3 Gen bei 48 Patienten mit einem Rippling Muscle Disease (RMD)
Werbung
Aus der Neurologischen Klinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. J.-P. Malin Mutationsanalyse im Caveolin- 3 Gen bei 48 Patienten mit einem Rippling Muscle Disease (RMD)-Phänotyp Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Nikola Popovic aus Gelsenkirchen 2005 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. M. Vorgerd Koreferent: PD Dr. rer. Nat. W. Schliebs Tag der Mündlichen Prüfung: 24.05.2005 INHALTSVERZEICHNIS 1 Verzeichnis der Abkürzungen 1 2 Einleitung 3 2.1 Caveolae 3 2.1.1 Morphologie 3 2.1.2 Biosynthese 4 2.1.3 Funktion 5 2.2 Caveolin-3 6 2.3 Rippling Muscle Disease 9 3 Fragestellung 12 4 Patienten, Material und Methoden 13 4.1 Patienten 13 4.2 Material und Methoden 15 4.2.1 Extraktion genomischer DNA aus EDTA-Blut 15 4.2.2 Polymerase-Ketten-Reaktion 16 4.2.3 Gelelektrophorese 18 4.2.4 DNA-Aufreinigung aus Agarosegel 19 4.2.5 Sequenzierreaktion 19 5 Ergebnisse 21 5.1 Heterozygote R26Q-Mutation in einer deutschen Familie mit autosomal-dominanter RMD 21 5.2 Homozygote A92T-Mutation bei einem italienischen Patienten 23 5.3 RMD-Patienten ohne Mutationsnachweis 23 5.4 Polymorphismen 25 6 Diskussion 27 7 Zusammenfassung 33 8 Literaturverzeichnis 34 1 Verzeichnis der Abkürzungen A Alanin Abb. Abbildung Bp Basenpaare Cav Caveolin CK Creatinkinase DGK Dystrophin-Glykoprotein-Komplex DNA Desoxyribonukleinsäure dATP Desoxyadenosidtriphosphat dCTP Desoxycytosidtriphosphat dGTP Desoxyguanosidtriphosphat dNTP Desoxynukleosidtriphosphat dTTP Desoxythymididtriphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EMG Elektromyographie GPI Glykosylphosphadityl-Inositol KDa Kilodalton LGMD Gliedergürteldystrophie nNOS neuronale Stickoxid-Synthase NO Stickoxid NOS Stickoxid-Synthase Pat. Patient PCR Polymerase-Kettenreaktion PIRC percussion induced rapid contraction Q Glutamin R Arginin RMD Rippling Muscle Disease RNA Ribonukleinsäure T Threonin T-Tubulus transversaler Tubulus UpM Umdrehungen pro Minute Tbl. Tabelle 1 TAE Tris-Acetate Tris Tris (-hydroxymethyl-) aminoethan TFBS Transkriptionsfaktorbindestellen U Unit (Einheit der Enzymaktivität) UV Ultraviolett 2 2 EINLEITUNG 2.1 Caveolae 2.1.1 Morphologie 1953 wurden erstmals Invaginationen in Epithelzellmembranen beschrieben, die als „plasmalemmal vesicles“ bezeichnet wurden (41). Yamada verwendete 1955 dafür erstmals den Begriff „Caveolae intracellulares“ und bezeichnete damit mit dem Äußeren der Zelle kommunizierende kleine Vesikel oder Höhlen in Gallenblasenepithel (67). Caveolen wurden ursprünglich rein morphologisch definiert als flaschenförmige Invaginationen der Plasmamembran mit einem Durchmesser von 60-80 nm, die bei den meisten Zellen vorkommen, besonders ausgeprägt aber bei Adipozyten, Endothel-zellen, Muskelzellen und Fibroblasten (65,56). Anderson definierte Caveolen nach biochemischen Gesichtspunkten als Membrandomänen, die in Triton X-100 schwer löslich sind, eine geringe Dichte aufweisen und reich sind an Glykosphingolipiden, Cholesterin und lipidgebundenen Membranproteinen. In nahezu allen Zellen lassen sich Membrandomänen mit diesen Eigenschaften nachweisen, nicht alle Zellen zeigen aber die typische Morphologie. Caveolen können in verschiedenen Formen vorkommen, sie können flach, tubulär oder vesikulär sein, der Grad der Invagination kann variieren, außerdem können sie einzeln oder gruppiert vorkommen (2). Struktureller Hauptbestandteil der Caveolenmembran sind Proteine der Caveolin-Familie, 21-24 kDa große Transmembranproteine (20,23,45). Es konnten bisher vier Isoformen nachgewiesen werden: Caveolin-1α bzw. Caveolin-1β und Caveolin-2 kommen hauptsächlich in Fettgewebe, Endothelzellen, Fibroblasten und Pneumozyten vor, während Caveolin-3 muskelspezifisch ist (45,51). Alle vier Isoformen sind strukturell homolog, unterscheiden sich aber in der jeweiligen Peptidsequenz. Caveolin1α bzw. Caveolin-1β bestehen aus 178 bzw. 147, Caveolin-2 aus 149 und Caveolin-3 aus 151 Aminosäuren. Alle weisen eine hydrophile N-terminale Domäne, eine hydrophobe Transmembrandomäne und eine wiederum hydrophile C-terminale Domäne auf und bilden eine Haarnadelschleife, so 3 daß sowohl N- wie auch C-Terminus dem Zytoplasma zugewandt sind (12,56). Die genaue Funktion der Proteine ist nicht geklärt, sie scheinen aber für die Differenzie-rung der Caveolen und T-Tubuli und als Interaktiospartner von verschiedenen Signal- und Strukturproteinen innerhalb dieser Membrandomänen essentiell zu sein. 2.1.2 Biosynthese Die Biosynthese von Caveolen ist ein mehrschrittiger Prozeß. Sie beginnt im Golgikomplex mit der Bildung von glykosphingolipid-, sphingomyelin-, und cholesterinreichen Membrandomänen. 14-16 Caveolinmonomere lagern sich im endoplasmatischen Retikulum zu höhermolekularen Oligomeren zusammen und bilden mit den neu synthetisierten Membrandomänen die Caveolenmembran, in die zusätzlich glykosylphosphaditylinositol-gebundene Proteine eingelagert werden. Die neugebildete Caveolenmembran wird zur Zelloberfläche transportiert und in die Zytoplasmamembran eingegliedert, wo sie eine spezielle Mikrodomäne bildet. Über Protein-Protein-Interaktionen werden schließlich weitere Proteine gebunden (2,36). Caveolin steuert entscheidend die Biogenese von Caveolen. Die Expression von Caveolin korreliert direkt mit dem entwicklungsbiologischen Auftreten der Caveolen. Die rekombinante Expression von Caveolin führt in vorher caveolin-negativen Zellen zu einer de-novo-Bildung von Caveolen (50,51,56). Die Interaktion von Caveolin und Cholesterin scheint an der Invagination der Caveolenmembran beteiligt zu sein, wobei Caveolin als cholesterinbindendes Protein wirkt. Die Entfernung von Cholesterin aus der Caveolenmembran durch Behandlung mit cholesterinbindenden Stoffen wie Nystatin oder Filipin führen zur Abflachung der Invagination oder zum vollständigen Verschwinden von Caveolen (2,28). 4 2.1.3 Funktion Caveolen wird eine Beteiligung an verschiedenen Zellfunktionen zugeschrieben, z.B. Internalisierung extrazellulärer Moleküle, deren Weiterleitung in bestimmte Zellkompartimente, Organisation von Signalmolekülen und Regulation von Signalwegen (28). Als Potozytose wird die rezeptorvermittelte Aufnahme von kleinen Molekülen und Ionen durch Caveolen bezeichnet (3). Die Rezeptoren sind über LipidLipid-Interaktionen mit Glykosylphosphadityl-Inositol (GPI) an die Oberfläche der Caveolenmembran gebunden und bilden Cluster von bis zu 700 Rezeptormolekülen. Dadurch wird eine starke Konzentration des aufzunehmenden Substrats innerhalb der Caveolen erreicht. Aus dem Extrazellulärraum werden Substratmoleküle an die Rezeptoren gebunden, die Caveole schließt sich und über einen Carrier werden die Substratmoleküle durch die Caveolenmembran ins Zytoplasma abgegeben (3,48). Neben Folsäure werden wahrscheinlich auch Moleküle wie z.B. Choleraoder Tetanustoxin über Potozytose in die Zelle aufgenommen (37). Potozytose unterscheidet sich von anderen endozytotischen Aufnahmemechanismen der Zelle durch den Einsatz GPI-gebundener Rezeptoren in der Caveolenmembran, um kleine Moleküle und Ionen innerhalb eines abgeschlossen Kompartiments zu konzentrieren und die Abgabe in das Zytoplasma zu erleichtern (9). Anderson unterscheidet vier verschiedene Wege der mittels Potozytose aufgenommenen Moleküle: Aufnahme ins Zytoplasma (z.B. 5-Methyltetrahydrofolat, Eisen, Kalzium), Transport ins endoplasmatische Retikulum (z.B. Cholesterin, Kalzium, Fettsäuren), transzellulärer Transport (z.B. Albumin) und Internalisierung und Speicherung von Molekülen innerhalb eines Vesikels im Zytoplasma (2). Caveolen wird zudem eine wichtige Rolle in der Kalzium-Homöostase von Muskelzellen bei der Kontraktion / Relaxation zugeschrieben. Untersuchungen zeigten eine ausgeprägte Anhäufung von Kalzium und Kalzium-Transportproteinen in der Caveolenmembran. Daher wird vermutet, daß Caveolen spezialisierte Membrandomänen sind, die den zellulären Kalziumstoffwechsel regulieren und kalziumabhängige Signalkaskaden modulieren (1,17,18,28,43). 