Drosophila melanogaster: Ein Modellsystem zur

Überblick
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Drosophila melanogaster: Ein Modellsystem
zur Analyse neurodegenerativer Erkrankungen
Jose A. Botella und Stephan Schneuwly
Institut für Zoologie, Universität Regensburg
Neurodegenerative Erkrankungen stellen
in steigendem Umfang ein wichtiges
gesundheits-ökonomisches Problem
unserer Gesellschaft dar. Obwohl enorme
Anstrengungen zur Klärung der Krankheitsursachen und zur Entwicklung neuer
Therapien unternommen werden, liegt
vieles noch im Dunkeln, insbesondere
deshalb, weil adäquate Modellsysteme zur
Untersuchung der pathophysiologischen
Mechanismen fehlen. Die vollständige
Sequenzierung mehrerer eukaryotischer
Genome, vom Nematoden Caenorhabditis
elegans über Drosophila melanogaster bis
zum Menschen, ermöglichen es nun,
vergleichende Untersuchungen an einfacheren Organismen zu unternehmen und
neue Ansätze für die Aufklärung der
Krankheitsursachen und möglicher Therapien zu entwickeln. Diese Arbeit soll einen
Überblick über die verschiedenen Ansätze
geben, mit denen an Drosophila melanogaster neue Erkenntnisse gewonnen
werden.
Abb. 1: Altersabhängige Neurodegeneration im Gehirn von Drosophila Mutanten. A) Horizontaler
Schnitt durch ein Fliegengehirn, angefärbt mit einem Antikörper gegen Synapsen zeigt die typische
Anordnung der Neuropil-Regionen des Drosophila-Gehirns. B) Ähnliche Schnittebene durch ein Gehirn
einer gleichaltrigen Mutante vap (vacuolar pedunculi). Deutlich zu sehen ist die Vakuolisierung in
großen Bereichen der Neuropil-Region. Der Phänotyp nimmt mit zunehmendem Alter der Fliegen zu.
Neurodegenerative Erkrankungen sind
mit zunehmender Überalterung unserer Gesellschaft ein ständig wachsendes Problem.
Obwohl einige dieser Erkrankungen bereits
in jungen Jahren ausbrechen können (z.B.
ALS; Amyotrophe Lateralsklerose) ist das
Alter der hauptsächliche Risikofaktor dieser
Erkrankungen wie bei der Alzheimer Krankheit oder bei Parkinson. Altersabhängige
neurodegenerative Erkrankungen sind im
Zunehmen und die Krankheitsfälle werden
in Zukunft noch dramatischer ansteigen, da
man davon ausgehen kann, dass sich die Population der über 60-jährigen in den nächsten 50 Jahren annähernd verdoppeln wird.
Trotz umfangreicher Forschungsansätze gibt
es gegenwärtig weder eine Heilung noch eine ursächliche Therapie für diese Erkrankungen.
Eine der Möglichkeiten, neue Entwicklungen in der Forschung anzustoßen, ist der
Einsatz von einfachen Modellsystemen. Die
Motivation, Invertebraten-Modelle wie Drosophila melanogaster zu nutzen, kommt aus
dem hohen Verwandtschaftsgrad der bisher
sequenzierten Genome. Im Jahre 2000 wurde die erste Fassung des Drosophila-Genoms
veröffentlicht[1] und man rechnet mit ca.
14.000 Genen, dabei ist besonders interessant, dass von den etwa 1.000 Genen, die bereits mit humanen Erbkrankheiten assozi-
iert sind, 77 % homologe Gene in Drosophila
aufweisen[2].
Es wäre sicher irreführend, Invertebraten
als die idealen Systeme zur Untersuchung
humaner neurodegenerativer Krankheitsbilder zu bezeichnen, trotzdem gibt es einige wichtige Vorteile, die es zu berücksichtigen gilt. So besitzt die Fliege ein Zentrales
Nervensystem welches nach den gleichen
Prinzipien funktioniert wie bei höheren Organismen, nur mit einer wesentlich geringeren Anzahl an Neuronen und Glia-Zellen.
