Untitled - TiHo Bibliothek elib - Stiftung Tierärztliche Hochschule

Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2010
© 2010 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-005-2
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
[email protected]
www.dvg.net
Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz
bei der murinen Theiler-Enzephalomyelitis von
experimentell infizierten Mäusen mittels polyklonaler
Antikörper und RNS-Sonden
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Maren Kummerfeld
Neumünster in Holstein
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Dr. Andreas Beineke
Institut für Pathologie
1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke
2. Gutachter: Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand
Tag der mündlichen Prüfung: 10.11.2010
meinen Eltern
in Dankbarkeit
Die Neugier steht immer an erster Stelle eines Problems,
das gelöst werden möchte.
(Galileo Galilei)
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits vorab veröffentlicht
oder zur Veröffentlichung eingereicht:
Kummerfeld M., Meens J., Haas L., Baumgärtner W., Beineke
A. (2009):
Generation and characterisation of a polyclonal antibody for the detection of Theiler´s
murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy. J. Virol. Methods
160: 185–188
Kummerfeld M., Klein S., Ulrich R., Kreutzer R., Gerhauser I., Baumgärtner W.,
Beineke A. (2010): Periventricular brain lesion development in a viral murine model
for multiple sclerosis, J. Virol. eingereicht
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Poster präsentiert:
Kummerfeld M., Baumgärtner W., Haas L., Alldinger S. Beineke A. (2006):
Generation and characterization of a polyclonal antibody for detection of Theiler´s
murine encephalomyelitis virus in cell culture and animal tissue.
24th Annual Meeting of European Society of Veterinary Pathology (ESVP), The
University of Edinburgh, 31. August - 2. September 2006
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeitrag
präsentiert:
Kummerfeld M., Baumgärtner W., Beineke A. (2008): Detection and distribution of
Theiler´s murine encephalomyelitis virus in acute and chronic brain lesions of mice.
26th Annual Meeting of European Society of Veterinary Pathology (ESVP),
Dubrovnik, 17. September - 21. September 2008
Sonstige
mit
der
Arbeit
in
thematischem
Zusammenhang
stehende
Veröffentlichungen in Zeitschriften:
Pringproa K., Rohn K., Kummerfeld M., Wewetzer K., Baumgärtner W. (2010):
Theiler´s murine encephalomyelitis virus preferentially infects immature stages of the
murine oligodendrocyte precursor cell line BO-1 and blocks oligodendrocytic
differentiation in vitro. Brain. Res. 1327: 24–37
Navarrete-Talloni M.J.,Kalkuhl A., Deschl U., Ulrich R., Kummerfeld M., Rohn K.,
Baumgärtner W., Beineke A. (2010): Transient peripheral immune response and
central nervous leaky compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis.
Brain. Pathol. in press.
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1
2
Literaturübersicht
3
2.1
Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle
3
2.2
Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus
8
2.3
Immunreaktion und Demyelinisierung im Verlauf der murinen
Theilervirus-Enzephalomyelitis
13
2.4
Ausbreitung von Viren im Zentralen Nervensystem
16
2.5
Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
im Zentralen Nervensystem
2.6
18
Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus im extraneuralen
Gewebe nach natürlicher und experimenteller Infektion bei Mäusen
20
2.7
Virale Persistenzmechanismen
22
2.8
Persistenz und Zelltropismus des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
im Zentralen Nervensystem
3
Hypothesen und Ziele
4
Generation and characterization of a polyclonal antibody for the detection
of Theiler´s murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy
5
24
29
30
Periventricular brain lesion development and region-specific susceptibilities
to demyelination in a viral murine model for multiple sclerosises
31
5.1
Abstract
32
5.2
Introduction
33
5.3
Materials and Methods
36
5.4
Results
42
5.5
Discussion
58
5.6
Acknowledgments
62
5.7
References
63
II
6
Inhaltsverzeichnis
Diskussion
6.1
Charakterisierung des polyklonalen Antikörpers zum Nachweis des
6.2
Darstellung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus mittels
murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
Immunhistologie und in situ-Hybridisierung
6.2.1
72
73
75
Virusausbreitung im Gehirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
75
6.2.2
Virusausbreitung im Rückenmark bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
78
6.2.3
Phänotypisierung der infizierten Zellpopulationen im Verlauf der murinen
Theiler-Enzephalomyelitis
6.3
79
Entzündungsreaktionen im Zentralen Nervensystem von SJL/J- und
C57BL/6-Mäusen im Verlauf der murinen Theiler-Enzephalomyelitis
81
6.3.1
Entzündungsreaktionen im Großhirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
81
6.3.2
Entzündungsreaktionen im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei
SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
6.4
murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
6.4.1
6.5
82
Demyelinisierung im Zentralen Nervensystem nach Infektion mit dem
83
Demyelinisierung im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei
SJL/J-Mäusen
83
Schlussbetrachtung
86
7
Zusammenfassung
88
8
Summary
91
9
Literaturverzeichnis
94
Inhaltsverzeichnis
III
10
118
Anhang
10.1
Ergänzendes Material zu Kapitel 4
118
10.1.1
Vermehrung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
in BHK21-Zellen
118
10.1.2
Virusreinigung über einen Saccharosegradienten
119
10.1.3
Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum Nachweis vom
murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
120
10.1.3.1
Herkunft und Haltung der Kaninchen
120
10.1.3.2
Serumgewinnung
121
10.1.3.3
Immunisierung der Kaninchen
122
10.1.3.4
Immunisierungschema zur Herstellung des polyklonalen Antikörpers 123
10.2
Ergänzendes Material zu Kapitel 5
10.2.1
Theiler´s murine encephalomyelitis virus
10.2.2
124
Overview of viral distribution in C57BL/6-mice infected with the
124
Overview of viral distribution in SJL/J-mice infected with the
Theiler´s murine encephalomyelitis virus
126
10.3
Bezugsquellen für Reagenzien, Chemikalien und Einmalartikel
128
10.4
Bezugsquellen für die Tiere
136
10.5
Bezugsquellen für Geräte
136
10.6
Lösungen und Puffer
142
10.6.1
Zellkultur
142
10.6.2
Immunfluoreszenz
143
10.6.3
Western Blot
144
10.6.4
Histologie
147
10.6.5
Immunhistologie
147
10.6.6
RNS-Isolierung, PCR und Sondensynthese
148
10.6.7
in situ-Hybridisierung
149
10.6.8
Elektronenmikroskopie
156
11
Abkürzungen
158
12
Danksagung
162
Einleitung
1
1
Einleitung
Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus („Theiler´s murine encephalomyelitis
virus“, TMEV) aus der Gattung Cardiovirus und der Familie Picornaviridae dient in
einem Tiermodell der Erforschung von Pathogenese und Therapiemöglichkeiten
humaner demyelinisierender Erkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS)
(RACANIELLO, 2001). Das Virus kommt als natürlicher Krankheitserreger bei der
Maus vor. Es persistiert dabei überwiegend in den Enterozyten des Darmes sowie in
den Mesenteriallymphknoten und ruft bei fäkal/oraler Übertragung asymptomatische
Magen-Darm-Infektionen mit Serokonversion hervor (LIPTON et al., 2001). In
seltenen Fällen können jedoch auch spontane zentralnervöse Manifestationen
beobachtet werden (THEILER und GARD, 1940 a und b; THOMPSON et al., 1951).
Es
werden
verschiedene
TMEV-Stämme
in
hoch-
und
schwachvirulente
Untergruppen eingeteilt (LIPTON, 1980). Bei den hochvirulenten Stämmen zeigt sich
das Krankheitsbild einer akuten Polioenzephalomyelitis mit oftmals tödlichem
Ausgang. Im Gegensatz dazu verursachen die schwachvirulenten Stämme, wie der
BeAn-Stamm, nach intrazerebraler Infektion einen biphasischen Krankheitsverlauf,
bei dem sich an eine akute, milde Polioenzephalomyelitis eine chronischprogrediente, demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis anschließt (LIPTON et al.,
1994). Bei der chronischen Phase der murinen Theiler-Enzephalomyelitis („Theiler`s
murine encephalomyelitis“, TME) persistiert das Virus im ZNS und führt dadurch zu
einer primären Schädigung, woraufhin sich eine sekundäre Hypersensitivitätsreaktion
vom verzögerten Typ gegen Virusepitope und im späteren Verlauf auch gegen
Myelinbestandteile entwickelt (CLATCH et al., 1986; MILLER et al., 2001). Der
Schweregrad dieses Krankheitsverlaufs bei den schwachvirulenten Stämmen wird
durch den Genotyp der infizierten Maus, deren Geschlecht
sowie vom Alter
beeinflusst (MONTEYNE et al., 1997, FULLER et al., 2005). Da das histologische
Entzündungsbild und auch die beteiligten Pathomechanismen der TME denen der
Multiplen Sklerose (MS) des Menschen sehr ähnlich sind, dient es der Forschung als
bedeutendes Tiermodell (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; STOHLMAN und
HINTON, 2001; DRESCHER und SOSNOWSKA, 2008).
2
Einleitung
Ein besonderes Augenmerk wurde in vorausgegangenen Studien auf die chronische,
demyelinisierende Phase im Rückenmark gelegt und weniger auf die akute
Infektionsphase im Gehirn. Es ist bekannt, dass sich das TMEV nach experimenteller
intrazerebraler Infektion zuerst in Neuronen und Astrozyten der grauen Substanz des
Großhirns repliziert, bevor es über eine vermutlich axonale Ausbreitung in die weiße
Substanz des Rückenmarks gelangt und dort in Makrophagen, Oligodendrozyten
und/oder Astrozyten persistiert (DAL CANTO und LIPTON, 1982; RODRIGUEZ et al.,
1983 b; TSONUDA et al., 2003; OLESZAK et al., 2004). Der Verbreitungsweg im
ZNS sowie in extraneuralen peripheren Organen und die Persistenz in der Zielzelle
unterscheiden sich in Abhängigkeit von dem verwendeten Mäusestamm, der
Infektionsart und auch der Virusart. Bisher liegen allerdings nur
wenige
Untersuchungen über die Ausbreitung des TMEV im ZNS, besonders in der akuten
Infektionsphase und extraneuralen Organen empfänglicher oder resistenter Mäuse
vor.
Literaturübersicht
3
2
Literaturübersicht
2.1
Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle
Die
Multiple
Sklerose
(MS)
ist
die
weltweit
häufigste
demyelinisierende
autoimmunbedingte zentralnervöse Erkrankung des Menschen mit nach wie vor
unbekannter, vermutlich multipler Ätiologie (HAFLER, 1999; LUCCHINETTI et al.,
2000). Eine polygene Veranlagung bei Trägern der humanen Leukozyten-Antigene
(HLA)-DR
und
–DQ
gilt
als
erwiesen
(BERTI
und
JACOBSON,
1999).
Epidemiologische Untersuchungen gaben Hinweise auf eine mögliche Bedeutung
von Umweltfaktoren, insbesondere von Virusinfektionen in der Pathogenese der MS.
In diesem Zusammenhang wurden die unterschiedlichsten viralen Erreger, wie das
Masern-, das Epstein-Barr-, das Herpes-simplex-, das Varizella-Zoster-, das
Zytomegalie- und das humane Herpesvirus-6 sowie humane Coronaviren und das
kanine Staupevirus als Krankheitsauslöser diskutiert (EBERS et al., 1986; BERTI
und JACOBSON, 1999; WILLER und EBERS, 2000; HAAHR und HÖLLSBERG,
2001). Des Weiteren wurden auch Retroviren wie das humane T-Zell-Leukämie-Virus
(HTLV-1) als mögliche Auslöser der Krankheit genannt (MEINL, 1999; HAAHR und
HÖLLSBERG, 2001). Im Liquor von MS-Patienten wurde weiterhin ein neues, MSassoziiertes Retrovirus (MSRV) mittels PCR nachgewiesen und ebenfalls als
potentielles auslösendes Agens vorgestellt (PERRON et al, 1997). Bisher konnte
allerdings keines der genannten Viren in einen eindeutigen, ätiologischen
Zusammenhang mit der MS gebracht werden. Klinisch unterscheidet man eine
schubförmig remittierende („relapsing remitting“) Verlaufsform, bei der es meistens
zur vollständigen Rekonvaleszenz zwischen den Schüben kommt. Diese Form kann
allerdings sekundär in einen progressiven Krankheitsverlauf übergehen („secondary
progressive“; BAR-OR et al., 2000). Weiterhin kommen auch primär progressive
Verlaufsformen ohne intermittierende Symptomfreiheit („primary progressive“) vor. In
seltenen Fällen werden auch akute Formen beobachtet, die rasch zum Tode führen
(HUNTER und RODRIQUEZ, 1995; PRINEAS et al., 2002). Histologisch stellt die MS
4
Literaturübersicht
eine entzündlich-degenerative Erkrankung der weißen Substanz des Gehirns und
Rückenmarks dar, die durch plaqueförmige T-Zell- und Makrophageninfiltrate mit
primärer Demyelinisierung gekennzeichnet ist. In der progressiven Phase der MS
kommt es außerdem zu diffusen entzündlichen Veränderungen mit generalisierter
Mikrogliaaktivierung sowie sekundärer Demyelinisierung durch die Schädigung und
den Verlust von Axonen (ADAMS et al., 1989; HALFER und WEINER, 1995;
LASSMANN et al., 2007; TSUNODA und FUJINAMI, 2002). Zusätzlich kann eine
ausgeprägte subpiale kortikale Entmarkung des Vorderhirns (Proenzephalon) und
Kleinhirns mit assoziierter Leptomeningitis auftreten (LASSMANN et al., 2007). Die
pathohistologischen Veränderungen in der weißen Substanz bei der MS lassen sich
in vier verschiedene Gruppen unterteilen (LASSMANN et al., 2001). Zu der Gruppe I
zählen Läsionen mit Infiltrationen von T- Zellen und Makrophagen/Mikroglia mit
nachfolgenden
Hypersensitivitätsreaktionen
vom
verzögerten
Typ
(„delayed type hypersensitivity“, DTH). Die Gruppe II ist durch eine vermehrte
Immunglobulin- und Komplementkomponentenablagerung gekennzeichnet, was für
eine Mitbeteiligung der humoralen Immunantwort an dem autoimmunen Prozess
spricht. Für die Veränderungen der Gruppe III, welche durch einen selektiven Verlust
des Myelin-assoziierten Glykoproteins (MAG) und oligodendrogliale Apoptosen
gekennzeichent sind, werden eine sekundäre ischämische Genese oder eine virale
Infektion als Ursache diskutiert. In den selten vorkommenden Läsionen der Gruppe
IV liegen Zonen mit oligodendroglialen Nekrosen in der Nähe von aktiven
Demyelinisierungsherden der weißen Substanz vor, so dass hier ätiopathogenetisch
ein toxisches Geschehen angenommen wird (LUCCHINETTI et al., 2000)( Tab. 2-1).
In Abhängigkeit vom Alter lassen sich die pathohistologischen Befunde auch in
aktive, chronisch-aktive und chronisch-inaktive Läsionen einteilen (HUNTER und
RODRIGUEZ, 1995).
In der Forschung werden zahlreiche Tiermodelle genutzt, jedoch vereinigt keines der
Modelle
die
vielfältige
Pathogenese
und
Heterogenität
der
pathologischen
Organveränderungen bzw. der klinischen Symptomatik der MS in sich. Es existieren
neben experimentellen Tiermodellen, auch einige Modelle bei denen es sich um
natürlich vorkommende, demyelinisierende Enzephalitiden viraler Genese bei
Literaturübersicht
5
Säugetieren handelt. Die Visna des Schafes oder die demyelinisierende Form der
Staupeenzephalitis des Hundes eignen sich beispielsweise sehr gut als spontan
auftretende Erkrankungen bzw. als natürliche Tiermodelle zur Erforschung der
humanen MS (ALLDINGER et al., 1993; BEINEKE et al., 2009; DAL CANTO und
RABINOWITZ, 1982; BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005; SEEHUSEN et al.,
2007; SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010; STOHLMANN und HINTON, 2001).
Tierexperimentelle Studien mit Labornagern, wie die Theiler-Enzephalomyelitis der
Maus,
die
murine
Autoimmune
Hepatitisvirus
Enzephalomyelitis
Infektion
(MHV)
(EAE)
erlauben
oder
die
Experimentelle
jedoch
Hypothesen-
gestützte Untersuchungen unter standardisierten Bedingungen.
Diese Mausmodelle repräsentieren verschiedene pathogenetische Aspekte der MS,
die einerseits möglicherweise durch eine primäre Virusinfektion des ZNS bedingt
sein können oder andererseits eine primär autoimmune Erkrankung darstellen (DAL
CANTO et al., 1995; TSUNODA und FUJINAMI, 1996; HALFER, 1999; STOHLMAN
und HINTON, 2001; ULRICH et al., 2006). Zusätzlich werden noch toxische (z.B.
Cuprizone, Lysolezithin und Ethidiumbromid) und genetische („shiverer“ Maus [MBP
„knock-out“-Mutante]
und
„rumpshaker“
Maus
[PLP
„knock-out“-Mutante])
Entmarkungsmodelle zur Erforschung demyelinisierender Krankheiten eingesetzt
(EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007).
Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus (TMEV) wurde erstmals 1933 von dem
Mikrobiologen Max Theiler bei Labormäusen beobachtet und als auslösendes Agens
für eine akute Polioenzephalomyelitis, die murine Theilervirus-Enzephalomyelitis
(TME) beschrieben (THEILER, 1934). Durch experimentelle Infektionen wurde einige
Jahre später ein biphasischer
Krankheitsverlauf
in
Abhängigkeit
von
den
verwendeten Virus- und Mäusestämmen bekannt, der sich durch eine initiale, akute
Polioenzephalomyelitis und eine chronische, demyelinisierende Enzephalomyelitis
auszeichnet (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975 und 1980; LIPTON und DAL
CANTO,
1979).
Erkrankungen
des
demyelinisierende
Dieser
ZNS
TME
Verlauf
des
der
zeigte
Parallelen
Menschen.
Forschung
Seitdem
als
zu
demyelinisierenden
dient
wertvolles
die
chronische,
Pathogenese-
und
Therapiemodell für die MS (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; STOHLMAN und
6
Literaturübersicht
HINTON, 2001). Bei der chronischen demyelinisierenden TME verursacht die
Virusinfektion eine primäre Schädigung des Nervensystems, woraufhin sich eine
durch CD4+-T-Zellen vermittelte Immunreaktion gegen Virusepitope entwickelt. Im
weiteren Verlauf entsteht durch den Prozess des „epitope spreading“ eine gegen
Myelinbestandteile gerichtete Autoimmunität (CLATCH et al., 1986; BORROW et al.,
1998; DI ROSA und BARNABA, 1998; VANDERLUGT et al., 1998; KIM et al., 2001;
MILLER et al., 2001). Das klinische Bild der TME entspricht damit der primär
progressiven Verlaufsform der MS und den Gruppen I und II der histologischen MSKlassifizierung (LUCCHINETTI et al., 2000; TSUNODA und FUJINAMI, 1996) (Tab.
2-1).
Die Demyelinisierung bei der MHV-Infektion wird durch zytologische Effekte
virusinfizierter
Oligodendrozyten
induziert.
Das
MHV
repliziert
sich
in
Oligodendrozyten, wodurch diese zur Apoptoseinduktion veranlasst werden und
dadurch die Entmarkung auslösen (MATTHEWS et al., 2002; STOHLMAN und
HINTON, 2001). Daneben zeigen sich bei der MHV-Infektion, wie auch bei der TME,
Makrophagen
mit
intrazellulären,
phagozytierten
Myelinbestandteilen
in
demyelinisierenden Läsionen. Da bei der TME je nach Virusstamm wie auch bei der
neurotrophen
MHV-Infektion
ein
hoher
Anteil
von
direkt
virusinduzierten
Oligodendrozytenuntergängen in den demyelinisierten Läsionen auftreten, können
durch diese experimentellen Virusinfektionen auch Aspekte der Gruppen III und IV
der MS untersucht werden (LANE und BUCHMEIER, 1997; ZOECKLEIN et al., 2003)
(Tab. 2-1). Bei der EAE wird bei empfänglichen Mäusen, Ratten, Meerschweinchen,
Kaninchen und Affen durch eine Immunisierung mit Myelinbestandteilen, wie dem
basischen
Myelinprotein
(MBP),
Myelin-Proteolipid-Protein
(PLP),
Myelin-
Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) oder Ganglioside eine autoimmun-bedingte
Entmarkung in der weißen Substanz des ZNS ausgelöst (DE-CARVALHO et al.,
1999). Die EAE entspricht klinisch der schubweise remittierenden Form der MS, sie
kann allerdings auch primär progressiv verlaufen (GOLD et al., 2006; TSUNODA und
FUJINAMI, 1996). Die EAE kann in Abhängigkeit vom experimentellen Design
entweder der Gruppe I oder II der MS nach LUCCHINETTI et al., (2000) zugeordnet
werden (Tab. 2-1). Bei den toxischen Modellen wird die Demyelinisierung entweder
Literaturübersicht
7
durch die orale Gabe von Cuprizone oder durch direkte Injektion von Substanzen,
wie beispielsweise Ethidiumbromid, Lysolecithin und Lipopolysaccharid, in das ZNS
induziert (FELTS et al., 2005; MATSUSHIMA und MORELL, 2001; TORKILDSEN et
al., 2008; WOODRUFF und FRANKLIN, 1999). Die toxischen Modelle zeigen
Demyelinisierung mit selektiven Schädigungen der Oligodendrozyten oder deren
Vorläuferzellen mit schneller bis langsamer Remyelinisierung, wodurch diese den
Gruppen III und IV der MS nach LUCCHINETTI et al., (2000) entsprechen (Tab. 2-1).
Durch die systemischen (z.B. orale Aufnahme von Cuprizone) und lokal toxischen
Prozesse (z.B. Injektion von Ethidiumbromid, Lysolecithin und Lipopolysaccharid)
können Mikrogliaaktivierungen und Axonopathien standardisiert untersucht werden.
Außerdem ist das Cuprizone-Modell besonders gut zur Untersuchung von
Remyelinisierungsvorgängen im Gehirn geeignet (BEDARD et al., 2007; LINDNER et
al., 2008). Schließlich gibt es noch genetische Modelle mit „knock-out“-Mäusen, wie
den „shiverer“ Mutanten (MBP „knock-out“) oder den „rumshaker“ Mutanten (PLP
„knock-out“), die jeweils durch einen definierten Gendefekt eine fehlerhafte
Ausbildung der Myelinscheiden aufweisen (EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al.,
2007). Aufgrund des klar definierten Gendefekts kann nach der Bedeutung des
entsprechenden Proteins für den Erhalt und Ausbau einer normal strukturierten und
funktionstüchtigen Myelinscheide geforscht werden. In kombinierten Modellen mit
genetisch veränderten Mäusen konnte außerdem der Einfluss des Myelins auf die
Viruspersistenz bei der TME näher untersucht werden (BRAHIC und ROUSSARIE,
2009).
8
Literaturübersicht
Tabelle 2-1: Einteilung der Multiplen Sklerose in vier Gruppen mit dem jeweiligen
repräsentativen Tiermodell (modifiziert nach LUCCHINETTI et al., 2000)
MS-Gruppen
Mechanismus
T-Zell und Makrophagen
I
Experimentelle Tiermodelle
TME, EAE
vermittelte Demyelinisierung
II
III
Antikörper und Komplement
TME, EAE
vermittelte Demyelinisierung
distale Oligodendrogliopathie
TME, MHV-Infektion, toxische
und Apoptose
Mausmodelle (z.B. Ethidiumbromid,
Cuprizone, Lysolecithin,
Lipopolysaccharid)
IV
primäre oligodendrogliale
TME, MHV-Infektion, toxische
Degeneration
Mausmodelle (z.B. Ethidiumbromid,
Cuprizone, Lysolecithin,
Lipopolysaccharid)
TME: murine Theilervirus-Enzephalomyelitis; EAE: Experimentelle Autoimmune
Enzephalomyelitis; MHV: Murines Hepatitisvirus
2.2
Das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus
Das TMEV gehört zur Familie der Picornaviridae und stammt mit dem ebenfalls bei
Mäusen vorkommenden Enzephalomyokarditisvirus aus dem Genus Cardiovirus.
