Expression der Flagellingene von Helicobacter pylori in
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Aus dem Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Abteilung für Medizinische Mikrobiologie und Immunologie der Ruhr-Universität Bochum Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. S. Gatermann _________________________________________________ Expression der Flagellingene von Helicobacter pylori in unterschiedlichen bakteriellen Wirtsspezies Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Tanja Astrid Treschan aus Dortmund 1999 Dekan: Prof. Dr. med. U. Eysel Referent: PD Dr. med. S. Suerbaum Koreferent: Prof. Dr. med. Werchau Tag der mündlichen Prüfung: 13.07.2000 „Wir schreiben die Blumen nicht auf“, sagte der Geograph. „Warum das? Sie sind das Schönste!“ „Weil die Blumen vergänglich sind.“ Der kleine Prinz Diese Arbeit widme ich in Liebe Christian, Ma, Pa und Erbse. Sie ist auch für meine Großmütter Seßi und Lulu. Inhalt und Verzeichnisse INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung...................................................................................................................1 1.1 Helicobacter pylori: Von der Entdeckung zur eigenen Gattung .................................1 1.1.1 Morphologie, Biochemie und Kultur von Helicobacter pylori .............................1 1.1.2 Die Gattung Helicobacter .....................................................................................2 1.1.3 Tiermodelle der gastrischen Infektion des Menschen mit Helicobacter pylori ....2 1.2 Die Infektion des Menschen mit H. pylori ..................................................................3 1.2.1 Übertragung und Epidemiologie ...........................................................................3 1.2.2 Nachweismethoden ...............................................................................................3 1.2.3 Pathogenese der Infektion mit H. pylori................................................................4 1.3 Schwerpunkt Motilität ...............................................................................................14 1.3.1 Flagellen als Grundlage bakterieller Motilität.....................................................14 1.3.2 Die Flagellen von H. pylori .................................................................................17 1.4 Vorstellung der Teilprojekte dieser Dissertation und Definition der Arbeitsziele ....18 1.4.1 Überexpression der Flagelline von H. pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine................................................................................................19 1.4.2 Expression der Flagelline von H. pylori in Campylobacter coli.........................19 1.4.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von H. pylori ...............................20 2 Material und Methoden..........................................................................................21 2.1 Material......................................................................................................................21 2.1.1 Chemikalien ........................................................................................................21 2.1.2 Puffer zur Reinigung der rekombinanten Proteine..............................................21 2.1.3 Antikörper ...........................................................................................................21 2.1.4 Bakterien .............................................................................................................22 2.1.5 Kulturbedingungen..............................................................................................22 2.1.6 Vektoren, Plasmide und Oligonukleotide ...........................................................23 2.2 Methoden ...................................................................................................................24 2.2.1 Molekulargenetische Methoden ..........................................................................24 2.2.2 Präparative und immunologische Methoden.......................................................26 2.2.3 Überexpression der Flagellinmoleküle FlaA und FlaB von Helicobacter pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine......................................................28 2.2.4 Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen die rekombinanten Flagelline29 2.2.5 Methoden zur Charakterisierung der Mutanten von Helicobacter pylori und Campylobacter coli ......................................................................................................29 3 Ergebnisse................................................................................................................31 3.1 Überexpression der Flagelline FlaA und FlaB von H. pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine.............................................................................................31 3.1.1 Die Plasmide zur Überexpression der Flagelline ................................................31 I Inhalt und Verzeichnisse 3.1.2 Überexpression und Detektion der rekombinanten Proteine...............................34 3.1.3 Reinigung der rekombinanten Flagellinmoleküle ...............................................34 3.1.4 Herstellung spezifischer Antiseren gegen die rekombinanten Flagelline............37 3.2 Expression der Flagelline von Helicobacter pylori in Campylobacter coli ..............38 3.2.1 Herstellung des flaB-Shuttle-Plasmids pSUS43 .................................................38 3.2.2 Herstellung des flaA-Shuttle-Plasmids pSUS44 .................................................40 3.2.3 Übertragung der Shuttle-Vektoren von E. coli nach Campylobacter coli durch Konjugation ..................................................................................................................40 3.2.4 Charakterisierung der rekombinanten Campylobacter coli-Mutanten ................42 3.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von Helicobacter pylori N6 ..............49 3.3.1 Konstruktion des Plasmids pSUS76....................................................................49 3.3.2 Charakterisierung der durch Elektroporation erzeugten Klone...........................50 4 Diskussion....................................................................................................................56 4.1 Überexpression der Flagelline FlaA und FlaB von Helicobacter pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine ...........................................................................56 4.2 Expression der Flagelline von Helicobacter pylori in Campylobacter coli ..............58 4.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von Helicobacter pylori N6 ..............61 5 Zusammenfassung ......................................................................................................65 6 Literaturverzeichnis ...................................................................................................66 7 Danksagung.................................................................................................................75 8 Lebenslauf ...................................................................................................................76 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Abbildung 1: Pathogenese der H. pylori-Infektion............................................................5 Abbildung 2: Der Flagellenapparat..................................................................................15 Abbildung 3: Hierarchische Organisation der Flagellingene...........................................16 Abbildung 4: Die Plasmide zur Überexpression der rekombinanten Flagelline .............33 Abbildung 5: Überexpression, Reinigung und Detektion der rekombinanten Flagelline36 Abbildung 6: Western-Blot-Untersuchung zur Demonstration der Antiseren gegen die rekombinanten Flagelline..........................................................................................37 Abbildung 7: Die Shuttle-Plasmide pSUS43 und pSUS44 .............................................39 Abbildung 8: Schematische Darstellung der Konjugationsexperimente zur Übertragung der Shuttle-Plasmide von E. coli nach Campylobacter coli......................................41 Abbildung 9: Western-Blot-Untersuchung der Lysate der Flagellin-negativen Mutanten von C. coli VC167 und der im Konjugationsexperiment erzeugten Stämme...........44 Abbildung 10: Western-Blot-Untersuchung der Flagellin-negativen Mutanten von C. coli VC167 und der im Konjugationsexperiment erzeugten Stämme..............................45 II Inhalt und Verzeichnisse Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Bilder der C. coli-Mutante KX5 ..................47 Abbildung 12: Elektronenmikroskopische Bilder der durch Konjugation erzeugten Mutante KX5 (pSUS43) ............................................................................................48 Abbildung 13: Lineare Restriktionskarte des Plasmids pSUS76 ....................................50 Abbildung 14: Restriktionsanalyse des Plasmids pSUS76..............................................51 Abbildung 15: Western-Blot-Untersuchung von Lysaten des Wildstammes N6, der flbAMutante von N6 sowie N6 flbA- (pSUS76)...............................................................52 Abbildung 16: Elektronenmikroskopisches Bild des H. pylori-Wildtyps N6 .................53 oben Abbildung 17: Elektronenmikroskopisches Bild der flbA-Mutante von H. p. N6.54 unten Abbildung 18:Elektronenmikroskopisches Bild des Stammes N6 flbA- (pSUS76)54 Abbildung 19: Elektronenmikroskopisches Bild des Stammes N6 flbA- (pSUS76). ......55 VERZEICHNIS DER TABELLEN Tabelle 1: Das Genus Helicobacter...................................................................................2 Tabelle 2: Mögliche Virulenzfaktoren...............................................................................9 Tabelle 3: Bakterienstämme ............................................................................................22 Tabelle 4: Vektoren und Plasmide...................................................................................23 Tabelle 5: Oligonukleotide ..............................................................................................23 Tabelle 6: Die rekombinanten C. coli-Stämme.. .............................................................42 VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN Bp °C ca. C-Terminus DNS Da eV fla Fla IgG IL-8 I.E. MALT min N-Terminus OD600 PCR rRNS ! sec. sog. spp. U/min vgl. WHO Basenpaare Grad Celsius circa Carboxy-Ende eines Peptids Desoxyribonukleinsäure Dalton Elektronenvolt Flagellingene Flagellinprotein Immunglobulin G Interleukin 8 Internationale Einheit Mukosa assoziiertes lymphatisches Gewebe Minute Amino-Ende eines Peptids Optische Dichte, gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm Polymerase-Kettenreaktion ribosomale Ribonukleinsäure Sigma, Sigma-Faktor Sekunde sogenannte Spezies Umdrehungen pro Minute vergleiche Weltgesundheitsorganisation III Einleitung 1 Einleitung 1.1 Helicobacter pylori: Von der Entdeckung zur eigenen Gattung Der Magen galt lange Zeit als steriles Organ, da er aufgrund seiner Physiologie als Habitat für Mikroorganismen auszuscheiden schien. Daher wurde der schon vor ca. 100 Jahren erfolgten Beschreibung von Bakterien im menschlichen Magen keine Bedeutung beigemessen [22]. Erst die kulturelle Anzüchtung von Helicobacter pylori durch Warren und Marshall im April 1982 [161] lieferte die Grundlage für die enorme Forschungsaktivität auf diesem Gebiet. Im Laufe der Zeit wurde dadurch das Verständnis der Pathogenese von Gastritis und gastroduodenaler Ulkuskrankheit revolutioniert. Weitere Erkrankungen wurden als mit der H. pylori-Infektion assoziiert erkannt. Therapieschemata zur Eradikation des Erregers und zur Behandlung der assoziierten Krankheiten konnten etabliert werden und gewinnen zunehmend an Bedeutung. 1.1.1 Morphologie, Biochemie und Kultur von Helicobacter pylori Helicobacter pylori ist ein gramnegatives, gebogenes oder spiralförmiges Stäbchenbakterium. Die Bakterien sind 2,5-5 µm lang und bis zu 1 µm breit [161]. Charakteristisch ist ein unipolares Bündel von 4-6 Flagellen, die von einer Hülle umgeben sind, welche sich am Ende bläschenförmig erweitert [62]. Zu den biochemischen Identifizierungsmerkmalen gehören die positive Katalase- und Oxidasereaktion, sowie die Produktion hoher Mengen an Urease. Weiterhin lassen sich Gamma-Glutamyltranspeptidase und alkalische Phosphatase nachweisen. Es findet weder HippuratHydrolyse noch Nitratreduktion statt. H. pylori stellt hohe Ansprüche an die Bedingungen der kulturellen Anzucht. Optimales Wachstum wird in mikroaerophiler Atmosphäre bei 37"C auf reichhaltigen Nährböden, z. B. frischen Blutagarplatten, erreicht, die Antibiotika zur Hemmung der Kontaminationsflora enthalten. Nach 3-5 Tagen entstehen 1-2 mm große, glänzend-transparente Kolonien, die empfindlich für Cefalotin und resistent gegen Nalidixinsäure sind [70;71]. 1 Einleitung 1.1.2 Die Gattung Helicobacter Die für H. pylori entdeckten Eigenschaften zeigten markante Abweichungen von allen bis dahin bekannten Bakteriengattungen. Unter Berücksichtigung der Ultrastruktur, des zellulären Fettsäuregehalts, der Wachstumsbedingungen und der Enzymaktivitäten, sowie anhand von 16S rRNS Sequenzanalysen [132] wurde 1989 die Gattung Helicobacter begründet [71]. Das Genus Helicobacter umfaßt neben den von Warren und Marshall kultivierten H. pylori etliche Spezies, die sich alle durch eine hohe Wirtsspezifität auszeichnen (siehe Tabelle1). Von den gastrischen Spezies läßt sich beim Menschen auch H. heilmannii nachweisen [78;140]. Die Infektion mit diesem Erreger ist selten, die Gastritis in der Regel nur mild ausgeprägt [144]. Eingehende mikrobiologische Untersuchungen des Erregers sind noch nicht erfolgt, da die erstmalige kulturelle Anzucht erst kürzlich gelang [81]. Die Bedeutung dieses Organismus und der resultierenden Gastritis ist zur Zeit noch unklar. Gastrische Helicobacter-Spezies unklare Position H. pylori H. muridarum Nagetiere H. cinnaedi menschl. Durchfallerreger H. hepaticus Mäuse (Leberkolonisation u. -tumoren) H. fennelliae menschl. Mäuse (Galle, Faeces) Durchfallerreger H. bilis H. pametensis Vögel H. pullorum Geflügel, H. rodentium Mäuse in Assoziation mit H. bizzozeronii Durchfall beim H. salomonis Menschen beob. H. heilmannii H. canis H. mustelae H. felis H. nemestrinae H. acinonyx Menschen, Primaten,Katzen Mensch Hund Frettchen Katze, Hund Affen Gepard Durchfallerreger Tabelle 1: Das Genus Helicobacter [84;138;147] 1.1.3 Tiermodelle der gastrischen Infektion des Menschen mit Helicobacter pylori Die hohe Wirtsspezifität der einzelnen Spezies macht es schwierig, geeignete Tiermodelle der Infektion mit H. pylori zu etablieren. Nachdem verschiedene Ansätze zur experimentellen Simulation der Krankheit in konventionellen Labortieren gescheitert waren, existierte lange Zeit nur die Möglichkeit der Infektion von gnotobiotischen Ferkeln mit H. pylori [51;93]. Als Alternativen nehmen daher die tierpathogenen Spezies H. mustelae und H. felis in der Helicobacter-Forschung eine wichtige Rolle ein. So kolonisiert H. mustelae den Magen von Frettchen [61], wogegen die ursprünglich aus Katzenmägen isolierten H. felis [102] in der Lage sind, Mäuse zu infizieren [101]. In beiden Fällen kommt es zur Ausbildung einer Gastritis, die einen der menschlichen Erkrankung ähnlichen Verlauf nimmt. Erst seit kurzem steht ein standardisiertes Mausmodell der Infektion mit H. pylori zur Verfügung [104]. 2 Einleitung 1.2 Die Infektion des Menschen mit H. pylori 1.2.1 Übertragung und Epidemiologie Das Vorkommen von Helicobacter pylori ist weltweit belegt und etwa 60 % der Weltbevölkerung sind infiziert [28]. Der Erwerb der Infektion erfolgt nach heutiger Vorstellung überwiegend im Kindesalter. Als wichtigstes Erregerreservoir gilt der Magen. Der Durchseuchungsgrad einer Population wird von den Lebensbedingungen entscheidend beeinflußt. Welche Faktoren dafür verantwortlich sind, ist bislang nicht bekannt. Das Zusammenleben vieler Menschen auf engem Raum, Hygiene- und Ernährungsgewohnheiten sowie die Herkunft des Trinkwassers und die Haltung von Tieren werden diskutiert [2;26;69]. Auch genetische Faktoren des Wirts beeinflussen die Infektionshäufigkeit [110]. Genanalysen gastrischer Isolate von H. pylori zeigen eine sehr hohe Stammvariabilität [149]. Der Nachweis gleicher H. pylori-Stämme gelingt fast ausschließlich bei Personen, die in engem räumlichem Kontakt leben. Einerseits kann in diesen Fällen eine gemeinsame Infektionsquelle bestehen, andererseits ist die Weitergabe des Bakteriums von Person-zu-Person wahrscheinlich [11;65]. Es lassen sich sowohl Hinweise für eine fäkal-orale, als auch für eine oral-orale Übertragung finden. Zahlreiche Studien liefern abweichende Befunde beim Nachweis von H. pylori in Speichel oder Stuhl und bei der Wiederanzucht aus diesen Medien, so daß eine befriedigende Aussage zum Übertragungsweg noch nicht möglich ist [28;127]. Ungeklärt ist auch die Bedeutung der Kokkoid-Formen von H. pylori. Unter ungünstigen Wachstumsbedingungen, aber auch in der stationären Wachstumsphase, gehen die Bakterien regelmäßig in diese Rundform über. Bislang ist die Wiederanzucht solcher Zellen in vitro nicht gelungen. Ob sie als Manifestation des Zelltodes zu werten sind oder eine mögliche Ansteckungsquelle darstellen, wird kontrovers diskutiert [21;95]. 1.2.2 Nachweismethoden Eine Infektion mit Helicobacter pylori läßt sich direkt durch invasive diagnostische Maßnahmen, aber auch indirekt durch nicht-invasive Methoden in Form von serologischen Tests oder durch den Harnstoff-Atemtest nachweisen. Zur Detektion von Antikörpern gegen H. pylori-Antigene sind kommerzielle Tests für den Einsatz in der Routinediagnostik erhältlich [123]. Der Harnstoff-Atemtest weist die Besiedelung des 3 Einleitung Magens durch H. pylori anhand der bakteriellen Ureaseaktivität nach. Dazu trinkt der Proband eine Lösung mit 13 C-Harnstoff aus dem das Enzym 13 CO2 freisetzt, welches vom Patienten ausgeatmet und massenspektrometrisch erfaßt wird [106]. Dieser Test eignet sich besonders als Kontrolluntersuchung nach einer Eradikationstherapie. Die am häufigsten verwendete und zuverlässigste Methode zur Diagnose einer H. pyloriInfektion ist die endoskopische Untersuchung des Magens mit Entnahme von Biopsiematerial aus Antrum- und Korpusschleimhaut. Schon sehr kleine Gewebsproben reichen aus, um einen Urease-Schnelltest durchzuführen. Dabei wird die Enzymaktivität der Bakterien durch einen Farbumschlag sichtbar gemacht [116]. Eine histologische Untersuchung des entnommenen Materials ermöglicht den direkten Erregernachweis mit hoher Sensitivität und Spezifität. Durch die Kombination des histologischen Befundes mit dem makroskopischen Bild können die Ausdehnung und der Grad der Entzündungsreaktion in der Schleimhaut beurteilt werden. Nur in therapieresistenten Fällen erfolgt die kulturelle Anzucht der Bakterien aus Magenbiopsien zur Resistenzbestimmung. 1.2.3 Pathogenese der Infektion mit H. pylori Bei der Infektion des Menschen durch H. pylori sind zwei Aspekte wesentlich: 1. die Fähigkeiten, die dem Erreger ermöglichen, die Magenschleimhaut zu kolonisieren, dort zu persistieren und krankheitsauslösend zu wirken. Sie werden unter dem Begriff Virulenzfaktoren zusammengefaßt. 2. die Abwehrmechanismen und die spezifische Immunantwort des Wirtsorganismus, welche bei der H. pylori-Infektion stark ausgeprägt sind, die Ausbildung einer chronischen Infektion jedoch nicht verhindern. 1.2.3.1 Die Virulenzfaktoren von H. pylori Die Eigenschaften, die dem Bakterium das Überleben im Wirtsorganismus ermöglichen, sind von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der resultierenden Erkrankungen. Darüber hinaus eröffnen sie mögliche Ansätze für die Therapie und Prophylaxe einer Infektion. Die wesentlichen Virulenzfaktoren von H. pylori werden hier erläutert. Sie sind in Abbildung 1 im Überblick dargestellt. 4 Einleitung Infektion des Magens mit Helicobacter pylori Virulenzfaktoren orale Aufnahme Kolonisationsfaktoren und Persistenzfaktoren Überwinden der physikochemischen Barriere, Durchdringen des Mukus, Adhärenz an die Epithelzellen Motilität Ureaseaktivität Adhäsine Etablierung einer stabilen Besiedelung und Ausdehnung der Infektion gewebschädigende Faktoren Induktion einer spezifischen Immunantwort Interaktion mit den Abwehrmechanismen des Wirts und deren Modulation Auslösung von Ulzerationen, Lymphomen und Karzinomen Vacuolisierendes Zytotoxin VacA Ammoniak aus Ureaseaktivität CagA-Antigen und weitere Genprodukte der Pathogenitätsinsel Hitzeschockproteine Lipopolysaccharid Superoxiddismutase / Katalase Abbildung 1: Pathogenese der H. pylori-Infektion. Ablauf der Infektion und die daran beteiligten bakteriellen Virulenzfaktoren. 