Epidemiologische Untersuchungen zur
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Tierärztliche Hochschule Hannover Epidemiologische Untersuchungen zur Bedeutung und zum Vorkommen einer vermuteten Eperythrozoon-Infektion beim Pferd INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin oder eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Rutmer Niemendal Sneek Hannover 2009 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. T. Blaha Außenstelle für Epidemiologie 1. Gutachter: 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. T. Blaha Univ.-Prof. Dr. K. Feige Tag der mündlichen Prüfung: 14.05.2009 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG.......................................................................................................................... 1 2. LITERATURÜBERSICHT ..................................................................................................... 2 2.1 Definition .......................................................................................................................... 2 2.2 Ätiologie ........................................................................................................................... 2 2.2.1 Nomenklatur .............................................................................................................. 2 2.2.2 Phylogenetischer Analyse ......................................................................................... 4 2.2.3 Sonstige hämotrophe Mykoplasmen ......................................................................... 5 2.2.4 In Situ Hybridisation ................................................................................................. 6 2.3 Morphologie ..................................................................................................................... 6 2.3.1 Feinstrukturelle Morphologie .................................................................................... 6 2.3.2 Lichtmikroskopische Morphologie ........................................................................... 8 2.4 Pathogenese ...................................................................................................................... 9 2.4.1 Übertragung ............................................................................................................... 9 2.4.2 Stadien der Infektion ............................................................................................... 10 2.4.3 Erythrozyten-Beschädigung .................................................................................... 10 2.4.4 Einfluss auf den Säure-Basen-Haushalt und den Kohlenhydratstoffwechsel ......... 11 2.5 Immunologie ................................................................................................................... 11 2.6 Diagnostik ....................................................................................................................... 12 2.6.1 Einleitung ................................................................................................................ 12 2.6.2 Direkter Erregernachweis ........................................................................................ 12 2.6.3 Indirekter Erregernachweis ..................................................................................... 14 2.7 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schwein..................................................................... 15 2.7.1 Symptome................................................................................................................ 15 2.7.1.1 Klinisches Erscheinungsbild ............................................................................ 15 2.7.1.2 Hämatologische Veränderungen ...................................................................... 15 2.7.2 Pathologie ................................................................................................................ 16 2.7.2.1 Sektionsbild...................................................................................................... 16 2.7.2.2 Histologie ......................................................................................................... 17 2.7.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 17 2.7.4 Diagnostik ............................................................................................................... 18 2.7.5 Therapie und Prävention ......................................................................................... 18 2.7.6 Bedeutung................................................................................................................ 19 2.8 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schaf ......................................................................... 19 2.8.1 Symptome................................................................................................................ 19 2.8.2 Pathologie ................................................................................................................ 19 2.8.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 19 2.8.4 Diagnostik ............................................................................................................... 20 2.8.5 Therapie und Prävention ......................................................................................... 21 2.8.6 Bedeutung................................................................................................................ 21 2.9 Hämotrophe Mykoplasmen bei der Katze ...................................................................... 21 2.9.1 Symptome................................................................................................................ 21 2.9.2 Pathologie ................................................................................................................ 22 2.9.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 22 2.9.4 Diagnostik ............................................................................................................... 24 2.9.5 Therapie und Prävention ......................................................................................... 25 2.9.6 Bedeutung................................................................................................................ 26 2.10 Hämotrophe Mykoplasmen beim Hund ......................................................................... 26 2.10.1 Symptome................................................................................................................ 26 2.10.2 Pathologie ................................................................................................................ 27 2.10.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 27 2.10.4 Diagnostik ............................................................................................................... 27 2.10.5 Therapie ................................................................................................................... 27 2.10.6 Bedeutung................................................................................................................ 28 2.11 Hämotrophe Mykoplasmen beim Rind........................................................................... 28 2.11.1 Symptome................................................................................................................ 28 2.11.2 Pathologie ................................................................................................................ 28 2.11.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 28 2.11.4 Diagnostik ............................................................................................................... 29 2.11.5 Therapie ................................................................................................................... 29 2.11.6 Bedeutung................................................................................................................ 30 2.12 Hämotrophe Mykoplasmen bei andere Tierarten und beim Menschen .......................... 30 2.12.1 Symptome................................................................................................................ 30 2.12.2 Pathologie ................................................................................................................ 30 2.12.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen ............................................... 30 2.12.4 Diagnostik ............................................................................................................... 31 2.12.5 Therapie ................................................................................................................... 31 2.12.6 Bedeutung................................................................................................................ 31 2.13 Hinweise auf hämotrophe Mykoplasmen beim Pferd .................................................... 32 2.14 Hämatologie beim Pferd ................................................................................................. 34 2.14.1 Normale Hämatologie ............................................................................................. 34 2.14.2 Periphere Blutausstriche mit besonderer Beachtung der Erythrozyten ................... 35 2.14.3 Hämolytische Anämie ............................................................................................. 36 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN .......................................................................................... 38 3.1 Material und Methoden .................................................................................................. 38 3.1.1 Tiermaterial ............................................................................................................. 38 3.1.2 Untersuchungsgruppen ............................................................................................ 38 3.1.3 Blutentnahme und Probenverarbeitung ................................................................... 40 3.1.4 Zytologische Untersuchung..................................................................................... 41 3.1.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) .......................................................................... 42 3.1.6 Hämatologische Messwerte..................................................................................... 42 3.1.7 Biometrische Analyse ............................................................................................. 42 3.2 Ergebnisse ....................................................................................................................... 44 3.2.1 Untersuchungsgruppen ............................................................................................ 44 3.2.2 Symptome................................................................................................................ 45 3.2.3 Zytologie ................................................................................................................. 46 3.2.4 Hämatologie ............................................................................................................ 54 3.2.5 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits .............................................................................. 58 3.2.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) .......................................................................... 59 4. DISKUSSION ........................................................................................................................ 60 4.1 Allgemeine Anmerkungen .............................................................................................. 60 4.2 Zytologie ......................................................................................................................... 61 4.3 Hämatologie.................................................................................................................... 63 4.4 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits .................................................................................. 64 4.5 Bewertung der Fragestellung .......................................................................................... 65 5. ZUSAMMENFASSUNG ...................................................................................................... 67 6. SUMMARY ........................................................................................................................... 70 7. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 73 8. ANHANG ............................................................................................................................ 112 8.1 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ 112 8.2 Herkunftsnachweis der verwendeten Materialien ........................................................ 113 8.3 Tabellarische Darstellung der Einzelergebnisse ........................................................... 114 8.4 Tabellenverzeichnis ...................................................................................................... 121 8.5 Abbildungsverzeichnis ................................................................................................. 122 8.6 Curriculum Vitae .......................................................................................................... 123 8.7 Dankwort ...................................................................................................................... 124 1 1. EINLEITUNG Hämotrophe Mykoplasmen (Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies) sind Bakterien, die die roten Blutzellen parasitieren. Infektionen mit hämotrophen Mykoplasmen sind beim Schwein (SPLITTER 1950; NEIMARK et al. 2002 b), beim Schaf und bei der Ziege (NEITZ et al. 1934; OVERAS 1969; NEIMARK et al. 2004), beim Rind (ADLER u. ELLENBOGEN 1934; NEIMARK et al. 2002 b), bei der Katze (CLARK 1942; FOLEY u. PEDERSEN 2001; NEIMARK et al. 2002 b; WILLI et al. 2005), beim Hund (TYZZER u. WEINMAN 1939; MESSICK et al. 2002) und bei der Maus (SCHILLING 1928; TYZZER u. WEINMAN 1939; NEIMARK et al. 2002 b, 2005) ausführlich beschrieben. Als Krankheitsverursacher sind diese hämotrophen Mykoplasmen-Spezies wissenschaftlich anerkannt. In der Massentierhaltung, wie zum Beispiel in den sehr großen Betrieben in der ehemaligen DDR, wird diesen Erregern eine bedeutende Rolle zugeschrieben (BUGNOWSKI 1988; BUGNOWSKI et al. 1989, 1990; WU et al. 2006). Verschiedene Fallberichte aus der letzten Zeit, u.a. beim Rind (ANON. 2007), beim Schwein (DE BUSSER et al. 2008), beim Schaf (PHILBEY et al. 2006) und beim Löwen (GUIMARAES et al. 2007 b), sowie die Beschreibung neuer hämotropher Mykoplasmen-Spezies bei der Katze (WILLI et al. 2005) und beim Rind (TAGAWA et al. 2008), zeigen zudem das aktuelle Interesse an diesem Thema. In der wissenschaftlichen Literatur sind bisher keine Publikationen über die systematische Untersuchung zum Vorkommen von hämothrophen Mykoplasmen beim Pferd veröffentlicht worden. Nur eine Veröffentlichung aus dem Jahr 1978 beschreibt die Haemobartonellose bei Pferden in Nigeria (GRETILLAT 1978). Seit einigen Jahren kommt es aber immer häufiger zu Berichten aus der Praxis über Diagnose und Behandlung einer vermuteten Eperythrozoonose bei Pferden. Zum Teil bitten die Pferdebesitzer den Tierarzt explizit darum, ihre Pferde auf diesen „Blutparasiten“ zu untersuchen. In verschiedenen Internetportalen ohne Anspruch auf Wissenschaftlichkeit, zum Beispiel dem “ Hufreheforum „ (www.hufreheforum.de), wird diese Materie von Pferdebesitzern ausführlich diskutiert. Laut Praxisberichten erfolgt der Nachweis dieser Parasiten beim Pferd an Hand einer lichtmikroskopischen Untersuchung eines Blutausstriches. Eine Behandlung wird mit Tetrazyklinen oder alternativen Heilverfahren durchgeführt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es zunächst, eine Übersicht über die wissenschaftlich beschriebenen hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei den unterschiedlichen Tierarten zu geben. Des Weiteren soll mittels einer explorativen epidemiologischen Studie die von vielen Tierärzten angenommene Kausalität zwischen Eperythrozoon (hämotrophe Mykoplasmen) und beobachteten klinischen Symptomen überprüft werden. 2 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Definition Hämotrophe Mykoplasmen (Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies) sind sehr kleine, pleomorphe Bakterien ohne Zellwand oder Flagellen, welche resistent gegen Penicillin, aber empfänglich für Tetrazyklin sind. Eine in-vitro Vermehrung ist nicht möglich. Die Erreger werden auch als Hämoplasmen bezeichnet. Es sind die Krankheitsverursacher der Eperythrozoonose und Haemobartonellose, bei der Katze auch als Infektiöse Anämie bekannt. Hämotrophe Mykoplasmen sind weitverbreitet und wurden bei vielen Tierarten und beim Menschen beschrieben (NEITZ 1968; PUNTARIC et al. 1986; GANTER et al. 1993; MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; TASKER 2006; HOELZLE 2007; WILLI et al. 2007 b). KIKUTH (1928) führte in Deutschland Übertragungsversuche auf splenektomierte Hunde durch und ordnete den von ihm beobachteten Bakterien das Genus Bartonella zu. Später wurde der Name Bartonella canis in Haemobartonella canis geändert (TYZZER u. WEINMAN 1939). Ebenfalls in Deutschland beschrieb SCHILLING (1928) diese Parasiten bei der weißen Maus. Mit dem Namen Eperythrozoon coccoides kennzeichnete er das kokkenähnliche Aussehen und die Beziehung zum Erythrozyten. Bis vor wenigen Jahren wurden die Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies den Rickettsien zugeordnet. Basierend auf der Analyse des 16S rRNA Gens wurden die Spezies neu zu den Mykoplasmen eingeteilt (NEIMARK et al. 2001, 2002 b, 2004, 2005; MESSICK et al. 2002). Eine Infektion verläuft im immunkompetenten Tier häufig latent und wird als Faktorenkrankheit angesehen, ein akuter Anfall kann durch Splenektomie hervorgerufen werden. Hauptsymptom ist eine hämolytische Anämie (NEITZ 1968; OVERAS 1969; MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; HOELZLE 2007). 2.2 Ätiologie 2.2.1 Nomenklatur Über die Namensgebung der Eperythrozoonose- und Haemobartonelloseverursacher besteht aus mehreren Gründen Uneinigkeit. Kürzlich wurden diese Erreger basierend auf der Analyse des 16S rRNA Gens umklassifiziert in das Genus Mycoplasma (Ordnung Mycoplasmatales). Auch über diese Neueinteilung in das Genus Mycoplasma besteht Kontoverse (UILENBERG et al. 2004). Davor wurden diese Spezies als Eperythrozoon und Haemobartonella in der Ordnung der Rickettsiales eingeteilt. Als eigenständige Genera waren Eperythrozoon und Haemobartonella neben Anaplasma der Familie der Anaplasmataceae zugeordnet (KREIER et al. 1992). Die Namen dieser Spezies, sowie deren Wirte, sind in den Tabellen 2.1 und 2.2 aufgelistet. Es wurde nie klar definiert, welche Kriterien darüber entscheiden, ob von Eperythrozoon oder von Haemobartonella zu sprechen ist. Hinzu kommt, dass von verschiedenen Autoren bei schon beschriebenen Spezies andere Namen verwendet wurden. So benutzen WEINMAN (1944) Haemobartonella wenyonii und SHERIFF et al. (1966) Bartonella bovis als Synonym für Eperythrozoon wenyonii. Haemobartonella felis wurde auch als Eperythrozoon felis bezeichnet (CLARK 1942). 3 Spezies Haemobartonella canis Wirt Hund Haemobartonella felis Katze Haemobartonella muris Maus und andere Rodentia TYZZER u. WEINMAN 1939 Waschbär FRERICHS u. HOLBROOK 1971 Haemobartonella procyoni Referenz TYZZER u. WEINMANN 1939 CLARK 1942 Tabelle 2.1: Beschriebene Haemobartonella-Spezies und deren Wirte Spezies Eperythrozoon coccoides Eperythrozoon parvum Wirt Maus und andere Rodentia Schwein Referenz SCHILLING 1928 Eperythrozoon suis Schwein SPLITTER 1950 Eperythrozoon ovis Schaf und Ziege NEITZ et al. 1934 Eperythrozoon wenyonii Rind SPLITTER 1950 Eperythrozoon teganodes Eperythrozoon tuomii Rind ADLER u. ELLENBOGEN 1934 HOYTE 1962 Rind UILENBERG 1967 Eperythrozoon mariboi Flughund EWERS 1971 Tabelle 2.2: Beschriebene Eperythrozoon-Spezies und deren Wirte Eperythrozoon tuomii wurde nur auf Thrombozyten der Rinder beobachtet (UILENBERG 1967; ZWART et al. 1970) und wird nicht weiter besprochen. Aus Tabelle 2.3 sind die Namen von Spezies zu entnehmen, die basierend auf Genanalyse umklassifiziert oder kürzlich entdeckt wurden. Nicht alle klassisch beschriebenen Spezies wurden umbenannt. Mit dem Zusatznamen Candidatus wird noch nicht vollständig beschriebenen Prokaryoten ein provisorischer Status verliehen (MURRAY u. STACKEBRANDT 1995). Der Candidatus Status darf aber nicht verwendet werden, um einer schon beschriebenen Spezies einen provisorischen neuen Namen zu geben (NEIMARK et al. 2002 b). Statt Mycoplasma suis ist auch der Name Mycoplasma haemosuis als neue Kombination fälschlicherweise benutzt worden (NEIMARK et al. 2001). Statt Mycoplasma haematoparvum benutzen einige Autoren auch Mycoplasma haemoparvum (KENNY et al. 2004). 4 Spezies Mycoplasma coccoides Wirt Maus Referenz NEIMARK et al. 2005 Mycoplasma haemomuris Maus NEIMARK et al. 2002 b Mycoplasma suis Schwein NEIMARK et al. 2002 b Mycoplasma ovis Schaf und Ziege NEIMARK et al. 2004 Mycoplasma wenyonii Rind NEIMARK et al. 2002 b Candidatus Mycoplasma haemobos Rind TAGAWA et al. 2008 Mycoplasma haemocanis Hund MESSICK et al. 2002 Candidatus Mycoplasma haematoparvum Hund SYKES et al. 2005 Mycoplasma haemofelis Katze und andere Feliden Katze und andere Feliden Katze und andere Feliden Beutelratte NEIMARK et al. 2002 b Alpaka MESSICK et al. 2002 Totenkopfaffen NEIMARK et al. 2002 a Candidatus Mycoplasma turicensis Candidatus Mycoplasma haemominitum Candidatus Mycoplasma haemodidelphidis Candidatus Mycoplasma haemolamae Candidatus Mycoplasma kahanei WILLI et al.2006 b FOLEY u. PEDERSEN 2001 MESSICK et al. 2002 Tabelle 2.3: Namen der hämotrophen Mykoplasmen nach neuer Einteilung in das Genus Mykoplasma und deren Wirte Ein Teil der genannten Spezies sind nicht vollständig beschrieben oder haben nicht korrekte Namen und sind deswegen nicht in die offizielle Liste der bakteriologischen Namen aufgenommen. Für eine Beschreibung der Regeln dieser Nomenklatur und die validierten Listen der bakteriologischen Namen wird auf die entsprechende Fachliteratur verwiesen (SKERMAN et al. 1980; SNEATH 1992; ANON. 2001; ANON. 2002). 