5 Caveolen spielen bei der Kompartmentierung von Signalmolekülen eine wichtige Rolle, die eine effiziente Koppelung von Rezeptoren und verschiedenen Effektorsystemen ermöglicht (32). Es konnte gezeigt werden, daß innerhalb dieser speziellen Membraninvaginationen eine Interaktion von Caveolin mit einer Vielzahl verschiedener Signalmoleküle im Sinne einer Aktivitätshemmung erfolgt, z.B. Src-Tyrosinkinase, G-Proteine, Ras, Wachstumsfaktorrezeptoren, Proteinkinase C und NOS (10,22,30,31,40,50). Eine Beteiligung von Caveolen an der Biosynthese des transversalen Tubulussystems der Muskelzelle wurde aufgrund morphologischer Beobachtungen erstmals 1968 von Ishikawa vermutet. Demnach kommt es durch wiederholte Invagination einer Caveole („Caveolation“) zur Ausbildung eines transversalen Tubulus (27). Die Beteiligung von Caveolen an der Entwicklung von T-Tubuli wurde auch in anderen Untersuchungen beschrieben (15,16,39); dafür sprechen die Assoziation von Caveolin-3, der muskelspezifischen Isoform, mit transversalen Tubuli sowohl in Myoblasten als auch ausdifferenzierten Myozyten (42,44) und veränderte T-Tubuli im Caveolin-3 knockout-Mausmodell (45). 2.2 Caveolin-3 Caveolin-3 ist die muskelspezifische Isoform der Caveolin-Proteinfamilie (6,56,65). Es wird sowohl in quergestreifter und glatter Muskulatur als auch in Myokard exprimiert, kommt am Sarkolemm vor und assoziiert dort mit dem Dystrophin-Glykoprotein-Komplex (DGK), der als Bindeglied zwischen extrazellulärer Matrix und intrazellulärem Zytoskelett fungiert (51). Caveolin-3 interagiert direkt mit β-Dystroglykan, einem Bestandteil des DGK (siehe Abb. 1) (34,52). Ein weiterer Bindungspartner von Caveolin-3 ist nNOS, eine in der Skelettmuskulatur vorkommende Stickoxid-Synthase, die über den DGK mit der Muskelfasermembran assoziiert. nNOS scheint eine modulierende Funktion im Kontraktionsablauf von Muskelfasern zu haben und wird von Caveolin-3 direkt gehemmt (24,60). Die genaue Funktion von Caveolin-3 innerhalb des DGK ist bisher nicht bekannt. Ein intakter Komplex scheint allerdings wichtig 6 für die normale Funktion des Sarkolemms zu sein, da Defekte von Proteinen im DGK zu einer Muskeldystrophie führen können (52). Das Caveolin-3 kodierende Gen liegt auf dem Chromosom 3p25 (34). Bisher sind fünf verschiedene Erkrankungen der Skelettmuskulatur bekannt, die durch Mutationen dieses Gens hervorgerufen werden, sogenannte Caveolinopathien: 1) die autosomal-dominant vererbte Gliedergürteldystrophie 1C (LGMD1C), die klinisch durch Wadenhypertrophie, Muskelschwäche, Myalgien und Muskelkrämpfe und histologisch durch unspezifische myopathische bis hin zu dystrophen Gewebsveränderungen der Skelettmuskulatur manifest wird (26,36); 2) die isolierte HyperCKämie ohne weitere Symptome (8); 3) hereditäre Rippling Muscle Disease, eine autosomal-dominante Erkrankung mit Zeichen mechanischer Übererregbarkeit der Muskulatur (5); 4) die distale Myopathie (57) und 5) die isolierte hypertrophe Kardiomyopathie ohne Skelettmuskelbeteiligung und CK-Erhöhung (25). In allen Fällen kommt es durch Mutationen im Caveolin-3 Gen zu einer verminderten bis fehlenden Expression von Caveolin-3 am Sarkolemm. 7 Abbildung 1: schematische Darstellung einer Caveole und verschiedener an Caveolinopathien beteiligter Proteine, darunter Caveolin-3 als Hauptstrukturprotein der Caveole (aus Neurology 2001, 57; 2273-2277) 8 Promotorstellen (Promotoren) sind bestimmte Genregionen, die spezifisch die RNA-Polymerase binden und den Transkriptionsstart festlegen. Sie besitzen 5´-wärts vom ersten transkribierten Nukleotid kurze wiederkehrende Nukleotidsequenzen, sog. Consensus-Sequenzen, an die Transkriptionsfaktoren binden können. Transkriptionsfaktoren sind spezifische Proteine, die an der Initiierung und Regulation der Transkription beteiligt sind. Proteincodierende Eukaryontengene besitzen Promotorstellen mit einer TATAAA-Consensus-Sequenz (TATA-Box), oft auch eine CAAT-Box und eine GC-Box. Mutationen in diesen Consensus-Sequenzen können die Transkription beeinträchtigen und dadurch die Proteinexpression vermindern (55). Die Promotorsequenz des humanen Caveolin-3 Gens wurde erstmals von Biederer et al. charakterisiert (6). Demnach befindet sich die Transkriptionsstartstelle 81 Nucleotide vor dem Startcodon, die TATA-Box liegt weitere 34 Nucleotide 5´-wärts. Vier Transkriptionsfaktorbindestellen, mit dem Motiv CAXXTG, befinden sich wiederum 5´-wärts dieser TATA-Box. Mutationen innerhalb dieser Transkriptionsfaktorbindestellen führen zu einer signifikanten Abnahme der Promotoraktivität (7). Daraus läßt sich die Vermutung ableiten, daß möglicherweise auch bei Patienten mit einem RMD-Phänotyp ursächliche Mutationen im nicht codierenden Promotorbereich des Caveolin-3 Gens vorkommen, die über eine Verringerung der Genexpression zu einem Mangel an Caveolin-3 führen. 2.3 Rippling Muscle Disease (RMD) RMD ist eine autosomal-dominant erbliche Caveolinopathie und kann durch Mutationen im Caveolin-3 Gen auf dem kurzen Arm von Chromosom 3 (3p25) hervorgerufen werden (5,63). Sie wurde erstmals 1975 von Torbergsen in einer norwegischen Familie beschrieben (58). Der klinische Phänotyp wurde in der Folgezeit an weiteren deutschen und amerikanischen RMD-Familien genauer herausgearbeitet. Zu den Symptomen gehören belastungsabhängige Muskelschmerzen, 9 Muskelkrämpfe und schmerzhafte Muskelsteifigkeit in Ruhe oder bei Belastung. Bei vielen Patienten findet sich eine generalisierte oder lokal die Wadenmuskulatur betreffende Muskelhypertrophie. Paresen und Muskelatrophien kommen selten vor. Nach körperlicher Belastung kann es zur Myoglobinurie kommen. Laborchemisch findet sich meist eine CK-Erhöhung im Serum. Bei RMD-Patienten im Kindesalter kann, insbesondere nach längeren Ruhephasen, für einige Minuten ein passagerer Zehenspitzengang auftreten. Zu den für die Erkrankung charakteristischen Zeichen mechanischer Übererregbarkeit gehören durch Perkussion oder mechanischen Druck auslösbare rasche Muskelkontraktionen (Perkussion-/Pressure-Induced Rapid Muscle Contractions, PIRC), die nicht habituieren und einen deutlichen Bewegungseffekt erzeugen. PIRC sind von myotonen Reaktionen abzugrenzen. Diese verlaufen träger, dauern länger an und zeigen im EMG charakteristische myotone Serienentladungen, demgegenüber sind PIRC elektrisch stumm. Neben PIRC kann es nach Beklopfen der Muskulatur bei RMD zu lokaler Muskelwulstbildung (muscle mounding) kommen, wobei dies nicht spezifisch für diese Erkrankung ist, sondern auch bei anderen Myopathien auftritt. Bei einem Teil der Patienten kommt es spontan oder nach rascher Dehnung der Muskulatur zu wellenartig sich ausbreitenden Muskelkontraktionen (rippling muscle) (46,47,49,54,58,59,62). Untersuchungen deutscher RMD-Familien zufolge sind PIRC und muscle mounding diagnostisch sehr verläßliche klinischen Zeichen, die bei allen RMD-Patienten nachweisbar sind, während das rippling-Phänomen nur bei etwa 60% der Betroffenen auftritt (62). Zur Phänotypisierung von RMD wurden folgende Diagnostik-Kriterien herausgearbeitet: 1) PIRC in mindestens zwei Muskeln der oberen und unteren Extremitäten bei normalen Muskeldehnungsreflexen und Ausschluß myotoner Serien im EMG. 2) Mindestens eine der folgenden Auffälligkeiten: CK-Erhöhung im Serum, rippling muscle, muscle mounding. Sind bei einem Patienten diese Diagnostik-Kriterien erfüllt, liegt ein begründeter Verdacht auf RMD vor (62). 