia, F: Fundus/Korpus, P: Pylorus/Antrum 4.5 infizierte Tiere (n = 82) 0: o.b.B., I: geringgradig, II: mittelgradig, III: hochgradig Transmissionselektronenmikroskopische Untersuchungen Ausgewählte Proben, bei denen bei der molekulargenetischen Untersuchung H. felis und H. heilmannii nachgewiesen worden waren, wurden transmissionselektronenmikroskopisch untersucht. Dabei wurden etwa 0,5 bis 0,6 µm breite und 4 bis 10 µm lange Bakterien mit bis zu 7 spiraligen, korkenzieherartigen Windungen beobachtet (Abb. 6). Unipolar konnten 10 bis 17 Geißeln, die zu Flagellenbüscheln zusammengelagert waren (Abb. 7), beobachtet werden. Diese wurden als H. heilmannii angesprochen, wobei bei H. felis zusätzlich periplasmatische Ergebnisse 61 Fasern auf dem Kamm der Bakterienmembran beobachtet werden konnten. Die Bakterien, die z. T. in großer Anzahl in den Bakterienlumina beobachtet werden konnten, zeigten keinen Kontakt zum Epithel oder Alterationen an Epithelstrukturen. Intrazellulär wurden bei den untersuchten Proben keine Bakterien beobachtet. Ergebnisse Abb. 4: Immunhistologische Reaktionen a) Darstellung spiralig gewundener Bakterien im oberflächlichen Schleim, Pylorus, Tier-Nr. 74, Paraplastschnitt, IHC, 40x Obj. b) und in den Drüsenlumina, Kardia, Tier-Nr. 36, Paraplastschnitt, IHC, 40x Obj. 62 Ergebnisse Abb. 5: H.-E. Färbung a): Lymphfollikelbildung (↑), Pylorus/Antrum, Tier-Nr. 48, Paraplastschnitt, H.-E., 10x Obj. und b): hochgradige diffuse Infiltration mit Entzündungszellen in der Lamina propria der Mukosa, Kardia, Tier-Nr. 39, Paraplastschnitt, H.-E., 20x Obj. 63 Ergebnisse 64 Abb. 6: Elektronenmikroskopische Darstellung der spiralig gewundenen Bakterien innerhalb der Magendrüsen. Die Abbildung zeigt, daß die mehrfach gewundenen Bakterien im Bereich des Drüsenlumens liegen und keinen Kontakt zu den Belegzellen zeigen. Fundus/Korpus; Tier-Nr. 14, Vergr. 12.000x . Ergebnisse 65 Abb. 7: Elektronenmikroskopische Darstellung eines Bakteriums mit einem Geißelbüschel an einem Pol (↑). Fundus/Korpus, Tier-Nr. 14, Vergr. 30.000x. Diskussion 5 66 Diskussion Es gilt als gesichert, daß verschiedene Helicobacter-Arten, vor allem H. pylori, beim Menschen unterschiedliche Erkrankungen, wie u. a. Magenulzera, Magenadenokarzinome und Enteritiden auslösen können (STOLTE, 1994; PARSONNET et al., 1991; NOMURA et al., 1991). Im Gegensatz dazu ist die Beziehung zwischen einer Infektion mit Helicobacter-Spezies und einer Erkrankung bei Haustieren noch ungeklärt (NEIGER, 1998a). Trotz zahlreicher Untersuchungen bleiben weiterhin Fragen zur Epidemiologie offen. Bis heute konnte nicht eindeutig geklärt werden, inwieweit Haustiere für eine Übertragung der Keime auf den Menschen in Frage kommen. Infektionsversuche an verschiedenen Säugetieren (HONDA et al., 1998; FOX u. LEE, 1997; LEE et al., 1997) trugen eher zum Verständnis der Pathogenese, als zur Klärung der Epidemiologie bei. Allerdings weisen einige Studien auf einen Zusammenhang zwischen Tierkontakt und Erkrankung beim Menschen hin (FOX u. LEE 1997; LAVELLE et al., 1994; DIETERICH et al., 1998). Eine der wenigen Tierarten, bei der eine natürliche Infektion mit H. pylori festgestellt wurde, war die Katze (HANDT et al., 1994). Ziel der Arbeit war es, mit Hilfe verschiedener Nachweisverfahren einen Beitrag zum Vorkommen des Keimes durch Untersuchungen an Katzen zu leisten und die Bedeutung für das Entstehen morphologisch faßbarer Magenveränderungen für ein Patientenkollektiv im Raum Göttingen darzustellen. 5.1 Probenmaterial Für die Untersuchung wurden Magenbiopsien von zufällig ausgewählten männlichen und weiblichen Katzen verschiedenen Alters aus dem Raum Göttingen ausgewählt. Anamnestisch waren dabei unterschiedliche Erkrankungen, bzw. Todesursachen festzustellen. Nur bei einer der untersuchten Katzen war vorberichtlich ein Magen-Darmproblem in Form von chronischem Durchfall beobachtet worden. Diskussion 5.2 67 Methodik Die histologische Untersuchung, PCR und die mikrobiologische Untersuchung wurden in dieser Arbeit als Nachweismethoden angewendet, da sie als die sichersten Methoden für den Nachweis von Helicobacter spp. gelten, wobei die PCR als der spezifischste und sensitivste Nachweis anzusehen ist (FABRE et al., 1994; SIMPSON et al., 1999). Trotzdem besteht immer die Möglichkeit, daß Biopsieproben, die in der histologischen Untersuchung positive Ergebnisse aufweisen, in der PCR negativ sind und umgekehrt. Dafür verantwortlich ist die ungleichmäßige Verteilung von Helicobacter spp. im Magen, so daß u. U. Biopsien an Stellen entnommen werden, die keine Keime aufweisen. Außerdem kann eine Probe jeweils nur einmal für eine Untersuchungsmethode verwendet werden, so daß immer unterschiedliche Bioptate untersucht werden. Um hier verläßliche Resultate zu erzielen, sollten jeweils mehrere Proben entnommen und u. U. mehrere Verfahren zur Anwendung kommen. Auf den in der Humanmedizin häufig eingesetzten Screening-Test (HUT®-Test, Fa. Astra, Wedel) wurde verzichtet. Bei diesem Test werden endoskopisch gewonnene Biopsieproben in ein mit Harnstoff versetztes gelartiges Nährmedium gegeben. Bei Anwesenheit bestimmter Helicobacter-Arten, wie z. B. H. pylori, wird durch die Bildung