2.2.2 Phylogenetischer Analyse Anhand von Gensequenzen des 16S rRNA Gens wurden phylogenetische Analysen für die in Tabelle 2.3 aufgelisteten Spezies durchgeführt (RIKIHISA et al. 1997; FOLEY u. PEDERSEN 2001; NEIMARK et al. 2001, 2004; MESSICK et al. 2002; TASKER et al. 2003 c; SYKES et al. 2005; WILLI et al. 2005, 2006 a, b; TAGAWA et al. 2008). Phylogenetische Stammbäume wurden erstellt und zeigen eine große Homologie zwischen den beschriebenen hämotrophen Mykoplasmen. So haben die Gensequenzen des 16S rRNA Gens von Candidatus M. turencis 92%ige Ähnlichkeit mit denen von M. coccoides und 90%ige Ähnlichkeit mit denen von M. haemomuris (WILLI et al. 2006 b). Auf Grund dieser Analysen werden die hämotrophen Mykoplasmen der Pneumoniae Gruppe der Mykoplasmen der Klasse der Mollicutes zugeteilt (NEIMARK et al. 2001). Eine sehr enge Verwandtschaft von Mycoplasma cavipharyngis und 5 Mycoplasma fastidiosum (beide aus dieser Pneumoniae Gruppe) und den hämotrophen Mykoplasmen wurde beschrieben (JOHANSSON et al. 1999). Das Genom besteht aus einer zirkulären, doppelsträngigen DNA, wovon die Größe bei M. suis auf 745 kbp geschätzt wurde (MESSICK et al. 2000 b). Dies stellt eine theoretische Minimalgröße für die Fähigkeit zur AutoReplikation dar (HOELZLE 2007). Das Genom von M. haemofelis wurde auf 1245 kbp geschätzt und 75 Gene wurden beschrieben (BERENT u. MESSICK 2003). HARASAWA et al. (2002) untersuchten die 16S-23S rRNA Region von M. haemomuris. Diese genetischen Analysen bekräftigen sämtlich die Verwandtschaft mit der Pneumonia Gruppe der Mykoplasmen. Abbildung 2.1 zeigt die hieraus folgende taxonomische Leiter. Bakterien Domäne Firmicutes Abteilung Mollicutes Klasse Mycoplasmateles Ordnung Mycoplasmataceae Familie Mykoplasmen Genus Pneumoniae Gruppe der Mykoplasmen hämotrophe Mykplasmen Spezies Abbildung 2.1: Taxonomische Leiter der hämotrophen Mykoplasmen Bis vor Kurzem war es fraglich, ob M. felis und M. haemocanis nicht die gleiche Spezies repräsentierten (LUMB 2001). Eine Analyse des RNase P Gens zeigte aber zwei genetisch deutlich unterschiedliche Spezies (BIRKENHEUER et al. 2002). Innerhalb M. felis werden auf Grund morphologischer, pathogener und genetischer Eigenschaften eine große und eine kleine Form dieser hämotrophen Mykoplasmen beschrieben (FOLEY et al. 1998). Auf Grund weiterer Genanalysen unterschied man verschiedene Stämme, die geografisch unterschiedlich vorkommen (JENSEN et al. 2001; TASKER et al. 2001; CLARK et al. 2002). Nach neustem Wissen wurden diese Isolate, die „Ohio“ und „California“ Stämme, jetzt als M. haemofelis, beziehungsweise Candidatus M. haemominitum bezeichnet (WILLI et al. 2007 b). 2.2.3 Sonstige hämotrophe Mykoplasmen Bei einer Gruppe anämischer Rentiere wurden die klinischen Symptome der Eperythrozoonose beobachtet. Basierend auf zytologischen Untersuchungen wurde DNA aus Blut von den betroffenen Tieren mittels PCR verarbeitet. Die phylogenetische Analyse ergab eine große Homologie mit Gensequenzen bekannter hämotrophe Mykoplasmen (STOFFREGEN et al. 2006). PETERS et al. (1974) beschrieben die Anwesenheit von Eperythrozoon-ähnlichen Strukturen im Blut von Affen und legten deren Morphologie mittels Elektronenmikroskop fest. In einer anderen Gruppe anämischer Affen wurden Haemobartonella-ähnliche Strukturen im Blut 6 festgestellt und mittels Elektronenmikroskop morphologisch beschrieben. Der Zusammenhang zwischen diesen Strukturen und der Anämie blieb aber unklar (DILLBERGER et al. 1994). Humane Eperythrozoonose wurde zum ersten Mal von PUNCTARIC et al. (1986) im ehemaligen Jugoslawien beschrieben. Seitdem wird aus China diese Krankheit sporadisch gemeldet. Erstaunlicherweise findet die Diagnostik auch heute noch mittels Licht-, Elektronenmikroskopie und Inokulation von Tieren statt. Ein PCR ist bisher in der humanen Diagnostik nicht beschrieben worden (YANG et al. 2000). 2.2.4 In Situ Hybridisation In Gewebeproben infizierter Schweine und Katzen wurde mittels In Situ Hybridisationen DNA der hämotrophen Mykoplasmen angezeigt. Dies gilt als starker Beweis dafür, dass hämotrophe Mykoplasmen ursächliches Agens bei Infektionen dieser Art sind (GWALTNEY et al. 1993 b; BERENT et al. 2000; HA et al. 2005). Auch elektronenmikroskopisch wurden von hämotrophen Mykoplasmen befallene Erythrozyten in Makrophagen der Lunge und der Milz angezeigt (SIMPSON et al. 1978). 2.3 Morphologie 2.3.1 Feinstrukturelle Morphologie Die feinstrukturellen Eigenschaften von H. muris wurden 1965 von TANAKA et al. zum ersten Mal beschrieben und mit denen von E. coccoides und Mycoplasma pulmonis verglichen. Seitdem wurde die Morphologie von H. felis (SMALL u. RISTIC 1967; DEMAREE u. NESSMITH 1972; JAIN u. KEETON 1973; SIMPSON et al. 1978), H. canis (VENABLE u. EWING 1968; McKEE et al. 1973), E. ovis (McKEE et al. 1973; ICHIJO et al. 1982; GULLAND et al. 1987 a), E. wenyonii (KEETON u. JAIN 1973) und E. suis (POSPISCHIL u. HOFFMANN 1982; ZACHARY u. BASGALL 1985; LIEBICH u. HEINRITZI 1992) mittels licht- und elektronenmikroskopischer Studien dokumentiert. Auch von nicht näher identifizierten hämotrophen Mykoplasmen bei Affen (PETERS et al. 1974; DILLBERGER et al. 1994), Waschbären (FRERICHS u. HOLBROOK 1971), Lamas (REAGAN et al. 1990), Menschen (DUARTE et al. 1992), Beutelratten (MESSICK et al. 2000 a), Alpakas (MESSICK et al. 2002) und Rentieren (STOFFREGEN et al. 2006) wurden die feinstrukturellen Eigenschaften dokumentiert. Es wurde ein großes Maß an Übereinstimmung der morphologischen Eigenschaften zwischen den verschiedenen hämotrophen Mykoplasmen festgestellt. Sie kommen in vielen Erscheinungsformen vor, meistens rund bis lang gestreckt, und haben einen Durchmesser von 0,3 bis 3 μm. Je nach Vermehrungsstadium unterscheidet man bei E. suis kokkoide unreife, diskusförmige jugendliche und ringförmige reife Organismen (ZACHARY u. BASGALL 1985). Während akuten eperythrozoonotischen Anfällen bei Schweinen wurden diese Erscheinungsformen auf der Erythrozyten-Membran nebeneinander beobachtet, wobei bei chronisch infizierten Schweinen kreisrunde bis elliptische, abgerundete Ruheformen zu erkennen waren (LIEBICH u. HEINRITZI 1992). Beim Schaf wurden Hinweise gefunden, dass die Erscheinungsform mit dem Grad der Bakteriämie zusammen hängt (GULLAND et al. 1987 a). 7 So wie alle Prokaryoten haben hämotrophe Mykoplasmen keinen Zellkern und im Zytoplasma sind kleine Granulen und filamentöse Strukturen zu finden. Die meisten Autoren beschreiben nur eine einzelne Zellmembran, von der das Zytoplasma umgeben wird. SMALL und RISTIC (1967) beobachteten bei H. felis eine doppelte Membran. Die hämotrophen Mykoplasmen befinden sich in Eindellungen oder Falten der Erythrozyten-Membran, aber es wurden auch freie Formen beobachtet. Abbildung 2.2 zeigt ein elektronenmikroskopisches Bild von einem von M.suis befallenen porcinen Erythrozyten. Eine intrazelluläre Invasion der Erythrozyten wurde nicht nachgewiesen. Ein 15 bis 25 nm breiter Spalt trennt die Bakterien von der Erythrozyten-Membran. Die Bindung scheint von Mikrofilamenten versorgt zu werden. Durch gemeinsamen Kontakt mit den Organismen können mehrere Erythrozyten miteinander verbunden werden (VENABLE u. EWING 1968; SIMPSON et al. 1978). Die Vermehrung findet durch Spaltung oder Knospung statt (DEMAREE u. NESSMITH 1972; KEETON u. JAIN 1973). Die Eindellungen der Erythrozyten-Membran, sowie die hämotrophen Mykoplasmen (1) sind deutlich erkennbar. 17.000 x (Foto: Dr. L. Hoelzle) Abbildung 2.2: Elektronenmikroskopisches Bild eines von M. suis befallenen Erythrozyten des Schweines 8 2.3.2 Lichtmikroskopische Morphologie Im peripheren Blutausstrich sind die hämotrophen Mykoplasmen vereinzelt, in Ketten, als Aggregate oder als Ringe lichtmikroskopisch zu beobachten und werden marginal, mittig oder verteilt über der gesamten Oberfläche der Erythrozyten angetroffen. Im Plasma werden auch freie Formen gefunden. Die pleomorphen Strukturen sind meistens als Ring- oder Stäbchenform erkennbar (VENABLE u. EWING 1968; OVERAS 1969; ICHIJO et al. 1982; MESSICK et al. 2000 a). Die Ketten können sich aufteilen und eine Y-Form oder streichholz-ähnliche Form annehmen (KIKUTH 1928; MESSICK 2003). Die Erscheinungsform von E. ovis änderte sich unter Einfluss der Außentemperatur und Lagerungszeit im Blutröhrchen. Auch innerhalb eines Blutausstrichs und zwischen Blutausstrichen von demselben Tier wurden Unterschiede im Aussehen beobachtet (OVERAS 1969). Abbildung 2.3 zeigt das mikroskopische Bild der hämotrophen Mykoplasmen in einem Ausstrich infizierten Schweineblutes nach Anfärbung mit Akridin-Orange. Sowohl auf den Erythrozyten, als auch in freier Form sind die hämotrophen Mykoplasmen (M. suis) als orange Punkte deutlich erkennbar. Die Erythrozyten stellen sich grün dar. Akridinorange Färbung, 1000 x (Foto: Dr. L. Hoelzle) Abbildung 2.3: Fluoreszenz-Mikroskopisches Bild 9 2.4 Pathogenese 2.4.1 Übertragung Die natürlichen Übertragungsmechanismen der hämotrophen Mykoplasmen sind noch teilweise ungeklärt (WILLI et al. 2007 b). Experimentelle Übertragungen infizierten Blutes durch orale, intravenöse, subkutane und intraperitoneale Inokulation waren erfolgreich (THURSTON 1955; FLINT et al. 1958; OVERAS 1969). Iatrogene Übertragung durch zootechnische Eingriffe (HENRY 1979; WEIKEL und GRAUNKE 1995; HASHEMI-FESHARKI 1997) und Bluttransfusionen (LESTER et al. 1995; SYKES et al. 2004; GARY et al. 2006; WILLI et al. 2006 c; PAUL et al. 2008) sind wahrscheinlich. Es wird vermutet, dass blutsaugende Arthropoden eine wichtige Rolle in der Transmission spielen. Hämotrophe Mykoplasmen-DNA wurde bei unterschiedlichen Arthropoden nachgewiesen. Diese wurden zum einen auf Tieren gesammelt (SHAW et al. 2004; LAPPIN et al. 2006), aber auch in freier Form auf Vegetation aufgefunden (TAROURA et al. 2005). Übertragungsexperimente mittels verschiedener Arthropoden verliefen aber nicht eindeutig (OVERAS 1969; SENEVIRATNA et al. 1973; BERKENKAMP u. WESCOTT 1988; PRULLAGE et al. 1993; WOODS et al. 2005, 2006). In der Studie von GRINDEM et al. (1990) war die Anwesenheit von Flöhen bei Katzen kein erhöhtes Risiko für Haemobartonellose. Klimatische Umstände beeinflussen das Vorkommen unterschiedlicher Arthropoden und können so indirekt die Infektionsfrequenz beeinträchtigen (SHERIFF et al. 1966; WILLI et al. 2007 a; WENGI et al. 2008). Rodentia scheinen kein Reservoir für feline hämotrophe Mykoplasmen zu sein (WILLI et al. 2007 a). Eine direkte Übertragung über Speichel und Fezes könnte bei Katzen eine wichtige Rolle spielen. Hämotrophe Mykoplasmen-DNA wurde in diesen Exkretionen nachgewiesen (WILLI et al. 2007 a). Zudem wurde eine signifikante Assoziation von hämotrophen MykoplasmenInfektionen mit dem männlichen Geschlecht, Freigang, und Beiß-Abszessen beschrieben (GRINDEM et al. 1990; TASKER et al. 2003 a; LURIA et al. 2004; WILLI et al. 2006 b). Bei Schweinen wurde die vertikale Übertragung beschrieben (BERRIER u. GOUGE 1954; HENDERSON et al. 1997). Bei Lamas wurden Infektionen bei Neugeborenen festgestellt und eine in utero Übertragung für wahrscheinlich gehalten (FISHER u. ZINKL 1996; ALMY et al. 2006). YANG et al. (2000) wiesen beim Menschen Eperythrozoon in der Nabelschnur nach, sowie im peripheren Blutausstrich von neugeborenen Babys. Beim Schaf wurden keine kongenitalen Infektionen beobachtet. Die infizierten Lämmer waren älter als 5 Monate (OVERAS 1969). Hämotrophe Mykoplasmen werden als wirtspezifisch betrachtet. Eperythrozoon wenyonii konnte nicht erfolgreich auf Ziegen, Hirsche oder splenektomierte Schafe übertragen werden (NEITZ 1940; KREIER u. RISTIC 1963). Im Rahmen von Kreuzexperimenten mit mit hämotrophen Mykoplasmen infizierten Hunden und Katzen konnte keine eindeutige Übertragung zwischen diesen Spezies festgestellt werden (LUMB 2001). Auch nicht näher identifizierte hämotrophe Mykoplasmen von Lamas konnten bei Schweinen, Schafen und Katzen keinen Bakteriämie oder Anämie auslösen. Auch die Serologie verlief in diesen Experimenten negativ (McLAUGHLIN et al. 1991). Demgegenüber zeigten Übertragungsexperimente bei Schafen und 10 Ziegen, dass beide Spezies für E. ovis empfindlich sind (DADDOW 1979 b, c; MASON u. STATHAM 1991 a). Beim Waschbär isolierte Haemobartonella Spezies wurden bei 6 anderen Tierarten, darunter ein Hund, inokuliert. Diese Tierarten wurden als nicht empfindlich befunden (FRERICHS u. HOLBROOK 1971). 2.4.2 Stadien der Infektion Der Krankheitsverlauf einer hämotrophen Mykoplasmen-Infektion kann in eine präparasitäre, eine akute, eine Herstell- und eine Träger-Phase eingeteilt werden (ALLEMAN et al. 1999). Die präparasitäre Phase oder Inkubationszeit beträgt bei der Katze zwei bis drei Wochen (FOLEY et al. 1998; WESTFALL et al. 2001; TASKER et al. 2006 b). Bei splenektomierten Schweinen wurden experimentell nach drei Tagen die ersten Erreger im Blut festgestellt (BUGNOWSKI et al. 1990). In der Praxis treten klinische Erscheinungen meist 3 bis 4 Tage nach Stressbelastungen auf (HEINRITZI 1983). Beim Schaf lag die Inkubationszeit bei intravenös inokulierten, intakten Schafen durchschnittlich bei 4,5 Tage (OVERAS 1969). Die Bakteriämie erreicht meist zwischen zwei bis vier Wochen post-Infektion seinen Gipfel (OVERAS 1969; WILLI et al. 2005), ist aber variabel und kann sogar mehrere Monate anhalten (OVERAS 1969). Experimente an splenektomierten Schweinen zeigten schon nach fünf Tage einen 100% Befall der Erythrozyten (BUGNOWSKI et al. 1990). Der Einfluss der Infektion auf den Hämatokrit ist abhängig von dem Grad und der Länge der Bakteriämie (OVERAS 1969). Bei Tieren, die die akute Phase überlebt haben, steigt der Hämatokrit in der Herstellphase langsam wieder an (SYKES 2003). Chronisch infizierte Tiere bleiben häufig Träger, auch wenn Antibiotika verabreicht werden (HEINRITZI 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; MESSICK 2003, 2004; HOELZLE 2007). Diese Träger können andere Tiere anstecken oder selbst wieder durch Reaktivierung erkranken (FOLEY et al. 1998; FOLEY u. PEDERSEN 2001). Chronisch erkrankte Schweine sind sehr empfänglich für faktorenabhängige Mischinfektionen (BUGNOWSKI 1988). 2.4.3 Erythrozyten-Beschädigung Bei an Infektiöser Anämie erkrankten Katzen wurden ultrastrukturelle Untersuchungen durchgeführt. Dabei zeigten sich deutliche Veränderungen an der Zelloberfläche der Wirterythrozyten durch die Anheftung der Parasiten, so dass von einer direkten Beschädigung ausgegangen wird (SMALL u. RISTIC 1967; JAIN u. KEETON 1973). Bei Schwein und Rind wurden diese Zellmembran-Veränderungen vorerst nicht beobachtet (KEETON u. JAIN 1973; POSPISCHIL u. HOFFMANN 1982). Abhängig vom Stadium der Infektion wurden aber auch bei E. suis-infizierten roten Blutzellen gravierende Membran-Veränderungen festgestellt (ZACHARY u. BASGALL 1985). Sowohl bei Schweinen, Schafen, Mäusen als auch bei Katzen führt eine akute Infektion zu einer Erniedrigung der osmotischen Resistenz der rote Blutzellen (THURSTON 1954; OVERAS 1969; MAEDE u. HATA 1975; HEINRITZI u. PLANK 1992). Auch Kälteagglutininen könnten über immunologische Mechanismen zu einer indirekten Beschädigung der Erythrozyten-Membran führen (COX u. CALAF-ITURRI 1976; BELLAMY et al. 1978; IRALU u. GANONG 1983; ZACHARY u. SMITH 1985; JÜNGLING et al. 1994; ZULTY u. KOCIBA 1990; SCHMIDT et al. 1992). Bei verschiedenen Tierarten wurde während der Infektion ein positiver Coomb’s Test festgestellt (SHERIFF 1967; SHERIFF u. GEERING 1969; MAEDE u. HATA 1975; BUNDZA et al. 1976; ZULTY u. KOCIBA 1990). Bei 11 infizierten Katzen wurden erhöhte Zahlen von Erythrozyten beobachtet, die intrazelluläre kristalloide Strukturen aufwiesen (SIMPSON et al. 1978). Die Einschränkung der Flexibilität zur Formveränderung der Zellen könnte so zur schnelleren Entfernung durch das Retikuloendotheliale System aus dem Blut führen (SYKES 2003). Die resultierende Anämie beruht bei Katzen hauptsächlich auf einer extravaskulären Hämolyse (SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Intravaskuläre Hämolyse wurde bei einer Candidatus M. turicensis-Infektion beschrieben (WILLI et al. 2005). Bei Schafen scheint intravaskuläre Hämolyse Hauptmechanismus der Erythrozyten-Entfernung zu sein (OVERAS 1969, 1987; SUTTON 1978). 2.4.4 Einfluss auf den Säure-Basen-Haushalt und den Kohlenhydratstoffwechsel Sowohl bei Schweinen als auch bei Schafen wurden massive metabolische Störungen im Zusammenhang mit der akuten Phase der Eperythrozoonose festgestellt. Die Blutkonzentrationen von Lactat und Pyruvat, sowie der pCO2 sind stark erhöht, Bicarbonat ist herabgesetzt, und die Basenabweichung ist negativ (SUTTON 1976; ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 c; HEINRITZI et al. 1990 a, b). Die vorliegende Blutazidose setzt sich aus einer metabolischen und respiratorischen Komponente zusammen (HEINRITZI 1989; HEINRITZI et al. 1990 b). Ein sehr starker Abfall des Blutzuckerspiegels tritt auf und kann zu einer möglicherweise lebensbedrohlichen Situation führen. Dieser Glucoseabbau ist nachweislich mit dem Stoffwechsel des Parasiten assoziiert (SUTTON 1976; ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 c; HEINRITZI et al. 1990 a, b; SMITH et al. 1990 b; NONAKA et al. 1996; BURKHARD u. GARRY 2004). Auch eine latente Infektion führt beim Schwein zu einer kontinuierlichen Abnahme des Blutzuckerspiegels (HEINRITZI 1989; HEINRITZI et al. 1990 a). 2.5 Immunologie Immunologische Reaktionen scheinen eine wichtige Rolle in der Entwicklung der Anämie zu spielen. Die akute Phase der Krankheit geht mit der Bildung von Kälteagglutininen einher und wurde bei den meisten Tieren nachgewiesen (COX u. CALAF-ITURRI 1976; BELLAMY et al. 1978; IRALU u. GANONG 1983; ZACHARY u. SMITH 1985; ZULTY u. KOCIBA 1990; SCHMIDT et al. 1992; JÜNGLING et al. 1994). Es handelt sich um Antikörper der Klasse IgM, welche nicht gegen den Erreger, sondern gegen Antigene der Erythrozytenmembran gerichtet sind. Auch Auto-Antikörper der Klasse IgG wurden beschrieben (HOELZLE et al. 2006). Immunkomplexe könnten in der Haut zu Überempfindlichkeitsreaktionen mit Ödem-Bildung führen, wie es schon beim Rind vermutet wird (MONTES et al. 1994). Auch beim Schwein sind allergische Hauterscheinungen beschrieben (HEINRITZI 1983). Tiere, die die Krankheit überstanden haben, bleiben empfindlich und können wieder erkranken (FLINT et al. 1959; BUGNOWSKI 1988). Es scheint nur eine kurzzeitige Immunität aufzutreten, wobei keine richtigen protektiven Antikörper gebildet werden (BUGNOWSKI 1988). Der Verlauf der Antikörperbildung nach klinischer Erkrankung ist beim Schwein wellenförmig und persistiert nur zwei bis drei Monate. Eine Boosterreaktion wurde nicht beobachtet (BALJER et al. 1989). In der latenten Phase stellt sich wahrscheinlich ein Gleichgewicht zwischen Wirt, Erreger und Umwelt ein, wobei bei Zerstörung dieses 12 Gleichgewichts ein neuer Anfall auftreten kann (BUGNOWSKI 1988; BALJER et al. 1989). Splenektomierte Schweine scheinen mehr IgM zu produzieren, wobei bei intakten Tieren der Titer länger anhält (HEINRITZI 1989). Eine erregerspezifische Immunantwort mittels Immunglobulinen der Klasse G wurde kürzlich bei dieser Tierart veröffentlicht, wobei die protektiven Eigenschaften noch untersucht werden müssen (HOELZLE 2007). Studien am Schaf zeigten teilweise eine Protektion, ausgehend von Antikörpern in hyperimmunen Sera (HUNG u. LLOYD 1985). Zudem waren Lämmer, die von latent infizierten Schafen gesäugt wurden, gegen klinische Erkrankungen bis zum Absetzten geschützt (DADDOW 1982). Hauptantigene von M. haemofelis (ALLEMAN et al. 1999) und M. suis (HOELZLE et al. 2006, 2007a, c, d) sind beschrieben worden. Die Rolle solcher Antigene in der Entwicklung von Schutzimpfungen erfordert weitere Untersuchungen (SYKES 2003; HOELZLE 2007). Kreuzimmunität zwischen M. haemofelis und Candidatus M. haemominitum wurde beschrieben (FOLEY et al. 1998; FOLEY u. PEDERSEN 2001). Während der akuten Phase scheint der zelluläre Immunrespons reduziert zu sein (ZACHARY u. SMITH 1985). 2.6 Diagnostik 2.6.1 Einleitung 1928 beschrieb SCHILLING die lichtmikroskopische Diagnose der Eperythrozoonose bei weißen Mäusen. Latente Infektionen ließen sich durch Splenektomie hervorrufen und konnten auch durch Blutimpfung auf vorher negative und entmilzte Mäuse übertragen werden. Dabei erkrankten die inokulierten Tiere schnell und die Erreger konnten lichtmikroskopisch im peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden. Die Diagnose an Hand der klinischen Symptome kann nur während eines akut verlaufenden Krankheitsprozesses mit Sicherheit gestellt werden, obwohl die Symptomatik sicher nicht pathognomonisch ist. Außerhalb der akuten klinischen Phase ist die Diagnose schwierig zu stellen, wobei ein direkter Erregernachweis durch PCR oder ein indirekter Erregernachweis durch Serologie Anwendung finden. Der Goldstandard zur Diagnose chronisch latenter Infektionen bleibt auch heute noch der mikroskopische Nachweis einer Bakteriämie nach Splenektomie verdächtiger Tiere oder nach Übertragung einer verdächtigen Blutprobe auf bereits splenektomierte Versuchstiere (BUGNOWSKI et al. 1989; HOELZLE 2007). Hämotrophe Mykoplasmen wurden bisher nicht in vitro kultiviert (OVERAS 1969; MESSICK 2004; HOELZLE 2007; WILLI et al. 2007 b). 2.6.2 Direkter Erregernachweis Während der akuten Phase der Eperythrozoonose können die Erreger in hoher Zahl lichtmikroskopisch im peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden (SCHILLING 1928; OVERAS 1969; PURNELL et al. 1976; HEINRITZI 1990; MESSICK 2003). Der Zeitraum dieser Bakteriämie ist aber sehr kurz und variabel, wodurch mit falsch negativen Ergebnissen gerechnet werden muss (OVERAS 1969; HEINRITZI 1990; ALLEMAN et al. 1999; MESSICK 2003). Sogar innerhalb weniger Stunden könnte ein Zustand mit deutlicher Bakteriämie in einen Zustand übergehen, in dem kaum Organismen nachzuweisen sind (ALLEMAN et al. 1999; MESSICK 2003). Im Übrigen wurden auch sehr starke Schwankungen in der nachweisbaren 13 DNA von M. haemofelis innerhalb kürzester Zeit beobachtet (TASKER et al. 2006 b). Um eine höhere Wahrscheinlichkeit zu erreichen, die Bakterien im Blut anzutreffen, könnte man mehrere Ausstriche über einen bestimmten Zeitraum anfertigen (TASKER u. LAPPIN 2002). OVERAS (1969) beschrieb einen starken Einfluss der Außentemperatur, bei der die Blutentnahme und die Anfertigung des Ausstrichs stattfanden, auf die Nachweishäufigkeit von E. ovis. Auch zwischen Ausstrichen derselben Blutproben und innerhalb eines Ausstrichs wurde einige Variabilität im Nachweis festgestellt. Eine längere Aufbewahrungszeit der Blutproben bis zur Anfertigung der Ausstriche könnte zur Lösung der Mikroorganismen von der Erythrozytenmembran und auch zur Änderung der Morphologie führen. Auch EDTA könnte zur Lösung der Bakterien von der Zellmembran führen und so die Identifizierung erschweren (HALL et al. 1988; ALLEMAN et al. 1999). Das Bewerten von Artefakten, Heinz-Körpern oder Howell-Jolly-Körpern als Mikroorganismen führt schnell zur falsch positiven Ergebnisse (OVERAS 1969; HENRY 1979; HEINRITZI 1990; TASKER u. LAPIN 2002; SYKES 2003). Farbartefakte werden häufig oberhalb der Fokusfläche der Erythrozyten gefunden (TASKER u. LAPPIN 2002). Routinemäßig werden die Blutausstriche mit einer Romanowsky-Typen Färbung gefärbt (SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Um Artefakte zu vermeiden, sollten neue gefilterte Farblösungen verwendet werden (TASKER u. LAPPIN 2002). Die Anwendung einer Färbung mittels Akridinorange zum Nachweis von Kernmaterial könnte die Sensitivität und Spezifität erhöhen, setzt aber die Verfügbarkeit eines Fluoreszenz-Mikroskops voraus (BOBADE u. NASH 1987). Um den Infektionsgrad der Erythrozyten zu erfassen, wurden verschiedene Schlüssel beschrieben (NEITZ 1937; THURSTON 1953; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969; MCLAUGHLIN et al. 1990). Beispielhaft zeigt Tabelle 2.4 die Schlüssel nach HEINRITZI et al. (1984). TASKER et al. (2003 a) beurteilen 10 Blickfelder. Identifikation von drei oder mehr Mikroorganismen ergibt ein positives Ergebnis, weniger als drei oder nicht eindeutige Strukturen ein fragliches, und das Nicht-Vorhandensein von Mikroorganismen ein negatives Ergebnis. Grad 0 1 2 3 4 5 6 Befallstärke keine Eperythrozoon im Ausstrich vereinzelt E.suis im Ausstrich max. 10% der Erythrozyten mit E. suis behaftet max. 25% der Erythrozyten mit E. suis behaftet max. 50% der Erythrozyten mit E. suis behaftet max. 75% der Erythrozyten mit E. suis behaftet alle Erythrozyten mit mindestens 1 E. suis behaftet (HEINRITZI et al. 1984) Tabelle 2.4: Infektionsgrad der Erythrozyten mit E. suis 1990 wurde von OBERST et al. (1990 a, b) E. suis- DNA im Blut von Schweinen mittels Hybridisierung detektiert. Drei Jahre später wurden von GWALTNEY et al. (1993 a) und OBERST et al. (1993) die ersten PCR-Assays zum Nachweis von E. suis beschrieben. Heutzutage ist die PCR-Untersuchung die beste Methode zur Diagnose von hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen (WILLI et al. 2007 b). Die PCR-Untersuchung ist ein hoch sensitiver 14 Test, bei dem eine niedrige Zahl von spezifischen DNA-Fragmenten amplifiziert wird und detektiert werden kann (TASKER u. LAPPIN 2002). Beim Nachweis von Bakterien mittels PCR ist das ribosomale RNA Gen das wichtigste Angriffsziel in vielen Tests. Strukturell ist dieses Gen aus drei Gensequenzen (16S, 23S und 5S) und zwei Spacer Regionen aufgebaut (SACHSE 2003). Viele der PCR-Assays zum Nachweis von hämotrophen Mykoplasmen beruhen auf der Amplifikation von 16S rRNA DNA-Sequenzen (TASKER u. LAPPIN 2002; HOELZLE 2007). HOELZLE et al. (2003, 2007 b) beschrieben PCR-Assays basierend auf EcoRI-Genomfragment und MSG1 Gen als M. suis Ziel-DNA. Die Entwicklung von Real-time PCR-Assays (COOPER et al. 1999; TASKER et al. 2003 b, 2004 a; BRADDOCK et al. 2004; LOBETTI u. TASKER 2004; SYKES et al. 2007 a, b; HOELZLE et al. 2007 b; GATTINGER et al. 2008; PETERS et al. 2008; WENGI et al. 2008) ermöglicht den quantitativen Nachweis von hämotropher Mykoplasmen-DNA. Dies ist hilfreich bei der Beurteilung des Infektionsgrades und dem Erfolg einer Antibiotikatherapie. Zudem bleiben bei diesem Verfahren die Reaktionsbehälter geschlossen, wodurch Kontamination vermieden wird und die Tests zuverlässiger sind (WILLI et al. 2007 b). 