Charakterisierung eines murinen Norovirus
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Tierärztliche Hochschule Hannover _______________________________________________________ Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der Interleukin-10 defizienten Maus INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin -Doctor medicinae veterinariae(Dr. med. vet.) vorgelegt von Marcel Achard Münster Hannover 2011 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium Medizinische Hochschule Hannover Univ.-Prof. A. Bleich, Ph.D. Institut für Versuchstierkunde und Zentrales Tierlaboratorium Medizinische Hochschule Hannover Apl.-Prof. Dr. M. Mähler Labor für biomedizinische Diagnostik - BioDoc Hannover 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Hans-J. Hedrich 2. Gutachter: Apl.-Prof. Dr. Ludwig Haas Tag der mündlichen Prüfung: 24. November 2011 Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................... V 1 Einleitung ........................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht .............................................................................................. 2 2.1 Caliciviridae ................................................................................................... 2 2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV ....................................................... 3 2.3 MNV in der Zellkultur ..................................................................................... 5 2.4 Nachweisverfahren für MNV .......................................................................... 7 2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen ..................................................... 8 2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung ...................... 8 2.7 Infektionsverlauf ............................................................................................. 9 2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und Tiermodelle .................................................................................................... 9 2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren .................................................. 12 2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) ............. 12 2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus ............................................................... 15 2.12 Ziele dieser Arbeit ........................................................................................ 17 3 Eigene Untersuchungen ..................................................................................18 3.1 Material ........................................................................................................ 18 3.1.1 Mäuse ................................................................................................ 18 3.1.2 Herkunft ............................................................................................. 18 3.1.3 Haltung im Experiment ...................................................................... 19 3.1.4 Synthetische Oligonukleotide ............................................................ 22 3.1.5 Zelllinie .............................................................................................. 24 3.1.6 Eingesetzter Virusstamm ................................................................... 24 I Inhaltsverzeichnis 3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm ............................................................ 24 3.1.8 Materialliste ....................................................................................... 24 3.2 Methoden ..................................................................................................... 31 3.2.1 Zellkultur ............................................................................................ 31 3.2.2 Virusisolation ..................................................................................... 31 3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR .............................................................. 32 3.2.4 Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR ........................... 35 3.2.5 Sequenzierung .................................................................................. 36 3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch ........................................... 37 3.2.7 Virus-Titer-Bestimmung ..................................................................... 37 3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA) ...................................................... 39 3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation ..................................... 40 3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................................. 42 3.2.11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen.............................................. 44 3.2.12 Isolation und Anzucht von Helicobacter hepaticus für den Doppelinfektionsversuch ................................................................... 44 3.2.13 Experimentelle Infektion der Mäuse mit MNV .................................... 45 3.2.14 Experimentelle Infektion der Mäuse mit Helicobacter hepaticus........ 45 3.2.15 Sterile Aufarbeitung des Mesenteriallymphknotens unter einer Werkbank .......................................................................................... 48 3.2.16 Vorbereitung und Verwendung der Zellkulturplatten für die Bestimmung von Interferon γ............................................................. 49 3.2.17 Bestimmung von Interferon γ im Lymphozytenzellkulturüberstand mit Hilfe eines ELISA .............................................................................. 49 3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate ................................................. 50 3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate........................................... 51 II Inhaltsverzeichnis 3.2.20 4 Statistische Auswertung .................................................................... 52 Ergebnisse ........................................................................................................53 4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur ............................................................... 53 4.2 Virus-Nachweis mittels PCR ........................................................................ 53 4.3 Sequenzierung des Virus ............................................................................. 56 4.4 Virusquantifizierung ..................................................................................... 58 4.5 Indirekte Antikörpernachweisverfahren ........................................................ 58 4.5.1 IFA ..................................................................................................... 58 4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA ......................................................... 60 4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen ........................................................ 66 4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen Tierlaboratoriums auf MNV .......................................................................... 68 4.8 5 Infekionsversuche ........................................................................................ 68 4.8.1 Klinik .................................................................................................. 70 4.8.2 Sektion............................................................................................... 70 4.8.3 Serologie ........................................................................................... 70 4.8.4 Lymphozytenstimulation .................................................................... 71 4.8.5 PCR-Nachweis von MNV ................................................................... 78 4.8.6 PCR-Nachweis von Helicobacter hepaticus ...................................... 79 4.8.7 Histologie ........................................................................................... 79 Diskussion ........................................................................................................84 5.1 Zellkultur und Quantifizierung ...................................................................... 84 5.2 Sequenzierung ............................................................................................. 84 5.3 Nachweisverfahren ...................................................................................... 85 5.4 Prävalenz ..................................................................................................... 89 5.5 MNV im Tierversuch .................................................................................... 90 III Inhaltsverzeichnis 5.6 Ausblick ....................................................................................................... 91 6 Zusammenfassung ...........................................................................................93 7 Summary ...........................................................................................................95 8 Anhang ..............................................................................................................97 9 Literaturverzeichnis .......................................................................................115 Abbildungsverzeichnis .........................................................................................126 Tabellenverzeichnis ..............................................................................................129 Erklärung ................................................................................................................131 Danksagung ...........................................................................................................132 IV Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis % BHI BLAST bzw. CD cDNA CED CPE DMEM DNA EDTA EL ELISA FELASA FKS L.E. GM-CSF h H. hepaticus H.E. HPRT IFA IFNγ IL kb l m MCMV MDA MDR MEZ MFI MHH min ml MLK MNV MNV-h MW NCBI Prozent Brain-Heart-Infusion Basic Local Alignment Search Tool beziehungsweise Cluster of differentiation Complementary DNA Chronisch entzündliche Darmerkrankung Cytopathischer Effekt Dulbecco's Modified Eagle's Medium Desoxyribonucleic Acid Ethylendiamintetraacetat Charles-River-ELISA-Messung Enzyme linked immune sorbent assay Federation of Laboratory Animal Science Associations Fetales Kälberserum low endotoxin Granulocyte macrophage colony-stimulating factor Stunde Helicobacter hepaticus Hämatoxylin-Eosin Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase Immunofluorescence Assay Interferon gamma Interleukin Kilobasenpaare Liter männlich Maus Cytomegalie Virus Melanoma-differentiation-associated gene Multiple drug resistance Mitteleuropäische Zeit Multiplex fluorescent immunoassay Medizinische Hochschule Hannover Minute Milliliter Mesenteriallymphknoten Murines Norovirus Murines Norovirus/ Hannover1/2007/DEU Mittelwert National Center for Biotechnology Information V Abkürzungsverzeichnis NEA ng NSR OD ORF p.i. PBS PBSM PCR pg RAG RNA RT scid SD SEM STAT TBE TCID TEM Th TJL TLR TNF TRIS U v.a. VK vs. w ZTL Nicht essentielle Aminosäuren Nanogramm Nicht spezifische Reaktion Optical density Open reading frame post infectionem Phosphate buffered saline Phosphate buffered saline ohne Mg2+- und Ca2+-Ionen Polymerase Chain Reaction Picogramm Recombination-activating gene Ribonucleic Acid Raumtemperatur Severe combined immunodeficiency Standardabweichung Standard Error of the Mean Signal transducer and activator of transcription TRIS-Borat-EDTA-Puffer Tissue culture infectious dose Transmissionselektronenmikroskopie T-Helfer The Jackson Laboratory Toll-like receptor Tumornekrosefaktor Trishydroxymethylaminomethan Umdrehung vor allem Variationskoeffizient versus weiblich Zentrales Tierlaboratorium VI Einleitung 1 Einleitung Noroviren sind unbehüllte, sehr umweltresistente RNA-Viren und gehören zur Familie der Caliciviridae, in der sie ein eigenständiges Genus bilden. Sie wurden erstmals 1968 bei einem Ausbruch akuter Gastroenteritis an einer Schule in Norwalk/Ohio in den USA entdeckt (DOLIN et al. 1972) und werden für ca. 90% aller nicht-bakteriell bedingten epidemischen Gastroenteritiden beim Menschen verantwortlich gemacht. Zu den animalen Noroviren gehören bovine, porzine und murine Noroviren. Bisher wurde keine Übertragung dieser Viren vom Tier auf den Menschen oder umgekehrt nachgewiesen. Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST et al. 2003). Infektionsexperimente mit diesem Virus, dem murinen Norovirus 1 (MNV-1), zeigen, dass Infektionsdauer und Krankheitsmanifestation vom Mausstamm beeinflusst werden (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005; MUMPHREY et al. 2007). Seit der Erstbeschreibung von MNV-1 wurden viele weitere MNVStämme mit unterschiedlichen biologischen Eigenschaften isoliert (HSU et al. 2006; THACKRAY et al. 2007). Untersuchungen in Nordamerika (HSU et al. 2005; PRITCHETT-CORNING et al. 2009) und Westeuropa (MÜLLER et al. 2007; MÄHLER u. KÖHL 2009) dokumentieren eine hohe Prävalenz von MNV-Infektionen bei Labormäusen. In der bis dato größten Studie (PRITCHETT-CORNING et al. 2009) wiesen 32,4% von 44.876 getesteten Serumproben MNV-spezifische Antikörper auf. Die Bedeutung von murinen Noroviren als mögliche Einflussgröße für Tierexperimente ist gegenwärtig unklar und Untersuchungsziel verschiedener Forschergruppen. Ziel dieser Arbeit war es, ein murines Norovirusisolat zu charakterisieren, direkte und indirekte Nachweisverfahren für MNV zur Erfassung der Prävalenz in einer Labortierhaltung zu entwickeln, sowie den Einfluss des murinen Norovirus auf die Interleukin-10 (IL10) defiziente Maus - ein Tiermodell für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) (KÜHN et al. 1993) - zu untersuchen. 1 Literaturübersicht 2 Literaturübersicht 2.1 Caliciviridae Die Familie der Caliciviridae besteht aus kleinen (27 bis 40 nm) unbehüllten ikosaedrischen Viren. Ihr Genom ist eine lineare, positiv polare, einsträngige RNA. Innerhalb der Familie Caliciviridae gibt es vier Genus: Norovirus, Sapovirus, Vesivirus und Lagovirus. Die am häufigsten auftretenden humanmedizinschen Krankheitserreger dieser Familie gehören zu den Noro- und Sapoviren, die eine akute Gastroenteritis hervorrufen. Diese sind auch bekannt als „Norwalk-like“ Viren; erstmals wurde ein Krankheitsausbruch 1968 an einer Schule in Norwalk/Ohio in den USA beschrieben und weitergehend untersucht (DOLIN et al. 1972). Wichtige veterinärmedizinische Erreger sind das feline Calicivirus (FCV, Vesivirus), das Atemwegserkrankungen bei der Katze hervorruft, und das Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen, abgekürzt RHDV (rabbit hemorrhagic disease virus), das zu den Lagoviren gehört (FIELDS et al. 2007). Noroviren bei Labornagern Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST et al. 2003). Weitere murine Noroviren mit der Bezeichnung MNV-2, MNV-3 und MNV-4 wurden 2006 isoliert (HSU et al. 2006) und charakterisiert (HSU et al. 2007). Im gleichen Jahr wurden auch in Berlin drei neu Stämme isoliert und charakterisiert (MÜLLER et al. 2007). Thackray et al. vergleichen 2007 die Genome 21 neuer MNVIsolate mit 5 bekannten und nehmen eine phylogenetische Einteilung in 15 Stämme vor (THACKRAY et al. 2007). Auch aktuell werden weitere Isolate publiziert (KIM et al. 2010). Bisher konnten keine Noroviren bei Ratten oder anderen Nagern nachgewiesen werden (HENDERSON 2008). 2 Literaturübersicht 2.2 Genetik und Molekularbiologie von MNV Das murine Norovirus besitzt ein lineares, positiv polares, einsträngiges RNAGenom, das ungefähr 7,5 kb lang ist und drei offene Leseraster beinhaltet (ORF1, ORF2 und ORF3; Abbildung 1) (FIELDS et al. 2007). ORF1 kodiert ein Polyprotein, das durch eine 3C-ähnliche Protease endolytisch in mindestens sechs nichtstrukturelle Proteine gespalten wird (BLAKENEY et al. 2003). ORF2 kodiert das Haupt-Kapsid-Protein (Virales Protein 1). ORF 3 kodiert das virale Protein 2, das eine Rolle bei der Stabilität vom Kapsid-Protein spielt (HSU et al. 2006). Ein viertes offenes Leseraster, das sich mit ORF2 überlappt, wird von Thackray beschrieben (THACKRAY et al. 2007). Die verschiedenen murinen Noroviren weisen eine genetische Diversität von bis zu 13% auf (THACKRAY et al. 2007). Konservierte Bereiche werden in der „junction region“ zwischen ORF1 und ORF2 beschrieben (MÜLLER 2009). Abbildung 1: Schema des MNV-Genoms; unterhalb der Leseraster sind die verschiedenen Proteinprodukte mit ihrem Gewicht in Kilodalton aufgeführt; N, N Terminus; 3A, NTPase 3A-like; P, Vpg Protease; RdRp, RNA dependent RNA Polymerase; VP1, VP2 Hauptkapsidproteine (HENDERSON 2008). 3 Literaturübersicht Das murine Norovirus ist unbehüllt, hat eine Größe von 28 - 35 nm und weist die typische äußere Kelchstruktur der Caliciviridae auf (siehe Abbildung 2 und Abbildung 3) (KARST et al. 2003). Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von MNV-1 (markiert durch schwarze Pfeile) (HSU et al. 2005). 4 Literaturübersicht Abbildung 3: Dreidimensionale Rekonstruktion anhand cryoelektronen- mikroskopischer Aufnahmen von humanem Norovirus (NV, virus-like particles), murinem Norovirus (MNV) und dem Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen (RHDV, virus-like particles) im Vergleich (KATPALLY et al. 2010). 2.3 MNV in der Zellkultur Als erstes Virus des Genus Norovirus ist eine Anzucht von MNV in der Zellkultur möglich. Das murine Norovirus zeigt dabei einen Tropismus zu Makrophagen und dendritischen Zellen (WOBUS et al. 2004). Die Anzucht erfolgt in der Mausmakrophagen-Zelllinie RAW 264.7 (RASCHKE et al. 1978; WOBUS et al. 2004). Das Virus verursacht einen deutlichen cytopathischen Effekt (CPE). Eine 5 Literaturübersicht Virusquantifizierung erfolgt daher mittels Plaque-Test (WOBUS et al. 2004). Nicht alle isolierten MNV-Stämme weisen jedoch auszählbare Resultate im Plaque-Test auf. In diesen Fällen wird ein „tissue culture infectious dose“ (TCID)50-Test angewandt (MÜLLER et al. 2007; THACKRAY et al. 2007). Durch Passagieren in der Zellkultur kann es zu einer Attenuierung von MNV kommen (WOBUS et al. 2004). In einem Fall ließ sich diese Attenuierung auf eine Aminosäurenveränderung auf Position 296 des Viruskapsid-Proteins zurückführen. Wird die Veränderung rückgängig gemacht, erreicht der Erreger seine alte Virulenz im Infektionsversuch mit signal transducer and activator of transcription (STAT) 1defizienten Mäusen (KARST et al. 2003; BAILEY et al. 2008). Die erfolgreiche Anzucht ermöglicht biochemische und molekulare Untersuchungen zum Zelleintritt und zur Replikation des murinen Norovirus. So untersuchten Perry et al. den Mechanismus des Zelleintritts von MNV1-Virionen, der im Gegensatz zu felinen Caliciviren keinen niedrigen pH-Wert im Endosom erfordert (PERRY et al. 2009; PERRY u. WOBUS 2010). Ein niedriger pH-Wert löst bei felinen Caliciviren die Freisetzung des Virusgenoms in der Zelle aus (STUART u. BROWN 2006). Gerondopoulos et al. untersuchten weitere Abhängigkeiten der Virusendozytose bei MNV-1 (GERONDOPOULOS et al. 2010). Elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusreplikation zeigen starke Veränderungen der Zellmorphologie. Unter Verlust eines intakten Golgi-Apparates werden intrazelluläre Membranen extensiv umgewandelt (WOBUS et al. 2004). Hyde et al. untersuchten die Virus-Replikation und spätere Proteinlokalisation in der Wirtszelle bei MNV-1 (HYDE et al. 2009; HYDE u. MACKENZIE 2010). Han et al. analysierten die in vitro RNA-Synthese-Aktivität der „RNA dependent RNA Polymerase“ (HAN et al. 2010). Die virusbedingte Zellapoptose mit MNV infizierter Makrophagen erfolgt durch eine Aktivierung von Kaspase-9 und Kaspase-3. Außerdem herunterreguliert (BOK et al. 2009). 6 wird die Expression von Survivin Literaturübersicht 2.4 Nachweisverfahren für MNV MNV kann in der Zellkultur vermehrt und anschließend mittels Ultrazentrifugation per Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradient aufgereinigt werden. Es ergibt sich eine Bande auf der Höhe anderer Noroviren (Dichte 1,36 ± 0,04 g/cm³) (KARST et al. 2003). Aus der entnommenen Bande angefertigte elektronenmikroskopische Präparate zeigen Partikel mit der für Caliciviren typischen Struktur (KARST et al. 2003). Das MNV-Genom kann mittels PCR nachgewiesen werden. Hierzu muss die VirusRNA zuerst zu cDNA umgeschrieben werden. Dann erfolgt im zweiten Schritt eine Vervielfältigung der cDNA. Da Noroviren eine hohe Mutationsrate haben, ist ein Nachweis aller murinen Noroviren mit einem Primerpaar bisher nicht beschrieben. Bisher werden mehrere Primerpaare für einen diagnostischen Nachweis herangezogen (HENDERSON 2008). Ein Nachweis ist beschrieben aus Milz, Leber, Mesenteriallymphknoten, Duodenum, Jejunum, Zäkum und Kotproben (HSU et al. 2005; MANUEL et al. 2008; GOTO et al. 2009). Dabei gelten Kot sowie Organe des Magen-Darm-Traktes, vor allem Zäkum und Mesenteriallymphknoten, als zuverlässige Nachweisorte für MNV (GOTO et al. 2009). Auch das „Poolen“ von mehreren MNV-negativen und einer MNV-positiven Kotprobe sowie das anschließende Lagern bei Raumtemperatur für 14 Tage führten zu einem positiven PCR-Ergebnis (MANUEL et al. 2008). Der PCR-Nachweis wird erschwert durch die variable Ausscheidungsdauer von MNV je nach Virusstamm und infiziertem Mausstamm (HSU et al. 2006). Von der Maus gegen MNV gebildete Antikörper können mit serologischen Tests nachgewiesen werden. Hsu et al. stellten eine Kreuzreaktivität bei Antikörpern gegen MNV-1, MNV-2, MNV-3 und MNV-4 fest (HSU et al. 2006). Die Antikörper richten sich dabei gegen das Viruskapsid (CHACHU et al. 2008). Die Kreuzreaktivität ermöglicht die Anwendung serologischer Testverfahren wie multiplex fluorescent immunoassay (MFI), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) und immunofluorescence assay (IFA) (HSU et al. 2005). Murine Noroviren sind 7 Literaturübersicht Bestandteil einer einzigen Genogruppe und weisen einen Serotyp auf (THACKRAY et al. 2007). 