von Ammoniak der pH-Wert erhöht und dies mit Hilfe eines Indikators angezeigt. Da allerdings auch andere Keime Urease bilden, wie z. B. Proteus sp., Klebsiella sp., Lacto- und Actinobacillus sp., besteht die Gefahr falsch positiver Ergebnisse. VAIRA et al. (1988b) weisen darauf hin, daß positive Ergebnisse dieses Tests bereits nach einer Stunde nicht ausschließlich auf H. pylori hinweisen. Eine genauere Differenzierung verschiedener Helicobacter-Arten ist nicht möglich, und so war die Anwendung dieses Tests bei der gestellten Fragestellung nicht sinnvoll. Dieser Test bringt von allen vorgestellten Methoden die schnellsten Testergebnisse, ist aber auch wesentlich unspezifischer als die angewendeten Methoden. Der 13 C Atem- und Bluttest konnte nicht durchgeführt werden, da nur verstorbene Tiere für die Untersuchung zur Verfügung standen. Vorteile dieser Methode sind die Nichtinvasivität und die einfache Durchführung ohne Narkose. Der Nachweis von Helicobacter-Antikörpern Diskussion 68 erschien wegen der bestehenden Kreuzreaktivität der einzelnen Helicobacter-Arten untereinander und der hohen Befallsrate mit Helicobacter-Spezies als nicht sinnvoll. 5.2.1 Mikrobiologisch-kultureller Nachweis Da nur wenige Keime in einer Biopsie ausreichen, um bei optimalen Kulturbedingungen ein positives Ergebnis zu bewirken, gilt die kulturelle Isolierung und Anzüchtung von H. pylori als Goldstandard (MALFERTHEINER u. NILIUS, 1994b). Dabei muß allerdings entweder ein optimales Transportmedium zur Verfügung stehen, oder die Proben müssen sofort auf Selektivnährböden aufgetragen und entsprechend inkubiert werden. Da die benötigten Mittel zur Verfügung standen, wurde die kulturelle Anzüchtung als eine Methode zum Nachweis von H. pylori ausgewählt. Nachteilig erweist sich weiterhin die langandauernde Inkubationszeit und die, trotz des Gebrauchs von Selektivnährböden, Gefahr der Überwucherung durch Kontaminanten. H. felis ist nur sehr schwer kulturell anzuzüchten und zu isolieren, da andere Begasungsverhältnisse und Nährböden als bei H. pylori benötigt werden und der Keim makroskopisch auf dem Nährboden nicht zu erkennen ist, so daß auf eine Anzüchtung verzichtet wurde. H. heilmannii galt bis zum Untersuchungsbeginn als nicht anzüchtbar und wurde bis heute erst einmal angezüchtet, so daß auch in diesem Fall auf eine mikrobiologisch-kulturelle Untersuchung verzichtet wurde. Die kulturelle Untersuchung stellt deshalb die am wenigsten praktikable und sichere Methode der drei angewendeten Nachweismethoden dar. 5.2.2 Molekularbiologische Untersuchung Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion ist es möglich kleinste Mengen auch bereits abgestorbener, d. h. der mikrobiologisch–kulturellen Untersuchung nicht mehr zugänglichen, Mikroorganismen nachzuweisen. Diese Art der Untersuchung ist die spezifischste der im Moment zur Verfügung stehenden Untersuchungsmethoden und ermöglicht bei der Auswahl selektiver Primer auch ohne Kreuzreaktionen die eindeutige Abgrenzung verschiedener Helicobacter-Arten voneinander. Allerdings müssen die Biopsieproben nach der Entnahme Diskussion 69 schnell eingefroren werden, um Verwesungsvorgänge zu verhindern und die Proben in diesem Zustand in ein entsprechend spezialisiertes Labor verschickt werden. Zusätzlich muß vor der eigentlichen Reaktion eine aufwendige Reinigung der DNA stattfinden und eine Kontamination des Arbeitsplatzes vermieden werden, um falsch positive Testergebnisse zu vermeiden. Nach IBELGAUFTS (1993) werden für eine sichtbare Bande in einem Agarosegel, in dem die Nukleinsäuren mit Dimidiumbromid angefärbt worden sind, bis zu 5 ng Nukleinsäure benötigt. Mit Hilfe dieser Angabe kann berechnet werden, wieviele Kopien genomischer DNA der nachzuweisenden Bakterien im originären Untersuchungsmaterial mindestens vorhanden sein müssen, um nach Amplifikation der spezifischen DNA-Erregersequenz die Mindestmasse für ein Signal im Agarosegel zu erreichen (Tab. 9). Amplifikatlänge x Molekülmasse/Basenpaar x Vermehrungsrate/Zyklus Zykluszahl Avogadro-Zahl Tab. 9: Amplifikatlängen der isolierten Helicobacter-DNA und eingesetzte Zyklenzahlen Helicobacter sp. Amplifikatlänge (bp) Zyklenzahl H. pylori 1024 40 H. felis 416 40 H. heilmannii 580 31 Entscheidend für die Berechnung ist die Vermehrungsrate pro Zyklus. Theoretisch liegt pro Zyklus eine Verdoppelung vor. Praktisch wird aber von einer Vermehrungsrate von 1,8 bis zu 1,6 ausgegangen. Hieraus läßt sich die benötigte Mindestanzahl an Kopien für einen Nachweis genomischer DNA der Helicobacter spp. im Ausgangsmaterial ermitteln. Zu beachten ist weiterhin, daß Verunreinigungen den Ablauf der PCR durch Hemmung der TaqDNA-Polymerase behindern können, so daß eine gründliche Reinigung der Amplifikation vorangehen sollte. Ebenso kann eine große Menge von DNA im Ausgangsmaterial, wie z. B. Diskussion 70 Wirts-DNA aus der Magenschleimhaut, die Amplifikation verhindern und falsch negative Ergebnisse verursachen. Mit Hilfe eines Spektrophotometers kann die optische Dichte, also die durch eine Lösung absorbierte Lichtmenge, die die Ausgangskonzentration der Nukleinsäure angibt, gemessen werden (IBELGAUFTS, 1993). Um auch eine einzelne