2.6.3 Indirekter Erregernachweis Die serologischen Methoden werden bei den einzelnen Tierarten besprochen. 15 2.7 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schwein 2.7.1 Symptome 2.7.1.1 Klinisches Erscheinungsbild Das klinische Bild einer hämotrophen Mykoplasmen-Infektion kann von asymptomatisch bis zu einer lebensbedrohlichen akuten hämolytischen Krise variieren. In wie weit sich die Krankheit präsentiert, hängt von viele Faktoren ab, wie z.B. der involvierten hämotrophen MykoplasmenSpezies, der Tierart, dem Stadium der Infektion, der Empfindlichkeit des Wirtes, den Haltungsbedingungen, sowie den immunsuppressiven Umständen und Begleitkrankheiten (OVERAS 1969; HARBUTT 1969 a; UILENBERG 1981; GULLAND et al. 1987 b; NICHOLLS et al. 1989; WILLI et al. 2007 b). Chronische Infektionen werden typischerweise bei nicht splenektomierten, immunkompetenten Tieren beobachtet (MESSICK 2004). Beim Schwein ist der akute Anfall durch hohes Fieber, Anorexie, Dyspnoe, Anämie, milden Ikterus und Zyanosen an den Akren gekennzeichnet und wird vor allem bei Absetzern und Mastschweinen beobachtet. Die Diagnose an Hand dieser Symptome wäre in der akuten Phase möglich (HENRY 1979; BRÖMEL u. ZETTL 1985; BUGNOWSKI 1988; HOELZLE 2007). Nach der akuten Phase werden Produktionsverluste durch Abfall der zootechnischen Leistungen evident. Es handelt sich hier um Störungen der Fertilität und des Wachstums. Auch werden verschiedene Mischinfektionen beobachtet. Am individuellen Tier sind Folgeerscheinungen der überstandenen Anfälle sichtbar wie Ohrrandnekrose und Kachexie. Zudem wurden Vulva- und Mamma-ödem beobachtet (BROWNBACK 1981; ZINN et al. 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; BUGNOWSKI 1988; HENDERSON et al. 1997; MESSICK 2004). 2.7.1.2 Hämatologische Veränderungen Die Veränderungen im Blutbild bei hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen sind der Hämolyse zuzuschreiben. Meistens betrifft es hier eine regenerative Anämie, häufig gekennzeichnet durch eine Normozytose, Makrozytose oder Anisozytose, Retikulozytose und Normo- oder Polychromasie (HARBUTT 1969 a; SUTTON et al. 1977; HENDERSON et al. 1997; MESSICK 2003, 2004; LOBETTI u. TASKER 2004; WILLI et al. 2007 b). Beim Schwein wurden neben Erythroblasten als Ausdruck einer verstärkten Erythropoese auch gelegentlich Heinzsche und Howell-Jolly Körperchen beobachtet (BUGNOWSKI et al. 1989). Beim Schwein zeigt die akute Phase bei splenektomierten Tieren einen klassischen Verlauf, wobei die hämatologischen Werte -zusammen mit der Körpertemperatur- eng verbunden mit der Bakteriämie sind (Abbildung 2.4). Es kommt zu einem massiven Abfall der Erythrozyten, des Hämatokrits und des Hämoglobins, mit einem Tiefpunkt ungefähr 4 Tage nach Beginn des Anfalls (HEINRITZI et al. 1984; BUGNOWSKI et al. 1989; HEINRITZI 1989). Der Höhepunkt der Fieberphase wird von einer deutlichen Leukozytose begleitet (BUGNOWSKI et al. 1989). 16 E.suis/1000 Ery 800 600 400 E.suis/1000 Ery 200 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Erythrozyten 6 5 4 3 2 1 0 Erythrozyten T/l 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Körpertemperatur 42 41 40 39 Körpertemperatur °C 38 37 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Geändert nach HEINRITZI (1989) Abbildung 2.4: Klassischer Verlauf der Bakteriämie, Erythrozytenzahl und Körpertemperatur beim infizierten, klinisch unauffälligen Schwein nach Splenektomie am Tag 1 2.7.2 Pathologie 2.7.2.1 Sektionsbild Ausführliche Beschreibungen der pathologisch-anatomischen Veränderungen liegen hauptsächlich bei Schweinen und Schafen vor. Abweichungen werden abhängig von der Phase der Infektion angetroffen (NEITZ 1937; HENDERSON et al. 1997). Als deutlicher Hinweis auf das Vorliegen von Eperythrozoonose wird die sofortige Agglutination des Blutes bei Gefäßaustritt angesehen (HEINRITZI 1983; HEINRITZI et al. 1984). Sehr auffällig ist eine starke Vergrößerung der Milz (BRÖMEL u. ZETTL 1985). Neben unspezifischen Merkmalen wie Abmagerung wird das Sektionsbild weiter von einer allgemeinen Blässe und/oder 17 Gelbfärbung beherrscht (BRÖMEL u. ZETTL 1985; BUGNOWSKI et al. 1990). Vermehrte Körperhöhlenflüssigkeiten und Ödeme sind häufig anzutreffen (BRÖMEL u. ZETTL 1985). Durchblutungsstörungen werden vor allem beim Schwein deutlich sichtbar durch Hautveränderungen wie Petechien, Zyanosen und Nekrosen, zum Beispiel an der Ohrspitze (HEINRITZI 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; HENDERSON et al. 1997). Häufig leiden die Tiere unter Ekto- und Endoparasitenbefall (BRÖMEL u. ZETTL 1985). 2.7.2.2 Histologie Das histologische Bild zeigt ein Hämosiderose, wobei Milzhämosiderose zusammen mit einem aktivierten Knochenmark Hinweise auf die hämolytische Anämie sind. Zellbeschädigungen in Leber und Nieren sind häufig zu sehen (BRÖMEL u. ZETTL 1985). Thrombosierung der Gefäße wurde in der Leber, Lunge und Myokard nachgewiesen (BELLAMY et al. 1978; BUGNOWSKI et al. 1990). PLANK und HEINRITZI (1990) zeigten eine die akute Phase der Eperythrozoonose begleitende erhöhte Blutungsneigung. Als Ursache kommt eine intravasale Gerinnungsaktivierung mit anschließender Verbrauchskoagulopathie in Frage. 2.7.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen Antikörper gegen E. suis wurden in 16 Beständen in Süd-Deutschland bei insgesamt 138 Schweinen bestimmt. Zehn Bestände waren klinisch unauffällig und serologisch negativ. Schweine aus 4 von 6 klinisch auffälligen Beständen wiesen einen positiven Antikörper-Titer auf. Zwanzig von insgesamt 78 Tieren dieser klinisch auffälligen Bestände hatten einen positiven E. suis Anitkörper-Titer (BALJER et al. 1989). In China nimmt die Ausbreitung von porciner Eperythrozoonose von Jahr zu Jahr zu und die Krankheit gewinnt immer mehr an Bedeutung. Ein Surveillance Untersuchung in 57 Beständen im Jahr 2002 ergab eine gesamte Morbidität von 30% und Mortalität von 10-20%. Innerhalb infizierter Bestände war die Morbidität bis zur 100%, meistens mit einer Mortalität von über 50%. Unklar blieb, in wieweit hier Mischinfektionen (u.a. Schweinepest, PRRS, Toxoplasmose) eine Rolle spielten. Die diagnostische Methode wurde nicht beschrieben (WU et al. 2006). Vier Bestände im Süden Brasiliens wurden mittels PCR und Southern Blot auf M. suis untersucht. Proben von 121 Schweinen wurden ausgewertet. Achtzehn Prozent der Tiere war PCR positiv und 33 % waren Southern Blot positiv, wobei alle PCR-positiven Proben auch in der Southern Blot Analyse positiv waren (GUIMARAES et al. 2007 a). Hämotrophe Mykoplasmen können Infektionen mit verschiedenen Mikro-Organismen beeinflussen. Dabei kann sowohl ein hemmender, als auch ein verstärkender Effekt beobachtet werden (ZWART et al. 1970). Beim Schwein wird während einer Ko-Infektion von E. suis und Babesia trautmanni eine deutlich verzögerte Parasitämie des Babesia Parasiten beobachtet (DIPEOLU et al. 1983). Von E. parvum wurde ein vergleichbarer Einfluss beobachtet (BARNETT 1963). GRESHAM et al. (1994) beschrieben PRRS als prädisponierenden Faktor bei einem Ausbruch von Eperythrozoonose. In einem aktuellen Ausbruch von Eperythrozoonose unter Ferkeln in einem belgischen Betrieb wurden nach antibiotischer Behandlung die Zahl der anämischen Tiere sowie die Mortalität deutlich niedriger. Die festgestellte Fertilitätsstörung wurde aber nicht verbessert. Die nachgewiesene Ko-Infektion mit dem PRRS Virus könnte die ausgebliebene Verbesserung erklären (DE BUSSER et al. 2008). 18 2.7.4 Diagnostik Die Diagnose der akuten Eperythrozoonose beim Schwein kann an Hand der klinischen, mikroskopischen und hämatologischen Untersuchungen sicher und schnell gestellt werden (BUGNOWSKI et al. 1989). Neben dem Erregernachweis in dieser akuten Phase ermöglicht die PCR Untersuchung auch die Identifikation von chronisch persistierenden Infektionen (HOELZLE 2007). Es wurden mehrere PCR-Tests zum Nachweis von M. suis veröffentlicht (GWALTNEY u. OBERST 1994; RIKIHISA et al. 1997; MESSICK et al. 1999; HOELZLE et al. 2003, 2007 b; STRIMITZER et al. 2004; GATTINGER et al. 2008). Die serologische Diagnose der porcinen Eperythrozoonose basiert klassischerweise auf dem Nachweis von Kälteagglutininen der Klasse IgM mittels Komplementbindungsreaktion (SPLITTER 1950), indirekter Hämagglutinationassay (SMITH u. RAHN 1975; BALJER et al. 1989) und ELISA (SCHULLER et al. 1990; HSU et al. 1992). Wegen eines sehr variablen und undulierenden Titer-Verlaufs eignen sich diese Verfahren zur Herdendiagnostik. Beim Einzeltier ist nur ein positives Ergebnis als sicher zu bewerten (HEINRITZI 1989, 1990; SCHULLER et al. 1990). Rezent wurden spezifische Antigene als Zielproteine für Immunglobuline der Klasse G detektiert (HOELZLE et al. 2006). Zwei Hauptantigene wurden näher identifiziert (HOELZLE et al. 2007 c, d). Mit diesen beiden Proteinen als Testantigene wurde ein ELISA entwickelt. Neben guter Sensitivität und Spezifität wurde eine signifikante Korrelation zwischen die IgG-Titer und erniedrigte Hämatokrit-, Erythrozyten-, und Hämoglobinwerte festgestellt (HOELZLE et al. 2007 a). 2.7.5 Therapie und Prävention Traditionell werden hämotrophe Mykoplasmen mit Tetrazyklinen oder Arsenderivaten behandelt (NEITZ 1968; SUTTON 1970; BRÖMELL u. ZETTL 1985). Von Oxytetrazyklin, Doxyzyklin und Diminazen Aceturat ist die Effektivität nachgewiesen. Der Einsatz von traditionellen chinesischen Kräutern scheint weniger effektiv wegen einer hohen Rezidivenrate und zu hohen Kosten (WU et al. 2006). Vorbeugend können Tetrazykline als Medizinalfutter eingesetzt werden (BRÖMEL u. ZETTL 1985; WU et al. 2006). Es wird empfohlen, in infizierten Beständen direkte und indirekte Blutübertragung über Instrumentarien zu vermeiden, die Haltungs- und Futterbedingungen optimal zu halten und Stress zu reduzieren. Verschiedene Studien geben Hinweise über die Rolle von Flöhen (SHAW et al. 2004; WOODS et al. 2005, 2006; LAPPIN et al. 2006; WILLI et al. 2007 a), Zecken (SENEVIRATNA et al. 1973; TAROURA et al. 2005), Läusen (HENRY 1979; BERKENKAMP u. WESCOTT 1988) und Moskitos (PRULLAGE et al. 1993) bei der Übertragung von hämotrophen Mykoplasmen. Die Bekämpfung von Ekto- und Endoparasiten sollte Infektionen reduzieren können (BRÖMEL u. ZETTL 1985; WU et al. 2006). Obwohl mittlerweile Hauptantigene von M. suis beschrieben wurden, stehen derzeit noch keine Impfstoffe zur Verfügung (HOELZLE et al. 2007 c, d). 19 2.7.6 Bedeutung In der intensiven Nutztierhaltung können hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bedeutende ökonomische Produktionsverluste verursachen (BROWNBACK 1981; ZINN et al. 1983; BRÖMEL u. ZETTL 1985; HENDERSON et al. 1997; HOELZLE 2007). In China wird eine schnelle Ausbreitung der porcinen Eperythrozoonose beobachtet und es wird dem eine große sozialökonomische Bedeutung zugeschrieben (WU et al. 2006). Durch den Einsatz von Tetrazyklinen als Medizinalfutter beim Schwein könnten Infektionen verschleiert bleiben (BRÖMEL u. ZETTL 1985). 2.8 Hämotrophe Mykoplasmen beim Schaf 2.8.1 Symptome Leitsymptome beim Schaf sind ein Verkümmern der Tiere, meist einhergehend mit Anämie oder Ikterus, Anorexie, Schwäche und Mortalität. Schnell treten auch hier zootechnische Leistungsabfälle in den Vordergrund. Diese variieren von weniger Gewichtsansatz, Abmagerung, weniger Produktion von Wolle bis Bewegungsschwäche (NEITZ 1968; OVERAS 1969; SUTTON 1970; CAMPBELL et al. 1971; FRIEDHOFF et al. 1971; DADDOW 1979 a; SHERIFF 1979; BURROUGHS 1988; WEIKEL u. GRAUNKE 1995; HOFF et al. 1996). Auch Steifheit der Hinterhand wurde beobachtet. Fieber scheint beim Schaf nicht als Hauptsymptom aufzutreten. Hämoglobinurie wird hingegen häufig beobachtet (OVERAS 1969, 1987; GANTER et al. 1993). In der Blutchemie sind Hyperbilirubinämie, Hyper- oder Hypoproteinämie und erhöhte Leberwerte anzutreffen (NEITZ 1937; SHERIFF et al. 1966; GRESHAM et al. 1994; TASKER 2006). Letzteres wird vielleicht durch Beschädigungen in Folge von Hypoxie ausgelöst (TASKER 2006). 2.8.2 Pathologie Sehr auffällig ist eine starke Vergrößerung der Milz (NEITZ 1937; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969; SUTTON 1978) und eventuell auch der Leber (NEITZ 1937; SUTTON 1978). Neben unspezifischen Merkmalen wie Abmagerung wird das Sektionsbild weiter von einer allgemeinen Blässe und/oder Gelbfärbung beherrscht (NEITZ 1937; ARCHER u. LITTLEJOHNS 1984). Vermehrte Körperhöhlenflüssigkeiten und Ödeme sind häufig anzutreffen (NEITZ 1937; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969). Manche Autoren stellten auch Veränderungen an den Nieren fest. Nephrose wird als ein Folgeschaden der Hämoglobinurie betrachtet, und nicht als direkter Effekt der Erreger (SHERIFF et al. 1966; OVERAS 1969). Das histologische Bild zeigt ein Hämosiderose (OVERAS 1969; SUTTON 1978). Zellbeschädigungen in Leber und Nieren sind häufig zu sehen (OVERAS 1969). 2.8.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen Eine Vielzahl von Veröffentlichungen aus Australien und Neuseeland zeigt das Interesse an der Epidemiologie der Eperythrozoonose beim Schaf in diesem Raum (MAXWELL 1969; CAMPBELL et al. 1971; LAWS u. DADDOWS 1976; MASON et al. 1981, 1989; LITTLEJOHNS u. NICHOLLS 1989; MASON u, STATHAM 1991 b). Drei weitere australische Studien und einige aus anderen Räumen werden hier besprochen. 20 In einer Gruppe von 164 Schafen, die lebendig in einem australischen Untersuchungsinstitut zur Routineautopsie vorgestellt wurden, wurde in einer Periode von 19 Monate eine Inzidenz von 4,8% festgestellt. In der gleichen Untersuchungsreihe wurde in verschiedenen Herden bei 1035% der Lämmer eine Infektion mit E. ovis beobachtet. Die Diagnose erfolgte durch lichtmikroskopische Untersuchung eines peripheren Blutausstrichs (HARBUTT 1969 b). Über eine Periode von zwei Jahren wurden 1110 sechs bis zwölf Monate junge Schafe und 198 erwachsene Schafe aus 22 Betrieben auf E. ovis Antikörper getestet. 10 % der jungen und 51% der erwachsenen Schafe waren serologisch positiv. In 27% der Betriebe waren junge Schafe positiv und in 90% der Betriebe erwachsene Tiere (NICHOLLS u. VEALE 1986 b). In einer anderen Studie wurden 4,5% (N= 1820) der jungen Schafe von 47% (N= 91) der Betriebe in West-Australien serologisch getestet. Die Prävalenz der E. ovis Infektion der Schafe wurde zwischen 3,6 % und 5,5 % geschätzt und die Prävalenz der Betriebe zwischen 37,5 % und 56,5% (KABAY et al. 1991). Die Prävalenz von E. ovis Antikörpern in einer norwegischen Untersuchung von 9 blind ausgewählten Herden betrug 92% der Schafe (N=144), wobei in allen Herden positive Tiere nachgewiesen wurden. Die Zahl der positiven Schafe innerhalb der Herde lag zwischen 83 und 100% (BRUN-HANSEN et al. 1997 a). Aus einer norwegischen Schafsherde mit 60-70 Tieren wurden in der Periode von 1991-1995 vier Mal Blutproben bei 30 % der Schafe gezogen. Die Prävalenz der E. ovis Antikörper variierte zwischen 58% und 100%. Nur im Jahr 1995 wurde bei 11 von 26 Tieren E. ovis im peripheren Blutausstrich nachgewiesen (BRUN-HANSEN et al. 1997 b). In einer Forschungsherde mit 30 anämischen Lämmern wurde bei 13 Tieren E. ovis im peripheren Blutausstrich nachgewiesen. Die Geschlechter waren gleichmäßig verteilt (MARTIN et al. 1988). Aus verschiedenen für die Schafzucht bedeutenden Gebieten in Nigeria wurden von 402 Tieren Blutproben gesammelt. Sechsunddreißig Prozent der Schafe war serologisch positiv. Nur bei 12 der serologisch positiven Tiere wurde im peripheren Blutausstrich E. ovis nachgewiesen (ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 b). Beim Schaf wurden mehrere Ko-Infektionen beschrieben. Ehrlichiose scheint eine latente Infektion mit E. ovis zu aktivieren (OHDER 1967). In Süd-Afrika wurden mehrere Mischinfektionen von Eperythrozoon mit diversen anderen Blutparasiten bei anämischen Schafen festgestellt (BURROUGHS 1988). Listeriose beim Schaf wird nachweislich von E.ovis beeinflusst (GRONSTOL u. OVERAS 1980), die Ko-Infektion mit Trypanosoma vivax beeinträchtigte keinen der beiden Parasiten bei dieser Tierart (ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 c). Hämonchose könnte einen additiven Effekt auf der Eperythrozoon-Infektion haben (LITTLEJOHNS 1960). 2.8.4 Diagnostik Während der akuten Phase der Eperythrozoonose können die Erreger in hoher Zahl lichtmikroskopisch im peripheren Blutausstrich nachgewiesen werden (LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969; SHERIFF 1972). Ein Routine PCR-Test zum Nachweis von M. ovis bei kleinen Wiederkäuern ist bisher nicht entwickelt worden (persönliche Mitteilung Prof. Dr. M. Ganter), obwohl phylogenetische Zuordnung basierend auf Gensequenzen stattfand (NEIMARK et al. 2004). 21 Zur serologischen Herdendiagnostik wurden ein Komplementbindungsreaktion (DADDOW 1977), ein ELISA (LANG et al. 1986, 1987) und indirekter Immunfluoreszenzassays (ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 a; HUNG u. LLOYD 1985; NICHOLLS u. VEALE 1986 a) beschrieben. 2.8.5 Therapie und Prävention Der Einsatz von Oxytetrazyklin und Chlortetrazyklin führt zu einer deutlichen Reduzierung der Bakteriämie, eine vollständige Eliminierung der Erreger ist aber nicht zu erreichen (NEITZ 1968; BURROUGHS 1988; GANTER et al. 1993). Gleiche Ergebnisse für Arsenderivate wurden schon von NEITZ (1937, 1968) und LITTLEJOHNS (1960) veröffentlicht. Mit Imidocarb dipropionat wurde beim Schaf eine schnelle Reduktion, aber auch keine vollständige Elimination der Infektion erreicht. Die Nebenwirkungen schienen in dieser Studie rassebedingt zu sein (HUNG 1986). Mittels einer hochdosierten, intravenösen Spirotrypan Verabreichung erreichte SHERIFF (1973) eine Eliminierung des Erregers bei Schafen. Beim Einsatz dieses Sulfur-enthaltenden Arsenderivates traten aber gravierende Nebenwirkungen auf und zu dieser Zeit war eine PCR-Kontrolle der Tiere noch nicht möglich. Es wird empfohlen, in infizierten Beständen bei der Anwendung von chirurgischen Instrumentarien und Scherköpfen nach jedem Tier eine Reinigung und Desinfektion durchzuführen. Trägertiere sollten aus der Herde entfernt werden. Als Futtersupplementation kommen Eisen- und Kupfersalze im Betracht (GANTER et al. 1993). Auch Ekto- und Endoparasitenkontrolle kommt große Bedeutung zu (BURROUGHS 1988). 2.8.6 Bedeutung In der extensiven Nutztierhaltung in Ländern wie Australien, Neuseeland und Süd-Afrika, können hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen große ökonomische Produktionsverluste verursachen. Beim Schaf stehen hier Gewichtsverluste, ikterische Karkassen, verringerte Produktion von Wolle, verringerte Ausdauer und Mortalität im Vordergrund. Zudem werden hämotrophen Mykoplasmen eine bedeutende Rolle im Rahmen des sogenannten „Ill-thrift“ Syndroms zugeschrieben, wobei in einer Herde mehrere Tieren chronisch erkranken mit rezidivierendem Fieber und Anämie (HARBUTT 1969 b; SUTTON u. JOLLY 1973; DADDOW 1979 a; ARCHER u. LITTLEJOHNS 1984; BURROUGHS 1988; KABAY et al. 1992; LITTLEJOHNS 1992). 2.9 Hämotrophe Mykoplasmen bei der Katze 2.9.1 Symptome In der akuten Phase einer M. haemofelis-Infektion werden Fieber, Anämie, Lethargie und Anorexie als wichtigste Symptome festgestellt (MESSICK 2004). Zudem sind teilweise Gewichtsverlust, Schwäche, Synkope, Exitus, Tachypnoe, Tachykardie, Splenomegalie, Herznebengeräusche, Ikterus, Hypothermie, Lymphadenopathie oder Pika vorhanden (MESSICK 2003; SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). Candidatus M. haemominitum scheint weniger pathogen zu sein, und es werden bei infizierten Katzen nur minimale klinische 22 Symptome beobachtet (MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). KoFaktoren scheinen das Erscheinungsbild bei Candidatus M. turicensis-Infektionen zu bestimmen (WILLI et al. 2007 b). Neben Unterschieden in Virulenz könnten auch dosis-abhängige Effekte (WESTFALL et al. 2001) oder individuelle Empfindlichkeit der Tiere (WILLI et al. 2007 b) eine Rolle spielen. Chronisch latente Infektionen werden typischerweise bei nicht splenektomierten, immunkompetenten Tieren beobachtet (MESSICK 2004). Bei der Katze scheint der Ernst der Symptome mit der Quantität des nachgewiesenen DNAs der hämotrophen Mykoplasmen korreliert (COOPER et al. 1999; LOBETTI u. TASKER 2004; TASKER et al. 2004 a). In verschiedenen Studien konnte diese Korrelation aber nicht bestätigt werden (TASKER et al. 2003 b; WILLI et al. 2006 c). Grundsätzlich ist die Anwesenheit eines Pathogens notwendig, aber dies alleine wäre unzureichend, Krankheit auszulösen (SACHSE 2003). In vielen molekular epidemiologischen Studien wurde dieses Prinzip auch für hämotrophe Mykoplasmen bestätigt, und es wurde keine Korrelation zwischen positivem hämotrophen Mykoplasmen-Status und hämatologischen Veränderungen festgestellt (TASKER et al. 2003 a; ISHAK et al. 2006; GUIMARAES et al. 2007 a; JUST u. PFISTER 2007; SYKES et al. 2007 a; WENGI et al. 2008). 2.9.2 Pathologie Systematische Sektionsbilder und histopathologische Untersuchungen an von hämotrophe Mykoplasmen-infizierten Katzen wurden in der Literatur nicht gefunden. 2.9.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen Seit der Entwickelung molekular genetischer Nachweismethoden wurden hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei Hauskatzen und wilden Feliden weltweit beschrieben. Tabelle 2.5 zeigt eine Übersicht rezent publizierter Nachweishäufigkeiten von hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen bei Katzen. Auf Grund von Unterschieden in den untersuchten Katzenpopulationen und zum Teil auch in der angewendeten PCR Methode ist ein direkter Vergleich der Zahlen nicht immer möglich. In der Studie von WILLI et al. (2006 b) werden die Proben der Untersuchungen von LOBETTI und TASKER (2004), TASKER et al. (2003 a) und TASKER et al. (2004 a) nochmal analysiert und es wurde spezifisch auch nach Candidatus M. turicensis gesucht (Tabelle 2.5). In einer japanischen Studie wurden 21 Haemobartonellose-verdächtige Hauskatzen auf M. haemofelis mittels PCR untersucht. Bei 18 der Tiere war das Ergebnis positiv und wurde zytologisch im peripheren Blutausstrich bestätigt. Dieses PCR Verfahren ermöglichte es, zwischen den wichtigsten M. haemofelis-Stämmen zu differenzieren. Vier Katzen (22%) waren mit dem California Stamm, 12 (67%) mit dem Ohio Stamm, und 2 (11%) mit beiden Stämmen infiziert (WATANABE et al. 2003). 