Picornaviren sind kleine (Pico), unbehüllte, ikosaedrische, ribonukleinsäure (RNS)haltige Viren mit einem Durchmesser von ca. 30 nm (RACANIELLO, 2001) (Abb. 21). Die genetisch sehr eng miteinander verwandten TMEV-Stämme werden in eine
hoch- (GDVII, FA) und in eine schwachvirulente Untergruppe (DA, BeAn 3886, To4,
Yale, WW) eingeteilt (THEILER, 1937; THEILER und GARD, 1940 a und b;
DANIELS et al., 1952; ROZHON et al., 1983; PEVEAR et al., 1988, MONTEYNE et
al., 1997). Sie unterscheiden sich in ihrem in vitro- und in vivo-Verhalten. Die
Literaturübersicht
9
hochvirulenten Virusstämme zeichnen sich durch die Bildung großer Plaques in der
Zellkultur
aus
und
rufen
nach
intrazerebraler
Infektion
eine
akute
Polioenzephalomyelitis mit oftmals tödlichem Ausgang für das Tier binnen 24 bis 48
Stunden post infectionem hervor. Die letale Dosis (LD)50 des GDVII-Stammes beträgt
etwa ein bis zehn plaquebildende Einheiten („plaque forming units“ PFU). Diese
Virusstämme zerstören hauptsächlich die Neurone des Großhirnkortex sowie der
spinalen Vorderhörner, wohingegen die weiße Substanz des Kleinhirns und
Rückenmarks nicht von der Infektion betroffen ist (STROOP et al., 1981). Im
Gegensatz zu den schwachvirulenten Virusstämmen, deren LD50 > 106 PFU beträgt,
fehlt den GDVII- und FA-Virusstämmen die Fähigkeit zur Persistenz im ZNS der
Maus (LIPTON, 1980; MONTEYNE, 1997). Die
schwachvirulenten Virusstämme
bilden in vitro kleinere Plaques und sind durch eine deutlich geringere Virulenz in
vivo charakterisiert. Die DA- und BeAn-Stämme, auch „Theiler´s original strains“ (TOStämme) genannt, verursachen nach intrazerebraler Infektion in empfänglichen
Mäusestämmen ein biphasisches Krankheitsbild. Dieses beginnt mit einer milden,
akuten Polioenzephalomyelitis und anschließenden chronischen, demyelinisierenden
Leukoenzephalomyelitis (DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975; LIPTON, 1980;
TSUNODA und FUJINAMI, 1996; MURRAY et al., 1998; MCGAVERN et al., 1999;
ZOECKLEIN et al., 2003). Der an die Zellkultur adaptierte, schwachvirulente WWStamm verursacht eine remittierende demyelinisierende Enzephalomyelitis (DAL
CANTO und BARBANO, 1984).
Die einzelsträngige genomische RNS des TMEV hat eine positive Polarität und eine
Länge von etwa 8100 Nukleotiden. Sie enthält keine subgenomische mRNS
(PEVEAR et al., 1987; OHARA et al., 1988). Das TMEV unterscheidet sich von
anderen Picornaviren durch den nicht-kodogenen 5`-Bereich seines Virusgenoms,
welcher durch eine „internal ribosome entry site“ (IRES) gekennzeichnet ist, an die
zelluläre Ribosomen binden können (RACANIELLO, 2001). Unterschiede im 5´Bereich des Virusgenoms, die möglicherweise die Bindungseigenschaft der IRES für
die neuronale Form des Polypyrimidintrakt-Bindungsproteins beeinflussen, haben
einen erheblichen Einfluss auf die Neurovirulenz des Virus (JAROUSSE et al., 1999;
PILIPENKO et al., 2001; BRAHIC et al., 2005). Ein großer offener Leserahmen
10
Literaturübersicht
(„open reading frame“, ORF) kodiert für ein aus 2303 Aminosäuren bestehendes
Polyprotein, dass wiederum in die zwölf reifen Proteine L, VP4, VP2, VP3, VP1, 2A,
2B, 2C, 3A, 3B, 3C, und 3D gespalten wird (Abb. 2-2). Ein weiterer die L/VP4/VP2
kodierende Region überlappender, kleiner ORF kodiert für das 18 kDa alternative
„leader“ (L*)-Protein. Dieses Protein wird nur von schwachvirulenten TMEVStämmen, nicht aber vom neurovirulenten GDVII-Stamm, gebildet und stellt somit
einen wichtigen Bestandteil für die Erregerpersistenz dar (CHEN et al., 1995 a;
DRESCHER et al., 1997; OHARA et al., 2002; BRAHIC et al., 2005; STAVROU et
al., 2010). Das L*-Protein erleichtert die Infektion von Makrophagen/Mikroglia,
verzögert die Apoptose von infizierten Zellen und verhindert die durch CD8+-TLymphozyten hervorgerufene Zytotoxizität (GHADGE et al., 1998; TAKATA et al.,
1998; LIN et al., 1999; VAN EYLL und MICHIELS, 2000). Eine Virusreplikation in
vitro in BHK21-Zellen findet auch ohne das „leader“ (L)- und das alternative „leader“
(L*)-Protein statt, allerdings besitzen die Proteine eine Schlüsselrolle bei der
Entstehung der chronischen demyelinisierenden TME in vivo (BRAHIC et al., 2005).
Das L-Protein ist ein kleines Zink-Finger Protein (CHEN et al., 1995 b), welches die
virale Replikation durch eine Hemmung der Typ-I Interferon-Synthese begünstigt
(VAN PESCH et al., 2001; VAN PESCH und MICHIELS, 2003; WEBER et al., 2004,
TAKANO-MARUYAMA et al., 2006). Des Weiteren zeigten Untersuchungen, dass
dieses Protein auch die intrazelluläre Translokation von Transkriptionsfaktoren
hemmt, was zur Unterdrückung von „immediate early genes“ führt und damit die
frühe antivirale Immunantwort unterdrückt (MAMANE et al., 1999; DELHAYE et al.,
2004; BRAHIC et al., 2005). Eine Grundeinheit des Kapsids setzt sich jeweils aus
einem Molekül der vier Strukturproteine VP1-4 zusammen, wobei VP1-3 an der
Oberfläche liegen und VP4 darunter lokalisiert ist. Das Kapsid besteht aus insgesamt
60 solcher Grundeinheiten und weist 20 dreieckige Flächen und 12 Ecken auf (LUO
et al., 1992; RACANIELLO, 2001) (Abb. 2-1). Durch die verschiedenartigen
Kapsidstrukturen und die daraus resultierenden unterschiedlichen Virusrezeptoren
kann der veränderte Zelltropismus der TMEV-Untergruppen erklärt werden.
Beispielsweise findet sich eine Infektion von Neuronen bei hochvirulenten Stämmen,
während schwachvirulente Stämme auch Mikroglia/Makrophagen infizieren können
Literaturübersicht
11
(FU et al., 1990; JAROUSSE et al., 1994; SATO et al., 1996; JAROUSSE et al.,
1996; DRESCHER et al., 1997; O´SHEA et al., 1997; JAROUSSE et al., 1999;
MCCRIGHT et al., 1999; CAMERON et al., 2001; BRAHIC et al., 2005). Das virale
Protein 3D stellt die virale RNS-abhängige RNS-Polymerase dar, welche für die
genomische Replikation und RNS-Synthese des Virus verantwortlich ist. Die viralen
Proteine 2A und 3C katalysieren als Proteasen die Spaltung des viralen Polyproteins.
Das Protein 2C stellt eine Nukleosid-Triphosphatase dar und 3B ist ein kovalent an
das 5´-Ende der Virus-RNS gebundenes Protein. Die genauen Funktionen der
viralen Proteine 2B und 3A sind bisher noch nicht eindeutig geklärt worden
(DRESCHER et al., 1997; MONTEYNE et al., 1997; RACANIELLO, 2001; BRAHIC et
al., 2005). In Infektionsversuchen mit einem chimären GDVII/DA-TMEV wurde
bewiesen, dass alle Substämme des TMEV die Fähigkeit besitzen, in empfänglichen
Mäusestämmen eine Demyelinisierung hervorzurufen (FU et al., 1990; RODRIGUEZ
und ROOS, 1992). Allerdings kommt dieses bei den hochvirulenten Stämmen
aufgrund der ausgeprägten Neurovirulenz und der fehlenden Erregerpersistenz nicht
zum Ausdruck. Bisher konnte die Eigenschaft zur Demyelinisierung keinem
spezifischen viralen Genprodukt zugeordnet werden (BRAHIC et al., 2005; LIPTON
et al., 2005 a).
In vitro konnte in Infektionsversuchen mit Gehirnzellkulturen und Organexplantaten
verifiziert werden, dass sowohl die hochvirulenten als auch die schwachvirulenten
Virusstämme Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten sowie Gliavorläuferzellen
und Mikroglia/Makrophagen infizieren können (WROBLEWSKA et al., 1979; O`SHEA
et al., 1997). So konnte gezeigt werden, dass es in Oligodendrozyten und nicht nur in
Astrozyten zu einer persistierenden Infektion mit der Expression von Virusprotein
kommen kann. Weiterhin ist bekannt, dass der DA-Stamm in kultivierten Neuronenund Oligodendrozytenzelllinien eine Lyse induziert, im Gegensatz zum GDVII-Stamm
in murinen Makrophagen/Mikrogliazelllinien persistiert und eine produktive Infektion
hervorruft (GRAVES et al., 1986; OBUCHI et al., 1999; OHARA et al., 2002). Der
BeAn-Stamm ist in primären Gehirnzellkulturen von SJL/J-Mäusen vermehrt in
Astrozyten und kaum in Mikrogliazellen nachweisbar (KUMNOK et al., 2008).
Zusätzlich konnte in in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass der BeAn-Stamm
12
Oligodendrozytenvorläuferzellen
Literaturübersicht
infiziert
und
deren
Differenzierung
in
reife
Oligodendrozyten blockiert (PRINGPROA et al., 2010).
Abbildung 2-1: Dreidimensionale schematische Darstellung des unbehüllten TMEV-Virus
mit den Kapselproteinen VP1-4, die die kegelartigen Spitzen auf der Oberfläche des
ikosaedrischen Kapsids bilden (erstellt mit freundlicher Unterstützung von Benjamin Peters
mittels Adobe Photoshop CS3 und Adobe Illustrator CS3).
Abbildung 2-2: TMEV-Genom kodiert für zwölf Proteine, die sich aus vier Kapselproteinen
(VP1-4) und sechs Proteinen (2A-C, 3A-D) sowie den beiden L- und L*-Proteinen für die
Replikation zusammensetzen. Die Translation wird durch einen nicht-kodogenen 5`-Bereich
der „internal ribosome entry site“ (IRES) gesteuert, an die zelluläre Ribosomen binden
können.
Literaturübersicht
2.3
13
Immunreaktion und Demyelinisierung im Verlauf der
murinen Theilervirus-Enzephalomyelitis
Nach experimenteller Infektion zeigen die hochvirulenten Substämme des TMEV,
GDVII und FA histologisch Neuronennekrosen mit mikroglialer Neuronophagie und
lymphohistiozytärer
Meningoenzephalomyelitis
im
Gehirn
und
Rückenmark
(OLISTKY und SCHLESINGER, 1941; LIPTON, et al., 1994; SETHI und LIPTON,
1981). Diese Läsionen finden sich hauptsächlich in Neocortex, Thalamus,
Hippocampus
und
Hirnstamm
sowie
in
den
Basalganglien
und
spinalen
Vorderhörnern. Das Kleinhirn und die weiße Substanz des ZNS zeigen in der Regel
keine entzündlichen Veränderungen (STROOP et al., 1981; LIPTON et al., 1994;
SIMAS et al., 1995). Vereinzelt werden intranukleäre Einschlusskörperchen vom
Cowdry
B-Typ
in
Neuronen
des
Rückenmarks
gefunden
(OLITSKY
und
SCHLESINGER, 1941; SETHI und LIPTON, 1981). Histologisch ist die durch das
GDVII-Virus hervorgerufene akute Polioenzephalomyelitis der Maus nicht eindeutig
von anderen viralen Enzephalitiden abgrenzbar. Ähnliche Veränderungen können
beispielsweise bei der Infektion mit dem Enzephalomyokarditisvirus, Coxsackievirus
oder Vilyuiskvirus auftreten (SETHI und LIPTON, 1981).
Vergleichbar mit diesen Alterationen finden sich nach experimenteller Infektion in der
akuten Infektionsphase bei den schwachvirulenten TMEV-Substämmen (DA- und
BeAn-Stamm) ebenfalls Makrophagen-, Lymphozyten- und Plasmazellinfiltrate in der
grauen Substanz und der Meninx. Die perivaskulären Entzündungszellinfiltrate sind
hauptsächlich
im
Dienzephalon
(Thalamus,
Hypothalamus,
Subthalamus),
Hippocampus, Hirnstamm und Rückenmark sowie in den Basalganglien (Nucleus
caudatus, Pallidum und Putamen) lokalisiert (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941;
RODRIGUEZ et al., 1987; STROOP et al., 1981; ZOECKLEIN et al., 2003). Die
entzündlichen Veränderungen im Groß- und Zwischenhirn sind in der chronischen
Phase (90 bis 180 Tage post infectionem) wieder verschwunden, wobei eine
Astrogliose und in Regionen ausgeprägter Malazie auch Mineralisationen in der
grauen
Substanz
zurückbleiben
können
(LIPTON
et
al.,
1994).
Die
Entzündungsreaktion in der Leptomeninx und weißen Substanz von Hirnstamm und
14
Literaturübersicht
Rückenmark besteht überwiegend aus fokalen, perivaskulären Infiltrationen von
Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen, die sich nach ca. sieben Tagen post
infectionem manifestiert (LIPTON, 1975; ZOECKLEIN et al., 2003; ULRICH et al.,
2006). Diese mononukleäre Entzündung greift sukzessiv vom meningealen und
perivaskulären Raum auf das Parenchym der weißen Substanz über und besteht
dort ab dem 30. Tag post infectionem überwiegend aus Makrophagen/Mikroglia, die
sich durch die Phagozytose von Myelinbestandteilen zu Gitterzellen entwickeln
(LIPTON et al., 1994). Ihren Höhepunkt erreicht die Leukomyelitis etwa drei Monate
nach der Infektion (ULRICH et al., 2006). Mittels Durchflusszytometrie konnten im
Rückenmark hauptsächlich CD3+-T-Lymphozyten und CD11b+-Makrophagen in den
Entzündungszellinfiltraten nachgewiesen werden, während nur wenige CD19+-BZellen und vereinzelte NK1.1+ natürliche Killerzellen vorlagen (LIPTON et al. 2005 a).
Die Immunantwort bei der TMEV-Infektion wird stark von der Zytokinexpression der
T-Zellen, Makrophagen/Mikroglia und Astrozyten beeinflusst. DA-TMEV-infizierte
empfängliche Mäuse exprimieren in der akuten Infektionsphase im Gehirn und in der
chronischen
Phase
im
Rückenmark
vermehrt
den
transformierenden
Wachstumsfaktor (TGF)-ß, Interferon (IFN)-γ und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α
sowie Interleukin (IL)-1, IL-6, IL-12 und IL-10. Die Expression von IL-2 und IL-4
ändert sich im Verlauf der Infektion im Gehirn nicht. Im Rückenmark steigt hingegen
IL-4 in der akuten Phase an, während die IL-2-Expression in der chronischen Phase
vermindert ist (OLESZAK et al. 2004). Bei resistenten Mäusen zeigen sich keine
messbaren Veränderungen der Zytokinexpression im Rückenmark (CHANG et al.,
2000; OLESZAK et al., 1998 b). Resistente C57BL/6-Mäuse weisen während der
akuten Infektionsphase im Gehirn lediglich eine erhöhte IFN-γ-, IL-1-, IL-6-, IL-12und IL-10-Expression auf, wohingegen die Expression von TGF-ß, TNF-α, IL-2 und
IL-4 unverändert bleibt. IFN-γ wird von aktivierten NK-Zellen sowie von CD4+-T- und
CD8+-T-Lymphozyten produziert und trägt zur Viruseliminierung in resistenten
Mäusen bei (RODRIGUEZ et al., 1995). CD4+-T-Zellen wirken einerseits in der
frühen Erkrankungsphase protektiv, indem sie die antivirale Immunantwort
induzieren, andererseits sind sie bei empfänglichen Mäusen maßgeblich an der
Entwicklung der entzündungsbedingten Demyelinisierung beteiligt (BORROW et al.,
Literaturübersicht
15
1993; BORROW et al., 1998). CD8+-T-Zellen eliminieren das Virus bei resistenten
Mäusen über eine Perforinausschüttung in der akuten Erkrankungsphase aus dem
ZNS (BORROW et al., 1992; MURRAY et al., 1998; PENA ROSSI et al., 1998).
Weiterhin verhindert die starke Induktion von ETS-1 und IFN-γ in der Frühphase der
TME eine Viruspersistenz und Entstehung von Läsionen in C57BL/6-Mäusen
(GERHAUSER et al., 2005). Im Vergleich führt die perforinabhängige Zytotoxizität
bei empfänglichen Mäusen in der chronischen Phase zu einer Schädigung von
Axonen und Entmarkung (RODRIGUEZ und SRIRAM, 1988; MURRAY et al., 1998).
Die Zytotoxizität der CD8+-T-Zellen reicht jedoch in diesen Mäusestämmen nicht aus,
um das Virus vollständig zu eliminieren (DRESCHER et al., 1997).
Nur bei TME-empfänglichen SJL/J-Mäusen entstehen eine Hypersensitivitätsreaktion
vom verzögerten Typ und Autoimmunreaktionen gegen endogene Myelinepitope in
der späten demyelinisierenden Krankheitsphase (CLATCH et al., 1986). Die
entscheidenen Zellen für die Entzündungsprozesse sind aktivierte CD4+-T-Zellen. In
der Frühphase richtet sich die DTH-Reaktion direkt gegen TMEV-Epitope. Im Verlauf
der Erkrankung erfolgt durch den Prozess des „epitope spreading“ ein Wechsel zu
MBP- und PLP-spezifischen Immunreaktionen (BORROW et al., 1998; LEHMANN et
al., 1998; VANDERLUGT et al., 1998; KATZ-LEVY et al., 1999; MILLER et al., 2001).
Die Lymphozyten produzieren vermehrt Lymphokine und locken damit Makrophagen
chemotaktisch an. Diese werden durch Phagozytose des Virus infiziert und spielen
somit eine entscheidene Rolle bei der Virusausbreitung im ZNS. Außerdem wird die
DTH-Reaktion
durch
die
fortwährende
Virusreplikation
und
-persistenz
aufrechterhalten (TSUNODA et al., 1996; DRESCHER et al., 1997; LIPTON et al.,
2005 b). In wieweit immunpathologische Prozesse für die Demyelinisierung
verantwortlich sind, wird teilweise kontrovers diskutiert, da die Beteiligung einer
direkten Virusinfektion von Oligodendrozyten oder einer Autoimmunreaktion an der
Zerstörung der Myelinscheiden in Abhängigkeit vom verwendeten Virusstamm variert
(ZOECKLEIN et al., 2003). In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass
der DA-Stamm, welcher hauptsächlich in Oligodendrozyten persistiert, sowohl eine
virusinduzierte Apoptose und Nekrose der Zellen als auch eine zytotoxische TZellantwort auslöst (RODRIGUEZ et al., 1983 a; AUBERT et al., 1987; LINDSLEY et
16
Literaturübersicht
al., 1991; ZOECKLEIN et al., 2003), während der BeAn-Stamm vor allem
Makrophagen infiziert und damit zunächst eine DTH-Reaktion gegen das TMEV und
im weiteren Krankheitsverlauf zusätzlich eine myelinspezifische Autoimmunität
induziert (CLATCH et al., 1986; LIPTON et al., 1995; KATZ-LEVY et al., 1999;
MILLER et al., 2001; ZOECKLEIN et al., 2003; LIPTON et al., 2005 b).
2.4
Ausbreitung von Viren im Zentralen Nervensystem
Viren besitzen mehrere Möglichkeiten das ZNS zu infizieren und sich innerhalb des
Nervengewebes auszubreiten. Neurotrope Erreger finden sich in zahlreichen
Virusfamilien, wie beispielsweise den Reoviren, Coronaviren, Paramyxoviren,
Bornaviren, Herpesviren und Picornaviren (TYLER und NATHANSON, 2001). Dabei
spielen spezifische Rezeptoren an ihrer Oberfläche eine nicht unerhebliche Rolle.
Diese ermöglichen es den Viren an bestimmten Zellrezeptoren hochaffin zu binden.
Herpesviren binden beispielsweise über Heparansulfat an ihre Zielzellen, während
Tollwutviren an Acetylcholinrezeptoren, Phospholipiden und Gangliosiden binden.
Reo-, Ortho- und Paramyxoviren koppeln an Sialinsäure enthaltene Oligosaccharide
und Polioviren an spezifische Immunglobuline, die sogenannten Poliovirusrezeptoren
(BLAKE, 2010; DALEY et al., 2005; DIETZSCHOLD et al., 2005). Murine
Coronaviren nutzen ein karzinoembryonales Adhäsionsmolekül auf B-Lymphozyten
und
Makrophagen
als
spezifischen
Rezeptor
(MATTHEUS
et
al.,
2002).
Paramyxoviren, wie das kanine Staupevirus infiziert Lymphozyten über das CD150Molekül, den sogenannten „signaling lymphocyte activation molecule“ (SLAM)
Rezeptor (WENZLOW et al., 2007).
Eine experimentelle Virusinfektion muss von der natürlichen Virusinfektion des ZNS
abgegrenzt werden. Bei einer experimentellen Infektion durch direkte intrazerebrale
oder -nervale Injektion des Virus oder auch oro-nasale Verabreichung, lässt sich das
Virus zunächst in der Nähe der Infektionsstelle nachweisen. Im weiteren Verlauf
breitet sich die Infektion axonal, liquorogen oder hämatogen weiter aus. Die
Ausbreitung über das periphere Nervensystem bedingt eine Infektion von Axonen
Literaturübersicht
17
oder Dendriten. Neurotrope Viren gelangen bei einer natürlichen Infektion des
Wirtstieres zum einen über periphere sensorische, motorische und autonome Nerven
oder zum anderen hämatogen über die Blut-Hirn-Schranke ins Gehirn. Bornaviren
nutzen zum Beispiel den intraaxonalen Weg über die olfaktorischen Nerven zum
ZNS (CARBONE et al., 1987; MORALES et al., 1988). Das obligat neurotrophe
Tollwutvirus nutzt überwiegend motorische Nerven, um sich transsynaptisch über die
Dendriten auszubreiten (DIETZSCHOLD et al., 2005; UGOLINI, 2008). Im ZNS
können sich neurotrope Viren axonal und transsynaptisch (z.B. das Borna- und
Tollwutvirus), über Ependym- und Plexus choroideus-Zellen und weiter in der
zerebrospinalen Flüssigkeit über das Ventrikelsystem (z.B. LCMV, MHV, Polio-,
Influenza A- und Visna-Viren) oder hämatogen über Blutgefäße der Meningen, des
Plexus choroideus sowie des Gehirns ausbreiten (z.B. LCMV, Staupe-, Retro-,
Masern-, Influenza A- und Lentiviren). Das Staupevirus aus der Familie der
Paramyxoviridae nutzt in der frühen Krankheitsphase die Infektion von Lymphozyten
als Strategie, um hämatogen als „Trojanisches Pferd“ in das ZNS der betroffenen
Tiere zu gelangen (BAUMGÄRTNER et al., 1989; SUMMERS et al., 1978). Im
Gehirn breitet sich das Staupevirus anschließend liquorogen aus. Im weiteren
Verlauf kann eine Infektion des Plexus choroideus sowie eine ependymale und
subependymale
Infektion
in
der
weißen
Substanz
bei
der
Hundestaupe
nachgewiesen werden, wodurch die hierbei auftretende periventrikuläre Entmarkung
erklärt werden kann (VANDEVELDE et al., 1985). Auch eine direkte Ausbreitung des
Hundestaupevirus von meningialen Zellen der Pia mater wird angenommen
(BAUMGÄRTNER et al., 1989). Das Semliki Forest Virus der Mäuse gelangt bei
einer gestörten Blut-Hirnschranke über zerebrale Endothelzellen ins Gehirn, wobei
multifokale perivaskuläre Infiltrate entstehen (FAZAKERLEY, 2002). Bei der
experimentellen Poliovirusinfektion von Mäusen kann ebenfalls eine ependymale
Ausbreitung mit einer Infektion glialer Zellen nachgewiesen werden (IDAHOSONUMA et al., 2002). Eine neurogen aszendierende Infektion des Rückenmarks
wird zusätzlich für Polioviren nach einer intramuskulären Inokulation beschrieben.
Hierbei breitet sich das Virus intraaxonal retrograd über den N. ischiadicus aus (REN
und RACANIELLO, 1992; OHKA et al., 1998). Das MHV vom Serotyp 4 und das
18
Literaturübersicht
neurovirulente
Influenza
A-Virus
breiten
sich
im
Gehirn
der
Maus
nach
intrazerebraler Infektion in der akuten Phase über die Ependymzellen im
Ventrikelsystem aus und sind vier Tage post infectionem periventrikulär in der
weißen Substanz nachweisbar (STOHLMAN und HINTON, 2001; REINACHER et al.,
1983). Bei intranasaler Infektion gelangen sowohl das MHV als auch das Influenza
A-Virus über den N. olfactorius und den N. trigeminus ins Gehirn der Versuchstiere
(PERLMAN et al., 1989; BARNETT und PERLMAN, 1993; REINACHER et al., 1983).
Aus der Familie der Picornaviridae und dem Genus Enterovirus gelangen das
porcine Enterovirus 1, beim Schwein, und das aviäre Enterovirus, beim Vogel,
hämatogen ins ZNS, wo sie eine Enzephalomyelitis beim jeweiligen Tier auslösen
(TYLER und NATHANSON, 2001).
2.5
Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
im Zentralen Nervensystem
Eine natürliche ZNS-Manifestation von TMEV tritt vermutlich nur sehr selten auf und
wurde lediglich auf ein bis zehn Fälle pro 10000 Mäuse geschätzt (THEILER und
GARD, 1940 a und b). Allerdings kam es in einer Mäusekolonie zu einem einmaligen
epidemischen Ausbruch mit einer Mortalität von über 50% durch den hochvirulenten
GDVII-TMEV-Stamm. Die betroffenen Tiere zeigten eine akute Polioenzephalitis
(THOMPSON et al., 1951). Max Theiler gelang es das TMEV aus dem ZNS von
Mäusen mit spontaner schlaffer Gliedmaßenlähmung zu isolieren (THEILER, 1934
und 1937). Alle Mäusestämme entwickeln nach experimenteller intrazerebraler
Infektion mit dem TMEV eine akute Polioenzephalomyelitis von variablem Ausmaß
(BRAHIC et al., 2005).
