Abbildung - Universität Stuttgart

Untersuchung der DNA-Reparaturwege in
Streptomyces lividans TK64 anhand von
Deletionsmutanten
von der Fakultät für Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart
zur Erlangung der Würde eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
genehmigte Abhandlung
vorgelegt von
Lisa Grundmann
aus Stuttgart
Hauptberichter: Prof. Dr. Ralf Mattes
Mitberichter: Prof. Dr. Andreas Stolz
Tag der mündlichen Prüfung: 26.07.2012
Universität Stuttgart
Institut für Industrielle Genetik
2012
Danksagung
Herrn Prof. Dr. R. Mattes danke ich für die Bereitstellung des Themas, des Arbeitsplatzes und für die Korrektur dieser Arbeit.
Mein Dank gilt zudem Herrn Prof. Dr. A. Stolz für die Bereitschaft das Zweitgutachten
für diese Arbeit zu übernehmen.
Ich danke ferner Herrn Dr. J. Altenbuchner für die intensive Betreuung, die ständige
Diskussionsbereitschaft und die vielen hilfreichen Hinweise bei der Niederschrift dieser Arbeit.
Den Mitarbeitern des Instituts für Industrielle Genetik danke ich für ihre Hilfsbereitschaft und die gute Zusammenarbeit.
2
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen und Einheiten .....................................................................................7
1
Zusammenfassung ...............................................................................9
1.1
1.2
2
Summary ................................................................................................9
Kurzfassung.......................................................................................... 11
Einleitung ............................................................................................ 14
2.1
2.1.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.3
2.3.1
2.3.2
Streptomyceten .................................................................................... 14
Das Genom von Streptomyceten und seine Stabilität .......................... 15
Mutationen ............................................................................................ 17
Arten von Mutationen ........................................................................... 17
Spontane Ursachen für DNA-Schäden ................................................. 18
Induzierte DNA-Schäden ...................................................................... 19
Mutagene ............................................................................................. 20
DNA-Reparatursysteme ....................................................................... 22
Prävention und Reversion .................................................................... 23
Basenexzisionsreparatur ..................................................................... 25
2.3.3
2.3.4
Nukleotidexzisionsreparatur ................................................................. 29
Rekombinationsreparatur ..................................................................... 31
Der „RecF-Weg“ .................................................................................. 33
Wiederaufnahme der DNA-Synthese .................................................. 36
Transläsions-Synthese ........................................................................ 36
Der „RecBCD-Weg“ ............................................................................. 36
Der „RecE-Weg“ .................................................................................. 38
Das AddAB-Helikase/Nuklease-System .............................................. 39
Das AdnAB-Helikase/Nuklease-System .............................................. 39
Wie RecFOR RecBCD ersetzen kann ................................................. 40
2.3.5
2.3.6
2.3.7
2.4
Nicht-homologes Verbinden von Enden ............................................... 41
MMR ..................................................................................................... 41
Übersicht der vorgestellten Reparaturgene .......................................... 42
Zielsetzung ........................................................................................... 44
3
Material und Methoden ...................................................................... 46
3.1
Materialien ............................................................................................ 46
-3-
3.1.1
Antibiotika ............................................................................................. 46
3.1.2
3.1.3
3.1.4
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.5
3.5.1
Enzyme ................................................................................................ 46
Chemikalien .......................................................................................... 46
Kits ....................................................................................................... 46
Bakterielle Plasmide und Stämme ........................................................ 46
Oligonukleotide ..................................................................................... 50
Medien, Puffer und Lösungen............................................................... 55
Medien.................................................................................................. 55
Puffer und Lösungen ............................................................................ 57
Antibiotika ............................................................................................. 59
Aufzuchtbedingungen und Stammhaltung ............................................ 60
Escherichia coli..................................................................................... 60
3.5.2
3.6
3.6.1
3.6.2
3.6.3
Streptomyceten .................................................................................... 60
Molekulargenetische Methoden ............................................................ 60
Transformation von Escherichia coli ..................................................... 60
Plasmidisolierung aus Escherichia coli durch Bio-Feedback ................ 61
Plasmidisolierung aus Escherichia coli durch QIAprep......................... 61
3.6.4
3.6.5
3.6.6
3.6.7
3.6.8
3.6.9
3.6.10
3.6.11
3.6.12
3.6.13
3.6.14
3.6.15
Agarosegelelektrophorese .................................................................... 62
DNA-Extraktion aus Agarosegelen ....................................................... 62
Reinigung von PCR-Fragmenten.......................................................... 62
PCR (Polymerase Chain Reaction) ...................................................... 62
Restriktionsverdau von PCR-Fragmenten und Plasmiden ................... 63
Isopropanolfällung ................................................................................ 63
Behandlung mit alkalischer Phosphatase ............................................. 64
Behandlung mit Klenow-Polymerase .................................................... 64
Ligation ................................................................................................. 64
Herstellung von Streptomyceten Protoplasten ..................................... 65
Transformation von Streptomyceten..................................................... 65
Konjugation von E. coli und Streptomyces lividans .............................. 66
3.6.16
3.6.17
3.7
3.7.1
3.7.2
3.7.3
3.8
3.9
3.9.1
3.9.2
3.9.3
Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten (1)...................... 66
Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten (2)...................... 67
Proteinanalytik ...................................................................................... 68
Gen-Expression bei Vektoren mit Rhamnose-Promotor ....................... 68
Zellaufschluss ....................................................................................... 68
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese .................................................. 68
Komplementation.................................................................................. 69
Mutageneseassays mit S. lividans........................................................ 70
MNNG-Mutagenese.............................................................................. 70
EMS-Mutagenese ................................................................................. 71
Zeocin-Mutagenese .............................................................................. 71
-4-
3.9.4
UV-Licht-Mutagenese ........................................................................... 72
3.9.5
3.10
3.10.1
Mitomycin C-Mutagenese ..................................................................... 72
Statistische Methoden .......................................................................... 73
Berechnung des P-Wertes ................................................................... 73
3.10.2
Berechnung der alternativen Prüfgröße  ............................................. 73
4
Ergebnisse .......................................................................................... 75
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
Erstellung der Deletionsstämme in S. lividans TK64 ............................ 75
Methoden zur Inaktivierung chromosomaler Gene ............................... 75
Vorgehen bei der Deletion chromosomaler Gene ................................ 78
Vorstellung der einzelnen, deletierten Gene bzw.
Deletionsstämme .................................................................................. 83
Deletion von SSPG01861 - dut ......................................................... 84
Deletion von SSPG06524 - alkB ....................................................... 84
Deletion von SSPG02133 - mutM ..................................................... 85
Deletion von SSPG06453 - ung1 ...................................................... 86
Deletion von SSPG06217 - ung2 ...................................................... 86
Deletion von SSPG05758 - 3maDG .................................................. 87
Deletion von SSPG01289 - exoIII...................................................... 87
Deletion von SSPG05581 - uvrB ....................................................... 88
Deletion von SSPG05020 - recO....................................................... 88
Deletionsversuch von SSPG04042 - recR ........................................ 89
Deletion von SSPG06037, 06038, 06036 - ruvA, ruvB, ruvC ............ 89
Deletion von SSPG02139 - recG....................................................... 90
Deletion von SPG04791 - recD ......................................................... 90
Deletion von SSPG06266, 06265 - sbcCD ........................................ 91
Deletion von SSPG019151- recQ...................................................... 92
Deletion von SSPG05771 - recN ....................................................... 92
Deletion von SSPG02373, 02374 - ku+lig ......................................... 93
recF -Mutante aus Tübingen: SSPG03777 - recF ............................. 93
4.1.4
Übersicht über die erhaltenen Deletionsstämme ................................ 100
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.2.5
4.3
Assayentwicklung für die Mutageneseversuche ................................. 100
MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin) .................................... 101
EMS (Ethylmethansulfonat) ................................................................ 101
Zeocin................................................................................................. 101
UV-Licht .............................................................................................. 102
Mitomycin C ........................................................................................ 103
Charakterisierung der Deletionsstämme ............................................ 104
-5-
4.3.1
4.3.2
4.3.3
4.3.4
4.3.5
4.3.6
4.4
5.
Deletionsstämme der Prävention und Reversion der DNAReparatur ........................................................................................... 105
Deletionsstämme der Basenexzisionsreparatur ................................. 108
Deletionsstämme der Nukleotidexzisionsreparatur............................. 111
Deletionsstämme des nicht-homologen Verbindens von Enden ........ 114
Deletionsstämme der Rekombinationsreparatur ................................ 117
Zusammenfassung der Mutageneseversuche .................................... 125
Komplementation Rekombinations-defekter E. coli Stämme .............. 127
Diskussion und Ausblick ................................................................. 141
5.1
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
Mutanten mit Deletionen von Genen der Prävention und
Reversion bei der DNA-Reparatur ...................................................... 143
Mutanten mit Deletionen von Genen der
Basenexzisionsreparatur .................................................................... 146
Deletion eines Gens der Nukleotidexzisionsreparatur ........................ 149
Mutanten mit Deletionen von zwei vermuteten Genen des nichthomologen Verbindens von Enden..................................................... 150
Mutanten mit Deletionen von Genen der
Rekombinationsreparatur ................................................................... 151
Fehlende Enzyme der methylierungsabhängigen Reparatur .............. 159
Komplementationsversuche ............................................................... 160
Zusammenfassung der Diskussion und Ausblick ............................... 161
6
Literaturverzeichnis ......................................................................... 167
7
Anhang .............................................................................................. 182
7.1
Nicht selbstständig hergestellte Plasmide .......................................... 182
7.2
P-Wert und -Wert für die einzelnen Deletionsstämme bei der
7.3
7.5
Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin .................................................. 184
Abbildungsverzeichnis ........................................................................ 185
Tabellenverzeichnis ............................................................................ 188
-6-
ABKÜRZUNGEN UND EINHEITEN
°C
Amp
AmpR
AP-Stelle
ATP
BER
Bp
bzw.
cm
Grad Celsius
Ampicillin
Ampicillinresistenz
Stelle ohne gebundene Base in der DNA
(engl.: apurinic/apyrimidinic site)
Adenosintriphosphat
Basenexzisionsreparatur (engl.: base excision repair)
Basenpaar(e)
beziehungsweise
Zentimeter
Cm
CPD
DBS
dG
dGTP
DMSO
DNA
dNTP
E. coli
EMS
Chloramphenicol
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer
Doppelstrangbruch
Deoxyguanosin
Deoxyguanosintriphosphat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure (engl.: desoxyribonucleic acid)
Desoxynucleotidtriphosphat
Escherichia coli
Ethylmethansulfoxid
GC-Gehalt
h
kb
Km
KmR
LB
Mb
min
ml
µl
mM
NER
Prozentualer Gehalt an Gunanin und Cytidin in der DNA
Stunde
Kilobasenpaar(e)
Kanamycin
Kanamycinresistenz
Laura Bertani Medium
Megabasenpaar(e)
Minute(n)
Milliliter
Mikroliter
Millimolar (mmol/l)
Nukleotidexzisionsreparatur
(engl.: nucleotide excision repair)
Nanogramm
Nanometer
Optische Dichte
ng
nm
OD
7
ORF
ori
p.a.
PCR
R
upm
RR
RT
S.
S. coelicolor A3(2)
S. lividans
Offenes Leseraster eines möglichen Gens
(engl.: open reading frame)
origin of replication
pro analysis
Polymerase-Kettenreaktion
(engl.: polymerase chain reaction)
Resistenz
Umdrehungen pro Minute
Rekombinationsreparatur (engl.: recombinational repair)
Raumtemperatur
Seite
Streptomyces coelicolor A3(2)
Streptomyces lividans
s.o.
sec
srter
Thio
TIR
siehe oben
Sekunde(n)
Chromosomenenden des Stammes Streptomyces rochei
Thiostrepton
invers repetitive Sequenzen an den Chromosomenenden
(engl.: terminal inverted repeats)
Tris
TSS
ÜN
v/v
w/v
z.B.
z.T.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Transformation and storage solution
über Nacht
Volumen pro Volumen (engl.: volume/volume)
Gewicht pro Volumen (engl.: weight/volume)
zum Beispiel
zum Teil
Gene
amp
korA, korB
rep
spdA, spdB, kilB
tpgL
tra
tsr
tet
Ampicillinresistenz-Gen
Regulatoren (kill override)
Replikationsgene
"spread" Gene für die Ausbreitung eines Plasmids über die
Septen eines Mycels
Gen für das TpgL-Protein (terminales Protein)
Transfergene
Thiostreptonresistenz-Gen
Tetracyclinresistenz-Gen
8
Zusammenfassung
1
ZUSAMMENFASSUNG
1.1
Summary
Streptomycetes are famous for their extended secondary metabolism (e.g. antibiotica
production). Their life cycle is complex and includes sporulation. The genome is linear and with 8 Mb extraordinarily large. The high frequency of spontaneous deletions
is also very uncommon. The goal of this work was to improve the understanding of
DNA repair or recombination respectively and the chromosomal instability of Streptomycetes. Depending on the character of a certain DNA lesion the cells can use different kinds of DNA repair pathways. Some lesions can be removed or reversed directly (prevention and reversion). Many modifications on bases can be repaired by
the base excision repair. DNA deforming lesions call for the nucleotide excision repair. The recombinational repair steps in as soon as recombination with the homologous sister chromosome is needed because of double strand breaks, double stranded ends or daughter strand gaps.
Mutants with one or more genes deleted in a certain DNA repair pathway were created in S. lividans. All in all seventeen deletion mutants could be isolated. Their chromosomal instability was investigated. Furthermore the survival capability of those
mutants was determined after treatment with four different mutagens in comparison
to that of the original strain S. lividans TK64. The mutagens were selected, so that all
DNA repair pathways were adressed at least once.
The genes for the dUTPase and AlkB serve in the prevention and reversion of DNA
lesions. Their deletion had no effect on the chromosomal stability of the mutants. The
survival capability of the mutants also didn´t differ significantly after treatment with the
different mutagens. The activity of dUTPase, which hydrolyses dUTP to dUMP, has
no meaning for the conditions used in this work. The demethylating enzyme AlkB also seems to play no important role in reversion or can perhaps be compensated by
other redundant systems in the cell (Ada). Unexpectedly mutagens which need the
nucleotide excision repair reduced the survival rate of alkB mutants.
There are many, often functionally redundant DNA glycosylases in base excision repair in the cell. The genes for four DNA glycosylases and exonuclease III (late phase
of base excision repair) were deleted. The loss of a single DNA glycosylase could be
compensated in most cases, while the survival rate of the exo III mutants was reduced more severely in case of methylations. Unanticipated the survival rate of three
mutants was significantly changed when treated with mutagens which require the
nucleotide excision repair. The results hint at an unsuspected strong interaction of
the repair pathways.
Nucleotide excision repair plays a very important role in cells. After the deletion of
uvrB, an essential gene of this repair pathway, chromosomal instability was signifi9
Zusammenfassung
cantly increased. Furthermore the survival capability of the cells was reduced severely after treatment with mutagens which call for the nucleotide excision repair.
For the first steps in recombinational repair or homologous recombination, respectively Streptomycetes only have the genes of the RecFOR pathway available. The
genes recB and recC of the RecBCD pathway which plays the central role in E. coli
are missing in Streptomycetes. Also there is no alternative system AddAB like in
B. subtilis. The results proved that the RecFOR pathway is essential for chromosomal stability and recombinational repair. A third of the spores of the recF or recO mutants were genetically changed already and the survival capability of the cells was
reduced dramatically throughout all mutagenesis experiments. In contrast RecD is
not important in one of the repair pathways without RecB and RecC since a deletion
of recD has no significant effect.
The enzymes RecG and RuvABC are of upmost significance for the postsynaptical
phase of recombinational repair. The results hint at a task sharing between those two
systems. For the sole resolution of Holliday junctions RuvABC is required. RecG is
involved as soon as migration of the Holliday junction or regression of the replication
fork is needed.
The helicase RecQ seems to be participating in different DNA repair pathways. The
chromosomal instability of the recQ mutants was slightly increased. Together with the
5´3´-exonuclease RecJ RecQ can provide 3´ single-stranded DNA overhangs for
homologous recombination. In Streptomycetes recJ is missing. An alternative 5´3´exonuclease could not yet be assigned.
Furthermore the investigations demonstrated that RecN is involved in maintenance of
chromosomal stability and recombinational repair even if only of minor importance.
Genes of the non-homologous end joining could be identified in S. lividans TK64 by
sequence comparison. But the deletion of the gene orthologous to ku and the ligase
encoded adjoining to it didn´t show any effect.
Deletion of sbcCD improved survival capability against some mutagens but also increased chromosomal instability. Maybe the 3´5´-exonuclease activity of SbcCD in
the original strain worsens the creation of 3´ single-stranded DNA overhangs for homologous recombination.
Concerning their configuration of genes, regarding the DNA repair pathways, as well
as their reactions towards mutagens, Streptomycetes have many similarities but also
some differences with the up to now therein very intensely researched bacteria
E. coli, D. radiodurans, B. subtilis or M. tuberkulosis. In particular, it remains to be
resolved which enzymes are responsible for the first steps of recombinational repair
or the general homologous recombination respectively (production of 3´ singlestranded DNA overhangs).
10
Zusammenfassung
1.2
Kurzfassung
Die Streptomyceten sind vor allem wegen ihres ausgeprägten Sekundärstoffwechsels bekannt (z.B. Antibiotikaproduktion). Ihr Lebenszyklus ist komplex und beinhaltet
ein Sporenstadium. Das lineare Genom ist mit über 8 Mb außergewöhnlich groß.
Ebenso ungewöhnlich ist die hohe Frequenz von spontanen Deletionen. Ziel dieser
Arbeit war es ein besseres Verständnis für die DNA-Reparatur bzw. Rekombination
und chromosomale Stabilität in Streptomyceten zu erhalten. Abhängig von der Art
eines bestimmten DNA-Schadens stehen der Zelle verschiedene DNAReparaturwege zur Verfügung. Manche Schäden können verhindert oder direkt behoben werden (Prävention und Reversion). Viele Basenmodifikationen können mittels der Basenexzisionsreparatur behoben werden. Schäden, welche die DNA verformen, sprechen die Nukleotidexzisionsreparatur an. Sobald DNA-Brüche, doppelsträngige Enden oder Tochterstranglücken eine Rekombination mit dem homologen
Schwesterchromosom erfordern, wird die Rekombinationsreparatur benötigt.
Von S. lividans wurden Mutanten erstellt, bei denen jeweils ein oder mehrere Gene
eines bestimmten DNA-Reparaturweges deletiert wurden. Insgesamt wurden siebzehn verschiedene Deletionsmutanten isoliert. Diese wurden auf die chromosomale
Stabilität hin untersucht. Desweiteren wurde die Überlebensfähigkeit dieser Mutanten
nach der Mutagenese mit vier verschiedenen Mutagenen untersucht, jeweils im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64. Die Mutagene wurden so ausgesucht,
dass jeder DNA-Reparaturweg einmal angesprochen wurde.
Die Gene für die dUTPase und AlkB dienen der Prävention und Reversion von DNASchäden. Ihre Deletion hatte keinen Einfluss auf die chromosomale Stabilität der Mutanten. Auch die Überlebensfähigkeit der Mutanten war durch die Behandlung mit
den verschiedenen Mutagenen meist nicht signifikant verändert. Die Aktivität der
dUTPase, welche dUTP zu dUMP hydrolysiert, hat für die in dieser Arbeit verwendeten Bedingungen offensichtlich keine Bedeutung. Auch das demethylierende Enzym
AlkB, scheint bei der Reversion von DNA-Schäden keine wichtige Rolle zu spielen
bzw. kann eventuell durch redundante Systeme in der Zelle kompensiert werden
(z.B. Ada). Merkwürdigerweise hatten jedoch Mutagene, die vor allem die Nukleotidexzisionsreparatur ansprechen, die Überlebensrate der alkB Mutanten reduziert.
Für die Basenexzisionsreparatur gibt es in der Zelle viele, oft redundante DNAGlykosylasen. Es wurden die Gene von vier DNA-Glykosylasen und das der Exonuklease III (späte Phase der Basenexzisionsreparatur) deletiert. Der Ausfall einer einzelnen DNA-Glykosylase konnte meist kompensiert werden, während die Überlebensrate der exo III Mutanten bei Methylierungsschäden etwas stärker reduziert war.
Unerwartet war dagegen die signifikant veränderten Überlebensraten von drei Mutanten bei Mutagenen, welche nach der Theorie die Nukleotidexzisionsreparatur benöti11
Zusammenfassung
gen. Die Ergebnisse deuten auf eine unvermutet starke Vernetzung der Reparaturwege hin.
Die Nukleotidexzisionsreparatur spielt in der Zelle eine sehr wichtige Rolle. Nach der
Deletion von uvrB, einem essentiellen Gen dieses Reparaturweges, war die chromosomale Instabilität signifikant erhöht. Die Überlebensfähigkeit der Zellen war zudem
nach der Behandlung mit Mutagenen, welche die Nukleotidexzisionsreparatur erfordern, stark reduziert.
Streptomyceten stehen für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der
homologen Rekombination nur die Gene des RecFOR-Weges zur Verfügung. Es fehlen die Gene recB und recC für den RecBCD-Weg, der in E. coli die zentrale Rolle
spielt, oder das alternative System AddAB, wie es in B. subtilis vorkommt. Die Ergebnisse zeigten, dass der RecFOR-Weg essentiell für die chromosomale Stabilität
und die Rekombinationsreparatur ist. Schon ein Drittel der gebildeten Sporen der
recF bzw. recO Mutanten war genetisch verändert, und die Überlebensfähigkeit der
Zellen war bei allen Mutagenese-Versuchen drastisch reduziert. RecD spielt dagegen
ohne RecB und RecC keine wichtige Rolle in einem der DNA-Reparaturwege, da
sich eine Deletion von recD nicht signifikant auswirkte.
Die Enzyme RecG und RuvABC sind in der postsynaptischen Phase der Rekombinationsreparatur von zentraler Bedeutung. Die Ergebnisse deuten auf eine Aufgabenteilung zwischen diesen beiden Systemen hin. Die alleinige Auflösung von DNAÜberkreuzungsstrukturen erfordert RuvABC. Wird dagegen eine Verschiebung der
Überkreuzungsstruktur benötigt, oder findet eine Regression der Replikationsgabel
statt, so ist RecG beteiligt.
Die Helikase RecQ dürfte an mehreren DNA-Reparaturwegen beteiligt sein. Die
chromosomale Instabilität war bei den recQ Mutanten leicht erhöht. RecQ kann zusammen mit der 5´3´-Exonuklease RecJ 3´-DNA-Überhängen für die homologe
Rekombination bereitstellen. In Streptomyceten fehlt recJ. Eine alternative 5´3´Exonuklease konnte noch nicht zugeordnet werden.
Die Untersuchungen zeigten ferner, dass RecN bei der Aufrechterhaltung der chromosomalen Integrität und bei der Rekombinationsreparatur beteiligt ist, wenn auch
von untergeordneter Bedeutung.
Gene für das nicht-homologe Verbinden von Enden konnte in S. lividans TK64 durch
Sequenzvergleiche nachgewiesen werden. Die Deletion von einem zu ku orthologen
Gen und der benachbart kodierten Ligase zeigte jedoch keine Auswirkungen.
Die Deletion von sbcCD verbesserte die Überlebensfähigkeit gegenüber manchen
Mutagenen, erhöhte jedoch die chromosomale Instabilität. Eventuell verschlechtert
die 3´5´-Exonukleaseaktivität von SbcCD im Ausgangsstamm die Bereitstellung
von 3´-DNA-Überhängen für die homologe Rekombination.
12
Zusammenfassung
Streptomyceten zeigen in ihrer Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und
der Reaktion auf Mutagene viele Gemeinsamkeiten aber auch einige Unterschiede
mit den bisher darin sehr intensiv untersuchten Bakterien wie E. coli, D. radiodurans,
B. subtilis oder M. tuberculosis. Insbesondere bleibt noch zu klären, welche Enzyme
für die ersten Schritte der Rekombinationsreparatur bzw. der allgemeinen homologen
Rekombination verantwortlich sind (Herstellung der 3´-DNA-Überhänge).
13
Einleitung
2
EINLEITUNG
2.1
Streptomyceten
Die Streptomyceten sind eine intensiv untersuchte Gattung der Gram-positiven, Mycel bildenden Actinomyceten, die sich durch einen hohen GC-Gehalt im Genom auszeichnen. Ihr charakteristisches, hyphenartiges Wachstum gab ihnen den Namen
„Strahlenpilz“ (Hopwood 1999). Streptomyceten sind typische Bodenbakterien, die in
der Natur ubiquitär vorkommen. Zu ihrer Gattung gehören über 500 Arten.
Actinomyceten haben einen ausgeprägten Sekundärstoffwechsel. Sie produzieren
über die Hälfte der bekannten Antibiotika (ca. 8700, 70-80 % davon nur durch Streptomyceten). Das chemische Spektrum der Antibiotika ist dabei sehr divers und beinhaltet unter anderem Strukturen aus der Klasse der β-Lactame, Polyketide, Aminoglycoside, Peptide und Glycopeptide. Außerdem bilden Actinomyceten noch eine
Vielzahl anderer biologisch aktiver Komponenten (Herbizide, Insektizide, antitumorale Substanzen etc.). Sie haben auch eine große Bedeutung in der Biodegradation
von Polymeren. Sie synthetisieren diverse extrazelluläre Enzyme, die ihnen das Recycling einer Vielfalt von Substraten erlaubt (Bérdy 2005, Kieser et al. 2000), Durch
das von Ihnen gebildete bicyclische Terpen Geosmin erhält Walderde ihren charakteristischen Geruch, vor allem bei einsetzendem Regen.
Die Kolonialisierung des Bodens wird den Streptomyceten durch ihr vegetatives, hyphenartiges Wachstum erleichtert. Allerdings ist das nur ein Stadium im komplexen
Lebenszyklus der Streptomyceten. Dieser ist am Beispiel von Streptomyces coelicolor A3(2) in Abbildung 1 dargestellt. Unter guten Bedingungen wächst auf diesem
Substratmycel nach zwei bis drei Tagen ein oft charakteristisch geformtes und gefärbtes Luftmycel heran. Das obere Ende des Luftmycels spiralisiert und wird durch
Septen in Kompartimente getrennt, die sich zu Sporen weiterentwickeln. Diese
Sporen dienen sowohl der Verbreitung als auch dem Überdauern der Bakterien. Sie
sind resistent gegenüber Wasser- und Nährstoffmangel und können als semidormante Form über Jahrzehnte im Boden existieren. Wenn die Sporen auf nährstoffreichen Medien mit einem sogenannten Keimschlauch auskeimen, bildet sich
daraus wieder das aus multichromosomalen Hyphen bestehende Substratmycel
(Mayfield et al. 1972, Ensign 1978). Dieser Lebenszyklus bringt bei genetischen Manipulationen die Notwendigkeit mit sich, über das Stadium der unichromosomalen
Spore zu gehen. Erst wenn eine Kolonie, die aus einer einzelnen Spore hervorgegangen ist, ein gewünschtes verändertes Merkmal aufweist, hat man eine „reinrassige“ Mutante.
14
Einleitung
Abbildung 1: Lebenszyklus von Streptomyces coelicolor A3(2) (aus Kieser et
al. 2000)
Eine ruhende Spore (im Bild oben) bildet einen oder mehrere Keimschläuche aus, die
sich durch apikales Wachstum verlängern und seitlich verzweigen. Das entstehende
Substratmycel ist durch Septen unterteilt und enthält je Kompartiment zirka ein Dutzend Chromosomen. Nach zwei bis drei Tagen bilden sich senkrechte Verzweigungen, die das Luftmycel formen. Der obere Bereich wird durch Sporulationssepten in
Kompartimente unterteilt, die sich zu Sporen ausformen (bld, whi und sig sind Gene
der Differenzierung).
2.1.1 Das Genom von Streptomyceten und seine Stabilität
Der vielfältige Sekundärstoffwechsel und komplexe Lebenszyklus der Streptomyceten spiegelt sich in dem für Bakterien ungewöhnlich großen Genom wieder. Das
Chromosom von Streptomyces coelicolor A3(2) wie auch das anderer Streptomyceten hat eine Größe von 8-9 Mb (Bentley et al. 2002). Eine weitere Besonderheit ist,
dass es sich um ein lineares Chromosom handelt (Lin et al. 1993, Chen 2002), obwohl aufgrund von genetischen Kartierungen lange Zeit ein zirkuläres Genom postuliert wurde (siehe Abbildung 2) (Hopwood 1965, Kieser et al. 1992, Hopwood 2006).
Diese scheinbare Zirkularität lässt sich jedoch durch kovalent gebundene terminale
Proteine und der Tendenz zu einer geraden Anzahl von Crossovern bei linearer DNA
erklären (Wang et al. 1999). Die Chromosomenenden bestehen aus langen terminalen, umgekehrt repetitiven Sequenzen (TIRs, engl.: terminal inverted repeats) (Huang
et. al. 1998), je nach Art zwischen 1 und 550 kb lang. An die 5`-Enden des Chromo15
Einleitung
soms sind kovalent Proteine gebunden (tpgL: Gen für terminales Protein). Diese dienen als Primer für die Synthese des letzten Okazaki-Fragments bei der Replikation.
Die Replikation des Chromosoms erfolgt bidirektional von einem zentralen Replikationsursprung oriC aus.
Abbildung 2: Kombinierte genetische und physikalische Karte des Chromosoms von S. coelicolor A3(2) M145 (Hopwood 1999)
Der Replikationsursprung (: oriC) befindet sich im Zentrum des linearen Chromosoms (:Chromosomenenden). Die Darstellung des Genoms in Kreisform erinnert
daran, dass lange Zeit ein zirkuläres Chromosom angenommen wurde.
Das Chromosom wird in eine 4,9 Mb lange Zentrumsregion und zwei seitliche „Arme“
unterteilt (1,5 Mb links und 2,3 Mb rechts). Diese Zentrumsregion weist eine hohe
Ähnlichkeit mit dem insgesamt 4,4 Mb großen, zirkulären Genom von Mycobacterium
tuberculosis auf. Das könnte darauf hindeuten, dass das Chromosom der Streptomyceten evolutionär aus einem zirka 4 Mb großen zirkulären Genom entstand, welches
16
Einleitung
über horizontalen Transfer seinen Gensatz schrittweise erweiterte, um letztendlich
die ausgedehnten Armregionen zu formen (Bentley et al. 2002). Korrespondierend
damit sind die fast 8000 ORFs auf dem Genom zwar einheitlich verteilt, jedoch befinden sich die essentiellen Gene für den zentralen Zellstoffwechsel, die DNA Replikation, Transkription und Translation nur auf der zentrumsnahen Region. Die Gene auf
den Chromosomenarmen gehören zum sogenannten „Sekundärstoffwechsel“. Dieser
bietet den Streptomyceten die Möglichkeit auf eine Vielzahl externer Faktoren wie
seltene Nahrungsquellen, Fressfeinde etc. zu reagieren (Bentley et al. 2002).
Die Streptomyceten können spontan große chromosomale Deletionen entwickeln, die
an den Enden auftreten. Diese Deletionen können beide Enden betreffen und zu zirkulären Chromosomen führen, die noch die Fähigkeit zur Replikation besitzen (Lin et
al. 1993, Volff und Altenbuchner 1998, Redenbach und Altenbuchner 2002). Im
Stamm S. lividans TK64 gibt es zum Beispiel eine Chloramphenicolresistenz, die sich
terminal am rechten Chromosomenarm befindet. Dieser Marker ist in etwa 0,5 % der
Sporen deletiert und führt zu Chloramphenicol-sensitiven Mutanten. Diese zeigen
zum Teil weitere Instabilitäten und deletieren das zentraler gelegene argG (Gen des
Arginin-Stoffwechsels).
2.2
Mutationen
Die DNA kann spontan geschädigt werden, z. B. durch Fehler bei der Replikation, bei
Reaktionen mit Intermediaten des normalen Zellstoffwechsels (Rydberg und Lindahl
1982) oder durch spontane Hydrolyse (Lindahl und Nyberg 1972). Zusätzlich entstehen induzierte Schäden durch die Reaktion mit externen Agenzien oder energetischer Strahlung. Diese verschiedenen Einflüsse können zu Strangbrüchen des Zuckerphosphatrückgrats, zur Spaltung der N-glykosidischen Bindung, zur kovalenten
Verbindungen der DNA-Stränge oder zu Basenveränderungen führen. Gelingt es den
DNA-Reparaturmechanismen der Zelle nicht, diese Schäden zu beheben, entstehen
bleibende Mutationen. Gegebenenfalls führen diese zum Zelltod.
2.2.1 Arten von Mutationen
Die Schädigung der DNA kann sich in Form verschiedener Mutationen im Chromosom etablieren.
Bei einer Punktmutation kommt es zur Veränderung einer einzelnen Base. Hierbei
unterscheidet man zwischen der Transition und der Transversion. Bei der Transition
bleibt der Charakter der Base erhalten, da zum Beispiel ein Purin gegen ein anderes
Purin ausgetauscht wird. Bei der Transversion wird ein Purin gegen ein Pyrimidin
ausgetauscht bzw. umgekehrt. Befinden sich diese Basenveränderungen innerhalb
des Leserahmens eines Gens, kann sich dadurch die Aminosäuresequenz des co17
Einleitung
dierten Proteins verändern. Bei einer „Stillen Mutation“ bleibt die Aminosäuresequenz
unverändert, da das veränderte Codon für die gleiche Aminosäure codiert (Degeneration des genetischen Codes). Eine „Missense Mutation“ führt zum Aminosäureaustausch im Protein und eine „Nonsense Mutation“ zu einem Abbruch der Translation, da durch den Basenaustausch ein Stopcodon entstanden ist. Durch die Insertion
oder Deletion einer einzelnen Base kommt es zur Verschiebung des Leserahmens
(engl.: frameshift) (Streisinger et al. 1966).
Es können auch ganze Chromosomenabschnitte von Mutationen betroffen sein. Geht
ein solcher verloren, spricht man von einer Deletion, während bei einer Inversion ein
Bereich der DNA invertiert (umgedreht) wird.
2.2.2 Spontane Ursachen für DNA-Schäden
Im Folgenden werden einige Möglichkeiten genannt, wie es zur spontanen Schädigung von DNA kommen kann.
Es gibt seltene Basenformen, die zum Beispiel durch die Keto-Enol-Tautomerie oder
die Bildung von Iminoformen auftreten (Singer und Kusmierek 1982). Die Enolform
von Thymin paart sich mit Guanin, so dass es zu einer Transition kommt (Enol-TG
 CG). Die Enolform von Guanin paart mit Thymin, und auch hier kommt es zu einer Transition (Enol-G=T  A=T). Die Iminoformen von Cytosin bzw. Adenin paaren
mit Adenin bzw. Cytosin, so dass auch hier Transitionen (Imino-C=A  T=A; IminoAC  GC) erfolgen, wenn diese falschen Paarungen nicht rechtzeitig repariert
werden. Selten kommt es auch zum Einbau von Uracil anstelle von Cytosin oder Cytosin wird zu Uracil desaminiert (Transition: G=U  A=T). Desweiteren führt die
Desaminierung von Adenin zu Hypoxanthin und die von 5-methyl-Cytosin zu Thymin
(Lindahl 1979, 1993). Die Oxidation von Guanin, zum Beispiel durch *OH oder ionisierende Strahlung ergibt 8-oxo-Guanin (Cadet et al. 1999), welches mit Adenin paart
(ohne Reparatur Transversion: 8-oxo-G=A  T=A).
Wenn eine Base oft hintereinander vorkommt, kann die DNA, wenn sie bei der Replikation aufgeschmolzen wird, bei der Zweitstrangsynthese versetzt paaren. Im neuen
Strang ist dann eine Base zu viel oder zu wenig vorhanden (Slippage Replikation).
DNA-Bereiche, die von kurzen oder langen gleichgerichteten repetitiven Sequenzen
flankiert werden, können über Deletion verloren gehen. Ein DNA-Bereich, der von
umgekehrt repetitiven Sequenzen flankiert wird, kann invertiert werden. Desweiteren
kann es zu Deletionen kommen, wenn die Replikationsgabel auf einen Einzelstrangbruch trifft und abbricht. Durch eine intermolekulare Transposition durch Transposons und IS-Elemente kann es ebenfalls zu Deletionen und Inversionen kommen.
Damit diese DNA-Läsionen nicht zu bleibenden Mutationen führen, gibt es in der Zelle verschiedene DNA-Reparatursysteme, die meist sehr spezifisch bestimmte DNASchäden erkennen und beheben (siehe 2.3 DNA-Reparatursysteme). Stämme, wel18
Einleitung
che einen Defekt in einem dieser Reparatursysteme haben, zeichnen sich oft durch
eine stark erhöhte Mutationsrate aus. Sie werden daher auch Mutatorstämme genannt. Allerdings gibt es in der Zelle kein Reparatursystem für Deletionen oder Inversionen.
2.2.3 Induzierte DNA-Schäden
Die DNA ist nicht nur spontan auftretenden Schäden unterworfen, sondern kann
auch durch mutagene Agenzien oder Strahlung geschädigt werden.
Durch den Einbau von Basenanalogen (z.B. 2-Aminopurin, 5-Bromuracil) kann eine
Falschpaarung herbeigeführt werden, die zu Punktmutationen führt.
Alkylierende Substanzen (z.B. N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin (MNNG), EthylMethan-Sulfonat (EMS)) führen zur Übertragung einer Methyl- oder Ethylgruppe auf
verschiedene Positionen im Purin-/Pyrimidinring oder auch des Zuckerphosphatrückgrats (Singer und Kusmierek 1982). Als Folge kommt es oft zur Falschpaarung der
alkylierten Basen (z.B. O6-Methylguanin paart mit Thymin). Die Hydroxylierung von
Cytosin zu Hydroxycytosin (z.B. durch NH2OH, fast nur in vitro wirksam) führt zur
Verpaarung mit Adenin.
Chemische Agenzien, die zu einer Quervernetzung von DNA-Strängen führen, sind
für eine Zelle besonders toxisch, da die Replikationsgabel hier blockiert wird. Mitomycin C vernetzt zum Beispiel Guanin-Reste (Borowy-Borowski et al. 1990, Iyer und
Szybalski 1963) und Psoralen führt zu Pyrimidin-Crosslinks (Cole 1970) – beides
sind sehr starke Mutagene.
DNA-Strangbrüche führen zum Abbruch/Anhalten der Replikation und gegebenenfalls zur Deletion oder Duplikation, wenn die Replikationsgabel an der falschen Stelle
wieder etabliert wird. Bleomycin (aus der Krebstherapie) oder Zeocin (BleomycinDerivat, Antibiotikum) können Doppelstrangbrüche hervorrufen (Bérdy 1980). Sie
sind daher sehr toxisch bzw. mutagen.
Jede Art von ionisierender Strahlung kann die DNA auf vielfältige Weise schädigen
(Goodhead 1989, Hutchinson 1985, Téoule 1987). Dazu gehört elektromagnetische
Strahlung unterhalb einer Wellenlänge von zirka 200 nm (siehe Abbildung 3) und
Teilchenstrahlung (α- oder β-Strahlung). Teilchenstrahlung kann beim radioaktiven
Zerfall entstehen. Ionisierende Strahlung kann direkt zu Einzel- oder Doppelstrangbrüchen führen oder Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere bilden. Dies geschieht schon und
bevorzugt bei einer Wellenlänge von 260 nm (Absorptionsmaximum der DNA) (Mitchell et al. 1991). Sie kann aber auch in der Zelle zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (z.B. Hyperoxidanion: O2·− oder Hyperoxylradikal: OH·) führen, welche
dann die DNA schädigen können.
19
Einleitung
Abbildung 3: Elektromagnetisches Spektrum
Die Graphik zeigt das Spektrum der elektromagnetischen Strahlung von >1 km bis
<0,001 nm. Licht mit einer Wellenlänge unter 200 nm (UV-Licht und noch energiereichere Strahlung) wirkt ionisierend. Bildquelle: http://electromagnetic-waves.com/default.aspx
2.2.4 Mutagene
Einige der bereits genannten Mutagene werden im Folgenden genauer aufgeführt,
da sie in dieser Arbeit eine wichtige Rolle spielen.
MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin) wird schon seit langem als DNAschädigendes Agens in der Erforschung der DNA-Reparaturwege eingesetzt. Die
chemische Struktur ist in Abbildung 4 zu sehen. Es wird als krebserregend und
teratogen eingestuft (Druckrey et al. 1967, Kogura et al. 1974, Habs et al. 1978,
IARC 1987), und sollte daher zum persönlichen Schutz nur bei guter Belüftung und
mit Handschuhen gehandhabt werden.
CH3
Abbildung 4: Struktur von MNNG
Die Abbildung zeigt die Struktur von MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin,
CAS-Nummer: 70-25-7, Molekularformel: C2H5N5O3, Molekulargewicht: 147,1 g/mol).
Das Mutagen ist in fester Form gelblich kristallin.
MNNG ist hochentflammbar, reagiert stark mit Wasser und ist vor allem stark toxisch,
da es Methylgruppen an verschiedene nukleophile Stellen der DNA-Basen addiert.
Dabei entsteht bevorzugt N7-Methylguanin, Methylphosphotriester, O6-Methylguanin
20
Einleitung
und N3-Methyladenin in einer SN1-spezifischen Alkylierung (Singer 1975, Van Houten
und Sancar 1987). SN1 steht für eine nukleophile Substitution erster Ordnung. Wird
von einer chiralen Verbindung im ersten Schritt ein Anion freigesetzt, entsteht als
Intermediat ein planares Carbokation. Der nachfolgende Angriff eines Nukleophils
kann von beiden Seiten erfolgen, so dass Produkte beider Konfigurationen entstehen. Eine nukleophile Substitution zweiter Ordnung (SN2) wird dagegen zum Beispiel
von dem ebenfalls alkylierenden Agens EMS (Ethyl-Methan-Sulfonat) durchgeführt.
Dabei kommt es erst durch den Angriff eines Nukleophils auf einer Seite des Moleküls zur Abspaltung der Abgangsgruppe auf der anderen Seite (Hart 1989). Bei chiralen Molekülen kommt es daher zu einer Inversion der Konfiguration. Wenn EMS
auf die DNA einwirkt ist das primäre Produkt O6-Ethylguanin.
Mitomycin C wurde 1958 aus Streptomyces caespitosus isoliert und hat antibiotische Wirkung auf Gram-positive Bakterien. Die chemische Struktur ist in Abbildung 5
dargestellt. Nach einer enzymatischen Aktivierung (Reduktion) reagiert Mitomycin C
mit dG (Deoxyguanosin) in der DNA und bindet kovalent. An nebeneinander- oder
gegenüberliegenden Guaninbasen können nachfolgend intra- oder interstranguläre
Crosslinks entstehen. Vor allem letztere können die Replikation effektiv blockieren
(Borowy-Borowski et al. 1990, Weng et al. 2010, Bizanek et al. 1992).
Abbildung 5: Struktur von Mitomycin C
Mitomycin C ist ein zytotoxisches Antibiotikum blauer Farbe, das sich gut in Wasser
löst (CAS-Nummer: 50-07-7, Molekularformel: C15H18N4O5, Molekulargewicht: 334,3
g/mol).
Zeocin gehört zur Bleomycin/Phleomycin-Familie der Antibiotika und kann aus Streptomyces verticullus isoliert werden (Struktur siehe Abbildung 6) (Bérdy 1980). Es ist
toxisch gegenüber Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren.
Die zytotoxische Wirkung von Zeocin beruht auf der Fähigkeit, DNA zu fragmentieren. Der Wirkmechanismus ist vermutlich ähnlich zu dem der strukturell verwandten
Gruppe der Bleomycin/Phleomycin Antibiotika (Bérdy 1980). In der Zelle wird das
Kupferion reduziert, wodurch das Zeocin aktiviert wird. Der aktivierte Komplex bindet
21
Einleitung
an die DNA und entfernt ein H-Atom von der Zuckereinheit. Das resultierende