10 Differentialdiagnostisch sind bei Angabe schmerzhafter Muskelsteife und dem klinischen Nachweis von Zeichen erhöhter Muskelerregbarkeit und Muskelhypertrophie die hereditären Myotonie-Erkrankungen, z.B. Myotonia congenita, zu berücksichtigen. Bei diesen Erkrankungen zeigt das EMG myotone Serienentladungen, die bei RMD immer fehlen. Myalgien und CKErhöhung lassen auch an eine Muskeldystrophie oder Myositis denken. Bei der Abgrenzung zu RMD ist der Nachweis von PIRC wegweisend. Bei Belastungsintoleranz und CK-Erhöhung sind differentialdiagnostisch metabolische Myopathien zu berücksichtigen. Weitergehende Stoffwechseluntersuchungen sind hier bei der Abgrenzung hilfreich (47). Die Therapie der RMD ist symptomorientiert, eine kausale Behandlung bislang nicht möglich. Stehen belastungsabhängige Myalgien im Vordergrund, ist eine analgetische Therapie mit Nicht-Opioiden (z.B. Paracetamol, Metamizol, Diclofenac) oder bei Bedarf auch mit niederpotenten Opioiden (z.B. Tramadol, Tilidin mit Naloxon) indiziert. Bei funktionell beeinträchtigenden Symptomen wie schmerzhafter Muskelsteifigkeit oder Muskelkrämpfen können zunächst Magnesium in Kombination mit Chinin-Präparaten, Flupirtin oder Benzodiazepine zur Muskelrelaxation eingesetzt werden. Bei Beschwerdepersistenz ist auch die Gabe von Kalziumantagonisten (z.B. Verapamil, Dantrolen) empfehlenswert. Der klinische Verlauf und die Prognose von RMD ist in den meisten Fällen gutartig. Die Ausprägung der Symptome unter den RMD-Patienten und auch im intraindividuellen Krankheitsverlauf ist sehr unterschiedlich. Ein Teil der Patienten kann durch Myalgien, Muskelkrämpfe und Muskelsteifheit in der Leistungsfähigkeit deutlich eingeschränkt sein, andere dagegen werden dadurch nicht wesentlich beeinträchtigt.. Wenn neben den Symptomen der mechanischen Übererregbarkeit auch Paresen und Muskelatrophien auftreten, kann dies den Verlauf entscheidend beeinflussen und zur weiteren Leistungseinschränkung führen. 11 3 Fragestellung Ziel dieser Arbeit ist die Mutationsanalyse beider Exone und des Promotorbereichs des Caveolin-3 Gens bei 48 Patienten mit klinischen Zeichen einer Rippling-Muskelerkrankung (Rippling Muscle Disease). 12 4 Patienten, Material und Methoden 4.1 Patienten Die Mutationsanalyse im Caveolin-3 Gen wurde bei 48 Personen aus Deutschland, Italien, Norwegen, Griechenland und Japan durchgeführt. 28 Patienten wurden in der Neurologischen Universitätsklinik Bergmannsheil in Bochum ausführlich klinisch untersucht . Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Von den übrigen Patienten wurde von den betreuenden Kliniken genomische DNA zur Mutationsanalyse zur Verfügung gestellt. Eine genaue klinische Untersuchung dieser Patienten zur Charakterisierung des Phänotyps war nicht möglich. Alle Patienten gaben dazu ihr schriftliches Einverständnis. Tabelle 1: Phänotyp der untersuchten Patienten n.b. = nicht bestimmt, + = Symptom vorhanden, - = Symptom fehlt m = männlich, w = weiblich, CK = Kreatinkinase im Serum Patient Nr., Symptome Geschlecht, Alter (Jahre) Rippling Mounding PIRC CK (U/L) Normalwert 0-80 1, m, 59 Muskelschmerzen, Muskelkrämpfe + + + 160 2, m, 58 Muskelkrämpfe, Muskelermüdbarkeit - + + 360 3, m, 36 Schwäche der SchulterGürtelmuskulatur, Muskelschmerzen und Muskelverhärtung - + + 7000 4, w, 66 Muskelschmerzen, Krämpfe, Schwäche der Extremitätenmuskulatur + + + 440 5, m, 70 Krämpfe und Atrophie der Fußmuskulatur - - + n.b. 13 6, w, 63 Muskelschmerzen und Zuckungen der OberSchenkelmuskeln - - + 20 7, m, 41 Muskelschmerzen, Muskelsteifigkeit, Krämpfe - + + n.b. 8, m, 44 Muskelschmerzen, Krämpfe - - + 106 9, m, 42 Wadenkrämpfe, Wadenhypertrophie + + + 170 10, w, 54 Muskelschmerzen, Muskelsteifheit, Krämpfe - - + 908 11, m, 42 Muskelschmerzen, Muskelverhärtungen, Krämpfe - + + 7000 12, w, 46 Muskelschwäche - - - 171 13, w, 37 Muskelkrämpfe, Muskelschmerzen - + + n.b. 14, m, 25 Muskelschmerzen, Krämpfe, Muskelzucken, + + + 698 15, m, 21 Belastungsintoleranz, Muskelschwäche - + + 200 16, w, 35 Wadenkrämpfe, Schwäche der Wadenmuskulatur - + + 284 17, m, 59 Belastungsabhängige Schwäche der Beine - + + 200 18, w, 42 Schwäche der proximalen Extremitätenmuskulatur - - + Normal 19, m, 32 Muskelschmerzen, Muskelermüdbarkeit - - + 1124 20, m, 53 Muskelschmerzen - - + 121 21, m, 44 Muskelkrämpfe, Muskelschmerzen - - + 1326 22, m, 38 Ptosis, Scapula alata - - - 140 23, w, 49 Muskelschmerzen, Muskelverhärtung, Krämpfe - - + 419 24, m, 44 Keine neuromuskulären Beschwerden - - - 300 14 25, m, 14 Muskelsteifheit, Krämpfe, Muskelschmerzen + + + 8000 26, w, 37 Muskelschmerzen, Krämpfe + - + n.b. 27, m, 63 Muskelkrämpfe, Muskelschmerzen + - - Normal 28, m, 29 Muskelschmerzen, Schwäche, Muskelsteifheit + - + 1526 4.2 Material und Methoden 4.2.1 Extraktion genomischer DNA aus EDTA-Blut Die DNA-Extraktion aus EDTA-Blut wurde mit Hilfe des QIAamp® DNA Blood Mini Kit der Firma QIAGEN durchgeführt. Der erste Schritt bestand aus der Lyse der zellulären Bestandteile der Blutprobe. Dazu wurden zu 20 μl Qiagen-Protease und 200 μl Qiagen-ALPuffer 200 μl EDTA-Blut der Probe gegeben, 15 Sekunden gevortext und das Lysat 10 Minuten lang im Wasserbad bei 56°C inkubiert. Anschließend wurde zur Probe 200 μl 100% Ethanol zugegeben und 15 Sekunden gevortext. Im nächsten Schritt wurde das Lysat auf die QIAamp-Filtriersäule gegeben und mit 8000 UpM 1 Minute zentrifugiert. Dabei kam es durch die im Qiagen-AL-Puffer enthaltenen chaotropen Salze zur Adsorption der DNA an die Silica-Membran der Säule, während die übrigen Probenbestandteile nicht an die Säule banden und mit dem Filtrat verworfen wurden. Der dritte Schritt bestand im Auswaschen der noch auf der Membran befindlichen Verunreinigungen (z.B. Proteine, Lipide etc.). Dazu wurden zunächst 500 μl Qiagen-AW-1-Waschpuffer auf die Filtriersäule gegeben und mit 8000 UpM 1 Minute zentrifugiert und das Filtrat verworfen. Dann wurde in einem zweiten Waschschritt 500 μl Qiagen-AW-2-Waschpuffer auf die Säule gegeben und mit 13000 UpM 3 Minuten zentrifugiert. Auch dieses Filtrat wurde verworfen. 15 Schließlich wurde im letzten Schritt die an der Membran der Filtriersäule gebundene DNA eluiert. Dazu wurde 200 μl destilliertes Wasser auf die Säule gegeben,1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert und mit 8000 UpM zentrifugiert. Dieses Filtrat enthielt die genomische DNA. Reagenzien: • EDTA-Blut • QIAGEN - Protease • QIAGEN - AL-Puffer • QIAGEN - AW-1-Puffer • QIAGEN - AW-2-Puffer Alle Reagenzien wurden nach Angaben des Herstellers verwendet. 