Bakterienzelle im Ausgangsmaterial mit Hilfe der PCR nachweisen zu können, wurden die Zyklenzahlen für H. felis und H. pylori entsprechend angepaßt. Da die Reaktion für H. heilmannii mit der hohen Zyklenzahl keine verwertbaren Ergebnisse ergab, und bei zu hohen Zyklenzahlen mit der Entstehung von unspezifischen Banden im Agarosegel zu rechnen ist, wurden für H. heilmannii Primer, Zyklenanzahl und -temperatur nach NEIGER et al. (1998) gewählt, dabei wird bei einer Zyklenzahl von 31 bei 100 Mikroorganismen in der untersuchten Magenschleimhautprobe eine Bande sichtbar. Da bei Infektionen mit H. heilmannii häufig sehr viele Bakterien nachzuweisen sind, ist der Nachweis im Agarosegel auch bei geringerer Zyklenanzahl möglich. Die Primer für H. pylori und H. felis wurden mit dem Computerprogramm primer v 1.0 selbst zusammengestellt. Um zu gewährleisten, daß spezifisch nur die jeweilig gesuchte Helicobacter-Art, und nicht zusätzlich auch noch Kontaminanten, als positiv eingestuft wurden, wurden Primer ausgewählt, die nur mit der gesuchten Helicobacter-Art und nicht mit anderen Helicobacter spp., verschiedenen anderen Bakterienarten, Katzen- oder auch menschlicher DNA reagieren. Außerdem wurde mit der Polyacrylamidgelelektrophorese und der Silberfärbung, deren Nachweis bis zu 5fach empfindlicher als die Anfärbung mit Dimidiumbromid ist (IBELGAUFTS, 1993), ein weiteres Verfahren für H. pylori stichprobenartig angewendet, um die Ergebnisse der Gelelektrophorese zu bestätigen. 5.2.3 Histologische und ultrastrukturelle Untersuchung Die Helicobacter-Antigene wurden indirekt in einem Drei-Schritt-Verfahren mit der Streptavidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Methode (SABC-Methode) nachgewiesen. Die immunhistologischen Reaktionen wurden semiquantitativ beurteilt. In der Übersichtsvergrößerung wurden Lokalisation und Menge der Bakterien abgeschätzt. Mit Hilfe Diskussion 71 dieser Methode ist zwar eine Unterscheidung zwischen morphologisch sehr unterschiedlichen Helicobacter-Arten möglich, eine genauere Zuordnung, ob es sich um H. felis oder H. heilmannii handelt, ist nicht möglich, u. U. können unspezifische Hintergrundreaktionen die Auswertung erschweren. Mit Hilfe der H.-E. Färbung kann zusätzlich zum Nachweis einer Helicobacter-Infektion auch eine Beurteilung der Magenschleimhaut vorgenommen werden, so daß die Art und Ausprägung einer Gastritis gleich mit beurteilt werden kann. Die histologische Untersuchung ist nach der PCR der sicherste Nachweis einer HelicobacterInfektion. Es handelt sich dabei um eine Methode, die anwenderfreundlich und kostengünstig ist. Nach Entnahme der Bioptate können diese einfach in Formaldehyd fixiert und in entsprechenden Probengefäßen, die in jeder Praxis vorhanden sind, verschickt werden. Die transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung ermöglicht eine Diagnose von pathologischen Veränderungen in der Zellstruktur und die Unterscheidung verschiedener Helicobacter-Arten, wie z. B. H. felis und H. heilmannii, da Feinstrukturen, wie z. B. periplasmatische Fasern auf der Bakterienmembran, erkannt werden können. Da dieses Verfahren sehr aufwendig und teuer ist, und auch nur kleine Ausschnitte der Magenschleimhaut beurteilt werden können, wurden stichprobenartig Magenschleimhautproben von Biopsien verwendet, die sich vorher schon bei der PCR als positiv herausgestellt hatten. Dieses Verfahren eignet sich somit nicht für den Einsatz in der Routinediagnostik. Für die Diagnostik eines Helicobacter-Befalls eignen sich aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität am besten die PCR und die histologische Untersuchung, allerdings muß die Probenverarbeitung sorgfältig durchgeführt werden und Speziallabore entsprechende Verfahren, die im Moment noch nicht zur Routine gehören, anbieten. Eine Alternative dazu stellt der nicht-invasive Harnstoff-Atemtest dar, der auch gleichzeitig zur Kontrolle der Eradikation eingesetzt werden kann und für die Routinediagnostik im Rahmen einer Gastroskopie der invasive Urease-Schnelltest. Bei der histologischen Untersuchung besteht zusätzlich zum quantitativen Nachweis der Bakterien die Möglichkeit, Ausmaß und Lokalisation einer Infektion und den Entzündungsgrad zu beurteilen. Die serologische Untersuchung und die bakterielle Kultur kommen aufgrund der aufgeführten Probleme für die Routinediagnostik nicht in Frage. Diskussion 5.3 72 Ergebnisse In dieser Studie erwiesen sich alle 100 Katzen, mit Hilfe der angewendeten diagnostischen Methoden, als nicht mit H. pylori infiziert. Nach den bisher erfolgten Studien kann ausgeschlossen werden, daß H. pylori von Katzen auf den Menschen übertragen werden, allerdings können das Tier oder tierische Produkte sicherlich nicht generell als Infektionsquelle für verschiedene Helicobacter-Arten außer Acht gelassen werden. HANDT et al. (1994) wiesen zwar bei 22 Versuchstierkatzen H. pylori mit Hilfe mikrobiologischer, histologischer und molekularbiologischer Methoden nach, so daß Katzen als mögliches Reservoir von H. pylori angesehen wurden und eine zoonotische Übertragung in Betracht gezogen wurde (HANDT et al., 1994). Auch zeigten Studien, daß Landarbeiter, bei denen H. pylori nachgewiesen