C4-Radikal wird oxidiert, wodurch es nachfolgend zur Spaltung der DNA kommt
(Hecht 2000). Da Zeocin lichtsensitiv ist, sollte die wässrige Lösung und hergestellte
Medien dunkel gelagert werden.
Abbildung 6: Struktur von Zeocin
Zeocin, ein Derivat von Phleomycin D1, gut wasserlöslich und durch das gebundene
Cu++ blau gefärbt (Molekularformel: C55H83N19O21S2Cu, Molekulargewicht: 1137,4
g/mol). Bildquelle: https://commerce.invitrogen.com und http://www.genaxxon.de
UV-Licht wird auch als Mutagen eingesetzt. Das ultraviolette Spektrum umfasst Wellenlängen von 1 nm bis 380 nm und ist für das menschliche Auge nicht mehr sichtbar. UV-Licht wirkt ionisierend (siehe auch Absatz 2.2.3 und Abbildung 3). Es löst
primär - durch die kovalente Verknüpfung nebeneinanderliegender Thymine und Cytosine - die Bildung von Pyrimidin-Dimeren in der DNA aus. Indirekt schädigt es die
DNA zudem über reaktive Sauerstoffspezies, die durch die energiereiche Bestrahlung in der Zelle entstehen.
2.3
DNA-Reparatursysteme
Die fehlerfreie Reparatur von DNA-Schäden ist essentiell für den Erhalt der genomischen Integrität. In dieser Arbeit geht es um die Reparatursysteme von Streptomyceten, jedoch ist die DNA-Reparatur und Mutagenese in E. coli am besten untersucht
und verstanden. Das liegt zum einen daran, dass E. coli im Gegensatz zu Streptomyceten einen haploiden Chromosomensatz hat und sich daher eine einzelne Mutation direkt phänotypisch auswirkt, während man bei Streptomyceten den Schritt über
22
Einleitung
die mononukleären Sporen gehen muss, bevor sich die Auswirkung einer Mutation
zeigt. Zum Anderen ist E. coli durch Transformation, Transduktion und Konjugation
genetisch viel besser zugänglich, seit langem vollständig sequenziert und alle molekularbiologischen Techniken sind gut etabliert. Die Zellen wachsen viel schneller als
Streptomyceten, was die Untersuchungszeiträume deutlich verkürzt. Daher basieren
die in den folgenden Abschnitten vorgestellten Reparatursysteme größtenteils auf
den Erkenntnissen über E. coli. Es wird jedoch jeweils darauf hingewiesen, wenn
orthologe Reparaturgene in S. lividans bzw. dem Referenzorganismus S. coelicolor
A3(2), welcher zu Beginn der Arbeit bereits sequenziert war, nicht gefunden wurden
und daher bestimmte Reparaturwege ausfallen, oder die entsprechenden Gene bzw.
Alternativsysteme noch unbekannt sind.
Es gibt für die Zelle verschiedene Strategien, DNA-Schäden zu beheben. Der wohl
einfachste Mechanismus ist die direkte Umkehr eines Schadens, ohne das Zuckerphosphatrückgrat der DNA zu brechen. Beispiele für diesen Mechanismus und auch
die Prävention von Schäden durch die Vermeidung des Einbaus falscher Basen werden in Abschnitt 2.3.1 aufgeführt. Kann eine geschädigte Base nicht repariert werden, sondern muss aus der DNA entfernt werden, so geschieht dies über die sogenannte Basenexzisionsreparatur (BER; engl.: Base Excision Repair) (siehe Abschnitt
2.3.2). Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER; engl.: Nucleotide Excision Repair) ist
spezialisiert auf Läsionen, welche die DNA verformen, wie zum Beispiel CyclobutanPyrimidin-Dimere (siehe Abschnitt 2.3.3).
Für den Fall, dass beide DNA-Stränge gleichzeitig betroffen sind oder eine Replikationsgabel an einer DNA-Läsion, einem Strangbruch oder einer anderen Barriere aufgehalten wird, kommen bei der Reparatur Enzyme der homologen Rekombination ins
Spiel, da ein Strangaustausch erforderlich wird. Dieser Reparaturweg wird daher
auch Rekombinationsreparatur (RR, engl.: Recombinational Repair) genannt (siehe
Abschnitt 2.3.4). Ein alternativer Weg zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen ist das
nicht-homologe Verbinden von Enden (NHEJ, engl.: non-homologous end-joining)
(siehe dazu Abschnitt 2.3.5).
In E. coli gibt es zudem noch die methylierungsabhängige Reparatur (MMR, engl.:
methyl directed mismatch repair), welche kurz in Abschnitt 2.3.6 erläutert wird.
2.3.1 Prävention und Reversion
Gelingt es der Zelle, einen DNA-Schaden schon im Vorhinein zu vermeiden oder sofort umzukehren, werden aufwendigere und energieintensivere Reparaturmechanismen vermieden. Es ist daher evolutionär von Vorteil, solche Systeme zu entwickeln.
Im Folgenden werden Beispiele für die Prävention und Reversion von DNA-Schäden
vorgestellt.
23
Einleitung
Prävention
Die chromosomale Stabilität wird, wie im Abschnitt 2.2.2 und 2.2.3 erwähnt, nicht nur
durch Mutationen beeinträchtigt, sondern auch direkt durch die Gefahr der chromosomalen Fragmentierung an DNA-Doppelstrangbrüchen. Diese Fragmentierung kann
auch spontan auftreten, wenn Uracil in der DNA auftaucht (Kouzminova und Kuzminov 2008). Sehr selten geschieht dies durch die Desaminierung von Cytosin, meist
jedoch durch den Einbau von dUTP statt dTTP bei der Replikation. Uracil wird mithilfe von Uracil-DNA-Glykosylasen aus der DNA entfernt (UDG, codiert durch ung-Gen,
siehe hierzu Abschnitt 2.3.2) (Lindahl 1974), wobei zwischenzeitlich ein Strangbruch
entsteht. Je mehr Uracil in die DNA eingebaut wird, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Uracile nahe beieinander liegen und es bei der gleichzeitigen Reparatur zu einem leicht versetzten Doppelstrangbruch in der DNA kommt. Dieser
muss schnellstmöglich mittels der Rekombinationsreparatur behoben werden, oder
es kommt zu einer spontanen Fragmentierung des Genoms. Neben Uracil-DNAGlykosylasen gibt es aber auch noch die dUTPase (Gen: dut), welche dUTP zu
dUMP hydrolysiert und damit die dUTP-Konzentration in der Zelle senkt (Tye 1978).
Dies führt zu einer Verminderung des Einbaus von Uracil. Mutationen des ung oder
dut Gens wirken sich in E. coli verschieden aus. Der nachfolgende Sachverhalt ergibt
sich aus den Publikationen Kouzminova und Kuzminov 2008, 2006 und 2004. Doppelmutanten akkumulieren viel Uracil in der DNA, da keine dUTPase vorhanden ist,
um den Spiegel an dUTP in der Zelle zu senken. Es kommt aber nicht zu einer
Fragmentierung des Chromosoms, da keine Basenexzisionsreparatur über UracilDNA-Glykosylasen erfolgt. Bei einer Mutation von ung allein wird Uracil nur in geringen Mengen eingebaut, da der dUTP-Spiegel in der Zelle durch die dUTPase niedrig
gehalten wird. Eine deutlich reduzierte chromosomale Stabilität zeigt sich jedoch bei
einer Mutation von dut, da ein vermehrter Einbau von Uracil erfolgt. In der DNA finden sich zwar keine erhöhten Mengen an Uracil, was darauf zurückzuführen ist, dass
das Uracil sofort durch Uracil-DNA-Glykosylasen entfernt wird. Dies wirkt sich jedoch
negativ auf die Zellen aus, da die ständig nötige Reparatur zu einer erhöhten Rate an
chromosomaler Fragmentierung führt. Die dUTPase ist demnach ein Enzym zur Prävention von DNA-Schäden. In S. coelicolor A3(2) gibt es ein orthologes Gen
(SCO5868).
Ein weiteres Protein der Prävention ist MutT. Wie die dUTPase gehört es zu den
Nukleotidpool-klärenden Enzymen. Es verhindert den Einbau von Basenanalogen in
die DNA, indem es diese schon in der Zelle abbaut. MutT erkennt 8-oxo-dGTP (entsteht durch die Oxidation von dGTP) und hydrolysiert es zu 8-oxo-dGMP, welches
von den DNA-Polymerasen nicht mehr eingebaut werden kann (Maki und Sekiguchi
1992). E. coli Stämme mit einem Defekt in diesem Gen (mutT) sind starke
Mutatorstämme (Cox und Yanofsky 1969, Fowler et al. 2003), da der Einbau von
24
Einleitung
8-oxo-dGTP zu ATCG Transversionen führt, obwohl eine neuere Studie dem widerspricht (Rotman und Kuzminov 2007). In S. coelicolor A3(2) gibt es mehrere Gene
die mutT-ähnliche Sequenzen aufweisen, unter anderem SCO1013 und SCO7560.
Reversion
Wurde die DNA durch alkylierende Substanzen geschädigt, besteht die Möglichkeit,
dass bestimmte Methylierungen durch Methyltransferasen wieder entfernt werden.
Das Enzym Ada erkennt O6-Methylguanin, O4-Methylthymin und auch Methylierungen am Zuckerphosphatrückgrat der DNA (Samson und Cairns 1977, Sedgwick und
Vaughan 1991). Die Methylgruppe wird dabei auf einen Cysteinrest des Proteins
übertragen (Cys321 oder Cys69) (Sedgwick et al. 1988), wo sie verbleibt. Sind beide
Akzeptoren-Cysteine besetzt, kann Ada keine weiteren Demethylierungen durchführen. Da das Enzym aber auch nicht recycelt wird, ist es damit permanent für Demethylierungen inaktiviert. Es fungiert jedoch im Fall einer Methylierung am Cys69 noch
als Transkriptionsaktivator seines eigenen Gens (Akimura et al. 1990).
N1-Methyladenin und N3-Methylcytosin werden dagegen von AlkB erkannt und die
Methylgruppe mittels einer oxidativen Demethylierung unter Bildung von Formaldehyd entfernt (Begley und Samson 2003, Falnes et al. 2002). Die Substanzen, gegen
die das Genprodukt von alkB einen Schutz verleiht, gehören zur Klasse der SN2spezifisch alkylierenden Mutagene (Kataoka et al. 1983) (Erklärungen zu SN1 bzw.
SN2 siehe Abschnitt 2.2.4 bei MNNG). In S. coelicolor A3(2) gibt es zwei adaähnliche Gene (SCO6150 und SCO6461) und ein orthologes Gen zu alkB
(SCO1040).
Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere, die durch das Einwirken von UV-Licht entstanden sind,
können mittels einer lichtabhängigen Reaktion direkt reaktiviert werden (Rupert und
Harm 1966, Rupert 1975). Sogenannte Photolyasen mit einem gebundenen RedoxKofaktor (FADH) können nach Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht ein
Elektron von diesem Kofaktor auf die DNA übertragen und die kovalente Bindung
des Dimers damit lösen. Die Reaktion ist also auf eine Anregung durch Licht angewiesen und kann unterbunden werden, wenn kein Lichteinfall stattfindet. Der Genlokus SCO0183 in S. coelicolor A3(2) kodiert für eine Deoxyribopyrimidin-Photolyase.
2.3.2 Basenexzisionsreparatur
Die Basenexzisionsreparatur (BER) greift, wenn eine geschädigte Base nicht direkt
repariert werden konnte, so dass diese entfernt werden muss. Die zentralen Enzyme
der Basenexzisionsreparatur sind die DNA-Glykosylasen (Lindahl 1976). Es gibt in
der Zelle verschiedene DNA-Glykosylasen, die spezifische Basenveränderungen erkennen und die Hydrolyse der N-glykosidischen Verbindung katalysieren. Der Name
25
Einleitung
Basenexzisionsreparatur kommt also daher, dass die modifizierte Base entfernt wird
und nicht das ganze Nukleotid. Nach dem einleitenden Schritt durch die DNAGlykosylasen entsteht daher eine Stelle ohne gebundene Base in der DNA (engl.:
apurinic oder apyrimidinic site bzw. AP-Stelle) (siehe Abbildung 7). Manchmal können diese AP-Stellen auch durch die spontane Hydrolyse der N-glykosidischen
Bindung entstehen.
Abbildung 7: Schema der Basenexzisionsreparatur (BER)
(A, B) Eingeleitet wird die BER immer durch das Entfernen der modifizierten Base (X)
durch DNA-Glykosylasen. (C) Anschließend wird das Zuckerphosphatrückgrat der
DNA gespalten. (D) Die AP-Lyaseaktivität der DNA-Glykosylasen selbst schneidet 3´
von der AP-Stelle (rechte Bildseite, linker Weg). AP-Endonukleasen schneiden 5´ von
der AP-Stelle (rechte Bildseite, rechter Weg). (E) Die entstandenen Enden werden
gegebenenfalls noch für die DNA-Neusynthese modifiziert. (F) Das fehlende Nukleotid wird von DNA-Polymerasen integriert, und Ligasen schließen den Einzelstrangbruch wieder.
In einem zweiten enzymatischen Schritt wird das Zuckerphosphatrückgrat der DNA
an der AP-Stelle geschnitten (Beschreibung des Ablaufes siehe Wyatt et al. 1999,
Friedberg et al. 2006, Boiteux und Guillet 2004). Manche DNA-Glykosylasen besitzen
selbst eine solche Nukleaseaktivität (AP-Lyaseaktivität) und setzen diesen Schnitt 3´
von der AP-Stelle, so dass am Strangbruch der Phosphatrest am 5´-Ende verbleibt
und am 3´-Ende ein ungesättigter Aldehyd (aufgebrochener Zucker) entsteht. Phosphodiesterasen spalten diesen Aldehyd ab, um ein OH-Ende für die Reparatur-DNA26
Einleitung
Synthese freizulegen. Sogenannte AP-Endonukleasen setzen den Schnitt dagegen
5´-wärts von einer erkannten AP-Stelle, so dass direkt ein 3´-OH-Ende am Strangbruch entsteht. In E. coli erfüllen die Exonuklease III und die Endonuklease IV diese
Aufgabe (Weiss 1976, Ljungquist et al. 1976, Ljungquist und Lindahl 1977, Saporito
et al. 1989). An dem freien 3´-OH-Ende können DNA-Polymerasen ansetzen, um ein
neues Nukleotid einzufügen. Es entsteht jedoch auch ein 5´-DeoxyribophosphatEnde (5´-dRp-Ende), das mit Hilfe von DNA-Deoxyribophosphat-diesterasen (dRPasen) entfernt wird (Franklin und Lindahl 1988, Sandigursky und Franklin 1992). Alternativ verdrängen DNA-Polymerasen einen Teil des alten Strangs, und dieses abgelöste Strangstück (engl.: Flap) wird von Flap-Endonukleasen abgespalten. Nachdem
wieder ein intaktes Nukleotid eingesetzt wurde, wird der Bruch im Zuckerphosphatrückgrat am Schluss von DNA-Ligasen geschlossen.
Die DNA-Glykosylasen sind gut charakterisiert. Im Folgenden werden einzelne DNAGlykosylasen und Nukleasen vorgestellt. Wenn es orthologe Gene in S. coelicolor
A3(2) gibt, werden diese im Text aufgeführt. S. coelicolor A3(2) war schon zu Beginn
der Arbeit komplett annotiert und dient als Referenzorganismus, da er mit S. lividans
eng verwandt ist.
Formamido-Pyrimidin-DNA-Glykosylase
MutM (synonym auch Fpg genannt) wird von dem Gen mutM (fpg) kodiert. Es handelt sich um eine Formamido-Pyrimidin-DNA-Glykosylase, kurz FaPy-DNA-Glykosylase, welche oxidierte Purine und solche mit geöffneter Ringstruktur entfernt
(Chetsanga und Lindahl 1979, Boiteux et al. 1989), die durch reaktive Sauerstoffspezies oder stark ionisierende Strahlung entstehen. Ein typisches Substrat ist auch
8-oxo-dGuanosin (Thou et al. 1991, Chung et al. 1991), welches eine Fehlpaarung
mit Adenosin eingeht und daher zu G  A Transversionen führen kann (siehe 2.2.2).
MutM gehört zu den DNA-Glykosylasen, die eine eigene AP-Lyaseaktivität besitzen
(O´Conner und Laval 1989). In S. coelicolor A3(2) wurde eine FaPy-DNAGlykosylase annotiert (Genlokus SCO5573). Ein weiteres Gen (SCO0945) gehört
vermutlich auch zu dieser Enzymklasse.
Uracil-DNA-Glykosylasen (UDGs)
Wie es der Name sagt, entfernen diese DNA-Glykosylasen Uracil aus der DNA, welches durch Einbau von dUTP oder Desaminierung von Cytosin entsteht. UDGs sind
weit verbreitet, werden in verschiedene Familien unterteilt und besitzen keine APLyaseaktivität (Pearl 2000). Die bekannteste ist die UDG aus E. coli (Gen: ung). Sie
gehört zur Familie 1 der Uracil-DNA-Glykosylasen, die in vielen Organismen weit
27
Einleitung
verbreitet ist. In S. coelicolor A3(2) gibt es zwei UDGs: UDG1 und UDG2 (ung1 und
ung2 bzw. SCO1114 und SCO1314).
3-Methyladenin-DNA-Glykosylasen (3maDGs)
Alkylierende Agenzien führen zu verschiedenen Methylierungen und Ethylierungen
der DNA-Basen. Einige Produkte dieser Reaktion, zum Beispiel 7-Methylguanosin
und 3-Methyladenosin, führen zu einer Schwächung der N-glykosidischen-Bindung,
so dass diese modifizierten Basen mit der Zeit von selbst freigesetzt werden. DNAGlykosylasen, die alkylierte Basen erkennen, beschleunigen diese Freisetzung jedoch deutlich und verhindern so, dass sich in der Zwischenzeit eine Mutation manifestiert. E. coli zum Beispiel hat zwei 3-Methyladenin-DNA-Glykosylasen, Tag und
AlkA (Gene: tagA und alkA). Während Tag sehr spezifisch 3-Methyladenosin erkennt
und entfernt (mit geringerer Effizienz auch 3-Ethyladenosin und 3-Methylguanosin)
(Bjelland et al. 1993, Bjelland und Seeberg 1987) hat AlkA ein breiteres Substratspektrum (Lindahl 1982 und 1976, Wyatt et al. 1999). AlkA erkennt mehr alkylierte Basen und teilweise auch Oxidierungsmodifikationen und ist, im Gegensatz zu
Tag, induzierbar. Sie zeigen untereinander keine Homologien, haben sich also getrennt voneinander entwickelt und werden daher zu verschiedenen Familien gezählt.
In Säugern gibt es eine 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase namens MPG
(N-Methylpurin-DNA-Glykosylase), die AlkA in ihrem Substratspektrum ähnelt
(O´Conner 1993). Keine der genannten Glykosylasen hat eine AP-Lyaseaktivität. Das
Gen SCO5142 (tag) aus S. coelicolor A3(2) weist eine hohe Ähnlichkeit mit tagA auf,
während das Gen SCO1792 eine 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase codiert, die zur
Familie der MPG Glykosylasen gehört.
MutY-DNA-Glykosylase
Wenn 8-oxo-dGuanosin in die DNA integriert ist und schon eine Paarung mit Adenin
zustande gekommen ist, dann kann das fehlgepaarte Adenin von der Adenin-DNAGlykosylase MutY entfernt werden (Au et al. 1989). MutY besitzt zudem eine eigene
AP-Lyaseaktivität (Tsai-Wu et al. 1992). Für die Entfernung des 8-oxo-dGuanosin
selbst sind Formamido-Pyrimidin-DNA-Glykosylasen zuständig (s.o.). In S. coelicolor
A3(2) wird für das Gen SCO3355 eine solche Adenin-DNA-Glykosylase (mutY) vermutet.
Exonuklease III (ExoIII)
Die Exonuklease III (ExoIII bzw. XthA, Gen: exoIII bzw. xthA) ist keine DNAGlykosylase. Sie spielt in der Basenexzisionsreparatur jedoch eine wichtige Rolle, da
sie zusätzlich zu ihrer 3´5´-Exonukleaseaktivität eine 3´-Phosphodiesteraseaktivität
und eine AP-Endonukleasefunktion besitzt (Doetsch und Cunningham 1990). Vor
28
Einleitung
allem letztere wird bei der Reparatur von AP-Stellen benötigt (siehe Abbildung 7,
bzw. deren Erläuterung). Die Exonuklease III und die Endonuklease IV sind die beiden wichtigsten AP-Endonukleasen in E. coli (Saporito et al. 1989). Das Genprodukt
von SCO6341 ist ähnlich zu den Exonukleasen III verschiedener Organismen, auch
zu xthA aus E. coli.
2.3.3 Nukleotidexzisionsreparatur
Modifizierte Basen, wie sie bei der Basenexzisionsreparatur von DNA-Glykosylasen
erkannt werden, sind typische, nicht DNA-verformende Schäden. Es gibt aber noch
eine weitere wichtige Gruppe der DNA-Schäden, die in der Natur von hoher Relevanz ist, da die zugehörigen DNA-Läsionen durch Sonnenlicht ausgelöst werden
können (siehe auch UV-Licht unter 2.2.3 bzw. 2.2.4). Im Labor sind sie durch Nutzung einer UV-Lampe leicht zu reproduzieren. Die resultierenden CyclobutanPyrimidin-Dimere und 6,4-Photoprodukte entstehen durch kovalente Bindung benachbarter Pyrimidine eines DNA-Stranges. Dabei kommt es zu einer Verformung
und Schwächung der DNA-Helix-Struktur im Bereich des Schadens (Husain et al.
1988, Pearlman et al. 1985), welche den Enzymen der Nukleotidexzisionsreparatur
(NER) zur Erkennung dienen. Die wichtigsten Proteine dieses Reparaturweges sind
UvrA, UvrB und UvrC, kodiert von den Genen uvrA, uvrB und uvrC (Howard-Flanders
et al. 1966). Der Name Uvr leitet sich von ihrer Funktion, der Vermittlung von UVResistenz ab. Entsprechend führt die Mutation eines der Gene zu einer deutlich reduzierten Überlebensrate unter Einwirkung von UV-Licht oder auch Mitomycin C,
photoaktiviertem Psoralen und MNNG (Howard-Flanders et al. 1966, Murray 1979).
In S. coelicolor A3(2) sind diese wichtigen Gene der Nukleotidexzisionsreparatur
ebenfalls vorhanden. Sie liegen auf dem Chromosom zwar nicht direkt nebeneinander, aber doch eng benachbart. Kodiert werden sie von den Genloci SCO1958
(uvrA), SCO1966 (uvrB) und SCO1953 (uvrC).
Im Gegensatz zum lichtabhängigen Prozess der Photoreaktivierung (siehe hierzu
unter Abschnitt 2.3.1 „Reversion“) ist die Nukleotidexzisionsreparatur lichtunabhängig
(Boyce und Howard-Flanders 1964), und wie der Name schon besagt, werden bei
der Nukleotidexzisionsreparatur ganze Nukleotide aus der DNA entfernt und keine
Basen, wie dies im ersten Schritt der Basenexzisionsreparatur der Fall ist. Die Nukleotidexzisionsreparatur kommt mit wenigen Enzymen aus, da die Substrate dieses
Reparaturweges eher einer generellen Erkennung bedürfen und nicht einer hohen
Spezifität, wie sie von Glykosylasen in der Basenexzisionsreparatur gewährleistet
wird. Wie die genaue Erkennung der Schäden erfolgt, ist im Detail noch nicht geklärt.
Unklar ist vor allem wie diese DNA-Verformungen von natürlichen Verformungen des
DNA-Metabolismus unterschieden werden. Man weiß, dass der Prozess Mg++- und
Mn++-Ionen benötigt und ATP-abhängig ist. Ein guter Überblick über die Nukleo29
Einleitung
tidexzisionsreparatur ist unter anderem in der Arbeit Van Houten 1990 und in dem
Buch Friedberg et al. 2006, Kapitel 7 zu finden. Ein Schema der Nukleotidexzisionsreparatur ist in Abbildung 8 zu sehen.
Abbildung 8: Schema der Nukleotidexzisionsreparatur (NER)
(A) Substrate für die NER sind DNA-verformende Mutationen wie CyclobutanPyrimidin-Dimere. (B) Diese werden von dem UvrA2B-Komplex erkannt, wobei UvrA
nach der Bildung eines stabilen UvrB-DNA-Komplexes und Teilentwindung der DNA
in diesem Bereich abdissoziiert. Dabei verbraucht der Vorgang des Erkennens und
der Bindung ATP. (C,D) An den UvrB-DNA-Komplex kann nun UvrC binden, wofür die
Anwesenheit - aber nicht die Hydrolyse - von ATP erforderlich ist. UvrBC agieren als
Nuklease. Die katalytisch aktive Einheit UvrC trennt die Phosphodiesterbindung des
Zuckerphosphatrückgrats der DNA zunächst zirka vier Nukleotide 3` und dann sieben
Nukleotide 5` von der Läsion und fällt dann ab. (E) Die DNA-Reparatur-Synthese wird
durch UvrD (DNA-Helikase II) eingeleitet, welches das Oligonukleotid herauslöst, so
dass die DNA-Polymerase I nach Verdrängung von UvrB die Lücke mit neuen Nukleotiden auffüllen kann (F). Zum Schluss schließt die DNA-Ligase die letzte Phosphodiesterbindung.
UvrA kommt nur in einer geringen Stückzahl, zirka 20 Moleküle pro Zelle vor, die sich
aber im Rahmen der SOS-Antwort verzehnfachen kann (Kenyon und Walker 1981).
Es gehört zur Familie der ABC-Transporter und hat Charakteristika eines DNABindeproteins (Doolittle et al. 1986). Durch die Bindung von ATP kommt es zur Dimerisierung des Proteins. UvrB wird konstitutiv mit zirka 250 Molekülen pro Zelle expri30
Einleitung
miert und wird ebenfalls bei der SOS-Antwort induziert (Fogliano und Schendel 1981,
Sancar et al. 1982). UvrB kann mit UvrA interagieren, was vermutlich die ATPaseFunktion von UvrB aktiviert (Caron und Grossman 1988). Der Komplex UvrA2B hat
eine höhere Affinität zur DNA als UvrA alleine.
Man geht davon aus, dass UvrA2B die DNA patrouilliert und an bestimmten Verformungen der DNA arretieren kann und diese teilweise entwindet, wobei die HelikaseFunktion von UvrA2B und der destabilisierende Effekt des Schadens selbst zusammenwirken (Grossmann und Thiagalingam 1993). Wie die DNA auf die Entwindung
reagiert, ist dabei nochmals ein wichtiger Kontrollschritt, da native DNA eine andere
Reaktion aufweist als geschädigte DNA. Anschließend dissoziiert UvrA ab, und es
bleibt ein stabiler UvrB-DNA-Komplex zurück (Van Houten und Snowden 1993). UvrA
fungiert also als ein molekularer Vermittler, der UvrB an die beschädigten Stellen der
DNA führt (Sancar und Hearst 1993). UvrC hat eine hohe Affinität zu diesem UvrBDNA-Komplex. Die Bindung von UvrC erfordert ATP, jedoch wird dieses nicht hydrolysiert. UvrBC ist eine Endonuklease (Zou et al. 1997). Sie hydrolysiert 3´ des Schadens die vierte oder fünfte Phosphodiesterbindung und anschließend 5´ die achte
Phosphodiesterbindung, wobei der genaue Sitz der Schnitte von der Art des Schadens und auch von der Sequenz abhängig ist (Sancar und Rupp 1983). Nach dieser
beidseitigen Hydrolyse kommt UvrD hinzu (auch DNA-Helikase II genannt, SOSinduzierbar) und entfernt das Oligonukleotid mit dem geschädigten DNA-Abschnitt
sowie UvrC (Orren et al. 1992). UvrB schützt die einzelsträngige DNA und wird erst
durch die DNA-Polymerase I verdrängt, welche die Lücke mit neuen Nukleotiden füllt
(Reparatur-Synthese). Zuletzt schließt die DNA-Ligase die letzte Phosphodiesterbindung.
2.3.4 Rekombinationsreparatur
Der Name Rekombinationsreparatur (RR) kommt daher, dass Mutanten dieses Reparaturweges ursprünglich entdeckt wurden, da sie nicht mehr zur homologen Rekombination fähig waren. Die homologe Rekombination wurde schon in der ersten
Hälfte des letzten Jahrhunderts beschrieben. Sie wurde als treibender Faktor der
bakteriellen Evolution durch Genaustausch zwischen Bakterien eingestuft, so dass
man dies lange für die Hauptfunktion der homologen Rekombination hielt. Erst nachdem bekannt wurde, wie sensitiv ihre Mutanten gegenüber bestimmten DNASchäden sind, wurde die primäre Rolle der homologen Rekombination in der DNAReparatur erkannt (Courcelle et al. 2001). Es werden viele Gene der Rekombinationsreparatur mit rec (engl.: recombination) abgekürzt, da sie bei der homologen Rekombination mitwirken und hierbei entdeckt wurden. Eine gute Beschreibung der Rekombinationsreparatur findet sich unter anderem in den Arbeiten Kuzminov 1999,
31
Einleitung
Kowalczykowski 2000, Spies und Kowalczykowski 2005 und in dem Buch Friedberg
et al. 2006, Kapitel 16.
Die Rekombinationsreparatur kann zwei Arten von DNA-Schäden beheben. Zum einen Einzelstrang-Bereiche der DNA (ssDNA-Bereiche, engl.: single stranded DNA),
auch Tochterstranglücken (engl.: daughter strand gaps) genannt; zum anderen doppelsträngige Enden bzw. Doppelstrangbrüche (werden wie zwei doppelsträngige Enden behandelt).
In der Regel entstehen diese Schäden, weil die Replikationsgabel auf eine noch nicht
behobene Einzelstrangläsion trifft. Handelt es sich dabei zum Beispiel um ein Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer (CPD), wird die Replikation gestoppt. Befindet sich die Läsion
auf dem diskontinuierlichen Strang, so wird das entsprechende Okazaki-Fragment
nicht beendet, und die DNA-Polymerase III zykliert auf den nächsten Primer. Es verbleibt ein einzelsträngiger Bereich, der sich von dem unvollendeten OkazakiFragment (mit der Läsion auf dem Gegenstrang) zum 5´-Ende des darauffolgenden
Primers erstreckt. Befindet sich die Läsion auf dem kontinuierlichen Strang, wurde
auch die Entstehung von einzelsträngigen Bereichen beobachtet, so dass die Replikation strangabwärts weitergeht (engl.: restart) oder bis zur Behebung der Läsion
unterbrochen wird, während die Synthese auf dem diskontinuierlichen Strang noch
fortschreitet. Es kommt also jeweils zur Bildung von Tochterstranglücken (Friedberg
et al. 2006).
Handelt es sich bei der Einzelstrangläsion, auf welche die Replikationsgabel trifft,
dagegen um einen Einzelstrangbruch, so kollabiert die Replikationsgabel und setzt
dabei ein doppelsträngiges Ende frei (Friedberg et al. 2006, Cox 1998, Kuzminov
2001). Solche Einzelstrangbrüche entstehen direkt über ionisierende Strahlung oder
als Intermediate der Exzisionsreparaturwege (siehe Abschnitt 2.2.3).
Entstehen Doppelstrangbrüche direkt durch ionisierende Strahlung oder Einwirkung
von bestimmten Chemikalien (z.B. Zeocin), sind sie für die Zelle besonders gravierend, da sie unabhängig von der Replikation im Chromosom auftauchen. Es wird für
die Rekombinationsreparatur schwierig, da die Reparatur nicht direkt der Replikation
nachfolgt und ein homologes Schwesterchromosom eventuell nicht gefunden wird. In
diesem Fall käme es zu einer letalen Fragmentierung des Genoms. Die Rekombinationsreparatur muss also der Replikation schnell nachfolgen, da es nur ein kleines
Zeitfenster gibt, bevor die homologen Schwesterchromosomen sich zu weit voneinander entfernt haben.
In dem Modellorganismus E. coli gibt es zwei separate Wege, die auf die Reparatur
dieser Schäden spezialisiert sind, den RecF- und den RecBCD-Weg. Beide sind RecA-abhängig und wurden nach den kritischen Proteinen benannt, in denen sie sich
unterscheiden. Wurde die Reparatur aufgrund einer Läsion auf einem Strang nötig
(z.B. CPD), so wird die eigentliche Läsion bei der Rekombinationsreparatur nicht be32
Einleitung
hoben, sondern mit einem homologen Strang gepaart, um eine Fortsetzung der Replikation zu ermöglichen. Der DNA-Schaden selbst ist eine Einzelstrangläsion und
muss von den Exzisionsreparaturwegen behoben werden (siehe vorherige Abschnitte). Sind diese defekt, so bleibt die Läsion erhalten. Solange keine weiteren Schäden
hinzukommen, kann durch die Rekombinationsreparatur trotzdem noch die Replikation des Genoms erfolgen. Über mehrere Generationen hinweg kommt es dann zu
einer Ausdünnung der Läsion in der Gesamtkultur.
Der „RecF-Weg“
oder Reparatur von Tochterstranglücken (einzelsträngigen DNA-Bereichen)
Wie bereits erwähnt, entstehen Tochterstranglücken, wenn das Replisom auf eine
DNA-Läsion trifft, die sie nicht übergehen kann (z.B. CPDs). Ein solcher einzelsträngiger DNA-Bereich wird sofort von Einzelstrangbindeproteinen (SSB, engl.: single
strand binding protein) bedeckt, um ihn vor Nukleasen zu schützen. Ein Schema des
RecF-Weges ist in Abbildung 9 dargestellt.
Die drei Hauptproteine der präsynaptischen Phase sind RecF, RecO und RecR.
RecF bindet ssDNA und dsDNA (Ayora und Alonso 1997, Griffin und Kolodner 1990)
und wird von recF kodiert, das sich in einem Cluster mit dnaA, dnaN und gyrB befindet, welche alle bei der Replikation beteiligt sind. RecO bindet ssDNA und dsDNA
(Luisi-DeLuca und Kolodner 1994) und wird von dem Gen recO kodiert. Das Gen von
RecR (recR) befindet sich u.a. im Cluster mit dnaX (Untereinheit des -Komplexes
des Replisoms). Die Genorganisation und zum Teil auch koregulierte Expression von
recF und recR mit anderen Genen der Replikation bzw. des Replisoms deutet eventuell auf eine Interaktion mit dem DNA-Polymerase III-Holoenzym hin.
In S. coelicolor A3(2) sind diese Gene der Rekombinationsreparatur ebenfalls vorhanden. Sie werden von den Genloci SCO3876 (recF), SCO2510 (recO) und
SCO3618 (recR) kodiert.
Die Proteine RecF, RecO und RecR laden in der präsynaptischen Phase RecA auf
die SSB-bedeckte einzelsträngige DNA, da RecA an diese Lücke geführt werden
muss und bei der Verdrängung von SSB Hilfe benötigt (Morimatsu und Kowalczykowski 2003). Die Stimulation der RecA-Filament-Bildung ist maximal, wenn RecO und
RecR in einem Verhältnis 1:1 vorliegen. Der Komplex RecOR ist daher hier essentiell. Er verhindert auch, dass es auf der 5´-Seite des RecA-Filaments zu einer natürlichen Dissoziation kommt (Shan et al. 1997). Die Polymerisation des RecA-Filaments
erfolgt in 5´3´-Richtung (auf das blockierte Replisom zu) und würde sich auch in
den doppelsträngigen Bereich weiter fortsetzen. Diese RecA-Ausbreitung wird auf
der 3´-Seite der Lücke durch den Komplex RecFR verhindert (Webb et al. 1997).
RecFR bindet doppelsträngige DNA, jedoch ohne eine Präferenz zu Übergängen in
33
Einleitung
einzelsträngige Bereiche (Webb et al. 1999). Daher erfolgt das „targeting“ der Proteine vermutlich darüber, dass RecFR mit dem Replisom interagiert bzw. auf dem Folgestrang noch an den Primer des vorherigen Okazaki-Fragments gebunden ist.
RecFR hat eventuell auch Replisom-freisetzende Eigenschaften und hilft später bei
der Wiederaufnahme der Replikation (Courcelle et al. 1997).
Abbildung 9: Schema der Reparatur von Tochterstranglücken (RecF-Weg)
Die Reparatur wird auf der linken Seite allgemein und auf der rechten Seite an einer
Replikationsgabel dargestellt. Die Schritte sind meist identisch. (A1, A2, A`) Die Replikationsgabel trifft auf eine DNA-Läsion und wird blockiert. Es entsteht ein einzelsträngiger DNA-Bereich, der sofort mit SSB (engl.: single strand binding protein) bedeckt wird. (B, F) RecOR assistiert RecA bei der Verdrängung von SSB und der Filamentbildung (RecA polymerisiert in 5´3´-Richtung). Gleichzeitig verhindert es die
Dissoziation von RecA am 5´-Ende. RecFR, welches vermutlich mit dem Replisom
assoziiert ist, unterbindet die RecA-Ausbreitung in den doppelsträngigen DNABereich hinter der Läsion. (C, G) RecA sucht die homologe Sequenz auf dem
Schwesterchromosom und katalysiert den Strangaustausch (für den besseren Überblick erfolgt die Darstellung ab hier ohne die assoziierten Proteine). (C, H) Die Lücke
34
Einleitung
wird von DNA-Pol. I aufgefüllt und (D) durch DNA-Ligase geschlossen. (D, H) Die
Überkreuzung wird von RuvABC oder RecG aufgelöst (dargestellt als kleine Pfeile).
(E) Im Chromosom ist die Lücke geschlossen, wobei die Läsion noch erhalten ist,
sollte sie zwischenzeitlich nicht mittels Exzisionsreparatur behoben worden sein. (I)
An der Replikationsgabel kommt es zu einer Wiederaufnahme der Replikation, assistiert durch PriA (und vermutlich RecF). Auch hier ist die ursprüngliche DNA-Läsion
noch erhalten, sofern sie nicht repariert wurde.
In der synaptischen Phase kommt es zum Strangaustausch. Das RecA-Filament
umwindet die einzelsträngige DNA, wobei es auf der Außenseite des Filaments noch
weitere DNA-Bindestellen gibt (Howard-Flanders et al. 1984, Cox und Lehmann
1987, Cox 2001, Lusetti und Cox 2002). Das Schwesterchromosom wird nach homologen Bereichen gescannt, aber der genaue Mechanismus der Erkennung ist noch
unklar. Ist ein ausreichend homologer Bereich gefunden, katalysiert RecA den
Strangaustauch. Der verdrängte Strang bleibt zunächst außen an das Filament gebunden, wo er von SSB abgelöst wird. Hier handelt es sich also um eine 3-StrangÜberkreuzung zu beiden Seiten der Lücke.
Die Auflösung dieser Synapse geschieht in der postsynaptischen Phase. Die Tochterstranglücke wird durch die DNA-Polymerase I aufgefüllt. Gegebenenfalls erfolgt
auch die Reparatur der Einzelstrangläsion mit Hilfe der Exzisionsreparatur. Anderenfalls bleibt die Läsion erhalten. Um die typischen Überkreuzungsstrukturen (engl.:
Holliday Junctions) aufzulösen, gibt es zwei redundante Mechanismen, die RuvABCResolvase bzw. die RecG-Helikase (siehe West 1996, Sharples et al. 1999).
RuvA bindet als Tetramer an die Überkreuzung und hält sie in einer ausgebreiteten
Konformation (Rafferty et al. 1996, Hargreaves et al. 1998). RuvB interagiert mit
RuvA und bindet als hexamere Ringe über die Duplex-DNA an zwei gegenüberliegenden Seiten des RuvA-Tetramers (Stasiak et al. 1994). Es kommt zur spontanen
Migration bzw. Translokation der Überkreuzung zu den Stellen der Auflösung (Parsons et al. 1995). RecA wird dabei entfernt. RuvC bindet als Dimer planar an die
Überkreuzung und setzt zwei Schnitte in den sich nicht überkreuzenden Strängen
gleicher Polarität (nach einer Thyminbase) und löst damit die Überkreuzung auf
(Dunderdale et al. 1991, Bennett et al. 1993, Shah et al. 1994). Beide Überkreuzungen können auf diese Weise aufgelöst werden. Alternativ kann aber auch, nach der
Schnittsetzung in der ersten Überkreuzung, die zweite Überkreuzung zu diesem
Schnitt translokiert und somit aufgelöst werden.
RecG ist eine Helikase, die RuvABC zum Teil ersetzen kann (Whitby et al. 1994,
Lloyd und Sharples 1993, Lloyd 1991). Sie bindet an die Überkreuzung und stimuliert
eine Migration in 3´5´-Richtung. Sie bindet vor allem 3-Strang-Überkreuzungen und
35
Einleitung
drückt diese zum assoziierten RecA-Filament hin (Whitby et al. 1993, Whitby und
Lloyd 1995). Bei der Auflösung beteiligt sich jedoch noch eine Nuklease. In Abbildung 9 werden die Angriffsstellen von RuvABC bzw. RecG als Pfeile dargestellt (Bildteile D und H).
Wiederaufnahme der DNA-Synthese
Im Falle einer blockierten oder kollabierten Replikationsgabel ist für die Wiederaufnahme der DNA-Synthese ein Wiederaufbau der Replikationsmaschinerie nötig (siehe Abbildung 9 rechts und Abbildung 10). Das PriA-abhängige Primosom spielt dabei
eine zentrale Rolle (Cox et al. 2000, Masai et al. 1994, Kogoma et al. 1996, Marians
1999, Marians 2000, Sandler und Marians 2000, Polard et al. 2002). Nach der begrenzten Verdrängungs-Synthese durch die DNA-Pol. I bindet PriA an den verdrängten Strang und lädt das Primosom. Dieses besteht aus sieben Proteinen, u.a. die
DnaB-Helikase und die DnaG-Primase. Das Replisom kann auf dieses Gerüst aufsetzen und die DNA-Synthese neu starten.
Transläsions-Synthese
Es gibt noch einen alternativen Weg zur Reparatur von Tochterstranglücken, falls
kein homologes Schwesterchromosom gefunden wird, die DNA so schwer geschädigt ist, dass auch dieses Läsionen aufweist, oder der RecF-Weg nicht aktiv ist. Starke DNA-Schädigungen aktivieren die SOS-Antwort der Bakterien (Friedberg et al.
2006, Kapitel 14). Späte Gene dieser SOS-Antwort sind umuD und umuC (Smith und
Walker 1998, Woodgate und Levine 1996). UmuD wird nach Bindung von RecA
durch Proteolyse in UmuD´ überführt (Reuven et al. 1999). Der Komplex UmuD´2C
katalysiert die sogenannte Transläsions-Synthese (Sutton et al. 2000). UmuD´2C ist
eine DNA-Polymerase (DNA-Pol. V), die jedoch sehr fehlerhaft arbeitet (Tang et al.
1999). Sie ersetzt kurzzeitig die DNA-Pol. III im blockierten Replisom und synthetisiert über die DNA-Läsion hinweg (Einbau zufälliger Basen). Zudem gibt es in E. coli
zwei weitere DNA-Polymerasen, die durch den zufälligen Einbau von Nukleotiden
über eine Läsion hinweghelfen: DNA-Polymerase II und DNA-Polymerase IV (Bonner
et al. 1990, Iwasaki et al. 1990, Wagner et al. 1999).
Der „RecBCD-Weg“
oder die Reparatur von doppelsträngigen Enden (bzw. Doppelstrangbrüchen)
und die Wiederaufnahme der Replikation
Einzelstrangbrüche entstehen als Intermediate der Exzisionsreparaturwege und
durch Einwirkung von Chemikalien oder ionisierender Strahlung. Läuft eine Replikationsgabel in solch einen Einzelstrangbruch, kollabiert das Replisom, und es kommt
zur Freisetzung von doppelsträngigen Enden. Werden Doppelstrangbrüche nicht repariert, kommt es zur Fragmentierung des Chromosoms. Ziel des RecBCD-Weges ist
36
Einleitung
es, die Invasion eines Doppelstrangendes in sein homologes Schwesterchromosom
zu unterstützen, und die Replikation neu zu starten. Man spricht von einer Ursprungs-unabhängigen DNA-Synthese (siehe Abbildung 10).
Abbildung 10: Schema der Reparatur von Doppelstrangenden (RecBCD-Weg)
(A) Das Replisom kollabiert, wenn es auf einen Einzelstrangbruch trifft und setzt ein
doppelsträngiges Ende frei. (B) RecBCD degradiert sowohl den 3´- als auch den
5´-Strang des freien Endes, bis es auf eine chi-Stelle () trifft. (C) Dort kommt es zu
einer Modifikation von RecD und RecBCD* degradiert nur noch das 5´-Ende. (D) Der
entstehende 3´-Überhang wird von SSB bedeckt. (E) RecBCD* lädt RecA auf den
SSB-bedeckten 3´-Überhang, und RecA katalysiert den Strangaustausch mit dem
homologen Schwesterchromosom. (F) Am 3´-Ende des eingedrungenen Stranges
findet durch die DNA-Pol. I eine limitierte DNA-Synthese statt. Zeitgleich kommt es
am verdrängten Strang schon zum Wiederaufbau zunächst des Primosoms (katalysiert durch PriA) und dann des Replisoms, welches dann erste Primer setzt. (G) Die
Wiederaufnahme der DNA-Synthese formt eine typische Strangüberkreuzung (engl.:
Holliday Junction), die im letzten Schritt durch RuvABC oder RecG aufgelöst wird (H).
Die Hauptproteine der präsynaptischen Phase sind hier RecB, RecC und RecD. In
S. coelicolor A3(2) wurde jedoch nur ein zu recD orthologes Gen gefunden
(SCO2737). Zusammen bilden RecBCD einen Komplex, der auch als Exonuklease V
37
Einleitung
bekannt ist. Einen guten Überblick über RecBCD gibt die Arbeit von Dillingham und
Kowalczykowski 2008. Bei RecBCD handelt es sich um eine bipolare Helikase und
Nuklease: Die RecD-Untereinheit ist eine schnelle 5´3´-Helikase und RecB besitzt
eine 3´5´-Helikasedomäne und eine Nukleasedomäne (Taylor und Smith 2003,
Dillingham et al. 2003). RecBCD bindet an Doppelstrangenden und entwindet und
degradiert beide Stränge, bis der Komplex am 3´-Ende auf eine chi-Stelle (-Stelle)
trifft (gerichtete 8er Nukleotidsequenz) (Dixon et al. 1994, Köppen et al. 1995). Diese
Sequenz wird von RecC erkannt und gebunden (Chédin et al. 2006, Singleton et al.
2004). Das 3´-Ende wird so geschützt und es kommt nachfolgend nur noch zur Degradation des 5´-Strangs. So entsteht ein einzelsträngiger 3´-Überhang, wobei die
RecB-Untereinheit die RecA-Filament-Bildung auf diesem 3´-Strang ermöglicht
(Churchill et al. 1999, Spies und Kowalczykowski 2006). RecA sucht und katalysiert
daraufhin den Strangaustausch mit dem homologen Schwesterchromosom und bildet
so die Synapse. Im Schwesterchromosom sollte in der Zwischenzeit der ursprüngliche Einzelstrangbruch repariert worden sein.
In der postsynaptischen Phase kommt es am 3´-Ende des invasiven Stranges zu
einer limitierten DNA-Synthese durch DNA-Pol. I. PriA bindet an den verdrängten
Strang und ermöglicht den Wiederaufbau eines Primosoms (Marians 1999). Auf dieses kann das Replisom aufsetzen (siehe auch „Wiederaufnahme der DNA-Synthese“
Seite 32). Durch die Wiederaufnahme der DNA-Synthese wird aus der 3-StrangÜberkreuzung eine typische „Holliday Junction“. Diese wird von RuvAB gebunden
und unter Ablösung von RecA translokiert. RuvC bindet zusätzlich an die Überkreuzung und löst diese auf. Eine genaue Beschreibung des Vorgangs findet sich in dem
Abschnitt über den „RecF-Weg“ (ergänzend siehe auch Kreuzer 2005).
Dieser Ablauf entspricht der Darstellung in Abbildung 10. Alternativ kann nach der
Invasion des 3´-Endes der verdrängte Strang auch 3´ geschnitten werden (an der
Stelle, an der der eingedrungene Strang endet und der verdrängte Strang wieder zurückkehrt) (Chiu et al. 1997, Kuzminov 1999). Der eingedrungene Strang wird mit
dem neuen 5´-Ende des Elternstrangs ligiert. Diese 3-Strang-Überkreuzung kann
dann durch RecG unter Ablösung von RecA bis zum Ende translokiert werden,
wodurch wieder ein Grundgerüst für den Wiederaufbau des Replisoms hergestellt ist.
Der „RecE-Weg“
In E. coli gibt es noch einen alternativen Weg, Doppelstrangenden zu reparieren,
sollte RecBCD defekt sein: den RecE-Weg. RecE wird im kryptischen RacProphagen kodiert. In sbcA Mutanten kommt es zu einer Aktivierung des normalerweise reprimierten recE Gens (sbc steht für „supressor of RecBC mutation“) (Barbour
et al. 1970, Templin et al. 1972, Kowalczykowski et al. 1994). RecE ist eine 5´3´38
Einleitung
Exonuklease (Exonuklease VIII), die die für die Rekombination essentiellen 3´-DNAÜberhänge bildet (Gillen et al. 1977, Joseph und Kolodner 1983 und 1983a). Das
gleichfalls gebildete Protein RecT katalysiert die Renaturierung komplementärer Einzelstrang-DNA und die Translokation von 3-Strang-Überkreuzungen (Clark et al.
1993, Hall 1993, Hall und Kolodner 1994, Kowalczykowski et al. 1994). Zudem könnte RecT die 3´-Überhänge vor der Degradation durch ExoI schützen (Kuzminov
1999). PriA kann an einer bestimmten Sekundärstruktur („Stämmchen“, engl.: Hairpin) im 3´-Überhang binden und aggregiert das Primosom, das einen Primer setzt.
An diesen bindet RecFR, während RecOR RecA an das einzelsträngige 3´-Ende
führt. Sobald das RecA-Filament ausgebildet ist, kann die Reparatur wie beim
RecBCD-Weg mit der Synapse fortfahren (Kuzminov 1999). Orthologe Gene zu recE
oder recT gibt es in S. coelicolor A3(2) jedoch nicht.
Das AddAB-Helikase/Nuklease-System
In dem Gram-positiven Modellorganismus B. subtilis sind keine orthologen Gene zu
recB, recC und recD vorhanden, aber zu recF, recO und recR. Für die Reparatur von
Doppelstrangbrüchen sind jedoch zwei vorbereitende Schritte essentiell. Zum einen
muss ein 3´-DNA-Überhang gebildet werden, welcher ein universelles Intermediat zur
Initiation von DNA-Rekombination ist, und zum anderen muss RecA auf dieses einzelsträngige 3´-Ende geladen werden (siehe dazu auch „Der RecBCD-Weg“, „Der
RecE-Weg“ und nachfolgend „Wie RecFOR RecBCD ersetzen kann“). Es finden sich
in B. subtilis zu RecBCD funktionell redundante Proteine, das AddAB (ExoV) Helikase/Nuklease-System, welche diesen 3´-DNA-Überhang bilden kann (Chédin und
Kowalczykowski 2002). Mutationen in addA oder addB führen zu einer verringerten
Überlebensrate der Zellen und einer hohen Sensitivität gegenüber DNAschädigenden Agenzien, wie es auch für recB oder recC Mutationen in E. coli typisch
ist. AddAB ist eine starke Helikase und Exonuklease (Yeeles und Dillingham 2007).
Von einem doppelsträngigen Ende aus degradiert AddAB beide Stränge, bis das
B. subtilis -Äquivalent einer chi-Stelle (Bs) erreicht wird (Sequenz von 5 Nukleotiden:
5´-AGCGG-3´) (Chédin et al. 2006). Die Interaktion von AddAB mit Bs verändert die
Nukleaseaktivität, so dass nur noch das 5´-Strangende weiter verdaut wird. So entsteht der wichtige 3´-DNA-Überhang (Yeeles und Dillingham 2007).
Das AdnAB-Helikase/Nuklease-System
Die Enzyme AdnAB bilden ein alternatives Helikase/Nuklease-System, welches 2009
in Mykobakterien beschrieben wurde (Sinha et al. 2009). Orthologe Gene wurden
dabei in vielen anderen Bakterien gefunden, die jedoch alle zur Ordnung der Grampositiven Actinomycetales gehören. AdnAB ist in Mykobakterien zusätzlich zu
RecBCD vorhanden (Sinha et al. 2009), erfüllt jedoch keine redundante Funktion.
39
Einleitung
Während RecBCD in E. coli die wichtigste Nuklease zur Prozessierung der Doppelstrangenden ist und so die RecA-abhängige homologe Rekombination einleitet, zeigen Deletionsmutanten von recBCD in M. smegmatis keine erhöhte Sensitivität gegenüber UV-Licht (Stephanou et al. 2007). Stattdessen erfüllt AdnAB die Funktion
der präsynaptischen Nuklease in der RecA-abhängige homologen Rekombination,
während RecBCD einem RecA-unabhängigen Weg zugeordnet werden konnte, der
Einzelstränge zwischen gleichgerichteten Sequenzwiederholungen verbindet (SSA,
engl.: single strand annealing pathway) (Gupta et al. 2011). In Mykobakterien gibt es
mit der AdnAB- und RecA-abhängigen Rekombinationsreparatur insgesamt drei verschiedene Systeme zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen, da es neben dem
RecBCD-abhängigen und RecA-unabhängigen SSA noch ein System des nichthomologe Verbindens von Enden gibt (Gong et al. 2005, Shuman und Glickman
2007) (siehe auch Abschnitt 2.3.5). In S. coelicolor A3(2) werden orthologe Gene zu
AdnAB von den Genloci SCO5183 und SCO5184 kodiert.
Wie RecFOR RecBCD ersetzen kann
In S. coelicolor A3(2) gibt es keine Gene, die zu recB bzw. recC ortholog sind, und
auch kein AddAB-System. Freigesetzte Doppelstrangenden oder Doppelstrangbrüche müssen jedoch behoben werden. Der RecF-Weg spielt hier vermutlich die zentrale Rolle in beiden Wegen der Rekombinationsreparatur. RecFOR kann wie