1.2.3.1.1 Urease Der erste detailliert untersuchte Virulenzfaktor von H. pylori war das Enzym Urease. Dieses ca. 550 kDa große Protein besteht aus 2 verschiedenen Untereinheiten, UreA (26 kDa) und UreB (61 kDa), die jeweils 6 mal in einem Molekül vorhanden sind. Für die biologische Aktivität des Enzyms sind zusätzlich 2 Nickelatome erforderlich [42]. Nach Reinigung der beiden Untereinheiten und der Klonierung der zugehörigen Gene ureA und ureB [99] gelang es erstmals, Gene von H. pylori mittels gezielter Mutagenese auszuschalten [56]. Ohne Urease kann keine Kolonisation des Magens erfolgen [46]. Das Enzym katalysiert die Spaltung von Harnstoff zu Ammoniak und Kohlendioxid, wobei der freigesetzte Ammoniak eine Alkalisierung der Umgebung bewirkt. Die Ureaseproduktion könnte daher zum Schutz der Bakterienzelle gegenüber dem sauren Milieu des Magens beitragen. Da aber Urease-negative Mutanten auch bei medikamentös neutralisiertem Magen-pH nicht zur Kolonisation der Schleimhaut fähig sind [48], müssen weitere Auswirkungen der Ureaseaktivität bedeutsam sein. Dazu zählt, daß der freigesetzte Ammoniak als Stickstoffquelle für die bakterielle 5 Einleitung Aminosäuresynthese genutzt werden kann [162]. Zusätzlich sind erhebliche zytotoxische und zytostatische Effekte auf die Epithelzellen des Magens nachweisbar [113;119;141]. Einflüsse des Ammoniaks auf die Immunologie, wie eine Verminderung der phagozytischen Aktivität polymorphkerniger Leukozyten, werden ebenfalls diskutiert [115]. 1.2.3.1.2 Motilität Die außerordentliche Beweglichkeit von H. pylori wurde bald nach der Urease als weiterer Virulenzfaktor erkannt. Im Hinblick auf den experimentellen Teil dieser Arbeit, der sich mit der Expression der Flagelline und deren Regulation befaßt, werden die bakterielle Motilität und die Besonderheiten der Beweglichkeit von H. pylori in Kapitel 1.3 detailliert erläutert. 1.2.3.1.3 Adhärenz Mikroskopische Untersuchungen von infiziertem Gewebe zeigen, daß sich der Großteil der Helicobacter-Zellen in der Mukusschicht befindet, doch wird immer auch eine direkte Anlagerung an das antrale Magenepithel beobachtet [77]. Derartige Adhärenz von Mikroorganismen an eukaryontische Zellen wird gewöhnlich durch den Kontakt bakterieller Oberflächenstrukturen, sog. Adhäsine, mit speziellen Rezeptoren ermöglicht. Die Expression der Rezeptoren durch bestimmte Gewebe und die Spezialisierung auf die Interaktion mit diesen Zellen resultiert in einer hohen Wirtszellspezifität, wie sie auch für Helicobacter in vivo dokumentiert ist. Die Bindung von H. pylori an gastrische Zellen bewirkt bei diesen deutliche intrazelluläre Veränderungen. Im Bereich der Anlagerungsstelle werden Umverteilungen des Zytoskeletts und der Verlust von Mikrovilli beobachtet. Es kommt zur Ausbildung von füßchenförmigen Zellausläufern sowie zu einer verstärkten Tyrosin-Phosphorylierung von Wirtszellproteinen [135]. Die Adhärenz der Bakterien setzt Mechanismen der Signaltransduktion in Gang, die ihrerseits u. a. über die Freisetzung von Zytokinen an der Entstehung der Entzündung beteiligt sind [131;136]. Bislang sind etliche verschiedene Moleküle [86;139;156;167]. als Rezeptoren für H. pylori postuliert worden Von wesentlicher Bedeutung sind die Blutgruppenantigene Lewis b (Leb) und H-1, die als zellgebundene Antigene auch auf dem Magenepithel vorhanden sind [24]. An Leb bindet H. pylori durch das Adhäsin BabA2 (blood group 6 Einleitung antigen-binding adhesin). BabA2 ist auf der äußeren Zellmembran von H. pylori, nicht aber an den Flagellenhüllen, nachweisbar. Das Adhäsin ist biochemisch charakterisiert und das zugehörige Gen kloniert worden [83]. 1.2.3.1.4 VacA-Zytotoxin Im Rahmen der Gewebsschädigung durch die Infektion mit H. pylori läßt sich eine toxische Vakuolisierung des Zytoplasmas der betroffenen Zellen beobachten. Als auslösendes Agens wurde das vakuolisierende Zytotoxin VacA identifiziert [31]. Das 87 kDa Protein wird von den Bakterien in die Umgebung abgegeben und erst nach Kontakt mit saurem pH durch eine Konformationsänderung aktiviert [32;39]. Das zugrunde liegende vacA-Gen ist in allen H. pylori-Stämmen nachweisbar. Dennoch wird das Zytotoxin nur in ca. 50% der Fälle exprimiert [33]. Diese Tox+-Stämme werden signifikant häufiger von Ulkuspatienten isoliert [31]. Obwohl das VacA-Zytotoxin wahrscheinlich an der Ulkuspathogenese beteiligt ist, kann es für diese nicht als essentiell eingestuft werden [47;151]. Andere Effekte des Zytotoxin sind in vitro nachweisbar. Dazu zählt ein proliferationshemmender Einfluß auf Epithelzellen [130] und eine Einschränkung der Antigenpräsentation durch HLA-Antigene der Klasse II [121]. 1.2.3.1.5 CagA-Antigen und die Pathogenitätsinsel Statistisch korreliert mit der Produktion des VacA-Zytotoxins ist die Expression eines 128 kDa Proteins, des CagA (cytotoxin-associated gene product A). 70% aller H. pyloriIsolate produzieren CagA, wobei im Gegensatz zum VacA die mangelnde Expression immer mit dem Fehlen des zugehörigen cagA-Gens verbunden ist [155]. Patienten mit gastroduodenaler Ulkuskrankheit sind fast ausschließlich mit cagA+-Stämmen infiziert. Das cagA-Gen wurde als Marker für das Vorhandensein einer ganzen Gruppe von Genen, der Pathogenitätsinsel (PAI), erkannt. Diese umfaßt ca. 40.000 Bp und 29 Gene [29], deren Funktionen noch weitgehend unbekannt sind. 6 Genloci konnten identifiziert werden, die wahrscheinlich für die H. pylori-stimulierte Produktion des Zytokins IL-8 verantwortlich sind [29;34]. Ihre Genprodukte aktivieren den Transkriptionsfaktor NFkB, der die IL-8 Synthese reguliert [68] und so die neutrophile Infiltration der Mukosa beeinflußt (vgl.1.2.3.2). 7 Einleitung 1.2.3.1.6 Lipopolysaccharid Gramnegative Bakterien tragen an ihrer äußeren Membran ein auch als Endotoxin bezeichnetes Polymer aus Lipid A, einem Kernpolysaccharid und einer O-spezifischen Zuckerkette (Lipopolysaccharid (LPS)). Schon früh wurde für das LPS von H. pylori eine im Vergleich mit anderen intestinalen Bakterien ungewöhnliche Fettsäurenzusammensetzung, eine erniedrigte Toxizität und verminderte immunologische Aktivität nachgewiesen [17;63]. Strukturelle Untersuchungen des Lipids A, der für humane Zellen toxischen Komponente des LPS-Moleküls, bestätigen diese Befunde [122]. Das wohl auffälligste Merkmal des LPS von H. pylori ist der als Antigenmimikry bezeichnete Aufbau der O-Seitenketten aus Oligosacchariden, welche den menschlichen Lewis-Blutgruppenantigenen entsprechen [8]. Dabei läßt sich eine individuelle Übereinstimmung des bakteriellen Phänotyps mit dem des Wirt nachweisen [165]. Die Lewis-Antigenstruktur des LPS bei H. pylori unterliegt einer Phasenvariation in hoher Frequenz [9]. Die genaue Bedeutung dieser Beobachtungen ist noch unklar, doch könnte hierdurch die Anpassung an die Antigenstrukturen des Wirtsorganismus ermöglicht werden. 1.2.3.1.7 Andere mögliche Virulenzfaktoren Eine Vielzahl von H. pylori-Proteinen konnte bislang nachgewiesen und ihre Funktion untersucht werden. Für einige wird eine Bedeutung als Virulenzfaktoren diskutiert. Sie sind in Tabelle 2 (S.9) beschrieben. 1.2.3.2 Immunologische Reaktionen im Rahmen der Infektion mit H. pylori Im Gegensatz zu den tieferen Abschnitten des Intestinums enthält die Magenwand normalerweise kein lymphatisches Gewebe (MALT). Trotzdem werden bei der Infektion mit H. pylori neben den humoralen auch die zellulär vermittelten Mechanismen der Immunabwehr aktiviert [52;57]. Die akute durch H. pylori induzierte Gastritis ist histologisch durch eine deutliche neutrophile Infiltration der Magenschleimhaut gekennzeichnet [20]. Im Laufe der Infektion wandelt sich dieses Bild, so daß im chronischen Stadium zwar der Anteil an Granulozyten den Aktivitätsgrad der Entzündung bestimmt, aber überwiegend Monozyten und Lymphozyten bis hin zur Ausbildung von Lymphfollikeln zu finden sind [20,91]. 8 Einleitung Virulenzfaktor Beschreibung, vermutete Auswirkung - Hitzeschockproteine (HspA, HspB) HspA bindet spezifisch an Nickelionen und ist damit vermutlich wichtig für die Funktion des Nickelmetalloenzyms Urease [43;44]. Beide Proteine kommen primär intrazellulär vor , sind jedoch auch an der Zelloberfläche nachweisbar und damit dem Immunsystem des Wirts zugänglich. Ob altruistische Autolyse oder spezifische Exportsysteme für diese Befunde verantwortlich sind, wird zur Zeit diskutiert [88;159]. - Proliferations hemmendes Protein 100 kDa Proteinfaktor, der an der Hemmung zellulären Immunantwort beteiligt sein soll. Auch Wachstumvon epithelialen Zellen wird gehemmt, so möglicherweiseeine reduzierte Regenerationsaktivität Mukosa durch dieses Protein bewirkt wird [90]. - N-alpha-Histamin-Methyltransferase Katalysiert die Bildung von N-alpha-methyl-Histamin, das an gastrischen H3-Rezeptoren agonistisch wirkt und so potentiell an der Entstehung der Hypergastrinämie und des Serotoninabfalls beteiligt ist [30]. - Superoxiddismutase Enzym aus zwei Untereinheiten (je 24 kDa), das zugehörige Gen sod ist kloniert und sequenziert worden. Das Enzym dient vermutlich zum Schutz gegen reaktive Sauerstoffmetaoliten aus neutrophilen Granulozyten (sog. oxidative outburst) [142]. - Katalase Tetramer aus 58 u. 50 kDa Proteinen, das zugehörige Gen ist kloniert und charakterisiert worden. Das Enzym scheint dem Schutz der Bakterienzelle gegen toxische Sauerstoffmetaboliten zu dienen. Wie für die Hitzeschockproteine wird die Lokalisation an der Zelloberfläche vermutet [76;126]. Die Katalase zählt zu den wichtigen Antigenen für die Vakzinentwicklung [129]. - Phospholipasen In vitro und in vivo nachgewiesene Enzymaktivitäten, die vermutlich in der Lage sind, die Hydrolyse der Phospholipide der gastrischen Mukosa zu katalysieren. Der surfactant-artigen hydrophoben und phosholipidreichen Zone oberhalb der Mukosa wid eine wichtige Barrierefunktion zugeschrieben [100;114]. der das daß der Tabelle 2: Mögliche Virulenzfaktoren von H. pylori Zu den bakteriellen Antigenen gegen die Antikörper gebildet werden zählen CagA, VacA, HspB und Urease [91]. Diese Antikörper führen im natürlichen Infektionsablauf jedoch nicht zu einer wirksamen Abwehr der Infektion (vgl.1.2.3.4). Eine Vielzahl von Untersuchungen belegt sowohl stimulierende als auch hemmende Effekte von H. pylori auf immunkompetente Zellen [18;35;54;89;150]. In vitro konnten bakterielle Proteine nachgewiesen werden, die für diese Immunmodulation mitverantwortlich sind [53;90]. Untersuchungen der Zytokinausschüttung von H. pylori-spezifischen T-Zellen in der antralen Mukosa zeigen Unterschiede in der Immunantwort von Patienten mit gastroduodenaler Ulkuskrankheit zu Patienten mit unkomplizierter Gastritis [12;37;38]. 9 Einleitung Es ist Gegenstand intensiver Forschungstätigkeit, ob die immunologische Antwort des Wirtsorganismus selbst zur Persistenz der Infektion und zur Pathogenese der assoziierten Erkrankungen beiträgt. Auch Mechanismen der autoimmunvermittelten Gewebsschädigung werden dabei diskutiert [52]. 1.2.3.3 Helicobacter pylori-assoziierte Erkrankungen 1.2.3.3.1 Gastritis Die durch H. pylori induzierte Entzündung der Magenschleimhaut tritt bevorzugt im Antrum auf und wird als chronisch aktive Gastritis oder Gastritis vom Typ B bezeichnet. Zusätzlich zu den charakteristischen Infiltrationen der Mukosa kann das histologische Bild deutliche regressive Veränderungen zeigen. Dazu gehören das stellenweise Auftreten von Regeneratepithel, Reduktion spezifischer Magendrüsen (Atrophie) und die Ausbildung intestinaler Metaplasien [20]. Die Ausprägung der Infiltration durch Lymphozyten und Plasmazellen wird als Grad der Gastritis bezeichnet. Die Aktivität der Gastritis wird anhand der Stärke der Infiltration durch neutrophile Granulozyten beurteilt. Im allgemeinen besteht eine derartige chronische Infektion mit H. pylori über Jahre ohne Symptome zu erzeugen. Meistens führen erst die sich auf diesem Boden entwickelnden Folgekrankheiten, auf die im weiteren eingegangen wird, zu Beschwerden. 1.2.3.3.2 Gastroduodenale Ulkuskrankheit Die Entstehung von umschriebenen Substanzdefekten der Schleimhäute wird durch ein Ungleichgewicht zwischen Schutzmechanismen und aggressiven Faktoren erklärt. Unter den aggressiven Faktoren ist nach heutigem Verständnis die durch H. pylori induzierte Gastritis von so herausragender Bedeutung, daß das Ulkusleiden als Folgeerkrankung der Infektion definiert wird. Die Prädilektionsstelle gastrischer Läsionen ist die kleine Kurvatur, was mit der dort stärker ausgeprägten Gastritis begründet wird. Anatomische Faktoren und Aspekte der lokalen Blutversorgung spielen dabei eine Rolle [143]. Maßgeblich an der Pathogenese der Ulzerationen beteiligt sind Veränderungen der gastroduodenalen Physiologie durch den Erreger. Dazu zählen besonders Abweichungen im komplexen System der Magensaftsekretion. Im Laufe der Infektion 10 Einleitung kommt es nach einer passageren Hypochlorhydrie zu einer Hypergastrinämie, die verbunden ist mit verschiedenen charakteristischen Mustern der gastrischen Säure- und Pepsinsekretion [16;55;67]. Welche bakteriellen Mechanismen hierfür verantwortlich sind, wird derzeit intensiv erforscht. Patienten mit Duodenalulkus sind zu 95% mit H. pylori infiziert. Eine mögliche Entwicklung des Duodenalulkus verläuft über die Ausbildung einer gastrischen Metaplasie durch erhöhte Säureeinwirkung auf die Duodenalschleimhaut. So entsteht ein Schleimhautabschnitt, der von H. pylori besiedelt und Ausgangspunkt einer Bulbitis werden kann in deren Folge sich das Ulcus duodeni entwickelt. Letztlich ist ungeklärt, unter welchen Bedingungen die Infektion mit H. pylori zu einem Ulkusleiden führt. Einerseits steht noch keine Typisierung zur Verfügung, die eine definitive Einteilung der Stämme nach Pathogenität und ulzerogenem Potential ermöglicht [75]. Andererseits ist der große Einfluß genetischer und immunologischer Faktoren des Wirtsorganismus zu berücksichtigen [52;79]. Schließlich sind weitere schädigende Einflüsse, wie Eß- und Trinkgewohnheiten oder die Einnahme von Medikamenten sowie vegetative Faktoren bekannt, deren Bedeutung für die Pathogenese der gastroduodenalen Ulkuskrankheit sich im Einzelnen kaum definieren läßt [94;111]. 1.2.3.3.3 Magenkarzinom Seit langer Zeit ist bekannt, daß die chronisch atrophische Gastritis ein erhöhtes Karzinomrisiko bedingt. Da die Infektion mit H. pylori als Ursache der Gastritis nachgewiesen wurde, stellt sich die Frage, ob die Infektion selbst karzinogene Potenz hat. H. pylori kommt nicht nur in von Karzinomen befallenen Mägen vor, sondern es ist eine statistisch signifikante Verbindung zwischen der Infektion und einem erhöhten Krebsrisiko nachweisbar [1;137]. Dabei erhöht eine chronische, über Jahre bestehende Infektion mit H. pylori die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Magenkarzinoms deutlich [60;124;128]. Hiervon ist das Kardiakarzinom, bei dem andere Pathomechanismen ausschlaggebend sind, auszunehmen [137]. Der Rolle der Infektion mit H. pylori bei der Krebsentstehung wurde 1994 durch die WHO Rechnung getragen, indem H. pylori als Klasse I Karzinogen, also als definitiv krebserregend eingestuft wurde [59]. 11 Einleitung 1.2.3.3.4 MALT-Lymphom Die Ausbildung lymphatischen Gewebes in der gastralen Mukosa im Rahmen der durch H. pylori induzierten Entzündung gehört zu den spezifischen immunologischen Reaktionen auf den Erreger (vgl. 1.2.3.2). Das histologische Erscheinungsbild dieser reaktiven Infiltration kann zum Teil nur sehr schwer von atypischen lymphozytären Infiltraten, die als maligner Tumor zu werten sind, abgegrenzt werden. Solche MALTLymphome zählen zu den Non-Hodgkin-Lymphomen, für die eine Entwicklung ausgehend von benignen fokalen lymphatischen Hyperplasien diskutiert wird [163]. Mittlerweile ist gesichert, daß niedrig-maligne MALT-Lymphome des Magens kausal mit der H. pylori-Infektion assoziiert sind. Bei über 90% der Patienten mit solchen Malignomen wird die Infektion diagnostiziert [13;166]. Daß H. pylori in der Lage ist, das Wachstum von niedrig-malignen B-Zell-Lymphomen anzuregen, konnte in vitro gezeigt werden [82]. Therapiestudien zeigen Remissionsraten von bis zu 75% nach Eradikationsbehandlung [14;158]. Diese Befunde unterstreichen, daß die Bakterien einen Stimulus für das erworbene lymphatische Gewebe des Magens darstellen, der vermutlich in der Lage ist, eine maligne Transformation zu bewirken. Entfällt dieser Reiz, sind die Veränderungen reversibel. Welche Faktoren an diesen Umwandlungsprozessen beteiligt sind, ist Gegenstand intensiver Forschung. Hochmaligne Lymphome unterliegen anderen Gesetzmäßigkeiten. Sie lassen sich auch nicht durch Eradikationstherapien beeinflussen. Bei gleichzeitigem Vorliegen niedrig- maligner Anteile wurde beobachtet, daß diese trotz Chemotherapie bestehen blieben, während die hoch-maligne Komponente darauf ansprach. Erst durch Therapie der Infektion gelang es, das niedrig-maligne Gewebe in eine Regression zu überführen [23]. Ob und welche Lymphompatienten durch eine Eradikationstherapie dauerhaft geheilt werden können, bleibt noch unklar. Besonderes Interesse gilt daher der weiteren Beobachtung der bisher erfolgreich behandelten Patienten. 1.2.3.4 Therapie und Prävention der Infektion Die physiologischen Besonderheiten des Magens, in Verbindung mit den Eigenschaften des Erregers, stellen hohe Anforderungen an eine Eradikationstherapie. Neben einer guten Wirksamkeit gegen H. pylori ist bei der Wahl eines Antibiotikums sowohl dessen Verfügbarkeit im Mukus, als auch das Verhalten bei saurem pH zu berücksichtigen. Da bislang keine Substanz zur Verfügung steht, die allen Kriterien gerecht wird, ist die 12 Einleitung Kombination von drei Therapeutika heute Mittel der Wahl [97;117;118]. Protonenpumpenhemmer wie Omeprazol sind Bestandteil aller aktuellen Therapieschemata. In Kombination mit Antibiotika führen sie zu einer signifikanten Steigerung der Eradikationsrate (80-90 % Eradikation). Es ist noch unbekannt, welche Mechanismen dabei wirksam sind. Durch die Blockade der Säuresekretion kommt es zu einer dauerhaften Erhöhung des Magen-pH. Unter solchen Bedingungen wird eine Reduktion der Anzahl von H. pylori-Zellen und die beschleunigte Abheilung von Ulzerationen beobachtet [10]. Die Eradikationstherapie sollte bei allen infizierten Ulkuspatienten angewendet werden. Sie kann auch bei dyspeptischen Beschwerden erwogen werden, wenn eine Infektion nachgewiesen ist und andere Ursachen ausgeschlossen sind. Im Fall eines niedrig-malignen Lymphoms des Magens ist die Eradikationstherapie im Rahmen kontrollierter Studien möglich [97]. Nachteile der medikamentösen Therapie sind die hohen Kosten und die zunehmende Beobachtung von Resistenzen, mögliche Nebenwirkungen und die teilweise geringe Compliance aufgrund der Einnahme von drei Medikamenten [117;118]. Nach der Durchführung einer Eradikationstherapie werden kaum Reinfektionen beobachtet, häufiger ist das Wiederaufleben der Infektion durch Bakterien, die nicht zuverlässig abgetötet wurden (Rekrudeszenz) [157]. Unter besonderer Berücksichtigung der hohen Prävalenzraten in Entwicklungsländern ist die Prävention der Infektion von außerordentlichem Interesse. Da der genaue Übertragungsweg noch ungeklärt ist, bleibt es schwierig zu definieren, wie eine Ansteckung vermieden werden kann. Große Hoffnungen werden daher in die Entwicklung eines Impfstoffes gesetzt [36]. Sehr erfolgversprechende Ansätze auf tierexperimenteller Basis sind bereits vorhanden. Obwohl die im Laufe der natürlichen Infektion auftretenden Antikörper keine Immunität verleihen, konnten bei Verwendung von Zellsonikaten zur aktiven oralen Vakzinierung im Tierversuch kurative und protektive Effekte beobachtet werden [40]. Ähnliche Erfolge wurden mit definierten Antigenen, wie der B Untereinheit der Urease und dem Hitzeschockprotein A, erzielt [58]. Ein weiteres aussichtsreiches Antigen ist das Enzym Katalase [129]. Klinische Phase II Studien beschäftigen sich bereits mit den Möglichkeiten des Einsatzes der Urease beim Menschen [120;146]. Die Suche nach weiteren Antigenen, effektiven Adjuvantien und die Übertragbarkeit der tierexperimentellen Ergebnisse auf den Menschen sind Gegenstand intensiver Forschungstätigkeit. 13 Einleitung 1.3 Schwerpunkt Motilität Helicobacter pylori besitzt eine ungewöhnlich hohe Motilität, die besonders in visköser Umgebung wie dem Magenschleim ausgeprägt ist. So kann sich H. pylori in Medien bewegen, deren Viskosität die Motilität von E. coli komplett zu hemmen vermag [77]. Grundlage dieser hervorragenden Beweglichkeit ist der Flagellenapparat, der an die besonderen Anforderungen des Habitats Magen angepaßt zu sein scheint. Der Aufbau der Flagellen, ihre Synthese und die verantwortlichen Regulationsvorgänge haben im Hinblick auf die Motilität als Virulenzfaktor einen entscheidenden Einfluß auf den Verlauf der Infektion und sind somit von erheblicher medizinischer Relevanz. 