Stammzellbiotechnologie

Stammzellbiotechnologie –
Revolution etablierter Therapieverfahren?
S 24
1
Einleitung … 24
2
Was sind Stammzellen? … 25
3
Entwicklung von Stammzellsystemen whrend
der Ontogenese … 26
4
4.1
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
Stammzelltypen … 26
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen) … 26
Somatische (adulte) Stammzellen … 28
H!matopoetische Stammzellen … 28
Neuronale Stammzellen … 29
Mesenchymale Stammzellen … 29
5
Plastizitt somatischer Stammzellen … 30
6
6.1
Anwendung der Stammzellbiologie in der HNO-Heilkunde … 31
M(gliche Bedeutung der Stammzellbiologie f,r
die HNO-Heilkunde am Beispiel des Innenohres … 31
6.1.1 Bedeutung neurotropher Faktoren und anderer Molek,le
f,r Differenzierung und Funktionserhalt cochle!rer Zellen … 31
6.1.2 Ist eine Regeneration sensorischer und neuraler
cochle!rer Zellen aus Stammzellen vorstellbar? … 33
6.1.3 M(glichkeiten zur Erzeugung autologer
Stammzellen
6.2 Ersatz anderer Gewebe im Kopf-Hals-Bereich aus Stammzellen … 35
7
Ethisch-rechtliche Gesichtspunkte … 35
8
Entscheidende wissenschaftliche Fragen … 35
9
Ausblick … 36
10
Literatur … 36
Einleitung
Die Diskussion ber die Stammzellbiologie und deren Mglichkeiten und Grenzen gehren derzeit zu den kontroversen Themen in den Grundlagenwissenschaften, der Medizin, der Politik
und der breiten Gesellschaft. Aktuelle Erkenntnisse und Techniken in der Zell- und Molekularbiologie erffnen prinzipiell neue
Mglichkeiten, verschiedenartige Zellen und Gewebe zu erzeugen sowie bisher unverstandene Entwicklungsprozesse der Gewebeentstehung und Organogenese sowie deren Erhaltung und
Regeneration n'her zu untersuchen. Fr die Medizin knnten
sich durch den Einsatz embryonaler und somatischer Stammzellen, neue kausale Behandlungsstrategien fr bisher nur begrenzt
therapierbare Erkrankungen ergeben. Offen bleibt derzeit, welcher therapeutische Nutzen von diesen neuen Methoden erwartet werden darf und welche medizinischen, ethischen und rechtlichen Gesichtspunkte bei deren Anwendung am Menschen zu
bedenken sind.
Der erwachsene S'ugetierorganismus setzt sich aus etwa 200
verschiedenen, hoch spezialisierten Zelltypen zusammen, die
zum Teil nur sehr bedingt zur Regeneration f'hig sind. Stammzellen bilden und erhalten eine Vielzahl dieser Zellen und gew'hrleisten somit die Homostase vieler Gewebe und Organe.
W'hrend der Embryonal- und Fetalentwicklung bilden Stammzellen durch Differenzierung zu spezialisierten Effektorzellen
den entstehenden Organismus. Die toti- und pluripotenten Zellen des Embryos besitzen ein breites Entwicklungspotenzial,
das nach bisheriger Lehrmeinung bei den somatischen Stamm-
Institutsangaben
1
Klinik und Poliklinik fr Hals-, Nasen- und Ohrenkranke,
Bayerische Julius-Maximilians-Universit't Wrzburg (Direktor: Prof. Dr. J. Helms)
2
Institut fr Medizinische Strahlenkunde und Zellforschung,
Bayerische Julius-Maximilians-Universit't Wrzburg
Korrespondenzadresse
Priv.-Doz. Dr. Stefan Dazert · Hals-Nasen-Ohrenklinik der Ruhr-Universit't Bochum ·
St. Elisabeth Hospital · Bleichstraße 15 · 44787 Bochum · E-mail: [email protected]
Bibliografie
Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81 Supplement 1: 24–38 E Georg Thieme Verlag Stuttgart · New York ·
ISSN 0935-8943
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1
Inhaltsverzeichnis
S. Dazert 1
A. M. Mller 2
zellen adulter Gewebe grßtenteils verloren gegangen ist. Im Gegensatz zu Salamandern, bei denen nach Amputation komplett
neue Gliedmaßen gebildet werden, ist diese F'higkeit bei den
hher entwickelten S'ugern nicht mehr ausgebildet. Beim S'uger wurden adulte Stammzellen beispielsweise im Knochenmark, im Darm, in der Haut, im Muskel und auch im Gehirn
nachgewiesen. Diese gewebespezifischen Stammzellen knnen
differenzierte Zellen ihres Ursprungsgewebes regenerieren.
In der vorliegenden Arbeit soll ein Iberblick ber den aktuellen
Kenntnisstand der Biologie embryonaler und somatischer
Stammzellen gegeben und auf eine mgliche Nutzung als Ausgangszellen fr regenerative Zellsysteme in der Medizin, insbesondere in der Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, eingegangen werden.
2
Was sind Stammzellen?
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Die Evolution multizellul'rer Organismen brachte verschiedene
Strategien hervor, Gewebe und Organe effizient zu erzeugen
und zu erhalten. Ein grundlegendes Konzept geht von Stammzellsystemen als Quelle zur Bildung und Erhaltung von Geweben
aus. Gemeinsames funktionelles Merkmal aller Stammzellen ist
ihre Vermehrungsf'higkeit, d. h. neue Stammzellen zu bilden,
sowie die Charakteristik, in einzelne oder mehrere Zelltypen
mit spezifischen Funktionen zu differenzieren. Die entwicklungsbiologischen Potenziale sind in embryonalen, fetalen und
adulten Stammzellen in unterschiedlichem Maße ausgepr'gt.
Multizellul're Organ- und Gewebesysteme bestehen aus einer
Hierarchie von Stamm- und Vorl'uferzellen sowie reifen Effektorzellen (Abb. 1). Da die reifen Zellen in den Geweben meist
nur eine begrenzte Lebensdauer besitzen und letztendlich absterben, sind Stammzellen die einzigen permanent vorhandenen
Zellen. Beim S'ugetier wurden verschiedene Stammzellsysteme
u. a. im Dnndarm [1], in den Gonaden [2], in der Haut [3], im olfaktorischen Epithel [4], im Gehirn [5] und im Knochenmark,
hier sogar zwei Stammzelltypen, h'matopoetische und mesenchymale Stammzellen [6], gefunden. Weiterhin wird die Existenz
von Zellen mit Stammzelleigenschaften in der Leber diskutiert
[7].
Die genaue Lokalisation von Stammzellen in den verschiedenen
Geweben ist schwierig zu bestimmen. Es wurden diverse Zelloberfl'chenmarker entwickelt, von denen jedoch keiner alleine
eine zweifelsfreie Identifizierung von Stammzellen erlaubt. Die
Pr'senz von Stammzellen in einem Gewebe wird in der Praxis
durch den Nachweis der charakteristischen funktionellen
Stammzelleigenschaften gezeigt:
Abb. 1 Stammzellen (S) knnen auf klonaler Ebene
durch Teilungen sich selbst erneuern sowie Vorlufer
mit geringem Selbsterneuerungspotenzial bilden. Vorluferzellen (V) teilen sich weiter und differenzieren zu
reifen Effektorzellen (E). Die Fhigkeit zur Selbsterneuerung vermindert sich zunehmend von der Stammzelle
zur reifen Effektorzelle. Abk$rzungen: S: Stammzelle;
V: Vorluferzelle; E: reife Effektorzelle.
1. Die F'higkeit, sich zu teilen und neue Stammzellen zu bilden,
was als Selbsterneuerungspotenzial bezeichnet wird.
2. Die F'higkeit, alle reifen Zellen mit spezifischer Funktion eines Stammzellsystems bilden zu knnen. Es wird hier von einem Multilinien-Differenzierungspotenzial gesprochen [8].
Durch diese beiden herausragenden Eigenschaften verleihen
Stammzellen den Geweben die F'higkeit, lebenslang verbrauchte Zellen zu ersetzen und Sch'den innerhalb gewisser Grenzen
zu reparieren. Bei der Differenzierung von Stammzellen ber
Vorl'ufer hin zu reifen Effektorzellen gehen zunehmend Selbsterneuerungs- und Multilinien-Differenzierungspotenzial verloren. W'hrend Vorl'uferzellen sich zwar nicht mehr selbst erneuern knnen, besitzen sie noch die F'higkeit sich zu teilen und in
verschiedene Zelllinien zu differenzieren. Diese F'higkeiten fehlen weitestgehend bei den reifen Zellen.
Stammzellen des adulten Systems sind h'ufig langsam zyklisierende Zellen, die nicht isoliert, sondern in engem Kontakt zu speziellen Stromazellen stehen. Die Proliferation und das Iberleben
von Stammzellen ist abh'ngig von einer engen Assoziation mit
komplexen stromalen Komponenten, die regulierend wirkende
Faktoren und wichtige Zell-Zellkontakte fr das Iberleben der
Stammzellen bilden. In diesen speziellen Stammzellnischen werden Stammzellen in einem undifferenzierten Zustand gehalten.
Bei Bedarf an reifen Zellen erhalten die Stammzellen entsprechende Signale und fhren Selbsterneuerungs- oder Differenzierungsteilungen durch. Die adulten Stammzellen gehren somit
einem Regulationsnetzwerk an, das sowohl die Anzahl von
Stammzellen als auch die Produktion der fr das Iberleben des
Organismus notwendigen Menge an reifen Zellen sicherstellt.
Das zellul're und molekulare Milieu der Stammzellnische ist
selbst in dem gut charakterisierten h'matopoetischen System
nur teilweise aufgekl'rt [9].
Prinzipiell knnen Stammzellen zwei mitotische Wege beschreiten: Symmetrische Teilungen (beide Zellen nehmen das gleiche
Schicksal an) und asymmetrische Teilungen (Tochterzellen haben verschiedene Schicksale) (Abb. 2). Untersuchungen des Zellteilungsverhaltens somatischer Stammzellen zeigen, dass beide
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Neuere Daten zeigen jedoch ein modifiziertes Bild, das auch
Stammzellen aus adulten Geweben berraschend große Entwicklungsf'higkeiten zuweist. So knnen neurale und Muskelstammzellen Blutzellen bilden, w'hrend Blutstammzellen in
vivo Gehirn- und Muskelzellen erzeugen knnen. Dies zeigt,
dass gewebespezifische Stammzellen ein erstaunlich großes Entwicklungs- und Differenzierungspotenzial besitzen, wobei jedoch unklar ist, wie ausgedehnt die Entwicklungsf'higkeiten
adulter Stammzellen wirklich sind und welche Mechanismen
die Bildung gewebefremder Zelltypen untersttzen.
Abb. 2 Asymmetrische und symmetrische Teilungsmuster in der
Stammzelllinie. A. Alle Teilungen sind obligatorisch asymmetrisch.
Durch diese Art der Teilung erfolgt keine Vernderung des Verhltnisses von neu gebildeten Stammzellen (S) und Vorluferzellen (V). B.
Zwei Stammzellen sind abgebildet, die sich symmetrisch teilen und
entweder zwei neue Stammzellen oder zwei weiter differenzierte Vorluferzellen bilden.
Arten der Stammzellteilung vorkommen. Klonale Untersuchungen an isolierten h'matopoetischen Stammzellen ergaben, dass
sich diese asymmetrisch teilen [10,11], w'hrend symmetrische
als auch asymmetrische Teilungen durch Zeitraffer-Videomikroskopie bei der Teilung von neuralen Stammzellen beobachtet
wurden [12]. Die asymmetrische Zellteilung erzeugt Zellen mit
verschiedenen Schicksalen und resultiert in der Bildung einer
neuen Stammzelle und einem Vorl'ufer, der die Stammzelleigenschaften verloren hat.