4.2 .2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Aus der extrahierten DNA wurden die Nukleotidsequenzen der beiden kodierenden Exone und des Promotorbereichs des Caveolin-3 Gens mit Hilfe der PCR vervielfältigt. Die Reaktionsansätze hatten ein Gesamtvolumen von je 50 μl und bestanden aus • 40,00 μl Aqua bidest • 5,00 μl PCR-Puffer • 1,00 μl dNTP • 1,25 μl forward-Primer • 1,25 μl reverse-Primer • 0,50 μl Taq-Polymerase • 1,00 μl DNA Nach einem initialen Denaturierungsschritt bei 95°C für 2 Minuten wurde die PCR mit 35 Zyklen nach folgendem Protokoll durchgeführt: 16 1. Denaturierung der DNA bei 95°C für 40 Sekunden 2. Annealing der DNA - Einzelstränge und der Primer (siehe Tab. 2 ) bei 62°C bzw. 61°C für 70 Sekunden 3. Elongation der Nukleotidkette bei 72°C für 100 Sekunden Der letzte Schritt bestand aus einer Inkubation bei 72°C für 7 Minuten Bei jeder PCR wurde grundsätzlich eine Negativkontrolle (PCR-Ansatz ohne Template-DNA) mitgeführt. Reagenzien: • Aqua bidest • QIAGEN 10 x PCR-Puffer ( TrisCl; KCl; (NH4)2SO4; 15mM MgCl2; pH 8,7) • dNTP Mix ( je 10mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Primer (10 pmol/μl) • QIAGEN Taq-Polymerase ( 5U/μl ) • DNA ( ca. 200ng/μl) Tabelle 2: Primer zur Amplifikation von Cav3 durch PCR Primerbezeichnung PrimerSequenz AnnealingTemperatur Cav-3 Exon1 Forward: Cav-3 Exon1 Reverse: 5´-CTGGCCGGGACATAAGTCTGG-3´ 5´-ACTGTGTCTGCAGCAGATACC-3´ 62°C Cav-3 Exon2 Forward: Cav-3 Exon2 Reverse: Cav-3 Exon2 Reverse´: 5´-GATTCTGACACCTGCACGCAC-3´ 5´-CAGCCCCTGTGAAGAAGTCC-3´ 5`-GAACAGGAAGCCCCAGAGCAG-3´ 62°C Prom-1 Prom-1 Forward: Reverse: 5´-GTTGCCATCCTTCATGCTGC-3´ 5´-GAATTTGCCCCACTGCTGTC-3´ 62°C Prom-2 Prom-2 Forward: Reverse: 5´-GAATAACCCCACTTCCCTCCAC-3´ 5´-CTGCCATCATCGCAGAGCTGG-3´ 61°C 17 Abbildung 2: Cav-3 Genstruktur und Lage der Primer 4.2.3 Gelelektrophorese Zum Nachweis der Amplifikationsprodukte und deren Auftrennung wurde eine Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wurde durch Erhitzen von 1,4g Agarosepulver und 100ml 1x TAEPuffer ein 1,4% Agarosegel hergestellt, welches zur Färbung der DNA mit 1μl Ethidiumbromidlösung versetzt wurde. Je 20μl PCR-Produkt wurden mit 4μl Ladepuffer vermischt und auf das Gel aufgetragen. Eine 100bp DNALeiter wurde bei jedem Gellauf mitgeführt. Nach einer Laufzeit von 1 Stunde bei 100mV wurden unter UV-Licht die abundanten, spezifischen Banden mit einem sterilen Skalpell ausgeschnitten und die DNA aus dem Gel aufgereinigt. Reagenzien: • Agarose Seakem LE (FMC Bioproducts; Rockland, Maine 04841 USA) • 50 x TAE-Puffer ( 242g Tris(hydroxymethyl)aminoethan; 57,1ml Eisessig; 100ml 0,5M EDTA pH8 ad 1l Aqua bidest) • Ethidiumbromid 1% (Sigma; 89552 Steinheim) • Ladepuffer (Cambrex Bio Science, Rockland, Maine 04841, USA) • Leiter (Cambrex Bio Science, Rockland, Maine 04841, USA) 18 4.2.4 DNA-Aufreinigung aus Agarosegel Die amplifizierte DNA wurde mit Hilfe des High Pure PCR Product Purification Kit® der Firma Roche von Agarosegel und anderen Kontaminanten wie z.B. Primern, Nucleotiden, Salzen gereinigt. Dazu wurde zunächst zum ausgeschnittenen Agarosegelstück (ca.450mg), das die amplifizierte DNA enthielt, 750μl Bindungspuffer gegeben, gevortext und im Wasserbad bei ca. 65°C 5 Minuten inkubiert, um das Agarosegel aufzulösen. Anschließend wurde die Probe auf eine Filtrationssäule gegeben und 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert. Dabei kam es durch das im Bindungspuffer enthaltene Guanidinthiozyanat zur selektiven Adsorption der DNA an die Glasfasermembran der Filtrationssäule. Das Filtrat mit Kontaminanten wurde verworfen. In drei aufeinanderfolgenden Waschschritten wurde anschließend die an der Membran der Säule gebundene DNA weiter gereinigt. Dazu wurden einmal 500 μl und zweimal je 200 μl Waschpuffer auf die Filtrationssäule gegeben und bei 8000 UpM je 1 Minute lang zentrifugiert. Das Filtrat wurde jeweils verworfen. Im abschließenden Elutionsschritt wurde 50 μl destilliertes Wasser auf die Säule gegeben und 1 Minute bei 8000 UpM zentrifugiert. Das Filtrat wurde in einem sterilen 1,5 ml Reaktionsgefäß aufgefangen und enthielt die gereinigte DNA, die für weitere Arbeitsschritte eingesetzt werden konnte. Reagenzien: • Bindungspuffer (3M Guanidinthiozyanat; 10mM TrisHCl; 5% Ethanol (v/v); pH 6,6) • Waschpuffer (20mM NaCl; 2mM TrisHCl; pH 7,5) • Aqua bidest. 4.2.5 Sequenzierreaktion In der Sequenzierreaktion wurden die Exone 1und 2 bzw. die Promotorregion des Caveolin-3 Gens jeweils in forward-Richtung amplifiziert, wobei das gleiche Protokoll wie unter 4.2 verwendet wurde. 19 Dazu wurden 16 μl Template-DNA, 4 μl Sequenzier-Mix und 1 μl forwardPrimer eingesetzt. Zur anschließenden Fällung des Amplifikates wurden zunächst 80 μl Aqua bidest. zugegeben und gemischt, dann wurden 10 μl Natrium-Acetat und 250 μl Ethanol 100% hinzugefügt und 30 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit gevortext. Nach Zentrifugation von 20 Minuten bei 12500 UpM wurde der Überstand abgenommen und verworfen, dann 100μl Ethanol 75% auf das Pellet gegeben und noch einmal 5 Minuten mit 12500 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet über Nacht getrocknet und dann in 5 μl Laufpuffer aufgenommen. Die Elektrophorese wurde auf dem ABI PRISM 377 Sequenzierer durchgeführt. Reagenzien: • DNA • Sequenzier-Mix (PE Biosystems, Foster City, CA 94404, USA) • Sequenzier-Primer (PE Biosystems, Foster City, CA 94404, USA ) • Aqua bidest. • Natrium-Acetat (3M pH 4,8) • Ethanol 100% bzw. 75% • Laufpuffer (Formamid / 25mM EDTA pH 8,0; Dextran Blau) 20 5 Ergebnisse 5.1 Heterozygote R26Q-Mutation in einer deutsche Familie mit autosomaldominanter RMD Die Mutationsanalyse im Caveolin-3 Gen ergab bei einem 14-jährigen Jungen (Pat. Nr. 25 in Tbl.1) und dessen 37-jährigen Mutter (Pat. Nr. 26 in Tbl.1) eine heterozygote Missense-Mutation (R26Q), als Ursache der autosomal-dominaten RMD. Erste Symptome waren bei dem Jungen im Alter von 2-3 Jahren Zehenspitzengang und Myalgien nach längerer Ruhe. Im Krankheitsverlauf kam es zu Muskelsteifheit, vermehrtem Hinstürzen und Wadenhypertrophie. Bei der klinischen Untersuchung fanden sich für RMD charakteristische Befunde: PIRC, Mounding und Rippling der Muskulatur. Die CK lag bei 8000 U/L (Normalwert <80 U/L). Ähnliche Beschwerden wurden auch von dessen Mutter berichtet. Die klinische Untersuchung ergab Rippling und PIRC als Zeichen einer erhöhten mechanischen Erregbarkeit der Skelettmuskulatur. Direktsequenzierungen der beiden kodierenden Exone des Caveolin-3 Gens ergaben bei beiden Patienten eine heterozygote Mutation im Exon 1 (Abb.3 und 4). Es fand sich ein Basenaustausch von Guanin zu Adenin innerhalb des Codons 26. Dies führt zu einem Aminosäureaustausch von Arginin (R) zu Glutamin (Q) (R26Q). Die Mutation liegt innerhalb der N-terminalen Domäne des Proteins und betrifft eine evolutionär konservierte Aminosäure (52). Die histologische Aufarbeitung einer Muskelbiopsie von Pat. Nr. 25 zeigte Fasergrößenvariabilität, degenerative Veränderungen fehlten. In der Immunfluoreszenz mit monoklonalen Antikörpern gegen Caveolin-3 fand sich eine starke Reduktion dieses Proteins am Sarkolemm. Im Western-Blot fehlte Caveolin-3 völlig bei normaler Expression von nNOS. 21 Codon 26 Abbildung 3: Elektropherogramm Wildtyp Abbildung 4: Elektropherogramm Pat. 25, heterozygote Mutation R26Q Abbildung 5: Elektropherogramm Pat.26; heterozygote Mutation R26Q 22 5.2 Homozygote A92T-Mutation bei einem italienischen Patienten Bei einem italienischen Patienten (Pat. Nr. 28 in Tbl.1) wurde eine homozygote Missense-Mutation (A92T) nachgewiesen. Erstsymptome waren fortschreitende Muskelschwäche, Muskelschmerzen und Muskelsteifheit, die erstmals im Alter von 26 Jahren auffielen. Die klinische Untersuchung im Alter von 29 Jahren zeigte Paresen der proximalen Extremitätenmuskulatur, der Bauchwandmuskulatur und der Nackenmuskulatur. Rippling und PIRC waren generalisiert nachweisbar. Die CK war mit 1526 U/L erhöht. Damit erfüllte der Patient die klinischen Kriterien von RMD. Die Direktsequenzierungen der beiden codierenden Exone des Caveolin-3 Gens ergaben eine homozygote Mutation im Exon 2. Im Codon 92 fand sich eine homozygote Transition von Guanin zu Adenin. Dies führte in der abgeleiteten Aminosäuresequenz von Caveolin-3 zu einem Austausch von Alanin (A) zu Threonin (T) (A92T). Der Aminosäureaustausch befindet sich in der Transmembrandomäne von Caveolin-3 und betrifft eine Aminosäure, die bei verschiedenen Spezies konserviert ist (36,52). Histologisch fanden sich sowohl hypertrophe als auch atrophische Muskelfasern ohne Zeichen einer Muskeldystrophie. Elektronenmikroskopisch fiel eine Reduktion der Caveolen am Sarkolemm auf. In der Immunfluoreszenz war Caveolin-3 am Sarkolemm massiv verringert, im Western-Blot fehlte Caveolin-3 vollständig. 