worden war, signifikant mehr Kontakt zu Katzen, als zu anderen Tieren hatten (THOMAS et al., 1995). Aber andererseits zeigen Studien, die H. pylori-Antikörper bei Katzenhaltern untersuchten, kein erhöhtes Risiko im Vergleich zur Kontrollpopulation (ANSORG et al., 1995) auf. EL-ZAATARI et al. (1997), OTTO et al. (1994), PAPASOULIOTIS et al. (1997) und LEE et al. (1988) konnten mit Hilfe verschiedener diagnostischer Methoden H. pylori bei Katzen mit gastroduodenalen Symptomen, spezifisch-pathogen-freien (SPF) und zufällig ausgesuchten Katzen ebenfalls nicht nachweisen. So ist davon auszugehen, daß es sich bei dem Nachweis von H. pylori bei Katzen eher um eine Anthropozoonose handelt (NEIGER, 1998b). H. heilmannii wurde in dieser Studie mit Hilfe der PCR in 84 % der Fälle, H. felis zu 20 % nachgewiesen. Nur eine Katze wies eine Infektion mit H. felis ohne Beteiligung von H. heilmannii auf. Bei der Katze sind häufiger als beim Menschen, bei dem Doppelinfektionen aufgrund des angenommenen Verdrängungseffektes (STOLTE, 1994) nicht vorkommen, Mischinfektionen verschiedener Helicobacter-Arten nachzuweisen. Da die Bakterien z. T. in sehr unterschiedlichen Verteilungen in der Magenschleimhaut angesiedelt sind, unterscheiden sich die Ergebnisse der PCR und der immunhistologischen Untersuchung. In der Literatur variieren die Prozentzahlen bei verschiedenen Studien. Diese fassen allerdings beide Helicobacter-Arten aufgrund der histologischen Ähnlichkeit unter dem Sammelbegriff Diskussion 73 GHLO (gastric Helicobacter-like organisms) zusammen, so daß bei klinisch gesunden Katzen zwischen 41 und 100 % und bei Katzen mit gastroduodenaler Symptomatik zwischen 57 und 76 % (OTTO et al., 1994; GEYER et al., 1993; HERMANNS et al., 1995; HAPPONEN et al., 1996) GHLO nachgewiesen wurden. Zum Teil untersuchten diese Autoren mehrere Lokalisationsstellen des Sektionsmaterials, so daß die Wahrscheinlichkeit für ein positives Ergebnis erhöht wurde. Bei der vorliegenden Untersuchung wurden mit Hilfe der immunhistologischen Untersuchung GHLO bei 82 % der untersuchten Katzen nachgewiesen. Die Transmissionselektronenmikroskopie ermöglicht die Untersuchung an Ultrastrukturen, die lichtmikroskopisch nicht zugänglich sind. Im Gegensatz zu LECOINDRE et al. (1997), die v. a. durch H. felis bedingten Zelluntergang der Epithelien und auch intrazellulär Bakterien beobachten konnten, wurden bei dieser Untersuchung nur Keime im Bereich der Magengrübchen und -drüsen ohne Kontakt zum Epithel beobachtet, allerdings war die Anzahl der untersuchten Proben zu gering, um eine statistische Aussage zu treffen. Bei der vorliegenden Untersuchung wurden nur Tiere aus Privathaushaltungen untersucht, so daß somit u. U. eine geringere Infektionsrate besteht. Auch bei Katzen, die erst wenige Wochen alt waren, konnten bereits Helicobacter-Spezies nachgewiesen werden. Die höchste Befallsrate wurde im Fundus/Korpusbereich nachgewiesen, dicht gefolgt vom Pylorus/Antrumbereich. Die Kardia war geringgradig weniger besiedelt. Insgesamt sind allerdings keine signifikanten Unterschiede in der Besiedlung der einzelnen Schleimhautabschnitte zu verzeichnen. Die Besiedlungsdichte der Magenschleimhaut mit Helicobacter-Spezies ist sehr unterschiedlich, in einigen Fällen sind nur einzelne Bakterien in einem Magengrübchen oder in einem Magenschlauch zu finden, in anderen Fällen sind hochgradige Ansammlungen von Bakterien sowohl in den Grübchen, als auch in den Drüsenlumina zu beobachten. Untersuchungen an natürlich mit GHLO infizierten Katzen berichten zwar über histopathologische Veränderungen der Magenschleimhaut (HENRY et al., 1987; GEYER et al., 1993; OTTO et al., 1994; HAPPONEN et al., 1996). Aber da in der Veterinärpathologie keine einheitlichen Kriterien für die Beschreibung histologischer Veränderungen benutzt werden, ist ein Vergleich verschiedener Studien schwierig. Außerdem ist zu berücksichtigen, Diskussion 74 daß es sich sehr häufig um eine beschränkte Anzahl diagnostischer Tests handelt (OTTO et al., 1994; GEYER et al., 1993; HAPPONEN et al., 1996). So ist es schwierig einen Vergleich der Befallsraten bei infizierten und nicht infizierten Tieren zu treffen (NEIGER, 1998a), zumal die Prävalenz bis zu 100 % betragen kann, und so keine geeignete Kontrollgruppe gebildet werden kann. Ein häufig wiederkehrender Befund bei der pathohistologischen Untersuchung war die Infiltration der Magenschleimhaut mit überwiegend lymphoplasmazellulären Entzündungszellen, die sich in vielen Fällen zu Lymphfollikeln zusammengelagert hatten. Die deutsche Gesellschaft für Pathologie hat 1989 festgelegt, daß die Magenschleimhaut nur als normal klassifiziert werden darf, wenn keine Entzündungszellen in der Lamina propria vorhanden sind. Das Erscheinen einzelner Lymphozyten ist bereits als geringgradige Gastritis einzuordnen. In der Einteilung des Sydney Systems allerdings wird das Erscheinen einer geringen Anzahl von Entzündungszellen als physiologisch angesehen. Beim Menschen werden Lymphfollikel nur im Zusammenhang mit einer Helicobacter-Infektion gesehen, bei Katzen werden Lymphfollikel auch bei nicht infizierten Katzen gesehen. OTTO et al. (1994) allerdings schätzen diese