S 26
3
Entwicklung von Stammzellsystemen w"hrend
der Ontogenese
Stammzellen aus verschiedenen ontogenetischen Entwicklungsstufen besitzen unterschiedliche Entwicklungsf'higkeiten, d. h.
embryonale, fetale und adulte Stammzellen bilden eine nach
den Bedrfnissen des Organismus ausgerichtete Ausstattung an
reifen Effektorzellen. Dies l'sst sich sowohl im Blut als auch im
Gehirn beobachten [13 – 15]. Das frheste Entwicklungsstadium,
die befruchtete Eizelle, wird als Zygote bezeichnet, gefolgt von
Morula (8 – 16 Zellen) und Blastozyste (100 – 200 Zellen). Die
Blastozyste wird aus der inneren Zellmasse, dem Embryoblasten
und einer ihn umgebenden Zellschicht, dem Trophoblast aufgebaut. Im Stadium der Gastrulation ordnen sich die Zellen der
Blastozyste zu den drei Keimbl'ttern (Abb. 3). In der Folge entsteht durch Zellwanderung ein Embryo, der in seiner Form erstmals dem fertig entwickelten Lebewesen 'hnelt.
4
Stammzelltypen
4.1
Embryonale Stammzellen (ES-Zellen)
ES-Zelllinien vieler Spezies knnen aus undifferenzierten Zellen
frher Embryonalstadien zum Zeitpunkt der Pr'implantationsBlastozyste gewonnen werden. Die Blastozyste besteht aus der
inneren Zellmasse und dem umgebenden Trophektoderm
(Abb. 3). Aus der inneren Zellmasse entwickelt sich der Embryo,
w'hrend das Trophektoderm an der Bildung der extra-embryonalen Gewebe, wie der Plazenta und dem Dottersack, teilnimmt.
Aus der inneren Zellmasse von Maus-Blastozysten knnen embryonale Zellen entnommen und in Zellkultur in Gegenwart des
Wachstumsfaktors LIF (leukaemia inhibitory factor) kontinuierlich wachsende ES-Zelllinien etabliert werden [18,19]. Diese ESZellen besitzen eine nahezu unbegrenzte Proliferationsf'higkeit,
sind nicht transformierte Zellen mit einem stabilen Karyotyp
und knnen sich in vitro nach Entzug von Serum und LIF in viele
verschiedene reife Zelltypen entwickeln (Abb. 4). Differenzierende ES-Zellen bilden komplexe, dreidimensionale Zellaggregate,
so genannte embryoide Krperchen (embryoid bodies), in denen
vermutlich durch spontane Differenzierung zellul're Abkmmlinge aller drei Keimbl'tter entstehen. Unter geeigneten Kulturbedingungen, wie z. B. durch Zugabe gewebespezifischer Wachstumsfaktoren, knnen bestimmte Zelltypen mit Vorl'ufereigenschaften selektiv vermehrt werden. Aus den embryoiden Krperchen entstehen z. B. nach Zugabe von Retins'ure und Insulin vermehrt Adipozyten [20], h'matopoetische Wachstumsfaktoren
lassen Blutvorl'uferzellen proliferieren, die nach Transplantation in immundefiziente Tiere sogar Lymphozyten bilden [21],
und die Zugabe lslicher Faktoren wie TGF-ß1 und BMPs (transforming growth factor-ß1, bone morphogen proteins) induziert
die Bildung von Chondrozyten [22]. Nach Zugabe neurogener
Wachstumsfaktoren in differenzierende ES-Zellkulturen werden
neurale und gliale Zellen gebildet [23]. Des Weiteren wurde
krzlich die Differenzierung von ES-Zellen zu Insulin und andere
endokrine Hormone sekretierenden Strukturen, die sogar abh'n-
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Bei der Betrachtung von Vorl'ufer-Nachkommen-Verh'ltnissen
verschiedener Stammzellsysteme ist allerdings zu beachten,
dass das generell angewandte Modell der Stamm- und Vorl'uferzellhierarchie am h'matopoetischen System etabliert wurde. Es
ist aber gegenw'rtig unklar, in wieweit dieses Modell fr Stammzellen verschiedener Systeme und Entwicklungsstadien zutrifft.
Die organspezifischen Stammzellen, wie die h'matopoetischen
und die neuralen Stammzellen, werden in der Literatur als multipotente Zellen beschrieben. Sie sind in ihrem Entwicklungspotenzial noch weiter eingeschr'nkt, da in ihnen Ver'nderungen
im Genexpressionsmuster stattgefunden haben, die sie einem
einzigen Organ- bzw. Zellsystem zuordnen [5]. So bentigen
Stammzellen aus verschiedenen adulten Geweben spezielle, gewebespezifische Wachstumsfaktoren fr ihr Iberleben und fr
die Proliferation und sie exprimieren zelltypspezifische Genexpressionsmuster [16,17].
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W'hrend die totipotente Zygote, die ultimative Stammzelle, und
jede Zelle des 8-Zellembryos den kompletten Organismus einschließlich aller intra- und extra-embryonaler Strukturen bilden
knnen, entwickeln sich aus der inneren Zellmasse von Blastozysten und den daraus isolierten pluripotenten embryonalen
Stammzellen „nur noch“ die verschiedenen Gewebetypen des
Embryos. Der Unterschied zwischen toti- und pluripotenten Zellen wird darin gesehen, dass die Zygote und die aus den ersten
Teilungen entstandenen Tochterzellen sich als Einzelzellen zu einem intakten Organismus entwickeln, w'hrend die pluripotenten embryonalen Stammzellen dies nur im Kontext eines sich
entwickelnden Embryos knnen.
fung der Zellen und Gewebe weiter Gestalt an. Aber nicht alle Zellteilungen erzeugen ausdifferenzierte Effektorzellen, sondern einige spezialisierte Zellen, so genannte Stammzellen, behalten Selbsterneuerungs- und Multilinien-Differenzierungsfhigkeiten. Whrend der Ontogenese treten Stammzellen mit unterschiedlichem Entwicklungspotenzial (toti-, pluri- und multipotente) auf.
gig von der Glukosekonzentration Insulin produzieren, von Ron
McKay u. Mitarb. berichtet [24]. Diese breiten Differenzierungsf'higkeiten von ES-Zellen der Maus lassen auch einen therapeutischen Einsatz humaner ES-Zellen erhoffen.
Auch von menschlichen Embryonen knnen Stammzellen, z. B.
innerhalb der ersten Tage nach knstlicher Befruchtung, aus der
Blastozyste entnommen und in vitro in kontinuierlich wachsende Zelllinien berfhrt werden [26]. Die so gewonnenen humanen ES-Zellen leben ber viele Generationen in Zellkultur weiter
und behalten ihre pluripotenten Eigenschaften bei [27]. Bei Bedarf lassen sich diese Zellen ggf. durch Zugabe gewebespezifischer Wachstumsfaktoren in vitro in gewnschte Effektorzellen
umwandeln.
Interessant fr grundlagenwissenschaftliche Fragestellungen ist
die Mglichkeit, durch molekularbiologische Methoden gezielt
Gene in den Kernen von ES-Zellen der Maus modifizieren zu knnen (gene targeting). Hierbei knnen einzelne Zielgene mutiert,
deletiert oder auch durch rekombinante Gene ersetzt werden.
Nach Transfer dieser modifizierten ES-Zellen in Blastozysten
und Kontribution der injizierten ES-Zellen zur Keimbahnlinie
sich entwickelnder chim'rer Tiere knnen durch Kreuzungen
Nachkommen mit vorher geplanten genetischen Modifikationen
hergestellt werden. Durch diese Strategien ist es heute mglich,
die Funktion ausgew'hlter Gene im Kontext eines sich entwickelnden Tieres zu studieren [25]. Hierbei handelt sich um eine
w'hrend der letzten Jahre vielfach angewandte Technik, die zu
wichtigen Erkenntnissen bezglich der Expression und Funktion
von Genen beigetragen hat.
Bedenken gegen eine Zellentnahme nach In-vitro-Fertilisation
bestehen u. a. darin, dass durch diesen Vorgang der Embryo zerstrt und somit die Verwendung fr eine Schwangerschaftseinleitung nicht mehr mglich ist. Hierfr sind in Deutschland die
ethisch-rechtlichen Voraussetzungen nicht gegeben und durch
das Embryonenschutzgesetz untersagt.
Die Gewinnung und Kultivierung von ES-Zellen ist im Mausmodell soweit standardisiert und optimiert, dass die meisten Arbeitsgruppen nur mit einigen wenigen etablierten murinen ESZelllinien arbeiten, ohne wiederholt auf neue Embryonen zurckgreifen zu mssen. In der Erforschung menschlicher ES-Zellen ist man aber von einem solchen hohen Grad der Standardisierung weit entfernt.
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Abb. 3 Hierarchie und Potenzial verschiedener Stammzellen whrend der Ontogenese. Im Laufe der Entwicklung differenziert die Zygote zur Morula und Blastozyste. Die Blastozyste nistet sich in die Gebrmutter ein und durchluft die Gastrulation, bei der die drei Keimbltter (Ekto-, Meso-, Entoderm) gebildet werden. Der Embryo nimmt
durch den Prozess der Organogenese sowie durch Wachstum und Rei-
S 28
4.2.1 Hmatopoetische Stammzellen
Das h'matopoetische System stellt das bisher bestcharakterisierte Stammzellsystem dar. H'matopoetische Stammzellen
kommen zu verschiedenen Entwicklungsstadien in unterschiedlichen Geweben, wie dem Dottersack, der dorsalen Aorta, der fetalen Leber und dem Knochenmark, vor [13, 28]. Sie sind insgesamt ein seltener Zelltyp und finden sich im adulten Knochenmark von M'usen mit einer H'ufigkeit von etwa 1/10– 4 bis
1/10– 5. Dank einer Reihe funktioneller Tests und einer großen
Anzahl monoklonaler Antikrper, die Zelloberfl'chenepitope
verschiedener Blutzellen erkennen, kann dieser seltene Zelltyp
bis fast zur Homogenit't angereichert werden (Abb. 5). Das
hohe regenerative Potenzial dieser Zellen kann daraus ersehen
werden, dass eine Injektion von 20 – 40 aus dem Knochenmark
adulter M'use isolierter h'matopoetischer Stammzellen alle h'mato-lymphoiden Zelllinien letal bestrahlter Tiere lebenslang
repopulieren kann [29]. Die Aufreinigung dieses potenten Zelltyps erlaubt Studien, in denen die molekularen Zusammenh'nge
hinsichtlich der Entstehung, Proliferation und Differenzierung
von Stammzellen gekl'rt werden knnen. Deshalb ist es nicht
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4.2
Somatische (adulte) Stammzellen
Somatische Stammzellen sind gewebespezifische Vorl'uferzellen, die im adulten Organismus die F'higkeit zur Selbsterneuerung sowie zur Differenzierung in verschiedene reife Effektorzellen besitzen. Die Bildung spezialisierter Zelltypen ist nicht nur
w'hrend der Entwicklung, sondern auch im ausgewachsenen Organismus erforderlich, denn durch natrlichen Zelltod, Degeneration und Trauma mssen Zellen permanent ersetzt werden.