Der Verbreitungsweg des TMEV in der akuten Infektionsphase im Gehirn und auch
der Weg vom Gehirn ins Rückenmark in der chronischen Erkrankungsphase sind
bisher noch nicht eindeutig geklärt (VILLAREAL et al., 2006; WADA und FUJINAMI,
1993; ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). Die Dorsalstränge des Rückenmarks
Literaturübersicht
19
sind kaum in den Krankheitsprozess einbezogen, was unter anderem darauf
hinweist, dass das Virus über deszendierende Nervenfasern ins Rückenmark gelangt
(TSUNODA et al., 2003). Durch die Lyse der Axone kann das freigesetzte TMEV die
umliegenden Myelinscheiden und Oligodendrozyten infizieren (ROUSSARIE et al.,
2007). Anschließend wird das Virus von Mikroglia/Makrophagen phagozytiert, was
essentiell für die spätere Persistenz des Agens in der weißen Substanz und die
Auslösung der immunpathologischen Reaktionen ist (CLATCH et al., 1986; KATZLEVY et al., 1999; MILLER et al., 2001; TSUNODA und FUJINAMI, 2002; LIPTON et
al., 2005 b). Die Verteilung des Virus im ZNS hängt bei der experimentellen Infektion
von der Injektionsstelle und Infektionsart (orale oder intrazerebrale Infektion) ab (HALEE et al., 1995; VILLARREAL et al., 2006). Nacktmäuse, die mit TMEV in den
olfaktorischen Bulbus oder den Kortex infiziert wurden, weisen zwei Tage post
infectionem das Virus in Neuronen der olfaktorischen Nuklei und in Neuronen der
anteroventralen Kerngebiete des Thalamus und Hippocampus auf. Bis zum zehnten
Tag post infectionem verteilt sich der Erreger im Gehirn in den Regionen des
Dienzephalons sowie in denen des Mittelhirns, Stammhirns und der Medulla. Das
Kleinhirn weist bei diesem Versuchsansatz kein Virusantigen und der N. trigeminus
nur sehr wenige infizierte Zellen auf. Hieraus lässt sich ableiten, dass eine Verteilung
über miteinander verbundene zerebrale Regionen des limbischen Systems im Gehirn
für das TMEV von Bedeutung ist (WADA und FUJINAMI, 1993) (Tab. 2-2). Bei oraler
TMEV-Infektion neonataler Mäuse kann das Virus vorwiegend im Dienzephalon,
Kortex, rostralen Mittelhirn und kaudalen Thalamus nachgewiesen werden. Zuerst
findet sich das Virus bei dieser Infektion in Milz sowie Leber und gelangt
anschließend möglicherweise über vaskuläre Endothelzellen ins Gehirn (HA-LEE et
al., 1995). Über die Virusausbreitung vom Gehirn ins Rückenmark gibt es ebenfalls
verschiedene Hypothesen. In vorangegangenen Studien wurde virale RNS in pialen
Zellen und dem Liquor detektiert, woraufhin eine liquorogene Verteilung postuliert
wurde (YAMADA et al., 1990; TROTTIER et al., 2002). In oral infizierten, neonatalen
Mäusen gelang der Nachweis von TMEV in Ependymzellen der Ventrikelsysteme
oder in der periventrikulären grauen Substanz des ZNS allerdings nicht (HA-LEE et
al., 1995). Der hämatogene Verteilungsweg ist ebensfalls möglich, da virale RNS in
20
Literaturübersicht
Endothelzellen nachgewiesen wurde (WADA und FUJINAMI, 1993; ZURBRIGGEN
und FUJINAMI, 1988). Bei Mäusen, die mit dem GDVII-Stamm infiziert werden,
wandert das Virus axonal über den N. ischiadicus ins Rückenmark (MARTINAT et
al., 1999). Bei einer Studie mit immundefizienten SCID-Mäusen wurde nach direkter
Injektion des DA-Virusstammes in den N. ischiadicus auch eine Infektion der Nerven
und
des
Rückenmarks
nachgewiesen
(DRESCHER
und
TRACY,
2007).
Bemerkenswert ist, dass es bei einer intraperitonealen Infektion von empfänglichen
Mäusestämmen mit dem DA-Stamm in der Regel nach drei Wochen zu einer
demyelinisierenden Myelitis kommen kann, ohne dass das Gehirn pathologische
Veränderungen ausweist. Diese Tatsache deutet auf eine neurogen aszendierende
Infektion des Rückenmarks hin (GOMEZ et al., 1996)(Tab. 2-2).
2.6
Ausbreitung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
im
extraneuralen
Gewebe
nach
natürlicher
und
experimenteller Infektion bei Mäusen
Das TMEV ist ein natürlich vorkommender Erreger der Maus und wird normalerweise
fäkal/oral übertragen und verursacht in der Regel inapparente Magen-DarmInfektionen (OLITSKY, 1939; OLITSKY, 1940; THEILER und GARD, 1940 a und b;
VON ZSCHOCK, 1953; LIPTON et al., 2001). Serumantikörper gegen TMEV können
weltweit in etwa 60% aller freilebenden Hausmäuse (Mus musculus) nachgewiesen
werden, die somit den natürlichen Wirt und das Reservoir für TMEV darstellen
(LIPTON et al., 2001). Bei Labormäusen, die nicht unter spezifisch-pathogenfreien
Bedingungen
gehalten
werden,
kann
das
TMEV
häufig
isoliert
werden
(DESCOTEAUX et al., 1977). Empfängliche Wühlmäuse (Microtus pennsylvanicus)
können außerdem TMEV-spezifische Antikörper aufweisen (DESCOTEAUX und
MIHOK, 1986; LIPTON et al., 2001).
Die natürliche fäkal/orale Infektion findet bei drei bis sechs Wochen alten Mäusen
kurz nach dem Absetzen statt (OLITSKY, 1939). In einer Kolonie sind dabei häufig
Literaturübersicht
21
nahezu alle Tiere betroffen (THEILER und GARD, 1940 a und b). Die Virusreplikation
findet vornämlich im Darmtrakt statt, wobei die Ausscheidungsmenge des TMEV in
den Fäzes zwischen sechster Woche und dem sechsten Monat nach der natürlichen
Infektion drastisch abnimmt. Bei einzelnen Mäusen gelingt es das Virus im Kot bis 53
Tage nach der natürlichen Infektion zu reisolieren (OLITSKY, 1939; THEILER und
GARD, 1940 a und b). Vermutlich persistiert das Virus innerhalb einer
Mäusepopulation durch kontinuierliche, fäkal/orale Neuinfektionen von nichtimmunen
Mäusen (THEILER und GARD, 1940 a und b; GOMEZ et al., 1996; VON ZSCHOCK,
1953; TROTTIER et al., 2002).
Experimentell gelang es nach intramuskulärer oder intraperitonealer TMEV-Injektion
die Herz- und Skelettmuskulatur zu infizieren (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941;
GOMEZ et al., 1996). Auch induzierter sozialer Stress bei einer experimentellen,
intrazerebralen TMEV-Injektion kann sich negativ auf den klinischen Verlauf mit einer
deutlich verminderten Immunantwort im ZNS und daraus resultierenden erhöhten
Virustitern in der akuten Infektionsphase auswirken. Zusätzlich liegt eine deutliche
Thymusatrophie sowie eine Nebennierenhypertrophie und ein verminderter Gehalt
an Lymphozyten sowie eine Erhöhung von neutrophilen Granulozyten im Blut von
gestressten Mäusen vor (CAMPBELL et al., 2001; JOHNSON et al., 2004). Diese
Veränderungen
werden
auf
einen
stress-induzierten
Kortikosteroidspiegel
zurückgeführt, welcher eine Immunsuppression und damit eine verminderte
Entzündungszellantwort bedingt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass
wiederholter
induzierter
Stress
in
der
akuten
Infektionsphase
auch
eine
Virusausbreitung bei der TME in die peripheren Organe wie Lunge, Milz,
Lymhknoten, Thymus und Herz begünstigt (MI et al., 2006). Die Immunsuppression
vermindert auch die Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK) und lässt TNF-α im
Serum gestresster Mäuse ansteigen. Dieses trägt ebenfalls dazu bei, dass das
TMEV nicht aus dem ZNS gestresster Mäuse eliminiert wird (WELSH et al., 2004).
Die hochvirulenten Virusstämme (GDVII, FA) zeichnen sich nach intrazerebraler,
intranasaler und seltener nach intraperitonealer Infektion durch das Hervorrufen einer
akuten Polioenzephalomyelitis aus. Eine experimentelle orale, subkutane oder
intravenöse Infektion bleibt überwiegend erfolglos (THEILER und GARD, 1940 a und
22
Literaturübersicht
b; VON ZSCHOCK, 1953). In der chronischen Infektionsphase nach intrazerebraler
Infektion gelang es bislang nicht, das TMEV mittels Reverse TranskriptasePolymerase-Kettenreaktion
(RT-PCR)
in
extrazerebralen
Organen
von
immunkompetenten Mäusen nachzuweisen (TROTTIER et al., 2002).
2.7
Virale Persistenzmechanismen
Viren werden vom Immunsystem als fremd erkannt und induzieren eine
Immunantwort, welche im Idealfall den Erreger eliminiert. Allerdings haben
verschiedene Viren im Verlauf der Evolution effektive Strategien entwickelt dieser
antiviralen Immunität zu entgehen, um eine fortwährende Replikation bzw. Persistenz
im Wirtsorganismus sicherzustellen. Beispielsweise induzieren bestimmte Viren (z.B.
Pockenviren, Adenoviren, Herpesviren) eine verminderte MHC Klasse I-Expression
der infizierten Zellen, sodass diese nicht mehr von CD8+-T-Effektorzellen erkannt
werden können (OLDSTONE, 2006). Gammaherpesviren persistieren latent in Boder T-Lymphozyten, dabei spielt das sogenannte „genome maintenance protein“
(GMP),
eine
entscheidene
Rolle
(BLAKE,
2010).
Das
Lymphozytäre
Choriomeningitisvirus (LCMV) persistiert in der Maus in B- und T-Lymphozyten und
Monozyten (OLDSTONE, 2006).
Außerdem vermögen verschiedene Viren, wie zum Beispiel das kanine Staupevirus,
durch ihre Affinität für lymphatische Organe die Immunzellen direkt zu zerstören oder
zu modulieren. In diesem Zusammenhang führt die Infektion bestimmter Zelltypen
des lymphoretikulären Systems zu deren Apoptose oder zu einer gestörten
Zytokinexpression.
Hiervon
sind
häufig
antigenpräsentierende
Zellen,
wie
Makrophagen und dendritische Zellen oder CD4+-T-Helferzellen betroffen, wodurch
eine effiziente Induktion der Immunantwort unterbleibt. Viren haben Mechanismen
entwickelt, dem wirtseigenen Interferon (IFN) Type 1-System entgegen zu wirken
und die IFN-Antwort herunter zu regulieren. Das Masernvirus und Respiratorisches
Syntitialvirus blocken beispielsweise die IFN-Produktion durch Beinflussung des tolllike Rezeptor (TLR)-Signalwegs in dendritischen Zellen (OLDSTONE, 2006).
Literaturübersicht
23
Viele negativ-strängige RNS-Viren, wie das Tollwut- und Bornavirus besitzen das
Phosphorprotein, welches als IFN-Antagonist fungiert (HALLER et al., 2006). Eine
immunologische Toleranz mit klonaler Depletion virusspezifischer T-Zellen kann
insbesondere bei fetalen oder frühen postnatalen Virusinfektionen beobachtet
werden. Diesen Persistenzmechanismus findet man bei dem Model der kongenitalen
LCMV-Infektion der Maus (OLDSTONE, 2009). Die gehemmte Immunität ist hierbei
auf das jeweilige Virus beschränkt, während die Immunabwehr gegen andere
Erreger nicht beeinflusst ist. Außerdem besitzen verschiedene virale Proteine
immunmodulatorische Eigenschaften und vermögen so immunologische Funktionen
von infizierten, aber auch von nicht infizierten Zellen zu beeinflussen. Beispiele
hierfür sind die virusinduzierten Hemmungen der Zellproliferation und der
Komplementaktivierung durch Lenti-, Polio- und Herpesviren (OLDSTONE, 2006).
Weiterhin führt eine Dysregulation der Zytokinexpression beispielsweise über
erhöhte IL-10- und verminderte IL-12-Sekretionen zu einer gestörten Immunabwehr.
In diesem Zusammenhang findet sich bei der Infektion mit dem Felinen
Immundefizienz-Virus (FIV) der Katze eine immunologische Anergie mit vermehrter
Apoptoseinduktion von Immunzellen und Expansion von regulatorischen T-Zellen.
Neuere therapeutische Strategien bei chronischen Viruskrankheiten in der Humanund Tiermedizin basieren daher unter anderem auf der Beeinflussung der Expression
von
programmed
cell
death-1
(PD-1)
und
IL-10,
um
virusinduzierte
Immunsuppressionen zu unterbrechen (MARTINIC und VON HERRATH, 2008).
Weiterhin ist die fehlende oder reduzierte Expression von MHC I-Molekülen auf der
Oberfläche von Neuronen ein Grund für die neuronale Persistenz vieler Viren, da die
virusspezifische, zytotoxische T-Zellantwort dadurch erheblich abgeschwächt wird
(JOLY et al., 1991). Neuronale Persistenz zeigen die unterschiedlichsten Viren, wie
z. B. Paramyxo-, Borna- und Tollwutviren (BAUMGÄRTNER et al., 1989; CARBONE
et al., 1987; DIETZSCHOLD et al., 2005). Alphaherpesviren persistieren latent in
sensorischen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Mikroglia dienen
ebenfalls der dauerhaften Persistenz und Replikation von Viren, z.B. von
verschiedenen Morbilliviren sowie von den Semiki Forest Virus oder MHV (BURKE
und COX, 2010; FAZAKERLEY, 2002). Das Gehirn als ein Zielorgan begünstigt eine
24
Literaturübersicht
virale Persistenz, da die Blut-Liquor-Schranke nur ein limitiertes Einwandern von
Lymphozyten zur antiviralen Abwehr ermöglicht (OLDSTONE und RALL, 1993).
2.8
Zelltropismus und Persistenz des murinen TheilerEnzephalomyelitisvirus im Zentralen Nervensystem
Der Zelltropismus des TMEV im Verlauf der experimentellen Infektion ist maßgeblich
abhängig von dem genetischen Hintergrund und der Immunkompetenz der
verwendeten Mäuse. Vergleichbar der Virusausbreitung wird darüber hinaus die
Infektion der primären Zielzelle in der akuten bzw. chronischen Phase durch den
Versuchsaufbau, insbesondere durch die Injektionsart beeinflusst (Tab. 2-2).
Nach intrazerebraler Injektion mit einem hoch- (z.B. GDVII)- oder einem
schwachvirulenten (z.B. DA oder BeAn)-TMEV-Stamm in die Großhirnhemisphäre
zeigt sich bis zum zehnten Tag post infectionem eine Virusreplikation überwiegend in
den Neuronen der grauen Substanz. Virusantigen und virale RNS können in den
Neuronen und auch deren Axone in der Nähe der Injektionsstelle sowie bilateral
symmetrisch in der Pyramidalzellschicht des Hippokampus nachgewiesen werden.
Dieses ist charakteristisch für die akute Erkrankungsphase nach experimenteller
Infektion in allen Mäusestämmen ungeachtet ihres genetischen Hintergrundes
(AUBERT und BRAHIC, 1995; DAL CANTO und LIPTON, 1975; ZURBRIGGEN und
FUJINAMI, 1988). Anschließend gehen die infizierten Neuronen und ihre Axone
durch Apoptose zugrunde. Allerdings breiten sich das DA-Virus sowie das GDVIIVirus zunächst in den ersten Tagen nach der Infektion axonal weiter aus (MARTINAT
et al., 1999; DAL CANTO und LIPTON, 1982; TSUNODA et al., 2003) (Tab.2-2).
Neben dem Vorkommen in Neuronen des Gehirns repliziert sich der DA-TMEVStamm vier Tage post infectionem in SJL/J-Mäusen auch zu einem geringen Anteil in
Astrozyten und Makrophagen/Mikroglia. Der GDVII-Virusstamm infiziert zum gleichen
Zeitpunkt annähernd zehnmal mehr Neurone als der schwachvirulente DA-Stamm
(AUBERT und BRAHIC, 1995). Die Apoptose zahlreicher Nervenzellen in der akuten
Literaturübersicht
25
Phase im Gehirn und Rückenmark ist vermutlich als eine aktive Abwehrreaktion nach
der akuten Virusinfektion mit dem GDVII-Virusstamm zu sehen, wenngleich sie den
Tod der Tiere bedingt (TSUNODA et al., 1997). Bei dem schwachvirulenten DAVirusstamm finden sich in der Spätphase der Infektion vorwiegend apoptotische
Oligodendrozyten in den demyelinisierenden Läsionen sowie Apoptosen von
mononukleären Zellen in den perivaskulären Infiltraten und in der weißen Substanz
des Rückenmarks von infizierten SJL/J-Mäusen, welche nicht direkt den Tod der
Mäuse implizieren oder zur Eliminierung des Virus führen (TSUNODA et al., 1997).
Das schwachvirulente DA-Virus kann am vierten Tag post infectionem auch in
einigen Neuronen des Rückenmarks nachgewiesen werden. Ab dem elften Tag nach
der Infektion findet eine Vermehrung des TMEV in der spinalen, weißen Substanz
vor allem in intraläsionalen Makrophagen und Astrozyten statt (DAL CANTO und
LIPTON, 1982; RODRIQUEZ et al., 1983 b). Im Verlauf der experimentellen Infektion
kommt
es
zu
PFU/Rückenmark
einer
Reduktion
der
Virusmenge
im
Rückenmark
(>
106
am 15. Tag post infectionem im Vergleich zu 102 bis 104
PFU/Rückenmark am 28. Tag post infectionem). Allerdings ist die Persistenz mit
einer kontinuierlichen Replikation viraler RNS während der chronischen Phase
vergesellschaftet (SETHI und LIPTON, 1983; TROTTIER et al., 2001). Erst am 28.
Tag
nach
der
Infektion
befindet
sich
das
TMEV
im
Zytoplasma
von
Oligodendrozyten, Astrozyten und Makrophagen der weißen Substanz und nicht
mehr in Neuronen der grauen Substanz des Rückenmarks von SJL/J-Mäusen. Ab
dem 45. Tag post infectionem kann DA-Virusantigen vorwiegend in Oligodendrozyten
nachgewiesen werden (RODRIQUEZ et al., 1983 a). Mittels in situ-Hybridisierung
wird virale RNS des DA-Virus in 25-40% der Oligodendrozyten, 10% der Mikroglia
und 5-10% der Astrozyten im Zeitraum von zwei bis sechs Monaten post infectionem
detektiert (AUBERT et al., 1987). Andere Untersuchungen zeigen jedoch, dass
Astrozyten die primären Zielzellen für die virale Persistenz darstellen. In dieser
Untersuchung konnte virale RNS und Antigen des BeAn-Stammes vorwiegend in
Astrozyten von infizierten SJL/J-Mäusen dargestellt werden (ZHENG et al., 2001). Im
Gegensatz dazu wurde in anderen Studien eine bevorzugte Replikation und
Persistenz des BeAn-Virus in Makrophagen des Rückenmarks von chronisch
26
Literaturübersicht
infizierten SJL/J-Mäusen nachgewiesen (CLATCH et al., 1990; LIPTON et al., 1995).
Die Immunfluoreszenzdoppelmarkierung zeigt DA- und BeAn-Virus-Antigen an Tag
45. und 90. post infectionem bei SJL/J-Mäusen in Oligodendrozyten und
Makrophagen/Mikroglia der weißen Substanz des Rückenmarks und Stammhirns
(ZOECKLEIN et al., 2003). Zu keinem Infektionszeitpunkt wurde bislang DAVirusantigen
in
Ependymzellen
oder
infiltrierten
T-
und
B-Lymphozyten
nachgewiesen (HA-LEE et al., 1995; LIPTON et al., 1995; SETHI und LIPTON, 1983;
ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). In vitro gelang es das TMEV in
zerebrospinalen Endothelzellen zu vermehren, so dass eine virale Persistenz in
diesen Zellen und auch eine Ausbreitung in vivo postuliert wurde (SAPATINO et al.,
1995). Im Gehirn und Rückenmark infizierter Nacktmäuse wurde TMEV-RNS in
vaskulären Endothelzellen und in der Nähe von Blutgefäßen mittels in situHybridisierung detektiert. Vier Monate nach der intrazerebralen Infektion mit dem
BeAn-Stamm wies keine Maus Virus im Herz, Verdauungstrakt und den
mesenterialen Lymphknoten auf (ZURBRIGGEN und FUJINAMI, 1988). Diese
Ergebnisse sprechen für eine primäre Persistenz des TMEV im ZNS und nicht in
peripheren extraneuralen Organen von immunkompetenten Mäusen. Mittels RT-PCR
wurde virale RNS des BeAn-Virus in der chronischen Infektionsphase hauptsächlich
im Rückenmark und in geringen Mengen im Klein- und Stammhirn sowie in der
zerebrospinalen Flüssigkeit von SJL/J-Mäusen detektiert (TROTTIER et al., 2002).
Somit persistiert das schwachvirulente TMEV vorwiegend in der weißen Substanz
des Rückmarks, sowie des Klein- und Stammhirns, jedoch nicht im Großhirn
(YAMADA et al., 1990).