1.3.1 Flagellen als Grundlage bakterieller Motilität Der Aufbau des Flagellenapparates ist eingehend bei den Enterobacteriaceae Escherichia coli und Salmonella spp. untersucht worden [3;109]. Ein Flagellum enthält drei Hauptkomponenten, den Basalkörper, den Haken und das Filament (siehe Abbildung 2). Der Basalköper besteht aus einer zentralen Röhre und einem Komplex aus zylindrischen Elementen (MS-Ring-Komplex und C-Ring). Dieser bildet das Fundament des Flagellums und funktioniert zusammen mit der Röhre als dessen Antriebswelle. Weitere ringförmige Bestandteile (P-Ring und L-Ring) nehmen nicht an der Rotation teil, sondern dienen vermutlich als Lager für die rotierenden Elemente. Wichtig für die Chemotaxis ist der C-Ring. Er enthält einen Umschalter, der auf chemotaktische Reize hin die Rotation beeinflussen und eine Richtungsänderung induzieren kann. An der Motorfunktion des Flagellums sind weitere Proteine (MotProteine) beteiligt. Der Basalkörper schafft durch die Röhre einen zentralen Kanal mit Verbindung zur Zellaußenseite, wo der Haken beginnt. Er stellt eine gekrümmte, ebenfalls röhrenartige Verbindung zum Filament dar, durch welche die Rotation auf das Filament übertragen wird. Das Filament ist über zwei Verbindungsproteine (HAP1, HAP3) am Haken befestigt. Es ist schlauchförmig aufgebaut und besteht aus Tausenden von identischen Proteinuntereinheiten, den Flagellinen. 14 Einleitung FILAMENT ca. 10 µm Übergang Haken-Filament HAKEN BASALKÖRPER L-Ring P-Ring Äußere Membran Periplasmatischer Raum Röhre MS-Ring-Komplex C-Ring Zellmembran Mot-Proteine Abbildung 2: Der Flagellenapparat von S. typhimurium, schematische Darstellung mit Hinweis auf die Lokalisation in der Zellmembran (nach Macnab [109]). Erläuterungen im Text. Bei der Synthese eines Flagellums entsteht zuerst der Basalkörper. Da ein Großteil des Flagellums außerhalb der Zellmembran liegt, ist ein Exportsystem zur Ausschleusung der Proteine erforderlich. Hierin liegt vermutlich die Bedeutung des zentralen Kanals. So entstehen die Röhre, der Haken und das Filament nach Export der notwendigen Proteine durch den Kanal erst an der Außenseite der Zelle. Der Haken wächst, indem die FlgE-Untereinheiten an die distale Spitze angelagert werden. Dieses Prinzip gilt auch für die Synthese der Filamente, während derer die Flagelline durch das Lumen des Schlauchs transportiert und an dessen Ende zusammengesetzt werden [45] Die koordinierte Flagellensynthese wird in E. coli durch eine hierarchische Struktur der Gene ermöglicht, die in zahlreichen Operons organisiert sind und durch stufenweise Aktivierung die einzelnen Bauphasen der Flagellensynthese ermöglichen (vgl. Abbildung 3). Dabei werden vier Operonklassen (1, 2, 3a, 3b) unterschieden. Die Kaskade beginnt mit dem Master-Operon (Klasse 1). Ein Stimulus für dieses Operon ist cAMP. Die Ausbildung des Flagellenapparates ist stark von der Wachstumsphase abhängig, Details der übergeordneten Regulation zur Induktion der Flagellensynthese sind jedoch noch nicht bekannt. Die Genprodukte der Klasse 1 ermöglichen die Transkription der Gene der Klassen 2 und 3a. Damit beginnt die Synthese des Basalkörpers einschließlich des Exportapparates und des Hakens. Außerdem werden die Regulator- 15 Einleitung proteine FliA und FlgM gebildet. FliA ist ein Sigma-Faktor für die Gene der Klasse 3b, der solange durch den anti-Sigma-Faktor FlgM inhibiert wird, bis der Haken komplett hergestellt ist. Dann wird FlgM durch den Exportapparat des Flagellums in das Medium ausgeschleust und gibt so den Sigma-Faktor FliA frei, der die Transkription der Gene der Klasse 3b ermöglicht. Dazu gehören auch die Flagellingene, so daß die aufwendige Flagellinexpression (2% der gesamten Proteinproduktion) erst beginnt, wenn diese tatsächlich gebraucht werden. Weitere Genprodukte der Klasse 3 sind die Mot-Proteine sowie Proteine, die an der Chemotaxis beteiligt sind [109]. Im Vergleich zu E. coli ist über die Regulation der Flagellensynthese bei H. pylori nur wenig bekannt (siehe dazu Teilprojekt 3 dieser Dissertation). Es ist daher Gegenstand der Forschung wie die Flagellensynthese in H. pylori koordiniert wird. Abbildung 3: Hierarchische Organisation der Flagellingene zur koordinierten Expression im Rahmen der Flagellensynthese. Beschreibung im Text (nach Macnab [109]). 16 Einleitung 1.3.1.1 Aufbau und Struktur der Flagelline Der Begriff Flagelline bezeichnet die Strukturproteine des Flagellenfilaments. Bei vielen Spezies ist das gesamte Filament ein Homopolymer einer einzigen Flagellinuntereinheit, nur für wenige Bakterien wurde bisher das Vorhandensein mehrerer Flagelline beschrieben. Alle bisher bekannten Flagelline zeigen eine gemeinsame Struktur. Ausgehend von ihrer vermutlichen Konfiguration im Filament und anhand stark konservierter Bereiche in den Flagellingenen werden drei Domänen (D1, D2, D3) unterschieden, die sich in einer haarnadelartigen Tertiärstruktur der Flagelline widerspiegeln. Dies bedeutet, daß sich der C- und N-Terminus im gefalteten Protein gegenüber liegen. Sie sind zum Zentrum des Filaments gerichtet und bilden dessen innere Domäne (D1). Die Aminosäuren in diesem Bereich sind überwiegend hydrophob und führen zu einer #-helikalen Sekundärstruktur. Die inneren Domänen sind vermutlich für die grundlegende Struktur und Funktion des Flagellums verantwortlich. Entsprechend stark konserviert sind die Aminosäuresequenzen an den N- und C-Termini der Flagelline. Die mittlere Domäne (D2) der “Haarnadel” ist ebenfalls am Aufbau der basalen Struktur des Flagellums beteiligt. Die Domäne D3 stellt den nach außen gerichteten Teil des Flagellins dar und bestimmt damit maßgeblich den Durchmesser, die physikochemischen Oberflächeneigenschaften und die Antigenität des Flagellums. Im Bereich der Flagellingene ist die Information für die Domäne D3 im Mittelteil der Sequenz zu finden. Diese zentrale Genregion ist hoch variabel und schon geringe Veränderungen können die Antigeneigenschaften des Flagellums maßgeblich ändern. Anderseits ist die Domäne D3 für die eigentliche Funktion des Flagellums als Propeller entbehrlich. Auch ohne diese Domäne ist der Aufbau funktionsfähiger Flagellen möglich [96;109]. Für viele Bakterien sind die Sequenzen der Flagellingene bekannt. Anhand von Homologievergleichen lassen sich daraus z. B. phylogenetische Verwandtschaftsgrade für die untersuchten Organismen ableiten [164]. 1.3.2 Die Flagellen von H. pylori Die Flagellen von H. pylori gehörten zu den ersten detailliert untersuchten Strukturen dieses Erregers [62]. Charakteristisch für H. pylori ist das Vorhandensein eines unipolaren Flagellenbündels aus 4-6 Flagellen. Die Flagellen werden von einer Hülle umgeben, die sich am Ende bläschenförmig erweitert. Sie verleihen H. pylori die hohe 17 Einleitung Motilität, welche es dem Bakterium ermöglicht, sich im viskösen Magenschleim zu bewegen. Da die Etablierung einer dauerhaften Besiedelung des Magens für unbewegliche Bakterienzellen nicht möglich ist, stellt die Motilität einen essentiellen Virulenzfaktor dar [49]. Die Flagellenfilamente von H. pylori sind keine Polymere aus einer einzigen identischen Untereinheit, sondern bestehen aus zwei Flagellinen, FlaA und FlaB. Die beiden Proteine haben ein Molekulargewicht von 53 bzw. 54 kDa [105;148] und weisen 57% identische Aminosäuren auf. Die zugehörigen Gene flaA und flaB gehörten zu den ersten Genen von H. pylori, die kloniert und sequenziert worden sind [105;148]. Das flaA-Gen umfaßt 1530 Nukleotide und unterliegt der Kontrolle eines $28-Promotors. Im Gegensatz dazu wurde für das ebenfalls 1,5 kB große flaB-Gen ein $54-Promotor nachgewiesen. FlaB ist in wesentlichen geringeren Mengen und hauptsächlich im zellnahen Flagellenteil vorhanden [92]. Ohne Flagellen ist H. pylori komplett unbeweglich. Fehlt FlaA entstehen Stummelflagellen, die nur eine minimale Beweglichkeit erzeugen. Flagellen ohne FlaB erscheinen optisch unverändert, sind jedoch nicht in der Lage, den Bakterienzellen die volle Motilität zu verleihen [87]. Zu den besonderen Merkmalen der Gattung Helicobacter gehört die Flagellenhülle. Die Ultrastruktur der Flagellenhülle von H. pylori und ihre biochemischen Eigenschaften sind untersucht worden [64]. Über die Funktion der Hülle ist jedoch nur wenig bekannt. Vermutlich schützt sie die Flagellen gegen den sauren Magensaft. Ein weiterer Bestandteil des Flagellums, der Haken, ist ebenfalls gereinigt und untersucht worden. Er besteht aus identischen FlgE-Untereinheiten mit einer Größe von 78 kDa . Das flgE-Gen ist kloniert und sequenziert worden [125]. Hinsichtlich der übergeordneten Regulation der Flagellinexpression bei H. pylori ist bislang nur wenig bekannt. Die erste Entdeckung eines Faktors zur koordinierten Expression der Flagelline war die Klonierung und Charakterisierung des flbA-Gens [134]. Die 2,1 kB umfassende Sequenz kodiert für das Membranprotein FlbA. 1.4 Vorstellung der Teilprojekte dieser Dissertation und Definition der Arbeitsziele Die vorliegende Arbeit gliedert sich in drei Teilprojekte. Alle Projekte befassen sich mit der Expression der beiden Flagelline FlaA und FlaB von H. pylori. 18 Einleitung 1.4.1 Überexpression der Flagelline von H. pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine Um eine dauerhafte Kolonisation des Magens zu etablieren, sind Flagellen notwendig, die beide Flagelline enthalten [50]. Über die Regulation der Zusammensetzung der Flagellen aus FlaA und FlaB ist wenig bekannt. Es ist denkbar, daß durch Variation der Mengenverhältnisse der beiden Flagelline eine Anpassung an besondere Erfordernisse im Habitat Magen möglich wird. Aus H. pylori lassen sich die Flagelline nur mit großem Aufwand und in geringen Mengen gewinnen, wobei das Hauptflagellin FlaA überwiegt. Es sollte daher versucht werden, die H. pylori-Flagelline in E. coli unabhängig voneinander zu exprimieren, um sie anschließend separat und in großer Menge reinigen zu können. Die gereinigten Proteine sollten als Antigene für serologische Untersuchungen oder zur Vakzinentwicklung eingesetzt werden können. Auch die Herstellung von monospezifischen Antiseren zum Einsatz bei immunologischen Versuchsmethoden wurde angestrebt. 1.4.2 Expression der Flagelline von H. pylori in Campylobacter coli H. pylori ist phylogenetisch nah verwandt mit Campylobacter coli. Die Flagellen von C. coli bestehen ebenfalls aus zwei Flagellinen, FlaA und FlaB. Ein wesentlicher Unterschied besteht darin, daß die Flagellen von C. coli nicht von einer Flagellenhülle umgeben sind. Ebenfalls anders als bei H. p. sind die C. coli-Flagelline nahezu identisch und die entsprechenden Gene liegen im Genom direkt nebeneinander (sog. Tandemposition). Wie die H. pylori-Flagellingene unterliegen sie auch der separaten Regulation durch einen !28- bzw. !54-Promotor [5;74]. Durch die Zusammenarbeit mit einer Arbeitsgruppe in Amerika (Dr. Patricia Guerry, Bethesda, Md.) standen Flagellinnegative Mutanten von C. coli VC167 zur Verfügung. Die Auswirkungen der Mutationen in den Flagellingenen gleichen denen bei Flagellin-negativen Mutanten von H. pylori (vgl. Tabelle 3 sowie 1.3.2). Im Rahmen des zweiten Teilprojektes dieser Arbeit sollte die Möglichkeit untersucht werden, die Flagellingene von H. pylori unter der Kontrolle ihrer eigenen Promotoren in den C. coli-Mutanten zu exprimieren. Falls die Expression der fremden Flagelline in C. coli stattfindet, sollte gezeigt werden, ob die Mutationen funktionell komplementiert werden. Dadurch könnten Flagellen entstehen, die ganz oder teilweise aus H. pylori-Flagellinen bestehen und nicht von einer Hülle 19 Einleitung umgeben sind. Besonderes Interesse besteht an der Zusammensetzung derartiger Flagellen aus FlaA und FlaB im Hinblick auf Biosynthese, Lokalisation und Menge der Flagelline. Eventuelle Folgen des Fehlens der Flagellenhülle für die H. pylori-Flagelline könnten Aufschluß über die Funktion der Hülle liefern. 1.4.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von H. pylori In unserer Arbeitsgruppe war es in Vorarbeiten gelungen, eine isogene Mutante von H. pylori N6 herzustellen, deren flbA-Gen unterbrochen ist. Folge dieser Mutation ist die fehlende Synthese des FlbA-Proteins, welches als Regulator für die Flagellenbiosynthese charakterisiert werden konnte [134]. Ohne FlbA kommt es nicht zu einer Transkription der Flagellingene und die Expression des Hakenproteins FlgE wird reduziert. FlbA-negative Mutanten haben keine Flagellen und sind unbeweglich. komplett Das dritte Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Komplementation der Mutation im flbA-Gen. Der Einsatz von Methoden der reversen Genetik zur Expression von Genen in H. pylori ist erst seit kurzem möglich, so daß erstmals versucht werden konnte, das flbA-Gen in der FlbA-Mutante von H. pylori zu exprimieren. Schwerpunkt der Untersuchungen sollten die Auswirkungen der FlbAExpression auf die Flagellinexpression sein. 20 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien waren von höchstem Reinheitsgrad und stammten, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt), Sigma (München) und Serva (Heidelberg). 2.1.2 Puffer zur Reinigung der rekombinanten Proteine Sonikationspuffer mit Proteaseinhibitoren: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, pH 7,8. Folgenden Proteaseinhibitoren wurden verwendet: Pefabloc (100 µM), Leupeptin (1µM), Pepstatin (1µM), Aprotinin (0,1 µM). Waschpuffer: 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10% Glycerol, pH 8,0. Puffer B: 8 M Harnstoff, 0,1 M NaH2PO4, 0,01 M Tris pH 8,0. Puffer C: wie B, pH 6,3. Puffer D: wie B, pH 5,9. Puffer E: wie B, pH 4,5. 2.1.3 Antikörper Als Zweitantikörper bei der Entwicklung von Western-Blots diente ein Ziege-antiKaninchen-Immunglobulin der Firma Biogenzia, Bochum, das mit einer Peroxidase gekoppelt ist. Zum Nachweis von Flagellin wurde das Kaninchen-Antiserum AK179 [105] verwendet. Es ist gegen native H. pylori-Flagellen gerichtet. Das Serum wurde am Max-Planck-Institut für Biologie in Tübingen gewonnen und von Dr. Hermann Leying freundlicherweise zum Gebrauch überlassen. Dr. R. Pogge v. Strandmann, AG Physiologie der Mikroorganismen, Ruhr-Universität Bochum, stellte ein KaninchenAntiserum gegen den 6xHis-Affinitätskomplex zur Verfügung. Polyklonale Antiseren gegen die rekombinanten Helicobacter pylori-Flagellinmoleküle entstanden im Rahmen dieser Arbeit. Die Detektion des Regulatorproteins FlbA gelang durch ein gegen den CTerminus des Moleküls gerichtetes polyklonales Kaninchen-Antiserum, das im Institut für medizinische Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum hergestellt worden war [134]. 21 Material und Methoden 2.1.4 Bakterien Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 3 aufgeführt. Stamm Verwendung/Charakteristika Referenz H. pylori N6 Wildtyp, unipolares Bündel langer Flagellen, die von einer Hülle umgeben sind, hohe Motilität [56] H. pylori N6 flbA- isogene Mutante mit Kanamycin-Resistenzkassette im flbA-Gen; unbeweglich, da keine Flagellinexpression [134] E. coli DH5 Wirtsstamm für Klonierungsexperimente Bethesda Research Laboratories E. coli MC1061 Wirtsstamm für Klonierungsexperimente [27] E. coli TG1 Wirtsstamm für Klonierungsexperimente [66] E. coli HB101 (pJB3) Spenderzellen bei der Konjugation mit den Mutanten von C. coli VC167 [25] E. coli M15 (pREP4) Überexpression der rekombinanten H. p.-Flagelline Firma Qiagen, Hilden FlaA und FlaB C. coli KX5 flaA flaB Mutante von C. coli VC167, lange bipolare Flagellen, hohe Motilität C. coli KX15 flaA flaB Mutante von C. coli VC167, Stummelflagellen oder fehlende Flagellierung, nahezu unbeweglich; häufiges Auftreten motiler Varianten C. coli 656p2 flaA flaB Mutante von C. coli VC167, keine Flagel- Dr. P. Guerry, Naval len, unbeweglich Medical Research Institute, Maryland pers. Mitteilung + - [74] - + [74] - - Tabelle 3: Bakterienstämme. Die in den Konjugationsexperimenten erzeugten C. coli-Stämme sind separat in Tabelle 6 aufgeführt. 2.1.5 Kulturbedingungen E. coli-Stämme wurden auf Luria-Bertani(LB)-Platten oder in LB-Flüssigmedium angezüchtet. Helicobacter- und Campylobacter-Stämme wurden auf Platten aus Columbia Agar Base 2 mit 10% Pferdeblut (beides OXOID) kultiviert, denen folgende Antibiotika zugesetzt wurden: Amphotericin B (4 mg/l), Vancomycin (10 mg/l), Trimethoprim (5 mg/l) und Polymyxin B (2500 I.E./l). Bei 37"C dauerte die Bebrütung in mikroaerophiler Atmosphäre (Gasgenerator Anaerocult C, Merck) zwei bis drei Tage. Zur Selektion von Mutanten dienten die folgenden Antibiotika: Chloramphenicol (10 mg/l), Kanamycin (20 mg/l), Ampicillin (100-200 mg/l) und Tetracyclin (8 mg/l). 22 Material und Methoden 2.1.6 Vektoren, Plasmide und Oligonukleotide Die Vektoren, Plasmide und Oligonukleotide, die in dieser Arbeit verwendet wurden, sind in Tabelle 4 und Tabelle 5 dargestellt. Plasmid Vektor Größe Antibiotika-Resistenz, Bemerkungen (kB) Referenz pQE31 pQE32 3,4 ampR; QIAexpress-Vektoren zur Überexpression Firma Qiagen pUOA18 7,4 cmR, E. coli-Campylobacter coli-Shuttle-Vektor [160] pHel2 5,0 cm , E. coli-Helicobacter pylori-Shuttle-Vektor pHL319-2-4 pIC20R2 6,3 amp , enthält das flaA-Gen von H. pylori pSUS43 pUOA18 10,8 cmR, E. coli-C. coli-Shuttle-Plasmid, enthält das flaB-Gen von H. pylori pSUS44 pUOA18 11,2 cm , E. coli-C. coli-Shuttle- Plasmid, enthält das flaA-Gen von H. pylori pSUS76 pHel2 7,4 cm , E. coli-H.pylori-Shuttle-Plamid, enthält das flbA-Gen von H. pylori pSUS120 pQE31 4,9 amp , Überexpressions-Plasmid mit einem 1,5 kB großen PCR-Fragment, welches das flaB-Gen von H. pylori umfaßt pSUS130 pQE32 4,9 ampR, Überexpressions-Plasmid mit einem 1,5 kB großen (BamHI/SphI)-Fragment aus pHL319-2-4, welches die 3´-Hälfe des flaA-Gens von H. p. umfaßt R [80] R [105] R R R . Tabelle 4: Die verwendeten Vektoren und Plasmide. Sofern keine Referenz angegeben ist, entstanden die Plasmide im Rahmen dieser Arbeit. ampR, cmR: Resistenz gegen Ampicillin bzw. Chloramphenicol. Name Position in Strang Länge Sequenz der DNA(Bp) Sequenz Referenz/Zweck OHLPFlaB-20 149-169 + 30 gtaGGATCC GATAAATACCAATATCGCCGC Überexpression von H. p.-flaB [148] OHLPFlaB-21 1652-1671 - 29 acgGGTACCGCCTTAAGACATTCTGTTGC Überexpression von H. p.-flaB OHLPFlbA-30 46-76 + 30 cg GGATCCCGTTTTCCTTAGTAGCAAACGC PCR-Klonierung von H. p.-flbA [134] OHLPFlbA-31 2510-2539 - 29 taGGTACC AACAAGCTGGCATGCATAGC PCR-Klonierung von H. p.-flbA Tabelle 5: Für PCR eingesetzte Oligonukleotide. Die Referenzen geben die Herkunft der Sequenzen an. Unterstreichungen markieren Restriktionsschnittstellen der Oligonukleotide. Kleine Buchstaben bezeichnen Nukleotide zur Verbesserung der Restriktionseffizienz. 23 Material und Methoden 2.2 Methoden 2.2.1 Molekulargenetische Methoden 2.2.1.1 DNS-Präparation Zur Präparation genomischer DNS wurde das Genomic DNA kit der Firma Qiagen verwendet. Die Gewinnung von Plasmid-DNS erfolgte als Minipräparation mittels Alkalischer Lyse mit anschließender Phenol-Extraktion nach der Methode von Birnboim und Doly [19], bei größeren Mengen als Maxipräparation mit Hilfe des Qiagen Midi Plasmid Kits. Alternativ kam die Wizard Prep Methode der Firma Promega zum Einsatz. Zur Elution von DNS aus Agarose-Gelen dienten das QiaEx oder das QiaQuick Kit (Qiagen, Hilden). 2.2.1.2 DNS-Modifikation DNS-Restriktionen und -Ligationen wurden nach den Methoden von Sambrook et al. [133] durchgeführt. Die notwendigen Enzyme stammten von Boehringer Mannheim oder Gibco/BRL und wurden nach Angaben der Hersteller verwendet. 2.2.1.3 Polymerase-Kettenreaktion Die Amplifizierung von DNS-Fragmenten mittels PCR erfolgte in einem Perkin Elmer Cetus Thermal Cycler. Als Matrize wurde gereinigte genomische DNS oder PlasmidDNS verwendet. Je Ansatz wurden die Reaktionspartner in folgenden Mengen eingesetzt: 5 pmol DNS, 100 pmol je Primer und 20 pmol pro Desoxynukleotid. Es wurden jeweils 35 Zyklen durchgeführt. Pro Zyklus wurde die DNS eine Minute lang bei 94"C denaturiert. Danach erfolgte die Bindung der Primer an die Matrize bei der für sie ermittelten Bindungstemperatur, so daß anschließend über eine Dauer von drei Minuten bei 72"C die Synthese der komplementären DNS-Stränge erfolgen konnte. 2.2.1.4 Herstellung kompetenter Zellen und Transformation Beide Verfahren erfolgten nach Protokollen von Sambrook et al. [133]. Zur Herstellung kompetenter Zellen wurde 0,1 M CaCl2 verwendet. Für eine Transformation wurden jeweils 200 µl der kompetenten Zellen eingesetzt. 