Regenerative Vorl'uferzellen finden sich im adulten S'ugetierorganismus in vielen Geweben mit hohem Zellumsatz wie z. B. in
der Haut, in der Darmwand und im Knochenmark. Aber auch in
Geweben mit niedrigeren Umsatzraten wie dem Nervensystem
wurden somatische Stammzellen gefunden. Eine weitere Quelle
zur Gewinnung adulter Stammzellen stellt das Nabelschnurblut
dar, das nicht nur h'matopoetische, sondern auch mesenchymale Stammzellen enth'lt. Bisher wurden etwa 20 verschiedene
Haupttypen adulter Stammzellen in S'ugern gefunden.
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Abb. 4 Embryonale Stammzellen. Bei der
Etablierung von ES-Zelllinien der Maus werden etwa am dritten Tag nach der Befruchtung die Blastozysten, die zu diesem Zeitpunkt aus dem Trophektoderm und der inneren Zellmasse bestehen, aus dem Ovidukt
herausgesp$lt und auf embryonale Stromazellen ausplattiert. Die embryonalen Stromazellen produzieren u.a den Wachstumsfaktor
LIF, der die ES-Zellen, die aus der inneren
Zellmasse hervorgehen, in einem undifferenzierten Zustand halten. Nach Verminderung
der Serumkonzentration und Entzug von LIF
differenzieren die ES-Zellen zu embryoiden
Krperchen, die eine Vielzahl verschiedener
Zelltypen enthalten.
verwunderlich, dass in den zurckliegenden Jahren eine Reihe
von Genen identifiziert und beschrieben wurden, die fr die Entwicklung h'matopoetischer Stammzellen, z. B. die Tyrosinkinase
Flt-1 [30] und der Transkriptionsfaktor tal-1/SCL [31]), wichtig
sind. Andere Genprodukte beeinflussen die Stammzellmigration
(ß1 und a4Integrin [32, 33]), w'hrend LIF [34] oder Interleukin-6
[35] die Anzahl der Stammzellen regulieren. Des Weiteren wurde von Ihor Lemischka u. Mitarb. das genetische Programm
h'matopoetischer Stammzellen durch DNA-Chip-Analyse untersucht [16].
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Obwohl die Mglichkeiten der funktionellen Analyse humaner
h'matopoetischer Stammzellen gegenber Stammzellen aus
dem Tiermodell eingeschr'nkter sind, stehen auch fr deren
Analyse monoklonale Antikrper zur Verfgung. Humane h'matopoetische Stammzellen verschiedener Entwicklungsstadien
befinden sich in der LIN–, CD34+, CD38– Zellfraktion. Durch limitierende Verdnnung wurde gefunden, dass sich eine humane
h'matopoetische Stammzelle in 617 LIN–, CD34+, CD38– befindet,
die das Blutsystem speziell konditionierter Versuchstiere repopulieren kann [36]. Krzlich wurde berichtet, dass ein Antikrper gegen den KDR-Rezeptor (vascul're endotheliale Wachstumsfaktor Rezeptor 2) in Kombination mit Antikrper gegen
CD34 humane h'matopoetische Stammzellen noch selektiver
anreichern kann [37].
Die Anreicherung humaner h'matopoetischer Stammzellen ist
eine essenzielle Voraussetzung fr eine zell- und molekularbiologische Untersuchung dieses wichtigen Zelltyps und besitzt
große klinische Relevanz im Rahmen der Entfernung von Tumorzellen aus Zelltransplantaten wie auch bei der Gentherapie ausgehend von h'matopoetischen Stammzellen [38].
4.2.2 Neurale Stammzellen
Obwohl bis vor kurzem die Lehrmeinung galt, dass die Neurogenese, die eine Proliferation neuraler Vorl'uferzellen voraussetzt,
nach der Geburt beendet sei, wurden neurale Stammzellen in der
subventrikul'ren Zone und im Hippocampus des adulten Gehirns von S'ugern nachgewiesen [39]. Diese neuralen Stammzellen knnen auf klonaler Ebene zum einen neue Stammzellen bilden und zum anderen zu den drei Hauptzelltypen des zentralen
Nervensystems, Astrozyten, Oligodendrozyten und Neurone, differenzieren [40, 41]. Neurale Stammzellen sind neuroektodermalen Ursprungs und entstehen zuerst im sich entwickelnden Neu-
ralrohr. Davis und Temple kultivierten aus dem embryonalen
Rattenhirn gewonnene Einzelzellsuspensionen und erhielten
multipotente Zellen, die in alle neuralen Zelltypen differenzieren
konnten sowie Selbsterneuerungspotenzial besaßen [42]. Dieses
Verhalten entsprach den charakteristischen Eigenschaften von
Stammzellen. Shnliche Aktivit'ten ließen sich in Zellen nachweisen, die aus dem embryonalen Neuralrohr und dem fetalen
Gehirn von M'usen isoliert wurden (Abb. 6).
Neuronale Stammzellen knnen im Unterschied zu h'matopoetischen Stammzellen, deren effektive Vermehrung sich in in vitro-Kultursystemen als schwierig herausgestellt hat [43], in Zellkultur vermehrt werden. Neuronale Stammzellen des fetalen
und adulten Gehirns konnten in Gegenwart von bFGF (basic fibroblast growth factor) und EGF (epidermal growth factor) in vitro
zur Proliferation angeregt werden. Diese Zellen durchlaufen
Selbsterneuerungsteilungen und besitzen Differenzierungspotenzial zur Bildung neuronaler, astrozyt'rer und oligodendrozyt'rer Zelltypen [40, 44].
Weitere Untersuchungen zeigten die Pr'senz aktiv proliferierender Zellen in verschiedenen Bereichen des sich entwickelnden
zentralen Nervensystems und sogar noch im erwachsenen Gehirn. Dort waren sie z. B. im subventrikul'ren Bereich und im
Hippocampus lokalisiert [39]. Diese Beobachtungen zeigten,
dass sowohl im fetalen als auch im adulten Gehirn neurale Vorl'ufer und Stammzellen vorkommen.
Die Pr'senz von Stammzellen im adulten Gehirn ist bisher nicht
ad'quat in unsere Vorstellung von der Funktionsweise des Gehirns integriert worden, dessen Nervenzellen lange Zeit als postmitotisch angesehen wurden. Als mgliche Aufgabe dieser
Stammzellen wird u. a. diskutiert, dass das adulte Gehirn fr
Lern- und Ged'chtnisfunktionen eine begrenzte Kapazit't der
Selbsterhaltung bzw. Selbsterneuerung bentigt [5]. Die Stimulation der Neurogenese durch Umweltreize unterstreicht diese
Vermutung [45].
4.2.3 Mesenchymale Stammzellen
Neben den Stammzellen des Blutes enth'lt das Knochenmark
und das Nabelschnurblut auch nicht h'matopoetische Zellen
mesenchymalen Ursprungs. In den 70er Jahren konnten bereits
Fibroblasten-'hnliche Vorl'uferzellen aus Knochenmarksaspiraten isoliert werden [46]. In sp'teren Versuchen wurden Einzel-
S 29
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Abb. 5 Hmatopoetische Stammzellen.
Hmatopoetische Stammzellen werden aus
dem Knochenmark adulter Tiere $ber eine
positiv-negativ Selektionsstrategie durch
monoklonale Antikrper isoliert. In einem
ersten Schritt werden durch Antikrper, an
die kleine Magneten gebunden sind, die
reifen Zellen depletiert. Die Zellen, die nicht
gebunden wurden (LIN– Zellen), werden mit
zwei weiteren Antikrpern, von denen der
eine gegen die Rezeptortyrosinkinase c-kit
und der andere gegen das Stammzellantigen
Sca-1 gerichtet ist, durchflusszytometrisch
aufgetrennt. Hmatopoetische Stammzellen
aus dem murinen Knochenmark besitzen den
Phnotyp LIN–, c-kit+, Sca-1+ (eingerahmte
Zellpopulation).
Abb. 7 Plastizitt somatischer Stammzellen.
In der Maus wurde durch Transplantationsversuche mit verschiedenen somatischen
Stammzellen beobachtet, dass somatische
Stammzellen nicht nur Zellen ihres Ursprungsgewebes, sondern auch reife Effektorzellen fremder Gewebe erzeugen knnen
(horizontale Linien). Hierbei knnen sogar
Keimblattgrenzen $bersprungen werden,
wenn z. B. neurale Stammzellen des Gehirns
zu Blut- und Muskelzellen differenzieren.
S 30
5
Plastizit"t somatischer Stammzellen
Bisher bestand die allgemeine Auffassung, dass das Differenzierungspotenzial somatischer Stammzellen auf nur ein Stammzellsystem beschr'nkt sei, d. h. h'matopoetische Stammzellen bilden Blutzellen etc. Arbeiten der letzten drei Jahre haben jedoch
gezeigt, dass eine Reihe somatischer Stammzellen ein grßeres
Entwicklungspotenzial besitzen als bisher angenommen. Zum
einen konnte Plastizit't innerhalb eines Stammzellsystems beobachtet werden, als z. B. in adulten h'matopoetischen Stammzellen nach Transplantation in embryonale Mikroumgebungen
embryonale Eigenschaften reaktiviert wurden [49], zum anderen
erfolgte nach Transplantation hoch angereicherter Stammzellen
die Bildung gewebefremder Zellen (Abb. 7). So konnten neurale
Stammzellen, gewonnen aus dem Gehirn fetaler und adulter
M'use, auch nach monatelanger In-vitro-Kultur das h'matopoetische System bestrahlter Empf'ngertiere besiedeln und sowohl
myelo-erythroide als auch lymphoide Zelllinien entwickeln [50].
Neben einer ekto- zu mesodermaler Transformation neuraler
Stammzellen der Maus konnten menschliche und murine neurale Stammzellen auch in vitro und in vivo Muskelzellen bilden [51].
Des Weiteren zeigten sowohl prim'r isolierte als auch kultivierte
Muskelstammzellen nach Transfer in bestrahlte Empf'ngertiere
ein h'matopoetisches Differenzierungspotenzial [52, 53].
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zellsuspensionen aus dem Knochenmark in Kulturschalen plattiert und nach mehreren Stunden Inkubationszeit alle nicht-adh'renten Zellen ausgewaschen. Die verbleibenden Zellen bildeten innerhalb weniger Tage Kolonien, die u. a. zu Adipozyten,
Chondrozyten, Osteoblasten, Myoblasten, Kardiomyozyten sowie Stromazellen differenzieren konnten [47]. Pittenger u. Mitarb. konnten aus dem Knochenmark freiwilliger Spender Zellen
entnehmen, die die Kriterien mesenchymaler Stammzellen erfllten [48]. Diese Zellen wiesen in vitro einen stabilen Ph'notyp
auf und verblieben als einlagige Zellschicht in der Kulturschale.
Durch Zugabe gewebespezifischer Stimulatoren konnte aus diesen Zellen eine Differenzierung in Fett-, Knorpel- und Knochengewebe eingeleitet werden, w'hrend die Inkubation von Kontroll-Fibroblasten keine mesenchymale Differenzierung zeigte
[48]. Die in der letztgenannten Arbeit beschriebenen mesenchymalen Stammzellen besitzen somit sowohl die F'higkeit zur
Selbsterneuerung als auch zur Differenzierung in verschiedenartige Gewebezellen. Die Kultivierung und selektive Differenzierung l'sst wichtige Erkenntnisse ber molekulare Mechanismen
dieser Zelldifferenzierung erwarten und auf neue Therapieans'tze fr die Wiederherstellung traumatisierter oder erkrankter Gewebe ausgehend von mesenchymalen Stammzellen hoffen.