intrazerebral
intraperitoneal
intrazerebral
intrazerebral
intraperitoneal
intrazerebral
intraokulär
intravenös
intrazerebral
oral
intrazerebral
(Cortex)
DA
DA
DA
DA
DA
DA
DA
DA
DA
weibliche, 21-28 Tage alte
SJL/J-Mäuse
weibliche, 28-42 Tage alte
Nacktmäuse
weibliche, 1-2 Tage
alte Mäuse*
weibliche, 42 Tage
alte SJL/J-Mäuse
weibliche, 42-70 Tage alte
C57BL/6-Mäuse
weibliche, 10-14 Tage alte
C57BL/6-, SJL/J-, CD-1-,
ABY/SnJ-, BALB/c-, DBA-,
SWR/J-, SCID-Mäuse
männliche, 28 Tage alte,
BALB/c Nacktmäuse
weibliche, 42-70 Tage alte
SJL/J-Mäuse
weibliche, 1-28 Tage
alte SJL/J-Mäuse
weibliche, 28 Tage
alte SJL/J-Mäuse
weibliche, 21-28
Tage alte SJL/J-Mäuse
weibliche , 14-28 Tage
alte SJL/J-Mäuse
Mäusestamm
Neurone, Astrozyten
-
Großhirn
Rückenmark
Rückenmark
Gehirn (limbisches
System), Rückenmark
Gehirn, Rückenmark
Rückenmark
Gehirn, Rückenmark
Gehirn, Rückenmark,
Herz- und
Skelettmuskulatur
Großhirn,
Kleinhirn, Stammhirn,
Rückenmark
ZNS, periphere
Organe
Rückenmark
-
Neurone
Makrophagen,
Mikroglia
Neurone
Neurone
Neurone
Kardiomyozyten,
Myozyten
-
-
Neurone, Astrozyten
Astrozyten, Neurone
-
Neurone, Myozyten
Neurone
Rückenmark,
Stammhirn
Großhirn
Neurone, Makrophagen,
Mikroglia, Astrozyten
Neurone
initiale Infektion
Gehirn, Rückenmark
untersuchte
Lokalisation
Oligodendrozyten,
Astrozyten,
Makrophagen, Mikroglia
-
-
Mononukleäre Zellen,
Makrophagen,
Astrozyten
-
-
Kardiomyozyten,
Myozyten
-
Makrophagen, Mikroglia,
Oligodendrozyten
Makrophagen,
Astrozyten,
Oligodendrozyten
Oligodendrozyten
Oligodendrozyten,
Astrozyten,
Makrophagen
-
-
Makrophagen,
Mikroglia
-
persistente
Infektion
-
intraaxonal,
hämatogen,
liquorogen
neuronal,
hämatogen,
intraaxonal
intrazellulär
transsynaptisch
intraaxonal
-
intrazellulär
-
hämatogen
intraaxonal,
hämatogen,
liquorogen
intraaxonal
intrazellulär
Ausbreitungshypothese
60-180 dpi
2-14 dpi
1-9 dpi
7- 29 dpi
22-43 dpi
10-164 dpi
5-28 dpi
7- 84 dpi
21- 180 dpi
45 - 360 dpi
4 dpi
11 dpi
28 dpi
3-28 dpi
11 dpi
28 dpi
5 dpi
3 dpi
4 dpi
Untersuchungszeitpunkt
nach Infektion
AUBERT et al., 1987
WADA und FUJINAMi, 1993
HA-LEE et al., 1995
SETHI und LIPTON, 1983
LOVE, 1987
GOMEZ et al., 1996
ZOECKLEIN et al., 2003
RODRIQUEZ et al., 1983
RODRIGUEZ et al., 1983
AUBERT und BRAHIC, 1995
Literaturnachweis
TMEV = murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus, dpi = Tage nach der Infektion (days post infection), - = keine Angabe, ZNS =
Zentrales Nervensystem; * keine Angabe des Mäusestammes
intrazerebral
(Bulbus olfactorius)
intrazerebral
intrazerebral
DA
DA
Art der
Virusinfektion
TMEVStamm
– zusammenfassende Übersicht der Literaturangaben
Tabelle 2-2: Nachweis des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus in experimentell-infizierten Mäusen
Literaturübersicht
27
intrazerebral
BeAn
BeAn
subkutan (linker
Hinterfußballen)
intrazerebral
BeAn
GDVII
weibliche, 28-35 Tage alte
SJL/J-Mäuse
weibliche, 21-28 Tage
alte SJL/J-Mäuse
weibliche, 42-70 Tage
alte C57BL/6-Mäuse
weibliche, 21-28 Tage alte
SJL/J-Mäuse
weibliche, 42 Tage
alte SJL/J-Mäuse
weibliche, 42-56 Tage alte
SJL/J-Mäuse
weibliche, 35-42 Tage alte
SJL/J-Mäuse
N. ischiadicus,
Rückenmark
Gehirn
Großhirn, Kleinhirn,
Stammhirn,
Rückenmark
Rückenmark
Rückenmark
Rückenmark
Großhirn,
Kleinhirn, Stammhirn,
Rückenmark
Gehirn, Rückenmark
Rückenmark
N. ischiadicus,
Rückenmark
Rückenmark
Rückenmark
Gehirn
Rückenmark
Gehirn
untersuchte
Lokalisation
Neurone
Axone
-
-
-
-
-
-
-
Makrophagen,
Oligodendrozyten
Makrophagen
Astrozyten,
Makrophagen
Makrophagen,
Makrophagen,
Mikroglia,
Oligodendrozyten
-
-
-
Oligodendrozyten
Neurone, Astrozyten
Makrophagen,
Astrozyten
Oligodendrozyten
Makrophagen,
Mikroglia
-
Makrophagen,
Oligodendrozyten
-
-
persistente
Infektion
Neurone, Astrozyten
-
Schwann-Zellen und
Makrophagen
-
Neurone,
Makrophagen,
Mikroglia
-
Neurone, Astrozyten,
Makrophagen
-
initiale Infektion
-
intraaxonal
intrazellulär
intrazellulär
intrazellulär
intrazellulär
-
intrazellulär
-
transsynaptisch
-
-
intraaxonal
intrazellulär
intraaxonal,
intrazellulär
intrazellulär
Ausbreitungshypothese
4 dpi
1-5 dpi
46-124 dpi
14-49 dpi
33- 225 dpi
56 dpi
21-180 dpi
1- 268 dpi
1-268 dpi
60- 240 dpi
31-99 dpi
4-7 dpi
7- 21 dpi
3 dpi
14- 45 dpi
8- 11 dpi
Untersuchungszeitpunkt
nach Infektion
AUBERT und BRAHIC, 1995
MARTINAT et al., 1999
TROTTIER et al., 2002
LIPTON et al., 1995
CLATCH et al., 1990
ZHENG et al., 2001
ZOECKLEIN et al., 2003
SIMAS und FAZAKERLY, 1996
BLAKEMORE et al., 1988
SCHLITT et al., 2003
DRESCHER und TRACY, 2007
ZURBRIGGEN und FUJINAMI,
1988
PENA ROSSI et al., 1997
Literaturnachweis
TMEV = murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus, dpi = Tage nach der Infektion (days post infection), - = keine Angabe, ZNS =
Zentrales Nervensystem SCID = schwerer kombinierter Immundefekt (severe combined immunodeficiency) ; # keine Angabe des
Alters
GDVII
intrazerebral
intrazerebral
BeAn
intrazerebral
intrazerebral
BeAn
intrazerebral
intrazerebral
BeAn
BeAn
weibliche, 42 Tage
alte SCID-Mäuse
weibliche, adulte SJL/J#
Mäuse
weibliche, 28-42 Tage alte
CBA-Mäuse
weibliche, 21-28 Tage alte
CBA-Mäuse
weibliche, 21-28 Tage
alte BALB/c-Mäuse
weibliche, 42-70 Tage alte
SJL/J-Mäuse
intraneural (N.
Ischiadicus)
intrazerebral
DA
BeAn
weibliche, 35 Tage
alte SCID-Mäuse
intrazerebral
DA
weibliche, 28 Tage
alte SJL/J-Mäuse
intrazerebral
DA
Mäusestamm
Art der
Virusinfektion
TMEVStamm
– zusammenfassende Übersicht der Literaturangaben
Tabelle 2-2, Fortsetzung: Nachweis des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus in experimentell-infizierten Mäusen
28
Literaturübersicht
Hypothesen und Ziele
3
29
Hypothesen und Ziele
In vorausgegangenen Untersuchungen über die Pathogenese der TME lag ein
besonderes Augenmerk auf der chronischen, demyelinisierenden Erkrankungsphase
dieses Tiermodells der MS (LIPTON et al., 1994, TSONUDA et al., 2003). Über die
akute Infektionsphase sowie über die Ausbreitung des Virus nach experimenteller
intrazerebraler Infektion im ZNS, insbesondere im Gehirn sowie in extraneuralen
Gewebe der Mäuse, gibt es vergleichsweise wenige Studien. Bei der MS treten die
demyelinisierenden Läsionen vorwiegend im Gehirn auf, so dass sich die Frage
stellt, ob Parallelen zu der MS hinsichtlich der Läsionsentwicklung im Gehirn von
TMEV-infizierten Mäusen gefunden werden können. Außerdem ergibt sich die Frage
nach der Virusausbreitung in verschiedenen Regionen des ZNS (VELLINGA et al.,
2009).
Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit bestand in der Herstellung und
Charakterisierung eines TMEV-spezifischen polyklonalen Antikörpers im Kaninchen,
welcher für weiterführende immunhistologische, immunfluoreszenzmikroskopische
und immunelektronenmikroskopische Studien verwendet werden kann.
Basierend auf den Ergebnissen des ersten Teiles war es das Ziel des zweiten Teils
der vorgelegten Arbeit, mittels des hergestellten Antikörpers die Verteilung des
TMEV in empfänglichen SJL/J- und resistenten C57BL/6-Mäusen während des
Infektionsverlaufes
vergleichend
zu
charakterisieren.
Zusätzlich
wurde
die
Ausbreitung der viralen RNS mittels in situ-Hybridisierung in beiden Mäusestämmen
ermittelt. Schließlich diente die immunfluoreszenzmikroskopische Doppelmarkierung
zur Ermittlung der Persistenz des BeAn-Virus zu verschiedenen Zeitpunkten der
Infektion und in unterschiedlichen Regionen des ZNS.
Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse sollen zu einer detaillierten
Charakterisierung
des
Verlaufes
der
experimentellen
Vergleichbarkeit mit der MS des Menschen beitragen.
TME
und
deren
30
4
Periventricular brain lesion development
Generation and characterization of a polyclonal
antibody
for
the
encephalomyelitis
detection
of
virus
light
by
Theiler´s
and
murine
electron
microscopy
Maren Kummerfeld a, Jochen Meens b, Ludwig Haas
c
,
Wolfgang Baumgärtner a,
Andreas Beineke a*
a
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg
17, D-30559 Hannover, Germany
b
Department of Microbiology and Infectious Diseases, University of Veterinary
Medicine Hannover, Bischhofsholer Damm 15, D-30173 Hannover, Germany
c
Department of Virology, University of Veterinary Medicine Hannover, Bünteweg 17,
D-30559 Hannover, Germany
Published in:
The Journal of Virological Methods
160: 185-188, 2009
*
Corresponding Author:
Prof. Dr. Andreas Beineke, Dipl. ECVP
Department of Pathology
University of Veterinary Medicine Hannover
Bünteweg 17
D-30559 Hannover
Tel: +49 (0) 511 953 8640
Fax: +49 (0) 511 953 8675
E- mail address: [email protected]
Periventricular brain lesion development
5
31
Periventricular brain lesion development and regionspecific susceptibilities to demyelination in a viral
murine model for multiple sclerosis
Maren Kummerfeld a, Stephanie Klein a, Reiner Ulrich a, Robert Kreutzer a, Ingo
Gerhauser a, Wolfgang Baumgärtner a, b, Andreas Beineke a
a
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hanover, Bünteweg
17, D-30559, Hanover, Germany.
b
Center for Systems Neuroscience Hanover, Bünteweg 17, D-30559, Hanover,
Germany.
Submitted 2010
Corresponding author:
Prof. Dr. Andreas Beineke, Dipl. ECVP
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine Hanover.
Bünteweg 17, D-30559 Hanover, Germany
Phone: +49-(0)511-953-8640
Fax: +49-(0)511-953-8675
Email: [email protected]
32
5.1
Periventricular brain lesion development
Abstract
The Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection of mice is a widely
used animal model for demyelinating disorders, such as multiple sclerosis in humans.
The aim of the present study was to identify topographical differences of TMEV spread
and demyelination in the central nervous system (CNS) of experimentally infected
susceptible SJL/J mice and C57BL/6 mice, which are resistant to virus-induced
demyelination. Viral dissemination within the CNS and extraneural tissues was
quantified by immunohistochemistry and in situ- hybridization. Further, the phenotype
of infected cells was identified by confocal laser scanning microscopy. Inflammatory
responses and demyelination within the CNS was determined by a semiquantitative
scoring system. Furthermore, accumulation of microglia/macrophages was quantified
in different CNS regions by CD107b-specific immunohistochemistry. Results show an
early infection of ependymal and periventricular cells followed by inflammation and
demyelination around the fourth ventricle in susceptible SJL/J mice. While
periventricular demyelination was transient, white matter lesions of brain stem and
spinal cord progressed. Myelin loss was associated with an accumulation of CD107b+
microglia/macrophages. Summarized, the demonstration of ependymal infection and
subjacent spread into the brain parenchyma as well as regional virus clearance
despite ongoing demyelination in other CNS compartment allows new insights into
TME pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance our
understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities of
the brain in this infectious MS model.
Key words: multiple sclerosis, Theiler’s murine encephalomyelitis virus, viral spread,
periventricular demyelination
Periventricular brain lesion development
5.2
33
Introduction
Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune demyelinating disorder of the central
nervous system (CNS) in humans with unknown etiology (Rosche et al., 2003).
Although the likelihood of developing MS is influenced by different genetic and
environmental factors, the underlying mechanisms are poorly understood (Baranzini
et al., 2010). Based on epidemiological data, several infectious agents, including
human herpesvirus-6, Epstein-Barr virus, MS-associated retrovirus, canine distemper
virus and measles virus have been suggested to play a role in the pathogenesis,
however, so far, no direct causality has been established (Cepok et al., 2005; Sips et
al., 2007; Swanborg et al., 2003). The most popular theory linking autoimmunity to
MS is that a triggering infection by a virus induces molecular mimicry due to
antigenetic similarities between viral and host proteins (hit- and run-theory).
Subsequently, autoaggressive immune responses are extended to other CNSderived antigens by epitope spreading. Alternatively, immune mediated tissue
damage can result from viral persistence in which the host immune response is
directed against viral rather than self proteins due to the release of myelinotoxic
substances by activated microglia/macrophages (bystander demyelination) or
delayed type hypersensitivity, respectively (Lipton et al., 2007). MS is characterized
by focal to confluent demyelinating plaques in the white matter with axonopathy and
atrophy of the neuroparenchyma. Here, topographically variable susceptibilities to
injury or specific predilection sites, such as the optic nerves, brain stem and
cerebellum can be observed in different MS forms (Hu and Luchinetti, 2009).
Moreover, the periventricular region seems to be particularly vulnerable and often
affected by intense inflammation and myelin loss during the disease course (Adams
et al., 1987; Patrikios et al., 2006). In addition to white matter lesions, patients with
progressive MS exhibit inflammation and myelin damage also in the cerebral and
cerebellar cortical grey matter (Kutzelnigg et al., 2005 and 2007; Pirko et al., 2007
and 2009).
The experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection of mice
is a widely used animal model for demyelinating disorders, such as MS. The agent is
34
Periventricular brain lesion development
a single-stranded RNA virus which belongs to the cardiovirus genus of the family
Picornaviridae. Two major subgroups of TMEV can be distinguished based on their
neurovirulence after intracerebral infection (Oleszak et al., 2004). Neurovirulent
strains, including the GDVII and FA strains, cause acute fatal encephalitis with
widespread neuronal death in the cerebrum (Aubert and Brahic, 1995). In
comparison, the BeAn and Daniels strains, also called Theiler´s original strains, are
characterized by low neurovirulence and the ability to induce long term CNS
inflammation. Usually, an initial infection of neurons and astrocytes in the
hippocampus, thalamus, hypothalamus and brain stem nuclei associated with an
acute polioencephalitis can be observed in mice after intracerebral infection by these
strains (Rodriguez et al., 1983; Simas and Fazakerly, 1996). The subsequent
disease course depends decisively upon the genetic background of the animals.
Thus, while the virus is eliminated from the brain in resistant C57BL/6 mice after the
initial phase, an inadequate antiviral immune response leads to viral persistence in
susceptible SJL mice (Chamorrow et al., 1988; Gerhauser et al., 2007a, 2007b,
Pavelko et al., 2000). Viral antigen-induced delayed-type hypersensitivity by
activated
microglia/macrophages
and
myelin-specific
autoimmunity
induce
inflammatory demyelination predominantly in the spinal cord of susceptible mouse
strains, resembling the chronic progressive form of MS. Recently, up-regulation of
gene expression associated with intrathecal antibody production and antigen
presentation has been detected in the spinal cord of TMEV infected mice by
microarray analysis, supporting the view of a CNS-restricted immune response
during disease progression (Ulrich et al., 2010). Similarly, compartimentalized
inflammation within the brain trapped behind a closed blood brain barrier has been
suggested to contribute to prolonged lesion development and therapy failure in MS
patients (Hochmeister et al., 2006; Lassmann et al., 2007). In comparison, during the
early phase of Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) immune responses can be
observed in the CNS-draining cervical lymph node, indicative of peripheral antiviral
immunity triggered by dendritic cells (McMahon et al., 2005; Navarrete-Talloni et al.
2010, in press). Since CNS-derived antigen presenting cells gain access to the
lymphatic system via the cerebrospinal fluid and are able to migrate from the
Periventricular brain lesion development
35
ventricular system to periventricular demyelinating foci in experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE) in rats (Hatterer et al., 2008), these studies have raised the
question of region-specific CNS lesion development and viral spread during the
initiation and progression of experimental TME.
Axonal transport is supposed to be the primary mode of virus transmission within the
CNS grey matter during the acute TME phase and possibly responsible for the
spread to the white matter (Rodriguez et al., 1983b; Tsunoda et al., 2003). In
addition, TMEV RNA has been detected also in the cerebrospinal fluid by reverse
transcriptase-polymerase chain reaction, demonstrating the possibility of additional
routes, such as a liquorogenic transport, to play a role for viral dissemination (Trottier
et al., 2002). Further, TMEV has been detected in forebrain subventricular zone in
experimentally infected mice during the acute disease phase (Goings et al., 2008).
However, ependymal infection and periventricular demyelination, as demonstrated in
other infectious demyelinating disorders, such as canine distemper leukoencephalitis
(Beineke et al., 2009) has not yet been described in this murine MS model.
The aim of the present study was to facilitate a detailed analysis of the spatial and
temporal distribution of TMEV in experimentally infected SJL/J mice in comparison to
C57BL/6 mice to detect region-specific susceptibilities to virus-induced CNS injury.
Special emphasis was given to test the hypothesis of the occurrence of
periventricular demyelination as observed in MS patients.
36
5.3
Periventricular brain lesion development
Materials and Methods
Experimental design
Forty-eight, five-week-old female SJL/J HanHsd mice and 48 C57BL/6 mice (Harlan
Winkelmann, Borchen, Germany) were inoculated into the right cerebral hemisphere
with 1.63x106 plaque-forming units/mouse of the BeAn-strain of TMEV in 20µl
Dulbecco’s Modifid Eagle Medium (PAA Laboratories, Cölbe, Germany) with 2% fetal
calf serum and 50µg/kg gentamycin. The same number of control animals received
20µl of the vehicle only (sham-infected animals). Inoculation was carried out under
general anesthesia with medetomidine (0.5 mg/kg, Domitor, Pfizer, Karlsruhe,
Germany) and ketamine (100 mg/kg, Ketamine 10%, WDT eG, Garbsen, Germany).
All experiments were performed in groups of six TMEV and sham-infected mice,
euthanized one hour after intracerebral inoculation (0 days post infection [dpi]) as well
as 4, 7, 14, 28, 56, 98 and 196 dpi. For histology, immunohistochemistry and in situhybridization, brain was removed immediately after death and transversely transected
within the cerebrum (bregma -2.18 mm) and the cerebellum with brain stem (bregma 5.88 mm). Subsequently, tissues were fixed in 10% formalin for 24 hours and
embedded in paraffin wax. In addition, thoracic spinal cord segments encased in
vertebral
bodies
were
formalin
fixed,
decalcified
in
25%
dinatriumethylenediaminetetraacetic solution (EDTA) for 48 hours and subsequently
embedded in paraffin wax (Ulrich et al., 2006). In addition, brain and spinal cord
tissue was immediately snap frozen for immunofluorescence double labeling and
stored at -80°C until use.
In order to detect possible systemic viral spread, samples of the gastrointestinal tract,
liver, pancreas, respiratory tract (lung, trachea, and nasal cavity), urogenital tract
(kidney, urinary bladder, uterus, and ovary), cardiovascular system (heart and aorta),
lymphoid organs (spleen and thymus as well as cervical, axillary, brachial,
mediastinal, mesenteric, renal, pancreatic, lumbar, sacral, popliteal, and inguinal
lymph nodes) and peripheral nerves (brachial and sciatic nerves) were fixed in 10%
formalin and embedded in paraffin.
Periventricular brain lesion development
37
The animal experiments were approved and authorized by the local authorities
(Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz- und Lebensmittelsicherheit
(LAVES), Oldenburg, Germany, permission numbers: 509c-42502-02/589, 509.642502-04/860 and 33-42502-05/963)
Histological examination of brain and spinal cord
Transversal sections of formalin fixed, paraffin embedded cerebrum, cerebellum,
brain stem and spinal cord were stained with hematoxylin and eosin (HE).
Inflammatory responses within the CNS were graded based upon the degree of
perivascular lymphohistiocytic infiltrates (PVI) using a semiquantitative scoring
system: 0 = no changes, 1 = scattered perivascular infiltrates, 2 = 2 to 3 layers of
perivascular inflammatory cells, 3 = more than 3 layers of perivascular inflammatory
cells, as described previously (Gerhauser et al., 2007a). The gliosis within affected
CNS areas was graded semiquantitatively as follows: + = 1-25 cells; ++ = 26-50 cells;
+++ = > 50 cells.
For the evaluation of myelin loss, serial sections of the brain and spinal cord were
stained with Luxol fast blue-cresyl violet and the degree of demyelination was
semiquantitatively evaluated as follows: 0 = no change, 1 = 25%, 2 = 25-50% and
3 = 50-100% of the white matter affected (Gerhauser et al., 2007a).
Virus detection
Virus dissemination during early (0, 4, 7 and 14 dpi) and late time points (28, 56, 98
and 196 dpi) was investigated by immunohistochemistry and in situ-hybridization in
brain and spinal cord as well as in extraneural tissues.
Immunohistochemistry was performed using a polyclonal rabbit anti-TMEV capsid
protein VP1-specific antibody, as described before (Kummerfeld et al., 2009). Briefly,
for blocking of the endogenous peroxidase, formalin fixed, paraffin embedded tissue
sections were treated with 0.5% H2O2 diluted in methanol for 30 min at room
temperature (RT). Subsequently, slides were incubated with the primary antibody at a
dilution of 1:2000 for 16 hours at 4°C. Goat-anti-rabbit IgG diluted 1:200 (BA9200,
H+L, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) was used as a secondary antibody
38
Periventricular brain lesion development
for one hour at RT. Sections used as negative controls were incubated with rabbit
normal serum at a dilution of 1:2000 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen,
Germany). Slides were subsequently incubated with the peroxidase-conjugated avidinbiotin complex (ABC method, PK-6000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) for
30 min at RT. After the positive antigen-antibody reaction visualization by incubation
with 3.3-diaminobenzidine-tetrachloride (DAB) in 0.1M imidazole, sections were
counterstained with Mayer’s hematoxylin.
In situ-hybridization was performed as described before (Gröters et al., 2005; Ulrich et
al., 2006). For the detection of TMEV specific RNA, a polymerase chain reaction
product homologous to the base pair 193 to 322 of the nucleotide sequence for BeAn
8386 strain (Pevear et al., 1987) was generated from a TMEV infected baby hamster
kidney cell culture by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using the
sense
primer
5`GACTAATCAGAGGAACGTCAGC
and
the
anti-sense-primer
5`GTGAAGAGCGGCAAGTGAGA. The obtained PCR product was cloned in the
PCR 4-TOPO plasmid vector and amplified in DH5α-T1® cells (TOPO TA Cloning Kit
for sequencing; Invitrogen, Karlsruhe, Germany). The plasmid was sequenced
(SEQLAB, Göttingen, Germany) and the sequence is accessible under the GenBank
(accession number: AY618571). In vitro transcription was carried out according to
manufacturer’s
instructions
with
DIG-RNA-labeling
Mix
and
T3-
and
T7-RNA-polymerases (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Tissue sections
were dewaxed in xylene, hydrated in graded ethanol, and washed in ultrapure,
pyrogen-free, diethylpyrocarbonate-treated water (DEPC; Sigma-Aldrich Chemie,
Taufkirchen, Germany; 0.1% in ultrapure, pyrogen-free water). After proteolyses (5
µg/ml proteinase K, Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), acetylation and prehybridization, hybridization was performed overnight in a moist chamber at 52°C with
a probe concentration of 200 ng/ml. The detection system consisted of an anti-DIGantibody conjugated with alkaline phosphatase (1:200, Roche Diagnostics,
Mannheim, Germany) and the substrates nitroblue tetrazoluimchloride (NBT) (both
Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl
phosphate (BCIP, X-Phosphate) (Sigma-Aldrich Chemie, Taufkirchen, Germany),
which yielded a bluish precipitate.
Periventricular brain lesion development
39
The absolute numbers of TMEV-infected cells labeled by immunohistochemistry and
in situ-hybridization, respectively, were counted in different regions of the CNS.
Immunofluorescence double labeling and confocal laser scanning microscopy
The phenotypes of infected cells within the CNS white matter were determined by
immunofluorescence double labeling on representative slides of the brain and spinal
cord at 4, 28, 56 and 98 dpi.
Astrocytes were detected by the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP),
while oligodendocytes and microglia/macrophages were labeled with CNPase- and
F4/80-specific antibodies, respectively. Methanol-fixed frozen sections of pre-elected
tissues were rinsed in 0.1% Triton X-100 in PBS for 30 min. Non-specific binding was
blocked with 20% goat serum diluted in PBS/0.1% Triton X-100/1% BSA (bovine
serum albumin) for 30 min, before incubation with the primary polyclonal antibody
against TMEV at 4 °C overnight (polyclonal anti-TMEV BeAn VP1 antibody, diluted
1:2000; Kummerfeld et al., 2009). After washing with 0.1 % Triton X-100 in
PBS, incubation with a Cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG antibody (H+L, diluted
1:200, Jackson Immuno Research Europe, Newmarket, UK) was performed for 1h at
room temperature. After additional washing steps, sections were incubated with the
second antibody (GFAP, monoclonal mouse anti-pig IgG1, diluted 1:1600, SigmaAldrich Chemie, Taufkirchen, Germany; CNPase, monoclonal mouse anti-human
IgG1, diluted 1:100 Millipore GmbH, Schwalbach/Ts., Germany; F4/80, monoclonal
rat anti-mouse, MCA497, diluted 1:200, Serotec Product, Düsseldorf, Germany) for
2h at room temperature, respectively. GFAP and CNPase were labeled with Alexa
Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG1 Fab fragments at a molar ratio according to
the manufracturer`s instructions (Zenon Mouse IgG labeling Kit, Invitrogen,
Karlsruhe, Germany). The second antibody for microglia/macrophages was a Cy2conjugated AffiniPure F(ab`)2 Fragment Goat Anti-Rat antibody (Fragment specific,
diluted 1:200, Jackson ImmunoResearch Europe, Newmarket, UK) and incubated for
one hour. Adjacent further washing steps, sections were post-fixed in 4%
formaldehyde, cell nuclei were counterstained using 1.0 % bisbenzimide and
mounted with fluorescent mounting medium (Dako Diagnostika, Hamburg, Germany).
40
Periventricular brain lesion development
Controls were incubated with rabbit preimmune serum and/or a mouse or rat IgG1
anti-isotype antibody (Millipore GmbH, Schwalbach/Ts., Germany) instead of primary
antibodies. Expression of cell type specific markers was studied by a Leica TCS SP5
laser confocal microscope (Leica, Wetzlar, Europe) equipped with a 63-fold water
immersion objective as described (Kummerfeld et al., 2009; Kreutzer et al., 2007).