24 Material und Methoden 2.2.1.5 Elektroporation von Helicobacter pylori Für die Elektroporationsversuche nach dem Protokoll von Ferrero et al. [56] wurden Mutanten des Helicobacter-Stammes N6 verwendet. Die Anzucht der Empfängerzellen erfolgte auf 4-6 frisch hergestellten Blutplatten. Nach 24-48 Stunden konnten die Bakterien abgeerntet werden. Sie wurden in 20 ml ESG-Medium (15% Glycerol, 9% Saccharose in Aqua bidest) aufgenommen und anschließend bei 5.000 U/min 20 Minuten lang abzentrifugiert. Das so gewonnene Pellet wurde für mindestens zwei Stunden auf Eis inkubiert. Im Anschluß daran wurden die Zellen in 8 ml ESG-Medium resuspendiert, auf vier 2 ml-Reaktionsgefäße verteilt und erneut zentrifugiert. Zur Herstellung einer konzentrierten Bakteriensuspension wurde jedes Pellet vorsichtig in ca. 400 µl Medium resuspendiert. Eine Mischung von 100 µl dieser Suspension mit 10 µl frisch gegen Wasser dialysierter Plasmid-DNS wurde in eine vorgekühlte Elektroporationsküvette (-20"C) gegeben und einem Puls von 2,5 kV ausgesetzt. Sofort im Anschluß daran mit 100 µl SOC-Medium aufgefüllt, konnten die Zellen auf eine frische Blutplatte ohne Antibiotika pipettiert werden. Ohne die Bakterien auszustreichen wurde die Platte bei 37"C in mikroaerophiler Atmosphäre 24 Stunden bebrütet. Danach wurden die Zellen zur Selektion auf Nährböden mit Antibiotika überimpft. Von diesen Platten konnten nach 2-5-tägiger Inkubation Einzelkolonien isoliert werden. 2.2.1.6 Konjugationsexperimente von Campylobacter coli mit E. coli Die Spenderzellen, E. coli HB 101 (pJB3), mit den Shuttle-Plasmiden pUOA18, pSUS43 oder pSUS44, wurden nach der Transformation mindestens dreimal passagiert. Dazu wurden LB-Flüssigkulturen (5 ml) unter Zusatz von Tetrazyklin und Chloramphenicol jeweils über Nacht bei 37"C geschüttelt. Am Tag des Konjugationsexperiments wurden 10 ml antibiotikahaltigen LB-Mediums in einem Verhältnis von 1:20 beimpft. Die Ernte der Zellen erfolgte bei einer OD600 von 0,5 durch Zentrifugation über 10 min bei 4.000 U/min. Nach einmaligem Waschen mit 0,9% NaCl wurde das E. coli-Zellpellet in 2-3 ml Brucella-Bouillon ohne Antibiotika aufgenommen. Parallel zu der Anzucht der Spender-bakterien wurden die Empfängerzellen, die Campylobacter coli-Mutanten KX5, KX15 und 656p2%, kultiviert. Diese wurden für das Konjugationsexperiment von Platten geerntet und in 2 ml NaCl eingerieben. Mit dieser Suspension wurden 200 ml Brucella-Bouillon im Verhältnis 1:200 beimpft. Die Bakterien wurden in mikroaerophiler Atmosphäre über 2 25 Material und Methoden Tage bei leichtem Schütteln inkubiert, so daß sie am Tag des Konjugationsexperimentes eine OD600 von 0,5-0,6 erreicht hatten. Die Ernte erfolgte in vier Portionen a 50 ml durch Zentrifugation bei 3.000 U/min über 15 min. Die Zellen wurden in 0,9% NaCl gewaschen und erneut abzentrifugiert. Im nächsten Schritt wurden Spender- und Empfängerzellen zusammengegeben, um die Konjugation zu ermöglichen. Dazu wurden die Campylobacter-Pellets in jeweils 1 ml der E. coli-Suspension aufgenommen. Dieses Gemisch der beiden Stämme wurde auf Brucella-Platten ohne Antibiotikazusatz überführt. Ohne die Bakterien auszuspateln, erfolgte die Bebrütung über mindestens fünf Stunden bei 37"C in mikroaerophiler Atmosphäre. Anschließend wurden das Bakteriengemisch auf Brucella-Platten überimpft, welche die unter 2.1.5 beschriebenen Standard-Antibiotika sowie Kanamycin und Chloramphenicol (halbe Standard- Konzentration) enthielten, um die Transkonjuganten zu selektionieren. Das Zellgemisch wurde von den Platten ohne Antibiotika zurückgewonnen, indem 800 µl Brucella-Broth auf den Agar gegeben und die Bakterien mit Hilfe eines sterilen Drigalski-Spatels mit der Flüssigkeit gemischt wurden. Portionen von je 100 µl konnten dann auf die Selektionsplatten übertragen werden. Auf den antibiotikahaltigen Platten wurden die Zellen ausgestrichen. Nach einer Inkubationszeit von 3-6 Tagen entstanden Einzelkolonien. Da E. coli für Kanamycin sensibel ist, mußte es sich bei diesen Bakterien um Campylobacter handeln, die durch Aufnahme des Shuttle-Plasmides resistent gegen Chloramphenicol geworden waren. Um diese zu isolieren, erfolgte die Anzucht auf Blutagarplatten mit Kanamycin und Chloramphenicol wie unter Kulturbedingungen beschrieben. Dabei wurde für zwei Passagen die ChloramphenicolKonzentration halbiert, um das Wachstum nicht zu sehr zu verlangsamen. 2.2.2 Präparative und immunologische Methoden 2.2.2.1 Aufschluß der Bakterienzellen durch Ultraschall Die Ultraschall-Lyse der Bakterienzellen erfolgte mit Hilfe eines Branson Sonifier Cell Disruptors Modell W185. Die Bakterien wurden in Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren oder in 0,9% NaCl viermal 15 sec. lang beschallt. Dabei wurde die Zellsuspension durch Eis gekühlt. Zusätzlich lag zwischen den Impulsen jeweils eine Pause von einer Minute, um einer Erwärmung des Lysats vorzubeugen. 26 Material und Methoden 2.2.2.2 Proteinbestimmung Proteinbestimmungen wurden nach der Bradford-Methode [145] durchgeführt. Als Standard diente eine Rinderserumalbuminlösung der Firma Sigma mit einem Proteingehalt von 400 µg/ml oder 1 mg/ml. 2.2.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (SDS-Page) erfolgte nach der Methode von Lugtenberg et al. [108]. Als Standard für die Molekulargewichtsbestimmung diente eine 10 kDa-Proteinleiter der Firma Gibco BRL oder ein Gemisch der Firma Biorad mit folgenden Bestandteilen: Myosin (Kaninchen) 200 kDa, ßGalakto-sidase (E. coli) 116 kDa, Phosphorylase B (Kaninchen) 97,4 kDa, Rinderserumalbumin 66,2 kDa, Ovalbumin (Huhn) 45 kDa, Carboanhydrase (Rind) 31 kDa, Trypsininhibitor (Sojabohne) 21,5 kDa, Lysozym-Hühnereiweiß 14,4 kDa und Aprotinin (Rind) 6,5 kDa. 2.2.2.4 Western-Blotting Im Anschluß an die Auftrennung der Proteine durch SDS-Page wurden diese nach dem von Towbin et al. [153] beschriebenen Verfahren auf eine Nitrozellulosemembran der Firma Schleicher & Schüll übertragen. Zur Molekulargewichtsbestimmung diente hier der unter 2.2.2.3 beschriebene Protein-Molekulargewichtsstandard in biotinylierter Form. Bei der Entwicklung des Blots wurden die Proteine des Standards durch Zugabe eines Avidin-Meerrettich Peroxidase Konjugates detektiert und nach Zugabe des Substrates sichtbar. 2.2.2.5 Flagellenpräparation Die Abtrennung und partielle Reinigung der Flagellen von Helicobacter pylori und Campylobacter coli erfolgte nach der von Geis et al. [62] beschriebenen Methode. Die Bakterien wurden von Platten geerntet und nach mehrmaligem Waschen mit 0,9% NaCl in 0,01 M Tris-Puffer (pH 7,2) resuspendiert. Die Flagellen wurden mit Hilfe eines Sorvall-Omnimixers (5 Minuten, Stufe 5, Zellsuspension gekühlt auf 4 "C) mechanisch abgeschert. Durch Zentrifugation bei 5.000 U/min über 15 min wurden die Zellen sedimentiert. Die Anreicherung der Flagellenproteine aus dem Präparationsüberstand erfolgte durch Ultrazentrifugation (20.000 U/min, 30 min). 27 Material und Methoden 2.2.3 Überexpression der Flagellinmoleküle FlaA und FlaB von Helicobacter pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine Um die Flagellinmoleküle aus Helicobacter pylori in E. coli überexprimieren zu können, wurden die Flagellingene flaA und flaB in Expressionsvektoren des QIAexpress-Systems kloniert. Diese Vektoren ermöglichen es, rekombinante Proteine mit einem Anhang von sechs Histidinmolekülen herzustellen. Dieser 6xHisAffinitätskomplex bindet reversibel an Nickel-NTA-Agarose, so daß eine schnelle Reinigung der rekombinanten Proteine mit Hilfe entsprechender Agarose-Säulen erfolgen kann. Vor dem Polylinker der Vektoren befindet sich der lac-Promotor, dessen Aktivität durch den lac-Repressor unterbunden werden kann. Die zur Klonierung verwendeten E. coli Stämme M15 (pREP4) (kurz E. coli M15) und TG1 (lacI) synthetisieren beide den lac-Repressor. E. coli M15 ist durch das Plasmid pREP4 in der Lage den Repressor überzuexprimieren, wogegen die Repressormenge in TG1 eine geringfügige Expression des Proteins (sog. “leaky expression”) zuläßt. Große Mengen an Protein werden in beiden Stämmen gebildet, wenn die Proteinexpression durch Zugabe von IPTG induziert wird. Die Vektoren kodieren für eine Ampicillin-Resistenz, so daß eine Selektion von rekombinanten Klonen durch Verwendung von Kulturmedien mit Ampicillinzusatz erfolgen kann. Für beide Überexpressionsversuche wurden QIAexpress-Konstrukte vom Typ IV angefertigt, die Details der Konstruktion sind im Ergebnisteil erläutert. Um einen besonders starken Selektionsdruck und damit den Erhalt der Plasmide in den Zellen zu bewirken, wurde Ampicillin den Nährmedien in der doppelten Standardkonzentration zugesetzt. Zur Herstellung der rekombinanten Flagelline wuchsen die Bakterien in flüssigem LB-Medium bei 37"C bis zu einer OD 600 von ca. 0,6. Die Proteinexpression wurde dann durch Zugabe von 0,5 mM IPTG induziert. Nach anschließender vierstündiger Inkubation konnten die Zellen durch Zentrifugation abgeerntet werden. Der Aufschluß der Bakterien erfolgte mittels Ultraschallbehandlung in Lysepuffer mit Proteaseinhibitoren. Das Lysat wurde 15 min bei 4.000 U/min zentrifugiert, um die löslichen Zellbestandteile von der Membranfraktion zu trennen. Die Reinigung der Proteine erfolgte mit Hilfe der Nickel-NTA-Agarose in Form von Säulenchromatographie. Die Proben wurde in Puffer B resuspendiert und dann nach den Angaben des Herstellers behandelt (vgl. The QIAexpressionist 2nd edition Protokoll 7). Die gereinigten Proteine konnten in den Puffern D und E eluiert werden. Der pH-Wert 28 Material und Methoden der Proben wurde durch Titration mit 0,2 M NaOH in den neutralen Bereich gebracht. Zum Entsalzen der Probe wurde diese durch Zentrifugation in MikrosepsMikrokonzentratoren (Filtron, Northborough, Mass., USA; 4"C, 5000 x g) eingeengt und in leichtflüchtigem Puffer (50 mM Ammoniumhydrogencarbonatpuffer) resuspendiert. Dadurch konnten bei der anschließenden Gefriertrocknung die Salzrückstände minimiert werden. Alternativ wurden die Proteine in PBS resuspendiert. Die lyophilisierten Proben wurden bei -80ºC aufbewahrt. 2.2.4 Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen die rekombinanten Flagelline Die Immunisierung von Kaninchen gegen die rekombinanten Flagellinmoleküle wurde durch die Firma Eurogentec, Seraing, Belgien, vorgenommen. Um geeignete Tiere auswählen zu können, die noch keine Antikörper gegen H. pylori-Antigene hatten, wurden die Seren von 5 Kaninchen im Western-Blot untersucht. Zwei Proben enthielten keine oder nur unbedeutende Mengen an Antikörpern, die mit einem Lysat des Helicobacter-Stammes N6 reagierten. Beide Seren erkannten die gereinigten rekombinanten Flagellinuntereinheiten nicht. Die so ermittelten Tiere wurden durch intradermale Injektion der gereinigten Proteine zur Bildung von Antikörpern gegen je eines der Flagelline angeregt. Pro Immunisierungsschritt wurden 100 µg FlaA und 150 µg FlaB eingesetzt. Die Portionen lyophilisierter Antigene wurden in jeweils 500 µl PBS resuspendiert und mit 500 µl komplettem Freundschen Adjuvans versetzt. Boosterimpfungen erfolgten nach 14 und 38 Tagen. Nach insgesamt 64 Tagen wurden die Antiseren, anti-H. pylori-FlaA und anti-H. pylori-FlaB, gewonnen. 2.2.5 Methoden zur Charakterisierung der Mutanten von Helicobacter pylori und Campylobacter coli 2.2.5.1 Elektronenmikroskopie Zur Beurteilung des Phänotyps wurden die Mutanten unter einem Transmissionselektronenmikroskop Typ Zeiss EM900 bei 50 keV Beschleunigungsspannung untersucht. Als Objektträger dienten mit Formvar-Kohlenstoff beschichtete Kupfernetzchen (300 mesh, plano, Marburg). Bei der Herstellung der Präparate wurden die 29 Material und Methoden Bakterien direkt von hauchdünn bewachsenen Blutplatten abgenommen, indem die Kupfernetzchen mit ihrer unbeschichteten Seite auf die Kolonien gelegt wurden. Die einminütige Fixierung der Bakterien erfolgte mit 1% Glutaraldehyd, pH 7. Anschließend wurden die Präparate 30 Sekunden lang mit 1% Phosphorwolfram (pH 7, eingestellt mit KOH) negativkontrastiert. 2.2.5.2 Motilitätstests Als Medium für beide Arten von Motilitätstests diente Brucella-Bouillon mit 0,5% Bacto-Agar, dem 10% fetales Kälberserum zugesetzt wurde. Gutes Wachstum der Bakterien in diesem Medium konnte nur mit Zellen erreicht werden, die frisch passagiert, d.h. maximal 24 Stunden alt waren. Die Tests wurden in mikroaerophiler Atmosphäre 2-4 Tage lang bebrütet. Die Beurteilung der Motilität erfolgte durch Ausmessen der Schwärmhöfe oder durch direkte Beobachtung der beweglichen Zellen im Phasenkontrastmikroskop (Inversmikroskop) bei 400facher Vergrößerung. 2.2.5.2.1 Einstichtest Für den Einstichtest wurde der Motilitätsagar zu dünnen Platten gegossen. Das Einbringen der Bakterien erfolgte mit Hilfe einer Pipettenspitze, so daß mehrere punktförmige Inokulate auf einer Petrischale untergebracht werden konnten. 2.2.5.2.2 Einzelkoloniemorphologie Zur Beurteilung der Motilität einzelner Kolonien wurden geringe Bakterienmengen in das Medium eingegossen. Die Bakterien wurden dazu direkt von der Platte geerntet. Eine zum Eingießen geeignete Keimzahl konnte durch zweimaliges Verdünnen der Zellen erreicht werden. Dazu wurden ca. 108 Zellen in 10 ml 0,9% NaCl eingerieben und anschließend 1:1000 in NaCl verdünnt. Mit dieser Suspension konnte das auf ca. 40ºC abgekühlte Motilitätsmedium im Verhältnis 1:1000 beimpft werden. Der Agar wurde in Petrischalen mit 6 cm Durchmesser zu dünnen Platten gegossen. 30 Ergebnisse 3 Ergebnisse 3.1 Überexpression der Flagelline FlaA und FlaB von H. pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine Aus Helicobacter pylori lassen sich die Flagelline nur mit großem Aufwand und in geringen Mengen gewinnen. FlaA und FlaB werden in sehr unterschiedlichen Mengen exprimiert und sind nur schwer zu trennen. Eine effektive Reinigung der beiden Flagelline bedurfte daher eines Systems, in welchem sie separat und in großer Menge synthetisierbar waren. Mit Hilfe des QIAexpress-Systems konnte die genetische Information für die Flagelline von H. pylori in Form von Plasmid-DNS in E. coliStämme eingebracht und anschließend überexprimiert werden. Die Proteine waren säulenchromatographisch leicht zu reinigen, da sie durch einen Anhang aus 6 Histidinmolekülen (6xHis-Affinitätskomplex) reversibel an das Chromatographiematerial Nickel-NTA-Agarose binden konnten. Die mit Hilfe dieses Systems gewonnenen rekombinanten Flagellenproteine wurden zur Herstellung monospezifischer Antiseren verwendet. 3.1.1 Die Plasmide zur Überexpression der Flagelline Für dieses Projekt wurden Vektoren der pQE30-Serie des Expressionssystems gewählt. Die Vektoren dieser Serie unterscheiden sich nur im Leseraster des Polylinkers, die Restriktionskarten sind jedoch identisch. Wie alle Vektoren des QIAexpress-Systems kodieren sie für den 6xHis-Affinitätskomplex. Die Vektoren haben eine Größe von 3,4 kB und enthalten ein &-Lactamasegen, das Ampicillin-Resistenz verleiht. Sie enthalten als Promotor/Operator-Region den Promotor des E. coli-Phagen T5 sowie zwei Sequenzen des lac-Operons, den Promotor und das Regulatorgen lacI. Daher kann die Proteinsynthese durch Zugabe von IPTG induziert werden. Bei den pQE30-Vektoren liegen die Kodons für den 6xHis-Affinitätskomplex vom Polylinker aus in 5`-Richtung. Diese sogenannten Typ IV Konstrukte plazieren die 6 Histidinmoleküle an den NTerminus der rekombinanten Proteine (vgl. Abbildung 4). 31 Ergebnisse 3.1.1.1 Konstruktion der Plasmide pSUS130 und pSUS131 Leying et al. [105] war es trotz verschiedener Versuchsansätze nicht gelungen, das gesamte flaA-Gen, sondern nur dessen 3´-Hälfte in E. coli zu exprimieren. Daher wurde auch im vorliegenden Projekt ein Teilstück des Gens verwendet. Die Sequenz des gesamten, 1,5 kB großen, flaA-Gens aus H. p. 898-1 liegt in einem 3,8 kB großen Insert auf dem Plasmid pHL319-2-4 vor. Aus diesem Insert wurde durch Restriktion mit BamHI und SphI ein 1,5 kB großes Fragment ausgeschnitten. Der DNS-Abschnitt enthält die C-terminale Hälfte des flaA-Gens (763 Nukleotide) und kodiert für ein 28 kDa großes Protein. Die übrigen 750 Nukleotide des Inserts liegen stromabwärts des flaA-Gens. Darin sind ein Stopkodon und ein rho-unabhängiges Transkriptionsstopsignal enthalten, so daß die Proteinexpression durch die zusätzlichen Sequenzen nicht beeinträchtigt wurde. Das 1,5 kB große Fragment wurde gereinigt. Die Vektoren pQE31 und pQE32 wurden ebenfalls mit BamHI und SphI geschnitten, gereinigt und mit dem Fragment ligiert, das auf diese Weise direktional kloniert werden konnte. Der Vektor pQE32 und das 1,5 kB große Insert bilden das Plasmid pSUS130. Dieses Konstrukt ermöglicht die Transkription des flaA-Gens durch Einhaltung des Leserasters. Das Plasmid pSUS131, dem der Vektor pQE31 zu Grunde liegt, läßt dagegen nicht zu, daß das Gen im korrekten Leserahmen transkribiert wird und diente daher als Negativkontrolle. 3.1.1.2 Konstruktion des Plasmids pSUS120 Die Sequenz der zweiten H. pylori-Flagellinuntereinheit FlaB wurde in ganzer Länge kloniert. Ein geeignetes Fragment konnte durch PCR-Amplifizierung des flaB-Gens hergestellt werden. Als Matrize diente das Plasmid pSUS19, welches die flaB-Sequenz des H. pylori-Stammes 85P enthält. Durch Verwendung der Primer OLHPFlaB-20 und OLHPFlaB-21 wurde so ein 1,5 kB großes DNS-Stück erzeugt. Dieses trägt an seinem 5`-Ende eine BamHI-, am 3`-Ende eine KpnI- Schnittstelle. Das Fragment kodiert für ein Protein von 54 kDa. Nach Restriktion des PCR-Produktes und des Vektors pQE31 mit den genannten Endonukleasen und Reinigung der Ligationspartner, konnte das flaBGen direktional in den Vektor ligiert werden. Das Leseraster des Gens wurde gewahrt. 32 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5,0 kB 4,0 kB 3,0 kB 2,0 kB 1,5 kB 1,0 kB - 0,5 kB - Abbildung 4: Die Plasmide zur Überexpression der rekombinanten Flagelline '( oben: Konstruktion der Plasmide pSUS120, 130 und 131 mit Darstellung der Restriktionskarten der Plasmide pSUS19 und pHL319-2-4 sowie einem Schema des Aufbaus der Vektoren der Serie pQE30. Die farbigen Pfeile kennzeichnen Leserichtung und Position der klonierten DNS-Fragmente. Die Klonierung in den Polylinker der Vektoren wird durch die Verbindungslinien angezeigt. '( unten: Restriktionsanalyse der Plasmide pSUS120 und pSUS130: Spur 1 u. 10: 1kB-Standard; Spur 26: pSUS120, Spur 2: ungeschnitten, Spur 3: BamHI-KpnI, Spur 4: HindIII, Spur 5: SphI, Spur: 6 SacI, Spur 7-9: pSUS130, Spur 7: ungeschnitten, Spur 8: BamHI-SphI, Spur 9: HindIII. 33 Ergebnisse 3.1.2 Überexpression und Detektion der rekombinanten Proteine Zur Überexpression der rekombinanten Proteine wurden die Plasmide pSUS120 und pSUS130 sowie die Negativkontrolle pSUS131 in die E. coli-Stämme TG1 und M15 transformiert. Nach Anzucht der Bakterien wurde die Proteinsynthese durch die Zugabe von IPTG induziert. Verschiedene IPTG-Konzentrationen zwischen 0,2 und 1 mM wirkten sich nicht wesentlich auf die entstehende Proteinmenge aus. Die induzierten Kulturen wurden nach 4 Stunden durch Zentrifugation geerntet. Nach der Lyse der Bakterien durch Ultraschallbehandlung wurden die Membranfraktion und die löslichen Bestandteile in der SDS-PAGE aufgetrennt und auf ihren Gehalt an rekombinantem Protein untersucht. Alle Membranfraktionen, mit Ausnahme der Negativkontrolle, enthielten die überexprimierten Proteine der erwarteten Größe von 28 bzw. 54 kDa. Außerdem fielen zwei weitere Proteine auf. In der Membranfraktion des Lysats von M15 pSUS130 war zusätzlich ein Protein von 26 kDa, in der Membranfraktion von M15 pSUS120 ein 110 kDa Protein enthalten (siehe Abbildung 5). Um die Proteine von 28 und 54 kDa als die gewünschten Flagellinuntereinheiten zu identifizieren, wurden sie im Western-Blot untersucht. Das gegen native Flagelline von H. p. gerichtete Antiserum AK179 erkannte beide Proteine. Mit Hilfe eines anti-Histidin-Serums gelang außerdem der Nachweis des 6xHis-Affinitätskomplexs an den überexprimierten Proteinen. Das 26 kDa große Protein aus dem FlaA-Pellet wurde von keinem der beiden Antiseren detektiert. Im Gegensatz dazu reagierten beide Antiseren mit dem 110 kDa Protein, welches in der Membranfraktion von M15 pSUS120 enthalten war (vgl. 3.1.3.1 und Abbildung 5). Es fanden sich keine Unterschiede in der Proteinexpression zwischen den Klonen der Stämme M15 oder TG1. Die weiteren Untersuchungen erfolgten mit Klonen von M15. 3.1.3 Reinigung der rekombinanten Flagellinmoleküle Zur Reinigung der überexprimierten Flagellinuntereinheiten aus den Membranfraktionen wurde zunächst eine Reinigung in nativer Form versucht (Protokoll 5 des Handbuchs The Qiaexpressionist). Auf diese Weise gelang es nicht, die rekombinanten Flagelline zu gewinnen. Daher erfolgte die Reinigung unter denaturierenden Bedingungen, die durch Zusatz von 8 M Harnstoff zu allen verwendeten Puffern erzeugt wurden. Diese Methode basiert auf Protokoll 7 des 34 Ergebnisse Handbuchs, wurde aber in den ersten Schritten leicht modifiziert. Zur Elution der Proteine diente ein pH-Gradient, da durch Protonierung der Histidin-Reste deren Bindung von der Matrix gelöst werden kann. Auf diese Weise war es möglich aus 100 ml Bakterienkultur ca. 3 mg Protein in 3 ml denaturierendem Puffer herzustellen. Für die weitere Verarbeitung der Proben mußte der pH-Wert des Eluats durch Titration mit NaOH auf einen neutralen Wert angehoben werden, um dem Abbau der Proteine durch saure Hydrolyse vorzubeugen. Nach dem Einkonzentrieren der Proben mittels Zentrifugation in Microseps-Microkonzentratoren konnten die Proteine in Puffer ohne denaturierende Agenzien aufgenommen werden. Die gereinigten Proteine wurden abschließend lyophilisiert. 