2.5 MNV-Prävalenz in Versuchstierhaltungen Die Prävalenz von MNV in Labortierhaltungen in den USA und Kanada wurde 2005 anhand von 12639 Serumproben untersucht. Hierbei ergab sich eine Prävalenzrate von 22,1% (HSU et al. 2005). Eine von Januar 2007 bis Juni 2008 durchgeführte Erhebung bei Mäuseseren aus westeuropäischen Labortierhaltungen ergab für MNV eine Prävalenzrate von 31,8% (MÄHLER u. KÖHL 2009). Die bisher größte Studie ergab eine Prävalenzrate von 32,4% bei 44876 auf MNV getesteten Mäuseseren, die aus Versuchstierhaltungen in Nordamerika und Europa stammten (PRITCHETTCORNING et al. 2009). Eine koreanische Studie zeigte eine 36,5 prozentige serologische Prävalenz für MNV bei gentechnisch veränderten Mäusen (YEOM et al. 2009). Goto et al. untersuchten Maus-Zäkum-Proben von verschiedenen Labortierhaltungen per PCR auf ein Vorhandensein von MNV und ermittelten dabei eine Prävalenzrate von 13,1% (GOTO et al. 2009). 2.6 Erfassung und Bekämpfung von MNV in der Labortierhaltung Der Einsatz von Anzeiger-Mäusen zur MNV-Erfassung im Experiment wird in zwei Studien erläutert. Bei Manuel et al. waren 80% der Anzeiger-Mäuse positiv für MNV im PCR-Nachweis, nachdem sie Kontakt zur Einstreu von mit MNV infizierten Mäusen hatten (MANUEL et al. 2008). Eine gegensätzliche Beobachtung schildern Compton et al. Hier kam es keineswegs immer zu einer MNV-Infektion nach Haltung von Anzeiger-Mäusen auf der Einstreu von MNV-infizierten Mäusen (COMPTON et al. 2010). Die Sanierung eines Haltungsbereichs, in dem Mäuse mit MNV infiziert waren, gelang nur durch Keulen aller Tiere und anschließende Raumdesinfektion vor der Neubesiedlung. Eine Testung und Entfernung positiver Tiere allein war nicht erfolgreich (KASTENMAYER et al. 2008; GOTO et al. 2009). Eine Infektion neugeborener Mäuse von MNV-positiven Muttertieren konnte durch Transfer der 8 Literaturübersicht Säuglinge auf MNV-freie Ammen („cross fostering“) in den ersten 24 Stunden nach der Geburt verhindert werden (ARTWOHL et al. 2008; COMPTON 2008). Eine andere Studie hatte weniger Erfolg bei der Sanierung von gentechnisch manipulierten Mäusen durch „cross fostering“ (YEOM et al. 2009). Embryotransfer und Hysterektomie wurden ebenfalls als erfolgreiche Eradikationsmethoden beschrieben (PERDUE et al. 2007; GOTO et al. 2009). 2.7 Infektionsverlauf Die Infektion mit MNV unterscheidet sich in Dauer und klinischer Symptomatik je nach infiziertem Mausstamm als auch dem für die Infektion verantwortlichen Norovirusstamm (WOBUS et al. 2004; MUMPHREY et al. 2007; THACKRAY et al. 2007; KELMENSON et al. 2009). Je nach Virusstamm und infiziertem Mäusestamm kann es zu einer persistenten Infektion oder verlängerten Ausscheidung über den Kot kommen (HSU et al. 2006). Bei immunkompetenten 129S6 Mäusen wurde eine Infektionsdauer mit MNV-1 von 7-14 Tagen festgestellt. Bei immunkompetenten Hsd:ICR Mäusen dauerte die Infektion 5 Wochen und länger. Die Infektion ging nicht mit klinischen Symptomen einher (KARST et al. 2003; HSU et al. 2005). Bei bestimmten Defizienz immundefizienten und Mausstämmen STAT1-Defizienz] konnte die [Interferon Infektion (INF)-αβγ jedoch zu Rezeptortödlichen systemischen Erkrankungen wie Enzephalitis, Vaskulitis, Meningitis, Hepatitis und Pneumonie führen. Bei anderen immundefizienten Mausstämmen [Recombinationactivating gene (RAG)1- und RAG2-Defzienz] persistierte die Infektion länger als 90 Tage ohne jegliche Krankheitssymptome (KARST et al. 2003). 2.8 Untersuchungen zum Einfluss von MNV auf bestimmte Mausstämme und Tiermodelle - Ward et al. erforschten die Pathologie natürlich vorkommender MNV-Infektionen bei 28 immundefizienten Mäusen verschiedener Genotypen in zwei verschiedenen Maushaltungen. In der einen Haltung stellten sie bei Tieren mit verschiedenen kombinierten genetischen Defekten Hepatitis, Peritonitis oder Pneumonie anhand histologischer Veränderungen fest. Diese kombinierten 9 Literaturübersicht genetischen Defekte betrafen das RAG1, den IFNγ-Rezeptor, OT-1, OT-2 und STAT1. RAG2-defiziente Mäuse aus der zweiten Maushaltung waren histologisch unauffällig. Bei ihnen wurde MNV jedoch per PCR im Mesenteriallymphknoten nachgewiesen (WARD et al. 2006). - Wobus et al. stellten eine STAT1-abhängige Interferon-Immunantwort im Zellkultur- und Infektionsversuch fest (WOBUS et al. 2004). Mumphrey et al. infizierten im Folgeversuch Wildtyp- und STAT1-defiziente Mäuse. Verwandt wurden zwei verschiedene MNV-Isolate, eines davon war attenuiert. Neugeborene Wildtyp-Mäuse zeigten weder Diarrhoe noch Gewichtsverlust. Bei den STAT1-defizienten Mäusen kam es zu einem Gewichtsverlust. Außerdem wurden milde histologische Veränderungen in Darm und Milz erfasst. Das Virus wurde in Milz, Leber, Lunge und Lymphknoten nachgewiesen; in der Milz konnte MNV dauerhaft bis Versuchsende nachgewiesen werden, was für eine persistente Infektion spricht (MUMPHREY et al. 2007). - Chachu et al. beobachteten einen längeren Verlauf einer MNV-Infektion bei BZell-defizienten Mäusen. Außerdem versahen sie RAG1-defiziente Mäuse mit Splenozyten von B-Zell defizienten Mäusen. Dies führte nicht zu einer Virusclearance. Die Gabe von polyklonalem Anti-MNV-Serum oder monoklonalen Antikörpern verringerte den systemischen und luminalen Virusgehalt (CHACHU et al. 2008). - Lencioni et al. untersuchten den Einfluss von MNV-4 auf die multiple drug resistance 1α (MDR1α) defiziente Maus, ein Tiermodell für CED. Die Infektion mit MNV-4 und anschließender Verabreichung von Helicobacter (H.) bilis 7 Tage danach führte hierbei zu größerem Gewichtsverlust und höhergradigen histologischen Veränderungen im Vergleich zur Kontrollgruppe, die nur mit H. bilis infiziert wurde. Eine alleinige MNV-4-Infektion führte zu erhöhten SerumBiomarkern. Mittels Durchflusszytometrie wurden außerdem Veränderungen bei dendritischen 10 Zellen (CD11c+) und anderen nicht T-Zell (CD4- CD8-) Literaturübersicht Populationen ermittelt. Dendritische Zellen, gewonnen aus MNV-4-infizierten Mäusen, sorgten für eine höhere IFNγ-Sekretion bei polyklonalen T-Zellen im in vitro-Versuch an Tag 2 p.i. Zu späteren Messzeitpunkten wurde keine höhere IFNγ-Sekretion gemessen. Die akute Infektion mit MNV-4 förderte die AntigenPräsentation dendritischer Zellen und wirkte sich immunmodulatorisch auf den Krankheitsverlauf aus. Es wurden keine klinische Symptome bei Mäusen beobachtet, die nur mit MNV-4 infiziert waren (LENCIONI et al. 2008). - McCartney et al. untersuchten den Einfluss von MNV auf melanomadifferentiation-associated gene (MDA)5- und toll-like receptor (TLR)3-defiziente Mäuse sowie dendritische Zellen mit dem jeweiligen Defekt. Sowohl bei MDA5defizienten Mäusen als auch bei MDA5-defizienten dendritischen Zellen wurde ein höherer Virustiter im Vergleich zum Wildtyp durch einen Plaquetest ermittelt. TLR3-defiziente dendritische Zellen hatten keinen höheren Virustiter im in vitroVersuch, TLR3-defiziente Mäuse wiesen jedoch einen leicht erhöhten Virustiter auf. MDA5-defiziente Mäuse eliminierten die MNV-Infektion vollständig (MCCARTNEY et al. 2008). - Doom et al. zeigten, dass MNV kaum Einfluss auf die experimentelle Infektion mit dem Cytomegalievirus der Maus (MCMV) hat. Lediglich die CD8 T-Zell-Antwort wurde in der akuten Phase der Infektion geringgradig herabgesetzt. Eine MNVInfektion führte nicht zu einem Wiederaufblühen einer latenten MCMV-Infektion (DOOM et al. 2009). - Hensley et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf die adaptive Immunität gegen das Vaccinia oder Influenza A Virus bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest (HENSLEY et al. 2009). - Compton et al. erforschten den Einfluss von MNV auf die Ausscheidung von Maus Parvovirus (MPV). Eine MNV-Infektion verlängerte die Ausscheidungsdauer von MPV über den Kot und erhöhte den MPV-DNA-Spiegel in Organen von 11 Literaturübersicht BALB/c-Mäusen. Die Serokonversion für MPV erfolgte bei einer Doppelinfektion von BALB/c-Mäusen innerhalb kürzerer Zeit. Außerdem konnte bei AnzeigerMäusen, die Kontakt mit der Einstreu MNV-infizierter Tiere hatten, nicht in jedem Fall eine Serokonversion für MNV festgestellt werden (COMPTON et al. 2010). - Paik et al. stellten keinen Einfluss von MNV auf ernährungsbedingte Fettleibigkeit und Insulinresistenz bei C57BL/6 Wildtyp Mäusen fest. Bei diesen Mäusen war vor der Infektion durch eine extrem fettreiche Diät eine Insulinresistenz herbeigeführt worden (PAIK et al. 2010). 2.9 Weitere Forschung mit murinen Noroviren Da das murine Norovirus in der Zellkultur anzüchtbar ist, wird es als Ersatz für das humane Norovirus im Rahmen der Effektivitätsuntersuchung von Desinfektionstechniken und -mitteln verwendet (BAERT et al. 2008; PARK et al. 2010). Auch für die Erfassung sowie Reduktion des Eintrags von Noroviren in die Lebensmittelkette über Muscheln, Fisch, Salat und Gemüse wird MNV als Surrogatmarker eingesetzt (WEI et al. 2010, 2011). 2.10 Tiermodelle für chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED) CED sind charakterisiert durch rezidivierende oder kontinuierliche Entzündungen des Intestinaltraktes (BAUMGART u. CARDING 2007; BAUMGART u. SANDBORN 2007). Zu den häufigsten CED beim Menschen gehören Morbus Crohn und Colitis ulcerosa (FARROKHYAR et al. 2001). Morbus Crohn ist durch eine transmurale Entzündung verschiedener Segmente des Gastrointestinaltraktes mit diskontinuierlicher Ausbreitung und episodischer Progression gekennzeichnet. Hierbei können Strikturen, Abszesse und Fisteln als Komplikation auftreten (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Colitis ulcerosa weist eine Entzündung der Mukosa und oberflächlichen Submukosa des Kolons auf, die schubweise voranschreitet und sich kontinuierlich nach oral ausbreitet. Typische Symptome für beide Erkrankungen sind blutige bis wässrige Durchfälle, Bauchschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und Fieber (BAUMGART u. SANDBORN 2007). Die Äthiopathogenese 12 Literaturübersicht der CED ist bisher noch nicht vollständig aufgeklärt. Es gibt deutliche Hinweise, dass durch eine Kombination von immunologischen und umweltbedingten Faktoren eine unkontrollierte Immunantwort innerhalb des Darms ausgelöst wird, die in einem genetisch prädisponierten Individuum zu einer chronischen Entzündung führt (TORRES u. RIOS 2008). Tiermodelle, zum Beispiel für CED, ermöglichen es, störende Umwelteinflüsse durch standardisierte Haltungsbedingungen zu kontrollieren. Durch den Einsatz von Inzuchtstämmen können Studien an genetisch homogenen Populationen durchgeführt werden. Techniken der Transgenese und der gerichteten Mutagenese stehen zur Verfügung, um das Genom der Tiere gentechnisch zu verändern. Seit Anfang der 90er Jahre werden zahlreiche Tiermodelle, v.a. Mausmodelle, für CED beschrieben, die klinische und histopathologische Analogien zum Morbus Crohn oder zur Colitis ulcerosa aufweisen. Einige Tiermodelle für CED - spontan: SAMP1/Yit-Maus (MATSUMOTO et al. 1998) - durch Chemikalien induziert: Dextran Natriumsulfat (OKAYASU et al. 1990) Trinitrobenzolsulfonsäure (ELSON et al. 1996) Oxazolon (BOIRIVANT et al. 1998) - durch Zelltransfer: CD4+/CD45RBhigh-Zellen in Prkdcscid-Mäuse (POWRIE et al. 1993) Knochenmarkszellen in CD3ε transgene Mäuse (HOLLANDER et al. 1995) - durch genetische Manipulation: IL2-defiziente Maus (SADLACK et al. 1993) IL10-defiziente Maus (KÜHN et al. 1993) MDR1α-defiziente Maus (PANWALA et al. 1998) 13 Literaturübersicht SMAD3-defiziente Maus (YANG et al. 1999) Verschiedene Tiermodelle für CED werden durch Umweltfaktoren beeinflusst. Besonders die Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora sowie spezifische Keime haben starken Einfluss (siehe Tabelle 1). Der genetische Hintergrundstamm der Merkmalsträger kann sich ebenfalls auf den Verlauf der CED auswirken (siehe Tabelle 2). Tabelle 1: Interaktion verschiedener Umweltfaktoren auf das CED-Modell der IL10defizienten Maus Umweltfaktor Haltung unter keimfreien Bedingungen Haltung unter keimarmen Bedingungen bzw. nach Antibiotikagabe Keim Lactobacillus spp. Keim Enterococcus faecalis Keim Helicobacter spp. Auswirkung Referenz Keine Kolitis (SELLON et al. 1998) Reduktion der (KÜHN et al. 1993; MADSEN et al. Kolitissymptome 2000) (MADSEN et al. 1999; SCHULTZ u. SARTOR 2000) Protektiv Proinflammatorisch (BALISH u. WARNER 2002) Proinflammatorisch (CAHILL et al. 1997; KULLBERG et al. 1998; BURICH et al. 2001) Tabelle 2: Ausprägung der Kolitis bei IL10-defizienten Inzuchtstämmen Hintergrundstamm Schwere Kolitis und Verlauf C57BL/6J Mild, protrahiert BALB/c NOD/Lt NOD.NON-H2nb1 129/SvEv C3H/HeJBir C3H.SW Intermediär, progressiv Intermediär, progressiv Intermediär, progressiv Schwer, progressiv Schwer, beginnt sehr früh Schwer, beginnt sehr früh 14 der Referenz (BERG et al. 1996; TAKEDA et al. 1999; BRISTOL et al. 2000) (BERG et al. 1996) (MÄHLER u. LEITER 2002) (MÄHLER u. LEITER 2002) (TAKEDA et al. 1999) (BRISTOL et al. 2000) (MÄHLER u. LEITER 2002) Literaturübersicht 2.11 Die Interleukin-10 defiziente Maus Die IL10-defiziente Maus (formal: Il10tm1Cgn; abgekürzt Il10-/-) wurde 1993 am Institut für Genetik der Universität Köln durch gezielte Mutation entwickelt (KÜHN et al. 1993). Ein Teil des ersten Exons des IL10-Gens (Codon 5-55) wurde mit Hilfe homologer Rekombination durch ein Stopcodon und ein neo-Gen (Neomycin exprimierend) ersetzt. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Exon 3 des Gens eingefügt. Mäuse mit dieser Nullmutation entwickeln nach dem Absetzen eine spontane Form der CED. Der Entzündungsprozess kann sich über den gesamten Intestinaltrakt erstrecken. Er tritt dabei segmental, teilweise transmural auf. Histologisch ist diese Enterokolitis durch Entzündungszellinfiltrate in der Lamina propria und der Submukosa, Erosionen und Ulzerationen der Mukosa, Schleimhauthyperplasie, eine abnorme Kryptarchitektur, Becherzelldepletionen sowie Kryptabszesse gekennzeichnet (KÜHN et al. 1993; LÖHLER et al. 1995; BERG et al. 1996). Im Spätstadium der Erkrankung können kolorektale Tumoren auftreten (BERG et al. 1996). Da bei IL10-defizienten Mäusen außer dem Intestinaltrakt keine weiteren Organsysteme entzündlich verändert sind, eignet sich dieses Tiermodell besonders für Studien bezüglich der CED. Daher wurde es auch an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) bereits häufig untersucht und für CED-Studien eingesetzt (MOST 2001; BLEICH 2003; BÜCHLER 2010). IL10 ist ein regulatorisches Zytokin, welches von zahlreichen Immunzellen, wie Makrophagen, dendritischen Zellen und T-Zellen produziert wird. Innerhalb der TZellen sezernieren fast alle Untergruppen IL10, inklusive Th1-, Th2- und regulatorischen T-Zellen (MURRAY 2006). Neben Immunzellen sind auch Epithelzellen und Keratinozyten in der Lage, IL10 freizusetzen. IL10 unterdrückt die Effektorfunktion von Th1/Th17-Zellen, Natürlichen Killerzellen und Makrophagen. Es moduliert die zelluläre Immunreaktion (MOORE et al. 1993). Diese modulierenden Effekte bleiben bei IL10-defizienten Mäusen aus. Ihr Immunsystem reagiert gegenüber luminalen Antigenen bzw. der intestinalen Bakterienflora mit einer überschießenden Immunantwort (siehe Abbildung 4) (BERG et al. 1996). Eine Analyse von konditionalen Knockout-Mäusen, bei denen IL10 nur in T-Zellen 15 Literaturübersicht inaktiviert wurde, zeigte eine vergleichbare Kolitis wie bei IL10-defizienten Mäusen (ROERS et al. 2004). Das von T-Zellen produzierte IL10 ist also essentiell für die Verhinderung einer spontanen CED in diesem Tiermodell. Vermutlich nehmen die IL23-Th17-Achse und die von Th17-Zellen produzierten Zytokine wie IL17, IL21, IL22, Tumornekrosefaktor (TNF), granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) und IL6 eine wichtige Funktion bei der Entzündungsreaktion ein (YEN et al. 2006). Abbildung 4: Pathogenese der CED bei IL10-defizienten Mäusen, modifiziert nach Powrie (POWRIE 1995) und Elson (ELSON 1999). 16 Literaturübersicht 2.12 Ziele dieser Arbeit Ziel dieser Arbeit war es, das bereits isolierte murine Norovirus zu charakterisieren. Das Virus sollte mit gebräuchlichen Methoden quantifiziert werden. Zusätzlich sollte eine serologische Diagnostik in Form eines ELISA aufgebaut werden. Mit Hilfe serologischer Testverfahren sollte die Prävalenz für MNV in einer Labortierhaltung dem Zentralen Tierlaboratorium (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) – ermittelt werden. Nach der Charakterisierung sollten dann Infektionsversuche durchgeführt werden, die den Einfluss von MNV auf die IL10-defiziente Maus - ein Tiermodell für CED (KÜHN et al. 1993) - erfassen. 17 Eigene Untersuchungen 3 Eigene Untersuchungen 3.1 Material Die Durchführung der Versuche wurde mit den Bescheiden vom 13.03.2008 und 10.04.2008 durch das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit mit den Aktenzeichen 08/1443 und 08/1467 genehmigt. 3.1.1 Mäuse In der Zeit vom 2.4.2008 bis 6.5.2009 wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Mäuseinzucht- und Defektmutantenstämme für den Infektionsversuch mit dem murinen Norovirus Stamm Hannover eingesetzt. Im Weiteren werden für eine übersichtlichere Gestaltung nur noch die entsprechenden Abkürzungen für die Mausstämme benutzt. Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung Stammbezeichnung C3H/HeJBirZtm C57BL/6JZtm C3Bir.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm B6.129P2-Il10tm1Cgn/JZtm 3.1.2 Knockout/ Wildtyp Wildtyp Wildtyp Knockout Knockout Abkürzung C3-wt B6-wt C3-Il10-/B6-Il10-/- Herkunft Alle im Experiment eingesetzten Mäuse stammten aus Zuchten des ZTL der MHH. Sie wurden dort regelmäßigen, mikrobiologischen Kontrolluntersuchungen entsprechend den Empfehlungen der Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA) unterzogen (NICKLAS et al. 2002). Die Versuchstiere entstammten aus Haltungsbereichen, die frei von bakteriellen, viralen (inklusive MNV) und parasitären Infektionserregern gemäß der Empfehlungsliste der FELASA waren. 18 Eigene Untersuchungen 3.1.3 Haltung im Experiment Die experimentell infizierten Mäuse wurden im S2-Bereich des ZTL der MHH in einem belüfteten Käfigregalschrank (Scantainer) gehalten. Es wurden jeweils 1-5 Mäuse in Makrolon-Käfigen des Typs II oder III mit Filterdeckeln getrenntgeschlechtlich gehalten. Die Kontrolltiere wurden bis auf 5 Tiere in der Haltungsabteilung belassen, um eine mögliche Kontamination mit MNV zu vermeiden. Die 5 Kontrolltiere, die gesondert mit im Käfigregalschrank saßen, wurden daher zuerst umgesetzt und versorgt. Futter (Tabelle 4) und autoklaviertes Trinkwasser (über Tränkeflaschen) wurden ad libitum angeboten. Die Einstreu wurde ein- bis zweimal in der Woche erneuert. Die Reinigung der Käfige erfolgte routinemäßig. Die Raumtemperatur betrug 22 ± 2° C, die relative Luftfeuchte lag bei 55 ± 5%. Der Hell-Dunkel-Zyklus wurde automatisch geregelt; es herrschte ein Lichtrhythmus von 14 Stunden Helligkeit zu 10 Stunden Dunkelheit, wobei die Hellphase von 7 bis 21 Uhr mitteleuropäischer Zeit (MEZ) dauerte. Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF Inhaltsstoffe Rohprotein Rohfett Rohfaser Rohasche Kalzium Phosphor Zusatzstoffe Vitamin A Vitamin D3 Vitamin E Vitamin C Kupfer Prozent % 19,0 4,0 6,0 7,0 0,9 0,7 je Kilogramm 15000 I.E. 600 I.E. 75 mg 36 mg 5 mg 19 Eigene Untersuchungen Verwendete Lösungen Alle verwendeten Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, über die Firma Carl Roth in Karlsruhe bezogen. Phosphate buffered saline (PBS) (pH = 7,2) Menge 8,00 g 0,20 g 1,15 g 0,20 g 1,0 l 0,10 g NaCl (Natriumchlorid) KCl (Kaliumchlorid) Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) Aqua bidest. CaCl2 (Calciumchlorid) MgCl2 x 6 H2O (Magnesiumchlorid – 0,10 g Hexahydrat) PBS Tween (pH = 7,4) NaCl (Natriumchlorid) KCl (Kaliumchlorid) Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) Aqua bidest. Tween 20 Menge 8,00 g 0,20 g 2,90 g 0,20 g 1,0 l 0,5 ml PBSM (pH = 7,2) NaCl (Natriumchlorid) KCl (Kaliumchlorid) Na2HPO4 (di-Natriumhydrogenphosphat) KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat) Aqua bidest. Menge 8,00 g 0,20 g 1,15 g 0,20 g 800 ml Evan´s Blue Evans blue Glycerin Aqua bidest. 20 Menge 5 mg 200 ml 800 ml Eigene Untersuchungen Coating Buffer (ph = 9,6) Na2CO3 (Natriumcarbonat, wasserfrei) NaHCO3 (Natriumhydrogencarbonat) Aqua bidest. Menge 1,59 g 2,93 g 1,0 l Konjugate Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-FITC Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule)-Peroxidase Hersteller/ Artikelnummer Sigma / Art. F 0257 Sigma / Art. A 4416 10x TBE-Puffer TRIS Borsäure EDTA Aqua bidest. Menge 108 g 53,4 g 7,4 g ad 1 l 1x TBE-Puffer 10x TBE-Puffer Aqua bidest. Menge 100 ml 900 ml Orange G-Ladepuffer Orange G (Sigma) Glycerin 99% Aqua bidest. Menge 0,05 g 30 ml 70 ml RAW-Medium Pro Flasche Dulbecco´s Modified Eagle´s medium (DMEM) Fetales Kälberserum (FKS) Ultra Low Endotoxin (L.E.) Penicillin-Streptomycin Menge 22 ml 2,5 ml 0,5 ml 21 Eigene Untersuchungen Anti-mCD3 PBS Anti-mCD3 (145-2C11) 1 µg/µl Menge 10 ml 50 µl Lymphozyten-Medium RPMI 1640 FKS Ultra Low Endotoxin NEA (nicht essentielle Aminosäuren) L-Glutamin 2-Mercaptoethanol Pyruvat Penicillin-Streptomycin Menge 500 ml 25 ml 5 ml 5 ml 0,5 ml 5 ml 5 ml Neutrales Formalin nach Sörensen (10%ig) Puffer A Kaliumhydrogenphosphat Aqua bidest. Menge 13,6 g 1l Puffer B Kaliumhydrogenphosphat Aqua bidest. 