Bereiche als Areale vermehrter Antwort gegen das Helicobacter-Antigen ein. Die pathohistologischen Befunde stimmen mit denen in der Literatur erwähnten weitgehend überein (LEE et al., 1988; HERMANNS et al., 1995). Zwar wird bei Katzen mit einer Helicobacter-Infektion meist eine gering- bis mittelgradige lymphoplasmazelluläre Gastritis beschrieben, trotzdem kann, wie auch in dieser Studie, eine Korrelation zwischen spirillenförmigen Bakterien im Magen und histopathologischen Veränderungen kaum festgestellt werden (FEINSTEIN und OLSSSEN, 1992). Nur HERMANNS et al. (1995) konnten eine Korrelation zwischen bakterieller Besiedlung und Anzahl der Lymphfollikel feststellen. Katzen kommen als Überträger von H. pylori nicht in Frage. Obwohl HANDT et al. (1994) H. pylori bei Laborkatzen nachweisen konnten, wurde auch in dieser Studie an 100 Katzen aus Privathaushalten mit unterschiedlicher Krankheitssymptomatik (allerdings Diskussion 75 ohne Magen- oder Darmerkrankungen) und verschiedenen Nachweismethoden H. pylori nicht nachgewiesen. Infektionen mit GHLO sind auch bei klinisch gesunden Katzen sehr häufig zu isolieren, sie werden häufig von einer Entzündungsreaktion begleitet. Es kann sich dabei also entweder um ein kommensales oder symbiotisches Verhältnis (durch kompetitive Verdrängung anderer wesentlich pathogenerer Bakterien, wie es ja auch bei der Verdrängung von H. pylori durch H. heilmannii festzustellen ist) handeln. Für H. heilmannii jedoch läßt sich ein Infektionsrisiko aufgrund der hohen Prävalenz, des intensiven Kontaktes der Besitzer zu ihren Katzen und der nachgewiesenen Pathogenität des Keimes beim Menschen nicht von der Hand weisen. 5.4 Therapie Bei Patienten mit peptischem Ulkus und H. pylori-Infektion wird eine Eradikationstherapie empfohlen. Ob eine antimikrobielle Therapie bei Helicobacter-positiven Haustieren durchgeführt werden sollte, ist bis heute unklar, da eine Pathogenität bis heute nicht bewiesen werden konnte. Auch in dieser Studie wurde zwar eine hohe Prävalenz der Keime nachgewiesen, eine Magenerkrankung war aber bei keiner der untersuchten Katzen anamnestisch oder makroskopisch nachweisbar. Bis jetzt existieren nur wenige Studien über die Behandlung bei Hunden und Katzen mit anschließender Eradikationskontrolle (CORNETTA et al., 1998). Bei diesen Studien waren sowohl Katzen als auch Hunde nach erfolgreicher Therapie nach 28 bzw. 42 Tagen wieder Helicobacter-positiv (CORNETTA et al., 1998; NEIGER, 1998b). Unklar ist, ob eine Reinfektion oder eine unvollständige Eradikation der Keime durch resistente Keime oder ungenügende Therapiedauer, die Ursache hierfür darstellen. Weitere Studien zu dieser Problematik sollten sich in der Zukunft anschließen. Auf jeden Fall sollte nach Durchführung einer antimikrobiellen Therapie der Eradikationserfolg kontrolliert werden. Zusammenfassung 6 76 Zusammenfassung H. pylori, aber auch verschiedene andere Helicobacter-Arten, werden seit den 90iger Jahren des 20. Jahrhunderts für verschiedene Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes verantwortlich gemacht, vor allem für die Typ B Gastritis des Menschen. Dabei sind bis heute, trotz zahlreicher Nachforschungen, Erregerquellen und Übertragungswege weitgehend unbekannt. Die häufigsten und schwerwiegendsten Erkrankungen werden beim Menschen beobachtet, aber auch beim Tier weisen zahlreiche Studien auf einen Zusammenhang zwischen Infektion mit den Bakterien und klinischen Symptomen hin. Helicobacter-Spezies sind im Tierreich sehr weit verbreitet, häufig ohne Erkrankungen hervorzurufen. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, welche Helicobacter-Arten bei der Katze vorherrschen, welche Veränderungen sie hervorrufen, und ob sie für eine Infektion auf den Menschen in Frage kommen. 100 frisch verstorbene und euthanasierte Katzen aus Privathaushalten im Bereich Göttingen wurden untersucht. Als Methoden kamen mikro- und molekularbiologische Nachweistechniken, sowie histologische, immunhistologische und ultrastrukturelle Verfahren zur Anwendung. Folgende Ergebnisse wurden ermittelt: Im Rahmen der mikrobiologischen Untersuchung, die als Goldstandard gilt, wurden keine H. pylori nachgewiesen. Die molekulargenetische Untersuchung erbrachte mit der höchsten Spezifität und Sensitivität einen Befall der meisten untersuchten Katzen sowohl mit H. heilmannii als auch mit H. felis. Nur eine Katze wies eine einfache Infektion mit H. felis auf. In 84 % der Fälle wurde H. heilmannii und bei 20 % der Katzen H. felis nachgewiesen. H. pylori wurde auch mit Hilfe der hochauflösenden Polyacrylamidgelelektrophorese und anschließender Silberfärbung bei keiner Katze nachgewiesen. Die immunhistologische Untersuchung, die im Gegensatz zur mikrobiologischen Untersuchung auch eine hohe Nachweissicherheit aufweist, konnte gastric Helicobacter-like organisms (GHLO) in 82 % der Fälle nachweisen, dabei wurden die Bakterien im Magenschleim, in den Magengrübchen und in den Magendrüsen in unterschiedlicher Zusammenfassung 77 Intensität in allen drei untersuchten Magenlokalisationen beobachtet. H. pylori konnte nicht nachgewiesen werden. Mit Hilfe der H.