RecBCD in der präsynaptischen Phase die Polymerisierung des RecA-Filaments einleiten (siehe dazu „Der RecF-Weg“). Um RecBCD zu ersetzen, muss jedoch der kritische Schritt – die Bildung des 3´-DNA-Überhangs – von anderen Enzymen vorbereitet werden. Danach kann RecFOR übernehmen (siehe auch Beschreibung des RecE-Weges zuvor). Hat das freigesetzte Doppelstrangende einen 5´-Überhang, so
wird dieser zunächst von der Einzelstrang-5´3´-Exonuklease RecJ abgebaut (Lovett und Kolodner 1989). Anschließend ist ein Zusammenspiel von Helikasen (RecQ
und eventuell UvrD oder HelD) (Mendonca et al. 1995) zur Entwindung des doppelsträngigen Endes sowie RecJ zur Bildung eines einzelsträngigen 3´-DNA-Überhangs
nötig (Courcelle und Hanawalt 1999, Ivančić-Baće et al. 2003, Ivančić-Baće et al.
2005). Die synaptische und postsynaptische Phase unterscheiden sich in den beiden
Wegen nicht.
RecQ und UvrD gibt es auch in S. coelicolor A3(2): SCO5815 bzw. SCO5188. Jedoch existiert kein zu recJ orthologes Gen. Trotzdem muss es zur Bereitstellung des
3´-DNA-Überhangs eine 5´3´-Exonuklease geben, auch wenn diese noch nicht
zugeordnet werden konnte.
In E. coli fördern Mutationen der sbc-Gene die vollständige Aktivierung des RecFWeges. Ohne sbcB gibt es keine Exonuklease I-Aktivität, welche ungeschützte 3´DNA-Überhänge verdauen würde und die Nuklease SbcCD schneidet in der DNA
40
Einleitung
von E. coli bestimmte Sekundärstrukturen (z.B. Hairpins und überkreuzte DNAStrukturen). Die Gene sbcCD finden sich auch in S. coelicolor A3(2): sbcC
(SCO1300) und sbcD (SCO1301).
RecN sollte zudem nicht unerwähnt bleiben, da es nachgewiesener Weise als eines
der ersten Enzyme zu Doppelstrangbrüchen rekrutiert wird (Kidane et al. 2004). Es
ist mit der eukaryotischen SMC Proteinfamilie verwandt, welche wichtige Komponenten für die Kohäsion von Schwesterchromosomen (cohesin) und die Chromosomenkondensation (condensin) stellen (Rostas et al. 1987, Kidane et al. 2004, Stunnikov
1998, Hirano 1999). RecN bildet in Lösung multimere (vermutlich oligomere) Komplexe und könnte in dieser Form zwei DNA-Moleküle und weitere Proteine binden
(Kidane et al. 2004). Es wird vermutet, dass es an die Doppelstrangbrüche bindet
und die korrekte Verbindung der doppelsträngigen Enden unterstützt (Meddows et al.
2005). Zu recN gibt es in S. coelicolor A3(2) ein orthologes Gen (SCO1780).
2.3.5 Nicht-homologes Verbinden von Enden
Das nicht-homologe Verbinden von Enden (NHEJ, engl.: non-homologous endjoining) wurde ursprünglich für eukaryotische Zellen beschrieben, wo es für die Reparatur von Doppelstrangbrüchen essentiell ist. Dieser Reparaturweg erfordert keinen
Strangaustausch und keine homologe DNA (Krejci et al. 2003). Ku bindet an die Enden von Doppelstrangbrüchen, rekrutiert den Ligase-Komplex IV/XRCC4 und stimuliert seine Ligase-Aktivität. Ohne diese Proteine des NHEJ kommt es zum Beispiel in
Säugerzellen zu keiner Religation von Doppelstrangbrüchen, und die Zellen sind hypersensitiv gegenüber ionisierender Strahlung (Nussenzweig et al. 1997, Kabotyanski et al. 1998). Das NHEJ schützt damit generell vor genetischer Instabilität,
auch schon in Säugerzellen ohne mutagenen Stress (Roth et al. 2000). In einigen
Bakterien wurden ku-ähnliche Gene gefunden (Weller et al. 2002, Della et al. 2004,
Gong et al. 2005, Bowater und Doherty 2006). In vielen Bakterien befinden sich diese ku Gene in einem Operon mit einer Ligase, was auf eine funktionelle Interaktion
hindeutet (Aravind und Koonin 2001). Wie genau die Enden vor oder von Ku prozessiert werden ist unklar, jedoch kommt es durch das Zusammenspiel von Ku und
Ligase zu einer direkten Verbindung von Doppelstrangenden. In S. coelicolor A3(2)
gibt es einen Bereich, in dem ein ku-ähnliches Gen und eine Ligase zusammen kodiert sind (SCO5309 und SCO5308), was auf eine gemeinschaftliche Funktion im
Rahmen eines NHEJ hindeuten könnte.
2.3.6 MMR
Die methylierungsabhängige Reparatur (MMR, engl.: methyl directed mismatch repair) ist aus E. coli bekannt. Dieser Reparaturweg nutzt den Umstand, dass ein neu
41
Einleitung
synthetisierter DNA-Strang noch keine Methylierungen an den GATC-Stellen (Basensequenz: GATC, Erkennungssequenz für die von dam kodierte Methylase) aufweist, da diese erst durch die Methylase integriert werden müssen (Wagner und
Meselson 1976, Lyons und Schendel 1984, Radman und Wagner 1986). Beteiligte
Proteine sind MutH, MutL und MutS (Modrich 1989, Friedberg et al. 2006), die sich
an einer Fehlpaarung anlagern und die DNA bis zur nächsten GATC-Stelle als
Schlaufe einziehen (Guarné et al. 2004). Der unmethylierte Strang wird durch MutH
geschnitten (Welsh et al. 1987, Au et al. 1992), mit Hilfe von UvrD und Nukleasen
abgebaut und anschließend neu synthetisiert. Da es in S. coelicolor A3(2) jedoch
keine orthologen Gene zu diesem Reparaturweg gibt, wird er hier nicht im Detail
ausgeführt.
2.3.7 Übersicht der vorgestellten Reparaturgene
Obwohl in dieser Arbeit mit S. lividans gearbeitet wurde, wurden die Gene anhand
des Referenzorganismus S. coelicolor A3(2) vorgestellt. S. coelicolor A3(2) ist von
den Streptomyceten am besten charakterisiert. Sein Chromosom wurde bereits 2002
vollständig sequenziert (Bentley et al. 2002, Hopwood 1999, Kieser et al. 2000).
S. coelicolor A3(2) ist eng verwandt mit S. lividans, welcher zu Beginn der Arbeit
noch nicht sequenziert war. Die Auswahl der Oligonukleotide für die PolymeraseKettenreaktionen (PCRs) erfolgte dementsprechend mit der Sequenzinformation aus
S. coelicolor A3(2). Eine Auflistung der besprochenen Gene aus S. coelicolor A3(2)
bzw. S. lividans findet sich in der nachfolgenden Tabelle 1.
In dieser Tabelle sind alle Gene aus S. coelicolor A3(2) (bzw. S. lividans TK24) aufgeführt, die eine Homologie zu den vorgestellten Genen der DNA-Reparatur haben.
Sie erhebt jedoch keinen Anspruch auf Vollständigkeit, da es weitere Gene der DNAReparatur gibt, die nicht vorgestellt wurden. Diese stellen nicht den Hauptweg der
Reparatur oder sind in der Vor- bzw. Nachbereitung der erläuterten Hauptreaktionen
beteiligt. Das bedeutet jedoch nicht, dass sie keine essentielle Rolle spielen können.
Zudem mag es in Streptomyceten noch weitere Gene der Reparatur geben, die aufgrund fehlender Sequenzübereinstimmungen noch nicht zugeordnet werden konnten
und bisher phänotypisch nicht aufgefallen sind.
Bei den Proteinen SbcC und AdnB ist die Aminosäuresequenz in S. lividans deutlich
kürzer angegeben, als es bei S. coelicolor der Fall ist. Wenn die entsprechenden Unterschiede in der Basensequenz tatsächlich so vorhanden sind und es sich nicht um
Fehler bei der Sequenzierung handelt, dann ist bei diesen Genen fraglich, inwieweit
die gebildeten, verkürzten Proteine noch ihre Funktion ausführen können.
42
Einleitung
Tabelle 1: Übersicht der vorgestellten Gene der DNA Reparatur und homologen Rekombination von S. coelicolor A3(2) und S. lividans TK24
Genname
Protein/Funktion
Genlokus S.l.
AS
Genlokus S.c. AS
dut
dUTPase
SSPG01861
183
SCO5868
183
mut-like
MutT-Proteinfamilie
SSPG00288
177
SCO7560
177
mut-like
MutT/NUDIX-Proteinfamilie
SSPG06550
159
SCO1013
159
ada-like
Ada-ähnlich
SSPG01223
490
SCO6461
490
SCO6150
477
alkB
AlkB
SSPG06524
216
SCO1040
216
Deoxyribopyrimidin
SSPG06754
458
SCO0842
458
Photolyase
SSPG07416
457
SCO0183
415
FaPy-DNA-Glykosylase
SSPG02133
286
SCO5573
286
Photolyase
mutM (fpg)
FaPy-DNA-Glykosylase
SSPG06652
287
SCO0945
287
ung1
Uracil-DNA-Glykosylase 1
SSPG06453
225
SCO1114
225
ung2
Uracil-DNA-Glykosylase 2
SSPG06217
227
SCO1343
227
tag
3-Methyladenin-DNAGlykosylase I
SSPG02545
194
SCO5143
194
mpg-like
3-Methyladenin-DNA-
(alkA)
Glykosylase
SSPG05758
213
SCO1792
213
mutY
Adenin-Glykosylase
SSPG04201
308
SCO3355
308
xthA-like
Exodeoxyribonuklease III
SSPG01289
259
SCO6341
259
uvrA
UvrA
SSPG05588
1014
SCO1958
1014
uvrB
UvrB
SSPG05581
712
SCO1966
712
uvrC
UvrC
SSPG05594
728
SCO1953
728
recF
RecF
SSPG03777
373
SCO3876
373
recO
RecO
SSPG05020
251
SCO2510
251
recR
RecR
SSPG04042
199
SCO3618
199
recA
RecA
SSPG01963
374
SCO5769
374
ruvA
RuvA
SSPG06037
201
SCO1519
201
ruvB
RuvB
SSPG06038
357
SCO1518
357
ruvC
RuvC
SSPG06036
188
SCO1520
188
recG
RecG
SSPG02139
742
SCO5566
742
priA
PriA
SSPG06080
516
SCO1475
716
recD
RecD
SSPG04791
753
SCO2737
753
sbcC
SbcC
SSPG06266
480
SCO1300
999
sbcD
SbcD
SSPG06265
387
SCO1301
387
recQ
RecQ
SSPG01915
719
SCO5815
719
uvrD
UvrD
SSPG02499
780
SCO5188
785
recN
RecN
SSPG05771
576
SCO1780
572
adnA
AdnA
SSPG02504
1165
SCO5183
1159
adnB
AdnB
SSPG02503
770
SCO5184
1222
ku
Ku
SSPG02373
362
SCO5309
365
lig
Ligase
SSPG02374
293
SCO5308
293
Genlokus S. l.: Genlokusnummer in S. lividans TK24; AS: Anzahl der Aminosäuren im Protein; Genlokus S. c.: Genlokusnummer in S. coelicolor A3(2).
43
Einleitung
2.4
Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit war es, ein größeres Verständnis für die DNA-Reparatur bzw. Rekombination und chromosomale Stabilität in Streptomyceten zu erhalten. Zum Thema
der DNA-Reparatur und Rekombination gibt es zahllose Veröffentlichungen, aber
diese befassen sich vorwiegend mit den Vorgängen in gängigen Modellorganismen,
allen voran E. coli. Aber schon ein Blick auf die Genausstattung (siehe Tabelle 2)
zeigt, dass in S. coelicolor als Vertreter der Streptomyceten die Verhältnisse anders
sind als in E. coli.
Im Rahmen dieser Arbeit sollten verschiedene Deletionsstämme von S. lividans
TK64 hergestellt werden. Ziel der Knock-outs waren dabei einige der Gene, die zuvor
besprochen wurden. Alle ausgewählten Gene sind bekannter Weise oder vermutlich
an der DNA-Reparatur und/oder homologen Rekombination beteiligt und damit auch
an der Stabilität des Genoms. Ziel war es, ein breites Spektrum an Deletionsmutanten zu erhalten, die für die verschiedenen Wege der DNA-Reparatur repräsentativ sind, und diese Mutanten näher zu charakterisieren. Wurde die chromosomale
Stabilität durch die Deletionen verändert und wie reagieren die Mutanten auf das
Einwirken von Mutagenen? Interessant ist hierbei auch, welche Gene der DNAReparatur in S. lividans bzw. dem zu Beginn der Arbeit sequenzierten und eng verwandten S. coelicolor A3(2) überhaupt vorkommen und welche DNA-Reparaturwege
daher offen stehen.
Es wurde bereits erwähnt, welche Gene der DNA-Reparatur bzw. der homologen
Rekombination auch bei S. coelicolor A3(2) gefunden wurden. Die Tabelle 2 gibt einen Überblick über das Vorkommen der verschiedenen Gene der DNARekombination in ausgewählten Bakterien (abgewandelt aus Rocha et al. 2005).
Nicht enthalten sind in der Tabelle die Gene der Prävention und Reversion bzw. der
Exzisionsreparaturwege. Wie in den Abschnitten 2.3.1 bis 2.3.3 erläutert, gibt es die
entsprechenden Gene der Prävention und Reversion in S. coelicolor A3(2), sowie
diverse Glykosylasen für die Basenexzisionsreparatur und die essentiellen Gene
uvrA, uvrB und uvrC der Nukleotidexzisionsreparatur. Interessant sind die Unterschiede in der Genausstattung der Rekombinationsreparatur bzw. der homologen
Rekombination.
Für die präsynaptischen Phase der homologen Rekombination fällt auf, dass RecBC
in S. coelicolor, D. radiodurans und B. subtilis fehlt. B. subtilis kompensiert dieses
Fehlen mit dem Nuklease-Helikase-System AddAB. S. coelicolor und D. radiodurans
scheinen jedoch nur auf das alternative präsynaptische System RecFOR zurückgreifen zu können, das in E. coli vor allem für die Reparatur von Tochterstranglücken
verantwortlich ist. Ist der RecF-Weg also der zentrale und einzige Reparaturweg der
44
Einleitung
Rekombinationsreparatur? Und welche Aufgabe erfüllt RecD, wenn RecB und RecC
nicht vorhanden sind? Durch das zusätzliche Fehlen von RecJ stellt sich bei
S. coelicolor die Frage, wie gegebenenfalls die Doppelstrangenden vorbereitet werden, bzw. welche andere Nuklease diese Funktion erfüllt (siehe hierzu Abschnitt
2.3.4: „Wie RecFOR RecBCD ersetzten kann“). Das neu entdeckte AdnAB-System
aus Mykobakterien ist hier ebenfalls von Interesse, da orthologe Gene in Streptomyceten vorhanden sind (siehe hierzu Abschnitt 2.3.4: „Das AdnAB-Helikase/NukleaseSystem“). In der postsynaptischen Phase unterscheidet sich S. coelicolor nicht von
E. coli. Auffällig ist noch das Vorkommen von orthologen Genen zu ku und zur Ligase, so dass in S. coelicolor eventuell ein System des nicht-homologen Verbindens
von Enden vorkommen könnte.
Tabelle 2: DNA-Reparatur/homologe Rekombinationssysteme in Bakterien
Präsynaptische Phase
Add
A
B
Rec
B
C D F
Rec
O R
J
Migration Resolvasen
Rec Rec Ruv Ruv Rec Ypg Pri
N Q X
A
G A
B
C U F
A
NHEJ
Anti-Rekombination
Sbc
ku
lig
Mut
B C D S2
E. c.
P. p.
S.t.
D. r.
M. t.
S. c.
B. s.
Die Tabelle zeigt das Vorkommen assoziierter Gene der DNA-Reparatur/homologen
Rekombination in verschiedenen Genomen (Rocha et al. 2005). Schwarz markierte
Kästchen bedeuten das Vorkommen orthologer Gene, graue eine geringere Sequenzübereinstimmung. Für weiße Kästchen wurden keine orthologen Gene gefunden. Die ausgewählten Genome sind von Escherichia coli (E. c.), Pseudomonas putida (P. p.), Salmonella typhimirium (S. t.), von dem für sein besonders stabiles Genom
bekannten Deinococcus radiodurans (D. r.), von den Actinomyceten Mycobacterium
tuberculosis (M. t.) und Streptomyces coelicolor (S. c.), sowie von Bacillus subtilis
(B. s.).
Bei der Genauswahl für die Deletionen dieser Arbeit wurde darauf Wert gelegt, ein
möglichst breites Spektrum an Genen zu wählen, bei dem jeder Reparaturweg mindestens einmal betroffen ist.
45
S1
L
Material und Methoden
3
MATERIAL UND METHODEN
3.1
Materialien
3.1.1 Antibiotika
Ampicillin
Chloramphenicol
Kanamycin
Nourseothricin
Thiostrepton
Zeocin
Roth GmbH
Roche Diagnostics GmbH
Sigma Chemie GmbH
WERNER BioAgents, Jena
Höchst AG
Invitrogen
3.1.2 Enzyme
Die zur DNA-Amplifikation verwendeten Polymerasen wurden von Promega (PfuPolymerase), Biomaster (Taq-Polymerase) und Fermentas (High Fidelity PCR Enzyme Mix) bezogen. Die eingesetzten Restriktionsendonukleasen waren von Roche
und New England BioLabs. Alkalische Phosphatase, Klenow-Polymerase und T4DNA-Ligase wurden von Roche bezogen.
3.1.3 Chemikalien
Die verwendeten Chemikalien sind erhältlich bei Merck, Fluka BioChemika, Roth
GmbH, Sigma Chemie GmbH, Serva Feinbiochemika, Difco Labratories, BMA (BioWhittaker Molecular Applications) und Biorad.
3.1.4 Kits
Plasmide wurden mit dem „QIAprep Miniprep Kit“ von Qiagen isoliert und zur Aufreinigung von PCR-Produkten oder geschnittenen Plasmid-Fragmenten wurde das
„GFXTM PCR and Gel Band Purification Kit“ von GE Healthcare verwendet. Chromosomale DNA wurde alternativ zur Dichtegradientenzentrifugation mit dem „DNeasy
Blood and Tissue Kit“ von Qiagen isoliert.
3.2
Bakterielle Plasmide und Stämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Plasmide und Stämme sind in den folgenden Tabellen aufgelistet. Die vorgefertigten Plasmide (Tabelle 3) wurden gestellt. Darauf aufbauend entstanden in dieser Arbeit neue Plasmide (Tabelle 4) mit dem Kürzel pLIG
(Plasmid von Lisa Grundmann). Die genutzten Stämme finden sich in Tabelle 5.
46
Material und Methoden
Tabelle 3:
Vorgefertigte Plasmide
Plasmid
pJOE230.1
pJOE773.2
Eigenschaften
Thiostreptonresistenzgen aus pIJ702 in
pHP45mega
Positiver Selektionsvektor
pJOE1082.1 Shuttlevektor aus pIC19 und pGM11
pJOE4042.1 Expressionsvektor mit Rhamnose-Promotor
pJOE4602.1 Expressionsvektor mit Rhamnose-Promotor
pJOE4786.1 Positiver Selektionsvektor
pJOE4908.1 Vektor mit Kanamycinresistenzgen
pJOE4928.1 Positiver Selektionsvektor mit Kanamycinresistenzgen und lacZ
pIC20HE
Klonierungsvektor mit MCS in lacZ
Resistenz
AmpR, ThioR
AmpR
Referenz
Altenbuchner
AmpR
Marsch et al.
1984
WERNER BioAgents
Haug 2003
Altenbuchner
et al. 1992
AmpR, KmR Volff und Altenbuchner 1997 b
AmpR
Altenbuchner
AmpR
Altenbuchner
AmpR
Jeske und Altenbuchner 2010
KmR
Altenbuchner
KmR
Altenbuchner
pINS
Vektor mit Nourseothricinresistenzgen
pFIS244b
Derivat
des
positive
Selektionsvektors AmpR
pJOE773.2 mit Replikationsregion von SCP2*,
zwei Kopien der parS-site, mrpA, mrpS
Tabelle 4:
NourR
In dieser Arbeit entstandene Plasmide
Plasmid
Ursprungsvektor1
Primer3
(ggf. aus Vektor) Regeschnitten mit4 sistenz
pLIG01.1
pLIG03.7
pLIG12.1
pLIG13.1
pLIG14.1
pLIG16.1
pLIG17.1
pLIG18.3
pJOE4928.1
pLIG01.1
pIC20HE
pIC20HE
pIC20HE
pLIG12.1
pLIG13.1
pLIG14.1
MCS aus pJOE4786.1
recF` -Genfragment
5`+ 3` Region recD
5`+ 3` Region recF
5`+ 3` Region ku+lig
nat1
nat1
nat1
S4313, S4314
S4345 - S4348
S4353 - S4356
S4341 - S4344
S4357, S4358
S4357, S4358
S4357, S4358
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recD
-
pLIG21.4
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recF
-
pLIG22.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region ku+lig
-
pLIG25.1
pLIG26.1
pLIG27.1
pLIG28.1
pLIG29.1
pLIG30.1
pLIG31.1
pLIG32.1
pIC20HE
pIC20HE
pIC20HE
pIC20HE
pLIG25.1
pLIG26.1
pLIG27.1
pLIG28.1
5`+ 3` Region recG
5`+ 3` Region recN
5`+ 3` Region ruvABC
5`+ 3` Region recQ
nat1
nat1
nat1
nat1
S4426 - S4429
S4430 - S4433
S4434 - S4437
S4438 - S4441
S4357, S4358
S4357, S4358
S4357, S4358
S4357, S4358
pLIG33.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recG
-
 HindIII:blunt
blunt
 HindIII
 HindIII
 HindIII
 PacI
 PacI
 PacI
pLIG16.1
 HindIII
pLIG17.1
 HindIII
pLIG18.3
 HindIII
 HindIII
 HindIII
 HindIII
 HindIII
 PacI
 PacI
 PacI
 PacI
pLIG29.1
 HindIII
pLIG20.1
Insert2
Km
Km
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
47
Material und Methoden
Tabelle 4:
Fortsetzung: In dieser Arbeit entstandene Plasmide
Plasmid
Ursprungsvektor1
pLIG34.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recN
pLIG35.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region
ruvABC
pLIG36.2
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recQ
pLIG40.1
pLIG41.1
pLIG44.1
pLIG45.1
pIC20HE
pIC20HE
pLIG40.1
pLIG41.1
5`+ 3` Region uvrB
5`+ 3` Region recO
nat1
nat1
pLIG48.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region uvrB
pLIG49.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recO
pLIG58.1
pLIG60.2
pLIG62.1
pIC20HE
pLIG58.1
pJOE1082.1
5`+ 3` Region alkB
nat1
5`-nat1-3` Region alkB
Insert2
pLIG63 .9 pIC20HE
5`+ 3` Region recR
pLIG71.1
pLIG63.9
nat1
pLIG73.1
pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region recR
pLIG90.1
pLIG92.1
pLIG96.7
pLIG104.1
pLIG105.3
pLIG106.3
pLIG107.1
pLIG108.3
pLIG109.3
pLIG111.1
pJOE4042.1
pJOE4042.1
pJOE4602.1
pIC20HE
pIC20HE
pIC20HE
pIC20HE
pLIG104.1
pLIG105.3
pLIG107.1
recD
recF
recD
5`+3` Region 3maDG
5`+3` Region mutM
5`+3` Region ung1
5`+3` Region ung2
nat1
nat1
nat1
5`-nat1-3` Region
3maDG
pLIG112.1 pJOE1082.1
pLIG113.2 pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region mutM
pLIG114.7 pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region ung2
pLIG116.1 pLIG106.1
nat1
pLIG117.1 pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region ung1
pLIG147.1 pJOE4042.1
pLIG148.1 pJOE4602.1
pLIG155.1
pLIG157.1
pLIG158.1
pLIG160.1
pLIG162.1
pLIG163.1
pJOE4602.1
pJOE4042.1
pJOE4602.1
pJOE4042.1
pIC20HE
pLIG162.1
Kanamycinpromotor
aus pJOE4908.1
Kanamycinpromotor
aus pJOE4908.1
recO
recO
recR
recR
5`+3` Region exoIII
nat1
Primer3
(ggf. aus Vektor) Regeschnitten mit4 sistenz
pLIG30.1
 HindIII
pLIG31.1
 HindIII
pLIG32.1
 HindIII
S4498 - S4501  HindIII
S4502 - S4505  HindIII
S4357, S4358  PacI
S4357, S4358  PacI
pLIG44.1
 HindIII
pLIG45.1
 HindIII
S4506, S4509  HindIII
S4357, S4358  PacI
 HindIII
S4663/4,
 HindIII
S4556/7
S4357, S4358  PacI
pLIG71.1
 HindIII
S4808, S4810  NdeI, HindIII
S4812, S4813  NdeI, HindIII
S4824, S4810  BglII, HindIII
S4875 - S4878  HindIII
S4879 - S4882  HindIII
S4883 - S4886  HindIII
S4887 - S4890  HindIII
S4357, S4358 pLIG45.2  PacI
S4357, S4358 pLIG45.2  PacI
S4357, S4358 pLIG45.2  PacI
pLIG108.3
 HindIII
pLIG109.3
 HindIII
pLIG111.1
 HindIII
S4357, S4358 pLIG45.2  PacI
pLIG116.1
 HindIII
-
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Km,
Nour
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
S5002, S5003
 MunI, NdeI
Amp
S5002, S5003
 MunI, NdeI
Amp
S5045, S5046
S5047, S5046
S5049, S5050
S5051, S5050
S5037 - S5040
S4357, S4358
 BamHI, HindIII
 NdeI, HindIII
 BamHI, HindIII
 NdeI, HindIII
 HindIII
pLIG45.2  PacI
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
48
Material und Methoden
Tabelle 4:
Plasmid
Fortsetzung: In dieser Arbeit entstandene Plasmide
Ursprungsvektor1
Insert2
pLIG178.1 pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region exoIII
pLIG179.1 pFIS244b
pLIG184.1 pLIG179.1
Pr.-6-PGDH-recF
5`+ 3` Region
6-PGDH-recF
pLIG190.4 pIC20HE
pLIG191.1 pLIG184.1
tsr
pLIG194.1 pLIG190.4
nat1
5`-nat1-3` Region 6PGDH-recF
5`+ 3` Region dut
recF
recO
recR
recD
nat1
recR
recO
pLIG199.1 pJOE1082.1
pLIG208.1
pLIG211.2
pLIG212.1
pLIG213.1
pLIG214.4
pLIG220.1
pLIG221.1
pLIG222.1
pIC20HE
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG208.1
pLIG148.1
pLIG148.1
pLIG224.3 pJOE1082.1
5`-nat1-3` Region dut
pLIG226.1
pLIG227.1
pLIG237.1
pLIG238.1
pLIG284.1
pLIG294.1
pLIG295.1
pLIG296.1
pLIG297.1
pLIG304.1
recF
recF
recF
recD
5`+ 3` Region sbcCD
recF (aus E. coli)
recO (aus E. coli)
recR (aus E. coli)
recD (aus E. coli)
nat1
pLIG147.1
pLIG148.1
pJOE4602.1
pLIG148.1
pIC20HE
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG147.1
pLIG284.1
pLIG306.1 pJOE1082.1
5`-nat1-3` sbcCD
Primer3
(ggf. aus Vektor) Regeschnitten mit4 sistenz
S5119, S5120
pLIG163.1
 HindIII
Religation
 HindIII
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
S5121 - 5124
 HindIII
Amp
-
S4357, S4358
S5255, S5258
S4812, S4813
S5047, S5046
S5051, S5050
S4808, S4810
S4357, S4358
S5049, S5050
S5045, S5046
S4812, S4813
S5314, S4813
S5314, S4813
S4824, S4810
S5550, S5553
S5500, S5501
S5502, S5503
S5504, S5505
S5506, S5507
S4357, S4358
-
pJOE230.1
 SmaI
pLIG45.2  PacI
pIG194.1
 HindIII
 BamHI
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
pLIG45.2  PacI
 BamHI, HindIII
 BamHI, HindIII
pLIG220.1
 BamHI
 NdeI, HindIII
 BamHI, HindIII
 BamHI, HindIII
 BglII, HindIII
 HindIII
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
 NdeI, HindIII
pLIG45.2  PacI
pIG304.1
 HindIII
Amp, Thio
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp
Amp
Amp, Km,
Nour
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp
Amp, Nour
Amp, Km,
Nour
1
: Der Ursprungsvektor gibt den Vektor an, mit dem das Insert ligiert wurde. 2: Bei dem Insert
handelt es sich entweder um ein PCR-Fragment oder ein Fragment aus einem anderen
Plasmid. 3: Wurde ein PCR-Fragment verwendet, werden hier die Primer aufgeführt. 4: Es
werden die Restriktionsschnittstellen angegeben, die beim Insert genutzt wurden. Gegebenenfalls wird auch der Vektor aufgeführt, aus dem das Insertionsfragment stammt.
Tabelle 5:
Relevante Stämme
Stammname
Eigenschaften
Referenz
Escherichia coli
E. coli K12 JM109
E. coli S17.1
recA1, supE44, endA1, hsdR17, gyrA96, relA1, Yanisch-Perron et al.
thi, (lac-proAB), F`[traD36, proAB, lacIq, lacZ, 1985
M15]
TpR, SmR, recA, thi, pro, hsdR-M+RP4: 2- Simon et al. 1983
Tc::Mu, Km::Tn7
49
Material und Methoden
Tabelle 5:
Fortsetzung: Relevante Stämme
Stammname
Eigenschaften
Referenz
CL1 (HL812 bzw.
SR108)
-, thyA36, deoC2, IN(rmD-rmE)1, rph
Courcelle und
Hanawalt 1999
CL4 (oder HL923)
-, thyA36, deoC2, IN(rmD-rmE)1, rph, argA81::Tn10 (TetR), recD1011
-, thyA36, deoC2, IN(rmD-rmE)1, rph,
tnaA300::Tn10 (TetR), recF349
-, thyA36, deoC2, IN(rmD-rmE)1, rph, recR6212
(sub cat883 for cdn4-182)
-, thyA36, deoC2, IN(rmD-rmE)1, rph,
recO1504::Tn5 (KanR)
Courcelle und
Hanawalt 1999
Courcelle und
Hanawalt 1999
Courcelle und
Hanawalt 1999
Courcelle und
Hanawalt 1999
Escherichia coli
CL5 (oder HL919)
CL544
CL584
Streptomyces lividans
spc-1 SLP2- SLP3pro-2 str-6 SLP2- SLP3-
TK23
TK64
3.3
Hopwood et al. 1983
Hopwood et al. 1983
Oligonukleotide
Die unmarkierten Oligonukleotide wurden von der MWG-Biotech AG geliefert und für
die Genamplifikation mittels PCR oder Sequenzierungen eingesetzt. Die Stammlösung wurde jeweils auf eine Konzentration von 100 pmol/µl eingestellt. In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide sind in der folgenden Tabelle aufgeführt.
Tabelle 6:
Verwendete Oligonukleotide
Name
Sequenz in 5`-> 3`-Richtung
Gen/Richtung/Zweck
S0988
AGGCTGAAAATCTTCTCT
S1095
GGCCCATTTTCCTGTCAGT
S4311
S4312
S4313
TTCCTCACCGCCGACAAGA
Sequenzierung pJOE4042.1/
pJOE4602.1
Sequenzierung pJOE4042.1/
pJOE4602.1
recD-v Genfragment
CTTGTTGGCGAGGAGCAGA
recD-r Genfragment
AAGACGAACCTGGTCGAGG
recF-v Genfragment
S4314
AGCTTGAGCAGCAGGTCGT
recF-r Genfragment
S4317
CGATCGAGATCGTCGCCTT
ku-v Genfragment
S4318
CCTTGGCCGTCGACTTCTT
ku-r Genfragment
S4341
aacccAAGCTTATGGACGGACTGCGCGT
5R-v ku+lig (HindIII)
S4342
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAACGTCGGACG
5R-r ku+lig (PacI + kompl. zu 3R-v)
GCGGGT
S4343
GTAGGGTAGCTAGGCTAGAAGACGGCGGCCGGGA
3R-v ku+lig (kompl. zu 5R-r)
S4344
ttcccAAGCTTCGGTGCGCGAACCCGA
3R-r ku+lig (HindIII)
S4351
GTAGGGTAGCTAGGCTAGAGGACGCCTTCGAGGGT
3R-v recD (kompl. zu 5R-r)
S4352
ttcccAAGCTTCACTGCAACTTTTCAGGGT
3R-r recD (HindIII)
50
Material und Methoden
Tabelle 6:
Fortsetzung: Verwendete Oligonukleotide
Gen/Richtung/Zweck
Name
S4353
Sequenz in 5`-> 3`-Richtung
AACCCAAGCTTCTTTCTGGCACAGCACGA
S4354
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAGTATGAGCGC
5R-r recF (PacI + kompl. zu 3R-v)
GGACGCA
S4355
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCGAACGGAAGTCGGCCA
3R-v recF (kompl. zu 5R-r)
S4356
TTCCCAAGCTTCCTTGCCACCTCGCACA
3R-r recF (HindIII)
S4357
AACCCTTAATTAAGAGGTGTACCGGAAGGT
nat1+P-v (PacI)
S4358
TTCCCTTAATTAACTAGGGGCAGGGCATGCT
nat1+P-r (PacI)
S4359
aacccAAGCTTGCTGTCCTGGTAGAAGGT
5R-v recD (HindIII)
S4360
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACCCACGCGTA
5R-r recD (PacI + kompl. zu 3R-v)
CGCGGT
S4426
AACCCAAGCTTCGAGGTGATCTACCTCCT
S4427
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAATTGCACACC
5R-r recG (PacI + kompl. zu 3R-v)
ACGCCACT
S4428
GTAGGGTAGCTAGGCTAGTACCTGGAGAAGGGCTGA 3R-v recG (kompl. zu 5R-r)
S4429
TTCCCAAGCTTCGTAGTCGAAGTCGCTGA
3R-r recG (HindIII)
S4430
AACCCAAGCTTAGTTCGGCCCGGACCTT
5R-v recN (HindIII)
S4431
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAACGCGTCCGG
5R-r recN (PacI + kompl. zu 3R-v)
GAACTCT
S4432
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGCGACCGTATCCGCATC
3R-v recN (kompl. zu 5R-r)
S4433
TTCCCAAGCTTATCGGCGTACGGGTCCT
3R-r recN (HindIII)
S4434
AACCCAAGCTTCGATCAGGATCAGGGCCA
5R-v ruvABC (HindIII)
S4435
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAATTGTTCGGGG 5R-r ruvABC (PacI + kompl. zu 3Rv)
CGTGACGA
5R-v recF (HindIII)
5R-v recG (HindIII)
S4437
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCCCACTCGTCGATCACCT 3R-v ruvABC (kompl. zu 5R-r)
TTCCCAAGCTTGTCGTTCCACCCGGAACT
3R-r ruvABC (HindIII)
S4438
AACCCAAGCTTCACGAGCGAACAGCGCAA
S4439
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAGTCCATGCCC
5R-r recQ (PacI + kompl. zu 3R-v)
CCATGCAA
S4440
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCCTGCTCGTCGACGACTT 3R-v recQ (kompl. zu 5R-r)
S4441
TTCCCAAGCTTCTCCCTCGGAAGCATCCT
3R-r recQ (HindIII)
S4498
AACCCAAGCTTCCCCCTGTGTCATTCGTC
5R-v uvrB (HindIII)
S4499
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACAGATCGAGG
5R-r uvrB (PacI + kompl. zu 3R-v)
ACCTCACC
S4500
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCGTGCGTTCGATCTGGG
3R-v uvrB (kompl. zu 5R-r)
S4501
TTCCCAAGCTTGGGCGCACATCAGGAGAA
3R-r uvrB (HindIII)
S4502
AACCCAAGCTTCCCCTGTATCGGCCTGAA
5R-v recO (HindIII)
S4503
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACCTGCGGTAC
5R-r recO (PacI + kompl. zu 3R-v)
GTCGAGAA
S4436
S4504
S4505
5R-v recQ (HindIII)
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGCTCATGCCGCCCATTCT 3R-v recO (kompl. zu 5R-r)
TTCCCAAGCTTGTCCGGCTTGAAGGGGTT
3R-r recO (HindIII)
51
Material und Methoden
Tabelle 6:
Fortsetzung: Verwendete Oligonukleotide
Gen/Richtung/Zweck
Name
S4506
Sequenz in 5`-> 3`-Richtung
AACCCAAGCTTACTGCTGGAGCAGGGACA
S4507
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAACATCACGCT
5R-r alkB (PacI + kompl. zu 3R-v)
CCGGGTCA
S4508
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCGTCCATGTCCCCATCCT 3R-v alkB (kompl. zu 5R-r)
S4509
TTCCCAAGCTTCTGGAACGACTCGTCGGT
3R-r alkB (HindIII)
S4554
AACCCAAGCTTACGCACAACCCTTGCGG
5R-v recR (HindIII)
S4555
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACCTTCGAGGG
5R-r recR (PacI + kompl. zu 3R-v)
GAGACGA
S4556
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGTCCTGGACCACGCCTT
3R-v recR (kompl. zu 5R-r)
S4557
TTCCCAAGCTTATACCAGGCCGCCGTGT
3R-r recR (HindIII)
S4631
TGACCATCACGGACGGCA
recG-v Genfragment
S4632
TGGCGGTCATGACGAGCA
recG-r Genfragment
S4633
ATCACGCGCGACAGCTCA
recN-v Genfragment
S4634
GCTGAAGCTGAACCGGCA
recN-r Genfragment
S4635
AACTCGCCCAGGTCCTTC
ruvABC-v Genfragment
S4636
CTCGCCATCTGCCACATC
ruvABC-r Genfragment
S4637
GGTCCTCGGCCATCTTCT
uvrB-v Genfragment
S4638
CCTCCGTGTCCTGCATCT
uvrB-v Genfragment
S4639
GCCTAGAAGCCACTGACC
alkB-v Genfragment
S4640
ACTGGTACCCGTACGGCT
alkB-r Genfragment
S4702
CCGGGATCATCTACACCC
recQ-v Genfragment
S4703
ATGTCCGACAGCCTTCCC
recQ-r Genfragment
S4746
AGTGCAGGTAGGCGGAGA
recO-v Genfragment
S4747
CATGAGCCTGTTCCGCGA
recO-r Genfragment
S4748
GACCCGGAGCGTGATGTT
alkB-v Genfragment
S4749
ACTGGTACCCGTACGGCT
alkB-r Genfragment
S4808
aaaaaCATATGCCCACCCAGCCCCCCG
recD-v (NdeI, N-term mit ATG)
S4810
aaaaaAAGCTTTCAggtccggggccccgcca
recD-r (HindIIII, ohne Strep-Tag)
S4812
aaaaCATATGCACGTCACGCATCTGTC
recF-v (NdeI, N-term mit ATG)
S4813
aaaaAAGCTTTCATACGCGCTCCACCGTGC
recF -r (HindIII, ohne Strep-Tag)
S4824
aaaaaAGATCTATGCCCACCCAGCCCCCCG
recD-v (BglII, N-term Strep-Tag)
S4875
AACCCAAGCTTGAAGGCCGTCATCCCTCA
5R-v 3maDG (HindIII)
S4876
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACGGTGACCAG
5R-r 3maDG (PacI+kompl. zu 3R-v)
GTACGGAA
5R-v alkB (HindIII)
S4878
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGGGCGGTCGAAGAATTCC 3R-v 3maDG (kompl. zu 5R-r)
TTCCCAAGCTTTCGGTCACCTCGGTACCT
3R-r 3maDG (HindIII)
S4879
AACCCAAGCTTAACAAGCGCCAGGTCCTC
S4880
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACCGTACGACC
5R-r mutM (PacI + kompl. zu 3R-v)
TCTACCTC
S4881
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCGTGGATGAACCGCTCCA 3R-v mutM (kompl. zu 5R-r)
S4877
5R-v mutM (HindIII)
52
Material und Methoden
Tabelle 6:
Fortsetzung: Verwendete Oligonukleotide
Name
S4882
Sequenz in 5`-> 3`-Richtung
TTCCCAAGCTTGGACACCGTCGAAGACCA
Gen/Richtung/Zweck
S4883
AACCCAAGCTTCTGGGAGTTCGACGAGAG
5R-v ung1 (HindIII)
S4884
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAGCCCATCGAG
5R-r ung1 (PacI + kompl. zu 3R-v)
GTGATCTG
3R-r mutM (HindIII)
S4886
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGCCAACGACCTGCTGATG 3R-v ung1 (kompl. zu 5R-r)
TTCCCAAGCTTGACCGGTTCTCAGCCGTT
3R-r ung1 (HindIII)
S4887
AACCCAAGCTTGAACACGCCACCGGAGAA
S4888
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAGTTAGCGTCG
5R-r ung2 (PacI + kompl. zu 3R-v)
TCGGGACA
S4889
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCAGCATGGCGATGTCGGT 3R-v ung2 (kompl. zu 5R-r)
S4890
TTCCCAAGCTTCCGAACGGCAGAACAAGG
3R-r ung2 (HindIII)
S4981
TCCGTTCCGTACCTGGTC
3maDG-v Genfragment
S4982
TCCGATCACCCTCCGTCT
3maDG-r Genfragment
S4983
CTGAAGGACCACCGCATC
mutM-v Genfragment
S4984
GTCCGCGTAGATGTTGCC
mutM-r Genfragment
S4985
TCCTGATCGTCGGACAGG
ung1-v Genfragment
S4986
GCATCAGCAGGTCGTTGG
ung1-r Genfragment
S4987
GTCGATCAGCGGCAGCTT
ung2-v Genfragment
S4988
TGGAGTTCGTCGAGGAGG
ung2-r Genfragment
S5002
aaaaaCAATTGATGTCAGCTACTGGGCTA
Kanamycinpromotor-v
S5003
aaaaaCATATGAAACGATCCTCATCCTGT
Kanamycinpromotor-r
S5037
AACCCAAGCTTCCGGGCGAGATCAAGGAA
5R-v exoIII (HindIII)
S5038
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAGGGCGGTGAT
5R-r exoIII (PacI + kompl. zu 3R-v)
CGAGTTCA
S4885
5R-v ung2 (HindIII)
S5040
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGTCACCGACTCCTACGTC 3R-v exoIII (kompl. zu 5R-r)
TTCCCAAGCTTGGACGTCGAACTGCTGTC
3R-r exoIII (HindIII)
S5045
aaaaaGGATCCATGGGCGGCATGAGCCTGT
recO-v (BamHI, N-term Strep-Tag)
S5046
S5047
S5049
aaaaaAAGCTTCTACTTCTCGACGTACCGCA
aaaaaCATATGGGCGGCATGAGCCTGT
aaaaaGGATCCATGTACGAAGGCGTGGTCC
recO-r (HindIIII, ohne Strep-Tag)
S5050
aaaaaAAGCTTCTAGACATCTAGGAGTCGTCTC
recR-r (HindIIII, ohne Strep-Tag)
S5051
aaaaaCATATGTACGAAGGCGTGGTCC
recR-v (NdeI, N-term mit ATG)
S5108
CCGAGGAGAAGCTGATC
Seq. recD mittig bindend
S5119
AACCCAAGCTTGAGCGGCTGAGCGGCTGA
S5120
AACCCAAGCTTTCATACGCGCTCCACCGT
S5121
AACCCAAGCTTGTGGAACGCGACGTACTC
S5122
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAATCAGCCGCTC
5R-r P.6-PGDHrecF
AGCCGCAC
S5039
recO-v (NdeI, N-term mit ATG)
recR-v (BamHI, N-term Strep-Tag)
Komplementation
(Promotor6-PGDHrecF)-v
Komplementation
(Promotor6-PGDHrecF)-r
5R-v P.6-PGDHrecF
53
Material und Methoden
Tabelle 6:
Fortsetzung: Verwendete Oligonukleotide
Name
S5123
Sequenz in 5`-> 3`-Richtung
Gen/Richtung/Zweck
GTAGGGTAGCTAGGCTAGCGTATGAGCGCGGACGCA 3R-v P.6-PGDHrecF
S5124
TTCCCAAGCTTCAGCGTTGCTCAGCTAGTC
3R-r P.6-PGDHrecF
S5188
CATAGGCTTCGTCGACTG
Seq. P.6-PGDHrecF 1
S5189
CGTACATCAGCGCGTAGC
Seq. P.6-PGDHrecF 2
S5206
ATGCACGTCACGCATCTG
Seq. P.6-PGDHrecF 3
S5207
GACGATGGACCTGTCCAC
Seq. P.6-PGDHrecF 4
S5255
AACCCGGATCCTACAGGTACGGAGTCGGGT
5R-v dut (BamHI)
S5256
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACTCACGGGTT
5R-r dut (PacI + kompl. zu 3R-v)
CACCTCGAA
S5257
GTAGGGTAGCTAGGCTAGAACTGGTCGTCCAGCAGG
3R-v dut (kompl. zu 5R-r)
T
S5258
TTCCCGGATCCGTGACCACCTGGGTCATGT
3R-r dut (BamHI)
S5314
aaaaaGGATCCATGCACGTCACGCATCTGTC
recF-v (BamHI, N-term Strep-Tag)
S5412
TGGAACGGAGTGGCGGTG
exoIII-v Genfragment
S5413
CATGCCGCGGTTCTTGGG
exoIII-r Genfragment
S5414
CACCCACGTTCCGGACTG
dut-v Genfragment
S5415
AGTTCCGCGACCTGACGG
dut-r Genfragment
S5500
aaaaCATATGTCCCTCACCCGCTTG
recF-v aus E. coli
S5501
aaaaAAGCTTTTAATCCGTTATTTTACC
recF-r aus E. coli
S5502
aaaaCATATGGAAGGCTGGCAGCGC
recO-v aus E. coli
S5503
aaaaAAGCTTTTATTCATAATGTGTTTTC
recO-r aus E. coli
S5504
aaaaCATATGCAAACCAGCCCGCTG
recR-v aus E. coli
S5505
aaaaAAGCTTTTAAAAAACGAATCTTATG
recR-r aus E. coli
S5506
aaaaCATATGAAATTGCAAAAGCAA
recD-v aus E. coli
S5507
aaaaAAGCTTTTATTCCCGTGAACTAAA
recD-r aus E. coli
S5550
AACCCAAGCTTTGACGGGGTACCCGAGTT
5R-v sbcCD (HindIII)
S5551
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAACGCTCAACTC
5R-r sbcCD (PacI + kompl. zu 3R-v)
GAGGTCGT
S5552
GTAGGGTAGCTAGGCTAGGTCGGACGTGTGCAGCAA 3R-v sbcCD (kompl. zu 5R-r)
S5553
TTCCCAAGCTTGGGTGTGCACGAAACCGA
3R-r sbcCD (HindIII)
S5769
ACGCAGTTGCTCGGGATG
sbcCD-v Genfragment
S5770
TGCAGCCGCTGTTCCTTG
sbcCD-r Genfragment
* Der Zusatz v hinter einer Primerbezeichnung steht für den Vorwärts-Primer
** Der Zusatz r hinter einer Primerbezeichnung steht für den Rückwärts-Primer
54
Material und Methoden
3.4
Medien, Puffer und Lösungen
3.4.1 Medien
Medien zur Kultivierung und Transformation von E. coli
LB0
Trypton
Hefeextrakt
NaCl
H2O (Leitungswasser)
10 g
5 g
5 g
ad 1000 ml
pH-Wert auf 7,2 einstellen
autoklavieren
LB0-Platten
Zusammensetzung s. LB0
6,4 Euroagar / 400 ml Medium
TSS
LB0 (pH 6,5)
80 ml
(transformation and storage solution)
PEG 6000
DMSO
10 g
5 ml
1 M MgCl2
autoklavieren
5 ml
bei 4°C lagern
TY
Trypton
Hefeextrakt
H2O
10 g
5 g
ad 1000 ml
pH-Wert auf 7,2 einstellen
autoklavieren
Glycerinkulturmedium
TY, pH 7,2 steril
42,5 ml
Glycerin 87 % steril
57,5 ml
getrennt autoklavieren
Medien zur Kultivierung und Transformation von Streptomyceten
HT
Hefeextrakt
Beefextrakt
Dextrine
NZ Amine TypA
.
CoCl2 7 H2O [20 g/l]
H2O (heißes Leitungswasser)
pH-Wert auf 7,3 einstellen (NaOH)
1 g
1 g
10 g
2 g
1 ml
ad 1000 ml
8 g Euroagar / 400 ml Medium
autoklavieren
55
Material und Methoden
R2 (Hopwood et al. 1985)
Sucrose
41,2 g
K2SO4
0,1 g
.
MgCl2 6H2O
Glucose
4,05 g
4 g
Casamino-Acids (Vitamin-frei)
H2O
0,04 g
ad 320 ml
+ 8,8 g Difco Bacto-Agar
nach dem Autoklavieren zugeben:
0,5 % KH2PO4
4 ml
.
3,68 % CaCl2 2H2O
20 % L-Prolin
32 ml
6 ml
0,25 M TES-Puffer pH 7,2
Spurenelement-Lösung
40 ml
0,8 ml
1 M NaOH
10 % Hefeextrakt
2 ml
20 ml
R2-Softagar (0,8 %)
Zusammensetzung s. R2
statt Agar 0,64 g LMP-Agarose pro 80 ml
M40
Asparagin
1,5 g
KH2PO4
1 g
.
0,5 g
3,5 g
MgSO4 7H2O
(NH4)SO4
H2O (warmes Leitungswasser)
pH-Wert auf 7,2 einstellen (NaOH)
ad 1000 ml
+NaCl 10 %
.
+CaCl2 2H2O 10 %
1 ml
1 ml
+Spurenelement-Lösung
1 ml
(8 g Difco-Agar / 400 ml Medium)
nach dem Autoklavieren zugeben:
Glycerin 20 %
MS-Platten
Mannitol
Soja-Pepton
H2O
4 ml pro 400 ml Medium
20 g
20 g
ad 1000 ml
8 g Euroagar / 400 ml Medium
autoklavieren
YEME (Hopwood et al. 1985)
Hefeextrakt
Pepton
2,4 g
4 g
Malzextrakt
Glucose
2,4 g
8 g
Sucrose
H2O (warmes Leitungswasser)
216 g
ad 800 ml
in 400 ml Aliquots aufteilen
nach dem Autoklavieren zugeben pro 400 ml
10 % Glycin
20 ml
1 M MgCl2
2 ml
56
Material und Methoden
L-Medium
Sucrose
10,3 g
K2SO4
0,025 g
MgCl2
Spurenelement-Lösung
0,203 g
0,2 ml
H2O
ad 80 ml
nach dem Autoklavieren zu 80 ml zugeben:
0,5 % KH2PO4
3,68 % CaCl2
0,25 M TES pH 7,2
1 ml
1 ml
10 ml
H2O
P-Medium
9 ml
Grundlösung s. L-Medium
nach dem Autoklavieren zu 80 ml zugeben:
0,5 % KH2PO4
T-Medium
1 ml
3,68 % CaCl2
0,25 M TES pH 7,2
10 ml
10 ml
PEG 1000
2,5 g
autoklavieren
vor Gebrauch schmelzen und folgende Reagenzien zugeben:
2,5 % Sucrose
7,5 ml
0,5 % KH2PO4
2,5 % K2SO2
0,1 ml
0,1 ml
1 M MgCl2
5 M CaCl2
0,1 ml
0,2 ml
1 M Tris/Maleinsäure
0,5 ml
3.4.2 Puffer und Lösungen
10x Auftragspuffer für DNAAgarosegelelektrophorese
Xylencyanol
0,25 % (w/v)
Bromphenolblau
Glycerin
0,25 % (w/v)
50 %
0,5 M EDTA pH 8
ad 200 ml
Coomassie-Färbelösung
Coomassie R250
2 g
für SDS-PAGE
Coomassie G250
EtOH
0,5 g
425 ml
MeOH
Eisessig
50 ml
100 ml
H2O
425 ml
EtOH
450 ml
Eisessig
H2O
100 ml
450 ml
Entfärberlösung für SDS-PAGE
57
Material und Methoden
10x Ligase-Puffer
Lysepuffer Bio-Feedback
1 M Tris pH 7,9
660 µl
1 M MgCl2
100 µl
1 M DTT
1 M ATP
100 µl
10 µl
H2O
ad 1 ml
20 % Glucose
2 M Tris/HCl pH 8,0
22,7 ml
6,25 ml
EDTA pH 8,0
10 ml
H2O
autoklavieren
461 ml
vor Gebrauch zu 5 ml Lysepuffer:
Lysozym
5x SDS-PAGE-Auftragspuffer
10 mg/ml RNase I
125 µl
Tris/HCl pH 6,8
250 mM
EDTA
SDS
10 mM
5 % (w/v)
-Mercaptoethanol
10x SDS-PAGE-Laufpuffer
5 % (w/v)
Glycerin
50 % (w/v)
Bromphenolblau
0,1 % (w/v)
Tris Base
30 g
Glycin
SDS
144 g
10 g
H2O
Spurenelement-Lösung für R2
50 mg
ad 1000 ml
ZnCl2
40 mg
3+
.
Fe Cl3 6 H2O
.
CuCl2 2 H2O
.
MnCl2 4 H2O
.
Na2B4O7 10 H2O
.
(NH4)6Mo7O24 4 H2O
H2O
200 mg
10 mg
10 mg
10 mg
10 mg
ad 1000 ml
autoklavieren
SDS-PAGE Trenngel 12 %ig
1,5 M Tris/HCl pH 8,8
H2O
10 % SDS
30 % Acrylamidlösung
10 % APS
Temed
2,5 ml
3,35 ml
100 µl
4 ml
50 µl
5 µl
58
Material und Methoden
SDS-PAGE Sammelgel 3 %ig
TAE 50Puffer
0,5 M Tris/HCl pH 6,8
625 µl
H2O
1,5 ml
10 % SDS
30 % Acrylamidlösung
25 µl
335 µl
10 % APS
Temed
25 µl
2,5 µl
Tris
242 g
0,5 M EDTA pH 8,0
100 ml
Eisessig
H2O
TAE-Laufpuffer für Agarosegele
57,1 ml
ad 1000 ml
50 ml
TAE 50Puffer
H2O
TE 10.01
2450 ml
Ethidiumbromid 10 mg/ml
100 µl
2 M Tris/HCl pH 8,0
0,5 M EDTA pH 8,0
5 ml
0,2 ml
H2O
Tris/Maleinsäurelösung
ad 1000 ml
1 M Tris-Lösung
1 M Maleinsäure
auf pH 8,0 titrieren
autoklavieren
Zusätze
Stammlösung
Endkonzentration
[mg/ml]
Thymin
4
Arginin
Tryptophan
erwärmen
50
5
[µg/ml]
10
50
25
gelöst in H2O mp, sterilfiltriert
3.4.3 Antibiotika
Antibiotika
Konzentration der Stammlösung
Nourseothricin (Nour)
1
10 mg/ml
20* bzw. 10 µg/ml
2
100 mg/ml
25 mg/ml
100 µg/ml
25* bzw. 7 µg/ml
3
50 mg/ml
50 mg/ml
50* bzw. 10 µg/ml
50 µg/ml
100 mg/ml
100 µg/ml
Ampicillin (Amp)
2
Chloramphenicol (Cm)
Kanamycin (Km)
4
Thiostrepton (Thio)
Zeocin (Zeo)
Endkonzentration
1
1
: gelöst in sterilem H2O
: gelöst in 50 % Ethanol
2
3
: gelöst in 0,1 M NaOH
: gelöst in DMSO
*: Bei diesen Antibiotika wurde für E. coli die höhere Konzentration verwendet.
4
59
Material und Methoden
3.5
Aufzuchtbedingungen und Stammhaltung
3.5.1 Escherichia coli
Zur Aufzucht wurden Stämme generell bei 37°C auf LB-Platten oder in flüssigem LBMedium kultiviert. Bei plasmidtragenden Stämmen wurden Platten oder Flüssigmedien mit dem entsprechenden Antibiotika verwendet.
Für Übernachtkulturen von E. coli wurde LB-Flüssigmedium mit entsprechenden Antibiotika mit einer Einzelkolonie steril angeimpft. Die Röhrchen wurden über Nacht bei
37°C gerollert.
Die Stammhaltung erfolgte bis zu sechs Wochen auf Agarplatten im Kühlschrank. Für
längere Aufbewahrung wurden 5 ml Übernachtkulturen 10 Minuten bei 4000 upm
abzentrifugiert und das Pellet in 3 ml Einfriermedium aufgenommen. Davon wurden
1 ml Aliquots als Glycerinkulturen bei -20°C gelagert.
3.5.2 Streptomyceten
Streptomyceten wurden bei 30°C auf HT-Platten (gegebenenfalls mit Antibiotikum)
ohne Noppen zur Belüftung kultiviert. Für kürzere Zeit konnten diese Platten im Kühlschrank oder bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
Zur Gewinnung von Glycerinkulturen für eine längere Aufbewahrung wurden Einzelkolonien von Streptomyceten auf HT-Platten ausgestrichen und bei 30°C bis zur vollständigen Sporulation inkubiert. Die Sporen wurden mit 5-6 ml sterilem Wasser
(durch leichten Druck ganz benetzen) mit einer Glaspipette abgeschwemmt und
durch nicht absorbierende Baumwolle filtriert (Abtrennung des Restmycels). Das Filtrat wurde zentrifugiert (5 min, 4500 upm, Megafuge), das Pellet im letzten Tropfen
resuspendiert und in 3 ml Glycerinkulturmedium aufgenommen. Davon wurden 1 ml
Aliquots zwei Frier-Tau-Zyklen (-20°C und RT) unterworfen, bevor sie weiter verwendet wurden. Die Lagerung erfolgte bei -20°C.
Zur Bestimmung des Sporentiters dieser Glycerinkulturen wurden von verschiedenen
Verdünnungen (mit sterilem Wasser) jeweils 100 µl auf HT-Platten ausgestrichen
(Endverdünnung: 10-5, 10-6, 10-7). Zur Vereinzelung wurden dann Verdünnungen der
Sporen ausgestrichen, die zwischen 100 und 300 Kolonien auf einer Platte bilden.
3.6
Molekulargenetische Methoden
3.6.1 Transformation von Escherichia coli
Zwei Stunden vor der Transformation wurden 20 bis 50 ml LB0 in einem 250 oder
500 ml Schikanekolben 1:100 aus einer Übernachtkultur von E. coli JM109 angeimpft. Die Zellen wurden ca. 2 h bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert (bis OD600
zwischen 0,3 und 0,4). Der Ansatz wurde in SS34-Becher überführt und 10 min bei
60
Material und Methoden
4500 upm (4°C, SS34-Rotor) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und
das Pellet in 2 ml eisgekühltem TSS resuspendiert. Für eine Transformation wurden
200 µl dieser kompetenten Zellen mit einem Ligationsansatz oder Plasmid-DNA vermischt und mindestens 30 min auf Eis inkubiert. Nach einem Hitzeschock von 90 sec
bei 42°C wurden die Zellen wieder auf Eis abgekühlt. Der Ansatz wurde dann in
Schott-Röhrchen mit 2 ml LB0 überführt und 1 h bei 37°C gerollert.
Von diesem Ansatz wurden 0,1 ml auf einer LB-Platte mit dem entsprechenden Antibiotika ausplattiert. Der Rest wurde 5 min bei 4500 upm (RT, Megafuge) abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen im letzten Tropfen resuspendiert
und dann ebenfalls ausplattiert. Die Zellen wuchsen über Nacht bei 37°C.
Als Negativkontrolle wurde ein Ansatz ohne DNA nur mit kompetenten Zellen angesetzt. Hiervon wurde nur das Pellet ausplattiert. Als Positivkontrolle diente ein Ansatz
mit kompetenten Zellen und 10 ng pUC18-DNA (es wurden nur 0,1 ml des Ansatzes
nach dem Rollern ausplattiert).
3.6.2 Plasmidisolierung aus Escherichia coli durch Bio-Feedback
Bei dieser kostengünstigen Methode zur Überprüfung vieler Transformanten wurden
2 ml Übernachtkulturen abzentrifugiert (5 min, 5000 upm, Megafuge). Der Überstand
wurde verworfen und das Pellet jeweils in 200 µl Lysepuffer resuspendiert. Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei RT wurden 300 µl NaOH/SDS (1,68 ml NaOH 1 M,
0,84 ml SDS 10 %, 5,88 ml H2O) hinzugefügt, vermischt und 5 min auf Eis inkubiert.
Es wurden 400 µl vorgekühltes 7,5 M NH4-Acetat dazugegeben, gemischt und weitere 5 min auf Eis belassen. Die Ansätze wurden nochmals geschüttelt und dann zentrifugiert (5 min, 14000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge). Der Überstand (maximal
800 µl) wurde in Eppendorf-Gefäße überführt, in denen 700 µl Isopropanol vorgelegt
waren, und die beiden Phasen gemischt. Nach 10 min bei RT wurden die Ansätze
zentrifugiert (10 min, 14000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge) und der Überstand vorsichtig abpipettiert. Das Pellet wurde einmal mit 50 µl 70 % Ethanol und einmal mit
50 µl 100 % Ethanol gewaschen (3 min, 14000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge),
einige Minuten offen auf dem Tisch getrocknet und zuletzt in 50 µl TE10.01 resuspendiert.
3.6.3 Plasmidisolierung aus Escherichia coli durch QIAprep
3-5 ml Übernachtkulturen wurden abzentrifugiert (5 min, 4500 upm, Megafuge) und
dann weiter behandelt wie vom Hersteller beschrieben. Die eluierte DNA wurde bei
4°C oder –20°C gelagert.
61
Material und Methoden
3.6.4 Agarosegelelektrophorese
Bei einer Agarosegelelektrophorese wird DNA
entsprechend ihrer Größe im elektrischen Feld
aufgetrennt, um Restriktionsverdauungen und
PCR-Fragmente zu kontrollieren.
Es wurde immer ein 0,7 %iges Agarosegel verwendet. Die SEAKEM-Agarose wurde in 1 TAE
aufgekocht. Vor dem Gießen in einen Gelschlitten
mit Kamm wurde Ethidiumbromid zugegeben
(4 µl/100 ml). Das erstarrte Gel wurde mit dem
Schlitten aber ohne Kamm und Auslaufsperren in
eine Gelkammer mit Laufpuffer gelegt (1x TAE mit
4 µl/100 ml Ethidiumbromid). Bei großen Gelen
(100 ml) wurde eine Spannung von 100-120 V
und bei kleine Gele (50 ml) wurde eine Spannung von 60-80 V (als Faustregel: ~5 V pro cm
Elektrodenabstand) angelegt. Die DNA wurde vor
dem Auftrag mit 10 Auftragspuffer (0,25 g Xylencyanol, 0,25 g Bromphenollau, 50 ml Glycerin,
ad 100 ml mit 0,5 M EDTA pH 8,0) versetzt. Als
Längenstandard diente die 1 kb DNA-Leiter von
Gibco/Invitrogen. Die DNA-Banden konnten durch die Interkalation des Ethidiumbromids in die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht werden.