17,7 g 1l Puffer A Puffer B 35 – 37% Formalin 352,8 ml 547,2 ml 100 ml 3.1.4 Synthetische Oligonukleotide Für die Umschreibung der MNV-RNA in cDNA wurden Oligo(dT)18 und Random Hexamer Primer der Firma Fermentas vergleichend eingesetzt. Die zur Detektion und Sequenzierung verwendeten Primer wurden von der Firma Sigma Aldrich bezogen. Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV 5205f 5388r 5469r 22 Sequenz von 5´ nach 3´ AATTGACCCCTGGATCTTCC GACCAGCTGAACCTCCATGT AGTGGTGAGTGACCCTTTGG Eigene Untersuchungen Fortsetzung Tabelle 5 5473f CAGATCACATGCTTCCCAC 5659r AGACCACAAAAGACTCATCAC 5580f 5671r GGAGGAATCTATGCGCCTGG GAAGGCGGCCAGAGACCAC 4972f 5580r CACGCCACCGATCTGTTCTG GCGCTGCGCCATCACTC 5004f 5219r 5277r TTTGGAACAATGGATGCTGA ATCCAGGGGTCAATTTGGTT GGTGTTTCGAGGTGAAATGG Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV Noro Hannover for 1 Noro Hannover rev 1 Noro Hannover for 2 Noro Hannover rev 2 Noro Hannover for 3 Noro Hannover rev 3 Sequenz von 5´ nach 3´ GTGAAATGAGGATGGCAACG GTGATGACATCTGTGGCCAT ATGGCCACAGATGTCATCAC GGAAGCATGTGATCTGAGCA TGCTCAGATCACATGCTTCC GCCAACGACCGGGAGGCCAGCTTTTTTTTTTTTTTTV Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV Norosense 1 Noroantisense 1 Norosense 2 Noroantisense 2 Norosense 3 Noroantisense 3 Norosense 1 Noroantisense 1 Sequenz von 5´ nach 3´ CCGATCAAGAACCTACTGGCA AATCATCCCAGAGAACCACC ACTTCACCAATGCCGTTA CAAACTGGTCACCGACTATC TTCCTTCCAAGATGAGCTCC CCCTGAGTAAGACACAGCAA CCGATCAAGAACCTACTGGCA AATCATCCCAGAGAACCACC Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA Sequenz von 5´ nach 3´ RPS9f TGACGTTGGCGGATGAGCACA RPS9r TTTTTGACAGGGGGAGTGG Hierbei wurde das Housekeeping Gen RPS-9 nachgewiesen. 23 Eigene Untersuchungen Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus H276f H676r Sequenz von 5´ nach 3´ CTATGACGGGTATCCGGC ATTCCACCTACCTCTCCCA B38 B39 GCATTTGAAACTGTTACTCTG CTGTTTTCAAGCTCCCCGAAG 3.1.5 Zelllinie Zur Anzucht von MNV wurden RAW 264.7 Zellen verwendet (ATCC TIB-71™). Es handelt sich hierbei um eine Mausmakrophagenzelllinie, die vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) Heidelberg zur Verfügung gestellt wurde. Die Zelllinie wurde von der Firma QM Diagnostics (Nimwegen, Niederlande) per PCR negativ auf Mycoplasmen getestet. 3.1.6 Eingesetzter Virusstamm Der im Experiment eingesetzte Virusstamm wurde aus NOD-Prkdcscid-Mäusen des ZTL der MHH isoliert und nach genetischer Charakterisierung als Murines Norovirus/Hannover1/2007/DEU (MNV-h) bezeichnet. 3.1.7 Eingesetzter Bakterienstamm Der im Experiment eingesetzte Bakterienstamm H. hepaticus wurde im ZTL der MHH von Mitarbeitern des mikrobiologischen Labors im Rahmen der wissenschaftlichen Arbeit von Frau Büchler isoliert und angezüchtet (BÜCHLER 2010). 3.1.8 Materialliste Vorversuche Zellkultur Zelllinie RAW 264.7, DKFZ Heidelberg, Deutschland Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Sicherheitswerkbank MSC 1.8, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Zellkultur-Flaschen 75 cm² Vented Cap, Straight Neck, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland 24 Eigene Untersuchungen Zellschaber Cell Scraper, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Medium DMEM High Glucose 4,5 g/l, L-Glutamin, 500 ml, PAA, Parching, Österreich Antibiotikum Penicillin (5000IU/ml) Streptomycin 5000 µg/ml, MP Biomedicals, Eschwege, Deutschland Fetales Kälberserum Ultra Low Endotoxin, PAA, Parching, Österreich Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Glas-Gewindeflaschen mit flachem Boden und Deckel, Omnilab, Bremen, Deutschland Gefrierschrank Premium No-Frost, Liebherr, Biberach an der Riss, Deutschland -80° C Truhe 6385, GFL, Großburgwedel, Deutschland Identifizierung, Sequenzierung Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland Primer Fermentas, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA Phusion™ Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase, Finnzymes, Maahantuonti, Finnland Stratagene StrataClone PCR Cloning Kit, Agilent, La Jolla, CA, USA QIAprep Spin Miniprep Kit (50), Qiagen, Hilden, Deutschland Sequenzierung: MWG Biotech AG, Ebersberg, Deutschland Software zur Analyse der Sequenz: DNA Dynamo, Blue Tractor Software, North Wales, UK BLAST http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Nachweisverfahren IFA Wasserbad 1008, GFL, Großburgwedel, Deutschland Objektträger Cel-Line Diagnostic Microscope Slides 8 Well 8mm, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland PBS PBSM 25 Eigene Untersuchungen Diluter Microlab 500, Hamilton-Robotics, Martinsried, Deutschland Antikörper Anti Mouse IGG-FITC F0257, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Evans Blue, Fluka, Buchs, Schweiz Fluoreszenzmikroskop DM2000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland Lichtquelle EL6000, Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Deutschland ELISA Zentrifuge Minifuge 2, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ultrazentrifuge L7, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland Ultrazentrifugenrotor SW 28, SW 32, SW 55, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland Bechereinsätze Centrifuge Tubes Polyallomer 32683; 326819 (SW55), BeckmanCoulter Deutschland, Krefeld, Deutschland Sucrose analytical grade, Serva, Heidelberg, Deutschland Waage LA 2200S, Sartorius, Göttingen Waage ALJ 120-4, Kern und Sohn, Balingen-Frommern, Deutschland PBSM Coating Buffer Immuno-Modules U8 Maxisorp 475078, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Multikanal-Pipette Eppendorf, Hamburg, Deutschland Washer Columbus Pro, Tecan, Männedorf, Schweiz PBS Tween Zweitantikörper Anti Mouse IGG Peroxidase, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland ABTS-Substrat Tablets 11 112 422 001, Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland Photometer Sunrise, Tecan, Männedorf, Schweiz Laptop Inspiron 6000, Dell Deutschland, Frankfurt, Deutschland Software Magellan 5.03, Tecan, Männedorf, Schweiz PCR-Nachweis Für die RNA-Isolierung: Nucleospin RNA II Kit, Macherey Nagel, Düren, Deutschland 26 Eigene Untersuchungen Für die DNA-Isolierung: PSP® Spin Stool DNA Kit, Invitek, Berlin, Deutschland Photometer Nanodrop 1000, Peqlab, Erlangen, Deutschland Omniscript RT-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland REDExtract-N-AmpTM PCR ReadyMix, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland Taq PCR Core-Kit, Quiagen, Hilden, Deutschland Primer, Fermentas, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Primer, Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland DNA-Leiter, Biozym Art.-Nr.: 850321 (50321), Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf PTC Thermocycler-200TM, MJ Research, Watertown, MA, USA Magnetrührer L81, Kisker Biotech, Steinfurt, Deutschland Agarose LE Agarose, Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf DNA-Farbstoff Gelstar Nucleic Acid Gel Stain, Lonza, Basel, Schweiz 10x TBE Orange G Ladepuffer, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Gelschlitten, Gelkammer Eigenkonstruktion der MHH, Hannover, Deutschland Gleichstromgerät, Omnilab, Bremen, Deutschland UV-Transilluminator, PC+Kamera, INTAS, Göttingen, Deutschland Virusquantifizierung Mikroskop, Zeiss, Jena, Deutschland Neubauer-Zählkammer 0,1mm Tiefe; 0,0025mm² Fläche, Brand, Wertheim, Deutschland Kristallviolett-Indikator, Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Plaque-Test Platten Multi Dish 6 Well 140675, Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Agarose SeaPlaque, Lonza, Basel, Schweiz TCID50-Test 96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland 27 Eigene Untersuchungen Elektronenmikroskopische Darstellung Tischultrazentrifuge Airfuge® im Institut für Virologie der MHH, Beckman-Coulter Deutschland, Krefeld, Deutschland Elektronenmikroskop Elektronenmikroskopie-Labor MHH, Tecnai 20, FEI Europe; Eindhoven, Niederlande Hauptversuche Infektionsversuche Sicherheitswerkbank Klasse II, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Ventilierter Haltungsschrank, Scantainer, Scanbur Technology, Karlslunde, Dänemark Mini-Isolator „Gnotocage“ (Deckel: Eigenkonstruktion der technischen Werkstatt der MHH; Unterbau: Multifunktionstopf Nalgene DS5300-9212), Hannover, Deutschland bzw. Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Filterdeckelkäfige Typ II, III, UNO, Roestvaststaal BV, Niederlande Futter, pelletiertes Altromin© 1324 total pathogen free (TPF) Haltungsfutter, Altromin, Lage, Deutschland Autoklaviertes Trinkwasser Einstreu, Weichholzgranulat, Fichten- und Tannenholz, Hahn & Co, BredenbeckKronsburg, Deutschland Spritze, Spritzenkolben, Knopfkanüle/Braunüle zur Gavage, Braun, Melsungen, Deutschland Histocassetten, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland Lymphozytenstimulation 3-Polysterene-Reaktionsgefäße-Gefäße 15 ml, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Petrischalen, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Gewebesieb, 40µm BD Falcon M, BD Bioscience, Heidelberg, Deutschland Zentrifuge Eppendorf, Hamburg, Deutschland 28 Eigene Untersuchungen Lymphozytenmedium Zellzählgerät scil Vet ABC, scil animal care company, Viernheim, Deutschland 96-Well Platte 655185, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Anti-mCD3 (145-2C11) 1µg/µl ELISA zur IFNBestimmung (extern: Arbeitsgruppe Detlef Neumann, MHH) mIFN Antikörper eingesetzt als Fänger (an ELISA-Platte gebunden) und späterer Detektor, Pierce Antibodies, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland P96 Immuno MaxiSorb Nunc, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Beschichtungspuffer: 100 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6 Blockpuffer: PBS mit 4 % BSA Lymphozytenmedium Waschpuffer: PBS mit 0,005 % Tween 20 Streptavidin-HRP 0,5 mg/ml Substrat: 3,3’,5,5’-Tetramethyl-Benzidine (TMB) 1 mg/ml in DMSO Substratpuffer: 1,36 g Natriumacetat x 3 H2O + 2,1 g Zitronensäuremonohydrat in 100 ml H2O (pH 4,9) 3% H2O2 Isolation und Anzucht von H. hepaticus für den Doppelinfektionsversuch (ZTL) Brutschrank, Heraeus, Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Deutschland Impföse, Omnilab, Bremen, Deutschland Wattetupfer, Omnilab, Bremen, Deutschland Polypropylen-Röhrchen, Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland Brain-Heart-Infusion Medium, Merck, Darmstadt, Deutschland 0,45 µm Weißrandfilter, Schleicher & Schuell, Basel, Schweiz Petrischale Ø 60 mm, Greiner Bio One, Frickenhausen, Deutschland Columbiaagar, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland Amphotericin B, Biochrom, Berlin, Deutschland Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow), Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland 29 Eigene Untersuchungen Pferdeblut, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland Anaerobiertopf HP0011A, Oxoid Deutschland, Wesel, Deutschland 1,5 ml Schraubdeckelgefäß Twist Top Vial und Twist Top Vial Caps, Sorenson BioScience, Salt Lake City, UT, USA Stereomikroskop zur histologischen Auswertung Zur statistischen Auswertung wurden folgende Programme genutzt: StatView D-4.5, Abacus Corporation Graphpad Prism 5, Graphpad Software Inc., La Jolla, CA, USA Excel 2003, 2007, Microsoft, Redmond, WA, USA 30 Eigene Untersuchungen 3.2 Methoden In den ersten Versuchen mussten grundlegende Erkenntnisse zum Virus gesammelt werden. Das Virus war bereits isoliert worden, jedoch nicht klassifiziert. Außerdem mussten direkte und indirekte Nachweismethoden und Virusquantifizierungsverfahren für den Infektionsversuch etabliert werden. Im Anschluss erfolgten Infektionsversuche, die den Einfluss einer MNV-Infektion auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus erfassen sollten. 3.2.1 Zellkultur Die RAW 264.7 Zellen wurden in 75 ml Filterdeckel-Zellkulturflaschen mit DMEM, 2% Penicillin-Streptomycin und 10% low endotoxine fetalem Kälberserum bei 37° C und 5% CO2-Begasung in einem Brutschrank kultiviert. Zum Passagieren wurde der Zellrasen mit einem Zellschaber abgelöst. Die Zellen wurden dann in 5 ml vorbereitetem Medium und anschließend anteilig je nach gewünschter Zelldichte in insgesamt 25 ml Medium pro Zellkulturflasche resuspendiert. 3.2.2 Virusisolation Die Virusisolation wurde von Mitarbeitern der MHH und der Firma Biodoc (Hannover, Deutschland) durchgeführt. Aus vorhergehenden wissenschaftlichen Veröffentlichungen war bekannt, dass MNV weit verbreitet in versuchstierkundlichen Einrichtungen ist. Klinische Symptome blieben jedoch abhängig vom infizierten Mausstamm aus. Mesenteriallymphknoten und Milz waren als Virusreservoir beschrieben. Eine Virusvermehrung gelang in RAW 264.7 Zellen. Mehrere genetische Sequenzen von MNV-Isolaten waren bereits beschrieben. Als potentielle Virusträger wurden NOD-Prkdcscid-Mäuse, die als Anzeigertiere im ZTL verwendet wurden, eingeschätzt. Von ihnen wurden im Rahmen einer diagnostischen RoutineSektion Mesenteriallymphknoten und Milz gewonnen. Diese wurden bei -80° C eingefroren. Eine kleine Probe der Organe wurde für eine PCR-Untersuchung mit dem Primerpaar 5004f/5219r verwandt. Die PCR-Untersuchung ergab für Milz und Mesenteriallymphknoten der Mäuse einen positiven Befund. Daraufhin wurde ein Viertel der PCR-positiven Milz mit einem Cell-Douncer in DMEM homogenisiert. 31 Eigene Untersuchungen Nach einer Zentrifugation bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) wurde der Überstand filtriert. Mit dem aus dem Milz-Isolat gewonnenen Überstand wurde eine zu 75% besiedelte RAW-Zellkulturflasche beimpft. Nach zwei Tagen trat ein cytopathischer Effekt >90% auf, der bei einer parallel bebrüteten Kontrollflasche nicht zu beobachten war. Die beimpfte Zellkulturflasche wurde daraufhin bei -20° C eingefroren, aufgetaut, erneut eingefroren (-20° C) und dann aufgetaut. Das Medium inklusive cryolysierter RAW 264.7 Zellen sowie vermeintlicher Viruspartikel wurde bei 6000 U/min für 10 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und filtriert, das Pellet wurde verworfen. Das Filtrat wurde in 1 ml Portionen konfektioniert und bei -80° C tiefgefroren. 3.2.3 Virus-Nachweis mittels PCR 3.2.3.1 RNA-Isolation Da es sich bei Noroviren um RNA-Viren handelt, musste zuerst die Virus-RNA aus dem Filtrat gewonnen werden. Hierzu wurde das Macherey Nagel Kit NucleoSpin RNA II mit dem Support-Protokoll zur Isolation von Gesamt-RNA aus Zellkulturüberstand eingesetzt (siehe Anhang S.97). Bei der RNA-Isolation aus Organen wurde ebenfalls das vom Hersteller empfohlene Protokoll angewandt (siehe Anhang S. 97). Zur Isolation von Gesamt-RNA aus Kot wurde erfolgreich ein modifiziertes Protokoll angewandt, das der Hersteller auf Anfrage übersandte. Es handelte sich hierbei um die Modifikation eines Kunden, dem es auf diese Art und Weise gelungen war, RNA aus Kot zu isolieren (siehe Anhang S. 99). 3.2.3.2 Reverse Transkription Um die isolierte RNA weiter zu analysieren, wurde diese mit Hilfe des Quiagen Omniscript RT-Kits umgeschrieben. Für den Reaktionsansatz wurde der RNA-Gehalt der Proben photometrisch bestimmt. Es erfolgte eine Einstellung auf 500 ng RNA pro 10 µl Ansatz. 32 Eigene Untersuchungen Ansatz pro Probe RT-Buffer dNTPs 5 µM Oligo(dT)18 20 µM bzw. Random Hexamer RNAse-Inhibitor 1:4 verdünnt Reverse Transkriptase Eingestellte RNA Summe 2 µl 2 µl 1 µl 1 µl 1 µl 13 µl 20 µl Temperaturprofil für die reverse Transkription Temperatur 37° C 3.2.3.3 Dauer 60 min PCR Die gewünschten cDNA-Abschnitte wurden nun entweder mit dem Redextract-Kit oder dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit vervielfältigt, je nach verwendetem Primerpaar. Ansatz pro Probe Redextract H2O Forward-Primer RPS 9 (13,7 µM) Reverse-Primer RPS 9 (13,7 µM) cDNA Summe 5 µl 2,5 µl 0,25 µl 0,25 µl 2 µl 10 µl Ansatz pro Probe Q-Solution 10x PCR-Buffer dNTPs 2 µM Forward-Primer (13,7 µM) Reverse-Primer (13,7 µM) Taq-Polymerase cDNA Summe 2 µl 1 µl 1 µl 1,5 µl 1,5 µl 0,05 µl 2,95 µl 10 µl 33 Eigene Untersuchungen Anhand von bereits publizierten Sequenzen verschiedener MNV-Stämme (MNV 1 4) wurden passende Primerpaare in einer genetisch konservierten Region entwickelt, mit denen möglichst viele Varianten von MNV reagieren; zusätzlich wurden Primerpaarsequenzen aus Publikationen übernommen. Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.) 5205f/5388r 5004f/5219r Länge des Amplikon 183 bp 215 bp Nach Sequenzierung getestet: 5004f/5277r 5580f/5671r modifiziert (MÜLLER et al. 2007) 4972f/5080r (BAERT et al. 2008) 5205f/5469r 5473/5659r modifiziert (HSU et al. 2006) 273 bp 91 bp 608 bp 264 bp 186 bp Name des Primerpaars Die Probenansätze wurden anschließend mit nachfolgendem Temperaturprofil im Thermocycler zur Reaktion gebracht. Temperaturprofil für die MNV-PCR Temperatur 95° C 94° C 55° C 72° C 39x Schritt 2-4 72° C 8° C Dauer 4 min 1 min 1 min 2 min 7 min Bis zur Entnahme Zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA wurde das Housekeeping-Gen RPS9 mit Hilfe des Primerpaares RPS9f/RPS9r nachgewiesen. Hierbei wurde das Redextract-Kit verwendet. 34 Eigene Untersuchungen Temperaturprofil für die RPS-9-PCR Temperatur 95° C 94° C 55° C 72° C 24x Schritt 2-4 72° C 8° C 3.2.4 Dauer 4 min 1 min 1 min 2 min 7 min Bis zur Entnahme Nachweis von Helicobacter hepaticus mittels PCR Die Gesamt-DNA wurde aus den im Infektionsversuch gewonnenen Kotproben mit Hilfe des Invitek PSP® Spin Stool DNA Kit gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Für die Detektion kamen die Primerpaare H276f/H676r und B38/B39 zum Einsatz. Mit dem Primerpaar H276f/H676r lassen sich 16S rRNA Gensequenzen der Helicobacter spp. nachweisen (RILEY et al. 1996). Alle Helicobacter spp. ergeben ein 374Basenpaarfragment. Das Primerpaar B38/B39 weist eine H. hepaticus spezifische 16S rRNA-Gensequenz nach (SHAMES et al. 1995). Das Basenpaarfragment ist 417 bp groß. Für beide Primerpaare wurde das Redextract-Kit verwendet. Ansatz pro Probe Redextract H2O Forward-Primer (20 µM) Reverse-Primer (20 µM) cDNA Summe 5 µl 2,5 µl 0,25 µl 0,25 µl 2 µl 10 µl Temperaturprofil für die Helicobacter spp.- / H. hepaticus - PCR Temperatur 94° C 94° C 53° C 72° C 34x Schritt 2-4 72° C 8° C Dauer 3 min 0,5 min 0,5 min 0,5 min 10 min Bis zur Entnahme 35 Eigene Untersuchungen 3.2.4.1 Agarosegel-Elektrophorese Für ein 1,5%iges Gel wurden 2,25 g Agarosepulver in 150 ml 1x TBE-Puffer gegeben und in der Mikrowelle erhitzt. Unter ständigem Rühren mittels Magnetrührer wurde die Agaroselösung auf 50° C abgekühlt. Dann wurden der Lösung 6 µl Gelstar DNAFarbstoff zugefügt. Die Flüssigkeit wurde dann bis zu einer Höhe von 0,5 cm in den mit bis zu zwei 25er-Taschen-Kämmen präparierten Gelschlitten gegossen. Nach einem Auskühlen von 30 min konnten die Kämme gezogen werden, und das Gel war einsatzbereit. Für die Elektrophorese wurde das Gel in die mit 1x TBE-Puffer gefüllte Gelkammer gelegt. Danach wurden die dem Thermocycler entnommenen Proben mit 4 µl Orange G Ladepuffer versehen, sofern der PCR-Ansatz mit dem Quiagen-Taq PCR Core-Kit erstellt wurde. Ein mit Redextract erstellter PCR-Ansatz enthält bereits Ladepuffer. Je nach Ansatz wurden pro Tasche 10-14 µl Probenvolumen einpipettiert. Zur Größendifferenzierung der Basenfragmente wurde in mindestens eine Tasche pro Kamm 6 µl einer standardisierten Basenleiter gegeben. Die anschließende Laufzeit bei 180 V 250 mA betrug ca. 45 min. Zur Auswertung wurde das Gel abschließend mit einem UV-Transilluminator betrachtet und digital fotografiert. 3.2.5 Sequenzierung Die Klonierung und Vorbereitung für eine externe Sequenzierung wurde durch Herrn Dr. Nils-Holger Zschemisch vom ZTL durchgeführt. Aus Zellkulturüberstand isolierte MNV-RNA wurde mit dem Oligo(dT)18-Primer zu cDNA umgeschrieben. Diese cDNA wurde als Template verwandt. Die Primerpaare für die PCR-Produkte, die kloniert wurden, sind Tabelle 6 (S.23) zu entnehmen. Der Primer Noro Hannover rev 3 entspricht dem Primer 15T-aTAG (MÜLLER et al. 2007). Die Klonierung und Transformation erfolgte gemäß Anweisungen und gelieferten Materialien des StrataCloneTM PCR Cloning Kit von Agilent Technologies. Detaillierte Protokolle sind zusätzlich in der Dissertation von Herrn Dr. Zschemisch zu finden (ZSCHEMISCH 2004). 36 Eigene Untersuchungen Die Bakterienkulturen mit erfolgreich klonierten Abschnitten des MNV-Genoms in Plasmidform wurden mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit gemäß Anweisungen des Herstellers aufgearbeitet. Abschließend erfolgte eine PCR mit den Primerpaaren, die in Tabelle 7 (S.23) genannt werden. Die Sequenzierung der drei PCR-Produkte wurde extern durch die Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Eine Analyse der erhaltenen Sequenzen erfolgte auf einem Macbook mit DNA Dynamo und internetbasiert mit BLAST (ALTSCHUL et al. 1990). 3.2.6 Virus-Anzucht für den Infektionsversuch Eine Portion des Virusisolats wurde zweimal mit RAW-Zellen passagiert, von dieser Passage wurden für Infektionsversuche und weitere Virusanzucht erneut 1 ml Portionen in sterile Glasfläschchen abgefüllt und bei -80° C tiefgefroren. 3.2.7 3.2.7.1 Virus-Titer-Bestimmung Plaque-Test Um den Virus-Titer zu bestimmen, wurde ein Plaque-Test durchgeführt. Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen auf einer 6er-Zellkultur-Platte in einer Dichte von 6 x 105 Zellen/ml ausgesät. Die Zelldichte pro ml wurde durch Auszählung mit einer Neubauer Zellzählkammer bestimmt. Pro Vertiefung der Platte wurden 2,5 ml aufgetragen, was einer Gesamtzellzahl von 1,5 x 106 Zellen pro Vertiefung entsprach. Die Zellen wurden über Nacht im Brutschrank bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am nächsten Tag wurden Zehner-Verdünnungen der Virussuspension für den Infektionsversuch angefertigt. Das ursprüngliche Zellmedium wurde von den Platten abgesaugt. Danach wurden pro Verdünnung 2 Vertiefungen als Doppelbestimmung mit 500 µl der angefertigten Virusverdünnungsreihe beimpft. Die Platten wurden danach eine Stunde im Brutschrank bei 5% CO 2 und 37° C bebrütet. Währenddessen wurde eine Lösung aus 2,5% SeaPlaque Agarose und ergänztem DMEM-Medium (10% FKS LE, 2% Penicillin-Streptomycin) hergestellt. Nach der einstündigen Inkubation wurde die Virussuspension von den Vertiefungen abgesaugt und durch 2,5 ml der vorbereiteten Agarose-Medium-Mischung ersetzt. Nachdem die 37 Eigene Untersuchungen Agarose-Mediummischung bei Raumtemperatur erstarrt war, wurden die Platten bei 5% CO2 und 37° C für 48h bebrütet. Um die Auswertung zu erleichtern, wurden die Platten mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt. 3.2.7.2 Auswertung eines Plaque-Tests Die Löcher im Zellrasen werden bei zwei bis drei auszählbaren Verdünnungsstufen der Virussuspension erfasst und mit dem Kehrwert der Verdünnungsstufe multipliziert. Hierbei erhält man die Anzahl von plaqueforming units pro inokkuliertes Volumen der Virussuspension. 3.2.7.3 TCID50-Test Hierzu wurden RAW 264.7 Zellen in der Konzentration von 3 x 104 Zellen/Vertiefung auf eine Reaktionsplatte mit 96 Vertiefungen aufgetragen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Zellsuspension aufgetragen, dies entspricht einer Zellkonzentration der Suspension von 3 x 105 Zellen/ml. Die Vertiefungen am Plattenrand wurden mit 300 µl Medium befüllt, um einer Verdunstung im Randbereich vorzubeugen. Die Platten wurden über Nacht bei 5% CO2 und 37° C inkubiert. Am folgenden Tag wurde eine Verdünnungsreihe der Virussuspension in Zehnerschritten angelegt. Je 200 µl einer Verdünnungsstufe der Virussuspension wurden pro Vertiefung auf der Reaktionsplatte zugegeben. Je eine Reihe mit 10 Vertiefungen wurde mit einer Verdünnungsstufe befüllt. Eine Kontrollreihe bekam statt der Virussuspension 200 µl Medium. Dies entsprach einem Gesamtvolumen von 300 µl Flüssigkeit pro Vertiefung. Danach erfolgte eine weitere Bebrütung bei 5% CO2 und 37° C über acht Tage. 3.2.7.4 Auswertung eines TCID50-Tests Zur Auswertung wurde der CPE optisch erfasst. Bereits der dem Nährmedium zugesetzte Indikator Phenolrot ließ eine Unterscheidung zwischen toten (rosa) und lebenden (gelb) RAW-Zellen in den Vertiefungen zu, zur Erleichterung wurde jedoch auch hier mit einer 5% Kristallviolett-Lösung angefärbt. 38 Eigene Untersuchungen Die Berechnung der Viruskonzentration erfolgt mit der Formel nach Spearmann und Kärber. Zuerst wurde die Verdünnungsstufe bestimmt, in der noch ein vollständiger CPE in allen Vertiefungen zu ermitteln ist. Diese Verdünnungsstufe ergab die Variable a (bei 10-6 ist diese gleich -6). Für die Variable b wurden die Anzahl Vertiefungen mit CPE der niedrigeren Verdünnungsstufen zu der Anzahl Vertiefungen der Verdünnungsstufe mit vollständigem CPE addiert (10+9+2+1=22). Die Variable c war gleich der Gesamtzahl an Vertiefungen pro Verdünnungsstufe (in diesem Fall c=10). Dies entsprach 107,7 TCID50/200 µl oder 2,5 x 108 TCID50/ml. 3.2.8 Immunofluorescence Assay (IFA) Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper gegen MNV nachzuweisen. Entwickelt und validiert wurde der Test bei der Firma Biodoc. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf Objektträger aufgetragen, die mit fixierten MNV-infizierten Zellen beschichtet sind. Die Auswertung erfolgt optisch mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. 3.2.8.1 Herstellung und Anwendung der Objektträger für die Immunfluoreszenz Für diesen Test wurden RAW-Zellen in der Flasche kultiviert. Bei einer Zelldichte von 75% wurden diese mit 0,5 ml der eingefrorenen Virussuspension infiziert. Nach einer flexiblen Inkubationszeit von 4 bis 8 Stunden wurde das Medium entfernt, die Zellen abgeschabt und in 25 ml neuem Medium (DMEM, 2% Penicilin-Streptomycin, 10% LE-FKS) pro Flasche suspendiert. Diese Zellsuspension wurde in 50 µl-Tropfen auf teflonbeschichtete 8-Loch-Objektträger aufgetragen. Danach erfolgte eine weitere 39 Eigene Untersuchungen Inkubation der Objektträger für 4 bis 8 Stunden im Brutschrank, bis die erwünschte Infektionsrate von 10 - 30% infizierter Zellen im Zellrasen erreicht war. Die Infektionsrate wurde zwischendurch durch Anfertigen von Probeobjektträgern gemäß dem Anwendungsprotokoll (siehe weiter unten) kontrolliert. Bei Erreichen der gewünschten Infektionsrate wurde das Medium von den Objektträgern abgesaugt. Die Objektträger wurden an der Luft getrocknet und dann in einem Aceton-Bad für 10 min fixiert. Danach erfolgte eine abschließende Lufttrocknung. Die Objektträger wurden bis zum Gebrauch bei -20° C gelagert. Anwendungsprotokoll der Objektträger bei Raumtemperatur: Es wurden 32 µl des 1:20 mit PBS verdünnten Mausserums pro Kavität aufgetragen. Anschließend folgten 20 Minuten Inkubationszeit. Dann wurde das Serum abgesaugt, und es wurden 50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Erneut wurden 50 µl PBS pro Kavität zum 2. Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Jetzt wurden 25 µl des in PBSM 1:3000 verdünnten Fluoreszenz Anti-Maus-IGG-Antikörpers pro Kavität aufgetragen und für 20 Minuten inkubiert. Nachdem die Antikörperlösung abgesaugt worden war, wurden 50 µl PBS pro Kavität zum Spülen aufgetragen. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten wurde das PBS abgesaugt. Pro Kavität wurden erneut 50 µl PBS zum 2. Spülen aufgetragen und nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten abgesaugt. Abschließend wurden 50 µl Evan´s Blue pro Kavität zum Anfärben des Zellhintergrunds aufgetragen, die nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten wieder abgesaugt wurden. Der Objektträger konnte dann mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 320 facher Vergrößerung optisch beurteilt werden. 3.2.9 Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Einfrier-Auftauzyklen wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, das Pellet verworfen. Die weitere Aufreinigung 40 Eigene Untersuchungen erfolgte dann mit der Ultrazentrifuge. Zum Einsatz kam hierbei ein SW32-Rotor mit sechs Bechern. In einem matten Ultrazentrifugenröhrchen wurden 25 ml Überstand mit 5 ml einer 30% Sucrose-Lösung unterschichtet. Danach wurde für drei Stunden bei 27000 U/min (89500 x g) und 4° C zentrifugiert. Nach sorgfältigem Abgießen des Überstandes und der Sucrose-Lösung war ein hauchdünnes Pellet am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens zu sehen, das in je 50 µl PBSM resuspendiert wurde. 3.2.9.1 Weitergehende Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten im SW55- Rotor Hierfür wurde eine CsCl-Lösung mit einer Dichte von 1,3393 g/cm³ angesetzt (5,15 g CsCl auf 10 g H2O). In 9,5 ml dieser Lösung wurden 0,5 ml der PBSM-MNVSuspension gegeben. Je 5 ml wurden auf zwei klare Ultrazentrifugenröhrchen verteilt. Die Zentrifugation im SW55-Rotor erfolgte für 18 Stunden bei 35000 U/min (116000 x g) und 4° C. Die sichtbare Bande wurde im Gegenlicht mit einer Spritze abgenommen und bei -20° C für eine weitere Verwendung gelagert. 3.2.9.2 Aufreinigung für elektronenmikroskopische Aufnahmen MNV wurde wie bereits beschrieben angezüchtet. Nach zwei Auftauzyklen wurde der Flascheninhalt bei 6000 U/min für 30 min (2800 x g) zentrifugiert. Insgesamt 50 ml des Zellkultur-Überstands wurden abgenommen, das Pellet verworfen. Nun kam ein anderes Aufreinigungsprotokoll zum Einsatz, da CsCl-Ionen eine elektronenmikroskopische Aufnahme erschweren. Je 2 ml Zellkulturüberstand wurden bei 55000 U/min für 32 min (201000 x g) in einem SW-TLS 55 Rotor zentrifugiert. Der Großteil des Überstandes wurde verworfen. Die Pellets wurden in 20 µl Restüberstand gelöst. Insgesamt entstanden so 500 µl aus 50 ml. Von der Pelletsuspension wurden 125 µl mit 1,875 ml steriler Kochsalzlösung aufgefüllt. Diese Lösung wurden erneut bei 55000 U/min für 32 min im SW-TLS 55 Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die hierbei entstandenen Pellets wurden in 20 µl Restüberstand gelöst. Anschließend erfolgte ein dritter Zentrifugationsschritt bei 55000 U/min für 32 min im SW-TLS 55 Rotor. 41 Eigene Untersuchungen 3.2.9.3 Gewinnung von RAW-Zellbestandteilen für eine Zellkontrolle Parallel zur MNV-Anzüchtung wurden Zellkulturflaschen mit geschlossenem RAWZellrasen (Zelldichte ähnlich der zu infizierenden Zellkulturflaschen) bei -20° C eingefroren. Die weitere Behandlung entsprach den Schritten der Virusaufreinigung mittels Ultrazentrifugation. Auch hier konnte visuell ein Pellet am Boden des Ultrazentrifugenröhrchens ausgemacht werden, das in je 50 µl PBSM resuspendiert wurde. 3.2.10 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) Dieser Test dient dazu, in einem Mausserum möglicherweise vorhandene Antikörper gegen MNV nachzuweisen. Verdünntes Maus-Serum wird hierbei auf mit MNVAntigen beschichtete Microtiter-Riegel aufgetragen. Die Auswertung der enzymatischen Umsetzung des Substrats ABTS durch Peroxidase-markierte AntiMaus-IgG-Antikörper erfolgt optisch mit Hilfe eines Photometers. Bei einer Substratumsetzung färbt sich die Lösung grün. 3.2.10.1 Die durch Beschichtung (Coating) und Anwendung der ELISA-Platten die Aufreinigung gewonnene Virus-PBSM-Lösung wurde mit Beschichtungspuffer (Coating Buffer) 1:100 verdünnt. Von der Coating-Lösung wurden 150 µl pro Vertiefung der 8er-Microtiterriegel aufgetragen. Eine Platte besteht aus 12 Riegeln mit 8 Vertiefungen. Danach wurden die ELISA-Platten für 24 Stunden im Kühlschrank bei 8° C inkubiert. Der Inkubation folgten ein Waschen und ein Blockvorgang mit 200 µl Roche-Blocking Reagent pro Vertiefung über 15 min bei Raumtemperatur gemäß Gebrauchsanweisung des Herstellers. Zum Abschluss wurden die Riegel erneut gewaschen. Die Riegel der RAW-Zellkontrolle wurden genau wie die MNV-Riegel beschichtet und anschließend geblockt. Verdünnt in Coating-Buffer wurde hier stattdessen das in PBSM gelöste RAW-Pellet. Hierbei wurde die gleiche Verdünnungsstufe wie beim MNV-Coating (1:100) verwendet. Die ELISA-Platten wurden dann bis zum Gebrauch bei -20° C gelagert. 42 Eigene Untersuchungen Das Standardwaschprogramm des Columbus Washer, das sowohl nach dem Coating als auch beim Elisa-Standardprotokoll zur Anwendung kam, sah 3 Waschschritte mit jeweil 250 µl PBS Tween vor. Das PBS Tween wurde direkt nach dem Einfüllen in die Vertiefungen wieder abgesaugt. Beim Standard-Protokoll zur Anwendung der beschichteten ELISA-Riegel wurden 100 µl des 1:50 mit PBS verdünnten Mausserums in je eine MNV- und eine RAWVertiefung pipettiert. Nach einer Inkubation von 45 Minuten bei 37° C im Brutschrank wurden die Vertiefungen mit PBS Tween im Washer gespült. Anschließend wurden 100 µl Zweitantikörper 1:1000 verdünnt in PBS Tween pro Vertiefung aufgetragen. Es folgte eine Inkubation über 45 Minuten bei 37° C im Brutschrank. Nach einem erneuten Waschen mit PBS Tween wurden schließlich 100 µl ABTS-Substrat pro Vertiefung aufgetragen. Nach 45 Minuten Inkubation bei 37° C im Brutschrank wurde die Extinktion im Photometer beim Wellenlängenpaar 405 nm vs. 492 nm gemessen. Die Verdünnungsstufe des Antigens zur Beschichtung wurde durch eine AntigenVerdünnungsreihe ermittelt. Virus-PBSM-Lösung wurde in verschiedenen Konzentrationen mit Coating Buffer verdünnt und in die Vertiefungen gemäß Beschichtungsprotokoll gegeben. Mit einem positiven Kontrollserum-Pool wurde das Standardprotokoll zur Anwendung der beschichteten ELISA-Riegel abgearbeitet. Dieser positive Kontrollserumpool war zuvor aus in der IFA deutlich positiv getesteten Mäuseseren erstellt worden. Ziel der Verdünnungsreihe war es, mit einer möglichst hohen Verdünnung des Antigens dennoch einen hohen OD-Wert zu erreichen. 3.2.10.2 Der korrigierte OD-Wert Um eventuelle Kreuzreaktionen mit RAW-Zellbestandteilen auszuschließen, wurde die Zellkontrolle eingeführt. Diese ermöglicht die Bestimmung eines korrigierten ODWerts: OD MNV-Kavität – ODRAW-Kavität = ODkorrigiert 43 Eigene Untersuchungen 3.2.11 Elektronenmikroskopische Aufnahmen Nach der bereits beschriebenen Virusaufreinigung für elektronenmikroskopische Aufnahmen wurden durch Jutta Milzer im Institut für Virologie der MHH elektronenmikroskopische Präparate hergestellt. Unbeschichtete Trägerplättchen, sogenannte Grids, wurden auf einen Formvarfilm (Formvarpulver gelöst in Chloroform) auf einer Wasserfläche aufgebracht. Anschließend wurden sie mit einem Filterpapierstreifen abgenommen und luftfixiert. Danach erfolgte eine Bedampfung mit Graphit. Auf die vorbereiteten Grids wurden 20 µl der konzentrierten Viruspartikel-Lösung aufgetragen. Nach sechsmaligem Waschen mit Aqua ad iniectabilia wurden 5 µl 1% Uranylacetat (gelöst in Wasser) für die Negativkontrastierung aufgetragen. Abschließend wurden die Grids luftfixiert. Drei Präparate (Grids) wurden im Zentrallabor Elektronenmikroskopie der MHH mit einem FEI Tecnai 20 Elektronenmikroskop im TEM-Modus bei 80 kV in 62000-facher und 80000-facher Vergrößerung untersucht und digital gespeichert. Dies geschah mit Unterstützung von Prof. Dr. Ungewickell, Gerhard Preiß und Jutta Milzer. 3.2.12 Isolation und Anzucht von Helicobacter hepaticus für den Doppelinfektionsversuch Der Keim wurde im mikrobiologischen Untersuchungslabor des ZTL isoliert und identifiziert. Hierzu wurde die Maus Nummer 1240 des Stammes BC-R4-Il10-/- nach CO2 Betäubung durch Genickbruch getötet. Nach Eröffnung der Bauchhöhle wurde die Zäkumspitze mit sterilem Besteck entfernt und in ein 5 ml Polypropylen-Röhrchen mit 2 ml Brain-Heart-Infusion Medium überführt. Nach Homogenisierung wurde die Suspension durch einen 0,45 µm Weißrandfilter gegeben. Von der gefilterten Lösung wurden jeweils 200 µl auf eine Petrischale mit Columbiaagar mit Zusatz von Amphotericin B, Campylobacter-Selektiv-Supplement (nach Skirrow) und Pferdeblut getropft und mit einer Impföse verteilt. Die Platten wurden unter mikroaerophilen Bedingungen in einem Anaerobiertopf bei 37° C kultiviert. Zur Erzeugung der mikroaerophilen Bedingungen wurde die Luft viermalig evakuiert auf -0,2 bar. 44 Eigene Untersuchungen Danach wurde ein Gasgemisch, bestehend aus 10% CO2, 10% H2 und 80% N2, bis 0,2 bar hinzugefügt. Die Bakterien wurden alle 3 bis 4 Tage auf eine neue Platte überimpft, indem etwas Bakterienmaterial mit einer Impföse von der alten Platte abgenommen und auf einer neuen Platte verteilt wurde. Die vierte Passage dieses Keimes wurde in großem Umfang als Dauerkultur bei -80° C eingefroren, da hieraus die Bakterien zur Infektion gewonnen wurden. Zum Einfrieren der Bakterien wurde auf jede Platte 1 ml brain-heart-infusion (BHI)-Medium gegeben. Anschließend wurden die Bakterien mit Hilfe eines Wattetupfers in das Medium eingerieben. Von dieser Suspension wurden 800 µl abgenommen und in ein 1,5 ml Schraubdeckelgefäß mit 100 µl Gycerin und 100 µl FKS überführt. Mehrere gefüllte Schraubdeckelgefäße wurden bei -80° C eingefroren. 3.2.13 Experimentelle Infektion der Mäuse mit MNV Die Mäuse wurden anhand ihres Alters in die Infektionsgruppen (siehe Tabelle 11) eingeteilt, um zum geplanten Sektionstermin ein möglichst gleiches Alter (12-15 Wochen) zu haben. Sie wurden im Alter von 7 bis 12 Wochen zweimal hintereinander im Abstand von 3 Tagen mit jeweils 0,1 ml virushaltigem Zellkulturüberstand 2,5x108 TCID50/ml per oraler Gavage und 10 µl per nasaler Applikation experimentell infiziert. Für die Gavage wurde eine Knopfkanüle eingesetzt. Die Infektion erfolgte unter einer sterilen Sicherheitswerkbank. Die Kontrolltiere erhielten 0,1 ml PBS per oraler Gavage und 10 µl PBS nasal. Sie wurden als Einzelgruppe zusammengefasst und zu einem gesonderten Sektionstermin getötet und seziert. 3.2.14 Experimentelle Infektion der Mäuse mit Helicobacter hepaticus Zwei Wochen nach der Inokulation mit MNV wurden Mäuse im letzten Teil (Infektionsversuch 5) der Versuchsreihe ebenfalls per oraler Gavage mit 0,1 ml einer H. hepaticus – Suspension (106 KBE, 7. Passage) experimentell inokuliert. Fünf Tage später erfolgte eine zweite Inokulation. Die Kontrolltiere (infiziert mit MNV) erhielten zweimal 0,1 ml PBS per oraler Gavage. 45 46 Tabelle 11: Übersichtsdiagramm der Infektionsversuche 1. Versuch Stamm -/- C3-Il10 Geschlecht (Tiere pro Sektionstermin) Sektion p.i. Kontrollgruppe Probenverwendung m (2+3+3),w (3+4+6) 2, 4, 8 m (5+6+5),w (5+5+4) Wochen m (4), w (2+2) -/- m (4+4),w (3+4) m (3), w (2) -/- B6-Il10 m (6+4),w (6+4) C3-wt m (2+1(1),w (0+0) B6-wt m (4+4),w (6+6) -/- B6-Il10 m (3), w (3+3) Besonderheit Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation Lymphozytenstimulation Geschlecht zusammengefasst pro Stamm 2. Versuch C3-Il10 2, 4 Wochen m (4), w (5) m (5), w (0) Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation pro Einzeltier für alle weiteren Versuche Lymphozytenstimulation m (4), w (6) 3. Versuch (Ergänzung zum 2. Versuch, sowie Untersuchung des akuten Infektionsverlaufs) -/- w (3) 2 Wochen w (3) -/- B6-Il10 w (3) 4 Wochen - C3-wt m (2) 2 Wochen - B6-wt - - - C3-Il10 -/- B6-Il10 m (4) B6-wt m (4), w (4) B6-wt w (4+4+3+3) 7d m (4) m (4), w (4) 3, 6, 9, 12 d 0 Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation Serologie, Histologie, PCR, Lymphozytenstimulation Serologie, Histologie, PCR Verlaufsversuch, Darmlymphknoten für PCR verwendet 4. Versuch (Infektion keimfreier Tiere) -/- C3-Il10 w (5) 4 Wochen m (4) 8 (6) Wochen m (2), w (4) Serologie, Histologie, PCR, keimfreie Tiere, im Micro-Isolator gehalten Lymphozytenstimulation 5. Versuch (Doppelinfektion) -/- m (2), w (4) -/- w (6) C3-Il10 B6-Il10 w (5) m = männlich; w = weiblich; p.i. = post inoculationem; d = Tag Serologie, Histologie, PCR, Infektion mit MNV, sowie 2 Wochen später mit H. hepaticus Lymphozytenstimulation Kontrollen: Infektion nur mit H. hepaticus und Eigene Untersuchungen 3.2.14.1 Tötung Am Sektionstag wurden die Tiere von der Infektionsabteilung in das mikrobiologische Untersuchungslabor des ZTL der MHH gebracht. Dort wurden sie durch Kohlendioxidgasinhalation betäubt und anschließend durch Entbluten getötet. 3.2.14.2 Postmortale Untersuchung Die Tierkörper wurden gewogen, auf äußerliche Veränderungen untersucht und anschließend seziert. 3.2.14.3 Sektion Die Sektion erfolgte mit sterilem Sektionsbesteck. Dabei wurden alle Organe auf makroskopische Veränderungen untersucht. 3.2.14.4 Probennahme Serum Nach Eröffnen des Brustkorbs des Tieres wurde das Herz mit einer Spritze mit aufgesetzter Kanüle punktiert, um möglichst viel Vollblut zu gewinnen. Das Blut wurde in sterile Eppendorf-Gefäße gegeben und bei Raumtemperatur bis zum Eintritt der Gerinnung stehen gelassen. Dann erfolgte eine Zentrifugation bei 6000 U/min (2800 x g) für 7 min. Der Serumteil wurde abgenommen und für weitere Untersuchungen bei -80° C gelagert. PCR Als PCR-Proben wurden bei jedem Versuch mit sterilem neuen Besteck Lunge, Leber, Niere, Milz, Mesenteriallymphknoten (nur Versuch 3; Tag 3, 6, 9, 12 p.i.), proximaler Dünndarm, Ileum, proximales Kolon und Kot genommen. Die Proben wurden in sterile Eppendorf-Gefäße gefüllt und sofort in flüssigem Stickstoff gekühlt bis zur anschließenden Lagerung bei -80° C. 47 Eigene Untersuchungen Histologie Für die Histologie wurden Zäkum, Kolon, proximaler Dünndarm, distaler Dünndarm, Magen, Leber, Lunge und Milz entnommen. Die Proben wurden in Standardeinbettkassetten gelegt und abschließend bis zur Zuschneidung in 10%igem, gepufferten Formalin nach Sörensen gelagert. Das Kolon wurde dabei als „modifizierte Swiss-Roll“ in die Kassette gebettet (MOOLENBEEK u. RUITENBERG 1981; BLEICH et al. 2004). Hierzu wurde das proximale Kolon in die Mitte der Kassette verbracht und das restliche Kolon sowie Rektum und Anus in Form einer Schnecke flach ausgerollt. 3.2.14.5 Präparation des Mesenteriallymphknotens Der Mesenteriallymphknoten (MLK) wurde mit sterilem Besteck präpariert und in mit 5 ml Lymphozyten-Medium gefüllte verschließbare 15 ml Plastik-Reaktionsgefäße gegeben und bis zur weiteren Aufarbeitung auf Eis gelagert. In Versuch 1 wurden die MLK pro Stamm und Geschlecht in einem Gefäß zusammengefasst, in den folgenden Versuchen wurde jeder MLK pro Tier separat aufgearbeitet. 3.2.15 Sterile Aufarbeitung des Mesenteriallymphknotens unter einer Werkbank Der MLK wurde mit Lymphozytenmedium auf ein steriles Zellsieb gegeben, welches in einer sterilen Petrischale lag. Anschließend wurde das Gewebe im Sieb gleichmäßig mit dem sterilen Stempel einer 1 ml-Spritze homogenisiert. Die Lymphozyten wurden dabei freigesetzt und konnten durch das Sieb ins Medium passieren. Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren wurde das Medium mit den suspendierten Lymphozyten in ein neues steriles BlueCap gegeben. Dann erfolgte eine Pelletierung der Lymphozyten durch Zentrifugation bei 4° C und 1100 U/min (163 x g) für 7 min. Das Medium wurde verworfen, das Pellet erneut in 5 ml Medium gelöst und in ein neues Reaktionsgefäß übertragen. Nach einer erneuten Zentrifugation bei 4° C und 1100 U/min (163 x g) für 7 min wurde auch hier das Medium verworfen, und das gewaschene Pellet in 0,5 ml Medium gelöst. Zur Bestimmung des Lymphozytengehalts pro Volumen wurde ein scil VetABC 48 Eigene Untersuchungen eingesetzt, um die Lymphozyten-Konzentration der jeweiligen Mesenterial- Lymphknotensuspension auf 2 x 106 Zellen/ml einzustellen. 