5 (6,4) 21 (4,3) 6 (4,1) 2 (2,0) 4 (3,4) 2 (1,8) 2 (2,2) 8 (4,5) 9 (1,3) 12 (1,9) 45 (17,5) 6 (10,0) 6 (4,4) 78 484 147 102 146 112 92 176 713 642 257 60 135 (7,6) 154 (9,7) 34 (10,3) 11 (8,1) 21 (35,0) 83 (32,2) 102 (15,9) 63 (8,8) 14 (8,0) 15 (16,3) 7 (6,3) 9 16 (15,7) 34 (23,1) 40 (8,3) 25 (32,1) 7 (11,7) 13 (0,8) 0 0 51 (19,8) 16 (2,4) 3 (0,4) 11 (0,7) 18 (5,4) 1 (0,7) 2 (3,4) 12 (4,7) 7 (1,0) 2 (0,3) 7 (4,0) 5 (5,4) 3 (2,7) 1 (0,8) 0 1 (0,7) 19 (3,9) 5 (6,4) 0 0 2 (0,1) 3 (2,2) 1 (1,7) 0 4 (0,6) 0 10 (0,6) 0 1 (1,7) 15 (5,8) 23 (3,6) 6 (0,8) 2 (0,1) 0 4 (6,7) 28 (10,8) 2 (0,3) 0 JUST u. PFISTER 2007 FUJIHARA et al. 2007 WILLI et al. 2007 c WILLI et al. 2006 b WILLI et al. 2006 a ISHAK et al. 2006 LAPPIN et al. 2006 EBERHARDT et al. 2006 HACKETT et al. 2006 INOKUMA et al. 2004 TASKER et al. 2004 a LURIA et al. 2004 LOBETTI u. TASKER 2004 KEWISH et al. 2004 CRIADO-FORNELIO et al. 2003 TASKER et al. 2003 a HAEFNER et al. 2003 WATANABE et al. 2003 JENSEN et al. 2001 Referenz PETERS et al. 2008 30 (1,9) 16 (26,7) 60 3 (10,0) 1 (0,2) Mhf + CMhm + CMt (%) 1585 6 (20,0) 30 72 (16,9) CMhm + CMt (%) YU et al. 2007 6 (1,4) 426 Mhf + CMt (%) 14 (4,2) 2 (3,7) 54 Mhf + CMhm (%) 331 18 (85,7) 21 CMt (%) MACIEIRA et al. 2008 43 (19,5) 220 CMhm (%) 149 Mhf (%) Stichprobe (N) Hauskatzen Haemobartonellose-Verdacht; Großbritanien Wildkatzen; Korea Gesunde und FIV/FeLV infizierte Hauskatzen; Brasilien Hauskatzen mit variablen Symptomen; Deutschland Hauskatzen mit variablen Symptomen; Japan Katzen aus Tierparks und Natur; Europa, Tanzania, Brasilien Proben aus vorherigen Studien Hauskatzen mit variablen Symptomen; Schweiz Hauskatzen mit variablen Symptomen; VS Hauskatzen mit Flohbefall; VS Wildkatzen; VS Hauskatzen, gesunde Blutspender; VS Hauskatzen mit variablen Symptomen; Japan Hauskatzen mit variablen Symptomen; Australien Wildkatzen; VS Hauskatzen mit variablen Symptomen; Süd Afrika Hauskatzen mit variablen Symptomen; Canada Hauskatzen Haemobartonellose-Verdacht; Spanien Hauskatzen mit variablen Symptomen; Großbritanien Katzen aus Tierparks und Natur; VS Hauskatzen Haemobartonellose-Verdacht; Japan Hauskatzen mit variablen Symptomen; VS Population 23 Mhf: Mycoplasma haemofelis; CMhm: Candidatus Mycoplasma haemominitum; CMt: Candidatus Mycoplasma turicensis; VS: Vereinigten Staaten (geändert und erweitert nach PETERS et al. 2008) Tabelle 2.5: Veröffentlichte Nachweishäufigkeiten von Hämoplasmenspezies-DNA mittels PCR bei Katzen nach Einzel- und Mischinfektionen 24 JENSEN et al. (2001) fanden bei 82 hämotrophe Mykoplasmen-verdächtigen Katzen in den Vereinigten Staaten 10 (12,2%) Infektionen mit dem Ohio Stamm, 9 (11,0%) Infektionen mit den California Stamm, und 4 (4,9%) mit Mischinfektionen. Nach neustem Wissensstand wurden die Ohio und California Stämme als M. haemofelis beziehungsweise Candidatus M. haemonitum bezeichnet (WILLI et al. 2007 b). Bei unterschiedlichen Feliden sind hämotrophe Mykoplasmen nachgewiesen. Die zwei positiven Tiere in der Studie von HAEFNER et al. (2003) sind Tiger. Die Studie von WILLI et al. (2007 c) beschreibt hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei neun Wildkatzen Spezies - darunter Löwe, Puma und Luchs - aus drei unterschiedlichen Kontinenten. Viele Prävalenz-Studien, meistens basierend auf DNA-Nachweis, wurden zur Analyse von Risikofaktoren verwendet. Hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen werden in verschiedenen Veröffentlichungen mit folgenden Faktoren assoziiert: höheres Alter, männliches Geschlecht, retrovirale Infektionen (FIV, FeLV), Mischinfektionen mit anderen hämotrophen Mykoplasmen, Freigang, Beiß-Abszesse, kutanes squamöses Zellkarzinom, Stomatitis (GRINDEM et al. 1990; HARRUS et al. 2002; TASKER et al. 2003 a; INOKUMA et al. 2004; WILLI et al. 2006 b, c; DE MORAIS et al. 2007; JUST u. PFISTER 2007; SYKES et al. 2007 a; MACIEIRA et al. 2008). In der Studie von GRINDEM et al. (1990) hingegen wiesen Katzen, die jünger als drei Jahre waren, ein erhöhtes Risiko auf, und das Geschlecht war nicht mit einer Infektion assoziiert. WILLI et al. (2006 c) fanden keine Assoziation mit retroviralen Infektionen, aber kranke Katzen mit einer Candidatus M. haemominitumInfektion wiesen häufiger eine Niereninsuffizienz auf. Ko-infizierte Katzen mit Candidatus M. haemomintum oder M. haemofelis und FeLV entwickelten eine viel schwerere Anämie als Tiere, bei denen keine FeLV-Infektion vorlag (BOBADE et al. 1988; GEORGE et al. 2002; HARRUS et al. 2002). Bei FIV-infizierten Katzen wurden keine vergleichbaren Effekte beobachtet (TASKER et al. 2006 a, b). Hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen werden bei FeLV-infizierten Katzen als ein erhöhtes Risiko dafür betrachtet, schneller eine hämatopoetische Neoplasie zu entwickelen (PRIESTER u. HAYES 1973; GEORGE et al. 2002; MESSICK 2003). Die Infektion mit Candidatus M. haemomintum scheint bei der Katze den Verlauf einer Bartonella henselae-Infektion nicht zu beeinflussen (SYKES et al. 2007 c). 2.9.4 Diagnostik Zum Erregernachweis bei der Katze wurden viele PCR-Tests beschrieben (BERENT et al. 1998; MESSICK et al. 1998; COOPER et al. 1999; JENSEN et al. 2001; HAEFNER et al. 2003; TASKER et al. 2003 a, b, 2004 a, b; WATANABE et al. 2003; BRADDOCK et al. 2004; LOBETTI u. TASKER 2004; SYKES et al. 2007 a, b; PETERS et al. 2008). In einigen Veröffentlichungen wird der zytologische Nachweis mit der PCR verglichen. In der Studie von TASKER et al. (2003 a) waren zwei mikroskopisch positive Ausstriche im PCR-Test negativ; von 46 fraglichen Ergebnissen waren 6 PCR positiv und von 269 negativen Ausstrichen waren 48 PCR positiv. Die errechnete Sensitivität und Spezifität der 25 lichtmikroskopischen Untersuchung war damit 11,1% und 84,0%. In einer anderen Studie wurde bei 78 Katzen im peripheren Blutausstrich eine hämotrophe Mykoplasmen-Infektion nachgewiesen. Nur 45% dieser Blutproben waren im PCR-Test positiv (LOBETTI u. TASKER 2004). JENSEN et al. (2001) fanden durch zytologische Untersuchungen bei 53 verdächtigen Katzen, von denen 28 anämisch waren, 9 falsch negative Ergebnisse im Vergleich mit dem PCR-Test. Bei 3 dieser falsch negativen Ergebnisse betraf es anämische Katzen. WESTFALL et al. (2001) inokulierten mit hämotrophen Mykoplasmen infiziertes Blut bei Katzen. Der Erreger wurde in allen Blutproben durch PCR, aber nur in 38% der Fälle durch Zytologie nachgewiesen. Obwohl experimentelle Studien mittels Western Immunblot (ALLEMAN et al. 1999) und Immunfluoreszenz (FOLEY et al. 1998) über Antiköper gegen feline hämotrophe Mykoplasmen durchgeführt wurden, stehen keine serologischen Routinetests zur Verfügung (TASKER u. LAPPIN 2002; WILLI et al. 2007 b). 2.9.5 Therapie und Prävention Bei Katzen wurden neben dem Tetrazyklin Doxyzyklin auch die Fluoroquinolonen Enrofloxacin und Marbofloxacin auf Wirksamkeit untersucht. Alle drei waren effektiv in der Reduktion der klinischen Symptome und Erreger-DNA-Mengen im Blut (BERENT et al. 1998; FOLEY et al. 1998; DOWERS et al. 2002; TASKER et al. 2004 b; 2006 a, b). Die drei felinen hämotrophen Mykoplasmen scheinen aber Unterschiede in der Empfindlichkeit gegenüber diesen Wirkstoffen aufzuweisen (TASKER et al. 2006 a, b; WILLI et al. 2006 a). Parenterale Verabreichung von Imidocarb dipropionat wurde auch bei Katzen getestet. Vier von acht Katzen wurden vorübergehend PCR negativ und es traten keine Nebenwirkungen auf (LAPPIN et al. 2002). Eine völlige Eliminierung des Erregers wurde mit keinem dieser Therapeutika erreicht (MESSICK 2003). Azithromycin, ein Makrolid das bei MykoplasmaInfektionen benutzt wird, wurde an mit H. felis infizierten Katzen getestet und wurde für nicht effektiv befunden (WESTFALL et al. 2001). Obwohl die Anämie zum Teil immunvermittelt sein könnte (COX u. CALAF-ITURRI 1976; VAN STEENHOUSE et al. 1995), bleiben Kortikosteroide als unterstützende Behandlungsmaßnahme umstritten. Methylprednisolon bei einer mit Candidatus M.turicensis infizierten Katze resultierte in einer Verschlechterung der Blutarmut (WILLI et al. 2005). Kortikosteroide können die Zahl der hämotrophen Mykoplasmen im Blut ansteigen lassen (HARVEY u. GASKIN 1978; GULLAND et al. 1987 b; BÜTTNER et al. 1995; ALLEMANN et al. 1999; MESSICK 2003; YUAN et al. 2007) und unbekannte Begleitinfektionen verschlimmern (SYKES 2003). Der Einsatz von Kortikosteroiden wird von CARNEY und ENGLAND (1993) bei Autoagglutination oder akuter Anämie empfohlen, es fehlen aber klinische Studien an denen die Ergebnisse kontrolliert werden können. In Fällen lebensbedrohlicher Anämie sollte Blut übertragen werden (TASKER u. LAPPIN 2002; SYKES 2003). 26 Obwohl es in einer Studie von HARVEY und GASKIN (1978) nicht gelang, bei chronisch infizierten Katzen durch Stress eine Rezidive zu induzieren, wird geraten, Stress und andere immunschwächende Umständen zu vermeiden (WILLI et al. 2006 c). Weil Freigang bei Katzen als Risikofaktor beschrieben ist (GRINDEM et al. 1990) und direkte Übertragung über Speichel oder Fäzes eine Rollen spielen könnte (WILLI et al. 2007 a, b), sollte Wohnungshaltung eine Infektion bei Katzen vermeiden können. Fallberichte über Infektionen nach Bluttransfusion liegen vor (LESTER et al. 1995; SYKES et al. 2004; PAUL et al. 2008), und Nachweishäufigkeiten bei Blutspendern wurden veröffentlicht (HACKETT et al. 2006). Blutspender sollten mittels PCR auf Anwesenheit von hämotrophen MykoplasmenInfektionen getestet werden (SYKES 2003; GARY et al. 2006; HACKETT et al. 2006). Splenektomie löst bei infizierten Tieren einen akuten Anfall der Krankheit aus (SCHILLING 1928; BENJAMIN u. LUMB 1959; MESSICK 2004) und macht den Verlauf unvorhersehbar (KEMMING et al. 2004 b). Patienten, bei denen eine elektive Splenektomie geplant wird, sollten präoperativ getestet werden. Die Bekämpfung von Flöhen sollte Infektionen reduzieren können (LAPPIN et al. 2006). 2.9.6 Bedeutung Bei Katzen kann es sowohl bei immunkompetenten (VAN STEENHOUSE et al. 1995; REYNOLDS u. LAPPIN 2007), als auch bei immungeschwächten oder splenektomierten Tieren (LESTER et al. 1995; DE LORIMIER u. MESSICK 2004; REYNOLDS u. LAPPIN 2007) zu klinischen Erkrankungen kommen. Die Haemobartonellose wurde bei der Katze mit retroviralen Infektionen assoziiert. Die Prävalenz von FIV und FeLV liegt bei mit hämotrophen Mykoplasmen infizierten Tieren deutlich höher (HARRUS et al. 2002). KoInfektionen von M. haemofelis und FeLV verursachen eine deutlich gravierendere Anämie (BOBADE et al. 1988; GEORGE et al. 2002). Zudem wurden Hinweise gefunden, Candidatus M. haemomintum könnte bei FeLV infizierten Katzen myeloproliferative Krankheitsprozesse auslösen (GEORGE et al. 2002). Es gab auch Hinweise auf eine Rolle der Mykoplasmen in der humanen Onkogenese (TSAI et al. 1995). Die Übertragung der Infektion bei Katzen durch Bluttransfusionen wurde dokumentiert. Blutspender sollten auf das Vorkommen von hämotrophen Mykoplasmen kontrolliert werden (GARY et al. 2006; HACKETT et al. 2006). 2.10 Hämotrophe Mykoplasmen beim Hund 2.10.1 Symptome Bei Hunden in der akuten Phase einer M. haemocanis-Infektion wird das Bild von Anämie, Anorexie, Gewichtsverlust, Fieber und manchmal Todesfällen bestimmt. Chronisch treten eine leichte Blutarmut und Antriebslosigkeit auf. Manche Hunde zeigen abnorm großen Appetit und Pika (MESSICK 2003). 27 2.10.2 Pathologie NORTH (1978) beschreibt in einem Fallbericht das Sektionsbild eines an Haemobartonellose eingegangenen Irischen Setters. Ein allgemeiner Ikterus war prominent, sonstige Abweichungen der Organe wurden nicht beobachtet. In einem anderen Fallbericht sind eine disseminierte intravasale Thrombose und Infarktbildung zusammen mit einer Glomerulonephritis die wichtigsten Auffälligkeiten post-mortem (BELLAMY et al. 1978). 2.10.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen In einer Prävalenz Studie von hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen im Süden von Frankreich waren 15,4 % der 460 untersuchten Hunde PCR positiv. Bei 9,6 % der Tiere lag eine Infektion mit Candidatus M. haemoparvum vor, bei 3,3 % lag eine Infektion mit M. haemocanis vor, und 2,6 % der Hunde waren mit beiden Erregern infiziert. Der klinische Zustand der untersuchten Tiere in dieser Studie war unbekannt (KENNY et al. 2004). Die Braune Hundezecke, Rhipicephalus sanguineus, könnte ein Vektor für M. haemocanis sein und kommt nur in mediterranen Klimazonen wie dem Süden Frankreichs einheimisch vor (SENEVIRATNA et al. 1973). Dazu ergab ein Prävalenz Studie in der Schweiz nur 0,2 % Candidatus M. haematoparvum DNA und 0,9% M. haemocanis DNA positiver Hunde (N= 889). Mischinfektionen lagen nicht vor. Die untersuchten Tiere wurden aus unterschiedlichen Gründen an der Universitätsklinik vorgestellt und sechs Tiere waren gesunde Blutspender. Eine Assoziation zwischen hämotrophen Mykoplasmen und Alter oder Geschlecht wurde in diese Studie nicht gefunden. Bei infizierten Hunden wurde aber häufig im Vorbericht festgestellt, dass sie sich in Gebieten aufgehalten haben, in denen die Zecke Rhipicephalus sanguineus einheimisch ist (WENGI et al. 2008). Ein Studie von KEMMING et al. (2004 a) vergleicht die Prävalenz M.haemocanis DNA einer Hundepopulation bestehend aus der Klientel einer Nordamerikanischer Universitätsklinik (N=60) mit einer Population Hunde, die in drei Zwingern in Frankreich (N=23), Ungarn (N=20) und Nordamerika (N=20) aufgezogen wurden. Von den im Zwinger aufgezogenen Hunden waren 30, 35 und 87% PCR positiv, wobei keines der nordamerikanischen Tiere aus privater Haltung PCR positiv war. 2.10.4 Diagnostik Für den Nachweis der Erreger aus EDTA-Blut wurden in letzter Zeit auch PCR-Tests beschrieben (BRINSON u. MESSICK 2001; WENGI et al. 2008). 2.10.5 Therapie Therapie der Wahl beim Hund ist Oxytetrazyklin oder Doxyzyklin (MESSICK 2003; CHALKER 2005). 28 2.10.6 Bedeutung Bei Hunden kann es, sowie bei der Katze beschreiben, sowohl bei immunkompetenten (NORTH 1978; AUSTERMANN 1979), als auch bei immungeschwächten oder splenektomierten Tieren (LESTER et al. 1995; BRINSON u. MESSICK 2001) zu klinischen Erkrankungen kommen. Auch die Bluttransfusion wird als Übertragungsmöglichkeit beim Hund vermutet (LESTER et al. 1995). Tiermodelle sind bisher unverzichtbar in der klinischen Forschung. In einem Untersuchungsprojekt nach der Pathophysiologie von hämorrhagischem Shock wurden Hunde als in-vivo-Modell eingesetzt. Dieses Projekt musste wegen der Entdeckung einer Infektion der Hunde mit M. haemocanis vorzeitig beendet werden (KEMMING et al. 2004 b). Die Infektion könnte die Experimente beeinflussen und Bias verursachen. KEMMING et al. (2004 a) zeigten die Anwesenheit dieser Pathogen in verschiedene Zuchtstätten von Laborhunde. 2.11 Hämotrophe Mykoplasmen beim Rind 2.11.1 Symptome Rinder werden mit Fieber, Anorexie, schlechtem Fellzustand, Lymphadenopathie, Ödemen und Anämie auffällig. Ein Abfall der Milchproduktion und Fertilitätsstörungen bestimmen weiter das Infektionsbild mit M. wenyonii (LOTZE u. YIENGST 1941; OBI u. ANOSA 1980; ANZIANI et al. 1982; SMITH et al. 1990 a; MONTES et al. 1994). 2.11.2 Pathologie Systematische Beschreibungen der pathologischen Veränderungen beim an M. wenyonii erkrankten Rind wurden in der Literatur nicht gefunden. 2.11.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen In einem Rinderbestand (N=110) in Italien wurde in einer kurzen Periode bei drei 5 bis 6 Monate alten Kälbern Eperythrozoonose beobachtet. Die Diagnose wurde gesichert durch Übertagung von Blut eines kranken auf ein splenektomiertes Kalb (CAGNASSO et al. 1983). In einer Herde erwachsener Rinder (N= 46) in Irland kam es bei 18 Tieren zu klinischen Symptomen der Eperythrozoonose. Auch hier wurde die Diagnose durch Übertragungsexperimente bestätigt (POOLE et al. 1976). Auf einem Betrieb in Großbritannien mit 500 Milchkühen kam es bei 35 Tieren zu klinischen Symptomen und es wurde die Diagnose mit Untersuchung von peripheren Blutausstrichen und PCR gesichert (ANON. 2007). In einer nordamerikanischen Studie von VANDERVOORT et al. (2001) wurden 191 Rinder mittels PCR auf M. wenyonii DNA untersucht. Die Tiere kamen teils aus Beständen, in denen eine M. wenyonii-Infektion vermutet wurde. Ein Teil der Tiere zeigte klinische Symptome. Acht Rinder waren PCR positiv, wobei bei 5 Tieren auch im peripheren 29 Blutausstrich Mikroorganismen gesehen wurden. In Japan wurden 78 Rinder mittels PCR auf hämotrophe Mykoplasmen untersucht. Bei 17 Tieren wurde M. wenyonii, bei 13 Tieren Candidatus M. haemobos nachgewiesen. Bei 4 Rindern wurden beide Spezies identifiziert (TAGAWA et al. 2008). Bei Rindern in den Tropen wurden Ko-Infektionen von M. wenyonii, Anaplasma marginale und Trypanosoma vivax beobachtet (BRETANA et al. 2002). Im August 2002 kam es auf einem Milchviehbetrieb in der Schweiz zu einem schweren Erkrankungsausbruch mit als Hauptsymptomen Fieber, Anorexie, Agalaktie und Depression. Die Hälfte der Kühe war anämisch. Neben dem Hauptpathogen Anaplasma marginale (47% infizierte Tiere) wurden verschiedene andere Blutparasiten, darunter auch M. wenyonii, diagnostiziert. Bis zu fünf verschiedene von Arthropoden übertragbare Pathogene wurden bei 90% der erkrankten Rinder mittels PCR festgestellt. Vermutet wird, dass die Ko-Infektionen das Krankheitsbild deutlich verschlimmerten (HOFMANN-LEHMANN et al. 2004). 2.11.4 Diagnostik Auch beim Rind steht einen PCR-Test als effektiver Nachweis von M. wenyonii zur Verfügung. Dies stellt eine deutlich sensitivere Alternative zur klassischen zytologischen Untersuchung dar. VANDERVOORT et al. (2001) vergleichen die Ergebnisse des PCR-Tests mit den Ergebnissen der lichtmikroskopischen Untersuchungen beim Nachweis von E. wenyonii. Von 8 PCR-positiven Rindern wurde nur bei 5 ein positives Ergebnis bei der mikroskopischen Untersuchung erzielt. Bei keinem der PCR-negativen Tiere wurden Mikroorganismen im peripheren Blutausstrich beobachtet. LIU et al. (2008) untersuchten Blutausstriche von 412 Rindern auf M. wenyonii. 93 (22,6%) waren in der Zytologie positiv. Von diesen 93 Proben waren 81 (88,2%) positiv in der PCR. Auch in Kombination der PCR mit „denaturing gradient gel electrophoresis“ (DGGE) wurde der Erreger spezifisch und schnell nachgewiesen (MCAULIFFE et al. 2006; ANON. 2007). DGGE ermöglicht es nach Verarbeitung der Probe mit Mykoplasma-spezifischen Primers, innerhalb von 24 Stunden 67 Mykoplasma Spezies zu differenzieren (McAULIFFE et al. 2005). 2.11.5 Therapie Klinische Erfahrungen über die Therapie von hämotrophen Mykoplasmen beim Rind berichten nur über den Einsatz von Breitbandantibiotika (POOLE et al. 1976; ANON. 2007). In einem Fallbericht wird ein kranker infizierter Bulle mit Oxytetrazyklin und Flunixin meglumine behandelt und spricht gut auf diese Therapie an (MONTES et al. 1994). 30 2.11.6 Bedeutung Infektionen mit M. wenyonii beim Rind kommen häufig vor, die meisten Infektionen verlaufen aber subklinisch (ZWART et al. 1970; POOLE et al. 1976; CAGNASSO et al. 1983; SMITH et al. 1990 a; MONTES et al. 1994; VANDERVOORT et al. 2001; ANON. 2007). 2.12 Hämotrophe Mykoplasmen bei andere Tierarten und beim Menschen 2.12.1 Symptome Hämotrophe Mykoplasmen wurden bei der Maus und andere Rodentia (SCHILLING 1928; TYZZER u. WEINMANN 1939), beim Waschbär (FRERICHS u. HOLBROOK 1971), beim Flughund (EWERS 1971), bei der Beutelratte (MESSICK et al. 2002), bei Alpaka und Lama (McLAUGHLIN et al. 1990; REAGAN et al. 1990; MESSICK et al. 2002), bei verschiedenen Affensorten (PETERS et al. 1974; DILLBERGER et al. 1994; NEIMARK et al. 2002 a) und beim Rentier (STOFFREGEN et al. 2006) beschrieben. Das klinische Spektrum dieser Infektion variiert von asymptomatisch zur schweren, manchmal fatalen Erkrankung einhergehend mit Anämie, abhängig von der Empfindlichkeit der Wirte und eventueller Splenektomie. GRETILLAT und KONARZEWSKI (1978) berichten über 97 schwer kranke Einheimische aus der Sahelregion in Nigeria. Im peripheren Blutausstrich waren die Erythrozyten von Haemobartonella-ähnlichen Strukturen befallen, wie sie auch bei an Haemobartonellose erkrankten Karnivoren, Pferde und Kaninchen in dieser Region beobachtet wurden. Die Patienten befanden sich in einem sehr schlechten Allgemeinzustand und wiesen Anämien auf. Bei sechs AIDS-Patienten wurden im Blutausstrich Haemobartonella-ähnliche Organismen beobachtet. Alle Patienten litten an einer Blutarmut, welche die Folge von der Infektion mit diesen Strukturen sein könnte (DUARTE et al. 1992). In China wird bei immunkompetenten Menschen die Eperythrozoonose als subklinische Infektion ansehen. Bei Schwangeren und Neugeboren kann es aber verstärkt zur klinischen Erkrankung kommen, wobei Anämie und Gelbsucht auftreten (YANG et al. 2000). 2.12.2 Pathologie DILLBERGER et al. (1994) beschreiben die Nekropsie einiger Affen, die nach teilweise spontaner Erkrankung nach einer Episode von schwerer Anämie eingegangen waren. Hauptbefunde waren eine allgemeine Blässe und Splenomegalie. 2.12.3 Epidemiologie, Risikofaktoren und Ko-Infektionen Von 30 Waschbären aus dem Wildfang in den Vereinigten Staaten wurde bei einem Tier H. procyoni nachgewiesen (FRERICHS u. HOLBROOK 1971). 31 In einer Herde mit 19 Rentieren erlebten über eine Periode von 18 Monate zehn Tiere eine Episode einhergehend mit mehr oder weniger ausgeprägte Anämie. Zytologisch wiesen alle Tiere Hinweise auf epierythrozytäre Strukturen auf. Bei sechs Tieren wurde ein PCR-Test durchgeführt, alle mit positivem Ergebnis. Bei jeweils drei Tieren war die Kotprobe auf Endoparasiten positiv oder es wurden bei der Nekropsie Parasiten festgestellt. Der regenerative Charakter der Anämie im Kontrast zu einer chronischen Anämie mit Eisenmangel bei Parasitenbefall könnte die Kausalität zwischen den hämotrophen Mykoplasmen und der Anämie unterstützen (STOFFREGEN et al. 2006). In der Periode 1994 bis 1996 wurden in unentwickelten Gebieten in der Mongolei 1529 Blutproben aus der Bevölkerung gesammelt. 35,3 % der Proben waren EperythrozoonSpezies positiv. Die Diagnose wurde mittels Licht- und Elektronenmikroskopie gestellt. Zudem wurde Probandenblut intramuskulär bei Mäusen inokuliert und eine Bakteriämie abgewartet (YANG et al. 2000). 2.12.4 Diagnostik Für Rodentia steht zum Nachweis von M. haemomuris ein eigener PCR-Test zur Verfügung (ZHANG u. RIKIHISA 2002). Zur Diagnostik dieser Erreger bei den anderen Tierarten und auch dem Menschen wurden keine spezifischen PCR-Tests beschrieben. 2.12.5 Therapie Totenkopfaffen werden routinemäßig in der Malariaforschung (Plasmodium falciparum) als Modelltiere genutzt. Traditionell werden die Tiere vor Anfang solcher Studien mit Tetrazyklinen behandelt. Diese Therapie scheint aber als Prophylaxe für hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen ineffektiv zu sein (NEIMARK et al. 2002 a). Das Arsenderivat Neoarsphenamine scheint gegen sowohl patente als auch latente Infektionen wirksam (MICHEL et al. 2000). Auch bei Mäusen und Ratten wurden Behandlungen mit Arsenderivaten bei Infektionen mit diesen Erregern erfolgreich durchgeführt (THOMPSON u. BAYLES 1966). Mit einer Tetrazyklinbehandlung konnten infizierte Alpakas nicht erregerfrei gemacht werden (TORNQUIST et al. 2002). PUNTARIC et al. (1986) berichten über eine junge Frau, die mit anhaltendem Fieber, Anämie und Lymphadenopathie vorgestellt wurde. Die eingestellte Therapie mit Benzylpenicillin war erfolglos. Nach Umstellung auf Doxyzyklin trat eine schnelle Heilung auf, und diese erfolgreiche Umstellung der Antibiose veranlasste die Autoren, hier eine Infektion mit hämotrophe Mykoplasmen als Ursache in Betracht zu ziehen. 