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Abb. 6 Isolation und Kultur neuraler
Stammzellen. a Zur Isolation neuraler
Stammzellen wird das Vorderhirn Tag 15 alter
Mausembryonen isoliert und in eine Einzelzellsuspension $berf$hrt. In Gegenwart der
neuralen Wachstumsfaktoren EGF (epidermal
growth factor) und bFGF (basic fibroblast
growth factor) bilden neuronale Stammzellen
kleine K$gelchen, so genannte Neurosphren.
b Werden die Neurosphren vereinzelt, so
knnen ausgehend von einer Zelle nach Teilung sowohl eine neue Neurosphre als auch
Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten
entstehen. Gezeigt ist eine zelltypspezifische
Immunfrbung.
Die Wissenschaft ist allerdings selbst im Tiermodell weit davon
entfernt, Stammzellen gezielt und in ausreichenden Mengen in
Zellen anderer Stammzellsysteme umwandeln zu knnen. Es
wird also noch eine Zeit dauern, bis die Plastizit't somatischer
Stammzellen gezielt eingesetzt werden kann.
6
Anwendung der Stammzellbiologie
in der HNO-Heilkunde
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Stammzellen werden als Quelle der embryonalen Entwicklung
des Organismus angesehen und sind, wie bereits erw'hnt,
grundlegend an der Erhaltung und Regeneration adulter Zellsysteme beteiligt. Es konnte inzwischen gezeigt werden, dass eine
große Anzahl an Geweben dem Differenzierungsmodell ausgehend von einer Stammzelle ber eine Progenitorzelle zur reifen
Effektorzelle folgen. Hierzu gehren u. a. das Blutzell-, das periphere und zentrale Nerven- und Skelettmuskelsystem. Es ist
denkbar, dass s'mtliche Organe und Gewebe des Krpers aus
Stammzellen entstanden sind und im adulten Zustand Stammzellen enthalten, die zur Regeneration des betroffenen Zellsystems angeregt werden knnten. Eine mgliche Bedeutung der
Stammzellbiologie fr die Hals-Nasen-Ohrenheilkunde soll an
einigen Beispielen erl'utert werden.
6.1
M2gliche Bedeutung der Stammzellbiologie f3r
die HNO-Heilkunde am Beispiel des Innenohres
Die neuen Erkenntnisse der Stammzellbiologie scheinen im Hinblick auf eine Anwendung am Menschen insbesondere fr Zellsysteme ohne bekanntes Regenerationsvermgen, wie z. B. die
cochle'ren Haarzellen und Spiralganglienzellen des Innenohres,
von Interesse zu sein. Die genannten Zellen entstehen w'hrend
der Embryonalentwicklung aus entsprechenden Vorl'uferzellen,
deren postnatale Reaktivierung und Differenzierung in Effektorzellen beim S'ugetier bisher nicht gelungen ist. Eine Sch'digung
cochle'rer Haarzellen z. B. durch L'rmeinwirkung oder Aminoglykosidantibiotika fhrt somit zu einer dauerhaften L'sion mit
Ausbildung einer Hrminderung bis hin zur Taubheit. Bei anderen Spezies, z. B. bei Vgeln, ist eine Haarzellregeneration nach
Zelluntergang beim erwachsenen Tier mglich [59, 60], so dass
prinzipielle Mechanismen fr die Differenzierung von Sinneszellen aus Vorl'uferzellen auch im adulten Organismus etabliert zu
sein scheinen. Aus Untersuchungen an Nervenzellen des Riechepithels, die beim Menschen permanent erneuert werden [4], ergibt sich, dass grunds'tzlich eine Neuroneogenese auch im adulten Gehirn der S'uger mglich ist. Im olfaktorischen System
konnte gezeigt werden, dass die Neubildung der Nervenzellen
von Stammzellen ausgeht, die sich weiter teilen und so neue Vor-
l'uferzellen generieren, die selbst zu postmitotischen Nervenzellen differenzieren knnen [60].
Interessanterweise regulieren lsliche Faktoren, die wesentlich
an der Differenzierung neuraler Stammzellen beteiligt sind,
auch das Iberleben und die Neuritogenese verschiedener cochle'rer Zellen wie z. B. der Haarzellen, Sttzzellen und Spiralganglienzellen. Auf die Bedeutung dieser externen Faktoren fr Innenohrgewebe soll im folgenden Abschnitt n'her eingegangen
werden. Die Aufkl'rung der mit diesen Differenzierungswegen
assoziierten Substanzen und Faktoren sowie die damit verbundenen molekularen Mechanismen knnten neue kausale Behandlungsmethoden fr angeborene oder erworbene Innenohrerkrankungen erffnen.
6.1.1 Bedeutung neurotropher Faktoren und anderer
Molek!le f!r Differenzierung und Funktionserhalt
cochlerer Zellen
Auch wenn aus der Mauscochlea Zelllinien mit Progenitoreigenschaften etabliert werden konnten [61, 62], war eine Identifikation von Stammzellen oder stammzell'hnlichen Vorl'uferzellen
im Innenohr von S'ugern bisher nicht sicher mglich. Aus der
Vogelcochlea weiß man jedoch, dass eine Haarzellregeneration
im adulten Tier mglich ist, so dass hier das Vorhandensein proliferations- und differenzierungsf'higer Vorl'uferzellen postuliert werden kann. Untersuchungen der letzten 10 Jahre am S'uger haben gezeigt, dass das Iberleben und die Wachstumsstimulation cochle'rer Zellen von dem Vorhandensein verschiedener
externer Faktoren, wie z. B. Wachstumsfaktoren, Integrine und
extrazellul're Matrixproteine, abh'ngt, die auch fr die Proliferation und Differenzierung neuraler Stammzellen eine entscheidende Rolle spielen [5].
S 31
Im sensorischen Epithel der Rattencochlea wurde die Expression
von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie, wie Neurotrophin-3
(NT-3) und Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF), gezeigt
[63, 64]. In Spiralganglienneuronen und Haarzellen der Ratte
konnte der Nachweis einer Fibroblast Growth Factor (FGF)-1und FGF-2-Expression erbracht werden [65]. In vivo wurde durch
cochle're Applikation von NT-3 und BDNF eine Protektion von
Spiralganglienneuronen gegen Aminoglykosidsch'digung erreicht [66 – 68]. In transgenen Tieren mit Genmutationen fr
NT-3 und BDNF zeigte sich eine signifikant geringere Anzahl dieser Neurone im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren [69, 70].
In eigenen Zellkulturuntersuchungen konnte nachgewiesen werden, dass Mitglieder der FGF-Familie w'hrend der Neonatalphase der Ratte konzentrations- und zeitabh'ngig auf das Wachstumsverhalten cochle'rer Haarzellen, Sttzzellen und Spiralganglienzellen Einfluss nehmen. Die biologische Wirkung der
FGFs wird ber transmembran're, hochaffine FGF-Rezeptoren
vermittelt, die die genannten Zellen auf ihrer Zelloberfl'che tragen. W'hrend der ersten Lebenstage ließ sich ein unterschiedliches FGF-Rezeptorenmuster auf den Haarzellen nachweisen, wodurch ein mglicher Regulationsmechanismus fr die Innenohrentwicklung zur Verfgung steht [71]. Die FGF-Rezeptorenausstattung der Haarzellen f'llt zeitlich mit der Synapsenbildung
zwischen Haarzellen und Spiralganglienzellen zusammen, so
dass von einer Beteiligung des FGF-Rezeptor-Systems an der Innervation des sensorischen Epithels ausgegangen werden kann.
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Ein weiteres Beispiel fr die Plastizit't des Entwicklungspotenzials somatischer Stammzellen sind Knochenmarkszellen, die
sowohl an der Leberregeneration [54] als auch an der Bildung
von mikro- und makroglialen Zellen im Gehirn adulter M'use
teilnahmen [55]. Ebenfalls wanderten Knochenmarkzellen nach
Transplantation in M'use ins Gehirn und bildeten dort neurale
Zelltypen [56]. Von potenziell großem therapeutischen Nutzen
scheinen h'matopoetische Stammzellen, die „Allesknner“ aus
dem Knochenmark auch deshalb zu sein, da sie nach Transplantation in ein myokardiales Infarktmodell neue Myokardzellen
bildeten [57] und nach Injektion die Leber besiedelten und dort
leberspezifische biochemische Funktionen ausfhrten [58].
Abb. 9 Stimulation der Spiralganglien-Neuritogenese durch FGF. Neurofilament-markierte Kulturen von Spiralganglienexplantaten
nach 48-st$ndiger Inkubation mit a FGF-1
(100 ng/ml) und b Kontrolle ohne FGF-1.
Nach FGF-1-Inkubation zeigte sich eine signifikante Zunahme der Neuritenaussprossung.
Balken = 200 Gm. Die Mikrophotos c und d
zeigen die Interaktionen der Spiralganglienneuriten mit FGF-1-produzierenden Zellen (F)
und Kontrollzellen (K). Die Neuriten wuchsen
in Richtung der FGF-1-produzierenden Zellen
(c), whrend Kontrollzellen ignoriert wurden
(d). Balken = 50 Gm.
S 32
In unserer Arbeitsgruppe konnte weiterhin gezeigt werden, dass
FGF-1 das Auswachsen von Spiralganglienneuriten konzentrationsabh'ngig frderte und die Wachstumsrichtung der aussprossenden Nervenfasern beeinflusste [74] (Abb. 9). Das FGF-Rezept-
or-System scheint somit wesentlich an der Entwicklung und Erhaltung der S'ugetiercochlea beteiligt zu sein, so dass diese
Gruppe von Wachstumsfaktoren auch als Signalmolekle fr
die Proliferation und Differenzierung cochle'rer Stammzellsysteme von Bedeutung sein knnte.
Neben den genannten lslichen Faktoren wird das Neuritenwachstum auch durch lokalisierte Molekle der extrazellul'ren
Matrix (EZM) beeinflusst. Hierzu z'hlen u. a. die Glycoproteine
Laminin (LN), Tenascin (TN) und Fibronectin (FN), die w'hrend
der Innenohrentwicklung lokal und zeitlich dynamisch in der
S'ugetiercochlea exprimiert werden [75, 76]. In eigenen in-vitroUntersuchungen wurde dargelegt, dass LN die Neuritenaussprossung von Spiralganglienzellen in Anzahl und L'nge stimulierte,
FN selektiv die Neuritenl'nge beeinflusste und TN keinen Effekt
auf das Neuritenwachstum aufwies (Aletsee u. Mitarb., nicht
publiziert). Die Interaktionen zwischen Spiralganglienzellen
und Matrixmoleklen sind von der Bindung spezifischer EZMDom'nen mit den zellul'ren Rezeptoren abh'ngig. Die grßte
Gruppe der EZM-Rezeptoren stellen die Integrine dar. Untersu-
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Von klinischem Interesse sind die Befunde an Explantaten des
Cortischen Organs neugeborener Ratten, an denen sich nach
Applikation von FGF-2 eine Protektion 'ußerer Haarzellen gegenber einer ototoxischen Sch'digung durch Aminoglykosidantibiotika nachweisen ließ [72] (Abb. 8). Da 'ußere Haarzellen gegenber verschiedenen Sch'digungsparametern deutlich empfindlicher reagieren als innere Haarzellen, erffnen sich hierdurch mgliche Behandlungsstrategien zum Hrerhalt gef'hrdeter Patienten. Es bestehen bereits Hinweise, dass gesch'digte
Haarzellen vermehrt FGF-Rezeptoren ausbilden und auf diese
Weise einer protektiven Wirkung der FGFs zug'nglich werden
[73]. Betrachtet man die FGF-Rezeptorausbildung als eine generelle Antwort der Haarzelle auf Stress, k'men die Mitglieder der
FGF-Familie zur Vorbeugung eines Haarzellverlustes auch beim
Menschen infrage.
