Dokument_17.

Expression und
Mutagenese von VEP1-kodierten Progesteron5β-Reduktasen aus pharmazeutisch
interessanten Angiospermen
Der Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr.rer.nat.
vorgelegt von
Peter Reinhard Bauer
aus Nürnberg
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich -Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
18.10.2012
Vorsitzender der Promotionskommission:
Prof. Dr. Reiner Fink
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Wolfgang Kreis
Zweitberichterstatter:
Prof. Dr. Yves Muller
2
Für Christina,
meine Familie und mich
Leb! Leb!
Eh deine Sehnsucht stirbt,
Eh durch den Hauch des Zeitlosen
Kraft und Fluss versiegen!
Gib! Gib!
All deine Lebenskraft,
den Träumen deines Herzens
deines freien Geist Vision!
Schandmaul
Die Nacht schuf tausend Ungeheuer
doch frisch und fröhlich war mein Mut
in meinen Adern, welches Feuer
in meinem Herzen, welche Glut
J.W. Von Goethe
Lasst uns realistisch bleiben,
versuchen wir das Unmögliche
Ernesto „Che“ Guevara
3
Danksagung
Ich bedanke mir bei meinem Doktorvater Prof. Dr. W. Kreis für die Möglichkeit, die
vorliegende Arbeit unter seiner Betreuung zu Erstellen und das in mich gesetzte Vertrauen.
Insbesondere für die stete Diskussionsbereitschaft, die kreative Freiheit, welche ich erfahren habe,
und seine Anleitung zur Entwicklung einer wissenschaftlichen Arbeitsweise.
Prof. Dr. L. Heide vom Lehrstuhl Pharmazeutische Biologie (Uni Tübingen), bei dem ich
während meiner Diplomarbeit die praktischen Grundlagen der Molekularbiologie erlernen durfte,
was wesentlich zu den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit beigetragen hat.
Ganz explizit bedanken möchte ich mich außerdem bei Herrn Dr. F. Müller-Uri, für sein
enormes Interesse an meinen Experimenten und Ergebnissen, seine stete Anteilnahme, die
Einführung in die Wissenschaftspolitik und die zahlreichen Gespräche, die ebenfalls sehr zum
Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Ebenso gebührt mein Dank sowohl Frau Dr. V. Herl
(durch deren Vorarbeit der Grundstein dieser Arbeit gelegt wurde), als auch Frau Dr. P. Schebitz,
v.a. für Ihre fachliche Einarbeitung zu Beginn meiner Zeit am Lehrstuhl und die wunderbare
persönliche Zusammenarbeit. Herrn Dr. C. Rieck danke ich für seine Hilfe bei der GC-MSAnalytik.
Herrn Dr. H. Lanig von CCC der Universität Erlangen danke ich für die Simulation der
Moleküldynamiken meiner klonierten bzw. mutierten Proteine. Herrn Dr. B. Schmid vom Lehrstuhl
für Biotechnologie für seine Einführung in Software zur Analyse von Proteinstrukturen.
Zu gleichen Teilen möchte ich mich bei ALLEN meinen Kollegen vom Lehrstuhl für
Pharmazeutische Biologie bedanken, von denen ich in den letzten Jahre fachliche und persönliche
Unterstützung erfahren durfte. Ganz besonders meiner Laborpartnerin Frau Kristin Rudolph, die ich
zunächst als Bachelor-Studentin an unserem Lehrstuhl kennenlernen durfte, um sie später als
Masterstudentin anzuleiten und mit der mich eine enge Freundschaft verbindet. Unser Laboralltag
und unsere gemeinsame Zeit waren immer super (und kalorienreich). Außerdem dem Rest meiner
direkten Laborkollegen im Labor von Herrn Dr. F. Müller-Uri für die sehr gute und
freundschaftliche Zusammenarbeit: Frau M. Ernst, Frau J. Munkert, Frau G. Fischer und Herrn A.
Löbers.
Frau H. Maiolino und Frau G. Friedrichs haben mit ihren „Grünen Daumen“ jede Pflanze
zum Blühen gebracht. Frau V. Kummeth danke ich für ihre gekonnte Hilfe in allen
Verwaltungsangelegenheiten.
Zuletzt möchte ich mich bei allen Pharmazie-Praktikanten bedanken, die zum Gelingen der
Arbeit beigetragen haben.
4
Inhaltsverzeichnis
Danksagung..........................................................................................................................................4
I. EINLEITUNG...................................................................................................................................8
I.1 Herzglykoside - eine wichtige Gruppe pflanzlicher Sekundärstoffe in der Gattung Digitalis...8
I.1.1 Chemische Eigenschaften und Verbreitung .......................................................................8
I.1.2 Medizinische Bedeutung von Digitalis sp und Herzglykosiden im Wandel....................10
I.2 Biosynthese der Herzglykoside ...............................................................................................11
I.2.1 Allgemeine Untersuchungen zum Ablauf ........................................................................11
I.2.2 Enzyme der Biosynthese: Progesteron-5β-Reduktase (P5βR).........................................15
I.3 Zielsetzung der Arbeit..............................................................................................................17
II. MATERIAL UND METHODEN..................................................................................................18
II.1 Materialien..............................................................................................................................18
II.1.1 Wasser..............................................................................................................................18
II.1.2 Chemikalien.....................................................................................................................18
II.1.3 Pflanzenmaterial..............................................................................................................19
II.1.4 Lösungen.........................................................................................................................20
II.1.4.1 Lösungen für die Molekularbiologie.......................................................................20
II.1.4.2 Lösungen für die Dünnschichtchromatographie......................................................21
II.1.4.3 Lösungen für die Protein-Biochemie.......................................................................21
II.1.5 Puffer...............................................................................................................................21
II.1.5.1 Puffer für die Molekularbiologie.............................................................................21
II.1.5.2 Puffer für die native His-tag-Reinigung von rekombinanten Proteinen .................22
II.1.6 Nährmedien ....................................................................................................................23
II.1.7 Bakterienstämme und Plasmide......................................................................................23
II.1.8 Molekularbiologische Kits..............................................................................................25
II.1.9 Enzyme............................................................................................................................26
II.1.10 Oligonukleotid-Primer...................................................................................................26
II.1.11 Verbrauchsmaterialien...................................................................................................29
II.1.12 Geräte............................................................................................................................29
II.1.13 DNA- und Proteinmarker..............................................................................................31
II.2. Methoden................................................................................................................................32
II.2.1 Klonierung und Mutation von Genen..............................................................................32
II.2.1.1 Isolierung von genomischer DNA (gDNA).............................................................32
II.2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA....................................................................................32
II.2.1.3 Umschreiben von Poly(A)+-RNA in cDNA............................................................33
II.2.1.4 Standard-/RT-PCR...................................................................................................33
II.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese .....................................................................................34
II.2.1.6 Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen („freeze'N squeeze“)..........................34
II.2.1.7 Konzentrierung und Reinigung von PCR-Produkten..............................................35
II.2.1.8 pQE30-UA- / TOPO-TA-Klonierung......................................................................35
II.2.1.9 Herstellung von kompetenten E. coli Zellen ..........................................................36
II.2.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli........................................................36
II.2.1.11 Colony-PCR ..........................................................................................................36
II.2.1.13 Mutagenese-PCR...................................................................................................37
II.2.1.14 Plasmid-Isolierung.................................................................................................38
II.2.1.15 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von RNA und DNA..........................38
II.2.1.16 DNA-Sequenzierung..............................................................................................39
II.2.1.17 Langzeit-Lagerung von Bakterienstämmen...........................................................39
II.2.1.18 DpnI-Verdau..........................................................................................................39
II.2.2 Heterologe Protein-Expression in E. coli........................................................................40
5
II.2.2.1 Kultivierung von E. coli M15[pREP4] und Induktion der Proteinexpression.........40
II.2.2.2 Zell-Lyse und native His-tag-Affinitätschromatographie........................................40
II.2.3 Proteinbiochemische Methoden......................................................................................41
II.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinen..............................................................41
II.2.3.2 Umpuffern von Proteinproben.................................................................................41
II.2.3.3 Konzentrierung von Proteinlösungen......................................................................41
II.2.3.4 SDS-PAGE ..............................................................................................................41
II.2.3.5 Proteinfärbung mit Coomassie brilliant blue...........................................................42
II.2.3.6 Standard-Enzymassays für rP5βR ..........................................................................43
II.2.4 Spezielle analytische Methoden......................................................................................43
II.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC).........................................................................43
II.2.4.2 GC-MS Analytik......................................................................................................44
II.2.4.3 Photometrische Analytik..........................................................................................44
II.2.5 Darstellung von Proteinstrukturen und in silico-Methoden ...........................................46
III. ERGEBNISSE..............................................................................................................................47
III.1 Klonierung von orthologen P5βR..........................................................................................47
III.1.1 Ableitung der Primer und Screening von RNA-Bibliotheken.......................................47
III.1.2 Klonierung in den TOPO-Klonierungsvektor................................................................49
III.1.3 Etablierung eines Klonierungssystems für pQE30-UA Vektoren..................................52
III.2 Funktionelle Expression der orthologen P5βR in E. coli M15[pREP4] ..........................56
III.2.1 Expressionsbedingungen und native His-tag-Reinigung...............................................56
III.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität.............................................................................57
III.2.3 Biochemische Untersuchung der rekombinanten P5βR.................................................59
III.2.3.1 Enantioselektivität..................................................................................................59
III.2.3.2 Cosubstrat-Spezifität .............................................................................................59
III.2.3.3 Temperatur-Optima................................................................................................61
III.2.3.4 Enzymkinetiken für Progesteron und 2-Cyclohex-1-enon.....................................61
III.3 Modellierung und in silico Analyse der heterolog exprimierten Biosynthese-Gene........65
III.3.1 Homologie-Modellierung der P5βR und deren Validierung..........................................65
III.3.2 Exakte Analyse der Substrat-Bindetaschen....................................................................70
III.4 Ortsgerichtete Mutagenese (SDM) der rekombinanten D. lanata P5βR...............................72
III.4.1 Mutagenese der konservierten Reste der Bindetasche der DlP5βR...............................72
III.4.1.1 Herstellung und Validierung der mutierten Plasmide.............................................72
III.4.1.2 Überexpression und Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine.......75
III.4.1.3 Kinetische Untersuchung der Muteine...................................................................78
III.4.1.4 In silico Betrachtung der Muteine DlP5βR G145A und F153A............................79
III.4.2 Rationale Mutagenese zur Steigerung der katalytischen Aktivität der rDlP5βR...........82
III.4.2.1 Ableitung von essentiellen Aminosäuren für die katalytische Aktivität der
rDlP5βR................................................................................................................................82
III.4.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese der D. lanata P5βR.....................................................84
III.4.2.3 Relative Aktivitäten und kinetische Untersuchungen der gefundenen Muteine....86
III.4.2.4 Alternative Strategien zur Verbesserung der katalytischen Aktivität ....................90
III.4.3 N-terminale Deletionsmutanten der DlP5βR.................................................................93
III.4.3.1 Klonierung der full-length DlP5βR........................................................................93
III.4.3.2 Subklonierung und funktionelle Expression der kompletten DlP5βR ..................94
III.4.3.3 Einkürzungs-Mutagenese.......................................................................................97
III.4.4 Mutagenese zur Änderung der Cosubstrat-Spezifität....................................................99
III.4.4.1 In silico Analyse NADPH und NADH-spezifischer SDRs....................................99
III.4.4.2 Mutagenese-Experimente.....................................................................................101
III.4.4.3 Versuche zur in-vitro-Biosynthese........................................................................104
6
IV DISKUSSION.............................................................................................................................108
IV.1 Klonierung, Sequenz-Analyse, Expression und Verbreitung der P5βR...............................108
IV.1.1 Klonierung von orthologen P5βR.................................................................................108
IV.1.2 Analyse der Proteinsequenzen und Strukturen.............................................................109
IV.1.3 Vorkommen und Vergleich von homologen, funktionellen P5βR in Herzglykosidhaltigen und Herzglykosid-freien Angiospermen .................................................................113
IV.2 Mutagenese-Experimente.....................................................................................................119
IV.2.1 Steigerung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR..................................................119
IV.2.1.1 Ableitung von Mutagenese-Positionen durch „bioactivity guided“-Screening . .119
IV.2.1.2 Gerichtete Mutagenese und Charakterisierung der Muteine................................123
IV.2.1.3 Simulation der Molekül-Dynamik (MD)..............................................................125
IV.2.2 Konservierte Reste innerhalb der Bindetasche der P5βR.............................................128
IV.2.3 Einkürzungs-Mutagenese der rDlP5βR .......................................................................131
IV.2.4 Änderung der Cosubstrat-Spezifität.............................................................................137
V ZUSAMMENFASSUNG.............................................................................................................143
V SUMMARY..................................................................................................................................145
VI LITERATURVERZEICHNIS*...................................................................................................147
VII ANLAGEN................................................................................................................................163
VII.1 Abkürzungsverzeichnis......................................................................................................163
VII.2 Publikationsliste.................................................................................................................165
VII.3 Tagungsbeiträge und wissenschaftliche Preise...................................................................165
VII.3.1 Wissenschaftliche Kongresse mit Eigenbeitrag..........................................................165
VII.3.2 Preise während der Promotionsphase.........................................................................166
VII.5 LEBENSLAUF..................................................................................................................167
7
I. EINLEITUNG
I.1 Herzglykoside - eine wichtige Gruppe pflanzlicher Sekundärstoffe in der
Gattung Digitalis
Die Gattung Digitalis akkumuliert eine große Anzahl von pflanzlichen Sekundärstoffen und
wurde phytochemisch bereits sehr gut untersucht. Beschrieben wurden u.a. über 40 verschiedene
Arten von Anthrachinonen (z.B. Digitolutein), Steroidsaponine mit meist nur schwachem
Saponincharakter (z.B. Digitonin und Titogenin), Flavonoide wie Digicitrin und als Digitanole
bezeichnete C5-C6 ungesättigte C21-Pregnane. Pharmazeutische und toxikologische Bedeutung
erlangte die Gattung aber ausschließlich auf Grund ihres Gehaltes an 5β-Cardenoliden, einer
Untergruppe der herzwirksamen Glykoside (Luckner und Wichtl, 2000; Clemente et al., 2011).
I.1.1 Chemische Eigenschaften und Verbreitung
Unter der Sammelbezeichnung Herzglykoside versteht man eine Gruppe von Naturstoffen
mit spezifischer Wirkung auf den Herzmuskel von Kalt- und Warmblütern. Es handelt sich um C 23oder C24-Steroide mit einer charakteristischen cis-trans-cis Verknüpfung des Steroid-Ringsystems.
Dieses kann in unterschiedlichen Hydroxylierungsmustern vorliegen, wobei die beiden β-ständigen
Hydroxylgruppen an den Positionen 3 und 14 obligatorisch sind (Abb. 1).
Abb. 1: Exemplarische Struktur eines Herzglykosids. Durch Abspaltung der terminalen Glucose entsteht aus dem
Primär- das Sekundärglykosid (A = Cardenolid; B = Bufadienolid).
An der 3-Hydroxylgruppe findet man in der Regel 1 - 4 glykosidisch gebundene
Zuckerketten. Neben „typischen“ Zuckern wie D-Glucose, L-Rhamnose und D-Fucose treten hier
auch sehr seltene 2,6-Didesoxyzucker wie β-D-Digitoxose auf. Kommen beide Zuckerarten
gemeinsam vor, ist das Aglykon an diese seltenen Zucker gebunden, während das „normale“
8
Zuckermolekül endständig angeknüpft ist (Primärglykosid). Die Abspaltung
des terminalen
Zuckerrestes (z.B. durch pflanzeneigene Glucosidasen während der Aufarbeitung) führt zur Bildung
von Sekundärglykosiden. Die Art und Anzahl der Zuckermoleküle der glykosidischen Seitenkette
sind von therapeutischer Relevanz, da sie einen wesentlichen Einfluss auf die Pharmakokinetik der
Herzglykoside haben.
Ein anderes typisches Merkmal ist der β-ständige Lactonring an C-17. Anhand der
Beschaffenheit dieses Rings erfolgt eine weitere Einteilung der Herzglykoside: Handelt es sich um
einen fünfgliedrigen Butenolid-Ring werden die Verbindungen den Cardenoliden (Abb. 1, A), im
Falle des sechsgliedrigen Cumalinrings den Bufadienoliden zugeordnet (Abb. 1, B). Zur
Cardenolidgruppe gehören die Glykoside aus Digitalis-, Strophanthus-, Convallaria-, Nerium- und
Adonis-Arten, während es sich bei den Urginea- und Helleborus-Glykosiden um Bufadienolide
handelt (Teuscher und Lindequist, 2010).
Herzglykoside treten sporadisch sowohl in monokotylen, als auch in dikotylen Pflanzen auf
und wurden bisher in über 20 Pflanzenfamilien beschrieben (Teuscher und Lindequist, 2010; Kreis
und Müller-Uri, 2009). Offizinelle Arzneibuch-Drogen (Ph.Eur 7.0, DAB, DAC) finden sich in
verschiedenen Pflanzenfamilien: Plantaginaceae (Digitalis lanatae folium, Digitalis purpureae
folium), Ranunculaceae (Adonidis herba, Hellebori radix), Apocynaceae (Nerii folium, Strophanthi
semen), Convallariaceae (Convallariae herba), Hyacinthaceae (Scillae bulbus). Bufadienolide
findet man außerdem in den Hautdrüsen von bestimmten Kröten (Bufo bufo), Schlangen der
Gattung Rhabdophis und einigen Insekten, wie dem Monarchfalter. Dieser Schmetterling ist
allerdings nur sekundär giftig, d.h. er nimmt die Herzglykoside mit der Nahrung auf, modifiziert sie
und speichert sie in endogenen Geweben (als Übersichtsartikel hierzu s. auch Dobler et al., 2011).
Andere Insekten sind zur aktiven Bildung dieser Strukturen in der Lage (Passtells JM et Daloze D,
1977). Beobachtet wird außerdem das Vorkommen von endogenen Herzglykosiden im
menschlichen Organismus, die vermutlich eine bisher unbekannte Art von Steroidhormonen
darstellen. Obwohl ihre Bedeutung noch nicht eindeutig bekannt ist, sind bereits zahlreiche
physiologische Wirkungen beschrieben worden (Schoner, 2002; Bagrov und Shapiro, 2008; Ritz
und Schoner, 2008).
9
I.1.2 Medizinische Bedeutung von Digitalis sp und Herzglykosiden im Wandel
Die aus Digitalis lanata und Digitalis purpurea isolierten Digitalis-Glykoside bewirken eine
Steigerung der Kontraktionskraft des Herzmuskels (positiv inotrope Wirkung) auf Grund derer
diese Verbindungen lange Zeit Mittel der ersten Wahl bei einer klinisch manifesten Herzinsuffizienz
darstellten. Neben dieser Steigerung der Kontraktionskraft des Herzens kommt es außerdem zu
einer Verringerung der Schlagfrequenz (negativ chronotrope Wirkung), einer Erschwerung der
Erregungsleitung (negativ dromotrope Wirkung) und zu einer Senkung der Reizschwelle des
Muskels (positiv bathmotrope Wirkung). In der Summe führen diese Effekte bei den Patienten so zu
einer Ökonomisierung der Herzarbeit (Mutschler et al., 2008). Andere Digitalis-Arten haben bzw.
hatten keine pharmazeutische Bedeutung (Clemente et al., 2011).
Auf molekularer Ebene kommt es durch die Gabe von Herzglykosiden zur dosisabhängigen
Hemmung der kardialen Mg-abhängigen Na+/K+-ATPase und folglich zu einer Störung des Na+- und
K+-Transports aus bzw. in die Zelle. Durch die erhöhte intrazelluläre Na +-Konzentration werden
membranständige Na+/Ca2+-Transporter in ihrer Funktionsweise beeinflusst. Die intrazelluläre Ca 2+Konzentration steigt an, da weniger Ca2+--Ionen aus der Zelle transportiert werden. Dies bedingt
eine verbesserte Kontraktionskraft des Herzmuskels (Demiryurek und Demiryurek, 2005). Für die
Erhöhung der intrazellulären Na+-Konzentration von 1 auf 2 mM wurde in vitro eine Verdopplung
der Kontraktionskraft beschrieben (Fozzord und Sheets, 1985).
Als Arzneistoffe werden heute entweder die isolierten Reinstoffe, oder partialsynthetische
Derivate eingesetzt. Therapeutisch stehen Digoxin (z.B. Lanicor®), Digitoxin (z.B. Digimerck®),
Acetyldigoxin (z.B. Novodigal®) und Metildigoxin (z.B. Lanitop ®) in einer Erhaltungsdosis von
0,05-0,3 mg/Tag zur Verfügung.
Neuere Untersuchungen stellen den therapeutischen Effekt der Therapie im Rahmen einer
Evidenz-basierten Medizin jedoch in Frage. In der placebokontrollierten DIG-Studie, an der 7788
Patienten teilnahmen, hatte die medikamentöse Therapie mit Digoxin keinen signifikanten Effekt
auf die Überlebenszeit der Patienten (Hobbs, 1997). Als Argument für eine Digitalis-Therapie
wurden jedoch eine erhöhte Belastbarkeit und eine geringe Hospitalisierungsrate in der VerumGruppe aufgeführt (Jaehde et al., 2003). Hinzu kommt die sehr geringe therapeutische Breite der
Substanzen. Typische Nebenwirkungen wie Benommenheit, Übelkeit, Farbsehen, Arrhythmien und
Halluzinationen bei älteren Patienten treten häufig bereits vor Erreichen des vollen Wirkspiegels auf
und werden mit etwa 20 % angegeben. Als besonders schwierig stellt sich hierbei die Dosisfindung
bei älteren, multimorbiden Patienten dar. Vor allem auf Grund der klinischen Untersuchungen
veränderte sich der Stellenwert der Herzglykoside in der Therapie: Obwohl sie noch immer zu den
Standard-Arzneimitteln des Indikations-Bereichs Herzinsuffizienz zählen, handelt es sich nach den
10
aktuellen Therapieleitlinien nicht mehr um Mittel der ersten Wahl. Diese sind jetzt Diuretika, βBlocker, ACE-Hemmer, Sartane und Spironolacton. Die Monotherapie mit Herzglykosiden gilt
ebenfalls als obsolet und wird in der Praxis in Deutschland nicht mehr praktiziert (Mutschler, 2008;
DEGAM Leitlinie von Muth et al., 2006).
Neue, vielversprechende Indikationsbereiche für Herzglykoside entstehen momentan
allerdings durch die Entdeckung der endogenen „Digitalis-artigen Faktoren“ (endogenous digitalislike factors / DLF; Ouabain, Marinobufagenin) und das wachsende Verständnis ihrer
physiologischen Funktionen bei der Blutdruckregulation, der Kontrolle des Zellzyklus und der
Apoptose (Jortani und Valdes, 1997; Bagrov und Shapiro, 2008). Hierdurch kann beispielsweise die
bereits 1967 durch Shiratori und Gan erstmals beschriebene Hemmung des Wachstums maligner
Zelllinien durch Herzglykoside im Ansatz erklärt werden. Neben solchen in-vitro-Effekten wurde
auch wiederholt die klinische Wirksamkeit der Herzglykoside als antitumorale Agenzien in vivo
demonstriert: So wurde eine Gruppe von Patientinnen, die an Brustkrebs erkrankten, über 22 Jahre
beobachtet, wobei die Mortalität bei den Frauen, die eine zusätzliche Therapie mit Digitalis
erhielten, bei 6 % lag, die der anderen bei 34 % (Stenkvist, 1999; Übersichtsarbeit s. Winnicka et
al., 2006). Ye et al. (2011) zeigten neben der Hemmung der Interferon-β-Genexpression einen
inhibierenden Effekt von Bufalin auf die Tumornekrosefaktor (TNF)-Signalkaskade und eine
Interferenz mit NfκB. Die Autoren geben Bufalin deshalb als möglichen Arzneistoff zur Therapie
von Entzündungen und bestimmten Autoimmunerkrankungen an. Digitoxin und andere Cardenolide
besitzen außerdem schon in geringster Konzentration antivirale Wirkung gegen Herpes simplex
Viren Typ 1 (HSV-1) (Su et al., 2008; Bertol et al., 2011).
I.2 Biosynthese der Herzglykoside
I.2.1 Allgemeine Untersuchungen zum Ablauf
Da es sich um therapeutisch interessante Naturstoffe handelt, war die Biosynthese der
Cardenolide (speziell in Digitalis) Gegenstand intensiver Forschung. Der putative Biosynthese-Weg
wurde unter anderem über Fütterungsexperimente mit radioaktiv markierten Vorstufen, die
Reinigung bzw. die Klonierung und heterologe Expression von vermeintlichen BiosyntheseEnzymen aufgeklärt (Kreis und Müller-Uri, 2009; Clemente et al., 2011). Eine zusammenfassende
Darstellung wichtiger Schritte der Biosynthese ist im folgenden wiedergegeben (Abb. 2):
11
B
A
Abb. 2: Schematische Darstellung der frühen Herzglykosid-Biosynthese ausgehend von Cholesterol. A stellt den
putativen Hauptweg über Pregnan-Zwischenstufen dar. B zeigt einen möglichen Nebenweg über Norcholansäuren.
Wichtige Enzyme sind angegeben (SCCE = Side-chain cleaving enzyme; 3β-HSD = 3β-HydroxysteroidDehydrogenase, KSI = Ketosteroid-Isomerase; P5βR = Progesteron-5β-Reduktase).
Da es sich bei den Cardenoliden um Steroide handelt, geht man davon aus, dass der Aufbau
des Aglykons aus Mevalonsäure über Triterpen- bzw. Phytosterolintermediate verläuft.
12
Experimentell konnte bereits früh der Einbau von markierten Mevalonat-Vorstufen in den SteroidKörper gezeigt werden (Ramstad und Beal, 1960). Das Muster der Markierung an C-1, C-7 und C15 entsprach ebenfalls den Erwartungen, die sich aus einer Biosynthese über den Mevalonat-Weg
ergeben (Gros und Leete, 1965). Die Kohlenstoff-Atome C-22 und C-23 des charakteristischen
Butenolid-Rings stammen jedoch nicht aus einem anderen Biosynthese-Weg (Gregory und Leete,
1969).
Man geht davon aus, dass der erste Schritt der Biosynthese in der partiellen Abspaltung der
Seitenkette an C-17 zwischen den beiden Kohlenstoffatomen C-20 und C-22 durch das Side Chain
Cleaving Enzyme (SCCE) besteht, wobei Pregnenolon gebildet wird (Pilgrim, 1972). Da die
Fütterung von 25-Azacycloartanol bei D. lanata Sprosskulturen jedoch zu einer Steigerung des
endogenen Cholesterols bei gleichzeitiger Abnahme der Konzentration von 24-Alkyl-Sterolen bzw.
Cardenoliden führte, gelten auch klassische Phytosterole, wie Campesterol, als mögliche
Ausgangsverbindungen (Milek at al., 1997).
Das gebildete Pregnenolon wird im Anschluss sukzessive über Isoprogesteron zu
Progesteron umgesetzt. Hierzu sind zwei Reaktionen notwendig: die Oxidation der 3Hydroxylgruppe des Steroid-Körpers zum Keton und die Isomerisierung der Doppelbindung des
entstandenen Δ5-Pregnen-3,20-dions (Isoprogesteron) zum Δ4-Pregnen-3,20-dion (Progesteron). Im
tierischen System werden beide Reaktionen durch einen einzigen Enzymkomplex, der sowohl 3βHydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD), als auch Ketosteroid-Isomerase-Aktivität (KSI) besitzt
katalysiert (Pollack, 2004). Frühere Theorien legten dieses Verhalten auch für die pflanzlichen 3βHSDs nahe (Finsterbusch et. al., 1999). Die Aminosäure-Sequenz des Enzyms zeigte jedoch eine
größere Übereinstimmung mit den 3β-HSDs mikrobiellen Ursprungs (Lindemann et al., 2000; Herl
et al., 2007), die keine KSI-Aktivität besitzen. Die Klonierung und funktionelle Expression der Δ 53β-HSD aus D. lanata erfolgte durch Herl et al. (2007). Neben Pregnenolon katalysierte das
rekombinante Enzym bei Anwesenheit von NAD + die Umsetzung zahlreicher weiterer Substrate
(z.B. Testosteron). Wie bei den bakteriellen Enzymen konnte jedoch keine KSI-Aktivität
nachgewiesen werden. Auf der anderen Seite besitzen Rohextrakte von D. lanata Blättern bzw.
Zellkulturen KSI-Aktivität. Aus den Blattextrakten konnte bereits ein 15 kDa Protein mit KSIAktivität partiell gereinigt werden. Auch hier erfolgte keine Co-Reinigung mit der 3β-HSD
(Meitinger et al., 2010). Obwohl der Ablauf der Biosynthese über Progesteron bereits seit
Jahrzehnten etabliert ist, konnte erst kürzlich das Vorhandensein von Progesteron in Pflanzen
(Juglans regia) zweifelsfrei nachgewiesen werden (Pauli et al., 2010).
Die stereospezifische Reduktion der Δ4,5-C=C-Doppelbindung des Progesterons erfolgt
13
durch die NADPH-abhängige Progesteron-5β-Reduktase (früher 5β-POR, jetzt P5βR), wobei die
charakteristische cis-Verknüpfung der Ringe A und B des Steroidkörpers entsteht, die typisch für
alle Cardenolide der Gattung Digitalis ist. Aus diesem Grund wurde dem Enzym lange Zeit eine
Schlüsselrolle in deren Biosynthese zugesprochen. Auch eine Progesteron-5α-Reduktase, welche
die Reduktion von Progesteron zu 5α-Pregnan-3,20-dion katalysiert, wurde aus D. lanata
Zellkulturen isoliert und charakterisiert (Wendroth und Seitz, 1990). Im Gegensatz zur P5βR ist
diese durch Finasterid bei einer Konzentration von 180 µM vollständig hemmbar (Grigat, 2005).
Das Enzym hat für die Biosynthese der 5β-Cardenolide vermutlich keine Bedeutung, da eine
Isomerisierung von 5α- zu 5β-Derivaten bisher nicht beschrieben wurde (Kreis et al., 1998).
Vermutlich sind die ubiquitär zu findenden Steroid-5α-Reduktasen primär in die Biosynthese der
Brassinosteroide involviert (Li et al., 1997).
Es folgt die enzymatische Reduktion der 3-Ketofunktion des 5β-Pregnan-3,20-dions zum
entsprechenden Alkohol (5-Pregnan-3β-ol-20-on). Obwohl 5β-Pregnan-3,20-dion in vitro durch
die rekombinante D. lanata 3β-HSD stereospezifisch umgesetzt wird (Herl et al., 2007), ist nicht
klar, ob diese Reaktion, wie von Finsterbusch et al. (1999) bereits angeregt, auch in vivo durch die
3β-HSD katalysiert wird, oder ob spezielle 3β-Hydroxysteroid-5α-Oxidoreduktasen, 3βHydroxysteroid-5β-Oxidoreduktasen und 3α-Hydroxysteroid-5β-Oxidoreduktasen eine Rolle in der
Biosynthese der verschiedenen Herzglykoside spielen (Stuhlemmer et al., 1993; Clemente et al.,
2011).
Die beiden Enzyme, die an der 14β- und 21β-Hydroxylierung beteiligt sind, konnten bisher
weder gereinigt noch kloniert werden. Auch die Abfolge der Oxidationen ist nicht bekannt
(Clemente et al. 2011). Da 14β-Hydroxyprogesteron in Cardenolide aufgenommen werden, geht
man davon aus, dass die 14β-Hydroxylierung der Bildung des Butenolid-Rings vorangeht (z.B.
Haussmann et al., 1997). Dieser entsteht vermutlich durch den nukleophilen Angriff einer
aktivierten Acetat- oder Mevalonat-Einheit an der C-20-Ketofunktion mit anschießender
Lactonringbildung über C-21, wobei die beiden Kohlenstoff-Atome C-22 und C-23 ins Molekül
eingeführt werden. Eine andere Möglichkeit postuliert zunächst die Bildung eines 21-O-MalonylHemiesters mit nachfolgender Decarboxylierung und Dehydrierung (Stuhlemmer und Kreis, 1996;
Pádua et al., 2008). Unterstützt wird dieser Mechanismus durch die kürzlich veröffentlichte
Reinigung einer Malonyl-CoenzymA: 21-Hydroxypregnan 21-O-Malonyltransferase (Dp21MaT9)
aus den Blättern von D. purpurea (Kuate et al., 2008).
Variationen der Cardenolidstruktur ergeben sich v.a. aus der 12β- und 16β-Hydroxylierung
des Steroidkörpers (Änderung der „Herzglykosid-Reihe“) und durch die Anknüpfung verschiedener
14
Zucker. Es wurde gezeigt, dass die Hydroxylierungen prinzipiell auf Stufe des Pregnans, des
Cardenolid-Aglykons oder des Glykosids erfolgen kann (Furuya et al., 1970; Tschesche, 1971;
Reinhard et al., 1975). Durch die Kombination der unterschiedlichen Aglyka mit verschiedenen
Zuckerketten ergibt sich so eine große Anzahl verschiedener Herzglykoside (bei Digitalis sind über
70 unterschiedliche Verbindungen beschrieben worden; Luckner und Wichtel, 2000).
Neben diesem „klassischen“ Biosynthese-Weg über Pregnan-Zwischenstufen, gibt es die
Möglichkeit der Biosynthese über Norcholansäure-Intermediate (Haussmann et al., 1997).
Markierte Norcholansäuren wurden in Fütterungsversuchen, analog zu den Pregnanen, ebenfalls in
die Cardenolide eingebaut. Für D. lanata gibt es Hinweise darauf, dass in der Pflanze je nach
Cardenolid-Typ beide Wege parallel ablaufen (Maier et al., 1986; Übersicht auch bei Kreis und
Müller-Uri, 2009). Die rekombinanten P5βR und 3β-HSDs aus D. lanata waren in der Lage
Norcholansäure-Substrate effizient umzusetzen (Schebitz et al., 2010).
I.2.2 Enzyme der Biosynthese: Progesteron-5β-Reduktase (P5βR)
Auf Grund der beschriebenen Rolle für die Katalyse des lange Zeit proklamierten
Schlüsselschrittes der Cardenolid-Biosynthese (Herl et al., 2007), handelt es sich bei der
Progesteron-5β-Reduktase um das momentan am intensivsten erforschte Enzym (z.B. Kreis und
Müller-Uri, 2010; Clemente et al., 2011). Die erste Reinigung, Charakterisierung und teilweise
Mikrosequenzierung des strikt NADPH-abhängigen Enzyms mit einer Größe von etwa 43 kDa
gelang aus Blätter- bzw. Sprosskulturen von D. purpurea (Gärtner et al., 1990; Gärtner et al., 1994).
Roca-Pérez et al. (2004) identifizierten das erste Gen für eine P5βR in D. obscura (Dop5βR;
AJ555127). Später erfolgte die Klonierung und funktionelle Expression der orthologen P5βR über
RT-PCR aus cDNA von D. lanata. Der Vergleich mit der klonierten Sequenz aus der gDNA zeigte
ein kleines Intron im P5βR-Gen (Herl et al., 2007). Das Gen selbst ist in der Gattung Digitalis stark
konserviert und wurde als Marker für phylogenetische Analysen herangezogen (Herl et al., 2007).
Das rekombinante Protein (rDlP5βR) setzte neben Progesteron eine Reihe von weiteren Steroiden
mit Enon-Struktur, wie Cortisol und Cortison, um. Auch kleinere mono- und azyklische Substrate
mit aktivierter Doppelbindung werden stereoselektiv reduziert (Burda et al., 2009).
Die Kristallstruktur der rDlP5βR mit und ohne Cosubstrat wurde von Egerer-Sieber et al.
(2006) bzw. Thorn et al. (2008) veröffentlicht (PDB 2v6g bzw. 2v6f). Wie bereits aus der Sequenz
ersichtlich war, zeigte die Struktur die Zugehörigkeit des Enzyms zur Familie der kurzkettigen
Dehydrogenasen/Reduktasen (short-chain dehyrogenases/reductases; SDRs), einer großen Gruppe
von NAD(P)H bzw. NAD(P)+-abhängigen Oxidoreduktasen, die zwar einige Sequenzmotive
15
gemeinsam haben, jedoch nur eine geringe Sequenzidentität aufweisen. Man findet sie in
zahlreichen Organismen und Stoffwechselwegen (Lipid-, Aminosäure-, Hormonmetabolismus,
ect.). Die strukturelle Gemeinsamkeit stellt ein zentrales, paralleles β-Faltblatt-System dar, das von
mehreren α-Helices flankiert wird und in der Gesamtheit als Rossmann-Faltung bezeichnet wird
(Kavanagh et al., 2008). Es handelte sich jedoch um eine neue Unterklasse, in welcher von der
charakteristischen katalytischen SDR-Tetrade (bzw. Triade) nur die beiden konservierten
Aminosäure-Reste Lys-147 und Tyr-179 vorhanden sind. Thorn et al. (2008) definierten drei neue
Proteinmotive, die in dieser neuen SDR-Familie zu finden sind (Abb. 3, Motiv IV, V, VI).
Abb. 3: Experimentell bestimmte Struktur der P5βR aus D. lanata. Die Lage der charakteristischen Protein-Motive I-III
(rot; Persson et al., 2003) bzw. IV-VI (weinrot; Thorn et al., 2008) ist farblich markiert. Die Lage von Cosubstrat
(NADP+, grün) Substrat (Progesteron, blau) ist ebenfalls ersichtlich.
Die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen der P5βR besaßen große Ähnlichkeiten zu Genen
bzw. Proteinen mit unbekannter Funktion aus Pflanzen, die keine Herzglykoside akkumulieren (z.B.
Populus tremuloides, Vitis vinifer, Ricinus communis). Herl et al. (2009) berichteten von der
Klonierung und funktionellen Expression einer orthologen P5βR aus A. thaliana (VEP1; AtStR).
Das rekombinante Enzym war ebenfalls in der Lage, Progesteron stereoselektiv zu 5β-Pregnan3,20-dion zu reduzieren. Obwohl die Sequenzidentität der AtStR zur DlP5βR über 70% beträgt,
16
besaß es eine etwa 50-fach höhere katalytische Aktivität. Auch dieses Enzym zeigte einen
deutlichen promisken Charakter (Burda et al., 2009).
I.3 Zielsetzung der Arbeit
Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es, mit Hilfe von systematischer, ortsgerichteter
Mutagenese (site-directed mutagenesis) der DlP5βR das Verständnis für die Struktur und
Reaktivität der Progesteron-5β-Reduktasen zu erweitern. Einen Schwerpunkt dieser Versuchsreihen
sollten Experimente bilden, mit deren Hilfe die stark ausgeprägten quantitativen Unterschiede in der
katalytischen Umsetzung von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion, die zwischen der D. lanata und
der A. thaliana P5βR existieren, erklärt werden sollten. Eine bereits bestehende in-silico-Theorie
musste experimentell überprüft werden. Anhand der Ergebnisse sollte die Aktivität der rDlP5βR
rational gesteigert werden. Des Weiteren sollten putativ für die Katalyse bzw. Substrat-Bindung
wichtige Aminosäure-Reste identifiziert bzw. ersetzt und die Cosubstrat-Spezifität geändert werden.
Hierzu sollten u.a. folgende Methoden Verwendung finden:
– Klonierung weiterer orthologer P5βR-Gene aus verschiedenen Taxa mit und ohne
Cardenolid-Akkumulation
– Heterologe Überexpression dieser Gene in E. coli M15 und deren funktionelle Analyse
– Homologie-Modellierung und Strukturanalyse der neuen rP5βR
– Mutagenese der rDlP5βR (Substitution einzelner Aminosäuren, Alanin-AustauschMutagenese, Deletionsmutagenese)
– Charakterisierung und Vergleich interessanter Muteine anhand ihrer Enzymkinetik (Km und
vmax)
Um eine große Anzahl von Protein-Proben effizient charakterisieren zu können, sollte eine
neue photometrische Methode für rP5βR etabliert werden.
17
II. MATERIAL UND METHODEN
II.1 Materialien
II.1.1 Wasser
Soweit nichts anderes angegeben, wird für alle molekularbiologischen und proteinbiochemischen Arbeiten bidestilliertes Wasser (Aquabidest) verwendet, das vor der Nutzung bei 121
°C und 1 bar Überdruck für 16 min autoklaviert wurde. Es wird verschlossen bei Raumtemperatur
gelagert.
II.1.2 Chemikalien
Bezeichnung
Hersteller / Lieferant
30 % Bis-Acrylamidlösung
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Agar
Merck KGaA, Darmstadt, D
Agarose NEEO Ultra-Qualität
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
Ampicillin-Na
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
Anisaldehyd
Fluca AG, Buchs, D
Coomassie Brilliant Blue
Serva Feinbiochemica GmbH &
Co. KG, Heidelberg, D
Dichlormethan
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
DMSO
Applichem GmbH, Darmstadt, D
dNTPs
Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, D
Ethidiumbromid
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
Glucose-6-Phosphat
Boehringer GmbH, Mannheim, D
Hefeextrakt
Applichem GmbH, Darmstadt, D
HEPES
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Imidazol
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
IPTG
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Isoprogesteron
LS Pharmazeutische Biologie
Kanamycin-Sulfat
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Methanol
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
NaCl
Applichem GmbH, Darmstadt, D
NAD+
Applichem GmbH, Darmstadt, D
NADH
Applichem GmbH, Darmstadt, D
NADP+
Applichem GmbH, Darmstadt, D
18
NADPH
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Natriumdihydrogenphosphat
Merck KGaA, Darmstadt, D
Natrium-EDTA
Applichem GmbH, Darmstadt, D
NaOH
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
Oligonucleotide
Eurogentec, Seraing, B
o-Phosphorsäure 85%
Merck KGaA, Darmstadt, D
Progesteron
Applichem GmbH, Darmstadt, D
Pregnanderivate
Steraloids Inc., Newport RI, USA
Proteinmarker Precision (Plus) Protein-Standard
BioRad GmbH, München, D
Salzsäure
Carl Roth GmbH, Karlsruhe, D
SDS Ultrapure
Applichem GmbH, Darmstadt, D
TEMED
Merck KGaA, Darmstadt, D
Tris/HCl
Sigma-Adrich, Taufkirchen, D
Trypton
Applichem GmbH, Darmstadt, D
X-Gal
Applichem GmbH, Darmstadt, D
β-Mercaptoethanol (β-ME)
VWR Int. GmbH, Darmstadt, D
Alle nicht aufgeführten Chemikalien wurden in p.A.-Qualität bei VWR International GmbH
(Darmstadt, D) oder Sigma-Aldrich GmbH (Taufkirchen, D) bezogen.
II.1.3 Pflanzenmaterial
Zur Isolierung von RNA und gDNA wird stets frisches Pflanzenmaterial in Form von
jungen, frisch geernteten Blättern genutzt. Diese werden aus dem botanischen Garten der Friedrich
Alexander Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) entnommen und unmittelbar verarbeitet oder in
Form von kommerziell erhältlichen Samen bezogen und im Gewächshaus bis zur Ausbildung von
Blättern geeigneter Größe angezogen. Die Pflanzen werden nach vier bis sieben Tagen pikiert,
täglich bewässert und einmal wöchentlich gedüngt (WUXAL Universaldünger, Wilhelm Haug,
Ammerbuch, Deutschland).
19
Pflanzenart
Herkunft
Atropa belladonna
Botanischer Garten FAU, Erlangen
Calotropis procera
www.rareplants.de
Gomphocarpus fruticosus
www.rareplants.de
Erysimum crepidifolium
www.rareplants.de
Erysimum rhaeticum
www.rareplants.de
Arabidopsis thaliana
LS Pharmazeutische Biologie, FAU
Digitalis lanata
LS Pharmazeutische Biologie, FAU
Mentha x piperita
LS Pharmazeutische Biologie, FAU
Solanum lycopersicon
LS Biochemie, FAU
Solanum tuberosum
LS Biochemie, FAU
Nicotiana tabacum
LS Biochemie, FAU
Withania somnifera
LS Pharmazeutische Biologie, FAU
Lunaria annua
LS Pharmazeutische Biologie, FAU
Die Pflanzen wurden durch Dr. Walter Welß (Botanischer Garten, FAU) identifiziert.
II.1.4 Lösungen
II.1.4.1 Lösungen für die Molekularbiologie
Lösung
Zusammensetzung
Ampicillin-Stammlösung (100 mg/mL)
100 mg Ampicillin-Natriumsulfat
ad 1000 µL Aquabidest
Carbenicillin-Stammlösung (50mg/mL)
50 mg Carbenicillin-Natriumsulfat
ad 1000 µL Aquabidest
Kanamycin-Stammlösung (25 mg/mL)
25 mg Kanamycin
ad 1000 µL Aquabidest
Antibiotika-Lösungen werden nach Herstellung steril filtriert
und bei - 20 °C aufbewahrt
CaCl2-RL
60 mM CaCl2
15 % Glycerin
10 mM PIPES
pH = 7,0 einstellen und autoklavieren
20
IPTG-Stammlösung (1M)
238,3 mg Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG)
ad 1000 µL Aquabidest
Die Lösung wird steril filtriert und bei -20 °C aufbewahrt
X-Gal-Stammlösung
20 mg X-Gal
ad 1000 µL Aquabidest
II.1.4.2 Lösungen für die Dünnschichtchromatographie
Lösung
Zusammensetzung
Fließmittel
7 VT Dichlormethan
3 VT Ethylacetat
Anisaldehyd-RL (Jork, 1990)
2,5 mL Anisaldehyd
50 mL Eisessig
425 mL Methanol
25 mL konz. Schwefelsäure
II.1.4.3 Lösungen für die Protein-Biochemie
Lösung
Zusammensetzung
Bradford-RL (Bradford, 1976)
100 mg Coomassie Brilliant Blue G25
50 mL Ethanol (96%)
100 mL o-Phosphorsäure (85%)
ad 1000 mL Aquabidest
Coomassie-Färberlösung-RL
800 mg Coomassie Brilliant Blue R-250
160 mL Methanol
40 mL Eisessig
ad 400 mL Aquabidest
Coomassie-Entfärberlösung-RL
160 mL Methanol
40 mL Eisessig
ad 400 mL Aquabidest
II.1.5 Puffer
II.1.5.1 Puffer für die Molekularbiologie
Bezeichnung
50 x TAE Puffer
Zusammensetzung
2,0 M Tris/HCL
1,0 M Natriumacetat
50 mM EDTA
pH einstellen auf 7,5
21
10 x DNA-Stopppuffer
50 % Glycerol
0,1 % Bromphenolblau
II.1.5.2 Puffer für die native His-tag-Reinigung von rekombinanten Proteinen
Alle Puffer werden nach der Herstellung auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.
Bezeichnung
Zusammensetzung
Nativer Lysepuffer
50 mM NaHPO4
300 mM NaCl
10 mM Imidazol
Nativer Waschpuffer
50 mM NaHPO4
300 mM NaCl
20 mM Imidazol
Nativer Elutionspuffer
50 mM NaHPO4
300 mM NaCl
250 mM Imidazol
II.1.5.3 Puffer für die Protein-Analytik und Enzymassays
Bezeichnung des Puffers
Zusammensetzung
P5βR-Assaypuffer (Gärtner et al., 1990)
100 mM HEPES-KOH, pH 8,0
250 mM Saccharose
2 mM EDTA
β-Mercaptoethanol
3β-HSD-Assaypuffer (Finsterbusch et al., 1999)
20 mM NaPi, pH 7,8
250 mM Saccharose
10 mM Natriumascorbat
5 x SDS-Probenpuffer
225 mM Tris/HCl, pH 6,8
50 % Glycerol
5 % SDS
0,05 % Bromphenolblau
250 mM DTT
SDS-PAGE Trenngelpuffer
1,5 M Tris/HCl, pH 8,8
20 mL SDS 20 %
ad 1000 mL Aquabidest
SDS-PAGE Sammelgelpuffer
0,5 mM Tris/HCl, pH 8,8
10 mL SDS 20 %
ad 1000 mL Aquabidest
22
SDS Elektrophoresepuffer
3,0 g TRIS
14,4 g Glycin
10 mL SDS 10%
ad 1000 mL Aquabidest
Vor jedem Gebrauch frisch zubereiten!
II.1.6 Nährmedien
Nach der Herstellung der Medien entsprechend den Vorgaben mit Aqua bidest, wird der pHWert auf 7,5 eingestellt und die Lösung unmittelbar danach autoklaviert. Die optionale Zugabe von
Antibiotika-Lösungen erfolgt bei den Flüssigmedien unmittelbar vor Gebrauch unter aseptischen
Bedingungen.
Medium
LB-Medium
Zusammensetzung
0,5% Hefeextrakt
1% NaCl
1% Trypton
pH-Wert einstellen auf 7,5 und autoklavieren
LB-Agar
LB-Medium + 1,5% Agar
SOC-Medium
20 mM Glucose
0.5% Hefeextrakt
2,5 mM KCl
10 mM MgSO4
10 mM NaCl
2% Trypton
II.1.7 Bakterienstämme und Plasmide
Die Bakterienstämme werden in LB-Medium mit 50 % DMSO bei -20 °C gelagert.