3.6.5 DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Die Aufreinigung erfolgte mit dem GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit
von GE Healthcare. Die aufzureinigende Bande wurde mit einem Skalpell möglichst
knapp aus dem Agarosegel geschnitten (das Agarosegel und der verwendete Laufpuffer sollten frisch sein). Die DNA wurde nach der Vorschrift des Herstellers extrahiert und abhängig von der DNA Menge in 25-50 µl Elutionspuffer eluiert.
3.6.6 Reinigung von PCR-Fragmenten
PCR-Fragmente, die zuvor nicht in einem Agarosegel aufgetrennt werden mussten,
wurden nach Herstellerangaben mit dem GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification
Kit von GE Healthcare direkt aufgereinigt und in 25-50 µl Elutionspuffer eluiert.
3.6.7 PCR (Polymerase Chain Reaction)
Zur Amplifikation chromosomaler DNA, zur Umklonierung/Neukonstruktion von Vektoren und zur Kontrolle von Deletionen wurden PCRs durchgeführt. Wurde die DNA
62
Material und Methoden
für Klonierungen benötigt, so wurde mit der Pfu-Polymerase amplifiziert, für KontrollPCRs wurde die Taq-Polymerase genutzt.
Chromosomale DNA wurde zuvor zusätzlich 5 min bei 94°C denaturiert und anschließend bis kurz vor dem Start der PCR auf Eis gehalten. Wenn es sich um DNA
von Streptomyceten handelte wurde dem PCR-Ansatz 5-10 % DMSO zugesetzt. Die
Polymerase wurde jeweils zuletzt zugegeben. Die nachfolgende Tabelle 7 fasst die
PCR-Bedingungen zusammen.
Tabelle 7:
PCR-Bedingungen
Reaktionsansatz für PCR
dNTPs 10 mM
MgCl2 50mM
PCR-Programm
2 µl
10Puffer ohne MgCl2
3 µl
10 µl
DMSO
Template-DNA
Primer 1 (100 pmol/µl)
Primer 2 (100 pmol/µl)
H2O
Polymerase
0-10 µl
1 µl
1 µl
1 µl
ad 99,5 µl
0,5 µl
(chr. DNA vorher 5 min, 94°C auf Eis)
PCR-Start (1x)
94°C
3 min
PCR-Zyklus (25x)
92°C
1 min Denaturierung
55-60°C
1 min Annealing
72°C
1-3 min Elongation
Schlussphase (1x, Auffüllung von ss-Bereichen)
72°C
5-10 min Auffüllen der
Enden
Die Reaktionen wurden in Multiply-Safecup-Amplifikationsgefäßen von Sarstedt angesetzt und im MinicyclerTM von MJ Research durchgeführt. Zur Kontrolle der Amplifikation wurden nach der PCR 5-10 µl des Ansatzes mittels einer Agarosegelelektrophorese überprüft.
3.6.8 Restriktionsverdau von PCR-Fragmenten und Plasmiden
Je nach Konzentration der Ausgangslösung wurden 1-6 µl DNA verwendet. Es wurden 1 µl 10 Restriktionspuffer zugegeben, mit TE 10.01 auf 9 µl aufgefüllt und der
Verdau durch Zugabe von 1 µl Restriktionsenzym gestartet. Es wurde, sofern für das
Restriktionsenzym nicht anders aufgeführt, bei 37°C für ca. 1 h inkubiert. Sollte ein
Verdau mit zwei Enzymen stattfinden, so wurde die DNA zwischen den einzelnen
Reaktionen gefällt.
3.6.9 Isopropanolfällung
Die Probe wurde mit 1/10 Volumen 3 M NaAc pH 6,2 und 1 Volumen Isopropanol
versetzt, vermischt und 5 min bei RT inkubiert. Der Ansatz wurde abzentrifugiert
(10 min, 13000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge), der Überstand verworfen (Pellet oft
nicht sichtbar) und 10 µl 100 %iges Ethanol auf das Pellet gegeben. Es wurde noch63
Material und Methoden
mals zentrifugiert (30 sec, 13000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge) und der Überstand abpipettiert. Das Pellet wurde offen am Platz getrocknet und dann in TE 10.01
aufgenommen.
3.6.10 Behandlung mit alkalischer Phosphatase
Um Religationen des Vektors zu verhindern und somit den Ligationserfolg zu erhöhen, erfolgte nach dem Restriktionsverdau noch eine Behandlung mit alkalischer
Phosphatase. Die alkalische Phosphatase stammt aus dem Kälbermagen (Roche)
und entfernt die 5`-Phosphatgruppe des linearisierten doppelsträngigen Vektors, der
somit nicht mehr mit sich selbst religieren kann. Zu 8 µl Vektor-DNA wurden 1 µl alkalische Phosphatase (20 U/µl) und 1 µl 10 Phosphatasepuffer gegeben und 30-60
min bei 37°C inkubiert. Laut Herstellerangaben ist das Enzym auch in allen RochePuffern aktiv und konnte alternativ nach 1 h zum Verdau gegeben werden, der dann
weitere 30-60 min bei 37°C inkubiert wurde. Die alkalische Phosphatase wurde anschließend durch eine Agarosegelelektrophorese abgetrennt.
3.6.11 Behandlung mit Klenow-Polymerase
Um zwei Fragmente oder ein Plasmid zu ligieren, die nicht kompatible Enden besitzen, wurde vorher eine Klenow-Behandlung durchgeführt. Die Klenow-Polymerase
füllt überstehende 5`-Enden auf oder baut überstehende 3`-Enden ab. Es entstehen
ligierbare DNA-Fragmente mit glatten Enden. Nach einer Isopropanolfällung wurde
die DNA in 8 µl TE 10.01 aufgenommen und die Reaktion durch Zugabe von je 1 µl
Restriktionspuffer B von Roche, dNTPs und Klenow-Polymerase (5 U) gestartet.
Nach einer Inkubation von 20 min bei 37°C wurden die „geglätteten“ DNA-Fragmente
mittels Agarosegelelektrophorese und anschließender Extraktion aus dem Gel aufgereinigt.
3.6.12 Ligation
Die Ligation eines Vektors mit seinem Insert (bzw. Religation eines Plasmids nach
der Entfernung eines Teilstücks) erfolgte enzymatisch mit T4-DNA-Ligase, in der Regel in einem Volumen von 10 µl. Die optimale DNA-Menge von Insertionsfragment zu
Vektor sollte 2,5 zu 1 betragen. Eine grobe Einschätzung der Mengen war anhand
der Gelbilder vor der Elution der DNA aus den Agarosegelen möglich. Gegebenenfalls wurden mehrere Ligationen mit verschiedenen Insert/Vektor-Verhältnissen angesetzt. Pro Ansatz wurden zu zirka 100 ng DNA 1 µl Ligasepuffer (mit ATP) und 1 µl
T4-Ligase (Roche) zugegeben und das Volumen mit TE 10.01 auf 10 µl aufgefüllt. Es
wurde immer eine Religationskontrolle (Ansatz ohne Insertionsfragment) mit angesetzt. Die Ligation erfolgte bei überstehenden Enden über Nacht im Kühlschrank. Im
Fall von glatten Enden wurde sie alternativ auch über Nacht bei RT durchgeführt.
64
Material und Methoden
3.6.13 Herstellung von Streptomyceten Protoplasten
Eine Vorkultur aus 20 ml YEME-Medium, 0,1 ml 1 M MgCl2 und 1 ml 10 % Glycin
wurden mit 50 µl Sporensuspension angeimpft und 3 Tage bei 30°C geschüttelt.
Es wurden 80 ml YEME-Medium mit der Vorkultur 1:100 angeimpft und weitere 3236 h bei 30°C inkubiert.
Die Kultur wurde unter dem Mikroskop auf Kontaminationen untersucht und dann in
sterile GS-Becher gegeben, in denen 80 ml H2O vorgelegt waren. Dann wurde 5-10
min bei 7000 upm zentrifugiert und der Überstand sofort abdekantiert.
Das Pellet wurde nun 2-mal gewaschen: dazu wurde es in 10 ml 10,3 %iger Sucrose
resuspendiert (in SS34-Röhrchen überführen) und wieder 5 min bei 7000 upm abzentrifugiert.
Anschließend wurde das Pellet in 9 ml L-Medium aufgenommen und nochmals auf
Kontaminationen geprüft. Es wurden 1 ml Lysozym-Lösung (40 mg/ml Lysozym frisch
in L-Medium gelöst, sterilfiltriert) dazugegeben und mindestens 30 min bei 30°C
(oder RT) inkubiert. Dabei wurde gelegentlich sanft gemischt.
Die Ansätze wurden durch Watteröhrchen filtriert und das Filtrat mit den Protoplasten
in neue SS34-Röhrchen überführt (nicht mehr vortexen!).
Die Protoplasten wurden abzentrifugiert (7 min, 3000 upm), mit 10 ml P-Puffer gewaschen und wieder abzentrifugiert (7 min, 3000 upm).
Das Pellet wurde jetzt je nach Protoplasten-Dichte in 6-10 ml P-Puffer aufgenommen.
Aliquots (1 ml) der Protoplasten wurden bei –70°C gelagert und für eine Transformation schnell aufgetaut (30°C Wasserbad).
3.6.14 Transformation von Streptomyceten
1) Vorbereitungen:
2 h vor der Transformation wurden R2-Platten (2 pro Ansatz) zum Trocknen aufgestellt. Das T-Medium und der R2-Softagar wurden vorbereitet (schmelzen und Reagenzien zugeben). Je 6 ml fertiger R2-Softagar wurden in Reagenzgläser gegeben
und bei 45°C aufbewahrt.
2) Transformation:
1 ml Protoplasten wurden aufgetaut, abzentrifugiert (5 min, 3000 upm, EppendorfTischzentrifuge) und das Pellet im letzten Tropfen gelöst. Die DNA (5 µl PlasmidDNA oder gesamter Ligationsansatz) wurde nun mit diesen Protoplasten vermischt.
Mit einer Pipette wurden 0,5 ml T-Medium zugegeben und gemischt. Der Ansatz
wurde sofort wieder aufgenommen und in die 6 ml R2-Softagar gegeben. Jeweils
3 ml davon wurden auf einer R2-Platte verteilt und bei 30°C inkubiert.
Nach spätestens 24 h wurde eine der Platten mit dem entsprechendem Antibiotikum
gelöst in 1 ml sterilem Wasser überschichtet (Thiostrepton: 1200 µg, Nourseothricin:
280 µg, Kanamycin: 600 µg, Apramycin: 1450 µg).
65
Material und Methoden
3.6.15 Konjugation von E. coli und Streptomyces lividans
Zur Konjugation wurde der Stamm E. coli S17.1 verwendet, welcher die Transferfunktionen für die Konjugation chromosomal integriert hat (tra aus RP4). Eine Übernachtkultur dieses Stammes mit dem zu übertragenden Plasmid wurde 1:100 in
10 ml LB (mit entsprechendem Antibiotikum, hier Kanamycin) verdünnt und bis zu
einer OD600 von 0,4-0,6 bei 37°C geschüttelt. Die Zellen wurden gewaschen: zweimal
abzentrifugieren (5 min, 4500 upm, Megafuge) und in 5 ml LB0 resuspendieren. Danach wurde noch einmal pelletiert und die Zellen in 1 ml LB0 aufgenommen ( 0,1
Volumen der 10 ml Kultur), was für zwei Konjugationen ausreicht. Für eine Konjugation benötigt man zudem 2*108 Sporen des Stammes S. lividans TK64 (doppelte
Menge, für einen einfachen Konjugationsansatz würden 10 8 Sporen reichen), die zuvor mit 5 ml TY-Medium gewaschen und dann in 1 ml TY-Medium aufgenommen
wurden. Zur besseren Germination wurden diese Sporen für 10 min bei 50°C einem
Temperaturshock ausgesetzt. Die so vorbehandelten E. coli S17.1 und Sporen des
Stammes S. lividans TK64 wurden kurz vermischt, abzentrifugiert (5 min, 4500 upm,
Megafuge), der Überstand abdekantiert und die Zellen im letzten Tropfen resuspendiert (sollten mindestens noch 300 µl sein). Je 1/3 des Ansatzes wurde auf LB0-, HT0und MS0-Platten plattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert. Nach spätestens 24 h
wurden die Platten mit Antibiotikum überschichtet. Dazu wurden die Platten zunächst
mit 5 ml LB0 gespült (mit Pipette über die Platte streichen, um die herangewachsenen E. coli zumindest zum Teil zu entfernen). Anschließend wurden die Platten mit je
350 µg Nalidixinsäure (nur S. lividans TK64 resistent) und 200 µg Kanamycin (Resistenz des Plasmids), zusammen gelöst in 1 ml sterilem Wasser überschichtet und weiter bei 30°C inkubiert. Nach 5-7 Tagen wurden die Konjugationsplatten mit einer
Impföse abgeerntet und auf frische HT-Platten mit Nalidixinsäure und Kanamycin
überimpft. Heranwachsende Streptomyceten-Kolonien sollten das Plasmid enthalten.
Diese Methode wurde abgewandelt nach Mazodier et al. 1989.
3.6.16 Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten (1)
Die qualitativ hochwertige DNA-Isolierung erfolgte über eine Dichtegradientenzentrifugation.
1) Zellvermehrung:
10 ml YEME-Medium wurden mit 100 µl einer Glycerinsporenkultur in Schikanekolben angeimpft. 40-70 h wurde bei 30°C geschüttelt (~180 upm). Wenn die Zellen gut
angewachsen waren, wurden alle Ansätze in 15 ml Falcons überführt und abzentrifugiert (5 min, 4500 upm, Megafuge).
2) Lyse:
Das Pellet wurde in 8 ml 25 mM Tris/25 mM EDTA/10 % Sucrose pH 8 und 1 ml
Lysozymlösung (100 mg/ml TE 10.01) resuspendiert (Vortex). Die Ansätze wurden
66
Material und Methoden
60 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Dabei wurde mehrmals geschüttelt bzw. mit
einer Pipette aufgesaugt, um die Pellets zu zerstören.
Nach der Lyse wurde 1 ml 10 % N-Lauroyl-Sarcosinat zugegeben, gemischt und weitere 15 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze für 15 min in ein
65°C Wasserbad gestellt.
Aus jedem Falcon wurden – wenn möglich – 10 ml entnommen (sonst mit TE 10.01
auf 10 ml auffüllen) und auf zuvor abgewogene 10 g CsCl in 50 ml Falcons gegeben.
Die Ansätze wurden gut gemischt und zum Lösen bei 65°C inkubiert (oft schütteln,
möglichst nicht länger als 15 min).
3) Ultrazentrifugation:
In die UZ-Röhrchen wurden 400 µl Ethidiumbromid vorgelegt. Die klare untere Phase
der Ansätze wird vorsichtig mit einer Pasteurpipette in die UZ-Röhrchen überführt.
Die Röhrchen wurden mit CsCl-Lösung (1 g/ml) austariert (auf 10 mg genau) und
dann zentrifugiert (48 h, 35000 upm, 17°C, Rotortyp: T-1270). Nach der Zentrifugation wurden die DNA-Banden unter einer UV-Lampe vorsichtig abgezogen (ca. 1 ml).
4) Butanolextraktion
Die DNA wurde in verschließbare Röhrchen gegeben und mit mindestens dem gleichen Volumen Butanol versetzt. Die Ansätze wurden 5-10 min gerollert. Dabei löst
sich das Ethidiumbromid im Butanol und die obere Phase verfärbt sich dadurch rot.
Das Butanol wurde abpipettiert und die Extraktion noch einmal wiederholt, bis die
untere Phase klar ist.
5) Dialyse:
Die untere Phase wurde in DNA-Dialyseschläuche gegeben und abgedeckt bei 4°C
in TE 10.01 dreimal dialysiert (1-2 h, neuer Puffer: über Nacht, neuer Puffer: 1-2 h).
Anschließend wurde die DNA in Eppendorfcups pipettiert und im Kühlschrank aufbewahrt.
3.6.17 Isolierung chromosomaler DNA aus Streptomyceten (2)
Eine schnelle Methode zur Isolierung von chromosomaler DNA aus Streptomyceten
bietet das „Blood and Tissue Kit“ von Qiagen.
Dazu wurden 10 ml YEME-Medium in einem 100 ml Schikanekolben mit 20 µl
Sporen-Glycerinkultur inokuliert und drei Tage bei 30°C und 200 upm inkubiert.
750 µl dieser Kultur wurden mit 750 µl H2O verdünnt und abzentrifugiert (2 min,
13000 upm, Eppendorf-Tischzentrifuge). Das Zellpellet wurde in 180 µl Lysepuffer
resuspendiert (25 mM Tris/HCl pH 8, 25 mM EDTA, 10 % Sucrose, 20 g/ml Lysozym)
und bei 37°C 30 min inkubiert. Das weitere Vorgehen erfolgte nach Herstellerangaben. Die chromosomale DNA wurde mit 200 µl Elutionspuffer eluiert und nach Zugabe von 4 µl RNase (10 mg/ml) 30 min bei 37°C inkubiert. Die Lagerung erfolgte bei
4°C.
67
Material und Methoden
3.7
Proteinanalytik
3.7.1 Gen-Expression bei Vektoren mit Rhamnose-Promotor
Zur Expression von Genen hinter einem Rhamnose-Promotor wurden 20 ml LB0Medium in einem 250 ml Kolben 1:100 aus einer 5 ml ÜN-Kultur (LB mit dem entsprechenden Antibiotikum) inokuliert und bei 37°C und 200 upm geschüttelt. Wenn
eine OD600 von ca. 0,4 erreicht war, wurde die Expression durch Zugabe von 0,2 %
Rhamnose (200 µl einer 20 %igen Rhamnoselösung) induziert und weiter bei 30°C
und 200 upm inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Proben für den Zellaufschluss entnommen (je das Äquivalent von 0,5 OD 600), zentrifugiert (10 min,
4500 upm, Megafuge) und das Zellpellet gegebenenfalls bei -20°C gelagert.
3.7.2 Zellaufschluss
Für den Zellaufschluss wurde die entsprechende Zellkultur abzentrifugiert (SS34Becher, 10 min, 4500 upm, 4°C, Sorvallzentrifuge) und der Überstand abdekantiert.
Das Zellpellet wurde mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5 auf eine Konzentration
von 10 OD600 pro 1 ml Puffer resuspendiert. 0,5 ml dieser Probe wurden per Ultraschall auf Eis aufgeschlossen (2×30 sec, cycle time 1 sec, Microtip 4, 8 mm, duty
cycle 50 %, Ultrasonic Sonicator). Nach einer weiteren Zentrifugation (15 min,
13000 upm, 4°C, Eppendorf-Tischzentrifuge) wurde der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß überführt und das Pellet in 0,5 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,5
resuspendiert. Die Proben wurden vor der Weiterverarbeitung auf Eis gelagert oder
für eine Nacht im Kühlschrank.
3.7.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Die SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) wird zur
Auftrennung von Proteingemischen, zum Nachweis exprimierter Gene und zur Kontrolle von Proteinaufreinigungen genutzt. SDS lagert sich an die hydrophoben Reste
der Proteine an und maskiert dadurch ihre native Ladung. Zur vollständigen Denaturierung der Proteine werden diese kurz erhitzt. Es befindet sich zusätzlich DTT im
SDS-Probenpuffer, welches Disulfidbrücken spaltet. Die nun stark negativ geladenen
Proteine werden elektrophoretisch aufgetrennt. Die hierzu verwendeten Polyacrylamid-Gele entstehen durch radikalische Polymerisation des Monomers Acrylamid
und des quervernetzenden Methylenbisacrylamid. Die Porengröße der Gele ist von
der eingesetzten Acrylamidkonzentration abhängig und beeinflusst die Auftrennung
der Proteine. Hochkonzentrierte Gele halten große Proteine stärker zurück und führen daher zu einem höheren Molekularsiebeffekt.
Bei der diskontinuierlichen SDS-PAGE laufen die Proben zunächst durch ein Sammelgel. Hier entsteht zwischen den schnell wandernden Chloridionen (Leitionen) und
68
Material und Methoden
den langsameren Glycinionen (Folgeionen) des Laufpuffers ein Feld geringer Leitfähigkeit, das zu einer Fokussierung der Proteine zwischen Leit- und Folgeionen führt.
Der pH-Sprung von 6,8 auf 8,8 beim Übergang ins Trenngel erhöht die Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen im Laufpuffer. Die Proteine werden nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt.
Für die Durchführung der SDS-PAGE wurden die Glasplatten gut mit Isopropanol
gereinigt, der Gummispacer eingelegt und die Platten aufeinander fixiert. Das Trenngel wurde bis 1 cm unter den Rand gegossen und mit Isopropanol überschichtet.
Nach ca. einer halben Stunde war das Gel auspolymerisiert. Das Isopropanol wurde
abgegossen und mit Wasser ausgespült. Anschließend wurde das Sammelgel auf
das Trenngel gegossen und der Probenkamm eingesetzt. Wenn das Sammelgel fest
war, wurden Probenkamm und Gummispacer entfernt, das Gel in die Elektrophoresekammer eingebaut und die Kammer mit SDS-Laufpuffer gefüllt.
Die Proben wurden 1:1 mit SDS-Probenpuffer versetzt und zur vollständigen Denaturierung der Proteine 5 min bei 95°C erhitzt, kurz abzentrifugiert und auf Eis gestellt.
Pro Tasche wurden 12 µl Probe aufgetragen. Die Elektrophorese verlief wie folgt:
1 Gel:
2 Gele:
10 mA beim Durchlaufen des Sammelgels
Weiter mit 20 mA - bis die Bromphenolblau-Bande das Gel verlässt.
20 mA beim Durchlaufen des Sammelgels
Weiter mit 40 mA - bis die Bromphenolblau-Bande das Gel verlässt.
Nach der Elektrophorese wurde das SDS-Gel zur Anfärbung der Proteinbanden für
ca. 1 h in Coomassie-Färbelösung geschwenkt. Anschließend wurde das Gel in Entfärberlösung geschwenkt, bis die Banden zu erkennen waren und dann weiter in
7,5 %iger Essigsäure (mehrfach wechseln) bis der Hintergrund weitestgehend entfärbt war. Das Gel wurde gescannt und konnte mit 7,5 %iger Essigsäure in Folie eingeschweißt gelagert werden. Zur Abschätzung des Molekulargewichts wurden 3,5 µl
des Proteinstandards von Roth mit Proteinbanden bei 200 kDa (Myosin vom Rind),
119 kDa (β-Galactosidase rekombinant aus E. coli), 66 kDa (Serumalbumin vom
Rind), 43 kDa (Ovalbumin), 29 kDa (Carbonic Anhydrase), 20 kDa (Trypsin Inhibitor
aus Soja) und 14,5 kDa (Lysozym vom Huhn) mit aufgetragen.
3.8
Komplementation
Bei der Komplementation sollte untersucht werden, ob Gene für DNAReparaturproteine aus S. lividans ein entsprechendes Defizit in E. coli Stämmen
ausgleichen (komplementieren) können.
69
Material und Methoden
Im Folgenden ist eine Auflistung der verwendeten Stämme (Courcelle und Hanawalt
1999). Konzentrationsangaben zu den erforderlichen Zusätzen sind unter 3.4.2 zu
finden.
Stamm
CL1
relevanter Genotyp
thyA36
Medienzusätze
Thymin
CL4
recD, thyA36, arg-, TetR
Thymin, Arginin
CL5
recF, thyA36, tryp-, TetR
Thymin, Tryptophan
CL544
recR, thyA36, CmR
Thymin
CL584
recO, thyA36, KmR
Thymin
Kompetente Zellen dieser E. coli Deletionsstämme wurden nach der TSS-Methode
(siehe Transformation von E. coli, 3.6.1) hergestellt. Zellen wurden mit den Plasmiden, die das entsprechende S. lividans Gen hinter dem Kanamycinpromotor sowie
eine Ampicillinresistenz enthielten, transformiert und die plasmidtragenden Zellen auf
LBAmp selektioniert. Am nächsten Tag wurden die Transformationsplatten mit 5 ml
LB0 abgeschwemmt und anschließend eine OD600 von 0,2 eingestellt. Diese Zellsuspension wurde weiter wie folgt verdünnt:
Kultur OD600 von 0,2 (Verdünnungsstufe 210-1)
1. Verdünnung 1:25 = 40 µl Kultur + 960 µl H2O (Verdünnungsstufe 810-3)
2. Verdünnung 1:25 = 40 µl Kultur + 960 µl H2O (Verdünnungsstufe 3,210-4)
3. Verdünnung 1:25 = 40 µl Kultur + 960 µl H2O (Verdünnungsstufe 1,2810-5)
Davon wurden je 100 µl auf insgesamt 30 LBAmp-Platten mit den entsprechenden
Medienzusätzen plattiert (Verdünnungsstufe 1,2810-6). Bei dieser Verdünnung bildeten sich 300-500 Kolonien auf der Kontrollplatte.
Im Anschluss erfolgte die UV-Bestrahlung. Dazu wurden je drei Platten einer bestimmten UV-Dosis ausgesetzt (0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 und 120 J/m2). Alle
Platten wurden in einem lichtundurchlässigen Behälter gesammelt und über Nacht
bei 37°C inkubiert. An den nächsten Tagen wurden die Kolonien auf den Platten
ausgezählt (Lagerung zwischendurch bei 4°C) und jeweils die Überlebensrate im
Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle ermittelt.
3.9
Mutageneseassays mit S. lividans
3.9.1 MNNG-Mutagenese
MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin) ist ein stark alkylierendes Mutagen. Es
wurde eine Stammlösung von 20 mg/ml MNNG in DMSO hergestellt, die bei -20°C
gelagert wurde. Unmittelbar vor dem Versuch wurde die Stammlösung 1:10 mit steri70
Material und Methoden
lem Wasser verdünnt, so dass eine MNNG-Lösung mit 2 mg/ml in 10 % DMSO entstand.
Für die MNNG-Mutagenese wurden 33 µl der Sporen der verschiedenen Deletionsstämme mit einer Konzentration von zirka 106 Sporen/ml mit 792 µl 0,1 M Tris/Maleat
pH 8,0 vermischt. Daraus wurden je 250 µl entnommen und mit 250 µl (1.) H2Osteril
(2.) 10 % DMSO und (3.) 2 mg/ml MNNG in 10 % DMSO vermischt. Die Ansätze
wurden zwei Stunden bei 30°C und 750 upm im Thermocycler inkubiert (Hopwood et.
al. 1985). Anschließend wurden jeweils Verdünnungen mit sterilem Wasser hergestellt, bis eine Sporenkonzentration von zirka 2.000 Sporen/ml erreicht war. Daraus
wurden je 100 µl auf insgesamt vier HT0-Platten plattiert und diese bei 30°C inkubiert. Nach drei Tagen wurden die heranwachsenden Kolonien ausgezählt. Es wurde
jeweils die Überlebensrate der MNNG-behandelten Sporen im Verhältnis zu den
Kontrollen bestimmt.
3.9.2 EMS-Mutagenese
Ethylmethansulfonat (EMS) wird wie MNNG oft zur Mutagenese von DNA verwendet.
Es alkyliert die Basen der DNA jedoch im Gegensatz zu MNNG bevorzugt in einer
SN2-spezifischen Reaktion. Für die nachfolgende Methode siehe Marins et al. 1994.
Im Versuch wurde eine definierte Anzahl Sporen in 50 µl Einfriermedium zu 900 µl
0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH 7 gegeben. Die Mutagenese wurde durch Zugabe
von 50 µl EMS gestartet (Endkonzentration 5 %). Der Ansatz wurde sofort gut gevortext und bei 25°C und 700 upm inkubiert. Zu bestimmten Zeiten wurden Proben entnommen (die erste sofort) und die Reaktion durch eine 1:20 Verdünnung in 4 %igem
Natriumthiosulfat-Pentahydrat gestoppt. Es erfolgten weitere Verdünnungsschritte in
Wasser und dann die Plattierung auf HT 0-Platten. Nach drei bis vier Tagen Inkubation bei 30°C wurden die heranwachsenden Kolonien ausgezählt und die Überlebensrate der Proben zu späteren Zeitpunkten im Vergleich zur sofort entnommenen Probe
bestimmt.
3.9.3 Zeocin-Mutagenese
Zeocin gehört zur Familie der Bleomycin/Phleomycin Antibiotika. Es bindet an die
DNA und fügt Doppelstrangbrüche ein.
Die Mutagenese mit Zeocin wurde als Plattenassay entwickelt. Unmittelbar vor dem
Gießen von HT-Platten wurde dem Medium Zeocin in einer Endkonzentration von
25 µg/ml zugesetzt. Die fertigen HTZeocin-Platten wurden maximal für zwei Wochen
bei 6°C gelagert.
Es wurden mit sterilem Wasser Vorverdünnungen der Sporen der verschiedenen Deletionsstämme mit einer Konzentration von zirka 300 Sporen/100 µl hergestellt und je
100 µl auf jeweils vier HT0-Platten bzw. vier HTZeocin-Platten plattiert. Nach drei Näch71
Material und Methoden
ten bei 30°C wurden die angewachsenen Kolonien ausgezählt. Es wurde jeweils die
Überlebensrate der Kolonien auf den HT Zeocin-Platten im Verhältnis zur HT0-Kontrolle
bestimmt.
3.9.4 UV-Licht-Mutagenese
UV-Licht kann die DNA durch die Dimerisierung von Pyrimidinen (v.a. ThyminDimere) direkt schädigen, oder durch die Bildung von freien Radikalen indirekt Schäden hervorrufen.
Für die UV-Licht-Mutagenese wurden mit sterilem Wasser Vorverdünnungen der
Sporen der verschiedenen Deletionsstämme mit einer Konzentration von zirka 300
Sporen/100 µl hergestellt und je 100 µl auf insgesamt 30 HT0-Platte plattiert. Diese
HT0-Platten wurden mit verschiedenen Dosen UV-Licht bestrahlt. Jeweils drei Platten
erhielten eine Dosis von 0 (Kontrolle), 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, bzw.
100 J/m2. Die Platten wurden über drei Nächte bei 30°C inkubiert und dann die
herangewachsenen Kolonien ausgezählt. Es wurde jeweils die Überlebensrate der
UV-Licht-bestrahlten Platten im Verhältnis zur unbestrahlten Kontrolle bestimmt.
3.9.5 Mitomycin C-Mutagenese
Mitomycin C verursacht kovalenten Verknüpfungen der DNA-Stränge. Mitomycin C
wurde für den Mutageneseversuch in 140 µl Aliquots mit einer Konzentration von
1 mg/ml (gelöst in 0,9 %iger NaCl-Lösung) bei -70°C gelagert (Stolk et al. 1986).
Vor jedem Versuch wurde ein Aliquot der Stammlösung frisch aufgetaut, mit 0.9 %
NaCl auf eine Konzentration von 100 µg/ml verdünnt und daraus Mutagenlösungen
mit sieben verschiedenen Konzentrationen Mitomycin C hergestellt (siehe Tabelle).
Tabelle 8:
Pipettierschema für die Mitomycin C Lösungen
200
192,5
185
170
155
140
125
µl 0.9 % NaCl
0
7,5
15
30
45
60
75
µl 100 µg/ml Mitomycin C
0
2,5
5
10
15
20
25
µg/ml Mitomycin C im Ansatz
(nach Zugabe der Sporen)
Für den Mutageneseversuch wurde zudem der Titer der jeweiligen Sporensuspension bestimmt und eine Vorverdünnung mit umgerechnet 10.000-20.000 Sporen/ml
hergestellt. 100 µl dieser Sporenverdünnung (1.000-2.000 Sporen) wurden zu den
200 µl der ersten Mutagenlösung gegeben, der Ansatz sofort vermischt und daraus
sofort zweimal 100 µl entnommen und auf je eine HT 0-Platte plattiert (~300-700
Sporen/Platte). Mit den weiteren Mutagenlösungen wurde genauso verfahren. Alle
Platten wurden über drei Nächte bei 30°C inkubiert und dann die herangewachsenen
72
Material und Methoden
Kolonien ausgezählt. Es wurde jeweils die Überlebensrate der verschieden Mitomycin C-Ansätze im Verhältnis zur Kontrolle ohne Mitomycin C im Ansatz bestimmt.
3.10 Statistische Methoden
3.10.1 Berechnung des P-Wertes
Bei der MNNG- und Zeocin-Mutagenese wurden für den Referenzstamm S. lividans
TK64 jeweils über sechs Werte gemessen (technische Replikate). Bei den einzelnen
Knock-out Mutanten standen vier bis sechs Klone für die Messungen zur Verfügung.
Mit diesen Werten wurde eine statistische Auswertung durchgeführt, auch wenn nicht
bei allen Mutanten der geforderte Stichprobenumfang von  6 gegeben war. Es sollen also zwei empirische Mittelwerte unabhängiger Stichproben aus annähernd normalverteilten Grundgesamtheiten und möglicherweise ungleichen Varianzen dieser
Grundgesamtheiten verglichen werden (Behrens-Fisher-Problem). Hierzu wurde
die studentverteilte Prüfgröße t berechnet (Sachs 2004, S. 256 ff).
= Mittelwert, mit
n1 und n2
= Stichprobenumfang
= Varianz, mit
Es gelte n1  6 und n2  6.
Die Anzahl der Freiheitsgrade () ist für n1  n2 mit  = n2 – 1 gegeben.
Geprüft wird die Nullhypothese (µ1 = µ2) auf Gleichheit zweier Erwartungswerte (als
zweiseitiger t-Test). Wenn die Nullhypothese abgelehnt werden kann, d.h. die Prüfgröße ist größer als der kritische t-Wert bei einer gegebenen Irrtumswahrscheinlichkeit (z.B.  = 5 %), dann unterscheiden sich die Mutanten signifikant vom Referenzstamm S. lividans TK64.
Über die berechnete Prüfgröße t kann auch ein P-Wert bestimmt werden. Der so gewonnene P-Wert ist die Überschreitungswahrscheinlichkeit, mit der man sich irrt,
wenn man die Nullhypothese ablehnt (vgl. Sachs 2004, S. 188). D.h. im Falle der
Mutageneseversuche gibt dieser P-Wert an, mit welcher Wahrscheinlichkeit die Mutanten sich gegebenenfalls doch nicht vom Referenzstamm S. lividans TK64 unterscheiden.
3.10.2 Berechnung der alternativen Prüfgröße 
Es gibt noch einen anderen Weg zur Lösung des Behrens-Fisher-Problems für
Stichprobenumfänge von n1 und n2  3 (Sachs 2004, S. 257). Allerdings ist hier der
73
Material und Methoden
Erwartungswert-Unterschied auf dem 5 %-Niveau statistisch gesichert. Geprüft wird,
ob die Nullhypothese µ1 = µ2 (zweiseitiger Test) mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit
von 5 % abgelehnt werden kann. Sobald die mit der nachfolgenden Formel berechnete Prüfgröße () den Wert 2 überschreitet, ist die Nullhypothese (µ1 = µ2) abzulehnen (d.h. die Werte unterscheiden sich signifikant). Unterschreitet der Quotient
den Wert 2, dann lässt sich die Nullhypothese auf dem 5 %-Niveau nicht ablehnen
(d.h. die Werte unterscheiden sich nicht signifikant).
Eine Erläuterung der Variablen ist neben der vorherigen Formel zu finden.
74
Ergebnisse
4
ERGEBNISSE
Die Ergebnisse dieser Arbeit werden in vier Unterkapitel gegliedert dargestellt. Zuerst
wird im Detail die Erstellung der verschiedenen Deletionsstämme in S. lividans TK64
berichtet. Insbesondere wird beschrieben welche Gene ausgewählt wurden, wie die
Deletion genau erfolgte, und welche Deletionsmutanten am Ende zur Verfügung
standen. Das zweite Unterkapitel beschäftigt sich mit der Assayentwicklung. Es wird
erklärt welche Mutagene ausgewählt wurden und beschreibt die Etablierung eines
reproduzierbaren Mutageneseverfahrens. Unterkapitel 4.3 zeigt dann die Charakterisierung der zuvor erstellten Deletionsmutanten. Hier werden die neuen Stämme von
S. lividans TK64 mit den Ergebnissen der Stabilitätsuntersuchungen und der Mutageneseassays vorgestellt. Das letzte Kapitel (4.4) beschäftigt sich mit den Ergebnissen von Komplementationsversuchen mit Mutanten von E. coli.
4.1
Erstellung der Deletionsstämme in S. lividans TK64
Es gibt verschiedene Methoden zur Inaktivierung chromosomaler Gene. In Abschnitt
4.1.1 werden zwei Methoden vorgestellt. Die gewählte Deletionsmethode wird dann
in Abschnitt 4.1.2 vom Design der Primer, über die Konstruktion der nötigen Vektoren
bis hin zur Transformation in S. lividans TK64 und der Selektion der entsprechenden
Deletionsstämme beschrieben. Details zu den ausgewählten Genen und die erhaltenen Deletionsmutanten werden in Abschnitt 4.1.3 einzeln aufgeführt und in Abschnitt
4.1.4 in einer Übersichtstabelle aufgelistet.
4.1.1 Methoden zur Inaktivierung chromosomaler Gene
Es gibt verschiedene Methoden, um Gene transient oder endgültig zu inaktivieren.
Eine schnelle und einfache Methode ist die Insertions-Strategie (siehe Abbildung 11).
Die Konstruktion des Insertions-Vektors kann in E. coli erfolgen. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird ein Fragment des Zielgenes amplifiziert und in einen
Klonierungsvektor inseriert. Dieser Vektor muss das Gen für eine Antibiotikaresistenz
besitzen, die auch in Streptomyceten aktiv ist, zum Beispiel die KanamycinResistenz. Zellen von S. lividans TK64 werden mit dem fertigen Insertions-Vektor
transformiert und mit Kanamycin selektioniert. Durch ein einmaliges Crossover kann
der Vektor in das Zielgen integrieren, wodurch es inaktiviert wird. Da kein Replikationsursprung für Streptomyceten auf dem Insertions-Vektor vorhanden ist, kann mit
Kanamycin auf die Integration des Plasmids selektioniert werden. Ohne Selektionsdruck kann der Vektor jedoch durch ein einfaches Crossover schnell verloren gehen,
da durch das eingefügte Genfragment homologe Bereiche im 5´- und 3´-Genstück
vorhanden sind (siehe Abbildung 11).
75
Ergebnisse
Abbildung 11: Gen Knock-out durch Insertion
Ein Genfragment des Zielgens im Vektor stellt den homologen Bereich für ein Einfach-Crossover (A). Der Vektor kann so ins Chromosom integrieren (B). Jedoch ist
dieser Weg reversibel und der Vektor kann ohne Selektionsdruck verloren gehen.
Ziel der Gendeletionen dieser Arbeit war es, neue Stämme zu erhalten, welche die
entsprechenden Gene dauerhaft verloren haben. Daher wurde auf eine InsertionsStrategie verzichtet. Eine zuverlässigere aber aufwendigere Methode für den Gen
Knock-out ist der komplette Verlust des Gens. Dies kann durch den Austausch mit
einem Antibiotika-Resistenzgen geschehen, wie es in dieser Arbeit durchgeführt
wurde (siehe Abbildung 12).
Ein wichtiges Element des dafür benötigten Knock-out Vektors ist der temperatursensitive Replikationsursprung (ori ts). Nach der Transformation des Knock-out Vektors in Streptomyceten kann dieser Replikationsursprung durch eine Temperaturerhöhung auf 42°C inaktiviert werden. Bei gleichzeitigem Selektionsdruck mit dem entsprechenden Antibiotikum wird die Integration des Vektors gefördert. Das Gen nat1
(vermittelt Resistenz gegenüber Nourseothricin) wird im fertigen Knock-out Vektor
von Sequenzen flankiert, die homolog zu den 5´- und 3´-Regionen des Zielgens sind
und somit eine homologe Rekombination des Vektors ins Chromosom ermöglichen
(Details zur Konstruktion der Vektoren siehe Abschnitt 4.1.2). Nach dem ersten
Crossover (dargestellt als doppelseitiger Pfeil in Abbildung 12) ist der gesamte Vektor ins Chromosom integriert. Das Gen ist noch vorhanden und auch die KanamycinResistenz des Vektors ist integriert. Die gesuchten Deletionsstämme sind jedoch nur
noch resistent gegenüber Nourseothricin, da in einem zweiten Crossover der Vektor76
Ergebnisse
anteil mit dem Zielgen verloren gehen soll. Die Stammhaltung auf Platten mit Nourseothricin hält einen Selektionsdruck auf die Nourseothricin-Resistenz aufrecht. Durch
die Temperaturerhöhung (Inaktivierung des temperatursensitiven Replikationsursprungs) wird zudem eine unabhängige Replikation des Vektors in der Zelle verhindert, sollte sich dieser durch ein Crossover wieder aus dem Chromosom herauslösen
(Umkehr des ersten Crossover).
Abbildung 12: Gen Knock-out durch Austausch gegen ein AntibiotikaResistenzgen
Der Knock-out Vektor hat eine Nourseothricin-Resistenz (nat1) flankiert von Sequenzen, die in der 5´- bzw. 3´-Region des Zielgens vorkommen. Zusätzlich sind eine Kanamycin-Resistenz (KmR) und ein temperatursensitiver Replikationsursprung (ori ts)
für Streptomyceten vorhanden. (A) Durch ein Einfach-Crossover integriert der Vektor
zunächst ins Chromosom. (B) Die erhaltenen Stämme sind resistent gegenüber
Nourseothricin und Kanamycin und besitzen auch noch das Zielgen. (C) Durch ein
zweites Crossover kann das Zielgen mit dem restlichen Vektor inklusive des Kanamycin-Resistenzgens verloren gehen. Der Vektor kann dabei alternativ auch wieder herausgeschnitten werden (Umkehr des ersten Crossover). Die gesuchten Deletionsstämme sind Nourseothricin-resistent und Kanamycin-sensitiv.
77
Ergebnisse
4.1.2 Vorgehen bei der Deletion chromosomaler Gene
Die Klonierungsarbeiten für die Konstruktion der Knock-out Vektoren wurden in
E. coli durchgeführt. Für den Genaustausch wurde nicht eine Region des Zielgens
selbst amplifiziert, sondern jeweils ein Sequenzstück von zirka 1000 Bp aus der 5´und 3´-Region des Zielgens. Abbildung 13 zeigt die Verhältnisse auf dem Chromosom und die Lage der gewählten Primer.
Abbildung 13: Primerdesign für die Amplifikation einer 5´- und 3´-Region des
Zielgens
Dargestellt ist das Zielgen auf dem Chromosom. Hervorgehoben ist jeweils auch ein
Sequenzabschnitt aus der 5´- und 3´-Region des Zielgens. Dieser 5´- und 3´Regionsabschnitt wurde jeweils mit einer Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Die
Lage der Primer ist in der Abbildung angezeigt.
Links und rechts vom Zielgen ist jeweils ein Bereich dunkler dargestellt. Hierbei handelt es sich um die 5´- und die 3´- Region, die im Rahmen der Polymerase Kettenreaktionen amplifiziert wurden. Die Primer wurden für jedes der Zielgene wie folgt designt (genaue Sequenz der Oligonukleotide siehe Tabelle 5 und bei der Vorstellung
der einzelnen deletierten Gene in Abschnitt 4.1.4).
5´R.v-Primer:
5´
aacccAAGCTTnnnnnnnnnnnnnnnnnn
Der Vorwärts-Primer der 5´-Region enthält eine HindIII Schnittstelle (AAGCTT) für
die Klonierung in einen Vektor. Davor befinden sich fünf Nukleotide (aaccc), damit
das Enzym HindIII die Schnittstelle besser verdauen kann. Danach folgen 17 bis 19
sequenzspezifische Nukleotide, die zirka 1000 Bp aufwärts des Zielgens binden.
78
Ergebnisse
5´R.r-Primer
5´
CTAGCCTAGCTACCCTACTTAATTAAnnnnnnnnnnnnnnnnnn
Der Rückwärts-Primer der 5´-Region hat am 5´-Ende eine Sequenz von 18 Nukleotiden, die revers komplementär zu der entsprechenden Sequenz auf dem 3´R.v-Primer
sind. Es folgt eine PacI Schnittstelle (TTAATTAA) zur späteren Integration des
Nourseothricin-Resistenzgens und wieder 17 bis 19 sequenzspezifische Nukleotide.
Diese sind revers komplementär zu einem Bereich unmittelbar vor oder auch schon
im 5´-Ende des Zielgens.
3´R.v-Primer:
5´
GTAGGGTAGCTAGGCTAGnnnnnnnnnnnnnnnnnn
Der Vorwärts-Primer der 3´-Region startet am 5´-Ende mit einer Sequenz von 18
Nukleotiden, die revers komplementär zu der entsprechenden Sequenz auf dem
5´R.r-Primer sind. Danach folgen 17 bis 19 sequenzspezifische Nukleotide, die unmittelbar nach oder auch schon im 3´-Ende des Zielgens binden.
3´R.r-Primer:
5´
ttcccAAGCTTnnnnnnnnnnnnnnnnnn
Der Rückwärts-Primer der 3´-Region enthält wie der 5´R.v.-Primer eine HindIII
Schnittstelle (AAGCTT) für die Klonierung in einen Vektor. Davor sind fünf Nukleotide
(ttccc), damit das Enzym HindIII die Schnittstelle besser verdauen kann. Dahinter
folgen 17 bis 19 sequenzspezifische Nukleotide, die revers komplementär zu einem
Bereich zirka 1000 Bp abwärts des Zielgens sind.
Mit dem Primerpaar 5´R.v und 5´R.r bzw. 3´R.v und 3´R.r wurde der 5´- bzw. 3´Bereich des Zielgens in zwei getrennten Polymerase-Kettenreaktionen amplifiziert.
Diese beiden jeweils zirka 1000 Bp langen Fragmente wurden aufgereinigt. Aufgrund
der Sequenzhomologie in den 5´R.r- und 3´R.v-Primern konnten diese beiden Regionen in einer weiteren Polymerase-Kettenreaktion fusioniert werden (siehe Abbildung 14). Dazu wurden der 5´R.v- und der 3´R.r-Primer mit den Fragmenten aus der
ersten Polymerase-Kettenreaktion als Ziel-DNA vermischt. Funktionierte die FusionsPolymerase-Kettenreaktion auf diese Weise nicht, so wurde alternativ eine größere
Menge der aufgereinigten 5´- und 3´-Region (mindestens 100 ng) ohne Primer zusammengegeben und eine Polymerase-Kettenreaktion gestartet. Hierbei sind die
Fragmente gleichzeitig Primer und Ziel-DNA. Man erhält jedoch maximal eine Verdopplung der eingesetzten Menge an DNA.
79
Ergebnisse
Abbildung 14: Fusion der 5´- und 3´-Region mittels Polymerase Kettenreaktion
(A) Die Fragmente der 5´- bzw. 3´-Region aus der ersten Polymerase Kettenreakti-
on haben dank der 5´R.r- und 3´R.v-Primer eine kurze identische Sequenz. (B)
Diese kann in einer weiteren Polymerase Kettenreaktion genutzt werden, um
die beiden Fragmente zu fusionieren (C).
Die weiteren Schritte sind in Abbildung 15 exemplarisch für ein beliebiges Zielgen
dargestellt. Die fusionierte 5´-3´-Region des Zielgens wurde aufgereinigt, mit HindIII
verdaut und mit dem gleichfalls HindIII verdauten Vektor pIC20HE ligiert. pIC20HE ist
ein Klonierungsvektor mit einer Multiple-Cloning-Site in lacZ, welches durch die Integration der 5´- und 3´-Region zerstört wurde. Die damit transformierten Zellen
E. coli JM109 wurden auf LBAmp-Platten selektioniert. Der resultierende Vektor
pLIG 5´R.+3´R. wurde mit PacI linearisiert und mit einem PacI verdauten Fragment
ligiert, welches das Nourseothricin-Resistenzgen enthält. Die NourseothricinResistenz (nat1) wurde zuvor mit seinem nativen Promotor (nat1p) aus dem Plasmid
pINS amplifiziert (Primer S4357 und S4358). Die transformierten E. coli JM109 Zellen
wurden wieder auf LBAmp–Platten selektioniert und man erhält einen Vektor, der flankiert von HindIII Schnittstellen die 5´-Region und 3´-Region eines Zielgens mit integriertem Nourseothricin-Resistenzgen enthält (pLIG 5´R.-nat1-3´R.).
80
Ergebnisse
Abbildung 15: Konstruktionsschema des Vektors pLIG 5´R.-nat1-3´R.
Das Schema zeigt beispielhaft die Ligation von pIC20HE mit der fusionierten 5´- und
3´-Region eines beliebigen Zielgens nach dem Verdau mit HindIII. Darauf folgt der
Verdau mit PacI und die Ligation mit dem Nourseothricin-Resistenzgen (nat1). Es
entsteht ein Vektor pLIG 5´R.-nat1-3´R, der das Insertkonstrukt: 5´-Region des Zielgens - nat1 - 3´Region des Zielgens enthält und von HindIII Schnittstellen gesäumt
wird. bla: Ampicillin-Resistenzgen, ori: Replikationsursprung in E. coli, 5´R.: 5´-Region
des Zielgens, 3´R.: 3´-Region des Zielgens, nat1 und nat1p: NourseothricinResistenzgen mit nativem Promotor aus pINS.
81
Ergebnisse
Dieses HindIII-Fragment wurde aus dem Vektor pLIG 5´R.-nat1-3´R. wieder mit HindIII herausgeschnitten und mit dem HindIII linearisierten Vektor pJOE1082.1 ligiert
(siehe Abbildung 16).
Abbildung 16: Konstruktionsschema mit pJOE1082.1 für den Knock-out Vektor
Der Vektor pLIG 5´R.-nat1-3´R wurde mit HindIII verdaut und das Fragment mit dem
Nourseothricin-Resistenzgen wurde mit dem ebenfalls HindIII verdauten Shuttlevektor
pJOE1082.1 ligiert. Das resultierende Plasmid ist der fertige Vektor für den Knockout. bla: Ampicillin-Resistenzgen, aphII: Kanamycin-Resistenzgen, rep ts: temperatursensitiver Replikationsursprung, 5´R.: 5´-Region des Zielgens, 3´R.: 3´-Region des
Zielgens, nat1 und nat1p: Nourseothricin-Resistenzgen mit nativem Promotor aus
pINS.
82
Ergebnisse
pJOE1082.1 ist ein E. coli-Streptomyces Shuttlevektor aus pUC18 und pGM11
(pSG5-Derivat, temperatursensitives Plasmid aus S. ghanaensis mit KanamycinResistenzgen). Die Replikation dieses Vektors in Streptomyceten ist temperatursensitiv. Das Replikon wird unter 34°C in Streptomyceten stabil vererbt und geht bei höheren Temperaturen verloren, sofern es nicht ins Genom integrieren konnte. Der resultierende Vektor pLIG knock-out wurde aus den transformierten E. coli Zellen aufgereinigt und für die Transformation von S. lividans TK64 verwendet.
Dazu wurden Protoplasten von S. lividans TK64 hergestellt und diese mit den Knockout Vektoren transformiert. Nach 24 Stunden bei 30°C wurde mit 280 µg Nourseothricin pro Platte überschichtet und bis zur Sporulation weiter bei 30°C inkubiert.
Danach erfolgte die Temperaturerhöhung. Dazu wurden die Sporen mit einer
Impföse abgekratzt und auf neue HTNours-Platten übertragen, die bei 42°C weiter inkubiert wurden. Bei dieser Temperatur wuchsen die Streptomyceten schlecht und
sporulierten kaum. Nach zirka einer Woche wurde der oberste Film auf dem Myzel
erneut auf eine frische HTNours-Platten übertragen und bei 42°C weiter inkubiert. Dieser Vorgang wurde mindestens noch einmal, meist zweimal wiederholt. Nur durch
diese wiederholte Übertragung und Inkubation bei 42°C konnte die Anzahl der später
zu findenden Deletionsmutanten erhöht werden. Nach diesen Zyklen wurde erneut
übertragen und die HTNours-Platte bis zur Sporulation bei 30°C inkubiert. Die Sporen
wurden geerntet und Glycerinkulturen angelegt. Nach 2 bis 3 Frier-Tau-Zyklen zur
Abtötung von Mycelresten wurden Verdünnungen der Kultur auf HT Nours-Platten ausgestrichen und bis zur Sporulation bei 30°C inkubiert. Einzelne Kolonien wurden gepickt und auf je eine HTNours- und eine HTKm-Platte übertragen und bei 30°C inkubiert.
Die gesuchten Deletionsmutanten sollten Nourseothricin-resistent und Kanamycinsensitiv sein. Entsprechende Kolonien wurden ausgewählt, auf neuen HT Nours-Platten
bei 30°C angezogen und Glycerinkulturen der Sporen erstellt.
Zum Nachweis der erfolgreichen Deletion wurden in YEME-Medium Kulturen angezogen und die chromosomale DNA der Klone isoliert. Diese DNA wurde mittels einer
Polymerase Kettenreaktion auf das Vorhandensein des Gens bzw. dessen Deletion
hin untersucht.
4.1.3 Vorstellung der einzelnen, deletierten Gene bzw. Deletionsstämme
Im Folgenden werden die Details zu den einzelnen Zielgenen und deren Deletion
beschrieben. Eine Deletion von recA wurde nicht versucht, obwohl recA den zentralen Schritt des Strangaustausches in der homologen Rekombination katalysiert, da
bereits Arbeiten dazu vorliegen. Eine partielle Deletion von recA in S. lividans wurde
erstmals 1997 publiziert (Muth et al. 1997, Volff und Altenbuchner 1997 a). 2001 gelang die komplette Inaktivierung von recA in S. lividans, obwohl zusätzliche Mutationen vermutet werden, die dieser Inaktivierung erst ermöglichten (Vierling et al. 2001).
83
Ergebnisse
Eine Deletion von recA in bestimmten Stämmen von S. coelicolor mit einer Charakterisierung der erhaltenen Deletionsstämme (inklusive Sensitivität gegenüber bestimmten Mutagenen) wurde 2006 publiziert (Huang und Chen 2006).
Deletion von SSPG01861 - dut
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
Protein:
SSPG01861 (in S. coelicolor: SCO5868)
dut
2086632 nt bis 2087183 nt auf –Strang von S. lividans
Deoxyuridin 5'-Triphosphat-Nukleotidhydrolase,
dUTPase, 183 AS
Reaktion:
Hydrolysiert dUTP zu dUMP.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S5255, S5256, S5257, S5258
Besonderheit der Oligonukleotide:
Da in der 5´-3´-Region von SSPG01861 eine HindIII Schnittstelle vorhanden ist, konnte HindIII nicht zur Klonierung genutzt werden. Daher wurde BamHI statt HindIII im 5´R.v- und im
3´R.r-Primer benutzt. Die Klonierung konnte ansonsten wie in den Schemen in Abbildung 15
und 16 ablaufen, da die Multiple-Cloning-Site von pIC20HE auch BamHI enthält und
pJOE1082.1 auch mit BamHI linearisiert werden kann (die BamHI Schnittstelle in ´´lacZ´
von pJOE1082.1 ist in Abbildung 16 eingezeichnet).
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG22
Genumgebung von SSPG01861:
SSPG01861
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG01861 befindet sich in einem Cluster mit den Genen SSPG01862 (hypothetisches Protein) und SSPG01860 (hypothetisches Protein). Vor allem SSPG01860