For excitation of Cy2-conjugated secondary antibody and Alexa Fluor 488, a 488 nm
Argon laser was used. For excitation of Cy3, a 546 nm Helium-Neon laser, and for
bisbenzimide, a 405 nm diode pumped solid-state laser was used. Full-frame images
were taken with water immersion objective (63x/1.20 HCX PL-APO CS, Leica,
Wetzlar, Germany), with an interval of 0.5 µm and a flattened z-stack image of the
confocal images (512 x 512 pixels) was generated. Each laser line was scanned
separately for individual excitation of the dyes, and data sets were finally merged and
analyzed employing the Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF)
(Leica, Wetzlar, Germany). The different cell types were identified according to their
morphological characteristics and antigen expression (Ulrich et al., 2008).
Quantification of CD107b+ microglia/macrophages by immunohistochemistry
For detection of activated microglia/macrophages immunohistochemistry was
performed on formalin fixed and paraffin embedded brain and spinal cord tissue
slides as described (Ulrich et al., 2010). A biotinylated CD107b-specific antibody
(monoclonal rat anti-mouse, clone M3/84, diluted 1:200; AbD Serotec., Oxford, UK)
was used as primary antibody. Sections used as negative controls were incubated
with IgG1 at a dilution of 1:200 (clone 43414, R&D Systems, Minneapolis, MN).
Finally, immunolabeling was visualized by the avidin biotin peroxidase-complex
method (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) with DAB as substrate. Slight
counterstaining was performed with Mayer’s hematoxylin. The numbers of
immunoreactive cells per square unit were counted in different CNS regions using an
ocular morphometric grid. Values represent the number of cells per mm2.
Periventricular brain lesion development
41
Statistical analysis
Statistical analysis was performed using SPSS for Windows (version 17.0, SPSS
Inc., Chicago, USA) and Statistical Analysis System (SAS; version 9.1, SAS Institute,
Cary, NC, USA). A Mann-Whitney-U-Test was performed to determine statistical
differences of the number of CD107b+ cells in TMEV infected SJL/J and C57BL/6
mice using SPSS. For analysis of log-transformed data of the TMEV specific
immunohistochemistry to determine statistical differences between SJL/J and
C57BL/6 mice a Wilcoxon`s two-sample test using SAS was performed. For analysis
of correlation between the number of TMEV infected cells detected by
immunohistochemistry and in situ-hybridization a Spearman`s rank correlation
coefficient (rs) was applied using SPSS. In general, the level of statistical significance
was designated at p ≤ 0.05.
Illustations
Immunohistochemical
images
were
obtained
with
Olympus
BX-51
digital
microscope (Olympus Optical Co. (Europe) GmbH, Hamburg) and stored as tagged
image file format (tiff) files using Cell_D images software (Olympus Soft imaging
Solutions GmbH, Münster). Adobe® Photoshop® 7.0 (Adobe Systems, Inc., San
Jose, CA) was used to prepare the figures and insets, with adjustment of contrast,
brightness and sharpness if necessary.
42
5.4
Periventricular brain lesion development
Results
Viral detection in SJL/J and C57BL/6 mice
The number of infected cells was determined in different CNS regions by
immunohistochemitry and in situ-hybridization. Virus was present at the entire apical
border of the ependyma of the third and lateral ventricles of investigated infected
SJL/J and C57BL/6 mice at one hour post infection (0 dpi; Figure 5-1).
At 4 dpi virus protein was present in individual ependymal cells as well as within the
periventricular area and corpus callosum of infected SJL/J and C57BL/6 mice as
determined by immunohistochemistry (Figure 5-1, 5-2). The number of TMEV
infected cells in the periventricular region was significantly higher in SJL/J as
compared to C57BL/6 mice at this time point (p=0.05; Figure 5-2, 5-3). While in the
periventricular region infected cells were only present in C57BL/6 mice at 7 dpi,
labeled cells were observed in the corpus callosum only in SJL/J mice at this time
(Figure 5-3). The phenotypes of infected cells in these regions of the forebrain white
matter were determined by immunofluorescence double labeling (see below).
Infected
cells
were
also
found
in
the
cortex,
hippocampus
and
thalamus/hypothalamus at 4 and 7 dpi in both mouse strains (Figure 5-3). Here, viral
protein was located predominately in cell somata and dendrites of neurons as well as
in axons (Figure 5-1). While equal numbers of TMEV infected cells were present in
the cortex of both mouse strains at 4 dpi, a significant reduction of the virus load was
observed in C57BL/6 mice at 7 dpi (p=0.008; Figure 5-2). At 14 dpi immunolabeled
cells were only found in the hippocampus of infected animals, while at later time
points no TMEV infected cells were present in the forebrain (Figure 5-2).
Virus infected ependymal cells of the fourth ventricle were found at 4 dpi in SJL/J and
C57BL/6 mice by immunohistochemistry (Figure 5-4). In the periventricular region
virus was present at 4 and 7 dpi in both mouse strains, while at 14, 28 and 56 dpi
TMEV was only detected in SJL/J mice in this region (28 dpi: p=0.004; Figure 5-4,
5.5). Virus antigen was detected in the brain stem white and grey matter at 28 dpi in
both mouse strains (Figure 5-5). However, at subsequent days TMEV was only
present in SJL/J mice in these regions (Figure 5-4, 5-5). In the thoracic spinal cord
Periventricular brain lesion development
43
TMEV antigen was found at 14, 28, 56 and 98 dpi only in SJL/J mice (Figure 5-4).
The phenotypes of infected cells in white matter regions of the periventricular area,
brain stem and spinal cord were determined by immunofluorescence double labeling
(see below).
In general, TMEV antigen was colocalized with viral RNA in all investigated CNS
regions. Spearman´s rank correlation between the number of infected cells detected
by immunohistochemistry and in situ-hybridization revealed a significant correlation in
the forebrain for SJL/J mice (p< 0.0001, rs=0.903) and C57BL/6 mice (p< 0.0001,
rs=0.878), in the brain stem and around the fourth ventricle for SJL/J mice (p<
0.0001, rs=0.754) and C57BL/6 mice (p< 0.0001, rs=0.727) as well as in the spinal
cord for SJL/J mice (p< 0.0001, rs=0.757).
No TMEV antigen or RNA was found in extraneural organs including the
gastrointestinal tract, liver, pancreas, respiratory tract, urogenital tract, cardiovascular
system, lymphoid organs and peripheral nerves in both infected mouse strains at any
investigated time point. As expected, no virus was present in the CNS or extraneural
organs of sham-infected control animals.
44
Periventricular brain lesion development
Figure 5-1: Immunohistochemical detection of Theiler´s murine encephalomyelitis virus
(TMEV) in the brain of SJL/J mice. (A) TMEV antigen at the apical border of the ependyma
(EP) of the lateral ventricle (V) at one hour post infection. (B) TMEV infected cells of the
ependyma (EP) of the lateral ventricle (V) at 4 days post infection (dpi). (C) TMEV infected
cells in the periventricular area (PV) at 4 dpi. (D) Detection of TMEV antigen in cell somata
and dendrites of neurons (arrowhead) and axons (arrow) in the hippocampus at 4 dpi. (E)
TMEV specific labeling of cells in the brain stem grey matter (vestibular nucleus) at 28 dpi.
(F) TMEV antigen in the brain stem white matter (inferior peduncle) at 28 dpi. Avidin biotin
peroxidase-method, slightly counterstained with Mayer`s haemalaun. Scale bars = 20 µm.
Periventricular brain lesion development
45
Figure 5-2: Quantification of infected cells in different regions of the forebrain of SJL/J and
C57BL/6 mice following experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)
infection. Number of infected cells in the (A) ependyma of the third and lateral ventricles, (B)
periventricular area of the forebrain ventricular system, (C) corpus callosum, (D) cortex, (E)
hippocampus, and (F) thalamus/hypothalamus. Box and whisker plots display median and
quartiles with maximum and minimum values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both
mouse strains are labeled with a star.
46
Periventricular brain lesion development
Figure 5-3: Schematic illustration of the distribution of Theiler´s murine encephalomyelitis
virus (green labeled areas) in the forebrain of SJL/J (A and B) and C57BL/6 mice (C and D)
during the acute infection phase. At 4 days post infection the virus is distributed in around the
ventricles, cortex and hippocampus as well as in thalamus and hypothalamus of both mouse
strains (A and C). Note also infected cells in the corpus callosum of SJL/J mice at this time
(A). In comparison virus is cleared from the periventricular area in SJL/J mice at 7 dpi (B). co:
cortex, cc: corpus callosum, 3v: third ventricle, lv: lateral ventricle, hi: hippocampus, th/hy:
thalamus and hypothalamus. Coronal section of the forebrain (bregma: -2.18 mm).
Hematoxylin and eosin staining. Slides are composed with mirax slide scanner (Carl Zeiss
AG, Oberkochen, Germany).
Periventricular brain lesion development
47
Figure 5-4: Quantification of infected cells in different regions of the brain stem, including the
periventricular region of the fourth ventricle, and spinal cord of SJL/J and C57BL/6 mice
following experimental Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection. Number of
infected cells in the (A) ependyma of the fourth ventricle, (B) periventricular area of the fourth
ventricle, (C) brain stem white matter, (D) brain stem grey matter and (E) spinal cord white
matter. Box and whisker plots display median and quartiles with maximum and minimum
values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both mouse strains are labeled with a star.
48
Periventricular brain lesion development
Figure 5-5: Schematic illustration of the distribution of Theiler´s murine encephalomyelitis
virus (green labeled areas) in the brain stem, including the periventricular region of SJL/J
mice during the chronic infection phase. (A) At 28 dpi virus is located predominately around
the fourth ventricle as well as in white matter tracts and grey matter. (B) At 56 dpi the
majority of the virus is present in the brain stem white and grey matter, while only few
infected cells can be found in the periventricular region. ce: cerebellum, 4v: fourth ventricle,
wm: brain stem white matter, gm: brain stem grey matter. Coronal section of the brain stem
and cerebellum (bregma: -5.88). Hematoxylin and eosin staining. Slides are composed with
mirax slide scanner (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).
Periventricular brain lesion development
49
Immunofluorescence double labeling and confocal laser scanning microscopy
Confocal laser scanning microscopy was performed on double stained CNS frozen
sections to determine the phenotypes of TMEV infected cells in the white matter of
both mouse strains (Figure 6). At 4 dpi the majority of TMEV infected cells were
identified astrocytes based on GFAP-expression in both mouse strains (SJL/J mice:
75%; C57BL/6 mice: 68%), located predominantly in the periventricular region.
Approximately 10% of infected cells represented CNPase+ oligodendrocytes and
15% F4/80+ microglia/macrophages in SJL/J mice at this time. In C57BL/6 22% of
infected cells express CNPase and 10% were F4/80+ microglia/macrophages at 4 dpi
in the white matter of the brain. At 28 dpi approximately 52% of infected cells were
identified as microglia/macrophages (F4/80) and 48% as oligodendrocytes (CNPase)
around the fourth ventricle in SJL/J mice, while infected astrocytes were not detected
in this brain region. In C57BL/6 mice 60% of infected cells represented
macrophages/microglia (F4/80), while no oligodendrocytes or astrocytes were found
in this region at 28 dpi in this mouse strain. At 56 dpi approximately 50% of TMEV
infected
cells
were
identified
as
oligodendrocytes
(CNPase)
and
microglia/macrophages (F4/80), respectively. At 98 dpi 70% of infected cells express
the oligodendrocyte marker CNPase and 30% the microglia/macrophage marker
F4/80 in brain stem white matter lesions of SJL/J mice. In the spinal cord white
matter were 40% of infected cells represented CNPase-expressing oligodendrocytes
and 60% represented F4/80-expressing microglia/macrophages in susceptible SJL/J
mice. No infected astrocytes were noted in the chronic TME phase (>28 dpi) in the
brain and spinal cord of both mouse strains.
50
Periventricular brain lesion development
Figure 5-6: Phenotyping of Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infected cells in
the white matter by immunofluorescence double staining. Left column: Determination of cell
phenotype using a glial fibrillary acidic protein (GFAP)-specific antibody as a marker for
astrocytes (top row), F4/80-specific antibody as a marker for microglia/macrophages (middle
row) and a CNPase-specific marker for the detection of oligodendrocytes (bottom row).
Middle column: Detection of TMEV antigen. Right column: colocalization of cell type specific
molecules and TMEV antigen (merged images). Double stained cells exhibit a yellow color
(arrows). Top row: TMEV infected GFAP+ astrocytes in the forebrain periventricular area at 4
days post infection (dpi).
Periventricular brain lesion development
51
Middle row: TMEV infected F4/80+ microglia/macrophages in the brain stem at 28 dpi.
Bottom row: TMEV infected CNPase+ oligodendrocytes in the brain stem at 28 dpi.
Immunofluorescence was performed using antibodies labeled with Alexa Fluor 488conjugated Fab fragments for the detection of GFAP and CNPase (green), Cy2-coupled
secondary antibody for the detection of F4/80 (green) and Cy3-coupled secondary antibody
for the detection of TMEV (red). Nuclei were stained with bisbenzimide (blue). Confocal laser
scanning microscopy. Scale bars = 3 µm.
Histological findings in the central nervous system of SJL/J and C57BL/6 mice
Gliosis and/or perivascular lymphohistiocytic infiltrates were first observed in the
forebrain of both infected mouse strains. Here, inflammatory responses were most
intense in the thalamus and hypothalamus, usually associated with the injection site
as well as around the third and lateral ventricles at 4 dpi. Hippocampal and cortical
inflammation was prominent at 7 and 14 dpi, followed by a decline with no or only
minimal changes at later time points. In comparison, inflammatory responses were
detected in the corpus callosum also at later time points (Table 2-1).
Similar to the forebrain ventricular system, gliosis was observed around the fourth
ventricle as early as 4 dpi in both investigated mouse strains following TMEV
infection. Periventricular inflammation was most intense from 7 to 56 dpi in SJL/J
mice and from 7 to 14 dpi in C57BL/6 mice. While inflammation dissolved in C57BL/6
mice, inflammatory responses persisted adjacent to the fourth ventricle in SJL/J
mice. Increasing gliosis and perivascular infiltrates were observed primarily in the
brain stem and spinal cord of TMEV infected SJL/J mice (Figure 5-7). In comparison,
inflammation was minimal or absent in the respective CNS regions of C57BL/6 mice
(Table 5-1).
Besides minimal gliosis at the injection site in the thalamus and hypothalamus at 4
dpi in individual animals, no inflammatory responses have been observed in shaminfected SJL/J and C57BL/6 mice.
52
Periventricular brain lesion development
Quantification of demyelination
Using LFB-staining, demyelination was only observed in TMEV infected SJL/J mice
in the periventricular region of the fourth ventricle, brain stem and spinal cord. No
myelin loss was present in infected C57BL/6 and sham-infected controls.
Demyelination was prominent around the fourth ventricle in SJL/J mice at 28 (Figure
5-7) and 56 dpi, followed by a decline at later time points (Figure 5-8). In comparison,
myelin loss increased in the brain stem white matter (Figure 5-8), affecting primarily
the spinal trigeminal tract, inferior peduncle and the vestibulocochlear nerve. While
no myelin damage was present in the periventricular region at 196 dpi, myelin
alterations persisted in the brain stem white matter till the end of the study period
(Figure 5-8). Similar to the brain stem white matter demyelination was found in the
spinal cord of SJL/J mice from 28 to 196 dpi (Figure 5-8). Here, myelin loss was
located predominantly in the funiculus ventralis and funiculus lateralis of the spinal
cord white matter.
No alterations of myelin integrity were detected in the forebrain grey and white
matter, including the corpus callosum of infected SJL/J or C57BL/6 mice.
Figure 5-7: Inflammatory demyelination in Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV)
infected SJL/J mice. (A) Demyelinating lesion in the brain stem white matter with perivascular
lymphohistiocytic infiltrations (arrows) and gliosis (arrowheads) at 28 days post infection
(dpi), hematoxylin and eosin staining. (B) Myelin loss around the fourth ventricle in a TMEV
infected SJL/J mice at 28 dpi (PV: periventricular area; EP: ependymal cells), Luxol fast bluecresyl violet staining. scale bars: 50µm.
Periventricular brain lesion development
53
Figure 5-8: Semiquantitative assessment of demyelination in the periventricular area of the
fourth ventricle, brain stem white matter and spinal cord white matter of SJL/J mice with
experimental Theiler´s murine encephalomyelitis. Box and whisker plots display median
and quartiles with maximum and minimum values.
0
0
Gliosis
PVI
0
PVI
0.2±0.4
1.0±0.0
Gliosis
Gliosis
1.3±1.1
0.3±0.5
PVI
1.3±1.0
PVI
Gliosis
1.0±0.6
1.3±1.2
PVI
Gliosis
0.2±0.4
0.5±0.8
PVI
Gliosis
0.5±0.5
0
PVI
Gliosis
0.3±0.5
0
0
0.3±0.5
0
1.5±0.5
1.0±0.9
1.2±1.2
0.8±1.0
1.0±0.6
0.3±0.5
1.2±1.3
1.2±1.3
1.0±0.9
0.8±1.0
0.8±1.0
0.8±1.0
C57BL/6
4 dpi
0.7±0.8
SJL/J
Gliosis
PVI
Inflammatory
response
0
0
1.0±0.0
1.0±1.1
2.2±1.1
1.8±1.1
2.0±1.1
2.3±0.5
1.3±0.8
1.5±0.8
1.5±1.4
2.0±1.1
0.7±0.8
0.2±0.4
2.0±0.6
0
0
0.6±0.5
0
2.2±1.0
1.8±0.4
3.0±0.0
1.4±1.3
1.5±1.2
0.5±0.8
2.0±1.3
2.0±1.3
0.5±0.5
0.5±0.8
1.8±0.8
1.0±0.9
C57BL/6
7 dpi
1.2±1.0
SJL/J
1.0±1.1
1.2±1.2
1.2±0.4
1.0±1.1
2.0±0.9
1.7±0.8
1.6±0.8
1.0±0.0
0.8±0.4
0.8±1.2
2.0±1.1
2.2±0.8
0.8±0.4
0.3±0.5
0.6±0.8
0.8±0.4
0.8±0.4
0
0.2±0.4
0
1.3±0.5
1.3±0.8
2.2±0.8
1.2±1.0
1.3±0.8
0.8±1.0
1.3±0.8
1.3±0.8
0.3±0.5
0.2±0.4
0,7±0.8
0.7±0.8
C57BL/6
14 dpi
SJL/J
3.0±0.0
2.3±0.5
2.7±0.5
2.3±0.5
2.5±0.8
2.0±0.6
0.5±0.5
0.5±0.5
0.3±0.4
0.2±0.4
0.7±1.2
0.5±0.8
0.5±0.5
0
0
0
1.0±0.6
0
1.0±0.7
0.2±0.4
0.5±0.5
0.3±0.5
1.0±0.6
0
1.0±0.0
0.2±0.4
1.2±0.8
1.2±0.8
0.2±0.4
0
0.2±0.4
0
C57BL/6
28 dpi
SJL/J
2.6±0.6
2.0±0.7
2.2±0.9
2.3±0.5
2.4±0.9
2.2±1.2
0.8±0.8
0.2±0.4
0.3±0.5
0.2±0.4
0.2±0.4
0.2±0.4
0.2±0.5
0
0
0
0.8±0.9
0
0.5±0.5
0
0.3±0.5
0
1.6±1.3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
C57BL/6
56 dpi
SJL/J
2.8±0.4
2.4±0.5
2.4±0.5
2.0±0.0
1.0±0.7
1.2±0.8
0.5±0.5
0.2±0.4
0.4±0.5
0
0
0
0
0
0.2±0.4
0
0.7±0.8
0
0.5±0.5
0
0.2±0.4
0
0.7±0.5
0
0.3±0.5
0
0.2±0.4
0.2±0.4
0
0
0
0
C57BL/6
98 dpi
SJL/J
2.0±1.4
1.5±1.3
2.2±0.8
2.4±0.9
1.0±0.7
1.0±1.0
0.6±0.5
0.4±0.5
0.3±0.8
0.4±0.9
0.2±0.4
0.3±0.5
0
0
0
0
0
0
0
0
0.2±0.4
0
0.8±0.5
0.2±0.4
0.4±0.5
0
0
0
0
0
0
0
C57BL/6
196 dpi
SJL/J
PVI = perivascular lymphohistiocytic infiltrates, dpi = days post infection; values display mean values and standard deviations of semiquantitative scoring (0 = no, 1 = mild, 2 = moderate and
3 = severe perivascular lymphohistiocytic infiltrates and gliosis, respectively
Spinal cord
Brain stem
Periventricular
/ fourth
ventricle
Thalamus and
hypothalamus
Periventricular
/ third and
lateral
ventricles
Hippocampus
Corpus
callosum
Cortex
CNS region
Table 6-1: Semiquantitative assessment of perivascular lymphohistiocytic infiltrates and gliosis in the central nervous system of
infected SJL/J and C57BL/6 mice
54
Periventricular brain lesion development
Periventricular brain lesion development
55
Quantification of CD107b+ microglia/macrophages by immunohistochemistry
In order to determine the role of virus-induced microglia/macrophage activation in the
pathogenesis of myelin injury in different regions of the CNS the numbers of
CD107b+ cells have been quantified. Results of immunohistochemical investigation
are given in figure 5-9.
CD107b+
microglia/macrophages
were
observed
in
the
cortex
and
thalamus/hypothalamus as well as around the ventricles at 7 dpi. Significantly more
CD107b+ cells were found in TMEV infected SJL/J mice as compared to C57BL/6
mice in the corpus callosum at 7, 14 and 28 dpi (p≤ 0.01) and in the hippocampus at
7 and 14 dpi (p≤ 0.01). In contrast, a significantly elevated number of labeled
microglia/macrophages were present in C57BL/6 mice at 14 dpi in thalamic and
hypothalamic regions (p≤ 0.05). Subsequently, at 56 and 98 dpi, infected SJL/J mice
show significantly increased numbers of CD107b+ microglia/macrophages in the
periventricular area of the fourth ventricle and grey matter of the brain stem (56 dpi:
p≤0.05; 98 dpi: p≤0.001), while no labeled cells were detected in infected C57BL/6
mice. In addition, a prominent accumulation of CD107b+ microglia/macrophages was
found in the brain stem white matter of SJL/J mice till the end of the study period
(p≤0.05). In general, demyelination around the fourth ventricle as well as of the brain
stem and spinal cord white matter was associated with an accumulation of CD107b+
microglia/macrophages which exhibited gitter cell morphology, indicative of
myelinophagia (Figure 5-10). No or only few labeled cells were observed in the CNS
of control SJL/J or C57BL/6 mice.
56
Periventricular brain lesion development
Figure 5-9: Quantification of CD107b+ microglia/macrophages in different regions of the
central nervous system of Theiler´s murine encephalomyelitis infected SJL/J and C57BL/6
mice. Number of accumulated cells in the (A) cortex, (B) corpus callosum, (C) periventricular
area of third and lateral ventricles, (D) hippocampus, (E) thalamus/hypothalamus, (F)
periventricular area of the fourth ventricle, (G) brain stem white matter, (H) brain stem grey
matter and (I) spinal cord white matter. Box and whisker plots display median and quartiles
with maximum and minimum values. Significant differences (p ≤ 0.05) between both mouse
strains are labeled with a star.
Periventricular brain lesion development
57
Figure 5-10: Accumulation of CD107b+ microglia/macrophages in a demyelinating lesion of
the brain stem white matter at 98 days post infection in a Theiler´s murine encephalomyelitis
virus infected SJL/J mice. Note vacuolated cytoplasm of immunolabeled cells, characteristic
of gitter cell formation and myelinophagia. Avidin biotin peroxidase-method, slightly
counterstained with Mayer`s haemalaun. Scale bar = 10 µm.
58
5.5
Periventricular brain lesion development
Discussion
Results of the spatiotemporal analysis demonstrate the occurrence of region-specific
susceptibilities to myelin damage in different CNS regions in SJL/J mice. For the first
time ependymal infection and virus-induced periventricular demyelination are shown,
representing a so far not described feature of this murine MS model.
Virus infection of neuronal somata, dendrites and axons in the cortex, hippocampus
and CNS nuclei are indicative of an axonal transport and transsynaptic neuron-toneuron transmission within the brain during the acute disease phase, as described
previously (Simas and Fazakerley, 1996; Wada and Fujinami, 1993). While the virus
is eliminated from the brain of C57BL/6 mice, ineffective antiviral immune responses
might represent a prerequisite for the observed viral persistence and demyelination
around the fourth ventricle, brain stem and spinal cord of SJL/J mice. However,
although C57/BL6 mice are able to mount a protective antiviral immunity, neuronal
cell damage and seizures has been demonstrated following infection with the TMEV
Daniels strain. Therefore, experimental infection of C57BL/6 mice with this virus
strain has become a novel animal model for inflammation-induced epilepsy
(Kirkmann et al., 2010; Libbey et al., 2008).
Independently of the mouse strain, an initial infection of ependymal cell in cerebrum,
cerebellum and brain stem has been detected during the early infection phase in the
present study. Previous reports hypothesized a liquorogenic spread, but virus
infection of the ependyma has not been detected before (Ha-Lee et al., 1995; Simas
and Fazakerley, 1996; Stohlmann and Hinton, 2001; Trottier et al., 2001).