Bakterien-Stamm
Beschreibung
E. coli BL21 (DE)
E. coli M15 [pREP4]
F- ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3)
(Lucigen)
S
S
S
+
+
Nal , Str , Rif , Thi , Lac , Ara , Gal , Mtl , F ,
RacA+, Uvr+,Lon+ (KanR)
(Qiagen)
F mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15
ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK
rpsL (StrR) endA1 nupG
(Invitrogen)
fhuA2Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80 Δ(lacZ)M15
recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC),endA1 recA1 Ø80dlac
ZΔM15, lacX74 araD139 Δ (ara,leu),7697 galU galK
rpsL nupG λ- tonA /Mini-F laclq1(GentR)
(Lucigen)
E. coli One Shot®TOP10
E. coli NEB5α
gyrA96
E. coli HI-Control 10G
Lieferant
23
Vektorkonstrukt
Selektionsmarker
Beschreibung bzw. Herkunft des
rekombinanten Proteins
pCR®2.1-TOPO®
Ampicillin/
Kanamycin
TA-Klonierungsvektor (Invitrogen)
pCR/NtP5βR
pCR/AbP5βR
pCR/SlP5βR
pCR/StP5βR
pCR/WsP5βR
pCR/LaP5βR
pEtiTe C-His
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Kanamycin
Überexpression von rekombinantem Protein
mit C-terminalem His-Tag
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Ampicillin
Überexpression von rekombinantem Protein
mit N-terminalem His-Tag (Qiagen)
Referenz: Herl et al., 2009
Referenz: Herl et al., 2006
Referenz: diese Arbeit
Ampicillin
Überexpression von rekombinantem Protein
mit N-terminalem His-Tag (Qiagen)
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
Referenz: diese Arbeit
pREP4
Kanamycin
Hilfsplasmid für die Proteinexpression mit
pQE-30 Vektoren in E. coli M15
pRARE2
Chloramphenicol
Hilfsplasmid zur Expression seltener tRNAs in
E. coli
pEtiTe /
pEtiTe /
pEtiTe /
pEtiTe /
pEtiTe /
rDlP5βR
rDlP5βR-10
rDlP5βR-20
rDlP5βR-30
rDlP5βR-40
pQE-30
pQE-30 / rAtP5βR
pQE-30 / rDlP5βR
pQE-30 / rDlP5βR
(Mutante)
pQE-30 UA
pQE-30 UA / rAbP5βR
pQE-30 UA / rEcP5βR
pQE-30 UA / rErhP5βR
pQE-30 UA / rGfP5βR
pQE-30 UA / rMpP5βR
pQE-30 UA/ rMpIPTR
24
Abb. 4: Vektorkarten aller im Rahmen dieser Arbeit genutzten Klonierungs- und Expressionsvektoren.
II.1.8 Molekularbiologische Kits
Handelsname des Kits
Vertreiber
Expresso T7 Cloning and Expression System
Lucigen Corp., Middleton, WI, USA
innuPREPRNA Mini Kit
Analytik Jena AG, Jena, D
peqGOLD® Plasmid Minipräp Kit I
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Phusion Site-directed Mutagenesis Kit
New England Biolabs Inc., Ipswich, USA
QIAquick® Gel Extraktion Kit
Quiagen GmbH, Hilden, D
QIAquick® Gel Purification Kit
Quiagen GmbH, Hilden, D
SuperScriptTM III First-Strand Synthesis
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D
System for RT-PCR
TOPO TA Cloning®
Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D
Die Nutzung der Kits erfolgte nach Angaben des Herstellers. Nähere Angaben finden sich unter II.2.
25
II.1.9 Enzyme
Bezeichnung des Enzyms
Herkunft
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen, D
Lysozym
AppliChem GmbH, Darmstadt, D
Pfu DNA Polymerase
Dr. Christoph Rieck, LS Pharmazeutische
Biologie Uni Erlangen
Phusion(R) High-fidelity DNA Polymerase
New England Biolabs Inc., Ipswich, USA
PeqGOLD Taq DNA Polymerase
PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Restriktionsendonucleasen (DpnI, SalI, SphI,)
Promega GmbH, Fermentas GmbH
Alle Enzyme werden bei – 20 °C aufbewahrt
II.1.10 Oligonukleotid-Primer
Alle Primer, die man zur Mutagenese und zur Klonierung von Genen benutzt, werden nach
Möglichkeit so konzipiert, dass sie eine Schmelztemperatur von ca. 53 °C und einen GC-Gehalt von
40 % besitzen. Ersteres soll gewährleisten, dass für alle Mutagenese-Experimente nur ein einziges
PCR-Programm notwendig ist. Bei den Mutagenese-Primern wird die geplante Fehlpaarung auf
beiden Seiten von mindestens 10 – 12 Basen flankiert, die komplementär an der Zielgensequenz
bindenden (Abb. 5):
Abb. 5: Design der Mutagenese-Primer am Beispiel des P5βR-Gens. Die rote Fehlpaarung muss sich in der Mitte des
Primers befinden und auf beiden Seiten von ca. 10-12 Nt flankiert werden, die komplementär an der Zielsequenz
binden (grün). Der Antisense-Primer (Primer 2, nicht in Abbildung sichtbar) ist revers-komplementär zu Primer 1.
Primer werden bei der Firma Eurogentec (Seraing, Belgien) bestellt und ihre Konzentration
vor der PCR mit Aquabidest auf 20 µM eingestellt. Die Lagerung erfolgt in Aliquots nach Vorgaben
des Herstellers bei -20 °C. Die nachfolgende Tabelle gibt die Nukleotidsequenzen aller verwendeten
Primer wieder.
26
Bezeichung
Sequenz (5'-3')
A. thaliana P5βR Mutagenese-Primer
At_F153A_F
At_F153A_B
At_F343A_F
At_F153A_B
CTT GGC CCT GCC ACC AAC GTT G
CAA CGT TGG TGG CAG GGC CAA G
GTG TGT GGT GGG CTG CTG ATG TTA TAC
GTA TAA CAT CAG CAG CCC ACC ACA CAC
E. crepidifolium P5βR Mutagenese-Primer
Ec_L156V_F
Ec_L156V_B
EcL156V_F2
EcL156V_B2
Ec_T205M_F
Ec_T205M_B
CTT TCA GCA ACG TGG ACG GAC C
GGT CCG TCC ACG TTG CTG AAA G
CAG CAA CGT GGA CGG ACC
GGT CCG TCC ACG TTG CTG
GGC CAA ACA TGA TCT TTG G
CCA AAG ATC ATG TTT GGC C
E. rhaeticum P5βR Mutagenese-Primer
Er_T248M_F
Er_T248M_B
Er_L156V_F
Er_L156V_B
Er_I140V_F
Er_I140V_B
Er_T205M_F
Er_T205M_B
Er_N84D_F
Er_N84D_B
Er_S154E_F
Er_S154E_B
GAA GGC TTC ATG ACG GCT TC
GAA GCC GTC ATG AAG CCT TC
TTT CAG CAA CGT CGG CGG CG
CGC CGC CGA CGT TGC TGA AA
TCC GGC ACG TCT GTC TCC AG
CTG GAG ACA GAC GTG CCG GA
GAA TCC AAA GAT CAT GTT TGG TC
GAC CAA ACA TGA TCT TTG GAT TC
GAT GTC TCC GAC GCT GAA GAT G
CAT CTT CAG CGT CGG AGA CAT C
GGC CCT TTC GAG AAC CTC GGC
GCC GAG GTT CTC GAA AGG GCC
D. lanata P5βR Mutagenese-Primer
T35G_fwd
T35G_rev
T35D_F
T35D_R
A62D_F
A62D_R
R63M_F
R63M_R
R63D_F
R63D_B
R63M_R64N_F
R63M_R64N_B
R63D_R64D_F
R63D_R64D_B
R64D_F
R64D_B
T65P_F
T65P_R
P85A_F
P85A_R
W106A_F
W106A_B
G145A_F
G145A_R
GAT AGT TGG GGT AGG GGA ATC ATC GGC AAC
GTT GCC GAT GAT TCC ACC TAC CCC AAC TAT C
GAT AGT TGG GGT AGA CGG AAT CAT CGG C
GCC GAT GAT TCC GTC TAC CCC AAC TAT C
GGT ATA CGG CGT CGA CCG CCG CAC CAG AC
GTC TGG TGC GGC GGT CGA CGC CGT ATA CC
GTA TAC GGC GTC GCC ATG CGC ACC AGA CCC GC
GCG GGT CTG GTG CGC ATG GCG ACG CCG TAT AC
GTA TAC GGC GTC GCC GAC CGC ACC AGA CCC G
CGG GTC TGG TGC GGT CGG CGA CGC CGT ATA C
GTA TAC GGC GTC GCC ATG AAC ACC AGA CCC GCC TGG C
GCC AGG CGG GTC TGG TGT TCA TGG CGA CGC CGT ATA C
GTA TAC GGC GTC GCC GAC GAC ACC AGA CCC GCC TG
CAG GCG GGT CTG GTG TCG TCG GCG ACG CCG TAT AC
CGG CGT CGC CCG CGA CAC CAG ACC CGC CTG
CAG GCG GGT CTG GTG TCG CGG GCG ACG CCG
GTC GCC CGC CGC CCG AGA CCC GCC TG
CAG GCG GGT CTC GGG CGG CGG GCG AC
CGA CAT ATC CGA TGC AGA TGA CTC CC
GGG AGT CAT CTG CAT CGG ATA TGT CG
GTT CTA CGT TAC CGC GGC TAA TCG ATC
GAT CGA TTA GCC GCG GTA ACG TAG AAC
CAT TGC AGA CTG CTA GGA AGC ATT AC
GTA ATG CTT CCT AGC AGT CTG CAA TG
27
R146T_F
R146T_R
K147A2_F
K147A2_R
M15[0]L_F
M15[0]L_R
F153A_F
F153A_R
Y156V_F
Y156V_R
D181T_L182Q_F
D181T_L182Q_R
G204N_F
G204N_R
N205A_F
N205A_B
N205L_F
N205L_B
N205M_F
N205M_R
M213L_F
M213L_R
M214A_F
M214A_R
S248M_F
S248M_R
S248Y_F
S248Y_B
Y302F_F
Y302F_R
F343A_F
F343A_R
V346A_fwd
V346A_rev
I347A_fwd
I347A_rev
N350V_fwd
N350V_rev
E351P_fwd
E351P_rev
C352G_F
C352G_R
C352M_F
C352M_B
F353M_F
F353M_R
F353P_fwd
F353P_rev
PB_CS_1fwd
PB_CS_1rev
CAT TGC AGA CTG GGA CTA AGC ATT ACA TGG G
CCC ATG TAA TGC TTA GTC CCA GTC TGC AAT G
GAC TGG GAG GGC GCA TTA CAT GG
CCA TGT AAT CGC CCC TCC CAG TC
GAG GAA GCA TTA CCT GGG ACC ATT TG
CAA ATG GTC CCA GGT AAT GCT TCC TC
CAT GGG ACC AGC TGA ATC CTA CGG
CCG TAG GAT TCA GCT GGT CCC ATG
CCA TTT GAA TCC GTC GGG AAA ATA GA
TCT ATT TTC CCG ACG GAT TCA AAT GG
CAT GAA CTT TTA CTA TAC TCA AGA GGA TAT TAT GCT TGA GG
CCT CAA GCA TAA TAT CCT CTT GAG TAT AGT AAA AGT TCA TG
GTT CAT CGC CCA AAC AAT ATA TTC GGG
CCC GAA TAT ATT GTT TGG GCG ATG AAC
CAT CGC CCA GGG GCT ATA TTC GGG
CCC GAA TAT AGC CCC TGG GCG ATG
GCC CAG GGC TGA TAT TCG G
CCG AAT ATC AGC CCT GGG C
CAT CGC CCA GGG ATG ATA TTC GGG TTT TC
GAA AAC CCG AAT ATC ATC CCT GGG CGA TG
CTC CAT ATA GTC TGA TGA ATT TGG TGG G
CCC ACC AA TTC ATC AGA CTA TAT GGA G
CCA TAT AGT ATG GCG AAT TTG GTG GG
CCC ACC AAA TTC GCC ATA CTA TAT GG
GGG ATG GGT ACA TGG ATT GCT CTG
CAG AGC AAT CCA TGT ACC CAT CCC
GGG ATG GGT ACT ATG ATT GCT CTG ATG
CAT CAG AGC AAT CAT AGT ACC CAT CCC
GGT GTG GAG AGT TTG AAG AAG GGG
CCC CTT CTT CAA ACT CTC CAC ACC
CGG AAT TTG GTG GGC TGG TGA TGT TAT AC
GTA TAA CAT CAC CAG CCC ACC AAA TTC CG
GTG GTT TGG TGA TGC TAT ACT TGG GAA TG
CAT TCC CAA GTA TAG CAT CAC CAA ACC AC
GGT TTG GTG ATG TTG TCC TTG GGA ATG AG
CTC ATT CCC AAG GAC AAC ATC ACC AAA CC
GTT ATA CTT GGG GTC GAG TGT TTC CTG G
CCA GGA AAC ACT CGA CCC CAA GTA TAA C
GTT ATA CTT GGG AAT CCG TGT TTC CTG GAT AG
CTA TCC AGG AAA CAC GGA TTC CCA AGT ATA AC
CTT GGG AAT GAG GGT TTC CTG GAT AG
CTA TCC AGG AAA CCC TCA TTC CCA AG
CTT GGG AAT GAG ATG TTC CTG GAT AGT ATG
CAT ACT ATC CAG GAA CAT CTC ATT CCC AAG
GGG AAT GAG TGT ATG CTG GAT AGT ATG AAC
GTT CAT ACT ATC CAG CAT ACA CTC ATT CCC
GGG AAT GAG TGT CCG CTG GAT AGT ATG
CAT ACT ATC CAG CGG ACA CTC ATT CCC
GTA TAC GGC GTC GAC ATG AAC ACC AGA CCC GCC
GGC GGG TCT GGT GTT CAT GTC GAC GCC GTA TAC
Primer für Deletionsmutagenese der rDlP5βR
MbdirGATE
VH1188brev
KR_pETite_rev_C
KR_pETite_dir_C
KR_Mut30_Rev
KR_Mut30_For
CAC CAT GAG YTG GTG GTG GGC T
AAC CAT GTC AAG GAA CAA TC
GTG ATG GTG GTG ATG ATG AGG AAC AAT CTT GTA AGC TTT TG
GAA GGA GAT ATA CAT ATG AGC TGG TGG TGG G
CAT ATG TAT ATC TCC TTC TTA TAG TTA AAC
ATA GTT GGG GTA ACC GG
28
Primer zur Klonierung von P5βR
PB_Mp_rev
Ntdir1
Ntrev1
NtdirSac1
NtrevHind3
ZmPORdir
ZmPORrev
PB_Rc_dir
PB_Rc_rev
PB_MP_IPTR_fwd
PB_MP_IPTR_rev
Gen_Dir
Gen_Rev
Ery_Dir
Erysalrev
PB_Can_fwd
PB_Can_bwd
GGC ACC ATY CTG TAN GCY AA
ATG AGC TGG TGG GCT
CTA AGG AAC AAC TTT GTA GGC
TAT AGA GCT CAT GAG GTG GTG GGC TGG
TAT AAA GCT TCT AAG GAA CAA CTT TGT AGG C
ATG AGC TTG AGC TGG TGG TGG
TCA AGG AAT AAT CTT GTA
ATG AGC TGG TGG TGG C
TCA AGG CAC AAT CTT ATA CGA CT
ATG GCA GAA GTA CAG AGG TAT GC
TTA ATA GAG AGC CAA AGC TTT GTC TCG
ATG AGY TGG TGG TGG GCT
AGG AAC AAT CTT GTA AGC CTT
ATG AGT TGG TGG GGG
TAT AGT CGA CTG GAA ATC AAG GCA CGA TCT
ATG AGC TGG TGG TGG
GCA TAC Å ATT GTG CCT TGA
II.1.11 Verbrauchsmaterialien
Bezeichnung
Firma
Amicon Ultra 10000 MWCO (UltracellTM)
Millipore, Carrigtwohill, I
DC-Aluminium Platten, Kieselgel 60 F254
Merck KGaA, Darmstadt, D
Reaktionsgefäße 0,1; 0,5; 1,5 und 2 mL
Sarstedt AG, Nümbrecht, D
PD-10 Colums (SephadexTM G-25M)
Amersham Biosciences Europe GmbH,
Freiburg, D
Pipettenspitzen 10 µL, 100 µL, 1000 µL
Sarstedt AG, Nümbrecht, D
Petrischalen, steril, Ø 8,5 cm
Greiner GmbH, Frickenhausen, D
Spritzenvorsatzfilter, steril, 0,45 µm Membran
Merck Labor, Bruchsal, D
UV/Vis-Küvetten
Sarstedt AG, Nümbrecht, D
II.1.12 Geräte
Bezeichnung
Firma
Autoklaven
Systec 5075 ELVC
Systec GmbH, Wettenberg, D
Systec DE-45
Systec GmbH, Wettenberg, D
Brutschrank
Heraeus B 5050
Heraeus Holding GmbH, Hanau, D
DC-Kammer
Desaga GmbH, Heidelberg, D
DC-Tauchkammer
Desaga GmbH, Heidelberg, D
DC Workstation CAB UVIS
Desage GmbH, Heidelberg, D
29
Gaschromatographie
GCMS-QP2010S
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D
AOC-20i Auto Injector
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D
Agarose Gelkammer 40-1214
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Heizblöcke
Digitaler Blockheizer HX-2
Peqlab GmbH, Erlangen, D
HPLC 2487 Dual λ Absorbance Detector
Waters Corporation, Milford MA, USA
1525 Binary WPLC Pump
Waters Corporation, Milford MA, USA
717plus Autosampler
Waters Corporation, Milford MA, USA
Symmetry C18 5µL, 1,6 x 150 mm Col.
Waters Corporation, Milford MA, USA
Inkubator G24 environmental incubator shaker
New Brunswick, NJ, USA
Magnetrührer
REC-G
Janke & Kunkel GmbH, Staufen, D
VMS – C7
VWR International, Darmstadt, D
Microprocessor pH-Meter pH 537
Wiss. Technische Werkstätten, Weilheim, D
Milli-Q Gradient A10
Millipore Corparate, Billerica MA, USA
Mikrowelle (MW 9716) Severin 700 & Grill
Severin Elektrogeräte GmbH, Sundern, D
Photometer
GeneQuant pro
Amersham Biosciences Europe GmBH,
Freiburg, D
®
NanoDrop ND-1000
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Novaspec Plus
Amersham Bioscience Europe GmbH, Freiburg
Pipetten
peqpette, div.
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Gilson pipetman
Agarose- / Protein-Elektrophorese
peqPOWER 250
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Schüttler
Infors HT Multitron
Infors GmbH, Einsbach, D
Gerhardt R05
C. Gerhardt GmbH Co. KG, D
Sterilbank
Meissner & Wurst GmbH, Stuttgart, D
Thermocycler
Thermocycler T3
Biometra GmbH, Göttingen, D
peqSTAR 96 Universal Gradient
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Thermomixer
30
Thermomixer comfort
Eppendorf AG, Hamburg, D
Thermomixer compact
Eppendorf AG, Hamburg, D
Thriller Thermomixer
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Ultraschallbad Sonorex
Bandelin Ultraschall GmbH, Berlin, D
Ultraschall-Homogenisator Sonoplus, HD 2070
Bandelin Ultraschall GmbH, Berlin, D
UV-Photometer
UV2450
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D
Temperature Control
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg, D
Vortex-Mischer
Vortex Genie® 2 G560 E
neoLab Migge GmbH, Heidelberg, D
Vortex Mixer neoLab 7-2020
neoLab Migge GmbH, Heidelberg, D
Waagen
Kern EMB 220-2M
Kern & Sohn GmbH, Baligen, D
Ohaus Pioneer PA114
Ohaus Corp. Pine Brook, NJ, USA
Wasserbad
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach, D
Zentrifugen
PerfectSpin 24R
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Kühlzentrifuge Sorvall RC 5B Plus
Kendro Laboratory GmbH, München, D
II.1.13 DNA- und Proteinmarker
DNA-Marker
Protein-Marker
Quick-Load(R) 1 kb DNA Ladder
(New England Biolabs, Frankfurt am Main, D)
Precision Plus ProteinTM Standards
(BioRad GmbH, München, D)
31
II.2. Methoden
II.2.1 Klonierung und Mutation von Genen
II.2.1.1 Isolierung von genomischer DNA (gDNA)
Die Methode zur Isolierung genomischer DNA aus Pflanzenmaterial beruht auf einem
Hinweis von E. Souza-Canada vom LS für Pflanzenphysiologie der Universität Bayreuth. 100 mg
frisches Blatt-Material wird mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und mit Mörser und Pistill
möglichst fein zerkleinert. Das Pulver wird noch im gefrorenen Zustand mit 1330 µL
vorgewärmtem Extraktionspuffer versetzt und 15 min bei 65 °C inkubiert. Nach einer Abkühlphase
von 1 min werden 650 µL Chloroform/Isoamylalkohol zugegeben und 5 min bei RT und 300 Upm
geschüttelt. Die beiden Phasen werden durch Zentrifugation (13000 Upm /5 min) getrennt, die
organische Phase wird verworfen. Durch Zugabe von 700 µL Isopropanol wird die gDNA bei RT
gefällt (2 min). Man zentrifugiert erneut bei 13500 Upm für 5 min und wäscht das Zellpellet mit 1
mL eiskaltem 70 %-igem EtOH. Nach dem Trocknen wird das DNA-Pellet in 100 µL Aqua bidest
gelöst und die Konzentration bestimmt. Die Lösung wird bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.
Optional kann nach der Chloroform-Extraktion ein RNase-Verdau durchgeführt werden.
II.2.1.2 Isolierung der Gesamt-RNA
Neben der gDNA war v.a. die pflanzliche RNA Ausgangspunkt für die Klonierung neuer
P5βR. Alle Arbeiten mit RNA werden auf Grund einer potentiellen Kontaminationsgefahr durch
RNasen mit speziell vorbehandelten Gerätschaften durchgeführt. Mörser, Pistille, Spatel werden für
mindestens 4 h bei 200 °C sterilisiert, die Verbrauchsmaterialien werden RNase-frei bezogen und
die Handschuhe regelmäßig nach jedem Arbeitsschritt gewechselt.
Zur Isolierung der Gesamt-RNA wird das innuPREP Plant RNA Mini Kit (Analytik Jena)
verwendet. Als Ausgangsmaterial der Gewinnung der RNA wird analog der Hersteller-Vorschrift
frisch geerntetes Blatt-Material eingesetzt, welches in flüssigem Stickstoff schockgefroren zu einem
feinen Pulver zerrieben wird.
Bis zu 200 µg dieses Pulvers werden mit einem der beiden
mitgelieferten Puffer versetzt und für 10 min bei Raumtemperatur geschüttelt. Bei der Arbeit mit
neuen Pflanzen zu denen keine Erfahrungswerte vorliegen, werden bei der erstmaligen RNAIsolierung jeweils beide im Kit enthaltenen Puffer (RL und PL) getestet. Die Gesamt-RNA wird
nach der Reinigung mit 30 µL RNase-freiem Wasser von der Säule eluiert und die Konzentration
bzw. Reinheit photometrisch bestimmt. Bis zum weiteren Gebrauch erfolgt die Lagerung bei - 80
°C.
32
II.2.1.3 Umschreiben von Poly(A)+-RNA in cDNA
Die Synthese der P5βR cDNA wird mit dem SuperScriptTM III First-Strand Synthesis for
reverse transcription PCR (RT-PCR) Kit (Invitrogen GmbH, Darmstadt) nach dem folgenden
Pipettierschema in einem Thermocycler mit Oligo(dT)20-Primern durchgeführt:
1. Denaturierung
RNA
Primer
dNTPs-Mix
DEPC-Wasser
5 µg
50 µM
je 250 µM
ad 10 µL
65 °C, 5 min
2. Inkubation
0 °C (auf Eis), 1 min
3. RT-Reaktion
Zugabe von 10 µL cDNA-Synthese-Mix
1x1
5 mM1
10 mM1
40 U
200 U
RT-Puffer (10x)
MgCl2
DTT
RnaseOUTTM
SuperScriptTM III RT
1
4. Termination
5. RNase-Verdau
Endkonzentration in 20 µL
50 °C, 50 min
85 °C, 5 min
Zugabe von 2 U RNase H
37 °C, 20 min
2 µL der synthetisierten cDNA werden als Template für eine PCR mit genspezifischen P5βR
Primern eingesetzt. Die restliche cDNA wird bei -20 °C gelagert.
II.2.1.4 Standard-/RT-PCR
Die Vermehrung von bestimmten gDNA- und cDNA-Fragmenten erfolgt mit Hilfe der
Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bei der Klonierung von unbekannten, orthologen Progesteron-5Reduktasen werden hierbei genspezifische Primer der am nächsten verwandten Art verwendet.
Folgender PCR-Ansatz wird auf Eis pipettiert:
Ansatz
Template/cDNA
Antisense-/Senseprimer
dNTP-Mix
Y- Puffer (10x)
Taq-DNA-Polymerase
Aquabidest
Standard-PCR / RT-PCR
2 ng
je 1 µM
50 mM
5 µL
2U
ad 50 µL
33
PCR Programm
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
94 °C
94 °C
50 °C
72 °C
72 °C
3 min
20 sek
30 sek
2 min
10 min
x 30 Zyklen
II.2.1.5 Agarose-Gelelektrophorese
Das
bei
einer
Restriktionsendonukleasen
PCR
erhaltene
geschnitten
DNA-Amplifikat
wurden,
werden
zur
und
Plasmide,
Kontrolle
die
mit
mittels Agarose-
Gelelektrophorese in einzelne DNA-Fragmente aufgetrennt und analysiert. Für alle Banden
zwischen 0,5 und 7 kb wird ein 1 %-iges Gel eingesetzt. 5 g Agarose werden abgewogen und in 500
mL 1 x TAE Puffer suspendiert. Die Suspension wird in der Mikrowelle erhitzt bis eine homogene,
klare Lösung entstanden ist. Man wartet bis diese auf etwa 50-60 °C abgekühlt ist und gießt dann
ein Gel.
Die zu untersuchende DNA-Lösung wird mit 0,1 VT 10 x DNA-Stopppuffer versetzt und
nach dem Auspolymerisieren des Gels mit einer Pipette in die Geltaschen transferiert. Als Referenz
werden parallel 5 µl SmartLadder (Eurogentec) DNA-Marker (1 kb oder 0,5 kb) aufgetragen.
Überschüssige Agarose-Lösung wird bis zu ihrer Verwendung im Trockenschrank bei 60°C
aufbewahrt. Die elektrophoretische Trennung der DNA erfolgt bei einer konstanten Spannung von
70 V. Das Gel wird anschließend für 20 min in einer 0,1%-igen Ethidiumbromidlösung inkubiert.
Die Auswertung und Dokumentation des Ergebnisses erfolgt bei einer Wellenlänge von
λ = 305 nm.
II.2.1.6 Aufreinigung von DNA aus Agarose-Gelen („freeze'N squeeze“)
Durch Ethidiumbromid-Interkalation sichtbar gemachte DNA-Fragmente gewünschter
Größe werden von störenden Begleitbanden im Anschluss an eine Agarose-Gelelektrophorese unter
UV-Licht (λ = 365 nm; Intensität = 70 %) mittels Skalpell zügig aus dem Gel geschnitten. Das
extrahierte Gel-Fragment wird in Parafilm gewickelt und bei -80°C für 10 min bis zur völligen
Erhärtung eingefroren. Anschließend wird durch mechanischen Druck der Finger die Flüssigkeit
inklusive der darin enthaltenen DNA aus diesem gefrorenen Gelstück in ein 1,5 mL EppendorfGefäß gepresst.
Die wässrige DNA-Lösung wird mit 0,75 VT Isopropanol (bzw. 2 VT Ethanol) versetzt und
gut gemischt. Diese Mischung wird zur Präzipitation der Nucleinsäuren zunächst für 15 min bei -20
°C belassen und daraufhin für 30 min bei 4 °C und 13000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wird
34
verworfen und das DNA-Pellet mit eiskaltem 70 %-igem Ethanol gewaschen. Nach einem weiteren
5-minütigen Zentrifugationsschritt wird der Überstand komplett entfernt. Das Pellet wird bei 40 °C
im Heizblock für 10 min getrocknet und je nach Anfangskonzentration der DNA vor der GelElektrophorese in der gewünschten Menge Aqua bidest gelöst. Die DNA-Lösung wird bis zum
Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt.
II.2.1.7 Konzentrierung und Reinigung von PCR-Produkten
Die Reinigung und Konzentrierung von amplifizierter DNA aus PCR-Reaktionen erfolgt mit
dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). Abhängig von der Konzentration der DNA werden
1-4 PCR Ansätze über dieselbe Säule gereinigt, um die Konzentration des gereinigten Produkts zu
erhöhen. Es wird nach der Vorschrift des Herstellers weitergearbeitet (QIAquick ® Spine Handbook,
Version 2002) und mit 30 - 50 µL Aquabidest eluiert. Die Aufbewahrung erfolgt bei -20 °C.
II.2.1.8 pQE30-UA- / TOPO-TA-Klonierung
Das Vorgehen bei der direkten Klonierung von gereinigten PCR-Produkten in den pQE-30
UA-Expressionsvektor erfolgt nach dem Protokoll 1 (Ligation with pQE30 UA) des
QIAexpressionistTM (Stand Juni 2003). Die direkte Klonierung in den TOPO-TA-Vektor
(Invitrogen GmbH, Karlsruhe, D) erfolgt nach Anleitung des Herstellers (Version U, Stand 2006).
Für beide Methoden sind weder Restriktionsverdau noch Ligase notwendig, allerdings muss in der
vorangehenden PCR taq-Polymerase genutzt werden, damit PCR-Produkte mit 5'-A-Überhängen
vorhanden sind.
Für die Ligation in den pQE30-UA Vektor wird ein molekulares Vektor:Insert-Verhältnis von 1:10
gewählt. Bei den P5βR-Genen entspricht dies etwa 200 ng gereinigtem PCR-Produkt. Die
Reaktionsansätze setzen sich wie folgt zusammen:
pQE30-UA-Klonierung
pQE-30 UA Vektor (50 ng/µL)
1 µL
gereinigtes PCR Produkt
1-4 µL (200 ng)
2 x Ligation Master Mix
5 µL
Aquabidest
ad 5 µL
Der Ligationsansatz wird für 2 h bei 16 °C im Thermoblock belassen und anschließend in
chemisch kompetente E. coli Zellen transformiert.
TOPO-TA Klonierung
pCR 2.1-TOPO Vektor
1 µL
Gereinigtes PCR-Produkt
2 - 4 µL
Salzlösung
1 µL
Aquabidest
ad 6 µL
35
II.2.1.9 Herstellung von kompetenten E. coli Zellen
Die Transformation von Plasmid-DNA in Bakterienzellen stellt einen notwendigen Schritt
für die Vermehrung von DNA oder die Expression von rekombinanten Proteinen dar. Voraussetzung
hierfür ist, dass die verschiedenen E. coli Laborstämme zunächst so behandelt werden, dass sie
chemisch kompetent werden. Es wird auf die Calciumchlorid-Methode nach Mülhardt (2008)
zurückgegriffen: 1 mL einer Übernachtkultur des Bakterienstamms wird in 400 mL LB-Medium
überführt und bis zu einer OD 595 von 0,6 in einem Schikane-Kolben bei 37 °C und 200 Upm
inkubiert. Anschließend wird die Kultur auf Eis abgekühlt und bei 4 °C und 4000 Upm
abzentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet in 100 mL CaCl2 RL resuspendiert. Es
wird erneut zentrifugiert, resuspendiert und zentrifugiert. Das Pellet wird nach diesen
Waschschritten in 10 mL CaCl 2 RL resuspendiert und unter der Impfbank steril zu je 100 µL
Portionen aliquotiert. Die Aufbewahrung erfolgt bei - 80 °C.
II.2.1.10 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli
Die Transformation von Plasmid-DNA in kompetente Zellen dient deren Vermehrung oder
Lagerung. Hierzu werden chemisch kompetente Zellen 5 min auf Eis aufgetaut, 1 ng eines Plasmids
(bzw. 5 µL eines durchschnittlichen Mutations- oder Ligationsansatzes) zugegeben und sehr
vorsichtig gemischt. Man lässt die Mischung für 30 min auf Eis stehen und platziert sie
anschließend für 30 s bei 42 °C in einen Thermoblock. Nach diesem Hitzeschock werden 100 µL
SOC-Medium zugegeben und der komplette Ansatz auf einer vortemperierten, antibiotikahaltigen
Agar-Platte mit einer sterilen Pipettenspitze ausplattiert. Die Wahl des Antibiotikums richtet sich
nach dem neu in die Bakterienzelle eingeführten Resistenz-Gen. Die Platte wird über Nacht bei 37
°C inkubiert. Sind am nächsten Tag Bakterien-Kolonien sichtbar, werden sie mit einem sterilen
Zahnstocher in eine 3 mL LB-Kultur überführt.
II.2.1.11 Colony-PCR
Bei der Colony-PCR handelt es sich um eine Modifikation der Standard-PCR-Methode (Van
Zeijl et al., 1998). Während diese allerdings zur Vermehrung von P5βR-Genen zum Zwecke der
Klonierung Anwendung findet, wird die Colony-PCR genutzt um Bakterienkolonien zu
identifizieren, bei denen die Aufnahme eines Klonierungs- oder Expressionsplasmides mit dem
gewünschten ORF erfolgreich stattgefunden hat. Je nach Anzahl der zu untersuchenden Kolonien
wird der folgende PCR-Mastermix vorbereitet und in einem PCR-Gefäß vorgelegt:
36
Ansatz
Insertspezifische Primer
Y-Buffer (10x)
Taq-DNA Polymerase
dNTPs-Mix
H20bidest
je 1µM
2,5 µL
0.5 U
50 mM
ad 25 µL
Statt einer Template-DNA wird eine Bakterienkolonie mit einem sterilen Zahnstocher
aufgenommen und im vorbereitetem PCR-Mix steril unter Laminar-Flow suspendiert. Der
Zahnstocher mit den Resten der Kolonie wird in 3 mL LB-Medium überführt (Inkubation über
Nacht bei 37 °C und 180 Upm). Die PCR-Programm für die Colony-PCR für alle P5βR ist:
Colony-PCR Programm
Initiale Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
94 °C
94 °C
50 °C
72 °C
72 °C
10 min
20 sek
30 sek
2 min
10 min
x 30 Zyklen
Die Identifizierung der positiven Klone erfolgt nach Agarose-Gelelektrophorese der PCRAnsätze.
II.2.1.12 Blau-Weiß-Selektion
Um E. coli Klone, die ein TOPO-Plasmid mit erfolgreich in das lacZ'-Gen integriertem
PCR-Produkt besitzen, zu identifizieren, wird die Blau-Weiss-Selektion angewendet. Man verteilt
50 µL X-Gal-Lösung unter sterilen Bedingungen auf einer Agar-Platte und wartet bis diese völlig
getrocknet ist. Die frisch transformierte Bakterien-Suspension wird auf der so vorbereiteten Platte
ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Bakterien-Kolonien, die Plasmide mit Insert
aufgenommen haben, zeichnen sich am nächsten Morgen durch eine weiße Färbung aus. Nur diese
werden weiter untersucht.
II.2.1.13 Mutagenese-PCR
Zum ortsgerichteten Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren wird eine modifizierte
Stratagene QuikchangeTM Methode (Stratagene, Santa Clara, CA, USA) verwendet. Die Primer
werden so konzipiert, wie es unter II.1.10 beschrieben wurde. Der 25 µL PCR-Ansatz wird zunächst
halbiert, wobei jede Hälfte nur einen der beiden komplementären Primer enthält. Für die
Mutagenese ist eine high-fidelity DNA-Polymerase ohne 5'-3'-Exonuclease-Funktion (Phusion- oder
pfu-DNA-Polymerase) obligatorisch:
37
PCR-Ansatz
Template DNA
Sense-/Antisense-Primer
dNTP-Mix
Phusion-DNA-Polymerase
H20bidest
PCR-Programm 1
Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Pause
98 °C
98 °C
50-55 °C
72 °C
2 ng / µL
je 1 µM
50 µM
2,5 U
ad 25 µl
1 min
20 sek
30 sek
1 min
5 Zyklen
Nach 5 Zyklen werden beide Teile ad 25 µL vereint und für weitere 30 Zyklen in den
Thermozykler gegeben. Die Annealingtemperatur kann hierbei aus Gründen der Ausbeute unter
Umständen auf 50 °C gesenkt werden.
PCR-Programm 2
Denaturierung
Denaturierung
Annealing
Elongation
Finale Elongation
98 °C
98 °C
50 °C
72 °C
72 °C
1 min
20 sek
30 sek
1 min
5 min
30 Zyklen
Das Ergebnis der PCR-Reaktion wird über 1 %-ige Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.
Um die Template-DNA zu zerstören folgt ein DpnI-Restriktionsverdau.
II.2.1.14 Plasmid-Isolierung
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus E. coli Zellen erfolgt unter Verwendung des
peqGOLD Plasmid Minipräp Kit I (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland) mit
leichten Modifikationen der Hersteller-Vorschriften (Protokoll A). Je nach erwarteter DNAAusbeute, die sich aus den Erfahrungswerten für die Kombination von bestimmten Plasmiden mit
bestimmten Bakterienstämmen ergibt, werden 2 - 4 mL einer LB-Übernachtkultur eingesetzt. Nach
Zugabe der Lösung III wird das Präzipitat für 30-45 min bei 13500 Upm zentrifugiert, um eine
bessere
Abtrennung
von
unerwünschten
Nicht-Plasmidbestandteilen
zu
erreichen.
Die
Konzentration und Reinheit der in 50 µL Aquabidest eluierten DNA wird photometrisch bestimmt. Die
DNA-Lösung wird bei -20 °C aufbewahrt.
II.2.1.15 Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von RNA und DNA
Die Qualität und Quantität von wässrigen DNA- und RNA-Lösungen werden photometrisch
mit einem NANODROP ND-2000 Spektrophotometer ermittelt. Der Nullabgleich des Geräts wird
38
mit Aquabidest oder Elutionspuffer durchgeführt. 1 µL der Lösung wird auf das Messsystem
aufgebracht und die Konzentration über die Absorption der DNA-Bestandteile bei einer
Wellenlänge von λ=260 nm bestimmt. Die Reinheit der Analyse ergibt sich aus dem Quotienten R
und dem Vergleich mit den theoretischen Sollwerten (Lottspeich und Zorbas, 2006).
R = A260 / A280
(SollwertDNA = 1,8; SollwertRNA = 2,0)
II.2.1.16 DNA-Sequenzierung
Plasmide mit putativ mutiertem P5βR-Gen oder eingebautem PCR-Produkt werden zur
endgültigen Verifizierung der erfolgreichen Klonierung zur Sequenzierung nach Sanger an die
Firma GATC Biotech AG (Konstanz, Deutschland) oder Eurofins MWG Operon (Ebersberg,
Deutschland) geschickt. Die Plasmid-Konzentration muss hierzu im Bereich zwischen 20 – 100
ng/µL liegen und der Reinheitsquotient möglichst nahe bei 1,8 sein. Von den Firmen gelieferte
Ergebnisse werden bioinformatisch, u.a. mit Hilfe von Alignment- und BLASTn-Algorithmen,
analysiert.
II.2.1.17 Langzeit-Lagerung von Bakterienstämmen
Alle E. coli Stämme mit erfolgreich aufgenommenen Plasmiden werden in Form von
Glycerol- oder DMSO-Stocks in eine haltbare Dauerkultur überführt. Dazu wird 1 mL frische
Bakterienkultur mit 1 mL Glycerol oder 1 mL DMSO versetzt und intensiv gemischt. Diese
Glycerol-/DMSO-Stocks können bei – 80 °C über Jahre aufbewahrt werden (Mühlhardt, 2009). Mit
20 µL dieser Lösung werden
bei einer erneuten Inkulturnahme 3 mL sterile LB-Kulturen
angeimpft.
II.2.1.18 DpnI-Verdau
Zur selektiven Entfernung von methylierter DNA (z.B. PCR-Templates) wurde ein 25 µL-PCRAnsatz mit 2 µL Enzym (= 20 U) über 2 h bei 37 °C verdaut.
39
II.2.2 Heterologe Protein-Expression in E. coli
II.2.2.1 Kultivierung von E. coli M15[pREP4] und Induktion der Proteinexpression
Eine 20 mL LB-Kultur wird mit 20 µL eines E. coli M15[pREP4] DMSO-Stocks, der das pQE-30
Vektorkonstrukt für die Produktion des gewünschten rekombinanten Proteins beinhaltet, unter
sterilen Bedingungen angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Um den Selektionsdruck
aufrecht zu erhalten, werden dieser LB-Vorkultur und der späteren LB-Hauptkultur Kanamycin (25
µg/mL) und Ampicillin (100 µg/mL) zugesetzt.
Die komplette Vorkultur wird am folgenden Tag in 1000 mL vorgewärmtes, autoklaviertes LBMedium (Schikane-Kolben) überführt und bei 37 °C / 180 Upm auf einem Schüttler bis zu einer
OD600 von 0,7 kultiviert. Anschließend erfolgt die Induktion der Proteinexpression mit 100 µL einer
1M IPTG-Lösung. Die Kulturen werden für 96 h bei 4 °C / 100 Upm geschüttelt.
Das Ernten der Kulturen erfolgt durch Zentrifugation bei 4 °C und 4500 Upm. Aus 1000 mL Kultur
werden zwei Zellpellets gewonnen, die bis zu ihrer Verwendung bei -20 °C aufbewahrt werden
können.
II.2.2.2 Zell-Lyse und native His-tag-Affinitätschromatographie
Alle Arbeitsschritte, vom Ernten der Bakterienkulturen bis zur Aufreinigung des
rekombinanten Proteins, werden bei 4 °C durchgeführt. Schockgefrorende Zellpellets werden vor
der Verarbeitung 30 min aufgetaut. Zwei aus je 500 mL derselben Bakterienkultur gewonnenen
Bakterienpellets werden jeweils in 5 - 10 mL einer Mischung aus Lysepuffer und Lysozym (1
mg/mL) redispergiert und die Suspension für 30 min inkubiert. Nach Ablauf dieser Zeitspanne
werden die Zellen durch eine Ultraschall-Behandlung aufgeschlossen (Sonoplus; 6 10-s-Intervalle
mit einer Zwischenpause von jeweils 10 s). Mittels Zentrifugation wird das lösliche Protein von
unerwünschten Abfallprodukten abgetrennt (20.000 Upm; 15 min). Der Überstand wird
portionsweise auf eine Ni-NTA-Säule aufgebracht, für 60 min bei 300 Upm geschüttelt und die
Aufreinigung des nativen Proteins entsprechend dem Protokoll Nr. 12 des „The QIAexpressionist“Handbuchs (Auflage Juni 2003) durchgeführt. Das rekombinante Protein wird mit 1 x 1 mL und 3 x
0,5 mL von der Säule eluiert. Gegebenenfalls werden Proben für die SDS-Analytik bzw. die
Gehaltsbestimmung entnommen.
40
II.2.3 Proteinbiochemische Methoden
II.2.3.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinen
Zur Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration wird auf die von Bradford (1976)
beschriebene Methode zurückgegriffen. Unter Rühren wird 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250
in einer Mischung aus 50 mL Ethanol 96 % und 100 mL o-Phosphorsäure 85 % gelöst. Mit Aqua bidest
wird daraufhin auf 1000 mL aufgefüllt und filtriert. Der Faktor der erhaltenen Bradford-RL wird
über eine Eichgrade mittels verschiedener Konzentrationen von Rinderserumalbumin abgeleitet.
20 µL der zu bestimmenden Lösung werden mit 2 mL der Bradford-RL versetzt und für 10
min bei RT inkubiert. In dieser Zeit wird mehrfach auf- und abpipettiert, um die Mischungen
vollständig zu homogenisieren. Nach Ablauf der Reaktionszeit wird die Intensität des blauen
Farbstoff-Proteinkomplexes gegen eine parallel bearbeitete Negativkontrolle, bestehend aus
Pufferlösung ohne Protein und Bradford-RL, photometrisch bei einer Wellenlänge von λ = 595 nm
bestimmt. Die Konzentration der Protein-Lösung berechnet sich wie folgt:
Proteinkonzentration [mg/mL] =
Durchschnittlich gemessene Extinktion595 x Faktor
Volumen der Probenlösung [ = 20 µL]
II.2.3.2 Umpuffern von Proteinproben
Zum
Abtrennen
von
eventuellen
niedermolekularen
Verunreinigungen
vor
der
Durchführung von P5βR-Assays und für Kristallisationsversuche wird das Protein mittels PD-10
Säulen (SephadexTM G-25M) aus dem Elutionspuffer in den entsprechenden Zielpuffer überführt
(z.B. P5βR-Assaypuffer). Die Säule wird hierzu erst mit 3 x 3 mL des Zielpuffers äquilibriert, bevor
2,5 mL Proteinlösung aufgebracht werden können. Der Durchfluss wird verworfen und das
rekombinante Protein mit 3,5 mL Zielpuffer von der Säule eluiert. Die Proteinlösung wird entweder
bis zur zeitnahen Verwendung bei -4 °C gelagert oder nach Zugabe von 5 % Glycerol bei -20 °C
eingefroren.
II.2.3.3 Konzentrierung von Proteinlösungen
Zur Einkonzentrierung von Proteinlösungen mit niedrigem Proteingehalt werden Amicon
Ultra 10000 MWCO Säulen entsprechend den Angaben des Herstellers verwendet.
II.2.3.4 SDS-PAGE
Die
Überprüfung
der
Proteinexpression
geschieht
durch
die
Polyacrylamid-
Gelelektrophorese (SDS-PAGE). Die Molekulargewichtsbestimmung der gereinigten Proteine
erfolgt über den Vergleich mit einem Molekulargewichtsmarker (II.1.13).
41
Sämtliche Utensilien werden vor Verwendung mit 70 %-igem Ethanol gereinigt. Der
Zusammenbau der Gießapparatur erfolgt nach Herstellerangaben. Als erstes werden Trenn- und
Sammelgel in separaten Gefäßen vorbereitet:
Bestandteil
Trenngel
Sammelgel
Acrylamid 30 %
4 x Trenngelpuffer
4 x Sammelgelpuffer
Aquabidest
TEMED
APS
1600 µL
1000 µL
1400 µL
3 µL
25 µL
330 µL
500 µL
1170 µL
3 µL
25 µL
Das Trenngel wird gegossen und mit 0,1%-iger SDS-Lösung überschichtet. Diese Lösung
wird, nachdem die Polymerisation vollständig abgelaufen ist, wieder entfernt. Daraufhin wird das
Sammelgel gegossen und der Kamm zur Aussparung der Geltaschen eingesetzt. Das fertige SDSGel wird in die Elektrophorese-Apparatur eingesetzt, die zunächst im Innen- und darauf im
Außenraum mit Elektrophoresepuffer befüllt wird. Anschließend wird der Kamm gezogen und die
Geltaschen mehrfach mit Pufferlösung gespült, um eventuelle Gelreste zu entfernen.
16 µL Proteinprobe werden mit 4 µL 5 x SDS-Probenpuffer versetzt und für 10 min bei 100
°C hitzedenaturiert. Nach dem Abkühlen wird kurz zentrifugiert und die Geltaschen werden mit
jeweils 20 µL der vorbereiteten Proben beladen. Pro Gel werden 5 µL Marker (Precision Plus
Protein Standards) eingesetzt.
Der Elektrophese-Lauf erfolgt zweiphasig: Bis zum Erreichen des Trenngels (ca. 20 min)
wird eine Spannung von 70 V angelegt, die dann für die restliche Zeit (ca. 90 min) auf 200 V erhöht
wird. Die Detektion der Proteinbanden erfolgt durch Anfärbung mit Coomassie brilliant blue (siehe
II.2.3.5).
II.2.3.5 Proteinfärbung mit Coomassie brilliant blue
SDS-Gele werden nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proben für 1 h unter
Schütteln in 100 mL Coomassie-Färber-RL inkubiert. Anschließend wird das vollständig gefärbte
Gel portionsweise mit jeweils 100 mL Coomassie-Entfärber-RL solange unter Schütteln entfärbt,
bis die Proteinbanden deutlich sichtbar werden. Die Gele werden dokumentiert. Soll ein Gel
aufbewahrt werden, wäscht man es 5 min mit Aqua bidest und schweißt es dann wasserdicht in Folie
ein.
42
II.2.3.6 Standard-Enzymassays für rP5βR
Die Funktionalität der gereinigten rP5βR wird mittels Standard-Enzymassay bestimmt.
Dieser geht zurück auf Stuhllemmer und Kreis (1996) bzw. in abgewandelter Form auf Herl et al.
(2006 und 2009): Unmittelbar nach der nativen His-tag-Reinigung wird das Protein in P5βRReduktase-Assaypuffer überführt und die Konzentration der Lösung bestimmt. Pro Enzym-Assay
werden i.d.R. 0,2 mg Protein eingesetzt. Nur bei stark aktiven Proteinen (rMpP5βR und rAtP5βR
bzw. bestimmt rDlP5βR-Muteine) wurde diese Enzym-Menge reduziert, um einen SubstratÜberschuss zu gewährleisten. Jeder P5βR-Assay setzt sich wie folgt zusammen:
P5βR-Assay
Rekombinantes Enzym
Progesteron-Lösung (50 mM in EtOH 96 %)
Regenerierendes System (in P5βR-Assaypuffer)
NADP+
Glucose-6-phosphat
Glucose-6-phosphat-Dehyrogenase
P5βR-Assaypuffer
0,2 mg
10 µL
45 µL
(6,4 mM EK)
(3,1 mM EK)
(42 nkat)
ad 1000 µL
Das regenerierende System wird immer frisch hergestellt. Der fertige Ansatz wird vor der
Substrat-Zugabe (Progesteron) für 10 min bei 30 °C und 550 Upm vorinkubiert. Mit der Zugabe
beginnt der eigentliche Assay, der für 2 h bei 30 °C durchgeführt wird. Die Negativkontrolle erfolgt
mit hitzedenaturiertem Protein (Wasserbad 100 °C, 10 min bzw. Mikrowelle 700 Watt, 30 s) in
analoger Weise.
Nach Ablauf der Reaktionszeit werden die Proben auf Eis gestellt, jeweils 1 mL
Dichlormethan zugesetzt und für 30 s gevortext. Die Phasen werden durch Zentrifugation (5 min,
13500 Upm) getrennt. Die untere (organische) Phase mit den extrahierten Produkten und Edukten
wird abgetrennt und zur Trockne eingedampft. Für eine nachfolgende GC-MS-Analytik wird der
Rückstand in 100 µL Dichlormethan gelöst. Für die Dünnschichtchromatographie erfolgt dies
analog in 50 µL Methanol.