3.2.16 Vorbereitung und Verwendung der Zellkulturplatten für die Bestimmung von Interferon γ Am Tag vor der Sektion wurden Reaktionsplatten mit 96 Vertiefungen mit 100 µl/Vertiefung der PBS-anti-mCD3-Lösung [5 µg anti-mCD3 (145-2C11)/ml] beschichtet. Diese wurden über Nacht bei 4° C inkubiert. Abschließend erfolgte am Sektionstag ein zweimaliges Waschen mit 200 µl Lymphozytenmedium/Vertiefung. Danach waren die Platten verwendungsbereit. Die vorbereitete Platte wurde entleert und 2 x mit Lymphozytenmedium gespült. Die äußeren Vertiefungen wurden zum Verdunstungsschutz mit 200 µl Lymphozytenmedium versehen. Jeweils 100 µl der Mesenteriallymphknotensuspensionen (2 x 105 Zellen) wurden anschließend in die freien Vertiefungen aufgetragen, pro Suspension 3 Vertiefungen. Zusätzlich wurden 100 µl Medium hinzugefügt. Die Platten wurden für 24 h bei 37° C, 5% CO2 und gesättigter H2OAtmosphäre bebrütet. Nach der Bebrütung wurden je 100 µl der Plattenüberstände auf zwei neue unbeschichtete Platten verteilt. Diese wurden bis zur externen INFγBestimmung durch einen ELISA bei -80° C gelagert. 3.2.17 Bestimmung von Interferon γ im Lymphozytenzellkulturüberstand mit Hilfe eines ELISA Die Bestimmung erfolgte durch die Arbeitsgruppe von PD Dr. Detlef Neumann vom Institut für Pharmakologie der MHH (NEUMANN et al. 2006). Zuerst wurde der Erstantikörper in der Konzentration 0,5 µg/ml in Coating Buffer verdünnt. Dann wurden je 100 µl der Verdünnung pro Vertiefung auf die Platten aufgetragen. Anschließend erfolgte eine Inkubation über Nacht bei 4° C. Am nächsten Tag wurde die Platte entleert und 3 x gewaschen. Zum Blocken wurden 250 µl Blockpuffer pro Vertiefung für eine Stunde bei Raumtemperatur aufgetragen. 49 Eigene Untersuchungen Für die Standards wurde die 100 ng/ml Stammlösung IFNγ in Kulturmedium 1:100 auf 1000 pg/ml verdünnt. Für weitere Verdünnungen wurde 1:2 weiterverdünnt bis zur höchsten Verdünnungsstufe von 16,5 pg/ml, insgesamt 7 Stufen. Im Doppelansatz wurden 50 µl pro Vertiefung jeder Verdünnungsstufe sowie eine zusätzliche Blindprobe aufgetragen. Die Proben wurden ebenfalls mit Medium verdünnt und doppelt aufgetragen. Nach einer einstündigen Inkubation wurden 50 µl biotinylierter Zweitantikörper in einer Verdünnung von 1:1000 pro Vertiefung zugegeben. Nach erneuter einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte entleert und 3mal gewaschen. Nach Zugabe von 100 µl verdünnter Streptavidin-HPRT-Lösung wurde für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Platte entleert und 4mal gewaschen. Pro Vertiefung wurden 100 µl Substrat zugegeben und unter Beobachtung bei RT ca. 20 min inkubiert. Dann wurde die Reaktion mit 50 µl 1M Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wurde im ELISA-Reader bei 450 nm vs. 570 nm gemessen. Anhand einer aus den Standards erstellten linearen Regression wurden danach die Probenwerte berechnet. 3.2.18 Anfertigung histologischer Präparate Die histologischen Gewebeschnitte wurden am ZTL von Frau Wiebe angefertigt und mit Hämatoxilyn-Eosin (HE) gefärbt. Die Organe wurden über Nacht paraffinisiert und anschließend per Hand eingebettet. Nach Einbettung wurden 3 µm dicke Längsschnitte gemacht und im Färbeautomaten HE gefärbt. Die gefärbten Schnitte wurden anschließend mit Korbitbalsam eingedeckt. 50 Eigene Untersuchungen 3.2.19 Histologische Auswertung der Präparate Die Schnitte wurden ohne vorher bekannte Zuordnung beurteilt. Zur Beurteilung der Entzündungsherde in Zäkum und Kolon kam der The Jackson Laboratory-Schlüssel zur Anwendung (BLEICH et al. 2004). Dieser gliedert sich in: Schweregrad Der Schweregrad der Entzündung wurde beurteilt als: 0 = keine Entzündung; 1 = mild; 2 = mäßig; 3 = schwer. Milde Läsionen waren kleine, fokale oder weiter voneinander entfernte multifokale Areale, in denen das Entzündungsgeschehen auf die Lamina propria beschränkt blieb. Bei mäßigen Veränderungen handelte es sich entweder um multifokale oder lokal extensive Entzündungsgebiete, in denen das Entzündungsgeschehen bis in die Submukosa fortschritt. Schwere Läsionen waren Ulzerationen größeren Ausmaßes (>1 mm der Mukosa betroffen). Hyperplasie Der Grad der Hyperplasie wurde beurteilt als: 0 = keine Hyperplasie; 1 = mild; 2 = mäßig; 3 = schwer. Bei einer milden Hyperplasie erschien das Epithel morphologisch normal als einfaches, hochprismatisches Schleimhautepithel, das aber im Vergleich zur normalen Mukosa eine mindestens zweifache Schleimhautdicke aufwies, was durch die Länge der Krypten angezeigt wurde. Eine mäßige Hyperplasie war durch eine zwei bis dreifache Schleimhautdicke mit hyperchromatischen Zellen, eine verringerte Anzahl an Becherzellen und vereinzelt verlängerte und verzweigte Krypten charakterisiert. Bei einer schweren Hyperplasie war das Epithel deutlich verdickt (vierfach oder mehr) und zeigte eine deutliche Hyperchromasie der Zellen, sehr wenige bis keine Becherzellen, einen hohen Mitoseindex der Zellen innerhalb der Krypten und viele Krypten mit verlängerter und verzweigter Struktur. 51 Eigene Untersuchungen Ulzeration Ulzeration wurde beurteilt als: 0 = kein Ulkus; 1 = eine bis zwei Ulzerationen, die insgesamt maximal 20 Krypten einbezogen; 2 = eine bis vier Ulzerationen, an denen insgesamt 20-40 Krypten beteiligt waren; 3 = jegliche Ulzeration, die über die vorher genannten Kriterien hinaus gingen. Fläche Der Anteil der entzündlich veränderten Fläche wurde in 10%-Schritten auf einer Skala von 0-100% geschätzt, bezogen auf die gesamte Fläche des jeweiligen Darmabschnitts. Für die Analysen wurden die Prozentzahlen folgendermaßen umgerechnet: 0 = 0%; 1 = 10-30%; 2 = 40-70%; 3 = >70% Aus den Werten für Schweregrad, Hyperplasie, Ulzeration und Fläche wurde die Summe gebildet und als Gesamtscore angegeben. 3.2.20 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung der INFγ-Bestimmung wurde mit dem Programm GraphPad Prism auf einem PC durchgeführt. Das Programm StatView wurde für die statistische Auswertung des MNV-ELISA auf einem Apple Powerbook G4 genutzt. Für weitere graphische Darstellungen und Berechnungen wurde Microsoft Excel 2007 verwendet. 52 Ergebnisse 4 Ergebnisse 4.1 Anzucht von MNV in der Zellkultur Eine Anzucht und Vermehrung von MNV war problemlos möglich. RAW-Zellen, die in einer gleichmäßigen Zellschicht wuchsen, reagierten mit einem deutlichen CPE. Dieser trat je nach Infektionsdosis innerhalb weniger Stunden bis zu 1,5 Tagen auf. Die Zellen kugelten sich ab und lösten sich aus dem Zellverband von der Flaschenoberfläche. Der CPE erfasste vollständig alle Zellen. 4.2 Virus-Nachweis mittels PCR Zu Beginn wurden die Primerpaare 5205f/5388r und 5004f/5219r erprobt. Die isolierte RNA wurde mit dem Reverse-Primer des jeweiligen Paares zur cDNA umgeschrieben. Hierbei erwies sich das Paar 5004f/5219r als geeignet. Bei den PCR-Untersuchungen des Infektionsversuches kamen Zweifel auf, ob das Primerpaar 5004f/5219r MNV in Organproben detektieren kann. Das MNV-Isolat wurde aus einer Milz isoliert (siehe 3.2.2 Virusisolation). Alle im Infektionsversuch gewonnenen Milzen wurden jedoch negativ getestet. Es erfolgte eine Entwicklung von weiteren Primerpaaren unter Berücksichtigung der Sequenzierungsergebnisse. Zur Austestung der Primerpaare wurde RNA verwandt, die aus Zellkulturüberstand, sowie aus Organ- und Kotproben des Infektionsversuchs isoliert worden war. Die RNA wurde mit dem OligoDT-Primer zu cDNA umgeschrieben, um mit der gleichen cDNA auch die RPS9-PCR durchführen zu können (siehe Abbildung 6). Letztlich zeigte sich, dass das Primerpaar 5004f/5219r weiterhin die besten Resultate brachte, da eine deutliche Bande auszumachen war. MNV war bei den in den Infektionsversuchen verwendeten Mausstämmen in keiner Milz nachweisbar (siehe Tabelle 20 S. 78). 53 Ergebnisse Abbildung 5: Vergleich verschiedener Primerpaare im Gradienten. Die PCR in Abbildung 5 wurde mit einer cDNA-Positivkontrolle (gewonnen aus MNVpositivem Zellkulturüberstand) bei 4 unterschiedlichen Annealingtemperaturen (53° C, 55,6° C, 58,4° C und 62° C) durchgeführt. Die Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r wiesen besonders kräftige Banden auf. Abbildung 6: Vergleich der Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r mit 5 verschiedenen Proben, die aus Organen und Kot isoliert wurden. 54 Ergebnisse Die PCR in Abbildung 6 wurde mit 3 MNV-positiven cDNA-Proben (gewonnen aus 2 MLK und einer Kotprobe), 2 MNV-negativen cDNA-Proben (gewonnen aus 2 Milzen) sowie Negativ- und Positiv-Kontrolle durchgeführt. Die 3 Banden der MNV-positiven Proben in der PCR mit dem Primerpaar 5580f/5671r sind schwer zu unterscheiden von den negativen Proben. Dies wird beim Primerpaar 5205f/5469r aufgrund eines größeren Amplikons (265bp) wesentlich erleichtert. Die RPS9-PCR wurde mit der cDNA, die aus den 2 MNV-negativen Milzen isoliert worden war, sowie Negativ- und Positiv-Kontrolle durchgeführt. Abbildung 7: Vergleich der Primerpaare 5205f/5469r und 5004f/5219r. Das Gel in Abbildung 7 zeigt 8 MNV-positive Kotproben aus einer PCR mit dem Primerpaar 5205f/5469r, dann eine Lücke gefolgt von Positiv- und Negativkontrolle. Nach der Basenleiter sind die gleichen 8 MNV-positiven Kotproben mit Positiv- und Negativkontrolle mit dem Primerpaar 5004f/5219r aufgetragen. Das Primerpaar 5205f/5469r weist bei allen Proben, die aus Kot isoliert wurden, Doppelbanden auf. Nur die Positivkontrolle, die aus MNV-positivem Zellkulturüberstand isoliert wurde, hat eine Bande. Bei Probe 3 ist nur eine schwache Bande zu erkennen, Probe 5 zeigt keine Bande. Das Primerpaar 5004f/5219r hingegen zeigt bei jeder Probe eine starke Bande. 55 Ergebnisse 4.3 Sequenzierung des Virus Als Template wurde die mit dem OligoDT-Primer umgeschriebene cDNA verwendet. Um eine reproduzierbare Sequenzierung zu ermöglichen, wurden die RNAAbschnitte als cDNA in Bakterienplasmide kloniert. Die Plasmid-DNA wurde per PCR vervielfältigt, anschließend über ein Gel laufen gelassen und dann ausgeschnitten und zur externen Sequenzierung verschickt. Die vollständige Sequenz wurde an die NCBI-Nukleotiddatenbank übermittelt. Sie wurde unter der Zugangsnummer EU854589 registriert. Das Isolat bekam die Bezeichnung Murine norovirus/Hannover1/2007/DEU. Der Stammbaum in Abbildung 8 zeigt die Verwandtschaft des Isolats mit anderen murinen Noroviren. Er wurde mit BLAST erstellt (ALTSCHUL et al. 1990). 56 Abbildung 8: Verwandschaft vom isolierten MNV-Stamm Hannover1/2007/DEU erstellt durch BLAST (ALTSCHUL et al. 1990). 57 Ergebnisse 4.4 Virusquantifizierung Im Plaque-Test trat ein CPE auf. Der CPE war bereits an der Verfärbung des Mediums (Indikator Phenolrot gelb bei pH 0,9-6,4, rot bei pH >6,4) zu erkennen. Bei den lebenden Kontrollen war das Medium gelb, bei den toten Zellen rosarot. Die Einfärbung der Zellen mit Kristallviolett zeigte jedoch keine zählbaren Löcher im Zellrasen, sondern eine schlierige Veränderung des Zellrasens. Dies wird für einige MNV-Isolate beschrieben (THACKRAY et al. 2007). Daraufhin wurde ein TCID50-Test durchgeführt. Auch hier zeigte bereits der dem Zellmedium zugesetzte Indikator den CPE an (Abbildung 9). Abschließend wurde mit Kristallviolett angefärbt. Abbildung 9: TCID50-Test; der Indikator des Mediums zeigt lebende Zellen (gelb) an; zweites Bild nach der Anfärbung mit Kristallviolett (lebende Zellen stark lila). Nach Auszählung der Vertiefungen mit lebenden/toten Zellen und Auswertung nach Spearmann und Kärber (siehe S. 38) ergab sich für die konfektionierte Viruscharge eine TCID50 von 2,5 x 108 TCID50/ml. Diese Charge wurde für die Infektionsversuche verwendet. 4.5 4.5.1 Indirekte Antikörpernachweisverfahren IFA Die Untersuchung von Mäuseseren auf Antikörper gegen MNV per IFA wurde bereits im Labor der Firma Biodoc etabliert und als Goldstandard für die Etablierung des ELISA sowie zur Untersuchung aller Tiere des Infektionsversuchs genutzt. 58 Ergebnisse Bei der Herstellung der Objektträger ist eine maximal 25% Infektionsrate des Zellrasens angestrebt. Abbildung 10 zeigt ein MNV-positives Mausserum in der Immunfluoreszenz. Die infizierten Zellen zeigen eine cytoplasmatische Fluoreszenz im Randbereich mit einem „Polkappenphänomen“. Als Bewertung wurde ein semiquantitativer Schlüssel angewendet. Dazu wurde die Serumprobe mit einem deutlich positiven Kontrollserum verglichen. Kennzeichnung +++ ++ + +/NSR Serumreaktion beurteilt anhand der Intensität Starke Reaktion Mittelstarke Reaktion Schwach positive Reaktion Keine Reaktion Grenzwertige Reaktion Nicht spezifische Reaktion Abbildung 10: MNV-positives Mausserum (+++) in der Immunfluoreszenz. MNVinfizierte Zellen sind grüngelblich markiert. 59 Ergebnisse 4.5.2 Antigenaufreinigung und ELISA Die Aufreinigung per Ultrazentrifuge erfolgte angelehnt an die Publikation von Wobus et al. (WOBUS et al. 2004). Ziel war es, MNV-Antigen für einen ELISA und elektronenmikroskopische Aufnahmen zu gewinnen. Nach der ersten Kissenzentrifugation Ultrazentrifugenröhrchens auszumachen, war ein welches Pellet in am PBSM Boden gelöst des wurde. Probeweise wurden bereits mit dem gelösten Pellet ELISA-Platten beschichtet und mit diversen Mäuseseren, die in der IFA postiv bzw. negativ für MNV reagiert hatten, erprobt. Hierbei zeigte sich eine Substratumsetzung bei IFA positiven Seren, während die meisten IFA negativen Seren nicht reagierten. Die Ausnahmen ließen eine Verunreinigung vermuten. Daher wurde mit dem gelösten Pellet eine Aufreinigung über einen Cäsiumchloridgradienten durchgeführt. Am Ende der Zentrifugation war eine deutliche Bande im Ultrazentrifugenröhrchen zu erkennen, die abgenommen wurde (Abbildung 11). Abbildung 11: Kissenzentrifugation; Bande nach der Gradientenzentrifugation. Eine Dialyse zur Entfernung des Cäsiumchlorids erfolgte nicht, da beim Coating der ELISA-Platten hoch verdünnt wurde. Doch auch hier reagierten einige negative Seren. Dies sprach für eine immer noch vorhandene Verunreinigung der Virusbande. Da es sich bei der RAW-Zelllinie um Mäusezellen handelt, kam die Vermutung auf, dass die falsch positiven Seren mit RAW-Zellresten reagiert hatten, die trotz 60 Ergebnisse Aufreinigung durch Zentrifugation und Ultrazentrifugation noch vorhanden waren. Um dies zu überprüfen wurden RAW-Zellen angezüchtet und nicht infiziert. Die weitere Behandlung und Aufreinigung entsprach jedoch der Behandlung infizierter RAWZellen. Nach der Kissenzentrifugation war ebenfalls ein Pellet am Boden auszumachen. Dieses wurde ebenfalls in PBSM gelöst und an ELISA-Platten gebunden. Hier reagierten die IFA-negativen Seren teilweise ebenfalls mit einer Substratumsetzung, dies bestätigte die Vermutung, dass einige Mäuse Antikörper gegen RAW-Zellbestandteile besitzen. Um die Mäuseseren zu erkennen, die mit RAW-Zellbestandteilen reagieren, wurde entschieden, eine parallele Zellkontrolle beim ELISA durchzuführen. Damit die OD-Werte von MNV-Reaktionsvertiefungen, in denen vermutlich auch noch RAW-Bestandteile gebunden waren, vergleichbar zu Zellkontroll- Reaktionsvertiefungen waren, wurden gleichzeitig zur MNV-Anzucht RAW-Zellen der gleichen Passage ohne Infektion angezüchtet. Sobald die zur Infektion vorgesehene Hälfte der Zellkulturflaschen infiziert wurde, wurde die andere Hälfte (Kontrollcharge) eingefroren. Beim Coating der ELISA-Platten wurde für MNV-Antigen und RAWAntigen die gleiche Verdünnung mit dem Coatingbuffer gewählt. Zur Einschätzung, ob ein Serum Antikörper gegen MNV enthält, wurde der korrigierte OD-Wert eingeführt. Dieser ergibt sich aus der Differenz des OD-Werts der MNVAntigen-beschichteten Kavität zur RAW-Antigen-beschichteten Kavität. Zur Bestimmung der Grenzwerte für die Serumbeurteilung und zur Überprüfung der Robustheit des ELISA wurde eine Validierung durchgeführt. Die einzelnen Messdaten sind im Anhang zu finden. 61 Ergebnisse 4.5.2.1 ELISA-Validierung Zuerst wurde ein Positivkontroll- und ein Negativkontroll-Pool aus eindeutig in der IFA beprobten Seren zusammengestellt. Jeder Pool wurde gründlich durchmischt, sterilfiltriert und in kleinen Chargen bei -20° C bis zur Verwendung gelagert. Erst eine große Menge Serum erlaubte eine Validierung in entsprechender Proben-Anzahl. Außerdem kann anhand dieser Pools eine Orientierung bei der Herstellung von neuen Chargen des ELISA stattfinden, um vergleichbare OD-Werte zu erhalten. Beim alltäglichen Gebrauch des ELISA können die Pools genutzt werden, um Abweichungen beim Anwendungsprotokoll sowie Qualitätsmängel des antigenbeschichteten Materials aufzuzeigen. Durch die Verwendung einer Differenz für den korrigierten OD-Wert wurden korrigierte OD-Werte kleiner null für die Berechnung von Mittelwert und Standardabweichung gleich null gesetzt und auf die Bildung eines Variationskoeffizienten verzichtet. Für die Validierung des ELISA wurden folgenden Messungen durchgeführt: 4.5.2.2 Intraserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools Der Positivkontroll-Pool wurde in einem Reaktionsansatz zehnmal untersucht, der Negativkontroll-Pool im gleichen Ansatz sechsmal. Hierbei ergab sich aus den korrigierten OD-Werten des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,76 bei einer Standardabweichung von 0,07. Der Variationskoeffizient betrug 2,59%. Für den Negativ-Kontroll-Pool betrug der Mittelwert 0,11 bei einer Standardabweichung von 0,04. 4.5.2.3 Interserielle Präzision des Positivkontroll- und des Negativkontroll-Pools Der Positivkontroll- als auch der Negativkontroll-Pool wurden an zehn verschiedenen Tagen als Einzelprobe getestet. Hierbei ergab sich aus den korrigierten OD-Werten des Positivkontroll-Pools ein Mittelwert von 2,82 bei einer Standardabweichung von 62 Ergebnisse 0,1. Der Variationskoeffizient betrug 3,63%. Für den Negativ-Kontroll-Pool betrug der Mittelwert 0,04 bei einer Standardabweichung von 0,04. 4.5.2.4 Linearität des Positivkontroll-Pools Für die Bestimmung der Linearität wurde der Positivkontroll-Pool in den Verdünnungsstufen 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 und 1:800 als Dreifachbestimmung gemessen. Die statistische Prüfung der Linearität erfolgte durch eine Regressionsanalyse. Die Analyse ergab folgende Gleichung, die in Abbildung 12 graphisch dargestellt ist: y = 2,559 – 0,001x. Extinktionswert 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 0 1:100 1:200 1:400 1:800 Verdünnung Abbildung 12: Beziehung zwischen Extinktionswert und Verdünnung mit Regressionsgerade. Das Bestimmtheitsmaß r² betrug 0,882, die ANOVA der Regression ergab einen p-Wert von <0,0001. 63 Ergebnisse 4.5.2.5 Einzelmessungen an IFA positiven und negativen Seren Um den ELISA als Testverfahren mit der IFA zu vergleichen, wurden 68 negative und 76 positive Seren in einem Versuchsansatz mit dem ELISA getestet. Hierbei ergab sich eine Verteilung der Messwerte, die in Abbildung 13 zu sehen ist. 64 45 40 35 Anteil in % 30 25 Negativ Positiv 20 15 10 5 3,0 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 2,3 2,2 2,1 2,0 1,9 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1 -0,2 -0,3 -0,4 0 OD-Wert korrigiert Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der Einzelmessungen von ausgewählten in der IFA positiven (n=76) und negativen (n=68) Mäuseseren. 65 Ergebnisse Zusätzlich wurden anschließend weitere 205 Seren, die in der IFA negativ für MNVAntikörper beurteilt worden waren, untersucht. Hierbei ergab sich ein Spektrum für den korrigierten OD-Wert eines MNV-negativen Serums von -0,385 bis 1,4. Die Verteilung ist in Abbildung 14 dargestellt. 25 Anteil in % 20 15 Negativ 10 5 0 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,9 1 1,1 1,4 OD-Wert korrigiert Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der Einzel-OD-Wertbestimmung von 205 in der IFA negativen Mäuseseren mit Hilfe des ELISA. Anhand der Verteilung wurden folgende Grenzwerte für die hergestellte Charge festgelegt, um eine Bewertung von Testseren zu ermöglichen: OD korrigiert < 0 bis 1 negativ OD korrigiert > 1 bis 1,5 fraglich OD korrigiert > 1,5 positiv 4.6 Elektronenmikroskopische Aufnahmen Die Aufreinigung über den CsCl-Gradienten führte nicht zu auswertbaren Grids (Objektträger für elektronenmikroskopische Aufnahmen). Daher erfolgte wie beschrieben eine Aufreinigung durch wiederholte Pelletierung. Verschiedene Aufnahmen sind in Abbildung 15 zu sehen. Das Virus ist ca. 35 nm groß. In Abbildung 15a ist die Kelchstruktur der Oberfläche auszumachen, Pfeile weisen auf Virionen hin. 66 Ergebnisse a b c d Abbildung 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MNV-Virionen (durch schwarze Pfeile gekennzeichnet). 67 Ergebnisse 4.7 Serologische Untersuchung von Anzeigertieren des zentralen Tierlaboratoriums auf MNV Um einen Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL zu erhalten, wurden Seren, die im Rahmen der Jahresuntersuchung 2008 von Anzeigertieren gewonnen worden waren, zusätzlich mittels IFA auf gegen MNV gerichtete Antikörper untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengefasst. Tabelle 12: Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL im Jahr 2008 Haltungssystem Anzahl Tiere Prävalenzrate (%) positiv/getestet Isolator 0/13 0 SPF-Zuchtbarriere 0/6 0 121/205 59 Experimentelle Haltungsbarriere* Vergleich von zwei Tierräumen der experimentellen Haltungsbarriere, in denen alle Mäuse getestet wurden Raum mit offenen Käfigen 174/200 87 Raum mit Filterdeckelkäfigen 104/155 67 *enthält eine Einheit mit einzeln belüfteten Käfigsystemen - individually ventilated cages (IVC) - mit 22/40 (55%) positiven Anzeiger-Mäusen 4.8 Infekionsversuche 1. Tierversuch Im ersten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse beider Geschlechter infiziert. Um einen Überblick über den bisher unbekannten Infektionsverlauf zu bekommen, wurden Sektionen nach zwei, vier und acht Wochen durchgeführt. 68 Ergebnisse 2. Tierversuch Im zweiten Infektionsversuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse sowie der jeweilige Wildtyp infiziert. Folgernd aus den Daten der INFγ-Messungen des ersten Versuchs wurden zwei Sektionstermine (zwei und vier Wochen nach Infektion) festgelegt. 