Accordingly, observed infection of periventricular cells might represent a sequel of
transependymal viral spread. Here, as demonstrated by immunofluorescence double
labeling, infection of the periventricular region is dominated by an infection of
astrocytes. While the virus is cleared from forebrain periventricular region in both
mouse strains and around the fourth ventricle of C57BL/6 mice, a dominating
infection of microglia/macrophages and oligodendrocytes has been observed during
the chronic demyelinating phase in SJL/J mice. The switch of cell tropism is required
for the induction of myelin loss in susceptible mice (Clatch et al., 1990; Lipton et al.,
Periventricular brain lesion development
59
1995; Lipton et al., 2005; Schlitt et al., 2003; Zoecklein et al., 2003). Similar to the
present findings, TMEV has been detected previously in macrophages/microglia
during the persistent phase in SJL/J mice infected with the BeAn (Dal Canto and
Lipton, 1982; Lipton et al., 1995) and Daniels strain (Rossi et al., 1997). However, in
contrast to other investigators viral persistence in astrocytes (Zheng et al., 2001) has
not been found during the chronic infection phase. The present study revealed the
occurrence of viral persistence of the BeAn-strain in the brain stem of SJL/J mice
during
the
chronic
disease
phase
within
microglia/macrophages
and
oligodendrocytes as observed by others (Zoecklein et al., 2003). In the chronic
phase, viral dissemination within the spinal cord is based upon continuous viral
replication within glial cells and infection of microglia/macrophages by phagocytosis
of infectious material released from apoptotic cells (Lipton et al., 2005; Trottier et al.,
2001). Similar mechanisms of viral persistence and spread in the brain stem white
matter can be postulated for infected SJL/J mice but have to be confirmed in future
studies.
Since the cerebrospinal fluid and CNS interstitial fluid drains to regional lymph nodes
(Kida et al., 1993), various extraneural tissues have been tested for the presence of
virus by immunohistochemistry and in situ-hybridization to exclude systemic infection.
Besides the mouse genetic background and virulence of the agent, viral spread and
cell tropism is influenced by the host immune response and age. For example,
stress-induced immunosuppression leads to disease exacerbation and systemic viral
spread in TMEV infected animals (Mi et al., 2006; Welsh et al., 2010; Young et al.,
2010). Similarly, congenital immunodeficiency (e.g. in nude mice and severe
combined immunodeficient [SCID] mice) leads to accelerated TMEV dissemination in
experimentally infected animals due to the lack of virus-specific immune responses
(Drescher and Tracy, 2007; Gomez et al., 1996; Love, 1987; Wada and Fujinami,
1993, Zurbriggen and Fujinami, 1988). Accordingly, the present extensive analysis of
several lymphoid organs and other extraneural tissues is indicative of a CNSrestricted infection of immunocompetent mice as demonstrated by others (Sethi et
al., 1983; Trottier et al., 2002).
60
Periventricular brain lesion development
Periventricular lesions have been recognized as characteristic and frequent findings
in MS patients. Here, the most commonly affected site is around the lateral ventricles
of the forebrain, followed by the neuroparenchyma around the fourth ventricle, third
ventricle and aqueduct (Adams et al., 1987). Although virus and inflammation is
observed in the forebrain periventricular region during the acute disease phase in
both infected mouse strains, demyelination was only observed adjacent to the fourth
ventricle in TMEV infected SJL/J mice in the present study. In contrast to prolonged
myelin damage in the brain stem and spinal cord white matter, periventricular
demyelination in SJL/J mice represents a transient process with termination of
inflammation and subsequent tissue recovery. Proposed causes for this phenomenon
include an efficient antiviral immune response which clears the virus from the
periventricular area and/or a more effective regenerative capacity of this CNS region
as compared to the brain stem and spinal cord in mice. In accordance with this,
recent studies showed that T-cell mediated immunity leads to viral elimination from
the ependyma but not from the brain parenchyma in experimental attenuated
lymphocytic choriomeningitis virus infection of mice (Pinschewer et al., 2010). In
addition, remyelination has been observed in the rat brain stem after chemically
induced demyelination by intraventricular ethidium bromide injection (Levine and
Reynolds, 1999). Similar to MS, limited remyelination due to dysfunctional
oligodendrocyte precursor cells has been described in the murine spinal cord
following TMEV infection (Ulrich et al., 2008). Additionally, maturation and
differentiation of an oligodendrocyte precursor cell line has been shown to be
impaired by TMEV in vitro (Pringproa et al., 2010). Currently, CD45+ hematopoietic
cell accumulation and associated neuroblast emigration has been described in the
forebrain subventricular zone of TMEV infected mice during the acute disease phase
(Goings et al., 2008). The importance of the periventricular region in the
pathogenesis of myelin loss disorders has been stressed by the demonstration of
glial progenitor cell activation in the subventricular zone of MS patients (NaitOumesmar et al., 2007). Similarly, activation of subventricular derived neural
progenitor has been described in autoimmune MS models, such as murine EAE,
indicating a potential therapeutic target of this brain region to stimulate endogenous
Periventricular brain lesion development
61
myelin regeneration in demyelinating inflammatory diseases (Picard-Riera et al.,
2002). Remyelination is frequently observed in early MS lesions and influenced by
the anatomical localization. Though, in contrast to the present findings the
periventicular region is regarded as a compartment of limited regenerative capacities
in affected humans (Goldschmidt et al., 2009). Usually, clinical magnet resonance
imaging of the “Dawson´s fingers” demonstrates lesions extending from the lateral
ventricle to surrounding lesions, suggesting that the periventricular regions are
particularly sensitive to MS (Barkhof and Scheltens, 2002; Boster et al., 2009).
Nevertheless, remyelination is influenced by a variety of factors which have to be
taken into account in clinical trials to promote CNS regeneration (Patrikios et al.,
2006). So far, transplantation of oligodendrocyte precursor cells and remyelination
strategies have been investigated predominately in chemically induced demyelination
models (Einstein et al., 2009). Therefore, the investigation of dynamical changes of
myelin integrity within the periventricular region of TMEV infected SJL/J mice offers a
new opportunity to study endogenous myelin repair mechanisms in future studies.
The observed periventricular accumulation of CD107b+ macrophages/microglia in the
present study is supposed to perpetuate the infection of SJL/J mice and possibly
accelerates bystander demyelination and delayed type hypersensitivity. Similarly,
CD107b+ cell accumulations were associated with myelin loss in the brain stem and
spinal cord white matter of the susceptible mouse strain. Interestingly, CD107b+
macrophages/microglia within the forebrain white matter, especially the prolonged
presence of this cell type within the corpus callosum did not induce demyelination.
Thus, virus infection of the white matter and subsequent microglial activation per se
does not induce myelin damage in this MS model. Topographical differences of the
CNS microenvironment or functionality of glial cells might be responsible for the
observed variable sensitivities to injury of the white matter in SJL/J mice. For
example, a reduced myelin degrading proteolytic activity of microglia and
macrophages might explain the lack of demyelination as described in C57BL/6 mice
(Liuzzi et al., 1995). The absence of myelin loss within the corpus callosum, which is
particularly susceptible to cuprizone-induced myelin damage, indicates differing
myelin damaging processes between viral and toxic demyelination models (Lindner
62
Periventricular brain lesion development
et al., 2008; Tayler et al., 2009). However, in analogy to the concept of regionspecific lesion development in TME and human MS, recent studies have
demonstrated topographical differences of de- and remyelination within the brain of
cuprizone fed mice, which might be attributed to unequal densities or functions of
microglia, astrocytes and oligodendocyte progenitor cell in the respective CNS areas
(Gudi et al., 2009; Skripuletz et al., 2008, Skripuletz et al., 2010).
Summarized, the demonstration of ependymal infection and subjacent spread into
the brain parenchyma as well as regional virus clearance despite ongoing
demyelination in other CNS compartment allows new insights into TME
pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance our
understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities
of the brain in this infectious MS model.
5.6
Acknowledgments
The authors wish to thank Danuta Waschke and Julia Schirrmeier for their excellent
technical
assistance.
This
study
was
Forschungsgemeinschaft (DFG, BE 4200/1-1).
supported
by
the
Deutsche
Periventricular brain lesion development
5.7
63
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72
6
Diskussion
Diskussion
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Darstellung des TMEV im ZNS und
im peripheren Gewebe von SJL/J- und C57BL/6-Mäusen nach experimenteller
intrazerebraler Infektion. Im ersten Teil dieser Studie wurde ein polyklonaler
Antikörper gegen das virale Kapselprotein 1 (VP1) des schwach virulenten BeAnVirus im Kaninchen hergestellt. Der Antikörper wurde mittels Western Blot und
Massenspektrometrie auf seine Spezifität geprüft. Im Weiteren wurde die Applikation
des Antikörpers zum Nachweis von viralem Antigen in TMEV-infizierten Zellkulturen
mittels Immunfluoreszenz und konfokaler Lasermikroskopie getestet. Zusätzlich war
es möglich mit diesem Marker sowohl parakristallin angeordnete als auch dissoziierte
intrazytoplasmatische
Viruspartikel
in
infizierten
BHK21-Zellen
mittels
Elektronenmikroskopie zu visualisieren. Als Grundlage für den zweiten Teil der Arbeit
konnte außerdem eine spezifische Reaktivität des hergestellten Antikörpers in
Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben von infizierten Mäusen
mittels Immunhistologie nachgewiesen werden.
Dieser Antikörper diente im zweiten Teil der Studie der genauen Beschreibung der
Ausbreitung und des Zelltropismus des TMEV-BeAn-Virus im Verlauf der
experimentellen TMEV-Infektion. Da sich bisherige Untersuchungen vorwiegend mit
den pathologischen Prozessen im Rückenmark bei der experimentellen TME
beschäftigten, wurde in der vorliegenden Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die
Virusausbreitung
und
assoziierte
Entmarkungen
während
der
akuten
und
chronischen Erkrankungsphase im Gehirn gelegt (SETHI und LIPTON, 1983;
LIPTON et al., 2005 a). Außerdem wurden die Vorgänge in empfänglichen SJL/Jund resistenten C57BL/6-Mäusen vergleichend analysiert.
Diskussion
6.1
73
Charakterisierung des polyklonalen Antikörpers zum
Nachweis des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
Die chronische demyelinisierende Form der TME in empfänglichen Mäusestämmen,
dient aufgrund vieler ähnlicher Aspekte in der Pathogenese und Klinik seit mehr als
30 Jahren als Tiermodell für die chronisch progressive Form der MS (DRESCHER
und SOSNOWSKA, 2008). Allerdings liegen bislang wenige Untersuchungen über
die Virusausbreitung in der akute Infektionsphase in diesem MS Modell vor
(DRESCHER und TRACY, 2007; NJENGA et al., 2004). Es ist bekannt, dass sich
das TMEV nach intrazerebaler Injektion zunächst in Neuronen des Gehirns vermehrt
(LIPTON, 1975). Über die anschließende Ausbreitung des TMEV und die zelluläre
Persistenz liefert die Literatur nur wenige und zum Teil widersprüchliche Ergebnisse
(Tab. 2-2). Insbesondere stellt sich die Frage, ob Mikrogliazellen bzw. Makrophagen
oder aber Astrozyten bzw. Oligodendrozyten die primären Zielzellen in der
chronischen Phase der TME darstellen (LIPTON et al., 2005 a; ZHENG et al., 2001).
Im ersten Teil der Arbeit wurde daher ein TMEV-spezifischer polyklonaler Antikörper
durch Immunisierung im Kaninchen hergestellt und charakterisiert. Zunächst wurde
hierzu eine Western Blot-Analyse durchgeführt, um die gebundenen viralen Proteine
zu visualisieren. Die spezifische Bande lag bei 37kDa, was der Molekülmasse des
Kapselproteins VP1 des TMEV entspricht. Für die nähere Charakterisierung des
Antikörpers wurde die Aminosäuresequenz des gebundenen Proteins mittels
Massenspektrometrie
ermittelt.
Diese
Technik
ermöglicht
die
einzelnen
Aminosäuren, aus denen ein Protein zusammengesetzt ist, spezifisch zu ermitteln
und
zu
quantifizieren
(KOLKER
et
al.,
2006).
Die
unterschiedlichen
schwachvirulenten TMEV TO-Stämme (DA- und BeAn-TMEV-Stamm) ähneln sich in
92%
der
Nukleotid-
und
94%
der
Aminosäurenzusammensetzung.
Die
massenspektrometrische Analyse des 37kDa-Proteins ergab eine 61%ige Homologie
mit dem gesamten BeAn-VP1-Protein und eine vollständige Übereinstimmung in den
drei detektierten Segmenten der Aminosäuresequenz. Ob der hergestellte Marker
jedoch selektiv nur das Kapselprotein des BeAn-TMEV erkennt oder zusätzlich
74
Diskussion
Kreuzreaktivitäten mit weiteren TMEV-Stämmen aufweist, muss in weiteren
Untersuchungen ermittelt werden. Bei der Infektion mit TMEV besitzt das VP1Kapselprotein eine gesonderte Relevanz, da mittels in vitro-Neutralisationstest
gezeigt werden konnte, dass vornehmlich Anti-VP1-Antikörper, neben Anti-VP2-, VP4- und -VP2A- und -VP2C-Proteinen im Serum infizierter Mäuse vorkommen.
Sowohl
Kapsel-
als
auch
Nicht-Kapsel-Proteine
scheinen
bei
den
immunpathologischen Prozessen im Verlauf der TME eine Rolle zu spielen
(CAMERON et al., 2001). In demyelinisierenden Arealen des ZNS konnten
beispielsweise infiltrierende T-Zellen, die spezifisch gegen das VP1-Protein gerichtet
waren, identifiziert werden (KIM et al., 1998; YAUCH und KIM, 1994). Genauso spielt
die Struktur des VP1-Kapselproteins bei der Viruspersistenz eine wichtige Rolle
(McCRIGHT et al., 1999). Mittels Röntgenkristallographie konnte gezeigt werden,
dass sich die VP1-Proteinstruktur im C-Terminus zwischen dem hochvirulenten
GDVII-Stamm
und
den
schwachvirulenten,
persistierenden
Virusstämmen
unterscheidet (LUO et al., 1996).
Die meisten Versuche das TMEV im Gewebe während der chronischen Phase
ultrastrukturell darzustellen misslangen (DAL CANTO und LIPTON, 1975; DAL
CANTO und LIPTON, 1979; DAL CANTO und LIPTON, 1980). Als Ursache hierfür
wird diskutiert, das die Virionen auf Grund ihrer geringen Größe und Ähnlichkeit mit
Ribosomen nur nach Aggregation mittels Elektronenmikroskopie nachgewiesen
werden können, was bei der Infektion älterer Mäuse in vivo nur selten vorkommt
(DAL CANTO und LIPTON, 1982). Vergleichbar den vorliegenden Ergebnissen in der
Zellkultur (BHK21-Zellen) konnten jedoch in einzelnen Untersuchungen typische
parakristalline
Strukturen
in
Oligodendrozyten
und
Myelinscheiden
elektronenmikroskopisch detektiert werden (BLAKEMORE et al., 1988). Der
immunelektronenmikroskopische Nachweis vom BeAn-TMEV-Stamm wurde in der
Literatur bisher nicht beschrieben. Im ersten Teil dieser Studie konnten auf
subzellulärer Ebene mittels Immunogold-Markierung des hergestellten Antikörpers
parakristallin angeordnete Virusaggregate im Zytoplasma infizierter BHK21-Zellen
visualisiert werden. Darüber hinaus ermöglichte der Antikörper die Lokalisierung von
dissoziierten, frei im Zytoplasma befindlichen Viruspartikeln, welche mit der
Diskussion
75
konventionellen Transmissionselektronenmikroskopie nicht nachweisbar waren. In
der Literatur wurde eine derartige Virusverteilung bisher nur bei dem GDVII- und FAStamm in der Zellkultur beschreiben (FRIEDMANN und LIPTON, 1980; FRIEDMANN
und LORCH, 1984). Der DA-Stamm wurde ultrastrukturell in infizierten BHK21-Zellen
auch
in
Aggregaten
angeordnet
dargestellt,
er
war
jedoch
ohne
Antikörpermarkierung nicht von humanen Polioviren zu unterscheiden (POWELL et
al., 1977). Unmarkierte schwachvirulente TMEV (DA, WW, TO, YALE, BeAn) wiesen
ansonsten eine kettenartige Anordnung im Zytoplasma von infizierten BHK21-Zellen
auf (LORCH et al., 1981).
Die Immunfluoreszenzfärbung ergab in infizierten murinen L-Zellen eine positive
Markierung im Zytoplasma. Darüberhinaus stellt die konfokale Lasermikroskopie eine
weitere Methode zum Nachweis des TMEV auf subzellulärer Ebene dar. Zusätzlich
wurde der Antikörper auf seine Kreuzreaktivität in BeAn-Virus-infizierten Geweben
vom ZNS und BHK21-Zellen in der Immunhistologie getestet. Hierzu wurden die
Gewebe und Zellkulturen in Formalin fixiert und in Paraffin eingebettet. Hierbei
konnte eine spezifische Markierung im Zytoplasma der Zellen in vivo und in vitro
nachgewiesen werden. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass sich der polyklonale
Antikörper sowohl für den Virusnachweis in der Gewebekultur als auch im
archivierten Gewebe eignet. So konnte beispielsweise mittels des hier hergestellten
polyklonalen Antikörpers in weiteren in vitro-Experimenten gezeigt werden, dass der
BeAn-Stamm des TMEV Oligodendrozytenvorläuferzellen infiziert und deren
Differenzierung in reife Oligodendrozyten blockiert (PRINGPROA et al., 2010).
6.2
Darstellung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
mittels Immunhistologie und in situ-Hybridisierung
6.2.1
Virusausbreitung im Gehirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
Aus verschiedenen Studien an Mäusen ist bekannt, dass nach experimenteller
intrazerebraler Infektion schwachvirulente TMEV-Stämme in den Neuronen der
grauen Substanz des Großhirns replizieren und sich anschließend axonal im ZNS
76
Diskussion
ausbreiten (OLESZAK et al., 2004). Das TMEV vom DA-Stamm konnte in der akuten
Infektionsphase in Nacktmäusen in den Strukturen des limbischen Systems im
Großhirn nachgewiesen werden. Daher wurde postuliert, dass sich das Virus
möglicherweise
entlang
anatomisch
verbundener
Strukturen
in
der
akuten
Infektionsphase ausbreitet (WADA und FUJINAMI, 1993). Beim TMEV vom BeAnStamm wird ebenfalls ein axonaler Transport sowie eine postsynaptische
Übertragung von Neuron zu Neuron im Kortex, Hippokampus, Thalamus und
Hypothalamus während der Frühphase diskutiert (SIMAS und FAZAKERLY, 1996).
Die Ergebnisse des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit bestätigten die Resultate
vorheriger Studien. Mittels Immunhistologie und in situ-Hybridisierung konnte zu
Beginn der Infektion (Tag 4 und 7 post infectionem) das BeAn-TMEV im
Hippokampus, Kortex, Corpus callosum, Thalamus und Hypothalamus in SJL/J- und
C57BL/6-Mäusen nachgewiesen werden (Abb. 6-1). Hierbei fand sich eine
vorwiegende Infektion von Neuronen sowie ein Ausbreitung des Virus entlang der
Axone.
Des
Weiteren
konnte
eine
periventrikuläre
Infektion
in
beiden
Mäusestämmen zu diesem Zeitpunkt aufgezeigt werden. Als charakteristisches
Zeichen einer liquorogenen Ausbreitung und eines transependymalen Transports
des Agens fand sich bereits eine Stunde nach der experimentellen Infektion das
TMEV am apikalen Ziliensaum der Ependymzellen des Ventrikelsystems im
Großhirn. In diesem Zusammenhang konnte Virusantigen und RNS im Zytoplasma
von Ependymzellen und von periventrikulären glialen Zellen am vierten Tag nach der
Infektion nachgewiesen werden. Eine subventrikuläre Infektion in Verbindung mit
einer Aktivierung CD45+ hämatopoetischer Zellen konnte in TMEV-infizierten Mäusen
nachweisen werden (GOINGS et al., 2008). Allerdings wurde eine virale Infektion von
Ependymzellen in vivo bei der TME bisher noch nicht beschrieben (HA-LEE et al.,
1995; SIMAS und FAZAKERLY, 1996; STOHLMAN und HINTON, 2001; TROTTIER
et al., 2001). Diese Ergebnisse der zweiten Studie lassen daher die Hypothese eines
liquorogenen und periventrikulären Transports als alternativen Mechanismus zu der
bereits beschriebenen axonalen Erregerausbreitung zu. Diesbezüglich konnte in
vorangegangenen Studien mittels PCR virale RNS im Liquor von TMEV-infizierten
Mäusen detektiert werden (TROTTIER et al., 2002). Im weiteren Verlauf der Infektion
Diskussion
77
kam es in der vorliegenden Studie zu einer Elimination des Virus aus dem Ependym
und der periventrikulären Region in beiden Mäusestämmen (Abb. 6-1). Allerdings
führte
eine
unzureichende
antivirale
Immunantwort
zur
Viruspersistenz
in
empfänglichen SJL/J-Mäusen, während resistente C57BL/6-Mäuse das TMEV
vollständig aus dem ZNS entfernten. Die Ergebnisse verdeutlichen, dass es
insbesondere in SJL/J-Mäusen in Abhängigkeit von der Region zu unterschiedlich
effektiven Immunreaktionen gegen das Virus kommt. In diesem Zusammenhang
findet sich bei experimentellen Infektionen mit attenuiertem LCMV eine effektive TZellantwort, welche den Erreger im Ependym, allerdings nicht im Neuroparenchym
zerstört (PINSCHEWER et al., 2010). Auch bei anderen Virusinfektionen wie
beispielsweise der MHV-Infektion findet sich der Erreger initial in Ependymzellen und
anschließend in der periventrikulären Region des Gehirns (STOHLMAN und
HINTON, 2001; REINACHER et al., 1983). In Analogie zu der beobachteten
periventrikulären Virusausbreitung mit Myelinverlust in TMEV-infizierten SJL/JMäusen, findet sich eine periventrikuläre Entmarkung bei der MS des Menschen
(ADAMS et al., 1987) und bei der Staupevirusinfektion des Hundes (BEINEKE et al.,
2009; SUMMERS et al., 1978).
Vergleichbar den Befunden im Großhirn konnte eine nahezu identische Verteilung
des TMEV am apikalen Saum des Ependyms des vierten Ventrikels in beiden
Mäusestämmen nach einer Stunde post infectionem nachgewiesen werden.
Außerdem fand sich der Erreger am vierten Tag nach der Infektion im Zytoplasma
der Ependymzellen sowie in Zellen der periventrikulären weißen Substanz und der
ventrikelnahen Kerngebiete (Abb. 6-1). Erst ab dem Tag 28 post infectionem zeigte
sich im Stammhirn ein deutlicher Unterschied im Virusverteilungsmuster zwischen
den beiden Mäusestämmen. Während die resistenten C57BL/6-Mäuse das TMEV
eliminierten kam es zu einer Persistenz in SJL/J-Mäusen. Hierbei verschwand das
Virus im Verlauf der Infektion aus dem periventrikulären Bereich und fand sich in der
späten chronischen Phase (196 Tage nach der Infektion) vorwiegend in der weißen
Substanz des Stammhirns. Das Stammhirn stellt damit zusammen mit dem
Rückenmark (ZOECKLEIN et al., 2003) die Hauptregion für die Erregerpersistenz dar
(Abb. 6-1).
78
6.2.2
Diskussion
Virusausbreitung im Rückenmark bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
Nach intrazerebraler Infektion des TMEV persistiert das Virus während der
chronischen
Infektionsphase
in
empfänglichen
Mäusestämmen
in
der
demyelinisierten weißen Substanz des Rückenmarks (TSUNODA und FUJINAMI,
2002). Als möglichen Ausbreitungsweg des TMEV vom Gehirn ins Rückenmark wird
der Kortikospinaltrakt diskutiert, da dort virusinfizierte gliale Zellen nachgewiesen
werden. Außerdem wird eine hämatogene Ausbreitung postuliert, weil das Virus
zusätzlich auch in den ventralen Anteilen der Spinalnerven des Rückenmarks
detektierbar ist (WADA und FUJINAMI, 1993). Mittels PCR wurden in der
chronischen Infektionsphase 10-100mal höhere BeAn-Virus RNS-Äquivalente im
Rückenmark im Vergleich zum Klein-, Stamm- und Großhirn von SJL/J-Mäusen
detektiert (TROTTIER et al., 2002).
Über die Foramina luschkae könnte das TMEV in der vorliegenden Studie
theoretisch vom Ventrikelsystem des Gehirns in den Subarachnoidalraum gelangen
und von dort aus das Rückenmark infizieren (WELLER et al., 2009). Andererseits
konnte im Subarachnoidalraum des Rückenmarks kein TMEV in dieser Studie
nachgewiesen werden, wie es bei MHV- oder Herpes simplex Virus-Infektionen in
experimentellen
Mäusestudien
beschrieben
ist
(BOERMANN
et
al.,
1992;
TAKATSUKI et al., 2010). Hinweise für eine hämatogene Virusausbreitung ergaben
sich bei dieser Studie nicht, da das Virus weder in der Nähe von Blutgefäßen noch in
Endothelzellen selbst detektiert wurde. Eine axonale Ausbreitung des TMEV nach
intrazerebraler
Infektion
wird
von
anderen
Forschergruppen
beschrieben
(RODRIGUEZ et al., 1983 a; WADA und FUJINAMI, 1993). Bei dem hochvirulenten
GDVII-Stamm konnte eine aufsteigende, intraaxonale Infektion ins Rückenmark über
den N. ischiadicus gezeigt werden (MARTINAT et al., 1999). Bei einer weiteren
Studie mit immundefizienten SCID-Mäusen wurde nach direkter Injektion des DAVirusstammes in den N. ischiadicus auch eine Infektion der Nerven und des
Rückenmarks mit Demyelinisierung nachgewiesen (DRESCHER und TRACY, 2007).