II.2.4 Spezielle analytische Methoden
II.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC)
Die DC-Analytik wird zur qualitativen Kontrolle der Standard-Enyzmassays verwendet.
Hierzu werden auf eine Kieselgelplatte (Kieselgel 60 F 254) geeigneter Größe jeweils 50 µL der
Proben und als Referenzen jeweils 10 µL der Edukte und Produkte der Reaktion (Konz. 50 mM)
mittels einer Kapillare strichförmig aufgetragen. Die DC-Kammer wird vor Verwendung mit der
mobilen Phase (vgl. Fließmittel) gesättigt. Die Laufhöhe beträgt ca. 12 cm. Die Detektion der
43
Substanzen erfolgt mittels Anisaldehyd-RL. Die DC-Platte wird nach Beendigung des Laufs
zwischengetrocknet und kurz in die RL getaucht. Im Anschluss wird sie bis zum Erscheinen der
Banden auf einer 100 °C heißen Heizplatte belassen. Die Auswertung und Dokumentation erfolgt
an der DC Workstation CAB UVIS (Desaga) bei Tageslicht.
II.2.4.2 GC-MS Analytik
Sowohl zur qualitativen Kontrolle der Standard-Enzymassays, als auch zur Quantifizierung
von relativen Enzymaktivitäten, findet die GC-MS Analytik Verwendung. 1-2 µL der Probe werden
mit einer GC HP 6890 MSD Type 5972A (Hewlett-Packard) unter den folgenden Bedingungen
untersucht:
Trägergas
Säule / Stationäre Phase
Einlasstemperatur
Solvent Delay
Messmodus
Transferline-Temperatur
Temperaturprogramm
Helium
Kapillarsäule HP Optima 5
300 °C
4 min
full-scan (m/z = 50 – 600)
300 °C
Dauer
Starttemperatur
[min]
[°C]
4
200
200
6
300
Endtemperatur
[°C]
200
300
300
Aufheizrate
[°C/min]
4
-
Die Produkte der Reaktion werden anhand des Vergleichs ihrer R f-Werte mit denen der
Standards und über ihre individuellen Zerfallsspektren im Massenspektrometer eindeutig
identifiziert. Die Flächen unter den jeweiligen Kurven (AUC) werden mittels der Gerätesoftware
integriert. Relative Enzymaktivitäten berechnet man nach:
X =
Relative Aktivität [%] =
AUCProdukt / (AUCProdukt + AUCEdukt)
(XMutante / XWildtyp) x 100
II.2.4.3 Photometrische Analytik
Kinetische Untersuchungen der Enzymaktivität der rP5βR erfolgen photometrisch über die
Abnahme der Extinktion des Cobsubstrats NADPH (λ=340 nm), das während der Reaktion
verbraucht wird. Je nach Aktivität des Proteins werden pro Assay zwischen 0.025 und 0.2 mg
Protein eingesetzt:
44
Ansatz 1
Rekombinantes Protein
0.025 – 0.2 mg
NADPH
0,4 mM
DMSO
40 µL
P5βR-Assaypuffer
ad 990 µL
Der Ansatz wird für 2 min bei der Reaktionstemperatur (30-40 °C) vorinkubiert. Die
Reaktion wird durch Zugabe von 10 µl Substratlösung (0,05 – 0,6 mM) gestartet. Die Messzeit
beträgt 200 s. Die Berechnung der kinetischen Konstanten (K m und vmax) erfolgt über die Steigung
der resultierenden Kurve mit der SHIMADZU UVProbe Software (Kinetik Modul) nach der HanesMethode (Hanes, 1935).
Die resultierenden vmax-Werte werden in mkat/kg (= nkat/mg) angegeben:
vmax [mkat/kg]
= 16,67
x
vmax [U/mg]
Aus diesen werden die Kcat-Werte (s-1) berechnet:
kcat [s-1] = Enzym-Menge pro mg [nmol] / vmax [nkat/mg]
Hieraus ergibt sich katalytische Spezifität mit:
Katalytische Spezifität [M-1s-1] = kcat [s-1] / Km [M]
Die Bestimmung der kinetischen Konstanten für das Cosubstrat (NADH bzw. NADPH)
erfolgt abweichend hiervon in Gegenwart eines 2-Cyclohexen-1-on-Überschusses nach folgendem
Ansatz:
Ansatz 2
Rekombinantes Protein
2-Cyclohexen-1-on
0.0125 – 0.05 mg
2 mM
DMSO
40 µL
P5βR-Assaypuffer
ad 990 µL
Die Reaktion wird in diesem Fall durch die Zugabe von 10 µL Cosubstrat (0,05 - 0,5 mM
EK) gestartet. Die übrigen Reaktionsbedingungen bleiben erhalten.
45
II.2.5 Darstellung von Proteinstrukturen und in silico-Methoden
Für die Beantwortung von bioinformatischen Fragestellungen in der modernen
molekularbiologischen Forschung finden eine Vielzahl von Programmen Anwendung. Im Rahmen
dieser Arbeit kamen folgende Software zum Einsatz:
Anwendungsgebiet
Programm(e)
Protein- und Nucleinsäure-Alignments
ClustalW (www.bi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)
Bioedit
Design und Analyse von PCR Primern
ID Integrated DNA Technologie; Oligoanalyser
(www.idtdna.com/analyzer/Applications/)
Planung von Plasmid-Restriktionen /
-Ligationen
PCR Simulation
PlasmaDNA
3d Liganden-Erstellung
ACD Chemsketch
Visualisierung und Bearbeitung
von Proteinstrukturen
Pymol
Swiss PDB Viewer / DeepView
Wincoot 7.1
Suche nach verwandten Proteinstrukturen
VAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/)
Docking
ArgusLab, Autodock
Berechnung von Proteineigenschaften
ExPasY ProtParam Tool (www.expasy.org)
Translation von Nucleotidsequenzen
ExPasY Translate Tool (www.expasy.org)
Suche nach orthologen und paralogen
Genen/Proteinen
BlastN, BlastP (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)
Homologie-Modellierung
SwissModel (www.swissmodel.expasy.org)
Validierung von Homologie-Modellen
SwissModel (www.swissmodel.expasy.org/qmean/)
FastPCR (primerdigital.com/fastpcr.html)
46
III. ERGEBNISSE
Im Gegensatz zu „Directed Evolution“-Experimenten, bei denen zu Beginn keine
detaillierten Informationen über das Zielprotein vorhanden sein müssen, ist der entscheidende
Faktor zur Planung eines rationalen Proteindesigns mittels ortsgerichteter Mutagenese die
Verfügbarkeit einer möglichst großen Basis an Struktur- bzw. Sequenzinformationen. Um die
Aktivitätsunterschiede, die sich bei der rDlP5βR und der AtP5βR finden, zu untersuchen, war das
erste Ziel dieser Arbeit deshalb eine Vielzahl von homologen P5βR-Genen aus verschiedenen
Pflanzen zu klonieren und funktionell in E. coli M15 zu exprimieren. Hierbei sollten
optimalerweise sowohl funktionelle Enzyme mit einer hohen, als auch Enzyme mit einer niedrigen
Aktivität gefunden werden. Aus den Sequenz- und Aktivitätsdaten sollten in der Folge
aussichtsreiche Positionen innerhalb der rDlP5βR für die anschließende ortsgerichtete Mutagenese
abgeleitet werden.
III.1 Klonierung von orthologen P5βR
Die Datenbank-Suche nach bekannten Homologen zur D. lanata P5βR (DlP5βR) mittels
BLAST Algorithmus (BLASTp bzw. BLASTn) ergab eine hohe Anzahl an entsprechenden
putativen P5βR-Genen, verteilt über viele Taxa innerhalb und außerhalb der Angiospermen, mit
einer Identität zur A. thaliana P5βR (AtP5βR) und D. lanata P5βR (DlP5βR) von etwa 50 - 99
Prozent. Ihre Annotierung erfolgte in nahezu allen Fällen ausschließlich auf Grund der
Sequenzähnlichkeit zu diesen Enzymen. Daten ihre Aktivitäten betreffend waren nicht verfügbar.
Die bekannten Sequenzen sollten genutzt werden, um Primer zur Klonierung weiterer P5βR-Gene
zu generieren.
III.1.1 Ableitung der Primer und Screening von RNA-Bibliotheken
Primer wurden abgeleitet aus den GenBank-Einträgen der funktionell bestätigten P5βR aus
Arabidopsis thaliana (EF579963), Digitalis lanata (AY585867) und Nicotiana tabacum
(AB488494.1/AB488495.1), sowie den putativen P5βR aus Zea mays (NM_001174269.1), Vitis
vinifera (AM448495.1) und Ricinus commumis (XM_002510077.1). Zum Teil wurden die Primer
mit degenerierten Positionen konzipiert (siehe II.1.10).
Von verschiedenen Pflanzen wurde RNA isoliert (II.2.1.2) und in cDNA umgeschrieben
(II.2.1.3). Es wurden dazu zunächst die Primer-Kombination gewählt, die für die taxonomisch am
nächsten stehende Art mit bekannter Gensequenz geeignet war. In den Fällen, in denen es auf diese
47
Art nicht möglich war, ein PCR-Produkt zu erhalten, wurden auch die anderen im Rahmen der
vorliegenden Arbeit abgeleiteten und synthetisierten Primer getestet. Da keine Festlegung auf
bestimmte Taxa erforderlich war, wurden Versuche mit Pflanzenmaterial, aus dem mit den
Standardmethoden keine RNA gewonnen werden (z.B. Dionaea muscipula oder Nepenthes alata)
oder bei denen mit keiner Primer-Kombination eine erfolgreiche PCR durchgeführt werden konnte
(z.B. Hedera helix), nicht weiter verfolgt. Ähnlich wie P5βR-cDNA aus D. lanata und A. thaliana
besaßen alle erhaltenen PCR-Amplifikate eine Größe von etwa 1,1 - 1,2 kb (II.2.1.5; Abb. 6):
M
1
2
3
M 4
1 cDNA Mentha piperita
2 cDNA 2 Mentha piperita
1,5 kb
1,0 kb
ca. 1,1 kb
3 cDNA Gomphocarpus fruticosus
4 cDNA Erysimum rhaeticum
Abb. 6: Beispiele für PCR-Amplifikate aus der cDNA von M. piperita, G. fruticosus und E. rhaeticum mit
verschiedenen P5βR-Primern, deren Größe auf putative P5βR-ORFs schließen lässt. M = 1kb Marker.
Die nachfolgende Tabelle fasst alle Organismen zusammen, bei denen cDNAs synthetisiert
werden konnten, mit denen eine Amplifikation von putativen P5βR möglich war und gibt die
dazugehörige Primer-Kombination an (Tab 1):
Tab. 1: Primer-Kombinationen für die Amplifikation von putativen, orthologen P5βR-Genen verschiedener Pflanzen.
cDNA aus Organismus
Primerkombination
Amoracia rusticana
Atropa belladonna
Coffea arabica
Nicotiana tabacum
Solanum tuberosum
Solanum lycopersicon
Erysimum crepidifolium
Erysimum rhaeticum
Gomphocarpus fruticosus
Ricinus communis
Mentha piperita
Calotropis procera
Withania somnifera
Lunaria annua
Ery_Dir + Erysalrev
Ntdir1 + Ntrev1
Gen_Dir + Gen_Rev
Ntdir1 + Ntrev1
Ntdir1 + Ntrev1
Ntdir1 + Ntrev1
Ery_Dir + Erysalrev
Ery_Dir + Erysalrev
Gen_Dir + Gen_Rev
PB_Rc_dir + PB_Rc_rev
Gen_Dir + Gen_Rev
Gen_Dir + Gen_Rev
Ntdir1 + Ntrev1
Ery_Dir + Erysalrev
48
Bei nahe verwandten Arten war in allen Beispielen jeweils ein Primer-Paar ausreichend. Die
Kombination von Ntdir1/Ntrev1 (beide aus der putativen N. tabacum P5βR abgeleitet) funktionierte
für alle untersuchten Solanaceen, Ery_Dir/Erysalrev für alle untersuchten Brassicaceen und
Gen_Dir/Gen_Rev für die verschiedenen Vertreter von Familien innerhalb der Gentianales.
III.1.2 Klonierung in den TOPO-Klonierungsvektor
Zur Aufklärung der Sequenzen der putativen P5βR-Gene und zur Vermehrung der DNA
sollten die erhaltenen, ca. 1,1 kb großen, (RT-)PCR-Produkte im Anschluss in den pCR ®2.1TOPO®-Vektor kloniert werden. Hierzu wurden die gewünschten Banden zur Reinigung und
Aufkonzentrierung mittels „freeze'N squeeze“-Verfahren (II.2.1.6) aus einem Agarose-Gel isoliert.
Mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese wurde kontrolliert, ob die Reinigung erfolgreich war. Im
aufgeführten Beispiel (Abb. 7) konnte so eine DNA-Lösung mit einer Konzentration von 165 ng/µL
und einem Reinheitsquotient (II.2.1.15) von 1,78 erhalten werden.
M
1
2
3
1 kb
Abb. 7: Kontrolle der mit „freeze'N squeeze“ gereinigte PCR-Amplifikate putativer P5βR aus der cDNA von Solanum
tuberosum (Spur 1) und Atropa belladonna (Spur 2/3). Die Konzentration betrug in beiden Fällen 165 ng/µL bei einem
Reinheitsquotient von 1,78.
Die gereinigte DNA wurde in den Vektor kloniert und dieses Konstrukt in chemisch
kompetente E. coli One Shot TOP10 transformiert. Die Auswahl von Bakterien-Kolonien mit
inserthaltigem pCR®2.1-TOPO® Vektor erfolgte mittels Blau-Weiß-Selektion (II.2.1.12). Von positiv
selektionierten Kolonien wurden LB-Flüssigkulturen angelegt und die Plasmid-DNA isoliert
(II.2.1.14).
Die Sequenzierung erfolgte bei GATC Biotech AG zunächst immer mit dem firmeneigenen
TOPO-1 Primer. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Hilfe von ClustalW mit der als Referenz
dienenden DlP5βR-Nucleotidsequenz verglichen. Es wurden jeweils beide Orientierungen
(5'-3' und 3'-5') getestet, da die bei der TOPO-UA Klonierung aufgenommenen Inserts beide
49
Integrationsmöglichkeiten vorweisen können. Zeigte sich eine signifikante Übereinstimmung,
wurde im Anschluss mit dem TOPO-2 Primer der Rest der Insert-Sequenz sequenziert. Beide
Teilsequenzen wurden händig zur Gesamtsequenz zusammengefügt. Abb. 8 zeigt beispielhaft die
Nukleotid-Sequenz der putativen A. belladonna P5βR, die aus den Sequenzierungen des pCR ®2.1TOPO® Vektor-Konstrukts Nr. 3 abgeleitet wurde im direkten Vergleich zur intronfreien P5βRSequenz aus D. lanata. Die Identität zwischen den beiden Sequenzen beträgt 75 %. Das Alignment
umfasst einen kompletten Leserahmen von Start- bis Stopp-Codon für eine putative P5βR. Aus
dieser Analyse lässt sich ableiten, dass die gewünschte P5βR-Sequenz vollständig in das Plasmid
eingebaut worden war.
AbP5βR
DlP5βR
ATGAGCTGGTG---GGCTGGAGCTATTGGTGCTGCCAAGAAAAAATTCGAAGAAGATGAT 57
ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60
***********
********* **:** *****.*******..** ***********
AbP5βR
DlP5βR
GCACCACCCAAGTATCAAAGCGTTGCTCTAATCATCGGAGTTACCGGCATCGTCGGCAAC 117
GCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120
****..**.*** ** ..***** ** *.**..* **.**:*****.***.********
AbP5βR
DlP5βR
AGTCTCGCCGAGATCCTCCCTCTCGCCGACACCCCCGGCGGTCCTTGGAAAGTCTATGGC 177
AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180
** ** ** ******** **:** ******************** *****.**.** ***
AbP5βR
DlP5βR
GTTGCTCGCCGCCCTAGACCGTCGTGGAATGCCGACCACTCAATTGAGTACGTCCAATGT 237
GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240
** ** ******.* ***** * ***.***. ** .* *.** .* ********.**
AbP5βR
DlP5βR
GACATATCTAACCCGGAAGATACCCAATCCAATCTCTCCCTTCTCACTGATGTCACCCAC 297
GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300
******** .* **.**:** :***** **** ** **.* *** ******** ******
AbP5βR
DlP5βR
GTGTTCTATGTTACTTGGGCTAATAGATCCACAGAGATTGAAAACTGTGAAATTAATGGG 357
GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360
******** ***** *********.*******.**..::************. ***.*
AbP5βR
DlP5βR
AAAATGTTTAGAAATGTTCTTAATGTTATTATCCCTAATTGCCCCAATTTACGCCACATC 417
AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420
******** **.** ** ***.*** :.**********************... ******
AbP5βR
DlP5βR
TGTTTGCAAGCGGGTCGAAAACATTATTTGGGTCCGTTTGAATTGTATGGAAAAGTAG-- 475
TCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCATTTGAATCCTACGGGAAAATAGAA 480
* :*****..* ** .*.**.***** :****:**.******* ** **.***.***
AbP5βR
DlP5βR
-CCCATGATTCTCCGTTTCACGAGGATTTACCGAGATTAAGTGGGCCTAATTTTTACTAC 534
TCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTAT 540
******** *:** *: .. ********.** **.**.*. . . ** ********
AbP5βR
DlP5βR
ATTCTTGAGGATATTTTATTTAAGGAGATGGAGAAGAAGGAAGGATTGACATGGTCAGTT 594
GATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAGAAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTT 600
.:* *:*********:*. **.*****.*************.**:*****:*****.***
AbP5βR
DlP5βR
CATAGGCCCGGGACGATATTTGGGTTTTCACCATATAGTTTGATGAACATTGTTGGAACG 654
CATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACC 660
***.* **.****. ***** ********:*********:******* :* ** **:**
AbP5βR
DlP5βR
CTTTGTGTTTACGCGGCTATATGTAAACACGAAGGGTTGCCGTTGAGGTTTCCAGGTGTT 714
CTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAGGGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGT 720
*********** **.*****:** ********.**.::*
*********.*:*** *
50
AbP5βR
DlP5βR
AAAGCGGCGTGGAATGGATACTCGGATTCCTCCGATGCGGACTTGATTGCTGAGCATCAG 774
AAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCTGATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCAT 780
**.** ******.****.********** *** ******** *****:** ********
AbP5βR
DlP5βR
ATATGGGCTGCAGTGGATCCGTACGCTAAGAATGAGGAGTTTAATGTGAGCAATGGGGAT 834
ATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAACGAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGAT 840
**:***************** ** **:**.** ****. *********** *****.***
AbP5βR
DlP5βR
GTCTTCAAGTGGAAGCATTTCTGGAAGGTTTTGGCTGAGCAATTTGGAGTGGAGGCCACG 894
GTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGGTGTTGGCGGAGCAGTTTGGAGTAGGGTGTGGA 900
** ** **.*********** ******** ***** *****.********.*.*
. .
AbP5βR
DlP5βR
GAGTTTGATGAAGGGAAGAGATGCACTTTGGGAGAGATGATGAAAGACAAAGGCGCTGTT 954
GAGTATGAAGAAGGGGTGGATTTGAAATTGCAGGATTTAATGAAGGGGAAGGAGCCGGTT 960
****:***:******.:*..:* *.:*** ..** :*.*****.*. **.*. * ***
AbP5βR
DlP5βR
TGGGATGAGATTGTGAAGGAGAATGGATTGGAGTCTACTAAATTGGAGGAGGTTGGGGTT 1014
TGGGAGGAAATCGTGAGGGAGAATGGATTGACACCTACGAAACTGAAGGATGTCGGAATT 1020
***** **.** ****.*************... **** *** **.**** ** **..**
AbP5βR
DlP5βR
TGGTGGTTTGTTGATCTTATTCTTGGTGGAGATTGTCCTTTGGATACTATGAACAAGAGC 1074
TGGTGGTTTGGTGATGTTATACTTGGGAATGAGTGTTTCCTGGATAGTATGAACAAGAGC 1080
********** **** ****:***** ..:** ***
****** *************
AbP5βR
DlP5βR
AAGGAGCACGGTTTCTTGGGATTCCGAAACTCACAAAAAGCATTCATTTCCTGGATTGAT 1134
AAGGAGCATGGCTTTTTGGGATTTAGGAACTCCAAGAATGCGTTCATTTCTTGGATTGAC 1140
******** ** ** ******** .*.*****..*.**:**.******** ********
AbP5βR
DlP5βR
AAGGTGAAAGCCTACAAAGTTGTTCCTTAG 1164
AAGGCAAAAGCTTACAAGATTGTTCCTTGA 1170
**** .***** *****..*********..
Abb. 8: Alignment der erhaltenen putativen P5βR-Sequenz aus Atropa belladonna (AbP5βR) aus dem pCR2.1-TOPOVektor mit der DlP5βR (AY585867), sequenziert mit TOPO-1 und TOPO-2 Primern. Start- und Stopp-Codon sind grün
bzw. rot hinterlegt.
Die Nukleotid-Sequenzen wurden mit dem Programm ExPASy in die korrespondierenden
Aminosäure-Sequenzen
übersetzt
und
in
der
Genbank
NCBI
Databases
GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi) veröffentlicht. Eine Liste aller auf diese Weise klonierten
und sequenzierten homologen P5βR-Sequenzen wird in Tab. 2 wiedergegeben.
Tab. 2: Zusammenfassung aller in den pCR®2.1-TOPO®-Vektor klonierten DNA-Abschnitte.
Organismus
ORF
NT
AS
Genbankeintrag
A. belladonna
P5βR (cDNA)
1164
387
GU451678
N. tabacum
P5βR (cDNA)
1167
388
GU807434
W. somnifera
P5βR (gDNA)
1235
-
JN638574
S. lycopersicon
P5βR (cDNA)
1164
387
JF504670
S. tuberosum
P5βR (cDNA)
1164
387
JF504669
L. annua
P5βR (gDNA)
1278
-
JN638575
A. thaliana
Promotorregion
ca. 1 kb
51
Für die heterologe Expression sollten diese zunächst auf die von Herl et al. (2006) etablierte
Art mittels Restriktionsendonukleasen in den pQE-30 Expressionsvektor subkloniert werden. Es
konnte jedoch kein zufriedenstellendes Konstrukt hergestellt werden. Unter anderem wurde das
Insert trotz geeigneter Schnittstellen in falscher Orientierung in den Vektor ligiert.
III.1.3 Etablierung eines Klonierungssystems für pQE30-UA Vektoren
Zur Steigerung der Klonierungseffizienz wurde deshalb ein alternatives Klonierungssystem
mit dem pQE30 UA-Expressionsvektor entwickelt. Mit Hilfe dieses Systems konnten innerhalb von
sehr kurzer Zeit PCR-Produkte nach einer Reinigung (unter Umgehung des Klonierungsvektors und
der Subklonierung in den pQE30-Vektor) direkt in einen Expressionsvektor kloniert werden
(Abb. 9).
Abb. 9: Entwickeltes System zur schnellen, direkten Klonierung orthologer P5βR mit dem pQE30-UA Vektor.
Durch dieses Vorgehen war es möglich, mehrere weitere homologe P5βR-Gene in frame zu
klonieren. Dies soll im Folgendem am Beispiel des P5βR-Gens aus Mentha piperita (MpP5βR;
Genbankeintrag GU451677) dargestellt werden.
Aus der cDNA, die durch Umschreiben von RNA aus frischem M. piperita Blattmaterial
gewonnen wurde, ließ sich durch eine PCR Reaktion mit den P5βR-spezifischen Primern Gen_Dir
und Gen_Rev im 1 %-igen Agarosegel eine deutlich sichtbare Bande bei der gewünschten Höhe von
ca. 1,1 kb nachweisen. Zur maximalen Ausbeute an DNA wurden jeweils 4-5 PCR-Ansätze gepoolt
und die gewünschten Banden aus einem Agarose-Gel isoliert, um störende Nebenprodukte
abzutrennen (Abb. 10).
52
Abb. 10: PCR-Produkte mit cDNAs aus jungen Blättern von M. x piperita (Spur 1-4) und den Gen_Dir- und Gen_RevPrimern. Schwach erkennbar sind Nebenbanden der Reaktion.
Die so gereinigten PCR-Amplifikate wurden direkt in den pQE-30 UA Vektor kloniert
(II.2.1.8) und das Konstrukt in (hoch)kompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10).
Das Screening der resultierenden Kolonien erfolgte mittels Colony-PCR (Abb. 11). Die
Erfolgsquote hierbei lag je nach PCR-Produkt zwischen 10 und 100 Prozent.
Abb. 11: Screening von zehn Bakterienkolonien (Spur 1-10) zur Kontrolle der erfolgreichen Aufnahme eines
Konstruktes aus putativer MpP5βR im pQE-30-UA Vektor mittels Colony-PCR (Gen_Dir/Gen_Rev-Primer). Spur 3-6,
8 und 10 zeigt positive Kolonien.
Die Bakterien-Kolonien, bei denen die Reaktion positiv verlief, wurden in Flüssigkultur
übernommen, um ihre Plasmid-DNA zu präparieren (II.2.1.14). Dies war wichtig, da bei der
gewählten Klonierungsstrategie PCR-Produkte (entsprechend der TOPO-UA Klonierung, II.2.1.8)
sowohl in sense- als auch in antisense-Orientierung in das Plasmid aufgenommen werden konnten.
53
Die Sequenzierung erfolgte jeweils mit den Primern pQE_FP und pQE_RP(-50). Die
erhaltenen Teilsequenzen (Daten nicht gezeigt) wurden kombiniert, um den durchgängigen
Leserahmen der Nucleotid-Sequenz zu erhalten. In der Sequenz des Klons Nr. 39 fanden sich auch
die beiden Primer wieder, die zur Klonierung Verwendung fanden. Dies spricht dafür, dass die
gesamte, intronfreie Gensequenz vollständig in den Vektor integriert wurde. Die vollständige InsertSequenz umfasste 1170 Nt und einen durchgehenden Leserahmen ohne Stopp-Codons (Abb. 12).
Am 5'-Ende der Sequenz konnte die Codierung für den späteren N-terminalen His-tag identifiziert
werden. Diese war vom putativen P5βR-Insert durch die 30 Basen der „Multiple Cloning Site“
(MCS) getrennt. Die Sequenzidentität zum D. lanata bzw. A. thaliana P5βR-ORF
auf
Nucleotidebene betrug 80 bzw. 71 %.
5'-ATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCCACGTGATATCCTCAATCGCTTCT
ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGGGCTATCGGCGCTGCAAAGAAAAAACTCGAAGAAGATGAGGCGCCGCCGA
ACTACCAGAGCGTAGCTCTGGTGGTGGGGGTGACCGGAATCGTCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCC
GCTCTCCGACACTCCCGGCGGCCCCTGGAAGGTCTACGGGGTGGCGCGCCGCCCCCGCCCCGCCTGGAAC
GACGATCACCCCATCACCTACATCCGCTGCGACGTGTCCGATTCCGGCGACGCGAAGGAGAAGCTGTCCC
CTCTCACCGATCTAACCAACATCTTCTATGTAACATGGACTAACAAATCCACCGAGGCGGAGAATTGCGA
AGCCAATGGGAAAATGCTGAAGAATGTGCTCGATGCATTGATCCCTAATTGCCCTAATTTGAAGCATGTC
TGTTTGTTGACTGGTAGGAAGCATTACGTTGGTCCATTCGAGTCCGTTGGAAAGATTCGAGCACACGATC
CTCCGTTTACTGAGGATTTGCCTCGATTGGACTGCCCGAATTTCTACTATACCTTGGAGGATATTCTGTT
TGAGGAGGTTCAGAAGAAGGAGGGCTTGACATGGTCTGTGCATAGGCCTGGGGCTATATTCGGGTTCTCG
CCATATAGCATGATGAATTTGGTTGGAACACTTTGTGTTTATGCAGCCATTTGTAAGCATGAAGGTGCAG
TCTTGAGGTTTCCTGGTTGTAAAGGTGCTTGGGATGGATACTATGATTGCTCTGATGCAGATTTGATTGC
GGAGCATCAAATCTGGGCAGCCGTGGATCCTTACGCGAAGAATGAGGCGCTCAATGTGAGCAATGGCGAT
GTTTTCAAGTGGAAGCATTTCTGGAAAGTGTTGGCAGAGCAGTTTGGGGTGGAGTGTGGGGAGTATGAGG
AAGGGAATGAGGTGAAGTTGCAGGATTTGATGAAGGATAAAGGCCCAGTTTGGGATGAAATCGTGAGGGA
GAATGGCTTGTCGCCTACGAAGCTGGAGGACGTGGGGATTTGGTGGTTTGCCGATTTTAGCCTTGGGTAT
GAATGTCCCTTGGATACGATGAACAAAAGCAAGGAGCATGGATTTCTGGGATTCAGAAATTCCAAGAACT
CCTTCATTTCTTGGATTGATAAGGTGAAGGCTTACAAGATTGTTCCTTAG-3´
Abb. 12: Sequenz der klonierten, putativen M. piperita P5βR im pQE30-UA-Vektor. Der ORF liegt „in frame“ zur Histag Codierung (gelb) vor. Die Sequenz des (sense) Klonierungs-Primers (Gen_Dir) ist unterstrichen. Start- und StoppCodon sind grün bzw. rot hinterlegt.
Diese
DNA Sequenz
wurde
mittels
ExPASy
Translation-Tool
(II.2.5)
in
die
korrespondierende Aminosäuresequenz übersetzt. Die putative MpP5βR umfasst 389 Reste. Die
charakteristischen Protein-Motive für SDR und P5βR sind im Protein zu finden. Die
Sequenzidentität zur rDlP5βR beträgt 82 % (Abb. 13).
MSWWWAGAIGAAKKKLEEDEAPPNYQSVALVVGVTGIVGNSLAEILPLSDTPGGPWKVYGVARRPRPAWN
DDHPITYIRCDVSDSGDAKEKLSPLTDLTNIFYVTWTNKSTEAENCEANGKMLKNVLDALIPNCPNLKHV
CLLTGRKHYVGPFESVGKIRAHDPPFTEDLPRLDCPNFYYTLEDILFEEVQKKEGLTWSVHRPGAIFGFS
PYSMMNLVGTLCVYAAICKHEGAVLRFPGCKGAWDGYYDCSDADLIAEHQIWAAVDPYAKNEALNVSNGD
VFKWKHFWKVLAEQFGVECGEYEEGNEVKLQDLMKDKGPVWDEIVRENGLSPTKLEDVGIWWFADFSLGY
ECPLDTMNKSKEHGFLGFRNSKNSFISWIDKVKAYKIVP
Abb. 13: Aminosäure-Sequenz der putativen MpP5βR. Charakteristische Protein-Motive der DlP5βR sind gelb
markiert.
54
Das Vorgehen beim Klonieren von weiteren putativen P5βR-Genen aus anderen Organismen
erfolgte analog. Die neu beschriebenen Sequenzen wurden ebenfalls in der NCBI Databases
GenBank veröffentlicht. Alle Sequenzen sind in richtiger Orientierung und im richtigen
Leserahmen zum N-terminalen His-tag in den pQE30-UA Expressionsvektor kloniert worden. Die
einzige Ausnahme stellt die putative P5βR aus Calotropis procera (CpP5βR) dar. Bei dieser
konnten durch Colony-PCR 11 positive Bakterienkolonien identifiziert werden, deren PlasmidDNA isoliert und sequenziert wurde. Allerdings besaßen alle Inserts die falsche („antisense“)
Orientierung. In der folgenden Tabelle (Tab. 3) sind alle im Rahmen dieser Arbeit in
Expressionsvektoren klonierte Gene, inklusive der entsprechenden Genbank-Einträge, verzeichnet.
Tab. 3: Zusammenfassung aller Gene/Genbankeinträge, die erfolgreich in frame in Expressionsvektoren kloniert
werden konnten (P5βR = Progesteron-5β-Reduktase; 3β-HSD = 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase; IPTR =
Isopiperitenon-Reduktase). Die Klonierung der CpP5βR gelang nur in 3'-5' Orientierung.
Organismus
ORF
NT
AS
Expressions-
Genbankeintrag
system
A. belladonna
P5βR
1164
387
pQE30-UA
A. thaliana
3β-HSD
E. crepidifolium
GU451678
-
-
pQE30-UA
P5βR
1170
389
pQE30-UA
GU354236
E. rhaeticum
P5βR
1170
389
pQE30-UA
GU354237
G. fruticosus
P5βR
1167
388
pQE30-UA
GU354238
M. piperita
P5βR
1170
389
pQE30-UA
GU451677
M. piperita
IPTR
945
314
pQE30-UA
C. procera
P5βR
1164
387
(pQE30-UA)
GU479996
H. carnosa
P5βR
1164
387
Gateway
GU354231
P. major
P5βR
1170
389
Gateway
GU354233
N. oleander
P5βR
1164
387
Gateway
GU354232
A. curassavica
P5βR
1164
387
Gateway
GU354230
-
-
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit erfolgte für die im Folgenden beschriebenen Versuche
(u.a. Expression, native His-tag Reinigung, katalytische Aktivität, Modellierung) eine
Konzentrierung auf die Plasmid-Konstrukte mit den klonierten P5βR aus Atropa belladonna,
Erysimum crepidifolium, Erysimum rhaeticum, Gomphocarpus fruticosus und Mentha piperita.
Trotzdem erfolgte auch der Nachweis der erfolgreichen funktionellen Expression der P5βR aus
Hoya carnosa, Plantago major, Nerium oleander und Asclepias curassavica (die Klonierung und
funktionelle Expression dieser vier cDNAs erfolgte im Rahmen der Diplomarbeit von Margareta
Brydziun; vgl. hierzu Bauer et al., 2010).
55
III.2 Funktionelle Expression der orthologen P5βR in E. coli M15[pREP4]
III.2.1 Expressionsbedingungen und native His-tag-Reinigung
Zur Aufklärung der optimalen Expressionsbedingungen der klonierten P5βR, wurden für alle
Proteine die beiden publizierten Möglichkeiten für rP5βR getestet (Standardbedingungen von 1mM
IPTG, 37 °C, 4 h bzw. Variation mit 0,1 mM IPTG, 4 °C, 96 h). Es wurde jeweils die Methode mit
den individuell besseren Ergebnissen weiterverwendet. Hauptkulturen zur Proteinexpression
wurden angelegt und auf eine Überexpression von rP5βR überprüft. Für die rMpP5βR konnte
rekombinantes Protein nur dann erhalten werden, wenn nach der Induktion mit 0,1 mM IPTG für 96
h bei 4 °C kultiviert wurde. Abb. 14 zeigt das Expressionsprofil des Proteins unter diesen
Gegebenheiten:
M
1
2
3
4
5
6
7
8
ca. 43 kDa
Abb. 14: Expressionsprofil der rMpP5βR mittels SDS-PAGE und Coomassie Brilliant Blue Analyse. Spur 1 = vor
Induktion; Spur 2 = 24 h; Spur 3 = 48 h; Spur 4 = 72 h; Spur 5 = 96 h; Spur 6/7 = Protein-Eluat der nativ gereinigten
rMpP5βR im Elutions- bzw. P5βR-Assaypuffer; Spur 8 = nativ gereinigte rGfP5βR.
Die nach 0 h (= vor IPTG-Induktion, Spur 1), 24 h (Spur 2), 48 h (Spur 3), 72 h (Spur 4) und
96 h (Spur 5) entnommenen Proben wurden nach ihrer Aufarbeitung mittels 12,5-%-igem SDS-Gel
aufgetrennt und nach Färben mit Coomassie Brilliant Blue analysiert. Es zeigte sich eine Bande,
deren Höhe von etwa 40 – 45 kDa der berechneten Proteingröße von ca. 43 kDa entspricht. Diese
Bande hat ihre stärkste Intensität nach 96 h Kultivierungsdauer.
Aus den so behandelten E. coli Kulturen konnte das rekombinante Enzym in einer guten
Ausbeute (nativ) überexprimiert werden. Die Abbildung 14 zeigt die gereinigte rMpP5βR im
Imidazol-Elutionspuffer bzw. im P5βR-Assaypuffer (Bahn 6 und 7). Im Vergleich hierzu ist
ebenfalls die nativ-gereinigte rGfP5βR zu sehen (Bahn 8). Die Reinigung erfolgte wie unter II.2.2.2
beschrieben.
56
Auf diese Weise war es möglich, die rekombinanten, homologen Enzyme in 2 Gruppen zu
separieren. Die rekombinanten Erysimum Enzyme (rEcP5βR, rErP5βR) konnten v.a. über die
Expressionsvariante mit 1 mM ITPG und einer Kultivierungsdauer von 4-5 h gewonnen werden, die
auch für die nahe verwandte P5βR aus A. thaliana (rAtP5βR) beschrieben worden ist. Die Enzyme
aus G. fruticosus (rGfP5βR) und M. piperita (rMpP5βR) wurden nach der oben dargelegten, langen
Inkubationszeit bei niedriger Temperatur überexprimiert. Mit keiner von beiden Methoden gelang
es, das A. belladonna Enzym (rAbP5βR) zu exprimieren.
III.2.2 Nachweis der katalytischen Aktivität
Zur Planung der Mutagenese-Versuche war neben der Aufklärung der Sequenz besonders
der Nachweis der katalytischen Aktivität (v.a. mittels Standard-P5βR-Enzymassays; II.2.3.6)
essentiell. Hierzu wurde das nativ gereinigte Enzym in P5βR-Assaypuffer umgepuffert (II.2.3.2)
und von dieser Mischung jeweils 0,2 mg in einem Volumen von 1000 µL eingesetzt. Die
Auswertung der Enzymtests erfolgte mittels DC nach Tauchen in Anisaldehyd-RL.
Abb. 15: DC Analyse des Standard-P5βR-Enzymassays der rMpP5βR bei 30 °C und 0,5 mM Progesteron (Spur 1 = 0,2
mg Protein; Spur 2 = 0,4 mg Protein; M = Referenzen; Spur 3 = Negativkontrolle)
Die Dünnschichtchromatographie zeigte, dass das Enzym in der Lage ist, Progesteron zu
5β-Pregnan-3,20-dion, dem putativen Folgeprodukt innerhalb der Herzglykosid-Biosynthese,
umzusetzen. Ebenfalls zu sehen war, dass diese Reduktion konzentrationsabhängig verläuft (Abb.
15). So war bei einer Konzentration von 0,2 mg/mL Protein nach 2 h bei 30 °C noch Substrat zu
sehen (Spur 1), während bei der doppelten Enzym-Konzentration nur noch das Produkt detektiert
werden konnte (Spur 2). Wurde das Enzym vor Substrat-Zugabe denaturiert, fand keine Katalyse
statt (Spur 3).
57
Auf diese Art konnten die katalytischen Aktivitäten der klonierten, funktionell exprimierten
Enzyme (EcP5βR, ErP5βR, GfP5βR und MpP5βR) verschiedener Taxa demonstriert werden. Dies
stellt nach den aus Digitalis sp. und A. thaliana rekombinant verfügbaren Proteinen den ersten
Nachweis der Funktionalität dieser neuen Enzym-Klasse dar. Abbildung 16 zeigt einen direkten
Vergleich der Aktivitäten aller Enzyme bei 30 °C nach 2 h.
1
2
3
4
5
M
5β-Pregnan-3,20-dion
Progesteron
β-Mercaptoethanol
Abb. 16: DC der P5βR-Standard-Assays der verschiedenen klonierten und
funktionell exprimierten rP5βR zur
vergleichenden Darstellung ihrer jeweiligen katalytischen Aktivitäten (T = 30 °C; PRO-Konzentration = 0.5 mM; Spur
1 = rEcP5βR; Spur 2 = rGfP5βR; Spur 3 = rDlP5βR; Spur 4 = rMpP5βR; Spur 6 = rAtP5βR).
Wie für die rMpP5βR bereits gezeigt besitzen alle Enzyme die Fähigkeit, Progesteron
katalytisch zu 5β-Pregnan-3,20-dion zu reduzieren. Allerdings unterscheiden sich die Proteine
hinsichtlich ihres Aktivitätslevels untereinander stark (Abb. 16). Die rMpP5βR (Bahn 5) und die
rAtP5βR (Bahn 6) zeichnen sich durch eine hohe Aktivität aus, während Enzyme aus E.
crepidifolium (Bahn 3) und E. rhaeticum (nicht in Abbildung) in ihrer Aktivität eher der rDlP5βR
entsprechen. Die rGfP5βR ist sogar noch weniger aktiv (Bahn 2). Es stellte sich so dar, dass sich die
beiden
taxonomisch
näher
verwandten
Protein-Gruppen,
mit
jeweils
ähnlicherer
Aminosäuresequenz (rP5βR aus Erysimum sp./A. thaliana bzw. D. lanata/M. piperita), jeweils
deutlich in ihrer Aktivität unterschieden. Des weiteren besaßen die beiden Enzyme, die sich aus
Organismen ableiten, welche keine Herzglykoside akkumulieren (AtP5βR und MpP5βR), die höhere
enzymatische Aktivität. Diese simple Einteilung der rekombinanten Enzyme hinsichtlich
verschiedener Aktivitätsgrade, bestimmt mittels P5βR-Enzymassay und DC (bzw. GC-MS, s.
III.2.3.2), wurde in späteren Versuchen zur Ableitung von Aminosäuren der DlP5βR genutzt, die
besonders gute Ziele der ortsgerichteten Mutagenese darstellen („bioactivity-guided screening“,
II.4.2.1).
58
III.2.3 Biochemische Untersuchung der rekombinanten P5βR
Neben den einfachen Funktionsdaten (III.2.2) wurden auch einige wichtige biochemische
Parameter bestimmt. Da der Zweck der vorhergehenden Klonierung und funktionellen Expression
der rekombinanten Proteine jedoch immer die Verwendung der gewonnenen Informationen für
spätere Mutagenese-Experimente der rDlP5βR war, erfolgte diese Charakterisierung selektiv für
bestimmte Merkmale.
III.2.3.1 Enantioselektivität
Die Untersuchung der Enantioselektivität (=stereospezifische Reduktion der Δ4,5-C=CDoppelbindung) erfolgte durch Auswertung der Standard-P5βR-Enzymassays mit Progesteron als
Substrat nach einer zweistündigen Inkubationsdauer mittels DC und GC-MS-Analytik (II.2.4.2). In
der Kontrolle konnten mittels des entwickelten GC-Programmes bzw. der bereits etablierten DC die
beiden möglichen Produkte der Reduktion (5β-Pregnan-3,20-dion [1] bzw. 5α-Pregnan-3,20-dion
[3]) von Progesteron mit beiden analytischen Methoden getrennt werden. In allen analysierten
Assays wurde jeweils nur ein Produkt gefunden. Dieses wurde über die Retentionszeit (R t=23,7)
und das dazugehörige Massenspektrum eindeutig als 5β-Pregnan-3,20-dion identifiziert (Abb. 17).
Abb. 17: Gaschromatographische Trennung möglicher Produkte der Reduktion von Progesteron zur Analyse der P5βRAssays. A Kontrolle B Enzym-Assay mit rekombinanter P5βR aus M. piperita (1 = 5β-Pregnan-3,20-dion, Rt=23,7; 2 =
Isoprogesteron, Rt=24,19; 3=5α-Pregnan-3,20-dion, Rt=24,55; 4 = Progesteron, Rt=25,93).
III.2.3.2 Cosubstrat-Spezifität
Es wurde getestet, ob die rekombinanten P5βR eine strikte NADPH-Spezifität besitzen oder,
ob NADPH durch NADH ersetzt werden kann. Hierzu wurden Standard-P5βR-Assays mit nativ
59
gereinigtem Enzym durchgeführt, wobei anstatt eines regenerierenden Systems mit 6,4 mM NADP +
nur NADH im Überschuss (6,4 mM) eingesetzt wurde. Parallel hierzu erfolgte zur Kontrolle ein
Standard-Assay mit NADPH (Abb. 18).
Abb. 18: GC-Analyse der rP5βR-Aktivitätstests mit NADPH (links) und NADH (rechts) als Reduktionsäquivalente
unter identischen Bedingungen (Temperatur = 30 °C; Reaktionsdauer 2 h).
Weder mittels DC (Daten nicht gezeigt), noch mit GC-MS (Abb. 18) konnte eine
enzymatische Umsetzung des Substrats in Anwesenheit von NADH beobachtet werden. Dies war
essentiell, da in späteren Mutagenese-Experimenten die Cosubstrat-Spezifität der rDlP5βR rational
geändert werden sollte. Die Ansätze mit NADPH, die als Kontrollen dienten, führte mit allen
Enzymen, wie bereits gezeigt, zur stereospezifischen Bildung von 5β-Pregnan-3,20-dion.
60
III.2.3.3 Temperatur-Optima
Die Temperatur-Optima der rekombinanten P5βR aus M. piperita, G. fruticosus und E.
crepidifolium wurden mittels Standard-P5βR-Assay bei verschiedenen Temperaturen (T = 25 °C –
60 °C) und Progesteron als Substrat bestimmt. Alle rekombinanten Proteine wiesen ein ähnliches
Temperatur-Profil auf, wobei das Optimum jeweils bei 45-50 °C zu finden war (Abb. 19). Dies
entspricht in den Werten, die für die rDlP5βR und die rAtP5βR vorliegen.
Abb. 19: Einzelmessungen der Temperatur-Optima bestimmt mittel GC-MS-Analytik über die relative Aktivitäten
(II.2.4.2) bei unterschiedlichen Temperaturen (A = rGfP5βR; B = rMpP5βR; C = rEcP5βR; gemessen wurde die relative
Aktivität – II.2.4.2- bei unterschiedlichen Temperaturen).
Alternativ wurden die Temperatur-Optima der rMpP5βR und der rDlP5βR auch
photometrisch mit 2-Cyclohexen-1-on als Substrat bestimmt. Diese Messungen lieferten sehr
ähnliche Aktivitätsverläufe (Daten nicht gezeigt).
III.2.3.4 Enzymkinetiken für Progesteron und 2-Cyclohex-1-enon
Zur Bestimmung der Km- und vmax-Werte der rekombinanten P5βR wurde eine neue
photometrische Messmethode adaptiert, die auf der Abnahme des Cosubstrats NADPH während der
Katalyse beruht (II.2.4.3). Hierzu wurden die nativ-gereinigten Enzyme in P5βR-Assaypuffer
61
umgepuffert (II.2.3.2). Zunächst wurde für jedes Protein je nach Aktivitätsstufe der optimale AssayKonzentration bestimmt.. Als Standardsubstrate wurden sowohl das putativ-native Substrat
Progesteron, als auch das kleine Substratanalogon 2-Cyclohexen-1-on eingesetzt. Zur Berechnung
der Km-Werte diente der Hanes-Plot (II.2.4.3).
In der folgenden Abbildung (Abb. 20) sind exemplarisch einige photometrische Messkurven
des Enzym-Assays mit Progesteron bzw. 2-Cyclohexen-1-on als Substrat und die Hanes-Plots zur
Bestimmung der Km/vmax-Werte für beide genannten Substrate und das Cosubstrat am Beispiel der
rMpP5βR aufgeführt (für die anderen Enzyme werden die Werte direkt in Tabellen-Form
angegeben; s. Tab. 4).
Km = 200,1 µM
Vmax =1,95 mkat/kg
Km = 109,5 µM
Vmax = 8,05 mkat/kg
Abb. 20: Hanes-Plots zur Ermittlung der Km- und vmax-Werte der rMpP5βR bei 40 °C. A Substrat = Progesteron;
Proteinkonzentration = 0,05 mg/mL. B Substrat = 2-Cyclohexen-1-on; Proteinkonzentration = 0.025 mg mL.
Für Progesteron konnte ein Km-Wert von 200,2 +/- 31,9 µM und ein vmax-Wert von 2,10 +/0,32 mkat/kg Protein ermittelt werden. Die kinetischen Daten der rGfP5βR und der rEcP5βR
wurden analog dazu bestimmt, wobei die rEcP5βR zur weiteren Charakterisierung im Rahmen der
Dissertation von Frau J. Munkert bearbeitet wurde (Munkert et al., 2011). Auf Grund der
geänderten Messmethode wurden die von Herl et al. (2006/2009) publizierten kinetischen Daten der
rDlP5βR bzw. rAtP5βR photometrisch neu bestimmt. Zusätzlich wurde erstmals auch 2-
62
Cyclohexen-1-on als alternatives Substrat getestet und kinetische Konstanten hierfür bestimmt
(Zusammenfassung s. Tab. 4).
Tab. 4: Kinetische Daten einiger klonierter, rekombinanter P5βR für unterschiedliche Substrate (CH = 2-Cyclohexen-1on; PRO = Progesteron), (n = min. 3) (n.b. = nicht bestimmt).
Substrat
rAtP5βR
rDlP5βR
rEcP5βR
rGfP5βR
rMpP5βR
Km
vmax
kcat
Km/kcat
[µM]
[mkat/kg]
[min-1]
[M-1/s-1]
PRO
268,3 +/- 23
3.69 +/- 1.09
10,11
628,0
CH
115.7 +/- 1.6
20.40 +/- 1.38
66,85
9630,1
PRO
362,3 +/- 57,5
0.42 +/- 0.05
1,13
52,2
CH
333,3 +/- 28,5
10.83 +/- 1.10
29,24
1462,3
PRO
n.b.