2.12.6 Bedeutung In Labortierbeständen wurden bei verschiedenen Tierarten wie Hunden (KEMMING et al. 2004 a), Schafen (MARTIN et al. 1988), Mäusen (SCHILLING 1928), Ratten (ELKO u. 32 CANTRELL 1968) und Affen (DILLBERGER et al. 1994; NEIMARK et al. 2002 a) hämotrophe Mykoplasmen nachgewiesen. Die Infektionen könnten Experimente beeinflussen und Bias verursachen. Mit infizierten Schaf-Erythrozyten, die in einem Komplement Fixation Test benutzt wurden, wurden nachweislich andere Ergebnisse erzielt, als mit Erythrozyten von negativen Tieren (NORRIS et al. 1987). Hinweise auf humane Eperythrozoonose wurden von verschiedenen Autoren beobachtet (GRETILLAT u. KONARZEWSKI 1978; PUNTARIC et al. 1986; DUARTE et al. 1992). In China wurden Eperythrozoon-Spezies als ursachliche Agentia beschrieben (YANG et al. 2000). Im Zusammenhang mit humanem systemischen Lupus erythematosus wurden Haemobartonella-ähnliche Strukturen nachgewiesen (KALLICK et al. 1972). Die Erreger wurden bisher nicht gentechnisch identifiziert. Hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei Tieren könnten als Modell zur Forschung humaner Krankheit genutzt werden (HOELZLE 2007). Die Rolle von hämotrophen Mykoplasmen als Krankheitserreger bei Waschbären, Flughunden, Beutelratten, Alpakas und Rentieren wurde an Hand von Fallberichten beschrieben. Wie groß die Bedeutung dieser Art von Erkrankung bei diesen Tierarten ist, bedarf noch weiterer Untersuchungen (EWERS 1971; FRERICHS u. HOLBROOK 1971; MESSICK et al. 2002; STOFFREGEN et al. 2006). Es bleibt noch ungeklärt, in wieweit hämotrophen Mykoplasmen eine Rolle als potentielle Zoonose zugeschrieben werden kann (GRETILLAT u. KONARZEWSKI 1978; PUNTARIC et al. 1986). Von verschiedenen Arthropoden, die auch Menschen befallen können, wurde nachgewiesen, dass sie hämotrophe Mykoplasmen übertragen können (SENEVIRATNA et al. 1973; BERKENKAMP u. WESCOTT 1988; PRULLAGE et al. 1993; SHAW et al. 2004; TAROURA et al. 2005; LAPPIN et al. 2006; WILLI et al. 2007 a). Obwohl hämotrophe Mykoplasmen im Allgemeinen als wirtspezifisch betrachtet werden und natürliche Kreuzinfektionen nicht bekannt sind, sollte Xenotransplantation als potentielle Übertragungsquelle berücksichtigt werden (HOELZLE 2007). 2.13 Hinweise auf hämotrophe Mykoplasmen beim Pferd Über die Pathogenität von Mykoplasmen beim Pferd ist wenig bekannt. Sie wurden bei verschiedenen Krankheitsprozessen isoliert, aber deren Rolle in der Pathogenese bleibt unklar (KIRCHHOF u. RUNGE 1998). In Handbüchern über Pferdemedizin ist keine Information über hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen zu finden. In einer einzigen Veröffentlichung berichtet GRETILLAT (1978) über die Haemobartonellose bei Pferden in Nigeria. In diesem Teil der Sahel scheint der Erreger sehr pathogen für Pferde zu sein und ihm wird große sozialökonomische Bedeutung zugeschrieben. Die Krankheit wird relativ häufig beobachtet. Auf einem Reitbetrieb waren 60 % der Pferde Träger der Haemobartonellen und bei 10 % wurden klinische Symptome beobachtet. Initial sind die Tiere allgemein schlapp, haben 33 intermittierend leichtes Fieber und Inappetenz. Bei leichter Arbeit fällt eine Dyspnoe und starkes Schwitzen auf. Die Schleimhäute sind blass, leicht ikterisch, und gelegentlich werden Petechien beobachtet. Wenn die Pferde rechtzeitig Ruhe kriegen, können die Symptome abklingen und die Tiere erholen sich in einigen Tagen. Ohne Ruhe geht die Krankheit in ein chronisches Stadium über, wobei die Patienten in sehr schlechtem allgemeinem Zustand sind. Bewegungsstörungen, Nasenbluten, Dyspnoe und eine schmerzhafte Adenopathie sind die Hauptsymptome. Fast immer wurde ein Splenomegalie festgestellt. Bei einem Teil der Pferde kommt es zum Festliegen, wobei die Patienten nach einer Agonie von einigen Stunden, nach 2 bis 3 Wochen sterben. Im akuten Stadium wird im Blutbild eine Lymphozytose beobachtet, bei chronisch kranken Tieren einen Neutrophilie. Auffällig war, dass Pferde mit einer Eosinophilie eine bessere Prognose zu haben scheinen. Kurz vor dem Tod tritt eine starke Leukopenie auf. Die Pferde sind anämisch. Im peripheren Blutausstrich werden kleine Strukturen von 0,1 bis 0,3 μm auf den Erythrozyten beobachtet. Sie präsentieren sich vereinzelt, doppelt oder in Ketten. Behandlung mit Kortikosteroiden verschlechtert den Zustand der Patienten. Mit Arsenpräparaten wird eine leichte Verbesserung erreicht. Durch Antibiotika wird keine Wirkung erreicht, von Penicillin und Streptomycin wird sogar abgeraten. Behandlungserfolge wurden nur mit einer Kombination von Chlorpromazin und einem anti-protozoalen Diminazine-Präparat beobachtet. Die Übertragung findet wahrscheinlich durch blutsaugende Arthropoden statt. Aus Großbritannien wurde über eine andauernde Lethargie bei Pferden in Zusammenhang mit einem Enterovirus berichtet (RICKETTS et al. 1992). Nach dem „Chronic fatigue syndrome“ bei Menschen wurde hier die Bezeichnung “Equine fatigue syndrome“ introduziert. „Chronic fatigue syndrome“ oder chronisches Erschöpfungssyndrom wurde von TARELLO (2001 a, b) an Hand von fünf Fallberichten beim Pferd beschrieben. Es betraf hier chronisch kranke Pferde, die nicht auf Standardbehandlungen mit Antibiotika, Anthelmintika und Kortikosteroiden reagierten. Die Pferde waren geschwächt, hatten abgenommen und zeigten Inappetenz. Der Zustand des Fells war schlecht. Verschiedene Pferde wiesen sekundäre bakterielle Infektionen auf und hatten intermittierendes Fieber. Neurologische und lokomotorische Symptome wurden auch beschrieben. Vier von den fünf Pferden waren anämisch, eines zeigte eine Neutrophilie. Im peripheren Blutausstrich wurden bei allen Pferden 0,3 bis 0,5 μm große Strukturen auf den Erythrozyten beobachtet. Babesia oder Ehrlichia Spezies wurden nicht festgestellt. Blutkulturen wurden nicht ausgeführt. Eine Behandlung mit intravenösen Arsenderivaten in einer niedrigen Dosierung, wie beschrieben bei der Haemobartonellose der Katze, führte bei allen Pferden zur kompletten Besserung. Bei Nachkontrollen wurden im Blutausstrich keine Mikroorganismen festgestellt und die hämatologischen Messwerte waren im normalen Bereich. Der Autor bemerkt, dass Arsenderivate von jeher beim Pferd als Tonikum und zur Behandlung von Asthenie eingesetzt wurden, aber über die letzten Jahrzehnte aus den regulären Behandlungen verschwunden sind. 34 Noch nicht veröffentlichte Daten aus der Schweiz (persönliche Mitteilung Dr. L. Hoelzle) und Deutschland (persönliche Mitteilung Dr. M. Winkler) geben Hinweise auf hämotrophe Mykoplasmen-ähnliche Bakterien beim Pferd. 2.14 Hämatologie beim Pferd 2.14.1 Normale Hämatologie Die Erythrozyten des Pferdes sind scheibenförmig und zwischen 5 und 6 μm groß. Die Lebensdauer beträgt 140 bis 155 Tage. Gesundes Pferdeblut weist in Folge der Geldrollenformung eine schnelle Sedimentation auf. Bei längerer Lagerung an Zimmertemperatur wird Glukose aufgebraucht und steht somit der Na⁺/K⁺ Membran Pumpe nicht mehr als Energielieferant zur Verfügung. So kommt es zur einen Pseudohyperkaliämie. Pferde mit höherem Vollblutanteil haben in Ruhe höhere Hämatokrit-Werte. Sonstige Variationen der Messwerte beruhen hauptsächlich auf Alter und emotionalem Status der erprobten Tiere, scheinen aber keine wichtige Rolle zu spielen (KRAMER 2000). Tabelle 2.6 gibt eine Übersicht über publizierte hämatologische Referenzwerte beim Pferd. Die Referenzwerte entsprechen den Werten einer bestimmten gesunden Population. Für eine Übersicht über das weiße Blutbild und über die Hämatologie des Fohlens wird auf die Literatur verwiesen (KRAMER 2000; LATIMER u. RAKICH 2002). Die Referenzwerte für Leukozyten folgen aus Tabelle 2.6. Im Vergleich zu den anderen Tierarten weisen Pferde sehr niedrige Thrombozytenkonzentrationen auf (KRAMER 2000). Die Referenzwerte folgen aus Tabelle 2.6. Wenn bei einem Pferd ohne deutliche Blutungsneigung eine Thrombozytopenie festgestellt wird, könnte eine EDTA-abhängige Pseudothrombozytopenie vorliegen. Die Diagnose kann durch einen Vergleich der Thrombozytenzahl einer Heparin-Blutprobe mit der Trombozytenzahl einer EDTA-Blutprobe gesichert werden (HINCHCLIFF et al. 1993). Messwert Leukozyten Erythrozyten Hämoglobin Hämatokrit MCH MCHC MCV Thrombozyten Einheit G/l T/l g/dl % pg g/dl fl G/l LATIMER u. RAKISH 2002 6-12 6-12 10-18 32-48 13-19 31-37 34-58 100-600 Tabelle 2.6: Publizierte hämatologische Referenzwerte des Pferdes KRAMER 2000 5,4-14,3 6,8-12,9 11,0-19 32-53 12,3-19,9 31,0-38,6 37,0-58,5 100-350 35 2.14.2 Periphere Blutausstriche mit besonderer Beachtung der Erythrozyten Das Ziel beim Anfertigen eines Blutausstrichs ist, die Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten so von einander zu trennen, dass sie identifiziert und beobachtet werden können. Aus EDTA-Vollblut kann mit Hilfe zweier Objektträger oder zweier Deckgläser ein Ausstrich angefertigt werden. Die Methode mit Anwendung der Objektträger wird hier kurz erläutert, für die andere Methode wird auf die Literatur verwiesen. Wichtig ist, die Blutprobe gut zu mischen bevor ein kleiner Blutstropfen auf das Ende eines Objektträgers gebracht wird. Ein anderen Objektträger wird in einem Winkel von ungefähr 30 Grad aus Richtung des dem Bluttropfen gegenüberliegenden Endes in den Blutstropfen geschoben. Das Blut verteilt sich und kann in die andere Richtung ausgestrichen werden (LATIMER u. RAKICH 2002). Der Blutausstrich sollte möglichst dünn und homogen sein. Dazu empfehlen GEHLEN et al. (2008), die Objektträger im Brutschrank auf 37 Grad anzuwärmen und das Präparat sofort mit dem Föhn zu trocknen. Es sollten nur 5 bis 7 μl Blut pro Ausstrich verwendet werden. Nach dem Trocknen werden die Ausstriche meistens mit Romanowsky-Färbungen angefärbt, welche sich aus drei Farben zusammen setzt (rot, blau und lila). Neben einer unzureichenden Färbung kann die Formation von Präzipitaten eine gute Beurteilung der Ausstriche erschweren. Präzipitate entstehen durch Verdampfung von Alkohol aus der Färbungslösung (LATIMER u. RAKISH 2002) oder durch unzureichende Spülung (LATIMER u. RAKISH 2002; GEHLEN et al. 2008). Erythrozyten des Pferdes färben sich rot mit einem etwas blasseren Zentrum. Häufig wird Geldrollenformung beobachtet. Howell-Jolly Körper sind punktförmige DNA-Reste und werden selten bei gesunden Pferden, häufiger bei Anämien beobachtet (LATIMER u. RAKICH). Sie sind keine eindeutigen Hinweise auf einer Regeneration (MORRIS 2002 a). Eine Makrozytose ist aber ein deutlicher Hinweis auf eine regenerative Anämie. Sie wird durch ein erhöhtes MCV angezeigt, welches aber wenig sensitiv ist (FEY 2006). Unvollständig getrocknete Präparate können nach dem Färben Falten aufweisen, wobei die Erythrozyten-Membran Punkte aufweist. Bei Anämien werden häufig kernhaltige Erythrozyten beobachtet. Bei verschiedenen Pathologien kann Mikrozytose und Poikilozytose auftreten (LATIMER u. RAKICH 2002). Nach oxydativer Beschädigung der Erythrozyten werden Heinz Körper als Punkte im Blutausstrich beobachtet (KRAMER 2000; LATIMER u. RAKICH 2002). Mit einer Spezialfärbung (neu Methylen blau) können diese denaturierten Hämoglobin-Aggregate noch deutlicher sichtbar gemacht werden. Nach Intoxikation mit Blei können kleine blau-grauen Stippen auf den Erythrozyten sichtbar gemacht werden. Die Identifikation dieser Veränderungen ist aber sehr abhängig von der angewendeten Technik. Bei einer Infektion mit Babesiose können die Parasiten mit ihrer typischen Tränenform in den Erythrozyten angetroffen werden (LATIMER u. RAKICH 2002). 36 2.14.3 Hämolytische Anämie Die Entwicklung von Retikulozyten zu Erythrozyten findet beim Pferd komplett im Knochenmark statt, wodurch der Unterschied zwischen einer regenerativen und nichtregenerativen Anämie erschwert wird (KRAMER 2000; LATIMER u. RAKICH 2002). Blutarmut oder Anämie wird definiert als ein Zustand, in dem die SauerstoffTransportkapazität des Blutes verringert ist (MORRIS 2002 a; FEY 2006). Klinisch ist eine Verminderung der Erythrozytenzahl und/oder des Hämoglobingehaltes vorhanden (FEY 2006). Den deutlichsten Hinweis auf eine Anämie gibt der Hämatokrit. Anämie entsteht durch Blutverlust, Hämolyse, unzureichende Erythrozyten-Produktion oder aus einer Kombination dieser Ursachen (MORRIS 2002 a). Von 33 Pferden die mit einer Bluttransfusion behandelt wurden, wiesen 18 eine hämorrhagische Anämie, 8 eine hämolytische Anämie und 5 eine Anämie durch Störung der Erythropoese auf (HURCOMBE et al. 2007). Viel häufiger als die intravasale Hämolyse tritt beim Pferd die extravasale hämolytische Anämie auf, wobei durch verstärkten immunologisch bedingten Abbau im retikuloendothelialen System die Lebensdauer der Erythrozyten verkürzt wird. Auslöser der Hämolyse sind meistens infektiöse oder immunologische Prozesse, wobei die Differenzierung oft schwierig ist. Seltener kommen Toxine oder Mikroangiopathien in Frage (FEY 2006). Tabelle 2.7 listet mögliche Ursachen der hämolytischen Anämie beim Pferd auf. Neonataler Isoerythrolyse Equine Infektiöser Anämie Rot-Ahorn Vergiftung Equine Ehrlichiose Zwiebelvergiftung Autoimmuner hämolytischer Anämie Babesiose Clostridium Infektionen Inkompatible Bluttransfusionen Übersetzt und geändert nach MORRIS (2002 a) Tabelle 2.7: Mögliche Ursachen einer hämolytischen Anämie beim Pferd Fallberichte von immunvermittelter hämolytischer Anämie bei Pferden, ausgelöst durch Penicillin (BLUE et al. 1987) und Trimethoprim-Sulfamethoxazol (THOMAS u. LIVESEY 1998), liegen vor. Hämoglobinurie, verfärbtes Serum und ein Hämatokrit (%)/ Hämoglobin (g/dl)-Wert unter 3 sind Hinweise auf Hämolyse (MORRIS 2002 a). Bei intravasaler hämolytischer Anämie können die erythrozytären Indices MHC und MCHC erhöht sein (FEY 2006). Ein positiver Coomb’s Test zeigt Antikörper auf der Oberfläche der Erythrozyten an, was beim Pferd meist ein Hinweis ist auf ideopathische autoimmune hämolytische Anämie, Infektiöse Anämie oder Neonatale Isoerythrolyse. Es ist aber mit vielen falsch negativen Ergebnissen zu rechnen (MORRIS 2002 a). In Deutschland wurden in 2007 zwei, und in 2008 sieben Fälle von Equiner Infektiöser Anämie angezeigt (ANON. 2008). Die Diagnose wird mittels Serologie 37 (Coggins-Test) oder PCR (ANON. 2005 a) gesichert. Eine Übersicht der Infektiösen Anämie in den Vereinigten Staaten, wo diese Krankheit weitverbreitet ist, wurde von SELLON (1993) veröffentlicht. Equine Piroplasmose oder Babesiose ist im Süden Europas und vielen anderen Teilen der Welt endemisch und wird durch die intraerythrozytären Protozoa Theileria equi und Babesia caballi verursacht. Die Diagnose wird durch Nachweis der Parasiten im peripheren Blutausstrich, PCR oder Serologie gesichert (ANON. 2005 b). 38 3. EIGENE UNTERSUCHUNGEN 3.1 Material und Methoden 3.1.1 Tiermaterial Die Untersuchungen wurden von August 2006 bis April 2007 an insgesamt 108 Pferden aus der Klientel einer tierärztlichen Praxis in Niedersachsen durchgeführt. Es handelte sich um Pferde und Ponys aus dem Raum Bremen-Osnabrück-Hannover, gehalten auf Pferdezuchtbetrieben und in Reitställen. In jedem Betrieb waren mindestens 5 oder mehr Pferde untergebracht. Die Tiere waren in normalen Boxen mit Auslauf auf Paddock oder Weide, oder nur auf Weide gehalten. Tiere, die in den letzten Monaten vor dem Untersuchungsdatum erkrankt (d.h. andere Symptomatik als zum Untersuchungszeitpunkt dieser Studie) oder antibiotisch behandelt worden waren, wurden nicht zur Studie zugelassen. Alle Tiere wurden regelmäßig mit Anthelmintika behandelt. Es wurden Stuten, Hengste und Wallache aller Rassen zur Untersuchung zugelassen. Eine Altersbegrenzung wurde nicht festgelegt, von Neugeborenen wurden aber keine relevanten Proben entnommen. Keines der Pferde war vorberichtlich splenektomiert. Neben Aufnahme des Signalements und Vorberichtes wurden die Pferde allgemein klinisch untersucht. Die Allgemeinuntersuchung beinhaltete die Beurteilung von Ernährungs- und Pflegezustand, die Evaluierung von Puls- und Atemfrequenz, der inneren Körpertemperatur, das Feststellen von Nasenausfluss, Durchfall, Ödemen oder Husten sowie der Palpation der Lymphknoten. 3.1.2 Untersuchungsgruppen Tiere, die Symptome aufwiesen die eine Infektion mit hämotrophen Mykoplasmen signalisieren könnten, wurden der Gruppe S („Symptomtiere“), und Tiere, die allgemein gesund waren, wurden der Gruppe K (Kontrolltiere) zugeordnet. Die Abbildung 3.1 zeigt das Untersuchungsschema dieser Studie. Aus der Praxis wird bei Pferden mit angenommener hämotropher Mykoplasmen-Infektion häufig über Asthenie, schlechten Fellzustand, Abmagerung und Leistungsschwäche berichtet. Diese und andere Symptome, welche bei hämotrophen Mykoplasmen-Infektionen in der Literatur beschrieben sind, wurden in der vorliegenden Studie als Kriterium genutzt, um eine Gruppe mit symptomatischen Pferden zusammen zu stellen. Diese zur Einteilung verwendeten Symptome sind in Tabelle 3.1 aufgelistet. Tiere mit einem oder mehreren Symptomen aus der Tabelle 3.1 wurden in die Gruppe S eingeteilt. Pferde, bei denen nach der allgemeinen klinischen Untersuchung die Diagnose einer Krankheit des Respirations- oder 39 Magen-Darmtraktes gestellt wurde, wurden von der Aufnahme in eine der Gruppen ausgeschlossen. Auch Pferde, die nur Pyrexie aufwiesen, wurden nicht zur Studie zugelassen. Tiermaterial Tiere mit klinischen Symptomen Allgemeingesunde Tiere Gruppe S Gruppe K Zytologischer Nachweis positiv Zytologischer Nachweis negativ Zytologischer Nachweis positiv Abbildung 3.1: Untersuchungsschema Symptome blasse Schleimhäute Asthenie schlechter Fellzustand Abmagerung Anorexie Pyrexie (Körpertemperatur > 38,3°C) Leistungsschwäche perifere Ödeme Hämoglobinurie Steifheit (OVERAS 1969; DADDOW 1979 a; BURROUGHS 1988; SMITH et al. 1990 a; MESSICK 2003, 2004) Tabelle 3.1: Auflistung der möglichen Symptome von Tieren in Gruppe S Zytologischer Nachweis negativ 40 Asthenie oder Leistungsschwäche wurden nicht mit Messwerten erfasst. Die Aussage des jeweiligen Bereiters oder Pflegers im Vorbericht wurde hier als Symptom festgehalten, und wenn der Vorbericht und die allgemein klinische Untersuchung keine andere Diagnose ergab, wurden die Tiere in Gruppe S eingeteilt. Zur Erfassung der Kondition der Tiere wurde ein Klassifizierungssystem angewendet wie von HENNEKE et al. (1983) beschrieben (Tabelle 3.2). Die Pferde wurden mittels Inspektion und Palpation untersucht, und Tiere der Klasse 3 oder weniger wurden als abgemagert bezeichnet und der Gruppe S zugeteilt. Klasse 1 schlecht Beschreibung Tier ist sehr abgemagert, Fettgewebe kann nicht palpiert werden 2 sehr dünn 3 dünn Tier ist abgemagert, etwas Fett über den Dornfortsätzen und Querfortsätzen Etwas Fett über den Rippen; Querfortsätze nicht mehr palpabel 4 mäßig dünn Konturen der Rippen noch sichtbar; Fett palpabel am Schweifansatz 5 mäßig Rippen nicht mehr sichtbar, aber palpabel; Fett am Schweifansatz schwammig Fett über den Rippen schwammig, am Schweifansatz weich; Anfangende Fettablagerungen am Widerrist, Schulter und Hals Deutliche Füllung zwischen den Rippen; Fettablagerungen an Widerrist, Schulter und Hals Rippen schwierig palpabel; Hals wirkt verdickt; Fettablagerungen am Innenschenkel Gelapptes Fett über den Rippen; vorspringendes Fett an Widerrist, Schulter und Hals; Flanken mit Fett gefüllt 6 mäßig bemuskelt 7 bemuskelt 8 fett 9 sehr fett Übersetzt und geändert nach HENNEKE et al. (1983) Tabelle 3.2: Klassifizierung der Kondition der Pferde Es wurden nur allgemeingesunde (allgemeine klinische Untersuchung) und beschwerdefreie (Besitzeraussage im Vorbericht) Pferde für die Gruppe K (Kontrolle) herangezogen. Alle Kontrolltiere wurden als Klasse 4 oder mehr eingestuft. Diese Pferde kamen sowohl aus Ställen mit, als auch Ställen ohne Pferde der Gruppe S. 3.1.3 Blutentnahme und Probenverarbeitung Es wurden Blutproben mit 18 G Kanülen (Terumo, Leuven, Belgien) und 10 ml Einmalspritzen (Henke Sass Wolf, Tuttlingen) aus der Vena jugularis externa entnommen und in zwei 4 ml Vacuette ® Rörchen mit EDTA als Antikoagulans (Greiner bio-one, Solingen) aufgefangen. Wie von LATIMER und RAKICH (2002) beschrieben, wurden mit 76x26 mm 41 Objektträgern (Menzel, Braunschweig) pro Blutprobe zwei Ausstriche angefertigt. Die Blutübertragung auf den Objektträger erfolgte mittels Ansaugpipetten PA10E1 (Milian, Genf, Schweiz). Mit Diff-Quik® (Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz) wurden die Ausstriche nach Herstellerangaben angefärbt. Die Zeit zwischen Blutentnahme und der Anfertigung der Ausstriche betrug zwischen 30 Minuten und 12 Stunden, wobei die Proben bei Raumtemperatur gelagert wurden. Ein Blutröhrchen jeder Probe wurde tiefgekühlt gelagert (-20°C), das andere wurde am gleichen oder am nächsten Tag per Post in das synlab.vet Labor Hamburg, Geesthacht, eingeschickt (synlab.vet damals noch Veterinärmedizinisches Analysenzentrum). 3.1.4 Zytologische Untersuchung Die angefärbten Blutausstriche wurden kodiert und danach blind beurteilt (Untersucher 1). Die Untersuchung erfolgte mit einem Olympus CH-2 Lichtmikroskop (Olympus Optical, Hamburg), unter Anwendung Benzylbenzoat enthaltenden Immersionsöl (Merck, Darmstadt). Zuerst wurde der Ausstrich bei 100-facher Vergrößerung beurteilt, danach bei 1000-facher Vergrößerung die einzelnen Blutzellen untersucht. Die Erythrozyten wurden auf Anwesenheit von Babesia Spezies, Howell-Jolly Körper, Heinz Körper und Eperythrozoon-ähnlichen Formen untersucht. Auch das Vorkommen deutlicher Artefakte wurde beurteilt. Als Eperythrozoon-ähnliche Formen wurden die Erscheinungsformen auf den Erythrozyten und im freiem Plasma angesehen, so wie dies bereits von OVERAS (1969) beim Schaf beschrieben wurde. Ein Vorkommen von drei oder mehr Eperythrozoon-ähnlichen Formen pro 10 Blickfelder in einem Ausstrich wurde als positiver zytologischer Nachweis eingestuft (TASKER et al. 2003 a). Alle anderen Ausstriche wurden als negativ bewertet. Eine quantitative Beurteilung der Eperythrozoon-ähnlichen Formen auf den Erythrozyten und im freien Plasma wurde nicht durchgeführt. Eine zweite mikroskopische Beurteilung erfolgte blind im synlab.vet Labor Hamburg nach eigener Anfertigung von Ausstrichen mittels Giemsa-Färbung des eingeschickten EDTABluts (Untersucher 2). Die von Untersucher 1 angefertigten Ausstriche wurden trocken bei Raumtemperatur gelagert und per Post in das Institut für Veterinärbakteriologie der Universität Zürich verschickt, wo eine mikroskopische Beurteilung der Ausstriche blind erfolgte (Untersucher 3). Aus den drei Beurteilungen der Untersucher wurde eine endgültige Diagnose erstellt, wobei zwei oder drei gleiche Beurteilungen der Untersucher das Endergebnis ergab. Kamen drei Untersucher zu drei unterschiedlichen Ergebnisse - was nur möglich war, wenn ein Untersucher eine Auswertung offenließ - wurde kein Diagnose gestellt. 42 3.1.5 Polymerase Kettenreaktion (PCR) Von zehn Proben mit einem deutlichen zytologischen Verdacht auf die Anwesenheit von hämotrophen Mykoplasmen wurde die tiefgefrorene EDTA-Probe in das Institut für Veterinärbakteriologie der Universität Zürich eingeschickt. Die Proben wurden nicht gekühlt über Nacht verschickt, wobei das Blut in aufgetautem Zustand im Labor eintraf. In der Probe vorhandenes 16S rDNA wurde mittels Universalprimers amplifiziert und eine Sequenzierung durchgeführt (LANE 1991). Die erhaltenen Sequenzen wurden mit Datenbankeintragungen verglichen. 