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Abb. 8 Haarzellprotektion durch FGF. Die
laserkonfokalen Mikrophotos zeigen mit
Phalloidin-Rhodamin markierte Haarzellen
des Cortischen Organs der neugeborenen
Ratte. a In-vivo-Kontrolle an Tag 8 mit
normaler dreireihiger Anordnung der ußeren
Haarzellen (>HZ), einer Reihe innerer Haarzellen (IHZ) und regelrechter Stereozilienanordnung. b In-vitro-Kontrolle nach vier
Tagen in Zellkultur mit hnlichem Zellmuster.
c Cortisches Organ nach zweitgiger Neomycinbehandlung mit einer etwa 50 %igen
Zerstrung der >HZ und Verlust der normalen
Stereozilienmorphologie der $berlebenden
>HZ und IHZ. d Cortisches Organ nach zweitgiger Koinkubation mit Neomycin und
FGF-2 (500 ng/ml) mit regelrechter Haarzellanordnung, jedoch einer Stereoziliendesorganisation der IHZ wie nach alleiniger Neomycinexposition.
Intrazellul'r scheint das LN-induzierte L'ngenwachstum der
Spiralganglienneuriten ber eine Ras/MEK/ERK-Kaskade (intrazellul're Signaltransduktionswege) vermittelt zu werden, w'hrend Vorg'nge, die zu erhhten Neuritenzahlen fhren, Ras-unabh'ngig ber andere MEK/ERK-gekoppelte Pfade laufen (Aletsee u. Mitarb., nicht publiziert).
6.1.2 Ist eine Regeneration sensorischer und neuraler
cochlerer Zellen aus Stammzellen vorstellbar?
W'hrend bei Vgeln eine permanente Regeneration cochle'rer
Haarzellen nach entsprechender Zellsch'digung, z. B. durch
Gabe von Aminoglykosidantibiotika, erfolgt, ist eine solche
Nachproduktion sensorischer Haarsinneszellen in der S'ugetiercochlea bisher nicht gesehen worden. Eine Haarzellsch'digung
fhrt beim S'uger zu irreparablen cochle'ren Ver'nderungen
mit bleibender Hrminderung. Ein Haarzelluntergang kann in
der Folge zu einem sekund'ren Zelluntergang der Spiralganglienneurone fhren, da fr das Zellberleben der Neurone von
den Haarzellen sezernierte neurotrophe Faktoren nicht mehr
zur Verfgung stehen. Eine Haarzell- und Spiralganglienzellregeneration aus pluri- oder multipotenten Vorl'uferzellen w're somit von besonderem klinischen Interesse.
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Im Vogelinnenohr konnte nach Haarzellsch'digung gezeigt werden, dass aus Sttzzellpopulationen neue Haarsinneszellen regeneriert werden knnen, die sowohl neuronale Kontakte mit den
sie innervierenden Spiralganglienzellen herstellten, als auch
ber ihre Stereozilien mit der Tektorialmembran in Verbindung
traten [78]. Die adulte Vogelcochlea verfgt offensichtlich ber
multipotente Vorl'uferzellen mit Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenzial. Iber die molekularen Mechanismen dieser Reparations-/Regenerationsprozesse ist bisher nur wenig bekannt und es werden verschiedene Modelle diskutiert:
1. Aus multipotenten Vorl'uferzellen werden durch Proliferation und Differenzierung neue Haarzellen und Sttzzellen gebildet.
2. Aus Sttzzellen entstehen neue Haarzellen ber eine De-/
Transdifferenzierung.
3. Reparation gesch'digter Haarzellen fhrt wieder zu intakten,
funktionsf'higen Sinneszellen.
Um auch beim S'ugetier eine Haarzellregeneration aus Vorl'uferzellen zu induzieren, w're zun'chst die Identifikation und
Charakterisierung solcher Zellen erforderlich. Bei der Haarzellentwicklung w'hrend der Fetalphase wird angenommen, dass
undifferenzierte Zellen des sensorischen Epithels, die als multipotente Progenitorzellen angesehen werden, sich sowohl zu
Haarzellen, als auch zu Sttzzellen entwickeln knnen. Diese
Vorl'ufer oder Stammzellen knnen bisher nicht isoliert und damit auch nicht n'her analysiert werden. Es existieren jedoch einige Informationen ber die molekularen Schalter, die die Haarzellentwicklung regulieren. Die Entscheidung, welchen Differenzierungsweg die Vorl'ufer oder Stammzellen einschlagen werden, h'ngt von der Expression zellspezifischer Signalprozesse
ab, die bisher nur unvollkommen verstanden sind. Eine wichtige
Rolle scheint in dieser frhen Entwicklungsphase dem Trans-
kriptionsfaktor Math1 zuzukommen, der fr die Determination
einer Vorl'uferzelle sich in eine Haarzelle zu entwickeln entscheidend ist [79, 80]. Weitere Transkriptionsfaktoren, die die
frhe Haarzelldifferenzierung beeinflussen, sind die Notch- und
Delta-Signalmolekle. Mausmutanten ohne den Deltafaktor Jagged1 bilden weniger Haarzellen als entsprechende Kontrolltiere,
was auf eine wichtige Funktion von Jagged1 bei der Haarzellgenese hinweist [81].
Sobald die Entscheidung einer cochle'ren Vorl'uferzelle getroffen ist, den Differenzierungsweg in Richtung Haarzelle einzuschlagen, wird ein weiterer Transkriptionsfaktor, Brn-3.1, bedeutungsvoll. Die Brn-3-Gruppe der IV-POU-Dom'ne-Transkriptionsfaktoren ist entscheidend an cochle'ren Differenzierungsvorg'ngen beteiligt und wird bei der Maus erstmalig zwischen dem
13. und 14. Embryonaltag exprimiert [82, 83]. Bei Inaktivierung
der Brn-3-Gene findet in den entsprechenden Tieren keine Differenzierung cochle'rer und vestibul'rer Haarzellen statt und Spiralganglienzellen weisen Struktur- und Migrationsdefizite auf.
Das Gen fr Brn-3.1 ist das erste, das eindeutig mit der Haarzelldifferenzierung assoziiert werden kann und auch im erwachsenen Tier exprimiert wird, was auf eine Bedeutung fr die Erhaltung auch der differenzierten Haarzelle hinweist. Eine Mutation
dieses Gens scheint auch fr die nicht-syndromassoziierte Innenohrschwerhrigkeit mit dem DFNA15-Ph'notyp verantwortlich zu sein [84]. Brn-3.1 wird innerhalb der Cochlea exklusiv in
Haarzellen exprimiert und kann somit als Marker fr Haarzellvorl'ufer bercksichtigt werden [62].
Im Anschluss an die Identifikation cochle'rer Vorl'uferzellen
w're die Stimulation zur Haarzelldifferenzierung erforderlich.
Mitglieder der FGF-Familie, die auch protektiv und wachstumsstimulierend auf adulte cochle're Zellen wirken, gelten als molekulare Trigger, die diese Regenerationsprozesse aus Vorl'uferzellen induzieren und aufrechterhalten [85 – 87]. Weiterhin ergab
sich der Hinweis, dass durch die Eliminierung von Zellzyklus-Inhibitoren wie p27(Kip1) ein Wiedereintritt cochle'rer Sttzzellen in die Proliferationsphase mglich ist [88]. Durch die Identifizierung und Charakterisierung wichtiger molekularer Schalter
fr die Haarzellentwicklung liegen somit Regulatoren vor, die
fr die weitere Erforschung und die gezielte Erzeugung von
Haarzellen aus Stammzellen bzw. aus undifferenzierten Vorl'uferzellen eingesetzt werden knnten.
6.1.3 M*glichkeiten zur Erzeugung autologer Stammzellen
Verschiedene Strategien sind denkbar, nach denen eine autologe
Regeneration verschiedener somatischer Zelltypen stattfinden
knnte (Abb. 10):
1. Die bereits o. g. Reaktivierung endogener Regenerationsprozesse, wie sie beim Haarzellersatz im Innenohr von Vgeln
gesehen wurde.
2. Nach der Isolation krpereigener somatischer Stammzellen
und falls mglich nach De- bzw. Transdifferenzierung dieser
Zellen knnte durch Zugabe spezifischer Gewebefaktoren
eine Differenzierung in die gewnschten reifen Zelllinien eingeleitet werden.
3. Die Erzeugung autologer Zellen in beliebiger Menge knnte
durch Transfer somatischer Zellkerne in entkernte Eizellen erfolgen (therapeutisches Klonen).
S 33
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chungen an Spiralganglienexplantaten deuten darauf hin, dass
vor allen das anb3-Integrin das Neuritenl'ngenwachstum beeinflusst, w'hrend b1-Rezeptoren an der Regelung des Gliazellwachstums beteiligt sind [77].
S 34
Bei der dritten Strategie werden nach Kerntransfer in eine entkernte Oozyte und nach Bildung einer Blastozyste so genannte
individualspezifische ES-Zellen erzeugt. Diese klonierten ES-Zellen sind mit dem Genom des Kernspenders identisch und knnen durch Zugabe entsprechender Faktoren zu reifen Effektorzellen differenzieren, die nach Ibertragung auf den entsprechenden Kernspender keine Abstoßungsreaktion hervorrufen.
Die große Differenzierungsf'higkeit humaner ES-Zellen stellt somit zusammen mit dem Nachweis, dass Kerne somatischer Zellen durch Kerntransfer in entkernte Eizellen reprogrammiert
werden knnen und ihre volle Entwicklungsf'higkeit wiedererlangen [92], in Kombination mit der ES-Zelltechnologien die
prinzipielle Mglichkeit dar, autologes Zellmaterial in beliebigen
Mengen zu gewinnen.
In der Tat wurden Zellen mit vielen Charakteristika muriner ESZellen von Thomson u. Mitarb. aus humanen Blastozysten isoliert, die im Rahmen einer in-vitro-Fertilisation gewonnen wurden [26]. Aus vierzehn inneren Zellmassen konnten fnf humane
ES-Zelllinien etabliert werden, von denen drei einen normalen
Karyotyp besaßen. Diese pluripotenten Zellen proliferierten in
vitro ber viele Monate und konnten in Derivate der drei Keimbl'tter differenzieren. Sie bildeten in vitro u. a. Darmepithelzellen, Knorpel, Knochen, Muskel und Neuroepithel. Eine ausgedehnte Studie zeigte, dass humane ES-Zellen je nach Wachstumsfaktorzugabe in vitro in elf verschiedene Zelltypen differenzieren konnten [27].
Embryonale Keimzellen (embryonic germ (EG) Zellen) mit 'hnlichen Eigenschaften wurden auch aus den Vorl'ufern von Ei- und
Samenzellen, den so genannten primordialen Keimzellen 5 – 9
Wochen alter humaner Embryonen gewonnen [93].
Die Beobachtungen, dass humane ES-Zellen große Differenzierungsf'higkeiten besitzen, wurden mit Euphorie aufgenommen,
weil es nun mglich erschien, die seit langem bekannten Befunde der Differenzierung von ES-Zellen der Maus auf den Menschen zu bertragen und damit eine Vielzahl somatischer Zellen
humanen Ursprungs in beliebigen Mengen zu generieren. Der
Nachweis, dass aus ES-Zellen differenzierte und selektiv gewonnene gewebespezifische Stamm- und Vorl'uferzellen nach
Transplantation im Organismus von Versuchstieren tats'chlich
gewebespezifisch integrieren und defekte Organfunktionen
bernehmen knnen, konnte im Blut und im zentralen Nervensystem demonstriert werden [21, 23].