CH
912,4 +/- 92,9
59,43 +/- 4,83
164,55
3005,7
PRO
267,0 +/- 55,2
0,18 +/- 0,01
0,48
30,0
CH
141,4 +/- 45,3
6,16 +/- 1,11
16,89
1990,8
PRO
200,2 +/- 31,9
2,10 +/- 0,32
5,77
480,6
CH
110,2 +/- 54,8
7,36 +/- 0,71
20,27
3064,5
Diese bestimmten Aktivitätsdaten für die rekombinanten Enzyme decken sich gut mit der
qualitativen, dünnschichtchromatographischen Analyse. Dieses einfache DC-Screening-Verfahren
stellte jedoch eine ausreichende Basis für das später zu erläuternde „bioactivity-guided screening“Verfahren dar (s. II.4.2).
Für die rAtP5βR und die rMpP5βR wurden zusätzlich Experimente zur Bestimmung von
kinetische Daten für 12-Oxophytodien-Säure (OPDA), einem (Enon-)Substrat aus dem
Jasmonsäure-Stoffwechsel, durchgeführt. Allerdings konnte für beide Enzyme keine Umsetzung
unter den Bedingungen des Photometer-Assays nachgewiesen werden.
III.2.3.5 Enzymkinetiken des Cosubstrats NADPH
Um die kinetischen Daten für das Cosubstrat NADPH zu ermitteln, wurde 2-Cyclohexen-1on im Überschuss (Endkonzentration 2 mM) zugesetzt. Für die rMpP5βR betrug der Km-Wert (bei
einer Enzymkonzentration von 0,0125 oder 0,025 mg pro Assay) 28,1 +/- 8,6 µM. In Abbildung 21
sind jeweils die Hanes-Plots dargestellt, die aus den photometrischen Daten der Aktivitäten der
Enzyme abgeleitet wurden. Die Enzymmengen, die pro Ansatz eingesetzt wurden, mussten jeweils
empirisch herausgefunden werden.
63
Km = 19,8 µM
Vmax = 6,8 mkat/kg
Km = 18,8 µM
Vmax = 19,8 mkat/kg
Km = 25,7 µM
Vmax = 17.8 mkat/kg
Km = 31,7 µM
Vmax = 1,7 mkat/kg
Km = 58,7 µM
Vmax = 41,2 mkat/kg
Abb. 21: Photometrische Bestimmung (repräsentative Einzelmessungen) der enzymkinetischen Daten für rMpP5βR,
rAtP5βR, rDlP5βR, rGfP5βR und rEcP5βR in der Hanes-Darstellung. Proteinkonzentrationen 0.0125 mg (n = mind. 3).
Die statistische Auswertung aller gemessenen Km- und vmax-Werte gibt die folgende Tabelle
wieder (Tab. 5):
Tab. 5: Kinetische Daten einiger rekombinanter P5βR für die Umsetzung des Cosubstrats.
Substrat
rAtP5βR
NADPH
Km
[µM]
17,8 +/- 1,4
vmax
[mkat/kg]
18,78 +/- 1,46
kcat
[min-1]
51,46
Km/kcat
[M-1/s-1]
48179,8
rDlP5βR
NADPH
40,6 +/- 12,9
17,99 +/- 4,14
48,59
19965,5
rEcP5βR
NADPH
54,1 +/- 13,7
49,18 +/- 7,68
136,16
46147,4
rGfP5βR
NADPH
29,2 +/- 7,2
4,46 +/- 1,23
12,25
7037,9
rMpP5βR
NADPH
28,1 +/- 8,6
9,88 +/- 2,71
27,19
16110,9
Die Affinitäten der verschiedenen orthologen P5βR lagen alle im selben Größenbereich. Die
Bestimmung der Werte wurde auch deshalb durchgeführt, um zu untersuchen, ob spätere
Mutationen innerhalb der Bindetasche einen zusätzlichen Effekt auf die Cosubstrat-Bindung
besitzen.
64
III.3 Modellierung und in silico Analyse der heterolog exprimierten Biosynthese-Gene
III.3.1 Homologie-Modellierung der P5βR und deren Validierung
Um einen Einblick in die räumliche Struktur der funktionellen rP5βR zu erhalten, wurden
diese mit SWISS-Model modelliert. Mit Hilfe des „Template Identification Tools“ wurde nach
möglichen Templates mit experimentell bestimmter Proteinstruktur gesucht. Hierbei fanden sich in
allen Fällen ausschließlich die beiden DlP5βR-Strukturen (PDB 2v6g mit co-kristallisiertem
NADPH bzw. PDB 2v6f ohne NADPH). Als Grundlage für die Modellierung wurde 2v6g gewählt,
da die Auflösung des Kristalls und der E-value des Kristalls geringfügig besser waren als für PDB
2v6f. Modelliert wurde neben den Proteinen, für die enzymkinetische Daten erhoben worden sind
(P5βR aus A. belladonna, A. thaliana, E. crepidifolium, E. rhaeticum, M. piperita), auch die
(funktionell) klonierten P5βR aus A. curassavica, A. rusticana, H. carnosa, L. annua, N. oleander,
Nierembergia aristata, P. major und W. somnifera. Auf Grund der hohen Sequenzidentität der
neuen entdeckten Enzyme von mindestens 69 % zur DlP5βR, wurde für die Modellierung mit
Swiss-Model der automatische Modus gewählt. Die Modelle unterschieden sich im Bezug auf ihre
Gesamtfaltung nur geringfügig hinsichtlich bestimmter „Loops“ an der Oberfläche der Proteine,
waren ansonsten jedoch praktisch identisch (Abb. 22; Pfeile):
65
Abb. 22: Cartoon-Darstellung der Homologie-Modelle der klonierten und funktionell exprimierten P5βR aus A.
thaliana (rAtP5βR, A), D. lanata (rDlP5βR, B; Template für Modellierung; PDB 2v6g), E. crepidifolium (rEcP5βR, C),
G. fruticosus (rGfP5βR, D), M. piperita (rMpP5βR, E). In gelb gezeigt sind Substrat (Progesteron) und Cosubstrat
(NADP+).
Unterschiede zeigten sich in der Mikroarchitektur, z.B. der Aminosäure-Zusammensetzung
der putativen Substratbindetaschen. Gezeigt werden im folgenden die Reste, die sich im Abstand
von bis zu 4 Å um ein in das Model integrierte Substrat (Progesteron) befanden (Abb. 23).
66
Abb. 23: Darstellung der Substratbindetaschen (= Reste im Abstand von 4 Å um das Substrat) der Homologie-Modelle
der klonierten und funktionell exprimierten P5βR aus A. thaliana (rAtP5βR, A), D. lanata (rDlP5βR, B; Template für
Modellierung; PDB 2v6g), E. crepidifolium (rEcP5βR, C), G. fruticosus (rGfP5βR, D), M. piperita (rMpP5βR, E). In
gelb gezeigt sind Substrat (Progesteron) und Cosubstrat (NADP+).
Die Qualität der Modelle wurde via QMEAN Server analysiert (Abb. 24). Für die MpP5βR
lag der globale „QMEAN-Score“ bei 0.73, der „z-Score“ bei -0.25 und somit jeweils in einem
Bereich, der sich mit den durchschnittlichen Werten für experimentell bestimmte Proteinstrukturen
ähnlicher Größe (Anzahl der Aminosäurereste +/- 10 %) vergleichen lässt. Auch bei näherer
Betrachtung der einzelnen Aminosäure-Reste im Protein konnten keine größeren, unstimmigen
Bereiche detektiert werden (Abb. 24.D, Darstellung in rot).
67
Abb. 24: Analyse der Qualität der erzeugten Homologie-Modelle am Beispiel der MpP5βR. A/B Darstellung der
globalen QMEAN-Scores im Vergleich zu nicht-redundanten, experimentell bestimmten Strukturen ähnlicher Größe
(rot = Lage des MpP5βR-Modells); C Aufgliederung des QMEAN-Scores in die Unterpunkte (blau = verlässliche
Bereiche; rot = unsichere Bereiche); D Plot zur detaillierten Beurteilung der Modellqualität (blau = verlässliche
Bereiche; rot = unsichere Bereiche).
Die folgende Tabelle gibt die QMEAN-Score- und z-Score-Werte für alle HomologieModelle wieder, mit denen weiter gearbeitet wurde (III.4.2). Diese Werte wurden zum Vergleich
auch für die experimentell bestimmte Struktur der rDlP5βR (PDB=2v6g) bestimmt (Tab. 6):
68
Tab. 6: Validierungsdaten wichtiger P5βR-Homologie-Modelle mittels QMEAN-Server. Grau unterlegt sind die Werte
für die experimentell bestimmte Kristallstruktur der rDlP5βR.
Protein
QMEAN-Score
z-Score
rAtP5βR
0.77
0,01
rDlP5βR
0.76
-0,12
rEcP5βR
0,76
-0,17
rErP5βR
0,73
-0,20
rGfP5βR
0,76
0,09
rMpP5βR
0,73
-0,25
rNaP5βR
0,79
0,23
Alle Modelle zeigten somit eine ausreichend gute Qualität für die Planung von MutageneseExperimenten.
69
III.3.2 Exakte Analyse der Substrat-Bindetaschen
Um die quantitativen Unterschiede in der Katalyse der funktionellen P5βR besser zu
verstehen, wurden die Substrat-Bindetaschen der modellierten P5βR näher untersucht. Hierbei
wurden die Reste, die sich in einem Abstand von bis zu 4 Å um das Substrat Progesteron befanden,
als Bindetasche definiert (Abb. 23). Dies umfasste für die DlP5βR die Reste W106, G145, R146,
K147, M150, F153, Y156, Y179, G204, N205, M215, F343, V346, I347, N350, E352 und F353.
Die Besetzung dieser Positionen mit Aminosäureresten in den erstellten Homologie-Modellen ist in
der folgenden Tabelle dargelegt (Tab. 7):
Tab. 7: Analyse der Belegung einzelner Positionen innerhalb der putativen Substratbindetasche unterschiedlicher P5βR.
106 145 146 147 150 153 156 179 204 205 215 343 346 347 350 351 353
D. lanata
W
G
R
K
M
F
Y
Y
G
N
M
F
V
I
N
E
F
E. crepidifolium
W
G
T
K
L
F
L
Y
N
T
M
F
V
I
V
E
M
E. rhaeticum
W
G
T
K
V
F
L
Y
N
T
M
F
V
I
V
E
M
A. belladonna
W
G
R
K
L
F
Y
Y
G
T
M
F
L
I
G
D
P
G. fruticosus
W
G
G
K
C
F
Y
Y
G
N
M
F
I
C
Y
E
A
M. piperita
W
G
R
K
V
F
V
Y
G
A
M
F
F
S
Y
E
P
A. thaliana
W
G
T
K
L
F
V
Y
N
M
M
F
V
I
V
E
M
A. curassavica
W
G
G
K
C
F
Y
Y
G
N
M
F
I
C
Y
E
A
H. carnosa
W
G
G
K
A
F
W
Y
G
N
M
F
L
C
Y
E
A
N. oleander
W
G
L
K
L
F
F
Y
G
N
M
F
I
V
F
E
Q
P. major
W
G
R
K
V
F
I
Y
G
N
M
F
A
V
I
P
P
I. canariensis
W
G
R
K
M
F
Y
Y
G
N
M
F
V
I
N
E
F
N. tabacum
W
G
R
K
L
F
Y
Y
G
V
M
F
L
M
G
D
R
Durch diesen Vergleich der Bindetaschen fanden sich sieben Positionen, die in allen
Proteinen strikt konserviert vorliegen: Es handelt sich um W106, G145, K147, F153, Y179, M215
und F343 (Nummerierung entsprechend der DlP5βR). Aus den Homologie-Modellen wurde
ersichtlich, dass diese Reste, trotz ihrer teils weiten Entfernung innerhalb der Primärsequenz der
Proteine, geclustert an einer Seite der Bindetasche vorlagen. Die relative Lage dieser Reste in der
Bindetasche wird in Abb. 25 dargestellt:
70
Abb. 25: A Nummerierung der Bindetasche der P5βR am Beispiel der DlP5βR und Darstellung der strukturellkonservierten Reste W106, G145, K147, F153, Y179, M215, F343. B Häufigkeit von bestimmten Aminosäuren
innerhalb der Bindetaschen der funktionell bestätigten P5βR. Die Schriftgröße des Einbuchstaben-Codes entspricht der
Häufigkeit des Auftretens in den untersuchten P5βR.
Die erstmalige Beschreibung der Reste bereits von uns publiziert (Bauer et al., 2010). Ihre
Rolle für die Katalyse/Struktur der P5βR wurde im Anschluss durch Alanin-Austausch-Mutagenese,
am Beispiel des D. lanata Proteins näher untersucht (III.4.1).
71
III.4 Ortsgerichtete Mutagenese (SDM) der rekombinanten D. lanata P5βR
Aufbauend auf die aus III.1-III.3 gewonnenen Erkenntnisse sollte im folgenden mittels
ortsgerichteter Mutagenese ein verbesserter Einblick in die Struktur und die Funktionalität der
P5βR erhalten werden. Dies ist von besonderem Interesse, da es sich bei diesen Enzymen um eine
neue Untergruppe der „short-chain dehydrogenases/reductases“ (SDRs) handelt, zu der neben einer
einzigen Kristallstruktur kaum strukturelle Daten vorhanden sind (Thorn et al., 2008). Den
Schwerpunkt der Experimente bildeten Versuche, die sich mit den quantitativen Unterschieden der
rDlP5βR und der rAtP5βR befassten und ein rationales Enzym-Engineerings der rDlP5βR zum Ziel.
hatten. Obwohl im Rahmen dieser Arbeit weitere rekombinante P5βR verfügbar wurden, war die
P5βR im folgenden auf Grund der experimentell bestimmten Kristallstruktur der hauptsächliche
Ausgangspunkt aller Mutagenese-Experimente.
III.4.1 Mutagenese der konservierten Reste der Bindetasche der DlP5βR
Um Hinweise auf die Bedeutung der in III.3.2 identifizierten, strukturell-konservierten
Aminosäurereste innerhalb der Bindetasche (W106, G145, K147, F153, Y179, M215, F343) zu
erhalten, sollten Muteine der DlP5βR erzeugt werden, bei denen diese jeweils einzeln mittels
ortsgerichteter Mutagenese durch Alanin ersetzt worden sind. In den folgenden Ausführungen wird
die DlP5βR stets als „Wildtyp“ (WT) bezeichnet (Herl et al., 2006; rDlP5βRnn-13).
III.4.1.1 Herstellung und Validierung der mutierten Plasmide
Das Mutagenese-Protokoll für P5βR wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert und optimiert.
Es beruht auf einer PCR-Reaktion (II.2.1.4), die mit Primern durchgeführt wurde, die jeweils ein
dem Codon-Usage von E. coli angepasstes Alanin-Codon (GCC/GCT) an Stelle des Tripletts der
Aminosäure, die im Wildtyp (WT) substituiert werden sollte, enthielt. Als Template diente jeweils
das von Herl et al. (2006) generierte pQE30/DlP5βR-Konstrukt zur Expression der WT-DlP5βR.
Das Ergebnis dieser PCRs wurde mittels Agarose-Elektrophorese kontrolliert. Dies ist in folgender
Abbildung exemplarisch am Beispiel der angestrebten Substitution von G145, K147, F343 und
M215 gegen Alanin zu sehen (Abb. 26). Die Primer hierzu finden sich unter II.1.10.
72
Abb. 26: PCR mit Mutagenese-Primern zum Austausch der konservierten Reste gegen Alanin und dem
pQE30/DlP5βR(WT)-Konstrukt
(1
=
G145A_F/G145A_R-Primer,
2
=
K147A_F/K147A_R-Primer,
3
=
F343A_F/F343A_R-Primer, 4 = M215A_F/M215A_R-Primer).
Erfolgreiche PCR-Ansätze kennzeichneten sich durch eine (schwach) sichtbare Bande bei
einer Größe von etwa. 4,0 kb (pQ30-Vektor, inkl. D. lanata P5βR-Insert). Bevor mit diesen PCRAnsätzen weiter gearbeitet werden konnte, wurde anschließend die Wildtyp-DNA (Template) durch
2-stündigen, selektiven Restriktionsverdau mit DpnI zerstört (II.2.1.18). Dies verringerte die spätere
Zahl an falsch-positiven Bakterien-Kolonien drastisch. Unabhängig von der Ausbeute der PCR
wurden 5 µL des ungereinigten PCR-Ansatzes zur in vivo Ligation und Vermehrung der DNA in
hochkompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10). Parallel wurden zur Kontrolle des
DpnI-Verdaus 5 µL des unbehandelten PCR-Ansatzes transformiert.
Zur Verifizierung der erfolgreichen Mutagenese des DlP5βR-Gens wurde die Plasmid-DNA
aus mehreren Bakterienkolonien re-isoliert (II.2.1.14) und sequenziert. Als Primer wurden pQE_FP
und pQE_RP(-50) genutzt. Die Auswertung der erhaltenen Sequenz erfolgte durch ein Alignment
gegen die WT-Sequenz. Ein repräsentativer Ausschnitt eines Nucleotid-Alignments zwischen dem
der WT- und der putativen DlP5βR_W106A-Sequenz zeigt Abb. 27:
73
DlP5βR
W106A
CGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA 299
CGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCA 298
************************************************************
DlP5βR
W106A
CGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAG 359
CGTGTTCTACGTTACCGCGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAG 358
**************** ******************************************
DlP5βR
W106A
CAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACAT 419
CAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACAT 418
************************************************************
Abb. 27: Ausschnitt aus dem Alignment der putativen DlP5βR_W106A-Sequenz gegen den D. lanata WT (rot = TrpCodon; grün = Ala-Codon).
In der WT-Sequenz befindet sich an den Position 316-318 mit TGG ein Tryptophan-Codon
(rot). Im Falle der mutierten Sequenz war der korrespondierende Sequenz-Abschnitt durch das
Alanin-Codon GCG (grün) ersetzt. Die Ergebnisse der Codon-Substitutionen bei allen anderen
Mutagenese-Experimente sind in Tab. 8 aufgelistet.
Tab. 8: Codons der konservierten Aminosäurereste im WT und nach erfolgreicher Mutagenese.
Position
Altes Codon (WT)
AS
Neues Codon
AS
106
TGG
W
GCG
A
145
GGG
G
GCT
A
147
AAG
K
GCG
A
153
TTT
F
GCT
A
215
ATG
M
GCG
A
343
TTT
F
GCT
A
Die Daten zeigten, dass mittels der Mutagenese-PCR (Expressions-)Plasmid-Konstrukte mit allen
gewünschten Mutationen der Dl5βR (W106A, G145A, K147A, F153A, M215A, F343A) erzeugt
werden konnten. Diese Konstrukte wurden zur Protein-Expression in chemisch kompetente E. coli
M15 [pREP4] Zellen transformiert (II.2.1.10). Der Austausch des katalytischen Tyrosins (Tyr-179)
gegen Alanin wurde bereits von Thorn et al. (2008) beschrieben. Das rDlP5βR Y179A-Mutein war
komplett inaktiv.
74
III.4.1.2 Überexpression und Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine
Die Überexpression aller Muteine und die native His-tag Reinigung (II.2.2.1-II.2.2.2)
erfolgte nach den Standardbedingungen für den DlP5βR WT, da - wie beschrieben - lediglich
einzelne Reste im Inneren des Proteins ausgetauscht wurden. Auf diese Art konnten alle Muteine
erfolgreich gereinigt werden. Jeweils 0,2 mg des rekombinanten Proteins wurden in einem
Standard-P5βR-Enzymassay eingesetzt (II.2.3.6). Die Auswertung der katalytischen Effizienz
erfolgte zunächst mit Hilfe der DC um eine Einschätzung des Aktivitätsgrads der Muteine treffen zu
können. Als Standard-Substrat diente hierbei Progesteron. Zur Bestimmung der relativen
Aktivitäten wurden die Verhältnisse von gebildetem Produkt zu Substrat nach einer Assay-Dauer
von genau 2 h zusätzlich auch gaschromatographisch quantifiziert. Abbildung 28 zeigt die
Ergebnisse dieser Versuchsreihen.
75
Abb. 28: GC-MS- und DC-Analyse der Standard-P5βR-Assays aller Muteine (0,2 mg/Assay) mit 0,5 mM Progesteron
bei 30 °C nach 2 h (Mut = Assay mit Mutein; WT = Referenz-Assay mit WT).
Die Ergebnisse der Versuche zeigten, dass der Austausch der strukturell-konservierten
Aminosäure-Reste gegen Alanin in allen Fällen jeweils zu einem drastischen Rückgang der
katalytische Aktivität führte. Dieser Rückgang lag im Bereich zwischen 51 und 100 Prozent. Die
Substitution von Gly-145 und Phe-153 hatten einen vollständigen Verlust der Aktivität zur Folge.
Andererseits führte die Mutagenese des als katalytisch essentiell geltende Lysin-Restes (Lys-147)
76
erstaunlicherweise nicht zum kompletten Funktionsverlust. Für das Mutein wurde eine Restaktivität
von ca. 13 Prozent gemessen. Die berechneten relativen Aktivitätswerte sind in Tab. 9
zusammengefasst:
Tab. 9: Berechnete relative Enzym-Aktivitäten für alle Muteine nach Alanin-Austauschmutagenese der konservierten
Aminosäure-Reste (n = 5 - 12; n.d. = nicht detektierbar; MW +/- STABW).
Mutein
AUC(Produkt)/AUC(Produkt+Substrat)
Relative Aktivität
rDlP5βR WT
0.25 +/- 0.04
100
rDlP5βR W106A
0.12 +/- 0.01
48
n.d.1
rDlP5βR G145A
rDlP5βR K147A
0
0.03 +/- 0.01
n.d.1
rDlP5βR F153A
12
0
rDlP5βR M215A
0.13 +/- 0.01
52
rDlP5βR F343A
0.04 +/- 0.01
16
Die beiden Muteine, die im Standard-P5βR-Assay mit Progesteron keine nachweisbare
Enzym-Aktivität mehr zeigten (DlP5βR G145A bzw. F153A), wurden zusätzlich photometrisch auf
die Umsetzung von 2-Cyclohexen-1-on hin untersucht. Dadurch sollte geklärt werden, ob der
Funktionsverlust der Proteine auf Progesteron als Substrat beschränkt war. Pro Assay wurden 0,2
mg Protein und 0,4 mM Substrat eingesetzt. Bei 40 °C wurde eine mögliche Reaktion indirekt über
den Verbrauch an Cosubstrat bestimmt. Es konnte in keinem der beiden Fälle eine signifikante
Umsetzung gemessen werden (Abb. 29).
Abb. 29: Photometrische Messung der Abnahme der Extinktion des Cosubstrats (λ = 340 nm) am Beispiel der
Umsetzug von 2-Cyclohexen-1-on (0,4 mM) durch das inaktive rDlP5βR F153A-Muteins (0,2 mg).
77
Aus den Steigungen konnten die spezifischen und relativen Aktivitäten aller Muteine für die
Umsetzung von 2-Cyclohexen-1-on (Konzentration 0,4 mM) errechnet werden (II.2.4.3). Bei alle
mutierten Proteinen zeigte sich einen deutlich Rückgang der Enzymaktivität (Tab. 10).
Tab. 10: Spezifische und relative Aktivitäten der Alanin-Austausch-Muteine mit CH als Substrat (EK = 0,4 mM; Temp.
= 40 °C) photometrisch bestimmt (n.d. = nicht detektierbar.; n > 3; MW +/- STABW).
Mutein
Spezifische Aktivität [U/mg]
Relative Aktivität
rDlP5βR WT
0,3279 +/- 0,0322
100,0
rDlP5βR W106A
0,0093 +/- 0,013
2,8
rDlP5βR G145A
rDlP5βR K147A
rDlP5βR F153A
n.d.
n.d
0,0031 +/- 0,001
n.d.
0,9
n.d.
rDlP5βR M215A
0,0043 +/- 0,001
1,3
rDlP5βR F343A
0,0032 +/- 0,001
0,9
Der Verlust an Enzymaktivität verglichen mit dem WT der rDlP5βR war insgesamt
betrachtet noch ausgeprägter, als bei den Messungen mit Progesteron als Substrat. Die Aktivität der
Muteine lagen alle unter 3 % verglichen zum Wildtyp. Auch in diesen Versuchen konnte weder für
die Substitution G145A, noch für F153A, Aktivität mehr gemessen werden, was deren potentielle
Wichtigkeit für die Struktur des Proteins nahelegt.
Zusätzlich wurden erste Muteine der rAtP5βR hergestellt um die Auswirkungen der
Substitution der beiden Phenylalanine (analog zu Phe-153 und Phe-343 in der DlP5βR) auch in
diesem Enzym zu messen. Die Herstellung der AtP5βR F153A- und AtP5βR F3423A-Muteine
erfolgte mittel ortsgerichteter Mutagenese via Mutagenese-PCR (II.2.1.13). Über DNASequenzierung wurde die Mutagenese auf Nukleotid-Ebene bestätigt (II.2.1.16). Die Mutagenese
aller weiteren hier identifizierten, konservierten Aminosäuren der rAtP5βR wird von Herrn Jan
Petersen im Rahmen seiner Masterarbeit fortgeführt.
III.4.1.3 Kinetische Untersuchung der Muteine
Zusätzlich zu den relativen Aktivitäten wurden auch kinetische Enzym-Daten einiger
Muteine experimentell bestimmt. Da die Aktivitäten mit Progesteron für die Messmethode zu
gering waren, wurde statt dessen auf das bereits beschriebene Substrat-Mimetikum Cyclohexenon
zurückgegriffen. Messungen gelangen nur bei einer Erhöhung der Protein-Konzentration im
78
Photometer-Assay auf 0,2 mg/mL für die rDlP5βR K147A, F343A und M215A.
Tab. 11: Kinetische Daten einiger Alanin-Austausch-Mutanten der rAtP5βR bzw. der rDlP5βR (MW +/- STABW; n = 1
-4; n.d. = nicht detektierbar).
Substrat
Km
[µM]
vmax
[mkat/kg]
kcat
[min-1]
rAtP5βR F153A
CH
1011,2
22,71
62,1
rAtP5βR F343A
CH
329,2
2,3
6,29
rDlP5βR G145A
CH
n. d.
rDlP5βR K147A
CH
46,9 +/- 21,6
0,065+/-0,010
0,18
rDlP5βR F153A
CH
n. d.
rDlP5βR M215A
CH
107,6 +/- 69,0
0,1278 +/- 0,034
0,35
rDlP5βR F343A
CH
206,1 +/- 133,5
1,067 +/- 0,203
2,89
Bei den Messungen der rAtP5βR-Muteine handelt es sich nur um Doppelbestimmungen (n =
2), die nur zur ersten Orientierung durchgeführt wurden. Man erkennt allerdings, dass der v max-Wert
des F343-Muteins im Vergleich zum A. thaliana WT durch den Austausch auf etwa 1/10 gesunken
ist (s. Tab. 4). Das identische Phänomen eines Rückgangs des v max-Werts auf 1/10 wurde auch für
das rDlP5βR F343A-Mutein gemessen. Beim A. thaliana-Protein führte der Austausche der Phe-153
nicht zu einem vollständigen Funktionsverlust, allerdings verkleinerte sich die Affinität des Proteins
für CH stark (Km des WT = 115,7 +/- 1,6; Vgl. Tab. 4).
III.4.1.4 In silico Betrachtung der Muteine DlP5βR G145A und F153A
Um eine Erklärung zu finden, weshalb die Substitutionen von Gly-145 und Phe-153 jeweils
zu einem vollständigen Funktionsverlust der beiden Muteine führten, erfolgte eine genauere in
silico Analyse der Kristallstrukturen der DlP5βR (PDB 2v6g und 2v6f). Hierzu wurde Progesteron,
das nicht im Kristall enthalten war, in das Enzym modelliert.
Für Gly-145 findet sich eine große räumliche Nähe sowohl zum Substrat (Progesteron), als
auch zur wichtigsten katalytischen Aminosäure Tyr-179 (Abb. 30, A). Das Cα-Atom des Glycins
befindet sich in einem Abstand von 3,8 Å zum O-Atom der Seitenkette des Tyrosins und 5,9 Å
entfernt von nächstgelegenen C-Atom des Progesterons. Die in silico Mutagenese dieses
Aminosäure mit Pymol (II.2.5) zeigt, dass durch die größere Seitenkette der C-O-Abstand auf 2,8 Å
und der C-C-Abstand auf 3,6 Å sinken (Abb. 30, B). Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe,
79
dass es zu einer sterischen Hinderung innerhalb der Substratbindetasche kommt und die Katalyse
deshalb gestört wird. Gleichzeitig sinkt mit dem Austausch eines Glycins die Flexibilität der
Bindetasche.
Abb. 30: In silico Mutagenese von Gly-145 (A = DlP5βR WT, PDB 2v6g; B = DlP5βR G145A). In Rot dargestellt sind
Substrat und Cosubstrat der Reaktion.
Analoge in silico Mutagenese-Experimente für das F135A-Mutein lieferten keine
eindeutigen Ergebnisse. Allerdings wurde im Weiteren die Lage aller identifizierten, konservierten
Reste in den beiden verfügbaren Kristallstrukturen am PC überlagert (Abb. 31). Hierbei wurde
ersichtlich, dass die relative Position aller 7 Aminosäure-Seitenketten sich unabhängig von der
Anwesenheit oder Abwesenheit von NADP+ nicht entscheidend verändert. Nur der Indol-Ring von
Trp-106 ändert geringfügig seine Lage. Die Ausnahme hierzu stellte Phe-153 dar. Die Aminosäure
ist Teil eines flexiblem „loops“, der einen Teil der Bindetasche bildet, beginnend bei Met-150.
Dieses Ergebnis wurde zusätzlich gestützt durch die niedrigen B-Faktoren, die für diesen Teil des
Protein-Kristalls angegeben werden.
80
A
B
Abb. 31: Vergleich der Positionen der konservierten Aminosäure-Reste in den beiden Kristallstrukturen der DlP5βR (A
= Kristall mit Cosubstrat; B = Kristall ohne Cosubstrat). Zu sehen sind das Substrat (Progesteron; blau) und das
Cosubstrat (NADP+; grün).
Die Ergebnisse geben einen Hinweis auf eine Art „Substrat-Klammer“ an der Phe-153
beteiligt ist. Zusammenfassend konnte in diesem Teil der Arbeit die Bedeutung der neu
identifizierten Aminosäure-Reste sowohl experimentell, als auch in silico gezeigt werden.
Gleichzeitig wurde experimentell die absolute Notwendigkeit des zweiten katalytischen
Aminosäure-Restes Lys-147 relativiert.
81
III.4.2 Rationale Mutagenese zur Steigerung der katalytischen Aktivität der rDlP5βR
Das wesentliche Ziel der Mutagenese-Experimente der DlP5βR war es die publizierten
Aktivitätsunterschiede für die Reduktion von Progesteron zwischen den beiden homologen P5βR
aus D. lanata und A. thaliana zu erklären (siehe I.2.2). Diese quantitativen Unterschiede wurden im
Rahmen dieser Arbeit reproduziert und neben Progesteron auch für das zweite gewählte StandardSubstrat 2-Cyclohexen-1-on demonstriert (II.2.3.4). Ein rationales Mutagenese-Konzept wurde
entwickelt, in welchem neben den beiden genannten Proteinen auf die Sequenz-, Struktur- und
Aktivitätsinformationen der im Rahmen dieser Arbeit klonierten, funktionell exprimierten,
homologen P5βR (rEcP5βR, rErP5βR, rGfP5βR, rMpP5βR) zurückgegriffen wurde. Daneben
wurden bereits bestehende in silico Erklärungen experimentell überprüft (Herl et al., 2009).
III.4.2.1 Ableitung von essentiellen Aminosäuren für die katalytische Aktivität der rDlP5βR
Ein Vergleich der hoch aktiven rAtP5βR und schwach aktive rDlP5βR zeigte im direkten
Alignment (II.2.5) eine Identität von ca. 70 Prozent auf Aminosäure-Ebene. Dies entsprach 118
Unterschieden in den Primärstrukturen der beiden Proteine, wobei keine Wertung der einzelnen
Substitutionen hinsichtlich ihrer Lage im Protein bzw. ihrer Qualität (konservative Substitutionen,
etc.) vorgenommen wurde. Zur weiteren Einschränkung von putativ wichtigen Aminosäure-Resten
wurde mit CLUSTALw ein „Multiple Sequence Alignment“ erstellt, das neben der DlP5βR und der
AtP5βR die in dieser Arbeit aus diesem Grund neu klonierten, funktionell exprimierten EcP5βR,
ErP5βR, GfP5βR und MpP5βR beinhaltete. Wie bereits dargelegt, fanden sich, wie bei der
Klonierung angestrebt, P5βR von 2-3 Aktivitätsstufen, wobei die phylogenetisch näher verwandten
Gruppen DlP5βR/MpP5βR bzw. AtP5βR/ErP5βR/EcP5βR jeweils überraschenderweise sehr
unterschiedliche Aktivitätswerte zeigten. Die GfP5βR besaß kaum noch katalytische Aktivität. Für
das Aktivitäts-Screening reichte ein einfacher Aktivitätsvergleich mit DC und GC unter
Standardbedingungen (Abb. 16). Die Kenntnis der genauen kinetischen Konstanten der Enzyme
war nicht notwendig, obwohl diese zu einem späteren Zeitpunkt ebenfalls bestimmt wurden
(II.2.3.4). Im Alignment wurden die phylogenetisch näher verwandten Gruppen von P5βR mit
verschiedener Aktivität jeweils zum direkten Vergleich untereinander angeordnet (Abb. 32).
I
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
MSWWWAGAIG
..........
..........
....G.....
....G.....
..........
AAKKRLEED....K........K.D......K.DD.....K.DD...RQKKTD.Y
DAQPKHSSVA
E.P.NYQ...
EPSQSFE...
EPSQSYE...
EPTQSYE...
T.LT.FQ..G
82
LIVGVTGIIG
.V......V.
..I.....V.
..I.....V.
..I.....V.
..I.....V.
NSLAEILPLA
.........S
.........S
.........S
.........S
.........S
49
49
49
49
49
50
III
II
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
DTPGGPWKVY
..........
..........
..........
..........
..........
GVARRTRPAW
.....P....
.....P..T.
.....P..S.
.....P..S.
.....P....
HEDNPINYVQ
ND.H..T.IR
NA.H..D.I.
NA.H..D.I.
NA.H..D.I.
NA.H..E...
CDISDPDDSQ
..V..SG.AK
..V..AE.TR
..V.NAE.AR
..V.NAE.AR
...ANRE.TE
A...PLTDVT
E.......L.
S.........
S.........
S.........
E...K.....
99
99
99
99
99
100
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
HVFYVTWANR
NI.....T.K
.V.....T..
.V.....TK.
.V.....T..
.V.......K
STEQENCEAN
...A......
ES.S......
ES.S......
ES.S......
.N.I....V.
SKMFRNVLDA
G..LK.....
GS.L....Q.
GS.L....Q.
GS.I....Q.
G..LK....V
VIPNCPNLKH
L.........
I..YA...R.
IV.HA...R.
IV.HA...R.
LV....K.Q.
ISLQTGRKHY
VC.L......
VC....T...
.C....T...
.C....T...
VC....G...
149
149
149
149
149
150
ESHDPPYTED
RA....F...
PR....F...
PR....F...
PR....F...
-G.E..F...
LPRLKYMNFY
....DCP...
M...QIQ...
M...QIQ...
M...QIQ...
....DVP...
VEKKE-GLTW
.Q...-....
IK.I.-TV..
IK...ISV..
IK...-SV..
.G...-....
198
198
197
198
198
198
IV
156
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
MGPFESYGKI
V.....V...
L...TNVDGL...SNLDGV...SNL.GG
C....L...V
VI
V
YDLEDIMLEE
.T....LF..
.TQ...LF..
.TQ...LF..
.TQ..TLF..
.T...VLF.A
248
205
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
SVHRPGNIFG
......A...
.I...NM...
.I...NT...
.I...NT...
..........
FSPYSMMNLV
..........
.....L..I.
.....L..I.
.....L..I.
.....L....
GTLCVYAAIC
..........
..........
..........
..........
..........
KHEGKVLRFT
....A....P
....SP.L.P
....SP.L.P
....SP.L.P
..D.VP.K.P
GCKAAWDGYS
...G.....Y
.S.K..E.FM
.S.K..E.FT
.S.K..E.FT
...E..E...
248
248
247
248
248
248
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
DCSDADLIAE
..........
TA........
TA........
TA........
V.........
HHIWAAVDPY
.Q........
QQ........
QQ........
QQ........
.Q.......F
AKNEAFNVSN
.....L....
.......CN.
.......CN.
.......CN.
..........
GDVFKWKHFW
..........
A.I.....L.
A.I.....L.
A.I.....L.
..........
KVLAEQFGVG
.........E
.I......IE
.I......IE
.I......IE
.......D.E
298
298
297
298
298
298
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
CGEYEEGVDL
.......NEV
EYGF...KN.
EYGF...KN.
QYGF...KN.
....-..EK.
KLQDLMKGKE
.......D.G
G.VEM.....
G.VEM.....
G.VEM.....
S.E.M..D.G
PVWEEIVREN
...D......
R....M.K..
R....M.K..
R....M.K..
G..D...A..
GLTPTKLKDV
..S....E..
Q.QEK..EE.
Q.QEK..EE.
Q.QEK..DE.
..A....EE.
GIWWFGDVIL
.....A.FS.
.V...A....
.V...A....
.V...A....
.L.....IC.
348
348
347
348
348
347
DlP5βR
MpP5βR
AtStR
EcP5βR
ErP5βR
GfP5βR
GNECFLDSMN
.Y..P..T..
.V.GMI....
.V.GMI....
.V.GMI....
.Y..A.M...
KSKEHGFLGF
..........
....Y.....
..........
..........
..........
RNSKNAFISW
.....S....
...N.S....
...N.S....
...N.S....
..........
IDKAKAYKIVP
...V.......
...Y..F....
...Y..F....
...Y..F....
.E.M.......
389
389
388
389
389
388
= 71
= 26
Abb. 32: Multiple Sequenz-Alignment der P5βR zur Ableitung von essentiellen Aminosäure-Resten für die katalytische
Aktivität. Grün = Unterschiede zwischen der DlP5βR/MpP5βR ; Rot = Unterschiede zwischen der AtP5βR/EcP5βR/
ErP5βR; Graue Kästen = Überschneidungen der beiden Gruppen; Grüne Kästen = putativ essentielle Aminosäure-Reste.
83
In einem ersten Schritt wurden mit Hilfe des Alignments die Primärstruktur-Unterschiede
innerhalb des rDlP5βR (geringe bis mittlere Aktivität) / rMpP5βR (hohe Aktivität) herausgearbeitet
(grün). Da die beiden Pflanzen nähere Verwandtschaft aufweisen, als das ursprüngliche
rDlP5βR/rAtP5βR-Paar, konnte die Anzahl der putativ wichtigen Positionen von 181 auf 71
reduziert werden. In gleicher Weise wurde mit der zweiten Gruppe rAtP5βR (hohe Aktivität) /
ErP5βR bzw. EcP5βR (jeweils geringe Aktivität) verfahren (rot). Hierbei fanden sich nur 26
Aminosäuren, die in der A. thaliana Variante anders waren, als in den beiden Erysimum sp.
Enzymen.
Unter der Annahme, dass die höheren Aktivitäten jeweils auf Mutationen an identischen
Bereichen der Enzyme zurückzuführen sind, wurde nun nach Überschneidungen aus den beiden
Ableitungen gesucht, also Positionen, die sowohl in der ersten als auch in der zweiten Gruppe
unterschiedlich besetzt sind (graue Kästen). Dies grenzte die zu untersuchenden Enzymbereiche
nunmehr auf 10 Positionen ein. Diese waren (bezogen auf die DlP5βR) Q22, H25, S88, F123, I140,
M150, Y156, N205, S248 und K336. Aminosäuren, die in den hoch aktiven Enzymen und der sehr
schwachen GfP5βR identisch waren - wie der Valin-Rest in Position 140 - wurden ebenfalls als
unbedeutend eingestuft.
Bei den übrigen identifizierten Positionen wurde untersucht, ob man bei den stark bzw.
schwach aktiven P5βR an den korrespondierenden Stellen identische bzw. Aminosäuren mit
ähnlichen chemischen Eigenschaften finden kann. Dies resultierte letzten Endes im Ausschluss aller
Positionen mit der Ausnahme von Y156, N205 und S248 (grüne Kästen): Anstatt des Restes
Tyrosin-156 fand man in beiden hoch-aktiven Enzymen ein Valin. Die Stelle 205 ist bei schwächer
aktiven P5βR durch einen hydrophilen Asparagin- bzw. Threonin-Rest gekennzeichnet, während
sonst mit Alanin (MpP5βR) bzw. Methionin (AtP5βR) hydrophobe Aminosäuren vorlagen.
Ähnliches gilt für Position 248, für die bei den schwach-aktiven Proteinen ein Threonin oder Serin
auftraten, ansonsten aber ein Methionin (AtP5βR) bzw. ein Tyrosin (MpP5βR). Aus diesem Grund
sollten im weiteren Verlauf, bei den Versuchen zum rationalen „Engineering“ der katalytischen
Aktivität der rDlP5βR, die Y156V-, N205(M/A)- und S248(M/Y)-Muteine mittels SDM hergestellt
werden.
III.4.2.2 Ortsgerichtete Mutagenese der D. lanata P5βR
Die Mutagenese erfolgte, wie bereits unter III.4.1 beschrieben, für den Austausch der
strukturell konservierten Aminosäure-Reste W106, G145, K147, F153, M215 und F343 gegen
Alanin. Abb. 33 zeigt beispielhaft das Agarose-Gel der PCR des pQE30/DlP5βR-Vektorkonstruktes
(Herl et al., 2006) mit der N205M_F / N205M_B- Primerkombination vor und nach dem Verdau der
84
WT-Template-DNA mit DpnI. Das Vorgehen bei der Erzeugung, Überprüfung und Überexpression
der anderen unter III.4.2.2 definierten Muteine erfolgte in Analogie.
M
1
2
M
Abb. 33: PCR mit der WT DlP5βR-DNA (pQE30/DlP5βR-Vektorkonstrukt) und N205M_F/N205M_B-Primern (1 =
Vor DpnI-Verdau; 2 = Nach DpnI-Verdau; M = 1kb Marker).
Die mutierten Plasmid-DNAs für N205M, N205A, Y156V, S248M und S248Y wurden zur
Vermehrung in chemisch-hochkompetente E. coli NEB-5α Zellen transformiert (II.2.1.10). Die
Bestätigung der erfolgreichen Mutagenese der Plasmid-DNA wurde wie bei III.4.1.1 durchgeführt
(Abb. 34).
DlP5βR WT
TCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGG 655
DlP5βR N205M TCATCGCCCAGGGATGATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGG 647
**************
*****************************************
Abb. 34: Alignment der Sequenz der putativen DlP5βR N205M Mutante gegen die WT DNA (rot = Asn-Codon; grün =
Met-Codon).
Die Überexpression der mutierten Enzyme (DlP5βR Y156V, N205M, N205A, S248M,
S248Y) erfolgte in E. coli M15[pREP4] unter den Bedingungen des rDlP5βR-WTs bzw. wie bereits
für die Alanin-Austausch-Muteine dargelegt (III.4.1). Alle angestrebten Muteine konnten so nativ in
guter Ausbeute gewonnen werden.
85
III.4.2.3 Relative Aktivitäten und kinetische Untersuchungen der gefundenen Muteine
Zur Bestimmung der katalytischen Aktivitäten der Muteine wurden Standard-P5βREnzymassays bei einer Temperatur von 30 °C und 0,5 mM Progesteron über 2 h, mit 0,02 - 0,2 mg
Enzym, durchgeführt (II.2.3.6; Abb. 35).
Abb. 35: GC-MS-Messungen der DlP5βR (WT) und der Muteine Y156V, N205A und N205A.
Die DlP5βR-Muteine Y156V, N205A und N205M zeigten sowohl in der DC-, als auch in
GC-MS-Analyse eine deutlich stärkere Umsetzung des Progesterons zu 5β-Pregnan-2,30-dion. Die
Substitution des Serin-248 Restes gegen Alanin oder Tyrosin hatte zur Folge, dass keine Umsetzung
mehr nachweisbar war (Daten nicht gezeigt).
Für die Bestimmung der relativen Aktivitäten mittels GC-MS wurden die Konzentrationen
der Proteine im P5βR-Enzymassay auf 0,02 mg/mL reduziert, um einen Produktüberschuss über die
komplette Dauer des Assays zu gewährleisten. Als Referenz wurde der DlP5βR WT genutzt. Es
wurden minimal sechs verschiedene Protein-Chargen in Doppelbestimmung untersucht. Bei den
ermittelten Werten (Tab. 11) handelt es sich jeweils um relative (apparente) Aktivitäten, d.h. einen
86
Vergleich der Umsatzraten von Progesteron durch die Muteine im Vergleich zum WT unter den
Bedingungen des P5βR-Standardassays (30 °C, 2 h). Die Bedingungen wurden nicht für jede
Mutante optimiert (s. Diskussion IV.2).
Tab. 11: GC-MS-Messwerte und berechnete relative Aktivitäten der Y156-, N205- und S248-Muteine (n = mind. 12 ;
n.d. = nicht detektierbar – Methode validiert von Herl et al., 2006; MW +/- STABW).
Mutein
AUC
Relative, apparente Aktivität
[Produkt-/Gesamtfläche]
DlP5βR WT
0,25 +/- 0,04
100 %
DlP5βR Y156V
0,66 +/- 0,13
264 %
DlP5βR N205A
1,43 +/- 0,17
572 %
DlP5βR N205M
1,16 +/- 0,09
464 %
DlP5βR S248M
n.d.
n.d.
DlP5βR S248Y
n.d.
n.d.
1,11 +/- 0,17
444 %
DlP5βR Y156V_N205M
Die relativen Aktivitäten zeigten einen deutlichen Anstieg der Aktivität durch den Austausch
von Y156 bzw. N205. Die Y156V Mutante besaß eine ca. doppelt so hohe apparente Aktivität wie
der WT. Für die beiden Muteine N205A (Substitution in Analogie zu MpP5βR) und N205M
(Substitution in Analogie zu AtP5βR) konnte jeweils durch die Mutation einer einzigen Aminosäure
eine sehr deutliche Steigerung der apparenten relativen Aktivität auf das ca. 5-fache erreicht
werden. Die Mutagenese des Serin-Restes in Position 248 hatte für beide Muteine (S248M und
S248Y) eine deutliche Verminderung der Aktivität zur Folge. Nach 2 h Assayzeit mit 0,2 mg
Protein konnte jeweils kein 5β-Pregnan-3,20-dion nachgewiesen werden.
Um eine Erklärung für die gemessenen Effekte zu erhalten, wurden die K m – und kcat-Werte,
sowie die katalytische Effizienz (kcat/Km) für die Muteine Y156V, N205A und N205M
photometrisch bestimmt (II.2.4.3; Abb. 36). Als Substrate wurden Progesteron und 2-Cyclohexen-1on verwendet. Die Enzymkinetiken der beiden WT-Proteine (rAtP5βR, rDlP5βR) wurden ebenfalls
bestimmt.
87
Abb. 36: Hanes-Plots zur Bestimmung der DlP5βR Y156V-, N205A- und N205M-Muteine nach photometrischer
Messung der Enzym-Aktivitäten mit PRO und CH als Substrat.
Tabelle 12 gibt einen Überblick über die K m und kcat-Werte aller WT-Proteine und der
Muteine. Da es sich um fast homogen gereinigte Enzyme handelte, wurden aus den v max-Werten die
Wechselzahlen (kcat) berechnet.
88
Tab 12: Kinetische Daten der Aktivitäts-Muteine und rDlP5βR / rAtP5βR (n = mind. 3).
Enzym/
Mutein
Substrat
Km
[µM]
kcat
[s-1]
rDlP5βR
Pro
362.3 +/- 57.5
0.0189 +/- 0.0022
52.2
CH
333.3 +/- 28.5
0.4874 +/- 0.0495
1462.3
Pro
268.3 +/- 23
0.1685 +/- 0.0498
628.0
CH
115.7 +/- 1.6
1.1142 +/- 0.0630
9630.1
rAtP5βR.
DlP5βR N205A
DlP5βR N205M
DlP5βR Y156V
DlP5βR Y156V_
N205M
kcat/Km
[M-1s-1]
Pro
84.6 +/- 42.7
0.0366 +/- 0.0088
432.6
CH
174.9 +/- 31.2
1.0965 +/- 0.0969
6269.3
Pro
63.3 +/- 17.6
0.0299 +/- 0.0049
472.4
CH
195.5 +/- 10.1
0.4751 +/- 0.0781
2430.2
Pro
71.5 +/- 48.3
0.0075 +/- 0.0035
104.9
CH
1150 +/- 130
0.6772 +/- 0.0625
588.9
Pro
90.1 +/- 10,5
0,0411 +/- 0.01
456,2
CH
334,4 +/- 33,7
1,0877 +/- 0,24
3252,7
CH (kcat/Km)/
Pro (kcat/Km)
28.0
15.3
14.4
5.1
5.6
7.1
Nach diesen Ergebnissen war 2-Cyclohexen-1-on sowohl für die WT-P5βR, als auch für die
N205- und Y156-Muteine das bevorzugte Substrat. Die rAtP5βR setzte das Substrat z.B. etwa 15fach besser um als Progesteron. Die Steigerung der Aktivitäten der N205A – und N205M-Muteine
trat nicht nur bei Progesteron, sondern auch bei 2-Cyclohexen-1-on auf. Hierbei wurde aber auch
ein selektiver Effekt auf die Substratspezifität sichtbar. Bei N205A erhöhte sich die Aktivität für
beide
Substrate
etwa
in
der
gleichen
Größenordnung,
während
bei
N205M
die
Aktivitätsverbesserung für Progesteron deutlich größer ausfällt als für 2-Cyclohexen-1-on. Auffällig
war bei allen Mutanten die erhöhte Affinität für beide Substrate. Bei Progesteron sank er von 362
µM (WT) auf 63.3 µM (N205M) bzw. 84.6 µM (N205A). Die Aktivitätsunterschiede zwischen der
rAtP5βR und rDlP5βR für die Reduktion von Progesteron betrug den Faktor 12. Die Werte für die
DlP5βR-Doppelmutante Y156V_N205M wurden ebenfalls unter diesen Bedingungen bestimmt,
obwohl im Screening mit dem Standard-P5βR-Assay keine synergistischen Effekte vermutet
werden konnten.