3.1.3.1 Untersuchung der gereinigten Proteine Die gereinigten Flagellinuntereinheiten wurden in der SDS-PAGE und durch WesternBlots analysiert (siehe Abbildung 5). Das Protein von 28 kDa wurde spezifisch von der Säule eluiert und lag in einem hohen Reinheitsgrad vor. Im Western-Blot banden die Antiseren gegen Histidin und native Flagellen an dieses Protein, so daß es sich bei dem überexprimierten und gereinigten Protein um den klonierten Teil des FlaA-Moleküls von H. pylori handelte. Die Reinigung der FlaB-Untereinheit lieferte ein abweichendes Ergebnis. Das Protein lag nicht allein im Eluat vor. Das 54 kDa Flagellin und ein 110 kDa Protein waren zwar Hauptbestandteile des Eluats, doch ließen sich außerdem Proteine unterschiedlicher Größen nachweisen. Alle zusätzlichen Proteine wurden in der Blotanalyse von den beiden Antiseren erkannt. Das Protein von 110 kDa ist vermutlich ein Dimer des FlaB. Die zusätzlichen Banden zeigen Fragmente des Dimers und des monomeren FlaB-Moleküls. 35 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 - - 110 kDa Protein - - FlaB 54 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa FlaA-Teilprotein 28 kDa 20 kDa - Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 - 110 kDa - FlaB 54 kDa FlaA-Teilprotein 24 kDa Abbildung 5: Überexpression, Reinigung und Detektion der rekombinanten Flagelline '( oben: SDS-PAGE zur Dokumentation der Lokalisation der überexprimierten Flagellinuntereinheiten in den Membranfraktionen vor der Reinigung und Analyse der Eluate der denaturierenden Reinigung: Spur 1 und 5: 10 kDa-Proteinleiter von Gibco BRL als Standard zur Molekulargewichtsbestimmung. Überexpression und Reinigung des 28 kDa FlaA-Teilproteins (Spur 2-4); Spur 2 zeigt den Überstand, Spur 3 die Membranfraktion des Lysats von M15 pSUS130. Das überexprimierte FlaA-Teilprotein ist nahezu vollständig in der Membranfraktion lokalisiert. Spur 4 zeigt das hochreine FlaA-Teilprotein im Eluat. Überexpression und Reinigung des 54 kDa FlaB (Spur 6-8); Spur 6 zeigt den Überstand, Spur 7 die Membranfraktion des Lysats von M15 pSUS120. Analog zum FlaA-Teilprotein ist das überexprimierte FlaB in der Membranfraktion enthalten. Auffällig ist ein weiteres Protein von 110 kDa. Spur 8 zeigt eine Probe des Eluats. Das rekombinante FlaB liegt nicht allein im Eluat vor. '( unten: Western-Blot-Analyse der Überstände, Membranfraktionen und Eluate: Spur 1-6 entwickelt mit dem gegen native Flagellen gerichteten Antiserum AK179 (1:500). Spur 1-3: Überstand und Membranfraktion vor sowie Eluat der Reinigung des 28 kDa FlaA-Teilproteins, Spur 4-6: Überstand und Membranfraktion vor sowie Eluat der Reinigung des 54 kDa FlaB. Spur 7-10 entwickelt mit einem gegen den 6xHis-Affinitätskomplex gerichteten Antiserum (1:1000). Spur 7 u. 8: Membranfraktion und Eluat der FlaA-Teilprotein Proben, Spur 9 u. 10: Membranfraktion und Eluat der FlaB-Proben. Alle Proteine werden von dem Antiserum gegen den 6xHisAffinitätskomplex wesentlich stärker erkannt. Als Zweitantikörper diente ein Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin (1:2000). 36 Ergebnisse 3.1.4 Herstellung spezifischer Antiseren gegen die rekombinanten Flagelline Zur Herstellung spezifischer Antiseren gegen die rekombinanten H. pylori-Flagelline wurden Kaninchen mit den gereinigten Proteinen immunisiert. Zuvor war durch Western-Blot-Untersuchungen sichergestellt worden, daß die Seren vor der Immunisierung keine Antikörper gegen H. pylori-Antigene enthielten.Die Seren wurden im Western-Blot untersucht (siehe Abbildung 6). Hier zeigte sich ein hoher Gehalt an Antikörpern gegen die gereinigten Proteine, es war jedoch eine relativ starke Kreuzreaktion mit dem jeweils anderen Flagellin nachweisbar. Es sollte daher versucht werden, durch Präabsorption den Anteil der kreuzreagierenden Immunglobuline zu verringern. Dazu wurden Acetonextrakte von Flagellinmutanten verwendet, bei denen jeweils ein Flagellingen durch gezielte Mutagenese ausgeschaltet war. Trotz dieser Maßnahme behielten die Seren die Eigenschaft an beide Flagelline zu binden bei. Spur FlaB 54 kDa ---FlaA 53 kDa ...... 1 2 3 4 --- FlaB 54 kDa FlaA 53 kDa ...... Abbildung 6: Western-Blot-Untersuchung zur Demonstration der kreuzreagierenden Antiseren gegen die rekombinanten Flagelline Spur 1-4 angereinigte Filamente des H. p.-Wildstammes N6. Als Zweitantikörper diente ein Ziege-anti-Kaninchen-Antiserum (1:2000). Erstantikörper: Spur 1: anti-H. p. FlaA (1:800), Spur 2: anti-H. p. FlaA (1.400) nach Präabsorption mit einem Acetonextrakt der H. p. flaA-Mutante. Spur 3: anti-H. p. FlaB (1:800), Spur 4: anti-H. p. FlaB (1:400) nach Präabsorption mit einem Acetonextrakt der H. p. flaB-Mutante. Es zeigt sich eine deutliche Spezifität der Seren für das jeweilige Flagellin, die Sensitivität wird jedoch durch die Kreuzreaktion stark herabgesetzt und ist auch durch Präabsorption nicht wesentlich zu verbessern. 37 Ergebnisse 3.2 Expression der Flagelline von Helicobacter pylori in Campylobacter coli Die Gattungen Helicobacter und Campylobacter sind eng verwandt. Eine wichtige Gemeinsamkeit ist der Aufbau der Flagellen aus zwei Untereinheiten, FlaA und FlaB. Flagellin-negative Campylobacter-Mutanten zeigen die gleichen morphologischen Veränderungen wie die entsprechenden Helicobacter-Stämme. Ein wichtiger Unterschied zwischen den beiden Gattungen betrifft die Flagellenhülle, die bei Helicobacter regelmäßig vorhanden ist, bei Campylobacter aber fehlt. Flagellin-negative Mutanten von Campylobacter coli VC167 wurden unserer Arbeitsgruppe freundlicherweise von Dr. Patricia Guerry zur Verfügung gestellt (siehe Tabelle 3). In diese Mutanten sollten die H. pylori-Flagellingene mit ihren eigenen Promotoren eingeschleust werden. Es sollte untersucht werden, ob die fremden Flagelline in C. coli exprimiert werden. Als Werkzeug zur Übertragung der genetischen Information stand der E. coli-Campylobacter coli-Shuttle-Vektor pUOA18 zur Verfügung. Dieser 7,4 kB große Vektor kodiert für eine Chloramphenicol-Resistenz und enthält die oriT-Sequenz, wodurch eine Weitergabe des Vektors durch Konjugation möglich wird. 3.2.1 Herstellung des flaB-Shuttle-Plasmids pSUS43 Wie schon bei der Konstruktion der Überexpressionsvektoren beschrieben, liegt die flaB- Sequenz aus H. pylori 85P auf dem Plasmid pSUS19 vor. Für die Konjugationsexperimente wurde durch Restriktion mit BamHI und ClaI ein Fragment von 3,5 kB ausgeschnitten. Neben der gesamten flaB-Sequenz in Form eines offenen Leserahmens von 1542 Basenpaaren, enthält das Fragment oberhalb des Gens eine Shine-DalgarnoBox und einen !54-Promotor. Im 3’-flankierenden Bereich befindet sich ein Transkriptionsterminator. Das Gen kodiert für ein Protein von 53,9 kDa. Der ShuttleVektor pUOA18 wurde mit BamHI linearisiert. Da die ClaI-Schnittstelle des flaBFragments und die BamHI-Schnittstelle des Vektors nicht kompatibel sind, wurden die Enden der Restriktionsstellen für beide Ligationspartner so mit Nukleotiden aufgefüllt, daß glatte Enden entstanden. Anschließend konnte das Fragment mit dem Vektor ligiert und in den E. coli -Stamm MC1061 transformiert werden (siehe Abbildung 7). 38 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5,0 kB 4,0 kB 3,0 kB 2,0 kB 1,5 kB 1,0 kB 0,5 kB - Abbildung 7: Die Shuttle-Plasmide pSUS43 und pSUS44 '( oben: Lineare Restriktionskarten der Shuttle-Plasmide pSUS43 und pSUS44. Das Plasmid pSUS43 enthält das flaB-Gen von H. pylori im Vektor pUOA18, pSUS44 enthält das flaA-Gen von H. pylori im Vektor pUOA18. Es sind nur die klonierten Fragmente dargestellt. Die Position der Flagellingene sowie die Leserichtung ist durch farbige Pfeile angezeigt. Schnittstellen, die nach der Konjugation nicht mehr zugänglich waren, sind durch Sternchen gekennzeichnet. '( unten: Überprüfung des Genotyps der durch Konjugation erzeugten Stämme anhand von Restriktionsanalysen des Vektors pUOA18 und der Shuttle-Plasmide pSUS43 und pSUS44. Spur 1: 1kB-Standard; Spur 2- 3: Restriktionen des Vektors pUOA18, Spur 2: PstI, Spur: 3 SacI, Spur 4-7: Analyse des Plasmids pSUS43, Spur 4: ungeschnitten, Spur 5: PstI, Spur 6: SacI, Spur 7: BamHI; Spur 810: Analyse des Plasmids pSUS44, Spur 8: ungeschnitten, Spur 9: PstI, Spur 10: BamHI. Der Vektor und die Plasmide in den durch Konjugation erzeugten Stämmen wiesen keine Rekombinationen auf. 39 Ergebnisse 3.2.2 Herstellung des flaA-Shuttle-Plasmids pSUS44 Zur Klonierung der flaA-Sequenz wurde das 3,8 kB große Insert des Plasmids pHL3192-4 verwendet, welches durch Restriktion mit BglII und SphI entsteht. Analog zum Aufbau des flaB-Fragments trägt dieser DNS-Abschnitt zusätzlich zu der Gensequenz aus H. pylori 898-1 (offener Leserahmen von 1530 Nukleotiden) im 5’-flankierenden Bereich eine Shine-Dalgarno-Box sowie einen !28-Promotor. Stromabwärts des Gens befindet sich ein rho-unabhängiger Transkriptionsterminator. Das Genprodukt ist das 53,2 kDa große FlaA. Der Vektor pUOA18 wurde für die Herstellung des Plasmids pSUS44 mit BamHI geschnitten. Um die ungleichen Enden der Ligationspartner anzupassen, wurden glatte Enden hergestellt. Nach der Ligation erfolgte die Transformation des E. coli-Stammes MC1061 mit dem Plasmid (siehe Abbildung 7). 3.2.3 Übertragung der Shuttle-Vektoren von E. coli nach Campylobacter coli durch Konjugation Um den Weg der Konjugation für die Einschleusung der Plasmide in die Campylobacter-Mutanten zu nutzen, mußten die Plasmide pUOA18, pSUS43 und pSUS44 in einen geeigneten E. coli-Stamm eingebracht werden. Dazu wurde zuerst das Helferplasmid pJB3, welches die tra-Gene enthält und damit die genetische Grundlage für den Konjugationsvorgang liefert, nach E. coli HB101 transformiert. Dieses Plasmid kodiert auch für eine Tetrazyklin-Resistenz, so daß die Selektion Plasmid-tragender Zellen auf entsprechenden Nährböden möglich war. Im nächsten Schritt erfolgte die Transformation der Shuttle-Vektoren pUOA18, pSUS43 und pSUS44. Sie konnten durch Minipräparation und Restriktionsanalysen in den Bakterien nachgewiesen werden, denen sie außerdem eine Chloramphenicol-Resistenz verliehen. Für die Konjugationsexperimente wurden diese mit den Campylobacter-Empfängerstämmen (resistent gegen Kanamycin) vereinigt und zunächst für fünf Stunden auf Nährböden ohne Antibiotika bebrütet. Zur Selektion derjenigen Stämme, welche die ShuttlePlasmide aufgenommen hatten, wurde das Zellgemisch auf Nährböden mit Kanamycin und Chloramphenicol übertragen. Sowohl die E. coli-, als auch jene CampylobacterZellen, die keine Plasmide aufgenommen hatten, waren nicht resistent gegen die verwendete Antibiotika-Kombination. Bei den entstandenen Kolonien mußte es sich daher um C. coli handeln, welche die Shuttle-Plasmide enthielten (siehe Abbildung 8). 40 Ergebnisse E. coli HB101[pJB3] resistent gegen Tetrazyklin E. coli HB101[pJB3] resistent gegen Tetrazyklin und Chloramphenicol Die Plasmide pUOA18, pSUS43 und pSUS44 enthalten die oriT-Sequenz. Sie können durch Konjugation als Einzelstrang-DNS weitergegeben werden. In der Empfängerzelle wird durch Synthese des komplementären Stranges das Plasmid wieder vollständig hergestellt. Abbildung 8: Schematische Darstellung der Konjugationsexperimente zur Übertragung der Shuttle-Plasmide pUOA18, pSUS43 und pSUS44 von E. coli nach Campylobacter coli 41 Ergebnisse Biochemische Merkmale charakterisierten die Zellen eindeutig als Campylobacter. Durch Reinigung der Plasmid-DNS und anschließende Restriktionsanalysen konnte der Erfolg der Konjugation bestätigt werden. Die Plasmide in den durch Konjugation erzeugten und isolierten Stämmen zeigten keine Rekombinationen und entsprachen den beschriebenen Ausgangsplasmiden pUOA18, pSUS43 und pSUS44 (vgl. Abbildung 7). 3.2.4 Charakterisierung der rekombinanten Campylobacter coli-Mutanten Durch die Konjugationsexperimente konnten sechs rekombinante C. coli-Stämme erzeugt werden (vgl. Tabelle 6). Als Kontrolle wurde in jeden der drei Flagellinnegativen Ausgangsstämme der Shuttle-Vektor pUOA18 übertragen. In die flaBMutante KX5 konnte das flaB-Shuttle-Plasmid pSUS43 eingebracht werden. Ebenso gelang es, das flaA-Plasmid pSUS44 in die flaA-Mutante KX15 einzuschleusen. In die Doppelmutante 656p2% konnte nur das Plasmid pSUS44 transformiert werden. Bei den Konjugationsexperimenten mit den Einfachmutanten KX5 und KX15 war die Ausbeute an Einzelkolonien hoch. Von etlichen isolierten Klonen wurden jeweils zwei weitergehend untersucht. Im Fall der Doppelmutante ist mit dem Vektor pUOA18 und dem Plasmid pSUS44 nur je ein Klon entstanden. Vielfaches Wiederholen der Konjugationsexperimente, sowohl mit dem Shuttle-Vektor als auch mit den Plasmiden, blieb ohne Erfolg. C. coli-Mutante Plasmid H. pylori-Flagellingen durch Konjugation erzeugter Stamm KX5 flaA+ flaB- pUOA18 pSUS 43 Vektor/ Negativkontrolle flaB KX5 (pUOA18) KX5 (pSUS43) KX15 flaA-flaB+ pUOA18 pSUS44 Vektor/Negativkontrolle flaA KX15 (pUOA18) KX15 (pSUS44) 656p2 flaA-flaB- pUOA18 pSUS44 Vektor/Negativkontrolle flaA 656p2 (pUOA18) 656p2 (pSUS44) Tabelle 6: Die rekombinanten C. coli-Stämme. Durch die Konjugationsexperimente konnten sechs Stämme erzeugt werden. 42 Ergebnisse 3.2.4.1 Western-Blot Untersuchung Von den Ausgangsstämmen und den rekombinanten Mutanten wurden GesamtzellLysate hergestellt, die zunächst mit dem gegen native H. pylori-Flagelline gerichteten Antiserum AK179 untersucht wurden. Dabei konnten jedoch keine H. pylori-Flagellinbanden detektiert werden. Erst die Entwicklung mit den im Überexpressionsprojekt hergestellten Antiseren anti-H. pylori-FlaA und anti-H. pylori-FlaB zeigte bei allen Stämmen, die ein Shuttle-Plasmid enthielten, Proteine einer Größe von ca. 54 kDa, die mit hoher Wahrscheinlichkeit die Genprodukte der Helicobacter-Flagellingene waren. Weder in den Ausgangsstämmen noch in den Negativkontrollen, die nur den Vektor pUOA18 enthielten, konnten diese Proteine nachgewiesen werden (siehe Abbildung 9 und Abbildung 10). Das Antiserum anti-H. pylori-FlaB erkannte in den C. coli-Lysaten auch das rekombinante Helicobacter-Flagellin FlaA, das rekombinante FlaB wurde aber deutlich stärker erkannt. Dagegen detektierte das gegen den C-Terminus des H. pyloriFlaA gerichtete Antiserum nur das rekombinante FlaA. In Höhe der CampylobacterFlagelline von 60 kDa differenzierte das anti-H. pylori-FlaA Antiserum zwei relativ starke Banden, die in allen Stämmen erkannt wurden. Die Entwicklung mit dem anti-H. pylori-FlaB Antiserum zeigte ebenfalls in allen Stämmen ein Protein dieser Größe, so daß eine eindeutige Zuordnung der Campylobacter-Flagelline nicht möglich war. Um zu überprüfen, ob ein Export der rekombinanten Helicobacter-Flagelline aus den C. coli -Zellen stattfand, wurden Flagellenpräparationen angefertigt und ebenfalls mit den beiden Antiseren anti-H. pylori-FlaB und anti-H. pylori-FlaA untersucht. Hier zeigten beide Seren die Anreicherung einer Bande in Höhe von 60 kDa, bei der es sich vermutlich um C. coli -Flagellin handelte. Durch die Flagellenpräparation ließen sich bei KX5 (pSUS43) und KX15 (pSUS44) neben den Campylobacter-Flagellinen auch die Helicobacter-Flagelline anreichern. Wiederum fanden sich keine vergleichbaren Banden in den Negativkontrollen oder den Ausgangsstämmen (siehe Abbildung 10 unten). Ein Mengenvergleich zwischen eigenem und fremdem Flagellin zeigte eine sehr geringe Expression der rekombinanten H. pylori-Flagelline im Vergleich zu den C. coliFlagellinen. Ausgehend von den Synthesemengen in H. pylori fällt auf, daß sich kein signifikanter Unterschied der Syntheserate zwischen FlaA und FlaB feststellen ließ, von denen in H. pylori FlaA überwiegt. 43 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 97 kDa 66 kDa ::: 45 kDa - FlaB FlaA H. p. Flagelline 53 bzw. 54 kDa FlaA Abbildung 9: Western-Blot-Untersuchung der Lysate der Flagellin-negativen Mutanten von C. coli VC167 und der im Konjugationsexperimente erzeugten Stämme Der Blot wurde mit dem Antiserum anti-H. p.-FlaB (1:1000) entwickelt, als Zweitantiköper diente ein Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1:2000). Spur 1: Standard zur Molekulargewichtsbestimmung, Spur 2: KX5, Spur 3: KX5 (pUOA18), Spur 4: KX5 (pSUS43), Spur 5: KX15, Spur 6: KX15 (pUOA18), Spur 7 und 8: KX15 (pSUS44). Nur in den Lysaten der im Konjugationsexperiment erzeugten Stämme KX5 (pSUS43) und KX15 (pSUS44) detektiert anti-H. p-FlaB zusätzliche Proteine von ca. 54 kDa. Weder in den Ausgangsstämmen KX5 und KX15 noch in den Negativkontrollen KX5 (pUOA18) und KX15 (pUOA18) sind diese Proteine enthalten. Dabei handelt es sich um die rekombinanten H. pyloriFlagelline FlaB, in KX5 (pSUS43), und FlaA, in KX15 (pSUS44). Das gegen H. p.-FlaB gerichtete Antiserum erkennt auch FlaA, markiert FlaB aber deutlich stärker. Die unterschiedliche Bandenintensität ist daher nicht als Unterschied in der Syntheserate der rekombinanten Flagelline zu werten (vgl. Abbildung 10). 44 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 60 kDa 54 kDa - Spur 9 - 1 2 3 4 5 6 - H. p.-FlaA 7 116 kDa 97 kDa 66 kDa - C. c.-Flagellin 60 kDa - H. p.-FlaA 54 kDa 45 kDa - Abbildung 10: Western-Blot-Untersuchung der Lysate sowie einer Flagellenpräparation der Flagellin-negativen Mutanten von C. coli VC167 und der im Konjugationsexperiment erzeugten Stämme Beide Western-Blots wurden mit dem Antiserum anti-H. p.-FlaA (1:1000) entwickelt, als Zweitantiköper diente ein Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin (1:2000). '( oben: Western-Blot der Gesamtzell-Lysate. Molekulargewicht durch Markierung gekennzeichnet, Spur 1: KX5, Spur 2: KX5 (pUOA18), Spur 3: KX5 (pSUS43), Spur 4: KX15, Spur 5: KX15 (pUOA18), Spur 6 u. 7: KX15 (pSUS44), Spur 8: 656p2%, Spur 9: 656p2% (pSUS44). Das gegen H. p.-FlaA gerichtete Antiserum detektiert das H. pylori-FlaA von 54 kDa nur in den im Konjugationsexperiment erzeugten Stämmen KX15 (pSUS44) und 656p2% (pSUS44). Weder in den Ausgangsstämmen KX15 und 656p2% noch in der Negativkontrolle KX15 (pUOA18) ist das zusätzliche Protein vorhanden. Das anti-H. p.-FlaA Serum reagiert nicht mit dem rekombinanten H. p. -FlaB (vgl. Abbildung 9). '( unten: Western-Blot der Flagellenpräparationen der Stämme KX15 und KX15 (pSUS44). Spur 1: Molekulargewichtsstandard, Spur 2-4: KX15, Spur 2: angereicherte Flagellenproteine, Spur 3: Präparationsüberstand, Spur 4: Zellproteine nach Abscheren der Flagellen; Spur 5-7: KX15 (pSUS44), Spur 5: angereicherte Flagellenproteine, Spur 6: Präparationsüberstand, Spur 7: Zellproteine nach Abscheren der Flagellen. In beiden Präparationen ist eine deutliche Anreicherung eines Proteins von ca. 60 kDa zu erkennen, welches dem Campylobacter-Flagellin entspricht. In der Präparation des Stammes KX15 (pSUS44) wird zusätzlich das 54 kDa Helicobacter-Flagellin FlaA im Flagellenpellet angereichert. Anteile beider Flagelline sind auch im Präparationsüberstand enthalten. Das Zellpellet enthält in beiden Präparationen nur wenig Flagellin. 45 Ergebnisse 3.2.4.2 Motilitätstests Um zu prüfen, ob die rekombinanten Helicobacter-Flagelline Einfluß auf die Beweglichkeit der C. coli-Mutanten hatten, wurden diese zunächst im Einstichverfahren untersucht. Dabei zeigte die flaB-negative Mutante KX5 eine ausgeprägte Motilität. Die Doppelmutante 656p2% war unbeweglich. Die flaA-Mutante KX15 fiel durch einen großen Schwärmhof auf, was im starken Widerspruch zu der vorhandenen Mutation steht. Sie schien sogar besser beweglich als die flaB-Mutante. Die Bewegung der Zellen im Agar konnte auch direkt im Phasenkontrastmikroskop beobachtet werden, womit sich die makroskopischen Ergebnisse belegen ließen. KX15 wurde daraufhin auch im Eingießverfahren untersucht. Es zeigte sich hier eine Mischung von Kolonien mit fehlender bis starker Beweglichkeit. Die flaA-Mutante von C. coli, KX15, war instabil und produzierte in hohem Maße motile Varianten. Mit den durch Konjugation erzeugten Stämmen wurden ebenfalls Einstichtests durchgeführt. Die Stämme, die nachweislich die Helicobacter-Flagelline exprimierten, unterschieden sich dabei weder von den Ausgangsstämmen, noch von den Negativkontrollen, die nur den Vektor enthielten. Besonders auffallend war bei dem Stamm 656p2% (pSUS44) das unveränderte Fehlen der Motilität, trotz nachgewiesener Expression des Helicobacter-FlaA. Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß sich kein Einfluß der Expression von Helicobacter-Flagellinen auf die Beweglichkeit der CampylobacterZellen nachweisen ließ. 3.2.4.3 Elektronenmikroskopie Die elektronenmikroskopische Untersuchung der Mutanten bestätigte weitgehend die Ergebnisse der Motilitätstests. Die C. coli-Ausgangsmutante KX5, deren Flagellen nur aus FlaA bestehen, läßt sich phänotypisch nicht vom Wildtyp unterscheiden. Nach Aufnahme des Plasmids pSUS43 zeigten sich als einzige Auffälligkeit stäbchenartige Strukturen (vgl. Abbildung 11 und Abbildung 12). Nachdem deutlich geworden war, daß die C. coli-Mutante KX15 motile Varianten produzierte, die mit langen Flagellen ausgestattet waren, wurde von einer elektronenmikroskopischen Untersuchung dieser Organismen abgesehen. Bei dem einzigen transkonjuganten Klon der Doppelmutante 656p2% (pSUS44) fielen keine Änderungen zum Ausgangsstamm auf (Bilder nicht gezeigt). 