Es teilt mit den Vertebraten die gleichen
Neurotransmitter-Systeme wie z.B. GABA,
Glutamat, Dopamin und Acetylcholin und
es können komplexe Verhaltensmuster wie
Lernen und Gedächtnis für die Untersuchungen herangezogen werden und dies bei
wesentlich einfacheren Zuchtbedingungen
als etwa bei Mäusen. Durch fast 100 Jahre
Genetik mit Drosophila stehen nicht nur
Tausende von Mutanten zur Verfügung, sondern auch eine Vielzahl genetischer Methoden zur Analyse komplexer Prozesse. Zudem ist, wie bereits erwähnt, eine große Zahl
von Genen und Signaltransduktionskaskaden von Fliegen bis zum Menschen konserviert. Aus diesen Gründen hat sich Drosophila in den letzten Jahren als wichtiger
Modellorganismus etabliert, um neue Hypothesen zu überprüfen oder neue KrankBIOspektrum · 5/04 · 10. Jahrgang
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Der reverse Genetik-Ansatz
Tab. 1: Einige Beispiele der genetischen Ansätze in Drosophila
Krankheit
Gene
Methode
Literatur
Adenoleukodystrophie(ALD)
VLCFA acyl CoA synthase
Forward-Genetik
Min and Benzer, 1999
Alzheimer und Tauopathien
Drosophila APPL
Humanes APP
TAU
GAL4/UAS
Gunawardena and Goldstein, 2001
Wittmann et al., 2001
Parkinson
Human α-synuclein
GAL4/UAS
Feany and Bender, 2000
Polyglutamin Erkrankungen
Huntington
Spinozerebelläre Ataxie Typ 1
Spinozerebelläre Ataxie Typ 3
Huntingtin
SCA-1
SCA-3
GAL4/UAS
Jackson et al., 1998
Fernández-Fúnez et al., 2000
Warrick et al., 1998
heits-relevante Gene mit Methoden zu identifizieren, die in anderen Organismen wie
z.B. der Maus nicht in der Einfachheit zugänglich sind.
Es gibt im Wesentlichen drei verschiedene Ansätze zur Untersuchung neurodegenerativer Phänotypen bei Drosophila:
„forward“-Genetik, reverse Genetik und
die Übertragung spezifischer Konstrukte
(Tab. 1).
von Nervenzellen und damit zu Neurodegeneration führt. Auch bei ALD-Patienten
(wie bei bubblegum Mutanten) kommt es zu
einer Erhöhung des Anteils dieser langkettigen Fettsäuren und zeigt damit die Parallelität der Mechanismen der Pathogenität
auf.
Der „forward“-Genetik-Ansatz
Die klassische Art mit Drosophila zu arbeiten läuft über die Isolierung neuer Mutanten in einem „forward“-Genetik Ansatz.
Diese neuen Mutanten werden aufgrund eines neurodegenerativen Phänotyps im ZNS
selektioniert, der meist altersabhängig auftritt. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel aus unserem Labor, wo es uns gelungen ist mit der
Isolierung und Charakterisierung der Mutante vap (vacuolar pedunculi), ein wichtiges
Gen zu entdecken, welches für die Stabilität
der Neurone eine entscheidende Bedeutung
hat. Deutlich sichtbar ist in Abbildung 1 die
altersabhängige Degeneration des Zentralen
Nervensystems. Mit dieser Mutante (Abb. 2)
konnte auch aufgedeckt werden, dass Signaltransduktionswege, die in der Entwicklungsbiologie von Drosophila eine wichtige
Rolle spielen, auch im ausgewachsenen Nervensystem eine entscheidende Bedeutung
für die Stabilität der Nervenzellen haben[3].
Solche neu identifizierten Gene können
als wichtige Kandidaten-Gene angesehen
werden und die Identifizierung entsprechend homologer Gene beim Menschen ermöglicht damit neue Forschungsansätze bis
hin zur Therapie. Eines der bekanntesten
Beispiele in Drosophila ist die Mutation bubblegum[4]. bubblegum Fliegen zeigen eine altersabhängige Degeneration des ZNS, die
mit einer Mutation in der überlangkettigen
Fettsäure Coenzym A-Synthetase gekoppelt
ist und zu einer Akkumulation dieser überlangkettigen Fettsäuren führt. Interessant
ist die Analogie zu einer humanen Erbkrankheit, der Adrenoleukodystrophie
(ALD), die u. a. zu einer Demyelinisierung
BIOspektrum · 5/04 · 10. Jahrgang
Abb. 2: Die Rolle der vap-Mutante in der RASMAPK-Signaltransduktionskaskade. Vereinfachtes Schema der EGF-Rezeptorsignalkaskade
und der Bedeutung von vap. Ein extrazellulärer
Ligand aktiviert den EGF-Rezeptor, der wiederum
zur Aktivierung von Ras führt, welches über die
MAP-Kinasekaskade ein Signal in den Kern
sendet. Vap kodiert für ein RasGAP-Protein,
welches mit einer GTPase-Aktivität die aktive
Form von Ras wieder inaktiviert und damit das
Signal abschaltet. Bei fehlendem RasGAP in vap
Mutanten wird der Signalweg überaktiviert und
führt zur Neurodegeneration.