Auch die Km-Werte der Einfach-Mutanten mit gesteigerter Aktivität wurden bestimmt
(II.2.4.3). Alle lagen etwa im Bereich des WTs: Y156V (21,5 +/- 2,5 µM; n = 2), N205A (18,8 +/5,2; n = 3) und N205M (18,3 +/- 1; n = 2).
Die in silico Betrachtung der DlP5βR-Strukturen (PDB 2v6g, 2v6f) und der modellierten
Enzyme (II.2.5, III.3) zeigte, dass es sich bei den Aminosäuren an Positionen 156 und 205 (bezogen
auf D. lanata) jeweils um Teile der Bindetaschen handelte (Abb. 37).
89
Abb. 37: Die identifizierten „hot spots“ Y156, N205 und S248 für die Aktivitätsmutagenese bilden einen Teil der
Bindetasche der DlP5βR.
Zusammenfassend zeigten die Versuche, dass mit Hilfe des „bioactivity-guided screening“Ansatzes zum rationalen Protein-Design, mutierte Varianten der DlP5βR mit einer deutlich
gesteigerten katalytischen Effizienz hergestellt werden konnten. Für zwei von drei AminosäureSubstitutionen, die als putativ bedeutend für die Aktivität identifiziert werden konnten, gelang der
experimentelle Beweis.
Die Positionen 156 und 205 wurden zur Kontrolle zusätzlich bei der rEcP5βR und der
rErP5βR mutiert, wobei die Aktivität ebenfalls stark gesteigert werden konnte (DC- und GCKontrolle; Daten nicht gezeigt). Eine weitere Charakterisierung dieser Erysimum-P5βR-Muteine
erfolgte nicht.
III.4.2.4 Alternative Strategien zur Verbesserung der katalytischen Aktivität
Alternativ zur beschriebenen Methode (und zu deren Überprüfung) wurde auch die
bestehende, aus in silico-Daten abgeleitete Theorie von Herl et al. (2009) experimentell überprüft.
Die Autoren diskutierten den Leu-182 Rest im rDlP5βR als wesentliche Ursache für die geringere
Aktivität dieses Enzyms, da sich in der entsprechenden Position bei klassischen SDRs ein Gln-Rest
befindet. Dieser Aminosäure-Rest wurde im „bioactivity-guided Screening“ allerdings nicht als
Schlüsselposition identifiziert.
90
Als Template für die Mutagenese diente erneut das von Herl et al. (2006) erstellte
pQE30/P5βR-Konstrukt (Klon Nr. 16). Die Mutagenese erfolgte mit den Primern aus II.1.10 bei 50
°C Annealing-Temperatur. Abbildung 38 zeigt die Kontrolle des Ergebnisses der PCR-Reaktion
mittels Gelelektrophorese.
M
1
Abb. 38: PCR zum Austausch von Leu-182 gegen Gln mit dem pQE30/DlP5βR(WT)-Konstrukt (M = Marker; 1 =
PCR-Reaktion).
Das weitere Vorgehen erfolgte in Analogie zu den bereits beschriebenen MutageneseExperimenten.
Zur Überprüfung der katalytischen Aktivität wurden 0,2 mg des nativ gereinigten rDlP5βR
L182Q-Muteins in einem Standard-P5βR-Assay (II.2.3.6) eingesetzt. Unabhängig von der
verwendeten analytischen Methode zeigte sich eine Aktivität, die mit einer relativen Aktivität von
120 Prozent in etwa der des rekombinanten WT Proteins entsprach. In einem weiteren Experiment
sollte die benachbarte Aminosäure Asp-181 zusätzlich mutiert werden, um eventuelle
Nachbargruppen-Effekte zu klären. Das D181T_L182Q Mutein zeigte jedoch eine leicht verringerte
Aktivität von ca. 80 Prozent. Die beschriebene in silico Hypothese konnte somit experimentell
widerlegt werden.
Neben diesen Versuchen wurden Aminosäure-Reste, die sich aus Unterschieden in den
Sequenzen der D. lanata und A. thaliana P5βR ergaben, mutiert, um die Auswirkungen auf die
Enzymaktivität zu untersuchen. Es wurden Aminosäuren gewählt, die entweder Teil der P5βRMotive oder Teil der putativen Substrat-Bindetasche waren. Die Mutagenese wurde wie oben
dargelegt durchgeführt, die Muteine überexprimiert und jeweils 0,2 mg in einem Standard-P5βRAssay bei 30 °C über 2 h eingesetzt. Die Auswertung erfolgte über GC-MS-Bestimmung der
Peakflächen von Substrat und Produkt (II.2.4.2). Als Referenz dienten parallel durchgeführte
91
Assays mit rDlP5βR WT Protein. Folgende Tabelle gibt einen Überblick über die so bestimmten
relativen Aktivitäten (Tab. 13).
Tab. 13: Relative Aktivitäten der weiteren Muteine und Lage der substituierten Reste. Relative, apparente Aktivität und
Tendenz der Aktivitätsveränderung im Vergleich zum rDlP5βR Wildtyp (WT) angegeben mit – (verringert) / 0
(identisch) / + (erhöht); (n =mind. 3).
Mutein
AUC
[Produkt-/Gesamtfläche]
Relative, apparente Aktivität /
Tendenz der Aktivitätsänderung
Lokalisierung des substituierten
Aminosäurerests
DlP5βR WT
0.25 +/- 0.04
100 %
0
-
T65P
0,20 +/- 0.001
80 %
0
Nahe Motiv II
R146T
0,25 +/- 0.02
100 %
0
Motiv IV
M150L
0.31 +/- 0.02
124 %
0
Motiv IV
L182Q
0.30 +/- 0.04
120 %
0
Motiv V
D181T_L182Q
0.20 +/- 0,01
80 %
0
Motiv V
G204N
0.02 +/- 0.01
8%
-
Motiv VI
Y156V
0.69 +/- 0.13
276 %
+
Bindetasche
N205M
1.16 +/- 0.09
464 %
+
Bindetasche
N205A
1.43 +/- 0.17
572 %
+
Bindetasche
S248M
-
0.0 %
-
Nahe Bindetasche
Y302F
0,22 +/- 0,01
88 %
C352G
0.17
67 %
0
Bindetasche
F353M
0.33
131 %
0
Bindetasche
F353P
0.21 +/- 0.01
84 %
0
Bindetasche
N205M_Y156V
1.10 +/- 0.17
440 %
+
Bindetasche
Bei Peripherie
Unabhängig von der Lage des Aminosäure-Restes konnte mit keiner dieser weiteren Mutationen, die nicht mit unserem Screening identifiziert wurde, eine nennenswerte Steigerung der Aktivität beobachtet werden. Die Aktivitäten der R146T, M150l, Y392F, C352G, F353M und F353P
Muteine entsprachen tendenziell der des WTs (67,1 bis 131 Prozent). Obwohl z.B. Phe-353 zur Bindetasche gehört, führt dessen Austausch im Gegensatz zu Asn-205 und Tyr-156 zu keiner großen
Veränderung der Aktivität. Der Austausch des flexiblen Gly-204-Restes hatte eine starke Reduzierung der Enzymaktivität zur Folge.
Mit Hilfe der Klonierung, der funktionellen Expression, einem einfachen Aktivitätsscreening
und dem Vergleich der Proteinsequenzen ist es in dieser Arbeit gelungen, essentielle Positionen für
die enzymatische Aktivität der P5βR zu identifizieren.
92
III.4.3 N-terminale Deletionsmutanten der DlP5βR
Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit klonierten und funktionell exprimierten P5βR-ORFs,
besteht das von Herl et al. (2006) klonierte Konstrukt aus einer 5'- verkürzten cDNA, die in den
pQE30-Vektor ligiert wurde. Das korrespondierende Genprodukt ist somit N-terminal um 13
Aminosäuren verkürzt, verglichen mit dem Genprodukt des full-length ORFs. Andere P5βR, wie die
hoch-aktive rAtP5βR (siehe III.2.3.4), liegen ebenfalls als ungekürzte cDNA im Vektor vor (Herl et
al., 2009), was die Vergleichbarkeit der rekombinanten Proteine möglicherweise einschränkt. Ein
Ziel war es deshalb mit Hilfe von systematischer Deletionsmutagenese zu erkunden, wie sich die Nterminalen Deletionen von Aminosäuren auf die Aktivität der rDlP5βR auswirkt. Hierzu wurde in
Kooperation mit Kristin Rudolph (im Vertiefungsmodul ihrer Masterarbeit) der full-length ORF
kloniert, sowie erste Mutagenese-Experimente durchgeführt.
III.4.3.1 Klonierung der full-length DlP5βR
Um diese Mutagenese-Experimente durchführen zu können, musste zunächst die ungekürzte
cDNA der DlP5βR gewonnen und in einen Expressionsvektor kloniert werden. Aus 200 mg frischen
Blättern von D. lanata wurde die Gesamt-RNA isoliert (II.2.1.2) und mit unspezifischen Primern in
cDNA umgeschrieben. Zur Amplifikation der gewünschten cDNA wurden verschiedene
Kombinationen am Lehrstuhl vorhandener P5βR-Primer in einer Standard-PCR (II.2.1.4) bei einer
Annealing-Temperatur von 50 °C getestet. Nur mit den beiden Primern MbdirGATE/VH1188brev
konnte ein PCR-Produkt mit der erwarteten Größe von ca. 1,2 kb nachwiesen werden (Abb. 39).
Abb. 39: PCR mit frischer cDNA von D. lanata und verschiedenen Primer-Kombinationen ( M = Marker, 1-3 =
untaugliche Primer; 4 = MbdirGATE/VH1188brev) (aus Rudolph, 2011).
Die 1,2 kb-Bande wurde aus dem Gel isoliert und die gereinigte DNA redispergiert(II.2.1.6).
Die Konzentration betrug 24,5 ng/µL bei einem Reinheitsquotienten von 1,75 (II.2.1.15). Die
gereinigte DNA wurde in den pCR(R)2.1-TOPO-Vektor kloniert und in chemisch kompetente
93
E. coli One Shot Top10 Zellen transformiert (II.2.1.10). Eine Unterscheidung von positiven und
negativen Klonen erfolgte mittels Blau-Weiß-Selektion (II.2.1.12). Die DNA wurde isoliert
(II.2.1.14) und sequenziert (II.2.1.16).
Beide bei der PCR eingesetzten Primer wurden in den erhaltenen Sequenzen
wiedergefunden. Die beiden Teilsequenzen wurden von Hand zusammengesetzt und über ClustalW
mit der bereits bekannten DlP5βR-Sequenz verglichen (II.2.5). Dies ergab, dass die komplette P5βR
cDNA-Sequenz erfolgreich in 3'-5'-Orientierung in den pCR(R)2.1-TOPO-Vektor eingebaut worden
war. Die Identität im Alignment betrug 99.0 % (Abb. 40).
TOPO
WT
ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60
ATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGAC 60
************************************************************
TOPO
WT
GCACAGCCNNAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120
GCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAAC 120
******** **************************************************
TOPO
WT
AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180
AGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGC 180
************************************************************
TOPO
WT
GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240
GTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGC 240
************************************************************
TOPO
WT
GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300
GACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCAC 300
************************************************************
TOPO
WT
GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360
GTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGC 360
************************************************************
TOPO
WT
AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420
AAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATC 420
************************************************************
Abb. 40: Ausschnitt aus dem Alignment der in den pCR (R)2.1-TOPO-Vektor klonierten Sequenz(„TOPO“) der putativen
full-length P5βR aus D. lanata („WT“).
III.4.3.2 Subklonierung und funktionelle Expression der kompletten DlP5βR
Für die funktionelle Expression der kompletten rDlP5βR wurde die klonierte cDNA in einen
Expressionsvektor subkloniert. Gewählt wurde der pETite-Vektor mit C-terminalem His-tag (II.1.7),
u.a. da bei der direkten Klonierung keine artifiziellen Aminosäuren am C- oder N-Terminus des
rekombinanten Proteins eingeführt werden. Die Vermehrung der klonierten cDNA erfolgte mit
Primern, die zur Vektorsequenz komplementäre Überhänge von 15-18 Nt besaßen (II.1.10), in einer
94
Standard-PCR (II.2.1.4) bei 58 °C. Die Template-DNA wurde mit DpnI selektiv zerstört (II.2.1.18)
und das PCR-Produkt durch homologe Rekombination in den linearisierten pETite C-His-Vektor
ligiert (nach Anleitung des Herstellers: ExpressoTM T7 Cloning and Expression System, Lucigen,
Version 1.0). Das Konstrukt wurde in chemisch kompetente E. coli HI-Control-Zellen transformiert
(II.2.1.10), positive Kolonien mittels Colony-PCR identifiziert (II.2.1.11), deren Plasmid-DNA reisoliert (II.2.1.14) und zur Sequenzierung (mit T7-Primern) an die GATC Biotech AG geschickt
(II.2.1.16).
In der erhaltenen Sequenz konnten sowohl Vektor-, als auch Insertabschnitte identifiziert
werden. Die Sequenz des eingesetzten Forward-Primers war vollständig erhalten. Ein Alignment
dieser Sequenz gegen die der DlP5βR bestätigte zusätzlich die erfolgreiche Klonierung (Daten nicht
gezeigt).
Der Nachweis der Expression der rDlP5βr mit C-terminalem His-tag (rDlP5βRc), unter den
beschriebenen Standard-Bedingungen bei 4 °C über 96 h (II.2.2.1), erfolgte zunächst mittels SDSPage-Analyse. Nach der His-tag-Reinigung (II.2.2.2) wurden der Protein-Gehalt des Eluats
bestimmt (II.2.3.1) und mit Puffer auf 2,8 µg eingestellt. Parallel hierzu wurde als Kontrolle die von
Herl et al. (2006) klonierte, verkürzte rDlP5βR (=WT; auch rDlP5βRnn-13), mit der alle bisher
beschriebenen Versuche durchgeführt wurden, aufgearbeitet. Beide Proben wurden auf einem 12 %igem SDS-PAGE-Gel analysiert (II.2.3.4). Die Detektion erfolgte mittels Coomassie-Färbung
(II.2.3.5). Das gewünschte Produkt konnte auf einer Höhe von etwa 43 kDa nachgewiesen werden
(Abb. 41).
Abb. 41: SDS-Page der rDlP5βRnn-13 (1) und der rDlP5βRc (2) (M1 = Marker; aus Rudolph, 2011).
95
Der Nachweis der enzymatischen Aktivität des rekombinanten Proteins erfolgte, nach
Umpuffern in den P5βR-Assaypuffer (II.2.3.2), über den Standard-P5βR-Assay (II.2.3.6). Die
Auswertung des Assays erfolgte mittels Dünnschicht-Chromatographie (II.2.4.1; Abb. 42).
Abb. 42: DC-Analyse des Standard-P5βR-Assays der nativ gereinigten P5βR aus D. lanata mit C-terminalem His-tag
(rDlP5βRc) (1 = Referenzen; 2 = Aktiver Assay; aus Rudolph, 2011).
Analog der verkürzten rDlP5βRnn-13 konnte die stereo-selektive Umsetzung von
Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion eindeutig nachgewiesen werden. Die Enzym-Assays wurden
zusätzlich über GC-MS ausgewertet (II.2.4.2). Hierbei wurde die Umsetzung des kompletten
Enzyms (rDlP5βRc) mit der der verkürzten Variante (rDlP5βRnn-13) direkt verglichen. Abbildung
43 ist zu entnehmen, dass die verkürzte rDlP5βRnn-13 unter den Bedingungen des Standard-P5βRAssays etwa doppelte Aktivität zeigte.
Abb. 43: GC Analyse der rDlP5βRc (A) und der rDlP5βRnn-13 (B) mit Progesteron als Substrat (roter Pfeil, Rt =
10.69) und 5β-Pregnan-3,20-dion als Produkt (blauer Stern; Rt = 9.97) nach Rudolph, 2011.
96
In Tab. 14 sind die ermittelten, relativen Aktivitäten dargestellt.
Tab. 14: Relative Aktivitäten der rDlP5βRnn-13 und der rDlP5βRc (MW +/- STABW; n = 7-9).
Protein
AUC
Relative, apparente Aktivität
[Produkt-/Gesamtfläche]
[%]
rDlP5βRnn-13
0,16 +/- 0,02
228,6
rDlP5βRc
0,07 +/- 0,02
100,0
III.4.3.3 Einkürzungs-Mutagenese
Mit dem Phusion Site-directed Mutagenesis Kit und 5'-phosphorylierten Primern (II.1.8,
II.1.10) wurden im Anschluss erste Deletionsmutanten der rDlP5βRc hergestellt. Vom 5'-Ende
ausgehend sollte die klonierte cDNA in jeweils 90 Nukleotide eingekürzt werden. Dies entspricht
einer N-terminalen Kürzung des Proteins um jeweils 10 Aminosäuren. Hierzu wurden Primer so
abgeleitet, dass einer in antisense-Orientierung an den pETite-Vektor bindet und genau bis zum
Startcodon der DlP5βR cDNA heranreicht, während der andere erst 90 Nukleotide downstream des
Startcodons binden sollte, wodurch bei der PCR die gewünschte Lücke an Nukleotiden entstehen
sollte (KR_Mut30_Rev; KR_30_For; II.1.10; Abb. 44).
Abb. 44: Schematisches Vorgehen bei der Erzeugung der Deletionsmutanten der rDlP5βRc mit 5'-phosphorylierten
Primern im pETite C-His/DlP5βR-Vektorkonstrukt (nach Rudolph, 2011).
Als Template der PCR diente das pETite C-His/DlP5βR-Vektorkonstrukt, das in einer
Standard-PCR (II.2.1.4) mit den phosphorylierten Primern (KR_Mut30_Rev/KR_Mut30_For) bei
einer Annealing-Temperatur von 50 °C durchgeführt wurde. Die Ergebnisse der PCRs wurden mit
Agarose-Gelelektrophorese ausgewertet (II.2.1.5; Abb. 45).
97
Abb. 45: Agarose-Gel der PCR zur Deletion von cDNA-Abschnitten am 5'-Ende des klonierten DlP5βR-ORFs (M =
Marker, 1 = KR_Mut30_Rev/KR_Mut30_ForMut).
Es konnte mit der Primer-Kombination ein PCR-Produkt der erwarteten Größe von etwa 3,4
kb (Vektor + DlP5βR-Insert) nachgewiesen werden. Das PCR-Template wurde mit DpnI verdaut
(II.2.1.18) und in chemisch kompetente E. coli HI-Control BL21(DE3) Expressionszellen
transformiert (II.2.1.10). Bei der Sequenzierung der Plasmid-DNA dieser E. coli-Zellen, konnten
die Teile der pETite-Vektorsequenz und der Sequenzabschnitt des jeweiligen Forward-Primers der
Mutagenese-PCR wiedergefunden werden (Abb. 46).
5'-AACAGCTAGAAATAATTTTGTTTAACTATAAGAAGGAGATATACATATGATAGTTGGGGTAACCG
GAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAGGT
ATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTG
CGA...-3'
Abb. 46: Nucleotid-Teilsequenz der DlP5βRcn-30 im pETite(R)C-His-Vektor (grau: Vektorsequenz; gelb: Startcodon;
blau: Sequenz des KR_Mut10_For-Primers).
Über Nukleotid-Alignments mit ClustalW, wurde die erfolgreiche Deletion des gewünschten
cDNA-Bereichs verifiziert. Diese Alignments finden sich bei Rudolph (2011): Die Analyse der
Sequenz zeigte einen Abschnitt der Vektorsequenz, in-frame gefolgt vom genutzen Forward-Primer
der Mutagenese-PCR und dem Rest des DlP5βR-Gens. Ein Vorteil des (vom Autor gewählten)
Vektors war, dass keine artifiziellen Aminosäuren während der Klonierung zwischen dem klonierten
cDNA-Abschnitt und dem His-tag eingeführt worden sind.
Die nachfolgende Erstellung von weiteren Deletionsmutanten, Versuche zu deren
Expression, der Nachweis der katalytischen Aktivität, die exakte biochemische Charakterisierung,
98
sowie die Bestimmung der (Co-)Substratspezifität und der Proteinfaltung mit CD-Messungen
erfolgte durch Frau Rudolph im Rahmen ihrer Masterarbeit (Rudolph et al., Manuskript in
Vorbereitung).
III.4.4 Mutagenese zur Änderung der Cosubstrat-Spezifität
Über die heterologe Expression rekombinanter Enzyme der Herzglykosid-Biosynthese
lassen sich (putative) Reaktionen der Biosynthese gut isoliert untersuchen. Daneben ergibt sich,
speziell durch die Verfügbarkeit der rekombinanten 3β-HSD und der P5βR aus verschiedenen Taxa,
die Option, mehrere rekombinante Enzyme der Biosynthese zu kombinieren, um nicht nur
Einzelschritte, sondern ganze Biosynthese-Sequenzen in vitro zu analysieren. Da die rekombinanten
3β-HSDs alle strikte NAD(H)-Spezifität aufweisen, sollte für diese Kombinationsversuche durch
SDM eine NADH-abhängige P5βR erzeugt werden.
III.4.4.1 In silico Analyse NADPH und NADH-spezifischer SDRs
Da sich die Cosubstrate NADPH und NADH einzig durch die negativ geladene
Phosphatgruppe am Ribose-Teil des Moleküls unterscheiden (Abb. 47, Abb. 68), wurde geprüft,
welche (basischen) Aminosäuren der DlP5βR (PDB 2v6g) mit dieser wechselwirken. Hierbei
fanden sich nur die beiden positiv geladenen Arginine Arg-63 und Arg-64. Diese befinden sich in
der Kristallstruktur in einem Abstand von 4,4 bzw. 5,0 Å zur Phosphatgruppe des Cosubstrats. Um
eine NADH-Spezifität zu erhalten, mussten an Stelle der basischen saure Aminosäure-Reste in der
Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR platziert werden. Um eine adäquate Position hierfür zu finden,
wurde die Phosphatgruppe in silico aus der Kristallstruktur 2v6g entfernt und gegen eine
Hydroxylgruppe ausgetauscht. In einer in silico-Mutagenese wurden alle Reste, die sich im Abstand
von 5 Å um diese befanden, gegen Asparaginsäure und Glutaminsäure ersetzt. Nur für
Asparaginsäure wurden Rotamere gefunden, die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden
Hydroxylgruppen der Ribose und der Carboxylgruppe der Seitenkette erlaubten. Dies erschien
möglich von den Positionen T35, A62, R63 und R64. Beispielsweise fanden sich im Falle der
DlP5βR T35D-Mutante für den eingeführten Asparaginsäure-Rest mögliche Rotamere, mit einem
Abstand der beiden Sauerstoffe der Carboxyl-Gruppe zu den Hydroxylgruppen der Ribose von 1,78
bzw. 2,58 Å (Abb. 47).
99
Abb. 47: A Durch in silico Mutagenese identifizierte Positionen zur Platzierung eines sauren Asp-Restes, der H-Brücken zur Ribose
ausbilden könnte, innerhalb der Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR B Darstellung der Lage des eingeführten Asp-Restes und
Messung der Abstände am Beispiel des DlP5βR T35D (in silico) Muteins.
Parallel wurden mit Hilfe der „Superposition“-Funktion der Wincoot Software (II.2.5) in
silico die Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR jeweils mit der von verschiedenen NADHabhängigen SDR-Enzymen überlagert (PDB: 2ztl, 3d3w, 3grk, 2zea, 2gng, 2gn5, 1x1t, 1xhl, 1mg5,
1I24), um die Konformation der Kohlenstoffketten und Aminosäure-Reste an den vier
identifizierten Positionen zu vergleichen. Tab. 19 zeigt die Ergebnisse dieser Überlagerung für
einige Enzyme, bei denen die Übereinstimmung der Kohlenstoffkette akzeptabel erschien.
Tab. 19: Vergleich der identifizierten Positionen zur Platzierung eines sauren Restes aus der Überlagerung der
Cosubstrat-Bindetasche NADH-spezifischer SDR-Enzyme mit der DlP5βR (2v2g).
Enzym (PDB)
35
62
63
64
2v2g (= Referenz
T
A
R
R
1zem
G
D
M
N
1iy8
G
D
V
S
2hsd
A
D
N
L
1qrr
-
D
N
-
Die Xylitoldehydrogenase 1zem besaß die größte Übereinstimmung in der Konformation
der Kohlenstoffkette mit der DlP5βR. Für alle NADH-spezifischen Enzyme fand sich an der
Position des Alanin-62 der DlP5βR ein saurer Aspartat-Rest. Dies deckte sich mit den Ergebnissen
der in silico-Mutagenese, bei der ebenfalls diese Position für die SDM-Experimente identifiziert
wurde.
100
III.4.4.2 Mutagenese-Experimente
Die Mutagenese erfolgte analog zu III.2. Als Template für die PCR diente ebenfalls das
pQ30/DlP5βR-Konstrukt von Herl et al. (2006). In der Mutagenese-PCR (II.1.10) wurden
verschiedene
Primer-Kombinationen
genutzt
für
die
unterschiedlichen
Einzel-
und
Mehrfachmutanten. Nach DpnI-Verdau der Template-DNA (II.2.1.18) und Transformation der
putativ mutierten Plasmide (II.2.1.10) wurde der Erfolg der Mutagenese mittels DNASequenzierung bestätigt (II.2.1.16). Neben der abgeleiteten Mutante, bei der A62 ausgetauscht
werden sollte, sollten auch die anderen möglichen Platzierungen für Asp getestet werden.
Auf diese Weise konnten zunächst die DlP5βR-Muteine T35D, A62D, R63D, R64D,
R63D_R64D hergestellt werden, deren Expression jeweils unter den Bedingungen des WTs erfolgte
(II.2.2.1). Es wurden P5βR-Standardassays mit 0,2 mg Protein bei 30 °C über 2 h durchgeführt
(II.2.3.6), wobei jeweils beide Cosubstrate getestet wurden (6,4 mM Endkonzentration). Die
Auswertung erfolgte mittels DC und GC-MS. Die Daten sind in Tab. 20 zusammengefasst:
Tab. 20: Screening der ersten Mutanten-Reihe auf P5βR-Aktivität mit NADH. (- = nicht nachweisbar; -/+ = geringe
Aktivität; + = aktiv; n. b. = nicht bestimmt).
Protein/Mutein
Aktivität mit NADPH
Aktivität mit NADH
DlP5βR WT
+
-
DlP5βR T35D
n.b.
-
DlP5βR A62D
-
-
DlP5βR R63D
-
-
DlP5βR R64D
+
-/+
Die Veränderungen der Cosubstrat-Bindetaschen führte in den meisten Fällen zu einem
kompletten Verlust der Aktivität mit NADPH, wobei auch mit NADH keine Umsetzung detektiert
werden konnte. Die Ausnahme stellte das Mutein R64D dar. Dessen Aktivität mit NADPH
entsprach etwa der des WTs und auch mit NADH konnte sowohl mit DC, als auch mit GC eine
Umsetzung von Progesteron beobachtet werden.
Jedoch wurde trotz dieser nachweisbaren Umsetzung die A62D Mutante für weitergehende
Mutagenese-Experimente ausgewählt, da die Position des Asparaginsäure-Restes auf Grund der
„Überlagerungsexperimente“ (III.4.4.1) ideal erschien. Eine weitergehende in silico Analyse (Abb.
48) zeigte als mögliche Erklärung für die Inaktivität dieses Muteins eine ionische Wechselwirkung
zwischen diesem eingeführten, negativ geladenen Rest und den positiven Resten Arg-64 oder Arg-
101
63 auf (Abb. 48; B). Aus diesem Grund sollten diese ebenfalls mutiert werden sollten. Als Basis
diente die bereits erwähnte, NADH-abhängige Xylitol-Dehydrogenase (PDB: 1zem), die eine
ähnliche Konformation der Kohlenstoffkette aufweisen konnte. In der Kristallstruktur fand sich an
der Stelle des Arginins, das benachbart zum Purin-Ringsystem des Cosubstrats liegt, ein MethioninRest (Arg-63 bzw. Met-39). Anstelle des zweiten Arginins wurde ein Asparagin identifiziert (Arg-64
bzw. Asn-40; Abb. 52, C). Aus diesem Grund wurden weitere Mutagenese-Experimente
durchgeführt. Es konnten die DlP5βR A62D_R63D, A62D_R63M_R64N- (Abb. 48, D), sowie die
T35G_A62D_R63M_R64N-Muteine erfolgreich in E. coli überexprimiert (II.2.2.1) und über Histag-Affinitätschromatographie nativ gereinigt werden (II.2.2.2).
Abb. 48: A DlP5βR A62D-Mutein (in silico-Mutagenese; experimentell inaktiv); B Mögliche Wechselwirkung
zwischen D62 und R64; C Analoge Aminosäure-Reste in der Kristallstruktur der NADH-abhängigen XylitolDehydrogenase 1zem; D Re-designte DlP5βR (A62D_R63M_R64N).
Mit jeder dieser Mehrfachmutanten wurden erneut Standard-P5βR-Assays (II.2.3.6) bei 30
°C mit 0,2 mg Mutein und beiden Cosubstraten durchgeführt. Wie bereits A62D zeigte auch das
DlP5βR
T35G_A62D_R63M_R64N-Mutein
keine
Progesteron-5β-Reduktase-Aktivität
mit
NADPH. Die 3-fach Mutante A62D_R63M_R64N hingegen zeigte eine geringe Umsetzung von
Progesteron (Abb. 49):
102
Abb. 49: GC-Analyse des Standard-P5βR-Assays des DlP5βR A62D_R63M_R64N-Muteins (1 = Progesteron; 2 = 5βPregnan-3,20-dion).
Diese Ergebnisse ließen den Schluss zu, dass wirklich die beiden Arginine (Arg-63 und Arg64) für die Bindung und Umsetzung von NADH störend wirkten. Statt willkürlich und
unvorhersehbar andere Kombinationen von Aminosäuren für deren Substitutionen zu wählen (s.
Tab. 19), um die Aktivität des Muteins zu erhöhen, wurden die Ergebnisse aus III.4.2 zu Rate
gezogen und der Rest Asn-205, der als essentiell für die katalytische Effizienz definiert wurde (s.
III.4.2), gegen Methionin ersetzt (Substitution in Richtung der AtP5βR).
Mit 0,2 mg des gereinigten Muteins (DlP5βR A62D_R63M_R64N_N205M) wurden
Standard-P5βR-Assays bei 30 °C durchgeführt und die Umsetzung mittels DC und GC-MS
ausgewertet (Abb. 50).
103
Abb. 50: A Auswertung des Standard-P5βR-Assays mit 0,2 mg des DlP5βR A62D_R63M_R64N_N205M-Muteins mit
0,5 mM Progesteron durch Dünnschichtchromatographie (Ref: Progesteron, Rf = 0.5, 1; 5β-Pregnan-3,20-dion,
Rf = 0.6, 2). B Auswertung des Assays mittels GC-MS.
Die Ergebnisse zeigten eine deutliche Steigerung der katalytischen Umsetzung des Muteins
durch die zusätzliche Substitution von Asn-205. Die Aktivität mit NADH entsprach in etwa der des
WTs mit NADPH (134 +/- 20 %; n = 3). Der Km-Wert des Muteins für NADH wurde
photometrisch mit 0,2 mg Protein und einem Überschuss an CH von 2,0 mM ermittelt (II.2.4.3). Er
lag bei 45,2 +/- 28,9 µM (n = 4), der des WTs mit NADPH bei 40,6 +/- 12,9 µM (s. Tab. 5). Diese
NADH-spezifische, funktionelle „Designer-P5βR“, konnte somit für weitere Versuche genutzt
werden.
III.4.4.3 Versuche zur in-vitro-Biosynthese
Ziel der Mutagenese der Cosubstrat-Bindung war, neben dem prinzipiellen Nachweis der
Machbarkeit, insbesondere eine NADH-spezifische rekombinate P5βR zu erhalten, um sie in vitro
mit den anderen verfügbaren, NADH-spezifischen Enzymen der Cardenolid-Biosynthese
kombinierbar zu machen. Hierzu wurden mit der mutierten rDlP5βR verschiedene Vorversuche
unternommen. Um einen geeigneten Puffer zu finden, wurden P5βR-Enzymassays mit 0,2 mg
Protein in P5βR-, und 3β-HSD-Puffer durchgeführt, um die Aktivitäten zu vergleichen. Die
Auswertung erfolgte mittels GC-MS. Es konnte im direkten Vergleich kein qualitativer Unterschied
104
bei der Reduktion von Progesteron detektiert werden. Die 3β-HSD war in den beiden Puffern
ebenfalls etwa gleich aktiv (Daten nicht gezeigt).
Des Weiteren wurde, da die Standard-3β-HSD-Assays nach Herl et al. (2007) bei 50 °C
durchgeführt werden, überprüft, ob unter diesen Bedingungen noch eine katalytische Aktivität der
P5βR zu erwarten ist. Standard-P5βR-Assays mit 0,2 mg Protein, die bei 50 °C inkubiert worden
waren, wurden mit GC-MS und DC ausgewertet, wobei jedoch keine Umsetzung von Progesteron
mehr nachweisbar war. Gleiches galt für Assays bei 45 °C. Die folgende Abbildung (Abb. 51) zeigt
einen Vergleich der Umsetzung des P5βR-Muteins bei 35 °C und 45 °C mit 6,4 mM und einer
reduzierten Menge von 1 mM NADH.
Abb. 51: DC von P5βR-Cosubstrat-Mutein-Assays mit 6,4 und 1,0 mM NADH bei 35 °C und 45 °C (Ref=Progesteron).
105
Die Ergebnisse legten nahe, dass die NADH-Menge nur einen geringen, die Temperatur aber
einen sehr entscheidenden Einfluss auf die Reaktion hatte. Aus diesem Grund wurde das
Temperatur-Optimum des Cosubstrat-Muteins mittels Standard-P5βR-Assays (II.2.3.6) und GCMS-Analytik (II.2.4.2) bestimmt (Abb. 52).
Abb. 52: Temperatur-Optimum der rDlP5βR A62D_R63M_R64M_N205M bestimmt über Standard-P5βR-Assay mit
Progesteron als Substrat, analysiert mittels GC-MS (Rel. Umsetzung nach II.2.4.2).
Das Temperatur-Optimum des Muteins lag deutlich niedriger als beim WT-Enzym, bei etwa
30-35 °C. Dies erklärte, dass bei 45 °C keine Umsetzung mehr erkennbar war.
Daraufhin wurden Standard-P5βR-Assays über 2h bei 30 °C mit 0,2 mg Cosubstrat-Mutein
und 0,2 mg 3β-HSD aus D. lanata durchgeführt. Als Substrat dienten sowohl Progesteron, als auch
Pregnenolon. Die Auswertung erfolgte mittels DC (Abb. 53):
Abb. 53: Ausschnitt einer Dünnschicht-Chromatographie zur Auswertung eines Enzym-Assays mit Cosubstrat-Mutein
und D. lanata 3β-HSD. Progesteron wurde stereoselektiv zu 5β-Pregnan-3,20-dion (P1) und 5β-Pregnan-3α-ol,20-on
umgesetzt. (Referenzen: Isoprogesteron, 1; Progesteron, 2; Pregnenolon, 3; 5β-Pregnan-3,20-dion, 4; 5β-Pregnan-3βol,20-on).
106
Diese Versuche belegten, dass es prinzipiell möglich ist, die Enzyme in vitro hintereinander
zu schalten. Progesteron wurde in zwei Stufen erwartungsgemäß über 5β-Pregnan-3,20-dion (P1)
stereoselektiv zu 5β-Pregnan-3α-ol-20-on (P2) umgesetzt. 5β-Pregnan-3β-ol-20-on war nicht
nachweisbar. Eine Umsetzung ausgehend von Pregnenolon konnte - auch bei KSI-Zugabe - nicht
analytisch eindeutig gezeigt werden. Die Versuche mit der NADH-spezifischen „Designer“-P5βR
werden - aufbauend auf den vorliegenden Ergebnissen - von Herr Daniel Geiger im Rahmen seiner
Masterarbeit fortgesetzt.
107
IV DISKUSSION
IV.1 Klonierung, Sequenz-Analyse, Expression und Verbreitung der P5βR
IV.1.1 Klonierung von orthologen P5βR
Trotz mehrerer Dekaden der Forschungen ist der exakte Ablauf der Cardenolid-Biosynthese
bis dato noch nicht exakt aufgeklärt (Kreis und Müller-Uri, 2009; Clemente et al., 2011). Während
seit Längerem klassische Versuche, wie die Fütterung mit markierten Vorstufen (s. Schütte, 1987;
Kreis et al., 1998) und die Reinigung von Biosynthese-Enzymen aus Proteinextrakten (z.B. Gärtner
et al., 1990), durchgeführt werden, sind molekularbiologische Experimente zur ihrer Erforschung
erst seit relativ kurzer Zeit beschrieben worden (z.B. Sales et al., 2003; Roca-Pérez et al., 2004;
Herl et al., 2006; Gavidia et al. 2007; Herl et al., 2009; Ernst et al., 2010; Pérez-Bermúdez et al.
2010; Munkert et al., 2011). Unter ihnen gab es bisher keine Veröffentlichung, die sich intensiv mit
der gerichteten oder ungerichteten Mutagenese von verfügbaren, rekombinanten BiosyntheseEnzymen beschäftigt. Einzig Thorn et al. (2009) berichteten beiläufig über den Austausch eines
zentralen Tyrosin-Restes (Y179F bzw. Y179A), was zum kompletten Verlust der Enzymaktivität
führte. Im Rahmen dieser Arbeit stand deshalb die systematische Mutagenese der DlP5βR im
Mittelpunkt. Um diese Versuche sinnvoll und zielgerichtet betreiben zu können, sollten zunächst
weitere orthologe P5βR zur funktionellen Expression kloniert werden.
Ausgehend von der Nukleotid- und Aminosäurensequenz der D. lanata P5βR (Herl et al.,
2006) wurden die öffentlich zugänglichen Gen- und Proteindatenbanken mittels BlastN- und
BlastP-Algorithmus durchsucht, was eine große Anzahl von homologen Genen aus Bakterien und
verschiedenen pflanzlichen Taxa als Ergebnis lieferte (Gavidia et al, 2007, eigene Suche) - darunter
die zwei ebenfalls funktionell exprimierten, orthologen (Enon-)Reduktasen aus N. tabacum
(Matsushima et al., 2008) und A. thaliana (Herl et al., 2009). Mit Hilfe dieser Sequenzen wurden
Primer zur Klonierung von orthologen P5βR aus unterschiedlichen pflanzlichen cDNAs abgeleitet.
Mit den N. tabacum-Primern konnten erfolgreich PCR-Produkte aus den cDNAs aller getesten
Solanaceen amplifiziert werden (A. belladonna, N. tabacum, S. lycopersicon, S. tuberosum). Die A.
thaliana-Primer funktionierten bei einer Reihe von Brassicaceen (A. rusticana, E. crepidifolium, E.
rhaeticum, L. annua) und die D. lanata-Primer bei verschiedenen Vertretern der Gentianales (M.
piperita, P. major, A. curassavica, N. oleander, u.a.). Bei L. annua und W. somnifera konnte die
Existenz eines P5βR-Gens nur auf genomischer Ebene nachgewiesen werden. In allen anderen
Fällen wurde jeweils das mRNA-Transkript (in Form einer cDNA) kloniert. Über Alignments
konnte in den genomischen Sequenzen jeweils ein Intron identifiziert werden. Es handelt sich
jeweils um ein typisches GU-AG-Intron (Brown, 2007), wie es auch für die D. lanata P5βR
108
beschrieben wurde (Herl et al., 2006). Die Lage des Introns in allen bekannten Genen ist stark
konserviert, allerdings unterschiedet sich dessen Länge und Sequenz in den verschiedenen Arten
teils erheblich. Tarrìo et al. (2011) geben für alle pflanzlichen VEP1-Orthologe ein Intron, für alle
pilzlichen VEP1-Orthologe 1-4 Introns an, wobei die Position im Gen jeweils charakteristisch ist.
Sie nehmen dies als Hinweis darauf, dass die Gene nicht aus einem gemeinsamen eukaryontischen
Ur-Gen entstanden sind (s. IV.1.3). Fundierte Aussagen zur Nutzung der Intronsequenzen, z.B. für
taxonomische Analysen, lassen sich jedoch auf Grund der geringen Mengen an klonierten gDNAs
für P5βR kaum treffen.
Bei allen anderen, in dieser Arbeit klonierten (putativen) P5βR handelt es sich um Gene, die
von den Pflanzen aktiv transkribiert werden, da sie - wie die P5βR aus D. lanata, I./D. canariensis
und A. thaliana (Herl et al., 2006; Herl et al., 2006b; Herl et al., 2009) - jeweils aus der cDNA
junger Blätter kloniert werden konnten. Ernst et al. (2010) berichteten, dass auch von Cardenolidfreien D. lanata-Zellkulturen das P5βR-Gen exprimiert wird, allerdings weniger stark als in den
Blättern. Dies deckt sich mit den Ergebnissen dieser Arbeit, da bei den Klonierungsexperimenten
ebenfalls keine Korrelation zwischen der Akkumulation von Herzglykosiden und der Expression
des P5βR-Gens beobachtet werden konnte (vergleiche hierzu IV.1.3). Um Daten für die Planung der
Mutagenese-Versuche, die sich mit der Erhöhung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR
befassten, zu erhalten, wurden die cDNAs direkt in den pQE30-UA Expressions-Vektor kloniert
(z.B. die cDNA der MpP5βR) bzw. anschließend an die TOPO-Klonierung aus dem
Klonierungsvektor in diesen subkloniert (z.B. die cDNA der AbP5βR). Die erfolgreiche Klonierung
der P5βR aus E. crepidifolium und E. rhaeticum soll besonders betont werden, da die Gattung
Erysimum Cardenolide bildet (z.B. Rodman et al., 1982; Hugentobler und Renwick, 1995) und
gleichzeitig nahe verwandt ist mit dem pflanzlichen Modellorganismus der Molekularbiologie A.
thaliana
(Brown,
2007).
Es
besteht
deshalb
die
Hoffnung,
dass
die
etablierten
molekularbiologischen Methoden (z.B. Transformation der Pflanzen) von A. thaliana auf
Erysimum-Arten übertragen werden können (Munkert et al., 2012).
IV.1.2 Analyse der Proteinsequenzen und Strukturen
Um ein besseres Verständnis der Funktion der P5βR zu erhalten, wurde versucht, deren
räumliche Struktur über kristallographische Experimente aufzudecken. Egerer-Sieber et al. (2006)
veröffentlichten die erfolgreiche Kristallisation der rDlP5βR (genauer der DlP5βRnn-13). Bei der
ersten Analyse der Daten ergaben sich bereits Hinweise auf eine Rossmann-Faltung (Branden und
Tooze, 1998) innerhalb des Proteins. Die endgültige Aufklärung der Kristallstruktur, u.a. im binären
Komplex mit NADP(H), erfolgte durch Thorn et al. (2008). Bisher gelang es noch nicht einen
109
ternären Komplex mit Substrat und Cosubstrat zu kristallisieren (Yves Muller, mündliche
Mitteilung). Die Autoren konnten aus den Ergebnissen die DlP5βR - wie bereits von Gavidia et al.
(2007) auf Grund der Aminosäure-Sequenz vermutet – den kurzkettigen Dehydrogenase/Reduktase
(SDR)-Enzymen zuordnen, wobei ihre räumliche Faltung der eines „extended“ SDR-Proteins
entsprach (Kallberg et al., 2002). Die medizinisch wichtige, tierische Progesteron 5β-Reduktase
gehört im Gegensatz dazu in die Familie der Aldo-Keto-Reduktasen (AKRs), die eine andere
räumliche Struktur besitzen (Di Costanzo et al., 2009). Die Enzyme sind demzufolge einander nicht
homolog (Gavidia et al., 2007). Andere SDR-Enzyme aus dem Bereich des Sekundärstoffwechsels
findet man beispielsweise bei der Biosynthese der Lignane oder der Tropanalkaloide (Brock et al.,
2008).
In der Sequenz und der Struktur der rDlP5βR konnten drei SDR-Protein-Motive (Abb. 58/
bzw. Abb. 3, Motiv I-III), die für die Cosubstrat-Bindung innerhalb der Rossmann-Faltung
essentiell sind, identifiziert werden (Persson et al., 2003). Erstaunlicherweise stellte sich der Aufbau
des aktiven Zentrums deutlich anders dar als erwartet: Keine der für andere SDR-Enzyme
typischen, katalytischen Reste (i.d.R. katalytische Triade aus Tyrosin, Lysin und Serin bzw.
katalytische Tetrade aus Asparagin, Tyrosin, Lysin und Serin; Filling et al., 2002) war strukturell
konserviert. Es gibt zwar sowohl einen Tyrosin-, als auch einen Lysin-Rest, diese zeigten aber von
bisher unbekannten Positionen ins aktive Zentrum und wurden zu Bestandteilen von neuen, P5βRspezifischen Sequenz-Motiven erklärt (Abb. 58/ bzw. Abb. 3, Motiv IV-VI; Thorn et al., 2008). Die
DlP5βR wurde deshalb einer bisher nicht beschriebenen Klasse von SDR-Enzym zugeordnet. Die
Motive I-VI wurden auch in der funktionell exprimierten Progesteron 5β-Reduktase aus A. thaliana
beschrieben (AtStR; Herl et al., 2009).
Vergleicht man die Aminosäure-Sequenzen aller neu klonierten P5βR dieser Arbeit, konnten
in keiner größere Deletionen bzw. Insertionen mehrerer Aminosäuren gefunden werden. Sie
beschränken sich - falls vorhanden - auf einzelne Aminosäuren (Insertionen: z.B. GfP5βR-Tyr-19,
EcP5βR-Ile-195; Deletionen: z.B. Stelle 159 bei AtP5βR/EcP5βR). Jedes der beschriebenen
Sequenz-Motive ist in allen P5βR vorhanden und praktisch immer an derselben Position innerhalb
der Gesamtsequenz zu finden (Abb. 54). Für die Motive II (GxxRR), V (NFYYxxED) und VI
(WSVHRP) treten in keiner Sequenz Abweichungen in den vorgegebenen Aminosäure-Abfolgen
auf. In Motiv I (GxTGIxG) ist bei der EcP5βR das Threonin gegen Alanin ersetzt. Allerdings wird
dieses Motiv in anderen Veröffentlichungen vereinfacht mit GxxGxxG angegeben (Gavidia et al.,
2007, Kallberg et al., 2002), weshalb dieser Austausch nicht kritisch erschien. Die Aktivität dieses
rekombinanten Proteins konnte gezeigt werden. Bei Motiv IV (TGxKHYxGP) war ebenfalls in
einem Fall (AbP5βR) Threonin durch Alanin ersetzt. Der katalytische essentielle Lysin-Rest (K147;
110
Thorn et al., 2008) fand sich allerdings an der definierten Position. Obwohl keine Auswirkung auf
die Katalyse zu erwarten ist, lässt sich keine exakte Aussage treffen, da es bisher nicht gelungen ist,
das rekombinante Protein in E. coli zu exprimieren. Starke Unterschiede zeigen sich bei Motiv III
(DxxD), an dessen Stelle in etwa der Hälfte aller Fälle die Abfolge DxxN gefunden werden kann.
Dieses Motiv könnte deshalb richtiger mit DxxD/N angegeben werden. Diese konservative
Substitution hatte allerdings keinen Einfluss auf die Katalyse. Sowohl bei Enzymen mit dem DxxDMotiv, als auch bei Enzymen mit der DxxN-Variante, konnte die Funktionalität in vitro gezeigt
werden (z.B. rPmP5βR und rDlP5βR).
Spezies
Motiv I
GxTGIxG
A. belladonna
A. curassavica
C. olitorius
C. procera
D. canariensis
D. lanata
E. crepidifolium
E. rhaeticum
G. fruticosus
H. carnosa
M. piperita
N. orleander
P. major
GVTGIVG39
GVTGIVG40
32
GVTGIVG40
32
GVTGIVG40
32
GVTGIIG40
32
GVTGIIG40
32
GVAGIVG40
32
GVTGIVG40
33
GVTGIVG41
32
GVTGIVG40
32
GVTGIVG40
32
GVTGIVG40
32
GVTGIVG40
Motiv II
GxxRR
GVARR64
GVARR65
59
GLARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
60
GVARR66
59
GVARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
59
GVARR65
Motiv III
DxxD
DISN84
DIAN85
80
DISD85
80
DIAN85
80
DISD85
80
DISD85
80
DVSN85
80
DVSN85
81
DIAN86
80
DIGN85
80
DVSD85
80
DISD85
80
DISD85
Motiv IV
TGxKHYxGP
AGRKHYLGP152
TGGKHYCGP153
143
TGRKHYLGP153
143
TGGKHYCGP153
143
TGRKHYMGP153
143
TGRKHYMGP153
143
TGTKHYLGP153
143
TGTKHYVGP153
144
TGGKHYCGP154
143
TGGKHYAGP153
143
TGRKHYVGP153
143
TGLKHYLGP153
143
TGRKHYVGP153
Motiv V
NFYYxxED
NFYYILED183
NFYYSLED184
175
NFYYTLED184
175
NFYYTLED184
176
NFYYDLED185
176
NFYYDLED185
175
NFYYTQED184
176
NFYYTQED185
176
NFYYTLED185
175
NFYYTLED184
176
NFYYTLED185
175
NFYYTLED184
176
NFYYTQED185
Motiv VI
WSVHRP
WSVHRP202
WSVHRP203
196
WSVHRP203
196
WSVHRP204
197
WSVHRP204
197
WSVHRP204
197
WSIHRP204
197
WSIHRP204
197
WSVHRP204
196
WSVHRP203
197
WSVHRP204
196
WSVHRP203
197
WSVHRP204
31
58
79
142
174
195
32
59
80
143
175
196
Abb. 54: Alignment der charakteristischen P5βR-Sequenz-Motive einiger klonierter orthologen Enzyme (aus Bauer et
al., 2010).