46 Ergebnisse Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Bilder der Campylobacter coli-Mutante KX5 (flaA+flaB-) Lange bipolare Flagellen ohne Hülle kennzeichnen diese Mutante, die phänotypisch nicht vom Wildtyp zu unterscheiden ist. Die Länge der Markierung entspricht 1 µm. 47 Ergebnisse Abbildung 12: Elektronenmikroskopische Bilder der durch Konjugation erzeugte Mutante KX5 (pSUS43) Auffällig sind “gerade Stäbchen”, die an verlängerte flagelläre Bestandteile erinnern (Pfeil). Unteres Bild mit “Stäbchen”, das eventuell im Zytoplasma gelegen ist. Die Länge der Markierungen entspricht 1 µm. 48 Ergebnisse 3.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von Helicobacter pylori N6 Das FlbA-Protein ist ein Homolog der FlbF/LcrD-Proteinfamilie und stellt einen integralen Bestandteil der Zytoplasmamembran dar [134]. Das Protein erfüllt eine wichtige Regulatorfunktion im Bereich der Flagellenbiosynthese, was durch Untersuchungen an flbA-negativen Mutanten in unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden konnte. Die isogenen Mutanten entstanden durch Einbau einer Kanamycin-Resistenzkassette in das flbA-Gen. Bei diesen kommt es zu einer Unterbrechung der Transkription der Flagellingene flaA und flaB sowie zu einer Reduktion der flgE-Genexpression. Unter Verwendung eines neu entwickelten Vektors konnte das flbA-Gen in die isogene Mutante von H. pylori N6 eingebracht und exprimiert werden. Die Auswirkungen der Expression auf die Flagellinexpression wurden untersucht. 3.3.1 Konstruktion des Plasmids pSUS76 Die Grundlage dieses Plasmids bildet der 5,0 kB große Vektor pHel2, ein E. coli-H. pylori Shuttle-Vektor, der für Resistenz gegen Chloramphenicol kodiert. Zur Herstellung von pSUS76 wurde der Vektor durch Restriktion mit BamHI und KpnI linearisiert. Das flbA-Gen wurde unter Verwendung der Primer OLHPFlbA-30 und OLHPFlbA-31 von genomischer DNS des H. pylori Stammes 85P durch PCR amplifiziert. Dabei erhielt das 2,5 kB große Fragment am 5’-Ende eine BamHI-, am 3’Ende eine KpnI-Schnittstelle, wodurch die direktionale Ligation mit dem Vektor nach entsprechender Restriktion möglich wurde. Bei dieser Konstruktion sind die Leserichtungen des Gens und der cat-Kassette entgegengesetzt. Nach Transformation in E. coli MC1061 konnte die erfolgreiche Ligation durch Restriktionsanalysen bestätigt und eine Maxipräparation für die Elektroporation angefertigt werden. 49 Ergebnisse pSUS76 Abbildung 13: Lineare Restriktionskarte des Plasmids pSUS76 Das Plasmid pSUS76 enthält das flbA-Gen von H. pylori in dem E. coli-H. pylori Shuttle-Vektor pHel2. Es ist nur das klonierte PCR-Fragment dargestellt. Der Pfeil zeigt Position und Leserichtung des flbA-Gens. 3.3.2 Charakterisierung der durch Elektroporation erzeugten Klone Die Elektroporation der flbA-Mutante von H. pylori N6 mit dem Plasmid pSUS76 erwies sich als sehr effektiv. Aus einem Elektroporationsansatz resultierten ca. 350 Einzelkolonien. Die Mutanten waren resistent gegen Kanamycin und Chloramphenicol. Einzelkolonien wurden isoliert und untersucht. 3.3.2.1 Restriktionsanalysen der Plasmid-DNS Zunächst wurde die Plasmid-DNS von 5 Isolaten gereinigt und analysiert. In allen Fällen zeigte sich ein Restriktionsmuster, das deutlich von dem des Plasmids pSUS76 abwich. So ergab zum Beispiel die Restriktion mit SacI, welche aus pSUS76 das klonierte Fragment von 2,5 kB ausschneidet, ein Fragment von 3,8 kB Größe. Daraufhin wurden sowohl weitere Klone isoliert und untersucht, als auch erneute Elektroporationsversuche durchgeführt. Von ca. 30 untersuchten Plasmid-Präparationen aus verschiedenen Elektroporationsansätzen, zeigte nur das Material eines Klons in der SacI-Restriktion das 2,5 kB große Fragment. Auch bei Restriktionen mit anderen Enzymen erwies sich nur die Plasmid-DNS dieses Klons als mit dem Ausgangsplasmid pSUS76 identisch. Dieser Klon wurde N6 flbA- (pSUS76) genannt. Alle anderen untersuchten Klone zeigten ein abweichendes Restriktionsmuster. 50 Ergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 5,0 kB 4,0 kB 3,0 kB 2,0 kB 1,5 kB 1,0 kB 0,5 kB - Abbildung 14: Restriktionsanalyse des Plasmids pSUS76 vor und nach Elektroporation Spur 1 u. 11: 1 kB-Standard; Spur 2-4: pSUS76 vor Elektroporation, Spur 2: SacI, Spur 3: HindIII, Spur 4: BamHI-KpnI; Spur 5-7: pSUS76 nach Elektroporation, Plasmid-Präparation des einzigen Klons ohne Rekombination N6 flbA- (pSUS76), Spur 5: SacI, Spur 6: HindIII, Spur 7: ungeschnitten; Spur 8-10: pSUS76 nach Elektroporation durch Rekombination verändert, Spur 8: SacI, Spur 9: HindIII, Spur 10: ungeschnitten. 3.3.2.2 Western-Blot-Untersuchung In der Western-Blot-Untersuchung wurden Gesamtzell-Lysate von Isolaten, bei denen veränderte Plasmide nachgewiesen waren, und von N6 flbA- (pSUS76) mit Lysaten des Wildstammes N6 und der flbA-Mutante verglichen. Die Entwicklung der Blots erfolgte zunächst mit einem gegen den hydrophoben C-Terminus des FlbA-Proteins gerichteten Antiserum. Im Lysat des Wildstamms wurde das FlbA-Protein als schmale Bande in Höhe von 66 kDa erkannt. Diese Bande wurde weder bei der flbA-Mutante, noch bei einem derjenigen Elektroporationsklone detektiert, die veränderte Plasmide enthielten. Das Lysat von N6 flbA- (pSUS76) wies dagegen eine deutliche Bande bei 66 kDa auf. Die im Vergleich mit dem Wildtyp wesentlich stärkere Bande deutet darauf hin, daß durch das Einschleusen von mehreren Kopien des intakten flbA-Gens mit Hilfe des Shuttle-Plasmids in der Mutante nicht nur der Defekt komplementiert, sondern sogar eine Überexpression des FlbA-Proteins induziert wurde (vgl. Abbildung 15). 51 Ergebnisse Im Hinblick auf die Rolle des FlbA als Regulatorprotein der Flagellenbiosynthese wurden die gleichen Lysate mit dem gegen native H. pyloriFlagellen gerichteten Antiserum AK179 untersucht. Im Wildstamm N6 detektierte dieses die Flagelline FlaA und FlaB. In der flbA-Mutante fehlten diese Proteine. Im Lysat von N6 flbA- (pSUS76) ließen sich die Flagelline mit diesem Antiserum nachweisen. Damit konnte gezeigt werden, daß FlbA in N6 flbA- (pSUS76) nicht nur exprimiert wurde, sondern auch die Funktion als Transkriptionsregulator der Flagellinsynthese erfüllte (vgl. Abbildung 15). Spur 1 2 3 4 -- H. p.-FlbA ca. 66 kDa H. p.- -Flagelline 53 u. 54 kDa 5 6 7 - - 200 kDa - - 116 kDa - 97 kDa - - 66 kDa - 45 kDa Abbildung 15: Western-Blot-Untersuchung von Lysaten des Wildstammes N6, der flbA-Mutante von N6 sowie des Elektroporationsklons mit intaktem Plasmid pSUS76 '( links: Western-Blot-Untersuchung der Gesamtzell-Lysate mit dem gegen den hydrophoben C-Terminus des FlbAProteins gerichteten Antiserum (1:1000). Spur 1: N6, Spur 2: N6 flbA-, Spur 3: N6 flbA- (pSUS 76). Das mature FlbA-Protein von 66 kDa des H. pylori-Stammes N6 wird als dünne Bande erkannt. Es fehlt im Lysat der flbAMutante. Nach Aufnahme des intakten Plasmids pSUS76 ist das FlbA-Protein auch in der Mutante nachweisbar. Dabei deutet die im Vergleich zum Wildtyp deutlich stärkere Bande auf eine Überexpression des Proteins hin. '( rechts: Western-Blot-Untersuchung der Gesamtzell-Lysate mit dem gegen native Flagellen gerichteten Antiserum AK179 (1:2000). Spur 4: N6, Spur 5: N6 flbA-, Spur 6: N6 flbA- (pSUS76), Spur 7: Standard zur Bestimmung des Molekulargewichts. Die Flagelline mit einer Größe von ca. 54 kDa werden im Wildtyp als deutliche Bande detektiert. Sie sind in der flbA-Mutante nicht vorhanden. Nach Aufnahme des intakten Plasmids pSUS76 in die Mutante lassen sich die Flagellenproteine als gut sichtbare Bande nachweisen. Die Menge der Flagelline in der Mutante entspricht dabei der Menge im Wildtyp. 52 Ergebnisse 3.3.2.3 Elektronenmikroskopie Elektronenmikroskopische Präparate wurden von H. pylori N6 und dessen flbA-Mutante sowie von zwei Klonen angefertigt. Der Wildtyp zeigt die für H. pylori charakteristische Flagellierung mit einem unipolaren Flagellenbündel, Flagellenhüllen und Endbläschen. Der flbA-Mutante sowie dem Elektroporationsklon mit verändertem Plasmid fehlten diese Kennzeichen. Das Präparat des Stammes N6 flbA- (pSUS76) nach erfolgreicher Komplementation dagegen wies alle Merkmale des intakten Flagellenapparates auf. Zusätzlich sichtbar waren zahlreiche bläschen- oder paddelförmige Strukturen an der Außenseite der Zellen . Abbildung 16: Elektronenmikroskopisches Bild des H. pylori Wildtyps N6 Charakteristisch für den Wildtyp ist ein Bündel aus 4-6 Flagellen, die von Hüllen umgeben sind, welche sind am Ende bläschenförmig erweitern. Die Länge der Markierung entspricht 1 µm. 53 Ergebnisse oben Abbildung 17: Elektronenmikroskopisches Bild der flbA-Mutante von H. p. N6 Die Mutante zeichnet sich morphologisch durch das Fehlen der Flagellen aus. unten Abbildung 18: Elektronenmikroskopisches Bild des Stammes N6 flbA- (pSUS76) Nach erfolgreicher Komplementation sind die charakteristischen Flagellen mitsamt der Hüllen und Endbläschen wieder vorhanden. Daneben fallen zahlreiche bläschen- oder paddelförmige Strukturen an der Zellaußenseite auf. Die Länge der Markierungen entspricht 1 µm. 54 Ergebnisse Abbildung 19: Elektronenmikroskopisches Bild des Stammes N6 flbA- (pSUS76) Hier treten die zahlreichen bläschenförmigen Ausläufer an der Zellaußenseite gut sichtbar hervor. Die Länge der Markierung entspricht 1 µm. 55 Diskussion 4 Diskussion Zu den ersten Strukturen von H. pylori, deren molekularer Aufbau detailliert untersucht wurde, gehörten die Flagellen [62]. Kostrzynska et al. wiesen 1991 erstmals das Vorhandensein zwei verschiedener Flagellinuntereinheiten nach [92]. Leying et al. klonierten wenig später das flaA-Flagellingen [105]. Suerbaum et al. gelang 1993 die Klonierung des flaB-Gens [148]. Mittlerweile ist nicht nur der Einfluß der Motilität auf die Pathogenese der Infektion mit H. pylori nachhaltig bestätigt worden [50], sondern auch die Bedeutung der komplexen Organisation des Filaments aus zwei Flagellinen [87]. 4.1 Überexpression der Flagelline FlaA und FlaB von Helicobacter pylori in E. coli und Reinigung der rekombinanten Proteine Bei der Reinigung der H. pylori-Flagelline, wie sie z. B. durch Geis et al. [62] und Kostrzynska et al. [92] erfolgte, wurden zunächst beide Flagellinuntereinheiten gemeinsam aus nativen Flagellen gereinigt und erst in einem letzten Schritt voneinander getrennt. Auf diese Weise konnten hochreine Proben der Flagelline hergestellt werden. Die Proteinmengen waren allerdings sehr gering und es überwog der Anteil des Hauptflagellins FlaA [92]. Durch die Anwendung des QIAexpress-Systems zur getrennten Überexpression der H. pylori-Flagelline in E. coli konnten erstmalig rekombinante Flagelline von H. pylori separat in großer Menge hergestellt und anschließend in wenigen Schritten gereinigt werden. Leying et al. [105] haben gezeigt, daß es nicht möglich ist, das gesamte FlaA von H. pylori in E. coli zu exprimieren. Mögliche Ursachen sind Probleme auf Translationsebene z. B. durch toxische Effekte oder fundamentale Unterschiede im Kodongebrauch der Bakterien. Unter Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurde auch in der vorliegenden Arbeit die 3´-Hälfte des flaA-Gens exprimiert, die für ein 28 kDa Fragment des FlaA kodiert. Dieses Protein ließ sich ohne Schwierigkeiten in den E. coli–Stämmen TG1 und M15 überexprimieren. Das zweite Flagellin FlaB wurde komplett überexprimiert. Warum FlaB komplett in E. coli überexprimiert werden kann, nicht aber FlaA, bleibt unklar. Die Flagellingene flaA und flaB von H. pylori weisen deutliche Unterschiede auf (vgl.1.3.2), die sich scheinbar maßgeblich auf die Expression in E. coli auswirken. Das FlaA von Campylobacter coli ist dem H. pylori56 Diskussion Protein nah verwandt. Auch dieses läßt sich nach Berichten von Logan et al. [107] nicht in E. coli exprimieren. Die Plasmide pSUS130 und pSUS131, welche die 3´-Hälfte des flaA-Gens enthalten, erwiesen sich ebenso wie pSUS120, welches das gesamte flaB-Gen umfaßt, als stabil in E. coli. Mit Hilfe dieser Plasmide gelang es problemlos, große Mengen rekombinanter H. pylori-Flagelline in E. coli zu exprimieren. Um die rekombinanten Proteine aus den E. coli-Zellen zu gewinnen, wurden die Bakterien durch Ultraschallbehandlung lysiert und das Lysat mittels Zentrifugation aufgetrennt. Danach ließen sich die Flagelline nicht, wie erwartet, in der löslichen Fraktion nachweisen, sondern sedimentierten mit den Membranbestandteilen. Als Ursache ist die Bildung von sog. Einschlußkörperchen wahrscheinlich. Einschlußkörperchen können bei der Überexpression von Proteinen, die in physiologischen Mengen löslich sind, infolge der großen Mengen an rekombinanten Proteinen entstehen [112]. Mit dem QIAexpress System konnten die rekombinanten Flagelline nicht unter nativen Bedingungen gereinigt werden, da nur ein geringer Teil der Proteine an die Nickel-NTA-Agarose band. Ursache hierfür könnte sein, daß durch die Tertiärstruktur der Proteine der 6xHis-Affinitätskomplex verdeckt war und daher für die Bindung an die Agarose nicht zur Verfügung stand. Denkbar ist auch ein Verlust des Komplexes durch enzymatischen Abbau. Für die Reinigung wurden daher denaturierende Bedingungen gewählt, wodurch sowohl die Ausbildung der Tertiärstruktur, als auch ein enzymatischer Abbau verhindert werden sollte. Auf diese Weise war es möglich, aus 100 ml Bakterienkultur ca. 3 mg Protein zu reinigen. Bei der Detektion des rekombinanten FlaB fiel ein 110 kDa Protein auf, bei dem es sich vermutlich um ein Dimer des Flagellins handelt. Die starke Neigung zur Polymerisation ist eine der wesentlichen Eigenschaften der Flagelline [164], die trotz der gewählten denaturierenden Bedingungen nicht vollständig aufgehoben war. Das Dimer vermochte ebenfalls spezifisch an die Säule zu binden und wurde mit dem FlaBMonomer eluiert. Es wurde sowohl durch das gegen native Flagellen gerichtete Antiserum AK 179, als auch von dem Antiserum gegen den 6xHis-Affinitätskomplex detektiert. Analog zu diesem blieben etliche Proteine unterschiedlicher Größe nachweisbar. Es handelt sich wahrscheinlich um Fragmente des Dimers und des Monomers, da sie ebenfalls gereinigt und von beiden Antiseren detektiert wurden. 57 Diskussion Es wurde versucht, die rekombinanten H. pylori-Flagelline für serologische Tests in Form von Elisas (Enzyme linked immunosorbent assay) einzusetzen (Daten nicht gezeigt). Dabei ließen sich keine signifikanten Unterschiede im Antikörpertiter zwischen Seren von H. pylori-Infizierten und Gesunden nachweisen. Mögliche Ursachen sind eine ungenügende Bindung der rekombinanten Flagelline an die Reaktionsgefäße, Instabilität der Proteine unter den gewählten Reaktionsbedingungen oder eine möglicherweise veränderte Antigenität der rekombinanten Proteine. Die rekombinanten Flagelline wurden zur Herstellung monospezifischer Antiseren eingesetzt. Durch die Teilexpression des FlaA und auf Grund der denaturierenden Reinigungsbedingungen haben die rekombinanten Flagelline wahrscheinlich teilweise andere Epitope als native Flagelline. Da aber das Antiserum AK 179 die rekombinanten Flagelline detektiert, müssen sie auch Epitope präsentieren, wie sie an nativen Flagellen vorkommen. Die gegen die rekombinanten Flagelline gerichteten Antiseren zeigen eine starke Kreuzreaktivität, welche für die Antigenität von Flagellinen charakteristisch ist. Schon Lee et al. [103] berichteten 1987 darüber, daß Flagelline verschiedener Bakteriengattungen gemeinsamen Antigene haben. Auch Kostrzynska et al. [92] bestätigen diese Beobachtung. Es war nicht möglich, den Anteil kreuzreagierender Antikörper durch Präabsorption mit dem jeweils anderen Flagellin zu verringern. Daß die Antiseren wertvolle Werkzeuge zur Detektion der Flagelline von H. pylori darstellen, zeigen die Western-Blot-Untersuchungen, die im Rahmen des zweiten Teilprojekts dieser Arbeit durchgeführt wurden. 4.2 Expression der Flagelline von Helicobacter pylori in Campylobacter coli Vergleichende Analysen der für die Flagelline verantwortlichen genetischen Elemente von Helicobacter und Campylobacter zeigen eine Reihe von Gemeinsamkeiten, enthüllen aber auch elementare Unterschiede. In beiden Organismen unterliegen die Flagellingene der Kontrolle verschiedener Promotoren (!28 für flaA und !54 für flaB). Die Flagellingene von H. pylori liegen nicht in räumlicher Verbindung auf dem Chromosom. FlaA und FlaB zeigen eine Aminosäuresequenzidentität von 57%. Dagegen sind die Flagelline von C. coli nahezu identisch. Sie weisen eine 98%ige Identität ihrer Aminosäuresequenzen auf. Die Gene liegen im Genom direkt 58 Diskussion nebeneinander (sog. Tandemposition) [72;148]. Durch Expression der H. pylori- Flagellingene in Flagellin-negativen Mutanten von C. coli wurde versucht, Flagellen mit H. pylori-Flagellin herzustellen, die nicht von einer Hülle umgeben sind (vgl.1.4.2). Labigne-Roussel et al. [98] ermöglichten 1988 erstmals die Weitergabe genetischen Materials von E. coli nach C. coli durch den Einsatz von Shuttle-Vektoren und Konjugation. Mit Hilfe dieses Verfahrens gelang es in der vorliegenden Arbeit, die Flagellingene von H. pylori nach C. coli zu übertragen. Die Shuttle-Plasmide enthielten jeweils ein komplettes Flagellingen (pSUS43 flaB, pSUS44 flaA) sowie den zugehörigen Promotor. Die Konjugation erfolgte zwischen den Spenderzellen E. coli und drei verschiedenen Mutanten von C. coli, bei denen jeweils eines oder beide Flagellingene durch Insertion einer Kanamycin-Resistenzkassete unterbrochen war. Es resultierten transkonjugante Stämme, die sich biochemisch als C. coli charakterisieren ließen und resistent gegen Kanamycin und Chloramphenicol waren. Dabei waren die H. pylori-Flagellingene nicht durch Rekombinationen oder Deletionen verändert. Allerdings zeigte sich, daß einige Restriktionsenzyme die Plasmide nicht mehr verdauen konnten. Vermutlich sind dafür DNS-Modifikationen in den C. coli-Zellen verantwortlich, wie sie auch von Labigne-Roussel et al. beobachtet wurden [98]. Die Einfachmutanten KX5 und KX15 nahmen in hoher Frequenz Plasmid-DNS auf, so daß etliche transkonjugante Klone isoliert werden konnten. Bei der Charakterisierung der Stämme fiel aber auf, daß die Mutante im flaA-Gen, C. coli KX15, dazu neigt, motile Varianten zu produzieren. Wie Alm et al. [5] berichten, ist C. coli KX15 in der Lage unter Beibehaltung der Antibiotikaresistenz durch komplizierte Rearrangements die genetische Information für das FlaA-Protein zu komplettieren. Dabei kann es zu einer Verlagerung der Resistenzkassette in das flaB-Gen kommen. Die Expression des komplettierten FlaA ist mit der Ausbildung eines motilen Phänotyps verbunden. Derartige Veränderungen sind vermutlich auch für die beobachtete hohe Beweglichkeit der KX15-Stämme verantwortlich, da alle verwendeten Nährböden Antibiotika enthielten. Es ist nicht untersucht worden, ob diese Mechanismen die Expression des H. pylori-Flagellins beeinflußt haben oder dadurch beeinflußt worden sind. Die Untersuchungen der Gesamtzell-Lysate und der Flagellenpräparationen zeigen, daß die C. coli-Zellen in der Lage sind, die Flagelline von H. pylori unter der Kontrolle der H. pylori-Promotoren zu exprimieren und in ihre Flagellenfilamente 59 Diskussion einzubauen. Ein Einfluß auf die Motilität der Stämme wurde nicht beobachtet. Eine Auswirkung ist aber wenig wahrscheinlich, da der Phänotyp der Transkonjuganten sich nicht von dem der Ausgangsstämme unterschied und die Fremdproteine in sehr geringen Mengen gebildet wurden. Bei der elektronenmikroskopischen Untersuchung der Mutante KX5 (pSUS 43) fielen stäbchenförmige Strukturen auf, die an Filamente erinnerten. Da diese Strukturen nicht näher untersucht werden konnten, ist ihre Bedeutung weiterhin unklar. Im Fall der Doppelmutante 656p2% konnte nur ein Klon erzeugt werden, der das Plasmid pSUS44 enthielt. Western-Blot-Untersuchungen belegen die Expression des H. pylori-FlaA. Trotzdem kam es nicht zur Ausbildung von Flagellen oder zum Auftreten beweglicher Zellen. Möglicherweise reicht die vergleichsweise geringe Menge an Fremdprotein nicht zur Synthese von Flagellenfilamenten aus. Eine Ursache dafür, daß die H. pylori-Flagelline nur in kleinen Mengen von C. coli exprimiert werden, könnten Unterschiede im Bereich der Promotoren sein. Zwar wird in beiden Bakteriengattungen die FlaA-Expression durch !28-Promotoren kontrolliert, doch ist der H. p. !28-Promotor durch den ungewöhnlichen Abstand von 13 Nukleotiden zwischen den -35- und -10-Konsensussequenzen gekennzeichnet. Die geringe Expressionsrate des H. pylori-FlaA könnte daher durch eine geringere Effizienz des C. coli !