5.3 RMD-Patienten ohne Mutationsnachweis Bei 45 der 48 untersuchten Patienten mit klinischen Zeichen einer RMD wurden keine Mutationen in den beiden kodierenden Exonen und der Promotorregion des Caveolin-3 Gens nachgewiesen. 23 Abbildung 6: Elektropherogramm Wildtyp Abbildung 7: Elektropherogramm Pat. 28, homozygote Mutation A92T 24 5.4 Polymorphismen Es wurden drei Basenaustausche in der Nukleotidsequenz der Exone 1 und 2 des Caveolin-3 Gens festgestellt, die auf Proteinebene zu keiner Änderung der Aminosäuresequenz führen, so daß nichtpathogene Polymorphismen anzunehmen sind. Tabelle 3 zeigt eine Übersicht über diese polymorphen Stellen (Nummerierung der Nukleotidposition nach Biederer et al. 1998) : Tabelle 3: Polymorphismen in Exon 1 und 2 des Caveolin-3 Gens bei 48 Patienten mit klinischen Zeichen einer RMD. Basen- Nukleotid- Aminosäure Häufigkeit austausch Position Exon 1 CTC → CTT 38 L→L 14/48 Pat. Exon 1 AAC → AAT 110 N→N 32/48 Pat. Exon 2 TTT → TTC 134 F→F 10/48 Pat. Zusätzlich wurde bei acht der 48 Patienten im Intron eine Deletion von 17 Nukleotiden festgestellt. Diese 17-bp- Deletion (5´GTGTCTTCGGTGGGCAG-3´) wurde auch bei vier von fünfzehn untersuchten Normalpersonen nachgewiesen, so daß dieser intronischen Deletion keine pathogene Bedeutung zukommt. Mutationen in der Promotorsequenz können theoretisch zu einer Störung der Caveolin-3 Expression führen (7). Deshalb wurde in dieser Arbeit gezielt nach Mutationen in der Promotorregion der 45 Patienten gesucht, bei denen keine Mutation in den Exonen gefunden wurden, besonders im Bereich der Transkriptionsfaktor-Bindestellen (TFBS). Bei keinem der in dieser Arbeit untersuchten Patienten fanden sich Mutationen in den TFBS, der TATA-Box und anderen Consensus-Regionen. 25 Allerdings wurden nichtpathogene Sequenzabweichungen im übrigen Promotorbereich nachgewiesen (siehe Tabelle 4; Nummerierung der Nukleotidposition nach Biederer et al. 2000). Tabelle 4: Polymorphismen in der Promotorsequenz des Caveolin-3 Gens bei 45 Patienten mit RMD-Hinweisen Basenaustausch Nukleotidposition Häufigkeit G→A - 821 45/45 T→C - 593 45/45 C→T - 492 1/45 C→T - 487 45/45 G→T - 405 10/45 G→A - 267 4/45 G→A - 262 1/45 A→C - 259 25/45 T→C - 207 45/45 G→T - 103 13/45 G→A - 25 15/45 C→T + 31/45 1 26 6 Diskussion Klinisch-diagnostische Kriterien von erblicher RMD sind 1) PIRC in mindestens zwei Muskeln der oberen und unteren Extremität bei normal auslösbaren Muskeldehnungsreflexen und Ausschluß myotoner Serien im EMG und 2) mindestens eine der folgenden Auffälligkeiten: CK-Erhöhung, muscle rippling, muscle mounding (62). Sind diese Kriterien erfüllt, liegt ein klinisch begründeter Verdacht auf RMD vor. In dieser Arbeit wurden insgesamt 48 Patienten mit klinischen Hinweisen auf RMD nach Mutationen im Caveolin-3 Gen untersucht. Bei drei Personen wurden Mutationen gefunden, die auf Proteinebene zum Austausch evolutionär konservierter Aminosäuren führen und die damit als pathogen zu werten sind. Ein 14-jähriger Junge und seine 37 Jahre alte Mutter (Patienten Nr. 25 und 26 in Tbl. 1) zeigten eine heterozygote Missense-Mutation in Codon 26, die zum Aminosäureaustausch von Arginin (R) zu Glutamin (Q) führt (R26Q). Beide erfüllten die o.g. klinisch-diagnostischen Kriterien von RMD. Der Junge zeigte darüber hinaus Gangstörungen, z.B. Zehenspitzengang und häufiges Stürzen, Myalgien und Hypertrophie der Wadenmuskulatur. Der Mutationsbefund bestätigte damit den klinischen Verdacht auf eine autosomal-dominant erbliche Form von RMD. Auch der italienische Patient (Nr. 28 in Tbl. 1) erfüllte die klinischen Diagnosekriterien für RMD, eine genaue klinische Untersuchung konnte PIRC und muscle mounding objektivieren, laborchemisch fand sich eine CKErhöhung im Serum. Die molekulargenetische Untersuchung ergab eine vorher noch nicht beschriebene homozygote Mutation im Codon 92, die zum Aminosäureaustausch von Alanin zu Threonin führte (A92T). Die klinischen Symptome waren bei diesem Betroffenen ungewöhnlich stark ausgeprägt. Besonders auffällig waren zunehmende Paresen der proximalen Extremitätenmuskeln und der Bauchwandmuskulatur, die bei den bisherigen autosomal-dominanten RMD-Fällen in dieser Ausprägung nicht beobachtet wurden. Erst nach Abschluß des experimentellen Teils dieser Arbeit konnten auch die Eltern des Patienten auf Mutationen im Caveolin-3 Gen getestet werden, 27 nachdem sie mit einer klinischen Untersuchung und Blutabnahme einverstanden waren. Beide Elternteile waren heterozygot für die A92T-Mutation. Klinisch fanden sich bei beiden deutliche Hinweise für RMD, jedoch waren die Symptome deutlich geringer ausgeprägt als bei Pat. Nr. 28 (Information von PD Dr.med. M. Vorgerd, Neurologische Klinik, Berufsgenossenschaftliche Kliniken Bergmannsheil Bochum). Man muß daher annehmen, daß der ausgeprägtere Phänotyp bei Pat. 28 Folge des homozygoten Genotyps ist, wobei bereits die heterozygote A92TMutation klinisch manifest wird. Differentialdiagnostisch müssen bei klinischem Verdacht auf RMD, insbesondere wenn unspezifische Symptome wie Myalgien oder Muskelkrämpfe im Vordergrund stehen, andere Myopathien ausgeschlossen werden, z.B. Myotonia congenita, Muskeldystrophie, Myositis oder metabolische Myopathien. Neben einer genauen klinischen Untersuchung und apparativer Zusatzdiagnostik (EMG) ist eine gezielte molekulargenetische Untersuchung auf Mutationen im Caveolin-3 Gen eine effiziente Methode, den Verdacht auf eine hereditäre Form der RMD zu bestätigen. Wie diese Studie deutlich macht, schließt der fehlende Nachweis einer Caveolin-3 Genmutation eine hereditäre RMD-Form allerdings nicht aus. Bei 45 der insgesamt 48 untersuchten Patienten mit klinischem Verdacht auf RMD konnten in dieser Arbeit keine pathogenen Mutationen in den Exonen und auch dem Promotorbereich des Caveolin-3 Gens gefunden werden. RMD scheint daher eine genetisch heterogene Erkrankung zu sein. Es ist denkbar, daß bei den 45 Caveolin-3-mutationsnegativen Fällen Mutationen in Proteinen vorliegen, die mit Caveolin-3 interagieren oder die sich anderweitig auf das Caveolin-3-Molekül auswirken. Eine solche Veränderung der Protein-Protein-Interaktion könnte die physiologische Funktion von Caveolin-3 am Sarkolemm funktionell entscheidend beeinträchtigen und so zur Manifestation eines RMD-Phänotyps führen. Eine gezielte Suche nach Genmutationen in Caveolin-3-Interaktionspartnern könnte zur weiteren molekulargenetischen Aufklärung beitragen. 28 Mutationen im Caveolin-3 Gen führen zu unterschiedlichen Phänotypen. Neben RMD zählen dazu die autosomal-dominante Gliedergürteldystrophie 1C (26), die isolierte HyperCKämie (8), die distale Myopathie (57) und die isolierte Kardiomyopathie (25). Dabei können identische Mutationen klinisch unterschiedliche Caveolinopathien verursachen. Zum Beispiel kann die Mutation Ala46Thr zur Manifestation von RMD aber auch zur Gliedergürteldystrophie 1C führen (5,26). Die Mutation Arg26Gln kann entweder einer HyperCKämie oder aber auch einer RMD zugrunde liegen (5,8). Man muß annehmen, daß neben der Caveolin-3-Genmutation noch weitere Faktoren eine Rolle spielen, die an der klinischen Manifestation der Caveolinopathien beteiligt sind. Diese bisher unbekannten Einflußfaktoren könnten direkte Interaktionspartner von Caveolin-3 sein, oder aber Proteine der elektromechanischen Koppelung oder der intrazellulären Kalziumhomöostase. Einer dieser Interaktionspartner ist nNOS, eine Isoform der StickoxidSynthasen. nNOS wird physiologischerweise direkt von Caveolin-3 gehemmt (60). Bei RMD kommt es durch Mutationen im Caveolin-3 Gen zu einer Retention von Caveolin-3 im Golgi-Apparat der Skelettmuskelzelle. Dadurch kann Caveolin-3 seine normale Lokalisation an der Plasmamembran nicht einnehmen (immunhistologisch konnte mit monoklonalen Antikörpern gegen Caveolin-3 eine drastisch verringerte Menge von Caveolin-3 an der Plasmamembran nachgewiesen werden, zudem war die Caveolin-3 Proteinmenge auch im Western-Blot deutlich reduziert und elektronenmikroskopisch zeigte sich ein Verlust von Caveolen in humanem Muskel) (21,29,47,63). Der Mangel an Caveolin-3 am Sarkolemm führt zu einer gesteigerten nNOS-Aktivität und nachfolgend zu einer erhöhten Stickoxid-Konzentration in humanen Muskelzellen (5). Stickoxid ist an der Regulation der Kalziumhomöostase der Skelettmuskulatur beteiligt (24,53). Es ist denkbar, daß es durch die erhöhte Stickoxid-Konzentration zu einer Veränderung des zellulären Kalziumumsatzes kommt. Dies könnte durchaus zu einer mechanischen Übererregbarkeit der Skelettmuskulatur und damit zum RMD-Phänotyp beitragen. 