Motiv II deutet an, dass es sich bei allen Proteinen - wie bei der rDlP5βR (Herl et al., 2006)
und der rAtP5βR (Herl et al., 2009) - um strikt NADPH-abhängige Enzyme handelt (Kallberg und
Persson, 2006). Die strikte NADPH-Spezifität der rekombinanten Proteine konnte in dieser Arbeit
experimentell bestätigt und für die rDlP5βR mittels gerichteter Mutagenese gezielt verändert
werden (vgl. IV.2.4).
Zusätzlich zur Analyse der Motive können die kompletten Proteinsequenzen der
beschriebenen, neuen P5βR genutzt werden, um eine phylogenetische Analyse durchzuführen. Es
wurde bereits anhand der cDNA-Sequenzen von 21 klonierten P5βR-Genen aus verschiedenen
Isoplexis- und Digitalis-Arten gezeigt, dass es möglich war, statt eines klassischen molekularen
Markers - wie z.B. ITS (Bräuchler et al., 2004) - die P5βR-Sequenzen zu nutzen, um die Phylogenie
dieser beiden Gattungen zu untersuchen. Im Zuge der erwähnten Studie wurden weitere molekulare
Belege erbracht, die es nahelegten, die Gattung Isoplexis wieder mit der Gattung Digitalis zu
vereinen (Herl et al., 2007). Nutzt man die beschriebenen P5βR dieser Arbeit und zusätzlich die
Proteine, die bei einer BlastP Homologie-Suche identifiziert werden (Identität min. 50 %; alle
111
P5βR-Motive vorhanden), zur Erzeugung eines Kladogramms, werden zwei getrennte Cluster
erkennbar (Abb. 55).
Abb. 55: Kladogramm der neuen P5βR und Proteinen aus den Datenbanken, die alle P5βR-Motive besitzen (Dreiecke
symbolisieren Spezies aus denen die P5βR kloniert wurde; schwarze Dreiecke stehen für eine funktionelle Expression
der rekombinanten Proteine; Bauer et al., 2010).
Cluster II deckt sich gut mit der postulierten phylogenetischen Verwandtschaft der Arten
(Bauer et al., 2010). Dies zeigt einerseits, dass die P5βR nicht nur innerhalb der Gattung Digitalis
als molekularer Marker herangezogen werden können und spricht andererseits für die Evolution der
pflanzlichen P5βR-Gene aus einem gemeinsamen Vorfahren. Die Ergebnisse geben einen weiteren
Hinweis auf eine ubiquitäre Verbreitung der P5βR im Pflanzenreich. Cluster I ist zu klein, um
phylogenetische Aussagen treffen zu können. Interessanterweise besitzen alle Arten aus Cluster I
ebenfalls Paraloge in Cluster II (Bauer et al., 2010). In dieser Arbeit konnte die Liste der Gattungen
mit P5βR-Genen von ursprünglich 11 auf 21 erweitert werden. Mit Ausnahme der rAbP5βR konnte
für alle rP5βR, die in richtiger Orientierung in einen Expressionsvektor kloniert wurden, der
funktionelle Nachweis der katalytischen Aktivität erbracht werden (vgl. IV.2.1).
Wie dargelegt, konnten die Sequenzen aller funktionell exprimierten P5βR dieser Arbeit
genutzt werden, um Homologie-Modelle mit der DlP5βR als Template (PDB: 2v6g) zu erstellen
(II.3.1). Ein alternatives Template stand nicht zur Verfügung, da es sich wie beschrieben bei den
Enzymen um eine neue Art von SDR-Protein handelte (Thorn et al., 2008). Es wurde auf den
112
SWISS-MODEL-Server zurückgegriffen, da die automatisierten Server zur Erstellung von
Homologie-Modellen bei den CASP-Wettbewerben sehr gute, zuverlässige Ergebnisse erzielten
(Battey et al., 2007). Wegen der hohen Identität von mindestens 68 % der neuen Proteinsequenzen
zur DlP5βR, wurde der automatisierte Modus verwendet, um die Modelle zu erzeugen. Dies ist
sinnvoll bis zu einer Identität von etwa 50 % (Bordoli et al., 2009; Prof. Schwede, persönliche
Rücksprache). Man geht davon aus, dass Proteine ab einer Identität größer 40 % annähernd die
gleiche räumliche Struktur aufweisen (Petsko und Ringe, 2009). Die Qualität der Modelle wurde
mittels QMEAN-Server überprüft und war in allen Fällen sehr gut (Benkert et al., 2009). In
Einzelfällen (bei Deletionen/Insertionen einzelner Aminosäuren in kritischen Bereichen des
Proteins) wurden zusätzlich Modelle über den Alignment-Modus gemacht. Deren Qualität war
entweder etwas schlechter oder identisch (so dass keine Aussage getroffen werden konnte, welches
der Modelle das bessere war). Dies ist nicht problematisch, da im direkten Vergleich in keinem Fall
starke Abweichungen der Koordinaten der Seitenketten bzw. Hauptketten der Modelle auftraten.
IV.1.3 Vorkommen und Vergleich von homologen, funktionellen P5βR in Herzglykosidhaltigen und Herzglykosid-freien Angiospermen
Herl et al. (2009) berichteten erstmalig über das Vorkommen eines Gens im
Modelorganismus A. thaliana (AtStR, VEP1-Gen), das für eine funktionelle P5βR codiert. Dies war
erstaunlich, da keine Akkumulation von Herzglykosiden für die Spezies beschrieben ist. Bereits
vorher wurden Vermutungen angestellt, dass die P5βR im gesamten Pflanzenreich ubiquitär
vorhanden ist (Gavidia et al., 2007; später Perèz-Bermùdez et al. 2010), wobei diese Annahme nur
auf reinen Sequenz-Vergleichen von Enzymen aus den Datenbanken mit größtenteils unbekannter
bzw. nicht nachgewiesener Funktion beruhte. Dies ist kritisch, da eine hohe Identität zweier
Gene/Proteine ein ungenügendes Kriterium zur Vorhersage der katalytischen Funktion sein kann
(Facchini et al., 2004; Facchini et al., 2006). Aus Mutagenese-Experimenten ist beispielsweise
bekannt, dass der Austausch einer einzigen Aminosäure (H117E) ausreichend war, um aus einer 3αHSD (AKR1C9) eine Steroid 5β-Reduktase zu machen (Jez und Penning, 1998). In einem anderen
Beispiel konnte durch die Substitution von zwei Aminosäuren aus einer Esterase eine funktionelle
Hydroxynitril-Lyase gewonnen werden (Padhi et al., 2010). Aus diesem Grund wurden in dieser
Arbeit, bei der Klonierung der P5βR, cDNAs aus dem Transkriptom von Cardenolidakkumulierenden und Cardenolid-freien Spezies gewonnen und auf das Vorhandensein von P5βR
hin untersucht, wobei das Ziel jedoch immer die funktionelle Expression, d.h. der Nachweis der
katalytischen Umsetzung von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion, war.
113
Abb. 56: Isolierte P5βR-Gene mit nachgewiesener Progesteron 5β-Reduktase Aktivität (aus Bauer et al., 2010).
Wie im Falle von A. thaliana, konnte das Vorhandensein von funktionellen P5βR, die lange
als Schlüsselenzyme der Herzglykosid-Biosynthese bezeichnet wurden (z.B. Herl et al., 2007), in
den 5β-Cardenolid-freien Spezies A. curassavica, G. fruticosus, H. carnosa, M. piperita und P.
major demonstriert werden (Bauer et al., 2010). Ein Vergleich der Aktivitäten zeigte, dass die P5βR
der Herzglykosid-bildenden Spezies, wie E. crepidifolium und E. rhaeticum, alle nur sehr geringe
Aktivitäten zeigten, während die P5βR aus M. piperita fast ähnlich effizient war wie die hochaktive rAtP5βR (Herl et al., 2009; Munkert et al., 2011).
Das Vorkommen dieser Enzyme, unabhängig vom Sekundärstoffmuster der Pflanzen,
erscheint paradox. Eine Erklärung wäre, dass es sich bei dem von Gärtner et al. (1990) gereinigten
Enzym um eine unspezifische Reduktase handelt, die nicht in die Cardenolid-Biosynthese involviert
ist und falsch positiv identifiziert wurde. Perez-Bermudez et al. (2010) berichten von der Isolation
einer paralogen P5βR aus D. purpurea (P5βR2), die Stress-induziert ist und deren Expression mit
der Bildung der Cardenolide korreliert. Allerdings wird die Verbreitung dieses Enzyms von den
Autoren nicht genauer dargelegt.
Die momentan plausibelste Erklärung stützt sich auf die Beobachtung, dass es sich bei allen
getesteten P5βR um stark Substrat-promiske Enzyme handelt, die neben verschiedenen, aktivierten
Steroiden auch kleine zyklische und azyklische Substrate (stereoselektiv) umsetzen können
(Matsushima et al., 2008; Burda et al., 2009; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011). Diese
Eigenschaft macht Enzyme, wie die P5βR, zu interessanten Biokatalysatoren für die Anwendungen
bei chemischen Synthesen (Bornscheuer und Kazlauskas, 2004) bzw. in der Industrie. Realisiert
114
werden kann eine solche Promiskuität auf molekularer Ebene wahrscheinlich vor allem durch
flexible, ungefaltete Bereiche im Protein (Chouard, 2011). Bei promisken SDR-Enzymen diskutiert
man eine strukturelle Flexibilität der Substratbindetasche, die von C-terminalen Loops der Proteine
ausgeht (Nobeli et al., 2009). Die modellierten Strukturen der exprimierten P5βR (z.B. von M.
piperita) lassen ebenfalls keine Adaption der Bindetasche für ein spezielles Substrat wie
Progesteron erkennen. Während die konservative Lehrmeinung davon ausgeht, dass bei der
Evolution von neuen „Sekundär-“Stoffwechselwegen i.d.R. für jeden Schritt eine Genverdoppelung
mit anschließender Sub- oder Neofunktionalisierung der beiden paralogen Gene durch natürliche
Mutationen stattfindet (Ober, 2005; Ober, 2010), mehren sich Stimmen, die den promisken
Enzymen eine zentrale Bedeutung für die Evolution von neuen Stoffwechselwegen zusprechen:
Nach der Screening-Hypothese (Firn und Jones, 1991; Firn und Jones, 2009; Firn, 2010) gelingt es
einem Organismus durch das Vorhandensein einer gewissen Anzahl an promisken Enzymen eine
größere chemische Vielfalt an Metaboliten zu synthetisieren. Hierdurch werden die Chancen des
Organismus, einen Naturstoff mit biologischer Aktivität zu synthetisieren - im Vergleich zu
Organismen, die nur spezifische Enzyme besitzen - statistisch stark erhöht (Abb. 57).
Abb. 57: Vergleich der Vielfalt an gebildeten Sekundärstoffen durch 3 Enzyme (roter Rahmen = Substrat-spezifische
Enzyme; grüner Rahmen = promiske Enzyme) (modifiziert nach Firn, 2010).
115
So lässt sich argumentieren, dass in der Evolution sogar eine positive Selektion auf promiske
Enzyme erfolgen kann. Der mögliche Stellenwert von promisken Enzymen bei der Etablierung
neuer Stoffwechselwege wird in ähnlicher Weise u.a. auch von Grotewold (2005) und Pichersky
und Gang (2000) vertreten.
Aufbauend auf diese Hypothese wäre eine Kombination möglich, bei der durch
Genduplizierung ein neues Enzym einem bestehenden Set an promisken Enzymen zugeführt wird,
wodurch ganz neue Produkte entstehen können. Sind diese nützlich, können sie in der Folge durch
Adaption, Mutagenese und Selektion (z.B. auch durch verstärkte Expression wichtiger Enzyme des
„neuen“ Weges) im Stoffwechsel „gefestigt“ werden (Pichersky und Gang, 2000). Für diese
Hypothese spricht, dass Substrat-Promiskuität eine Eigenschaft ist, die für viele rekombinante
Enzyme v.a. des „Sekundär-“, aber auch des „Primär“-stoffwechsels beschrieben wird: Die 12Oxophytodienoat Reduktase 1 und 3 aus L. esulentum reduziert (wie die getesteten rP5βR)
unterschiedlichste α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen und sogar analoge ungesättigte
Nitroverbindungen (Hall et al., 2007). Pflanzliche Prenyltransferasen, wie sie z.B. in der ShikoninBiosynthese vorkommen, besitzen ebenfalls häufig eine breite Substratspezifität für das IsoprenoidSubstrat (Saleh et al., 2009). Viele Enzyme in den Biosynthesen flüchtiger pflanzlicher Naturstoffe
bilden mehr als ein Produkt aus einem Substrat oder setzen verschiedene Substrate um (Übersicht
bei Pichersky et al., 2006). So besitzen Petunien eine Carboxymethyl-Transferase, die in vitro
bevorzugt Salicylsäure methyliert, in vivo jedoch nur Benzoesäure umsetzt, da diese hier das
einzige verfügbare Substrat darstellt (Negre et al., 2003).
Da auch die 3β-HSD weit verbreitet ist und das rekombinante Enzym verschiedene
Substrate umsetzen kann, also promisken Charakter besitzt (Herl et al., 2007; Munkert et al.,
unveröffentlicht), lässt dies die Hypothese zu, dass zu diesen Teilreaktionen der CardenolidBiosynthese prinzipiell verschiedenste Pflanzen in der Lage wären. Da Cardenolide allerdings nur
sporadisch auftreten, müsste für den Phänotyp „Cardenolid-Akkumulation“ ein anderes SchlüsselEnzym z.B. durch erfolgte Genduplizierung hinzukommen. Eine Möglichkeit hierbei wäre z. B.
eine Oxygenase, welche die charakteristische 14-Hydroxyl-Gruppe in β-Konfiguration an den
Steroid-Körper anfügen kann, wobei auch die obligatorische cis-Verknüpfung der Ringe C/D
entsteht (Luckner und Wichtl, 2000). Es wäre aber auch vorstellbar, dass die Expression der P5βRGene in Cardenolid-freien und Cardenolid-akkumulierenden Pflanzen in unterschiedlichen
Geweben erfolgt. Die diskutierte Sonderstellung der P5βR, als Schlüsselenzym der HerzglykosidBiosynthese, kann mit den Ergebnissen dieser Arbeit nicht aufrecht erhalten werden. Hinzu kommt,
dass neben der P5βR auch endogenes Progesteron selbst in Cardenolid-freien Pflanzen
116
nachgewiesen werden konnte, z.B. in Junglans regia (Pauli et al., 2010), Nicotiana tabacum und
Inula helenium (Übersicht bei Janeczko, 2011). Seine physiologische Funktion in planta konnte
allerdings noch nicht aufgeklärt werden.
Falls es sich bei der Reduktion von Progesteron aber nur um eine unspezifische
Nebenreaktion handelt, stellt sich die Frage nach dem „physiologischen Hauptsubstrat“ bzw. der
eigentlichen Aufgabe der P5βR im pflanzlichen Stoffwechsel. Bekannt ist, dass bei A. thaliana die
Unterdrückung der Expression des VEP1-Gens (codiert für die AtP5βR) über Antisense-RNA die
Ausbildung von Gefäßen innerhalb der Blätter stark veränderte (Jun et al., 2002). Sowohl der
Stängel, als auch Wurzeln der transgenen Pflanzen waren weniger stark entwickelt und dünner
(Abb. 58).
Abb. 58: Vergleich von A. thaliana VEP1-Knock-down-Mutanten (A,B: rechts) mit dem WT (A,B: links). A = Ganze
Pflanze; B = Muster der Blattgefäße (aus Jun et al., 2002).
Versucht man über die Struktur des Proteins auf dessen Funktion zu schließen, kommt man
zu folgendem Ergebnis: Die Suche mit dem DALI-Server (Holm und Sander, 1995) gibt als
Strukturen, welche die größte Ähnlichkeit zur DlP5βR besitzen, verschiedene Enzyme aus dem
Zuckerstoffwechsel von E. coli aus: Eine GDP Mannose-4-6-Dehydratase (PDB 1DB3), eine UDPGalactose-4-Epimerase (PDB 1XEL) und eine dTDP-Glucose-4,6-Dehydratase, wobei die
Sequenzidentität jeweils nur 12-19 % beträgt (Thorn et al., 2008; eigene Suche). Diese bakteriellen
Gene scheinen aber einen gemeinsamen Ursprung mit den pflanzlichen P5βR zu haben. Eine
aktuelle Veröffentlichung geht davon aus, dass Pflanzen (und Pilze) das P5βR(VEP1)-Gen durch
einen lateralen Gentransfer von Proteobakterien erworben haben und dass dieses Ereignis in der
Evolution mehrfach stattgefunden hat. Während bei Pilzen die Tendenz sichtbar ist, das
aufgenommene Gen wieder zu verlieren, scheint es bei den Pflanzen eine wichtige Aufgabe
übernommen zu haben, weshalb es erhalten bleibt (Tarrío et al., 2011).
117
Um die weite Verbreitung einer unspezifischen Enon-Reduktase im Pflanzenreich, wie der
P5βR, erklären zu können, wäre es optimal, wenn es gelingen würde, ein physiologisches Substrat
mit α,β-ungesättigter Carbonylgruppe zu identifizieren, welches in einen grundlegenden,
pflanzlichen Stoffwechselvorgang involviert ist. Da einerseits, wie bereits erwähnt, für die P5βR2
aus D. purpurea eine Stress-Induktion nachgewiesen werden konnte (Perez-Bermudez et al., 2010)
und andererseits A. thaliana das P5βR/VEP1-Gen (das in der entsprechenden Veröffentlichung AWI
31 genannt ist) spezifisch nach Verwundung der Pflanze (Yang et al., 1997) exprimiert wird, ergab
sich der Verdacht, dass dieses Substrat im Jasmonat-Stoffwechsel zu finden wäre (Abb. 59). Bei
Methyljasmonat handelt es sich um ein pflanzliches (Stress-)Hormon, das als Antwort des
Organismus auf biotischen und abiotischen Stress durch eine Oxidation von Membranlipiden
gebildet wird (Abb. 59) und in der Folge zahlreiche Entwicklungsvorgänge auslöst (Cheong und
Choi, 2003).
Abb. 59: Haupt-Biosyntheseweg von Methyljasmonat aus Membranlipiden über Jasmonsäure. Das mögliche, α,βungesättigte Substrat der P5βR, OPDA („12-oxo-phytodenoic acid“), wurde rot umrandet.
Die einzige mögliche Struktur aus diesem Stoffwechselzweig, OPDA („12-oxo-phytodenoic
118
acid“), wurde als Substrat der rAtP5βR und der rMpP5βR allerdings nicht akzeptiert (diese Arbeit).
Die Hypothese muss deshalb verworfen werden. Um das physiologische Substrat bzw. die Aufgabe
der P5βR aufzuklären, könnten deshalb (mit Hilfe der neuen Sequenzen aus dieser Arbeit) Versuche
unternommen werden, einen Knock-down der P5βR in weiteren, leicht-transformierbaren Pflanzen
wie N. tabacum oder A. belladonna zu erreichen, um die Phänotypen mit dem der bekannten A.
thaliana Knockdown-Mutante zu vergleichen. Interessant wäre der Knock-down in einer
Cardenolid-akkumulierenden Spezies. Ein funktionelles Transformationssystem ist jedoch bisher
nur für D. minor publiziert (Sales et al., 2003).
IV.2 Mutagenese-Experimente
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der gerichteten Mutagenese
der DlP5βR, deren Eigenschaften gezielt verändert werden sollten. Die DlP5βR wurde als
Ausgangspunkt der Mutagenese gewählt, da von ihr (wie beschrieben) als einzigem Vertreter der
Enzymklasse eine experimentell aufgeklärte Kristallstruktur existiert (Thorn et al., 2008).
IV.2.1 Steigerung der enzymatischen Aktivität der rDlP5βR
Der umfangreichste Teil der Mutagenese-Experimente hatte zum Ziel, den quantitativen
Unterschied der katalytischen Aktivitäten der rP5βR zu erklären, wobei zu Beginn der Arbeit nur
die Aktivitäten der rekombinanten Enzyme aus D. lanata, I. canariensis und die, der etwa 50-fach
aktiveren Variante, aus A. thaliana bekannt waren (Herl et al. 2006; Herl et al., 2006; Herl et al.,
2009). Bei der Planung der Versuche wurde die rationale Mutagenese gewählt, obwohl allgemein
das Mittel der Wahl zur Verbesserung von Enzymeigenschaften die „Gerichtete Evolution“ (DE)
darstellt (Bornscheuer und Pohl, 2001). Dies gilt insbesondere für die Erhöhung der katalytische
Aktivität. So zeigte eine Analyse von durch DE erfolgreich mutierten Proteinen, dass in etwa der
Hälfte der Fälle Aminosäuren verändert wurden, die sich weit entfernt vom aktiven Zentrum
befanden (Morley und Kazlauskas, 2005) und i.d.R. zumindest nicht das primäre Ziel einer
rationalen Selektion gewesen wären.
IV.2.1.1 Ableitung von Mutagenese-Positionen durch „bioactivity guided“-Screening
Die Aminosäure-Sequenzen der rDlP5βR und der rAtP5βR sind zu etwa 70 % identisch, was
eigentlich eine solide Basis darstellt, um Hypothesen für die abweichenden enzymatischen
Eigenschaften der Proteine aufstellen zu können. So geben Herl et al. (2009) - abgeleitet aus
Sequenzvergleichen und einem Strukturmodell - für die signifikant stärkere Aktivität der rAtP5βR
119
folgende in silico Erklärung an: In den bekannten Standard-SDR-Enzymen findet man entweder
eine katalytische Triade aus Lysin, Tyrosin und Serin, oder eine Tetrade aus Lysin, Tyrosin, Serin
und Asparagin, die bis zur Entdeckung der Struktur der DlP5βR als essentiell galt (Filling et al.,
2002). In der neuen Struktur lagen, wie beschrieben, nur der konservierte Lysin- bzw. Tyrosin-Rest
vor (Thorn et al., 2008). Im Gegensatz dazu fand sich im Modell der AtP5βR ein Glutamin-Rest
(Gln-181) auf der räumlichen Position, die in den üblichen SDR-Proteinen von dem Asparagin der
katalytischen Tetrade eingenommen wird, und dieses - nach Meinung der Autoren - simulieren
kann. Bei der DlP5βR befindet sich an dieser Stelle dagegen ein Leucin, dessen Austausch gegen
Glutamin den „klassischen SDR-Charakter“ der DlP5βR erhöhen und dadurch die Aktivität des
rekombinanten Enzyms steigern sollte. Eine experimentelle Überprüfung der Theorie fand
allerdings nicht statt.
Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit zunächst die L182Q-Mutante der DlP5βR über
gerichtete Mutagenese erzeugt und das rekombinante Protein funktionell exprimiert. Die Aktivität
des Enzyms war jedoch nicht größer als die des WTs, wodurch die in silico-Hypothese von Herl et
al. (2009) widerlegt werden konnte. Ausgehend von den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit lässt
sich zusätzlich auch retrospektiv erkennen, dass diese Hypothese mit größter Wahrscheinlichkeit
falsch sein musste, da sich in einigen nur sehr schwach aktiven P5βR (EcP5βR, ErP5βR) ebenfalls
ein Glutamin-Rest an der identifizierten Position befindet, während z.B. in der MpP5βR, dem
stärksten der neu exprimierten Reduktasen, ein Leucin zu finden ist.
Um eine alternative Hypothese für die Frage, ob es möglich wäre durch die Selektion und
Mutagenese einzelner Reste die Aktivität der rDlP5βR zu erhöhen, aufzustellen, wurde entschieden
weitere P5βR-Gene zu klonieren (vgl. IV.1). Dies war essentiell, da die beiden verfügbaren Enzyme
zwar zu fast 70 % identisch waren, sich ihre Aminosäure-Sequenzen aber absolut betrachtet an 118
Stellen unterschieden, wobei prinzipiell jede dieser Substitutionen für die Aktivität (und die
Stabilität) Bedeutung haben konnte (Morley und Kazlauskas, 2005). Um Aminosäure-Reste für die
Mutagenese abzuleiten, war die funktionelle Expression der cDNAs obligatorisch. Ausreichend war
bereits der Vergleich der Progesteron-Umsetzung unter den Bedingungen des Standard-P5βR-Assay
(Herl et al., 2006). Dies erlaubte eine grobe Kategorisierung der katalytischen Potenz der
rekombinanten Reduktasen in die Rubriken schwach, mittel [= etwa rDlP5βR] oder hoch aktiv.
Unerwarteter Weise besaßen die homologen P5βR aus den näher verwandten Organismen-Gruppen
mit
jeweils
größerer
Identität
der
Aminosäure-Sequenzen
(rMpP5βR/rDlP5βR
bzw.
rAtP5βR/rEcP5βR/rErP5βR) auffallend unterschiedlich hohe enzymatische Aktivitäten. Dies war
für die Mutagenese-Planung jedoch vorteilhaft, da die Anzahl der relevanten Sequenz-Unterschiede
120
so (durch einen Vergleich der P5βR in diesen Gruppen) stark reduziert werden konnte auf 71
(innerhalb der „MpP5βR-Gruppe“) bzw. 26 (innerhalb „AtP5βR-Gruppe“). Unter der Prämisse, dass
die beobachteten Aktivitätsunterschiede in beiden Gruppen auf der gleichen Ursache beruhen,
wurde nach Überschneidungen bei den Sequenz-Unterschieden gesucht, wobei letztlich (von
ursprünglich 118 Substitutionen) die drei Aminosäuren Tyr-156, Asn-205 und Ser-248 als putative
„hot-spots“ identifiziert werden konnten. Diese Prämisse war zur Planung der Experimente
erforderlich, ist aber gleichzeitig ein möglicher Grund dafür, dass die Aktivität der rAtP5βR nicht zu
100 Prozent erreicht werden konnte, da viele der anderen Aminosäure-Substitutionen im D. lanata
Enzym die Aktivität zusätzlich modulieren werden. Wie und in welcher Weise ist im einzelnen nicht
vorhersehbar. Resümiert machte erst die grobe, vergleichende Analyse der in vitro-Aktivität über
GC-MS und DC in Verbindung mit den neuen Sequenzen die Ableitung der „hot-spots“ möglich,
weshalb der Ansatz als „bioactivity guided“ beschrieben wurde.
Obwohl es für das „bioactivity guided“-Screening nicht notwendig war, wurden zusätzlich
auch die exakten enzymkinetischen Konstanten (inklusive einiger anderer Enzym-Parameter) der
rMpP5βR, der rGfP5βR, sowie der rEcP5βR (Munkert et al., 2011) bestimmt. Hierzu wurde eine
photometrische Messmethode adaptiert (Burda et al., 2009). Der Methodenwechsel (Photometer
versus HPLC) machte es notwendig, die rAtP5βR und die rDlP5βR ebenfalls neu zu analysieren.
Neben dem (bisherigen) Standard-Substrat Progesteron (z.B. Herl et al., 2006; Herl et al., 2009)
wurde immer auch das kleine Substratmimetikum 2-Cyclohexen-1-on mitbestimmt, welches in
allen Fällen deutlich effizienter umgesetzt wurde. Generell verdeutlichten diese Experimente erneut
die promisken Eigenschaften der P5βR, da nie nur ein Substrat akzeptiert wurde. Besonders
auffällig war der Unterschied in der Substratpräferenz bei den rekombinanten Enzymen der
Gattungen Gomphocarpus und Erysimum, von denen 2-Cyclohexen-1-on jeweils sehr gut und
Progesteron kaum reduziert werden konnte (Bauer et al., 2010). Die rEcP5βR besitzt für 2Cyclohexen-1-on sogar den größten kcat-Wert aller bisher bekannten orthologen P5βR. Die
Effektivität reicht trotzdem nicht an die der AtP5βR heran, da die Affinität zum Enzym mit einem
Km-Wert von 912,4 sehr schlecht ist (Munkert et al., 2011). V.a. die neu bestimmten bzw. bereits
veröffentlichten kcat-Werte für die Progesteron-Umsetzung waren auffallend niedrig, verglichen mit
den Erwartungen, die sich für enzymatische Reaktionen nach Lehrbüchern der Biochemie ergeben,
z.B. 280.000 s-1 für eine Ketosteroid-Isomerase (Berg et al., 2003). Bar-Even et al. (2011) konnten
allerdings aus der systematischen Auswertung von ca. 5000 enzymatischen Reaktionen, an denen
etwa
2500
verschiedene
„Sekundärstoffwechsels“
im
Enzymen
Schnitt
beteiligt
etwa
sind,
30-fach
121
ableiten,
langsamer
dass
die
arbeiten
Enzyme
des
als
des
die
„Primärstoffwechsels“ (Abb. 60) und außerdem häufig promiskes Verhalten zeigen. Zur Erklärung
des Phänomens dieser niedrigen kcat-Werte wird angenommen, dass das gemessene Substrat häufig
nicht das native ist. Alternativ kann es auch sein, dass Enzyme mit einem promisken Charakter in
ihrem metabolischen Netzwerk mehrere Substrate umsetzen müssen und so keine Optimierung auf
eines davon erfolgen kann. Insgesamt wird nach der Auswertung die Höhe der typischen k cat -Werte
von Enzymen weit überschätzt. Sehr starke Umsetzungen finden sich v.a. bei hoch-spezialisierten
Enzymen des essentiellen Primärmetabolismus.
Abb. 60: Systematischer Vergleich der kcat-Werte (A) und der katalytischen Effizienz (B) von Enzymen des Primär- und
Sekundärstoffwechsels (aus Bar-Even et al., 2011).
Die Werte der rekombinanten P5βR sind, verglichen mit diesen publizierten Daten, zwar an
der unteren Grenze, aber noch im typischen Bereich der bekannten Sekundärstoffwechsel-Enzyme.
Alle Enzyme waren, wie vorhergesagt (Kallberg und Persson, 2006; vgl. auch Motiv-Analyse unter
IV.1.2) strikt NADPH-spezifisch. Die K m-Werte für das NADPH lagen bei allen gemessenen
Proteinen im gleichen Größenordnungsbereich zwischen 20 und 55 µM, wobei auch die P5βR aus
A. thaliana und D. lanata wieder mitbestimmt wurden. Die Km-Werte waren insgesamt etwas höher
als die früher publizierten, was mit der stark unterschiedlichen Messmethode erklärt wird. Die
Kurven zur Bestimmung der Temperatur-Optima der rEcP5βR, rGfP5βR, rMpP5βR wiesen keine
nennenswerten Unterschiede auf. Alle zeigten ein Maximum bei etwa 50 °C, was sich gut mit den
publizierten Daten der rDlP5βR und rAtP5βR deckt (Herl et al., 2006; Herl et al., 2009). Eine
wesentliche Erkenntnis war, dass unter den Bedingungen des Photometer-Assays der Unterschied in
der katalytischen Effizienz dieser beiden Proteine für die Reduktion von Progesteron keinen Faktor
50 betrug, sondern lediglich 12. Dies erscheint plausibel, weil die beiden Proteine bisher niemals
122
unter identischen Bedingungen bestimmt wurden, da ihr Verhalten zu stark voneinander abweicht.
Der Vergleich der Daten war deshalb schwierig, weil immer mehrere Faktoren gleichzeitig
verändert wurden, wie z.B. Enzymmenge, Temperatur, Messmethode (Herl et al., 2006; Herl et al,
2009).
IV.2.1.2 Gerichtete Mutagenese und Charakterisierung der Muteine
Die DlP5βR wurde an den identifizierten „hot-spots“ mutiert, wobei die Aminosäuren gegen
diejenigen ausgetauscht wurden, die sich an den entsprechenden Positionen bei der AtP5βR bzw. der
MpP5βR befinden. Das Mutagenese-System wurde optimiert und der Erfolg konnte über
Sequenzierung des mutierten Gens im Expressionsvektor bestätigt werden. Um stichprobenartig zu
prüfen, ob bei dem beschriebenen Vorgehen wichtige Aminosäuren übersehen werden, wurden
Kontrollmutationen innerhalb der Protein-Motive (z.B. M150L, G204N) bzw. der putativen
Substrat-Bindetasche (z.B. F353M; F353P) realisiert, über die es aber in keinem Fall gelang, die
Aktivität des rekombinanten Enzyms signifikant zu steigern. In diesem Teil der Arbeit war das Ziel,
Mutagenese-Experimente durchzuführen und die korrespondierenden Muteine schnell auf erhöhte
Aktivität hin zu analysieren, um vielversprechende Kandidaten zu selektionieren – inspiriert von
der DE-Methode (Chica et al., 2005). Es wurde hierfür auf den Standard-P5βR-Assay, der für den
D. lanata WT publiziert wurde (Herl et al., 2006), zurückgegriffen, um die relativen Aktivitäten der
Muteine zu bestimmen. Diese Bedingungen wurden direkt übernommen und auch deshalb gewählt,
da die beobachteten Aktivitätsunterschiede der rekombinanten P5βR (Herl et al., 2006, Herl et al.,
2009, Munkert et al., 2011) unter genau diesen auftreten.
Es konnte festgestellt werden, dass die Mutation des Tyrosin-156 (Y156V) die Aktivität
etwa verdoppelte, die Mutation des Asparagin-205 (N205M bzw. N205A) erhöhte sie sogar noch
stärker, während die S248-Mutation zum kompletten Funktionsverlust führte, was mit
Sekundäreffekten, v.a. sterischen Behinderungen zwischen dem eingeführten Methionin-Rest und
anderen Aminosäuren nahe der Bindetasche erklärt werden kann. Die Tendenzen der
Aktivitätsänderung der Muteine im Vergleich zum WT waren deutlich sichtbar und quantitativ gut
reproduzierbar. Es muss betont werden, dass die absoluten Zahlenwerte deshalb nur apparente
relative Aktivitäten darstellen, weil nicht für jede Mutante ein optimaler Test aufgebaut werden
sollte. Von Bedeutung war im Screening einzig, den tendenziellen Einfluss der Substitutionen auf
die Enzymaktivität festzustellen.
Die im Screening identifizierten Muteine mit den verbesserten Eigenschaften wurden über
ihre kinetischen Konstanten genau charakterisiert. Vergleicht man die kinetischen Daten der Asn205-Muteine (Kcat 2,4 min-1 bzw. 1,8 min-1) mit denen von anderen Sekundärstoffwechsel-Enzymen
123
(Bar-Even et al., 2011; IV.2.1.1), fallen diese zwar absolut betrachtet noch immer sehr gering aus,
allerdings wurde die Affinität der Enzyme für das Substrat im Vergleich zum rDlP5βR Wildtyp
stark erhöht. Dieser stark verbesserte Km-Wert begründet die gemessene Aktivitätszunahme der
Muteine. Nimmt man den kcat/Km -Wert als Richtgröße für die Effektivität des Enzyms (Eisenthal et
al., 2007), konnte durch die Substitution eines einzelnen Restes verglichen mit den WT eine
Steigerung der Effizienz um den Faktor 9 erreicht werden. Dies ist sogar noch mehr, als durch die
relativen Aktivitäten im ersten Screening ermittelt wurde. Wie in diesem bereits ersichtlich, war die
Y156V-Substitution weniger effektiv. Sie steigerte den k cat/Km-Wert nur um den Faktor 2. Betrachtet
man die Werte für die Reduktion von 2-Cyclohexen-1-on erkennt man, neben der bereits
diskutierten Bevorzugung des kleinen Substrats gegenüber Progesteron, die von beiden Asn-205Muteinen gezeigt wurde, auch einen wesentlichen Unterschied: Zwar steigt in beiden Fällen die
katalytische Effektivität der Enzyme (verglichen mit dem WT) an, allerdings passiert dies bei der
N205A-Mutante parallel zur Verbesserung der Progesteron-Reduktion, während bei der N205MMutante die relative Verbesserung nur etwa 66 % betrug. Es zeigt sich also, dass die
Punktmutationen nicht nur die katalytische Aktivität der rDlP5βR verbesserten, sondern, dass es bei
der N205M-Mutante zusätzlich zu einer Änderung der Substratpräferenz kommt: Während der
DlP5βR WT 2-Cyclohexen-1-on etwa 28 mal effektiver reduziert, betrug der Faktor nur noch 15 für
die N205A-Mutante und ungefähr 5 für die N205M und Y156V-Mutante. Eine Tendenz hin zur
starken Bevorzugung von kleinen Substraten zeigt sich dagegen bei der P5βR aus E. crepidifolium
(Munkert et al., 2011) und G. fruticosum. Dass sich bereits eine einzelne Mutation stark auf die
Substratpräferenz auswirken kann, wurde bereits bei anderen (Biosynthese-)Enzymen beschrieben.
Durch den Austausch von Asp-177 gegen Alanin in der Strictosidin-Synthase von C. roseus, konnte
die Breite der akzeptierten Secologanin-Analoga stark vergrößert werden (Chen et al., 2006). Bei
Chalkon-Synthasen konnte durch die Variation von einer bzw. einigen wenigen Aminosäuren die
Substratpräferenz so stark verändert werden, dass neue Gruppen von Sekundärmetaboliten
entstanden (Abe und Morita, 2010). Die Dihydroflavonol 4-Reduktase (DFR) aus Petunia, die in
die Anthocyanin-Biosynthese involviert ist, kann Dihydrokaempferol nur sehr ineffizient
reduzieren, weshalb bei der Pflanze keine orangen Blüten vorkommen. Johnson et al. (2001)
konnten zeigen, dass die Substitution einer einzelnen Aminosäure innerhalb der putativen SubstratBindetasche zu einer Enzym-Mutante führt, die nun präferenziell Dihydrokaempferol reduziert.
Zusammenfassend legen diese Beispiele und die Ergebnisse der Mutagenese-Experimente dieser
Arbeit nahe, dass in der Evolution des „Sekundärstoffwechsels“ - z.B. nach der Genduplizierung
(Ober, 2010) - nicht zwangsläufig eine größere Anzahl von Mutationen in einem Gen erfolgen
muss, um eine Sub- oder Neofunktionalisierung zu erreichen. Vielmehr sind bereits winzige
124
Veränderungen an geeigneten Positionen ausreichend, damit ein Protein grundlegend andere
Eigenschaften erhält, oder auch (nahezu) funktionslos wird (wie z.B. bei der DlP5βR G204NMutante zu erkennen ist).
Als Ausblick machen die Identifizierung und der experimentelle Nachweis der Wichtigkeit
der „hot-spot“-Positionen innerhalb der Sequenz der rDlP5βR es nun möglich, in der Folge ein
sogenanntes „semi-rationales“ Proteindesign (d.h. eine Kombination von SDM- und DEExperimenten) durchzuführen (Chica et al., 2005; Lutz, 2011). Die rational identifizierten
Positionen in einer hoch-aktiven P5βR könnten ganz gezielt „erschöpfend“ mutiert werden, um eine
noch effizientere Enzym-Variante (mit promiskem Charakter und stereoselektiver Umsetzung), z.B.
zur industriellen Anwendung, zu erhalten (Kirk et al., 2002; Bornscheuer und Kazlauskas, 2004).
V.a. wenn kein high-throughput-Screening für die gerichtete Evolution im Labor vorhanden ist,
vereint dieses Vorgehen die Vorteile der SDM- und DE-Methoden und wurde bereits häufig
erfolgreich angewandt (Wilming et al., 2002, Santoro und Schulz, 2002; Peimbert und Segovia,
2003).
IV.2.1.3 Simulation der Molekül-Dynamik (MD)
Zusätzlich zu den Mutagenese-Experimenten wurden die beiden ursprünglich bekannten
funktionellen P5βR aus D. lanata (Herl et al., 2006) A. thaliana (Herl et al., 2009) in silico mittels
Molekül-Dynamik(MD)-Berechnungen simuliert (Bauer et al., Manuskript in Vorbereitung). Die
Messungen und Berechnungen wurden von Dr. H. Lanig, CCC Uni-Erlangen, durchgeführt. In die
Strukturmodelle wurden hierzu die beiden Standardsubstrate dieser Arbeit, Progesteron und 2Cyclohexen-1-on, innerhalb der putativen Bindetasche der Enzyme platziert und die Abstände
zwischen dem Donor-C-Atom des NADPH, von dem das Hydrid übergeht, und dem Akzeptor-sp 2C-Atom des jeweiligen Substrats über die Zeit vermessen (Abb. 61).
125
Abb. 61: Molekül-Dynamik(MD)-Simulation der DlP5βR und der AtStR (CH = 2-Cyclohexen-1-on, PRO =
Progesteron; graue Linie = 5 Angstrôm-Linie) (nach Lanig, unveröffentlicht).
In den MD-Simulationen zeigte sich, dass die Bindetasche des A. thaliana Enzyms in silico
eine stark vergrößerte Affinität für beide Substrate besitzt. Sie blieben jeweils über die gesamte
Simulationszeit in der Bindetasche und zwar in einer Orientierung, in der eine Reduktion prinzipiell
möglich wäre. Währenddessen war das D. lanata Protein in silico nicht in der Lage die Substrate
lange in der Bindetasche zu halten. Das Enzym besaß also eine deutlich geringere Affinität zu
diesen, wobei solche Affinitäten zwischen Substraten und Bindetaschen häufig über hydrophobe
Wechselwirkungen unter Ausschluss von Wasser-Molekülen realisiert werden (Englert et al., 2010) .
Diese Berechnungen decken sich gut mit den experimentellen Ergebnissen der MutageneseVersuche der vorliegenden Arbeit. Einerseits können alle über das entwickelte Screening
abgeleiteten Mutationen als sogenannte „close mutations“ (Morley und Kazlauskas, 2005)
eingestuft werden, d.h. die mutierten Aminosäuren sind Teil bzw. liegen im direkten Umfeld der
Bindetasche und sind somit wahrscheinlich an der Wechselwirkung mit den Liganden beteiligt.
Andererseits wurden - v.a. im Fall der Position 205 - Aminosäuren gegen andere mit größerer
Hydrophobizität ersetzt. Auch die kinetischen Daten zeigen, dass durch den Austausch der
Aminosäuren im Wesentlichen nicht die Geschwindigkeitskonstanten, sondern v.a. die Affinität
zwischen den Substraten und dem Enzym signifikant verbessert wurde. Dies wird durch die in
silico-Daten bestätigt. Abb. 62 zeigt die MD-Simulation des N205M-Muteins:
126
Abb. 62: MD-Simulation des DlP5βR N205M-Muteins mit Progesteron (PRO) und 2-Cyclohexen-1-on (CH). Graue
Linie = 5 Angstrôm-Linie) (Bauer et al., Manuskript in Vorbereitung).
Verglichen mit dem WT (Abb. 61) zeigen auch die MD-Daten des Muteins eine längere
Verweildauer beider Substrate in der Bindetasche. Dies untermauert die Hypothese der gesteigerten
Affinität der Muteine weiter.
Ausgehend von den MD-Berechnungen und den Ergebnissen der Mutagenese-Experimente
kann versucht werden, alle Proteine, die als Ergebnisse einer BlastP-Suche mit der Sequenz der
DlP5βR gefunden werden konnten, anhand ihres Aminosäure-Musters an den beiden „hot-spots“
prospektiv in „starke“ und „schwache“ Proteine einzuteilen, wobei die Aktivität der DlP5βR als
Referenzwert dient. Es wird vorhergesagt, dass beispielsweise die VEP1-Gene von Medicago
trunculata (ABD33275.2), Picea sitchensis (ABK24388.1) und Oryza sativa (NP_001050440.1) für
sehr aktive P5βR codieren. Als schwach eingestuft werden z.B. die P5βR aus Calotropis procera
(Bauer et al., 2010) und aus Arabidopsis lyrata (XM_002869685.1). Dieses Protein scheint für die
Argumentation besonders interessant. Es besitzt fast die identische Sequenz wie die A. thalianaVariante (Herl et al., 2009), entspricht aber an den „hot-spots“ den Enzymen aus der Gattung
Erysimum und stellt deswegen einen guten Prüfstein für die Validierung der Vorhersagen dar.
Ausgehend von den MD-Simulationen ergaben sich Hinweise auf das Vorhandensein einer
alternativen Bindetasche für CH. Diese Hypothese widersprach zunächst den Ergebnissen dieser
Arbeit, konnte jedoch nicht aufrecht erhalten werden.
127
IV.2.2 Konservierte Reste innerhalb der Bindetasche der P5βR
Ein Vergleich der erstellten Homologie-Modelle aller P5βR zeigt, dass die Gesamtfaltung
der Proteine in allen Fällen etwa identisch ist, wie dies auch aus der hohen Sequenz-Identität zu
erwarten ist (Petsko und Ring, 2009). Abweichungen ergeben sich jedoch bei der Betrachtung und
dem Vergleich der putativen Substrat-Bindetaschen. Die Bindetasche wird in diesem Rahmen als
putativ bezeichnet, weil der genaue Binde-Modus des Substrats bisher noch nicht experimentell
bestimmt werden konnte. Die Co-Kristallisation von Progesteron mit der rDlP5βR war nicht
erfolgreich (Thorn et al., 2008). Dies lässt sich v.a. mit der schlechten Wasserlöslichkeit des
Steroids begründen. Sein Bindebereich ist jedoch über in silico-Methoden (Docking-Experimente)
mit Hilfe der aufgeklärten DlP5βR-Kristallstruktur (PDB 2v6g), in der das Cosubstrat der binären
Reaktion (NADPH) mit aufgelöst wurde, gut abgeleitet worden (Thorn et al., 2008; Herl et al.,
2009). Hinzu kommt, dass das Progesteron-Molekül insgesamt wenig sterische Freiheitsgrade
besitzt. Dieser publizierte Bindungsmodus wurde auch für alle neu modellierten P5βR in dieser
Arbeit übernommen. Alle Reste, die (mit mindestens einem Atom) höchstens 4 Å vom Substrat
entfernt lagen, wurden als direkte Bestandteile der Substrat-Bindetasche gewertet.
Insgesamt war in allen Strukturen auffällig, dass keine speziell für die Bindung von
Progesteron adaptierte Tasche vorliegt. Neben den Unterschieden an den Positionen, die sich - wie
diskutiert - als essentiell für die Stärke der enzymatischen Aktivität und die Substratpräferenz
erwiesen haben, findet man noch eine Reihe von anderen Substitutionen, aber interessanterweise
auch einen Bereich der Bindetasche, der in allen funktionell exprimierten P5βR streng konserviert
vorliegt. Dieser umfasst die Aminosäuren Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179, Met-215
und Phe-343, die den unteren Teil der „trichterförmigen“ Bindetasche bilden. In diesem Bereich
findet auch die eigentliche Katalyse in Form der Hydrid-Übertragung von NADPH auf das Substrat
statt (Thorn et al., 2008). Die Bindetasche reicht von der Oberfläche etwa 20 Å ins Proteininnere,
während Progesteron etwa 10 Å umfasst.
Während die räumliche Konservierung von Lys-147 und Tyr-179 einfach zu erklären ist, da
dies die beiden SDR-typischen katalytischen Reste sind (Kavanagh et al., 2008) und die absolute
Notwendigkeit von Tyr-179 bereits von Thorn et al., (2008) durch gerichtete Mutagenese gezeigt
werden konnte, führte der individuelle Austausch jedes der sieben Reste gegen Alanin zu einem
starken bis kompletten Funktionsverlust der rekombinanten Reduktase. Entgegen der Erwartung
war das Lys-147-Mutein nicht vollständig funktionslos. Die Ergebnisse des Versuchs zeigten, dass
dieses Lysin zwar sehr wichtig ist für die Effizienz des Proteins, aber im Gegensatz zu bisherigen
Annahmen nicht in dem Ausmaß obligatorisch ist wie Tyr-179 (Thorn et al., 2008). Ähnliche
128
Effekte wurden bei Mutagenese-Experimenten mit den katalytischen Resten Tyr-194 und Lys-198
eines anderen SDR-Enzyms beobachtet, bei denen gezeigt wurde, dass sowohl dessen Y194C-, als
auch das K198R-Mutein noch Restaktivität mit ausgewählten Substraten besitzt (Nakajin et al.,
1998).
Dass die G145A-Mutation die Katalyse-Fähigkeit des Proteins zerstört, konnte durch in
silico-Mutagenese weitgehend erklärt werden. Die Hauptkette des Proteins verliert einerseits an
Flexibilität, andererseits scheint die Einbringung einer voluminöseren Seitengruppe die
Orientierung von Tyr-179 zu stören.
Auffallend an den Mutagenese-Experimenten waren die ausgeprägten Effekte, die der
Austausch der beiden konservierten Phenylalanine auf das Enzym hatte. Besonders die
Auswirkungen der F153A-Mutation (= keine messbare Enzymaktivität mehr) wurden so nicht
vorhergesehen. In diesem Rahmen - und um eine mögliche Erklärung für den Stellenwert aller
konservierten Reste zu finden - wurden im Weiteren die Lage und Konformation aller sieben
Aminosäuren in den beiden aufgeklärten Kristallstrukturen der DlP5βR (PDB 2v6g/2v6f; mit und
ohne Cosubstrat) verglichen. Sie befanden sich alle an nahezu identischen Positionen, mit
Ausnahme von Phe-153. Diese Aminosäure ist Teil eines Protein-Abschnitts mit hoher Flexibilität
(s. auch B-Faktor der Kristallstrukturen; Thorn et al., 2008), der abhängig von der Bindung des
(Co-)Substrats herunter- oder hochgeklappt vorliegen kann. Zusammen mit den Resultaten der
Mutagenese-Versuche implizieren diese Ergebnisse eine wichtige Rolle des Phe-Restes bei der
Bindung der Substrate, z.B. in Form einer Phenylalanin-Klammer zusammen mit Phe-343 (dessen
Substitution gegen Alanin die Enzymaktivität ebenfalls dramatisch gesenkt hat). Diese Situation, in
welcher Substrat-Kanäle von Enzymen durch eine Kombination von zwei zusammen als „Pförtner“
fungierenden Phenylalanine verschlossen bzw. kontrolliert werden, wurde auch für die menschliche
CYP P450 3A4 Monooxygenease veröffentlicht (Fishelovitch et al., 2009). Analoges wurde auch
für andere CYP P450 Enyzme, wie z.B. für CYP 2B1 (PDB 1tqn), beschrieben (Li et al., 2005).