-Faktors bei der Erkennung dieser Sequenz bedingt sein, denn im Genom von C. coli trennen 17 Nukleotide die Konsensussequenzen. Die flaB !54-Promotoren zeigen eine ausgeprägtere Homologie der Nukleotide in der Promotorregion. In beiden Fällen liegt die Ribosomen-Bindungsstelle 12 Nukleotide genabwärts des Promotors [6;105; 148]. Neben Ursachen auf der Translations- oder Transkriptionsebene könnte für die geringe Menge an rekombinantem Flagellin auch eine mangelnde Proteinstabilität in den heterologen Bakterienzellen verantwortlich sein. Zur Detektion der H. pylori-Flagelline in den rekombinanten C. coli-Mutanten wurden erfolgreich die Antiseren anti-H. pylori-FlaA und anti-H. pylori-FlaB aus dem ersten Teilprojekt dieser Arbeit eingesetzt. Das gegen native H. pylori-Flagelline gerichtete Antiserum AK179 ist gut geeignet, die Flagellinuntereinheiten FlaA und FlaB zu erkennen [148]. An die H. pylori-Flagelline aus Präparationen der transkonjuganten C. coli vermochte das Antiserum jedoch nicht zu binden (Blots nicht gezeigt). Ebenfalls auffällig war das Fehlen der Kreuzreaktivität des anti-H. pylori-FlaA Antiserums mit rekombinantem H. pylori-FlaB aus C. coli. Die rekombinanten Flagelline aus den 60 Diskussion transkonjuganten C. coli präsentieren also eine andere Antigenität als H. pyloriFlagelline, die von H. pylori oder E. coli exprimiert werden. Die Ursache dafür liegt vermutlich in der Fähigkeit der verwendeten Mutanten von C. coli zur posttranslationalen Modifikation der Flagelline. Die Flagellin-negativen Mutanten KX5, KX15 und 656p2% stammen von C. coli VC167 ab, der in der Lage ist, Flagelline durch posttranslationale Veränderungen mit bestimmten oberflächenexponierten antigenen Determinanten zu versehen (sog. T2 Zellen) [4;41]. Doig et al. [41] konnten zeigen, daß es zu Glykosylierungen an den Flagellinen kommt. Zwei Gene wurden von Guerry et al. [73] als mögliche genetische Grundlage dieser Fähigkeit ermittelt. Die DNA-Abschnitte kodieren für Proteine, die Homologien mit N-Acetyl-Neuraminsäure-Synthetasen und Alkoholdehydrogenasen haben. Es ist denkbar, daß auch die H. pylori-Flagelline mit Hilfe von Enzymen in C. coli Veränderungen erfahren haben, die ihre Antigenität beeinflussen. In diesem Projekt konnte gezeigt werden, daß die nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Helicobacter und Campylobacter es ermöglicht, die Flagellingene aus H. pylori unter der Kontrolle ihrer eigenen Promotoren in C. coli zu exprimieren. Auch der Export der Fremdflagelline und ihr Einbau in die Flagellen der heterologen Bakterien konnte nachgewiesen werden. Die komplexen Unterschiede zwischen den Genera verhinderten die funktionelle Komplementation der Mutationen in den Flagellingenen der C. coli-Zellen, so daß auf weiterreichende Untersuchungen der Flagellen verzichtet wurde. Um daher die offenen Fragen zum Aufbau der H. pylori-Flagellen aus zwei Flagellinen, ihrer Synthese und Regulation sowie zur Funktion der Hülle beantworten zu können, bedarf es eines anderen Systems zur Expression der Flagelline. 4.3 Komplementation der Mutation im flbA-Gen von Helicobacter pylori N6 Schmitz et al. [134] entdeckten 1997 durch die Klonierung und Charakterisierung des flbA-Gens von H. pylori erstmals einen Regulator der koordinierten Expression der Flagellingene in Helicobacter. Die 2,2 kB umfassende Gensequenz kodiert für das Protein FlbA, das in der zytoplasmatischen Membran lokalisiert ist. Das flbA-Gen weist Homologien zu der lcrD/flbF-Genfamilie auf, deren Produkte alle an der Biosynthese von Flagellen oder an der Sekretion von virulenzassoziierten Proteinen beteiligt sind. 61 Diskussion Durch Herstellung einer isogenen flbA-Mutante konnte bestätigt werden, daß FlbA auch in H. pylori entscheidend an der Regulation der Flagellenbiosynthese beteiligt ist. Mutanten im flbA-Gen sind unbeweglich und durch das vollständige Fehlen von Flagellen gekennzeichnet. Nur selten zeigen sie die Ausbildung von Hakenstrukturen. Es findet keine Transkription der Flagellingene flaA und flaB statt. Die Transkription des flgE-Gens in der flbA-Mutante ist abhängig von der Wachstumsphase und nimmt mit zunehmendem Zellalter ab. Insgesamt ist die Expression des Hakenproteins FlgE im Vergleich mit dem Wildtyp deutlich reduziert. Experimente zur funktionellen Komplementation von Mutationen in H. pylori sind erst seit kurzem durch die Entwicklung eines geeigneten molekulargenetischen Werkzeugs in Form eines E. coli-H. pylori Shuttle-Vektors möglich geworden. Daher konnten erst in dieser Dissertation die molekularen Koch´schen Postulate für die Untersuchungen an der isogenen flbA-Mutante von H. pylori erfüllt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte, durch Komplementation der Mutation im flbA-Gen, die Rolle des FlbA-Proteins als Regulator der Flagellenbiosynthese bestätigt werden. Unter Verwendung des E. coli-H. pylori Shuttle-Vektors pHel2 konnte das flbAGen in das Plasmid pSUS76 eingebaut und in die isogene Mutante des H. pyloriStammes N6 transformiert werden. Das Plasmid wurde in hoher Frequenz von den Zellen aufgenommen, war jedoch in der Mehrheit der Klone durch Rekombinationen verändert. Tsuda et al. [154] fanden bei ihren Untersuchungen zur Transformation von H. pylori regelmäßig in vitro Rekombinationen an Plasmid-DNS, wobei der PlasmidAnteil, der aus E. coli -Zellen stammte, verloren ging. Suerbaum et al. [149] konnten die extrem ausgeprägte Fähigkeit von H. pylori zur freien Rekombination in vivo zeigen. Die Details der Rekombinationen an dem Shuttle-Plasmid pSUS76 wurden nicht untersucht. Ein Klon konnte identifiziert werden, der das Ausgangsplasmid pSUS76 in unveränderter Form enthielt (H. p. N6 flbA- (pSUS76)). In H. p. N6 flbA- (pSUS76) konnte die Expression des FlbA-Proteins nachgewiesen werden, welches im SDS-Gel als ein Protein von 66 kDa erscheint. Das anhand der Gensequenz berechnete Molekulargewicht des FlbA beträgt 80,9 kDa. Schmitz et al. wiesen ebenfalls ein Protein von 66 kDa als Genprodukt nach. Die abweichende Größe könnte durch Prozessierung des Proteins bedingt sein. Möglicherweise handelt es sich aber auch um eine Laufabweichung im SDS-Gel, zu der es aufgrund der basischen Eigenschaften des Proteins kommt [134]. 62 Diskussion FlbA scheint, wie das Homolog FlbF aus Caulobacter crescentus, in Abhängigkeit vom Zellzyklus exprimiert zu werden. Erst nach dem Maximum der FlbAExpression wird die Flagellinsynthese gesteigert, wie unveröffentlichte Daten unserer Arbeitsgruppe zeigen. FlbA wurde von H. p. N6 flbA- (pSUS76) im Vergleich zum Wildtyp verstärkt exprimiert. Hierfür ist vermutlich die hohe Anzahl an Genkopien in Form der Plasmid-DNS verantwortlich. Welche Auswirkungen die, im Vergleich zum Wildtyp, nach der Komplementation verstärkte Expression von FlbA hat, ist nicht näher untersucht worden. Möglicherweise besteht ein Zusammenhang zu den, in den elektronenmikroskopischen Bildern sichtbaren, bläschenförmigen Ausläufern, die nur an Zellen beobachtet wurden, die FlbA überexprimieren. Auch ohne FlbA ist H. pylori in der Lage, Bestandteile der Filamente, wie den Haken, zu produzieren und zu exportieren [134], so daß weitere, bisher unbekannt Mechanismen an der Regulation der Flagellenbiosynthese beteiligt sein müssen. Für die flbA-Sequenz wurde keine Promotorregion entdeckt. Welchen Regulationsmechanismen die Transkription des flbA-Gens unterliegt, ist noch nicht bekannt. Beier et al. [15] entdeckten kürzlich ein H. pylori-Operon, in dem die Sequenz für das chemotaktisch bedeutsame Umschaltprotein des Flagellenmotors CheY enthalten ist. Isogene cheY-Mutanten erwiesen sich in ersten Tests als unbeweglich. Nähere Charakterisierungen dieser Mutanten müssen zeigen, in welcher Weise die Motilität beeinflußt wird. Jenks et al. [85] berichten über eine Flagellen-spezifische ATPase, die für den Export der Flagelline in H. pylori notwendig ist. Isogene Mutanten im zugehörigen fliI-Gen exprimieren nur geringe Mengen an Flagellinen und Hakenproteinen, so daß unbewegliche Zellen resultieren. Bei anderen Enterobacteriaceae ist die hierarchische Struktur der Gene für die Flagellensynthese unter der Kontrolle eines Masteroperons nachgewiesen. Das Genom von Helicobacter pylori enthält kein Masteroperon für die Koordination der Flagellensynthese und auch andere Gene, die bei E. coli an der Regulation der Expression beteiligt sind, konnten nicht nachgewiesen werden [152]. Welchen Aufbau die genetische Organisation des Flagellenapparates bei Helicobacter hat und welche Regulationsmechanismen wirksam sind, ist Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. Einige Gene von H. pylori enthalten Sequenzen, die durch die Wiederholung der Nukleotide C und G oder der Dinukleotide CT und AG gekennzeichnet sind. Die Bedeutung dieser Sequenzen als mögliche Regulatoren der Genexpression wird diskutiert [7]. 63 Diskussion Für die Regulation der Flagellenbiosynthese konnte das FlbA-Protein als wichtiger Faktor identifiziert werden, dessen Einfluß in der vorliegenden Arbeit durch Komplementation der Mutation im flbA-Gen nachhaltig bestätigt werden konnte. 64 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Die Bedeutung von Helicobacter pylori für die Pathogenese der chronischen Gastritis und für die mit der Infektion assoziierten Erkrankungen ist unbestritten. Die Fähigkeiten, die dem Erreger ermöglichen die Magenschleimhaut zu kolonisieren, dort zu persistieren und krankheitsauslösend zu wirken, werden unter dem Begriff Virulenzfaktoren zusammengefaßt. Als ein bedeutender Virulenzfaktor wurde die Motilität der Bakterien erkannt, die ihnen durch ein unipolares Bündel von 4-6 Flagellen verliehen wird. Die Flagellen bestehen aus zwei Strukturproteinen, den Flagellinen FlaA und FlaB. FlaA stellt das Hauptflagellin dar, wogegen der Anteil des FlaB in Abhängigkeit von der Wachstumsphase variiert. Um die Flagelline von H. pylori näher zu charakterisieren, wurden sie in dieser Dissertation in unterschiedlichen bakteriellen Wirtsspezies exprimiert. Durch Überexpression des C-Terminus des FlaA sowie des gesamten FlaB in E. coli konnten die Flagelline erstmals unabhängig voneinander in großen Mengen exprimiert und gereinigt werden. Gegen die rekombinanten Flagelline wurden monospezifische polyklonale Kaninchen-Antiseren hergestellt. Im zweiten Projekt wurden die Flagellingene einschließlich ihrer Promotoren mittels Konjugation in Flagellin-negative Mutanten von C. coli eingeschleust. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutanten in der Lage waren, die H. pylori-Flagelline zu exprimieren und in ihre Flagellen einzubauen. Die Fremdflagelline wurden nur in geringen Mengen von C. coli hergestellt und zeigten eine veränderte Antigenität. Der Phänotyp der Transkonjuganten wurde durch die Expression der H. pylori-Flagelline nicht verändert. Über die Regulation der Flagellinexpression in H. pylori ist noch wenig bekannt. Zu den Faktoren, die hierfür maßgeblich sind, zählt das erst kürzlich entdeckte FlbA-Protein. Isogenen flbAMutanten fehlt nicht nur dieses Protein, sondern auch die Flagellenfilamente, da keine Transkription der Flagellingene mehr erfolgt. In dieser Arbeit wurden funktionelle Komplementationsexperimente mit einem neu entwickelten E. coli-H. pylori-ShuttleVektor durchgeführt. Die so entstandenen Bakterien exprimierten wieder die Flagelline und waren phänotypisch kaum vom Wildtyp zu unterscheiden. Die entscheidende Bedeutung des FlbA für die Organisation der koordinierten Expression der Flagelline konnte dadurch nachhaltig bestätigt werden. 65 Literatur 6 Literaturverzeichnis 1. Anonymous: An international association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer. The EUROGAST Study Group. Lancet 1993; 341: 1359-1362. 2. Anonymous: Epidemiology of, and risk factors for, Helicobacter pylori infection among 3194 asymptomatic subjects in 17 populations. The EUROGAST Study Group. Gut 1993; 34: 1672-1676. 3. Aizawa SI: Flagellar assembly in Salmonella typhimurium. Molecular Microbiology 1996;19:1-5. 4. Alm RA, Guerry P, Power ME, Trust TJ: Variation in antigenicity and molecular weight of Campylobacter coli VC167 flagellin in different genetic backgrounds. J.Bacteriol.1992; 174: 4230-4238 5. Alm RA, Guerry P, Trust TJ: Significance of duplicated flagellin genes in Campylobacter. J.Mol.Biol. 1993b; 230: 359-363. 6. Alm RA, Guerry P, Trust TJ: The Campylobacter sigma 54 flaB flagellin promoter is subject to environmental regulation. J.Bacteriol. 1993a; 175: 4448-4455. 7. Alm RA, Ling LL, Moir DT, et al: Genomic-sequence comparison of two unrelated isolates of the human gastic pathogen Helicobacter pylori. Nature 1999; 397:176-180. 8. Appelmelk BJ, Negrini R, Moran AP, Kuipers EJ: Molecular mimicry between Helicobacter pylori and the host. Trends Microbiol. 1997; 5: 70-73. 9. Appelmelk BJ, Shiberu B, Trinks C, et al: Phase Variation in Helicobacter pylori Lipopolysaccharide. Infect.Immun. 1998; 66: 70-76. 10. Axon AT: The role of acid inhibition in the treatment of Helicobacter pylori infection. Scand.J.Gastroenterol.Suppl. 1994; 201: 16-23. 11. Bamford KB, Bickley J, Collins JS, et al: Helicobacter pylori: comparison of DNA fingerprints provides evidence for intrafamilial infection. Gut 1993; 34: 1348-1350. 12. Bamford KB, Fan X, Crowe SE, et al: Lymphocytes in the human gastric mucosa during Helicobacter pylori infection have a T helper cell 1 phenotype. Gastroenterology 1998; 114: 482-492. 13. Bayerdorffer E, Miehlke S, Neubauer A, Stolte M: Gastric MALT-lymphoma and Helicobacter pylori infection. Aliment.Pharmacol.Ther. 1997; 11: 89-94. 14. Bayerdörffer E, Neubauer A: Helicobacter pylori und Magenlymphom. In: Helicobacter pylori Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 97-107. 15. Beier D, Spohn G, Rappuoli R, Scarlato V: Identification and characterization of an operon of Helicobacter pylori that is involved in motility and stress adaptation. J.Bacteriol. 1998; 197: 4676-4683 16. Beil W, Birkholz C, Wagner S, Sewing K-F: Interaction of Helicobacter pylori and its fatty acids with parietal cells and gastric H+/K+-ATPase. Gut 1994; 35: 1176-1180. 17. Birkholz S, Knipp U, Nietzki C,et al: Immunological activity of lipopolysaccharide of Helicobacter pylori on human peripheral mononuclear blood cells in comparison to lipopoly-saccharides of other intestinal bacteria. FEMS Immunol.Med.Microbiol. 1993; 6: 317-324. 18. Birkholz S, Knipp U, Opferkuch W: Stimulatory effects of Helicobacter pylori on human peripheral blood mononuclear cells of H. pylori infected patients and healthy blood donors. Zbl.Bakt. 1993; 280: 166-176. 19. Birnboim HC, Doly J: A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic.Acids.Res. 1979; 7: 1513-1523. 66 Literatur 20. Blaser MJ: Helicobacter pylori and the pathogenesis of gastroduodenal inflammation. J.Infect.Dis. 1990; 161: 626-633. 21. Bode G, Mauch F, Malfertheiner P: The coccoid forms of Helicobacter pylori. Criteria for their viability. Epidemiol.Infect 1993; 111: 483-490. 22. Boltcher: Dorpauer Medizinische Wochenzeitschrift 1874; 148 23. Boot H, de Jong D, van Heerde P, Taal B: Role of Helicobacter pylori eradication in high-grade MALT-lymphoma. Lancet 1995; 346: 448-449. 24. Boren T, Falk P, Roth KA, et al: Attachment of Helicobacter pylori to human gastric epithelium mediated by blood group antigens. Science 1993; 262: 1892-1895. 25. Boyer HW, Roulland-Dussoix D: A complementation analysis of the restriction and modification of DNA in Escherichia coli. J.Mol.Biol. 1969; 41: 459-472. 26. Breuer T, Sudhop T, Hoch J, et al: Prevalence of and risk factors for Helicobacter pylori infec-tion in the western part of Germany. Eur.J.Gastroenterol. Hepatol. 1996; 8: 47-52. 27. Casadaban M, Cohen SN: Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning in E. coli. J.Mol.Biol. 1980; 138: 179-207. 28. Cave DR: How is Helicobacter pylori transmitted? Gastroenterology 1998; 113: 9-14 29. Censini S, Lange C, Xiang Z, et al: cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996;93:14648-14653 30. Courillon-Mallet A, Launay JM, Roucayrol AM, et al: Helicobacter pylori infection: physiopathologic implication of N#-methyl histamine. Gastroenterology 1995; 108: 959-966. 31. Cover TL, Blaser MJ: Purification and characterization of the vacuolating toxin from Helicobacter pylori. J.Biol.Chem. 1992; 267: 10570-10575. 32. Cover TL, Hanson PI, Heuser JE: Acid-induced dissociation of VacA, the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin, reveals its pattern of assembly. J.Cell Biol. 1997; 138: 759-769. 33. Cover TL, Tummuru MKR, Cao P, et al: Divergence of genetic sequences for the vacuolating cytotoxin among Helicobacter pylori strains. J.Biol.Chem. 1994; 269: 10566-10573. 34. Crabtree JE, Covacci A, Farmery SM, et al: Helicobacter pylori induced interleukin-8 expression in gastric epithelial cells is associated with CagA positive phenotype. J.Clin Pathol. 1995; 48: 41-45. 35. Crowe SE, Alvarez L, Dytoc M, et al: Expression of interleukin 8 and CD54 by human gastric epithelium after Helicobacter pylori infection in vitro. Gastroenterology 1995; 108: 65-74. 36. Czinn SJ: What is the role for vaccination in Helicobacter pylori? Gastroenterology 1997; 113: S149-S153 37. D'Elios MM, Manghetti M, Almerigogna F, et al: Different cytokine profile and antigen-specificity repertoire in Helicobacter pylori-specific T cell clones from the antrum of chronic gastritis patients with or without peptic ulcer. Eur.J.Immunol. 1997; 27: 1751-1755. 38. D'Elios MM, Manghetti M, De Carli M, et al: T helper 1 effector cells specific for Helicobacter pylori in the gastric antrum of patients with peptic ulcer disease. J.Immunol. 1997; 158: 962-967. 39. De Bernard M, Papini E, de Filippis V, et al: Low pH activates the vacuolating toxin of Helicobacter pylori, which becomes acid and pepsin resistant. J.Biol.Chem. 1995; 270: 23937-23940. 40. Doidge C, Gust I, Lee A, et al: Therapeutic immunisation against Helicobacter infection. 1994; 343: 914-915. Lancet 67 Literatur 41. Doig P, Kinsella N, Guerry P, Trust TJ: Characterization of a post-translational modification of Campylobacter flagellin: identification of a sero-specific glycosyl moiety. Mol.Microbiol. 1996; 19: 379387. 42. Dunn BE, Campbell GP, Perez-Perez GI, Blaser MJ: Purification and characterization of urease from Helicobacter pylori. J.Biol.Chem. 1990; 265: 9464-9469. 43. Dunn BE, Roop RM, Sung CC, et al: Identification and purification of a cpn60 heat shock protein homolog from Helicobacter pylori. Infect.Immun. 1992; 60: 1946-1951. 44. Dunn BE, Vakil NB, Schneider BG, et al: Localization of Helicobacter pylori urease and heat shock protein in human gastric biopsies. Infect.Immun. 1997; 65: 1181-1188. 45. Dutcher SK: Flagellar assembly in two hundred and fifty easy-to-follow steps. TIG 1995; 11: 398404. 46. Eaton KA, Brooks CL, Morgan DR, Krakowka S: Essential role of urease in pathogenesis of gastritis induced by Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. Infect.Immun. 1991; 59: 2470-2475. 47. Eaton KA, Cover TL, Tummuru MKR, et al: Role of vacuolating cytotoxin in gastritis due to Helicobacter pylori in gnotobiotic piglets. Infect.Immun. 1997; 65: 3462-3464. 48. Eaton KA, Krakowka S: Effect of gastric pH on urease-dependent colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori. Infect Immun. 1994; 62: 3604-3607. 49. Eaton KA, Morgan DR, Krakowka S: Motility as a factor in the colonisation of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori. J.Med.Microbiol. 1992; 37: 123-127. 50. Eaton KA, Suerbaum S, Josenhans C, Krakowka S: Colonization of gnotobiotic piglets by Helicobacter pylori deficient in two flagellin genes. Infect.Immun. 1996; 64: 2445-2448. 51. Engstrand L, Gustavsson S, Jorgensen A, et al : Inoculation of barrier-born pigs with Helico-bacter pylori: a useful animal model for gastritis type B. Infect.Immun. 1990; 58: 1763-1768. 52. Ernst PB, Crowe SE, Reyes VE: How does Helicobacter pylori cause mucosal damage? The inflammatory response. Gastroenterology 1997; 113: S35-S42 53. Evans DJ, Jr, Evans DG, Takemura T, et al: Characterization of a Helicobacter pylori neutrophilactivating protein. Infect Immun. 1995; 63: 2213-2220. 54. Fan XG, Chua A, Fan XJ, Keeling PW: Increased gastric production of interleukin-8 and tumour necrosis factor in patients with Helicobacter pylori infection. J.Clin Pathol. 1995; 48: 133-136. 55. Fändriks L, von Bothmer C, Johansson B, et al: Water extract of Helicobacter pylori inhibits duodenal mucosal alkaline secretion in anesthetized rats. Gastroenterology 1997; 113: 1570-1575. 56. Ferrero RL, Cussac V, Courcoux P, Labigne A: Construction of isogenic urease-negative mutants of Helicobacter pylori by allelic exchange. J.Bacteriol. 1992; 174: 4212-4217. 57. Ferrero RL, Thiberge J-M, Huerre M, Labigne A: Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infect.Immun. 1998; 66: 1349-1355. 58. Ferrero RL, Thiberge J-M, Kansau I,et al: The GroES homolog of Helicobacter pylori confers protective immunity against mucosal infection in mice. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995; 92: 6499-6503. 59. Forman D: Helicobacter pylori and gastric cancer. Scand.J.Gastroenterol.Suppl.1996;215: 48-51. 60. Forman D, Webb P, Parsonnet J: H. pylori and gastric cancer. Lancet 1994; 343: 243-244. 61. Fox JG, Correa P, Taylor NS, et al: Helicobacter mustelae-associated gastritis in ferrets. An animal model of Helicobacter pylori gastritis in humans. Gastroenterology. 