-E. Färbung wurden parallel zum Nachweis der Befallsintensität, die in der immunhistologischen Untersuchung festgestellt wurde, Veränderungen der Magenschleimhaut diagnostiziert. Dabei wurden bei den meisten Katzen chronische Entzündungsreaktionen in Form von lymphoplasmazellulärer Infiltration festgestellt. Die Entzündungen waren graduell unterschiedlich in Kardia, Fundus/Korpus und Pylorus/Antrum verteilt, wobei keine Lokalisation bevorzugt wurde. Teilweise ließen sich auch negative Bereiche feststellen, obwohl andere Bereiche mehr oder weniger stark entzündlich verändert waren. 8 Tiere zeigten Entzündungssymptome, ohne daß Helicobacter-Spezies immunhistologisch nachgewiesen wurden, bei 16 Tieren wurden Helicobacter-Spezies ohne assoziierte Entzündungserscheinungen beobachtet. Die stichprobenartig durchgeführte transmissionselektronenmikroskopische Untersuchung erlaubt die Diagnostik der Feinstrukturen der Bakterien, wobei H. heilmannii und H. felis durch 10-15 Geißeln charakterisiert sind und H. felis zusätzlich Fasern auf dem Kamm der äußeren Membran aufweisen. Zusammenfassend kann nach Auswertung der Ergebnisse gesagt werden, daß Katzen sehr häufig mit GHLO, häufiger mit H. heilmannii als mit H. felis, infiziert sind und die meisten Katzen Entzündungsreaktionen in der Magenschleimhaut aufweisen, die keine Korrelation zur Befallsdichte mit den GHLO haben. H. pylori wurde in keinem Fall nachgewiesen, so daß Katzen wahrscheinlich nicht als Überträger der Keime auf den Menschen in Frage kommen, eine Infektion des Menschen mit H. heilmannii kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Unter gewissen Umständen können Helicobacter-Spezies auch beim Tier klinische Symptome hervorrufen, normalerweise verläuft die Infektion aber symptomlos. Summary 78 Uta Brandenburg Occurence of Helicobacter spp. in pet cats 7 Summary H. pylori as well as various other Helicobacter spp. have, since the 1990s, been thought to be responsible for causing various illnesses of the stomach and intestinal tract, particularly type B gastritis in humans. To date, however, the sources of causative agents and the means of transmission remain generally unknown, despite of extensive research. The most common and most serious illnesses have been observed in humans; similarly, extensive studies in animals indicate a relationship between infection by the bacterium and clinical symptoms. Helicobacter spp. are very common amongst animals, often without manifesting in any illness. The objective of this study was to establish which Helicobacter spp. are prevalent in cats, which changes are elicited by the bacteria and whether these bacteria can cause infections in humans. 100 cats from private households having undergone euthanasia or recently deceased, were examined. All those cats included in the study were from the Göttingen area. Methods used were microbiological and molecularbiological diagnostic techniques as well as histological, immunohistological and ultra-structural procedures. The following results were achieved: Within the spheres of microbiological examinations which serve as the Gold Standard, no H. pylori were discovered. The molecular genetic examinations revealed, to the highest degree of specificity and sensitivity, the contraction of H. heilmannii in 84 % of the research cats. H. felis was detected in 20 % of the cases; in only one cat a simple H. felis infection was observed, and the others were infected by both H. heilmannii and H. felis. Even with the aid of highly soluble polyacrylamide gelelectrophoreses and followed by silver staining, H. pylori could not be detected in any of the cats. Summary 79 The immunohistological examination which, contrary to the microbiological examination, also indicates a high certainty of proof, showed gastric Helicobacter-like organisms (GHLO) in 82 % of the cases. During said examination, the bacteria in the mucosal surface, the gastric pits and the gastric glands were observed, with varying degrees of intensity in all 3 specified areas of the stomach. H. pylori was not detected. Using H.-E. staining, changes in the gastric mucosa were diagnosed, in parallel to the detection of the intensity of the bacterial presence as discovered through the immunohistological examination. During this examination chronic reactions to infection in the form of lymphoplasmacellular infiltration were found in most of the cats. The infections varied gradually through the cardia, fundus/corpus and pylorus/antrum, with no particular prevalence of bacteria in any of the areas. Occasionally some areas were negative for the presence of bacteria, although other areas showed varying degrees of changes due to infection. In eight of the animals symptoms of infection were evident without Helicobacterspecies having been discovered through the immunohistological testing. In 16 of the animals Helicobacter-species without any associated signs of infection were observed. A transmission electron microscopic examination, which allows for the diagnosis of the ultrastructure of the bacteria, was conducted on a sample group. This examination revealed H. heilmannii and H. felis to be characterised by ten to fifteen flagellae and in addition H. felis was shown to exhibit periplasmatic fibrils distributed along the surface. To summarise, after evaluation of the results, it can be concluded that cats infected by GHLO, are more often infected by H. heilmannii than H. felis. Most cats exhibited reactions to infections of the gastric mucosa which show no correlation to the extent of intensity of the GHLO. H. pylori was not detected in any of the cases, meaning that cats are probably not carriers of these germs to humans; an infection in humans by H. heilmannii can, however, not be ruled out. Under certain circumstances, Helicobacter-species may also elicit clinical symptoms in animals but normally the infection exhibits no symptoms. 