Beide Beispiele zeigen diesen „Gating“-Mechanismus an Hand von Testosteron als Substrat. Bei
den durchgeführten MD-Berechnungen mit der rAtP5βR (und der rDlP5βR) ist zu erkennen, dass
die beiden Phenylalanin-Reste (Phe-153 und Phe-343) das Steroid-Substrat durch ihren
hydrophoben Charakter in der richtigen Position stabilisieren (Abb. 63; Bauer et al., Manuskript in
Vorbereitung).
129
Abb. 63: Darstellung der beiden Phenylalanine (Phe-153 und Phe-342) mit putativer „Pförtner“-Funktion in der MDSimulation der AtP5βR (rot = Substrat; blau = Cosubstrat).
Die MD-Berechnung mit 2-Cyclohexen-1-on zeigte einen kompletten Verschluss der
Bindetasche. Das Substrat wird davon abgehalten, sich aus dieser zu entfernen. Ursprünglich wurde
dies als mögliche Erklärung herangezogen, dass das kleine 2-Cyclohexen-1-on bisher in allen
Fällen das bevorzugte Substrat der P5βR darstellt. Die MD-Berechnungen der beiden AtP5βRMuteine, bei denen jeweils Phe-153 oder Phe-342 durch Alanin ersetzt wurde, sagten eine deutliche
Änderung der Katalyse voraus, wobei die Substrate nicht mehr über die gesamte Dauer der
Simulation in der Bindetasche gehalten werden können.
Alle bei einer Blast-Suche gefundenen Gene bzw. Proteine, die als orthologe P5βR
identifiziert wurden, konnten die beschriebenen sieben konservierten Reste vorweisen. Bei den
Genen/Proteinen
bakterieller
Herkunft,
wie
z.B.
aus
Methylobacterium
extorquens
(YP_001641399.1), ist der Phe-343-Rest durch ein (ebenfalls aromatisches) Histidin ersetzt.
Allerdings ist die Sequenz-Identität hier nur gering und es muss erst untersucht werden, ob es sich
bei den rekombinanten Enzymen überhaupt um Progesteron-Reduktasen handelt, da die Proteine in
den Datenbanken als Enzyme des Zuckerstoffwechsels geführt werden - in diesem speziellen Fall
als NAD-abhängige Epimerase.
Um die Ergebnisse aus der Mutagenese der konservierten Reste, v.a. die Hypothese einer
Phe-Klammer zur Bindung der Substrate, zu prüfen und weiter zu vertiefen, sollen nun aufbauend
auf diesen die entsprechenden, noch ausstehenden Reste der rAtP5βR substituiert werden.
130
IV.2.3 Einkürzungs-Mutagenese der rDlP5βR
Zur effektiven und schnellen Klonierung von orthologen P5βR wurde ein neues
Klonierungssystem mit dem pQE30-UA-Vektor etabliert, bei dem die „full-length“ cDNA direkt in
den Vektor kloniert wurde. Die von Herl et al. (2006; 2006; 2009) klonierten Gene liegen im
Gegensatz dazu im Standard-pQE30-Vektor vor. Dieser Unterschied sollte jedoch keine große Rolle
spielen, muss aber erwähnt werden, da durch die gewählte Klonierungsmethode unterschiedliche
artifizielle Reste zwischen dem N-terminalen His-tag und der ersten Aminosäure des rekombinanten
Proteins eingeführt werden. Im Falle des pQE30 UA-Vektors sind dies zehn Stück (Qia
Expressionist, 2003). Potentiell problematisch war aber, dass die rDlP5βR (Herl et al., 2006)
zusätzlich keine komplette P5βR darstellt, wie z.B. die rAtP5βR (Herl et al., 2009) und die in dieser
Arbeit neu klonierten und funktionell exprimierten P5βR (Bauer et al., 2010), sondern, dass es sich
dabei um ein rekombinantes Protein handelt, welches durch die Klonierung eines unvollständigen
ORFs N-terminal um 13 Aminosäuren verkürzt wurde („rDlP5βnn-13“; Erklärung der Nomenklatur
auch unter VII.1). Um die Auswirkungen solcher Proteinverkürzungen auf die P5βR zu analysieren,
wurde zunächst die vollständige cDNA aus frischem Pflanzenmaterial neu kloniert. Das etablierte
Mutagenese-System wurde modifiziert, um gezielte Deletionen am 5'-Ende des P5βR-Gens
durchführen zu können, wodurch rekombinante D. lanata-Muteine exprimiert werden sollten, deren
N-Terminus um eine definierte Anzahl an Aminosäuren verkürzt ist. Um beim anschließenden
Vergleich der Aktivität der WT-P5βR und deren Deletionsmutanten keine Komplikationen durch
sekundäre Effekte des His-tags mit dem Protein zu erhalten, z.B. wenn dieser durch ein fehlendes
Zwischenstück in die Lage versetzt wird, die Cosubstrat-Bindung zu behindern oder komplett
unmöglich zu machen, wurde entschieden, einen neuen Vektortyp mit C-terminalem His-tag zu
verwenden. Dass solche negativen Interferenzen zwischen dem Protein-Tag und der Substrat- oder
Cosubstrat-Bindung bei (SDR-)Enzymen möglich sind, wurde bereits am Beispiel einer TropinonReduktase aus S. dulcamara gezeigt (Freydank et al., 2008). Ob diese theoretische Möglichkeit
auch bei den P5βR besteht, kann aus der Struktur nicht abgeleitet werden, da die einzige
experimentelle Kristallstruktur erst mit dem Aminosäure-Rest Ser-26 beginnt (Thorn et al., 2008).
Der Versuch die fehlenden Reste 1-25 zu modellieren, gelang nicht, da es nicht möglich war, ein
geeignetes Template in der RCSB-Proteindatenbank zu finden. Ein weiterer Vorteil des neuen
Vektors ist, dass durch die Art der Klonierung über homologe Rekombination - mit Ausnahme des
His-tags selbst - keinerlei artifiziellen Aminosäuren mehr im rekombinanten Protein auftauchen.
Die Klonierung und die folgende erste Deletions-Mutagenese der klonierten cDNA
(Deletion von 30 Aminosäuren) konnte erfolgreich durchgeführt werden. Die Expression der „full-
131
length“-P5βR lieferte auch mit einem C-terminalen His-tag ein funktionelles Protein. Dies war nicht
selbstverständlich, da C-terminale His-tags häufig zu schlechter Löslichkeit der rekombinanten
Proteine führen (Busso et al., 2003). Auch Woestenenk et al. (2004) legten an Hand von 20
klonierten menschlichen ORFs systematisch dar, dass die Art des His-tags sich stark auf die
Eigenschaften des Proteins (Löslichkeit und Ausbeute) auswirken kann. Die Expression der
Deletionsmutante (rDlP5βRcn-30) und der Nachweis der Funktionalität erfolgte durch Rudolph
(2011). Die Autorin führte weitere Deletions-Experimente durch und beschrieb zusätzlich die
erfolgreiche Expression von rDlP5βR mit N-terminaler Deletion von 10, 20 und 40 Aminosäuren.
Sowohl die relativen Aktivitäten, als auch die kinetischen Konstanten der Muteine zeigten, dass
durch die Einkürzung des Proteins die enzymatische Aktivität erst zunimmt (-10 und -20
Aminosäuren) und dann verschwindet (-30 und -40 Aminosäuren). Gleichzeitig mit dem Verlust der
Aktivität nahm jedoch die Menge an rekombinant-exprimiertem Protein stark ab. Die Ursachen für
die schlechtere Expression können vielfältig sein und reichen von einer inkorrekten Faltung, über
eine gesteigerte Aggregationsrate, bis hin zur Bildung von „Inclusion-Bodies“ (Baneyx, 1999;
Baneyx und Mujucic, 2004). Da die Expressionsanalyse der rDlP5βRcn-30 auch einige
Verunreinigungen aufzeigte, wurden von allen Proteinen CD-Spektren (Cantor et al., 1980)
aufgenommen, um Hinweise zu erhalten, dass es sich bei den gereinigten Enzymen um rDlP5βRMuteine handelt. Die Faltungszustände der rekombinanten Proteine wurden mit „fernem“ UV-Licht
analysiert, um deren Sekundärstrukturgehalt zu quantifizieren (Abb. 64; Rudolph et al., Manuskript
in Vorbereitung).
132
Abb. 64: CD-Spektren der rDlP5βRnn-13 (F), rDlP5βRc (A) und deren Deletions-Muteinen (B = rDlP5βRcn-10, C =
rDlP5βRcn-20, D = rDlP5βRcn-30, E = rDlP5βRcn-40, G = überlagerte Spektren; nach Rudolph, 2011; zur Erklärung
der Nomenklatur der P5βR siehe auch VII.1)
Alle gemessenen CD-Spektren zeigten die Charakteristika eines α-helikalen Proteins mit βFaltblattanteil: zwei Minima bei etwa 208 nm und 222 nm und ein absolutes Maximum bei 193 nm
(Holzwarth et al., 1965; Greenfield und Fasmann, 1969). Dies entspricht den aus der Struktur der
rDlP5βR abgeleiteten Erwartungen (Abb. 3; Thorn et al., 2008). Aus der Tatsache, dass alle
Spektren nahezu identisch waren, kann abgeleitet werden, dass es sich bei den exprimierten
Proteinen um P5βR -Varianten (und nicht um Verunreinigungen) handelt, die unabhängig vom Grad
der N-terminalen Deletion gleich gefaltet vorliegen. Auch über Dot-Blots/Western-Blots der
133
rDlP5βRcn-30 (Rudolph und Kreis, unveröffentlicht) konnte gezeigt werden, dass trotz der Deletion
von 30 Aminosäuren noch gefaltetes Protein gebildet wird, welches aber ab dieser Stufe keine
Aktivität besitzt. Die enzymatische Aktivität der P5βR geht durch N-terminale Kürzung der
Proteine im Bereich von 21-30 Aminosäuren verloren. Eine plausible Erklärung hierfür ist, dass
durch die Deletion der Aminosäuren eines der sechs parallelen β-Faltblätter der Rossmann-Faltung
(Rossmann und Argos, 1976) betroffen ist, wodurch das Netzwerk von intramolekularen HBrücken, welches zwischen diesen β-Strängen besteht, gestört wird (Abb. 65, B). Bei der Kürzung
von 10 weiteren Resten auf '-40' wurden dieser erste β-Strang und zusätzlich der Loop, der das
zentrale Gx(x)Gx(x)G-Rossmann-Motiv beinhaltet, komplett entfernt (Abb. 65, C). Folglich fehlt
die Position, die wesentlich für die Cosubstrat-Bindung zuständig ist (Kallberg et al., 2002, Person
et al., 2003). Da die Proteine nach den CD-Messungen noch gefaltet vorliegen, sollten fehlerhafte
Bindungen des Cosubstrats, z.B. durch eine fehlerhafte Orientierung der Motive, für den
Aktivitätsverlust verantwortlich sein.
Abb. 65: Struktur der DlP5βR (PDB 2v6g) gefärbt nach Sekundärstruktur-Elementen (rot = α-Helix, gelb = β-Faltblatt;
grün = Loop; blau = Cosubstrat). Der Pfeil markiert jeweils den N-Terminus des Proteins (A = WT; B = DlP5βRn-30; C
= DlP5βRn-40).
Mit der CD-Methode wurden auch die Hitzestabilität der rDlP5βRc und der
Deletionsmutanten gemessen. Dies geschah über die Aufnahme von mehreren CD-Spektren eines
Proteins bei unterschiedlichen Temperaturen, zwischen 20 und 96 °C (Rudolph et al., Manuskript in
134
Vorbereitung). Es konnte keine vollständige, sondern immer nur eine teilweise Entfaltung
beobachtet werden. Es handelt sich bei allen rekombinanten Enzymen um sehr hitzestabile Proteine,
bei welchen die Hälfte der Protein-Moleküle erst bei 44 - 48°C entfaltet vorliegen (Rudolph, 2011).
Beispiele für andere pflanzliche Proteine, die ebenfalls sehr thermostabil sind, wären u.a. die
Peroxidasen aus der Sojabohne (Jones et al., 1998) und Meerrettich (Oppmann et al., 1990; Dunford
et al., 1991). Die Schmelztemperatur der SBP (Peroxidase der Sojabohne) ist mit 86 °C (Kamal et
al., 2002) ungefähr doppelt so hoch wie der Schmelzpunkt der rDlP5βRc.
Warum die Aktivität durch die Einkürzung zunächst steigt, lässt sich nicht beantworten, da
die Struktur dieser Reste - wie beschrieben - im Kristall fehlt. Eine Möglichkeit, eine Erklärung zu
finden, wären MD-Simulationen mit und ohne diesen Protein-Tag durchzuführen. Die Aktivität der
rDlP5βRcn-10 entspricht in etwa der der rDlP5βRnn-13 (Herl et al., 2006), allerdings ist der direkte
Vergleich nur bedingt zulässig, da sich der His-tag wie gesagt auf verschiedenen Seiten des Proteins
befindet. Dass dies nicht nur einen entscheidenden Einfluss auf Löslichkeit, sondern auch auf die
Aktivität eines rekombinanten Proteins haben kann, wurde am Beispiel der rekombinanten S.
dulcamara Tropinon-Reduktase gezeigt (Freydank et al., 2008). Auch bei rekombinantem humanem
Serum-Transferrin lassen sich je nach Platzierung des His-tags deutliche Unterschiede erkennen: So
war die Eisenfreisetzung bei C-terminalem His-tag signifikant verlangsamt im Vergleich zum
Protein ohne His-tag. Beim N-terminalen His-tag trat dieses Phänomen nicht auf (Mason et al.,
2002). Insgesamt sind jedoch beide Proteine, die um etwa 10 bzw. 13 Aminosäuren gekürzt sind,
aktiver als der ungekürzte Wildtyp. Ließe sich dies auch auf die „full-length“-DlP5βR mit Nterminalem His-tag übertragen, müsste die Aktivität der D. lanata P5βR nach unten korrigiert
werden und auf eine Stufe mit der rGfP5βR oder rEcP5βR gestellt werden. Ob eine Kristallisation
der kompletten rDlP5βRc ähnlich schnell verlaufen würde, wie für die rDlP5βRn beschrieben
wurde (Egerer-Sieber et al., 2006), lässt sich nicht sagen. Einige Autoren gehen allgemein davon
aus, dass die Effekte von His-tags auf die Kristallisation sehr gering sind (Smyth et al., 2003). Qin
et al., (2006) geben an, dass die Kristallisation durch den Tag sogar erleichtert ist gegenüber
nativem Protein. Es gibt aber auch Beispiele, in denen Tags starke, negative Auswirkungen hatten
(Bucher et al., 2002).
Obwohl es aus den theoretischen Überlegungen und den Literaturangaben nicht sehr
wahrscheinlich ist (vgl. Diskussion zur Cosubstrat-Bindung unter IV.2.4) , wurde die Aktivität der
gekürzten Proteine auch mit dem alternativen Cosubstrat NADH getestet, da durch die Deletionen
Veränderungen am N-terminalen Cosubstrat-Bindebereich (Kavanagh et al., 2008) des SDRProteins stattgefunden haben. Es konnte aber mit diesem Cosubstrat keine Aktivität gezeigt werden.
135
Mit dem entwickelten Photometer-Assay dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten
bestimmt, wobei die größte Auffälligkeit das Verhalten der rDlP5βRc (also der kompletten P5βR)
war, die mit 34,3 µM eine sehr starke Affinität zu Progesteron besaß (Rudolph, 2011). Dieser Wert
entspricht gut dem der nativen D. pupurea P5βR (Gärtner et al., 1994) und dem K m-Wert der D.
purpurea P5βR2 (Pérez-Bermúdez et al., 2010), ist aber um ein Vielfaches niedriger als die
publizierten und selbst gemessenen Werte der gekürzten DlP5βR (Herl et al., 2006). Um hier
Aussagen treffen zu können, müsste die „full-length“-P5βR mit N-terminalem His-tag zum
Vergleich ebenfalls kloniert und exprimiert werden. Die K m-Werte der Deletionsmutanten lagen
demgegenüber im typischen P5βR- Bereich (Herl et al., 2006; Munkert et al., 2011; diese Arbeit).
Sowohl die rDlP5βRc, als auch deren Deletions-Muteine, setzten bevorzugt das kleine SubstratMimetikum 2-Cyclohexen-1-on um, wie es für alle rekombinanten P5βR beschrieben wurde (Burda
et al., 2009; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011).
Die Ergebnisse der Deletionsmutagenese-Experimente erlauben es erneut, einen Bezug zur
Evolution von neuen Stoffwechselwegen zu machen. Ein verkürztes Gen könnte so z.B. die
Auswirkung einer (unvollständigen) Genduplizierung sein, wodurch ohne weitere Spezialisierung
und ohne weitere Mutation und Selektion (Ober et al., 2010) bereits Enzyme mit neuen
Eigenschaften, wie geänderter Substrat-Spezifität oder Aktivität erhalten werden könnten. Neue
Stoffwechselwege können durch diese Enzyme geöffnet oder gefestigt werden - z.B. durch die
Bevorzugung bisher nicht oder nur schlecht genutzter Substrate. Um die Existenz weiterer Nterminal verkürzter P5βR-artiger Enzyme nachzuweisen, wurde eine Blast-Suche durchgeführt
(Rudolph 2011; eigene Recherche). Hier konnten mehrere N-terminal um13 Aminosäuren verkürzte
Proteine gefunden werden, u.a. aus Populus tremula (ACE96881; ACE96889; ACE96904) und Zea
mays (NP_001140307). Allerdings muss man hier Vorsicht walten lassen, da es sich jeweils um
hypothetische Proteine handelt und es sich um falsch-positive Treffer handeln könnte, da die Stelle,
an der das Protein beginnt, diejenige ist, die sich im Gen bei D. lanata direkt nach dem Intron
befindet. Die Lage und das Vorkommen eines Introns ist für die Gene zwar nicht gezeigt, wäre aber
zu erwarten, da ein solches in allen pflanzlichen VEP1-Genen streng konserviert zu sein scheint
(Tarrío et al., 2011). Evtl. handelt es sich also um fehlerhafte Vorhersagen in der Datenbank auf
Grund von Unkenntnis der Intron-Exon-Grenzen. Andere unterschiedlich verkürzte P5βR findet
man in Oryza sativa (AAP20856) und Sorghum bicolor (XP_002467669). Alle identifizierten
verkürzten Treffern war allerdings gemein, dass sie nicht der „sensu strictu“-Definition
entsprachen, da bestimmte charakteristische Protein-Motive fehlten (Persson et al., 2003; Thorn et
al., 2008).
136
IV.2.4 Änderung der Cosubstrat-Spezifität
Ein häufig beschriebenes Ziel von rationalen Mutagenese-Experimenten ist es, EnzymVarianten zu erzeugen, die ein anderes als das natürliche bzw. verschiedene Cosubstrate verwerten
können. Der erste publizierte Erfolg umfasst die Änderung der Cosubstrat-Spezifität einer
Glutathion-Reduktase, wobei das Verhältnis der katalytischen Effizienz der Reduktion im Vergleich
zum NADPH-spezifischen WT um den Faktor 18.000 in Richtung NADH-Spezifität geändert
werden konnte (Scrutton et al., 1990).
Die Begründung, weshalb diese Art von Experimenten oft durchgeführt werden, beinhaltet
neben einem allgemeinen Erkenntnisgewinn über die Art und Weise der Cosubstrat-Bindung bei
verschiedenen
Enzym-Klassen
auch Aspekte
der
biotechnologischen
bzw.
industriellen
Anwendung: Enzyme mit NAD(H)-Spezifität werden häufig bevorzugt, u.a. da NADPH zehnmal
teurer ist als (das stabilere) NADH.
Auf dem Gebiet der rationalen Cosubstrat-Mutagenese ist die relative Häufung von
Veröffentlichungen auffällig, die sich mit dem Design von Enzymen des Xylitol-Abbaus
beschäftigen. D-Xylose stellt nach Glucose einen der am häufigsten in der Natur anzutreffenden
Zucker dar und ist wesentlicher Bestandteil von Hemicellulose(n). Es wird deshalb versucht,
nachhaltige Prozesse zu entwickeln, D-Xylose aus Abfällen in Form von pflanzlicher Biomasse in
Biotreibstoffe wie Bioethanol umzuwandeln und zur Energiegewinnung zu nutzen (Deluga et al.,
2004). Hierzu sollen biologische Organismen genutzt werden. Da jedoch die meisten ModellOrganismen, wie die Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) und das Bodenbakterium
Streptomyces coelicolor, D-Xylose nicht katabolisieren können, wurde versucht, die Gene des
Xylose-Metabolismus (Abb. 66, A) aus anderen Quellen, wie Pichia stipitis oder Gluconobacter
oxydans, in diesen ektopisch zu exprimieren (Übersicht z.B. Ostergaard et al., 2000; Jeffries und
Jin; 2004). Die genetisch veränderten Streptomyces-Stämme waren so in der Lage D-Xylose
abzubauen. Allerdings musste erst eine weitere Kohlenstoff-Quelle wie Glucose zugegeben werden.
Grund hierfür war wahrscheinlich ein Ungleichgewicht des intrazellulären Redoxpotentials,
welches durch die unterschiedlichen Cosubstrat-Spezifitäten der exprimierten Enzyme entsteht
(Ostergaard et al., 2000): Die Xylose-Reduktase (XR) ist NADPH-spezifisch, die XylitoseDehydrogenase (XDH) NAD+-abhängig. Watanabe et al. (2005) umgingen dieses Problem durch
das rationale Design einer NADP+-abhängigen XDH aus einer NAD+-spezifischen XDH aus Pichia
(EC 1.1.1.9; MDR-Enzym). Hierzu waren 3-4 Substitutionen notwendig. Später gelang durch den
Austausch von zwei Aminosäure-Resten das rationale Design einer XDH, welche NADP +spezifisch war und deren Aktivität der des WT-Proteins aus Gluconobacter (E.C. 1.1.1.9; SDR137
Enzym) entsprach (Ehrensberger et al., 2006). Umgekehrt gelang es später Khoury et al. (2009) die
Cosubstrat-Spezifität der XR aus Candida boidinii von NADPH auf NADH zu ändern.
Diese Beispiele legen zum einen gut die Bedeutung dar, die Mutagenese-Experimente auch
für die anwendungsorientierte Forschung haben können. Zum anderen zeigen sie, dass die in vivoKombination von Biosynthese-Enzymen mit unterschiedlichen Cosubstrat-Spezifitäten in einem
Organismus wie Saccharomyces cerevisiae möglich ist, aber zu Problemen führen kann.
Interessanterweise findet sich eine ähnliche Situation auch für die Biosynthese-Enzyme der
Cardenolide (Abb. 66, B).
Abb. 66: Analogie in den Reaktionen des biologischen Abbaus von D-Xylose in transgenen Hefen (A; nach
Ehrensberger et al., 2006 ) und in der Biosynthese der Cardenolide (B).
Da auch für die Cardenolid-Biosynthese das (mittelfristige) Ziel besteht, die verfügbaren
klonierten Biosynthese-Gene in vivo in Hefezellen zu kombinieren, erschien die Ableitung einer
NADH-spezifischen P5βR sinnvoll. Hinzu kommt, dass durch die Verfügbarkeit einer solchen
NADH-spezifischen P5βR zusätzlich eine in vitro-Kombination mit einer rekombinanten 3β-HSD
(Herl et al., 2007) und einer Cosubstrat-unabhängingen 3-Ketosteroidisomerase (Meitinger, 2011)
in Form eines sich selbst regenerierenden Systems möglich werden sollte (Abb. 67).
138
Abb. 67: Theoretisches System aus 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3β-HSD), Ketosteroidisomerase (KSI) und
mutierter NADH-spezifischer P5βR, das sich in vitro selbst regenerieren könnte.
In diesem System ersetzt die 3β-HSD die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, die im
„regenerierenden System“ des Standard-P5βR-Assays genutzt wird (vgl. II.2.3.6), um das
Cosubstrat der Reaktion der P5βR (NADPH) zu regenerieren (Stuhlemmer und Kreis; 1996; Herl et
al., 2006; Herl et al., 2009; Bauer et al, 2010; Munkert et al., 2011). Da die beiden WT-Enzyme
unterschiedliche Cosubstrate nutzen, wird diese Kopplung erst durch die Cosubstrat-Mutagenese
eines der beiden Biosynthese-Enzyme möglich gemacht.
Auf Grund der aufgeklärten Kristallstruktur wurde die DlP5βR auch bei dieser
Versuchsreihe als Template für die Mutagenese-Experimente ausgewählt, v.a. auch deshalb, weil
hier eine Co-Kristallisation mit dem Cosubstrat gelungen ist (Thorn et al., 2008). Eine Änderung
der Cosubstrat-Spezifität zu erreichen, ist in manchen Fällen dadurch gelungen, dass Enzyme mit
ähnlicher Struktur und Funktion identifiziert und analysiert werden konnten, z.B. durch den
Vergleich einer typischen NADPH-spezifischen XR mit einer NADH-bevorzugenden XR aus
Candida sp (Lee et al., 2003). In der Gruppe der P5βR gibt es jedoch keine orthologen Enzyme mit
experimentell nachgewiesener Spezifität für NADH. Es konnte aber auf einen großen
Erfahrungsschatz zurückgegriffen werden, da es sich um ein Protein aus der SDR-Familie mit einer
charakteristischen Rossmann-Faltung handelt, welche in der Vergangenheit bereits sehr gut
untersucht wurde. Diese besteht aus sechs β-Faltblättern, die von α-Helices umgeben werden und
für die Cosubstrat-Bindung verantwortlich sind (Rossmann und Argos, 1976). In der Sequenz der
139
P5βR findet man hier das charakteristische, Cosubstrat-bindende Gx(x)Gx(x)G-Motiv, das für die
„extended SDR“-Enzyme typisch ist (Carugo und Argos, 1997; Kallberg et al., 2002). Weil sich
NADPH und NADH nur durch eine Phosphatgruppe, die als Ester an die Position 2´ der AdenosinRibose gebunden vorliegt, unterscheiden und mit dieser Gruppe nur eine begrenzte Anzahl von
Aminosäuren interagieren können, existieren bestimmte „Marker-Aminosäuren“, die auf das
Rossmann-Motiv in der Aminosäure-Sequenz folgen (Baker et al., 1992; Persson et al., 2003).
Diese entsprechen in der D. lanata Struktur dem Motiv II (Thorn et al., 2008). In NADP +bevorzugenden Enzymen findet man hier basische (d.h. positiv geladene) Reste, die mit der negativ
geladenen Phosphatgruppe ionische Wechselwirkungen ausbilden können (Carugo und Argos,
1997). Es handelt sich hierbei i.d.R. um 1-2 Arginin-Reste (Scrutton et al., 1990), die auch in der
Cosubstrat-Bindetasche der DlP5βR zu finden sind (Arg-63 und Arg-64; Thorn et al., 2008; Abb.
68).
Abb. 68: Cosubstrat-Bindungetasche der rDlP5βR. Die beiden grün markierten Arginin-Reste sind wesentlich mitverantwortlich für die Diskriminierung zwischen NADPH und NADH (nach Thorn et al., 2008).
Über den Austausch dieser beiden Arginin-Reste (gegen Asparaginsäure) wurde in der
vorliegenden Arbeit gezeigt, dass v.a. der Rest Arg-63 die Bindung dieser Phosphatgruppe
übernimmt, da dessen Austausch einen vollkommenen Verlust der Funktion nach sich zieht, obwohl
die Kristallstruktur zeigt, dass beide Phosphatgruppen interagieren (Thorn et al., 2008). Im
Gegensatz zu den Aminosäuren mit basischen Seitenketten, findet sich bei den NAD +bevorzugenden Enzymen eine Wechselwirkung zwischen den beiden Hydroxlygruppen der
Adenosin-Riboseeinheit mit der Carboxyl-Seitengruppe einer sauren Aminosäure (Carugo und
140
Argos, 1997). Für NAD+-spezifische Enzyme handelt es sich fast ausnahmslos um einen
Asparaginsäure-Rest, bei Dehydrogenasen/Reduktasen mit FAD-Spezifität wurde eine ähnliche
Situation beschrieben, allerdings ist als saure Aminosäure i.d.R. ein Glutaminsäure-Rest vorhanden.
Kallberg und Persson (2006) entwickelten aus diesen Fakten einen Algorithmus, mit dem es
möglich war, zu 80 Prozent das richtige Cosubstrat (NAD +, NADP+, FAD) einer beliebigen
Dehydrogenase/Reduktase in silico zu bestimmen. Trotz all dieses Wissens ist der Erfolg einer
Mutagenese im allgemeinen nicht vorhersehbar, v.a. da die Diskriminierung zwischen NADH und
NADPH in der Praxis eine Konsequenz der gesamten Bindetasche ist und nicht nur von einzelnen
Resten. So besitzt NADPH viel größere Freiheitsgrade in seiner Konformation als NADH und
bedingt dadurch wurden - im Gegensatz zu NADH – sehr variable Protein-Cosubstrat-Interaktionen
beschrieben (Carugo und Argos, 1997). Vermutlich aus diesem Grund sind nicht viele Fälle
beschrieben, in denen eine vollständige Umkehr der Cosubstrat-Spezifität erfolgreich war, bei
denen die enzymatische Aktivität gleichzeitig vollständig erhalten blieb. Eine Tabelle mit einer
Zusammenfassung von erfolgreichen „Cofactor Engineering“-Arbeiten findet sich in Khoury et al.
(2009).
Im Falle der DlP5βR wurde über in silico-Mutagenese und Überlagerung der CosubstratBindetasche der Kristallstruktur mit der von NADH-abhängigen SDR-Enzymen die Positionierung
des postulierten sauren Restes abgeleitet. Es konnte auf diese Weise eindeutig Ala-62 als Ziel der
Mutagenese identifiziert werden. Glutaminsäure konnte auf Grund ihrer Größe nicht in der
Bindetasche platziert werden. Die abgeleitete Substitution von Ala-62 deckt sich mit
Literaturangaben, die beschreiben, dass an der Position des sauren Asparaginsäure-Restes von
NAD+-spezifischen Enzymen in den NADP +-spezifischen Enzymen meist eine kleine, ungeladene
Aminosäure wie Alanin, Glycin oder Serin gefunden werden kann (Watanabe et al., 2005). Ein
analoges Vorgehen, das ebenfalls strukturelle Alignments von Enzymen unterschiedlicher Spezifität
beinhaltete, führte auch bei Mutagenese der XDH durch Ehrensberger et al. (2006) zum Ziel. Um
ein funktionelles Protein zu erhalten, mussten zusätzlich die beiden basischen Arginine aus der
Bindetasche entfernt werden. Da es hier keine Vorgaben in Form von streng konservierten Resten
gibt, wurde das Substitutionsmuster der Struktur mit der größten Übereinstimmung im Verlauf der
Kohlenstoffkette der Cosubstrat-Bindetasche gewählt (PDB 1zem): R63M_R64N. Die Substitution
des Arginin-63, das im Kristall benachbart zum Adenin-Ring des Cosubstrats gefunden werden
kann, gegen Methionin und umgekehrt, wurde bereits in mehreren anderen Arbeiten beschrieben
(Scrutton et al., 1990; Ehrensberger et al., 2006). Da das dreifach mutierte Protein wie sich zeigt
zwar nun NADH-spezifisch, aber noch nicht ausreichend aktiv war, wurden die Ergebnisse der
141
Aktivitätsmutagenese-Experimente hinzugezogen und zusätzlich Asn-205 gegen Methionin ersetzt.
Diese Vierfach-Mutante entsprach in ihrer Aktivität, bezogen auf die Reduktion von Progesteron,
etwa dem WT. Es steht damit nun ein rekombinantes Mutein der DlP5βR zur Verfügung, das
NADH-spezifisch ist und für die in vitro- und in vivo-Kombination mit anderen BiosyntheseEnzymen optimale Voraussetzungen zeigt. Ob es in diesen Versuchen, nach strengen Maßstäben,
gelungen ist, die Cosubstrat-Spezifität im Vergleich mit dem WT ohne Aktivitätsverlust zu ändern,
lässt sich nicht eindeutig beantworten, da zusätzlich eine “hot spot“-Aminosäure mutiert wurde, um
die Aktivität zu verändern. Dies ist jedoch für die Praxis nicht von Bedeutung, da diese mehrfach
mutierte „Designer-P5βR“ alle Voraussetzungen erfüllte, um die ersten Kombinationsversuche
durchzuführen. Die erfolgreiche und stereoselektive Umwandlung von extern zugeführtem
Progesteron durch eine „Reihenschaltung“ des „Cosubstrat-Muteins“ der DlP5βR ( DlP5βRnn-13)
und der gereinigten D. lanata 3β-HSD (Herl et al., 2007) konnte in der vorliegenden Arbeit bereits
gezeigt werden. Ob sich dies auch auf kleine Substrate anwenden lässt, muss noch untersucht
werden. Dafür bestehen jedoch gute Chancen, da sowohl der WT der P5βR, als auch die
untersuchten 3β-HSDs stark promisken Charakter aufweisen (Herl et al., 2007; Burda et al., 2009;
Bauer et al., 2010). Damit würde sich dieses System sehr gut für biotechnologische Anwendungen
eignen (Bornscheuer und Kazlauskas, 2004). Während in der Biosynthese-Forschung nach
heutigem Stand i.d.R. nur einzelne Enzyme kloniert und getrennt charakterisiert bzw. analysiert
werden (z.B. Tropinon-Reduktasen durch Brock et al., 2008), entspricht das Vorgehen, einen Teil
der Cardenolid-Biosynthese(-reaktionen) mit Hilfe des Vierfach-Muteins in vitro ablaufen zu lassen,
den Ansätzen der „Kombinatorischen Biosynthese“-Forschung. Dabei sollen, wie in den
vorliegenden Experimenten, Chemikalien mit Zellen, Zellextrakten oder (gereinigten) Enzymen
verschiedener Organismen biotransformiert werden (Übersicht von Pollier et al., 2011), wobei es im
Bereich der Cardenolid-Biosynthese bisher keine derartigen Versuche gab.
Zusammenfassend konnte zusätzlich zur Analyse der Substrat-Bindetasche durch SDM, die
den Einfluss einzelner Reste auf die Aktivität der rekombinanten P5βR klären konnte, in diesem
Teil der Arbeit die Cosubstrat-Bindetasche durch in silico-Methoden analysiert und durch gezielte
Veränderungen von Aminosäure-Resten das Verständnis für die Struktur und Funktion der P5βR
weiter vertieft werden. Letztlich flossen die Ergebnisse aus diesen beiden Teilen der Arbeit im
Design des „Cosubstrat-Muteins“ zusammen und erlaubten so die Ableitung eines Enzyms, das nun
weiter gewinnbringend angewendet werden kann, um in letzter Konsequenz auch die Biosynthese
der Cardenolide besser zu verstehen.
142
V ZUSAMMENFASSUNG
Ein wesentlicher Schritt in der 5β-Cardenolid-Biosynthese besteht in der stereo-selektiven
Reduktion der Δ4,5-C=C-Doppelbindung der Steroidvorstufe (vermutlich Progesteron), da hierbei
die charakteristische cis-Verknüpfung der Ringe A/B ins Molekül eingeführt wird. Die Reaktion
wird katalysiert durch Progesteron 5β-Reduktasen (P5βR), die Gegenstand dieser Arbeit sind. Um
die Aktivitätsunterschiede der rekombinanten Enzyme aus der Cardenolid-führenden Art Digitalis
lanata (rDlP5βR) und der cardenolidfreien Art Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) hinsichtlich der
Reduktion von Progesteron zu erklären und mit gezielter Mutagenese rational zu verändern, wurden
zunächst weitere orthologe P5βR-cDNAs aus verschiedenen Cardenolid-akkumulierenden und
Cardenolid-freien Spezies kloniert (u.a. aus A. belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N.
tabacum). Im Vordergrund stand bei den Versuchen die funktionelle Expression dieser Enzyme in
E. coli. Diese gelang u.a. bei den cDNAs aus E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum und M.
piperita. Um die Enzymkinetik der rekombinanten Proteine in vitro zu bestimmen, wurde eine
photometrische Messmethode für P5βR adaptiert. Der promiske Charakter der P5βR wurde weiter
untermauert und dessen Bedeutung für die Biosynthese diskutiert.
Mit Hilfe von erzeugten Struktur-Modellen der funktionell exprimierten P5βR konnten
sieben Aminosäure-Reste identifiziert werden, die strukturell hoch konserviert im inneren Teil der
putativen Substrat-Bindetasche aller Proteine vorliegen (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr179, Met-215, Phe-343; Bauer et al., 2010). Von diesen Resten wurden bisher nur zwei als
katalytisch bedeutsam beschrieben. Die konservierten Reste in der DlP5βR wurden einzeln durch
Alanin ersetzt und die Aktivität der Muteine untersucht. Vor allem die essentielle Rolle von Phe-153
für die enzymatische Aktivität der DlP5βR konnte demonstriert werden. In Verbindung mit in silicoÜberlegungen wurden Phe-153 und Phe-343 eine zentrale Bedeutung für die Substrat-Bindung bei
den P5βR-artigen Proteinen zugesprochen.
Für die rationale Mutagenese zur Steigerung der Enzymaktivität der rDlP5βR wurden drei
Positionen innerhalb der Aminosäure-Sequenz als „hot-spots“ identifiziert (Tyr-156; Asn-205; Ser248). Dies geschah über eine Kombination aus Sequenz- und Aktivitätsvergleichen der neu
exprimierten Enzyme („bioactivity guided“). Durch die einfache Mutagenese von zwei dieser
Positionen konnte die katalytische Aktivität der DlP5βR stark verbessert werden (bis Faktor 9,
bezogen auf kcat/Km). Dies wurde zurückgeführt auf eine größere Affinität der Bindetasche zum
Substrat. Der Aktivitätsunterschied der rDlP5βR und der rAtP5βR konnte somit erklärt werden.
Andere publizierte in silico-Theorien wurden überprüft und konnten experimentell widerlegt
143
werden.
Eine „full-length“ DlP5βR wurde kloniert und funktionell exprimiert. Das Gen wurde über
Deletionsmutagenese rational verkürzt.
Über einen rationalen Mutagenese-Ansatz konnte zusätzlich durch die Substitution von vier
Aminosäuren (Ala-62, Arg-63; Arg-64; Asn-205) die Cosubstrat-Spezifität der rDlP5βR von
NADPH auf NADH (ohne Verlust an Enzymaktivität) geändert werden, um ein Enzym für die
Kombination mit anderen NADH-spezifischen, rekombinanten Biosynthese-Enzymen zu besitzen.
144
V SUMMARY
A main step in the biosynthesis of 5β-cardenolides is the stereo-specific reduction of the Δ4,5C=C bond of the steroid precursor (progesterone), which introduces the characteristic cisconnection between the rings A/B. This reaction is catalysed by progesterone 5β-reductases (P5βR),
which have been in the focus of this work. In order to find an explanation for the differences in the
activities of the recombinant enzymes from the cardenolide-containing Digitalis lanata (rDlP5βR)
and the cardenolid-free Arabidopsis thaliana (rAtP5βR) for the reduction of progesterone and to
change it by means of rational mutagenesis, an additional number of orthologous P5βR-cDNAs
from cardenolide-accumulation and cardenolide-free species have been cloned (e.g. from A.
belladonna, C. procera, S. lycopersicon, N. tabacum). The primary aim of these experiments,
however, was the functional expression of these enzymes. This was demonstrated for the cDNAs of
E. crepidifolium, E. rhaeticum, G. fruticosum and M. Piperita. For the in vitro determination of the
enzyme kinetics of the recombinant proteins, a photometric method has been developed.
Using the data of all functionally expressed P5βR for homology modeling experiments, a
number of seven highly-conserved amino acid residues could be deduced within the inner part of
the putative substrate binding-sites of all proteins (Trp-106, Gly-145, Lys-147, Phe-153, Tyr-179,
Met-215, Phe-343). Just two of these residues have been described to be catalytically important,
formerly. In the DlP5βR all of these conserved residues have individually been substituted against
alanine and the enzymatic activities of the muteins have been analysed. Especially the essential role
of the Phe-153 residue for the enzymatic activity of the DlP5βR could be demonstrated. In
combination with in silico methods Phe-153 and Phe-343 were identified to be important for the
substrat-fixation in P5βR-like enzymes.
Three „hot-spot“ positions (Tyr-156; Asn-205; Ser-248) for the site-directed mutagenesis
(SDM) experiments - in order to increase the enzymatic activity of the DlP5βR - were found within
its amino acid sequence. They were deduced by combining comparison of sequences and activities
of the newly expressed enzymes („bioactivity guided“). By substituting the residues at two of these
positions the catalytic activity of the rDlP5βR was highly increased (by a factor of 9; k cat/Km). This
was due to an increased affinity of the binding-site for the substrate. Hence, the observed
differences in the activity level of the rDlP5βR and the rAtP5βR could be explained. Other in silico
theories were tested and could experimentally be disproved.
A „full-length“ DlP5βR was cloned and functionally expressed. Subsequently, parts of the
ORF were deleted by rational mutagenesis.
145
With rational designed mutagenesis experiments the cosubstrate-specificity of the rDlP5βR
was „switched“ from NADPH to NADH by the substitution of four amino acid residues (Ala-62,
Arg-63; Arg-64; Asn-205) in order to gain an enzyme for the in vitro combination with other
NADH-specific recombinant biosynthesis-enzymes.
146
VI LITERATURVERZEICHNIS*
(*erstellt mit der „JabRef“-Software, Version 2.7, 2011)
ABDA
Deutscher Arzneimittel-Codex (DAC)
Govi Verlag, 2009
Abe, I. & Morita, H.
Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases.
Nat Prod Rep, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo
113-0033, Japan. [email protected], 2010, Vol. 27(6), pp. 809-838
Alméras, E., Stolz, S., Vollenweider, S., Reymond, P., Mène-Saffrané, L. & Farmer, E.E.
Reactive electrophile species activate defense gene expression in Arabidopsis.
Plant J, Gene Expression Laboratory, University of Lausanne, Biology Building, Switzerland., 2003, Vol. 34(2), pp.
205-216
Bagrov, A.Y. & Shapiro, J.I.
Endogenous digitalis: pathophysiologic roles and therapeutic applications.
Nat Clin Pract Nephrol, Hypertension Unit at Laboratory of Cardiovascular Science, Intramural Research Program,
National Institute on Aging, NIH, Baltimore 21224, MD, USA. [email protected], 2008, Vol. 4(7), pp. 378-392
Baker, P.J., Britton, K.L., Rice, D.W., Rob, A. & Stillman, T.J.
Structural consequences of sequence patterns in the fingerprint region of the nucleotide binding fold. Implications for
nucleotide specificity.
J Mol Biol, Krebs Institute for Biomolecular Research, Department of Molecular Biology and Biotechnology,
University of Sheffield, U.K., 1992, Vol. 228(2), pp. 662-671
Baneyx, F.
Recombinant protein expression in Escherichia coli.
Curr Opin Biotechnol, Department of Chemical Engineering University of Washington Box 351750, Seattle, WA 98195,
USA. [email protected], 1999, Vol. 10(5), pp. 411-421
Baneyx, F. & Mujacic, M.
Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia coli.
Nat Biotechnol, Departments of Chemical Engineering and Bioengineering, University of Washington, Box 351750,
Seattle, Washington 98195, USA. [email protected], 2004, Vol. 22(11), pp. 1399-1408
Bar-Even, A., Noor, E., Savir, Y., Liebermeister, W., Davidi, D., Tawfik, D.S. & Milo, R.
The moderately efficient enzyme: evolutionary and physicochemical trends shaping enzyme parameters.
Biochemistry, Department of Plant Sciences, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel., 2011, Vol. 50(21),
pp. 4402-4410
Battey, J.N.D., Kopp, J., Bordoli, L., Read, R.J., Clarke, N.D. & Schwede, T.
Automated server predictions in CASP7.
Proteins, Biozentrum, University of Basel, Basel, Switzerland., 2007, Vol. 69 Suppl 8, pp. 68-82
Bauer, P., Munkert, J., Brydziun, M., Burda, E., Müller-Uri, F., Gröger, H., Muller, Y.A. & Kreis, W.
Highly conserved progesterone 5 beta-reductase genes (P5 beta R) from 5 beta-cardenolide-free and 5 beta-cardenolideproducing angiosperms.
Phytochemistry, Department of Biology, University of Erlangen-Nuremberg, Staudtstr. 5, 91058 Erlangen, Germany.,
2010, Vol. 71(13), pp. 1495-1505
147
Benkert, P., Künzli, M. & Schwede, T.
QMEAN server for protein model quality estimation.
Nucleic Acids Res, Biozentrum, University of Basel, Switzerland., 2009, Vol. 37(Web Server issue), pp. W510-W514
Berg, J.M., Tymoczko, J.L. & Stryer, L.
Biochemie
Spektrum Akademischer Verlag, 2003
Bertol, J.W., Rigotto, C., de Pádua, R.M., Kreis, W., Barardi, C.R.M., Braga, F.C. & Simões, C.M.O.
Antiherpes activity of glucoevatromonoside, a cardenolide isolated from a Brazilian cultivar of Digitalis lanata.
Antiviral Res, Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC,
Brazil., 2011, Vol. 92(1), pp. 73-80
Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J. & Schwede, T.
Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace.
Nat Protoc, Biozentrum, University of Basel, Klingelbergstrasse 50-70, CH 4056 Basel, Switzerland., 2009, Vol. 4(1),
pp. 1-13
Bornscheuer, U.T. & Kazlauskas, R.J.
Catalytic promiscuity in biocatalysis: using old enzymes to form new bonds and follow new pathways.
Angew Chem Int Ed Engl, Institute of Chemistry and Biochemistry, Department of Technical Chemistry and
Biotechnology, Greifswald University, Soldmannstrasse 16, 17487 Greifswald, Germany. [email protected], 2004, Vol. 43(45), pp. 6032-6040
Bornscheuer, U.T. & Pohl, M.
Improved biocatalysts by directed evolution and rational protein design.
Curr Opin Chem Biol, Biotechnology, Greifswald University, Germany. [email protected], 2001, Vol.
5(2), pp. 137-143
Bradford, M.M.
A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding.
Anal Biochem, 1976, Vol. 72, pp. 248-254
Branden, C. & Tooze, J.
Introduction to Protein Structure.
Taylor & Francis, 1998
Brock, A., Brandt, W. & Dräger, B.
The functional divergence of short-chain dehydrogenases involved in tropinone reduction.
Plant J, Institute of Pharmacy, Faculty of Science I, Martin Luther University Halle-Wittenberg, Hoher Weg 8, D-06120
Halle/Saale, Germany., 2008, Vol. 54(3), pp. 388-401
Brown, T.
Gene und Genom: Lehrbuch der molekularen Genetik
Spektrum Akademischer Verlag, 2007
Bräuchler, C., Meimberg, H. & Heubl, G.
Molecular phylogeny of the genera Digitalis L. and
Isoplexis (Lindley) Loudon (Veronicaceae) based
on ITS- and trnL-F sequences.
Pl Syst Evol, 2004, Vol. 248, pp. 111-128
148
Bucher, M.H., Evdokimov, A.G. & Waugh, D.S.
Differential effects of short affinity tags on the crystallization of Pyrococcus furiosus maltodextrin-binding protein.
Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, National Cancer Institute at Frederick, PO Box B, Frederick, MD 21702, USA.,
2002, Vol. 58(Pt 3), pp. 392-397
Burda, E., Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W. & Gröger, H.
Recombinant Steroid Reductases as Biocatalysts for the Reduction of Activated C=C-Double Bonds in Acyclic and
Monocyclic Molecules
Adv. Synth. Catal., 2009, Vol. 351, pp. 2787-2790
Busso, D., Kim, R. & Kim, S.-H.
Expression of soluble recombinant proteins in a cell-free system using a 96-well format.
J Biochem Biophys Methods, Department of Chemistry, University of California, Berkeley, 314 Calvin Lab MS5230,
CA 94720-5230, USA. [email protected], 2003, Vol. 55(3), pp. 233-240
Cantor, C. & Schimmel, P.
Biophysical Chemistry, Part 2: Techniques for the Study of Biological Structure and Function (Pt. 2)
W. H. Freeman and Company, 1980
Carugo, O. & Argos, P.
NADP-dependent enzymes. I: Conserved stereochemistry of cofactor binding.
Proteins, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany., 1997, Vol. 28(1), pp. 10-28
Chen, S., Galan, M.C., Coltharp, C. & O'Connor, S.E.
Redesign of a central enzyme in alkaloid biosynthesis.
Chem Biol, Massachusetts Institute of Technology, Department of Chemistry, 18-592, Cambridge, Massachusetts
02139, USA., 2006, Vol. 13(11), pp. 1137-1141
Cheong, J., Choi, Y.D.
Methyl jasmonate as a vital substance in plants.
TRENDS in Genetics, 2003 Vol. 19, No 7
Chica, R.A., Doucet, N. & Pelletier, J.N.
Semi-rational approaches to engineering enzyme activity: combining the benefits of directed evolution and rational
design.
Curr Opin Biotechnol, Département de chimie, Université de Montréal, CP 6128, Succursale Centre-Ville, Montréal,
Québec, H3C 3J7, Canada., 2005, Vol. 16(4), pp. 378-384
Chouard, T.
Structural biology: Breaking the protein rules.
Nature, 2011, Vol. 471(7337), pp. 151-153
Clemente, E., Müller-Uri, F., Nebauer, S., Segura, J., Kreis, W. & Arrillaga, I.