könnte bei einem Knock-out mit beeinflusst werden, da es sich hinter SSPG01861
befindet. Die Funktion von SSPG01860 ist jedoch unbekannt.
Deletion von SSPG06524 - alkB
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
Protein:
SSPG06524 (in S. coelicolor: SCO1040)
alkB
7215831 nt bis 7216481 nt auf +Strang von S. lividans
vermutetes DNA Reparatur Protein, Methyltransferase, AlkB,
216 AS
84
Ergebnisse
Reaktion:
Demethyliert SN2-spezifische Alkylierungen an Basen oder dem
Zuckerphosphat-Rückgrat.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4506, S4507, S4508, S4509
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG08
Genumgebung von SSPG06524
SSPG06524
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Das Gen SSPG06524 endet 38 Bp vor SSPG06525. SSPG06525 ist ein vermutetes
regulatorisches Protein der ROK Familie.
Deletion von SSPG02133 - mutM
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG02133 (in S. coelicolor: SCO5573)
mutM
2413977 nt bis 2414837 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fapy-DNA-Glykosylase),
MutM (Fpg), 286 AS
Reaktion:
Entfernt oxidierte Purine und solche mit geöffneter Ringstruktur
aus der DNA.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4879, S4880, S4881, S4882
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG15
Genumgebung von SSPG02133
SSPG02133
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG02133 befindet sich über 100 Bp hinter dem Gen SSPG02134 (Ribonuklease III), welches jedoch bei der Deletion nicht beeinflusst werden sollte. Das Genende von SSPG02133 überlappt noch 10 Bp mit dem von SSPG02132 (Transkriptionsregulator). Dies sollte jedoch auf SSPG02132 keinen Einfluss haben, da die Primer für die 5´- und 3´-Region immer so gewählt wurden, dass auch überlappende
Gene noch komplett sind.
85
Ergebnisse
Deletion von SSPG06453 - ung1
Genlokus:
SSPG06453 (in S. coelicolor: SCO1114)
Gen:
ung1
Chromosom:
7140641 nt bis 7141318 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
Uracil-DNA-Glykosylase 1, UDG1, 225 AS
Reaktion:
Entfernt Uracil aus der DNA.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4883, S4884, S4885, S4886
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG17
Genumgebung von SSPG06453
SSPG06453
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Das Gen SSPG06452 (hypothetisches Protein) liegt in einem Cluster mit dem Gen
SSPG06453. Es könnte bei der Deletion mit beeinflusst werden.
Deletion von SSPG06217 - ung2
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG06217 (in S. coelicolor: SCO1343)
ung2
6891937 nt bis 6892620 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
Uracil-DNA-Glykosylase 2, UDG2, 227 AS
Reaktion:
Entfernt Uracil aus der DNA.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4887, S4888, S4889, S4890
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG16
Genumgebung von SSPG06217
SSPG06217
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG06217 befindet sich über 100 Bp vor SSPG06218 (vermutetes Protein) und
74 Bp hinter SSPG06216 (Transport Lipoprotein). Keines dieser Gene sollte beeinflusst werden.
86
Ergebnisse
Deletion von SSPG05758 - 3maDG
Genlokus:
SSPG05758 (in S. coelicolor: SCO1792)
Gen:
3maDG (alkA)
Chromosom:
6391417 nt bis 6392058 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
vermutete 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase der MPG-Familie,
3maDG, 213 AS
Reaktion:
Entfernt methylierte Basen aus der DNA.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4875, S4876, S4877, S4878
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG14
Genumgebung von SSPG05758
SSPG05758
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG05758 ist mit keinen anderen Genen in einem Cluster.
Deletion von SSPG01289 - exoIII
Genlokus:
Gen:
SSPG01289 (in S. coelicolor: SCO6341)
exoIII, (xthA-like)
Chromosom:
1427886 nt bis 142865 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
Exonuklease III, 259 AS
Reaktion:
Entfernt Nukleotide vom 3´-Hydroxyl-Ende der DNA.
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S5037, S5038, S5039, S5040
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG18
Genumgebung von SSPG01289
SSPG01289
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Die Gene SSPG01288 bis SSPG01290 bilden ein Cluster. SSPG01290 endet 55 Bp
vor SSPG01289. Das Gen SSPG01288 (hypothetisches Protein, beginnt 84 Bp hinter SSPG01289) könnte eventuell bei der Deletion beeinflusst werden.
87
Ergebnisse
Deletion von SSPG05581 - uvrB
Genlokus:
SSPG05581 (in S. coelicolor: SCO1966)
Gen:
uvrB
Chromosom:
6206384 nt bis 6208522 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
ABC Exzisionsnuklease Untereinheit B , 712 AS
Reaktion:
UvrB im NER
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4498, S4499, s4500, S4501
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG07
Genumgebung von SSPG05581
SSPG05581
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG05580 (vermutetes integrales Membranprotein) endet 40 Bp vor SSPG05581.
Das Gen SSPG05582 (vermutetes Transportassoziiertes Protein) folgt erst über
100 Bp hinter SSPG05581. Durch die Deletion sollte keines der Gene beeinflusst
werden.
Deletion von SSPG05020 - recO
Genlokus:
SSPG05020 (in S. coelicolor: SCO2510)
Gen:
Chromosom:
recO
5597938 nt bis 5598693 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
RecO, DNA Reparaturprotein, 251 AS
Reaktion:
Präsynaptische Phase in der Rekombinationsreparatur
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4502, S4503, S4504, S4505
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG09
Genumgebung von SSPG05020
SSPG05020
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Die Gene SSPG05019 bis SSPG05021 bilden ein Cluster. SSPG05020 befindet sich
14 Bp hinter dem Gen SSPG05019 (hypothetisches Protein) und endet 13 Bp vor
dem Genstart von SSPG05021. Das Gen SSPG05021 kodiert die Di-trans, poly-cisDecaprenylcistransferase und könnte bei der Deletion beeinflusst werden.
88
Ergebnisse
Deletionsversuch von SSPG04042 - recR
Genlokus:
SSPG04042 (in S. coelicolor: SCO3618)
Gen:
recR
Chromosom:
4440320 nt bis 4440919 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
RecR, 199 AS
Reaktion:
Präsynaptische Phase in der Rekombinationsreparatur
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4554, S4555, S4556, S4557
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: - keine Deletionsmutante erhalten
Genumgebung von SSPG04042
SSPG04042
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Das Gen SSPG04043 schließt unmittelbar an SSPG04042 an, jedoch ist die Funktion des hypothetischen Proteins bisher unbekannt.
Die Deletion wurde versucht wie bei den anderen ausgewählten Genen. Nach der
Ernte der Zellen, die mit dem recR-Knock-out-Vektor transformiert wurden, konnten
jedoch nur Nourseothricin- und Kanamycin-resistente Einzelkolonien gefunden werden. Eine vermutliche Deletionsmutante, die nur Nourseothricin-resistent sein sollte,
konnte auch nach dem Test von über 500 Kolonien nicht isoliert werden.
Deletion von SSPG06037, 06038, 06036 - ruvA, ruvB, ruvC
Genlokus:
Gene:
Chromosom:
Proteine:
SSPG06037, 06038, 06036
(in S. coelicolor: SCO1519, 1518, 1520)
ruvA, ruvB, ruvC,
6687470 - 6688075, 6688122 - 6689195, 6686907 - 6687473 nt
auf +Strang von S. lividans
RuvA, Holliday Struktur DNA Helikase, 121 AS
RuvB, Holliday Struktur DNA Helikase, 357 AS
RuvC, Holliday Struktur Resolvase,
Endodeoxyribonuklease, 201 AS
Reaktion:
Holliday Struktur Migration & Auflösung
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4434, S4435, S4436, S4437
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG05
89
Ergebnisse
Genumgebung von SSPG06037, 06038, 06036
SSPG06037
SSPG06038
SSPG06036
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Sie Gene SSPG06037 (ruvA), SSPG06038 (ruvB) und SSPG06036 (ruvC) befinden
sich in einem Cluster und wurden daher zusammen deletiert.
Deletion von SSPG02139 - recG
Genlokus:
SSPG02139 (in S. coelicolor: SCO5566)
Gen:
Chromosom:
recG
2419180 nt bis 2421408 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
RecG, ATP-abhängige DNA Helikase, 742 AS
Reaktion:
Helikase (Auflösung der Holliday Struktur)
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4426, S4427, S4428, S2229
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG03
Genumgebung von SSPG02139
SSPG02139
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG02139 liegt 63 Bp hinter SSPG02140 (vermutete Dihydroxyacetonkinase) und
endet 56 Bp vor SSPG02138. Das Gen SSPG02138 kodiert eine vermutete RNA
Methyltransferase und könnte bei der Deletion beeinflusst werden.
Deletion von SPG04791 - recD
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG04791 (in S. coelicolor: SCO2737)
recD
5320242 nt bis 5322503 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
RecD, 753 AS
Reaktion:
ohne RecB und RecC unklar
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4359, S4360, S4361, S4362
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG01
90
Ergebnisse
Genumgebung von SSPG04791
SSPG04791
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Das Gen SSPG04791 liegt nicht unmittelbar vor oder nach einem anderen Gen. Die
Deletion sollte kein anderes Gen beeinflussen.
Deletion von SSPG06266, 06265 - sbcCD
Genlokus:
SSPG06266, 06265 (in S. coelicolor: SCO1300, 1301)
Gene:
Chromosom:
sbcC, sbcD
6936855 – 6938297, 6934138 - 6935301 nt auf +Strang von
S. lividans
SbcC, 480 AS (999 AS bei S. coelicolor - anderes Startcodon
Proteine:
gewählt); SbcD, 387 AS
Reaktion:
Exonukleasen
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S5550, S5551, S5552, S5553
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG46
Genumgebung von SSPG06266, 06265
6,939,390 nt
SSPG06265
SSPG06266
Genumgebung von SCO1300, 1301
(Aufgrund der Annotation des Chromosoms von der anderen Seite beginnend ist hier
die Orientierung der Gene entgegengesetzt.)
SCO1300
SCO1301
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Die beiden Gene SSPG06266 (sbcC) und SSPG06265 (sbcD) liegen ohne weitere
Gene in einem Cluster. Sie wurden zusammen deletiert. Im Vergleich mit
S. coelicolor fällt auf, dass das Gen sbcC (SSPG06266 bzw. SCO1300) bei
S. lividans nur zirka halb so lang ist. Hier wurden die Startcodons bei der Annotation
91
Ergebnisse
der Gene verschieden gewählt. Es ist gut möglich, dass sbcC wie für S. coelicolor
angenommen auch bei S. lividans direkt an sbcD anschließt.
Deletion von SSPG01915- recQ
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG01915 (in S. coelicolor: SCO5815)
recQ
2149466 nt bis 2151625 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
RecQ, 719 AS
Reaktion:
ATP-abhängige DNA Helikase
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4438, S439, S4440, S4441
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG06
Genumgebung von SSPG01915
SSPG01915
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG019151 liegt nicht unmittelbar vor oder nach einem anderen Gen. Die Deletion
sollte kein anderes Gen beeinflussen.
Deletion von SSPG05771 - recN
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG05771 (in S. coelicolor: SCO1780)
recN
6408909 nt bis 6410639 nt auf +Strang von S. lividans
Protein:
RecN, 576 AS
Reaktion:
DNA Reparatur Protein
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4430, S4431, S4432, S4433
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG04
Genumgebung von SSPG05771
SSPG05771
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
SSPG05771 liegt nicht unmittelbar vor oder nach einem anderen Gen. Die Deletion
sollte kein anderes Gen beeinflussen.
92
Ergebnisse
Deletion von SSPG02373, 02374 - ku+lig
Genlokus:
Gene:
SSPG02373, 02374 (in S. coelicolor: SCO5309, SCO5308)
ku, lig
Chromosom:
SSPG02373: 2679990 nt bis 2681078 nt auf –Strang und
SSPG02374: 2681134 nt bis 2682015 nt auf +Strang von
S. lividans
ähnlich zu ku, 362 AS; ähnlich zu lig 293 AS
Proteine:
Reaktion:
vermutetes nicht-homologes Verbinden von Enden
Oligonukleotide für die 5´- und 3´-Region: S4341, S4342, S4343, S4344
Name des Deletionsstammes von S. lividans TK64: LG02
Genumgebung von SSPG02373, 02374
SSPG02373
SSPG02374
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Die Gene liegen nicht unmittelbar vor oder nach dem Start/Promotor eines anderen
Gens. Die Deletion sollte keine anderen Gene beeinflussen.
recF -Mutante aus Tübingen: SSPG03777 - recF
Genlokus:
Gen:
Chromosom:
SSPG03777 (in S. coelicolor: SCO3876)
recF
4164686 nt bis 4165807 nt auf –Strang von S. lividans
Protein:
RecF, 373 AS
Reaktion:
Präsynaptische Phase in der Rekombinationsreparatur
Oligonukleotide
für eine Insertionsstrategie: S4313, S4314
für die 5´- und 3´-Region: S4353, S5354, S5355, S5356
für die Komplementation von recF während des Knock-outs: S5119, S5120
neue Primer für die 5´- und 3´-Region: S5121, S5122, S5123, S5124
93
Ergebnisse
Genumgebung von SSPG03777
SSPG03777
Bildquelle: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.....
Die Gene SSPG03776 bis SSPG03778 bilden ein Cluster. Das Gen SSPG03776
(kodiert 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase) endet 31 Bp vor SSPG03777 (recF)
und noch 3 Bp überlappend mit recF folgt das Gen SSPG03778 (hypothetisches Protein). Die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase wandelt im Pentosephosphatweg
6-Phosphogluconat zu Ribulose-5-phosphat um. Bei einer Deletion von recF wäre
jedoch vermutlich eher das Gen für das unbekannte Protein SSPG03778 als das
Gen für die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase betroffen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, recF zu deletieren. Zunächst wurde die
schnelle Insertionsstrategie versucht. Details zu dieser Methode siehe unter Kapitel
4.1.1 Abbildung 11 und Erläuterung. Das genaue Klonierungsschema ist in Abbildung 17 zu sehen. Mit den Primern S4343 und S4314 wurde ein Fragment (Bp 106836) aus recF amplifiziert (recF´). Dieses Fragment wurde in den SmaI geschnittenen
Vektor pLIG01.1 ligiert und E. coli JM109 mit dem Ligationsansatz transformiert. Der
neue Vektor pLIG03.7 enthält das recF´-Genfragment. Das Kanamycin-Resistenzgen
(aphII) ist in E. coli und Streptomyceten funktionell. Zudem ist der Vektor im Rahmen
einer Konjugation mobilisierbar (mob), kann aber nicht in Streptomyceten replizieren
(nur Replikon für E. coli). E. coli S17.1 Zellen wurden mit dem aufgereinigten Vektor
pLIG03.7 transformiert. Dieser Stamm hat die Transferfunktionen für die Konjugation
chromosomal integriert (tra aus RP4) und wurde mit S. lividans TK64 konjugiert.
Nach der Integration des Vektors ins Chromosom von S. lividans TK64 sollte das
recF-Gen nach der Base 836 unterbrochen sein. Es könnte noch ein Restprotein mit
278 Aminosäuren gebildet werden. Von dem ursprünglich 373 Aminosäuren langen
RecF würden C-terminal folglich 95 Aminosäuren fehlen.
Es konnten jedoch keine Klone gefunden werden, die den Vektor integriert und damit
recF unterbrochen hatten. Im Folgenden werden daher die Ergebnisse der Knockout-Strategie mit dem Austausch von recF gegen nat1 beschrieben.
94
Ergebnisse
Abbildung 17: Konstruktion des Insertionsvektors für recF
Das recF´-Genfragment wurde in den SmaI geschnittenen Vektor pLIG01.1 eingefügt.
Der resultierende Vektor enthält das Fragment, trägt ein Kanamycin-Resistenzgen
(aphII), ist mobilisierbar (mob) aber kann nicht in Streptomyceten replizieren (nur
Replikationsursprung für E. coli: ori).
Wie bei den anderen Deletionen wurde ein Knock-out-Vektor hergestellt (pLIG21),
der die 5´- und die 3´-Region des Gens enthält (Primer: S4353, S5354, S5355,
S5356). Nach der Transformation und der Temperaturerhöhung auf 42°C wuchs
noch ein dünnes Mycel heran. Nach der Ernte konnten jedoch nur Nourseothricinund Kanamycin-resistente Klone isoliert werden. Eine Deletionsmutante, die nur
Nourseothricin-resistent war wurde auch nach dem Test von über 500 Einzelkolonien
nicht gefunden.
Da der Austausch von recF gegen nat1 nicht erfolgreich war, wurde getestet, ob recF
deletiert werden konnte, wenn es während des Knock-outs auf einem instabilen
Plasmid komplementiert wurde. Nach der Deletion von recF im Chromosom würde
dann nach Klonen gesucht, die das instabile Plasmid verloren hätten. Dazu wurde
95
Ergebnisse
ein Komplementationsvektor konstruiert wie in den Abbildungen 18 und 19
dargestellt.
Abbildung 18: Konstruktion des Komplementationsvektors für recF (1)
Der Shuttlevektor pFIS244b wurde mit NdeI und HpaI geschnitten, die Enden durch
die Klenow-Polymerase geglättet und miteinander ligiert um pLIG179.1 zu erhalten.
Ausgangsvektor der Konstruktion war der Shuttle-Vektor pFIS244b (Haug 2003).
Dieser Vektor ist ein Derivat des positiven Selektionsvektors pJOE773.2 mit der gesamten Replikationsregion von SCP2*, zwei Kopien der chromosomalen parS-site
und mrpA und mrpS (integriert in die SfoI-site von pJOE773.2). Durch die Restriktionsverdauung mit NdeI und HpaI, sowie der Religation der mit Klenow-Polymerase
geglätteten Enden entstand der Vektor pLIG179.1 (Abbildung 18). Der Verlust von
mrpA und mrpS (zuständig für die korrekte Auflösung multimerer Plasmidformen)
sollte die Replikation des Vektors in S. lividans destabilisieren, wodurch er vermehrt
verloren geht.
Zur Komplementation von recF wurde ein Fragment amplifiziert (Primer S5119 und
S5120, 2303 Bp), das über 200 Bp vor SSPG03776 (Gen für die 6-PhosphogluconatDehydrogenase) ansetzt, also die Promotorregion mit einschließt, falls recF von dem
Promotor von SSPG03776 aus mit transkribiert wird, und hinter recF endet. Dieses
Fragment und der Vektor pLIG179.1 wurden jeweils mit HindIII geschnitten und miteinander ligiert (Abbildung 19). Der resultierende Vektor pLIG184.1 besitzt nur die
Ampicillin-Resistenz (bla), welche in Streptomyceten nicht aktiv ist. Daher wurde das
SmaI-Fragment mit dem Thiostrepton-Resistenzgen (tsr) aus dem Vektor pJOE230.1
isoliert und mit dem EcoRV linearisierten Vektor pLIG184.1 ligiert. Die Vektoren
pLIG191.1 und pLIG191.2 haben dieses Insert in verschiedenen Orientierungen integriert. Protoplasten von S. lividans TK64 wurden mit diesen Vektoren transformiert
und auf Thiostrepton selektioniert. Nach zirka einer Woche wurden die Sporen von
96
Ergebnisse
der Transformationsplatte auf HTThio-Platten übertragen und bis zur Sporulation bei
30°C inkubiert.
Abbildung 19: Konstruktion des Komplementationsvektors für recF (2)
Das HindIII geschnittene Fragment zur Komplementation von recF wurde in den
ebenfalls HindIII geschnittenen Vektor pLIG179.1 eingefügt. Der resultierende Vektor
wurde mit EcoRV linearisiert und mit dem SmaI-tsr-Fragment aus pJOE230.1 ligiert.
Die endgültigen Vektoren pLIG191.1 und pLIG191.2 haben tsr in verschiedenen Orientierungen integriert.
97
Ergebnisse
Nach der Ernte wurden die entsprechenden Stämme von S. lividans TK64 mit
LG19.1 (S. lividans TK64 + pLIG191.1) und LG19.2 (S. lividans TK64 + pLIG191.2)
bezeichnet.
Für die Deletion von recF in diesen Stämmen wurde ein neuer Knock-out-Vektor
konstruiert, dessen 5´- und 3´-Region sich nicht mit dem amplifizierten Fragment des
Komplementationsvektors überschneidet (pLIG199.1 und pLIG199.2, Primer für die
5´- und 3´-Region: S5121, S5122, S5123, S5124), damit keine homologen Bereiche
in diesen beiden Vektoren entstehen. Sonst könnte der Komplementationsvektor
nach einem erfolgreichen Knock-out über diese Homologie ins Chromosom integrieren und damit wieder das recF-Gen einbringen oder der Knock-out-Vektor könnte
direkt in das Komplementationsplasmid integrieren.
Die Stämme LG19.1 und LG19.2 mit dem Komplementationsvektor wurden protoplastiert und jeweils mit den Knock-out-Vektoren pLIG199.1 und pLIG199.2 transformiert. Es folgte das übliche Vorgehen für die Isolierung einer Deletionsmutante mit
Selektion auf Nourseothricin. Die Sporen wurden zuletzt geerntet und Glycerinkulturen angelegt.
Verdünnungen der Glycerinkulturen wurden auf HTNours-Platten ausgestrichen und
die herangewachsenen Einzelkolonien mit sterilen Zahnstochern auf HT Nours-, HTKanund HTThio- Platten überimpft. Ziel war es zunächst, Nourseothricin-resistente und
Kanamycin-sensitive Kolonien zu finden, welche recF chromosomal deletiert hatten.
Gleichzeitig wurde noch auf die Präsenz des Komplementationsvektors pLIG191.1/2
getestet (Thiostrepton-resistent). Wie auch bei den beiden vorherigen Versuchen zur
Inaktivierung von recF gab es keine Nourseothricin-resistenten und Kanamycinsensitiven Kolonien. Dafür waren über 80 % der Kolonien bereits wieder Thiostrepton-sensitiv. Der instabile Komplementationsvektor ging demnach sehr schnell verloren. Dadurch gab es in den meisten Zellen auch keine Komplementation von recF für
eine zeitgleiche chromosomale Deletion des Gens. Es wurden mehrere hundert Einzelkolonien mit diesem Ergebnis getestet und keine einzige Nourseothricin-resistente
und Kanamycin-sensitive Deletionsmutante gefunden. Auch Kolonien, die den Komplementationsvektor noch enthielten, wurden nie Kanamycin-sensitiv getestet.
Da keine eigene recF-Mutante erstellt werden konnte, wurde auf einen Stamm zurückgegriffen, der während einer Diplomarbeit an der Universität Tübingen in der
Gruppe von Günter Muth entstand. Hier war eine Integrationsstrategie gewählt worden. Das recF-Genfragment wurde mit den nachfolgenden Primern amplifiziert.
ODF172 Tübingen 5´- ACGAATTCGGTCGAGGCGGTCGGC
ODF174 Tübingen 5´- ACCAGCACCGGCGAATTCCCCTCG
98
Ergebnisse
Dabei wurde bewusst eine Fehlpaarung von 3 Bp (fett, unterstrichen) in die Primer
eingefügt, um jeweils eine EcoRI-Schnittstelle für die Klonierung zu erhalten. Der
Primer ODF172 setzt 109 Bp nach dem Genstart in recF an, ODF174 endet bei Basenpaar 953 von recF. Die eingefügte EcoRI-Schnittstelle befindet sich bezogen auf
recF N-terminal bei Basenpaar 111-116 und C-terminal bei Basenpaar 936-941. Das
Fragment wurde in einen Klonierungsvektor integriert, der ein KanamycinResistenzgen besitzt (Abbildung 20).
Abbildung 20: recF-Genfragment und Insertionsvektor pMK2RECF
Das recF*-Genfragment (recF*) wurde mit EcoRI in einen E. coli Vektor eingesetzt, der ein Kanamycin-Resistenzgen (aphII) besitzt.
Der fertige Vektor wurde genutzt, um recF in S. lividans TK23 zu disruptieren
(S. lividans TK23 ist nah verwandt mit S. lividans TK64). Bei der Integration wird recF
dabei so unterbrochen, dass das Gen noch bis zur 938sten Base vollständig ist. Es
fehlt also ein Stück von 181 Bp und damit C-terminal 60 der 373 Aminosäuren. Das
sind 35 fehlende Aminosäuren weniger, als in dem eigenen Insertionsvektor
pLIG03.7. Eventuell ergibt sich dadurch eine Restaktivität von RecF, ohne die die
Zelle nicht überleben könnte. Leider wurde diese Genunterbrechung in dem Stamm
S. lividans TK23 und nicht in S. lividans TK64 durchgeführt. Da die Stämme nah verwandt sind und ihr Stabilitätsverhalten vergleichbar ist, wurde diese recF-Mutante
trotzdem für die weiteren Untersuchungen genutzt
99
Ergebnisse
4.1.4 Übersicht über die erhaltenen Deletionsstämme
Die nachfolgende Tabelle gibt nochmals einen Überblick über alle erhaltenen Deletionsstämme in S. lividans TK64. Die Deletion von recR und recF ist in dieser Arbeit
nicht gelungen. Eine recF-Mutante in S. lividans TK23 wurde von der Gruppe von
Günter Muth (Universität Tübingen) gestellt.
Tabelle 9:
Auflistung der Deletionsstämme
Genname
Genlokus
S. lividans
Genlokus
S. coelicolor
Protein/Funktion
dut
SSPG01861
SCO5868
dUTPase
LG22
alkB
SSPG06524
SCO1040
AlkB
LG08
mutM
SSPG02133
SCO5573
FaPy-DNA-Glykosylase
LG15
ung1
SSPG06453
SCO1114
Uracil- DNA-Glykosylase 1
LG17
ung2
SSPG06217
SCO1343
Uracil- DNA-Glykosylase 2
LG16
3maDG
(mpg-like/alkA)
SSPG05758
SCO1792
3-Methyladenin-DNAGlykosylase, MPG Familie
LG14
exoIII, xthA-like
SSPG01289
SCO6341
Exonuklease III
LG18
uvrB
SSPG05581
SCO1966
UvrB
LG07
recO
SSPG05020
SCO2510
RecO
LG09
recR
SSPG04042
SCO3618
RecR
-
ruvA
SSPG06037
SCO1519
RuvA
LG05
ruvB
SSPG06038
SCO1518
RuvB
LG05
ruvC
SSPG06036
SCO1520
RuvC
LG05
recG
SSPG02139
SCO5566
RecG
LG03
recD
SSPG04791
SCO2737
RecD
LG01
sbcC
SSPG06266
SCO1300
SbcC
LG46
sbcD
SSPG06265
SCO1301
SbcD
LG46
recQ
SSPG01915
SCO5815
RecQ
LG06
recN
SSPG05771
SCO1780
RecN
LG04
ku
SSPG02373
SCO5309
Ku
LG02
lig
SSPG02374
SCO5308
Ligase
LG02
recF
SSPG03777
SCO3876
RecF
recF *
Deletionsstamm
*Details zur erhaltenen recF-Mutante siehe unter 4.1.3
4.2
Assayentwicklung für die Mutageneseversuche
Für die Mutageneseversuche mit dem Stamm S. lividans TK64 und den erstellten
Deletionsmutanten wurde zuvor der genaue Versuchsaufbau für das jeweilige Mutagen etabliert. Details zu den Mutagenen siehe Abschnitt 2.2.4: „Mutagene“ und die
endgültige Versuchsdurchführung siehe 3.9: „Mutageneseassays mit S. lividans“.
100
Ergebnisse
4.2.1 MNNG (N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidin)
Das Protokoll wurde in abgewandelter Form dem Buch Hopwood et al. 1985 entnommen, wobei der Versuchsaufbau bezüglich MNNG-Konzentration, Inkubationszeit und Sporenaufbereitung zunächst an S. lividans TK64 getestet wurde. Nach diesen Vorversuchen zur MNNG-Mutagenese wurde eine Inkubationszeit von zwei
Stunden und eine MNNG-Konzentration von 1 mg/ml in 10 % DMSO bei der
Sporeninkubation gewählt. Nach der Inkubation wurden die Sporen nur noch in mehreren Schritten verdünnt und dann auf HT-Platten plattiert. Ein Abzentrifugieren der
Sporen und die Wiederaufnahme in Wasser, um das Mutagen vorher ganz zu entfernen, wurde nicht durchgeführt, da dies in den Vorversuchen zu einer geringeren Reproduzierbarkeit des Tests führte. Bei einem solchen Waschvorgang gingen zum Teil
viele Sporen verloren. Eine Auswertung der Versuche wäre dadurch nicht möglich
gewesen. Eine Kontrolle, in der der Stamm S. lividans TK64 sofort nach Zugabe von
MNNG verdünnt wurde, im Vergleich zur Behandlung nur mit Wasser oder 10 %
DMSO, zeigten keine verringerte Überlebensrate. MNNG ist offensichtlich nach der
entsprechenden Verdünnung nicht mehr ausreichend konzentriert, um die Lebensfähigkeit der Sporen auf den Platten noch zu beeinträchtigen.
4.2.2 EMS (Ethylmethansulfonat)
EMS wirkt methylierend wie MNNG und wurde in dieser Arbeit nur für einen Deletionsstamm verwendet (alkB). Es führt bevorzugt SN2-spezifische Methylierungen
durch, auf die AlkB spezialisiert sein soll. Der Mutageneseversuch wurde als Zeitreihe durchgeführt, so dass die Überlebensrate gegen die Inkubationszeit mit EMS aufgetragen werden konnte. Zur Bestimmung der richtigen EMS-Konzentration wurden
zuvor die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 nach einer Stunde mit verschiedenen Konzentrationen EMS getestet. Es wurde eine 5 %ige Lösung EMS (v/v)
in 0,2 M Kaliumphosphatpuffer pH 7 gewählt, bei der noch 20 % der Sporen überlebten. Natriumthiosulfat-Pentahydrat diente zum Abstoppen der Reaktion.
4.2.3 Zeocin
Das Antibiotikum Zeocin wurde direkt in einem Plattentest eingesetzt, der leicht zu
handhaben ist und gut reproduziert werden kann. Dazu wurden frische HTZeocinPlatten verwendet, da Zeocin lichtempfindlich ist und die fertigen Platten nicht lange
gelagert werden können. Die richtige Konzentration an Zeocin in den Platten wurde
über eine Testreihe mit dem Stamm S. lividans TK64 ermittelt (siehe Abbildung 21).
Für den Mutageneseversuch wurde eine Überlebensrate des Stammes von zirka
20 % angestrebt. In der Versuchsreihe stellte sich diese Überlebensrate bei der
zweithöchsten Zeocin-Konzentration ein. Daher wurde für die HTZeocin-Platten diese
Konzentration von 25 µg/ml Zeocin gewählt.
101
Ergebnisse
Abbildung 21: Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender ZeocinKonzentration
Es wurde eine Verdünnung von 300-500 Sporen S. lividans TK64 pro 100 µl hergestellt und jeweils 100 µl auf HT-Platten mit verschiedenen Konzentrationen Zeocin (0,
1, 2,5, 5, 10, 25 und 50 µg/ml) plattiert. Nach drei bis vier Tagen bei 30°C wurden die
heranwachsenden Kolonien ausgezählt und die Überlebensrate der Sporen auf HTZeocin-Platten im Vergleich zu HT 0-Platten bestimmt und in obigem Diagramm aufgetragen.
4.2.4 UV-Licht
Bei der UV-Licht-Mutagenese bot sich wie bei der Zeocin-Mutagenese ein Plattentest
an. Eine entsprechende Verdünnung der Sporen wurde vorgefertigt und auf zirka 30
HT-Platten plattiert, was gewährleistet, dass sich vor der Bestrahlung auf allen Platten mehr oder weniger die gleiche Anzahl an Sporen befindet. Das macht den Test
sehr einfach und reproduzierbar. Nach der Bestrahlung mit verschiedenen Dosen
UV-Licht ist die mutagene Wirkung der ionisierenden Strahlung direkt an der abnehmenden Anzahl noch heranwachsender Kolonien zu sehen. Die zu wählenden Bestrahlungsintensitäten wurde bei einem Vorversuch mit S. lividans TK64 ermittelt
(siehe Abbildung 22). Für die Deletionsmutanten wurde nach diesem Vorversuch eine Bestrahlung von 0 bis 100 J/m2 festgelegt, wobei Intervalle von 10 J/m 2 gewählt
wurden.
102
Ergebnisse
Abbildung 22: Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender UV-LichtIntensität
HT-Platten mit Sporen von S. lividans TK64 wurden unterschiedlichen Dosen UVLicht ausgesetzt und anschließend bei 30°C inkubiert. Über die Anzahl der noch heranwachsenden Kolonien im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle konnte die Überlebensrate in Prozent ermittelt werden.
4.2.5 Mitomycin C
Mitomycin C (MMC) ist sehr toxisch (siehe Abschnitt 2.2.4) und schon wenige Milligramm sehr teuer. Trotzdem sollte eine Versuchsreihe aufgestellt werden, in der die
Überlebensrate gegen eine zunehmende Konzentration des Mutagens aufgetragen
wird. Daher wurde ein Versuchsaufbau gewählt, in dem das Mitomycin C erst direkt
vor dem Plattieren der verschiedenen Sporenverdünnungen hinzukam und nur die
Menge Sporen-Mutagen-Lösung hergestellt wurde, die für die Plattierung nötig war
(geringst möglicher Verbrauch an Mitomycin C). Die toxische Wirkung des Mutagens
und welche Konzentrationen geeignet waren, wurden in einem Vorversuch mit
S. lividans TK64 bestimmt (siehe Abbildung 23, Konzentrationen von 2 bis 30 µg/ml).
Für die Mutageneseversuche mit den Deletionsmutanten wurden daraufhin sechs
Mitomycin C-Konzentrationen von 2,5 bis 25 µg/ml ausgewählt. Im Unterschied zum
Vorversuch wurden die Sporen jedoch nach Zugabe der Mutagenlösung sofort plattiert (keine Inkubation der Sporen in der Lösung für zirka 5 Minuten).
103
Ergebnisse
Abbildung 23: Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender Mitomycin C-Konzentration
Eine Endverdünnung der Sporen von S. lividans TK64 in einer Lösung mit Mitomycin C (MMC) der oben angegebenen Konzentration (Y-Achse) wurde auf HT-Platten
plattiert und die Überlebensrate der heranwachsenden Kolonien im Vergleich zur
Kontrolle ohne Mitomycin C bestimmt.
4.3
Charakterisierung der Deletionsstämme
Die Ergebnisse zu den einzelnen Deletionsstämmen werden in den folgenden Unterkapiteln dargestellt. Dabei werden sie in Gruppen präsentiert. Gene, die zu einem
bestimmten Reparatursystem gehören, werden gemeinsam behandelt.
Nach einer Aussage zur chromosomalen Stabilität der Deletionsmutante werden zuerst die Ergebnisse der MNNG- und Zeocin-Mutagenese gezeigt. Den zugehörigen
Abbildungsbeschriftungen ist jeweils zu entnehmen wie viele Klone einer Deletion
untersucht wurden (verdeutlicht im Fehlerbalken). Beim Stamm S. lividans TK64
handelt es sich dagegen um technische Replikate. Dieser Stamm wird in den Graphiken als Wildtyp (WT) tituliert, da es sich um den Ausgangsstamm für die Deletionen
handelt.
Für die anschließend präsentierten Ergebnisse der UV-Licht- und Mitomycin CMutagenese wurden jeweils nur zwei der zuvor untersuchten Klone der Deletionsmutanten verwendet, die sich zuvor im Mittelfeld bewegten. Dies wurde angesichts des
aufwendigen Versuchsaufbaus dieser Mutagenesen und der großen Zahl der Deletionsstämme so gewählt.
104
Ergebnisse
Bei jeder Deletion gab es eine Erwartungshaltung, gegenüber welchen Mutagenen
die entsprechenden Klone eine veränderte Überlebensrate zeigen. Es wurden trotzdem immer alle Mutagene getestet, um auch unerwartete Reaktionen zu erfassen.
4.3.1 Deletionsstämme der Prävention und Reversion der DNA-Reparatur
Aus der Gruppe der Gene für die Prävention und Reversion von DNA-Schäden wurden die Gene alkB (Protein: AlkB) und dut (Protein: dUTPase) deletiert. AlkB demethyliert alkylierte Basen (Reversion) und die dUTPase senkt den dUTP-Spiegel in der
Zelle (Prävention), wie in Abschnitt 2.3.1 erläutert.
Die erhaltenen Deletionsmutanten zeigten phänotypisch keine Veränderung zum Referenzstamm S. lividans TK64. Die chromosomale Stabilität war ebenfalls nicht beeinträchtigt. Wie bei dem Stamm S. lividans TK64 waren zirka 0,3 % der Sporen
Chloramphenicol-sensitiv.
Die Ergebnisse der Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin sind in Abbildung 24 zu sehen. Die Fehlerbalken zeigen die Spannweite der Ergebnisse für die verschiedenen
Klone der Deletionsmutanten bzw. die Variation bei technischen Replikaten des
Stammes S. lividans TK64 (WT).
MNNG
Zeocin
Abbildung 24: Überlebensrate von S. lividans TK64 (WT) und den Mutanten
alkB und dut nach der Behandlung mit MNNG (links) bzw. Zeocin (rechts)
Der Fehlerindikator bezieht sich beim Wildtyp auf 12 technische Replikate des Stammes S. lividans TK64 und bei den Mutanten auf sechs (alkB) bzw. vier (dut) erhaltene
Klone nach der Deletion.
Die Deletionsmutanten von alkB zeigen bei der Zeocin-Mutagenese mit im Mittel
24 % Überlebensrate eine um 4 % höhere Überlebensrate als S. lividans TK64 mit
20 %. Bei der MNNG-Mutagenese ist die Überlebensrate im Mittel um 7 % erniedrigt.
Allerdings streuen die Ergebnisse der sechs untersuchten Klone bei beiden Mutagenesen sehr stark, so dass nicht von einer signifikant veränderten Überlebensrate
ausgegangen werden kann.
105
Ergebnisse
Die Überlebensrate der dut Klone ist bei der MNNG-Mutagenese mit durchschnittlich
17 % nicht signifikant verändert im Vergleich zu S. lividans TK64 mit 19 %. Bei der
Zeocin-Mutagenese entspricht die Überlebensrate mit im Mittel 21 % annähernd der
von S. lividans TK64 (20 %).
MNNG ist ein SN1-spezifisch alkylierendes Mutagen (SN1 bzw. SN2 siehe Abschnitt
2.2.4 unter MNNG). AlkB ist jedoch spezialisiert auf die Demethylierung von S N2spezifischen Alkylierungen. Daher wurde für diese Deletionsmutanten noch ein weiteres Mutagen getestet, welches SN2-spezifisch alkyliert. In Abbildung 25 ist die Überlebensrate der alkB Mutanten und des Stammes S. lividans TK64 (WT) in Abhängigkeit von der Inkubationszeit mit 5 % EMS dargestellt. Die Überlebensrate der alkB
Mutanten ist im Vergleich mit S. lividans TK64 geringfügig reduziert.
Abbildung 25: Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
alkB Mutanten nach der Behandlung mit EMS
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von alkB in Abhängigkeit von der Inkubationszeit der Sporen mit
5 % EMS.
Die Deletionsmutanten von alkB zeigen bei der UV-Licht-Mutagenese eine reduzierte
Überlebensrate im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 (Abbildung 26).
Schon bei der geringsten Bestrahlungsintensität von 10 J/m² ist diese verringerte Vitalität zu erkennen (93 % bei alkB zu 96 % bei S. lividans TK64). Bei 50 J/m² ist die
Überlebensrate 15 % geringer (47 % bei alkB zu 62 % bei S. lividans TK64) und bei
der höchsten Bestrahlungsdosis von 100 J/m² keimen fast nur ein Drittel so viele
Sporen aus (4 % bei alkB zu 11 % bei S. lividans TK64).
106
Ergebnisse
Auch bei der Mutagenese mit Mitomycin C ist die Überlebensfähigkeit der alkB Mutanten beeinträchtigt (Abbildung 27). Bei der höchsten Konzentration an Mitomycin C
(25 µg/ml) keimen nur noch halb so viele Sporen aus als bei S. lividans TK64 (26 %
bei alkB zu 54,5 % bei S. lividans TK64).
Abbildung 26: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten alkB und
dut nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Die Sporen der verschiedenen Stämme wurden mit UV-Licht zunehmender Intensität
bestrahlt. Anschließend wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet und in Prozent aufgetragen.
Die Überlebensrate der dut Mutanten schwankt bei der Bestrahlung mit UV-Licht um
die Werte des Ausgangsstammes S. lividans TK64. Während die Überlebensrate bei
Bestrahlungsintensitäten bis 50 J/m2 erniedrigt ist, ist die Überlebensrate der dut Mutanten bei Bestrahlungsintensitäten über 60 J/m2 im Vergleich zu S. lividans TK64
erhöht. Gemittelt über alle Werte ist die Überlebensrate der dut Mutanten um 1,4 %
erhöht.
Bei der Mutagenese mit Mitomycin C nimmt die Überlebensrate der dut Mutanten bei
der geringsten Mitomycin C-Konzentration von 2,5 µg/ml zunächst stärker ab als die
des Ausgangsstammes (81 % bei dut zu 89 % bei S. lividans TK64). Bei einer Mitomycin C-Konzentration von 10 µg/ml ist die Überlebensrate der dut Mutanten ebenfalls um 8 % erniedrigt (64 % bei dut zu 72 % bei S. lividans TK64). Bei den Messungen der anderen Mitomycin C-Konzentrationen ist die Vitalität nicht signifikant verän107
Ergebnisse
dert im Vergleich zu S. lividans TK64 (Werte innerhalb der Streubreite des Referenzstammes). Insgesamt ist die Überlebensrate der dut Mutanten durchschnittlich um
4,5 % reduziert.
Abbildung 27: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten alkB und
dut nach der Mutagenese mit Mitomycin C zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von alkB und dut. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener
Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle berechnet und in
Prozent aufgetragen.
4.3.2 Deletionsstämme der Basenexzisionsreparatur
Bei dem Reparaturweg der Basenexzision wurden die Gene von vier DNAGlykosylasen deletiert: eine 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase (3maDG), das Gen
der Formamido-Pyrimidin-DNA-Glykosylase (mutM) und die Gene der zwei UracilDNA-Glykosylasen (ung1 und ung2). Zusätzlich wurden noch exoIII Mutanten erstellt,
bei denen das Gen der Exonuklease III deletiert ist (siehe auch Abschnitt 2.3.2).
Die Kolonien der verschiedenen Mutanten sahen phänotypisch so aus wie die des
Ausgangsstammes S. lividans TK64. Auch die chromosomale Stabilität, gemessen in
der Anzahl der Chloramphenicol-sensitiven Sporen, war unverändert und schwankte
um 0,3 %.
108
Ergebnisse
Die Ergebnisse der Mutagenese mit dem methylierenden Agens MNNG bzw. dem
DNA-Doppelstrangbruch einführenden Zeocin sind in Abbildung 28 dargestellt. Die
Fehlerbalken zeigen die Spannweite der Ergebnisse für die verschiedenen Klone der
Deletionsmutanten bzw. die Variation bei technischen Replikaten des Stammes
S. lividans TK64 (in der Abbildung mit „WT“ tituliert).
Bei der MNNG-Mutagenese ist bei den Glykosylase-Deletionsmutanten die Überlebensrate der mutM Mutanten im Mittel am stärksten reduziert (13 % zu 19 % bei
S. lividans TK64), die der 3maDG bzw. ung2 Mutanten mit jeweils zirka 16 % weniger
stark und die Überlebensrate der ung1 Mutanten ist mit durchschnittlich 25 % sogar
erhöht im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64. Im Hinblick auf die Variation der Überlebensrate einzelner Klone einer Deletion und die Streuung der Messwerte des Stammes S. lividans TK64 (siehe Fehlerbalken) ist zu beachten, dass es
bei den Werten jeweils größere Überlappungsbereiche gibt. Die exoIII Mutanten
zeigen eine reduzierte durchschnittliche Überlebensrate von 7 %. Die einzelnen
Werte der exoIII Mutanten streuen jedoch stark. Drei der untersuchten Mutanten
haben eine Überlebensrate zwischen 3 % und 6 % während die vierte exoIII Mutante
mit einer Überlebensrate von 17 % deutlich von den anderen abweicht und die
mittlere Überlebensrate damit auf 7 % erhöht.
MNNG
Zeocin
Abbildung 28: Überlebensrate von S. lividans TK64 (WT) und den Mutanten
3maDG, mutM, ung2, ung1 und exoIII nach der Behandlung mit
MNNG (links) bzw. Zeocin (rechts)
Der Fehlerindikator bezieht sich beim Wildtyp auf 12 technische Replikate des Stammes S. lividans TK64 und bei den Mutanten auf jeweils vier erhaltene Klone nach der
Deletion.
Die Überlebensrate nach der Mutagenese mit Zeocin ist für die 3maDG und mutM
Mutanten mit im Mittel 10 % und 12 % deutlich reduziert. Im Vergleich mit S. lividans
TK64 (im Mittel 20 %) keimen zirka nur halb so viele Sporen aus. Auch die Überlebensrate der ung2 Mutanten ist mit durchschnittlich 15 % reduziert, wobei fast alle
Messwerte (Einzelwerte zwischen 10 % und 19 %) noch innerhalb der Streubreite
109
Ergebnisse
des Ausgangsstammes S. lividans TK64 liegen (siehe Fehlerbalken: 11 % bis 26 %).
Die Überlebensrate der ung1 Mutanten ist im Mittel mit 28 % um 8 % höher als bei
S. lividans TK64. Es gibt dabei einen Überlappungsbereich der Fehlerbalken zwischen 23 % (tiefster Wert der ung1 Mutanten) und 26 % (höchster Wert von
S. lividans TK64). Die exoIII Mutanten sind bei der Zeocin-Mutagenese mit
durchschnittlich 20 % Überlebensrate nicht verändert.
Die Ergebnisse der UV-Licht-Mutagenese sind in Abbildung 29 dargestellt. Die Deletionsmutanten der Glykosylasen sind relativ unauffällig. Nur die mutM Mutanten zeigen vor allem bei höheren Bestrahlungsintensität eine verringerte Überlebensrate im
Vergleich mit S. lividans TK64 (zum Beispiel bei 70 J/m²: 35 % bei mutM zu 43 % bei
S. lividans TK64). Im Mittel ist die Überlebensrate der mutM Mutanten um 4 % reduziert. Die anderen Glykosylase-Deletionsmutanten zeigen kaum Abweichungen.
Durchschnittlich sind die Überlebensraten um 2,4 % (ung1 Mutanten), 1,5 % (ung2
Mutanten) und 2,3 % erhöht (3maDG Mutanten).
Abbildung 29: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten der Basenexzisionsreparatur nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von 3maDG, mutM, ung2, ung1 und exoIII. Nach der Bestrahlung
der Sporen mit UV-Licht zunehmender Intensität wurde die Überlebensrate im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet und in Prozent aufgetragen.
110
Ergebnisse
Die Überlebensrate der exoIII Mutanten ist dagegen durchschnittlich um 8 % reduziert verglichen mit S. lividans TK64.
Bei der Mutagenese mit Mitomycin C ist die Überlebensrate der ung2 Mutanten und
der exoIII Mutanten leicht reduziert im Vergleich mit dem Referenzstamm (ung2:
5,6 % und exoIII: 3,1 % durchschnittliche Abweichung) (siehe Abbildung 30). Die anderen Deletionsmutanten sind resistenter gegenüber Mitomycin C. Bei der höchsten
Mitomycin C-Konzentration von 25 µg/ml haben die mutM Mutanten noch eine Überlebensrate von 77 % und auch die Mutanten von 3maDG bzw. ung1 sind mit 69 %
bzw. 70 % im Vergleich zu S. lividans TK64 mit 55 % deutlich vitaler. Im Mittel weichen die Mutanten um 11 % (mutM), 10 % (3maDG) und 13 % bei ung1 ab.
Abbildung 30: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten der Basenexzisionsreparatur nach der Mutagenese mit Mitomycin C
zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von 3maDG, mutM, ung2, ung1 und exoIII. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten
Kontrolle berechnet und in Prozent aufgetragen.
4.3.3 Deletionsstämme der Nukleotidexzisionsreparatur
Die zentralen Enzyme der Nukleotidexzisionsreparatur sind UvrA, UvrB und UvrC
(siehe Abschnitt 2.2.3). Das Gen von UvrB wurde deletiert.
111
Ergebnisse
Phänotypisch zeigten die Kolonien der uvrB Mutanten keine Veränderung zum Ausgangsstamm S. lividans TK64. Die chromosomale Stabilität war mit zirka 1 % Chloramphenicol-sensitiven Kolonien erhöht im Vergleich zu S. lividans TK64 (zirka
0,3 %).
Bei der MNNG-Mutagenese zeigen die uvrB Mutanten mit im Mittel 19 % Überlebensrate keine Veränderung zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 (siehe linkes
Diagramm Abbildung 31). Ein einzelner uvrB Klon weicht dabei mit einer Überlebensrate von 7 % deutlich von den anderen vier Klonen ab, die zwischen 19 % und 26 %
liegen. Auch bei der Mutagenese mit Zeocin ist die Vitalität der uvrB Mutanten (im
Mittel 20 %) unverändert zu S. lividans TK64 (siehe rechtes Diagramm Abbildung
31).
MNNG
Zeocin
Abbildung 31: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der Nukleotidexzisionsreparatur nach der Behandlung mit MNNG (links)
bzw. Zeocin (rechts)
Die Balkendiagramme zeigen die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64
(WT) und der Deletionsmutanten von uvrB nach der Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin. Der Fehlerindikator bezieht sich beim Wildtyp auf 12 technische Replikate des
Stammes S. lividans TK64 und bei der Mutante auf fünf erhaltene Klone nach der Deletion.
Die Überlebensrate nach der Bestrahlung mit verschiedenen Dosen UV-Licht ist in
Abbildung 32 dargestellt. Es ist zu sehen, dass die Überlebensfähigkeit der uvrB Mutanten mit zunehmender UV-Licht-Intensität rasch abnehmen. Während beim Referenzstamm S. lividans TK64 (hier WT) bei der geringsten UV-Licht-Intensität noch
96 % der Sporen auskeimen, sind es bei den uvrB Mutanten nur 66 %. Bei einer UVLicht-Intensität von 60 J/m2 sind bei den uvrB Mutanten weniger als 1 % der Sporen
lebensfähig, während S. lividans TK64 noch eine Überlebensrate von 54 % besitzt
und selbst bei der höchsten Dosis von 100 J/m2 noch 11 % der Sporen auskeimen.
Über alle Messwerte gerechnet ist die Überlebensrate im Durchschnitt um 44 % erniedrigt.
112
Ergebnisse
Abbildung 32: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der Nukleotidexzisionsreparatur nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von uvrB. Nach der Bestrahlung der Sporen mit UV-Licht zunehmender Intensität wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im
Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet und in Prozent aufgetragen.