3. Tierversuch Im dritten Infektionsversuch wurden Mäuse infiziert, um Daten des zweiten Versuchs zu ergänzen. Außerdem wurden männliche B6-Il-10-/- - Mäuse sowie männliche und weibliche Mäuse des zugehörigen Wildtyps infiziert und nach einer Woche seziert, um Erkenntnisse über den Infektionsstatus (vor allem die Stimulation der Lymphozyten) der Tiere eine Woche nach der Infektion zu bekommen. Eine zusätzliche Tiergruppe B6-wt Weibchen wurde infiziert und nach 3, 6, 9 und 12 Tagen seziert. Durch diese Gruppe sollte Aufschluss darüber geschaffen werden, wo und ab wann das Virus per PCR nachzuweisen ist. Daher wurde der Mesenteriallymphknoten der Tiere für den PCR-Nachweis verwandt. 4. Tierversuch Im vierten Infektionsversuch wurden keimfreie männliche und weibliche C3-Il10-/Mäuse, die aus einem Isolator des ZTL stammten, mit MNV infiziert und vier Wochen bis zur Sektion in einem Mikroisolator gehalten. Dieser Versuch sollte zeigen, welche Einflüsse MNV auf Tiere ohne jegliche natürliche mikrobiologische Flora hat. 5. Tierversuch In fünften Versuch wurden C3-Il10-/-- und B6-Il-10-/--Mäuse zuerst mit MNV infiziert. Zwei Wochen später erfolgte eine zusätzliche Infektion mit H. hepaticus. Die Kontrolltiere wurden nur mit H. hepaticus infiziert. Mit diesem Versuch sollte ein möglicher Einfluss der MNV-Infektion auf die spätere H. hepaticus-Infektion untersucht werden. Die Sektion erfolgte dann sechs Wochen nach Infektion mit H. hepaticus. 69 Ergebnisse 4.8.1 Klinik In Tierversuch 1 bis 4 zeigten die mit MNV infizierten Mäuse bis zum Versuchsende ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Zu den Kontrolltieren war kein Unterschied festzustellen. In Tierversuch 5 zeigten die Tiere bis 40 Tage nach Infektion mit H. hepaticus keine Auffälligkeiten. Erst am Sektionstermin war sowohl bei der Doppelinfektionsgruppe als auch bei der Kontrollgruppe ein leicht aufgekrümmter Rücken festzustellen. Die Tiere fraßen und tranken noch. 4.8.2 Sektion Die Sektion der Tiere aus Tierversuch 1 bis 4 ergab keinerlei makroskopische Hinweise auf ein Infektionsgeschehen. Es bestand kein feststellbarer Unterschied zu den Kontrolltieren. In Tierversuch 5 waren sowohl bei der Doppelinfektions- als auch bei der Kontrollgruppe makroskopische Veränderungen feststellbar. Es handelte sich hierbei um ein geschwollenes Kolon. 4.8.3 Serologie Die Untersuchung der gewonnenen Seren zeigte in der Immunfluoreszenz bereits am Tag 7 nach Infektion (Tierversuch 3) eine positive Reaktion. Ab Tag 9 p.i. lag die Serokonversion aller mit MNV infizierten Tiere (Tierversuch 1 bis 5) bei 100 %. Die Kontrolltiere hatten keine nachweisbaren Antikörper gegen MNV. Dies galt auch für die Kontrolltiere, die in einem separaten Filterdeckelkäfig im Käfigregalschrank mit den infizierten Tieren gehalten wurden. 70 Ergebnisse 4.8.4 4.8.4.1 Lymphozytenstimulation Versuch 1 Um sicher zu gehen, dass genügend Lymphozyten für eine Stimulation aus den Mesenteriallymphknoten der Tiere zu Verfügung standen, wurden im ersten Versuch die Mesenteriallymphknoten nach Stamm und Geschlecht gepoolt. Die Lymphozyten wurden sechsfach pro Pool aufgetragen. Die IFNγ-Messwerte des ersten Infektionsversuchs sind in Abbildung 16 graphisch dargestellt. Hierbei zeigte sich, dass B6-Il10-/--Mäuse im Allgemeinen geringere Werte in der Lymphozytenstimulation aufwiesen als C3-Il10-/--Mäuse; ein geschlechtlicher Unterschied innerhalb der Stämme konnte nicht beobachtet werden. Acht Wochen nach Infektion war kein weiterer Anstieg von IFNγ festzustellen. Die Lymphozytenstimulation der weiblichen Kontrolltiere (C3-Il10-/-) war nicht effektiv. Die Präparation eines einzelnen MLK lieferte genügend Lymphozyten für den Versuchsaufbau. Um mehr verwertbare Daten bezüglich der LymphozytenStimulation zu erhalten, wurden ab dem 2. Tierversuch Einzelpräparationen der Mesenteriallymphknoten pro Tier angefertigt, die dreifach aufgetragen wurden. Tabelle 13: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 1 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 4 Gruppen: Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i., 8 Wochen p.i. B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w S; p<0,0001 S; p<0,0001 NS; p=07358 S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05 Maus-Stamm C3-Il10-/- m S; p<0,0001 71 Ergebnisse Tabelle 14: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 1 untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) B6-Il10-/- w B6-Il10-/- m C3-Il10-/- w C3-Il10-/- m Maus-Stamm Kontrolle vs. S S NS NS 2 Wochen p.i. Kontrolle vs. NS NS NS S 4 Wochen p.i. Kontrolle vs. NS NS NS n.d. 8 Wochen p.i. 2 Wochen p.i. vs. S S NS S 4 Wochen p.i. 2 Wochen p.i. vs. S S NS n.d. 8 Wochen p.i. 4 Wochen p.i. vs. NS NS NS n.d. 8 Wochen p.i. S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; w: weiblich; m: männlich; n.d.: nicht durchgeführt (keine Messwerte vorhanden, weil Tiere verstorben sind); vs.: versus Abbildung 16: Infektionsversuch 1, Mittelwert und SEM der IFNγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Proben pro Stamm, Geschlecht und Zeitpunkt gepoolt). 72 Ergebnisse 4.8.4.2 Versuch 2 Die IFNγ-Sekretion der Darmlymphozyten aller im 2. Tierversuch mit MNV infizierten Mäuse war zwei Wochen p.i. erhöht im Vergleich zur Kontrollgruppe (signifikant bei B6-Il10-/- Mäusen und dem zugehörigen Wildtyp). Vier Wochen p.i. war die INFγSekretion im Vergleich zur Kontrollgruppe ebenfalls erhöht, signifikant jedoch nur bei C3-Il10-/--Mäusen. Tabelle 15: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 2 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 3 Gruppen: Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i. B6-Il10-/B6-wt C3-Il10-/S; p=0,0094 S; p=0,0012 S; p=0,0221 S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05 Maus-Stamm C3-wt NS; p=0,2042 Tabelle 16: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 2 untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) B6-Il10-/- B6-wt C3-Il10-/- C3-wt Maus-Stamm Kontrolle vs. 2 Wochen p.i. S S NS NS Kontrolle vs. 4 Wochen p.i. NS NS S NS 2 Wochen vs. 4 Wochen p.i. NS S NS NS S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus 73 5 5 4 4 INF (ng/ml) INF (ng/ml) Ergebnisse 3 2 1 3 2 1 0 0 Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle -/- 4 Wochen B6-wt B6-Il10 25 25 20 20 INF (ng/ml) INF (ng/ml) 2 Wochen 15 10 5 15 10 5 0 Kontrolle 2 Wochen C3-Il10 -/- 4 Wochen 0 Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen C3-wt Abbildung 17 Infektionsversuch 2, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht) 74 Ergebnisse 4.8.4.3 Versuch 3 Die Werte der Lymphozytenstimulation sieben Tage nach der Infektion mit MNV ergaben eine signifikante Erhöhung der INFγ-Sekretion für männliche B6-Il10-/Mäuse im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch beim Wildtyp sind die gemessenen Werte erhöht, jedoch nicht signifikant. Tabelle 17: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 3 mit einem ungepaarten t-Test B6-Il10-/B6-wt Maus-Stamm Kontrolle vs. 1 Woche p.i. S; p=0,0154 NS; p=0,1346 S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus 5 INF (ng/ml) 4 3 2 1 0 Kontrolle B6-Il10-/- 1 Woche Kontrolle 1 Woche B6-wt Abbildung 18: Infektionsversuch 3, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht). 75 Ergebnisse 4.8.4.4 Versuch 4 Die Auswertung der Lymphozytenstimulation aus dem 4. Tierversuch zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den keimfreien mit MNV infizierten C3-Il10-/Mäusen vier Wochen nach der Infektion und der zugehörigen Kontrollgruppe. Tabelle 18: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 4 mit einem ungepaarten t-Test C3-Il10-/- (keimfrei) Maus-Stamm Kontrolle vs. 4 Woche p.i. NS, p=0,8988 S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus 5 INF (ng/ml) 4 3 2 1 0 Kontrolle 4 Wochen Keimfreie C3-Il10-/- Abbildung 19: Infektionsversuch 4, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten Geschlecht). 76 MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Ergebnisse 4.8.4.5 Versuch 5 Im 5. Tierversuch wurden keine Unterschiede in der INFγ-Sekretion der mit H. hepaticus infizierten Kontrollgruppe zur Doppelinfektionsgruppe festgestellt. Tabelle 19 Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 5 mit einem ungepaarten t-Test C3-Il10-/B6-Il10-/Mausstamm Kontrolle (Helico) vs. NS, p=0,5697 NS, p=0,5155 Doppelinfektion (MNV+Helico) S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus; Helico: H. hepaticus 60 INF (ng/ml) 50 40 30 20 10 0 Helico C3-Il10-/- MNV+Helico Helico MNV+Helico B6-Il10-/- Abbildung 20: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht). 77 Ergebnisse 4.8.5 PCR-Nachweis von MNV Lunge, Leber, Nieren bis Tag 12 nach Infektion sowie Milzen bis Tag 28 nach Infektion wurden per PCR negativ auf MNV getestet. Weitere Untersuchungen zu späteren Zeitpunkten erfolgten nicht. Wie aus Tabelle 20 hervorgeht, wurde MNV im Mesenteriallymphknoten, Darm sowie Kot bis zu acht Wochen nach Infektion nachgewiesen. Die zugehörigen nicht infizierten Kontrolltiere wurden negativ auf MNV getestet. Tabelle 20: MNV-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) Organe/Proben Tage p.i. Milz MLK Ileum Kolon Kot 3 0/4 4/4 Nicht getestet Nicht getestet 3/3 6 0/4 4/4 3/3 3/3 2/2 9 0/3 3/3 Nicht getestet Nicht getestet 3/3 12 0/3 2/2 Nicht getestet Nicht getestet 3/3 14 0/17 * Nicht getestet Nicht getestet 12/12 28 0/17 * 4/12 12/12 12/12 56 Nicht getestet * 4/8 4/8 4/8 *benutzt für Zytokin-Bestimmung 78 Ergebnisse 4.8.6 PCR-Nachweis von Helicobacter hepaticus Zum Nachweis einer Infektion mit H. hepaticus wurden Kotproben der Tiere mittels PCR untersucht. Die Ergebnisse sind Tabelle 21 zu entnehmen. Tabelle 21: H. hepaticus-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) positiv Infektion mit MNV und H. hepaticus Infektion mit H. hepaticus (Kontrollen) 12/12 9/11 Alle mit H. hepaticus infizierten Mäuse, auch die PCR-negativ getesteten Tiere, zeigten in der Sektion typische pathologische Veränderungen, die für eine Erkrankung der Tiere sprachen (siehe 4.8.2). 4.8.7 Histologie Die infizierten Tiere aus Versuch 1 bis 4 zeigten kaum histologisch auswertbare Unterschiede im Vergleich zur jeweiligen Kontrollgruppe. Nur bei mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen waren besonders vier Wochen nach der Infektion (Tierversuch 2) geringgradige fokale entzündliche Läsionen feststellbar (siehe Abbildung 22). In Tierversuch 4 wurde bei den keimfreien mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen histologisch nur die Anwesenheit einer höheren Anzahl mononukleärer Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt (siehe Abbildung 23). Die Auswertung von Tierversuch 5 ergab sowohl bei der Doppelinfektions- als auch bei der Kontrollgruppe eine hochgradige multifokale Dickdarmentzündung (siehe Abbildung 21) ohne signifikante Unterschiede in der Score-Bewertung (siehe Tabelle 22). Es wurde jedoch bei einigen Tieren der Doppelinfektionsgruppe ein etwas geringerer histologischer Score-Wert ermittelt. 79 Ergebnisse Tabelle 22: Statistische Auswertung der histologischen Scorewerte von Infektionsversuch 5 mit einem ungepaarten t-Test C3-Il10-/B6-Il10-/Mausstamm Zäkum, Helico vs. NS; p=0,4105 NS; p=0,0977 MNV+Helico Kolon, Helico vs. NS; p=0,1102 NS; p=0,3201 MNV+Helico S: Signifikant, p≤0,05; NS: Nicht signifikant, p>0,05; vs.: versus; Helico: H. hepaticus Zäkum Kolon 20 Histologischer Score Histologischer Score 20 15 10 5 0 15 10 5 0 Helico MNV+Helico C3-Il10-/- Helico MNV+Helico B6-Il10-/- Helico MNV+Helico C3-Il10-/- Helico MNV+Helico B6-Il10-/- Abbildung 21: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM des histologischen Score (Jackson) von Zäkum und Kolon bei der Kontrollgruppe (Helico mit H. hepaticus infiziert) und der Doppelinfektionsgruppe (MNV+Helico mit MNV und H. hepaticus infiziert). 80 B C E F Abbildung 22: Kolonabschnitt einer C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-C) und die zugehörige Kontrolle (D-F); HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle ist eine milde Hyperplasie des Epithels, ein gemischtzelliges Infiltrat in Mukosa und Submukosa sowie ein geringgradiges Ödem festzustellen. 81 82 Abbildung 23: Kolonabschnitt einer keimfreien C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H); HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle unterscheidet sich die infizierte Maus nur durch eine leicht vermehrte Anzahl mononukleärer Zellen. Weitere Entzündungsreaktionen sind nicht feststellbar. Abbildung 24: Kolonabschnitt einer B6-Il10-/--Maus infiziert mit MNV und H. hepaticus (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H), nur infiziert mit H. hepaticus; HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Doppelinfektion und Kontrolle weisen eine vergleichbare mittel- bis hochgradige transmurale, gemischtzellige Enteritis mit prominenter Hyperplasie der Enterozyten auf. 83 Diskussion 5 Diskussion 5.1 Zellkultur und Quantifizierung Der erste Nachweis eines Norovirus bei der Maus wurde 2003 beschrieben (KARST et al. 2003). Es konnte gezeigt werden, dass MNV-1 in Makrophagen und dendritischen Zellen repliziert (WOBUS et al. 2004). An der MHH wurde MNV aus Anzeiger-Mäusen isoliert, die Kontakt zur Einstreu von Mäusen der Quarantäneabteilung des ZTL hatten. Da die Mäuse eine schwere kombinierte Immundefizienz hatten, wurde eine mögliche aktive bzw. persistierende Infektion vermutet. Spätere Studien von Goto et al. untermauern eine langfristige MNV-Ausscheidung bei Prkdcscid-Mäusen nach einer Infektion mit MNV (GOTO et al. 2009). Klinische Symptome gab es nicht. Ein Antikörpernachweis war zu diesem Zeitpunkt nicht etabliert. Außerdem war ein serologischer Nachweis aufgrund der Immundefizienz der Anzeiger-Mäuse ungeeignet. Mit Hilfe von RAW 264.7-Zellen gelang eine Isolierung und Vermehrung des MNVStammes. MNV-typisch trat ein starker CPE auf. Um Infektionsversuche durchführen zu können, musste das angezüchtete Virus quantifiziert werden. Ein zuerst durchgeführter Plaque-Test zur Virusquantifizierung ließ sich nicht auswerten, da das Virus keine auszählbaren Löcher im Zellrasen verursachte. Daraufhin wurde ein TCID50-Test durchgeführt, der ausgewertet werden konnte. Ungefähr zeitgleich wurden ebenfalls Isolate beschrieben, bei denen ein Plaque-Test nicht auswertbar war (MÜLLER et al. 2007). Nur der TCID50-Test ist geeignet für eine Virusquantifizierung des vorliegenden Isolats. Für einen Vergleich verschiedener Isolate sollte daher der TCID50-Test angewandt werden. 5.2 Sequenzierung Zur Sequenzierung des MNV-Isolats wurde unter anderem der Primer 15T-aTag eingesetzt (MÜLLER et al. 2007). Aufgrund seines Aufbaus eignet sich dieser Primer 84 Diskussion sehr gut, um unbekannte Noroviren zu sequenzieren. Er verfügt über einen zum Poly-Adenin-Schwanz des Virus-Genoms komplementären Anteil von 15 Thymin kombiniert mit einer variablen Base (V=A+C+G), sowie einer zusätzliche Sequenz, die als spätere Primerbindungsstelle („Tag“) verwendet wurde. Das komplette Genom wurde in der Nukleotiddatenbank des NCBI unter dem Namen Murine norovirus/Hannover1/2007/DEU mit der accession number EU854589 veröffentlicht. Ein Vergleich mittels BLAST (ALTSCHUL et al. 1990) zeigte eine hohe Übereinstimmung mit MNV-4 (accession number FJ446719). Die Kenntnis der genetischen Sequenz des MNV-Isolats ermöglichte dann einen Abgleich der bereits für die Detektion entwickelten Primer, um diese an die vorliegende Sequenz anzupassen. 5.3 Nachweisverfahren MNV-PCR Um MNV isolieren zu können, musste eine direkte Detektionsmethode in Form der PCR entwickelt werden. Da unterschiedliche MNV-Isolate voneinander stark abweichende Sequenzen haben können, wurden zuerst anhand bereits veröffentlichter MNV-Sequenzen Primer zur Detektion entwickelt, sowie Primer aus anderen Veröffentlichungen erprobt. Das durch die eigenen Untersuchungen bevorzugte Primerpaar 5004f/5219r ist ohne Abweichung in der Sequenz des Isolats vorhanden. Im Vergleich zu anderen ausgetesteten Primerpaaren war hier zwar nur eine mittelstarke Bande zu sehen, jedoch kam es bei aufgearbeiteten Organ- und Kotproben nicht zu einer Mehrfachbandenbildung, die für einen PCR-Nachweis unerwünscht ist (siehe Abbildung 7 S. 55). Da das Isolat aus der Milz einer NOD-Prkdcscid-Maus gewonnen worden war, wurden im Tierversuch auch die Milzen der infizierten Mäuse entnommen und per PCR auf das Vorhandensein von MNV-RNA getestet. Hierbei stellte sich heraus, dass alle Milzen negativ getestet Gastrointestinaltrakt der wurden. Mäuse Es konnte nachgewiesen jedoch werden. Erreger-RNA Dies bestätigt im die 85 Diskussion Untersuchungsergebnisse von Goto et al. (GOTO et al. 2009). Auch acht Wochen nach der Infektion war im Kot der Mäuse noch MNV-RNA nachzuweisen, bei Paik et al. wurde zehn Wochen p.i. MNV-RNA im Kot nachgewiesen (PAIK et al. 2010). Der RNA-Nachweis lässt jedoch nicht unbedingt eine Aussage über die Infektiösität zu (MÜLLER 2009). Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich Mäusekot gut für einen Erregernachweis eignet. Die Mäuse müssen nicht getötet werden. Häufig setzen sie bei einer Fixierung Kot ab. Dies bedeutet relativ wenig Stress im Vergleich zu einer Blutentnahme für einen serologischen Nachweis. Bisher wurde aufgrund der genetischen Variabilität bei murinen Noroviren allerdings kein Universalprimerpaar zum Nachweis verschiedener bekannter muriner Norovirusstämme gefunden. Es müssen also mehrere Primerpaare verwandt werden. Ein PCR-Nachweis ist daher eher für die Überwachung eines Infektionsversuchs mit murinem Norovirus bekannter Sequenz geeignet (HENDERSON 2008). Im Rahmen dieser Doktorarbeit kam der PCR-Nachweis zum Einsatz, um die Virusverteilung im Tier und die Dauer der Ausscheidung zu bestimmen. Das Zäkum wurde im Rahmen der Versuche immer komplett für die Histologie entnommen. Es sollte bei zukünftigen Versuchen beprobt werden, da Goto et al. Kot und Zäkum für den PCR-Nachweis von MNV empfehlen (GOTO et al. 2009). Serologische Nachweisverfahren Für den Nachweis einer Infektion mit MNV wurde mit Hilfe des isolierten MNVStammes im Rahmen der Dissertation ein serologisches Testverfahren in Form eines ELISA entwickelt. Aufgrund der serologischen Kreuzreaktivität verschiedener MNVIsolate (HSU et al. 2006; THACKRAY et al. 2007) eignet sich der serologische Test sehr gut für die Routine-Untersuchung auf eine Infektion mit MNV. Zu beachten ist beim serologischen Nachweis, ob die Maus in der Lage ist, Antikörper zu bilden, und ob die Infektion lange genug zurückliegt, dass bereits Antikörper gebildet wurden. Humane Noroviren haben im Gegensatz zu MNV verschiedene Serotypen. Hinzu 86 Diskussion kommt eine hohe Durchseuchung beim Menschen, was den serologischen Nachweis in der Humandiagnostik weniger sinnvoll erscheinen lässt. MNV-IFA (entwickelt durch die Firma Biodoc) Die Herstellung der Objektträger, die mit MNV infizierten Zellen beschichtet sind, erfolgte technisch angelehnt an Kraft und Meyer. (KRAFT u. MEYER 1990). Dadurch, dass die Auswertung durch einen Untersucher am Mikroskop durchgeführt wird, können hier Seren mit hohem unspezifischen Hintergrund erkannt werden. Auch Seren mit niedrigem Titer können durch den Untersucher anhand der typischen Markierung infizierter Zellen erkannt werden. Oft werden in Veröffentlichungen positive Befunde aus ELISA und MFI mit der IFA bestätigt bzw. validiert (HSU et al. 2005). MNV-ELISA Der ELISA ermöglicht die automatisierte und quantitative Auswertung, da hier mit einem Photometer der OD-Wert bestimmt wird. Anfangs wichen die Ergebnisse des im Rahmen dieser Dissertation entwickelten ELISA teilweise von den Ergebnissen der Immunfluoreszenz ab. Einige Mäuse, die eindeutig negativ in der Immunfluoreszenz auf MNV getestet wurden, reagierten im MNV-ELISA positiv. Ein kommerzieller rekombinanter ELISA, hergestellt zu wissenschaftlichen Zwecken durch Charles River Laboratories, reagierte ebenfalls negativ. Dies sprach für eine unspezifische Reaktion aufgrund von ungenügender Aufreinigung des Virusantigens. Eine zusätzliche Aufreinigung über einen CsCl-Gradienten, wie sie in diversen Veröffentlichungen beschrieben war (HSU et al. 2005), führte nicht zu besseren Ergebnissen. Daraufhin wurde untersucht, ob die besagten Seren auch mit Bestandteilen der für die Virusanzucht verwendeten RAW-Zellen reagierten, da es sich bei der Zelllinie um Maus-Makrophagen handelt. Die Zellen wurden in der Zellkultur angezüchtet Aufreinigungsprozess, und der zur nicht infiziert. Es erfolgte MNV-Antigenaufreinigung der angewandt gleiche wurde. Anschließend wurden Untersuchungskavitäten beschichtet. Wurden nun die IFAnegativen Seren getestet, so reagierten einige Seren mit einer deutlichen Erhöhung 87 Diskussion des OD-Werts. Die „falsch“ positiven Seren reagierten also auf einen Bestandteil der Zellkultur. Andere Veröffentlichungen haben diese unerwünschte Reaktion bisher nicht beschrieben. Um falsch positive Seren zu erkennen, wurde daraufhin eine Zellkontrolle dauerhaft eingeführt. Damit die Kontrollzellkultur vergleichbar zu den infizierten Zellkulturen war, wurden beide Zellkulturen (nicht infiziert und infiziert mit MNV) parallel möglichst gleich behandelt inklusive der Aufreinigung. Bewertet für die diagnostische Aussage wurde die Differenz aus MNV-OD-Wert und RAW-OD-Wert. Durch Einführung des korrigierten OD-Werts wurde eine hohe Übereinstimmung zu den Testergebnissen der IFA erreicht. Um falsch positive Ergebnisse zu reduzieren, wurde auch ein fraglicher Bereich definiert. Im Idealfall ergab der Differenzwert bei einem MNVnegativen Serum den Wert 0, bei einem MNV-positiven Serum einen Wert >0, der abhängig von der Verdünnung des Antigens bei der Beschichtung der ELISA-Platte und dem Antikörpertiter des Serums war. Um bei der Beschichtung für eine größtmögliche Konstanz zu sorgen, wurde ein positiver Kontrollserumpool angelegt, aliquotiert und eingefroren. Bei der Erstellung einer neuen Charge ELISA-Platten sollten ähnliche OD-Werte erreicht werden, wenn der positive Kontrollserumpool aufgetragen wurde. Der positive Kontrollserumpool wurde außerdem für die Validierung eingesetzt und als Positivkontrolle bei ELISATests mitgeführt. Bei korrigierten OD-Werten, die im fraglichen Bereich zwischen 1 bis 1,5 lagen, sollte der OD-Wert der Zellkontrolle getrennt beurteilt werden. Fand hier eine starke Reaktion (hoher OD-Wert) statt, so konnte von einer unspezifischen Reaktion ausgegangen werden, die durch nicht gegen MNV gerichtete Antikörper hervorgerufen wurde. War der korrigierte OD-Wert im fraglichen Bereich, der ODWert der Zellkontrolle jedoch niedrig, so konnte es sich um ein Serum mit schwachem Antikörpertiter gegen MNV handeln. Es empfahl sich die erneute Untersuchung des Serums mit einem anderen Testverfahren (z. B. IFA) oder eine erneute Blutabnahme zur Serumgewinnung, um dieses dann mit dem ELISA zu testen. 