Wild Crop Relatives: Genomic and Breedings Resources (Chapter 5 - Digitalis)
Kole, C. (ed.)
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2011
Deluga, G.A., Salge, J.R., Schmidt, L.D. & Verykios, X.E.
Renewable hydrogen from ethanol by autothermal reforming.
Science, Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Minnesota, Minneapolis MN
55455, USA., 2004, Vol. 303(5660), pp. 993-997
149
Demiryürek, A.T. & Demiryürek, S.
Cardiotoxicity of digitalis glycosides: roles of autonomic pathways, autacoids and ion channels.
Auton Autacoid Pharmacol, Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Gaziantep, Gaziantep,
Turkey., 2005, Vol. 25(2), pp. 35-52
Di Costanzo, L., Drury, J.E., Christianson, D.W. & Penning, T.M.
Structure and catalytic mechanism of human steroid 5beta-reductase (AKR1D1).
Mol Cell Endocrinol, Roy and Diana Vagelos Laboratories, Department of Chemistry, University of Pennsylvania,
Philadelphia, PA 19104-6323, USA., 2009, Vol. 301(1-2), pp. 191-198
Dobler, S., Petschenka, G. & Pankoke, H.
Coping with toxic plant compounds--the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides.
Phytochemistry, Biocenter Grindel, Hamburg University, Martin-Luther-King Platz 3, 20146 Hamburg, Germany.
[email protected], 2011, Vol. 72(13), pp. 1593-1604
Dunford, H.
Horseradish peroxidase: structure and kinetic properties
Peroxidase in Chemistry and Biology, 1991, Vol. II, pp. 1-24
Egerer-Sieber, C., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W. & Muller, Y.A.
Crystallization and preliminary crystallographic analysis of selenomethionine-labelled progesterone 5beta-reductase
from Digitalis lanata Ehrh.
Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, Lehrstuhl für Biotechnik, Institut für Biologie, FriedrichAlexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Henkestrasse 91, D-91052 Erlangen, Germany., 2006, Vol. 62(Pt 3), pp.
186-188
Ehrensberger, A.H., Elling, R.A. & Wilson, D.K.
Structure-guided engineering of xylitol dehydrogenase cosubstrate specificity.
Structure, Section of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, Davis, California 95616, USA.,
2006, Vol. 14(3), pp. 567-575
Eisenthal, R., Danson, M.J. & Hough, D.W.
Catalytic efficiency and kcat/KM: a useful comparator?
Trends Biotechnol, Biochemistry, University of Bath, Bath, UK., 2007, Vol. 25(6), pp. 247-249
Englert, L., Biela, A., Zayed, M., Heine, A., Hangauer, D. & Klebe, G.
Displacement of disordered water molecules from hydrophobic pocket creates enthalpic signature: binding of
phosphonamidate to the S?'-pocket of thermolysin.
Biochim Biophys Acta, Department of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-University Marburg, 35032 Marburg,
Germany., 2010, Vol. 1800(11), pp. 1192-1202
Ernst, M., de Padua, R.M., Herl, V., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Expression of 3beta-HSD and P5betaR, genes respectively coding for Delta5-3beta-hydroxysteroid dehydrogenase and
progesterone 5beta-reductase, in leaves and cell cultures of Digitalis lanata EHRH.
Planta Med, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg, Erlangen, Germany., 2010, Vol. 76(9), pp. 923-927
Facchini, P.J.
Regulation of alkaloid biosynthesis in plants.
Alkaloids Chem Biol, of Calgary, Calgary, Alberta, Canada., 2006, Vol. 63, pp. 1-44
Facchini, P.J., Bird, D.A. & St-Pierre, B.
Can Arabidopsis make complex alkaloids?
Trends Plant Sci, Department of Biological Sciences, University of Calgary, Calgary, Alberta, Canada T2N 1N4.
150
[email protected], 2004, Vol. 9(3), pp. 116-122
Filling, C., Berndt, K.D., Benach, J., Knapp, S., Prozorovski, T., Nordling, E., Ladenstein, R., Jörnvall, H. &
Oppermann, U.
Critical residues for structure and catalysis in short-chain dehydrogenases/reductases.
J Biol Chem, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, SE-171 77 Stockholm,
Sweden., 2002, Vol. 277(28), pp. 25677-25684
Finsterbusch, A., Lindemann, P., Grimm, R., Eckerskorn, C. & Luckner, M.
Delta(5)-3beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. - a multifunctional enzyme in steroid
metabolism?
Planta, Universität Halle, Institut für Pharmazeutische Biologie, Hoher Weg 8, D-06120 Halle, Germany., 1999, Vol.
209(4), pp. 478-486
Firn, R.D.
Nature's Chemicals: The Natural Products That Shaped Our World
Oxford University Press, 2010
Firn, R.D. & Jones, C.G.
A Darwinian view of metabolism: molecular properties determine fitness.
J Exp Bot, Department of Biology, University of York, York, UK. [email protected], 2009, Vol. 60(3), pp. 719-726
Firn, R.D. & Jones, C.G.
The evolution of secondary metabolism - a unifying model.
Mol Microbiol, Institute of Ecosystem Studies (IES), PO Box AB, Millbrook, NY 12545, USA., 2000, Vol. 37(5), pp.
989-994
Fishelovitch, D., Shaik, S., Wolfson, H.J. & Nussinov, R.
Theoretical characterization of substrate access/exit channels in the human cytochrome P450 3A4 enzyme: involvement
of phenylalanine residues in the gating mechanism.
J Phys Chem B, Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Sackler Institute of Molecular Medicine,
Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, Tel Aviv 69978, Israel., 2009, Vol. 113(39), pp. 13018-13025
Fozzard, H.A. & Sheets, M.F.
Cellular mechanism of action of cardiac glycosides.
J Am Coll Cardiol, 1985, Vol. 5(5 Suppl A), pp. 10A-15A
Freydank, A.-C., Brandt, W. & Dräger, B.
Protein structure modeling indicates hexahistidine-tag interference with enzyme activity.
Proteins, Faculty of Science I, Institute of Pharmacy, Martin-Luther University Halle-Wittenberg, Hoher Weg 8, D06120 Halle/Saale, Germany., 2008, Vol. 72(1), pp. 173-183
Furuya, T., Hirotani, M. & Shinohara, T.
Biotransformation of digitoxin by suspension callus culture of Digitalis purpurea.
Chem Pharm Bull (Tokyo), 1970, Vol. 18(5), pp. 1080-1082
Gavidia, I., Tarrío, R., Rodríguez-Trelles, F., Pérez-Bermúdez, P. & Seitz, H.U.
Plant progesterone 5beta-reductase is not homologous to the animal enzyme. Molecular evolutionary characterization of
P5betaR from Digitalis purpurea.
Phytochemistry, 2007, Vol. 68(6), pp. 853-864
Greenfield, N. & Fasman, G.D.
Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation.
Biochemistry, 1969, Vol. 8(10), pp. 4108-4116
151
Grigat
Die Progesteron-5α-Reduktase - Hemmbarkeit und Einflüsse auf die Cardenolid-Biosynthese in D. lanata und I.
canariensis
FAU Erlangen, 2005
GROS, E.G. & LEETE, E.
BIOSYNTHESIS OF PLANT STEROIDS. II. THE DISTRIBUTION OF ACTIVITY IN DIGITOXIGENIN DERIVED
FROM MEVALONIC ACID-2-C-14.
J Am Chem Soc, 1965, Vol. 87, pp. 3479-3484
Grotewold, E.
Plant metabolic diversity: a regulatory perspective.
Trends Plant Sci, Department of Plant Cellular and Molecular Biology and Plant Biotechnology Center, The Ohio State
University, Columbus, OH 43210, USA. [email protected], 2005, Vol. 10(2), pp. 57-62
Gärtner, D.E., Keilholz, W. & Seitz, H.U.
Purification, characterization and partial peptide microsequencing of progesterone 5 beta-reductase from shoot cultures
of Digitalis purpurea.
Eur J Biochem, Botanisches Institut der Universität, Tübingen, Germany., 1994, Vol. 225(3), pp. 1125-1132
Gärtner, D.E., Wendroth, S. & Seitz, H.U.
A stereospecific enzyme of the putative biosynthetic pathway of cardenolides. Characterization of a progesterone 5
beta-reductase from leaves of Digitalis purpurea L.
FEBS Lett, Universität Tübingen, Institut für Allgemeine Botanik und Pflanzenphysiologie, FRG., 1990, Vol. 271(1-2),
pp. 239-242
Hall, M., Stueckler, C., Kroutil, W., Macheroux, P. & Faber, K.
Asymmetric bioreduction of activated alkenes using cloned 12-oxophytodienoate reductase isoenzymes OPR-1 and
OPR-3 from Lycopersicon esculentum (tomato): a striking change of stereoselectivity.
Angew Chem Int Ed Engl, Department of Chemistry, Organic and Bioorganic Chemistry, University of Graz,
Heinrichstrasse 28, 8010 Graz, Austria., 2007, Vol. 46(21), pp. 3934-3937
Hanes, C.S.
The reversible inhibition of beta-malt-amylase by ascorbic acid and related compounds.
Biochem J, The Ontario Research Foundation, Toronto, Canada., 1935, Vol. 29(11), pp. 2588-2603
Haussmann, W., Kreis, W., Stuhlemmer, U. & Reinhard, E.
Effects of various pregnanes and two 23-nor-5-cholenic acids on cardenolide accumulation in cell and organ cultures of
Digitalis lanata.
Planta Med, Pharmazeutisches Institut, Eberhard-Karls-Universität, Auf der Morgenstelle 8, D-72076 Tübingen,
Germany., 1997, Vol. 63(5), pp. 446-453
Herl, V., Albach, D.C., Müller-Uri, F., Bräuchler, C., Heubl, G. & Kreis, W.
Using progesterone 5β-reductase, a gene encoding a key enzyme in the cardenolide biosynthesis, to infer the phylogeny
of the genus Digitalis
Pl Syst Evol, 2007, Vol. 271, pp. 65-78
Herl, V., Fischer, G., Bötsch, R., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Molecular cloning and expression of progesterone 5beta-reductase (5beta-POR) from Isoplexis canariensis.
Planta Med, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,
Germany., 2006, Vol. 72(12), pp. 1163-1165
152
Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Molecular cloning and heterologous expression of progesterone 5beta-reductase from Digitalis lanata Ehrh.
Phytochemistry, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg,
Staudtstr. 5, D-91058 Erlangen, Germany. [email protected], 2006, Vol. 67(3), pp. 225-231
Herl, V., Fischer, G., Reva, V.A., Stiebritz, M., Muller, Y.A., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
The VEP1 gene (At4g24220) encodes a short-chain dehydrogenase/reductase with 3-oxo-Delta4,5-steroid 5betareductase activity in Arabidopsis thaliana L.
Biochimie, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität ErlangenNürnberg, Staudtstrasse 5, 91058 Erlangen, Germany., 2009, Vol. 91(4), pp. 517-525
Herl, V., Frankenstein, J., Meitinger, N., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Delta 5-3beta-hydroxysteroid dehydrogenase (3 beta HSD) from Digitalis lanata. Heterologous expression and
characterisation of the recombinant enzyme.
Planta Med, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen,
Germany., 2007, Vol. 73(7), pp. 704-710
Hobbs, R.E.
Digoxin's effect on mortality and hospitalization in heart failure: implications of the DIG study. Digitalis Investigation
Group.
Cleve Clin J Med, Section of Heart Failure and Cardiac Transplant Medicine, Cleveland Clinic, Cleveland Clinic
Foundation, OH 44195, USA., 1997, Vol. 64(5), pp. 234-237
Holm, L. & Sander, C.
Dali: a network tool for protein structure comparison.
Trends Biochem Sci, Protein Design Group, European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Germany., 1995, Vol.
20(11), pp. 478-480
HOLZWARTH, G. & DOTY, P.
THE ULTRAVIOLET CIRCULAR DICHROISM OF POLYPEPTIDES.
J Am Chem Soc, 1965, Vol. 87, pp. 218-228
Hugentobler, U. & Renwick, J.A.A.
Effects of plant nutrition on the balance of insect relevant cardenolides and glucosinolates in Erysimum cheiranthoides
OECOLOGIA, 1995, Vol. 102 (1), pp. 95-101
Jaehde, U., Radziwill, R., Mühlebach, S. & Schunack, W.
Lehrbuch der Klinischen Pharmazie
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2003
Jalloul, A., Montillet, J.L., Assigbetsé, K., Agnel, J.P., Delannoy, E., Triantaphylidès, C., Daniel, J.F.,
Marmey, P., Geiger, J.P. & Nicole, M.
Lipid peroxidation in cotton: Xanthomonas interactions and the role of lipoxygenases during the hypersensitive
reaction.
Plant J, IRD-UMR DGPC (Diversité et Génome des Plantes Cultivées; AGRO-M, CIRAD, INRA, IRD), BP 5045,
34032 Montpellier, France., 2002, Vol. 32(1), pp. 1-12
Janeczko, A.
The presence and activity of progesterone in the plant kingdom.
Steroids, Institute of Plant Physiology, Polish Academy of Sciences, Niezapominajek 21, 30-239 Krakow, Poland.,
2012, Vol. 77(3), pp. 169-173
153
Jeffries, T.W. & Jin, Y.-S.
Metabolic engineering for improved fermentation of pentoses by yeasts.
Appl Microbiol Biotechnol, USDA Forest Service, Forest Products Laboratory, Madison, WI 53726-2398, USA.
[email protected], 2004, Vol. 63(5), pp. 495-509
Jez, J.M. & Penning, T.M.
Engineering steroid 5 beta-reductase activity into rat liver 3 alpha-hydroxysteroid dehydrogenase.
Biochemistry, Departments of Biochemistry and Biophysics and of Pharmacology, University of Pennsylvania School
of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA., 1998, Vol. 37(27), pp. 9695-9703
Johnson, E.T., Ryu, S., Yi, H., Shin, B., Cheong, H. & Choi, G.
Alteration of a single amino acid changes the substrate specificity of dihydroflavonol 4-reductase.
Plant J, Kumho Life and Environmental Science Laboratory, 1 Oryong-dong, Puk-gu, Kwangju 500-712 Korea., 2001,
Vol. 25(3), pp. 325-333
Jones, D.K., Dalton, D.A., Rosell, F.I. & Raven, E.L.
Class I heme peroxidases: characterization of soybean ascorbate peroxidase.
Arch Biochem Biophys, Department of Chemistry, University of Leicester, University Road, Leicester, LE1 7RH,
England, United Kingdom., 1998, Vol. 360(2), pp. 173-178
Jortani, S.A. & Valdes, Jr, R.
Digoxin and its related endogenous factors.
Crit Rev Clin Lab Sci, Department of Pathology, University of Louisville School of Medicine, KY 40292, USA., 1997,
Vol. 34(3), pp. 225-274
Jun, J.H., Ha, C.M. & Nam, H.G.
Involvement of the VEP1 gene in vascular strand development in Arabidopsis thaliana.
Plant Cell Physiol, Division of Molecular Life Sciences, Pohang University of Science and Technology, Hyoja Dong,
Kyungbuk, 790-784, Korea., 2002, Vol. 43(3), pp. 323-330
Kallberg, Y., Oppermann, U., Jörnvall, H. & Persson, B.
Short-chain dehydrogenase/reductase (SDR) relationships: a large family with eight clusters common to human, animal,
and plant genomes.
Protein Sci, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet, S-171 77 Stockholm, Sweden.,
2002, Vol. 11(3), pp. 636-641
Kallberg, Y. & Persson, B.
Prediction of coenzyme specificity in dehydrogenases/reductases. A hidden Markov model-based method and its
application on complete genomes.
FEBS J, IFM Bioinformatics, Linköping University, Sweden., 2006, Vol. 273(6), pp. 1177-1184
Kamal, J.K.A. & Behere, D.V.
Thermal and conformational stability of seed coat soybean peroxidase.
Biochemistry, Department of Chemical Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, Homi Bhabha Road, Colaba,
Mumbai 400 005, India., 2002, Vol. 41(29), pp. 9034-9042
Kavanagh, K.L., Jörnvall, H., Persson, B. & Oppermann, U.
Medium- and short-chain dehydrogenase/reductase gene and protein families : the SDR superfamily: functional and
structural diversity within a family of metabolic and regulatory enzymes.
Cell Mol Life Sci, Structural Genomics Consortium, University of Oxford, United Kingdom., 2008, Vol. 65(24), pp.
3895-3906
154
Khoury, G.A., Fazelinia, H., Chin, J.W., Pantazes, R.J., Cirino, P.C. & Maranas, C.D.
Computational design of Candida boidinii xylose reductase for altered cofactor specificity.
Protein Sci, Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University, University Park, 16802, USA.,
2009, Vol. 18(10), pp. 2125-2138
Kirk, O., Borchert, T.V. & Fuglsang, C.C.
Industrial enzyme applications.
Curr Opin Biotechnol, Research and Development, Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, 2880, Bagsvaerd, Denmark.
[email protected], 2002, Vol. 13(4), pp. 345-351
Kreis, W., A., H. & Stuhlemmer, U.
Cardenolide biosynthesis in foxglove
Planta Med, 1998, Vol. 64, pp. 491-9
Kreis, W. & Müller-Uri, F.
BIOCHEMISTRY OF STEROLS, CARDIAC GLYCOSIDES, BRASSINOSTEROIDS AND STEROID SAPONINS
Annual Plant Reviews, 2009, Vol. 40, pp. 304-363
Kreis, W., H.A. & Stuhlemmer, U.
Cardenolide biosynthesis in foxglove.
Planta Med., 1998, Vol. 64, pp. 491-9
Kuate, S.P., Pádua, R.M., Eisenbeiss, W.F. & Kreis, W.
Purification and characterization of malonyl-coenzyme A: 21-hydroxypregnane 21-O-malonyltransferase (Dp21MaT)
from leaves of Digitalis purpurea L.
Phytochemistry, Department of Pharmaceutical Biology, Institute of Biology, Friedrich-Alexander University of
Erlangen-Nuremberg, Staudtstr. 5, D-91058 Erlangen, Germany., 2008, Vol. 69(3), pp. 619-626
Lee, J.-K., Koo, B.-S. & Kim, S.-Y.
Cloning and characterization of the xyl1 gene, encoding an NADH-preferring xylose reductase from Candida
parapsilosis, and its functional expression in Candida tropicalis.
Appl Environ Microbiol, BioNgene Co., Ltd., Jongro-Ku, Seoul 110-521, Korea. [email protected], 2003, Vol.
69(10), pp. 6179-6188
LEETE, E., GREGORY, H. & GROS, E.G.
BIOSYNTHESIS OF PLANT STEROIDS. I. THE ORIGIN OF THE BUTENOLIDE RING OF DIGITOXIGENIN.
J Am Chem Soc, 1965, Vol. 87, pp. 3475-3479
Li, J., Biswas, M.G., Chao, A., Russell, D.W. & Chory, J.
Conservation of function between mammalian and plant steroid 5alpha-reductases.
Proc Natl Acad Sci U S A, Plant Biology Laboratory, The Salk Institute, La Jolla, CA 92037, USA., 1997, Vol. 94(8),
pp. 3554-3559
Li, W., Liu, H., Scott, E.E., Gräter, F., Halpert, J.R., Luo, X., Shen, J. & Jiang, H.
Possible pathway(s) of testosterone egress from the active site of cytochrome P450 2B1: a steered molecular dynamics
simulation.
Drug Metab Dispos, Center for Drug Discovery and Design, State Key Laboratory of Drug Research, Shanghai Institute
of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China., 2005, Vol. 33(7), pp. 910-919
Lindemann, P., Finsterbusch, A., Pankert, A. & Luckner, M.
Mol. Steroidogenesis (Partial cloning ofa Δ5-3β-hydroxysteroid dehydrogenase from Digitalis lanata.).
Okamoto, M., Ishimura, Y. & Nawata, H. (ed.)
Universal Academy Press, Tokyo, 2000
155
Luckner, M. & Wichtl, M.
Digitalis
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2000
Lutz, S.
Beyond directed evolution--semi-rational protein engineering and design.
Curr Opin Biotechnol, Department of Chemistry, Emory University, 1515 Dickey Drive, Atlanta, GA 30322, USA.
[email protected], 2010, Vol. 21(6), pp. 734-743
Maier, M., Seldes, A. & Gros, E.
Biosynthesis of the butenolide ring of cardenolides in Digitalis purpurea.
Phytochemistry, 1986, Vol. 25, pp. 1327-9
Mason, A.B., He, Q.-Y., Halbrooks, P.J., Everse, S.J., Gumerov, D.R., Kaltashov, I.A., Smith, V.C., Hewitt, J.
& MacGillivray, R.T.A.
Differential effect of a his tag at the N- and C-termini: functional studies with recombinant human serum transferrin.
Biochemistry, Department of Biochemistry, University of Vermont, College of Medicine, Burlington, Vermont 05405,
USA. [email protected], 2002, Vol. 41(30), pp. 9448-9454
Matsushima, A., Sato, Y., Otsuka, M., Watanabe, T., Yamamoto, H. & Hirata, T.
An enone reductase from Nicotiana tabacum: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of enones
with the recombinant proteins.
Bioorg Chem, Natural Science Center for Basic Research and Development, Radioisotope Center, Hiroshima
University, 1-4-2 Kagamiyama, Higashi-Hiroshima 739-8526, Japan., 2008, Vol. 36(1), pp. 23-28
Meitinger, N.
Reinigung und Charakterisierung der 3-Ketosteroidisomerase aus Digitalis lanata
FAU Erlangen, 2011
Milek, F., Reinhard, E. & Kreis, W.
Influence of precursors and inhibition of the sterol pathway on sterol and cardenolide metabolism in Digitalis lanata
Ehrh.
Plant Physiol. Biochem., 1997, Vol. 35, pp. 111-21
Militzer, K. & Reinhard, H.J.
[Quantitative histometric investigations on paw edema induced by carrageenin, formalin and aerosil in rats (author's
transl)].
Exp Pathol (Jena), 1974, Vol. 9(5-6), pp. 342-353
Morley, K.L. & Kazlauskas, R.J.
Improving enzyme properties: when are closer mutations better?
Trends Biotechnol, Department of Chemistry, McGill University, 801 Sherbrooke Street West, Montréal, Québec H3A
2K6, Canada., 2005, Vol. 23(5), pp. 231-237
Munkert, J., Bauer, P., Burda, E., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Progesterone 5β-reductase of Erysimum crepidifolium: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of
enones with the recombinant protein.
Phytochemistry, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Department Biologie, Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg, Staudtstr. 5, 91058 Erlangen, Germany., 2011, Vol. 72(14-15), pp. 1710-1717
Muth, C., Gensichern, J. & Butzlaff, M.
DEGAM Leitlinie Herzinsuffizienz
2006
156
Mutschler, E., Geisslinger, G., Kroemer, H.K. & Ruth, P.
Arzneimittelwirkungen - Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2008
Mülhardt
Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics
Spektrum Akademischer Verlag, 2008
Nakajin, S., Takase, N., Ohno, S., Toyoshima, S. & Baker, M.E.
Mutation of tyrosine-194 and lysine-198 in the catalytic site of pig 3alpha/beta,20beta-hydroxysteroid dehydrogenase.
Biochem J, Department of Biochemistry, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Hoshi University, 2-4-41, Ebara,
Shinagawa-ku, Tokyo 142-8501, Japan., 1998, Vol. 334 ( Pt 3), pp. 553-557
Negre, F., Kish, C.M., Boatright, J., Underwood, B., Shibuya, K., Wagner, C., Clark, D.G. & Dudareva, N.
Regulation of methylbenzoate emission after pollination in snapdragon and petunia flowers.
Plant Cell, Department of Horticulture and Landscape Architecture, Purdue University, West Lafayette, Indiana 47907,
USA., 2003, Vol. 15(12), pp. 2992-3006
Nobeli, I., Favia, A.D. & Thornton, J.M.
Protein promiscuity and its implications for biotechnology.
Nat Biotechnol, Institute of Structural and Molecular Biology, School of Crystallography, Birkbeck, University of
London, Malet Street, London, WC1E 7HX, UK. [email protected], 2009, Vol. 27(2), pp. 157-167
Ober, D.
Gene duplications and the time thereafter - examples from plant secondary metabolism.
Plant Biol (Stuttg), Biochemische Okologie und Molekulare Evolution, Botanisches Institut und Botanischer Garten,
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Kiel, Germany. [email protected], 2010, Vol. 12(4), pp. 570-577
Ober, D.
Seeing double: gene duplication and diversification in plant secondary metabolism.
Trends Plant Sci, Institut für Pharmazeutische Biologie, Technische Universität Braunschweig, Mendelssohnstrasse 1,
D-38106 Braunschweig, Germany. [email protected], 2005, Vol. 10(9), pp. 444-449
Oppmann, B.
Entgiftung von Schwefeldioxid in der Zellwand von Blättern - Apoplastidäre Peroxydasen in unterschiedlichen
geschädigten Fichtennadeln verschiedener Waldstandorte
Uni Würzburg, 1990
Ostergaard, S., Olsson, L. & Nielsen, J.
Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae.
Microbiol Mol Biol Rev, Center for Process Biotechnology, Department of Biotechnology, Technical University of
Denmark, DK-2800 Lyngby, Denmark., 2000, Vol. 64(1), pp. 34-50
Padhi, S.K., Fujii, R., Legatt, G.A., Fossum, S.L., Berchtold, R. & Kazlauskas, R.J.
Switching from an esterase to a hydroxynitrile lyase mechanism requires only two amino acid substitutions.
Chem Biol, Department of Biochemistry, Molecular Biology, and Biophysics, and the Biotechnology Institute,
University of Minnesota, 1479 Gortner Avenue, Saint Paul, MN 55108, USA., 2010, Vol. 17(8), pp. 863-871
Pasteels, J.M. & Daloze, D.
Cardiac glycosides in the defensive secretion of chrysomelid beetles: evidence for their production by the insects.
Science, 1977, Vol. 197(4298), pp. 70-72
157
Pauli, G.F., Friesen, J.B., Gödecke, T., Farnsworth, N.R. & Glodny, B.
Occurrence of progesterone and related animal steroids in two higher plants.
J Nat Prod, Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy and Program for Collaborative Research in the
Pharmaceutical Sciences and Institute for Tuberculosis Research, College of Pharmacy, University of Illinois at
Chicago, Chicago, Illinois 60612, USA. [email protected], 2010, Vol. 73(3), pp. 338-345
Peimbert, M. & Segovia, L.
Evolutionary engineering of a beta-Lactamase activity on a D-Ala D-Ala transpeptidase fold.
Protein Eng, Departamento de Ingeniería Celular y Biocatálisis, Instituto de Biotecnología, UNAM, Av. Universidad
2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, 62250 México. [email protected], 2003, Vol. 16(1), pp. 27-35
Penning, T.M., Ma, H. & Jez, J.M.
Engineering steroid hormone specificity into aldo-keto reductases.
Chem Biol Interact, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania School of Medicine, 3620 Hamilton
Walk, 19104-6084, Philadelphia, PA, USA., 2001, Vol. 130-132(1-3), pp. 659-671
Persson, B., Kallberg, Y., Oppermann, U. & Jörnvall, H.
Coenzyme-based functional assignments of short-chain dehydrogenases/reductases (SDRs).
Chem Biol Interact, IFM Bioinformatics, Linköping University, S-581 83, Linköping, Sweden. [email protected], 2003,
Vol. 143-144, pp. 271-278
Petsko, G.A. & Ringe, D.
Protein Structure and Function (Primers in Biology)
Oxford University Press, 2009
Pichersky, E. & Gang, D.R.
Genetics and biochemistry of secondary metabolites in plants: an evolutionary perspective.
Trends Plant Sci, Biology Dept, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1048, USA. [email protected], 2000, Vol.
5(10), pp. 439-445
Pichersky, E., Noel, J.P. & Dudareva, N.
Biosynthesis of plant volatiles: nature's diversity and ingenuity.
Science, Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Michigan, 830 North University
Street, Ann Arbor, MI 48109, USA. [email protected], 2006, Vol. 311(5762), pp. 808-811
Pollack, R.M.
Enzymatic mechanisms for catalysis of enolization: ketosteroid isomerase.
Bioorg Chem, Department of Chemistry and Biochemistry, University of Maryland, Baltimore County, Baltimore, MD
21250, USA. [email protected], 2004, Vol. 32(5), pp. 341-353
Pollier, J., Moses, T. & Goossens, A.
Combinatorial biosynthesis in plants: a (p)review on its potential and future exploitation.
Nat Prod Rep, Department of Plant Systems Biology, VIB, Gent, Belgium., 2011, Vol. 28(12), pp. 1897-1916
Pádua, R.M., Waibel, R., Kuate, S.P., Schebitz, P.K., Hahn, S., Gmeiner, P. & Kreis, W.
A simple chemical method for synthesizing malonyl hemiesters of 21-hydroxypregnanes, potential intermediates in
cardenolide biosynthesis.
Steroids, Friedrich-Alexander-Universität, Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie, Staudtstr. 5, D-91058 Erlangen,
Germany., 2008, Vol. 73(4), pp. 458-465
Pérez-Bermúdez, P., García, A.A.M., Tuñón, I. & Gavidia, I.
Digitalis purpurea P5 beta R2, encoding steroid 5 beta-reductase, is a novel defense-related gene involved in
cardenolide biosynthesis.
New Phytol, Department of Plant Biology, Faculty of Pharmacy, University of Valencia, 46100 Burjassot, Spain., 2010,
158
Vol. 185(3), pp. 687-700
Qin, L., Hiser, C., Mulichak, A., Garavito, R.M. & Ferguson-Miller, S.
Identification of conserved lipid/detergent-binding sites in a high-resolution structure of the membrane protein
cytochrome c oxidase.
Proc Natl Acad Sci U S A, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, East
Lansing, MI 48824, USA., 2006, Vol. 103(44), pp. 16117-16122
RAMSTAD, E. & BEAL, J.L.
Mevalonic acid as a precursor in the biogenesis of digitoxigenin.
J Pharm Pharmacol, 1960, Vol. 12, pp. 552-556
Reinhard, E., Boy, M. & Kaiser, F.
[Transformation of digitalis-glycosides by cell suspension cultures (author's transl)].
Planta Med, 1975, Vol. Suppl, pp. 163-168
Ritz, E. & Schoner, W.
[From Digitalis purpurea to toad skin. An historical view of digitalis-like mammalian hormones ].
Dtsch Med Wochenschr, Medizinische Universitätsklinik, Nierenzentrum, Ruperto-Carola-Universität, Heidelberg.,
2008, Vol. 133(51-52), pp. 2690-2694
Roca-Pérez, L., Boluda, R., Gavidia, I. & Pérez-Bermúdez, P.
Seasonal cardenolide production and Dop5betar gene expression in natural populations of Digitalis obscura.
Phytochemistry, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Av. Vicent Andrés
Estellés s/n, 46100 Burjassot (Valencia), Spain., 2004, Vol. 65(13), pp. 1869-1878
Rodman, J., Brower, L. & Frey, J.
Cardenolides in North American Erysimum (Cruciferae), a preliminary chemotaxonomic report.
Taxon, 1982, Vol. 31 (3), pp. 507-516
Rossmann, M.G. & Argos, P.
Exploring structural homology of proteins.
J Mol Biol, 1976, Vol. 105(1), pp. 75-95
Rudolph, K.
N-terminal eingekürzte P5βR-Muteine: Herstellung & Charakterisierung
Masterarbeit, FAU Erlangen, 2011
Saleh, O., Gust, B., Boll, B., Fiedler, H.-P. & Heide, L.
Aromatic prenylation in phenazine biosynthesis: dihydrophenazine-1-carboxylate dimethylallyltransferase from
Streptomyces anulatus.
J Biol Chem, Pharmazeutische Biologie, Pharmazeutisches Institut, Eberhard-Karls-Universität Tübingen, Auf der
Morgenstelle 8, 72076 Tübingen, Germany., 2009, Vol. 284(21), pp. 14439-14447
Sales, E., Segura, J. & Arrillaga, I.
Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of the cardenolide-producing plant Digitalis minor L.
Planta Med, Departamento de Biología Vegetal, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, Burjassot, Valencia,
Spain., 2003, Vol. 69(2), pp. 143-147
Santoro, S.W. & Schultz, P.G.
Directed evolution of the site specificity of Cre recombinase.
Proc Natl Acad Sci U S A, Department of Chemistry and the Skaggs Institute for Chemical Biology, The Scripps
Research Institute, SR202, 10550 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA., 2002, Vol. 99(7), pp. 4185-4190
159
Schebitz, P., Nothdurft, L., Hensel, A., Müller-Uri, F. & Kreis, W.
Norcholanic acids as substrates for recombinant 3β-hydroxysteroid dehydrogenase and progsterone 5β-reductase,
enzymes of the 5β-cardenolide biosynthesis.
Tetrahedron Lett., 2010, Vol. 51(2), pp. 367-370
Schoner, W.
Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones.
Eur J Biochem, Institut für Biochemie und Endokrinologie, Justus-Liebig-Universität Giessen, Germany., 2002, Vol.
269(10), pp. 2440-2448
Schütte, H.
Secondary plant substrates: aspects of steroid biosynthesis
Prog. Bot., 1987, Vol. 49, pp. 117-36
Scrutton, N.S., Berry, A. & Perham, R.N.
Redesign of the coenzyme specificity of a dehydrogenase by protein engineering.
Nature, Department of Biochemistry, University of Cambridge, UK., 1990, Vol. 343(6253), pp. 38-43
Shiratori, O.
Growth inhibitory effect of cardiac glycosides and aglycones on neoplastic cells: in vitro and in vivo studies.
Gann, 1967, Vol. 58(6), pp. 521-528
Smyth, D.R., Mrozkiewicz, M.K., McGrath, W.J., Listwan, P. & Kobe, B.
Crystal structures of fusion proteins with large-affinity tags.
Protein Sci, Department of Biochemistry and Molecular Biology, Institute for Molecular Bioscience, and Special
Research Centre for Functional and Applied Genomics, University of Queensland, St Lucia, Queensland 4072,
Australia., 2003, Vol. 12(7), pp. 1313-1322
Stenkvist, B.
Is digitalis a therapy for breast carcinoma?
Oncol Rep, Institute of Pathology, University of Uppsala, Uppsala, Sweden., 1999, Vol. 6(3), pp. 493-496
Stuhlemmer, U., Haussmann, W., Milek, F., Kreis, W. & Reinhard, E.
3 alpha-Hydroxysteroid-5 beta-oxidoreductase in tissue cultures of Digitalis lanata.
Z Naturforsch C, Pharmazeutisches Institut, Eberhard-Karls-Universität, Tübingen, Bundesrepublik Deutschland., 1993,
Vol. 48(9-10), pp. 713-721
Stuhlemmer, U. & Kreis, W.
Does malonyl coenzyme A:hydroxypregnane 21-hydroxymalonyltransferase catalyze the first step in butenolide ring
formation?
Tetrahedron Lett., 1996, Vol. 48c, pp. 2221-4
Stuhlemmer, U. & Kreis, W.
Cardenolide formation and activity of pregnane-modifying enzymes in cell suspention cultures, shoot cultures and
leaves of Digitalis lanata.
Plant Physiol. Biochem., 1996, Vol. 34, pp. 85-91
Su, C.-T., Hsu, J.T.-A., Hsieh, H.-P., Lin, P.-H., Chen, T.-C., Kao, C.-L., Lee, C.-N. & Chang, S.-Y.
Anti-HSV activity of digitoxin and its possible mechanisms.
Antiviral Res, Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, National Taiwan University
College of Medicine, Taipei, Taiwan., 2008, Vol. 79(1), pp. 62-70
160
Tarrío, R., Ayala, F.J. & Rodríguez-Trelles, F.
The Vein Patterning 1 (VEP1) gene family laterally spread through an ecological network.
PLoS One, Universidad de Santiago de Compostela, CIBERER, Genome Medicine Group, Santiago de Compostela,
Spain., 2011, Vol. 6(7), pp. e22279
Teuscher, E. & Lindequist, U.
Biogene Gifte - Biologie-Chemie-Pharmakologie-Toxikologie
Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2010
Thorn, A., Egerer-Sieber, C., Jäger, C.M., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W. & Muller, Y.A.
The crystal structure of progesterone 5beta-reductase from Digitalis lanata defines a novel class of short chain
dehydrogenases/reductases.
J Biol Chem, Lehrstuhl für Biotechnik, Department of Biology, Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg,
Henkestrasse 91, D-91052 Erlangen, Germany., 2008, Vol. 283(25), pp. 17260-17269
Tschesche, R.
[Biogenesis of cardanolide and bufadienolide glycosides].
Planta Med, 1971, pp. Suppl 4:34-Suppl 4:39
Watanabe, S., Kodaki, T. & Makino, K.
Complete reversal of coenzyme specificity of xylitol dehydrogenase and increase of thermostability by the introduction
of structural zinc.
J Biol Chem, Institute of Advanced Energy, Kyoto University, Gokasyo, Uji, Kyoto 611-0011, Japan., 2005, Vol.
280(11), pp. 10340-10349
Wendroth, S. & Seitz, H.U.
Characterization and localization of progesterone 5 alpha-reductase from cell cultures of foxglove (Digitalis lanata
EHRH).
Biochem J, Institut für Biologie I, Universität Tübingen, Federal Republic of Germany., 1990, Vol. 266(1), pp. 41-46
Wilming, M., Iffland, A., Tafelmeyer, P., Arrivoli, C., Saudan, C. & Johnsson, K.
Examining reactivity and specificity of cytochrome c peroxidase by using combinatorial mutagenesis.
Chembiochem, 2002, Vol. 3(11), pp. 1097-1104
Winnicka, K., Bielawski, K. & Bielawska, A.
Cardiac glycosides in cancer research and cancer therapy.
Acta Pol Pharm, Department of Pharmaceutical Technology, Medical University of Białystok, 1 Kilińskiego Str., 15089 Białystok, Poland., 2006, Vol. 63(2), pp. 109-115
Woestenenk, E.A., Hammarström, M., van den Berg, S., Härd, T. & Berglund, H.
His tag effect on solubility of human proteins produced in Escherichia coli: a comparison between four expression
vectors.
J Struct Funct Genomics, Department of Biotechnology, Royal Institute of Technology (KTH), AlbaNova University
Center, Stockholm, Sweden., 2004, Vol. 5(3), pp. 217-229
Yang, K.Y., Moon, Y.H., Choi, K.H., Kim, Y.H., Eun, M.Y., Guh, J.O., Kim, K.C. & Cho, B.H.
Structure and expression of the AWI 31 gene specifically induced by wounding in Arabidopsis thaliana.
Mol Cells, College of Agriculture, Chonnam National University, Kwangju, Korea., 1997, Vol. 7(1), pp. 131-135
Ye, J., Chen, S. & Maniatis, T.
Cardiac glycosides are potent inhibitors of interferon-β gene expression.
Nat Chem Biol, Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University, Cambridge, Massachusetts, USA.,
2011, Vol. 7(1), pp. 25-33
161
van Zeijl, C.M., van de Kamp, E.H., Punt, P.J., Selten, G.C., Hauer, B., van Gorcom, R.F. & van den Hondel,
C.A.
An improved colony-PCR method for filamentous fungi for amplification of PCR-fragments of several kilobases.
J Biotechnol, TNO Nutrition and Food Research Institute, Department of Molecular Genetics and Gene Technology,
Zeist, The Netherlands., 1997, Vol. 59(3), pp. 221-224
Europäisches Arzneibuch 7.Ausgabe: Amtliche deutsche Ausgabe
EU (ed.)
Deutscher Apotheker Verlag, 2011
162
VII ANLAGEN
VII.1 Abkürzungsverzeichnis
Amp.
Ampicillin
APS
Ammoniumpersulfat
AS
Aminosäure(n)
AtStr
Steroid-Reduktase
AUC
Fläche unter der Kurve (area under the curve)
bidest
bidestilliert
Carb.
Carbenicillin
cDNA
komplementäre DNA
DC
Dünnschichtchromatographie
DE
Gerichtete Evolution („directed evolution“)
DlP5βRnn-13
D. lanata P5βR mit N-terminalem Histag („n“), N-terminal um 13
Aminosäuren gekürzt [Herl et al., 2006]
DlP5βRc[n-x]
D. lanata P5βR mit C-terminalem Histag („c“), N-terminal um x
Aminosäuren gekürzt
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleinsäure
DNase
Desoxyribonuclease
dNTP
Desoxynucleotidtriphosphat (beinhaltet dATP, dCTP, dGTP und dTTP)
DOZ
Desoxyzucker
EK
Endkonzentration in der Lösung
EtOH
Ethanol
FM
Fließmittel
HPLC
Hochdruckflüssigchromatographie
IPTG
Isopropyl-β-D-Thiogalactosid
Kan.
Kanamycin
kb
Kilobase (= 1000 Basenpaare)
Km
Michelis-Menten Konstante
LB
Luria Broth Bakterienmedium
mRNA
Boten-RNA (messenger RNA)
NAD(P)H
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat
neo
Resistenzgen gegen Kanamycin
NT / nt
Nucleotide
OD(260)
Optische Dichte (bei einer Wellenlänge von 260 nm)
OPDA
12-Oxophytodien-Säure
163
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
RNA
Ribonucleinsäure
RNase
Ribonuclease
RT
Reverse Transkriptase
SDS
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
SDM
ortsgerichtete Mutagenese („ “)
Taq-Polymerase
Thermus aquaticus DNA-Polymerase
Tm
Schmelztemperatur (melting temperature)
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
U
Enzymeinheit (unit)
Upm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
UV
Ultraviolett
vmax
Geschwindigkeitskonstante bei enzymatischen Reaktionen
VT
Volumenteile
P5βR
Progesteron 5β-Reduktase
RL
Reagenzlösung
X-Gal
5-Brom-4-Chlor-3-indoyl-β-galactosid
164
VII.2 Publikationsliste
Bauer P., Munckert J., Bryzidium M., Burda E, Müller-Uri F., Gröger H, Mueller YA, Kreis
W., 2010. Highly conserved progesterone 5β-reductase genes (P5βR) from 5β-cardenolide-free and
5β-cardenolide-producing angiosperms. Phytochemistry. 71(13), 225-231.
Munckert J., Bauer P., Burda E., Müller-Uri F., Kreis W., 2011. Progesterone 5β-reductase
of Erysimum crepidifolium: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of enones
with the recombinant protein. Phytochemistry 72(14-15):1710-7
Bauer P., Kreis W., 2011. Curcumin in der Krebstherapie . Deutsche Zeitschrift für
Onkologie. 41, 144-149
Bauer P., K. Rudolph, F. Müller-Uri, Kreis, W., 2012. Vein Patterning 1-Encoded
Progesterone 5β-Reductase: Activity-guided Improvement of Catalytic Efficiency. Phytochemistry
77, 53-59.
Weitere Manuskripte in Bearbeitung bzw. eingereichte Manuskripte
Bauer P., Lanig H., Müller-Uri F., Kreis W.; VEP1-encoded Progesterone 5β-Reductase:
Involvement of Two Phenylalanines in a Putative Substrate-Trapping Mechanism“
Rudolph K., Bauer P., Schmid B., Müller-Uri F., Kreis W.; Truncation of N-terminal regions
of Digitalis lanata progesterone 5β-reductase alters the catalytic efficiency and the substrate
preference.
Budeanu O.A., Loebers A., Bauer P., Müller-Uri F., Kreis W.;Progesterone 5β-Reductase
from horseradish (Armoracia rusticana Gaertn., Mey., & Scherb.): Cloning, Sequence Comparison
and Molecular Modelling. (Manuskript eingereicht)
VII.3 Tagungsbeiträge und wissenschaftliche Preise
VII.3.1 Wissenschaftliche Kongresse mit Eigenbeitrag
- Botanikertagung 2009, „Plants for the future“, 06.-11.09.2009 (Leipzig)
(P. Bauer et al., „Altering efficiency and coenzyme specificity of recombinant progesterone 5βreductase from Digitalis lanata by site-directed mutagenesis (SDM)“)
- Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2009, „Biotechnologisch erzeugte
Wirkstoffe – Konzepte, Erfolge, Erwartungen“, 28.09 - 01.10.2009 (Jena)
(P. Bauer et al., „Altering efficiency and coenzyme specificity of recombinant progesterone 5βreductase from Digitalis lanata by site-directed mutagenesis (SDM)“)
- 58th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant and Natural
Product Research (GA), 29.08-02.09.2010 (Berlin)
(P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βRlike enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)
165
(J. Munkert, P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Evolution and function of progesteron 5β-reductase
genes in angiosperms“)
- Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2010, „Personalisierte Therapeutika Traum oder Wirklichkeit“, 04.10-07.10.2010 (Braunschweig)
(P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βRlike enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)
- Terpnet 2011, 10th International Meeting, Biosynthesis and function of Isoprenoids in plants,
mircoorganisms and parasites“, 22.05-26.05.2011 (Kalmar, Schweden)
(P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Activity-Guided Design of Progesterone-5β-Reductase-Like ShortChain Dehydrogenases/Reductases“)
- Emil-Fischer-School Research-Day; 28.07.2011 (Erlangen)
(P. Bauer et al., „Cloning, functional expression, modelling and structural investigations on P5βRlike enone reductases from various pharmaceutically important angiosperms“)
- Jahrestagung der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft 2011, „Shaping the future-Trends and
perspectives in pharmaceutical science“ (Innsbruck, Österreich)
(P. Bauer, K. Rudolph, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Improvement of enzyme activity of
recombinant DlP5βR by a ration, bioactivity-guided approach“)
(K. Rudolph, P. Bauer, F. Müller-Uri, W. Kreis, „Truncation of N-terminal regions of Digitalis
lanata progesteron 5β-reductase alters catalytic efficiency and substrate preference“)
VII.3.2 Preise während der Promotionsphase
- Preisträger der Lesmüller-Stiftung im Fachbereich Pharmazeutische Biologie auf der DPhG
Jahrestagung 2010 (Poster-Preis Pharmazeutische Biologie)
- 1. Platz (Kampf) / 3. Platz (Tul/Form) bei der badenwürttembergischen Taekwondo Meisterschaft
2011 (ITF) bis 73 kg
- Taekwondo-/Kickbox-Academy Fürth (größte Kampfsportschule Mittelfrankens): Schüler des
Jahres 2011
166
VII.5 LEBENSLAUF
Persönliche Daten
Name:
Geburtsdatum:
Staatsangehörigkeit:
Familienstand:
Titel / Berufsbezeichnung:
Peter Reinhard Bauer
17.06.1983 in Nürnberg
deutsch
verlobt
Diplom Pharmazeut / Apotheker
Berufsausübung
Seit 02/2012
03/2011-12/2011
01/2009-12/2011
Mitarbeiter Bionorica AG in Neumarkt (Teamleiter Analytik/Präklinik)
Freier Mitarbeiter der Steigerwald AG (Arzneimittelschulungen)
Wissenschaftlicher Mitarbeiter bei Prof. Dr. W. Kreis am Lehrstuhl für
Pharmazeutische Biologie der Universität Erlangen
Hochschulausbildung und Praktisches Jahr
12/2008
Dritter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung in Regensburg und
Approbation zum Apotheker
05/2008 – 11/2008 Zweite Hälfte des praktischen Jahres in der Obertor – Apotheke in Esslingen
am Neckar
13.06.2008
Diplomprüfung an der Universität Tübingen bei Prof. Dr. L. Heide und
Prof. Dr. P. Ruth
11/2007 – 04/2008 Pharmaziepraktikant am LS Pharmazeutische Biologie der Universität
Tübingen. Dort Anfertigung einer Diplomarbeit (Antibiotikabiosynthese in
Streptomyceten – Untersuchungen zur transkriptionellen Organisation der
Chlorobiocin-Biosynthesegenclusters).
11/2007
Zweiter Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung (2.Staatsexamen)
09/2005
Erster Abschnitt der Pharmazeutischen Prüfung (1. Staatsexamen)
10/2003 – 11/2007 Studium der Pharmazie an der FAU Erlangen – Nürnberg.
Praktika während der Hochschulausbildung
08/2006 – 09/2006 Wahlpflichtfach – Praktikum bei der Firma Bionorica AG in Neumarkt
(Herstellung, Analytik und Bewertung von Echinacea purpurea Presssäften
und Entwicklung einer Arzneiform)
03/2006
Praktikum in der Kran Apotheke Lüneburg
03/2005 – 04/2005 Praktikum in der Praxis Dr. Ehrmeier, Facharzt für Allgemeinmedizin
02/2005 – 03/2005 Zweiter Teil der Famulatur in der Apotheke des Klinikums Nürnberg
10/2004
Praktikum bei Dr. Aye und Partner; vereidigter Sachverständiger für
pharmazeutische Chemie und Arzneimittelzulassung.
03/2004
Erster Teil der Famulatur in der Kran Apotheke in Lüneburg
Schulausbildung
09/1994 – 07/2003
09/1990 – 08/1994
Pirckheimer Gymnasium Nürnberg (LK Chemie und Wirtschaft/Recht)
Martin–Luther-King Grundschule Kornburg, Nürnberg
Interessen
Klettern, Klettersteige, Traditionelles Bogenschießen und Bogenbau, Rennradfahren und
Mountainbiken, Kampfsport (v.a. ITF Taekwondo / Kickboxen / Wing Tsun / JuJutsu), Literatur,
Geschichte und Leben des Mittelalters, Filme, Gitarre spielen
167
Befreie dich von deiner eigenen Kraft.
Befreie dich von der Kraft des Gegners.
Nutze die Kraft des Gegners gegen ihn selbst.
Füge zu der gegnerischen Kraft deine eigene Kraft hinzu.
Die vier Kraftprinzipien des Wing Tsun
Wenn der Weg frei ist, stoß vor.
Wenn der Weg nicht frei ist, bleib kleben.
Wenn die Kraft des Gegners größer ist, gib nach.
Wenn der Gegner zurück weicht, folge ihm nach
Die vier Kampfprinzipien des Wing Tsun
168