Abbildung 33 zeigt die Überlebensrate von S. lividans TK64 (WT) und den uvrB Mutanten nach der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen Mitomycin C. Die
uvrB Mutanten haben eine stark reduzierte Überlebensrate im Vergleich zu
S. lividans TK64. Bei der geringsten Mitomycin C-Konzentration keimen noch 89 %
der Sporen von S. lividans TK64 aus, aber nur 55 % der Sporen der uvrB Mutanten.
Im weiteren Verlauf sinkt die Überlebensrate der uvrB Mutanten weiterhin schneller
ab als die Überlebensrate von S. lividans TK64. Bei der höchsten Konzentration Mitomycin C hat S. lividans TK64 noch eine Überlebensrate von 55 % während die
uvrB Mutanten bei 4 % liegen. Im Mittel gerechnet ist die Überlebensrate der uvrB
Mutanten um 48 % geringer als beim Ausgangsstamm.
113
Ergebnisse
Abbildung 33: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der Nukleotidexzisionsreparatur nach der Mutagenese mit Mitomycin C
zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von uvrB. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle berechnet und in
Prozent aufgetragen.
4.3.4 Deletionsstämme des nicht-homologen Verbindens von Enden
Das nicht-homologe Verbinden von Enden (NHEJ, engl.: non-homologous endjoining) spielt in Eukaryoten eine wichtige Rolle bei der Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSB) (siehe Abschnitt 2.3.5). Die Gene für ein ku-ähnliches Gen und eine
Ligase, die auf dem Chromosom nebeneinander liegen, wurden deletiert, um zu testen, ob sie diese Funktion in S. lividans TK64 übernehmen.
Die Kolonien der ku+lig Mutanten waren phänotypisch unauffällig und zeigten auch
keine erhöhte chromosomale Instabilität (Chloramphenicol-sensitive Kolonien) im
Vergleich zum Referenzstamm S. lividans TK64.
Die Ergebnisse der Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin sind in Abbildung 34 dargestellt. S. lividans TK64 hat bei der MNNG-Mutagenese und bei der ZeocinMutagenese eine Überlebensrate von durchschnittlich 19 % bzw. 20 %. Die ku+lig
Mutanten zeigen mit einer Überlebensrate von durchschnittlich knapp 20 % bei der
114
Ergebnisse
MNNG-Mutagenese und 23 % bei der Zeocin-Mutagenese keine signifikante Abweichung im Vergleich mit S. lividans TK64. Die Überlebensrate der einzelnen ku+lig
Mutanten streut jedoch über 10 % um diesen Mittelwert (siehe Fehlerbalken im Diagramm).
MNNG
Zeocin
Abbildung 34: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des NHEJ
nach der Behandlung mit MNNG (links) bzw. Zeocin (rechts)
Der Fehlerindikator bezieht sich bei S. lividans TK64 (WT) auf 12 technische Replikate des Stammes S. lividans TK64 und bei der Mutante ku+lig auf fünf erhaltene Klone
nach der Deletion.
Abbildung 35: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des NHEJ
nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Nach der Bestrahlung der Sporen mit UV-Licht zunehmender Intensität wurde die
Überlebensrate im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet und in Prozent
aufgetragen.
115
Ergebnisse
Die ku+lig Mutanten haben bei der Bestrahlung mit UV-Licht geringer Intensität eine
leicht verringerte Überlebensrate (siehe Abbildung 35). Bis 70 J/m2 keimen jeweils
zirka 7 % weniger Sporen aus als bei dem Ausgangsstamm S. lividans TK64. Dann
nähern sich die Überlebensraten an und sind bei der stärksten UV-Licht-Intensität
identisch (11 % bei ku+lig und bei S. lividans TK64). Insgesamt ist die Überlebensrate der ku+lig Mutanten durchschnittlich um 5 % erniedrigt.
Abbildung 36: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des NHEJ
nach der Mutagenese mit Mitomycin C zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutante von ku+lig. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle berechnet und in
Prozent aufgetragen.
Bei der Mitomycin C Mutagenese sinkt die Überlebensrate von S. lividans TK64 und
den ku+lig Mutanten ähnlich stark ab. Im Mittel ist die Überlebensrate der ku+lig Mutanten um 1 % erhöht. Die stärkste Abweichung ist bei 15 µg/ml Mitomycin C mit 4 %
gegeben (68 % bei ku+lig und 64 % bei S. lividans TK64).
116
Ergebnisse
4.3.5 Deletionsstämme der Rekombinationsreparatur
Die Ergebnisse der Deletionsmutanten bezüglich der Rekombinationsreparatur werden nachfolgend in zwei Gruppen vorgestellt.
Die erste Gruppe umfasst die Enzyme der präsynaptischen und postsynaptischen
Phase der homologen Rekombination (siehe Kapitel 2.3.4, „der RecF-Weg“). Das an
der präsynaptischen Phase beteiligte recO wurde erfolgreich deletiert und eine Deletionsmutante von recF wurde gestellt (siehe unter Abschnitt 4.1.3). Die an der postsynaptischen Phase der homologen Rekombination beteiligten Gene ruvA, ruvB und
ruvC, die auf dem Chromosom nebeneinander in einem Operon liegen, wurden zusammen deletiert. Daher wird dieser Deletionsstamm nachfolgend als die ruvABC
Mutante bezeichnet. Desweiteren wurde das Gen für RecG deletiert, welches alternativ zu RuvA, RuvB und RuvC Strangüberkreuzungen auflösen kann.
Die zweite Gruppe besteht ebenfalls aus vier Deletionsmutanten: recD, dessen Funktion ohne recB und recC unklar ist (siehe unter Abschnitt 2.3.4 der „RecBCD-Weg“);
recQ und recN (siehe unter 2.3.4 „Wie RecFOR RecBCD ersetzen kann“) sowie die
Doppeldeletionsmutante von sbcC und sbcD (siehe unter 2.3.4 „Wie RecFOR
RecBCD ersetzen kann“).
Die Ergebnisse der ersten Gruppe sind in den Abbildungen 38 bis 41 dargestellt. Innerhalb dieser Gruppe gab es erstmalig Deletionsstämme, bei denen die Mehrzahl
der Kolonien sich phänotypisch vom Referenzstamm S. lividans TK64 deutlich unterschied und bei den Deletionen von ruvABC, recO und recF verfärbte sich das HTMedium zunächst unter den Kolonien und nach einigen Tagen in der ganzen Platte
blau.
a
b
c
d
Abbildung 37: Kolonien von S. lividans TK64 auf einer HT-Platte.
Sporen von S. lividans TK64 wurden auf eine HT-Platte plattiert. Die heranwachsenden Kolonien wurden bei 30°C bis zur Sporulation zirka eine Woche inkubiert. Die
Bilder zeigen a) normal gewachsene Kolonien und b-d) Kolonien mit verändertem
Phänotyp (Mutanten).
Die Kolonien von S. lividans TK64 bilden grau sporulierende, gewölbte Kolonien
(siehe Abbildung 37, a). Eine geringe Anzahl der Kolonien (weniger als 1 %) zeigen
keine Sporulation und sind weiß. Sehr selten kommen Kolonien vor, die kleiner und
117
Ergebnisse
flacher sind oder rötlich bzw. blau eingefärbt. Diese Kolonien haben größere Deletionen im Chromosom und sind in der Regel auch Chloramphenicol-sensitiv (siehe Abbildung 37, b-d). Daher entsprechen die Prozentzahlen in Abbildung 38 auch ungefähr dem Anteil dieser veränderten Kolonien, welche bei den Deletionsmutanten dieser Gruppe stark erhöht waren. Bei der ruvABC Mutante waren im Mittel 4,8 % der
Kolonien Chloramphenicol-sensitiv (linke Graphik in Abbildung 38). Bei den recO
bzw. recF Mutanten waren es im Mittel 8,4 % bzw. 10 % der Kolonien. Die chromosomale Instabilität der recG Mutanten war mit im Mittel 0,8 % weniger stark erhöht.
Zudem gab es in dieser Deletionsgruppe auffällig viele kleine, flache und verfärbte
Kolonien, die nach der Überimpfung auf frische HT-Platten nicht wieder angewachsen sind. Der Phänotyp dieser Kolonien wurde mit NLK (nicht lebensfähige Kolonie)
abgekürzt. Die Häufigkeit ihres Auftretens ist in dem rechten Diagramm der Abbildung 38 zu sehen. Bei recG lag der Anteil der NLK wie bei S. lividans TK64 unter
0,5 %. Die ruvABC Mutanten zeigten durchschnittlich 1,7 % NLK und die Deletionsmutanten recO bzw. recF hatten im Mittel 26 % bzw. 24 % solcher Kolonien. Damit
sind bei recO und recF ein Viertel der Sporen, nach einmaligem Anwachsen, nicht
mehr lebensfähig.
Abbildung 38: Chromosomale Instabilität (links) und nicht lebensfähige Kolonien (rechts) von S. lividans TK64 und den Mutanten ruvABC,
recG, recO und recF
Das linke Diagramm zeigt die chromosomale Instabilität der Deletionsmutanten anhand des Prozentsatzes Chloramphenicol-sensitiver Kolonien (CmS). Das rechte Diagramm stellt den Prozentsatz der Kolonien dar, die nach dem Überimpfen auf frische
HT-Platten nicht mehr anwuchsen. Diese Kolonien wurde daher NLK (nicht lebensfähige Kolonie) genannt. Zur Ermittlung der Anzahl dieser Kolonien wurden Sporen der
Deletionsmutanten auf HT-Platten ausgestrichen und eine Woche bei 30°C inkubiert.
Die Kolonien wurden anschließend auf frische HT-Platten überimpft und weiter bei
30°C inkubiert. Der angegebene Prozentsatz der NLK wuchs auf dieser zweiten HTPlatte nicht mehr an. Der Fehlerindikator bezieht sich bei S. lividans TK64 (hier: WT,
Wildtyp) und bei recF auf zwei technische Replikate und bei den Mutanten auf sechs
(ruvABC), fünf (recG) und vier (recO) erhaltene Klone nach der Deletion.
118
Ergebnisse
Bei der MNNG-Mutagenese (Abbildung 39 linkes Diagramm) ist die Überlebensrate
der ruvABC und recG Mutanten mit durchschnittlich 25 % und 22 % leicht erhöht im
Vergleich zu S. lividans TK64 (19 %). Die Messwerte liegen jedoch noch innerhalb
der Streubreite des Ausgangsstammes (siehe Fehlerbalken S. lividans TK64). Die
Überlebensrate der recO und recF Mutanten ist mit durchschnittlich 5 % und 3 % dagegen deutlich reduziert.
Die Ergebnisse der Zeocin-Mutagenese sind im rechten Diagramm der Abbildung 39
dargestellt. Mit im Mittel 22 % Überlebensrate zeigen die recG Mutanten keine signifikante Abweichung vom Ausgangsstamm S. lividans TK64 (20 %). Die Sporen der
Deletionsmutanten von ruvABC, recO und recF dagegen keimten auf einem Medium
mit 25 µg/ml Zeocin nicht aus. Die Überlebensrate war daher < 0,1 % (bei zirka 1000
plattierten Sporen).
MNNG
Zeocin
Abbildung 39: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten ruvABC,
recG, recO und recF nach der Behandlung mit MNNG (links)
bzw. Zeocin (rechts)
Die Balkendiagramme zeigen die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64
(WT) und der Deletionsmutanten von ruvABC, recG, recO und recF nach der Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin. Der Fehlerindikator bezieht sich beim Wildtyp auf 12
technische Replikate des Stammes S. lividans TK64 und bei den Mutanten auf sieben
(ruvABC), fünf (recG) und vier (recO) erhaltene Klone nach der Deletion.
Die Ergebnisse der UV-Licht-Mutagenese sind in Abbildung 40 zu sehen. Die Überlebensrate der ruvABC und recG Mutanten ist im Vergleich zu S. lividans TK64 (WT)
reduziert. Bis zu einer Bestrahlungsintensität von 40 J/m2 sinkt die Überlebensrate
dieser beiden Deletionsmutanten fast gleich ab und ist bei 40 J/m2 10-11 % niedriger
als die des Ausgangsstammes (74 % bei S. lividans TK64, 65 % bei ruvABC und
64 % bei recG). Bei UV-Licht stärkerer Intensität ist die Überlebensrate der ruvABC
Mutanten nicht mehr so stark reduziert und nähert sich bei maximaler UV-Licht Bestrahlung von 100 J/m2 mit 9 % auskeimenden Sporen dem Ausgangsstamm auf 2 %
Differenz an (11 % bei S. lividans TK64). Allerdings streuen die Werte der drei unter119
Ergebnisse
suchten ruvABC Mutanten bis zu 15 %. Die Fehlerbalken der ruvABC-Werte sind
daher in der Abbildung als einzige verdickt hervorgehoben. Die Überlebensrate der
recG Mutanten ist stärker reduziert und erreicht bei 100 J/m2 einen Wert von 4 %.
Gemittelt über alle Messwerte ist die Überlebensrate der ruvABC Mutanten bzw. der
recG Mutanten um 4,6 % bzw. 10 % reduziert. Die Überlebensrate der recO und recF
Mutanten sinkt schnell ab. Bei der geringsten UV-Licht-Intensität von 10 J/m2 keimen
bei recO 79 % der Sporen aus und bei recF nur noch 37 %. Bei einer UV-Licht Dosis
von 50 J/m2 erreicht die Überlebensrate der recO Mutanten 2 % und die Sporen der
recF Mutanten keimen nicht mehr aus (< 0,1 % Überlebensrate), während S. lividans
TK64 noch einen Prozentsatz von 62 % vitaler Sporen aufweist. Bei 70 J/m2 sinkt
auch die Überlebensrate der recO Mutanten auf < 0,1 %. S. lividans TK64 hat bei
70 J/m2 noch eine Überlebensrate von 43 %. Die durchschnittliche Abweichung vom
Referenzstamm beträgt für die recO Mutanten 39 % und für die recF Mutanten 50 %.
Abbildung 40: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten ruvABC,
recG, recO und recF nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von ruvABC, recG, recO und recF. Nach der Bestrahlung der plattierten Sporen mit UV-Licht zunehmender Intensität wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet
und in Prozent aufgetragen.
120
Ergebnisse
Die Behandlung mit Mitomycin C wirkt sich ebenfalls auf die recO und recF Mutanten
am stärksten aus (siehe Abbildung 41). Bei der geringsten Konzentration Mitomycin C von 2,5 µg/ml hat S. lividans TK64 eine Überlebensrate von 89 %. Die Sporen
der recO Mutanten keimen nur noch zu 9 % aus und die der recF Mutanten zu unter
2 %. Bereits die nächsthöchste Mitomycin C-Konzentration von 5 µg/ml ist für beide
Deletionsmutanten letal. Die Überlebensrate der recG Mutanten ist im Durchschnitt
6,8 % geringer als die von S. lividans TK64, wobei die Ergebnisse der beiden untersuchten Klone bei allen Mitomycin C-Konzentration stark streuen (siehe Fehlerbalken). Die ruvABC Mutanten sind in ihrer Vitalität noch stärker beeinträchtigt als die
recG Mutanten. Die Überlebensrate der ruvABC Mutanten ist über alle Mitomycin CKonzentrationen durchschnittlich um 33 Prozentpunkte niedriger als bei S. lividans
TK64.
Abbildung 41: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten ruvABC,
recG, recO und recF nach der Mutagenese mit Mitomycin C zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von ruvABC, recG, recO und recF. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle
berechnet und in Prozent aufgetragen.
121
Ergebnisse
Die Ergebnisse der zweiten Gruppe, die in den Genen für Rekombinationsreparatur
betroffen sind, sind in den nachfolgenden Abbildungen zu sehen.
Alle Deletionsstämme dieser Gruppe waren phänotypisch unauffällig und zeigten
keine signifikant erhöhte chromosomale Instabilität. Bei allen Deletionsmutanten war
die Anzahl der Chloramphenicol-sensitiven Kolonien unter 1 %.
Die recD Deletionsmutanten sind sowohl bei der MNNG- als auch bei der ZeocinMutagenese mit 22 % (MNNG-Behandlung) bzw. 20 % (Zeocin-Mutagenese)
durchschnittlicher Überlebensrate unauffällig. Die Differenz zu S. lividans TK64 (WT,
MNNG: 19 %, Zeocin: 20 %) beträgt nur 3 % bzw. 0 % (siehe Abbildung 42). Die
recQ Mutanten sind bei der Zeocin-Mutagenese mit durchschnittlich 20 %
Überlebensrate ebenfalls nicht verändert. Allerdings zeigen die recQ Mutanten eine
reduzierte durchschnittliche Überlebensrate bei der MNNG Mutagenese (8 %). Die
recN Mutanten zeigen bei der MNNG-Mutagenese mit durchschnittlich 23 %
Überlebensrate eine leichte um 4 % erhöhte Überlebensrate im Vergleich zum
Ausgangsstamm. Die Überlebensrate bei der Zeocin-Mutagenese ist mit im Mittel
15 % um 5 % erniedrigt im Vergleich zu S. lividans TK64 (20 %). Die Überlebensrate
der einzelnen untersuchten Deletionsmutanten von recN streuen mit Werten zwischen 7 % und 25 % allerdings deutlich. Die sbcCD Mutanten zeigen bei beiden Mutagenesen eine signifikant erhöhte Überlebensrate. Bei der Behandlung mit MNNG
keimen noch 35 % der Sporen aus und 40 % der Sporen sind bei der ZeocinMutagenese noch lebensfähig. Im Vergleich mit S. lividans TK64 entspricht dies einer
Erhöhung der Überlebensrate um durchschnittlich 16 Prozentpunkte bei der MNNGMutagenese und 20 Prozentpunkte bei der Zeocin-Mutagenese.
MNNG
Zeocin
Abbildung 42: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Behandlung mit MNNG (links)
bzw. Zeocin (rechts)
Die Balkendiagramme zeigen die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64
(WT) und der Deletionsmutanten von recD, recQ, recN und sbcCD nach der Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin. Der Fehlerindikator bezieht sich beim Wildtyp auf 12
technische Replikate des Stammes S. lividans TK64 und bei den Mutanten auf sechs
(recD), zwei (recQ) und vier (recN, sbcCD) erhaltene Klone nach der Deletion.
122
Ergebnisse
Die Ergebnisse der UV-Licht Mutagenese zeigen für diese Deletionsgruppe keine
Mutanten, die extrem sensitiv gegenüber UV-Licht reagieren (siehe
Abbildung 43). Die Überlebensrate der sbcCD Mutanten schwankt um die Werte des
Ausgangsstammes S. lividans TK64. Die durchschnittliche Abweichung zu den Werten von S. lividans TK64 beträgt nur 0,7 %. Die Überlebensraten der recD
Deletionsmutanten sind im Vergleich mit S. lividans TK64 reduziert. Die größte Ab-
weichung beträgt 10 % bei 10 J/m2 (recD: 86 % und S. lividans TK64: 96 %).
Abbildung 43: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender Intensität
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von recD, recQ, recN und sbcCD. Nach der Bestrahlung der plattierten Sporen mit UV-Licht zunehmender Intensität wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet
und in % aufgetragen.
Gemittelt über alle Bestrahlungsintensitäten ist die Überlebensrate der recD Mutanten durchschnittlich um 5 % erniedrigt. Die recQ Mutanten verhalten sich sehr ähnlich
wie die recD Mutanten mit einer durchschnittlichen Erniedrigung der Überlebensrate
von 4 % im Vergleich zu S. lividans TK64. Die stärkste Reduktion der Vitalität ist bei
40 J/m2 (recQ: 67 % und S. lividans TK64: 74 %). Die Überlebensrate der recN Mu123
Ergebnisse
tanten ist durchschnittlich um 8 % reduziert verglichen mit S. lividans TK64. Bei Bestrahlungsintensitäten zwischen 20 und 70 J/m2 keimen dabei verhältnismäßig weniger Sporen aus als bei der geringsten oder den höheren UV-Licht Dosen.
Die Ergebnisse der Mitomycin C Mutagenese sind in Abbildung 44 zu sehen. Die
Überlebensrate der recD Mutanten ist im Vergleich mit S. lividans TK64 nicht signifikant verändert (durchschnittlich 0,3 % Abweichung). Die Überlebensfähigkeit der
recN Mutanten ist gegenüber dem Ausgangsstamm reduziert. Gemittelt über alle Mitomycin C-Konzentrationen sind ihre Überlebensraten um 7 % erniedrigt. Die Vitalität
der recQ Mutanten ist noch stärker beeinträchtigt, mit einer durchschnittlich um 14 %
geringeren Überlebensrate als S. lividans TK64. Die größte Differenz liegt bei
25 µg/ml Mitomycin C (recQ: 31 % und S. lividans TK64: 55 %). Dagegen keimen bei
den sbcCD Mutanten durchschnittlich 5 % mehr Sporen aus als bei S. lividans TK64.
Abbildung 44: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Mutagenese mit Mitomycin C
zunehmender Konzentration
Das Diagramm zeigt die Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
Deletionsmutanten von recD, recQ, recN und sbcCD. Die Sporen wurden Mitomycin C verschiedener Konzentration ausgesetzt und plattiert. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle
berechnet und in % aufgetragen.
124
Ergebnisse
4.3.6 Zusammenfassung der Mutageneseversuche
Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnisse der Deletionsmutanten zusammen.
Tabelle 10:
Ergebnissüberblick der Mutageneseversuche
Gen
Reparatursystem
S. lividans
TK64
-
dut
P&R
alkB
P&R
3maDG
BER
ung1
BER
ung2
mutM
exoIII
uvrB
recN
recD
recQ
BER
BER
BER
NER
RR
RR
RR
recF
RR
recO
RR
ruvABC
recG
sbcCD
Ku+lig
RR
RR
RR
NHEJ
CmS
0,32
[0,5; 0,2]
0,21
[0,32; 0,01]
0,33
[0,6; 0,2]
0,24
[0,33; 0,14]
0,32
[0,56; 0,12]
0,58
[0,46; 0,7]
0,31
[0,34; 0,27]
0,31
[0,52; 0,14]
0,97
[1,1; 0,8]
0,75
[1,1; 0,2]
0,47
[0,8; 0,0]
0,86
[1,01; 0,71]
10,0
[12; 8]
8,43
[10,9; 5,7]
4,77
[6,3; 2,9]
0,83
[1,1; 0,7]
0,65
[1,1; 0,44]
1,3
[2,4; 0,8]
NLK
0,33
< 0,2
0,25
< 0,2
< 0,2
< 0,2
< 0,2
< 0,2
0,6
0,2
0,12
0,15
24,0
26,1
1,7
0,3
< 0,2
0,2
MNNG
Zeocin
UV-Licht
MMC
19,1
20,2
53,6
54,5
[27; 11]
[26; 11]
+/- 3,9
+/- 9,6
16,8
21,0
55,3
51,3
[25; 9]
[30; 15]
+/- 4,7
+/- 3,7
16,3
24,0
32,5
25,8
[23; 5]
[34; 11]
+/- 0,9
+/- 1,9
15,9
10,4
58,3
68,9
[19; 11]
[15; 8]
+/- 3,1
+/- 1,3
25,2
28,4
59,8
70,2
[29; 17]
[34; 23]
+/- 5,6
+/- 2,0
16,4
15,0
58,5
51,5
[21; 13]
[19; 10]
+/- 1,5
+/- 8,8
13,1
12,2
48,9
76,6
[16; 10]
[16; 8]
+/- 3,4
+/- 5,9
7,1
20,5
39,0
48,0
[17; 3]
[23; 15]
+/- 0,4
+/- 1,6
19,4
20,0
0,7
4,3
[26; 7]
[25; 17]
+/- 0,3
+/- 2,4
23,0
14,9
43,6
40,8
[30; 16]
[25; 7]
+/- 1,7
+/- 4,9
22,0
20,1
47,0
52,7
[29; 13]
[28; 15]
+/- 5,4
+/- 5,1
8,0
19,8
49,3
31,4
[11; 5]
[22; 18]
+/- 6,0
+/- 7,0
< 0,1
< 0,1
< 0,1
[0; 0]
+/- 0
+/- 0
5,4
< 0,1
1,2
< 0,1
3,1
[7; 4]
[0,2; 0]
+/- 0,2
+/- 0
24,8
< 0,1
48,7
21,3
[30; 20]
[0; 0]
+ 10; - 15,4
+/- 1,1
21,3
21,7
36,3
49,3
[27; 15]
[33; 14]
+/- 3,0
+/- 7,0
34,5
40,2
55,1
61,5
[39; 30]
[45; 35]
+/- 4,9
+/- 0,8
19,5
23,2
46,7
53,4
[33; 8]
[30; 7]
+/- 5,2
+/- 4,1
Reparatursysteme: P&R: Prävention und Reversion, NHEJ: nicht-homologes Verbinden von Enden,
BER: Basenexzisionsreparatur, NER: Nukleotidexzisionsreparatur, RR: Rekombinationsreparatur,
S
Cm : Prozentsatz der Chloramphenicol-sensitiven Kolonien, NLK: Prozentsatz der nicht lebensfähigen Kolonien, MNNG: Überlebensrate in % nach der Behandlung mit MNNG (1 mg/ml, 2 h), Zeocin:
Überlebensrate in % nach der Mutagenese mit Zeocin (25 µg/ml), UV-Licht: Überlebensrate in %
125
Ergebnisse
2
nach der Bestrahlung mit UV-Licht bei 60 J/m , MMC: Überlebensrate in % nach der Mutagenese mit
25 µg/ml Mitomycin C. Die obere Zahl gibt immer den Mittelwert der getesteten Mutanten an und die
untere Zeile den jeweils höchsten/tiefsten gemessenen Wert bzw. bei UV-Licht und MMC die Abweichung vom Mittelwert.
Bei Kästchen, die nicht farblich hervorgehoben sind, befindet sich der Mittelwert der
Mutanten innerhalb der Streubreite des Ausgangsstammes S. lividans TK64 (technische Replikate). Bei Werten in hellgrau hinterlegten Kästchen liegt der Mittelwert der
Mutante nicht mehr innerhalb der Streuung des Ausgangsstammes, jedoch überlappt
diese mit der Streubreite der Mutanten selbst. In hellgrau hinterlegten Kästchen mit
fettgedruckter Schrift ist keine Überlappung des höchsten bzw. tiefsten Wertes der
Mutanten mit den Messungen von S. lividans TK64 vorhanden. Sind die Kästchen
noch dunkler hinterlegt, ist die Abweichung vom Mittelwert des Ausgangsstammes S.
lividans TK64 stärker. Für die Tabellenwerte der UV-Licht-Mutagenese und der Mutagenese mit Mitomycin C wurde aus den aufgenommenen Kurven der Überlebensraten ein Messpunkt exemplarisch herausgenommen (bei UV-Licht der Messwert bei
60 J/m2 und für Mitomycin C die Messung mit 25 µg/ml).
126
Ergebnisse
4.4
Komplementation Rekombinations-defekter E. coli Stämme
Mit Hilfe der Komplementation sollte untersucht werden, ob Gene für bestimmte
DNA-Reparaturproteine aus S. lividans TK64 ein entsprechendes Defizit in E. coli
Stämmen ausgleichen (komplementieren) können. Der Wildtyp Stamm E. coli CL1
und die zugehörigen Deletionsstämme (CL4: recD, CL5: recF, CL544: recR,
CL585: recO) wurden von der Arbeitsgruppe Justin Courcelle (Portland State University, Department of Biology, P.O. Box 751, Portland, Oregon) zur Verfügung gestellt. Eine Auflistung der verwendeten Stämme mit genauem Genotyp (Courcelle J.,
Hanawalt P. C., 1999) findet sich in Abschnitt 3.8. Konzentrationsangaben zu den
erforderlichen Zusätzen sind unter 3.4.2 zu finden. Es wurde die Komplementation
für die Gene recF, recO, recR und recD untersucht.
Die ausgewählten Gene wurden in verschiedene Vektoren eingefügt, welche teilweise zuvor modifiziert wurden. Die Abbildungen 45 bis 47 zeigen die Konstruktionsschemen für die Komplementationsvektoren.
Bei der Komplementation wurde eine nicht zu starke aber konstante Genexpression
angestrebt. Daher fiel die Entscheidung auf den Kanamycinpromotor des Transposons Tn5. Dieser wurde mittels einer PCR aus dem Vektor pJOE4908.1 amplifiziert
(Primer s5002 und s5003), wobei die Schnittstellen MunI und NdeI an den Enden
hinzugefügt wurden. Die Expressionsvektoren pJOE4042.1 und pJOE4602.1 wurden
mit MunI und NdeI geschnitten und mit dem ebenfalls MunI und NdeI geschnittenen
Kanamycinpromotor ligiert (siehe Abbildung 45). Durch diesen Schritt wurden der
Rhamnosepromotor durch den Kanamycinpromotor ausgetauscht und die Grundvektoren für die Komplementation pLIG147.1 und pLIG148.1 geschaffen. Nach dem Einsetzen der gewünschten Gene ist in dem Vektor pLIG147.1, je nach gewählter
Schnittstelle, eine Expression des unveränderten Gens oder auch eine Expression
mit einem C-terminalen Streptavidin-Tag möglich. Der Vektor pLIG148.1 kann für die
Expression eines Gens mit einem N-terminalen Streptavidin-Tag genutzt werden. Bei
dem Streptavidin-Tag (kurz: Strep-Tag) handelt es sich um eine kurze Sequenz, die
acht Aminosäuren kodiert (WSHPQFEK). Normalerweise wird dieser Tag genutzt,
um die Proteine aus dem Zellextrakt aufzureinigen. N-terminal kann ein Strep-Tag
jedoch auch die Expression eines heterologen Gens verbessern.
127
Ergebnisse
Abbildung 45: Konstruktionsschema der Grundvektoren pLIG147.1 und
pLIG148.1 für die Komplementation von E. coli rec Mutanten
Die Expressionsvektoren pJOE4042.1 und pJOE4602.1 wurden mit MunI und NdeI
geschnitten und mit dem ebenso geschnittenen Kanamycinpromotor ligiert. Dieser
wurde zuvor mit den Oligonukleotiden s5002 (mit  MunI) und s5003 (mit  NdeI)
aus pJOE4908.1 amplifiziert.
Die Gene recF, recO, recR und recD wurden mittels PCR aus der chromosomalen
DNA von S. lividans TK64 amplifiziert. Für die Insertion in das Plasmid pLIG147.1
wurden dabei die Schnittstellen NdeI und HindIII durch die Primer angehängt (recF:
s4812, s4813, recO: s5046, s5047, recR: s5050, s5051 und recD: s4808, s4810).
Die amplifizierten Gene und der Vektor pLIG147.1 wurden mit NdeI und HindIII geschnitten und miteinander ligiert. In Abbildung 46 ist diese Ligation dargestellt. Der
resultierende Vektor ist bei der Komplementation für die Expression des unveränderten Gens geeignet (ohne Strep-Tag).
128
Ergebnisse
Abbildung 46: Konstruktionsschema der Vektoren für die Komplementation
von E. coli rec Mutanten (Expression ohne Strep-Tag)
Der Vektor pLIG147.1 und die amplifizierten rec Gene wurden jeweils mit NdeI
und HindIII verdaut und miteinander ligiert. In den resultierenden Vektoren für
die Komplementation werden die Gene von dem Kanamycinpromotor aus
konstitutiv exprimiert.
Für die Insertion in den Vektor pLIG148.1 wurden die Schnittstellen BamHI und HindIII mit den Primern an die Gene angefügt (recF: s5314, s4813, recO: s5045, s5046,
recR: s5049, s5050 und recD: s4824, s4810). Im Fall von recD wurde am Genanfang
statt BamHI die Schnittstelle BglII gewählt, da eine BamHI Schnittstelle im Gen vorhanden ist. pLIG148.1 und die amplifizierten Gene wurden jeweils mit BamHI und
HindIII geschnitten bzw. recD wurde mit BglII und HindIII geschnitten. Die Ligation ist
in Abbildung 47 dargestellt. Der resultierende Vektor ist für die Komplementation
(Expression der Gene mit einem N-terminalen Strep-Tag).
129
Ergebnisse
Abbildung 47: Konstruktionsschema der Vektoren für die Komplementation
von rec defizienten E. coli Mutanten mit entsprechenden Genen
aus S. lividans, die mit einem N-terminalen Strep-Tag versehen
wurden
Der Vektor pLIG148.1 und die amplifizierten Gene wurden jeweils mit BamHI
(BglII bei recD) und HindIII verdaut und miteinander ligiert. In dem resultieren
den Vektor für die Komplementation werden die Gene mit N-terminalem StrepTag von dem Kanamycinpromotor aus konstitutiv exprimiert.
Für den Nachweis, dass eine Komplementation mit dem gewählten Verfahren möglich ist, wurden zudem die Gene recF, recO, recR und recD aus der chromosomalen
DNA von E. coli JM109 amplifiziert. Dabei wurde die Sequenz der Schnittstelle für
NdeI und für HindIII durch die Primer angefügt (recF: s5500, s5001, recO: s5002,
s5003, recR: s5004, s5005 und recD: s5006, s5007). Die Insertion in den Vektor
pLIG147.1 (Expression ohne Tag) erfolgt wie zuvor schon für die Gene aus
S. lividans TK64 (nicht dargestellt, vergleiche Abbildung 46).
130
Ergebnisse
Der Kanamycinpromotor der Komplementationsvektoren gewährleistet eine konstante, jedoch geringere Expression als dies bei dem induzierbaren Rhamnosepromotor
der Fall wäre. Um nachzuweisen, dass die Gene überhaupt exprimiert wurden, wurden diese daher zusätzlich in die ursprünglichen Expressionsplasmide eingefügt. Die
PCR-Fragmente von recF, recO, recR und recD mit den angefügten Schnittstellen
NdeI und HindIII (Fragmente siehe Abbildung 46) wurden für eine Expression ohne
Tag in den Vektor pJOE4042.1 eingesetzt (Vektor siehe Abbildung 45). Für eine Expression mit N-terminalem Strep-Tag wurden die PCR-Fragmente der Gene mit den
angefügten Schnittstellen BamHI (BglII bei recD) und HindIII (Fragmente siehe Abbildung 47) mit dem ebenso geschnittenen Vektor pJOE4602.1 ligiert (Vektor siehe Abbildung 45). Die fertigen Vektoren wurden in den Referenzstamm für die Komplementation (CL1) transformiert. Anschließend wurden die Gene exprimiert, die Zellen aufgeschlossen und Proben auf SDS-Gele aufgetragen. In Abbildung 48 und 49 sind
diese SDS-Gele dargestellt.
Abbildung 48: SDS-PAGE aus der Expression von recF und recD in CL1 und
den entsprechenden Deletionsstämmen
Die Expression der Gene wurde durch Rhamnose in dem Referenzstamm CL1 bzw.
den Deletionsstämmen CL4 oder CL5 mit den entsprechenden Expressionsvektoren
induziert. Nach dem Zellaufschluss (24 h nach der Induktion) wurde der Rohextrakt abzentrifugiert und jeweils Proben des Überstandes (links) und des resuspendierten Pellets (rechts) aufgetragen. Die berechneten Molekulargewichte von RecD bzw. RecF
sind 81,3 kDa bzw. 40,6 kDa. 1) CL1 mit leerem Vektor pJOE4042.1, induziert 2) CL1
mit recF in pJOE4602.1, induziert M) Marker von Roche 3) CL1 mit recD in
pJOE4042.1, induziert 4) CL4 (recD) mit recD in pJOE4042.1, induziert 5) CL4
(recD) mit recD in pJOE4602.1, induziert 6) CL4 (recD) mit recD in pJOE4602.1, uninduziert 7) CL5 (recF) mit recF in pJOE4602.1, induziert 8) CL5 (recF) mit recF in
pJOE4602.1, uninduziert. Nicht dargestellt ist CL5 (recF) mit recF in pJOE4042.1, induziert (Expression ist geringer als bei CL5 (recF) mit recF in pJOE4602.1, induziert).
131
Ergebnisse
Im Referenzstamm CL1 ist die Expression von recF etwas unter der 43 kDaMarkerbande auf Spur 2 (mit N-terminalem Strep-Tag) und von recD auf Spur 3 (ohne Tag) zwischen der 119 kDa- und der 66 kDa-Markerbande gut zu sehen. Im Fall
von recD ist deutlich mehr Protein im Pellet als im Überstand. Bei dem Deletionsstamm von recD CL4 ist bei der Expression von recD keine zusätzliche Proteinbande
zu sehen (Spur 4: recD ohne Tag und Spur 5: recD mit Tag) verglichen mit der uninduzierten Kultur (Spur 6). Die Expression von recF mit N-terminalem Strep-Tag in
CL5 (recF) führt dagegen zu einer deutlich sichtbaren Proteinbande (Spur 7) mit
mehr Protein im Pellet.
Abbildung 49: SDS-PAGE aus der Expression von recO und recR in CL1 und
den entsprechenden Deletionsstämmen
In dem Referenzstamm CL1 bzw. den Deletionsstämmen CL544 oder CL584 mit den
entsprechenden Expressionsvektoren wurde die Expression der heterologen Gene
durch Rhamnose induziert. Nach zirka einem Tag Wachstum mit bzw. ohne Induktor
wurden die Zellen aufgeschlossen und der Rohextrakt abzentrifugiert. Proben des
Überstandes (links) und des resuspendierten Pellets (rechts) wurden auf die Gele aufgetragen. Die berechneten Molekulargewichte von RecO bzw. RecR sind 26,9 kDa
bzw. 21,7 kDa. 1) CL1 mit recO in pJOE4602.1, uninduziert 2) CL1 mit recR in
pJOE4602.1, uninduziert M) Marker von Roche 3) CL1 mit recO in pJOE4602.1, induziert 4) CL1 mit recR in pJOE4602.1, induziert 5) CL544 (recR) mit recR in
pJOE4602.1, induziert 6) CL544 (recR) mit recR in pJOE4042.1, induziert 7) CL584
(recO) mit recO in pJOE4602.1, induziert 8) CL584 (recO) mit recO in pJOE4042.1,
induziert.
Die ersten beiden Spuren in den SDS-Gelen der Abbildung 49 zeigen den uninduzierten Referenzstamm CL1 mit dem recO- bzw. recR-Expressionsvektor. Mit Induktion (Spur 3: recO in pJOE4602.1 und Spur 4: recR in pJOE4602.1) ist im Fall von
recO nur im Pellet eine zusätzliche Proteinbande bei zirka 27 kDa zu sehen. Bei der
132
Ergebnisse
Expression von recR ist sowohl im Pellet als auch im Überstand eine zusätzliche Proteinbande zwischen der 20 kDa- und 29 kDa-Markerbande zu sehen. Die Expression
von recR im Deletionsstamm CL544 (recR) ergibt mit und ohne Tag (Spur 5 und 6)
eine deutliche Bande in Überstand und Pellet. Bei der Expression von recO im Deletionsstamm CL584 (recO) ist, wie schon bei CL1 mit und ohne Tag, nur eine zusätzliche Proteinbande im Pellet zu sehen (Spur 7 und 8).
Es werden alle Gene exprimiert, auch wenn das entstehende Protein teilweise vorwiegend in unlöslicher Form gebildet wird (recO, recF) oder das Protein vor allem bei
der Expression in dem Referenzstamm nachzuweisen ist (recD).
Ein weiterer Vorversuch war die Kontrolle, ob das Wachstum des Referenzstammes
CL1 durch die Expression der heterologen Gene beeinträchtigt wurde.
Abbildung 50: Wachstumskurve des Stammes CL1 mit und ohne Expressionsvektoren
Die OD600 wurde über 24 h aufgenommen. Zum Zeitpunkt 0 h erfolgt gegebenenfalls
die Induktion mit Rhamnose. In der Legende steht ein + für die Induktion, - für keine
Induktion. Das Zeichen „~“ gibt an, dass das entsprechende Gen mit N-terminalem
Tag exprimiert wurde (in pJOE4602.1). CL1 -: Referenzstamm ohne Vektor, ~rec -:
CL1 mit Expressionsvektor (pJOE4602.1 mit recF, recO, recR oder recD), aber ohne
Induktion, ~rec +: CL1 mit Expressionsvektor (pJOE4602.1 mit recF, recO, recR oder
recD) und mit Induktion, rec +: CL1 mit Expressionsvektor (pJOE4042.1 mit recF,
recO, recR oder recD) und mit Induktion durch Rhamnosezugabe.
133
Ergebnisse
Dazu wurden Wachstumskurven des Stammes CL1 mit und ohne Vektoren aufgenommen (siehe Abbildung 50). Die Graphiken zeigen jeweils die Entwicklung der
OD600 von CL1, von CL1 mit Expressionsvektor, aber ohne Induktion und von den
beiden Expressionsvektoren der jeweiligen Gene (Expression mit und ohne Tag).
Das Wachstum von CL1 mit oder ohne Genexpression ist nicht signifikant verändert.
Um zu testen, ob eine erfolgreiche Komplementation stattfindet, wurden die Empfindlichkeit des Referenzstammes und der Deletionsstämme gegenüber UV-Licht verschiedener Intensitäten bestimmt. Die Deletionsstämme zeigen eine deutlich reduzierte Überlebensfähigkeit (siehe Abbildung 51).
Überlebensrate [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
UV Dosis [J/m2]
CL1 CL544 - (recR)
CL5 - (recF)
CL584 - (recO)
CL4 - (recD)
Abbildung 51: Überlebensrate des Referenzstammes CL1 und der Deletionsstämme CL4, CL5, CL584 und CL544 nach der Bestrahlung mit
verschiedenen UV-Licht-Intensitäten
Verdünnungen des Stammes CL1 und der Deletionsstämme von recD, recF, recO
und recR wurden plattiert und mit UV-Licht zunehmender Intensität bestrahlt. Es wurde die Überlebensrate (Anzahl der anwachsenden Kolonien) im Vergleich zur unbestrahlten Kontrolle berechnet und in Prozent aufgetragen.
Die Überlebensrate des Stammes CL4 (recD) ist dabei noch am wenigsten beeinträchtigt. Sie sinkt bei 10 J/m2 auf 51 % und erst bei 80 J/m2 unter 1 %. Die Überle134
Ergebnisse
bensrate der Stämme CL5 (recF), CL544 (recR) und CL584 (recO) sinkt dagegen schon bei 10 J/m2 unter 10 % und bei 20 J/m2 unter 3 %. Die Überlebensrate
des Referenzstammes CL1 sinkt erst bei einer Bestrahlungsintensität von 80 J/m2
unter 10 %.
Findet eine Komplementation statt, sollte die Überlebensrate der Deletionsstämme bei gleichzeitiger Expression der entsprechenden heterologen Gene - sich der des
Referenzstammes annähern. Als Positivkontrolle wurde in den Deletionsstämmen
jeweils auch das entsprechende Gen aus E. coli selbst exprimiert und die Überlebensrate bestimmt. Die Ergebnisse der Komplementation sind in den Abbildungen 52
bis 55 zu sehen. Als erstes werden die Ergebnisse der Komplementation mit recF
dargestellt.
Überlebensrate [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
UV Dosis [J/m2]
CL1 -
CL1-~recF
CL5-recF E. coli
CL5 -
CL5-recF
CL5-~recF
Abbildung 52: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL5 (recF) mit und ohne
Expression von recF bei zunehmender UV-Licht-Intensität
CL1 -: Referenzstamm ohne Vektor, CL1-~recF: CL1 mit recF in pLIG148.1 (Expression mit Tag), CL5-recF E. coli: CL5 mit recF aus E. coli in pLIG147.1 (Expression
ohne Tag), CL5 -: Deletionsstamm ohne Vektor, CL5-recF: CL5 mit recF in
pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL5-~recF: CL5 mit recF in pLIG148.1 (Expression mit Tag).
135
Ergebnisse
Die Überlebensrate des Referenzstammes CL1 sinkt mit zunehmender UV-LichtIntensität langsam ab. Bei 10 J/m2 wachsen noch 75 % der Kolonien an, bei 20 J/m2
sind es noch 61 % und bei 30 J/m2 überlebt mit 44 % weniger als die Hälfte der Kolonien. Erst bei 80 J/m2 sinkt die Überlebensrate unter 10 % (genauer Wert: 7 %), bei
90 J/m2 wachsen noch 3 % der Kolonien an und eine Überlebensrate von unter
0,1 % wird schließlich bei der höchsten UV-Licht-Intensität von 120 J/m2 erreicht.
Wird in CL1 das Gen recF aus S. lividans TK64 mit N-terminalem Strep-Tag exprimiert (CL1-~recF), so verändert sich die Empfindlichkeit des Stammes gegenüber
UV-Licht nicht. Die Überlebensrate sinkt mit mehr oder weniger gleicher Stärke ab.
Der Stamm CL5 (recF) ist dagegen sehr empfindlich gegenüber UV-Licht. Schon
bei der geringsten Bestrahlungsintensität sinkt die Anzahl der anwachsenden Kolonien auf 9 % und bei 30 J/m2 ist die Überlebensrate unter 1 %. Wird in diesem
Stamm das heterologe Gen recF aus S. lividans TK64 mit N-terminalem Strep-Tag
exprimiert (CL5-~recF) verändert sich die Vitalität des Stammes nicht (9 % Überlebensrate bei 10 J/m2, 1 % Überlebensrate bei 30 J/m2). Die Expression des Gens
recF aus S. lividans TK64 ohne Tag (CL5-recF) führt nur zu einer geringfügigen Erhöhung der Lebensfähigkeit (16 % Überlebensrate bei 10 J/m2, 3 % Überlebensrate
bei 30 J/m2). Verglichen mit CL5 ohne die Expression des heterologen Gens handelt
es sich jedoch schon fast um eine Verdopplung der ursprünglichen Überlebensrate
(16 statt 9 % Überlebensrate bei 10 J/m2). Dass die Komplementation in diesem System funktioniert, beweist die Expression des Gens recF aus E. coli in CL5 (CL5-recF
E. coli). Es wird mit kleinen Schwankungen die UV-Licht-Resistenz des Referenzstammes CL1 erreicht.
Die Ergebnisse des Komplementationsversuchs mit recO sind in Abbildung 53 zu
sehen. Im Vergleich zum Referenzstamm CL1 ohne Vektor wirkt sich hier die Expression der Gens recO aus S. lividans TK64 (CL1-~recO) auf die Überlebensrate
aus, vor allem bei den UV-Licht-Intensitäten zwischen 20 J/m2 und 40 J/m2. Die größte Abweichung ist mit 20 % verringerter Überlebensrate bei 20 J/m2 (41 % Überlebensrate CL1-~recO zu 61 % Überlebensrate CL1 -). Bei stärkerer Bestrahlung nähert sich die Überlebensrate wieder der des Referenzstammes ohne Vektor an. Die
Überlebensrate des Deletionsstammes CL584 (recO) beträgt bei der geringsten
Bestrahlungsintensität nur 8 %, und bei 20 J/m2 sinkt diese bereits auf 1 % ab. Wird
in diesem Stamm das Gen recO aus S. lividans TK64 exprimiert (CL584-recO), so
verbessert sich die Überlebensfähigkeit des Stammes bei UV-Licht-Bestrahlung geringfügig. Bei 10 J/m2 wachsen noch 17 % der Kolonien an und bei 20 J/m2 noch
8 %. Erst bei einer UV-Licht-Intensität von 60 J/m2 sinkt die Überlebensrate unter
1 %. Eine Expression des Gens recO aus S. lividans TK64 mit N-terminalem StrepTag (CL584-~recO) führt zu einer noch deutlicheren Verbesserung der Resistenz
gegenüber UV-Licht. Bei der geringsten Bestrahlungsintensität beträgt die Überle136
Ergebnisse
bensrate 42 % (34 % mehr als bei CL584 ohne Vektor) und bei 20 J/m2 19 % (hier
hat CL584 ohne Vektor nur 1 %). Die Komplementationskontrolle (CL584 mit recO
aus E. coli: CL584-recO E. coli) steigert die Überlebensrate des Deletionsstammes
noch über die Werte des Referenzstammes CL1 hinaus. Die Resistenz gegenüber
UV-Licht ist bis 80 J/m2 extrem erhöht. Zum Beispiel wachsen bei 40 J/m2 75 % der
Kolonien an, eine Überlebensrate, die bei CL1 bereits bei einer Bestrahlung mit
10 J/m2 erreicht wird.
Überlebensrate [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
UV Dosis [J/m2]
CL1 -
CL1-~recO
CL584-recO E. coli
CL584 -
CL584-recO
CL584-~recO
Abbildung 53: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL584 (recO) mit und ohne Expression von recO bei zunehmender UV-Licht-Intensität
CL1 -: Referenzstamm ohne Vektor, CL1-~recO: CL1 mit recO in pLIG148.1 (Expression mit Tag), CL584-recO E. coli: CL584 mit recO aus E. coli in pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL584 -: Deletionsstamm ohne Vektor, CL584-recO: CL584 mit
recO in pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL584-~recO: CL584 mit recO in
pLIG148.1 (Expression mit Tag).
Die Ergebnisse des Komplementationsversuchs mit recR sind in der nachfolgenden
Abbildung 54 zu sehen. Die Expression des Gens recR aus S. lividans TK64 in CL1
(CL1-~recR) erhöht dessen Empfindlichkeit gegenüber UV-Licht. Die Überlebensrate
sinkt etwas schneller ab als bei CL1 ohne Vektor. Beispielsweise beträgt die Überlebensrate bei 10 J/m2 70 % (75 % bei CL1 -) und bei 50 J/m2 15 % (26 % bei CL1 -).
137
Ergebnisse
Die Überlebensrate des Stammes CL544 (recR) sinkt sehr schnell ab (10 % bei
10 J/m2 und 2 % bei 40 J/m2 - vergleichbar mit der Überlebensrate des Stammes
CL5 und des Stammes CL584). Wird in diesem Stamm das Gen recR aus S. lividans
TK64 mit (CL544-~recR) oder ohne N-terminalen Strep-Tag (CL544-recR) exprimiert,
so erhöht sich die Überlebensrate geringfügig. Bei einer Bestrahlung mit 10 J/m2 beträgt die Überlebensrate 19 % (CL544-~recR) bzw. 15 % (CL544-recR) im Vergleich
zu 10 % (CL544 -). Bei 30 J/m2 beträgt die Überlebensrate 1 % (CL544-recR) bzw.
Überlebensrate [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
UV Dosis [J/m2]
CL1 -
CL1-~recR
CL544-recR E. coli
CL544 -
CL544-recR
CL544-~recR
Abbildung 54: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL544 (recR) mit und ohne Expression von recR bei zunehmender UV-Licht-Intensität
CL1 -: Referenzstamm ohne Vektor, CL1-~recR: CL1 mit recR in pLIG148.1 (Expression mit Tag), CL544-recR E. coli: CL544 mit recR aus E. coli in pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL544 -: Deletionsstamm ohne Vektor, CL544-recR: CL544 mit
recR in pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL544-~recR: CL544 mit recR in
pLIG148.1 (Expression mit Tag).
2 % (CL544-~recR) und sinkt bei höheren Bestrahlungsintensitäten dann unter 0,1 %
ab. Die Expression des Gens recR aus E. coli in CL544 zur Kontrolle der Komplementation erhöht die Resistenz gegenüber UV-Licht deutlich. Es werden jedoch nicht
die Überlebensraten des Referenzstammes CL1 erreicht. So beträgt beispielsweise
138
Ergebnisse
die Überlebensrate bei einer Bestrahlung mit 10 J/m2 61 % (75 % bei CL1), mit
30 J/m2 23 % (44 % bei CL1) und bei 50 J/m2 10 % (26 % bei CL1).
Überlebensrate [%]
100
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
UV Dosis [J/m2]
CL1 -
CL1-~recD
CL4-recD E. coli
CL4 -
CL4-recD
CL4-~recD
Abbildung 55: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL4 (recD) mit und ohne
Expression von recD bei zunehmender UV-Licht-Intensität
CL1 -: Referenzstamm ohne Vektor, CL1-~recD: CL1 mit recD in pLIG148.1 (Expression mit Tag), CL4-recD E. coli: CL4 mit recD aus E. coli in pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL4 -: Deletionsstamm ohne Vektor, CL4-recD: CL4 mit recD in
pLIG147.1 (Expression ohne Tag), CL4-~recD: CL4 mit recD in pLIG148.1 (Expression mit Tag).
Abbildung 55 zeigt die Ergebnisse des Komplementationsversuchs mit recD. Wird
das Gen recD aus S. lividans TK64 in CL1 (CL1-~recD) exprimiert verändert sich die
Überlebensrate des Referenzstammes nicht. Die gemessenen Werte schwanken um
die Überlebensraten von CL1 ohne Vektor bei den verschiedenen UV-LichtIntensitäten. Die Überlebensrate des Stammes CL4 (recD) sinkt mit zunehmender
UV-Licht-Intensität stärker ab als CL1, jedoch deutlich langsamer als die Überlebensraten der anderen Deletionsstämme. Die Überlebensraten betragen beispielsweise
51 % bei 10 J/m2, 22 % bei 20 J/m2 und unter 10 % (8 %) erst bei 50 J/m2. Weder die
Expression von recD aus S. lividans TK64 ohne Tag (CL4-recD) noch mit
N-terminalem Strep-Tag (CL4-~recD) kann die Empfindlichkeit dieses Stammes ge139
Ergebnisse
genüber UV-Licht signifikant verändern. Bei einer Bestrahlungsintensität von 10 J/m2
ist die Überlebensrate in einem Fall sogar erniedrigt (40 % bei CL4-recD). Bei der
Kontrollexpression von recD aus E. coli in CL4 verbessert sich die UV-Licht –
Resistenz des Stammes signifikant. Die Überlebensrate erreicht sogar deutlich höhere Werte, als der Referenzstamm CL1 selbst (z.B. bei 50 J/m 2 26 % bei CL1 und
44 % bei CL4-recD aus E. coli).
140
Diskussion
5.
DISKUSSION UND AUSBLICK
Im Rahmen dieser Arbeit wurden sechzehn Gene (bzw. Gengruppen im Falle von
ruvABC, sbcCD und ku+lig) in S. lividans TK64 erfolgreich deletiert. Zusätzlich wurde
die S. lividans TK23 recF-Mutante, die an der Universität Tübingen in der Gruppe von
Günter Muth entstand, untersucht. Diese Gene sind repräsentativ für die Reparaturwege der Prävention und Reversion (P & R), der Basenexzisionsreparatur (BER), der
Nukleotidexzisionsreparatur (NER), der Rekombinationsreparatur (RR) bzw. der homologen Rekombination (hR) und des nicht-homologen Verbindens von Enden
(NHEJ). In der nachfolgenden Tabelle 11 sind die deletierten Gene fett hervorgehoben. Diese Tabelle gibt einen Überblick über die Genausstattung der Organismen
Escherichia coli (E.c), Deinococcus radiodurans (D.r), den Streptomyceten
S. coelicolor (S.c) und S. lividans (S.l), Bacillus subtilis (B.s), sowie Mycobacterium
tuberculosis (M.t)
Tabelle 11:
Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und homologen
Rekombination verschiedener Modellorganismen
E.c
Gen
P&R
monofunktionelle
Glykosylasen
BER
Bifunk-tionelle Glykosylasen
AP-Endonukleasen
NER
RR &
hR
Präsynaptische
Phase
D.r
S.c
S.l
B.s
M.t