3.1.6 Hämatologische Messwerte Im synlab.vet Labor Hamburg wurden aus den gleichen EDTA-Blutproben, die zur zytologischen Untersuchung eingeschickt worden waren, hämatologische Untersuchungen durchgeführt. Hierbei wurde ein Abbott Cell-Dyn 3500 Hämatologie-Analysegerät (Abbott GmbH&Co. KG, Wiesbaden) benutzt. Tabelle 3.3 listet die gemessenen Parameter zusammen mit deren vom synlab.vet Labor Hamburg angegebenen Referenzbereich auf. Messwert Leukozyten Erythrozyten Hämoglobin Hämatokrit MCH MCHC MCV Thrombozyten Einheit G/l T/l g/dl % pg g/dl fl G/l Referenzbereich 5-10 6-11 11-17 32-46 13-19 31-36 37-55 100-300 Tabelle 3.3: Hämatologische Messwerte und deren Referenzwerte wie vom synlab.vet Labor Hamburg angewendet 3.1.7 Biometrische Analyse Ein Vergleich von Gruppe S mit Gruppe K wurde an Hand der hämatologischen Messwerte durchgeführt. Die Kontrolle der Daten auf Normalverteilung erfolgte vor und nach Logarithmustransformation mittels Tests von Shapiro-Wilk, Kolmogorov-Smirnov, Cramervon Mises und Anderson-Darling. Bei normalverteilten Daten wurde der T-Test verwendet, bei nicht-normalverteilten Daten der Wilcoxon-Test. Zur Evaluierung der zytologischen Diagnostik wurden die Übereinstimmungen zwischen den drei verschiedenen Untersuchern mittels des McNemar-Tests und Errechnung des Kappa-Indexes überprüft. Ein Vergleich von Tieren mit höheren und niedrigen Erythrozyten-, Hämoglobin- und Hämatokrit-Werte wurden 43 an Hand der zytologischen Diagnose mittels des Chi-Quadrat-Homogentitätstests durchgeführt. Bei der Beurteilung ist jeder P-Wert>0,05 als nicht signifikant, jeder P-Wert <0,05 als signifikant und jeder P-Wert<0,001 als hoch signifikant eingestuft worden. Die Berechnung der Werte wurde am Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Tierärztlichen Hochschule Hannover mit Hilfe des Statistikprogramms SAS (Statistical Analysis Systems) durchgeführt. 44 3.2 Ergebnisse 3.2.1 Untersuchungsgruppen Insgesamt 108 Pferde und Ponys konnten auf Grund der aufgestellten Kriterien in Gruppe S und Gruppe K eingeteilt und getestet werden. Tabelle 3.4 zeigt die Zahl der Tiere und das Geschlechtsverhältnis der Versuchsgruppen. Gruppe Geschlecht Hengst Wallach Stute Summe Gruppe S 11 15 6 32 Gruppe K 14 36 26 76 Summe 25 51 32 108 Tabelle 3.4: Zahl und Geschlecht der Pferde in Gruppe S und K Von 80 (74,1 %) Warmblütern, 1 (0,9%) Welsh Pony, 10 (9,3 %) Deutsches Reitponys, 14 (13,0 %) Arabern, 1 (0,9%) Shetlandpony und 2 (1,9 %) Haflingern wurden Proben entnommen und ausgewertet. Die Verteilung der Rassen pro Gruppe wird in Abbildung 3.2 dargestellt. Gruppe K (N=76) Gruppe S (N=32) Warmblut Warmblut Araber Haflinger Abbildung 3.2: Kreisdiagramme mit Verteilung der Rassen in den Gruppen S und K Welsh DRP Araber Shetland 45 Alter (Jahre) Das Alter der Versuchstiere wird für die Gruppen S und K anhand von Box-Plots in Abbildung 3.3 dargestellt. Das Merkmal Alter war nicht normalverteilt, wobei die Tiere der Kontrollegruppe (K) durchschnittlich älter waren als die symptomatischen Tiere (S). Dieser Unterschied war hoch signifikant (P<0,001). Gruppe K Gruppe S Abbildung 3.3: Box-Plot-Darstellung des Alters Die Tabellen 8.1 und 8.2 im Anhang zeigen die Kodierung und die Einzelergebnisse der untersuchten Tiere für die Merkmale Geschlecht, Rasse und Alter in Gruppe S und K. 3.2.2 Symptome Die Häufigkeiten der einzelnen Symptome werden in Abbildung 3.4 dargestellt. Zu beachten ist, dass ein Einzeltier mehrere Symptome aufweisen kann. Zudem sind die Häufigkeiten einer positiven zytologischen Diagnose (als Endergebnis der Beurteilungen der drei Beobachter) pro Symptom aufgelistet. 46 blasse Schleimhäute Asthenie Schlechtes Fell Abmagerung Anorexie Pyrexie Leistungsschwäche periferes Ödem Hämoglobinurie Steifheit 0 N=32 5 "Symptomtiere" 10 15 20 25 30 positive Zytologie (als Endergebnis) Abbildung 3.4: Beobachtete Symptome und positive zytologische Befunde in der Gruppe S Asthenie (N=13) und Abmagerung (N=15) wurden am häufigsten beobachtet. Keines der Tiere in Gruppe S zeigten blasse Schleimhäute, Pyrexie oder Hämoglobinurie. Tabelle 8.1 listet die Symptome der einzelnen Tiere in der Gruppe S auf. 3.2.3 Zytologie Der negative Blutausstrich des Pferdes wird beispielhaft anhand von Abbildung 3.5 und 3.6 erläutert. Auf den Erythrozyten sind keine verdächtigen (Eperythrozoon-ähnliche) Strukturen anwesend. Häufig tendieren die roten Blutzellen zur Geldrollenformation. Bei den als positiv bewerteten Ausstrichen wurden die verdächtigen eperythrozytären Strukturen sowohl in der Einzelform als auch in der Ringform wahrgenommen (Abbildung 3.7 und 3.8). Babesia Spezies und Heinz Körper wurden nicht identifiziert. In nur einem einzigen Ausstrich wurde einen Howell-Jolly Körper identifiziert (Abbildung 3.9). Es handelt sich hier um ein leicht anämisches Tier aus der Kontrollegruppe (K20). Die Erythrozytenzahl ist mit einem Wert von 5,3 T/l unterhalb des Referenzbereiches (6-11 T/l), die MCH (20,7; 13-19 pg) und MCV (61; 37-55 fl) sind geringgradig erhöht. Die drei zytologischen Untersuchungen bei diesem Tier wurden einheitlich als positiv bewertet. Abbildung 3.10 zeigt ein Beispiel von Artefaktbildung wie es regelmäßig beobachtet wurde. Die roten Blutzellen scheinen von metallischen Kristallen befallen. 47 Keine verdächtigen Strukturen auf den Erythrozyten erkennbar. Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.5: Zytologische Untersuchung negativ 48 Keine verdächtigen Strukturen auf den Erythrozyten erkennbar. Deutliche Geldrollenformation. Eosinophiler Granulozyt mit großen, runden Speicherkörnchen gut erkennbar. Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.6: Zytologische Untersuchung negativ 49 Vereinzelt sind verdächtige Punkte auf den Erythrozyten und frei im Plasma erkennbar. Zusätzlich ein Lymphozyt erkennbar. Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.7: Zytologische Untersuchung positiv 50 Verdächtige Punkte in der Ringform auf den Erythrozyten erkennbar. Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.8: Zytologische Untersuchung positiv 51 Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.9: Howell-Jolly Körper 52 Kristallbildung auf den Erythrozyten etwas außerhalb der Fokusfläche. Diff-Quik® Färbung, 1000 x Abbildung 3.10: Artefaktbildung 53 In Tabelle 3.5 werden die gesamten zytologischen Beurteilungen von 108 Blutproben der drei Untersucher wiedergegeben. Eine Probe wurde von Untersucher 2 nicht beurteilt. Beurteilung positiv negativ na U1 82 26 Untersucher U2 72 35 U3 21 36 51 (U#=Untersucher; na= nicht auswertbar) Tabelle 3.5: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in beide Gruppen In Gruppe S (N=32) beurteilten die Untersucher nur 3 Blutproben einheitlich, nämlich zweimal alle positiv und einmal alle negativ. Zweimal beurteilten die Untersucher alle unterschiedlich. Tabelle 3.6 listet die Beurteilungen in Gruppe S auf. Beurteilung positiv negativ na U1 27 5 Untersucher U2 22 9 Endergebnis U3 7 12 13 24 6 (U#=Untersucher; na=nicht auswertbar) Tabelle 3.6: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in der Gruppe S In Gruppe K (N=76) beurteilten die Untersucher in 10 Fällen einheitlich positiv, in 6 Fällen einheitlich negativ und 21-mal wurden die Blutproben von allen drei Untersuchern unterschiedlich beurteilt. Tabelle 3.7 listet die Beurteilungen in der Kontrollgruppe auf. Beurteilung positiv negativ na U1 55 21 Untersucher U2 50 26 Endergebnis U3 14 24 38 (U#=Untersucher; na= nicht auswertbar) Tabelle 3.7: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in der Gruppe K 39 16 54 In dem Mc-Nemar-Test wurde eine sehr schlechte Übereinstimmung zwischen den Beurteilungen der verschiedenen Untersucher festgestellt. Untersucher 1 und 2 beurteilten mit P=1,1699 ähnlich, aber die tatsächliche Übereinstimmung ist mit einem Kappa-Wert von 0,0225 sehr schlecht. Die Vergleiche der Beurteilungen von Untersucher 1 und 3 und Untersucher 2 und 3 zeigten hoch signifikant (P<0,001) sehr schlechte Übereinstimmungen mit einem sehr kleinen Kappa-Wert (-0,0148). Tabelle 8.3 und Tabelle 8.4 listen die gesamten zytologischen Beurteilungen der Gruppen S und K auf. Abbildung 3.11 zeigt die Verteilung der von Untersucher 1 wahrgenommenen Artefakte in den Gruppen Zytologie positiv und negativ. Zytologie positiv (N=82) Zytologie negativ (N=26) Artefakt Ja Artefakt Ja Artefakt Nein Artefakt Nein Abbildung 3.11: Von Untersucher 1 beobachtete Artefakte in den als zytologisch positiv und negativ beurteilten Abstrichen 3.2.4 Hämatologie Die Streuungsmaße der hämatologischen Messwerte der Gruppe S und K werden in Tabelle 8.5 und Tabelle 8.6 wiedergegeben. Ein Vergleich zwischen den Kontrolltieren und den symptomatische Tieren wurde an Hand der hämatologischen Messwerte durchgeführt. Gruppe S und K wiesen keinen Unterschied in Leukozytenzahl (P=0,6472), Thrombozytenzahl (P=0,2182) oder mittlerer Hämoglobinkonzentration des Einzelerythrozyten (MCHC) (P=0,3372) auf. Die Erythrozytenzahl dagegen war hoch signifikant (P<0,001) unterschiedlich. Gruppe S wies durchschnittlich höhere Erythrozytenzahlen auf. Abbildung 3.12 zeigt den Unterschied in der Erythrozytenzahl zwischen Gruppe S und K. Erythrozyten (T/L) 55 Gruppe K Gruppe S Abbildung 3.12: Erythrozytenzahl der Gruppen S und K Hämoglobin (g/dl) Auch der Hämoglobingehalt (P=0,0117), der Hämatokritwert (P=0,0212), das Einzelvolumen der Erythrozyten (MCV) (P= 0,002) und der Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten (MCH) (P=0,0013) waren in beide Gruppen signifikant unterschiedlich. Die Abbildungen 3.13, 3.14, 3.15 und 3.16 geben die Verteilung dieser Zahlen wieder. Gruppe K Abbildung 3.13: Hämoglobingehalt der Gruppen S und K Gruppe S Hämatokrit (%) 56 Gruppe K Gruppe S MCV (fl) Abbildung 3.14: Hämatokritwert der Gruppen S und K Gruppe K Abbildung 3.15: MCV der Gruppen S und K Gruppe S MCH (pg) 57 Gruppe K Gruppe S Abbildung 3.16: MCH der Gruppen S und K Bei 21 Tieren (5 der Gruppe S; 16 der Gruppe K) lag die Leukozytenzahl außerhalb des Referenzbereiches (5-10 G/l). Fünf der Tiere wiesen eine geringgradige Leukozytose (höchster Wert 14,1 G/l) auf, die restlichen Tiere zeigten eine geringgradige Leukopenie (niedrigster Wert 4,0 G/l). Drei Kontrolltiere wiesen eine leicht niedrige Erythrozytenzahl auf (5,3; 5,9; 5,9; Referenzbereich 6,0-11,0 T/l). Diese 3 Tiere wurden im zytologischen Endergebnis als positiv bewertet. Neun Kontrolltiere und ein symptomatisches Tier wiesen einen leicht niedrigen Hämoglobingehalt auf (Werte von 9,6 bis 10,9; Referenzbereich 11,017,0 g/dl). Bei einem Tier aus Gruppe S war der Hämoglobingehalt erhöht (18,3 g/dl). Der Hämatokrit war bei 14 Tieren außerhalb des Referenzbereiches (32,0-46,0 %). Fünf von 7 Kontrolltieren und eins von 7 symptomatischen Tieren wiesen einen leicht niedrigen Wert auf (niedrigster Wert 28,5 %). Bei den restlichen Tieren war der Hämotokrit erhöht (höchste Wert 55,6 %). Mit einem Wert von 12,7 pg war MCH bei einem Kontrolltier geringgradig niedrig, bei 4 Kontrolltieren war MCH leicht erhöht (Werte von 19,1 bis 20,7; Referenzbereich 13,019,0 pg). Bei einem Kontrolltier war MCHC leicht niedrig (30,0 g/dl), bei einem anderen Kontrolltier war dieser Wert leicht erhöht (37,7; Referenzbereich 31,0-36,0 g/dl). Auch MCV war nur bei einigen Kontrolltieren außerhalb des Referenzbereiches (37,0-55,0 fl). Bei 7 Tieren war MCV leicht zu groß (Werte von 55,3 bis 61,0 fl). Bei vielen Tieren beider Gruppen wurde eine Thrombopenie festgestellt. Bei keinem dieser Tiere wurden Anzeigen einer Blutungsneigung festgestellt. Tier K20 wies mit 18,0 G/l einen extrem niedrigen Wert auf (Referenzbereich 100,0-300,0 G/l). Zudem war bei K20 die Erythrozytenzahl (5,3 G/l) niedrig. Klinische Symptome wurden nicht festgestellt. Bei einem Tier wurde eine erhöhte Trombozytenzahl gemessen (356,0 G/l). Tabelle 8.7 listet die Messwerte, die außerhalb des Referenzbereichs waren, auf. Bei mehreren Tieren waren mehr als ein Parameter außerhalb 58 des Referenzbereiches. Auffällig in der symptomatischen Gruppe war Tier S8. Der Hämoglobingehalt (10,6 g/dl) und Hämatokrit (31,6 %) waren leicht niedrig, die zytologische Untersuchung wurde im Endergebnis als positiv bewertet. Auffällig wurde dieses Pferd durch Asthenie und einen schlechten Fellzustand. Bei Tier S13 hingegen waren diese Parameter erhöht (Hämoglobingehalt 18,3 g/dl; Hämatokrit 55,6 %). Auch hier war die Zytologie im Endergebnis positiv. Diese Araberstute wurde auffällig durch Abmagerung. In der Kontrollegruppe zeigten 5 Pferde mehrere interessante Abweichungen des Referenzbereiches. Bei Tier K11 waren der Hämoglobingehalt (9,6 g/dl) und der Hämatokrit (29,3 %) niedrig. Zudem wurde eine leichte Leukozytose (12,1 G/l) festgestellt. Über die zytologische Enddiagnose wurde kein Konsens erreicht (3 unterschiedliche Bewertungen). Auch bei den Tieren K12 und K16 waren Hämoglobingehalt (10,9; 9,9 g/dl resp.) und Hämatokrit (31,4; 29,1 %) leicht niedrig. Im zytologischen Endergebnis wurden beide Tiere als positiv bewertet. Bei Tier K28 waren sowohl der Hämoglobingehalt (9,9 g/dl) und Hämatokrit (28,5 %), als auch die Erythrozytenzahl (5,9 T/l) niedrig. Das zytologische Endergebnis wurde als positiv bewertet. Bei Tier K48 waren Hämoglobingehalt (10,2 g/dl), Hämatokrit (31,2 %) und Erythrozytenzahl (5,9 T/l) niedrig. Zudem lag eine geringgradige Leukopenie (4,6 G/l) vor. Auch hier war das zytologische Endergebnis positiv. 3.2.5 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits Um eine mögliche Assoziation zwischen Anämie einerseits und positivem zytologischen Status anderseits zu untersuchen, wurde eine Neueinteilung der Gruppen basierend auf dem Median der Gruppen S und K als Ober- und Untergrenze durchgeführt. So wurde es möglich, Tiere mit höheren und niedrigen Werten im roten Blutbild an Hand der zytologischen Bewertungen zu vergleichen. Tiere mit einem Wert oberhalb des höheren Medians gehören in der neuen Einteilung zu der einen Gruppe („Werte hoch“), Tiere mit einem Wert niedriger als dem niedrigen Median zur anderen Gruppe („Werte niedrig“). Tiere mit Werten zwischen beiden Medianwerten wurden nicht berücksichtigt. Verglichen wurde die Anzahl der positiven und negativen zytologischen Untersuchungen (als Endergebnis der drei Untersucher). Für die Erythrozytenzahl wurde zum Beispiel eine Gruppe mit Werten oberhalb von 8,3 T/l (Median der Gruppe K) eingeteilt. Von allen Tieren in dieser Neugruppe („Erythrozytenzahl hoch“) wurden die zytologischen Untersuchungen mit denen von Tieren mit einer Erythrozytenzahl, die niedriger als 7,3 T/l (Median der Gruppe S; „Erythrozytenzahl niedrig“) war, verglichen. Dieser Vergleich wurde für die Parameter Erythrozytenzahl, Hämoglobingehalt und Hämatokrit durchgeführt und ist in Tabelle 3.8 zusammengefasst. 59 Zyto positiv negativ na Summe EryH 18 8 4 30 EryN 18 6 14 38 HämoglH HämoglN 23 26 9 9 9 12 41 47 HämatH 23 8 9 40 HämatN 30 7 10 47 Zyto= Zytologische Diagnose; na= nicht auswertbar; EryH= Tiere mit Erythrozyten >8,3 T/l; EryN= Tiere mit Erythrozyten < 7,3 T/l; HämoglH= Tiere mit Hämoglobin > 13,00 g/dl; HämoglN= Tiere mit Hämoglobin < 12,35 g/dl; HämatH= Tiere mit Hämatokrit > 38,30 %; HämatN= Tiere mit Hämatokrit < 36,75% Tabelle 3.8: Zahlen der zytologischen Bewertungen (als Endergebnis der 3 Untersucher) im Vergleich der Gruppen mit höheren und niedrigen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits. Der errechnete P-Wert zum Chi-Quadrat-Homogenitätstest war für die Erythrozytengruppen 0,0834, für die Hämoglobingruppen 0,9030 und für die Hämatokritgruppen 0,7852. Damit konnte bei den Tieren mit niedrigen Werten im roten Blutbild („anämisch“) kein höherer Anteil positiver zytologischer Diagnosen nachgewiesen werden. 3.2.6 Polymerase Kettenreaktion (PCR) Von Tier 47 aus der Gruppe S wurde die tiefgekühlte EDTA-Blutprobe mittels PCR untersucht. Diese Untersuchung ergab keine Sequenzen, die Ähnlichkeit mit bekanntem hämothrophen Mykoplasmen-Material zeigten, und wurde als negativ beurteilt. Von neun Tieren aus der Kontrollegruppe (K20, K35, K38, K45, K49, K51, K55, K56 und K58), von denen die drei Untersucher die Zytologie einheitlich als positiv beurteilt hatten, wurden die tiefgekühlten Blutproben mittels PCR untersucht. Der Vergleich der erhaltenen Sequenzen konnte im Rahmen dieser Arbeit noch nicht abgeschlossen werden und wird nicht bewertet. 60 4. DISKUSSION 4.1 Allgemeine Anmerkungen Die Beschreibung neuer hämotropher Mykoplasmen-Spezies (WILLI et al. 2005; TAGAWA et al. 2008) und die Veröffentlichung verschiedener Übersichtsartikel (TASKER u. LAPPIN 2002; SYKES 2003; MESSICK 2003, 2004; TASKER 2006; HOELZLE 2007; WILLI et al. 2007 b) und Fallberichte (PHILBEY et al. 2006; GUIMARAES et al. 2007 b; DE BUSSER et al. 2008) aus der letzten Zeit zeigen das aktuelle Interesse an diesen von Arthropoden übertragbaren Erregern in der Tiermedizin. In der Humanmedizin wird den von Arthropoden übertragbaren Krankheiten, darunter viele Zoonosen, immer größere Bedeutung zugeschrieben. Dies gilt umso mehr in der heutigen Zeit der Globalisierung und Klimaerwärmung (SCHOLTE et al. 2008). Obwohl beim Pferd in der wissenschaftlichen Literatur nicht beschrieben, wird sowohl von Pferdebesitzern als auch von Tierärzten die Eperythrozoonose beim Pferd diskutiert. Diese angenommene Kausalität zwischen Eperythrozoon (hämotrophen Mykoplasmen) und beobachteten klinischen Symptomen ist die Fragestellung dieser Arbeit. Mittels einer ausführlichen Literaturübersicht über hämotrophe Mykoplasmen-Infektionen bei verschiedenen Tierarten und eigenen epidemiologischen Untersuchungen am Pferd wurde diese Fragestellung erarbeitet. Die Infektion mit hämotrophen Mykoplasmen ist beim Schwein (SPLITTER 1950; NEIMARK et al. 2002 b), beim Schaf (NEITZ 1937; OVERAS 1969; NEIMARK et al. 2004), beim Rind (ADLER u. ELLENBOGEN 1934; NEIMARK et al. 2002 b), bei der Katze (CLARK 1942; FOLEY u. PEDERSEN 2001; NEIMARK et al. 2002 b; WILLI et al. 2006 b), beim Hund (TYZZER u. WEINMAN 1939; MESSICK et al. 2002) und bei der Maus (SCHILLING 1928; TYZZER u. WEINMAN 1939; NEIMARK et al. 2002 b, 2005) ausführlich beschrieben. Auch bei verschiedenen anderen Tierarten gab es Hinweise auf hämotrophe Mykoplasmen als Krankheitsverursacher (FRERICHS u. HOLBROOK 1971; EWERS 1971; PETERS et al. 1974; McLAUGHLIN et al. 1990; REAGAN et al. 1990; DILLBERGER et al. 1994; MESSICK et al. 2002; NEIMARK et al. 2002 a; STOFFREGEN et al. 2006). Bei immunkompetenten Tieren verlaufen die Infektionen häufig latent (MESSICK 2004; TASKER 2006; HOELZLE 2007). Ein akuter Anfall der Eperythrozoonose tritt bei immunschwachen oder splenektomierten Tieren auf. Das klassische Bild der akuten Eperythrozoonose geht mit Fieber, Anämie, Ikterus und Anorexie einher (NEITZ 1968; OVERAS 1969; MESSICK 2003, 2004; SYKES 2003; HOELZLE 2007). Diese Symptomkombination wurde bei keinem der in der vorliegenden Studie untersuchten Pferde (N=108) beobachtet. Von den verschiedenen gesuchten Einzelsymptomen (Tabelle 3.1) 61 wurden Asthenie, schlechter Fellzustand und Abmagerung relativ häufig gefunden. Blasse Schleimhäute und Hämoglobinurie wurden nicht beobachtet. Ikterus tritt bei anorektischen Pferden schnell auf (FEY 2006; GRABNER u. DIETZ 2006) und wurde nicht als Symptom zur Aufnahme in Gruppe S verwendet. Als deutlicher Hinweis auf das Vorliegen von Eperythrozoonose beim Schwein wird die sofortige Agglutination des Blutes bei Gefäßaustritt angesehen (HEINRITZI 1983; HEINRITZI et al. 1984). Bei der Blutentnahme wurde bei keinem der untersuchten Pferde eine solche Agglutination beobachtet. Die bei hämolytischen Anämien häufig zu beobachtende rötliche Verfärbung des Blutüberstandes (FEY 2006) wurde bei den Blutproben der untersuchten Pferde ebenfalls nicht festgestellt. Sowohl bei Schweinen, als auch bei Schafen, wurden massive metabolische Störungen im Zusammenhang mit der akuten Phase der Eperythrozoonose festgestellt. Es liegt eine metabole und respiratorische Blutazidose vor (SUTTON 1976; ILEMOBADE u. BLOTKAMP 1978 c; HEINRITZI et al. 1990 a, b). Akute und chronisch latente Infektionen führen beim Schwein zu einer kontinuierlichen Abnahme des Blutzuckerspiegels (HEINRITZI 1989; HEINRITZI et al. 1990 a). Blutgasanalyse und Blutglukose-Messung könnten zusätzliche Information geben, wurden bei den untersuchten Pferden aber nicht durchgeführt. LUI et al. (2008) stellten eine signifikant höhere Prävalenz von M. wenyonii bei jüngeren Rindern fest. In der vorliegenden Studie war das durchschnittliche Alter in Gruppe S (5,3 ± 4,3 Jahre) signifikant (P<0,001) niedriger als in Gruppe K (10,4 ± 6,5 Jahre). Die Einteilung der Gruppen erfolgte basierend auf Symptomen, die bei Eperythrozoonose bei verschiedenen Tierarten beschrieben wurden (OVERAS 1969; DADDOW 1979 a; BURROUGHS 1988; SMITH et al. 1990 a; MESSICK 2003, 2004), die aber nicht pathognomonisch für nur diese Erkrankung sind. Junge Tiere leiden häufiger unter banalen Infektionen und können dabei unspezifische Symptomatik vorweisen. Die PCR-Untersuchung eines zweijährigen Warmblüters, der durch Abmagerung und schlechten Fellzustand aufgefallen war, und von dem die zytologische Untersuchung von zwei Untersuchern als positiv beurteilt worden war, ergab keine Sequenzen mit Ähnlichkeit des genetisches Materials von bekannten Hämoplasmen und wurde als negativ eingestuft. Die Beurteilung der restlichen neun PCR-Proben, die einheitlich als positiv in der Zytologie bewertet und zur gentechnischen Untersuchung verarbeitet wurden, wurde im Rahmen dieser Studie nicht abgeschlossen. 4.2 Zytologie Bei der lichtmikroskopischen Diagnostik von hämotrophen Mykoplasmen im peripheren Blutausstrich wird über das regelmäßige Vorkommen von sowohl falsch positiven, als auch von falsch negativen Ergebnissen berichtet (OVERAS 1969; HENRY 1979; HEINRITZI 1990; TASKER u. LAPIN 2002; SYKES 2003). In einer Studie wurde sogar eine Sensitivität 62 von nur 11% errechnet (TASKER et al. 2003 a). Wegen dem Fehlen eines Pferd-spezifischen PCR-Tests, und um der in der Praxis genutzten Methodik beim Pferd zu folgen, wurden in der vorliegenden Studie zytologische Untersuchungen angewandt. Um die zytologische Diagnose zu validieren, wurden die Blutproben von drei unterschiedlichen Untersuchern blind mikroskopisch bewertet. Deutlich wurde, dass ein Untersucher mit nur 21 positiven und 51 nicht auswertbaren Ergebnissen anders bewertete als die beiden anderen Untersucher (jeweils 72 und 82 positive Diagnosen). In der statistischen Auswertung war dieser Unterschied signifikant (P<0,001). Aber auch die gesamte Übereinstimmung der drei Untersucher war sehr gering (Kappa-werte 0,0225; -0,0148). Artefakte können bei der Suche nach hämotrophen Mykoplasmen im peripheren Blutausstrich als Mikroorganismen angesprochen werden, was zu falsch positiven Ergebnissen führt (OVERAS 1969; HENRY 1979; HEINRITZI 1990; TASKER u. LAPIN 2002; SYKES 2003). Von einem Untersucher wurden die von Artefakten befallenen Ausstriche dokumentiert. Dieser Untersucher stellte in von Artefakten befallenen Ausstrichen deutlich häufiger verdächtige Strukturen fest als in Ausstrichen, die frei von Artefakten waren. In der Literatur wird zum mikroskopischen Nachweis von hämotrophen Mykoplasmen die Anwendung von Romanowsky-Typ Färbungen empfohlen (SYKES 2003; WILLI et al. 2007 b). In der vorliegenden Studie wurde dazu Diff-Quik® und Giemsa-Färbung verwendet. Einer der Untersucher beurteilte dabei Ausstriche, die mit Giemsa-Färbung angefertigt waren. Die beiden anderen Untersucher beurteilten mit Diff-Quik® angefertigte Ausstriche. Obwohl beide Färbungsmittel zur Romanowsky-Typen gehören, könnte die Anwendung dieser unterschiedlichen Färbungen die Ergebnisse beeinflusst haben. Während der Lagerung von EDTA-Blutproben kann es zur Lösung der hämotrophen Mykoplasmen von der Erythrozytenmembran kommen. Die Zahl der falsch negativen Bewertungen würde dadurch erhöht werden (HALL et al. 1988; ALLEMAN et al. 1999). Die Lagerung der in der vorliegenden Studie bearbeiteten Proben, die von zwei Untersuchern beurteilt wurden, lag zwischen 30 Minuten und 12 Stunden, bis Ausstriche angefertigt wurden. Zudem wurden EDTA-Blutproben am Tag nach der Entnahme per Post in ein externes Labor geschickt, wo eigene Ausstriche angefertigt wurden, um von dem dritten Untersucher beurteilt zu werden. Die Lagerungszeit betrug somit mehr als 36 Stunden. Diese mögliche Ursache von Bias hätte durch eine Standardisierung der Lagerzeit reduziert werden können. OVERAS (1969) beschrieb einen starken Einfluss der Außentemperatur auf die Nachweishäufigkeit in der mikroskopischen Untersuchung. Die Blutproben in der vorliegenden Studie wurden von August bis April entnommen. In diesem Zeitraum waren starke Schwankungen der Außentemperatur vorhanden und könnten die Ergebnisse beeinflusst haben. Neben diesen möglichen Gründen für eine Beeinflussung der Ergebnisse könnte auch die unterschiedliche Erfahrung der verschiedenen Untersucher eine Rolle gespielt haben. 