Im Gegensatz zum „forward“-Genetik Ansatz macht sich der reverse Genetik-Ansatz
die rasanten Fortschritte auf dem Gebiet der
vergleichenden Genomuntersuchungen zu
Nutze. Dabei werden in Drosophila die zum
humanen System verwandten Gene identifiziert und zur funktionellen Analyse in Drosophila entweder entsprechende Mutanten
erzeugt oder Defekte mittels gezielter Überexpression induziert. Mit diesen Methoden
können wichtige Erkenntnisse über die
Funktion einzelner Gene in Drosophila erlangt werden, welchen zwar eine Beteiligung
an humanen Erkrankungen nachgesagt wird,
aber über deren biologische Bedeutung man
im Wesentlichen noch im Unklaren ist (siehe unten, z.B. das APP-Gen).
Der Einsatz dominanter Konstrukte in
Drosophila
Der dritte Ansatz basiert auf der Übertragung einer toxischen Wirkung von dominanten Konstrukten. Bei vielen neurodegenerativen Erkrankungen wie z.B. bei Chorea Huntington, Spinozerebellärer Ataxien
(Poly-Glutamin-Erkrankungen), Synucleinopathien (Parkinson) oder Tauopathien
(Fronto-temporale Demenz) liegen dominante Gendefekte vor. In diesen experimentellen Ansätzen wird die krankheitsrelevante Form des menschlichen Gens in
Drosophila mittels dem Hefe UAS/GAL-4
System ektopisch in definierten Geweben
exprimiert[5] (siehe Abb. 3). Gerade dieser
Ansatz hat sich bei Drosophila äußerst erfolgreich etabliert und soll anhand einiger
Beispiele erläutert werden.
Bei der Alzheimer Erkrankung kommt es
zum Verlust von Neuronen, der von extrazellulären abnormen Ablagerungen der amyloiden Plaques begleitet wird, die durch die
Aggregation des Aβ-Peptids, einem Prozessierungsprodukt von APP (amyloid precursor-Protein) entstehen. Zusätzlich sind auch
intrazelluläre neurofibrilläre Strukturen
(Tangles) zu finden die aus hyperphosphoryliertem TAU-Protein bestehen. Obwohl
bereits sehr viele Hinweise für die Beteiligung von APP an der Alzheimer Erkrankung
bestehen, ist über die physiologische Bedeutung dieses Gens noch wenig bekannt.
Drosophila besitzt ebenfalls ein zu APP ähnliches Gen (APPL; APP-like). Eine Analyse
von appl-Mutanten und Überexpressionsstudien mit verschiedenen Mutanten der humanen- und Fliegen-APP-Gene hat gezeigt,
dass APP eine wichtige Rolle beim axonalen
Transport spielt[6]. Diese in vivo Phänotypen
zeigen neben den axonalen Transportdefekten auch eine Erhöhung des larvalen
Zelltods im ZNS. Obwohl keine amyloiden
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Abb. 3: Das Drosophila GAL4-UAS-System. In der Enhancer-trap-Fliege wird der Hefe-Transkriptionsfaktor gewebespezifisch exprimiert. Durch Kreuzung mit einer Fliege, die das zur Expression vorgesehene Gen hinter der Kontrollsequenzen UAS (upstream activating sequence) trägt, wird dieses Gen
durch die Gewebe-spezifische Expression des GAL4 angeschaltet.
Plaques gefunden werden konnten, wurde
beschrieben, dass Drosophila humanes APP
prozessieren und das Aβ-Peptid nachgewiesen werden kann[7]. Außerdem ist dieser Prozessierungsweg identisch mit der Prozessierung von Notch, einem außerordentlich
wichtigen Protein, welches an verschiedenen Entwicklungsprozessen bei Drosophila
beteiligt ist. Damit können in Drosophila
wichtige Erkenntnisse über die biologische
und pathophysiologische Bedeutung von
APP gewonnen werden. In ähnlicher Weise
wird auch die Bedeutung des TAU-Proteins
für die Destabilisierung von Neuronen in
Drosophila untersucht[8].
Das Parkinson-Syndrom umfasst verschiedene familiäre und spontane Erkrankungen mit motorischen Störungen, wobei
dopaminerge Neurone in einem definierten
Bereich des Gehirns in einer Alters-abhängigen Weise verloren gehen. Dieser Verlust
neuronaler Zellen wird begleitet durch das
Erscheinen von zellulären Einschlüssen, den
Lewy-Körperchen. Eine wichtige Komponente dieser Einschlüsse ist das Protein αSynuclein. Mehrere Mutationen im α-Synuclein-Gen konnten in den seltenen familiären Formen von Parkinson bereits aufgedeckt werden, jedoch sind die Proteinaggregate in allen, insbesondere der spontanen (idiopath.) Form von Parkinson zu finden. α-Synucleine scheinen deshalb eine
zentrale Rolle in der Pathogenese dieser Erkrankung zu spielen. Vor wenigen Jahren
konnte das erste Drosophila Modell für Parkinson etabliert werden[9]. Dabei wurde das
humane α-Synuclein im Fliegen-Gehirn
überexprimiert. Überraschenderweise wurde im ZNS der Fliegen ebenfalls nur eine
spezifische Neurodegeneration des dopaminergen Systems beobachtet, obwohl α-Synuclein in allen Neuronen exprimiert wurde.