Die genannten F'higkeiten von ES-Zellen im Tiermodell weisen
auf die potenziellen Mglichkeiten der ES-Zelltechnologie fr
den Gewebeersatz im adulten Organismus hin. Hierbei scheint
es realistisch, dass sowohl durch die ES-Zelltechnologie hergestellte Stamm- und Vorl'uferzellen als auch reife Effektorzellen
sich nach Transfer in kranke Gewebe in die Architektur bestehender Organe und Gewebe integrieren und therapeutisch wirksam werden. Auch ist es denkbar, dass selbstorganisierende
Stammzellsysteme, wie die Haut oder das h'matopoetische System, erfolgreich rekonstituiert werden knnen. Jedoch ist es aus
heutiger Sicht nicht vorstellbar, dass komplexe Organe, wie Gehirn, Herz oder Niere durch den Einsatz embryonaler oder adulter Stammzellen de novo entstehen knnen. Hierzu mssten Prozesse ablaufen, wie sie w'hrend der embryonalen Organogenese
stattfinden. Diese komplexen und zum großen Teil unverstandenen Prozesse gezielt ablaufen zu lassen stellt eine Herausforderung fr die Zukunft dar.
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Zu den ersten beiden Strategien ist anzumerken, dass die Reaktivierung endogener Stammzellen eine nicht-invasive Strategie
darstellt, bei der es auch keine Abstoßungsreaktionen gibt, da
krpereigene Stammzellen zum Einsatz kommen. Zum einen ist
es denkbar, dass ruhende Stammzellen eines Stammzellensystems aktiviert werden, um reife Zellen des betreffenden Systems
zu bilden, z. B. ist beim h'matopoetischen System bekannt, dass
zu jedem Zeitpunkt des Lebens alle Blutzellen von nur einigen
wenigen Stammzellen gebildet werden, w'hrend die meisten
h'matopoetischen Stammzellen sich in einem ruhenden Zellpool aufhalten [89]. Im Tiermodell sind Faktoren bekannt, die
im Knochenmark die Stammzellen mobilisieren und ruhende
Stammzellen zur Teilung anregen [90, 91]. Sollte dies auch auf
andere Stammzellsysteme zutreffen, knnten durch geeignete
Stimuli ruhende Gewebestammzellen aktiviert und zur Bildung
reifer Effektorzellen angeregt werden. Andererseits knnten bei
der Kenntnis entsprechender Faktoren Stammzellen vom Typ A
in einen Typ B umgewandelt werden. Hierbei ist es denkbar,
dass eine ruhende Stammzelle vom Typ A zuerst stimuliert wird
und anschließend geeignete Faktoren erh'lt, die sie in eine gewnschte Zelllinie vom Stammzelltyp B differenzieren l'sst. Es
sind jedoch bisher noch keine Faktoren bekannt, die Stammzellen weder in vitro noch in vivo ihre zellul're Identit't wechseln
lassen, so dass die zweite Mglichkeit gegenw'rtig spekulativer
Natur ist.
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Abb. 10 Mgliche Strategien f$r den autologen Gewebeersatz. Nach der Isolation krpereigener somatischer Stammzellen und
falls mglich nach De-/Transdifferenzierung
dieser Zellen knnte durch Zugabe spezifischer Gewebefaktoren eine Differenzierung in
die gew$nschten reifen Zelllinien induziert
werden (links). Die Erzeugung autologer Zellen in beliebiger Menge knnte durch Transfer
somatischer Zellkerne in entkernte Eizellen
erfolgen (therapeutisches Klonen) (rechts).
Ersatz anderer Gewebe im Kopf-Hals-Bereich
aus Stammzellen
Im Gegensatz zur Regeneration hochdifferenzierter sensorischer
Zellen, wie z. B. cochle'rer Haarzellen, die sich zur Funktionsaufnahme einserseits in das komplexe System des sensorischen Epithels innerhalb des Cortischen Organs integrieren, andererseits
Kontakte mit den Spiralganglienneuronen zur Weiterleitung auditorischer Signale herstellen mssen, knnte der Ersatz von
Sttz- und Deckgeweben einem „einfacheren“ Erneuerungsplan
folgen. Adulte mesenchymale Stammzellen knnen unter dem
Einfluss spezifischer Wachstums- und Differenzierungsfaktoren
in Zellkultur zu Fett-, Knorpel-, Knochen- und Muskelzellen differenzieren. Diese Zelltypen knnten in Zellkultur aus isolierten
mesenchymalen Stammzellen und somit in beliebiger Menge
hergestellt und fr die verschiedensten Indikationen zur Rekonstruktion an Ohr, Nase, Kehlkopf etc. retransplantiert werden. Die
Integration neu gebildeter Sttzzellen, wie z. B. Knorpelzellen, in
vorhandene Empf'ngergewebe sollte problemlos erfolgen, da
bestehende Strukturen als Leitstruktur fr die transplantierten
Zellen dienen. Dies ist bereits aus der vielf'ltigen Verwendung
von autologen Knorpel- oder Knochentransplantaten in der
Kopf- und Halschirurgie bekannt. Durch die Verwendung adulter
somatischer Stammzellen wrden einerseits autologe Gewebe
ohne Gefahr der Abstoßung generiert und zudem die rechtlichen
und ethischen Bedenken bei der Verwendung von ES-Zellen umgangen.
7
Ethisch-rechtliche Gesichtspunkte
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Seit es 1998 gelang, menschliche ES-Zellen in Zellkultur zu zchten, werden ethische, rechtliche und moralische Bedenken gegenber diesen Verfahren zunehmend auch in der Uffentlichkeit
diskutiert. Mit dem Beginn der Forschung an menschlichen ESZellen wird aus deutscher Sicht ein schmaler Grat zwischen der
Freiheit von Wissenschaft und Forschung (GG, Art. 5) und dem
wichtigen, im Grundgesetz der Bundesrepublik Deutschland verankerten Schutz der Wrde des menschlichen Lebens beschritten (GG, Art. 1). Die Forschungsfreiheit ist nach geltendem Recht
nicht uneingeschr'nkt, sondern kann durch andere Gesetzesartikel begrenzt sein. Die Wrde des Menschen, der Schutz des
menschlichen Lebens und der menschlichen Gesundheit sind
hier als vorrangige Verfassungsgter zu nennen. Der Schutz des
menschlichen Lebens soll dieses von Beginn an sichern und erstreckt sich somit auch auf die Zeit der Embryonal- und Fetalentwicklung. Nach dem Embryonenschutzgesetz beginnt das individuelle Leben nach abgeschlossener Befruchtung der Eizelle. Dies
gilt auch fr die In-vitro-Fertilisation. In den Entwicklungsablauf
eines menschlichen Embryos darf laut Gesetz nur zum Wohle
des Lebewesens eingegriffen werden. Als Embryonen werden in
diesem Zusammenhang auch alle dem Embryo entnommenen
totipotenten Zellen angesehen, die das Potenzial besitzen, sich
zu einem vollst'ndigen Organismus zu entwickeln. Da die Gewinnung von ES-Zellen den Embryo zerstrt, ist sie nicht mit
dem geltenden Embryonenschutzgesetz vereinbar. Nach dem
Beschluss des Bundestages vom 30. 1. 2001 drfen bestehende
ES-Zelllinien aus dem Ausland unter Auflagen importiert, jedoch
keine weiteren Embryonen zu Forschungszwecken gettet werden. Es ist anzumerken, dass die Gesetzgebungen bezglich der
Stammzellforschung in anderen europ'ischen L'ndern sowie
den USA und in Israel z. T. sehr differieren.
Bei der Diskussion ethisch-rechtlicher Aspekte der ES-Zellforschung sollte jedoch auch der mgliche therapeutische Nutzen
bedacht werden, der aus der Anwendung dieser Verfahren fr
Gewebe- und Organersatz sowie fr die Behandlung chronisch
degenerativer Erkrankungen erwachsen kann. Gerade fr die
Therapie neurodegenerativer Erkrankungen und Stoffwechselkrankheiten erffnen sich durch Fortschritte in der Stammzellbiologie neue kausale Behandlungskonzepte, die bisherigen
symptomatischen oder substituierenden Methoden deutlich
berlegen sein knnen. Wichtig scheint in diesem Zusammenhang die Kl'rung der Frage, ob adulte Stammzellen, die z. T. relativ einfach und ohne ethisch-rechtliche Bedenken gewonnen
werden knnen, ein 'hnliches Potenzial besitzen wie ES-Zellen.
Da die wissenschaftliche Untersuchung des Differenzierungspotenzials humaner ES-Zellen einerseits und der Plastizit't somatischer Stammzellen andererseits ein sehr junges Forschungsgebiet darstellt, ist es augenblicklich zu frh, den mglichen therapeutischen Nutzen beider Zellsysteme zu bestimmen. Fr eine
realistische Bewertung beider Stammzellsysteme sollte es deshalb auch in Deutschland zuknftig mglich sein, in begrenztem
Umfang mit humanen ES-Zellen zu forschen, um ihr therapeutisches Potenzial untersuchen zu knnen. Erst wenn das Entwicklungspotenzial humaner ES-Zellen und deren therapeutische
Nutzen bekannt sind, kann eine abschließende Bewertung vorgenommen werden. Hierzu hat die DFG mit ihren Empfehlungen
vom Mai 2001 zur Forschung mit menschlichen Stammzellen einen Rahmen vorgeschlagen. Sie spricht sich dafr aus, dass sowohl potenzielle Patienten als auch Wissenschaftler in Deutschland nicht von den Entwicklungen auf dem Gebiet der Stammzellen ausgeschlossen werden sollten und schl'gt einen Stufenplan zur Forschung mit humanen ES-Zellen vor. Die Empfehlungen sehen vor, zuerst die bestehenden humanen ES-Zelllinien zu
importieren. Zu einem sp'teren Zeitpunkt sollten Wissenschaftler in Deutschland auch die Mglichkeit erhalten, humane ESZellen gewinnen zu knnen. Neben der Erforschung der Mglichkeiten und Grenzen der Stammzellbiologie sollten aber auch alternative, stammzellunabh'ngige Forschungsaktivit'ten fr den
klinischen Gewebeersatz bedacht und weiter gefrdert werden.
8
Entscheidende wissenschaftliche Fragen
Wichtige Erkenntnisse fr den Fortgang der Stammzellforschung
w'ren Einblicke in die molekularen Schalter, die an der Plastizit't somatischer Stammzellen beteiligt sind und bisher grßtenteils fehlen. Sie sind aber Vorraussetzung dafr, gezielt und sicher die gewnschten Zelltypen erzeugen zu knnen. Prinzipiell
ist es denkbar, dass Transkriptionsfaktoren, die bei der Fruchtfliege Drosophila die Transformation eines Beines zu einer Antenne verursachen, auch an der Regulation von Zellidentit'ten
und von Plastizit't bei Stammzellen beteiligt sind [94]. Mitglieder dieser Klasse von so genannten „homeo box“ enthaltenden
Transkriptionsfaktoren sind auch in somatischen Stammzellen
der Maus und beim Menschen aktiv und knnten an der Annahme von alternativen Zellidentit'ten beteiligt sein [95]. Sobald die
gerichtete Bildung heterologer Zelltypen aus adulten Stammzellen mglich ist, knnen aus dem adulten Krper leicht zu isolierende Stammzellen, wie z. B. die Blut- oder die Hautstammzellen, zu anderen somatischen Stammzellen transformiert und anschließend retransplantiert werden.
S 35
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6.2
Gegenw'rtig arbeiten unterschiedliche Forschergruppen an der
Analyse der molekularen Schalter und der Aufkl'rung der Differenzierungswege von Stammzellen, so dass in naher Zukunft
erste Ergebnisse vorliegen werden.