88 Diskussion 5.4 Prävalenz Mit Hilfe der serologischen Testverfahren wurde das Vorkommen von MNV in verschiedenen Hygieneeinheiten im ZTL untersucht. Hierbei zeigte sich in der experimentellen Barriere eine hohe Prävalenz für MNV, die weltweit in vielen Versuchstierhaltungen festgestellt wurde (MÄHLER u. KÖHL 2009; PRITCHETTCORNING et al. 2009). Dagegen waren Zuchttiere aus Isolatoren und SPF-Haltung MNV-negativ. Die Art der Haltung der Mäuse hatte also einen großen Einfluss auf das Vorhandensein von MNV-Antikörpern. Dieses Ergebnis lässt sich einerseits durch eine bereits erfolgte Sanierung von anderen Erregern durch Embryotransfer und Hysterektomie in der Vergangenheit, sowie andererseits durch die strengen Hygiene-Auflagen erklären (HENDERSON 2008). In der experimentellen Haltung sind die Hygiene-Auflagen für Pflegepersonal und Experimentatoren weniger streng gefasst und überwacht. Hier werden nach Quarantänisierung und Freigabe durch das mikrobiologische Labor des ZTL auch importierte Tiere gehalten. Die Prävalenzdaten wurden erfasst, bevor MNV als Problem erkannt wurde. Werden die Tiere ohne Filterdeckel gehalten, kann sich MNV über kontaminierte Einstreu noch besser in einem Haltungsraum verbreiten. Dies lässt sich aus dem Vergleich der Prävalenz der Haltung im offenen Käfig (87%) zur Haltung im Filterdeckelkäfig (67%) schließen. Eine nochmals niedrige Prävalenz (55%) weist die Haltung im IVC-Regal auf. Durch die getrennte Belüftung jedes einzelnen Käfigs kann eine Übertragung über die Zuluft von Käfig zu Käfig verhindert werden. Gerät der Erreger jedoch beim Experiment oder Umsetzen in den Käfig, so kann von einer hohen Infektionsrate ausgegangen werden. Nach der Infektion im Tierversuch war eine Serokonversion bei allen infizierten Tieren festzustellen. Ein separater Filterdeckelkäfig mit nicht infizierten Kontrolltieren stand zusammen mit den Filterdeckelkäfigen der infizierten Tiere im gleichen belüfteten Käfigschrank. Die Haltung in einem Filterdeckelkäfig kombiniert mit der richtigen Reihenfolge der Tierbetreuung (nicht infizierte Käfige zuerst versorgen) sowie dem Käfigwechsel unter einer Sicherheitswerkbank haben bei oben genanntem Käfig mit Kontrolltieren 89 Diskussion erfolgreich eine Kontamination mit MNV verhindert. Sowohl PCR- als auch SerologieDiagnostik für MNV waren bei diesen Mäusen negativ. 5.5 MNV im Tierversuch Bei den immunkompetenten Mäusen, die im Rahmen dieser Dissertation untersucht wurden, war die Infektion mit dem isolierten MNV-Stamm zu den untersuchten Zeitpunkten auf den Magen-Darm-Trakt beschränkt. Die Infektion mit dem isolierten MNV-Stamm führte zu einer verstärkten IFNγ-Sekretion der T-Zellen der infizierten Mäuse (SPF-Haltung), wenn diese in vitro stimuliert wurden, auch im subakuten Infektionsstadium 4 Wochen p.i. Die histologische Auswertung zeigte eine geringfügige Erhöhung des Histologie-Scorewerts auf. So wurde bei einigen C3Il10-/--Mäusen 4 Wochen nach der Infektion eine milde Hyperplasie des Epithels, ein gemischtzelliges Entzündungszell-Infiltrat in Mukosa und Submukosa sowie ein geringgradiges Ödem festgestellt. Der isolierte MNV-Stamm kann daher einen kolitogenen Stimulus auf die IL10-defiziente Maus haben. Diese Beobachtungen (veränderte Histologie und gesteigerte IFNγ-Sekretion) wurden vor allem bei Mäusen mit dem genetischen Hintergrundstamm C3H/HeJBir gemacht. Im Infektionsversuch mit keimfreien C3-Il10-/--Mäusen gab es keinen signifikanten Unterschied bei der Messung der IFNγ-Sekretion zwischen infizierten und nicht infizierten Mäusen. Histologisch war lediglich eine leicht vermehrte Anzahl mononukleärer Zellen festzustellen, die für eine Aktivierung der intestinalen Immunantwort steht. Hieraus lässt sich schlussfolgern, dass murine Noroviren nur in Kombination mit einer aktiven Darmflora eine verstärkte IFNγ-Sekretion und histologische Veränderungen hervorrufen. Die Tötung der keimfreien Mäuse zur Organentnahme für die Histologie sowie zur Gewinnung von Lymphozyten zur Stimulation wurde 4 Wochen p.i. durchgeführt. In vorhergehenden Versuchen mit SPF-Mäusen war eine Erhöhung der IFNγ-Sekretion nach 2 und 4 Wochen gemessen worden. Daher wurde der Zeitpunkt für die Sektion 90 Diskussion 4 Wochen nach der Infektion gewählt. Veränderungen zu einem früheren Zeitpunkt p.i. können nicht ausgeschlossen werden. Der Doppelinfektionsversuch zeigte, dass eine vorhergehende Infektion mit MNV eine 14 Tage später folgende Infektion mit H. hepaticus nicht verstärkte. Anhand der Befunde der Lymphozytenstimulation aus dem zweiten Infektionsversuch wurde der Infektionstermin mit H. hepaticus 2 Wochen nach der Infektion mit MNV festgesetzt. Die histologische Auswertung zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen Doppelinfektion und Kontrollgruppe, jedoch war der Histologie-Score bei einigen Mäusen aus der Doppelinfektionsgruppe etwas geringer. Dies könnte für einen leicht protektiven Effekt der MNV-Infektion sprechen. Dieser ließe sich erklären durch eine Abschwächung der Immunantwort auf H. hepaticus durch MNV. Da das Virus antigenpräsentierende Makrophagen befällt und zerstört, könnte die überschießende Immunreaktion gegen H. hepaticus herabgesetzt sein. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu einer Veröffentlichung von Lencioni et al. (LENCIONI et al. 2008). Hier wurden jedoch ein anderes Mausmodell (MDR1α-defiziente Maus), ein anderer Infektionszeitpunkt, ein anderes Norovirus (MNV-4) und eine andere Helicobacter-Art gewählt. Die Infektion mit H. bilis erfolgte 7 Tage nach der Infektion mit MNV. Die Tötung der Tiere mit anschließender Sektion erfolgte bei Lencioni et al. variabel nach Schweregrad der klinischen Symptome. 5.6 Ausblick Die problemlose Anzucht von MNV ermöglicht neue Erkenntnisse zur Tenazität des Erregers, was gerade im Bereich Hygieneforschung genutzt werden kann, um gegen humane Noroviren wirksame Desinfektionsmittel und Hygienestrategien zu entwickeln (CANNON et al. 2006). Im Zellkulturmodell lassen sich Pathomechanismen ergründen, wie Noroviren Zellen schädigen und sich in ihnen vermehren. Dies ermöglicht unter Umständen die Entwicklung einer Impfung oder Akut-Therapie gegen humane Noroviren. Erste 91 Diskussion Antikörper wurden durch Müller et al. auf Kreuzreaktivität und Effizienz erprobt (MÜLLER 2009). MNV in der Labortierhaltung Die serologischen Testverfahren ermöglichen eine Routine-Überwachung der Hygiene in Labortierhaltungen aufgrund der vorhandenen serologischen Kreuzreaktivität bei verschiedenen murinen Noroviren (HSU et al. 2006). Der Nachweis per PCR ist möglich, jedoch gibt es bisher kein Primerpaar, mit dem alle murinen Noroviren detektiert werden können. Dies sollte bei Hygieneuntersuchungen bedacht werden. Ein negatives PCR-Ergebnis muss nicht zwangsläufig für einen negativen Bestand stehen (HENDERSON 2008). MNV hat in der vorliegenden Arbeit keine klinischen Auswirkungen auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus gehabt. Jedoch kann zum Beispiel eine akute MNV-Infektion bei IL10-defizienten Mäusen im Tierversuch zu falschen Vergleichswerten bei einer in vitro Lymphozytenstimulation in der INFγ-Bestimmung führen. Auch leichte histologische Veränderungen sind möglich. Diese Effekte können Ergebnisse in Versuchen mit der IL10-defizienten Maus als Tiermodell für CED verändern. Ein Einfluss von MNV auf andere Mausmodelle kann nicht ausgeschlossen werden. Weitere Untersuchungen hierzu sind empfehlenswert und notwendig. Es wurden zudem MNV-Isolate mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben. So kann MNV-1 bei schwer immundefizienten Mäusen (RAG2- und STAT1-defizient) zu tödlichen systemischen Erkrankungen führen (KARST et al. 2003). Da eine Diagnostik im Rahmen der Routine-Überwachung möglich ist, sollte MNV daher im Tierbestand langfristig ausgeschlossen werden. Hygienemaßnahmen und Standardmethoden der Bestandssanierung haben Erfolg gezeigt (ARTWOHL et al. 2008; COMPTON 2008). 92 Zusammenfassung 6 Zusammenfassung Marcel Achard „Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der IL10-defizienten Maus“ Im Rahmen dieser Dissertation wurde ein murines Norovirus (MNV), das aus Anzeiger-Mäusen des Zentralen Tierlaboratoriums (ZTL) der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH) isoliert wurde, charakterisiert. Die genetische Sequenz wurde bestimmt und wies eine 95% Übereinstimmung zu MNV-4 auf. Sie wurde unter der Zugangsnummer EU854589 veröffentlicht. Zusätzlich wurden elektronenmikroskopische Aufnahmen der Virusstruktur erstellt. Die erfolgreiche Anzucht und Vermehrung von MNV in RAW 264.7-Zellen ermöglichte die Etablierung diagnostischer Tests in Form von PCR und Serologie (ELISA). Mit Hilfe der serologischen Diagnostik wurde die Prävalenz für MNV im Zentralen Tierlaboratorium der MHH für den Überwachungszeitraum 2007/2008 erfasst. MNV-positive Anzeiger-Mäuse wurden nur in der experimentellen Barriere gefunden. Die Prävalenzrate bewegte sich je nach Tierraum zwischen 8% und 61%. Die Auswirkung von MNV auf das Tiermodell der IL10-defizienten Maus (Il10-/-) wurde anhand von zwei genetischen Hintergrundstämmen, C3H/HeJBirZtm (C3) sowie C57BL/6JZtm (B6), im Infektionsversuch untersucht. Alle infizierten Mäuse wiesen eine Serokonversion auf. Es kam zu keiner klinischen Beeinträchtigung. MNV war bei den infizierten Mäusen nur in Organen des Gastrointestinaltraktes per PCR nachweisbar. Kot, Kolon und Mesenteriallymphknoten waren als Probenmaterial besonders geeignet für einen PCR-Erregernachweis. 93 Zusammenfassung Es konnten keine schwerwiegenden histologischen Veränderungen im Vergleich zu nicht mit MNV infizierten Kontrollmäusen ausgemacht werden. Bei einigen mit MNV infizierten C3-Il10-/--Mäusen wurden jedoch sehr milde fokale entzündliche Veränderungen im Kolon festgestellt. Die Interferon (INF)γ-Sekretion in vitro stimulierter Darmlymphozyten von mit MNV infizierten Mäusen war 2 Wochen nach der Infektion erhöht im Vergleich zur nicht infizierten Kontrollgruppe. Bei infizierten C3-Il10-/--Mäusen war die IFNγ-Sekretion 4 Wochen nach der Infektion weiterhin erhöht. Keimfrei gehaltene C3-Il10-/--Mäuse, die mit MNV infiziert wurden, wiesen 4 Wochen nach der Infektion keine entzündlichen histologischen Veränderungen oder eine gesteigerte IFNγ-Sekretion auf. Demnach kann MNV nur in Verbindung mit einer endogenen bakteriellen Darmflora einen kolitogenen Stimulus erzeugen. Ein Doppelinfektionsversuch mit MNV und 14 Tage später mit Helicobacter (H.) hepaticus sollte zeigen, ob eine vorhergehende Infektion mit MNV eine entzündliche Darmerkrankung, ausgelöst durch H. hepaticus, verstärken kann. Die Kontrollgruppe wurde nur mit H. hepaticus infiziert. Alle Mäuse wurden 6 Wochen nach der Infektion mit H. hepaticus seziert. Die Befunde der Klinik, Histologie und IFNγ-Sekretion wiesen keine deutlichen Unterschiede auf. Hieraus lässt sich folgern, dass MNV die Entwicklung einer durch H. hepaticus hervorgerufenen Entzündung bei der IL10defizienten Maus nicht verstärkt. Dennoch zeigen die vorhergehenden Versuche, dass die Interaktion von MNV mit einer endogenen apathogenen Darmflora bei der IL10-defizienten Maus zu einer milden Entzündungsreaktion im Darm führen kann. Dies macht MNV zu einem nicht zu vernachlässigenden Faktor im Tierversuch. 94 Summary 7 Summary Marcel Achard “Characterization of a murine norovirus – the impact of the virus on experimental inflammatory bowel disease in IL10-deficient mice” Aim of this study was to characterize a murine norovirus (MNV) that was isolated from sentinel-mice of the Central Animal Facility (Ztm) at Hannover Medical School. Genetic sequencing was performed and showed 95% identity with MNV-4. The sequence was published under the accession number EU85489. Additionally, the virus structure of MNV was depicted by electron microscopy. The successful replication of MNV in RAW 264.7-cells allowed us to establish several diagnostic tests as PCR and serology (ELISA). Therefore, it was possible to determine the prevalence of MNV at the Ztm for the years of 2007 and 2008. MNVpositive mice were only found in the experimental barrier. Prevalence among animal rooms differed from 8% to 61%. In order to analyse the influence of MNV on IL10-defficient mice (Il10-/-), Il10-/- mice on genetic background strains C3H/HeJBirZtm (C3) and C57BL/6JZtm (B6) were experimentally infected. Although seroconversion could be detected in all infected animals, no clinical effects were visible. The detection of MNV in infected mice was solely possible in organs of the gastro-intestinal tract. Faeces, colon and mesenteric lymph nodes were suitable material for the detection of MNV via PCR. Histological examinations of MNV-positive mice did not show grave differences in comparison to control mice. Nevertheless, few individuals belonging to the C3-Il10-/group showed mild focal inflammations of the colon. In vitro stimulated intestinal lymphocytes of MNV-positive mice secreted significantly more interferon (IFN)γ two 95 Summary weeks post infection (p.i.) than those of the control group. Infected animals belonging to the C3-Il10-/- group showed an increased IFNγ-secretion up to four weeks p.i. Sterile housed C3-Il10-/--mice that were infected with MNV neither showed inflammatory changes of the colon nor an increased secretion of IFN-γ four weeks p.i. Therefore, MNV is only able to induce a colitogenic stimulus in combination with an endogenous bacterial intestinal flora. A dual infection experiment with MNV and Helicobacter (H.) hepaticus (14 days subsequent to the MNV infection) was intended to clarify the question, whether a preceding infection with MNV aggravates inflammatory diseases of the bowel. A control group was only infected with H. hepaticus. All mice were sacrificed six weeks p.i. with H. hepaticus. No obvious differences in clinical signs, intestinal pathology or INFγ secretion were observed. Therefore, it is suggested that MNV does not exacerbate inflammatory diseases resulting from a H. hepaticus infection in IL10deficient mice. Nevertheless, the preceding experiments demonstrate the interaction of MNV with the endogenous, non-pathogenic intestinal flora in IL10-deficient mice. Thus, an infection with MNV should be considered as a confounding variable in animal experimentation using mouse models. 96 Anhang 8 Anhang Protokoll zur Isolation von RNA aus Zellkulturüberstand bzw. Organen (gemäß Hersteller Macherey-Nagel) 1) Bis zu 30 mg Gewebe werden zerkleinert bzw. homogenisiert und in ein steriles Eppendorfgefäß gegeben; bei Zellkulturüberstand ist dieser Schritt nicht nötig. 2) 350 µl RA1-Puffer und 3,5 µl ß-Mercaptoethanol werden hinzugegeben; anschließend wird die Probe für 1 min gevortext. 3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt; anschließend wird die Probe auf den Filter aufgetragen und für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert. 4) Der NucleoSpin®- Filter wird verworfen, zum Filtrat werden 350 µl 70% Ethanol gegeben. 5) Nach mehrmaligem Durchmischen mit der Pipette wird das Lysat auf eine NucleoSpin® RNA II-Säule gegeben und für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. 6) Das Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert. 7) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben, danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur. 8) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesetzt. Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit 600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen zurückgestellt. Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2 min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies Sammelröhrchen gesetzt. 97 Anhang 9) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert, das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt bei 11000 x g für 1 min. 98 Anhang Protokoll zur Isolation von RNA aus Kot (gemäß Hersteller Macherey-Nagel, modifiziert durch Kunden) 1) Zur Kotprobe werden 350 µl des vorbereiteten ß-Mercaptoethanol-RA1 gegeben. 2) Anschließend wird die das Gemisch für 2 min gevortext. 3) Ein NucleoSpin®- Filter wird in ein Sammelröhrchen gesteckt; anschließend wird das Gemisch auf den Filter aufgetragen und für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert. 4) Der Überstand wird in ein neues Gefäß überführt, das sichtbare Pellet verworfen. 5) Zum Überstand werden 350 µl 70% Ethanol gegeben. 6) Nach einer Inkubation von 5 min wird das Gemisch nach mehrmaligem Durchmischen mit der Pipette auf eine NucleoSpin® RNA II-Säule aufgetragen und für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. 7) Das Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gestellt. 350 µl Membrane Desalting Buffer werden auf die Säule gegeben, dann wird für 1 min bei 11000 x g zentrifugiert. 8) 95 µl vorbereitete DNase-Reaktionsmixtur werden auf die Säule gegeben, danach erfolgt eine 15 minütige Inkubation bei Raumtemperatur. 9) Ein erster Waschschritt erfolgt mit 200 µl RA2-Puffer, der auf die Säule gegeben wird. Dann wird für 30 s bei 11000 x g zentrifugiert. Die Säule wird in ein neues Sammelröhrchen gesetzt.Ein zweiter Waschschritt erfolgt mit 600 µl RA3-Puffer für 30 s bei 11000 x g. Die Flüssigkeit im Sammelröhrchen wird verworfen, die Säule wird in das Sammelröhrchen zurückgestellt.Ein dritter Waschschritt erfolgt mit 250 µl RA3-Puffer für 2 min bei 11000 x g. Anschließend wird die Säule in ein nukleasefreies Sammelröhrchen gesetzt. 