1990; 99: 352-361. 68 Literatur 62. Geis G, Leying H, Suerbaum S, et al: Ultrastructure and chemical analysis of Campylobacter pylori flagella. J.Clin.Microbiol. 1989; 27: 436-441. 63. Geis G, Leying H, Suerbaum S, Opferkuch W: Unusual fatty acid substitution in lipids and lipopolysaccharides of Helicobacter pylori. J.Clin.Microbiol. 1990; 28: 930-932. 64. Geis G, Suerbaum S, Forsthoff B, et al: Ultrastructure and biochemical studies of the flagellar sheath of Helicobacter pylori. J.Med.Microbiol. 1993; 38: 371-377. 65. Georgopoulos SD, Mentis AF, Spiliadis CA, et al: Helicobacter pylori infection in spouses of patients with duodenal ulcers and comparison of ribosomal RNA gene patterns. Gut 1996; 39: 634-638. 66. Gibson, T. J. Studies on the Epstein-Barr virus genome (Ph.D. thesis). 1984. Univ. of Cambridge. 67. Gillen D, El-Omar EM, Wirz AA, et al: The acid response to gastrin distinguishes duodenal ulcer patients from Helicobacter pylori-infected healthy subjects. Gastroenterology 1998; 114: 50-57. 68. Glockner E, Lange C, Covacci A, et al: Proteins encoded by the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori are required for NF-kB activation. Infect.Immun. 1998; 66: 2346-2348. 69. Goodman KJ, Correa P, Tengana Aux HJ, et al: Helicobacter pylori infection in the Colombian Andes: a population-based study of transmission pathways. Am.J.Epidemiol. 1996; 144: 290-299. 70. Goodwin CS, Armstrong JA: Microbiological aspects of Helicobacter pylori (Campylobacter pylori). Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 1990; 9: 1-13. 71. Goodwin CS, Armstrong JA, Chilvers T, et al: Transfer of Campylobacter pylori and Campylobacter mustelae to Helicobacter gen. nov. as Helicobacter pylori comb. nov. and Helicobacter mustelae comb. nov., respectively. Int.J.Syst.Bacteriol. 1989; 39: 397-405. 72. Guerry P, Alm RA, Power ME, et al: Role of two flagellin genes in Campylobacter motility. J.Bacteriol. 1991; 173: 4757-4764. 73. Guerry P, Doig P, Alm RA, et al: Identification and characterization of genes required for posttranslational modification of Campylobacter coli VC167 flagellin. Mol.Microbiol. 1996; 19: 369-378. 74. Guerry P, Logan SM, Thornton S, Trust TJ: Genomic organization and expression of Campylobacter flagellin genes. J.Bacteriol. 1990; 172: 1853-1860. 75. Hazell SL, Andrews RH, Mitchell HM, Daskalopoulous G: Genetic relationship among isolates of Helicobacter pylori: evidence of the existence of a Helicobacter pylori species-complex. FEMS Microbiol.Lett. 1997; 76. Hazell SL, Evans DJJ, Graham DY: Helicobacter pylori catalase. J.Gen.Microbiol. 1991; 137: 5761. 77. Hazell SL, Lee A, Brady L, Hennessy W: Campylobacter pyloridis and gastritis: association with intercellular spaces and adaptation to an environment of mucus as important factors in colonization of the gastric epithelium. J.Infect.Dis. 1986; 153: 658-663. 78. Heilmann KL, Borchard F: Gastritis due to spiral shaped bacteria other than Helicobacter pylori: clinical, histological, and ultrastructural findings. Gut 1991; 32: 137-140. 79. Hein HO, Suadicani P, Gyntelberg F: Genetic markers for peptic ulcer. A study of 3387 men aged 54 to 74 years: the Copenhagen Male Study. Scand-J-Gastroenterol. 1997; 32: 16-21. 80. Heuermann D, Haas R: A stable shuttle vector system for efficient genetic complementation of Helicobacter pylori strains by transformation and conjugation. Mol.Gen.Genet. 1998; 257: 519-528. 69 Literatur 81. Holck S, Ingeholm P, Blom J, et al: The histopathology of human gastric mucosa inhabited by Helicobacter heilmannii-like (Gastrospirillum hominis) organisms, including the first culturable case. APMIS 1997; 105: 746-756. 82. Hussell T, Isaacson PG, Crabtree JE, Spencer J: The response of cells from low-grade B-cell gastric lymphomas of mucosa-associated lymphoid tissue to Helicobacter pylori. Lancet 1993; 342: 571574. 83. Ilver D, Arnqvist A, Ogren J, et al: Helicobacter pylori adhesin binding fucosylated histo-blood group antigens revealed by retagging. Science 1998; 279: 373-377. 84. Jalava K, Kaartinen M, Utriainen M, et al: Helicobacter salomonis sp. nov., a canine gastric Helicobacter sp. related to Helicobacter felis and Helicobacter bizzozeronii. Int.J.Syst.Bacteriol. 1997; 47: 975-982. 85. Jenks PJ, Foynes S, Ward SJ,et al: A flagellar-specific ATPase (FliI) is necessary for flagellar export in Helicobacter pylori. FEMS.Microbiol.Lett. 1997; 152: 205-211. 86. Jones AC, Logan RPH, Foynes S, et al: A flagellar sheath protein of Helicobacter pylori is identical to HpaA, a putative N-Acetylneuraminyllactose-binding Hemagglutinin, but is not an adhesin for AGS Cells. J.Bacteriol. 1997; 179: 5643-5647. 87. Josenhans C, Labigne A, Suerbaum S: Comparative ultrastructural and functional studies of Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae flagellin mutants: Both flagellin subunits, FlaA and FlaB, are necessary for full motility in Helicobacter species. J.Bacteriol. 1995; 177: 3010-3020. 88. Kansau I, Guillain F, Thiberge JM, Labigne A: Nickel binding and immunogenic properties of the C-terminal domain of the Helicobacter pylori GroES homologue (HspA). Mol.Microbiol. 1996; 22: 1013-1023. 89. Knipp U, Birkholz S, Kaup W, et al: Suppression of human mononuclear cell response by Helicobacter pylori: Effects on isolated monocytes and lymphocytes. FEMS Immunol.Med.Microbiol. 1994; 8: 157-166. 90. Knipp U, Birkholz S, Kaup W, Opferkuch W: Partial characterization of a cell proliferationinhibiting protein produced by Helicobacter pylori. Infect Immun. 1996; 64: 3491-3496. 91. Knipp U, Opferkuch W: Immunologie der Helicobacter pylori-Infektion. Die gelben Hefte 1995; 35: 104-111. 92. Kostrzynska M, Betts JD, Austin JW, Trust TJ: Identification, characterization, and spatial localization of two flagellin species in Helicobacter pylori flagella. J.Bacteriol. 1991; 173: 937-946. 93. Krakowka S, Morgan DR, Kraft WG, Leunk RD: Establishment of gastric Campylobacter pylori infection in the neonatal gnotobiotic piglet. Infect.Immun. 1987; 55: 2789-2796. 94. Kurata JH, Nogawa AN: Meta-analysis of risk factors for peptic ulcer. Nonsteroidal antiinflammatory drugs, Helicobacter pylori and smoking. J.Clin Gastroenterol. 1997; 24: 2-17. 95. Kusters JG, Gerrits MM, Van-Strijp JA, Vandenbroucke-Grauls CMJE: Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestations of cell death. Infect.Immun. 1997; 65: 36723679. 96. Kuwajima G: Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. J.Bacteriol. 1988; 170: 3305-3309. 97. Labenz J, Börsch G: Aktuelle Therapie der Helicobacter-pylori-Infektion. In: Helicobacter pylori Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 149-163. 70 Literatur 98. Labigne-Roussel A, Harel J, Tompkins L: Gene transfer from Escherichia coli to Campylobacter species: development of shuttle vectors for genetic analysis of Campylobacter jejuni. J.Bacteriol. 1987; 169: 5320-5323. 99. Labigne A, Cussac V, Courcoux P: Shuttle cloning and nucleotide sequences of Helicobacter pylori genes responsible for urease activity. J.Bacteriol. 1991; 173: 1920-1931. 100. Langton SR, Cesareo SD: Helicobacter pylori associated phospholipase A2 activity: a factor in peptic ulcer production? J Clin. Pathol 1992; 45: 221-224. 101. Lee A, Fox JG, Otto G, Murphy J: A small animal model of human Helicobacter pylori active chronic gastritis. Gastroenterology. 1990; 99: 1315-1323. 102. Lee A, Hazell SL, O'Rourke J, Kouprach S: Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infect.Immun. 1988; 56: 2843-2850. 103. Lee A, Logan SM, Trust TJ: Demonstration of a flagellar antigen shared by a diverse group of spiral-shaped bacteria that colonize intestinal mucus. Infect.Immun. 1987; 55: 828-831. 104. Lee A, O'Rourke J, Corazon de Ungaria M, Robertson B, Daskalopoulos G, Dixon MF: A standarized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology 1998; 112: 1386-1397. 105. Leying H, Suerbaum S, Geis G, Haas R: Cloning and genetic characterization of a Helicobacter pylori flagellin gene. Mol.Microbiol. 1992; 6: 2863-2874. 106. Logan RP, Polson RJ, Misiewicz JJ, et al: Simplified single sample 13Carbon urea breath test for Helicobacter pylori: comparison with histology, culture, and ELISA serology. Gut 1991; 32: 1461-1464. 107. Logan SM, Trust TJ, Guerry P: Evidence for posttranslational modification and gene duplication of Campylobacter flagellin. J.Bacteriol. 1989; 171: 3031-3038. 108. Lugtenberg B, Meijers J, Peters R, et al: Electrophoretic resolution of the "major outer membrane protein" of Escherichia coli K12 into four bands. FEBS.Lett. 1975; 58: 254-258. 109. Macnab RM: Flagella and Motility. In: Escherischia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Neidhardt FC, ed. Washington D. C.: ASM Press, 1996; 123-145. 110. Malaty HM, Engstrand L, Pedersen NL, Graham DY: Helicobacter pylori infection: genetic and environmental influences. Ann.Intern.Med. 1994; 120: 982-986. 111. Malfertheiner P: Helicobacter pylori in der Ulkuspathogenese. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 89-96. 112. Marston FAO, Hartley DL: Solubilization of Protein Aggregates. In: Guide to Protein Purification. Deutscher MP, ed. San Diego: Academic Press, Inc., 1990; 264-276. 113. Matsui T, Matsukawa Y, Sakai T, et al: Ammonia inhibits proliferation and cell cycle progression at S-phase in human gastric cells. Dig.Dis.Sci. 1997; 42: 1394-1399. 114. Mauch F, Bode G, Ditschuneit H, Malfertheiner P: Demonstration of a phospholipid-rich zone in the human gastric epithelium damaged by Helicobacter pylori. Gastroenterology 1993; 105: 1698-1704. 115. Mayo K, Held M, Wadstrom T, Megraud F: Helicobacter pylori - human polymophonuclear leucocyte interaction in the presence of ammonia. Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1997; 9: 457-461. 116. McNulty CA, Dent JC, Uff JS, et al: Detection of Campylobacter pylori by the biopsy urease test: an assessment in 1445 patients. Gut. 1989; 30: 1058-1062. 117. Megraud F: Rationale for the choice of antibiotics for the eradication of Helicobacter pylori. Eur.J.Gastroenterol.Hepatol. 1995; 7: S49-S54 71 Literatur 118. Megraud F: Resistance of Helicobacter pylori to antibiotics. Aliment.Pharmacol.Ther. 1997; 11: 43-53. 119. Megraud F, Neman Simha V, Brugmann D: Further evidence of the toxic effect of ammonia produced by Helicobacter pylori urease on human epithelial cells. Infect.Immun. 1992; 60: 1858-1863. 120. Michetti P, Kreiss C, Kotloff K, et al: Oral immunization of H. pylori infected adults with recombinant urease and LT adjuvant. Abstr.DDW 1997 1997; Abstract 953(Abstract) 121. Molinari M, Salio M, Galli C, et al: Selective inhibition of Ii-dependent antigen presentation by Helicobacter pylori toxin VacA. J.Exp.Med. 1998; 187: 135-140. 122. Moran AP, Lindner B, Walsh EJ: Structural characterization of the lipid A component of Helicobacter pylori rough- and smooth-form lipopolysaccharides. J.Bacteriol. 1997; 179: 6453-6463. 123. Nilius M, Malfertheiner P: Helicobacter-pylori-Infektion - Pathogenese, Entzündung und immunologische Reaktionen. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 25-33. 124. Nomura A, Stemmermann GN, Chyou P-H, et al: Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii. N.Engl.J.Med. 1991; 325: 1132-1136. 125. O'Toole PW, Kostrzynska M, Trust TJ: Non-motile mutants of Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae defective in flagellar hook production. Mol.Microbiol. 1994; 14: 691-703. 126. Odenbreit S, Wieland B, Haas R: Cloning and genetic characterization of Helicobacter pylori catalase and construction of a catalase-deficient mutant strain. J.Bacteriol. 1996; 178: 6960-6967. 127. Opferkuch W: Die Epidemiologie von Helicobacter pylori. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 3-9. 128. Parsonnet J, Friedman GD, Vandersteen DP, et al: Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma. N.Engl.J.Med. 1991; 325: 1127-1131. 129. Radcliff FJ, Hazell SL, Kolesnikow T, et al: Catalase, a novel antigen for Helicobacter pylori vaccination. Infect.Immun. 1997; 65: 4668-4674. 130. Ricci V, Ciacci C, Zarrilli R, et al: Effect of Helicobacter pylori on gastric epithelial cell migration and proliferation in vitro: role of VacA and CagA. Infect Immun. 1996; 64: 2829-2833. 131. Rieder G, Hatz RA, Moran AP, et al: Role of adherence in interleukin-8 induction in Helicobacter pylori-associated gastritis. Infect.Immun. 1997; 65: 3622-3630. 132. Romaniuk PJ, Zoltowska B, Trust TJ, et al: Campylobacter pylori, the spiral bacterium associated with human gastritis, is not a true Campylobacter sp. J.Bacteriol.1987; 169: 2137-2141. 133. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 134. Schmitz A, Josenhans C, Suerbaum S: Cloning and characterization of the Helicobacter pylori flbA gene, which codes for a membrane protein involved in coordinated expression of flagellar genes. J.Bacteriol. 1997; 179: 987-997. 135. Segal ED, Falkow S, Tompkins LS: Helicobacter pylori attachment to gastric cells induces cytoskeletal rearrangements and tyrosine phosphorylation of host cell proteins. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1996; 93: 1259-1264. 136. Segal ED, Lange C, Covacci A, et al: Induction of host signal transduction pathways by Helicobacter pylori. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1997; 94: 7595-7599. 72 Literatur 137. Seifert E: Helicobacter pylori und Magenkarzinom. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 109-123. 138. Shen Z, Fox JG, Dewhirst FE, et al: Helicobacter rodentium sp. nov., a urease-negative Helicobacter species isolated from laboratory mice. Int.J.Syst.Bacteriol. 1997; 47: 627-634. 139. Simon PM, Goode PL, Mobasseri A, Zopf D: Inhibition of Helicobacter pylori binding to gastrointestinal epithelial cells by sialic acid-containing oligosaccharides. Infect.Immun. 1997; 65: 750757. 140. Solnick JV, O'Rourke J, Lee A, et al: An uncultured gastric spiral organism is a newly identified Helicobacter in humans. J.Infect.Dis. 1993; 168: 379-385. 141. Sommi P, Ricci V, Fiocca R, et al: Significance of ammonia in the genesis of gastric epithelial lesions induced by Helicobacter pylori: an in vitro study with different bacterial strains and urea concentrations. Digestion 1996; 57: 299-304. 142. Spiegelhalder C, Gerstenecker B, Kersten A, et al: Purification of Helicobacter pylori superoxide dismutase and cloning and sequencing of the gene. Infect Immun. 1993; 61: 5315-5325. 143. Stolte M: Pathologie der Helicobacter-pylori-Krankheiten. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 37-61. 144. Stolte M, Kroher G, Meining A, et al: A comparison of Helicobacter pylori and H. heilmanii gastritis. A matched control study involving 404 patients. Scand-J-Gastroenterol. 1998; 32: 28-33. 145. Stoscheck CM: Quantitation of Proteins. In: Guide to protein purification. Deutscher MP, ed. San Diego, New York: Academic Press, Inc., 1990; 50-68. 146. Suerbaum S, Josenhans C: Virulence factors of Helicobacter pylori: implications for vaccine development. Mol.Med.Today 1998; 1: 1-1. 147. Suerbaum S: Bakterielle Physiologie und Virulenzfaktoren. In: Helicobacter pylori - Von der Grundlage zur Therapie. Malfertheiner P, ed. Stuttgart: Thieme, 1996; 11-23. 148. Suerbaum S, Josenhans C, Labigne A: Cloning and genetic characterization of the Helicobacter pylori and Helicobacter mustelae flaB flagellin genes and construction of H. pylori flaA- and flaBnegative mutants by electroporation-mediated allelic exchange. J.Bacteriol. 1993; 175: 3278-3288. 149. Suerbaum S, Maynard Smith J, Bapumia K, et al: Free recombination within Helicobacter pylori. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998; 95: 12619-12624. 150. Tarkkanen J, Kosunen TU, Saksela E: Contact of lymphocytes with Helicobacter pylori augments natural killer cell activity and induces production of gamma interferon. Infect Immun. 1993; 61: 30123016. 151. Telford JL, Ghiara P, Dell'Orco M, et al: Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric disease. J.Exp.Med. 1994; 179: 1653-1658. 152. Tomb J-F, White O, Kerlavage AR, et al: The complete genome sequence of the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 1997; 388: 539-547. 153. Towbin H, Staehelin T, Gordon J: Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1979; 76: 4350-4354. 154. Tsuda M, Karita M, Nakazawa Microbiol.Immunol. 1993; 37: 85-89. T: Genetic transformation in Helicobacter pylori. 155. Tummuru MK, Cover TL, Blaser MJ: Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun. 1993; 61: 1799-1809. 73 Literatur 156. Utt M, Wadstrom T: Identification of heparan sulphate binding surface proteins of Helicobacter pylori: inhibition of heparan sulphate binding with sulphated carbohydrate polymers. J.Med.Microbiol. 1997; 46: 541-546. 157. van der Hulst RW, Rauws EA, Koycu B, et al: Helicobacter pylori reinfection is virtually absent after successful eradication. J.Infect.Dis. 1997; 176: 196-200. 158. Vanagunas A: Eradication of Helicobacter pylori and regression of B-cell lymphoma. Biomed.Pharmacother. 1997; 51: 156-160. 159. Vanet A, Labigne A: Evidence for specific secretion rather than autolysis in the release of some Helicobacter pylori proteins. Infect.Immun. 1998; 66: 1023-1027. 160. Wang Y, Roos KP, Taylor DE: Transformation of Helicobacter pylori by chromosomal metronidazole resistance and by a plasmid with a selectable chloramphenicol resistance marker. J.Gen.Microbiol. 1993; 139: 2485-2493. 161. Warren JR, Marshall B: Unidentified curved bacilli on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1983; 1: 1273-1275. 162. Williams CL, Preston T, Hossack M, et al: Helicobacter pylori utilises urea for amino acid synthesis. FEMS Immunol.Med.Microbiol. 1996; 13: 87-94. 163. Wilms K: Erkrankungen des lymphoretikulären Systems. In: Lehrbuch der inneren Medizin. Siegenthaler W, Kaufmann W, Hornbostel H, Waller HD, eds. Stuttgart: Thieme, 1992; 715-734. 164. Wilson DR, Beveridge TJ: Bacterial flagellar filaments and their component flagellins. Can.J.Microbiol. 1993; 39: 451-472. 165. Wirth HP, Yang M, Peek RM, et al: Helicobacter pylori Lewis expression is related to the host Lewis phenotype. Gastroenterology 1997; 113: 1091-1098. 166. Wotherspoon AC, Ortiz Hidalgo C, Falzon MR, Isaacson PG: Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet 1991; 338: 1175-1176. 167. Yamaguchi H, Osaki T, Kurihara N, et al: Heat-shock protein 60 homologue of Helicbacter pylori is associated with adhesion of H. pylori to human epithelial cells. .Med.Microbiol. 1997; 46: 825-831. 74 Danksagung 7 Danksagung Zur Entstehung dieser Arbeit haben viele Menschen beigetragen. Ihnen allen danke ich dafür von ganzem Herzen. Herr PD Dr. med. Sebastian Suerbaum hat mir das Thema überlassen und meine Arbeit stets mit viel Engagement und fachlichem Rat gefördert. Frau Dipl. Biol. Dr. rer. nat. Christine Josenhans hat mich in die mikrobiologischen Versuchsmethoden eingearbeitet und stand mir jederzeit hilfreich zur Seite. Ich danke ihr besonders für die Erstellung der elektronenmikroskopischen Aufnahmen. Frau Susanne Friedrich und Frau Ulrike Deiß haben mir die Durchführung der Versuche durch Hilfe in Rat und Tat wesentlich erleichtert. Allen anderen Mitarbeitern des Instituts für Medizinische Mikrobiologie, darunter Frau Dipl. Biol. Tanja Brauer-Steppkes und Frau Sabine Kuhlenberg, danke ich für die freundliche Aufnahme und gute Zusammenarbeit. Diese Arbeit wurde gefördert durch ein Promotionsstipendium der Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum. Stellvertretend danke ich Herrn Prof. Dr. med. Wolfgang Opferkuch für das Interesse an dieser Dissertation. Schließlich gilt mein Dank meiner Familie und meinem Mann Christian für ihre beständige liebevolle Unterstützung. 75 Lebenslauf 8 Lebenslauf Tanja Astrid Treschan geb. Schrappe geboren am 27.07.1972 in Dortmund Schulausbildung 1979 bis 1982 Grundschule in Dortmund 1982 bis 1991 Heinrich-Heine-Gymnasium in Dortmund 25.05.1991 Abitur Studium und Beruf 1991 bis 1998 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 13.05.1998 3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung seit 1.07.98 Ärztin im Praktikum am Knappschafts-Krankenhaus Recklinghausen in der Abteilung für Anästhesiologie und operative Intensivmedizin unter der Leitung von Frau Prof. Dr. med R. Schlimgen Promotion Beginn der Arbeit an der Promotion im September 1994 unter der wissenschaftlichen Leitung von Herrn PD Dr. med. Sebastian Suerbaum am Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Ruhr-Universität Bochum. In der Zeit von September 1994 bis September 1995 wurde die Dissertation durch ein Promotionsstipendium der Medizinischen Fakultät der RuhrUniversität Bochum gefördert. Teile dieser Promotion wurden im Rahmen des internationalen Helicobacter-Symposiums im März 1997 in Galway, Irland, als Poster vorgestellt und als bestes Poster des Kongresses prämiert. 76