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Dis. 161, 1302-1304 Anhang 9 Anhang 9.1 Nährboden 98 H. pylori-Selektivnährboden (Fa. Oxoid, Wesel) (antibiotikahaltiger Columbia-Agar-Nährboden nach WARRELMANN u. HAHN (1987) zur Kultivierung und Isolierung von H. pylori aus Untersuchungsmaterial) Zusammensetzung der Columbia-Agar-Basis (g/l): Spezialpepton 23,0 Stärke 1,0 Natriumchlorid 5,0 Agar-agar pH 10,0 7,1-7,5 Zusammensetzung des H. pylori-Selektiv-Supplementes (Fa. Oxoid,Wesel) Je Röhrchen nach DENT u. McNULTY (1988): Vancomycin 5,0 mg Trimethoprim 2,5 mg Cefsulodin 2,5 mg Amphotericin B 2,5 mg In 500 ml Aqua dest. werden 19,5 g Columbia-Agar-Basis und 2 g Agar-agar suspendiert und bis zum vollständigen Lösen unter Rühren erhitzt, dann bei 121° C autoklaviert und auf 50° C abgekühlt. 2 ml Aqua dest. werden aseptisch zu einem Röhrchen Helicobacter-SelektivSupplement gegeben, vollständig gelöst und zu 500 ml abgekühltem Columbia-Agar-Basis hinzugefügt. Abschließend werden noch 35 ml Vollblut zugefügt. Anhang 9.2 99 Testreagenzien Ureasereagenz ( Fa. Oxoid,Wesel) Zusammensetzung der Harnstoff-Pepton-Lösung-Basis (g/l): Pepton 1,0 Glucose 1,0 Dinatriumhydrogenphosphat 1,2 Kaliumdihydrogenphosphat 0,8 Natriumchlorid 5,0 Phenolrot pH 0,004 6,6-7,0 In 95 ml Aqua dest. werden 0,9 g Harnstoff-Pepton-Lösung-Basis gelöst, bei 115° C 20 Minuten autoklaviert und dann auf 50° C abgekühlt. Danach werden aseptisch 5 ml sterile, 40%ige Harnstoff-Lösung zugegeben und gut gemischt. Je 100 ml der Lösung werden in sterilen Verschlußgläsern im Kühlschrank gelagert. Vor der Verwendung werden jeweils 2 ml in sterile Reagenzgläser gegeben und auf Zimmertemperatur (20° C) erwärmt. Oxidasereagenz (Fa. Merck, Darmstadt) N,N,N`,N`-Tetramethyl-1,4-phenyldiammoniumdichlorid 0,1 g Aqua dest. 9,9 ml 16%ige Glyzerinmilch Um den H. pylori-Stamm bei –20° C oder –80° C einzufrieren, wurden 16 ml steriles Glycerin mit 84 ml ultrahocherhitzter Milch, mit einem Fettgehalt von 0,3 %, vermischt. Anhang 9.3 GRAM-Färbung der Objektträger (Böck, 1989) 1. Objektträger für 1 min. mit GRAMS Kristallviolettlösung bedecken 2. Überschuß abkippen 3. Objektträger für 1 min. mit Lugolscher Lösung bedecken 4. Überschuß abkippen 5. kurz mit 96%igem Alkohol entfärben 6. mit Wasser abspülen 7. Objektträger für 1 bis 2 min. mit Fuchsinlösung bedecken 8. mit Wasser abspülen 9. trocknen lassen Gebrauchslösungen für die GRAM-Färbung Lugolsche Lösung: Kaliumjodid p.a. Iod, doppelt sublimiert Aqua dest. 14 g 7g 2100 ml Fuchsin-Lösung: Ziehl-Neelsen Karbolfuchsinlösung Aqua dest. 10 ml ad 100 ml 100 Anhang 9.4 Enzyme, Nukleinsäuren und Nukleotide Puffer für PCR-Ansatz KCl 3,728 g MgCl2 0,305 g TrisHCl 1,211 g Gelatine 0,010 g Aqua dest. ad 10 ml PCR-Beads (Fa. Amersham Pharmacia Biotech): 1 Bead gelöst in 32 µl Standardlösung beinhaltet: Taq-Polymerase 1,5 units Tris-HCl (pH 9,0 bei Raumtemperatur) 10 mM KCl 50 mM MgCl2 1,5 mM dNTP`s ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 200 µM Stabilisatoren 9.5 Protokolle für die Histologie und Elektronenmikroskopie 4%ige neutral gepufferte Formaldehydlösung nach Lillie (Böck, 1989): mind. 37%ige Formalinlösung 100 ml Aqua dest. 400 ml Lösung A Phosphatpuffer (s. u.) 100 ml Lösung B Phosphatpuffer (s. u.) 400 ml 101 Anhang 2,5%ige gepufferte Glutaraldehydlösung 25%ige Glutaraldehydlösung 100 ml Aqua bidest. 400 ml Lösung A Phosphatpuffer (s.u.) 100 ml Lösung B Phosphatpuffer (s.u.) 400 ml Phosphatpuffer: Stammlösung A (0,2 M) Na-dihydrogenphosphat-Monohydrat Aqua bidest. 27,6 g ad 1000 ml Stammlösung B (0,2 M) di-Na-hydrogenphosphat-Dihydrat Aqua bidest. 35,6 g ad 1000 ml Gebrauchslösung (0,1 M; pH 7,4-7,6) Stammlösung A 10 ml Stammlösung B 40 ml Aqua bidest. 50 ml Nachfixierung der Biopsien für die TEM mit 2%iger Osmiumsäure Osmiumsäure Aqua bidest. 1g ad 50 ml Osmiumsäure vor Gebrauch mit 0,2 M Phosphatpuffer im Verhältnis 1:1 mischen. Die Fixierzeit beträgt 2 Stunden. 102 Anhang Eponmischung nach Luft (1961): Mischung A Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg, FRG) DDSA (Fa. Serva, Heidelberg) 62 g 100 g auf einem Magnetrührer ca. 1 Stunde rühren Mischung B Glycidether 100 (Fa. Serva, Heidelberg) MNA (Fa. Serva, Heidelberg) 100 g 89g auf einem Magnetrührer ca. 1 Stunde rühren Gebrauchslösung EPON Mischung A und B im Verhältnis 1 : 1 30 min lang auf einem Magnetrührer rühren Beschleuniger DMP (2,4,6-Tris(dimethylaminomethyl)phenol) (Fa. Serva, Heidelberg) zugeben, so daß 1,8 % in der Endlösung erreicht werden; 1 Stunde lang rühren Kontrastierung der Ultradünnschnitte Wässrige Uranylacetat-Kontrastierung Uranylacetat Aqua bidest. 