Die befallenen Neurone zeigen ebenfalls
mit Lewy-Körperchen vergleichbare Einschlüsse wie sie im Gehirn von Patienten
zu finden sind. Neben α-Synuclein befinden sich in den Lewy Körperchen auch andere Proteine wie z.B. Chaperone. So konnte kürzlich in Drosophila gezeigt werden, dass
Chaperone eine schützende Wirkung vor
Degeneration der dopaminergen Neurone
haben[10].
Eine weitere Gruppe von Erkrankungen
betrifft die Polyglutamin-Erkrankungen.
Dabei werden durch genetische Defekte in
den betroffenen Genen bestimmte Trinukleotid-Wiederholungen (CAG), die für die
Aminosäure Glutamin kodieren, vermehrt.
Eine damit verbundene Erhöhung der Anzahl Wiederholungen führt zu einer pathologischen Akkumulation des mutierten Proteins, welches dadurch auf die Zellen toxisch
wirkt. Auch hier kommt es also zu intrazellulären Einschlüssen und zu einer spezifischen Degeneration eines Teils des Zentralen Nervensystems. Dabei konnte am Beispiel der Expression von unterschiedlich
langen Polyglutaminwiederholungen im
Drosophila Auge sowohl für Chorea Huntington, wie auch für die Spinozerebelläre
Ataxie (SCA) ein klarer Zusammenhang zwischen der Länge des Segmentes und der
Stärke des Defektes hergestellt werden[11,12].
Das Drosophila Auge ermöglicht nun in ei-
nem weiteren Ansatz die Suche nach genetischen Modifikatoren, d.h. nach Mutationen, die den Defekt abschwächen und verstärken[13,14]. Damit können wiederum neue
Faktoren identifiziert werden, die an der Pathogenese beteiligt sind oder die möglicherweise neue potenzielle therapeutische
Ziele darstellen können. Diesbezüglich sind
die Ergebnisse mit der Histon-Acetylierung
von besonderem Interesse. So konnten mehrere Mutationen identifiziert werden, die die
Histon-Acetylierung beeinflussen, und den
Phänotyp im SCA-Drosophila-Modell wie
auch im Huntington-Modell modifizieren[15,16]. Interessanterweise konnte in dieser Studie auch durch Füttern eines Inhibitors eines der Enzyme (SAHA; superoylanilide hydroxamic acid als Inhibitor der HistonAcetyltransferase) die durch diese Konstrukte induzierte Toxizität reduzieren. Ähnliche Effekte wurden auch in der Maus beschrieben[17]. SAHA und andere HistonDeacetylasen-Inhibitoren werden gegenwärtig in verschiedenen klinischen Tests
untersucht.
Damit stellt Drosophila auch hier ein sehr
interessantes Modell dar, mit welchem einerseits grundlegende biologische Vorgänge
in solchen Erkrankungen am Modell untersucht werden können, andererseits aber auch
wie im Falle der Histon-Acetyl-Transferasen-Inhibitoren neue interessante therapeutische Ansätze identifiziert werden können.
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José A. Botella
Jahrgang 1966; Studium
der Biologie und Pro-
Stephan
Schneuwly
Jahrgang 1959, Studium
der Biologie am Biozentrum der Universität Basel, Promotion 1986 bei
motion an der University of Murcia in Spanien.
1996–97 Postdoc an der
University of Kent, UK,
1997–2001 Postdoc und
seit 2001 wissenschaftlicher Assistent am Institut für Zoologie Universität Regensburg.
Prof. Dr. W. Gehring,
Biozentrum der Universität Basel. 1986–1989
Postdoc am Dep. of Biological Sciences, Purdue
University. 1990–94
Nachwuchsgruppenleiter einer BMBF-Nachwuchsgruppe bei Prof.
Dr. M. Heisenberg am
Lehrstuhl für Genetik,
Universität Würzburg.
Seit 1995 Professor für
Zoologie an der Universität Regensburg.
BIOspektrum · 5/04 · 10. Jahrgang
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100:2041–2046.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Stephan Schneuwly
Lehrstuhl für Biologie VI
Institut für Zoologie
Universitätsstr. 31
Universität Regensburg
D-93040 Regensburg
[email protected]