63 Um die Sensitivität und Spezifizität der Untersuchungen zu erhöhen, hätte eine Färbung mit Akridinorange verwendet werden können (BOBADE u. NASH 1987). Ein FluoreszenzMikroskop stand den Untersuchern aber nicht zur Verfügung. Auch die elektronenmikroskopische Untersuchung hätte genauere Informationen geben können, stand aber auch nicht zur Verfügung. Um den Infektionsgrad der Erythrozyten in der zytologischen Untersuchung zu erfassen, wurden verschiedene Methoden beschrieben (NEITZ 1937; THURSTON 1953; LITTLEJOHNS 1960; OVERAS 1969; HEINRITZI et al. 1984; McLAUGHLIN et al. 1990). In der vorliegenden Studie wurde nicht versucht, die beobachteten verdächtigen Strukturen zu quantifizieren. Beim Schwein ist in der akuten Phase zwar eine enge Verbundenheit der mikroskopisch sichtbaren Bakteriämie und der Abfall der hämatologischen Werte beschrieben worden (HEINRITZI et al. 1984; BUGNOWSKI et al. 1989; HEINRITZI 1989). In der vorliegenden Studie wurde aber das typische Bild des akuten eperythrozoonotischen Anfalls nicht beobachtet. Bei chronischen Infektionen der Katze wurde keine Korrelation zwischen dem Nachweis von hämotrophen Mykoplasmen mittels PCR und hämatologischen Veränderungen festgestellt (TASKER et al. 2003 a; ISHAK et al. 2006; GUIMARAES et al. 2007 a; JUST u. PFISTER 2007; SYKES et al. 2007 a; WENGI et al. 2008). In der zytologischen Untersuchung waren 24 von 32 (75%) der untersuchten Blutausstrichen in der Gruppe S als Endbewertung positiv. In Gruppe K waren es 39 von 76 (51%). Verdächtige Strukturen wurden also häufiger auf Erythrozyten von symptomatischen Tieren beobachtet. Aus den drei Beurteilungen der Untersucher wurde eine endgültige Diagnose erstellt, wobei zwei oder drei gleiche Beurteilungen der Untersucher das Endergebnis ergaben. Kamen drei Untersucher zu drei unterschiedlichen Ergebnissen - was nur möglich war, wenn ein Untersucher eine Auswertung offenließ - wurde keine Diagnose gestellt. Hätte man nur die einheitlich positive Beurteilung aller drei Untersucher als positiv in der Endbewertung gelten lassen, wäre die Zahl der positiven Endergebnisse deutlich niedriger ausgefallen. In Gruppe S wären nur zwei Tiere als positiv eingestuft, in Gruppe K zehn Tiere. Obwohl Eperythrozoon tuomii als epithrombozytärer Parasit beim Rind beschrieben wurde (UILENBERG 1967; ZWART et al. 1970), sind in dieser Studie die Blutplättchen nicht auf solche Strukturen untersucht worden. In der aktuellen Literatur wird diese Infektion nicht beschrieben, und die Bedeutung beim Rind scheint sehr gering zu sein. 4.3 Hämatologie Entgegen der Erwartung, in Gruppe S mehr anämische Tiere anzutreffen, wurden bei symptomatischen Tieren bessere Werte im roten Blutbild festgestellt. Die Erythrozytenzahl (P<0,001), der Hämoglobinwert (P<0,05) und der Hämatokrit (P<0,05) waren in der Gruppe S signifikant höher. Lediglich höhere Werte von MCV (P<0,05) und MCH (P<0,05) in der Gruppe S könnten Hinweisen auf das Vorliegen von Anämien bei symptomatischen Tieren 64 geben. Ein erhöhter Wert von MCH wird beim Pferd bei intravasaler hämolytischer Anämie beobachtet. Ein erhöhter Wert von MCV (Makrozytose) gibt einen Hinweis auf regenerative Anämie. Dieser Wert ist aber wenig sensitiv. Die Erythrozytenvolumen-Verteilungbreite (RDW) ist ein Maß für Anisozytose und wäre sensitiver (FEY 2006), stand aber in der vorliegende Untersuchung nicht zur Verfügung. Bei mehreren Tieren aus beiden Gruppen wurden vereinzelt niedrige Werte der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits festgestellt. Tiere, bei denen alle Parameter deutlich unterhalb des Referenzbereiches lagen und auf Anämie hinwiesen, wurden nicht angetroffen. Bei nur wenigen Tieren wurden im Zusammenhang mit klinischen Symptomen leichte Anämien und positive Bewertungen der zytologischen Untersuchungen festgestellt. Leichte Anämien werden aber häufig als Begleitsymptom bei chronisch erkrankten Tieren angetroffen. Chronische Infektionen, Entzündungen, Neoplasien oder Organversagen sind mögliche Ursachen (CARLSON 2002). Die Leukozytenzahl war zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschiedlich (P>0,05). Sowohl leichte Leukopenie, als auch Leukozytose wurde bei einigen Pferden festgestellt. Beim Schwein wurde während der Fieberphase eines akuten eperythrozoonotischen Anfalls eine deutliche Leukozytose beobachtet (BUGNOWSKI et al. 1989). Bei den Pferden in der vorliegenden Untersuchung wurde keine erhöhte Körpertemperatur festgestellt. Aus den Blutproben wurde lediglich die Leukozytenzahl erfasst, ein Leukogram wurde nicht angefertigt. Neutrophilie beim Pferd wird häufig bei Aufregung, Stress und meist chronische Infektionen beobachtet. Häufige Ursachen einer Neutropenie beim Pferd sind akute Infektionen wie Salmonellose (MORRIS 2002 b). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der Zahl der Thrombozyten zwischen Gruppe S und K festgestellt (P>0,05). Viele Pferde beider Gruppen wiesen aber eine leichte Thrombozytopenie auf. Ein Pferd zeigte mit 18 G/L (Referenzbereich 100-300 G/L) einen sehr niedrigen Wert. Klinische Symptome einer Blutungsneigung und begleitende Anämien wurden aber nicht beobachtet. Ein Vergleich dieser Thrombozytenwerte mit dem einer Heparin-Blutprobe könnte die Diagnose einer Pseudothrombozytopenie sichern (HINCHCLIFF et al. 1993). Es ist davon auszugehen dass die niedrigen Thrombozytenzahlen bei diesen klinisch unauffälligen Pferden EDTA-bedingt sind. 4.4 Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits Eine deutliche Assoziation zwischen dem Abfall der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts, des Hämatokrits und der Bakteriämie wurde beim Schwein in der akuten Phase ausführlich beschrieben (HEINRITZI 1983, 1989). Bei chronisch infizierten Katzen konnte eine Korrelation zwischen positivem PCR und hämatologischen Veränderungen nicht festgestellt werden (TASKER et al. 2003 a; ISHAK et al. 2006; GUIMARAES et al. 2007 a; 65 JUST u. PFISTER 2007; SYKES et al. 2007 a; WENGI et al. 2008). In dieser Studie wurden keine Pferde mit Anzeichen einer akuten Phase der Eperythrozoonose angetroffen. Der Vergleich von Tieren mit niedrigen und hohen Werten der Erythrozyten, des Hämoglobins und des Hämatokrits ergab keinen signifikant höheren Anteil positiver zytologischer Bewertungen (P>0,05) bei den Tieren mit niedriger Werten („anämisch“). 4.5 Bewertung der Fragestellung In der in dieser Studie untersuchten Pferdepopulation wurden keine Tiere mit den klassischen Symptomen des akuten eperythrozoonotischen Anfalles entdeckt. Bei verschiedenen Pferden wurden Symptome einer chronischen Erkrankung wie Abmagerung und schlechter Fellzustand festgestellt, ohne dass an Hand der klinischen Untersuchung eine Diagnose erstellt werden konnte. Verdächtige Strukturen wurden häufiger bei Tiere mit solcher Symptomatik festgestellt als bei klinisch gesundem Tiere (Kontrollgruppe). Ein Vergleich beider Gruppen an Hand hämatologischer Parameter ergab aber keine relevanten Unterschiede. Es wurden keine Hinweise auf eine höhere Präsenz von Anämien bei den symptomatischen Pferden gefunden. Zudem konnte bei Tieren mit niedrigen Werten der Erythrozyten, des Hämoglobins und des Hämatokrits kein erhöhter Anteil positiver zytologischer Diagnosen nachgewiesen werden. In sowohl Gruppe S als auch in Gruppe K wurden häufig verdächtige Strukturen auf den Erythrozyten beobachtet. In der Literatur wird eine sehr schlechte Sensitivität und Spezifität der mikroskopischen Untersuchung zur Diagnose von hämotrophen Mykoplasmen beschrieben. Auch in der vorliegenden Studie zeigt sich diese Diagnostik wegen einer schlechten Reproduzierbarkeit als unzuverlässig. Nur in der akuten Phase der Infektion sind die Erreger in großen Zahlen einfach lichtmikroskopisch nachzuweisen. Ein akuter eperythrozoonotischer Anfall kann bei infizierten Tieren durch Splenektomie ausgelöst werden. Einen solchen Eingriff bei verdächtigen Pferden durchzuführen wäre ethisch bei dieser Tierart nicht vertretbar. Auch die Inokulation verdächtigen Blutes auf ein für diesen Zweck splenektomiertes Versuchspferd wäre aus dem gleichem Grund abzulehnen. Zum Nachweis von hämotrophen Mykoplasmen beim Pferd sollte EDTA-Blut von stark verdächtigen Tieren mittels spezifischen Primern (16S rRNA Gen) untersucht werden. Nur nach phylogenetischer Analyse der erhaltenen Sequenzen könnte auf diese Weise - in Anlehnung an die Neubeschreibung verschiedener hämotropher Mykoplasmen-Spezies bei anderen Tierarten - eine pferdspezifische neue hämotrophe Mykoplasmen-Spezies beschrieben und das Krankheitsbild weiter erforscht werden. Aus der Praxis wird häufig über eine deutliche Besserung der Symptomatik berichtet, nachdem eine Behandlung mit Tetrazyklinen bei Pferden erfolgt ist, bei denen die Vermutung einer Infektion mit hämotrophen Mykoplasmen vorliegt. Tetrazykline haben jedoch ein breites Wirkungsspektrum. Die beobachtete Besserung kann dann auch nicht als Beweis dafür gelten, dass es sich hier tatsächlich um eine Infektion mit hämotrophen 66 Mykoplasmen handelt. Antibiotische Therapien wurden aus diesem Grund im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen nicht durchgeführt. Zudem sind bei Tetrazyklinen mögliche letale Nebenwirkungen beim Pferd beschrieben (ANDERSON et al. 1971; WILKE et al. 2007). Dazu soll an dieser Stelle auf das (Haftungs-)Risiko des behandelnden Tierarztes bei der Verabreichung von Tetrazyklinen beim Pferd unter dieser Indikationsstellung hingewiesen werden. Auf Grund der in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse und der Erkenntnisse über hämotrophe Mykoplasmen bei verschiedenen Tierarten kann bei Pferden mit Symptomen einer chronisch unspezifischen Erkrankung, bei der in der zytologischen Untersuchung verdächtige Strukturen auf den Erythrozyten nachgewiesen wurden, nicht ohne weiteres von einer Infektion mit hämotrophen Mykoplasmen ausgegangen werden. Bei solchen Patienten sollten weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden. Erst wenn hämotrophe Mykoplasmen nach phylogenetischer Genanalyse beim Pferd beschrieben und ein spezifischer PCR-Test entwickelt wurde, kann die Diagnose dieser Erreger beim Pferd mit Sicherheit gestellt werden. Die eigenen Untersuchungsergebnisse lassen keinen Schluß über eine Kausalität zwischen zytologisch nachweisbaren eperythrozoon-ähnlichen Strukturen auf Pferdeerythrozyten und klinischen Symptomen zu. 67 5. ZUSAMMENFASSUNG Rutmer Niemendal (2009): Epidemiologische Untersuchungen zur Bedeutung und zum Vorkommen einer vermuteten Eperythrozoon-Infektion beim Pferd Hämotrophe Mykoplasmen (Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies) sind weitverbreite Bakterien, die die roten Blutzellen parasitieren. Es sind die Erreger der Haemobartonellose und Eperythrozoonose. Infektionen mit hämotrophen Mykoplasmen sind beim Schwein, beim Schaf, bei der Ziege, beim Rind, bei der Katze, beim Hund und bei der Maus ausführlich beschrieben. Auch bei verschiedenen anderen Tierarten gibt es Hinweise auf hämotrophe Mykoplasmen als Krankheitsverursacher. Diese Mikroorganismen, auch Hämoplasmen genannt, sind sehr kleine (0,3 bis 3 μm), pleomorphe Bakterien ohne Zellwand oder Flagellen, welche resistent gegen Penicillin, aber empfänglich für Tetrazyklin sind. Bis vor wenigen Jahren wurden die Haemobartonella und Eperythrozoon Spezies den Rickettsien zugeordnet. Basierend auf der Analyse des 16S rRNA Gens wurden die Spezies neu zu den Mykoplasmen eingeteilt. Eine Infektion verläuft im immunkompetenten Tier häufig latent und wird als Faktorenkrankheit angesehen. Ein akuter Anfall tritt typischerweise nur bei immungeschwächten Tieren auf und kann durch Splenektomie hervorgerufen werden. Das Hauptsymptom ist dabei eine hämolytische Anämie. Bei chronischen Infektionen werden viele unspezifische Symptome wie Schwäche, Gewichtsverlust, schlechter Fellzustand, leichte Anämie und bei Nutztieren ein Abfall der zootechnischen Leistungen beobachtet. Infizierte Tiere leiden häufig unter Mischinfektionen mit sowohl anderen hämotrophen Mykoplasmen-Spezies, als auch anderen Pathogenen. In der akuten Phase sind die Erreger in großer Zahl als eperythrozytäre Strukturen im peripheren Blutausstrich lichtmikroskopisch nachweisbar. In der Regel kann eine Diagnose an Hand der klinischen Symptome und eines Blutausstriches nur während eines akut verlaufenden Krankheitsprozesses gestellt werden. Außerhalb dieser akuten Phase kann eine Infektion mittels direktem Erregernachweis durch PCR oder indirektem Erregernachweis durch Serologie festgestellt werden. Der Goldstandard zur Diagnose chronisch latenter Infektionen ist der mikroskopische Nachweis einer Bakteriämie nach Splenektomie verdächtiger Tiere oder nach Übertragung einer verdächtigen Blutprobe auf bereits splenektomierte Versuchstiere. Hämotrophe Mykoplasmen wurden bisher nicht in vitro kultiviert. In der wissenschaftlichen Literatur sind keine Publikationen über die systematische Untersuchung zum Vorkommen von hämothrophen Mykoplasmen beim Pferd zu finden. Lediglich eine Veröffentlichung aus dem Jahr 1978 beschreibt die Haemobartonellose beim Pferd in Afrika. Ein anderer Autor beschreibt in zwei Fallberichten aus jüngerer Zeit ein 68 chronisches Erschöpfungssyndrom beim Pferd und weist auf eine Besserung der klinischen Symptomatik und ein Verschwinden der anfangs beobachteten eperythrozytären Strukturen nach Behandlung hin. Seit einigen Jahren kommt es aber immer häufiger zu Berichten aus der Praxis über Diagnose und Behandlung einer vermuteten Eperythrozoonose bei Pferden. Laut Praxisberichten erfolgt der Nachweis dieser Parasiten beim Pferd an Hand einer lichtmikroskopischen Untersuchung eines Blutausstriches. In der vorliegende Studie wurden 108 Pferde, teils mit Symptomen einer vermuteten Eperythrozoonose (N=32; Gruppe S), untersucht. Die restlichen gesunden Pferde bildeten die Kontrollgruppe (Gruppe K). Neben der Erhebung des Vorberichtes und einer allgemein klinischen Untersuchung zur Erfassung der vorliegenden Symptomatik wurden von jedem Probanden eine Hämatologie und ein peripherer Blutausstrich angefertigt. Der Ausstrich wurde blind von drei Untersuchern auf die Anwesenheit von hämotrophen Mykoplasmenähnlichen Strukturen beurteilt. Um eine mögliche Assoziation zwischen Anämie einerseits und positivem zytologischen Status anderseits zu untersuchen, wurden Pferde mit höheren und niedrigen Werten im roten Blutbild an Hand der zytologischen Diagnose verglichen. In der in dieser Studie untersuchten Pferdepopulation wurden keine Tiere mit den klassischen Symptomen des akuten eperythrozoonotischen Anfalles entdeckt. Bei verschiedenen Pferden wurden Symptome einer chronischen Erkrankung wie Abmagerung, Asthenie und schlechter Fellzustand festgestellt. Sowohl bei symptomatischen Pferden als auch bei Kontrolltieren wurden häufig verdächtige Strukturen auf den Erythrozyten beobachtet. In der Literatur wird eine sehr schlechte Sensitivität und Spezifizität der lichtmikroskopischen Untersuchung zur Diagnose von hämotrophen Mykoplasmen beschrieben, wobei u.a. das Ansprechen von Artefakten als die gesuchten Strukturen die Zahl der falsch positiven Ergebnissen deutlich erhöhen kann. In der vorliegenden Studie beurteilte ein Untersucher mit nur 21 positiven Diagnosen signifikant (P<0,001) anders als die beiden anderen Untersucher (jeweils 72 und 82 positive Diagnosen). Auch die gesamte Übereinstimmung der drei Untersucher war sehr gering (Kappa-Werte 0,0225 und -0,0148). Des Weiteren wurden in von Artefakten befallenen Ausstrichen häufiger verdächtige Strukturen festgestellt als in Ausstrichen, die frei von Artefakten waren. Verdächtige Strukturen wurden häufiger bei Tieren mit Symptomatik festgestellt als bei klinisch gesunden Tieren (Kontrollgruppe). Ein Vergleich beider Gruppen S und K an Hand hämatologischer Parameter ergab aber keine relevanten Unterschiede. Es wurden keine Hinweise auf eine höhere Präsenz von Anämien bei den symptomatischen Pferden gefunden. Die Erythrozytenzahl (P<0,001), der Hämoglobinwert (P<0,05) und der Hämatokrit (P<0,05) waren sogar in der Gruppe S signifikant höher. Eine Neueinteilung der untersuchten Pferde wurde an Hand von höheren und niedrigen Werten im roten Blutbild durchgeführt. Die zytologischen Diagnosen beider Gruppen wurden 69 verglichen. Dabei war kein signifikant höherer Anteil positiver zytologischer Bewertungen (P>0,05) bei den Tieren mit niedrigen Werten („anämische Pferde“) festzustellen. Von zehn Tieren mit einer zytologisch positiven Diagnose wurden die tiefgekühlten Blutproben mittels PCR untersucht. Von neun dieser Proben konnte der Vergleich der erhaltenen Sequenzen im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen und bewertet werden. Eine Probe war negativ. Auf Grund der Erkenntnisse über hämotrophe Mykoplasmen bei verschiedenen Tierarten und der in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse kann bei Pferden mit Symptomen einer chronisch unspezifischen Erkrankung, bei der in der zytologischen Untersuchung verdächtige Strukturen auf den Erythrozyten nachgewiesen wurden, nicht ohne weiteres von einer Infektion mit hämotrophen Mykoplasmen ausgegangen werden. Bei solchen Patienten sollten weiterführende Untersuchungen durchgeführt werden. Erst wenn hämotrophe Mykoplasmen nach phylogenetischer Genanalyse beim Pferd beschrieben und ein spezifische PCR-Test entwickelt wurde, kann die Diagnose einer Infektion mit diesem Erreger beim Pferd mit Sicherheit gestellt werden. Die eigenen Untersuchungsergebnisse lassen keinen Schluß über eine Kausalität zwischen zytologisch nachweisbaren eperythrozoon-ähnlichen Strukturen auf Pferdeerythrozyten und klinischen Symptomen zu. 70 6. SUMMARY Rutmer Niemendal (2009): Epidemiological studies on the importance and existence of assumed Eperythrozoon-infections in horses Hemotrophic mycoplasmas (Haemobartonella and Eperythrozoon species) are widely spread bacteria parasiting red blood cells. The disease is known as haemobartonellosis and eperythrozoonosis. Infections with hemotrophic mycoplasmas are described in detail in pigs, sheep, goats, cattle, cats and dogs. Also in different other species there is evidence hemotrophic mycoplasmas could cause disease. These micro-organisms, also called hemoplasmas, are very small (0.3 to 3 μm), pleomorphic bacteria that lack a cell wall and flagella. They are susceptible to tetracyclines, but not to penicillins. Until recently Haemobartonella and Eperythrozoon species were classified as rickettsia. Based on 16S rRNA gen analysis these species have been reclassified as mycoplasmas. Infection in immunocompetent animals frequently is latent and considered to be a multifactorial disease. Typically acute disease is seen in immunosuppressed animals and can be provoked by splenectomy. The most important symptom in acute disease is hemolytic anemia. Clinical signs of disease in chronic infections are not specific including weakness, weight loss, poor hair coat, slight anemia and, in live stock, decreased production. Commonly concurrent infection with other hemotrophic mycoplasma species or other pathogens is seen. In acute disease great numbers of organisms can be observed as structures on the red blood cells in peripheral blood smears by light microscopic examination. Only in this acute stage the diagnosis can be made from the clinical signs and a blood smear. After the acute stage of disease infection can be diagnosed by direct detection by PCR or indirect detection by blood titers. The gold standard for diagnosing chronic latent infections is the microscopic detection of bacteriemia after splenectomy of a suspected animal or after the inoculation of suspected blood in a splenectomised laboratory animal. Hemotrophic mycoplasmas have not been grown in culture successfully. In the scientific literature no publications are found dealing with systemic research considering the existence of hemotrophic mycoplasmas in horses. Only one publication dating as far back as 1978 describes haemobartonellosis in horses in Africa. In two case reports another author recently describes the chronic fatigue syndrome in the horse, highlighting the resolving of clinical signs with the disappearance of the observed structures on the red blood cells after treatment. Since several years diagnosis and treatment of suspected eperythrozoonosis in horses are reported from the field. Accordingly to those reports detection of the parasite is done by microscopic examination of peripheral blood smears. 71 In this study 108 horses were examined, partially with symptoms of suspected eperythrozoonosis (n=32; group S). The other healthy horses composed a control group (group K). After taking the anamnesis and performing a clinical examination to detect present symptoms peripheral blood was collected from every proband to run a hematology and prepare a blood smear. The blood smear was blindly evaluated by three examiners for the detection of hemotrophic mycoplasma-like structures. To evaluate a possible association between anemia and positive cytological status the cytological diagnosis of horses with high and low values in the erythron were compared. In the population of horses examined in this study no animals were seen showing the classical signs of acute eperythrozoonotic disease. In several horses signs of chronic disease like cachexia, asthenia, and poor hair coat were observed. As well in symptomatic horses as in control animals suspected structures were observed regularly on the red blood cells. In the literature poor sensitivity and specificity are described for the light microscopic examination diagnosing hemotrophic mycoplasmas. Among other things the identification of artefacts as the structures looked for can markedly raise the amount of false positive results. In this study the assessment of one examiner with only 21 positive diagnoses was significantly (p<0.001) different than the two other examiners (each 72 and 82 positive diagnoses). Also the total correspondence of the three examiners was very low (kappa values of 0.0225 and -0.0148). Furthermore more suspected structures were observed in blood smears with artefacts than in blood smears without artefacts. Suspected structures were observed more often in animals showing symptoms than in clinically healthy animals (control group). Comparing the hematological parameter of both groups S and K did not show any relevant differences. No evidence was found confirming higher incidence of anemia in symptomatic horses. In group S the erythrocyte count (p<0.001), the hemoglobin value (p<0.05) and the packed cell value (p<0.05) were significantly higher. A new distribution of the horses examined was performed according to higher and lower values in the erythron. The cytological diagnoses of both groups were compared. No evidence was found confirming significantly (p>0.05) more positive diagnoses in animals with lower values (“anemic horses”). Frozen blood samples of 10 horses with positive cytological diagnosis were examined by PCR assay. During the course of this study the comparison of nine obtained sequences could not be finished and evaluated. One sample was negative. According to the knowledge about hemotrophic mycoplasmas in different species and the obtained results from this study an infection with hemotrophis mycoplasmas in horses showing signs of chronic non-specific disease, where suspected structures in the blood smear are observed, cannot be assumed just so. In such patients further examinations are required. 