5g ad 100 ml Lichtgeschützt aufbewahren und vor Gebrauch zentrifugieren Kontrastierungsdauer: 20 min. Bleikontrastierung nach REYNOLDS (1963) Bleinitrat 1,33 g Natriumcitrat 1,67 g Aqua bidest. 30 ml stark schütteln bis nach 30 min. Bleinitrat zu Bleicitrat umgewandelt ist Na OH, 1 N 8 ml Aqua bidest. ad 50 ml Kontrastierungsdauer: 7 min. 103 Anhang Färbung nach RICHARDSON et al. (1960): Stammlösung A 1 g Azur II für die Mikroskopie (Fa. Merck, Darmstadt) in 100 ml Aqua dest. lösen Stammlösung B 1 g Di-Natriumtetraborat p. a. (Fa. Merck, Darmstadt) in 100 ml Aqua dest. lösen und darin 1 g Methylenblau für die Mikroskopie (Fa. Merck, Darmstadt) auflösen Gebrauchslösung Lösung A und B im Verhältnis 1 : 1 mischen und Schnitte 1 min. damit färben Hämalaun & Eosin-Färbung der Paraffinschnitte (Böck, 1989) 1. 3 x in Xylol für 5, 2 und 2 min. entparaffinieren 2. absteigende Alkoholreihe (96 %, 96 %, 80 %, 70 %, 50 %) für je 1 min. 3. Aqua dest. für 1 min. 4. Hämalaun nach Mayer für 1 min. 5. fließendes Leitungswasser für 1 min. 6. 0,5%iges Eosin für 1 min. 7. Aqua dest. für 1 min. 8. aufsteigende Alkoholreihe: 50%iger Alkohol für 45 sek. 70%iger Alkohol für 45 sek. 80%iger Alkohol für 1 min. 96%iger Alkohol für 1 min. 96%iger Alkohol für 1 min. 9. 2 x in Xylol für je 2 min. und Schnitte mit Eukitt eindecken 104 Anhang 9.6 Lösungen für die Immunhistochemie (ICH) PBS-Puffer mit 0,5 % BSA (Verdünnungspuffer für die IHC): Gebrauchslösung (0,1 M PBS; 0,5 % BSA; pH 7,4-7,6) Aqua bidest. 50 ml NaCl p.a. 0,9 g Lösung A (Phosphat-Puffer s. Kap. 9.5) 10 ml Lösung B (Phosphat-Puffer s. Kap. 9.5) 40 ml BSA (Fa. Serva, Heidelberg) 0,5 g Tris-Puffer (Spülpuffer für die IHC) Stammlösung (0,5 M; pH 7,6) Aqua bidest. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 500 ml 60,57 g mit 1 N HCl (ca. 376 ml) auf pH 7,6 einstellen Aqua bidest. ad 1000 ml bei 4 °C aufbewahren Gebrauchslösung (0,05 M; pH 7,6) Tris-Stammlösung 100 ml NaCl 7,65 g Aqua bidest. ad 1000 ml gut auf einem Magnetrührer lösen Gebrauchslösung mit 2 % Milchpulver (gegen unspez. Hintergrund) Tris-Stammlösung 100 ml NaCl 7,65 g Milchpulver Aqua bidest. 20 g ad 1000 ml 105 Anhang 106 DAB (Chromogen für die enzymatische Farbreaktion) DAB (FA. Fluka, Seelze) 100 mg Tris-Puffer-Gebrauchslösung 200 ml unter Lichtausschluß lösen, anschließend zweimal filtrieren Stock Solution Aliquots DAB Tris-Puffer-Gebrauchslösung 100 mg 10 ml bei -25 °C einfrieren, vor Gebrauch auftauen, nach Zugabe von 190 ml TRIS-PufferGebrauchslösung zweimal filtrieren. Citratpuffer (für die Mikrowellenbehandlung) Stammlösung A (0,1 M Zitronensäure) Zitronensäure Aqua bidest. 21,01 g ad 1000 ml Stammlösung B (0,1 M Natriumcitrat) Natriumcitrat Aqua bidest. 29,41 g ad 1000 ml beide Stammlöungen bei 4 °C lagern Gebrauchslösung (10 mM; pH 6) Stammlöung A 9 ml Stammlösung B 41 ml Aqua bidest. 450 ml TBE-Puffer Tris-Puffer-Gebrauchslösung Borsäure EDTA auf einen pH von 7,5 einstellen und autoklavieren. 162 g 27,5 g 9,3 g Danksagung Bedanken möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. E. Scupin für die Überlassung des Themas, bei Herrn Prof. Dr. B. Brenig für die wissenschaftliche Betreuung und fachliche Anleitung, sowie für die kritische Durchsicht des Manuskriptes. Herrn Prof. Dr. Kaup möchte ich für die bereitwillige Übernahme meiner Arbeit und die kritische Korrektur meines Manuskriptes danken. Mein besonderer Dank gilt Dr. Gero Fabig, der mir jederzeit sowohl bei fachlichen Fragen, besonders zum mikrobiologischen und molekularbiologischen Teil, bei der Korrektur der Arbeit, als auch bei Problemlösungen motivierend zur Seite gestanden hat. Ganz herzlich möchte ich mich auch bei Dr. Ina Pfeiffer bedanken, für die wissenschaftliche Betreuung und die fachliche Anleitung des molekularbiologischen Teils der Arbeit. Bedanken möchte ich mich bei Dr. K. Mätz-Rensing für die wissenschaftliche Betreuung und die fachliche Anleitung zur Auswertung der histologischen und transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen. Der Kleintierklinik des Tierärztlichen Institutes, der Kleintierpraxis Dr. Wystub und Dr. Monika Ziegler danke ich für die Bereitstellung des Probenmaterials. Brigitte und Ingo Epler-Brandenburg danke ich für die spontane Hilfe bei der Übersetzung. Mein ganz besonderer Dank gilt Olaf Hummel, der mir jederzeit bei allen computertechnischen Fragen und Problemen zur Seite gestanden hat und mich auch ansonsten immer seelisch und moralisch unterstützt hat. Frau K. Kaiser-Jarry und Frau E. Niksch möchte ich für die Anfertigung der histologischen Schnitte und der Bearbeitung der Proben für die Elektronenmikroskopie und Frau Dr. K. Seidel vom Lehrstuhl für Tierhygiene, Universität München, für die Bereitstellung der H. felis-Stämme danken. Mein besonderer Dank gilt ebenso den Mitarbeitern des Tierärztlichen Institutes, die immer für eine freundliche Arbeitsatmosphäre sorgten, insbesondere auch Frau Steffi Koch für die Bereitstellung der Selektivnährböden und Frau Ilsemarie Grotian, die mir bei der Laborarbeit immer mit Rat und Tat zur Seite gestanden hat.