dut (dUTPase)

mutT (8-oxo-dGTPase)

phr (Photolyase)




ada (Alkyltransferase)





alkB (entfernt Methylgruppen: 1-mA, 3-mC)



ung (Uracil-DG)






mug (G/U spezifische mismatch DG)




tag (3maDG I)





alkA / 3maDG II






mutY (Adenin-DG: A gegenüber 8-oxoG)






mutM (fpg) (DG: 8-oxoG gegenüber C)






















nth (Endonuklease III)
nei (Endonuklease VIII)
entfernt fragmentierte Pyrimidine




xthA (Exonuklease III)

nfo (Endonuklease IV)

nfi (Endonuklease V)





uvrA (ATPase, DNA bindend)






uvrB (Helikase)






uvrC (Nuklease)






uvrD (mutU) (Helikase II)






addA (UE der AddAB Helikase/Nuklease)

addB (UE der AddAB Helikase/Nuklease)

adnA (UE der AdnAB Helikase/Nuklease)



adnB (UE der AdnAB Helikase/Nuklease)



141
Diskussion
Tabelle 11:
Fortgesetzt: Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und
homologen Rekombination verschiedener Modellorganismen
Gen
Prä-synap
tische
Phase
RR &
hR
synaptische
Phase
Migration
Resolvasen
DNA
Polymerasen
NHEJ
D.r
S.c
S.l
B.s
M.t
recB (UE der Exonuclease V (RecBCD))


recC (UE der Exonuclease V (RecBCD))


recD (UE der Exonuclease V (RecBCD))




recF






recO






recR






recJ (Exonuklease)


recN (Protein der SMC Familie)





recQ (Helikase)








xseAB (Exonuclease VII)






recA (Filamentbildung für Strangaustausch)






recX (Regulatorprotein für RecA)






recG (ATP-abh. DNA Helikase)






ruvA (Holliday Junction DNA Helikase)






ruvB (Holliday Junction DNA Helikase)






ruvC (Nuklease)






recU (Nuklease)
priA (Neuaufbau des Primosoms)






polA (DNA-Pol. I)






dinB (DNA-Pol. IV)





sbcB

sbcC (UE der SbcCD Nuklease)





sbcD (UE der SbcCD Nuklease)





ku (DNA-Bindeprotein)




lig (Ligase)




mutS1 (Erkennung von Fehlpaarungen)
MMR
E.c

mutS2 (Erkennung von Fehlpaarungen)
mutL (Mediator zw. mutS und mutH)