Höchstwahrscheinlich war dieses im ersten Fall durch die Neurovirulenz des GDVII-
Diskussion
79
Virus und im zweiten Fall durch die Immundefizienz des Mäusestammes sowie die
direkte Infektion des peripheren Nervens bedingt. In der vorliegenden Studie wurde
hingegen
kein
Virus
in
den
abgehenden
peripheren
Nerven
der
Mäuse
nachgewiesen. Bei resistenten Mäusen war zu keinem Infektionszeitpunkt Virus im
Rückenmark in dieser Studie nachweisbar. Dieses entspricht den Ergebnissen
anderer Arbeitsgruppen. Die empfänglichen Mäuse wiesen, wie in der Literatur
beschrieben, ab Tag 14 post infectionem das Virus in der demyelinisierten weißen
Substanz der Ventral- und Lateralhörner des Rückenmarks auf (LIPTON et al., 1995;
PENA ROSSI et al., 1997). In beiden Mäusestämmen wurde das TMEV
ausschließlich im ZNS nachgewiesen. Wie schon in der Literatur beschrieben, erfolgt
nach intrazerebraler Injektion des TMEV in immunkompetenten Mäusen keine
Ausbreitung in extraneurale Organe (LIPTON et al., 2005 a; OLESZAK et al., 2004;
TROTTIER
et
al.,
2002).
Lediglich
nach
oraler
Infektion
von
neonaten,
immundefizienten Mäusen oder nach induziertem Stress, gelang es das Virus in
extraneuralen Organen nachzuweisen (HA-LEE et al., 1995; MI et al., 2006; YOUNG
et al., 2010). Somit steht bei der experimentellen TME die zentralnervöse Persistenz
des Virus im Zusammenhang mit der Immunkompetenz der Versuchstiere und der
Infektionsart (DRESCHER und TRACY, 2007; WADA und FUJINAMI, 1993).
6.2.3
Phänotypisierung der infizierten Zellpopulationen im Verlauf der
murinen Theiler-Enzephalomyelitis
In der zweiten Studie wurde mittels Immunhistologie- und in situ-Hybridisierung die
Virusverteilung im Gewebe untersucht und mittels Doppelimmunfluoreszenzfärbung
und konfokaler Lasermikroskopie die infizierten Zellen näher charakterisiert. Die
Ergebnisse ergaben einen Virusnachweis ab Tag 28 nach der Infektion im
Stammhirn und Rückenmark in Makrophagen und Oligodendrozyten (Abb. 6-1). Wie
in vorangegangenen Studien beschrieben, war das TMEV bis zum 14. Tag post
infectionem sowohl in Astrozyten, Makrophagen und Oligodendrozyten nachweisbar
(PENA ROSSI et al., 1997).
80
In
Diskussion
vitro-Doppelimmunfluoreszenzfärbungen
Mäusezellkulturen
ergaben
eine
lytische
mit
dem
DA-Stamm
Infektion
von
infizierter
Neuronen
und
Oligodendrozyten und eine Persistenz in Astrozyten und Makrophagen (GRAVES et
al., 1986). Untersuchungen mittels Immunhistologie und Elektronenmikroskopie
zeigten in der chronischen Infektionsphase von DA-Virus infizierten Mäusen eine
primäre Persistenz in Oligodendrozyten im Rückenmark (RODRIQUEZ et al., 1983 a;
AUBERT et al., 1987). In einer anderen Studie wurde aus dem Rückenmark von
SJL/J-Mäusen mit Hilfe einer diskontinuierlichen Percoll-Gradienten-Zentrifugation
gezeigt, das Makrophagen ca. 90% der BeAn-Virus infizierten Zellen in der
chronischen
Infektionsphase
Doppelimmunfluoreszenzfärbungen
darstellen
und
(CLATCH
konfokale
et
al.,
Lasermikroskopie
1990).
zeigten
ebenfalls, dass das TMEV überwiegend in Makrophagen in der weißen Substanz
persistiert und deren Anzahl vom 14. bis zum 49. Tag post infectionem ansteigt.
Hierbei wird angenommen, dass das Virus von Zelle zu Zelle übertragen wird
(LIPTON
et
al.,
1995).
Ähnliche
Ergebnisse
lieferten
Doppelimmunfluoreszenzfärbungen in der chronischen Phase (45-90 Tag post
infectionem) im Rückenmark, die zeigten, dass vorwiegend Mikroglia/Makrophagen
infiziert sind (ZOECKLEIN et al., 2003). Im Gegensatz zu diesen Arbeiten und den
Ergebnissen der eigenen Untersuchungen ergab eine weitere Studie, dass das Virus
während der chronischen TME-Phase vorwiegend in Astrozyten und seltener in
Mikroglia/Makrophagen repliziert (ZHENG et al., 2001). Weiterhin fand sich der
Erreger in BeAn-infizierten CBA-Mäusen im Gehirn und Rückenmark ab dem 50. Tag
nach der Infektion hauptsächlich in Oligodendrozyten und in einzelnen Astrozyten,
während keine Infektion von Makrophagen nachweisbar war (SIMAS und
FAZAKERLEY, 1996). Diese Befunde konnten im zweiten Teil der Studie nicht
bestätigt werden. In der chronischen Infektionsphase wurde das TMEV lediglich in
Mikroglia/Makrophagen
und Oligodendrozyten nachgewiesen,
während keine
Infektion von Astrozyten im Stammhirn und Rückenmark der untersuchten Tiere
detektierbar war.
Diskussion
6.3
81
Entzündungsreaktionen im Zentralen Nervensystem von
SJL/J- und C57BL/6-Mäusen im Verlauf der murinen
Theiler-Enzephalomyelitis
6.3.1
Entzündungsreaktionen im Großhirn bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
Die Entzündungsreaktionen im Großhirn von empfänglichen und resistenten Mäusen
wiesen in der akuten Infektionsphase ein sehr ähnliches Verteilungsmuster auf. An
den Tagen vier, sieben und 14 post infectionem zeigten sich im Kortex, Corpus
callosum, Hippokampus, Thalamus und Hypothalamus bei SJL/J- und C57BL/6Mäusen perivaskuläre Infiltrate und Gliosen. Vergleichbare Entzündungsreaktionen
fanden sich auch in der periventrikulären Region des Großhirns. Im Thalamus und
Hypothalamus waren die perivaskulären Entzündungszellinfiltrate und glialen
Reaktionen am siebten Tag post infectionem bei beiden Mäusestämmen am
deutlichsten ausgeprägt (Abb. 6-1). In der Literatur wird ein vergleichbares
Entzündungsmuster
in
der
akuten
Infektionsphase
bei
schwachvirulenten
Virusstämmen sowie für andere empfängliche CBA- und resistente Balb/c-Mäuse
beschrieben (RODRIGUEZ et al., 1987; SIMAS und FAZAKERLEY, 1996;
ZOECKLEIN et al., 2003). In der chronischen Infektionsphase (> 28 Tage nach der
Infektion) nahmen die Entzündungsreaktionen kontinuierlich ab. Lediglich im
Thalamus und Hypothalamus waren bis zum 196. Tag post infectionem entzündliche
Reaktionen sichtbar. Dieses Ergebnis entspricht vorherigen Studien, in denen im
Großhirn in der chronischen Phase zusätzlich Mineralisationen und Malazien,
vermutlich als Folge der intrazerebralen Infektion beschrieben wurden (LIPTON,
1994; RODRIGUEZ et al., 1993).
Schließlich konnten in der akuten Phase mittels Immunhistologie deutliche
Infiltrationen bzw. Proliferationen von CD107b+-Mikroglia/Makrophagen in den
periventrikulären Bereichen des Großhirns und des Corpus callosums bei beiden
untersuchten Mäusestämmen beobachtet werden. Das zeitgleiche Auftreten von
Virusantigen bzw. -RNS in den entsprechenden Arealen spricht hierbei für das
Vorliegen
von
erregerbedingten
Entzündungsreaktionen.
Hinweise
auf
82
Diskussion
immunpathologische Reaktionen bzw. Myelinverluste konnten im Großhirn der
infizierten Versuchstiere hingegen nicht nachgewiesem werden.
6.3.2
Entzündungsreaktionen im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark
bei SJL/J- und C57BL/6-Mäusen
Klein- und Stammhirn wiesen am vierten Tag post infectionem bei beiden
Mäusestämmen ähnliche Läsionen, wie sie im Großhirn sichtbar waren, auf. Um den
vierten Ventrikel zeigten sich hyperzelluläre Areale mit perivaskulären Infiltraten. Im
weiteren Verlauf der Infektionsphase blieben diese Entzündungsreaktionen bei den
SJL/J-Mäusen bis zum 196. Tag post infectionem im Stammhirn, überwiegend in der
weißen Substanz, bestehen. Die resistenten C57BL/6-Mäuse zeigten ab den 28. Tag
nach der Infektion keine perivaskulären Infiltrate in den ventrikelnahen Regionen. In
der grauen und weißen Substanz des Stammhirns nahmen die entzündlichen
Infiltrate von der akuten zur chronischen Phase bei empfänglichen SJL/J-Mäusen
hingegen zu. Am stärksten ausgeprägt war die Entzündung am 28. Tag post
infectionem. Die Entzündungszellinfiltrationen im ZNS der SJL/J-Mäuse sind sehr
wahrscheinlich
Krankheitsverlauf
für
„bystander“-
verantwortlich
und
DTH-Reaktionen
(FUJINAMI
et
al.,
2006;
im
chronischen
GIRAUDOU
und
BERNARD, 2010). Resistente Mäuse zeigten hingegen nur eine minimale Gliose im
Verlauf der Infektion und in einem sehr geringen Ausmaß perivaskuläre
Entzündungszellinfiltrate. Die abnehmende Entzündungsreaktion in resistenten
Mäusestämmen ist als Folge der effektiven antiviralen Immunantwort und der damit
verbundenen vollständigen Viruseliminierung zu interpretieren (OLEASZEK et al.,
2004). Vergleichbar den Prozessen im Stammhirn ließen sich in der weißen
Substanz des Rückenmarks bei SJL/J-Mäusen zunehmend perivaskuläre und diffuse
Entzündungszellinfiltrate sowie Demyelinisierungen ab dem 14. Tag post infectionem
nachweisen. Im Gegensatz hierzu zeigten die resistenten Mäuse eine nur
geringgradige Gliazellaktivierung im Rückenmark und nahezu keine perivaskulären
Infiltrate. Diese Ergebnisse konnten in vorangegangenen Studien ebenfalls gezeigt
Diskussion
83
werden und scheinen mit dem genetischen Hintergrund der Tiere und deren
antiviraler Immunabwehr im Zusammenhang zu stehen (GERHAUSER et al., 2005;
ULRICH, 2006; ULRICH et al., 2006; OLEASZEK et al., 2004; CHAMORRO et al.,
1996). Im Stammhirn und Rückenmark von SJL/J-Mäusen waren die CD107b+-Zellen
in der chronischen Phase im Gegensatz zur akuten Phase im Großhirn deutlich
vermehrt.
Die
CD107b+-Zellansammlungen
Gitterzelltransformationen
unterstützen
daher
und
die
waren
Entmarkungsherden
Hypothese
des
hier
in
der
assoziiert.
Vorliegens
von
Regel
Die
mit
Befunde
„bystander“-
Demyelinisierungen bzw. DTH-Reaktionen in den entsprechenden ZNS-Regionen.
Die Ursache der beobachteten unterschiedlichen Sensitivitäten im ZNS bleibt
aufgrund
der
vorliegenden
Ergebnisse
spekulativ,
allerdings
muss
von
topographischen Unterschieden des Mikromilieus, der Bluthirnschranke, und/oder
der Zusammensetzung der glialen Zellen im ZNS der Versuchstiere ausgegangen
werden. Vergleichbare regionale Differenzen bezüglich der Entzündungsantwort und
Demyelinisierung finden sich in diesem Zusammenhang bei der MS des Menschen
(ADAMS et al., 1987; LASSMANN et al., 2001 und 2007; NEWCOMBE et al., 1991).
6.4
Demyelinisierung
im
Zentralen
Nervensystem
nach
Infektion mit dem murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
6.4.1
Demyelinisierung im Kleinhirn, Stammhirn und Rückenmark bei
SJL/J-Mäusen
Bei den empfänglichen SJL/J-Mäusen zeigte sich ab Tag 28 post infectionem eine
ausgeprägte Demyelinisierung um den vierten Ventrikel. Dabei waren auch Anteile
des Kleinhirns, dorsal um den Ventrikel betroffen. Ab dem 56. Tag nahm die
periventrikuläre Entmarkung ab und war am 196. Tag nach der Infektion nicht mehr
nachweisbar. In der weißen Substanz des Stammhirns und Rückenmarks war die
Entmarkung hingegen deutlich ausgeprägt und mit Entzündungszellinfiltrationen und
Myelinophagie vergesellschaftet. Wie in anderen Arbeiten beschrieben war die
84
Diskussion
Demyelinisierung in der weißen Substanz des Stammhirns in der Regel mit einem
Virusnachweis in den jeweiligen Regionen verbunden (ZOECKLEIN et al., 2003;
Abb. 6-1). Für die Entstehung der Demyelinisierung bei der TME ist die Infektion der
Oligodendrozyten ausschlaggebend. Im weiteren Verlauf kommt es durch die
Mikrogliaaktivierung und Sekretion von IFN-γ zur Infiltration von Makrophagen. Durch
die weitere Akkumulation von CD4+-T-Zellen werden DTH-Reaktionen im ZNS
induziert (STOHLMAN und HINTON, 2001). Bei der MS zeigt sich in der chronischen
Demyelinisierungsphase ein sehr ähnliches Verteilungsmuster der Läsionen in der
weißen
Substanz
des
Klein-
und
Stammhirns
sowie
vergleichbare
immunpathologische Prozesse (OLESZAK et al., 2004).
Die Demyelinisierung in der weißen Substanz des Rückenmarks begann ab dem 28.
Tag post infectionem und beschränkte sich hauptsächlich auf die lateralen und
ventralen Funiculi. Bis zum Tag 196 konnten in der vorliegenden Arbeit
Entmarkungsherde mit Myelinophagie und Entzündungszellinfiltraten nachgewiesen
werden. Diese Ergebnisse konnten in vorherigen Studien ebenfalls beobachtet
werden (ZOECKLEIN et al., 2003; ULRICH, 2006; ULRICH et al., 2006). Außerdem
zeigt sich im Rückenmark von MS-Patienten ein vergleichbares Verteilungsmuster
der Demyelinisierung in der weißen Substanz (LASSMANN et al., 2007;
NEWCOMBE et al., 1991; OLESZAK et al., 2004).
Diskussion
85
Abbildung 6-1: Schematische Darstellung des Infektionsverlaufes bei der experimentellen
Theiler-Enzephalomyelitis in SJL/J- und C57BL/6-Mäusen.
Nach intrazerebraler Injektion findet sich das murine Theiler-Enzephalomyelitisvirus vom
BeAn-Stamm in beiden Mäusestämmen während der akuten Infektionsphase (bis zum 14.
Tag nach der Infektion [dpi]) überwiegend im Großhirn (A1). Hierbei liegt initial eine Infektion
von Ependymzellen (A2), Neuronen (A3) und Astrozyten (A4) vor. Die resultierende akute
Polioenzephalitis ist in SJL/J- und C57BL/6-Mäusen gleichermaßen durch perivaskuläre
lymphohistiozytäre Infiltrationen (A5) und Gliosen (A6) gekennzeichnet. Während C57BL/6Mäuse das Virus im weiteren Verlauf eliminieren, führt eine unzureichende antivirale
Immunantwort zur Erregerpersistenz im Stammhirn und Rückenmark von SJL/J-Mäusen
(B1). In der chronischen Infektionsphase (28. bis 196. dpi) findet sich der Erreger hierbei
überwiegend
in
der
weißen
Substanz
(B2)
in
Mikroglia/Makrophagen
(B3)
und
Oligodendrozyten (B4). Aufgrund der periventrikulären Ausbreitung kann anfänglich (28. dpi)
eine periventrikuläre Demyelinisierung um den vierten Ventrikel (B5) beobachtet werden, die
sich ab dem 56. dpi auf die weiße Substanz des Stammhirns und Rückenmarks weiter
ausbreitet (B6).
86
Diskussion
TMEV: murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus; A1 = Virusausbreitung im ZNS während der
akuten Infektionsphase; A2 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV in Ependymzellen;
A3 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV in Neuronen; A4= Immunfluoreszenzmikroskopische Doppelmarkierung (konfokale Lasermikroskopie) zum Nachweis des TMEV
(rot) in Astrozyten (GFAP = grün), TMEV-infizierte Astrozyten (doppelmarktierte Zellen)
stellen sich gelb dar; A5 und A6 = Histologischer Nachweis perivaskulärer Infiltrate und
Gliose mittels Hämatoxylin-Eosin-Färbung; B1 = Virusausbreitung im ZNS während der
chronischen Infektionsphase; B2 = Immunhistologischer Nachweis des TMEV-infizierten
Zellen in der weißen Substanz; B3 und B4 = Immunfluoreszenzmikroskopische
Doppelmarkierungen (konfokale Lasermikroskopie) zum Nachweis des TMEV (rot) in
Mikroglia/Makrophagen (F4/80 = grün) und Oligodendrozyten (CNPase = grün), TMEVinfizierte Mikroglia/Makrophagen bzw. Oligodendrozyten (doppelmarktierte Zellen) stellen
sich gelb dar; B5 und B6: Histologischer Nachweis der Entmarkung im periventrikulären
Bereich und der weißen Substanz mittels Luxol Fast Blue-Kresylechtviolett-Färbung.
6.5
Schlussbetrachtung
In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil ein polyklonaler Antikörper zum
spezifischen Nachweis des TMEV in infizierten Geweben und Zellkulturen
hergestellt.
Neben
seiner
Einsetzbarkeit
in
der
Immunhistologie
und
Immunfluoreszenz ermöglicht der Marker darüber hinaus die Detektion des Virus auf
subzellulärer Ebene mittels Elektronenmikroskopie und konfokaler Lasermikroskopie.
Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen außerdem die besondere Bedeutung der
Western Blot-Technik und Massenspektrometrie zur spezifischen Charakterisierung
von Antikörpern.
Die Ergebnisse des zweiten Teils der Arbeit unterstützen die Hypothese einer
liquorogenen Ausbreitung des TMEV. Die ependymale Infektion und konsekutive
periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht beschriebenes Phänomen in
diesem Tiermodell für demyelinisierende Krankheiten dar (HA-LEE et al., 1995;
STOHLMAN und HINTON, 2001; TROTTIER et al., 2001). Diese Beobachtung sowie
die Darstellung regional unterschiedlicher Empfindlichkeiten im ZNS zeigen deutliche
Diskussion
87
Parallelen zur Läsionsentwicklung bei MS-Patienten (ADAMS et al., 1987). In diesem
Zusammenhang wird die periventrikuläre Region im Gehirn als ein potentielles Ziel
für innovative Therapieansätze, insbesondere von Remyelinisierungsstrategien, bei
der MS angesehen (EINSTEIN et al., 2009; LEVINE und REYNOLDS, 1999).
Weiterhin
findet
sich
bei
der
MS
und
TME
eine
gestörte
Oligodendrozytendifferenzierung (ULRICH et al., 2008; PRINGPROA et al., 2010), so
dass die Untersuchung der Markscheidenveränderungen in periventrikulären
Gehirnregionen von TMEV-infizierten Mäusen einen neuartigen Ansatz darstellt, um
endogene Myelinisierungsmechanismen zu studieren.
88
Zusammenfassung
7
Zusammenfassung
Untersuchung über die Virusausbreitung und -persistenz bei der murinen
Theiler-Enzephalomyelitis
von
experimentell
infizierten
Mäusen
mittels
polyklonaler Antikörper und RNS-Sonden
Maren Kummerfeld
Die experimentelle Infektion mit dem murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
(TMEV), einem einzelsträngigen RNS-Virus, welches zum Genus Cardiovirus und
der Familie Picornaviridae gehört, ruft eine demyelinisierende Leukomyelitis in
empfänglichen Mäusestämmen hervor. Nach einer akuten Infektionsphase im Gehirn
wird das Virus in resistenten C57BL/6-Mäusen eliminiert, wohingegen eine nicht
ausreichende antivirale Immunantwort in empfänglichen SJL/J-Mäusen eine
Viruspersistenz
bedingt.
Hypersensitivitätsreaktion
Autoimmunität,
welche
Weiterhin
vom
eine
führt
das
Virusantigen
verzögerten
Typ
und
entzündliche
zu
einer
Myelin-spezifischen
Demyelinisierung
vorwiegend
im
Rückenmark empfänglicher Mäusestämme hervorrufen. Diese Veränderungen
entsprechen daher denen der chronisch progressiven Verlaufsform der Multiplen
Sklerose (MS) des Menschen. Aufgrund der Ergebnisse vorangegangener Studien
stellt sich die Frage nach der Virusausbreitung und der Entstehung der Läsionen im
Zentralen Nervensystem (ZNS) zu Beginn und während des chronischen Verlaufes
der
experimentellen
murinen
Theiler-Enzephalomyelitis
in
resistenten
und
empfänglichen Mäusestämmen.
Das Ziel der ersten Studie bestand in der Herstellung und Charakterisierung eines
spezifischen polyklonalen Antikörpers zur Erkennung des TMEV in infizierten
Geweben und Zellkulturen. Hierfür wurden drei weiße Neuseeländische Kaninchen
mit gereinigtem TMEV des BeAn-Stammes immunisiert. Die Spezifität des
Antikörpers wurde mittels Western Blot bestimmt und eine Sequenzanalyse des
erkannten
Antigens
mittels
Massenspektrometrie
durchgeführt.
Das
Postimmunisierungsserum wurde auf Spezifität des polyklonalen Antikörpers in
Zusammenfassung
89
TMEV-infizierten L-Zellen (Lungenzelltumorlinie der Maus) mittels Immunfluoreszenz
getestet. Zusätzlich, wurde an Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten TMEVinfizierten BHK21-Zellpellets und Gehirngewebe TMEV-infizierter Mäuse das Virus
immunhistochemisch
detektiert.
Außerdem
konnten
mittels
Immunelektronenmikroskopie Picornavirus-typische parakristalline Ansammlungen
und dissoziierte Viren im Zytoplasma TMEV-infizierter BHK21-Zellen nachgewiesen
werden.
Das Ziel der zweiten Studie bestand in der Identifizierung von topographischen
Unterschieden in der Virusausbreitung und Demyelinisierung im ZNS von infizierten
empfänglichen SJL/J- und resistenten C57BL/6-Mäusen. Die Virusverteilung im ZNS
und in extraneuralen Geweben wurde immunhistochemisch mit Hilfe des
hergestellten polykonalen TMEV-spezifischen Antikörpers quantifiziert. Weiterhin
wurde zusätzlich virale RNS mittels in situ-Hybridisierung detektiert und der
Phänotyp der infizierten Zellen mittels Immunfluoreszenzdoppelmarkierung in der
konfokalen Lasermikroskopie dargestellt. Entzündungszellreaktionen sowie die
Demyelinisierung wurden histologisch semiquantitativ ausgewertet. Des Weiteren
wurden Makrophagen und Mikroglia mittels CD107b-spezifischer Immunhistologie in
unterschiedlichen ZNS-Lokalisationen quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten eine frühe
Infektion der ependymalen und periventrikulären Zellen, begleitet von einer
Entzündungs- und Entmarkungsreaktion um den vierten Ventrikel in empfänglichen
SJL/J-Mäusen. In der chronischen Phase lag eine Viruspersistenz im Stammhirn und
Rückenmark infizierter SJL/J-Mäuse vor. Die primären Zielzellen der Persistenz des
BeAn-Virus waren Mikroglia/Makrophagen und Oligodendrozyten. Während die
periventrikuläre Demyelinisierung um den vierten Ventrikel in der chronischen Phase
abnahm, stieg der Schweregrad der Läsionen in der weißen Substanz des
Stammhirns an. Der Myelinverlust war von einer Ansammlung von CD107b+Mikroglia/Makrophagen begleitet.
Die Ergebnisse des ersten Teils zeigten die vielfältige Verwendungsmöglichkeit des
polyklonalen Antikörpers zur Untersuchung des TMEV-Zelltropismus und der
Virusausbreitung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Mit Hilfe dieses Antikörpers
konnte eine Untersuchung der Virusverteilung in verschiedenen Regionen des ZNS
90
an
Zusammenfassung
unterschiedlichen
Zeitpunkten
und
der
damit
verbundenen
Entzündungsreaktionen im Rahmen der zweiten Studie erfolgen. Die ependymale
Infektion und konsekutive periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht
beschriebenes Phänomen bei der TME dar. Die neuen Aspekte bezüglich der
Virusausbreitung im ZNS liefern daher einen Beitrag zum besseren Verständnis
regionabhängiger Entzündungsreaktionen und regenerativer Vorgänge in diesem
viralen MS-Modell.