9
S 36
Ausblick
Wie die Mglichkeiten der Stammzellbiologie im Hinblick auf
ihren therapeutischen Einsatz beim Menschen nicht bersch'tzt
werden sollten, drfen auch die potenziellen Gefahren fr die
Gesellschaft nicht berbewertet werden. Die Mglichkeit der
Entstehung eines „Menschen aus dem Katalog“ ist derzeit als extrem gering einzustufen und sollte nicht als emotionales Argument bei der Diskussion ber die Stammzellforschung eingesetzt
werden. Wann ein klinisch-therapeutischer Einsatz stammzellbiologischer Verfahren mglich wird, ist derzeit nicht abzusehen.
Ein vorsichtiger Optimismus im Hinblick auf zuknftige Mglichkeiten der Stammzelltherapie ist sicher gerechtfertigt, aber Srzte
und Patienten sollten keine bertriebenen Hoffnungen auf einen
Einsatz dieser Methoden innerhalb der n'chsten Jahre hegen.
Die Autoren danken Frau P. Joa und Herrn R. Mlynski fr die Untersttzung bei der Erstellung der digitalen Bilddaten sowie
Herrn Prof. Dr. J. Helms, Frau Dr. W. E. Shehata-Dieler, Frau Dr.
N. Kirchhof und Herrn J. Kirsten fr die Durchsicht des Manuskriptes.
10
Literatur
1
Potten CS, Loeffler M. Stem cells: attributes, cycles, spirals, pitfalls and
uncertainties. Lessons for and from the crypt. Development 1990; 110:
1001 – 1020
2
Dym M. Spermatogonial stem cells of the testis. Proc Natl Acad Sci USA
1994; 91: 11287 – 11289
3
Lavker RM, Miller S, Wilson C, Cotsarelis G, Wei ZG, Yang JS, Sun TT.
Hair follicle stem cells: their location, role in hair cycle, and involvement in skin tumor formation. Journal of Investigative Dermatology
1993; 101: 16S – 26S
4
Graziadei PP, Monti Graziadei GA. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. III. Deafferentation and reinnervation of the olfactory bulb following section of the fila olfactoria
in rat. Journal of Neurocytology 1980; 9: 145 – 162
5
Gage FH. Mammalian neural stem cells. Science 2000; 287:
1433 – 1438
6
Weissman I. Stem cells: units of development, units of regeneration,
and units in evolution. Cell 2000; 100: 157 – 168
7
Sigal SH, Brill S, Fiorino AS, Reid LM. The liver as a stem cell and lineage system. American Journal of Physiology 1992; 263: G139 – 148
8
Loeffler M, Potten CS. Stem cells and cellular pedigrees – a conceptual
introduction. In: Potten CS, ed. Stem cells. London: Academic Press,
1997: 1 – 27
9
Whetton AD, Graham GJ. Homing and mobilization in the stem cell niche. Trends Cell Biol 1999; 9: 233 – 238
10
Huang S, Law P, Francis K, Palsson BO, Ho AD. Symmetry of Initial Cell
Divisions Among Primitive Hematopoietic Progenitors Is Independent
of Ontogenic Age and Regulatory Molecules. Blood 1999; 94:
2595 – 2604
11
Ema H, Nakauchi H. Expansion of hematopoietic stem cells in the developing liver of a mouse embryo. Blood 2000; 95: 2284 – 2288
12
Qian X, Goderie SK, Shen Q, Stern JH, Temple S. Intrinsic programs of
patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone
cells. Development 1998; 125: 3143 – 3152
13
Bonifer C, Faust N, Geiger H, Mller AM. Developmental changes in the
differentiation capacity of haematopoietic stem cells. Immunology
Today 1998; 19: 236 – 241
14
Qian X, Shen Q, Goderie SK, He W, Capela A, Davis AA, Temple S. Timing of CNS cell generation: a programmed sequence of neuron and
glial cell production from isolated murine cortical stem cells. Neuron
2000; 28: 69 – 80
15
Kirchhof N, Harder F, Petrovic S, Kreutzfeldt S, Schmittwolf C, Drr M,
Mhl B, Merkel A, Mller AM. Developmental potential of hematopoietic and neural stem cells: unique or all the same? Cells Tissues Organs (in press) 2002
16
Phillips RL, Ernst RE, Brunk B, Ivanova N, Mahan MA, Deanehan JK,
Moore KA, Overton GC, Lemischka IR. The genetic program of hematopoietic stem cells. Science 2000; 288: 1635 – 1640
17
Geschwind DH, Ou J, Easterday MC, Dougherty JD, Jackson RL, Chen Z,
Antoine H, Terskikh A, Weissman IL, Nelson SF, Kornblum HI. A genetic
analysis of neural progenitor differentiation. Neuron 2001; 29:
325 – 339
18
Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential
cells from mouse embryos. Nature 1981; 292: 154 – 156
19
Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.
Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 7634 – 7638
20
Dani C, Smith AG, Dessolin S, Leroy P, Staccini L, Villageois P, Darimont
C, Ailhaud G. Differentiation of embryonic stem cells into adipocytes
in vitro. J Cell Sci 1997; 110: 1279 – 1285
21
Mller AM, Dzierzak EA. ES cells have only a limited lymphopoietic
potential after adoptive transfer into mouse recipients. Development
1993; 118: 1343 – 1351
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Die Stammzellbiologie erffnet derzeit fr die medizinische Forschung und klinische Anwendung vielf'ltige Optionen des Zellund Gewebeersatzes sowie die Mglichkeit neuer Therapieans'tze fr verschiedene chronisch degenerative Erkrankungen,
die bisher kaum oder gar nicht behandelbar waren. Insbesondere
embryonale Stammzellsysteme besitzen ein großes Differenzierungspotenzial, wobei derzeit ethische und rechtliche Bedenken
gegen diese Methode breit in der Uffentlichkeit diskutiert werden. Intensive Forschungsanstrengungen sind erforderlich, um
die vielen offenen Fragen der Stammzellbiologie und des „tissue
engineering“ zu kl'ren. Insbesondere scheint von Interesse, ob
adulte Stammzellen, die z. B. aus dem Knochenmark Erwachsener oder dem Nabelschnurblut relativ leicht entnommen und angereichert werden knnen, ein 'hnliches Plastizit'tspotenzial
besitzen wie ES-Zellen. Selbst wenn es schwierig sein sollte, alle
Gewebe aus einem einzigen somatischen Stammzelltyp zu
erzeugen, so besitzen einige bisher n'her untersuchte Vertreter
dieses potenten Zelltyps doch die F'higkeit, in verschiedene
Effektorzellen zu differenzieren.
Danksagung
Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt.
Die große Plastizit't im Differenzierungspotenzial somatischer
Stammzellen wirft neben den oben erw'hnten Fragen zur Molekularbiologie auch Fragen hinsichtlich der zellul'ren Differenzierungswege auf, die bei der Bildung gewebefremder Zelltypen
z. B. bei der Bildung von Blutzellen aus neuralen Stammzellen
ablaufen. Folgende Mglichkeiten sind vorstellbar:
– Die Differenzierung in gewebefremde Zelltypen stellt einen
direkten Ibergang, eine Transdifferenzierung, dar. Hierbei
wrde eine Stammzelle vom Typ A direkt Stammzellen bzw.
Vorl'ufer oder reife Zellen eines Stammzellsystems B bilden.
Alternativ w're eine Dedifferenzierung der Stammzelle zu einer primitiveren Zelle mit grßerem Differenzierungspotenzial vorstellbar.
– Es existiert lediglich ein einziger somatischer Stammzelltyp,
der je nach gewebespezifischer Mikroumgebung verschiedene reife Effektorzellen produziert oder es befinden sich in differenzierten Geweben „Relikte“ embryonaler Entwicklungsstufen, die fr das berraschend große Differenzierungspotenzial verantwortlich sind.
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Kramer J, Hegert C, Guan K, Wobus AM, Mller PK, Rohwedel J. Embryonic stem cell-derived chondrogenic differentiation in vitro: activation by BMP-2 and BMP-4. Mech Dev 2000; 92: 193 – 205
23
Brustle O, Spiro AC, Karram K, Choudhary K, Okabe S, McKay RD. In vitro-generated neural precursors participate in mammalian brain development. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 14 809 – 14 814
24
Lumelsky N, Blondel O, Laeng P, Velasco I, Ravin R, McKay R. Differentiation of embryonic stem cells to insulin-secreting structures similar
to pancreatic islets. Science 2001; 292: 1389 – 1394
25
Capecchi MR. Altering the genome by homologous recombination.
Science 1988; 244: 1288 – 1292
26
Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ,
Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human
blastocysts. Science 1998; 282: 1145 – 1147
27
Schuldiner M, Yanuka O, Itskovitz-Eldor J, Melton DA, Benvenisty N.
From the cover: effects of eight growth factors on the differentiation
of cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci
USA 2000; 97: 11307 – 11312
28
Mller AM, Medvinsky A, Strouboulis J, Grosveld F, Dzierzak E. Development of hematopoietic stem cell activity in the mouse embryo. Immunity 1994; 1: 291 – 301
29
Okada S, Nakauchi H, Nagayoshi K, Nishikawa S-I, Miura Y, Suda T. In
vivo and in vitro stem cell function of c-kit- and Sca-1-positive murine
hematopoietic cells. Blood 1992; 80: 3044 – 3050
30
Fong G-H, Rossant J, Gertsenstein M, Breitman ML. Role of Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. Nature 1995; 376: 66 – 71
31
Porcher C, Swat W, Rockwell K, Fujiwara Y, Alt FW, Orkin SH. The T cell
leukemia oncoprotein SCL/tal-1 is essential for the development of all
hematopoietic lineages. Cell 1996; 86: 47 – 57
32
Hirsch E, Iglesias A, Potocnik AJ, Hartmann U, F'ssler R. Impaired migration but not differentiation of haematopoietic stem cells in the absence of b1 integrins. Nature 1996; 380: 171 – 175
33
Arroyo AG, Yang JT, Rayburn H, Hynes RO. Differential requirements
for a4 Integrins during Fetal and Adult Hematopoieis. Cell 1996; 85:
997 – 1008
34
Escary JL, Perreau J, Dumenil D, Ezine S, Brulet P. Leukemia inhibitory
factor is necessary for maintenance of haematopoietic stem cells and
thymocyte stimulation. Nature 1993; 363: 361 – 364
35
Bernad A, Kopf M, Kulbacki R, Weich N, Koehler G, Gutierrez-Ramos
JC. Interleukin-6 is required in vivo for the regulation of stem cells
and committed progenitors of the hematopoietic system. Immunity
1994; 1: 725 – 731
36
Bhatia M, Wang JCY, Kapp U, Bonnet D, Dick JE. Purification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating immune-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 5320 – 5325
37
Ziegler BL, Valtieri M, Porada GA, de Maria R, Mller R, Masella B, Gabbianelli M, Casella I, Pelosi E, Bock T, Zanjani ED, Peschle C. KDR receptor: a key marker defining hematopoietic stem cells. Science 1999;
285: 1553 – 1558
38
Weissman IL. Translating stem and progenitor cell biology to the clinic: barriers and opportunities. Science 2000; 287: 1442 – 1446
39
McKay R. Stem cells in the central nervous system. Science 1997; 276:
66 – 71
40
Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from
isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science
1992; 255: 1707 – 1710
41
Morshead CM, Reynolds BA, Craig CG, McBurney MW, Staines WA,
Morassutti D, Weiss S, van der Kooy D. Neural stem cells in the adult
mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron 1994; 13: 1071 – 1082
42
Davis AA, Temple S. A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex. Nature 1994; 372: 263 – 266
43
Dorrell C, Gan OI, Pereira DS, Hawley RG, Dick JE. Expansion of human
cord blood CD34(+)CD38(–) cells in ex vivo culture during retroviral
transduction without a corresponding increase in SCID repopulating
cell (SRC) frequency: dissociation of SRC phenotype and function.