29 Anders als bei RMD ist die nNOS-Expression bei der Gliedergürteldystrophie 1C drastisch reduziert (26). Dies läßt vermuten, daß die unterschiedliche Expression und Aktivität von nNOS den Phänotyp mitbeeinflußt und zur Manifestation entweder von RMD (bei gesteigerter nNOS-Aktivität) oder Gliedergürteldystrophie 1C (bei verminderter bis fehlender nNOS-Aktivität) führt. Die genauen pathophysiologischen Zusammenhänge sind allerdings noch unklar und bedürfen der weiteren Abklärung. Ein weiterer Interaktionspartner von Caveolin-3, der an der Pathogenese von RMD beteiligt sein könnte, ist Dysferlin. Dysferlin ist ein großes plasmamembranständiges Protein, das mehrere Caveolin-3 bindende Domänen besitzt und vermutlich an kalziumabhängigen Stoffwechsel- und Reparaturprozessen der Plasmamembran beteiligt ist (11). Es interagiert direkt mit Caveolin-3 (33). Mutationen im humanen Dysferlin-Gen verursachen klinisch verschiedene Myopathien, z.B. eine Form der Gliedergürteldystrophie (LGMD 2B), eine distale Myopathie oder aber phänotypische Mischbilder, die sich keiner definierten Gruppe zuordnen lassen (66). Immunhistologisch konnte bei Patienten mit LGMD 1C und distaler Myopathie, jeweils auf dem Boden verschiedener Caveolin-3 Mutationen, eine Reduktion der Dysferlin-Proteinmenge am Sarkolemm nachgewiesen werden (13,33). Auch bei dem in dieser Arbeit beschriebenen italienischen RMD-Patienten mit homozygoter (A92T)-Mutation zeigte sich immunhistologisch ein deutlicher Mangel an Dysferlin an der Muskelfasermembran (29). Folglich scheint eine Reduktion oder ein Fehlen von Caveolin-3 zu einer verringerten Expression des Interaktionspartners Dysferlin an der Plasmamembran zu führen. Dies könnte eine Störung der physiologischen Funktion des Sarkolemms nach sich ziehen und an der Manifestation einer Caveolinopathie beteiligt sein. Aufgrund morphologischer Untersuchungen wurde eine Beteiligung von Caveolen an der Biosynthese des transversalen Tubulussystems von Skelettmuskelzellen vermutet (15,16,27,39). Eine Assoziation von Caveolin-3 30 mit transversalen Tubuli konnte sowohl in Myoblasten als auch Myozyten gezeigt werden (42,44). Elektronenmikroskopisch wurden an Skelettmuskelfasern von RMD- und LGMD 1C-Patienten mit nachgewiesener Caveolin-3-Mutation Veränderungen der T-Tubuli nachgewiesen (14,29,35). Damit übereinstimmend konnten am Caveolin-3-negativen Mausmodell deutliche Fehlbildungen des transversalen Tubulussystems nachgewiesen werden (19,45). Möglicherweise kommt es aufgrund der pathologisch veränderten T-Tubuli durch mechanische Stimuli zu einer unphysiologisch hohen Kalziumfreisetzung aus dem sarkoplasmatischen Retikulum, die zur gesteigerten mechanischen Muskelerregbarkeit bei RMD beiträgt. Als alternativer Pathomechanismus ist eine verstärkte Aktivierung plasmamembranständiger Kalziumkanäle durch mechanische Reize denkbar, wodurch es zu einem vermehrtem Kalziumeinstrom in die Muskelzelle und dadurch zu klinischen Zeichen der muskulären Übererregbarkeit kommt. Die experimentelle Überprüfung dieser Hypothesen, z.B. durch das Patch-Clamp-Verfahren, könnte zur weiteren Aufklärung der pathophysiologischen Zusammenhänge beitragen. 1996 beschrieben Ansevin und Agamanolis erstmals eine sporadisch auftretende RMD-Form, die mit einer Myasthenia gravis und einem Thymom assoziiert ist (4). Diese Beobachtung wurde von Müller-Felber et al. bestätigt (38). Klinisch boten die Betroffenen das für RMD typische Rippling der Muskulatur, Muskelkrämpfe und Myalgien. Neben einer CK-Erhöhung konnten laborchemisch Autoantikörper gegen Skelettmuskelstrukturen nachgewiesen werden. Unter immunsuppressiver Therapie mit Azathioprin kam es zu einer deutlichen Beschwerdebesserung (38,61,64). Daher ist anzunehmen, daß neben der hereditären Form auch eine nicht erbliche, erworbene RMD-Form vorkommt, die der autosomal-dominanten RMD klinisch sehr ähnelt und bei der autoimmunologische Prozesse eine Rolle spielen. Bei Patienten mit klinischen Hinweisen auf RMD und molekulargenetischem Ausschluß einer Mutation im Caveolin-3 Gen ist das Vorliegen dieser erworbenen Form einer RMD differentialdiagnostisch 31 unbedingt zu berücksichtigen. Klinische Hinweise auf eine Myasthenia gravis und muskelspezifische Autoantikörper sind hierbei diagnostisch wegweisend. Insgesamt sind die genauen pathophysiologischen Zusammenhänge bei RMD bisher unklar. Weitere Untersuchungen der Funktion von Caveolin-3 und seiner Interaktionspartner im physiologischen Exzitations-Kontraktionsablauf der Skelettmuskulatur sind erforderlich, um diesbezüglich weitere Klärung zu bringen. 32 7. Zusammenfassung In dieser Arbeit wurden die beiden Exone und der Promotorbereich des Caveolin-3 Gens bei 48 Patienten mit klinischen Hinweisen auf eine Rippling Muscle Disease (RMD) auf pathogene Mutationen hin untersucht. Caveolin ist das Hauptstrukturprotein der sog. Caveolen, Invaginationen der Zytoplasmamembran, die bei verschiedenen Zelltypen vorkommen. Caveolen sind an zellulären Transport- und Signaltransduktionsmechanismen beteiligt. Caveolin-3 ist die muskelspezifische Isoform dieser Proteinfamilie. RMD ist eine seltene Myopathie, die zu einer mechanischen Übererregbarkeit der Skelettmuskelfasern führt. Sie zählt zu den Caveolinopathien, einer Gruppe von Muskelerkrankungen, die durch Mutationen im Caveolin-3 Gen verursacht werden. Die molekulargenetische Mutationsanalyse ergab bei drei der 48 untersuchten Patienten pathogene Mutationen im Caveolin-3 Gen. Bei einem 14jährigen Jungen und seiner Mutter konnte eine heterozygote MissenseMutation nachgewiesen werden, die auf Proteinebene zu einem Aminosäureaustausch von Arginin zu Glutamin im Codon 26 (R26Q) führte. Eine zuvor noch nicht beschriebene homozygote Missense-Mutation bei einem italienischen Patienten führte zum Austausch von Alanin zu Threonin im Codon 92 (A92T). Alle drei Patienten erfüllten die klinischen Kriterien von RMD, der italienische Patient zeigte eine besonders ausgeprägte Symptomatik. Bei den übrigen Personen wurden sowohl in den beiden codierenden Exonen als auch im Promotorbereich des Caveolin-3 Gens nichtpathogene Polymorphismen gefunden. Die molekulargenetische Untersuchung auf Mutationen im Caveolin-3 Gen ist eine effiziente und nichtinvasive Methode, den klinischen Verdacht auf eine hereditäre Form von RMD zu bestätigen. Da bei 45 der 48 untersuchten Patienten mit klinischen Symptomen von RMD keine pathogene Mutation nachgewiesen werden konnte, ist eine genetische Heterogenität von RMD anzunehmen. Denkbar sind Mutationen in Interaktionspartnern von Caveolin3 oder in Proteinen, die Caveolin-3 anderweitig beeinflussen. 