10) Zum Abschluss wird die RNA mit 40 – 60 µl RNase-freiem Wasser eluiert, das auf die Säule gegeben wird. Es erfolgt ein letzter Zentrifugationsschritt bei 11000 x g für 1 min. 99 Anhang Rohdaten ELISA-Messung Intraseriell Serumpool OD MNV OD RAW OD korrigiert + 3,474 0,773 2,701 + 3,348 0,717 2,631 + 3,505 0,69 2,815 + 3,475 0,681 2,794 + 3,524 0,738 2,786 + 3,535 0,806 2,729 + 3,524 0,713 2,811 + 3,492 0,739 2,753 + 3,44 0,726 2,714 + 3,593 0,709 2,884 - 0,673 0,591 0,082 - 0,651 0,523 0,128 - 0,757 0,607 0,15 - 0,752 0,592 0,16 - 0,677 0,612 0,065 - 0,7 0,609 0,091 MW SD 2,7618 0,071530568 0,11266667 0,03886215 +: MNV-positiv; -: MNV-negativ Interseriell Positivserumpool Tag OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD 1 3,601 0,714 2,887 2 3,671 0,843 2,828 3 3,52 0,706 2,814 4 3,72 0,776 2,944 5 3,737 0,905 2,832 6 3,627 0,8 2,827 7 3,801 0,949 2,852 8 3,594 0,67 2,924 9 3,836 1,133 2,703 10 3,559 0,96 2,599 2,821 0,10247927 100 Anhang Negativserumpool Tag OD MNV OD RAW OD korrigiert MW SD 1 0,691 0,612 0,079 2 0,613 0,658 -0,045 3 0,705 0,653 0,052 4 0,809 0,732 0,077 5 0,638 0,656 -0,018 6 0,784 0,773 0,011 7 0,725 0,617 0,108 8 0,503 0,521 -0,018 9 0,726 0,759 -0,033 0,091 0,0304 0,05721344 10 0,903 0,812 Linearität Serumverdünnung 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 OD MNV 3,495 3,527 3,4 2,946 3,318 3,438 2,741 3,077 3,129 2,74 2,624 2,647 2,149 2,592 2,327 1,826 1,725 1,693 OD RAW 0,874 0,885 0,938 0,721 0,76 0,876 0,527 0,534 0,549 0,415 0,389 0,409 0,332 0,321 0,335 0,248 0,244 0,237 OD korrigiert 2,621 2,642 2,462 2,225 2,558 2,562 2,214 2,543 2,58 2,325 2,235 2,238 1,817 2,271 1,992 1,578 1,481 1,456 MW SD 2,575 0,09842256 2,44833333 0,19342268 2,44566667 0,20148035 2,266 0,05111751 2,02666667 0,22897671 1,505 0,06444377 101 Anhang Einzelmessungen Negativ-Seren N=68 Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert 11146 8428 4050 8422 4053 4052 8423 11144 8418 11145 4054 8426 11143 4057 8431 4051 4058 10096 4049 11153 4059 11161 10095 8427 11158 8420 11156 10098 10089 10093 8430 8421 10097 8425 4055 8419 8429 11149 4769 10088 11150 4048 4056 8424 11147 102 - 3,032 1,56 2,122 0,167 2,146 0,414 0,207 1,171 0,235 0,478 0,386 0,172 0,322 0,278 2,744 0,379 0,491 0,296 0,54 0,257 0,386 1,432 0,218 0,2 0,274 0,164 0,236 0,298 0,331 0,287 0,178 0,23 0,303 0,154 0,381 0,272 0,175 0,235 0,456 0,372 0,226 0,411 0,393 0,185 0,212 3,375 1,883 2,434 0,402 2,369 0,592 0,359 1,32 0,383 0,606 0,512 0,297 0,425 0,375 2,841 0,468 0,577 0,38 0,623 0,336 0,463 1,503 0,287 0,265 0,336 0,222 0,288 0,35 0,382 0,334 0,223 0,273 0,345 0,187 0,414 0,305 0,203 0,26 0,481 0,395 0,244 0,423 0,403 0,194 0,221 -0,34 -0,32 -0,31 -0,24 -0,22 -0,18 -0,15 -0,15 -0,15 -0,13 -0,13 -0,13 -0,10 -0,10 -0,10 -0,09 -0,09 -0,08 -0,08 -0,08 -0,08 -0,07 -0,07 -0,07 -0,06 -0,06 -0,05 -0,05 -0,05 -0,05 -0,05 -0,04 -0,04 -0,03 -0,03 -0,03 -0,03 -0,03 -0,03 -0,02 -0,02 -0,01 -0,01 -0,01 -0,01 Prozentualer Anteil (von 68 negativen Seren) 4,41 8,82 32,35 42,64 Anhang Biodoc-Nr. IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert 10083 10099 11152 10084 10092 11155 10090 11151 10087 10086 11159 11154 10081 11160 10082 10085 11148 10100 4771 11157 10094 10091 4770 - 0,577 0,265 0,26 0,258 0,31 0,146 0,31 0,324 0,212 0,611 0,214 0,296 0,267 0,217 0,228 0,303 0,312 0,319 0,525 1,54 1,306 0,822 0,535 0,586 0,273 0,267 0,26 0,305 0,126 0,286 0,298 0,181 0,578 0,18 0,26 0,23 0,177 0,186 0,253 0,255 0,231 0,433 1,441 1,155 0,653 0,324 -0,01 -0,01 -0,01 0,00 0,01 0,02 0,02 0,03 0,03 0,03 0,03 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05 0,06 0,09 0,09 0,10 0,15 0,17 0,21 Prozentualer Anteil (von 68 negativen Seren) 1,47 4,41 103 Anhang Positiv-Seren N=76 Biodoc-Nr. IFA 8338 4131 10180 4454 10176 10181 4130 8725 8727 8344 4125 4453 8339 10173 8666 4451 8658 4126 4127 8718 4132 8723 8343 8676 4450 10191 4124 10174 8711 8677 10172 8648 8341 10178 8674 8675 4129 MAG03 8724 8669 MAG02 10175 8679 8719 4452 10171 8671 +/- EL + + NSR EL+ +++ NSR EL+ NSR EL+ ++ ++ + + ++ + + +++ + ++ + ++ + ++ ++ + +++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++ NSR EL+ + + + ++ + +++ +++ + +++ ++ +++ + +++ ++ NSR EL+ + 104 OD MNV OD RAW OD korrigiert 1,509 1,824 3,347 2,26 2,861 3,313 2,126 3,348 2,356 2,188 2,257 2,41 2,336 2,66 2,16 2,884 3,502 2,641 2,373 3,019 2,563 2,487 2,993 3,073 3,473 3,339 2,812 2,723 2,807 2,882 3,547 3,119 2,597 2,851 3,38 3,283 3,092 2,675 2,549 3,342 2,912 3,122 3,202 3,155 3,236 3,512 3,215 0,447 0,608 2,087 0,828 1,428 1,83 0,611 1,812 0,767 0,578 0,611 0,683 0,6 0,879 0,369 1,061 1,675 0,781 0,476 1,099 0,625 0,525 1,017 1,057 1,407 1,259 0,725 0,596 0,638 0,71 1,344 0,913 0,348 0,593 1,115 1,007 0,808 0,386 0,23 1,021 0,569 0,776 0,84 0,792 0,858 1,123 0,822 1,06 1,22 1,26 1,43 1,43 1,48 1,52 1,54 1,59 1,61 1,65 1,73 1,74 1,78 1,79 1,82 1,83 1,86 1,90 1,92 1,94 1,96 1,98 2,02 2,07 2,08 2,09 2,13 2,17 2,17 2,20 2,21 2,25 2,26 2,27 2,28 2,28 2,29 2,32 2,32 2,34 2,35 2,36 2,36 2,38 2,39 2,39 Prozentualer Anteil (von 76 positiven Seren) 1,32 1,32 1,32 2,63 3,95 2,63 3,95 6,58 3,95 3,95 5,26 5,26 11,84 15,79 Anhang Biodoc-Nr. IFA 8656 8650 8667 MAG04 MAG05 8668 8678 8716 8665 MAG01 8663 8680 8722 10177 10190 10189 10004 10001 8662 10185 8661 8660 10002 8681 8657 8720 8670 4503 10003 + ++ + ++ ++ + + ++ + ++ ++ +++ +++ ++ +++ +/- EL + +++ +++ + +++ + + +++ ++ ++ ++ ++ +++ +++ OD MNV OD RAW OD korrigiert 3,5 3,223 3,341 2,849 2,869 3,104 3,09 2,955 3,322 3,029 3,485 3,263 3,396 3,079 3,332 3,464 3,386 3,152 3,233 3,083 3,307 3,442 3,293 3,163 3,403 3,557 3,392 3,116 3,431 1,101 0,82 0,934 0,438 0,458 0,686 0,613 0,478 0,803 0,487 0,923 0,685 0,815 0,497 0,742 0,864 0,773 0,537 0,596 0,427 0,638 0,736 0,585 0,417 0,61 0,758 0,587 0,276 0,436 2,40 2,40 2,41 2,41 2,41 2,42 2,48 2,48 2,52 2,54 2,56 2,58 2,58 2,58 2,59 2,60 2,61 2,62 2,64 2,66 2,67 2,71 2,71 2,75 2,79 2,80 2,81 2,84 3,00 Prozentualer Anteil (von 76 positiven Seren) 5,26 11,84 5,26 5,26 1,32 1,32 +: schwach positive Reaktion; ++: Mittelstarke positive Reaktion; +++: Stark positive Reaktion NSR: Nicht spezifische Reaktion; +/-: Grenzwertige Reaktion; EL+: Charles-River-ELISA positiv 105 Anhang Negativ-Seren N=205 Biodoc-Nr. 3786 3830 2276 3122 3118 3559 3567 3563 3551 3555 3787 3782 4835 3547 3778 3837 3557 3036 2275 3794 3790 2343 2994 2530 2154 2212 3017 3014 3793 2995 2494 3561 2204 2496 3834 3554 2274 3549 2550 3562 3813 3833 2528 2344 3801 3553 2384 106 IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert - 0,782 0,93 1,711 0,162 1,232 0,352 0,507 0,66 0,602 0,804 1,378 0,957 1,416 0,45 0,898 0,567 0,426 0,505 0,839 0,548 0,689 0,599 0,673 0,353 0,658 0,657 0,829 1,006 0,505 0,823 0,512 0,306 0,476 0,376 1,717 0,747 1,63 0,321 0,964 0,75 0,687 1,02 0,344 0,784 0,551 0,71 1,323 1,167 1,284 2,048 0,48 1,517 0,622 0,776 0,892 0,828 1,021 1,579 1,15 1,608 0,614 1,058 0,719 0,578 0,652 0,984 0,688 0,823 0,732 0,8 0,464 0,755 0,737 0,898 1,075 0,573 0,888 0,575 0,365 0,534 0,432 1,772 0,793 1,675 0,365 1,006 0,792 0,727 1,056 0,378 0,815 0,582 0,739 1,348 -0,385 -0,354 -0,337 -0,318 -0,285 -0,27 -0,269 -0,232 -0,226 -0,217 -0,201 -0,193 -0,192 -0,164 -0,16 -0,152 -0,152 -0,147 -0,145 -0,14 -0,134 -0,133 -0,127 -0,111 -0,097 -0,08 -0,069 -0,069 -0,068 -0,065 -0,063 -0,059 -0,058 -0,056 -0,055 -0,046 -0,045 -0,044 -0,042 -0,042 -0,04 -0,036 -0,034 -0,031 -0,031 -0,029 -0,025 Prozentualer Anteil (von 205 Seren) 0,98 2,44 4,88 8,78 22,44 Anhang Biodoc-Nr. 2551 3016 3548 4833 3029 3119 2532 3032 2524 3564 2200 3781 3797 3010 2529 2999 2805 3550 3809 neg.Kontrolpool 3802 2192 4836 3005 2385 3006 2194 3818 3817 2672 3565 2195 3024 3810 3560 3821 3015 2197 2998 3030 4834 3558 3025 3803 3000 2341 2996 2342 2340 IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert - 0,433 0,56 0,39 0,776 0,725 1,342 0,43 0,544 1,253 1,457 0,846 0,868 0,599 0,617 0,417 0,942 0,142 0,56 0,518 0,879 1,029 0,492 0,292 0,937 0,82 0,635 0,523 1,004 0,732 0,832 0,331 0,891 0,727 0,837 0,612 0,772 0,941 0,576 0,66 0,443 0,341 0,497 0,912 0,648 0,515 1,088 0,614 0,685 1,28 0,458 0,584 0,412 0,796 0,742 1,359 0,445 0,558 1,26 1,464 0,851 0,873 0,602 0,615 0,407 0,93 0,128 0,544 0,502 0,862 1,01 0,47 0,267 0,911 0,791 0,604 0,49 0,968 0,692 0,791 0,288 0,845 0,678 0,788 0,562 0,719 0,887 0,521 0,604 0,385 0,283 0,437 0,852 0,587 0,446 1,019 0,542 0,613 1,206 -0,025 -0,024 -0,022 -0,02 -0,017 -0,017 -0,015 -0,014 -0,007 -0,007 -0,005 -0,005 -0,003 0,002 0,01 0,012 0,014 0,016 0,016 0,017 0,019 0,022 0,025 0,026 0,029 0,031 0,033 0,036 0,04 0,041 0,043 0,046 0,049 0,049 0,05 0,053 0,054 0,055 0,056 0,058 0,058 0,06 0,06 0,061 0,069 0,069 0,072 0,072 0,074 Prozentualer Anteil (von 205 Seren) 22,93 107 Anhang Biodoc-Nr. 2160 3038 2673 2552 3556 2193 2671 3783 3779 2196 2152 3039 3785 3808 3566 3026 3028 2958 2993 2526 2670 2153 3796 3806 3805 2203 3791 3018 3013 3033 2213 3001 3829 3835 3121 2527 3003 2531 3799 2188 3811 3815 3812 3820 3011 3552 3819 4943 3031 108 IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert - 0,679 0,545 0,716 0,871 0,778 0,498 0,499 0,939 1,259 0,812 0,693 0,838 0,892 0,689 0,499 1,089 0,405 0,783 0,739 1,004 0,948 0,708 0,851 0,859 0,593 0,642 0,946 1,309 0,933 0,887 0,863 0,689 0,989 0,951 0,302 1,757 0,73 0,47 0,961 0,594 0,596 0,758 0,936 0,739 0,971 0,733 0,966 0,639 0,722 0,604 0,47 0,638 0,792 0,699 0,418 0,414 0,852 1,168 0,714 0,59 0,735 0,789 0,585 0,394 0,983 0,295 0,671 0,626 0,883 0,826 0,578 0,718 0,724 0,457 0,504 0,804 1,166 0,789 0,741 0,716 0,541 0,836 0,797 0,147 1,595 0,568 0,306 0,794 0,417 0,411 0,573 0,748 0,55 0,78 0,539 0,77 0,442 0,523 0,075 0,075 0,078 0,079 0,079 0,08 0,085 0,087 0,091 0,098 0,103 0,103 0,103 0,104 0,105 0,106 0,11 0,112 0,113 0,121 0,122 0,13 0,133 0,135 0,136 0,138 0,142 0,143 0,144 0,146 0,147 0,148 0,153 0,154 0,155 0,162 0,162 0,164 0,167 0,177 0,185 0,185 0,188 0,189 0,191 0,194 0,196 0,197 0,199 Prozentualer Anteil (von 205 Seren) 12,68 Anhang Biodoc-Nr. 2273 3807 3795 2523 3784 2522 2201 3035 2495 3814 3034 3792 3827 3831 2497 3823 3826 3544 3800 2997 3648 2954 2525 4946 3023 3789 3004 3825 3009 3027 3804 3816 3836 3022 3020 3822 3002 3019 2151 4830 3012 3788 2211 3546 3037 3824 3021 3832 4832 IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert - 2,05 0,792 0,843 1,456 1,721 1,52 0,902 1,161 0,605 1,11 0,803 0,85 0,984 1,056 0,688 0,694 1,061 0,675 0,686 2,061 3,094 0,785 1,165 0,751 0,828 1,497 0,969 1,224 1,199 0,991 0,829 0,993 1,048 1,483 1,297 1,713 1,281 1,331 1,608 1,412 1,381 1,516 1,143 1,684 1,494 1,361 2,079 1,861 2,26 1,847 0,585 0,634 1,244 1,495 1,293 0,665 0,924 0,366 0,86 0,537 0,577 0,71 0,778 0,409 0,415 0,776 0,39 0,4 1,774 2,805 0,495 0,873 0,456 0,531 1,19 0,661 0,904 0,877 0,666 0,488 0,643 0,696 1,123 0,935 1,333 0,893 0,933 1,18 0,951 0,907 1,006 0,614 1,153 0,913 0,774 1,459 1,228 1,623 0,203 0,207 0,209 0,212 0,226 0,227 0,237 0,237 0,239 0,25 0,266 0,273 0,274 0,278 0,279 0,279 0,285 0,285 0,286 0,287 0,289 0,29 0,292 0,295 0,297 0,307 0,308 0,32 0,322 0,325 0,341 0,35 0,352 0,36 0,362 0,38 0,388 0,398 0,428 0,461 0,474 0,51 0,529 0,531 0,581 0,587 0,62 0,633 0,637 Prozentualer Anteil (von 205 Seren) 10,73 3,9 2,44 3,41 109 Anhang Biodoc-Nr. 3007 3545 3120b 3780 2966 3649 3008 3650 3647 3828 3798 110 IFA OD MNV OD RAW OD korrigiert - 1,482 1,78 1,515 1,877 1,802 2,998 3,578 1,365 4,636 2,185 2,428 0,845 1,131 0,854 1,194 1,117 2,276 2,832 0,482 3,653 1,078 1,006 0,637 0,649 0,661 0,683 0,685 0,722 0,746 0,883 0,983 1,107 1,422 Prozentualer Anteil (von 205 Seren) 2,44 0,49 0,49 0,49 0,49 Anhang Werte der Interferon γ-Messung (ng/ml) nach in vitro Stimulation Infektionsversuch 1 B6-Il10-/- m Kontrolle B6-Il10-/- w 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen Kontrolle 21,002 162,35 27,691 1,804 11,481 40,778 164,02 25,914 1,6 24,267 119 20,508 1,6 43,129 81,62 15,981 22,279 84,952 52,36 89,109 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen 179 10,3 2,093 10,358 172 22,539 1,974 13,52 78,676 18,599 1,6 1,6 6,696 52,232 17,027 1,6 19,176 1,6 9,89 66,46 16,575 1,6 27,472 3,06 12,541 48,36 32,708 1,6 27,089 38,835 15,756 9,782 10,59 18,992 C3-Il10-/- m Kontrolle C3-Il10-/- w 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 8 Wochen 0,3 79,938 395 216 103 188 117 0,3 61,699 292 321,004 121 184 315 0,472 99,934 443 278,172 144 276 134 0,3 112 382 199 205 202 128 0,3 60,732 160 104 237 122 176 0,3 117 342 356,347 167 171 109 64,899 201 128 402 67,924 99,694 111 Anhang Infektionsversuch 2 B6-Il10-/Kontrolle B6-wt 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 2,973333 3,035 5,729 0,469 3 1 2,075 4 6,951334 0,63 4 1 0,7683333 3,369333 1,065 0,336 6 2 2,113 2,861333 1,858 0,3836667 4 1 1,545667 3,317 1,369333 2,045667 1,265333 0,9803333 5,724667 1,910667 2,636333 0,9276667 0,7946666 2,797 2,543333 1,611333 0,4786667 0,2743333 2,458667 2,001667 2,554 3,642333 0,4215 3,029 2,399333 3,100333 3,239667 1,141667 0,755 1,194667 2,242333 7,518667 1,182 0,39 5,492 C3-Il10-/Kontrolle C3-wt 2 Wochen 4 Wochen Kontrolle 2 Wochen 4 Wochen 0,356 11,80267 6,646333 21,56933 6,281333 13,99133 8,830667 8,487667 31,18133 3,773 24,67033 6,955 19,142 38,412 2,569667 3,464667 9,635667 3,556667 17,75833 25,58133 2,814667 11,23733 3,849333 8,013 12,546 5,164667 4,597333 7,662 5,067 15,22533 4,452333 21,15 12,60533 Infektionsversuch 3 B6-Il10-/Kontrolle B6-wt 7d p.i. 0,9536667 3,396667 0,4835 2,374333 0,7356667 Kontrolle 7d p.i. 1,747 0,5966667 1,092333 1,172333 4,499 0,5336667 10,182 6,007 0,705 0,463 0,5565 3,774 0,429 1,819 2,051 3,633667 112 Anhang Infektionsversuch 4 C3-Il10-/- ( keimfrei) Kontrolle 4 Wochen 0,9279273 0,756581 0,969763 1,001276 1,777933 1,445699 1,157028 0,830935 1,817827 Infektionsversuch 5 C3-Il10-/- B6-Il10-/- H.hepaticus MNV + H.hepaticus H.hepaticus MNV + H.hepaticus 33,9378 26,05871 38,18218 46,39897 48,97928 50,26017 42,69127 9,08253 38,03638 45,06061 57,02307 24,43101 53,10282 54,62005 16,87314 12,40349 36,76929 55,69619 40,08938 36,34947 51,71358 50,76093 61,21308 113 Anhang TJL-Histologie-Werte für Infektionsversuch 5 Zäkum C3-Il10-/- B6-Il10-/- Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV 5 4 8 6 6 4 6 5 5 5 7 5 6 6 5 5 5 5 7 7 7 7 Helico Helico+MNV Helico Helico+MNV 11 10 15 18 14 7 14 12 11 10 14 6 12 12 11 12 10 7 17 13 10 11 5 Kolon 12 Helico: Infektion mit H. hepaticus; Helico+MNV: Doppelinfektion mit MNV und H. hepaticus 114 Literaturverzeichnis 9 Literaturverzeichnis ALTSCHUL, S. 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Hannover, Fachbereich Chemie der Universität Hannover, Diss. 125 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Schema des MNV-Genoms; unterhalb der Leseraster sind die verschiedenen Proteinprodukte mit ihrem Gewicht in Kilodalton aufgeführt; N, N Terminus; 3A, NTPase 3A-like; P, Vpg Protease; RdRp, RNA dependent RNA Polymerase; VP1, VP2 Hauptkapsidproteine (HENDERSON 2008). .................. 3 Abbildung 2: Elektronenmikroskopische Aufnahme von MNV-1 (markiert durch schwarze Pfeile) (HSU et al. 2005). .................................................................... 4 Abbildung 3: Dreidimensionale Rekonstruktion anhand cryoelektronenmikroskopischer Aufnahmen von humanem Norovirus (NV, virus-like particles), murinem Norovirus (MNV) und dem Virus der hämorrhagischen Erkrankung beim Kaninchen (RHDV, virus-like particles) im Vergleich (KATPALLY et al. 2010). .................................................................................................................. 5 Abbildung 4: Pathogenese der CED bei IL10-defizienten Mäusen, modifiziert nach Powrie (POWRIE 1995) und Elson (ELSON 1999). .......................................... 16 Abbildung 5: Vergleich verschiedener Primerpaare im Gradienten. ......................... 54 Abbildung 6: Vergleich der Primerpaare 5580f/5671r und 5205f/5469r mit 5 verschiedenen Proben, die aus Organen und Kot isoliert wurden. .................... 54 Abbildung 7: Vergleich der Primerpaare 5205f/5469r und 5004f/5219r. ................... 55 Abbildung 8: Verwandschaft vom isolierten MNV-Stamm Hannover1/2007/DEU erstellt durch BLAST (ALTSCHUL et al. 1990). ................................................. 57 Abbildung 9: TCID50-Test; der Indikator des Mediums zeigt lebende Zellen (gelb) an; zweites Bild nach der Anfärbung mit Kristallviolett (lebende Zellen stark lila). .. 58 Abbildung 10: MNV-positives Mausserum (+++) in der Immunfluoreszenz. MNVinfizierte Zellen sind grüngelblich markiert......................................................... 59 Abbildung 11: Kissenzentrifugation; Bande nach der Gradientenzentrifugation. ...... 60 Abbildung 12: Beziehung zwischen Extinktionswert und Verdünnung mit Regressionsgerade. .......................................................................................... 63 Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der Einzelmessungen von ausgewählten in der IFA positiven (n=76) und negativen (n=68) Mäuseseren. .................................. 65 126 Abbildungsverzeichnis Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der Einzel-OD-Wertbestimmung von 205 in der IFA negativen Mäuseseren mit Hilfe des ELISA. ............................................... 66 Abbildung 15: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von MNV-Virionen (durch schwarze Pfeile gekennzeichnet). ..................................................................... 67 Abbildung 16: Infektionsversuch 1, Mittelwert und SEM der IFNγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Proben pro Stamm, Geschlecht und Zeitpunkt gepoolt). ............................................................................................................ 72 Abbildung 17 Infektionsversuch 2, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht) ....................................................................................................... 74 Abbildung 18: Infektionsversuch 3, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht). ...................................................................................................... 75 Abbildung 19: Infektionsversuch 4, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht). ...................................................................................................... 76 Abbildung 20: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM der INFγ-Sekretion der in vitro stimulierten MLK-Zellen (Einzeltierproben, keine Unterscheidung nach Geschlecht). ...................................................................................................... 77 Abbildung 21: Infektionsversuch 5, Mittelwert und SEM des histologischen Score (Jackson) von Zäkum und Kolon bei der Kontrollgruppe (Helico mit H. hepaticus infiziert) und der Doppelinfektionsgruppe (MNV+Helico mit MNV und H. hepaticus infiziert). ............................................................................................ 80 Abbildung 22: Kolonabschnitt einer C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-C) und die zugehörige Kontrolle (D-F); HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle ist eine milde Hyperplasie des Epithels, ein gemischtzelliges Infiltrat in Mukosa und Submukosa sowie ein geringgradiges Ödem festzustellen. ........................................................................................... 81 Abbildung 23: Kolonabschnitt einer keimfreien C3-Il10-/--Maus 4 Wochen p.i. mit MNV (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H); HE-Färbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Im Vergleich zur Kontrolle unterscheidet sich die infizierte 127 Abbildungsverzeichnis Maus nur durch eine leicht vermehrte Anzahl mononukleärer Zellen. Weitere Entzündungsreaktionen sind nicht feststellbar. ................................................. 82 Abbildung 24: Kolonabschnitt einer B6-Il10-/--Maus infiziert mit MNV und H. hepaticus (A-D) und die zugehörige Kontrolle (E-H), nur infiziert mit H. hepaticus; HEFärbung, der schwarze Balken entspricht 100µm. Doppelinfektion und Kontrolle weisen eine vergleichbare mittel- bis hochgradige transmurale, gemischtzellige Enteritis mit prominenter Hyperplasie der Enterozyten auf................................ 83 128 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Interaktion verschiedener Umweltfaktoren auf das CED-Modell der IL10defizienten Maus ............................................................................................... 14 Tabelle 2: Ausprägung der Kolitis bei IL10-defizienten Inzuchtstämmen ................. 14 Tabelle 3: Verwendete Mausstämme und ihre Abkürzung ....................................... 18 Tabelle 4: Zusammensetzung von Altromin 1324 TPF ............................................. 19 Tabelle 5: Primer zur Detektion von MNV ................................................................ 22 Tabelle 6: Primer zur Klonierung von MNV .............................................................. 23 Tabelle 7: Primer zur Sequenzierung von MNV ........................................................ 23 Tabelle 8: Primer zur Kontrolle der RNA-Umschreibung zu cDNA ........................... 23 Tabelle 9: Primer zur Detektion von Helicobacter (H.) hepaticus ............................. 24 Tabelle 10: Primmerpaare zum Nachweis von MNV mit Hilfe des Quiagen-Taq PCR Core-Kit (Primersequenzen siehe S. 22f.) ......................................................... 34 Tabelle 11: Übersichtsdiagramm der Infektionsversuche ......................................... 46 Tabelle 12: Überblick über die Verbreitung von MNV im ZTL im Jahr 2008 ............. 68 Tabelle 13: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 1 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 4 Gruppen: Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i., 8 Wochen p.i. ..................................... 71 Tabelle 14: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 1 untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) ....................................... 72 Tabelle 15: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 2 mit Hilfe einer einfaktoriellen ANOVA für die 3 Gruppen: Kontrolle, 2 Wochen p.i., 4 Wochen p.i.............................................................. 73 Tabelle 16: Posthoc-Analyse zum Vergleich der Gruppen von Infektionsversuch 2 untereinander (Bonferroni´s Multipler Vergleichstest) ....................................... 73 Tabelle 17: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 3 mit einem ungepaarten t-Test ............................................ 75 Tabelle 18: Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 4 mit einem ungepaarten t-Test ............................................ 76 129 Tabellenverzeichnis Tabelle 19 Statistische Auswertung der Lymphozytenstimulation von Infektionsversuch 5 mit einem ungepaarten t-Test ............................................ 77 Tabelle 20: MNV-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) ............ 78 Tabelle 21: H. hepaticus-Nachweis via PCR (positiv getestet / insgesamt getestet) 79 Tabelle 22: Statistische Auswertung der histologischen Scorewerte von Infektionsversuch 5 mit einem ungepaarten t-Test ............................................ 80 130 Erklärung Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Disseration „Charakterisierung eines murinen Norovirus – Auswirkungen des Virus auf die experimentelle chronisch entzündliche Darmerkrankung bei der IL10-defizienten Maus“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: Die Sequenzierung von MNV wurde von der Firma MWG Biotech AG durchgeführt. Die elektronenmikroskopischen Aufnahmen erfolgten im Zentrallabor Elektronenmikroskopie der MHH mit freundlicher Unterstützung von Prof. Dr. Ungewickell, Gerhard Preiß und Jutta Milzer (Institut für Virologie, MHH). Die Messung der IFNγ-Sekretion erfolgte durch die Arbeitsgruppe PD Dr. Neumann im Institut für Pharmakologie der MHH. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am Institut für Versuchstierkunde der Medizinischen Hochschule Hannover angefertigt. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend gemacht habe. Hannover, den _____________________________ Marcel Achard 131 Danksagung Danksagung Mein Dank gilt Herrn Prof. Dr. Hedrich MHH Herrn Prof. Bleich, Ph.D. MHH Herrn Prof. Dr. Mähler MHH, Firma Biodoc am ZTL der MHH Herrn Dr. Zschemisch Frau Smoczek Frau Wehling Frau Wiebe Frau Janus, Ph. D. Frau Büchler, Ph. D. in der Firma Biodoc Frau Dr. Köhl & dem gesamten Labor-Team im Institut für Virologie der MHH Frau Milzer im Zentrallabor Elektronenmikroskopie der MHH Herrn Prof. Ungewickell Herrn Preiß im Institut für Pharmakologie der MHH PD Dr. Neumann & seiner Arbeitsgruppe im Institut für Virologie der TiHo Hannover Prof. Dr. Haas Frau Winter, Ph.D. und ganz besonders meinen Eltern und Freunden, die mich unterstützt haben. 132