Blood 2000; 95: 102 – 110
44
Gritti A, Parati EA, Cova L, Frohlichsthal P, Galli R, Wanke E, Faravelli L,
Morassutti DJ, Roisen F, Nickel DD, Vescovi AL. Multipotential stem
cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences
1996; 16: 1091 – 1100
45
Kempermann G, Kuhn HG, Gage FH. More hippocampal neurons in
adult mice living in an enriched environment. Nature 1997; 386:
493 – 495
46
Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol 1976;
4: 267 – 274
47
Fuchs E, Segre JA. Stem cells: a new lease on life. Cell 2000; 100:
143 – 155
48
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD,
Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak D. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284:
143 – 147
49
Geiger H, Sick S, Bonifer C, Mller AM. Globin gene expression is reprogrammed in chimeras generated by injecting adult hematopoietic
stem cells into mouse blastocysts. Cell 1998; 93: 1055 – 1065
50
Bjornson CRR, Rietze RL, Reynolds BA, Magli MC, Vescovi AL. Turning
brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem
cells in vivo. Science 1999; 283: 534 – 537
51
Galli R, Borello U, Gritti A, Minasi MG, Bjornson C, Coletta M, Mora M,
de Angelis MG, Fiocco R, Cossu G, Vescovi AL. Skeletal myogenic potential of human and mouse neural stem cells. Nat Neurosci 2000; 3:
986 – 991
52
Gussoni E, Soneoka Y, Strickland CD, Buzney EA, Khan MK, Flint AF,
Kunkel LM, Mulligan RC. Dystrophin expression in the mdx mouse
restored by stem cell transplantation. Nature 1999; 401: 390 – 394
53
Jackson KA, Mi T, Goodell MA. Hematopoietic potential of stem cells
isolated from murine skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci USA 1999;
96: 14 482 – 14 486
54
Petersen BE, Bowen WC, Patrene KD, Mars WM, Sullivan AK, Muras EN,
Boggs SS, Greenberger JS, Goff JP. Bone marrow as a potential source of
hepatic oval cells. Science 1999; 284: 1168 – 1170
55
Eglitis MA, Mezey E. Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci
USA 1997; 94: 4080 – 4085
56
Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, McKercher SR. Turning
blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo
from bone marrow. Science 2000; 290: 1779 – 1782
57
Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J,
McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. Bone marrow
cells regenerate infarcted myocardium. Nature 2001; 410: 701 – 705
58
Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, Reitsma M, Dohse M, Osborne L,
Wang X, Finegold M, Weissman IL, Grompe M. Purified hematopoietic
stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med 2000; 6:
1229 – 1234
59
Gleich O, Dooling RJ, Presson JC. Evidence for supporting cell proliferation and hair cell differentiation in the basilar papilla of adult Belgian
Waterslager canaries (Serinus canarius). J Comp Neurol 1997; 377:
5 – 14
60
Stone JS, Rubel EW. Cellular studies of auditory hair cell regeneration
in birds. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 11714 – 11721
61
Rivolta MN, Grix N, Lawlor P, Ashmore JF, Jagger DJ, Holley MC. Auditory hair cell precursors immortalized from the mammalian inner ear.
Proc R Soc Lond B Biol Sci 1998; 265: 1595 – 1603
62
Weir J, Rivolta M, Holley M. Identification of differentiating cochlear
hair cells in vitro. Am J Otol 2000; 21: 130 – 134
63
Merlio JP, Ernfors P, Jaber M, Persson H. Molecular cloning of rat trkC
and distribution of cells expressing messenger RNAs for members of
the trk family in the rat central nervous system. Neuroscience 1992;
51: 513 – 532
64
Pirvola U, Arumae U, Moshnyakov M, Palgi J, Saarma M, Ylikoski J.
Coordinated expression and function of neurotrophins and their receptors in the rat inner ear during target innervation. Hear Res 1994;
75: 131 – 144
65
Luo L, Koutnouyan H, Baird A, Ryan AF. Acidic and basic FGF mRNA expression in the adult and developing rat cochlea. Hear Res 1993; 69:
182 – 193
66
Ernfors P, Duan ML, ElShamy WM, Canlon B. Protection of auditory
neurons from aminoglycoside toxicity by neurotrophin-3. Nat Med
1996; 2: 463 – 467
67
Staecker H, Kopke R, Malgrange B, Lefebvre P, van de Water TR. NT-3
and/or BDNF therapy prevents loss of auditory neurons following loss
of hair cells. Neuroreport 1996; 7: 889 – 894
68
Staecker H, Gabaizadeh R, Federoff H, van de Water TR. Brain-derived
neurotrophic factor gene therapy prevents spiral ganglion degeneration after hair cell loss. Otolaryngol Head Neck Surg 1998; 119: 7 – 13
69
Ernfors P, Lee KF, Kucera J, Jaenisch R. Lack of neurotrophin-3 leads to
deficiencies in the peripheral nervous system and loss of limb proprioceptive afferents. Cell 1994; 77: 503 – 512
S 37
Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt.
22
S 38
Jones KR, Farinas I, Backus C, Reichardt LF. Targeted disruption of the
BDNF gene perturbs brain and sensory neuron development but not
motor neuron development. Cell 1994; 76: 989 – 999
71
Dazert S, Baird A, Ryan AF. Receptor-targeted delivery of an intracellular toxin to outer hair cells by fibroblast growth factor. Hear Res 1998;
115: 143 – 148
72
Low W, Dazert S, Baird A, Ryan AF. Basic fibroblast growth factor
(FGF-2) protects rat cochlear hair cells in organotypical culture from
aminoglycoside injury. J Cell Physiol 1996; 167: 443 – 450
73
Pirvola U, Cao Y, Oellig C, Suoqiang Z, Pettersson RF, Ylikoski J. The site
of action of neuronal acidic fibroblast growth factor is the organ of
Corti of the rat cochlea. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 9269 – 9273
74
Dazert S, Kim D, Luo L, Aletsee C, Garfunkel S, Maciag T, Baird A, Ryan
AF. Focal delivery of fibroblast growth factor-1 by transfected cells induces spiral ganglion neurite targeting in vitro. J Cell Physiol 1998;
177: 123 – 129
75
Woolf NK, Koehrn FJ, Ryan AF. Immunohistochemical localization of
fibronectin-like protein in the inner ear of the developing gerbil and
rat. Brain Res Dev Brain Res 1992; 65: 21 – 33
76
Whitlon DS, Zhang X, Kusakabe M. Tenascin-C in the cochlea of the developing mouse. J Comp Neurol 1999; 406: 361 – 374
77
Aletsee C, Mullen L, Kim D, Pak K, Brors D, Dazert S, Ryan AF. The disintegrin kistrin inhibits neurite extension from spiral ganglion explants cultured on laminin. Audiol Neurootol 2001; 6: 57 – 65
78
Koppl C, Manley GA, Konishi M. Auditory processing in birds. Curr
Opin Neurobiol 2000; 10: 474 – 481
79
Bermingham NA, Hassan BA, Price SD, Vollrath MA, Ben-Arie N, Eatock
RA, Bellen HJ, Lysakowski A, Zoghbi HY. Math1: an essential gene for
the generation of inner ear hair cells. Science 1999; 284: 1837 – 1841
80
Zheng JL, Gao WQ. Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nat Neurosci 2000; 3:
580 – 586
81
Tsai H, Hardisty RE, Rhodes C, Kiernan AE, Roby P, Tymowska-Lalanne
Z, Mburu P, Rastan S, Hunter AJ, Brown SD, Steel KP. The mouse slalom
mutant demonstrates a role for Jagged1 in neuroepithelial patterning
in the organ of Corti. Hum Mol Genet 2001; 10: 507 – 512
82
McEvilly RJ, Erkman L, Luo L, Sawchenko PE, Ryan AF, Rosenfeld MG.
Requirement for Brn-3.0 in differentiation and survival of sensory
and motor neurons. Nature 1996; 384: 574 – 577
83
Erkman L, McEvilly RJ, Luo L, Ryan AK, Hooshmand F, O’Connell SM,
Keithley EM, Rapaport DH, Ryan AF, Rosenfeld MG. Role of transcription factors Brn-3.1 and Brn-3.2 in auditory and visual system development. Nature 1996; 381: 603 – 606
84
Vahava O, Morell R, Lynch ED, Weiss S, Kagan ME, Ahituv N, Morrow
JE, Lee MK, Skvorak AB, Morton CC, Blumenfeld A, Frydman M, Friedman TB, King MC, Avraham KB. Mutation in transcription factor
POU4F3 associated with inherited progressive hearing loss in humans.
Science 1998; 279: 1950 – 1954
85
Pickles JO, van Heumen WR. The expression of messenger RNAs coding for growth factors, their receptors, and eph-class receptor tyrosine kinases in normal and ototoxically damaged chick cochleae. Dev
Neurosci 1997; 19: 476 – 487
86
Umemoto M, Sakagami M, Fukazawa K, Ashida K, Kubo T, Senda T, Yoneda Y. Hair cell regeneration in the chick inner ear following acoustic
trauma: ultrastructural and immunohistochemical studies. Cell Tissue
Res 1995; 281: 435 – 443
87
Lee KH, Cotanche DA. Potential role of bFGF and retinoic acid in the regeneration of chicken cochlear hair cells. Hear Res 1996; 94: 1 – 13
88
Lowenheim H, Furness DN, Kil J, Zinn C, Gultig K, Fero ML, Frost D,
Gummer AW, Roberts JM, Rubel EW, Hackney CM, Zenner HP. Gene
disruption of p27(Kip1) allows cell proliferation in the postnatal and
adult organ of corti. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 4084 – 4088
89
Jordan CT, Lemischka IR. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & Development 1990; 4: 220 – 232
90
Wright DE, Cheshier SH, Wagers AJ, Randall TD, Christensen JL, Weissman IL. Cyclophosphamide/granulocyte colony-stimulating factor
causes selective mobilization of bone marrow hematopoietic stem
cells into the blood after M phase of the cell cycle. Blood 2001; 97:
2278 – 2285
91
Nishio N, Hisha H, Ogata H, Inaba M, Yamamoto Y, Amoh Y, Yasumizu
R, Hanada K, Hamada H, Ikehara S. Changes in markers, receptors and
adhesion molecules expressed on murine hemopoietic stem cells after
a single injection of 5- fluorouracil. Stem Cells 1996; 14: 584 – 591
92
Campbell KH, McWhir J, W.A. R, Wilmut I. Sheep cloned by nuclear
transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64 – 66
93
Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, Bugg EM, Littlefield JW, Donovan PJ,
Blumenthal PD, Huggins GR, Gearhart JD. Derivation of pluripotent
stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl
Acad Sci USA 1998; 95: 13726 – 13731
94
Wei G, Schubiger G, Harder F, Mller AM. Stem cell plasticity in mammals and transdetermination in Drosophila: common themes? Stem
Cells 2000; 18: 409 – 414
95
Kawagoe H, Humphries RK, Blair A, Sutherland HJ, Hogge DE. Expression of HOX genes, HOX cofactors, and MLL in phenotypically and
functionally defined subpopulations of leukemic and normal human
hematopoietic cells. Leukemia 1999; 13: 687 – 698
Dazert S, Mller AM, Stammzellbiotechnologie … Laryngo-Rhino-Otol 2002; 81: S 24 – S 38
Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt.
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