33 8 Literaturverzeichnis (1) Amundson, J., Clapham, D. (1993). Calcium waves. Curr Opin Neurobiol 3, 375-382 (2) Anderson, R.G.W. (1998). The caveolae membrane system. Annu Rev Biochem 67, 199-225 (3) Anderson, R.G.W., Kamen, B.A., Rothberg, K.G., Lacey, S.W. (1992). Potocytosis: sequestration and transport of small molecules by caveolae. Science 255, 410-411 (4) Ansevin, C.F., Agamanolis, D.P. (1996). Rippling muscles and myasthenia gravis with rippling muscles. Arch Neurol 53, 197-199 (5) Betz, R.C., Schoser, B.G., Kasper D., Ricker, K., Ramirez, A., Stein, V., Torbergsen, T., Lee, Y.A., Nothen, M.M., Wienker, T.F., Malin, J.P., Propping, P., Reis, A., Mortier, W., Jentsch, T.J., Vorgerd, M., Kubisch, C. (2001). Mutations in CAV3 cause mechanical hyperirritability of skeletal muscle in rippling muscle disease. Nat Genet 28, 218-219 (6) Biederer, C., Ries, S., Drobnik, W., Schmitz, G. (1998). Molecular cloning of human caveolin 3. Biochim Biophys Acta 1406, 5-9 (7) Biederer, C.H., Ries, S.J., Moser, M., Florio, M., Israel, M.A., McCormick, F., Buettner, R. (2000). The basic helix-loop-helix transcription factors myogenin and Id2 mediate specific induction of caveolin-3 gene expression during embryonic development. J Biol Chem 275, 2624526251 (8) Carbone, L., Bruno, C., Sotgia, F., Bado, M., Broda, P., Masetti, E., Panelia, A., Zara, F., Bricarelli, D.F., Cordone, G., Lisanti, M.P., Minetti, C. (2000). Mutation in the CAV-3 gene causes partial caveolin-3 deficiency and persistent elevated levels of serum creatine kinase. Neurology 54, 1373-1376 (9) Chang, W.-J., Ying, Y-S., Rothberg, K.G., Hooper, N.M., Turner, A.J., Gambliel, H.A., De Gunzburg, J., Mumby, S.M., Gilman, A.G., Anderson, R.G.W. (1994). Purification and Characterization of smooth muscle cell caveolae. J Cell Biol 126, 127-138 34 (10) Couet, J., Sargiacomo, M., Lisanti, M.P. (1997). Interaction of a receptor tyrosine kinase, EGF-R, with caveolins. J Biol Chem 3042930438 (11) Davis, D.B., Doherty, K.R., Delmonte, A.J., McNally, E.M. (2002). Calcium-sensitive phospholipid binding properties of normal and mutant ferlin C2 domains. J Biol Chem 277, 22883-22888 (12) Dupree, P., Parton, R.G., Raposo G., Kurzchalia, T.V., Simons,K. (1993). Caveolae and sorting in the trans-golgi network of epithelial cells. EMBO J 12,1597-1605 (13) Figarella-Branger, D., Pouget, J., Bernard, R., Krahn, M., Fernandez, C., Levy, N., Pellissier, J.F. (2003). Limb-girdle muscular dystrophy in a 71-year-old woman with an R27Q mutation in the CAV3 gene. Neurology 61, 562-564 (14) Fischer, D., Schroers, A., Blümcke, I., Urbach, H., Zerres, K., Mortier, W., Vorgerd, M., Schröder, R. (2003). Consequences of a novel Caveolin3 mutation in a large german family. Ann Neurol 53, 233-241 (15) Franzini-Armstrong, C. (1991). Simultaneous maturation of transverse tubules and sarcoplasmic reticulum during muscle differentiation in the mouse. Dev Biol 116, 353-363 (16) Franzini-Armstrong, C., Landmesser, L., Pilar, G. (1975). Size and shape of transverse tubule openings in frog twitch muscle fibers. J Cell Biol 64, 493-497 (17) Fujimoto, T. (1993). Calcium pump of the plasma membrane is localized in caveolae. J Cell Biol 120, 1147-1157 (18) Fujimoto, T., Nakade, S., Miyawaki, A., Mikoshiba, K., Ogawa, K. (1992). Localization of inositol 1,4,5-triphosphate receptor-like protein in plasmalemmal caveolae. J Cell Biol 119, 1507-1513 (19) Galbiati, F., Engelman, J.A., Volonte, D., Zhang, X.L., Minetti, C., Li, M., Hou Jr, H., Kneitz, B., Edelmann, W., Lisanti, M.P. (2001). Caveolin-3 null mice show a loss of caveolae, changes in the microdomain distribution of the dystrophin-glycoprotein complex, and Ttubule abnormalities. J Biol Chem 276, 21425-21433 35 (20) Galbiat, F., Volonte, D., Engelman, J.A., Scherer, P.E., Lisanti, M.P. (1999). Targeted down-regulation of caveolin-3 is sufficient to inhibit myotube formation in differentiating C2C12 myoblasts. J Biol Chem 274, 30315-30321 (21) Galbiati, F., Volonte, D., Minetti, C., Chu, J.B., Lisanti, M.P. (1999). Phenotypic behavior of caveolin-3 mutations that cause autosomal dominant limb girdle muscular dystrophy (LGMD-1C). J Biol Chem 274, 25632-25641 (22) Garcia-Cardena, G., Martasek, P., Masters, B.S.S., Skidd, P.M., Couet, J., Li, S., Lisanti, M.P., Sessa, W.C. (1997). Dissecting the interaction between nitric oxide synthase (NOS) and caveolin. J Biol Chem 272, 25437-25440 (23) Glenny Jr., J.R. (1992). The sequence of human caveolin reveals identity with VIP21, a component of transport vesicles. FEBS Lett 314, 45-48 (24) Grozdanovic, Z., Baumgarten, H.G. (1999). Nitric oxide synthase in skeletal muscle fibers: a signaling component of the dystrophinglycoprotein complex. Histol Histopathol 14, 243-256 (25) Hayashi, T., Arimura, T., Ueda, K., Shibata, H., Hohda, S., Takahashi, M., Hori, H., Koga, Y., Oka, N., Imaizumi, T., Yasunami, M., Kimura, A. (2004). Identification and functional analysis of a caveolin-3 mutation associated with familial hypertrophic cardiomyopathy. Biochem Biophys Res Commun 313, 178-184 (26) Herrmann, R., Straub, V., Blank, M., Kutzick, C., Franke, N., Neuen Jakob, E., Lenard, H-G., Kröger, S., Voit, T. (2000). Dissociation of the dystroglycan complex in caveolin-3-deficient limb girdle muscular dystrophy. Hum Mol Genet 9, 2335-2340 (27) Ishikawa, H. (1968). Formation of elaborate networks of T-system tubules in cultured skeletal muscle with special reference to the T-system formation. J Cell Biol 38, 51-66 (28) Isshiki, M., Anderson, R.G.W. (1999). Calcium signal transduction from caveolae. Cell Calcium 26, 201-208 36 (29) Kubisch, C., Schoser, B.G.H., von Düring, M., Betz, R.C., Goebel, H.H., Zahn, S., Ehrbrecht, A., Aasly, J., Schroers, A., Popovic, N., Lochmüller, H., Schröder, J.M., Brüning, T., Malin, J.P., Fricke, B., Meinck, H.M., Torbergsen, T., Engels, H., Voss, B., Vorgerd, M. (2003). Homozygous mutations in caveolin-3 cause a severe form of rippling muscle disease. Ann Neurology 53, 512-520 (30) Li, S., Couet, J., Lisanti, M.P. (1996). Src tyrosine kinases, Gα subunits, and H-ras share a common membrane-anchored scaffolding protein, caveolin. J Biol Chem 271, 29182-29190 (31) Li, S., Okamoto, T., Chun, M., Sargiacomo, M., Casanova, J.E., Hansen, S.H., Nishimoto, I., Lisanti, M.P. (1995). Evidence for a regulated interaction between heterotrimeric G proteins and caveolin. J Biol Chem 270, 15693-15701 (32) Lisanti, M.P., Scherer, P.E., Tang, Z.L., Sargiacomo, M. (1994). Caveolae, caveolin and caveolin-rich membrane domains: a signalling hypothesis. Trends Cell Biol 4, 231-235 (33) Matsuda, C., Hayashi, Y.K., Ogawa, M., Aoki, M., Murayama, K., Nishino, I., Nonaka, I., Arahata, K., Brown Jr., R.H. (2001). The sarcolemmal proteins dysferlin and caveolin-3 interact in skeletal muscle. Hum Mol Genet 10, 1761-1766 (34) McNally E.M., de Sa Moreira E., Duggan, D.J., Bönnemann, C.G., Lisanti, M.P., Lidov, H.G.W., Vainzof M., Passos-Bueno, M.R., Hoffmann, E.P., Zatz, M., Kunkel, L.M. (1998). Caveolin-3 in muscular dystrophy. Hum Mol Genet 7, 871-877 (35) Minetti, C., Bado, M., Broda, P., Sotgia, F., Bruno, C., Galbiati, F., Volonte, D., Lucania, G., Pavan, A., Bonilla, E., Lisanti, M.P., Cordone, G. (2002). Impairment of caveolae formation and T-system disorganisation in human muscular dystrophy with caveolin-3 deficiency. Am J Pathol 160, 265-270 (36) Minetti, C., Sotgia, F., Bruno, C., Scartezzini, P., Broda,P., Bado, M., Masetti, E., Mazzocco, M., Egeo, A., Donati, M.E., Volonte, D., Galbiati, F., Cordone, G., Bricarelli, F.D., Lisanti, M.P., Zara, F. (1998). Mutations in the caveolin-3 gene cause autosomal dominant limb-girdle muscular dystrophy. Nature Genet 18, 365-368 37 (37) Montesano, R., Roth, J., Robert, A., Orci, L. (1982). Non-coated membrane invaginations are involved in binding and internalisation