72 Only after the demonstration of hemotrophic mycoplasmas in the horse following phylogenetic analysis and the development of a specific PCR assay, an accurate diagnosis of infection with this pathogen can be made in the horse. The results of this study do not allow for the assumption of any causalitiy between eperythrozoon-like structures on horse erythrocytes and any clinical symptoms. 73 7. 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Diergeneesk. 95, 129-137 112 8. ANHANG 8.1 Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius AIDS acquired immune deficiency syndrome DGGE denaturing gradient gel electrophoresis DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) DRP deutsches Reitpony EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alii ELISA enzyme linked immunosorbent assay FeLV feline leukemia virus FIV feline immunodeficiency virus fl Femtoliter (x10¯¹⁵ Liter) G Gauge g/dl Gramm pro Deziliter G/l Giga pro Liter (x10⁹ / Liter) IgM Immunglobulin M IgG Immunglobulin G kbp Kilo-Basenpare (1000 Basenpare) MCV mean corpuscular volume (Einzelvolumen der Erythrozyten) MCH mean corpuscular haemoglobin (Hämoglobingehalt des Einzelerythrozyten) MCHC mean corpuscular haemoglobin concentration (mittlere Hämoglobinkonzentration des Einzelerythrozyten) ml Milliliter mm Millimeter μm Mikrometer N oder n Zahl nm Nanometer Nr Nummer P Überschreitungswahrscheinlichkeit PCR polymerase chain reaction (Polymerase Kettenreaktion) 113 pCO2 CO2-Partialdruck pg Pikogramm (x10⁻¹² Gramm) PRRS porcine reproductive and respiratory syndrome P25 untere Quartile P75 obere Quartile RDW red blood cell distributionwidth (Erythrozytenvolumen-Verteilungsbreite) RNase ribonuclease (Ribonuklease) rRNA ribosomal ribonucleic acid (ribosomale Ribonukeinsäure) S Standardabweichung T/l Tera pro Liter (x10¹² / Liter) 8.2 Herkunftsnachweis der verwendeten Materialien Fa. Abbott GmbH&Co. KG, Wiesbaden Abbott Cell-Dyn 3500 Hämatologie-Analysegerät Fa. Greiner bio-one, Solingen Vacuette® 4 ml EDTA Blutrörchen Fa. Henke Sass Wolf, Tuttlingen Einmalspritzen 10 ml Fa. Medion Diagnostics, Düdingen, Schweiz Diff-Quik® Fa. Menzel, Braunschweig Objektträger 76 x 26 mm Fa. Merck, Darmstadt Immersionsöl Fa. Milian, Genf, Schweiz Ansaugpipetten PA10E1 Fa. Olympus, Hamburg Olympus CH-2 Lichtmikroskop Fa. Terumo, Leuven, Belgien Luer Kanülen 18 G 114 8.3 Tabellarische Darstellung der Einzelergebnisse Nummer Geschlecht Rasse Alter (Jahre) Symptome S1 Hengst Araber 8 Asthenie, Abmagerung S2 Wallach Warmblut 12 Asthenie S8 Hengst Warmblut 0,5 Asthenie, schlechter Fellzustand S9 Wallach Warmblut 4 Abmagerung S11 Hengst Haflinger 8 Abmagerung S12 Hengst Haflinger 4 Abmagerung S13 Stute Araber 13 Abmagerung S17 Wallach Warmblut 6 Asthenie S19 Stute Warmblut 8 Asthenie S23 Hengst Araber 1 Abmagerung S24 Wallach Warmblut 5 Asthenie S25 Stute Warmblut 3 schlechter Fellzustand S28 Wallach Warmblut 6 Abmagerung S37 Stute Warmblut 4 Abmagerung S39 Stute Warmblut 9 Asthenie, Abmagerung S40 Wallach Warmblut 3 Asthenie S41 Wallach Warmblut 3 Asthenie S42 Hengst Warmblut 2 Abmagerung, schlechter Fellzustand S44 Hengst Warmblut 1 Asthenie S45 Stute Warmblut 3 perifere Ödeme, Steifheit S50 Wallach Warmblut 7 Leistungsschwäche S51 Wallach Warmblut 4 Leistungsschwäche S52 Wallach Warmblut 21 perifere Ödeme, Steifheit, Anorexie S46 Wallach Araber 3 Abmagerung, perifere Ödeme S47 Hengst Warmblut 2 Abmagerung, schlechter Fellzustand S48 Wallach Warmblut 2 Abmagerung, schlechter Fellzustand S49 Hengst Warmblut 2 Abmagerung, schlechter Fellzustand S53 Hengst Warmblut 2 Abmagerung S54 Hengst Warmblut 2 Asthenie S55 Wallach Warmblut 3 Asthenie S56 Wallach Warmblut 9 Leistungsschwäche S57 Wallach Warmblut 9 Asthenie Tabelle 8.1: Nummer, Geschlecht, Rasse, Alter und Symptome der Tiere in Gruppe S 115 Nummer Rasse Alter (Jahre) Geschlecht Nummer Rasse KS7 Warmblut KS27 Warmblut KS35 Warmblut KS38 Warmblut K1 Warmblut K2 Warmblut K3 Warmblut 5 Stute K4 Warmblut 14 Wallach K5 Warmblut 3 Wallach K6 Warmblut 3 K7 Warmblut K8 Welsh K9 Warmblut K10 Warmblut Alter (Jahre) Geschlecht 7 Stute K37 Warmblut 12 Wallach 6 Wallach K38 Warmblut 4 Wallach 12 Wallach K39 Warmblut 18 Stute 0,6 Stute K40 Warmblut 28 Wallach 10 Hengst K41 Warmblut 18 Stute 3 Hengst K42 Warmblut 4 Wallach K43 Warmblut 13 Wallach K44 Warmblut 1 Stute K45 Warmblut 1 Hengst Hengst K46 Warmblut 17 Stute 3 Hengst K47 Shetland 17 Wallach 19 Hengst K48 Warmblut 12 Wallach 3 Hengst K49 Warmblut 4 Wallach 21 Stute K50 DRP 4 Wallach K11 Warmblut 1 Hengst K51 Warmblut 12 Wallach K12 Warmblut 9 Wallach K52 Warmblut 10 Stute K13 DRP 5 Stute K53 Warmblut 5 Wallach K14 Warmblut 8 Wallach K54 Warmblut 6 Stute K15 DRP 17 Stute K55 Warmblut 15 Wallach K16 Warmblut 2 Hengst K56 Warmblut 12 Wallach K17 DRP 21 Hengst K57 Warmblut 19 Wallach K18 Warmblut 5 Wallach K58 Warmblut 21 Stute K19 Warmblut 7 Wallach K59 Warmblut 12 Wallach K20 DRP 18 Stute K60 Warmblut 5 Wallach K21 Araber 20 Hengst K61 Warmblut 14 Stute K22 Araber 13 Hengst K62 DRP 18 Wallach K23 Araber 5 Wallach K63 Warmblut 12 Wallach K24 Araber 5 Stute K64 DRP 12 Stute K25 Araber 9 Wallach K65 Warmblut 11 Wallach K26 Araber 15 Hengst K66 DRP 30 Wallach K27 Araber 15 Hengst K67 DRP 11 Wallach K28 Araber 8 Stute K68 DRP 19 Wallach K29 Araber 8 Stute K69 Warmblut 15 Wallach K30 Araber 7 Stute K70 Warmblut 10 Stute K31 Warmblut 10 Stute K71 Warmblut 16 Wallach K32 Warmblut 5 Stute K72 Warmblut 6 Wallach K33 Warmblut 5 Wallach K34 Warmblut 5 Stute K35 Warmblut 6 Stute K36 Warmblut 10 Stute Tabelle 8.2: Nummer, Rasse, Alter und Geschlecht der Tiere in Gruppe K 116 Nummer U2 U1 U3 Endergebnis 1 pos pos neg pos 2 pos pos neg pos 8 pos pos neg pos 9 pos neg pos pos 11 pos pos neg pos 12 pos pos pos pos pos pos pos 13 17 neg neg na neg 19 neg neg neg neg 23 pos pos na pos 24 neg pos na 25 pos pos neg 28 neg pos na 37 pos pos na pos 39 pos pos na pos 40 pos pos na pos 41 pos pos na pos 42 pos pos na pos 44 pos pos na pos 45 neg pos neg neg 50 pos neg neg neg 51 neg pos pos pos 52 pos pos neg pos 46 pos pos pos pos 47 neg pos pos pos 48 neg pos pos pos 49 neg pos neg neg 53 pos neg neg neg 54 pos pos na pos 55 pos pos na pos 56 57 pos pos pos pos na neg pos pos (U#=Untersucher; pos=positiv; neg=negativ; na=nicht auswertbar) Tabelle 8.3: Zytologische Beurteilungen in Gruppe S pos 117 Nummer U2 U1 U3 Endergebnis Nummer U2 U1 U3 Endergebnis KS7 pos pos pos pos K35 pos pos pos pos KS27 pos pos neg pos K36 pos pos neg pos KS35 neg neg neg neg K37 pos neg na KS38 neg pos neg neg K38 pos pos pos pos K1 neg neg neg neg K39 neg pos pos pos K2 pos pos na pos K40 neg pos na K3 pos neg neg neg K41 neg pos na neg K4 pos neg neg K5 pos neg na K6 neg neg pos K7 pos neg na K8 neg neg neg neg K46 pos pos na pos K9 neg pos neg neg K47 pos pos na pos K10 pos neg na K48 pos pos na pos K11 pos neg na K49 pos pos pos pos K50 pos pos na pos K51 pos pos pos pos K52 pos pos na pos K53 pos pos neg pos neg pos K42 pos pos na pos K43 neg neg neg neg K44 pos pos neg pos K45 pos pos pos pos K12 pos pos neg K13 pos neg na K14 pos neg neg K15 pos neg na K16 pos pos na pos K54 pos pos na pos K17 pos pos neg pos K55 pos pos pos pos K18 pos neg neg neg K56 pos pos pos pos K19 pos pos na pos K57 pos pos na pos neg K20 pos pos pos pos K58 pos pos pos pos K21 pos pos na pos K59 pos pos na pos K22 neg neg neg neg K60 neg pos na K23 pos pos neg pos K61 neg pos na K24 pos neg pos pos K62 neg pos na K25 pos neg pos pos K63 neg pos na K26 neg pos na K64 neg pos na K27 pos pos na pos K65 neg pos na K28 pos pos neg pos K66 neg neg neg K29 pos pos na pos K67 neg pos na K30 pos pos neg pos K68 neg pos na K31 pos pos na pos K69 neg pos na K32 pos neg neg neg K70 neg pos neg K33 pos pos na pos K71 neg pos na K34 neg pos neg neg K72 neg pos na (U#=Untersucher; pos=positiv; neg=negativ; na=nicht auswertbar) Tabelle 8.4: Zytologische Beurteilungen in Gruppe K neg neg 118 Messwert N Mittelwert S Zentralwert Minimum Maximum P25 P75 Leukozyten 32 6,703125 1,6830242 6,4 4,1 10,9 5,3 7,55 Erythrozyten 32 8,45 1,2186719 8,3 6,2 10,8 7,6 9,1 Hämoglobin 32 13,3875 1,8754354 13 10,6 18,3 12,1 14,35 Hämatokrit 32 39,425 5,4307369 38,3 31,6 55,6 35,6 41,15 MCH 32 15,903125 1,2369276 15,95 13,2 18,2 15,25 16,7 MCHC 32 33,915625 0,67638 34 32,5 35,4 33,5 34,3 MCV 32 46,890625 3,648098 46,7 40,2 53,5 44,9 49,05 Thrombozyten 32 137,684375 65,466244 119 43,1 356 95,45 149 Alter 32 5,296875 4,3307963 4 0,5 21 2 8 Tabelle 8.5: Verteilung der Messwerte in Gruppe S Messwert N Mittelwert S Zentralwert Minimum Maximum P25 P75 Leukozyten 76 6,5565789 1,8162478 6,15 4 14,1 5,4 7,4 Erythrozyten 76 7,4605263 0,9306742 7,3 5,3 10,1 6,7 8,15 Hämoglobin 76 12,503947 1,4650088 12,35 9,6 16,1 11,35 13,45 Hämatokrit 76 37,122368 4,1252911 36,75 28,5 47,2 34,15 40,25 MCH 76 16,839474 1,3868025 16,8 12,7 20,7 16 17,8 MCHC 76 33,682895 1,0961007 33,75 30 37,7 33 34,4 MCV 76 50,018421 4,0886415 49,4 41,7 61 47,45 52,7 Thrombozyten 76 115,175 43,400252 114 18 247 89,8 133,5 Alter 76 10,428947 6,5098657 10 0,6 30 5 15 Tabelle 8.6: Verteilung der Messwerte in Gruppe K 119 Variabele Referenzbereich Wert Nr. Endergebnis Zytologie Variabele Referenzbereich Wert Nr. Endergebnis Zytologie Leuko 5,0-10,0 10,3 G/l KS38 negativ Hämatok 32,0-46,0 28,5 % K28 positiv Leuko 5,0-10,0 4,8 G/l K2 positiv Hämatok 32,0-46,0 31,2 % K48 positiv Leuko 5,0-10,0 4,7 G/l K4 negativ Hämatok 32,0-46,0 47 % S1 positiv Leuko 5,0-10,0 4,2 G/l K10 Hämatok 32,0-46,0 31,6 % S8 positiv Leuko 5,0-10,0 12,1 G/l K11 Hämatok 32,0-46,0 46,2 % S9 positiv Leuko 5,0-10,0 4,4 G/l K18 Hämatok 32,0-46,0 55,6 % S13 positiv Leuko 5,0-10,0 4,6 G/l K26 Hämatok 32,0-46,0 48,7 % S28 Leuko 5,0-10,0 4,5 G/l K27 positiv Hämatok 32,0-46,0 48,2 % S42 positiv Leuko 5,0-10,0 4,3 G/l K32 negativ Leuko 5,0-10,0 4,6 G/l K37 Leuko 5,0-10,0 4,6 G/l K48 Leuko 5,0-10,0 4 G/l Leuko 5,0-10,0 Leuko 5,0-10,0 Leuko 5,0-10,0 Leuko 5,0-10,0 negativ Hämatok 32,0-46,0 47,1 % S45 negativ MCH 13,0-19,0 12,7 pg KS38 negativ MCH 13,0-19,0 20,7 pg K20 positiv K63 MCH 13,0-19,0 20,1 pg K40 4,4 G/l K64 MCH 13,0-19,0 19,6 pg K58 14,1 G/l K68 MCH 13,0-19,0 19,1 pg K62 4,6 G/l K69 MCHC 31,0-36,0 30 g/dl KS38 negativ 4,4 G/l K71 MCHC 31,0-36,0 37,7 g/dl K56 positiv positiv positiv Leuko 5,0-10,0 10,3 G/l S1 positiv MCV 37,0-55,0 61 fl K20 positiv Leuko 5,0-10,0 4,1 G/l S17 negativ MCV 37,0-55,0 55,6 fl K39 positiv Leuko 5,0-10,0 4,8 G/l S19 negativ MCV 37,0-55,0 58,6 fl K40 Leuko 5,0-10,0 10,9 G/l S25 positiv MCV 37,0-55,0 59,3 fl K58 positiv Leuko 5,0-10,0 4,9 G/l S56 positiv MCV 37,0-55,0 55,3 fl K61 Ery 6,0-11,0 5,3 T/l K20 positiv MCV 37,0-55,0 58,6 fl K62 Ery 6,0-11,0 5,9 T/l K28 positiv MCV 37,0-55,0 59,1 fl K68 Ery 6,0-11,0 5,9 T/l K48 positiv Thromb 100,0-300,0 69,1 G/l KS27 positiv Hämogl 11,0-17,0 9,6 g/dl K11 Thromb 100,0-300,0 97,5 G/l KS35 negativ Hämogl 11,0-17,0 10,9 g/dl K12 positiv Thromb 100,0-300,0 78,6 G/l K2 positiv Hämogl 11,0-17,0 9,9 g/dl K16 positiv Thromb 100,0-300,0 94,6 G/l K5 Hämogl 11,0-17,0 9,9 g/dl K28 positiv Thromb 100,0-300,0 98,2 G/l K10 Hämogl 11,0-17,0 10,8 g/dl K44 positiv Thromb 100,0-300,0 77,7 G/l K14 negativ Hämogl 11,0-17,0 10,6 g/dl K45 positiv Thromb 100,0-300,0 61,1 G/l K18 negativ Hämogl 11,0-17,0 10,8 g/dl K47 positiv Thromb 100,0-300,0 18 G/l K20 positiv Hämogl 11,0-17,0 10,2 g/dl K48 positiv Thromb 100,0-300,0 73,5 G/l K23 positiv Hämogl 11,0-17,0 10,4 g/dl K50 positiv Thromb 100,0-300,0 65,4 G/l K26 Hämogl 11,0-17,0 10,6 g/dl S8 positiv Thromb 100,0-300,0 70,3 G/l K28 positiv Hämogl 11,0-17,0 18,3 g/dl S13 positiv Thromb 100,0-300,0 83,4 G/l K32 negativ Hämatok 32,0-46,0 47,1 % K1 negativ Thromb 100,0-300,0 47,9 G/l K35 positiv Hämatok 32,0-46,0 29,3 % K11 Thromb 100,0-300,0 42,6 G/l K37 Hämatok 32,0-46,0 31,4 % K12 positiv Thromb 100,0-300,0 76,8 G/l K41 Hämatok 32,0-46,0 29,1 % K16 positiv Thromb 100,0-300,0 91,6 G/l K46 positiv Hämatok 32,0-46,0 47,2 % K27 positiv Thromb 100,0-300,0 94,8 G/l K49 positiv Thromb 100,0-300,0 87,5 G/l K51 positiv 120 Variabele Referenzbereich Wert Nr. Endergebnis Zytologie Variabele Referenzbereich Wert Nr. Endergebnis Zytologie Thromb 100,0-300,0 93,4 G/l K52 positiv Thromb 100,0-300,0 87,4 G/l S17 negativ Thromb 100,0-300,0 92,6 G/l K54 positiv Thromb 100,0-300,0 83,8 G/l S24 Thromb 100,0-300,0 87,1 G/l K56 positiv Thromb 100,0-300,0 91,1 G/l S28 Thromb 100,0-300,0 57,8 G/l K58 positiv Thromb 100,0-300,0 91,9 G/l S40 positiv positiv Thromb 100,0-300,0 71,7 G/l K59 Thromb 100,0-300,0 95 G/l S41 positiv Thromb 100,0-300,0 27,5 G/l K60 Thromb 100,0-300,0 95,9 G/l S45 negativ Thromb 100,0-300,0 35,6 G/l K62 Thromb 100,0-300,0 80,3 G/l S52 positiv Thromb 100,0-300,0 88 G/l K64 Thromb 100,0-300,0 356 G/l S53 negativ Thromb 100,0-300,0 99,9 G/l K65 Thromb 100,0-300,0 72,4 G/l S56 positiv Thromb 100,0-300,0 91,7 G/l K70 Thromb 100,0-300,0 43,1 G/l S57 positiv Thromb 100,0-300,0 97,4 G/l K71 Thromb 100,0-300,0 87,4 G/l S17 negativ negativ (Leuko=Leukozyten; Ery=Erythrozyten; Hämogl=Hämoglobin; Hämatok=Hämatokrit; Thromb=Thrombozyten) Tabelle 8.7: Hämatologische Werte außerhalb des Referenzbereiches 121 8.4 Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1: Beschriebene Haemobartonella-Spezies und deren Wirte .................................................................. 3 Tabelle 2.2: Beschriebene Eperythrozoon-Spezies und deren Wirte ...................................................................... 3 Tabelle 2.3: Namen der hämotrophen Mykoplasmen nach neuer Einteilung in das Genus Mykoplasma und deren Wirte ....................................................................................................................................................................... 4 Tabelle 2.4: Infektionsgrad der Erythrozyten mit E. suis ...................................................................................... 13 Tabelle 2.5: Veröffentlichte Nachweishäufigkeiten von Hämoplasmenspezies-DNA mittels PCR bei Katzen nach Einzel- und Mischinfektionen ............................................................................................................................... 23 Tabelle 2.6: Publizierte hämatologische Referenzwerte des Pferdes .................................................................... 34 Tabelle 2.7: Mögliche Ursachen einer hämolytischen Anämie beim Pferd .......................................................... 36 Tabelle 3.1: Auflistung der möglichen Symptome von Tieren in Gruppe S ......................................................... 39 Tabelle 3.2: Klassifizierung der Kondition der Pferde.......................................................................................... 40 Tabelle 3.3: Hämatologische Messwerte und deren Referenzwerte wie vom synlab.vet Labor Hamburg angewendet ........................................................................................................................................................... 42 Tabelle 3.4: Zahl und Geschlecht der Pferde in Gruppe S und K ......................................................................... 44 Tabelle 3.5: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in beide Gruppen .............................................................. 53 Tabelle 3.6: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in der Gruppe S................................................................. 53 Tabelle 3.7: Zahlen der zytologischen Beurteilungen in der Gruppe K ................................................................ 53 Tabelle 3.8: Zahlen der zytologischen Bewertungen (als Endergebnis der 3 Untersucher) im Vergleich der Gruppen mit höheren und niedrigen Werten der Erythrozytenzahl, des Hämoglobingehalts und des Hämatokrits. .............................................................................................................................................................................. 59 Tabelle 8.1: Nummer, Geschlecht, Rasse, Alter und Symptome der Tiere in Gruppe S..................................... 114 Tabelle 8.2: Nummer, Rasse, Alter und Geschlecht der Tiere in Gruppe K ....................................................... 115 Tabelle 8.3: Zytologische Beurteilungen in Gruppe S ........................................................................................ 116 Tabelle 8.4: Zytologische Beurteilungen in Gruppe K ....................................................................................... 117 Tabelle 8.5: Verteilung der Messwerte in Gruppe S ........................................................................................... 118 Tabelle 8.6: Verteilung der Messwerte in Gruppe K .......................................................................................... 118 Tabelle 8.7: Hämatologische Werte außerhalb des Referenzbereiches ............................................................... 120 122 8.5 Abbildungsverzeichnis Abbildung 2.1: Taxonomische Leiter der hämotrophen Mykoplasmen .................................................................. 5 Abbildung 2.2: Elektronenmikroskopisches Bild eines von M. suis befallenen Erythrozyten des Schweines ....... 7 Abbildung 2.3: Fluoreszenz-Mikroskopisches Bild ................................................................................................ 8 Abbildung 2.4: Klassischer Verlauf der Bakteriämie, Erythrozytenzahl und Körpertemperatur beim infizierten, klinisch unauffälligen Schwein nach Splenektomie am Tag 1 .............................................................................. 16 Abbildung 3.1: Untersuchungsschema .................................................................................................................. 39 Abbildung 3.2: Kreisdiagramme mit Verteilung der Rassen in den Gruppen S und K ......................................... 44 Abbildung 3.3: Box-Plot-Darstellung des Alters .................................................................................................. 45 Abbildung 3.4: Beobachtete Symptome und positive zytologische Befunde in der Gruppe S ............................. 46 Abbildung 3.5: Zytologische Untersuchung negativ ............................................................................................. 47 Abbildung 3.6: Zytologische Untersuchung negativ ............................................................................................. 48 Abbildung 3.7: Zytologische Untersuchung positiv.............................................................................................. 49 Abbildung 3.8: Zytologische Untersuchung positiv.............................................................................................. 50 Abbildung 3.9: Howell-Jolly Körper .................................................................................................................... 51 Abbildung 3.10: Artefaktbildung .......................................................................................................................... 52 Abbildung 3.11: Von Untersucher 1 beobachtete Artefakte in den als zytologisch positiv und negativ beurteilten Abstrichen ............................................................................................................................................................. 54 Abbildung 3.12: Erythrozytenzahl der Gruppen S und K ..................................................................................... 55 Abbildung 3.13: Hämoglobingehalt der Gruppen S und K ................................................................................... 55 Abbildung 3.14: Hämatokritwert der Gruppen S und K ....................................................................................... 56 Abbildung 3.15: MCV der Gruppen S und K ....................................................................................................... 56 Abbildung 3.16: MCH der Gruppen S und K ....................................................................................................... 57 123 8.6 Curriculum Vitae Rutmer Niemendal, geboren am 16. März 1976 in Sneek (Niederlande), beendete dort 1994 das Gymnasium und studierte anschließend 2 Jahre Zootechnik an der landwirtschaftlichen Universität Wageningen (Niederlande). 1996 began er das Studium der Veterinärmedizin an der Universität Gent (Belgien). Nach sechs Jahren wurde das Studium mit der Diplomarbeit „Retrospektive Studien nach der Behandlung der Kornea-Ulkus beim Pferd“ abgeschlossen. Von Juli 2002 bis Juli 2006 hatte er eine Stelle als Assistenztierarzt in der tierärztlichen Klinik für Pferde und der Select Breeder Service (SBS) in Lüsche (Deutschland) inne. In der Zeit von 2003 bis 2004 machte er kurze Vertretungen in einer allgemeinen Tierarztpraxis in Leeuwarden (Niederlande). August 2006 began er die Promotion an der tierärztlichen Hochschule Hannover (Deutschland). Von August 2006 bis April 2007 arbeitete er als angestellter Tierarzt bei Dr. Ismer, Tierarztpraxis/Arabergestüt/Tierpark in Ströhen (Deutschland). Von Mai 2007 bis November 2008 war er Assistenztierarzt in der Pferdeklinik in Wachtberg (Deutschland). Seit Dezember 2008 arbeitet er als angestellter Tierarzt in der Tierarztpraxis in Merzenich (Deutschland) mit Schwerpunkt Pferdemedizin. 124 8.7 Dankwort Im Frühjahr 2006 entstand aus der Tätigkeit in der Pferdepraxis im Oldenburger Münsterland die Idee, die dort häufig erwähnte Eperythrozoonose beim Pferd im Rahmen einer Doktorarbeit zu untersuchen. Prof. Dr. med.vet. Thomas Blaha der Außenstelle für Epidemiologie in Bakum zeigte Interesse an der ihm vorgelegten Thematik und erklärte sich bereit, die wissenschaftliche Betreuung zu übernehmen. Es folgte eine Zeit sehr angenehmer Zusammenarbeit, in der Prof. Blaha mir stets mit gutem Rat zur Seite stand. Prof. Dr. med. vet. Karsten Feige willigte sofort ein, seitens der Klinik für Pferde als Zweitgutachter zu fungieren. Als Forscher der porcinen Eperythrozoonose unterstützte Dr. med.vet. Ludwig Hoelzle (Institut für Veterinärbakteriologie, Vetsuisse-Fakultät Universität Zürich) unsere Arbeit beim Pferd mit viel Enthusiasmus. Nicht nur viel Mikroskopie-Arbeit, sondern auch die Suche nach genetischem Material der Erreger sei erwähnt. Auch mit Dr. med.vet. Margit Winkler und ihren Mitarbeitern des Veterinärmedizinischen Analysenzentrums (synlab.vet Hamburg) kam bei der Bearbeitung und Auswertung der Blutproben eine produktive Zusammenarbeit zustande. Dr. med.vet. Karl Rohn (Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informationsverarbeitung) gewährleistete die benötigte Signifikanz. Die Illustration der Arbeit mit Aufnahmen der Ausstriche ermöglichte Dr. med. Sebastian Huss (Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Bonn). Dr. med.vet. Nils Ismer und seine Mitarbeiter Barbara Lehing, Tina Lange und Christopher Prigge waren sehr hilfsbereit bei der Probenentnahme und garantierten den nötigen Spaß bei der Arbeit. Um Ärger mit dem Rechner zu bekämpfen, war Corinna Kipke immer zur Stelle. Unterstützung aus Vechta lieferten Dres. med. vet. Beate und Dieter Mischok und Tochter stud. vet. med. Jasmin Mischok. Mehr als hundert Pferde wurden im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Von deren Besitzer kam immer Sympathie und Kooperation. Und ohne meine Tine wäre das alles sowieso nicht möglich gewesen. Allen ganz herzlichen Dank.