E.c: Escherichia coli; D. r.: Deinococcus radiodurans; S.c: Streptomyces coelicolor; S.l: Streptomyces
lividans; B.s: Bacillus subtilis, M.t: Mycobacterium tuberculosis DG: DNA-Glykosylase, UE: UntereinmutH
heit, P&R (Prävention und Reversion), BER (Basenexzisionsreparatur), NER (Nukleotidexzisionsreparatur), RR & hR (Rekombinationsreparatur und homologe Rekombination), NHEJ (nichthomologes Verbinden von Enden), MMR (methylierungsabhängige Reparatur); Fettgedruckte Gene
wurden in dieser Arbeit in S. lividans deletiert. : orthologes Gen vorhanden; : Enzymfunktion vorhanden, jedoch ohne Verwandtschaft zu dem entsprechenden Gen aus E. coli; : nur xseA bei D.r.
Schwarze Kästchen bedeuten, dass ein entsprechendes oder vergleichbares Gen in
dem jeweiligen Organismus vorhanden ist. Bezüglich der Prävention und Reversion
bzw. der Basenexzisionsreparatur sind die Streptomyceten vergleichbar wie E. coli
142
Diskussion
ausgestattet. Es fällt auf, dass D. radiodurans bei der Prävention und Reversion nur
ein zu mutT orthologes Gen besitzt, und auch B. subtilis sowie M. tuberculosis haben
hier weniger Gene. Weitere starke Unterschiede fallen in der Genausstattung zur
präsynaptischen Phase der homologen Rekombination auf. D. radiodurans,
S. coelicolor und S. lividans besitzen weder recB und recC wie E. coli, noch addA
und addB wie B. subtilis. Allerdings sind in den Streptomyceten orthologe Gene zu
adnA und adnB vorhanden, die in M. tuberculosis die Funktion der präsynaptischen
Nuklease in der RecA-abhängige homologen Rekombination übernehmen. Die
Streptomyceten haben zudem kein recJ und keine Gene der methylierungsabhängigen Reparatur, dafür aber orthologe Gene zu ku und lig.
Nachfolgend werden die Ergebnisse der Deletionsstämme der einzelnen Reparaturwege diskutiert. Dabei werden P-Werte und -Werte für die MNNG- und ZeocinMutagenese angegeben. Deren Berechnung wird unter Abschnitt 3.10 beschrieben
und eine vollständige Tabelle findet sich im Anhang (Abschnitt 7.3). Der P-Wert gibt
dabei die Wahrscheinlichkeit an, mit der die Werte sich nicht signifikant vom Referenzstamm unterscheiden bzw. mit diesem übereinstimmen. Der -Wert ist eine alternative Prüfgröße, die vor allem bei Messungen mit geringem Stichprobenumfang
geeignet ist. Allerdings kann hier nur mit einer Restirrtumswahrscheinlichkeit von 5 %
angegeben werden, dass sich die Werte signifikant von denen des Referenzstammes
unterscheiden, sobald die Prüfgröße den Wert 2 überschreitet. Eine feinere Abstufung der Restwahrscheinlichkeit kann auf Basis des -Wertes nicht erfolgen.
5.1
Mutanten mit Deletionen von Genen der Prävention und Reversion
bei der DNA-Reparatur
In E. coli kommt es bei dut Mutanten zu einer erhöhten chromosomalen Instabilität.
Das Fehlen der dUTPase sorgt für einen vermehrten Fehleinbau von Uracil, welches
über die Basenexzisionsreparatur entfernt werden muss. Dabei entstehen zwischenzeitlich Strangbrüche, die gehäuft zu einer Fragmentierung des Chromosoms führen
(Kouzminova und Kuzminov 2004, 2006 und 2008) (siehe Abschnitt 2.3.1). Abbildung 56 zeigt, wie der Einbau von Uracil in die DNA zu Läsionen zunehmender
Komplexität führt. Im ersten Schritt der Basenexzisionsreparatur entfernt die UracilDNA-Glykosylase (ung) das Uracil aus der DNA und die resultierende AP-Stelle wird
anschließend zu einem Einzelstrangbruch (1 Bp Lücke) prozessiert. Vermehrte Basenexzisionsreparatur (an gegenüberliegenden, leicht versetzten Uracilbasen in der
DNA) oder das Eintreffen des Replisoms können daraus einen Doppelstrangbruch
bzw. eine kollabierte Replikationsgabel entstehen lassen, welche die Rekombinationsreparatur erfordern.
143
Diskussion
Untersuchungen in E. coli haben gezeigt, das Doppelmutationen von dut und Genen,
welche Enzyme der späten Basenexzisionsreparatur (xthA, polA und ligA) (Taylor
und Weiss 1982, Tye und Lehmann 1977) und der Rekombinationsreparatur (recA,
recBC und ruvABC) (Kouzminova und Kuzminov 2004) kodieren, letal sind, da die
entstehenden Brüche nicht mehr repariert werden können.
dUTP
dut
dUMP + PPi
ung
U
polA, ligA
DNA
xthA, dRPase
ss-Bruch
viel BER od.
Replikation
ds-Bruch
x
BER
Rekombinationsreparatur
Abbildung 56: Die Verwertung von dUTP in der Zelle
dUTP wird von der dUTPase (dut) zu dUMP und PPi hydrolysiert. Bei der DNASynthese kann es auch in die DNA eingebaut werden. Diese Uracile werden von der
Uracil-DNA-Glykosylase im ersten Schritt der Basenexzisionsreparatur (BER) entfernt. Zwischenzeitlich entsteht ein Einzelstrangbruch (ss-Bruch). Ist viel Uracil in der
DNA vorhanden und es werden zwei, nur eine oder wenige Basen versetzte, Uracile
gleichzeitig entfernt, so können Doppelstrangbrüche (ds-Bruch) entstehen. Alternativ
kann ein solcher Doppelstrangbruch auch entstehen, wenn die Replikationsgabel auf
einen Einzelstrangbruch trifft. Bild: abgewandelt aus Ting et al. 2008.
In S. lividans war die natürliche Instabilität nicht erhöht. Mit 0,21 % war sie etwa in
der Größenordnung wie die des Ausgangsstammes S. lividans TK64 mit 0,32 %. Die
Streuungen der Messwerte überlappten. Bei einem Stichprobenumfang von 500 bis
1000 Kolonien entsprachen diese Werte einer bis drei Chloramphenicol-sensitiven
Kolonien. Bei dieser Kolonienzahl konnte man eigentlich nur Stämme mit deutlich
erhöhter chromosomalen Instabilität ausmachen. Stämme mit einer verbesserten
chromosomalen Stabilität (wie eventuell bei den dut Mutanten) waren dagegen
schwer zu bestimmen, da sich schon eine einzelne Chloramphenicol-sensitive Kolonie stark auswirkte.
Die Einwirkung von MNNG reduzierte die durchschnittliche Überlebensrate der dut
Mutanten geringfügig auf 16,8 % (S. lividans TK64: 19,1 %) (siehe Abbildung 24). Es
gab dabei eine große Überlappung der Werte (Streuung dut: 9-25 %, Ausgangsstamm: 11-27 %). Es konnte daher nicht von einer signifikanten Veränderung gesprochen werden (P-Wert: 59,3; -Wert < 2). MNNG führt primär zu Methylierungen,
welche die Basenexzisionsreparatur erfordern. Auch der erhöhte Einbau von Uracil
belastet diesen Reparaturweg, da die Uracil-DNA-Glykosylasen benötigt werden.
Nach der Mutagenese mit MNNG werden jedoch keine Uracil-DNA-Glykosylasen
144
Diskussion
benötigt, sondern solche die Methylierungen entfernen. Die nachfolgend von beiden
Glykosylasearten benötigte AP-Lyaseaktivität schien bei den dut Mutanten noch nicht
so stark ausgelastet zu sein, dass es sich auf die Überlebensfähigkeit der Zellen
auswirkte.
Bei der Zeocin-Mutagenese war die Überlebensfähigkeit der dut Mutanten mit 21,0 %
fast unverändert im Vergleich zum Referenzstamm (20,2 %) (P-Wert: 81,8 %; -Wert
< 2). Auch die Bestrahlung mit UV-Licht veränderte die Überlebensfähigkeit der dut
Mutanten nicht signifikant (Abbildung 26). Die durchschnittliche Abweichung vom Referenzstamm betrug nur +1,4 %. Zeocin erzeugt direkt Doppelstrangbrüche im
Chromosom, die von der Rekombinationsreparatur behoben werden. Die von UVLicht vorwiegend erzeugten Cyclobutandimere sprechen die Nukleotidexzisionsreparatur an. Durch den vermehrten Einbau von Uracil werden über die Uracil-DNAGlykosylasen zusätzlich Strangbrüche eingeführt, was jedoch weder bei der Mutagenese mit Zeocin noch mit UV-Licht einen signifikanten Effekt auf die Reparaturkapazität der Zellen hatte.
Bei der Einwirkung von Mitomycin C verhielten sich die dut Mutanten annähernd wie
der Ausgangsstamm. Die Überlebensfähigkeit der dut Mutanten war gemittelt über
alle Mitomycin C-Konzentrationen um durchschnittlich 4,5 % erniedrigt, wobei sich
die Streuung bei fast allen Werten mit der des Ausgangsstammes überlappte. Mitomycin C verursacht Schäden, die die Rekombinationsreparatur erfordern. Daher entsprach dies auch den Ergebnissen der Mutagenese mit Zeocin. Die Rekombinationsreparatur wurde durch eventuell zusätzliche Strangbrüche bei der Entfernung der
vermehrt eingebauten Uracilbasen nicht nennenswert belastet.
Die dUTPase ist somit ein Enzym, dessen Fehlen sich in S. lividans TK64 nicht signifikant auf die Vitalität der Zellen auswirkte. Die zusätzliche Beanspruchung der Basenexzisionsreparatur überlastete die Reparaturkapazität der Zellen nicht. Das Bakterium D. radiodurans, welches sehr hohe Bestrahlungsintensitäten ionisierender
Strahlung überlebt, besitzt zum Beispiel keine dUTPase und wird dadurch auch nicht
beeinträchtigt (siehe Tabelle 11).
Aus der Gruppe von Enzymen, die zu einer Prävention oder Reversion von DNASchäden führt, wurde zudem das Gen für AlkB erfolgreich deletiert. Sowohl Ada als
auch AlkB entfernen Methylierungen. Die Wahl fiel auf AlkB, da es bei der Suche in
dem schon zu Beginn der Arbeit sequenzierten S. coelicolor zwei ada-ähnliche Gene
gab (SCO6461 und SCO6150). Man hätte hier beide getrennt oder noch besser zusammen deletieren müssen. In der nun ebenfalls vorhandenen Sequenz von
S. lividans entspricht SSPG01223 dem Gen SCO6461. Das Gen SSPG01478 ist
nicht ganz mit SCO6150 identisch. In der Sequenz von SSPG01478 ist im mittleren
Bereich eine Base zu viel. Dadurch kommt es zu einem Frameshift und die nachfol145
Diskussion
gend kodierte Aminosäuresequenz ist entsprechend verändert und bricht vorzeitig
ab. Sollte diese Sequenzveränderung zutreffen, würde es in S. lividans nur das adaähnliche Gen SSPG01223 geben.
AlkB gehört zur Familie der Fe(II)- und 2-Oxoglutarat-abhängigen Oxygenasen. Das
Enzym entfernt vor allem SN2-spezifische Methylierungen. Die beiden
Hauptsubstrate sind dabei 1-Methyladenin und 3-Methylcytosin sowohl in dsDNA als
auch in ssDNA und RNA. Generell werden aber 1-Alkylpurine und 3-Alkylpyrimidine
von AlkB erkannt und oxidativ demethyliert, wenn auch teilweise mit geringer
Umsatzrate. Die natürliche chromosomale Stabilität war bei den alkB Mutanten nicht
beeinträchtigt. Bei der MNNG-Mutagenese (vorwiegend SN1-spezifische
Methylierungen) war die Überlebensrate nur geringfügig reduziert (Abbildung 24).
Der Mittelwert der alkB Mutanten lag noch innerhalb der Streubreite des
Ausgangsstammes (P-Wert: 44,1 %; -Wert < 2). Zusätzlich wurde bei dieser
Deletionsmutante noch eine Mutagenese mit EMS (S N2-spezifische Ethylierungen)
durchgeführt. Die Überlebensrate der alkB Mutanten war jedoch auch bei diesem
Mutagen nicht stark reduziert (Abbildung 25). Eine Deletion von alkB wirkte sich
vermutlich desshalb nur geringfügig aus, weil die Mutagene in der DNA vorwiegend
Alkylierungen hervorrufen, die von AlkB nur in geringem Umfang entfernt werden
können (v.a. O6-Alkylguanin). Zudem gibt es durch das noch vorhandene Enzym Ada
ein redundantes System. Wie erwartet wirkte sich die Mutation von alkB nicht
signifikant auf die Überlebensrate bei der Zeocin-Mutagenese aus (P-Wert: 37,3 %;
-Wert < 2). Interessant war jedoch das Verhalten der alkB Mutanten bei der
Mutagenese mit UV-Licht oder Mitomycin C. Die Überlebensfähigkeit war in beiden
Fällen signifikant reduziert (Abbildung 26 und 27). Die durchschnittliche Abweichung
betrug -13 % (UV-Licht) und -23,5 % (Mitomycin C). Bei diesen Mutagenen war diese
verringerte Vitalität vom Mechanismus her nicht nachzuvollziehen, vor allem da es
ein Charakteristikum der alkB Mutanten in E. coli ist, nicht gegenüber UV-Licht
sensitiv zu sein (Kataoka et al. 1983).
5.2
Mutanten mit Deletionen von Genen der Basenexzisionsreparatur
Wie in der Tabelle 11 zu sehen ist, gibt es für die Basenexzisionsreparatur mehrere
Glykosylasen und Nukleasen, deren Substratspektren zum Teil auch überlappen. Die
Streptomyceten haben für diesen Reparaturweg eine gute Genausstattung. Es fällt
wieder auf, dass D. radiodurans für diese Aufgaben weniger Gene besitzt. Es fehlen
ihm die 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase I (tag) und die Endonuklease IV (nfo).
146
Diskussion
Die ausgewählten Gene dieser Reparaturgruppe zeigten nach der Deletion keine
Verschlechterung der natürlichen Instabilität. Phänotypisch sahen die entsprechenden Kolonien aus wie die des Ausgangsstammes S. lividans TK64. Aus der Gruppe
der Glykosylase-Mutanten zeigte mutM bei der Mutagenese mit MNNG noch die
deutlichste Reduktion der Überlebensrate (Abbildung 28). Der P-Wert deutet mit
9,2 % auch auf eine signifikante Veränderung hin (-Wert < 2). Insgesamt überschnitten sich die Werte aller Mutanten mit den Messungen des Ausgangsstammes
S. lividans TK64, der Mittelwert lag jeweils innerhalb dessen Streubreite. Da MNNG
als Mutagen Methylierungen verursacht, war es nicht verwunderlich, dass der Ausfall
einer Uracil-DNA-Glykosylase (ung1 bzw. ung2) keine großen Auswirkungen hatte.
Die Deletion von 3maDG konnte dagegen kompensiert werden. Die Basenexzisionsreparatur hat durch die zweite 3-Methyladenin-DNA-Glykosylase in Streptomyceten
ein redundantes System. Zu der Glykosylase MutM mit eigener AP-Endonuklease
gibt es jedoch kein zweites Enzym der annähernd gleichen Funktion, so dass sich die
Deletion hier stärker auswirkte. Bei der Bestrahlung mit UV-Licht fiel ebenso auf,
dass nur die mutM Mutanten unter den Glykosylase-Mutanten eine leicht reduzierte
Überlebensfähigkeit aufwies (durchschnittlich -3,8 %) (Abbildung 29). UV-Licht verursacht auch indirekt DNA-Schäden (über Sauerstoffradikale vorwiegend Oxidationen
oder Ringbrüche), welche die Basenexzisionsreparatur benötigen. Da MutM als Formamido-Pyrimidin-DNA-Glykosylase oxidierte Purine und solche mit geöffneter
Ringstruktur entfernt, waren die mutM Mutanten hier betroffen.
Unerwartet war die Reaktion der Glykosylase-Mutanten auf die Mutagenese mit Zeocin (Abbildung 28). Die verringerte Überlebensrate der 3maDG (P-Wert: 6,2 %;
-Wert > 2), mutM (P-Wert: 11,2 %; -Wert > 2) und ung2 (P-Wert: 16,1 %; -Wert <
2) Mutanten, sowie die erhöhte Überlebensrate der ung1 Mutanten (P-Wert: 8,6 %;
-Wert > 2) lässt sich nicht erklären. Allerdings überlappten die Streuungen aller
Messungen mit der des Ausgangsstammes S. lividans TK64. Zeocin verursacht direkt Doppelstrangbrüche in der DNA und keine Basenmodifikationen, daher sollten
die Glykosylasen keine Rolle spielen, denn die Basenexzisionsreparatur wird bei diesem Mutagen nicht gefordert. Auch ist eine indirekte Wirkung, dass die verringerte
Möglichkeit zur Basenexzisionsreparatur die Rekombinationsreparatur beeinflusst,
hier kaum vorstellbar. Im Ausgangsstamm ist eventuell durch spontan vorkommende
Basenmodifikationen ein Basislevel der Basenexzisionsreparatur nötig, was über dabei entstehende Strangbrüche zu einer ständigen, geringfügigen Induktion der Rekombinationsgene führen könnte. Bei Glykosylase-Mutanten könnte folglich diese
Induktion geringer ausfallen. Dem widerspricht jedoch, dass die Überlebensrate der
ung1 Mutanten erhöht war. In Abbildung 57 ist zu sehen, welche Reparatursysteme
bei den verschiedenen DNA-Schäden zuständig sind und wie die Mutagene die DNA
schädigen. Zeocin ist das einzige Mutagen, welches nur die Rekombinationsrepara147
Diskussion
tur anspricht. DNA-Schäden, welche durch das Einwirken von Mitomycin C oder UVLicht entstehen, sind dagegen meist Substrate der Nukleotidexzisionsreparatur. UVLicht kann in geringerem Umfang auch zu Basenmodifikationen führen.
MNNG
Zeocin
UV-Licht
[dUTP]
xthA,
X
intakte
DNA
P&R
Glykosylase u.a.
polA, ligA
BER
ds-Bruch
ss-Bruch
viel BER od.
Replikation
RR
NER
ss-Lücke
x
x
Replikation
x
x
CPDs,
Cross-
links
UV-Licht
Mitomycin C
Abbildung 57: Zusammenspiel der DNA-Reparaturwege
DNA-Schäden zunehmender Komplexität werden von den verschiedenen Reparaturwegen behoben. Basenmodifikationen an dNTPs können durch Verhinderung des
Einbaus in die DNA unschädlich gemacht werden (Prävention). Befindet sich die veränderte Base bereits in der DNA, kann die Modifikation (z.B. Alkylierung) gegebenenfalls wieder entfernt werden (Reversion; P&R: Prävention und Reversion) oder über
die Basenexzisionsreparatur (BER) behoben werden. Bei letzterer entsteht zwischenzeitlich ein Einzelstrangbruch, welcher bei vielen Reparaturen (BER gleichzeitig gegenüberliegend in beiden DNA-Strängen) oder dem Eintreffen der Replikationsgabeln
zu einem Doppelstrangbruch bzw. –ende führen kann. Andere Mutagene verursachen CPDs (Cyclobutanpyrimidindimere) oder intra- und interstranguläre Crosslinks.
Diese DNA-verformenden Schäden werden von der Nukleotidexzisionsreparatur
(NER) behoben oder können sich durch Eintreffen des Replisoms zu Doppelstrangbrüchen oder Tochterstranglücken entwickeln, welche die Rekombinationsreparatur
erfordern. Interstranguläre Crosslinks können zudem durch gleichzeitige Exzisionsreparatur in beiden DNA-Strängen zu Doppelstrangbrüchen führen.
Nach der Behandlung mit Mitomycin C zeigten drei Glykosylase-Mutanten eine höhere Überlebensrate als der Ausgangsstamm S. lividans TK64 (Abbildung 30). Die
3maDG, ung1 und mutM Mutanten waren mit durchschnittlich 10 bis 13 % höheren
Überlebensraten signifikant resistenter gegenüber diesem Mutagen. Durch Mitomycin C wird die Nukleotidexzisionsreparatur und die Rekombinationsreparatur der Zelle belastet (siehe Abbildung 57). Die Ergebnisse der Glykosylase-Mutanten deuten
darauf hin, dass es für das Überleben der Zelle offensichtlich besser ist, einige spontan auftretende Basenmodifikationen (z.B. eingebautes Uracil) unrepariert zu belassen und die damit verbundenen Mutationen in Kauf zu nehmen, als die Reparatursysteme durch zusätzliche Basenexzisionsreparatur (bei nicht deletierten Glykosyla148
Diskussion
sen) zu belasten. Die Überlebensrate der ung2 Mutanten war zwar dem widersprechend um durchschnittlich 5,6 % erniedrigt, allerdings überlappten die Streuungen
der Messpunkte der ung2 Mutanten bei fast allen Mitomycin C-Konzentrationen mit
der Streuung bzw. auch dem Mittelwert des Ausgangsstammes S. lividans TK64. Vor
allem bei der höchsten Mitomycin C-Konzentration war die Überlebensrate der ung2
Mutanten nur um 3 % erniedrigt und die Messwerte streuten um 8,8 % (ung2) bzw.
9,6 % (Referenzstamm). Vermutlich war die Abweichung daher nicht signifikant und
die Uracil-DNA-Glykosylase spielt insgesamt nur eine untergeordnete Rolle.
Aus der Gruppe der Nukleasen ist die in dieser Arbeit deletierte Exonuklease III
(exoIII, xthA) vor allem in der späteren Phase der Basenexzisionsreparatur von Relevanz (Mutageneseergebnisse siehe Abbildung 28-30). Die um 12 % signifikant reduzierte Überlebensrate bei der MNNG-Mutagenese entsprach den Erwartungen
(P-Wert: 4,9 %; -Wert > 2), da MNNG DNA-Schäden verursacht, welche durch die
Basenexzisionsreparatur behoben werden. Die exoIII Mutanten waren stärker betroffen als die Glykosylase-Mutanten, da nach der Basenentfernung durch eine von
mehreren Glykosylasen (Ausnahme: mutM mit eigener AP-Endonuklease-Funktion)
die Exonuklease III den Reparaturweg weiterführt. Die exoIII Mutanten zeigten bei
der Mutagenese mit Zeocin oder Mitomycin C keine signifikanten Veränderungen im
Vergleich mit dem Ausgangsstamm S. lividans TK64, jedoch eine im Durchschnitt um
7,6 % verringerte Überlebensrate bei der Bestrahlung mit UV-Licht. Bei der Nukleotidexzisionsreparatur von UV-Licht-induzierten Pyrimidin-Dimeren spielt ExoIII vermutlich keine Rolle. UV-Licht verursacht jedoch zusätzlich direkt und indirekt DNASchäden, die von der Rekombinationsreparatur oder der Basenexzisionsreparatur
behoben werden. Hier könnte ExoIII als Nuklease beteiligt sein und sich die Deletion
von exoIII daher in geringem Maße auf die Vitalität der Zellen ausgewirkt haben.
5.3
Deletion eines Gens der Nukleotidexzisionsreparatur
Die verschiedenen Enzyme der Nukleotidexzisionsreparatur sind ubiquitär verbreitet
und hoch konserviert. In Zellen, die dem Sonnenlicht ausgesetzt sind, entstehen
durch das enthaltene UV-Licht u.a. Cyclobutanpyrimidindimere in der DNA. Fehlt den
Zellen die Fähigkeit, diese Art von DNA-verformenden Schäden zu beheben, so ist
ihre Vitalität stark beeinträchtigt. UvrB spielt in der Nukleotidexzisionsreparatur eine
zentrale Rolle, da es sowohl mit UvrA als auch mit UvrC wechselwirkt (siehe Abbildung 8). Die uvrB Deletionsmutanten sollten daher nicht mehr in der Lage sein, solche Schäden zu reparieren. Die Ergebnisse entsprachen diesen Erwartungen. Schon
die natürliche chromosomale Instabilität war mit zirka 1 % im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 verdreifacht. Dies zeigt deutlich, dass die Nukleotidexzisionsreparatur schon für die Aufrechterhaltung der chromosomalen Integrität
149
Diskussion
essentiell ist. Auch gab es etwa doppelt so viele Kolonien, welche phänotypisch
flach, verfärbt und vor allem bei einer Überimpfung auf neues Medium nicht mehr
lebensfähig waren (NLKs: nicht lebensfähige Kolonien). Die Mutagene MNNG und
Zeocin, welche keine verformenden DNA-Schäden verursachen, beeinträchtigten die
Überlebensfähigkeit der Deletionsmutanten nicht (Abbildung 31). UV-Licht und Mitomycin C waren dagegen für diese Zellen schon in schwachen Dosen letal (Abbildung
32 und 33). Im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 sanken die Überlebensraten bei zunehmender Einwirkung von Mutagen drastisch. Damit wurde deutlich, dass es zur Nukleotidexzisionsreparatur keine Alternative in der Zelle gibt. Auch
die Rekombinationsreparatur, welche gegebenenfalls Folgeschäden (Doppelstrangbrüche, Tochterstranglücken) beheben kann, konnte gehäuft auftretende Cyclobutanpyrimidindimere, Crosslinks oder andere DNA-verformende Schäden nicht auffangen. S. lividans TK64 ging es mit dieser Art von Schäden genauso wie E. coli und
anderen Bakterien bzw. Eukaryoten. Der Versuchsaufbau bei der Mutagenese mit
UV-Licht (Bestrahlung und anschließende Inkubation der Zellen im Dunkeln) verhinderte dabei ein mögliches Einschreiten der Photolyase (lichtabhängige Reaktion), so
dass der stark mutagene Effekt von UV-Licht auf eine fehlende Nukleotidexzisionsreparatur unverfälscht gemessen werden konnte.
5.4
Mutanten mit Deletionen von zwei vermuteten Genen des nichthomologen Verbindens von Enden
Das ursprünglich in Eukaryoten entdeckte System des nicht-homologen Verbindens
von Enden kommt in dem Modellorganismus E. coli oder auch dem sehr strahlungsresistenten Bakterium D. radiodurans nicht vor. Orthologe Gene wurden jedoch unter
anderem in B. subtilis gefunden. Auch in S. lividans und S. coelicolor zeigte die Sequenzanalyse ein ku-ähnliches Gen, welches unmittelbar neben einer Ligase kodiert
ist. Daher bestand die Möglichkeit, dass auch in Streptomyceten ein Reparaturmechanismus des nicht-homologen Verbindens von Enden vorhanden ist. Die Ergebnisse der Deletionsmutanten dieser beiden Gene stützen diese Vermutung jedoch
nicht (Abbildungen 34-36). Die durchschnittliche Abweichung der Überlebensraten
bei den Mutagenen UV-Licht und Mitomycin C betrug -5,1 % bzw. +1 % (siehe Abbildungen 35 und 36). Es kam also zu keiner signifikanten Verbesserung der Überlebensrate, obwohl diese Mutagene indirekt auch zu Doppelstrangbrüchen führen können. Bei der Mutagenese mit MNNG kam es zu keiner Veränderung der Überlebensfähigkeit, was jedoch für dieses Mutagen auch nicht erwartet wurde. Sollte es einen
Reparaturweg des nicht-homologen Verbindens von Enden geben, so ist Zeocin das
Mutagen, auf das diese Zellen am deutlichsten ansprechen sollten, da Zeocin direkt
Doppelstrangbrüche in der DNA erzeugt. Die Überlebensrate der Deletionsmutanten
150
Diskussion
war im Fall der Zeocin-Mutagenese jedoch mit 3 % mehr nicht signifikant erhöht
(P-Wert: 64,9 %; -Wert < 2). Die Gene des ku-ähnlichen ORFs (engl.: open reading
frames) und der benachbarten Ligase bilden daher in Streptomyceten kein – oder
zumindest kein effizientes – System des nicht-homologen Verbindens von Enden.
Dass die natürliche Instabilität in den ku+lig Deletionsmutanten trotzdem erhöht war
(1,3 % statt 0,32 %) könnte daran liegen, dass die Ligase separat eine Rolle in einem
der DNA-Reparaturwege spielt. Es sollte jedoch nicht unerwähnt bleiben, dass die
Deletion von ku zum Beispiel in Mykobakterien die Frequenz der homologen Rekombination erhöht, da Ku vermutlich die Doppelstrangenden vor dem Angriff der prozessierenden Nukleasen schützt (Gupta et al. 2011). Daher könnte die Deletion eines
funktionierenden Systems des nicht-homologen Verbindens von Enden durch einen
solchen Effekt kompensiert werden.
5.5
Mutanten mit Deletionen von Genen der Rekombinationsreparatur
Im Rahmen der Rekombinationsreparatur bindet RecN als eines der ersten Enzyme
an Doppelstrangbrüche und schützt diese bzw. bietet den nachfolgenden Proteinen
eine Plattform (siehe Ende des Abschnittes 2.3.4). Ist dies auch in Streptomyceten
der Fall, so sollten die recN Mutanten sensitiver gegenüber allen Mutagenen sein,
welche Doppelstrangbrüche direkt oder indirekt verursachen. Die Ergebnisse der
recN Mutanten zeigten diese Tendenz, jedoch waren die Auswirkungen auf die Überlebensfähigkeit der Zellen nicht besonders ausgeprägt. Das Mutagen MNNG (induziert Basenexzisionsreparatur) wirkte sich wie erwartet nicht auf die Überlebensrate
der Deletionsmutanten aus (Abbildung 42). Die um 3,9 % erhöhte Überlebensrate
war mit einem P-Wert von 46,7 % nicht signifikant verändert (-Wert < 2). Die Überlebensrate war dagegen bei der Zeocin-Mutagenese um zirka 5 % erniedrigt (P-Wert:
27,2 %; -Wert < 2). Nach der Bestrahlung mit UV-Licht war die Überlebensrate gemittelt über alle Werte um durchschnittlich 8 % erniedrigt. Die Mutagenese mit Mitomycin C reduzierte die Überlebensrate um durchschnittlich 7 %, wobei die größte
Abweichung mit 13 % bei der höchsten Mitomycin C-Konzentration gegeben war. Die
natürliche Instabilität war konsistent mit diesen Ergebnissen um zirka 0,4 % erhöht.
RecN spielt daher - wie auch in anderen Bakterien - eine Rolle bei der Rekombinationsreparatur von Doppelstrangbrüchen. Es ist aber nicht so essenziell, dass die recN
Mutanten vergleichbar wie bei einer Deletion von recO oder recF betroffen waren.
Die Rekombinationsreparatur konnte trotzdem noch in leicht verringertem Umfang
stattfinden.
Der RecBCD-Weg ist in E. coli und vielen anderen Bakterien der Hauptweg für die
Rekombinationsreparatur. Andere Bakterien wie B. subtilis haben alternativ das Heli151
Diskussion
kase/Nuklease System AddAB. Streptomyceten und D. radiodurans gehören dagegen zu den Bakterien, die keines dieser Systeme besitzen (vgl. Tabelle 11). Trotzdem ist in diesen Bakterien ein recD Gen gefunden worden. Allerdings ist die isolierte
Funktion von RecD unklar, da RecD in anderen Bakterien nur als Untereinheit des
RecBCD-Holoenzyms bekannt ist (siehe auch Abschnitt 2.3.4: „Der RecBCD-Weg“).
RecD aus D. radiodurans ist wie auch in E. coli eine 5´3´-DNA-Helikase (Wang und
Julin 2004). Die Reaktion der recD Mutanten sollte zeigen, ob RecD in S. lividans
TK64 noch einen wichtigen Beitrag zur DNA-Reparatur stellt. Die durchschnittliche
natürliche Instabilität der recD Mutanten war geringfügig erhöht, jedoch noch innerhalb der Streuung der Messungen des Ausgangsstammes S. lividans TK64. Die
Überlebensrate der Deletionsmutanten war bei der Mutagenese mit MNNG oder Zeocin nicht signifikant verändert (Abbildung 42) (MNNG P-Wert: 42,0 %; Zeocin
P-Wert: 96,6 %; -Wert jeweils kleiner als 2). Bei der Bestrahlung mit UV-Licht reagierten die recD Mutanten mit einer um durchschnittlich 5 % reduzierten Überlebensrate etwas sensibler als der Ausgangsstamm S. lividans TK64. Dies war bei den geringeren Bestrahlungsintensitäten etwas deutlicher zu erkennen (siehe Abbildung 43). Bei der Mitomycin C-Mutagenese gab es dagegen keine Abweichung im
Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 (Abbildung 44). Die geringfügige
Abweichung bei der UV-Licht-Mutagenese könnte darauf hindeuten, dass RecD als
Helikase bei der Rekombinationsreparatur involviert ist.
RecQ ist eine 3´5´-DNA-Helikase, die in E. coli zusammen mit der 5´3´Einzelstrang-Exonuklease RecJ (nicht vorhanden in Streptomyceten) an doppelsträngigen DNA-Enden 3´-DNA-Überhänge für die Rekombinationsreparatur mittels
des RecF-Weges erzeugt. Sie prozessieren auch den Folgestrang an blockierten
Replikationsgabeln für die Wiederaufnahme der Replikation (Courcelle und Hanawalt
1999) bzw. Tochterstranglücken vor der Bindung von RecF, RecO und RecR (Morimatsu und Kowalczykowski 2003). Andere Helikasen, die hier assistieren können,
wären die Helikase II (UvrD) und HelD (Mendonca et al. 1995). Zu Beginn der Arbeit
wurden die Sequenzen für die Primer zur Deletion von recQ aus S. coelicolor A3(2)
abgeleitet, da S. lividans noch nicht sequenziert war. In S. coelicolor A3(2) wird das
Gen SCO5815 als recQ Helikase vermutet und entspricht in S. lividans dem Gen
SSPG01915. In S. lividans dagegen wurde mittlerweile das Gen SSPG03087 als
recQ annotiert, welches in S. coelicolor A3(2) der Helikase SCO4577 entspricht. Deletiert wurde SSPG01915, welches in S. coelicolor A3(2) als recQ angenommen wurde. Es besteht daher die Möglichkeit, dass das wirkliche recQ-Gen SSPG03087 ist
und folglich nicht deletiert wurde. Die mehr als doppelt so hohe chromosomale Instabilität der erhaltenen recQ Mutanten spricht für eine wichtige Rolle des Enzyms im
Erhalt der genomischen Integrität. Die Überlebensfähigkeit der Deletionsmutanten
152
Diskussion
war im Vergleich mit S. lividans TK64 bei der Zeocin-Mutagenese nicht beeinträchtigt
(Abbildung 42). Bei der UV-Licht-Mutagenese war die Überlebensrate der recQ Mutanten um durchschnittlich 4 % reduziert und bei der Mitomycin C-Mutagenese sogar
um durchschnittlich 14 % (Abbildungen 43 und 44). Diese verringerte Vitalität der
Mutanten spricht dafür, dass RecQ als eine der möglichen Helikasen bei der Rekombinationsreparatur beteiligt ist. Unerwartet war dagegen die Reaktion der recQ Mutanten auf das Einwirken von MNNG. Die Überlebensrate war um zirka 11 % verringert (von 19,1 % bei S. lividans TK64 auf 8 %) (P-Wert: 17,1; -Wert > 2). RecQ
scheint demnach bei der Basenexzisionsreparatur eine Rolle zu spielen, obwohl hier
augenscheinlich keine Helikase benötigt wird. Bei der Basenexzisionsreparatur gibt
es den Fall, dass nach der Exzision des veränderten Nukleotids noch ein Teil des
angrenzenden DNA-Stranges abgelöst wird (engl.: Flap). Dieser wird von FlapEndonukleasen abgespalten und die fehlenden Nukleotide wieder von DNAPolymerasen ersetzt (siehe dazu Abbildung 7). Möglicherweise ist bei diesem Mechanismus eine Helikase beteiligt. Eventuell ist diese verminderte Überlebensfähigkeit auch ein Effekt der betroffenen Rekombinationsreparatur, welche einspringen
muss, wenn die Replikationsgabel auf Einzelstrangbrüche trifft, die als Zwischenprodukt der Basenexzisionsreparatur entstehen.
RecQ erzeugt zusammen mit RecJ in E. coli für die homologe Rekombination erforderliche 3´-DNA-Überhänge. Streptomyceten haben kein RecJ und ihnen fehlt die
Möglichkeit 3´-DNA-Überhänge über das RecBCD- oder das AddAB-System zu erzeugen. Es stellt sich daher die Frage, welches Enzym für RecJ einspringen kann. In
Streptomyceten ist die Exonuklease VII annotiert worden (xseA und xseB), welche
als 5´3´-Einzelstrang-Exonuklease diese Aufgabe übernehmen könnte (siehe Tabelle 11). Eine weitere Möglichkeit wäre das AdnAB-System. Dieses wurde erst
nach Abschluss der experimentellen Arbeiten publiziert (Sinha et al. 2009) und stellt
in Mykobakterien ein Helikase/Nuklease-System, welches an Stelle von RecBCD die
Doppelstrangenden für die RecA-abhängige homologe Rekombination prozessiert
(Gupta et al. 2011). RecBCD ist dabei in seiner Funktion nicht redundant zu AdnAB
sondern leitet einen RecA-unabhängigen Reparaturweg ein (siehe auch Abschnitt
2.3.4 „Das AdnAB-Helikase/Nuklease-System“).
Streptomyceten besitzen von den bekannten Enzymen der präsynaptischen Phase
der homologen Rekombination nur RecF, RecO und RecR. Das Gen recO wurde
erfolgreich deletiert. Eine recF Mutante wurde von der Arbeitsgruppe Günter Muth
aus Tübingen gestellt (siehe Abschnitt 4.1.3 letzter Absatz). Die Untersuchung der
Mutanten sollte klären, wie wichtig der RecF-Weg in Streptomyceten ist, und ob die-
153
Diskussion
se Bakterien gegebenenfalls auf einen noch nicht entdeckte Alternativweg zurückgreifen können.
Schon bei der Deletion von recO selbst fiel auf, dass sehr viel mehr Transformanten
getestet werden mussten als bei den anderen Genen, um vier Deletionsmutanten zu
erhalten. Der eigene Deletionsversuch von recF und recR war nicht erfolgreich. Die
gestellte recF Mutante hat gegebenenfalls noch eine geringe Restaktivität von RecF,
da das Gen nicht ganz entfernt wurde, sondern nur ein Antibiotikaresistenzgen eingefügt wurde. Das Fehlen von RecO oder RecF wirkte sich drastisch auf die chromosomale Stabilität der Zellen aus (siehe Abbildung 38). Zirka ein Drittel der Sporen
konnte keine normalen Kolonien bilden. 8,5 % (recO) bzw. 10 % (recF) dieser veränderten Kolonien waren Chloramphenicol-sensitiv. Die restlichen zirka 25 % wuchsen
nach dem Überimpfen auf frisches Medium schon nicht mehr an. Diese Beobachtungen zeigen bereits, dass RecF und RecO für die Zellen essentielle Enzyme sind. Die
Mutagenese mit MNNG verringerte die Überlebensrate der Mutanten um zirka das
Dreieinhalb- (recO) bzw. das Sechsfache (recF) im Vergleich zum Referenzstamm
S. lividans TK64 (5,4 % bzw. 3,1 % zu 19,1 %) (siehe Abbildung 39). Die Deletionsmutanten reagierten sehr sensitiv, obwohl das Mutagen MNNG nur über Folgeschäden (Brüche in der DNA während der Basenexzisionsreparatur) und daher in sehr
geringem Maße das Eingreifen der Rekombinationsreparatur erfordert (vergleiche
Abbildungen 57 und 58.). Wurden von Mutagenen DNA-Schäden verursacht, welche
direkt die Rekombinationsreparatur ansprechen (Zeocin, UV-Licht, Mitomycin C –
siehe Abbildung 58), war die Überlebensfähigkeit der Zellen schon bei geringsten
Konzentrationen stark beeinträchtigt. Die Sporen der recF und recO Mutanten keimten bei der gewählten Konzentration Zeocin von 25 µg/ml nicht mehr aus (siehe Abbildung 39). Bei der Mutagenese mit Mitomycin C führte bereits eine Konzentration
von 5 µg/ml dazu, dass keine Kolonien mehr anwuchsen (siehe Abbildung 41) und
die Bestrahlung mit UV-Licht senkte die Überlebensrate ab einer Intensität von
60 J/m2 (recF) bzw. 70 J/m2 (recF) auf unter 0,1 % (vergleiche Abbildung 40; siehe
dazu auch Tabelle 10).
Die recF und recO Mutanten sind demnach zur Rekombinationsreparatur bzw. homologen Rekombination kaum oder nicht mehr fähig. Die Auswirkungen der Deletionen
von recF oder recO sind mit der Deletion von recA vergleichbar. Der RecF-Weg ist
somit der Hauptweg der Rekombinationsreparatur ohne erkennbare Alternative.
154
Diskussion
MNNG
intakte DNA
P&R
UV-Licht
dUTP
UV-Licht
Glykosylasen
BER
NER
Mitomycin C
xthA u.a.
ss-Bruch
CPDs
Crosslinks
Regression
BER in beiden
DNA-Strängen
gleichzeitig
Kollaps der
Replikations-
Wiederaufnahme
der Replikation
gabel
strangabwärts
Zeocin
ds-Bruch
ds-Enden
ss-Lücke
Auflösen der
Holliday Struktur
RR
Abbildung 58: Zusammenspiel der DNA-Reparaturwege (erweitert)
Die Reparaturwege der Zelle (dunkel gestrichelte Pfeile) sind jeweils für bestimmte
DNA-Schäden zuständig. Durch Klärung des Nukleotidpools bzw. das Entfernen von
Modifikationen an Basen können Schäden verhindert bzw. rückgängig gemacht werden (P&R: Prävention und Reversion; oben links in der Abbildung). Veränderte Basen, welche u.a. durch die Einwirkung von MNNG oder UV-Licht entstehen, werden
sonst durch die Basenexzisionsreparatur (BER) entfernt. Der zwischenzeitlich entstehende Einzelstrangbruch kann durch gleichzeitige Basenexzisionsreparatur im Gegenstrang oder das Eintreffen und den nachfolgenden Kollaps der Replikationsgabel
zu Folgeschäden (Doppelstrangbruch, doppelsträngige Enden) führen, welche die
Rekombinationsreparatur (RR, untere Abbildungshälfte) benötigen. Doppelstrangbrüche können z.B. duch das Mutagen Zeocin auch direkt verursacht werden (siehe linke
Abbildungsseite). DNA-verformende Schäden - z.B. verursacht durch UV-Licht oder
155
Diskussion
Mitomycin C - werden von der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) behoben. Trifft zuvor das Replisom ein, so entstehen Tochterstranglücken, wenn die Replikation
strangabwärts an einer, nur einen Strang betreffenden Läsion wieder aufgenommen
wird (siehe rechte Abbildungsseite). Die Läsion selbst wird mittels Exzisionsreparatur
entfernt. Wird die Replikationsgabel dagegen ganz blockiert (interstrangulärer Crosslink, gebundenes Protein etc.) kann es zur Regression der Gabel in eine Hollidayartige Struktur kommen, (engl.: chicken foot structure), welche nach ihrer Auflösung
die Rekombinationsreparatur erfordert (doppelsträngiges Ende). Gleichzeitige Exzisionsreparatur in beiden DNA-Strängen (z.B. an interstranguläre Crosslinks) führt zudem zu Doppelstrangbrüchen (Verbindung in der Abbildung nicht dargestellt).
RuvA, RuvB und RuvC bzw. RecG sind die Hauptenzyme in der postsynaptischen
Phase der homologen Rekombination (siehe Abschnitt 2.3.4, Abschnitt „Der RecFWeg“). RuvABC kann DNA-Überkreuzungsstrukturen (engl.: Holliday junctions) verschieben und auflösen, während RecG diese nur verschieben kann. Die beiden Systeme sind also zum Teil redundant. Die Anzahl der Chloramphenicol-sensitiven Kolonien war bei der Deletion der Gengruppe ruvABC (4,8 %) und des Gens recG (0,8 %)
im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans TK64 (0,3 %) erhöht (Abbildung 38
bzw. Tabelle 10). Die ruvABC Mutanten hatten zusätzlich 1,7 % NLK (nicht lebensfähige Kolonien; S. lividans TK64: 0,3 %). RuvABC und RecG – RuvABC in stärkerem
Ausmaß – leisten demnach schon in der normalen Entwicklung der Zellen einen
wichtigen Beitrag zum Erhalt der genomischen Integrität der Bakterien. Eine Behandlung mit dem Mutagen MNNG, welches die Basenexzisionsreparatur anspricht, zeigte wie erwartet keine Reduktion der Überlebensrate der Deletionsmutanten (siehe
Abbildung 39). Diese war sogar jeweils etwas erhöht.
Wie in Abbildung 58 zu sehen ist, gibt es verschiedene Ausgangspunkte für die Rekombinationsreparatur, abhängig von der Art des DNA-Schadens. Es gibt die „klassische“ homologe Rekombination. Der 3´-DNA-Überhang eines prozessierten doppelsträngigen DNA-Bruchs oder -Endes dringt in das homologe Schwesterchromosom
ein und die dabei entstehende Überkreuzung mit dem verdrängten DNA-Strang wird
geschnitten (siehe Abbildung 58 untere Hälfte, links). Das Mutagen Zeocin, welches
Doppelstrangbrüche erzeugt, erfordert einen solchen Strangaustausch mit dem homologen Schwesterchromosom und die anschließende Auflösung der Überkreuzungsstrukturen. Hier zeigten die recG Mutanten keine Reaktion, während die
Sporen der ruvABC Mutanten nicht mehr auskeimten (<0,1 %) (S. lividans TK64:
20,2 %). Für die alleinige Auflösung einer Überkreuzungsstruktur scheint daher nur
RuvABC benötigt zu werden. RecG ist nicht beteiligt, wie die fehlende Sensibilität der
recG Mutanten gegenüber Zeocin zeigte.
UV-Licht und Mitomycin C verursachen dagegen DNA-Schäden, welche die Nukleotidexzisionsreparatur erfordern bzw. nach Eintreffen der Replikationsgabel die Re156
Diskussion
kombinationsreparatur. An blockierenden Läsionen, die nur einen DNA-Strang betreffen, entstehen nach der Wiederaufnahme der Replikation strangabwärts Tochterstranglücken (siehe Abbildung 58 untere Hälfte, rechts) oder es kommt an blockierenden Läsionen zur Regression der Replikationsgabel (siehe Abbildung 58, mittig)
(McGlynn und Lloyd 2002, Friedberg et al. 2006). Eine Regression kann dabei zum
einen an einer DNA-Läsion stattfinden, welche beide Stränge des Chromosoms blockiert, z.B. ein DNA-Crosslink (Mitomycin C). In diesem Fall ist nach der Regression
das RuvABC System zur Auflösung der Überkreuzungsstruktur nötig (McGlynn und
Lloyd 2002). Dadurch entstehen doppelsträngige Enden, die wiederum mit dem intakten Strang verpaart werden müssen, um eine Wiederaufnahme der Replikation zu
erreichen (siehe Abbildung 58 untere Hälfte, mittig). Zum anderen kann die Regression an DNA-Läsionen erfolgen, die nur einen der Elternstränge betreffen, z.B. an
einem Cyclobutandimere (UV-Licht). In diesem Fall bietet die Regression der Zelle
die Möglichkeit, den ansonsten durch das Replisom verdeckten Schaden der Exzisionsreparatur wieder zugänglich zu machen. Dabei wird die Läsion wieder mit dem
unbeschädigten Elternstrang verpaart, so dass eine fehlerfreie Reparatur stattfinden
kann (McGlynn und Lloyd 2002).
Die Regression der Replikationsgabel bietet alternativ auch eine Möglichkeit zur
Schadenstoleranz (siehe Abbildung 59). Zumindest in dem Bakteriophagen T4 konnte ein solcher Mechanismus nachgewiesen werden (Kadyrov und Drake 2003).
Regression
DNASynthese
reverse
Regression
Abbildung 59: Schadenstoleranz durch Regression der Replikationsgabel
Eine Läsion in einem DNA-Strang (z.B. Cyclobutanpyrimidindimer) verhindert die Polymerisation eines der neuen Tochterstränge. Die Regression und damit verbundene
Verpaarung mit dem weiter fortgeschrittenen homologen Tochterstrang ermöglicht die
DNA-Synthese über den Bereich der Läsion hinaus. Nach der Reversion der Regression kann die Replikation normal fortschreiten (Friedberg et al. 2006; Bildquelle siehe
Figure 16-27 bzw. 16-30).
Nach der Behandlung mit 25 µg/ml Mitomycin C war die Überlebensrate der ruvABC
Mutanten im Vergleich zu S. lividans TK64 um das Zweieinhalbfache reduziert (die
durchschnittliche Überlebensrate war um 33 % verringert), während die Überlebensrate der recG Mutanten durchschnittlich nur um 6,8 % reduziert war (Abbildung 41).
Bei der Bestrahlung mit UV-Licht reagierten die recG Mutanten mit einer durch157
Diskussion
schnittlich um 10 % reduzierten Überlebensrate dagegen empfindlicher als die
ruvABC Mutanten mit durchschnittlich nur 4,6 % verringerter Vitalität (siehe Abbildung 40).
Die Ergebnisse zeigten, dass die Aufgaben von RuvABC bzw. RecG, abhängig von
der Art des DNA-Schadens und dem damit verbundenen Reparaturmechanismus,
unterschiedlich verteilt sind. Die Auflösung von DNA-Überkreuzungsstrukturen erfordert RuvABC. Wird dagegen eine Verschiebung der Überkreuzungsstruktur benötigt welche bei der Wiederaufnahme der Replikation die Überkreuzungsstruktur alternativ
auflösen kann - oder findet eine Regression der Replikationsgabel statt, so ist RecG
beteiligt. Besonders deutlich zeigte dies die Reaktion auf UV-Licht, wo die Kombination aus Regression und Exzisionsreparatur eine wichtige Rolle spielt (recG Mutanten
sensitiver als ruvABC Mutanten). Dies entspricht der Theorie, dass eine Regression
der Replikationsgabel nicht spontan erfolgt, sondern von RecG katalysiert wird
(McGlynn und Lloyd 2001b, McGlynn et al. 2001, Rubo et al. 2004). RuvABC kann
dagegen zwar Überkreuzungsstrukturen auflösen, aber es kann die Replikationsgabel nicht so entwinden (Regression), dass solche Überkreuzungsstrukturen entstehen (McGlynn und Lloyd 2001a).
Mutationen von sbcC in E. coli wurden ursprünglich entdeckt, weil sie ein schnelleres
Wachstum rekombinationsdefizienter sbcB recBC Mutanten ermöglichten (Lloyd und
Buckman 1985). Palindromische Sequenzen und Wiederholungen von Trinukleotiden
können bestimmte Sekundärstrukturen, sogenannte Stämmchen (engl.: hairpin),
Pseudo-Stämmchen oder Kreuzformen ausbilden (Leach 1994). Dies führt zu Instabilität durch erhöhte Fehlpaarung bei der DNA Replikation und Rekombination (Leach
1994). SbcCD fungiert als 3´5´-Exonuklease und Endonuklease von DNA, welche
diese Sekundärstrukturen, die sich an der Replikationsgabel bilden können, erkennt
und schneidet (Connelly und Leach 1996). Die kollabierte Replikationsgabel wird danach mittels der Rekombinationsreparatur wieder hergestellt (siehe auch Abbildung 58).
Die Deletion der Gengruppe sbcCD in S. lividans TK64 verdoppelte die chromosomale Instabilität der Zellen. Dagegen war die Überlebensfähigkeit der sbcCD Mutanten bei der Mutagenese mit MNNG um 15 % erhöht (P-Wert: 0,3; -Wert > 2), bei der
Mutagenese mit Zeocin um 20 % erhöht (P-Wert: 0,6; -Wert > 2) und nach der Behandlung mit Mitomycin C um durchschnittlich 5,2 % verbessert. Nur die Bestrahlung
der sbcCD Mutanten mit UV-Licht führte zu keiner signifikanten Veränderung gegenüber dem Ausgangstamm. Durch das Fehlen von SbcCD können die erwähnten Sekundärstrukturen nicht geschnitten werden (s.o.), was zu der beobachteten, erhöhten
genetischen Instabilität führt. Ist die Zelle mutagenem Stress ausgesetzt, scheint sich
158
Diskussion
die Mutation von sbcCD jedoch positiv auf die Überlebensfähigkeit der Zellen auszuwirken.
Dies könnte daher kommen, dass im Ausgangsstamm die SbcCD Nuklease durch
das Entfernen der Sekundärstrukturen die Rekombinationsreparatur zusätzlich belastet, während die sbcCD Mutanten ihre gesamte Reparaturkapazität für die durch das
Mutagen verursachten DNA-Schäden aufwenden kann. Allerdings würde man dann
auch eine solche Reaktion bei der Mutagenese mit UV-Licht erwarten.
Wahrscheinlicher ist, dass die 3´5´-Exonukleaseaktivität 3´-DNA-Überhänge entfernt. Folglich wäre die Reparatur von Doppelstrangbrüchen im Ausgangsstamm
durch SbcCD reduziert, während sie in den sbcCD Mutanten unbehindert erfolgen
kann. SbcCD gilt auch als anti-Rekombinationsenzym (Lloyd und Buckman 1985).
Solche Doppelstrangbrüche entstehen bei der Mutagenese mit Zeocin direkt. Nach
der Behandlung mit Mitomycin C kann es an den Interstrang-Crosslinks zur Regression der Replikationsgabel kommen, welche nach der Auflösung der entstehenden
Überkreuzungsstrukturen durch RuvABC zu doppelsträngigen DNA-Enden führt (siehe dazu Abbildung 58 und den darauffolgenden Abschnitt zu RuvABC und RecG).
Die Bestrahlung mit UV-Licht führt dagegen eher zu Tochterstranglücken (Abbildung 58). Die Mutagenese mit MNNG kann bei der erforderlichen Basenexzisionsreparatur zwischenzeitlich zu Strangbrüchen führen. Dies kann nachfolgend
Doppelstrangbrüche erzeugen, falls die Replikationsgabel darüber hinweggeht. Obwohl die Verbesserung der Überlebensrate der sbcCD Mutanten bei der MNNGMutagenese im Verhältnis zur Mutagenese mit Zeocin oder Mitomycin C unerwartet
stark ausfiel. Insgesamt wäre diese Hypothese jedoch besser im Einklang mit den
beobachteten Überlebensraten der sbcCD Mutanten, als die Idee einer überlasteten
Rekombinationsreparatur.
Der Effekt in Streptomyceten unterscheidet sich dabei deutlich von dem Verhalten
von B. subtilis, in dem nach einer Deletion von sbcC die Empfindlichkeit gegenüber
Mitomycin C und Gammastrahlung erhöht ist (Mascarenhas et al. 2006)
5.6
Fehlende Enzyme der methylierungsabhängigen Reparatur
Wie der Tabelle 11 zu entnehmen ist, haben Streptomyceten keine Enzyme der methylierungsabhängigen DNA-Reparatur (MMR, engl.: methyl directed mismatch repair). Dies ist auch in Mycobacterium tuberculosis der Fall. Es wurde vermutet, dass
diese Gene in Mycobacterium tuberculosis verloren gegangen sind, da eventuell das
Fehlen dieses Reparaturweges einen Selektionsvorteil bietet. Die methylierungsabhängige Reparatur limitiert die Rekombination zwischen eng verwandten Sequenzen,
und der Verlust könnte die Diversifizierung und Evolution des bakteriellen Genoms
begünstigen, z.B. in Richtung Antibiotikabiosynthesewege und ihren Resistenzen
159
Diskussion
(genauere Ausführung dieser Hypothese siehe Dos Vultos et al. 2009) . Vielleicht
trifft dies auch auf Streptomyceten zu.
5.7
Komplementationsversuche
Im Rahmen dieser Arbeit wurden für die Gene recF, recO, recR und recD aus
S. lividans TK64 getestet, in wieweit diese eine Deletion der entsprechenden Gene in
E. coli komplementieren konnten. Alle Gene konnten erfolgreich in E. coli exprimiert
werden (siehe Abbildungen 48-49). Zur Kontrolle des Komplementationsverfahrens
wurden zudem die Gene recF, recO, recR und recD aus E. coli in den entsprechenden Deletionsstämmen exprimiert und eine Komplementation konnte für alle Enzyme
nachgewiesen werden. Die Ergebnisse eines Sequenzvergleiches der Enzyme aus
S. lividans und E. coli ist in Tabelle 12 zu sehen.
Tabelle 12:
Vergleich der Aminosäuresequenz der Enzyme RecF, RecO,
RecR und RecD aus S. lividans und aus E. coli
Protein
Identische AS
Ähnliche AS
Score
RecF
27,5 % (107/389)
41,6 % (162/389)
295,5
RecO
23,0 % (65/282)
35,1 % (99/282)
112,0
RecR
45,8 % (92/201)
64,2 % (129/201)
458,0
RecD
20,6 % (179/869)
32,0 % (278/869)
437,0
Proteininformation aus den sequenzierten Stämmen S. lividans TK24 bzw. E. coli K12;
Alignment mit EMBOSS Needle (www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/): Dieses
Tool benutzt den Needleman-Wunsch Alignment Algorithmus zur Auffindung des optimalen Alignment von zwei Sequenzen entlang ihrer gesamten Länge (Rice et al.
2000). Siehe dazu auch: http://bioweb2.pasteur.fr/docs/EMBOSS/needle.html und
http://emboss.sourceforge.net/docs/themes
Die Sequenzhomologie der Proteine RecF, RecO und RecD ist mit jeweils unter
30 % Identität nicht besonders ausgeprägt. Die Sequenzähnlichkeit erreicht aber immerhin bei RecF über 40 % und bei RecO und RecD über 30 %. Das Enzym RecR
aus S. lividans TK64 ist stärker konserviert und hat mit 45,8 % eine deutlichere
Übereinstimmung mit dem entsprechenden Protein aus E. coli.
Mit dem Enzym RecD aus S. lividans TK64 konnte im Versuch keine Komplementation festgestellt werden (siehe Abbildung 55). Seine Sequenzidentität ist im Vergleich
mit den anderen Proteinen auch am geringsten ausgeprägt. Allerdings sind Plasmide
in recBCD Stämmen sehr instabil, so dass nach der Induktion eine kontinuierliche
Expression des Gens recD aus S. lividans TK64 in dem Stamm CL4 (recD) nicht
gewährleistet werden konnte.
160
Diskussion
Die Expression von recF und recR in Deletionsstämmen von E. coli führte teilweise
zu einer geringfügig verbesserten Überlebensfähigkeit der Deletionsmutanten. Eine
eindeutige Komplementation fand jedoch nicht statt (siehe Abbildungen 52 und 54).
Bei der Komplementation von RecF war dieses Ergebnis nicht unerwartet. In der Arbeit von Sandler et al. 1992, in welcher für das Gen recF aus verschiedenen Bakterien eine Komplementation in E. coli durchgeführt wurde, konnte eine solche erst ab
einer Aminosäurensequenzidentität von 36 % zu recF aus E. coli nachgewiesen werden. Die Expression der recF Gene aus Salmonella typhimirium (92 % Identität) und
Pseudomonas putida (36 % Identität) konnten ein entsprechendes Defizit in E. coli
kompensieren, recF aus Bacillus subtilis (22 % Identität) dagegen nicht (Sandler et
al. 1992).
Der Komplementationsversuch mit recO führte in dieser Arbeit zu einer signifikanten
Erhöhung der Resistenz des Deletionsstammes gegenüber UV-Licht (siehe Abbildung 53). Die Werte des Wildtyps bzw. des Deletionsstammes mit einer Expression
des recO Gens aus E. coli konnten jedoch nicht erreicht werden. Zum Beispiel überlebten bei der Expression von recO aus S. lividans TK64 mit N-terminalem Strep-Tag
in CL584 (recO) bei 20 J/m2 19 % der Zellen. Die Zellen des Deletionsstammes
CL584 ohne heterologe Genexpression überlebten hier nur zu 1 %, der Referenzstamm erreichte jedoch eine Überlebensrate von 61 % (siehe Abbildung 53). Es
scheint demnach in geringem Umfang eine Komplementation stattgefunden zu haben.
Dass es überhaupt zu einer geringen Komplementation bei einem der Enzyme kam,
war nicht unbedingt erwartet, da keines der vier Enzyme für sich allein eine Funktion
ausfüllt. RecD arbeitet in E. coli im Komplex mit RecB und RecC. Für eine Komplementation müsste demnach das Enzym aus S. lividans TK64 mit den beiden anderen
Enzymen dieses Komplexes in der richtigen Weise wechselwirken. Die Enzyme
RecO und RecF arbeiten jeweils im Verbund mit RecR (Komplex RecFR bzw. Komplex RecOR). Obwohl RecR stärker konserviert ist als RecO und RecF (höhere Aminosäurensequenzidentität), wurde hier ein positives Ergebnis weniger erwartet. Für
eine wirksame Komplementation hätte RecR sowohl mit RecF als auch mit RecO aus
E. coli interagieren müssen. Die Enzyme RecO und RecF hätten dagegen jeweils
„nur“ mit RecR aus E. coli wechselwirken müssen. Dies scheint im Falle von RecO in
einem gewissen Umfang gelungen zu sein.
5.8
Zusammenfassung der Diskussion und Ausblick
Durch die Untersuchung der in dieser Arbeit erstellten Deletionsmutanten konnten
Erkenntnisse über die Funktionen der einzelnen Enzyme in der DNA-Reparatur ge-
161
Diskussion
wonnen werden. Es wurden aber auch neue Fragen aufgeworfen und Ansatzpunkte
für weitere Versuchsreihen gefunden.
Die dUTPase ist ein Enzym, das sich bei den Mutageneseversuchen nicht signifikant
auf die Überlebensfähigkeit der Zellen auswirkte. Durch den vermehrten Einbau von
Uracil in die DNA wird bei den dut Mutanten die Basenexzisionsreparatur belastet
und über Folgeschäden auch die Rekombinationsreparatur (siehe hierzu Abbildung 56). Dies erschöpfte jedoch die Reparaturkapazität der Zellen nicht. Die Erstellung von Doppelmutanten von dut und Genen der Basenexzisionsreparatur bzw. der
Rekombinationsreparatur wären hier interessant, da solche in E. coli zum Teil gravierende Folgen auf die Vitalität der Zellen hatten (Taylor und Weiss 1982, Tye und
Lehmann 1977, Kouzminova und Kuzminov 2004).
Die alkB Mutanten zeigten bei der Mutagenese mit UV-Licht und Mitomycin C eine
unerwartet niedrige Überlebensrate im Vergleich zum Ausgangsstamm S. lividans
TK64. Diese verringerte Überlebensfähigkeit war nicht zu erklären, vor allem, da alkB
Mutanten in E. coli gegenüber UV-Licht nicht sensitiver reagierten als der Wildtyp
(Kataoka et al. 1983). Die alkB Mutanten reagierten kaum auf die getesteten alkylierenden Mutagene MNNG und EMS. Da diese jedoch nicht das Hauptsubstrat
(1-Methyladenin) für AlkB in der DNA induzieren, wäre z.B. noch die Behandlung mit
MMS (Methylmethansulfonat) interessant. Desweiteren gibt es aus der Gruppe der
Prävention und Reversion von DNA-Schäden noch das Enzym Ada, welches untersucht werden könnte.
Aus dem Bereich der Basenexzisionsreparatur wurden vier Gene für Glykosylasen
deletiert. Auffällig war bei diesen Mutanten vor allem die erhöhte Überlebensrate von
drei Mutanten bei der Mutagenese mit Mitomycin C und die reduzierte Vitalität von
drei Mutanten nach der Mutagenese mit Zeocin. Diese Ergebnisse machen besonders deutlich, wie eng verknüpft die verschiedenen Reparaturwege sind (siehe Abbildung 58). Bei Deletionen von Genen, die zur Basenexzisionsreparatur gehören, ist
eine solche Reaktion auf Mutagene, welche die Rekombinationsreparatur oder die
Nukleotidexzisionsreparatur erfordern, ungewöhnlich. Es gibt in S. lividans TK64
noch weitere Glykosylasen. Bei den Glykosylasen wären Doppeldeletionsmutanten
generell besonders sinnvoll, da ihre Funktionen oft redundant sind.
Die Exonuklease III spielt in der späten Phase der Basenexzisionsreparatur eine
wichtige Rolle. Die signifikant reduzierte Überlebensrate nach der Behandlung mit
MNNG entsprach den Erwartungen, da die Exonuklease III die Reparatur weiterführt,
die von diversen Glykosylasen begonnen wurde.
Die Deletion von uvrB erlaubte keine Nukleotidexzisionsreparatur mehr. Die natürliche chromosomale Instabilität der Deletionsmutanten war deutlich erhöht. Nach der
Mutagenese mit UV-Licht oder Mitomycin C sank die Überlebensrate der uvrB Mutanten in beiden Fällen sehr schnell. Die Nukleotidexzisionsreparatur spielt daher
eine essentielle Rolle bei der Beseitigung von typischen DNA-verformenden Schä162
Diskussion
den. Wird dieser Reparaturweg ausgeschaltet, können die auftretenden Schäden von
der Rekombinationsreparatur alleine nicht ausreichend entfernt werden. Weitere Enzyme dieses Reparaturweges (z.B. uvrA oder uvrC) müssen weder separat noch
kombiniert mit uvrB getestet werden. Die Kombination mit Deletionen von Genen aus
anderen Reparaturwegen (v.a. der Rekombinationsreparatur) könnte dagegen sehr
aufschlussreich sein, vermutlich sind solche Doppelmutationen jedoch letal.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch untersucht, ob ein funktionierendes System
des nicht-homologen Verbindens von Enden (NHEJ) in S. lividans TK64 vorhanden
ist. Sequenzvergleiche zeigten bei einem Gen eine Ähnlichkeit zu ku, einem eukaryotischen Gen des NHEJ. Zudem lag dieses Gen neben einer Ligase, welche für einen
solchen Reparaturweg ebenfalls benötigt wird. Diese beiden Gene wurden erfolgreich zusammen deletiert. Es zeigte sich jedoch bei den Mutageneseversuchen mit
den ku+lig Mutanten keine signifikante Veränderung der Überlebensfähigkeit, die die
Funktion des nicht-homologen Verbindens von Enden bestätigen konnte. Vor allem
war die Überlebensrate der Mutanten bei der Mutagenese mit Zeocin nicht reduziert.
Zeocin erzeugt Doppelstrangbrüche in der DNA, worauf das nicht-homologe Verbinden von Enden spezialisiert ist. Die ausbleibende Reaktion der ku+lig Mutanten zeigte, dass die ausgewählten Gene bei einem solchen Reparaturweg keine messbare
Rolle spielen.
Die Deletion von recD in S. lividans TK64 wirkte sich auf die Überlebensfähigkeit der
Zellen nicht signifikant aus. Bei der Mutagenese mit UV-Licht reagierten die recD Mutanten etwas sensibler. Das Enzym scheint daher auch ohne die Enzyme RecB und
RecC, mit denen es normalerweise einen Komplex bildet, noch eine Funktion zu erfüllen. Diese Funktion ist jedoch für die Zellen nicht essentiell. Eventuell kann RecD
bei der DNA-Reparatur oder auch der Replikation als Helikase aushelfen. Es wurde
zudem eine Komplementation mit recD aus S. lividans TK64 in E. coli versucht. Das
heterologe Enzym konnte das Defizit in entsprechenden recD Mutanten von E. coli
jedoch nicht ausgleichen. Vermutlich fand keine erfolgreiche Interaktion mit RecB
und RecC statt. D. radiodurans besitzt wie S. lividans TK64 kein recB und recC. Das
Gen recD ist jedoch vorhanden. In einem interessanten Artikel wurde die Aufreinigung und Charakterisierung von RecD aus D. radiodurans beschrieben (Wang und
Julin 2004). Dabei konnte Helikaseaktivität nachgewiesen werden. Vorbereitend auf
vergleichbare Versuche wurde auch das Gen recD aus der chromosomalen DNA von
D. radiodurans bereits isoliert und in Expressionsvektoren eingesetzt (Plasmiderstellung in dieser Arbeit nicht dargestellt). Das Gen recD aus S. lividans TK64 ist
ebenfalls schon auf Expressionsvektoren vorhanden, da diese für die Komplementation benötigt wurden. Die Expression der Gene mit anschließender Aufreinigung
könnte für solche Aktivitätstests genutzt werden, wobei RecD aus D. radiodurans als
Positivkontrolle dienen würde.
163
Diskussion
Die Deletion von recN zeigte, dass das Enzym beim Erhalt der chromosomalen Stabilität eine Rolle spielt. Die recN Mutanten zeigten über doppelt so viele Chloramphenicol-sensitive Kolonien. Bei den Mutageneseversuchen war die Überlebensfähigkeit der recN Mutanten immer dann beeinträchtigt, wenn die Rekombinationsreparatur angesprochen wurde. RecN ist für die Zellen nicht essentiell, spielt jedoch eindeutig eine Rolle bei der Rekombinationsreparatur. Vermutet wird eine Schutzfunktion für DNA-Enden, und dass RecN den nachfolgenden Enzymen der Rekombinationsreparatur eine Plattform bietet. Dies entspricht der Beobachtung, dass RecN als
eines der ersten Enzyme zu Doppelstrangbrüchen rekrutiert wird (Kidane et al.
2004).
Die 3´5´-DNA-Helikase RecQ wurde ebenfalls erfolgreich deletiert (SCO5815 in
S. coelicolor A(3)2 bzw. SSPG01915 in S. lividans). Wie schon bei der Deletion von
recN und uvrB deutete bei den recQ Mutanten eine gesteigerte natürliche chromosomale Instabilität auf eine wichtige Rolle des Enzyms im Erhalt der genomischen
Integrität hin. Bei den Mutageneseversuchen entsprach die höhere Sensitivität der
Mutanten gegenüber UV-Licht und Mitomycin C den Erwartungen, da RecQ in E. coli
zusammen mit RecJ die 3´-DNA-Überhänge erzeugt, die für die homologe Rekombination und damit auch für die Rekombinationsreparatur nötig sind. Erstaunlicherweise waren die Mutanten jedoch auch sehr sensitiv gegenüber MNNG. RecQ könnte demnach auch die Basenexzisionsreparatur unterstützen. Hier wären weitere Untersuchungen z.B. auch mit einer größeren Anzahl recQ Mutanten von Interesse.
Desweitern sollte auch eine Deletion des Gens SSPG03087 in S. lividans versucht
werden. Es handelt sich dabei auch um eine Helikase, bei der es sich alternativ zu
dem deletierten SSPG01915 um das eigentliche recQ Gen handeln könnte.
In E. coli agiert die 5´3´-Einzelstrang-Exonuklease RecJ zusammen mit RecQ, um
3´-DNA-Überhänge zu erzeugen. In S. lividans TK64 gibt es dieses Enzym nicht und
es gibt auch kein RecBCD oder AddAB. Es ist jedoch die Exonuklease VII vorhanden, welche diese Funktion erfüllen könnte. Ein Deletionsversuch wäre von besonderem Interessen, da es sich hier um die wichtigste Nuklease in der Rekombinationsreparatur handeln könnte. Gegebenenfalls können jedoch keine Mutanten isoliert werden, da sich eine Deletion als letal erweisen könnte. In D. radiodurans ist wie in
Streptomyceten nur eine 5´3´-Einzelstrang-Exonuklease vorhanden. Es handelt
sich dabei um RecJ und die Deletion erwies sich als letal (Bentchikou et al. 2010).
Das 2009 publizierte AdnAB-System ist in diesem Zusammenhang ebenfalls von
großem Interesse, da gezeigt wurde, dass es in Mykobakterien statt RecBCD die
Doppelstrangenden für die homologe Rekombination prozessiert (Gupta et al. 2011).
Orthologe Sequenzen finden sich in allen bisher sequenzierten Actinomycetales. Eine Deletion der entsprechenden Gene adnA und/oder adnB würde klären, ob alterna-
164
Diskussion
tiv zu RecQ und RecJ das AdnAB-Helikase/Nuklease-System in S. lividans TK64
diese zentrale Funktion besetzt.
Streptomyceten haben nur die Enzyme RecF, RecO und RecR für die präsynaptische Phase der homologen Rekombination. RecO wurde erfolgreich deletiert, bei
recF und recR gelang dies nicht. Eine recF Mutante wurde jedoch gestellt. Schon das
Fehlen von recO oder recF hatte fatale Auswirkungen auf die genomische Integrität.
Über ein Drittel der Sporen war chromosomal verändert. Wurden DNA-Schäden induziert, welche die Rekombinationsreparatur und damit die homologe Rekombination
benötigten, so war die Überlebensfähigkeit der Zellen drastisch eingeschränkt. Selbst
nach der Behandlung durch MNNG wuchsen kaum mehr Sporen an. Diese Ergebnisse beweisen, dass der RecF-Weg in Streptomyceten essentiell ist. Die Rekombinationsreparatur ist auf diese Enzyme angewiesen. Weiterführende Untersuchungen
mit diesen Deletionsmutanten könnten die Erkenntnisse hier noch vertiefen. Zum
Beispiel wäre eine Quantifizierung interessant - wie viele Doppelstrangbrüche kann
eine solche Deletionsmutante verkraften? Es wurde zudem die Expression der Gene
recF, recO und recR aus S. lividans TK64 in entsprechenden Deletionsmutanten von
E. coli und die anschließender Bestrahlung mit UV-Licht durchgeführt. Dabei kam es
bei RecO zu einer geringfügigen Komplementation. Die UV-Licht-Resistenz des Wildtyps wurde jedoch nicht erreicht. Bei den Enzymen RecF und RecR konnte keine
Komplementation nachgewiesen werden.
Aus der postsynaptischen Phase der homologen Rekombination konnten die Gene
ruvA, ruvB und ruvC (ruvABC) bzw. recG deletiert werden. Die recG Mutanten zeigten eine erhöhte chromosomale Instabilität. Bei den ruvABC Mutanten war diese
noch stärker ausgeprägt. Die recG Mutanten zeigten eine deutlich verringerte Resistenz gegenüber UV-Licht. Die ruvABC Mutanten reagierten dagegen besonders sensitiv auf die Behandlung mit Zeocin und Mitomycin C. Obwohl teilweise redundante
Funktionen ausgeübt werden, gibt es nach diesen Ergebnissen eine Spezialisierung
der beiden Systeme auf bestimmte DNA-Schäden. RecG scheint dabei weniger für
die reine homologe Rekombination benötigt zu werden, wie sie bei Doppelstrangbrüchen durch Zeocin vorkommt, als für DNA-Schäden, bei denen es z.B. zu einer Regression der Replikationsgabel kommt (McGlynn und Lloyd 2002).
Zuletzt wurden noch die Gene sbcC und sbcD zusammen deletiert. Die Nuklease
SbcCD schneidet DNA, die bestimmte Sekundärstrukturen ausbildet. An den resultierenden Einzelstrangbrüchen kann die Replikationsgabel kollabieren. Zur Wiederaufnahme der Replikation ist die Rekombinationsreparatur nötig. Die chromosomale Instabilität der sbcCD Mutanten war leicht erhöht. Die Deletion von sbcCD zeigte jedoch bei den Mutageneseversuchen einen stabilisierenden Effekt. Die Überlebensfähigkeit war bei der Mutagenese mit MNNG, Zeocin und Mitomycin C signifikant erhöht. Entweder ist die Aktivität der Nuklease im Ausgangsstamm eine zusätzliche
Belastung für die Reparaturwege der Zelle, wenn diese bereits mutagenem Stress
165
Diskussion
ausgesetzt ist, oder die 3´5´-Exonukleaseaktivität von SbcCD greift im Ausgangsstamm die 3´-DNA-Überhänge an, so dass die Rekombinationsreparatur nicht effizient eingeleitet werden kann. Damit wirkte sich die Deletion in S. lividans TK64 anders aus als in B. subtilis. In diesem Bakterium erhöhte die Deletion von sbcC die
Empfindlichkeit gegenüber Mitomycin C und Gammastrahlung (Mascarenhas et al.
2006).
In dieser Arbeit wurden sechzehn Gene oder Gengruppen in S. lividans deletiert und
insgesamt siebzehn Deletionsmutanten von S. lividans untersucht. Die Reaktion auf
vier verschiedene Mutagene wurde mit allen erhaltenen Klonen getestet. Einige Ergebnisse entsprachen den Erwartungen, aber zum Teil zeigten diese Mutanten auch
unerwartete Reaktionen auf eines der getesteten Mutagene. Für zukünftige Untersuchungen wäre es generell sehr interessant Doppelmutanten inner- und außerhalb der
einzelnen DNA-Reparaturwege zu erstellen. Im Laufe der Arbeit wurde dies versucht.
Es konnten jedoch keine Doppelmutanten isoliert werden (in dieser Arbeit nicht beschrieben). Bei der Einführung weiterer Deletionen ergab sich das Problem, dass
man für eine Transformation Protoplasten einer Deletionsmutante von S. lividans
TK64 präparieren muss. Dies kann je nach bereits vorhandener Deletion schon eine
Herausforderung darstellen, da die Deletionsmutanten teilweise instabil waren oder
in einer Flüssigkultur schlecht wuchsen bzw. früh abstarben. Man sollte hier auch die
Methode der Kreuzung austesten, d.h. einen konjugativen E. coli Stamm, welcher
das Knock-out Plasmid enthält, mit dem entsprechenden Deletionsstamm von
S. lividans TK64 kreuzen. Desweiteren wirkt sich jede weitere Deletion eines Gens
vermutlich destabilisierend aus oder ist sogar letal. Es könnte daher sein, dass die
gewünschten Mehrfachmutanten nicht isoliert werden können. Ein weiterer Ansatzpunkt ist der Test weiterer Mutagene mit den bereits existierenden Deletionsstämmen, um die Erkenntnisse noch zu verfeinern. Auch wäre es interessant, die Mutanten aus der Gruppe der Rekombinationsreparatur gezielt auf die Fähigkeit zur homologen Rekombination zu untersuchen. Desweiteren befinden sich einige der Gene
bereits in Expressionsvektoren für E. coli, so dass sich hier eine Aufreinigung der
Enzyme und Aktivitätstests anbieten würden.
Durch die Gendeletionen besteht nun eine Stammsammlung, die weitergehende
Versuche erlaubt, oder als Grundlage für Mehrfachdeletionen dienen kann. Die Untersuchung der Deletionsmutanten konnte die Erkenntnisse über die DNAReparaturwege mit ihren beteiligten Enzymen vertiefen. Unter anderem bleibt jedoch
noch zu klären, welche Enzyme für die Bereitstellung der 3´-DNA-Überhänge für die
Initiation des Strangaustausches bei Rekombinationsreparatur bzw. der homologen
Rekombination verantwortlich sind.
166
Literatur
6
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181
Anhang
7
ANHANG
7.1
Nicht selbstständig hergestellte Plasmide
Im Folgenden sind alle Plasmide abgebildet, die zur Verfügung gestellt wurden
und nicht schon in anderen Abbildungen dieser Arbeit zu sehen sind.
Sma I
Nde I
3000
500
tsr
amp
pJOE230.1
2500
3404 bps
2000
1000
Sma I
1500
rep
3000
Nde I
ter
500
2500
amp
pJOE773.2 lacZ'
3122 bps
1000
ter
2000
ter
'lacZa''
3000
HindIII
BamHI
SmaI
Kpn I
NotI
Xho I
Eco RI
Eco RV
Bgl II
MluI
Eco RI
1500
HindIII
Sph I
Pst I
Sal I
BamHI
SmaI
Pvu II
Kpn I
Sac I
Eco RI
ClaI
Eco RI
ClaI
Eco RI
Pvu II Sac I
Kpn I
SmaI
BamHI
Sal I
Pst I
BglII
Sph I
HindIII
500
amp
Eco RI
pJOE4786.1
2500
3290 bps
2000
1500
lacPOZ'
1000
'lacZ´'
ter
Eco RI
MluI
Bgl II
Eco RV
Eco RI
Xho I
NotI
Kpn I
SmaI
BamHI
HindIII
182
Anhang
NotI
Xcm I
Bgl II
4000
aphII
mob
pJOE4908.1
1000
3000
Xba I
4204 bps
2000
rep
Bgl II
mob
aphII
4000
pJOE4928.1
''lacZ´'
1000
4905 bps
Dra I
lacPOZ'
3000
Xba I
Bgl II
Mlu I
''lacZa''
Sac I
Eco RI
Eco RI
Eco RI
Sac I
Mlu I
Bgl II
Xba I
Dra I
2000
rep
183
Anhang
7.2
P-Wert und -Wert für die einzelnen Deletionsstämme bei der
Mutagenese mit MNNG bzw. Zeocin
Gen
Reparatursystem
MNNG-Mutagenese
Mittelwert
[höchster, tiefster Wert]
S. lividans
TK64
-
dut
P&R
alkB
P&R
3maDG
BER
ung1
BER
ung2
BER
mutM
BER
exoIII
BER
uvrB
NER
recN
RR
recD
RR
recQ
RR
recF
RR
recO
RR
ruvABC
RR
recG
RR
sbcCD
RR
Ku+lig
NHEJ
19,1
[27; 11]
16,8
[25; 9]
16,3
[23; 5]
15,9
[19; 11]
25,2
[29; 17]
16,4
[21; 13]
13,1
[16; 10]
7,1
[17; 3]
19,4
[26; 7]
23,0
[30; 16]
22,0
[29; 13]
8,0
[11; 5]
3,1
5,4
[7; 4]
25,8
[32; 20]
21,3
[27; 15]
34,5
[39; 30]
19,5
[33; 8]
P-Wert
-Wert
-
59,3
0,54
44,1
0,79
29,3
0,83
15,5
1,54
37,7
0,69
9,2
1,55
4,9
2,90
93,2
0,09
46,7
0,84
42,0
0,83
17,1
2,07
Zeocin-Mutagenese
Mittelwert
[höchster, tiefster Wert]
20,2
[26; 11]
21,0
[30; 15]
24,0
[34; 11]
10,4
[15; 8]
28,4
[34; 23]
15,0
[19; 10]
12,2
[16; 8]
20,5
[23; 15]
20,0
[25; 17]
14,9
[25; 7]
20,1
[28; 15]
19,8
[22; 18]
7,3
2,96
< 0,1
0,6
3,62
< 0,1
5,58
1,81
< 0,1
[0; 0]
[0,2; 0]
[0; 0]
44,7
0,64
[33; 14]
0,3
4,50
[45; 35]
91,7
0,12
21,7
40,2
23,2
[30; 7]
P-Wert
-Wert
-
81,8
0,22
37,3
0,91
6,2
2,53
8,6
2,15
16,1
1,47
11,2
2,04
93,9
0,07
94,8
0,06
27,2
1,22
96,6
0,04
88,6
0,10
0,06
7,22
0,02
8,04
0,01
8,84
78,9
0,30
0,6
5,54
64,9
0,54
184
Anhang
P-Wert: die Überschreitungswahrscheinlichkeit, mit der man sich irrt, wenn man die
Nullhypothese ablehnt, d.h. der P-Wert gibt die Wahrscheinlichkeit an mit der die Werte
doch nicht signifikant verändert sind, wenn man annimmt sie würden sich vom Referenzwert unterscheiden (siehe auch Abschnitt 3.10.1). D.h. je kleiner der P-Wert ist,
desto wahrscheinlicher ist eine signifikante Abweichung vom Referenzstamm. -Wert:
Prüfgröße zur alternativen Lösung der Behrens-Fishe-Problems. Sobald die Prüfgröße
() den Wert 2 überschreitet, ist die Nullhypothese (µ1 = µ2) auf dem 5 %-Niveau abzulehnen (d.h. die Werte unterscheiden sich signifikant) (siehe auch Abschnitt 3.10.2).
Für recF musste der Wert 3,1 bei MNNG doppelt angenommen werden, um eine Berechnung durchführen zu können (kein Ergebnis bei nur einer Stichprobe).
7.3
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:
Abbildung 2:
Abbildung 14:
Abbildung 15:
Lebenszyklus von Streptomyces coelicolor A3(2) ............................ 15
Kombinierte genetische und physikalische Karte des
Chromosoms von S. coelicolor A3(2) M145 (Hopwood 1999) ......... 16
Elektromagnetisches Spektrum ....................................................... 20
Struktur von MNNG ......................................................................... 20
Struktur von Mitomycin C ................................................................ 21
Struktur von Zeocin ......................................................................... 22
Schema der Basenexzisionsreparatur (BER) .................................. 26
Schema der Nukleotidexzisionsreparatur (NER) ............................. 30
Schema der Reparatur von Tochterstranglücken (RecF-Weg) ....... 34
Schema der Reparatur von Doppelstrangenden (RecBCD-Weg) ... 37
Gen Knock-out durch Insertion ........................................................ 76
Gen Knock-out durch Austausch gegen ein AntibiotikaResistenzgen .................................................................................. 77
Primerdesign für die Amplifikation einer 5´- und 3´-Region des
Zielgens ........................................................................................... 78
Fusion der 5´- und 3´-Region mittels Polymerase Kettenreaktion ... 80
Konstruktionsschema des Vektors pLIG 5´R.-nat1-3´R................... 81
Abbildung 16:
Abbildung 17:
Abbildung 18:
Abbildung 19:
Abbildung 20:
Abbildung 21:
Konstruktionsschema mit pJOE1082.1 für den Knock-out Vektor ... 82
Konstruktion des Insertionsvektors für recF .................................... 95
Konstruktion des Komplementationsvektors für recF (1) ................. 96
Konstruktion des Komplementationsvektors für recF (2) ................. 97
recF-Genfragment und Insertionsvektor pMK2RECF ...................... 99
Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender Zeocin-
Abbildung 3:
Abbildung 4:
Abbildung 5:
Abbildung 6:
Abbildung 7:
Abbildung 8:
Abbildung 9:
Abbildung 10:
Abbildung 11:
Abbildung 12:
Abbildung 13:
Konzentration ................................................................................ 102
185
Anhang
Abbildung 22: Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender UVLicht-Intensität ............................................................................... 103
Abbildung 23: Überlebensrate von S. lividans TK64 bei zunehmender
Mitomycin C-Konzentration ........................................................... 104
Abbildung 24: Überlebensrate von S. lividans TK64 (WT) und den Mutanten
alkB und dut nach der Behandlung mit MNNG (links) bzw.
Zeocin (rechts) .............................................................................. 105
Abbildung 25: Überlebensrate des Stammes S. lividans TK64 (WT) und der
alkB Mutanten nach der Behandlung mit EMS .............................. 106
Abbildung 26: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten alkB
und dut nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender
Intensität........................................................................................ 107
Abbildung 27: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten alkB
und dut nach der Mutagenese mit Mitomycin C zunehmender
Konzentration ................................................................................ 108
Abbildung 28: Überlebensrate von S. lividans TK64 (WT) und den Mutanten
3maDG, mutM, ung2, ung1 und exoIII nach der Behandlung mit
MNNG (links) bzw. Zeocin (rechts)................................................ 109
Abbildung 29: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten der
Basenexzisionsreparatur nach der Bestrahlung mit UV-Licht
zunehmender Intensität ................................................................. 110
Abbildung 30: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten der
Basenexzisionsreparatur nach der Mutagenese mit Mitomycin C
zunehmender Konzentration ......................................................... 111
Abbildung 31: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der
Nukleotidexzisionsreparatur nach der Behandlung mit MNNG
(links) bzw. Zeocin (rechts) ........................................................... 112
Abbildung 32: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der
Nukleotidexzisionsreparatur nach der Bestrahlung mit UV-Licht
zunehmender Intensität ................................................................. 113
Abbildung 33: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante der
Nukleotidexzisionsreparatur nach der Mutagenese mit
Mitomycin C zunehmender Konzentration ..................................... 114
Abbildung 34: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des
NHEJ nach der Behandlung mit MNNG (links) bzw. Zeocin
(rechts) .......................................................................................... 115
Abbildung 35: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des
NHEJ nach der Bestrahlung mit UV-Licht zunehmender
Intensität........................................................................................ 115
186
Anhang
Abbildung 36: Überlebensrate von S. lividans TK64 und der Mutante des
NHEJ nach der Mutagenese mit Mitomycin C zunehmender
Konzentration ................................................................................ 116
Abbildung 37: Kolonien von S. lividans TK64 auf einer HT-Platte. ....................... 117
Abbildung 38: Chromosomale Instabilität (links) und nicht lebensfähige
Kolonien (rechts) von S. lividans TK64 und den Mutanten
ruvABC, recG, recO und recF ....................................................... 118
Abbildung 39: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten
ruvABC, recG, recO und recF nach der Behandlung mit MNNG
(links) bzw. Zeocin (rechts) ........................................................... 119
Abbildung 40: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten
ruvABC, recG, recO und recF nach der Bestrahlung mit UVLicht zunehmender Intensität ........................................................ 120
Abbildung 41: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten
ruvABC, recG, recO und recF nach der Mutagenese mit
Mitomycin C zunehmender Konzentration ..................................... 121
Abbildung 42: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Behandlung mit MNNG (links)
bzw. Zeocin (rechts) ...................................................................... 122
Abbildung 43: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Bestrahlung mit UV-Licht
zunehmender Intensität ................................................................. 123
Abbildung 44: Überlebensrate von S. lividans TK64 und den Mutanten recD,
recQ, recN und sbcCD nach der Mutagenese mit Mitomycin C
zunehmender Konzentration ......................................................... 124
Abbildung 45: Konstruktionsschema
der
Grundvektoren
für
die
Komplementation von E. coli rec Mutanten ................................... 128
Abbildung 46: Konstruktionsschema der Vektoren für die Komplementation
von E. coli rec Mutanten (Expression ohne Strep-Tag) ................. 129
Abbildung 47: Konstruktionsschema der Vektoren für die Komplementation
von rec defizienten E. coli Mutanten mit entsprechenden Genen
aus S. lividans, die mit einem N-terminalen Strep-Tag versehen
wurden .......................................................................................... 130
Abbildung 48: SDS-PAGE aus der Expression von recF und recD in CL1 und
den entsprechenden Deletionsstämmen ....................................... 131
Abbildung 49: SDS-PAGE aus der Expression von recO und recR in CL1 und
den entsprechenden Deletionsstämmen ....................................... 132
Abbildung 50: Wachstumskurve des Stammes CL1 mit und ohne
Expressionsvektoren ..................................................................... 133
187
Anhang
Abbildung 51: Überlebensrate
des
Referenzstammes
CL1
und
der
Deletionsstämme CL4, CL5, CL584 und CL544 nach der
Bestralung mit verschiedenen UV-Licht-Intensitäten ..................... 134
Abbildung 52: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL5 (recF) mit und ohne
Expression von recF bei zunehmender UV-Licht-Intensität........... 135
Abbildung 53: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL584 (recO) mit und
ohne Expression von recO bei zunehmender UV-Licht-Intensität . 137
Abbildung 54: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL544 (recR) mit und
ohne Expression von recR bei zunehmender UV-Licht-Intensität . 138
Abbildung 55: Überlebensrate der Stämme CL1 und CL4 (recD) mit und
ohne Expression von recD bei zunehmender UV-Licht-Intensität . 139
Abbildung 56:
Abbildung 57:
Abbildung 58:
Abbildung 59:
7.5
Die Verwertung von dUTP in der Zelle .......................................... 144
Zusammenspiel der DNA-Reparaturwege ..................................... 148
Zusammenspiel der DNA-Reparaturwege (erweitert).................... 155
Schadenstoleranz durch Regression der Replikationsgabel ......... 157
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1:
Tabelle 2:
Tabelle 3:
Tabelle 4:
Tabelle 5:
Tabelle 6:
Tabelle 7:
Tabelle 8:
Tabelle 9
Tabelle 10:
Tabelle 11:
Tabelle 12:
Übersicht der vorgestellten Gene der DNA Reparatur und
homologen Rekombination von S. coelicolor A3(2) und S.
lividans TK24 .................................................................................... 43
DNA-Reparatur/homologe Rekombinationssysteme in Bakterien .... 45
Vorgefertigte Plasmide ..................................................................... 47
In dieser Arbeit entstandene Plasmide ............................................. 47
Relevante Stämme ........................................................................... 49
Verwendete Oligonukleotide ............................................................ 50
PCR-Bedingungen ........................................................................... 63
Pipettierschema für die Mitomycin C Lösungen ............................... 72
Auflistung der Deletionsstämme ..................................................... 100
Ergebnissüberblick der Mutageneseversuche ................................ 125
Genausstattung bezüglich der DNA-Reparatur und homologen
Rekombination verschiedener Modellorganismen .......................... 141
Vergleich der Aminosäuresequenz der Enzyme RecF, RecO,
RecR und RecD aus S. lividans und aus E. coli ............................. 160
188