of cholera and tetanus toxins. Nature 296, 651-653 (38) Müller-Felber, W., Ansevin, C.F., Ricker, K., Müller-Jenssen, A., Töpfer, M., Goebel, H.H., Pongratz, D.E. (1999). Immunosuppressive treatment of rippling muscles in patients with myasthenia gravis. Neuromuscul Disord 9, 604-607 (39) Oguchi, K., Tsukagoshi, H. (1980). An electron-microscopic study of the t-system in progressive muscular dystrophy (Duchenne) using lanthanum. J Neurol Sci 44, 161-168 (40) Oka, N., Yamamoto, M., Schwencke, C., Kawabe, J., Ebina, T., Ohno, S., Couet, J., Lisanti, M.P., Ishikawa, Y. (1997). Caveolin interaction with protein kinase C. J Biol Chem 272, 33416-33421 (41) Palade, G.E. (1953). Fine structure of blood capillaries. J Appl Physics 24, 1424-1436 (42) Parton, R.G., Way, M., Zorzi, N., Stang, E. (1997). Caveolin-3 associates with developing t-tubules during muscle differentiation. J Cell Biol 136, 137-154 (43) Popescu, L.M., Diculescu, I., Zelek, U., Ionescu, N. (1974). Ultrastructural distribution of calcium in smooth muscle cells of guinea-pig taenia coli. Cell Tiss Res 154, 357-387 (44) Ralston, E., Ploug, T. (1999). Caveolin-3 is associated with the t- tubules of mature skeletal muscle fibers. Exp Cell Res 246, 510-515 (45) Razani, B., Lisanti, M.P. (2001). Caveolin-deficient mice: insights into caveolar function and human disease. J Clin Invest 108, 1553-1561 (46) Ricker, K., Moxley, R.T., Rohkamm, R. (1089). Rippling muscle disease. Arch Neurol 48, 405-408 (47) Schara, U., Vorgerd, M., Popovic, N., Schoser, B.G.H., Ricker, K., Mortier, W. (2002). Rippling muscle disease in childhood. J Child Neurol 17, 483-490 (48) Smart, E.J., Mineo, C., Anderson, R.G.W. (1996). Clustered folate receptors deliver 5-methyltetrahydrofalate to cytoplasm of MA104 cells. J Cell Biol 134, 1169-1177 38 (49) So, Y.T., Zu, L., Barraza, C., Figueroa, K.P., Pulst, S-M. (2001). Rippling muscle disease: evidence for phenotypic and genetic heterogeneity. Muscle Nerve 24, 340-344 (50) Song, K.S., Li, S., Okamoto, T., Quilliam, L.A., Sargiacomo, M., Lisanti, M.P. (1996). Co-purification and direct interaction of ras with caveolin, an integral membrane protein of caveolae microdomains. J Biol Chem 271, 9690-9697 (51) Song, K.S., Scherer, P.E., Tang, Z.L., Okamoto, T., Li, S., Chafel, M., Chu, C., Kohtz, S.D., Lisanti, M.P. (1996). Expression of caveolin-3 in skeletal, cardiac, and smooth muscle cells. J Biol Chem 271, 1516015165 (52) Sotgia, F., Lee, J.K., Das, K., Bedford, M., Petrucci, T.C., Macioce, P., Sargiacomo, M., Bricarelli, F.D., Minetti, C., Sudol, M., Lisanti, M.P. (2000). Caveolin-3 directly interacts with the c-terminal tail of βdystroglycan. J Biol Chem 275, 38048-38058 (53) Stamler, J.S., Meissner, G. (2001). Physiology of nitric oxide in skeletal muscle. Physiol Rev 81, 209-237 (54) Stephan, D.A., Buist, N.R.M., Chittenden, A.B., Ricker, K., Zhou, J., Hoffmann, E.P. (1994). A rippling muscle disease gene is localized to 1q41: evidence for multiple genes. Neurology 44, 1915-1920 (55) Stryer, L. (1996). Biochemie. Spektrum Akademischer Verlag (56) Tang, Z.L., Scherer, P.E., Okamoto, T., Song, K., Chu, C., Kohtz, D.S., Nishimoto, I., Lodish, H.F., Lisanti, M.P. (1996). Molecular cloning of caveolin-3, a novel member of the caveolin gene family expressed predominantly in muscle. J Biol Chem 271, 2255-2261 (57) Tateyama, M., Aoki, M., Nishino, I., Hayashi, Y.K., Sekiguchi, S., Shiga, Y., Takahashi, T., Onodera, Y., Haginoya, K., Kobayashi, K., Iinuma, K., Nonaka, I., Arahata, K., Itoyoma, Y. (2002). Mutation in the caveolin-3 gene causes a peculiar form of distal myopathy. Neurology 58, 323-325 (58) Torbergsen, T. (1975). A family with dominant hereditary myotonia, muscular hypertrophy, and increased muscular irritability, distinct from myotonia congenita Thomsen. Acta Neurol Scandinav 51, 225-232 39 (59) Torbergsen, T. (2002). Rippling muscle disease. Muscle Nerve 11, 103-107 (60) Venema, V.J., Ju, H., Zou, R., Venema R.C. (1997). Interaction of neuronal nitric-oxide synthase with caveolin-3 in skeletal muscle. Identification of a novel caveolin scaffolding/inhibitory domain. J Biol Chem 272, 28187-28190 (61) Vernino, S., Auger, R.G., Emslie-Smith, A.M., Harper, C.M., Lennon, V.A. (1999). Myasthenia, thymoma, presynaptic antibodies, and a continuum of neuromuscular hyperexcitability. Neurology 53, 1233-1239 (62) Vorgerd, M., Bolz, H., Patzold, T., Kubisch, C., Malin, J.P., Mortier, W. (1999). Phenotypic variability in rippling muscle disease. Neurology 52, 1453-1459 (63) Vorgerd, M., Ricker, K., Ziemssen, F., Kress, W., Goebel, H.H., Nix, W.A., Kubisch, C., Schoser, B.H.G., Mortier, W. (2001). A sporadic case of rippling muscle disease caused by a de novo caveolin-3 mutation. Neurology 57, 2273-2277 (64) Walker, G.R., Watkins, T., Ansevin, C.F. (1999). Identification of autoantibodies associated with rippling muscles and myasthenia gravis that recognize skeletal muscle proteins: possible relationship of antigens and stretch-avtivated ion channels. Biochem Biophys Res Commun 264, 430-435 (65) Way, M., Parton, R.G. (1995). M-caveolin, a muscle-specific caveolin- related protein. FEBS Letters 376, 108-112 (66) Weiler, T., Bashir, R., Anderson, L.V., Davison, K., Moss, J.A., Britton, S., Nylen, E., Keers, S., Vafiadaki, E., Greenberg, C.R., Bushby, C.R., Wrogemann, K. (1999). Identical mutation in patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B or Miyoshi myopathy suggests a role for modifier gene(s). Hum Mol Genet 8, 871-877 (67) Yamada, E. (1955). The fine structure of the gall bladder epithelium of the mouse. J Biophys Biochem Cytol 1, 445-458 40 Beteiligung an Veröffentlichungen: Schara, U., Vorgerd, M., Popovic, N., Schoser, B.G.H., Ricker, K., Mortier, W. (2002). Rippling muscle disease in childhood. J Child Neurol 17, 483-490 Kubisch, C., Schoser, B.G.H., von Düring, M., Betz, R.C., Goebel, H.H., Zahn, S., Ehrbrecht, A., Aasly, J., Schroers, A., Popovic, N., Lochmüller, H., Schröder, J.M., Brüning, T., Malin, J.P., Fricke, B., Meinck, H.M., Torbergsen, T., Engels, H., Voss, B., Vorgerd, M. (2003). Homozygous mutations in caveolin-3 cause a severe form of rippling muscle disease. Ann Neurology 53, 512-520 Danksagung Ganz herzlich bedanken möchte ich mich für die stets sehr gute Betreuung bei der Erstellung dieser Arbeit bei Herrn PD Dr. med. Matthias Vorgerd, der mir die Grundlagen molekulargenetischer Arbeitstechniken vermittelt hat und immer geduldig mit Rat und Tat zur Seite stand. Außerdem gilt mein Dank Frau Dr. med. Anja Schroers, Herrn Dr. med. Focke Ziemssen, Herrn Dr. Bruno Voß und Frau Sabine Böhm für Ihre Kollegialität und guten Ratschläge bei der Laborarbeit und Herrn Tim Adelt für die Hilfe bei der EDV. Abschließend danke ich meiner Familie für die moralische Unterstützung während der Erstellung der Arbeit. Lebenslauf Angaben zur Person: Nikola Popovic Geb. am 13.11.1975 in Gelsenkirchen Ledig Schulbildung: 1982-1986 Grundschule an der Schonnebecker Straße, Gelsenkirchen 1986-1995 Bischöfliches Gymnasium am Stoppenberg, Essen 06 / 1995 Abitur Zivildienst: 1995-1996 Zivildienst beim sozialen Friedensdienst, Gelsenkirchen Studium: 1996-2003 Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum 09 / 1998 Ärztliche Vorprüfung 09 / 1999 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 09 / 2001 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 2002-2003 Praktisches Jahr Evang. Krankenhaus Hattingen (Neurologie, Innere Medizin) Stadtspital Triemli, Zürich, Schweiz (Chirurgie) 04 / 2003 Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung Beruf: Seit 01.09.2003 Tätigkeit als Arzt im Evangelischen Krankenhaus Hattingen, Neurologische Klinik