Summary
8
91
Summary
Examination of viral distribution und persistence during the TheilersEncephalomyelitis in experimentally infected mice using polyclonal antibodies
and RNA probes
Maren Kummerfeld
The experimental infection with the Theiler‘s murine encephalomyelitis virus
(TMEV), a single-stranded RNA virus which belongs to the cardiovirus genus of the
family Picornaviridae causes a demyelinating leukomyelitis in susceptible mice
strains. Thus, while the virus is eliminated from the brain in resistant C57BL/6 mice
after the initial phase, an inadequate antiviral immune response leads to viral
persistence in susceptible SJL/J mice. Subsequent, viral antigen-induced delayedtype hypersensitivity and myelin-specific autoimmunity induce inflammatory
demyelination predominantly in the spinal cord of susceptible mouse strains,
resembling the chronic progressive form of human multiple sclerosis (MS). Previous
studies have raised the question of region-specific viral spread and central nervous
system (CNS) lesion development during the initiation and progression of
experimental Theiler´s murine encephalomyelitis (TME) in resistant and susceptible
mice strains.
The intention of the first part of the study was to generate and characterize a specific
polyclonal antibody for the detection of TMEV in infected tissues and cell cultures.
Therefore, New Zealand white rabbits were immunized with purified TMEV of the
BeAn strain. The specificity of the antiserum was confirmed by Western blotting and
sequence analysis of the recognized antigen by high resolution mass spectrometry.
The presence of TMEV-specific polyclonal antibodies in postimmunization sera was
tested on TMEV-infected L-cells (murine lung tumor cell line) using an
immunofluorescence assay. Additionally, the rabbit serum enabled virus detection in
formalin-fixed and paraffin-embedded TMEV-infected BHK21 cell pellets and brain
92
tissue
Zusammenfassung
of
TMEV-infected
mice
by
immunohistochemistry.
Immune
electron
microscopy revealed colloid gold-labeled picornavirus-typical paracrystalline arrays
and non-aggregated viral particles of TMEV-infected BHK21 cells. Strikingly, apart
from labeling of aggregated virus particles arranged in paracrystalline arrays, which
are detected easily by conventional electron microscopy, the postimmunization sera
also allowed the detection of non-aggregated individual viral particles of infected
BHK21 cells.
The aim of the second part of study was to identify topographical differences of
TMEV spread and demyelination in the CNS of experimentally infected susceptible
SJL/J mice and resistant C57BL/6 mice. Viral dissemination within the CNS and
extraneural tissues was quantified by immunohistochemistry using the generated
TMEV-specific polyclonal antibody. Further, viral RNA was detected by in situhybridization and the phenotype of infected cells was identified by confocal laser
scanning microscopy. Inflammatory responses and demyelination within the CNS
were determined by histology using semiquantitative scoring systems. Furthermore,
accumulation of microglia/macrophages was quantified in different CNS regions by
CD107b-specific immunohistochemistry. Results show an early infection of
ependymal and periventricular cells followed by inflammation and demyelination
around the fourth ventricle in susceptible SJL/J mice. Persistence of the virus was
observed in the brain stem of SJL/J mice during the chronic disease phase. Here,
microglia/macrophages and oligodendrocytes represented the primary targets of the
TMEV. While periventricular demyelination was transient, white matter lesions of
brain stem and spinal cord progressed. Myelin loss was associated with an
accumulation of CD107b+ microglia/macrophages.
The results of the first part of the study demonstrate the applicability of the generated
polyclonal antibody for investigating TMEV cell tropism and viral spread at a cellular
and subcellular level. Using this marker a spatiotemporal analysis of virus
dissemination and associated injuries in different CNS regions was performed in the
second part of the study. Here, the demonstration of ependymal infection and
subjacent spread into the brain parenchyma as well as regional virus clearance
despite ongoing demyelination in other CNS compartment allows new insights into
Summary
93
TME pathogenesis. This novel aspect of virus CNS interaction will enhance the
understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities
of the brain in this infectious MS model.
94
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infection II: NK cell function and cytokine levels in acute disease. Brain. Behav.
Immun. 18, 166-174
WILLER, C.J. und G.C. EBERS (2000):
Susceptibility to multiple sclerosis: interplay between genes and enviroment.
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WOODRUFF, R.H. und R.J.M. (1999):
Demyelination and remyelination of the caudal cerebellar peduncle of adult rats
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stereotaxic
injections
of
lysolecithin,
ethidium
bromide,
and
complement/anti-galactocerebroside: A comparative study. Glia. 25, 216-228
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117
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YAUCH, R.L. and B.S. KIM (1994):
A predominant viral epitope recognized by T cells from the periphery and
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ZURBRIGGEN, A. und R.S. FUJINAMI (1988):
Theiler´s virus infection in nude mice: viral RNA in vascular endothelial cells. J.
Virol. 62, 3589-3596
118
Anhang
10
Anhang
10.1
Ergänzendes Material zu Kapitel 4
10.1.1
Vermehrung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus in
BHK21-Zellen
Die BHK21-Zellen (permanente Fibroblastenzelllinie aus Babyhamsterniere) wurden
freundlicherweise von Prof. R. Roos von der Universität in Chicago zur Verfügung
gestellt.
Die Kultivierung erfolgte in T75-Zellkulturflaschen bei 37 °C und 5% CO2 im
Brutschrank
(Heraeus)
bis
zu
einem
50-60%
konfluenten
Zellrasen.
Als
Wachstumsmedium diente Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM) mit LGlutamin, 4500 mg/l D-Glucose, 50 µg/ml Gentamicin und 10% fötalem Kälberserum
(FKS). Die BHK21-Zellen wurden mit 5 ml Trypsin vom Flaschenboden abgelöst und
bei 400 x g und 4 °C für 5 Minuten zentrifugiert. Dann wurden 200 µl der
Zellsuspension mit 400 µl einer 0,2%igen Trypanblaulösung vermischt und in eine
Zählkammer nach Neubauer (Roth) pipettiert. Das Verhältnis der Zellsuspension zu
der Trypanblaulösung betrug 1:3 und in einem Quadranten der Zählkammer lagen
genau 0,1 µl des Gemisches vor. Unter dem Auflichtmikroskop (IX 70, Olympus)
wurde die Zellzahl in 3 Gruppenquadranten in der Zählkammer nach Neubauer
(Roth) ausgezählt und so konnte auf die Zellzahl in 0,1 µl geschlossen und daraus
die Gesamtzellzahl pro ml berechnet werden.
Formel:
Durchschnittliche Zellzahl x 3 x 10000 = Zellen/ml
3
Für die Infektion mit dem BeAn-Stamm des TMEV wurden 3 Millionen Zellen pro
Zellkulturflasche ausgesät und 24 Stunden bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank
(Heraeus) bis zu einem 75% konfluenten Zellrasen inkubiert. Der Virusstamm wurde
Anhang
119
dem Institut für Pathologie freundlicherweise von Prof. H. Lipton von der NorthWestern Universität in Chicago überlassen. Die BHK21-Zellen wurden mit einer
multiplicity of infection (MOI) von 0,1 pro Zelle der Passage 7 des BeAn-Stammes in
DMEM 2% FKS infiziert. Die Virusadsorption in den infizierten Zellen erfolgte auf
einem Horizontalschüttler (New Brunswick) bei 75 Umdrehungen pro Minute und
Raumtemperatur. Anschließend wurde der Zellrasen einmal mit DMEM ohne FKS
gewaschen und mit DMEM 2% FKS bei 37°C und 5% CO2 im Brutschrank (Heraeus)
für 19 Stunden inkubiert.
Bei einem zytopathischen Effekt von mehr als 95% der BHK21-Zellen erfolgte die
Virusernte mittels der Trockeneis-Azetonmethode (BAUMGÄRTNER et al., 1981).
Die infizierten und vom Zellkulturflaschenboden abgeschabten Zellen wurden in ein
Zentrifugenröhrchen überführt. Dazu wurde ein Gemisch, welches aus Azeton
(Fluka) und Trockeneis in einem Verhältnis 1:1 bestand, hinzugefügt. Zur
Freisetzung der Viruspartikel wurde diese Suspension dann dreimal eingefroren und
anschließend in kaltem Leitungswasser wieder aufgetaut. Abschließend wurde die
Virussuspension
durch
eine
10-minütige
Zentrifugation
in
blauen
Greiner-
Zentrifugengefäßen bei 380 x g und 4°C gereinigt und der Überstand bei -80°C
gelagert.
10.1.2. Virusreinigung über einen Saccharosegradienten
Die Virusaufreinigung des murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus erfolgte in
Kooperation mit Prof. Dr. Ludwig Haas am Institut für Virologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Der zuvor eingefrorene Überstand der Virussuspension (siehe 10.1.1) wurde
aufgetaut und anschließend zum Trennen von restlichen Zelltrümmern für 30
Minuten (10.000 x g bei 4°C) (Kühlzentrifuge J2-21 mit JS13-Rotor, Beckman)
zentrifugiert. Der virushaltige Überstand wurde in 0,1% Sodiumdodecylsulfat (SDS)
überführt und anschließend in einem Zentrifugenröhrchen mit 3 ml 30%iger
Saccharoselösung (w/v) in PBS unterschichtet. Danach wurde der Überstand für 3
Stunden in einer Ultrazentrifuge (Beckman, Rotor SW32) bei 120.000 x g bei 4°C
120
Anhang
zentrifugiert. Das entstandene virushaltige Pellet wurde in 500 µl PBS resuspendiert
und zur Reinigung über einen kontinuierlichen Saccharosegradienten (20%, 50% und
60% w/v in PBS) geschichtet. Nach einer weiteren zweistündigen Ultrazentrifugation
(Beckman, Rotor SW55) von 150.000 x g bei 4°C wurde die im durchscheinenden
Licht sichtbare, grau-milchige Virusbande mit einer 1 ml Spritze mit aufgesetzter
Kanüle abgenommen und in 3,5 ml PBS gegeben. Die refraktrometrisch gemessene
Dichte lag bei 1,39 g/cm3. Es schloss sich eine einstündige Zentrifugation bei 4°C
und 150.000 x g in der Ultrazentrifuge (Beckman, Rotor SW55) an. Der Überstand
wurde danach verworfen. Das Pellet des gereinigten Virusmaterials wurde kurz
angetrocknet und 100 µl PBS hinzugegeben. Abschließend wurde der Proteingehalt
(mg/ml) in einem Photometer (Pharmacia Biotech) bei einer Wellenlänge von 260 nm
bestimmt und die Probe bei -80°C bis zur Verwendung eingefroren.
10.1.3
Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum Nachweis
vom murinen Theiler-Enzephalomyelitisvirus
10.1.3.1 Herkunft und Haltung der Kaninchen
Die Haltung der Kaninchen zur Herstellung eines polyklonalen Antikörpers zum
Nachweis des murinen Theiler-Enzepalomyeltisvirus (TMEV) wurde von dem
Niedersächsichen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
nach § 10a des Tierschutzgesetzes (TSchG) vom 25.05.1998 in der zurzeit
geltenden Fassung unter dem Aktenzeichen 33-42502-05 A 331
vom 15.4.2005
genehmigt. Es wurden 18 Wochen alte, weibliche, weiße neuseeländische
Kaninchen (Oryctalagus cuniculus) (Harlan Winkelmann) verwendet. Die Kaninchen
waren spezifisch-pathogen frei (SPF) und somit serologisch negativ für Pasteurella
multocida,
Bordetella
bronchiseptica
und
Encephalitozoon
cuniculi.
Die
Quarantänezeit am Institut für Pathologie betrug 14 Tage und der Versuch begann
mit der 20. Lebenswoche der Kaninchen bei einem Körpergewicht von ca. 2,6 kg.
Anhang
121
Die Versuchstiere wurden artgerecht nach § 2 TSchG in Edelstahlkäfigen
(Techniplast) mit 4200 cm2 + 1650 cm2 in zweiter Ebene entsprechend der Norm der
Europarat Konvention EST 123 Appendix A in einem Versuchstierstall des Instituts
für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untergebracht.
Die Einstreu bestand aus einer Schicht Sägemehl (ssniff bedding ¾ Faser, Ssniff
Spezialitäten GmbH). Als Trinkwasser wurde Leitungswasser ad libitum in einer
Trinkflasche
angeboten.
Als
Futter
erhielten
die
Tiere
pelletiertes
Kaninchenerhaltungsfutter (Ssniff Spezialitäten GmbH), Heu ad libitum und zur
Beschäftigung Nageholz. Die Raumtemperatur betrug 23°C im Durchschnitt und die
relative Luftfeuchte lag bei 45%. Es bestand ein natürlicher Tag-Nachtrhythmus.
Nach einer gründlichen Allgemeinuntersuchung bei Lieferung der Kaninchen, folgte
eine täglich protokollierte Routinekontrolle des Allgemeinzustandes mit einer
Überprüfung der Futter- und Wasseraufnahme jeden Tieres. Die drei Kaninchen
waren mit Ohrtätowierungen gekennzeichnet (Tier Nummer 1: FBC2; Tier Nummer 2:
FBI4; Tier Nummer 3: FBG7).
10.1.3.2 Serumgewinnung
Das präimmune und postvakzinale Serum wurde durch die Punktion der zentralen
Ohrarterie bzw. der marginalen Ohrvene gewonnen. Hierzu wurde ein Ohr des
Kaninchens mit 70% igem Ethanol desinfiziert und mit einer 22G Kanüle (Thermo)
wurde zwischen 5 – 10 ml Blut in einem Serumröhrchen (Sarstedt) aufgefangen.
Eine Hilfsperson fixierte das Kaninchen in einem Handtuch als rutschfeste Unterlage.
Nach erfolgter Blutabnahme wurde dem Tier ein Ohrdruckverband aus Zellstofftupfer
(Hartmann) und Heftpflaster (W. Söhngen) angelegt und nach wenigen Minuten, bei
sistierender Blutung wieder entfernt. Das Serumröhrchen wurde leicht geschwenkt
und anschließend bei 4-8°C für Nacht aufbewahrt. Am nächsten Tag wurde das
Serum für 20 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert, anschließend zu 1 ml Portionen
aliquotiert und bei -80°C gelagert. Einzelne Portionen wurden bei 56°C für 30
122
Anhang
Minuten im Wasserbad hitzeinaktiviert und in 50 bzw. 100 µl Portionen für den
direkten Verbrauch bei -80°C gelagert.
10.1.3.3 Immunisierung der Kaninchen
Nach 14 Tagen Quarantänezeit wurde vor der eigentlichen Immunisierung bei jeden
Kaninchen das Präimmunserum entnommen und auf das Vorhandensein von TMEVkreuzreagierenden Antikörpern mittels Immunfluoreszenz und Immunhistologie
gestestet (HARBOW und LANE, 1988). Nach Herstellerangaben wurde das
lyophilisierte Adjuvans (Linaris) für 10 Minuten im 37°C warmen Wasserbad erwärmt
und der Inhalt des Fläschens mit 2 ml PBS und der gewünschten Menge AntigenKonzentration
(siehe
Immunisierungsschema,
10.1.3.4)
gelöst.
Für
die
Erstimmunisierung und die erste Boosterung wurde das Ribi`s komplette Adjuvans
(ABM-ZK, Linaris) verwendet und für die 2. bis 4. Boosterung das Ribi`s inkomplette
Adjuvans (ABM-N, Linaris). Im Bereich der Injektionstelle wurde das Fell rasiert, mit
70%igen Ethanol gereinigt und desinfiziert. Das angesetzte Virus-Adjuvansgemisch
(Linaris) wurde immer mittels 25 G Kanüle subkutan (s.c.) zwischen den
Schulterblättern appliziert. Nach jeder Immunisierung wurde auf ein ungestörtes
Allgemeinbefinden der Kaninchen geachtet. Das jeweilige postvakinale Serum wurde
entsprechend (siehe Kapitel 10.1.3.2) beschrieben aufgearbeitet und in der
Immunfluoreszenz, Immunhistologie und im Westernblot auf das Vorhandensein von
spezifischen Antikörpern gegen das TMEV getestet. Die Tiere wurden am Ende des
Immunisierungversuches tierschutzgerecht (siehe Immunisierungsschema, 10.1.3.4)
euthanasiert und das Blut entnommen (FEHR, 2002).
Anhang
10.1.3.4
123
Immunisierungsschema zur Herstellung des polyklonalen
Antikörpers
1.Tag: Erstimmunisierung mit 250 µg aufgereinigtem Virus in Ribi´s komplette
Adjuvans (ABM-ZK, Linaris) 1,0 ml subkutan (s.c.)
14. Tag: 1. Boosterung mit 250 µg aufgereiningtem Virus in ABM-ZK 0,5 ml s.c.
24. Tag: 1. Serumgewinnung
48. Tag: 2. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in Ribi´s inkompletten
Adjuvans (ABM-N, Linaris) 0,5 ml s.c.
62. Tag: 3. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in ABM-N 0,5 ml s.c.
72. Tag: 2. Serumgewinnung
86. Tag: 4. Boosterung mit 200 µg aufgereinigtem Virus in ABM-N 0,5 ml s.c.
96. Tag: 3. Serumgewinnung
106. Tag: 4. Serumgewinnung
136. Tag: letzte Serumnahme: Narkose (Ketamin 50 mg/kg KM intramuskulär [i.m.]
und Xylaxin 5 mg/kg KM [i.m.]) und Euthanasie (Pentobarbital 100 mg/kg
KM
intraperitoneal
Blutentnahme
[i.p.])
der
drei
Kaninchen
und
anschließende
124
Anhang
10.2
Ergänzendes Material zu Kapitel 5
10.2.1
Overview of viral distribution in C57BL/6-mice infected with
the Theiler`s murine encephalomyelitis virus
CNS localisation
meninx cerebrum
ependyma cells 1
plexus coroideus 1
periventricular area 2
habenular nucleus 2
paraventricular thalamic
nucleus 2
caudate putamen 2
cerebral cortex
corpus callosum
hippocampus*
thalamus
hypothalamus
amygdala
truncus opticus
median eminence
meninx cerebellum
ependyma cells 3
plexus coroideus 3
periventricular fourth ventricle 4
medial longitudinal fasciculus 4
prepositus nucleus 4
vestibular nuclei 4
inferior cerebellar peduncle 5
spinal trigeminal tract 5
vestibulocochlear
nerve 5
nervus fascialis
nucleus 6
ventral cochlear
nucleus 6
gigantocerebellar reticular
nucleus 6
spinal cord white matter 7
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
4 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
7 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
14 dpi
+
+
-
28 dpi
+
+
+
+
+
+
-
56 dpi
-
98 dpi
-
IHC: immunohistochemistry; ISH: in situ -hybridization; CNS: central nervous system;
dpi: days post infection; -: no virus detection; +: virus detection
196 dpi
-
-
Anhang
1
ependyma and plexus coroideus of the third and lateral ventricle;
2
periventricular area of the third and lateral ventricle, including: cerebral white matter
125
surrounding the ventricles, medial and lateral habenular nuclei, paraventricular thalamic
nucleus and caudate putamen;
3
ependyma and plexus coroideus of the fourth ventricle;
4
periventricular area fourth ventricle including: cerebellar white matter adjacent to the fourth
ventricle, brain stem white matter adjacent to the fourth ventricle, prepositus nucleus, medial
longitudinal fasciculus, lateral vestibular, medial vestibular and superior vestibular nuclei,
vestibular cerebellar and medial cerebellar nuclei;
5
brain stem white matter including: inferior cerebellar peduncle, spinal trigeminal tract and
vestibulocochlear nerve;
6
brain stem grey matter including: nervus fascialis nucleus, ventral cochlear and
gigantocerebellar reticular nuclei;
7
spinal cord white matter including: ventral and lateral funiculus;
* hippocampus including: cornu ammonis 1,2,3, oriens layer, pyramidal cell layer, stratum
radiatum, lacumosum moleculare layer, gyrus dentatus and fimbria of hippocampus.
126
10.2.2
Anhang
Overview of viral distribution in SJL/J-mice infected with
the Theiler`s murine encephalomyelitis virus
CNS localisation
meninx cerebrum
ependyma cells 1
plexus coroideus 1
periventricular areas 2
habenular nucleus 2
paraventricular thalamic
nucleus 2
caudate putamen 2
cerebral cortex
corpus callosum
hippocampus*
thalamus
hypothalamus
amygdala
truncus opticus
median eminence
meninx cerebellum
ependyma cells 3
plexus coroideus 3
periventricular fourth ventricle 4
medial longitudinal fasciculus 4
prepositus nucleus 4
vestibular nuclei 4
inferior cerebellar peduncle 5
spinal trigeminal tract 5
vestibulocochlear nerve 5
nervus fascialis
nucleus 6
ventral cochlear
nucleus 6
gigantocerebellar reticular
nucleus 6
spinal cord white matter 7
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
4 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
7 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
14 dpi
+
+
+
+
+
+
28 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
56 dpi
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
98 dpi
+
+
+
+
196 dpi
+
+
+
+
-
IHC: immunohistochemistry; ISH: in situ-hybridization; CNS: central nervous system; dpi:
days post infection; -: no virus detection; +: virus detection
Anhang
1
ependyma and plexus coroideus of the third and lateral ventricle;
2
periventricular area of the third and lateral ventricle, including: cerebral white matter
127
surrounding the ventricles, medial and lateral habenular nuclei, paraventricular thalamic
nucleus and caudate putamen;
3
ependyma and plexus coroideus of the fourth ventricle;
4
periventricular area fourth ventricle including: cerebellar white matter adjacent to the fourth
ventricle, brain stem white matter adjacent to the fourth ventricle, prepositus nucleus, medial
longitudinal fasciculus, lateral vestibular, medial vestibular and superior vestibular nuclei,
vestibular cerebellar and medial cerebellar nuclei;
5
brain stem white matter including: inferior cerebellar peduncle, spinal trigeminal tract and
vestibulocochlear nerve;
6
brain stem grey matter including: nervus fascialis nucleus, ventral cochlear and
gigantocerebellar reticular nuclei;
7
spinal cord white matter including: ventral and lateral funiculus;
* hippocampus including: cornu ammonis 1,2,3, oriens layer, pyramidal cell layer, stratum
radiatum, lacumosum moleculare layer, gyrus dentatus and fimbria of hippocampus.
128
Anhang
10.3
Bezugsquelle
für
Reagenzien,
Chemikalien
und
Einmalartikel
AbD Serotec., Oxford, UK
Rat anti mouse F4/80, monoclonal IgG2b, MCA497
Rat anti mouse CD107b, monoclonal, clone M3/84, MCA2293T
ABgene® Advanced Biotechnologies, Hamburg, Deutschland
„Superladder-Low” (100bp ladder), SLL-100
„6x gel loading buffer” AB-0594
Biologo, Dr. Hartmut Schultheiß e.K., Immunbiologische Produkte,
Kronshagen, Deutschland
Aszitesflüssigkeit von nicht-immunisierten Balb/cJ Mäusen, CL8100
Biozym Diagnostik GmbH, Hessisch Oldendorf, Deutschland
SeaKem® LE Agarose, 840004
Bio-Rad, München, Deutschland
30% Acrylamide/Bis Solution 37.5:1 (2,6% C), 161-0156
Ammoniumpersulfate, 161-0700
Bromphenol Blue, 161-0404
TEMED N; N, N`, N`- Tetramethylendiamine, 161-0801
Trans Blot® Transfer medium pure nitrocellulose membrane, 162-0115
Cell Signaling Technology®, Danvers, MA, USA (Vertriebspartner: New England
Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland)
Anti-rabbit, IgG, HRP-linked, 7074
Anhang
Chroma GmbH + Co. KG, Münster, Deutschland
Kresylechtviolett, 1A 396
Luxolechtblau MBS, 1B 389
DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland (ehemals Dako® Diagnostika
GmbH)
DakoCytomation Pen®, S 2002
GlycergelTM, Eindeckmedium C 0563
Dako® Fluorescent Mounting Medium, S3023
Edeka, Hannover, Deutschland
Sucofin Magermilchpulver
Fischer, Frankfurt, Deutschland
96-Fachloch-Mikrotiterplatte, Falcon Becton Dickinson, 3072
Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co. KG, Braunschweig,
Deutschland
SuperFrost®Plus Objektträger, J1800AMNZ
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland
50 ml Zentrifugenröhrchen, 227261
Hartmann, Heidenheim, Deutschland
Pur-Zellin®, Zellstofftupfer, 4 x 5 cm, 1432525
129
130
Anhang
Invitrogen™ GmbH, Karlsruhe, Deutschland
RNAse Out®, 10777-019
TRIZOL®, 15596-026
See Blue Plus® Prestained Standard, LC 5925
Simple Blue Safe Stain®, LC 6060
ZenonTm Alexa Fluor® 488 Mouse IgG1 Labeling Kit from Molecular Probes,
Z25002
Jackson ImmunoResearch Europe Ltd. Suffolk, UK (Vertriebspartner: dianova
GmbH, Hamburg, Deutschland)
CyTm 3-conjucated AffiniPure Goat anti-Mouse IgG (H+L), 115-165-166
CyTm 3-conjucated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 115-165-144
CyTm 2-conjucated AffiniPure Goat anti-Rat IgG, F (ab`) 2, 112-226-072
Knittel W. Glasbearbeitung GmbH, Braunschweig, Deutschland
Deckgläser (24 x 50 mm)
LINARIS Biologische Produkte GmbH, Wertheim-Bettingen, Deutschland
Antibody-Multiplier, Ziege/Kaninchen (ABM-ZK) komplett, A3190VG
Antibody-Multiplier, normal (ABM-N) inkomplett, A3120VG
Macherey-Nagel GmbH & Co KG, Düren, Deutschland
„NucleoSpin® Extract II Kit”, 740609.50
Menno Chemie Vertriebsges. mbH, Noderstedt, Deutschland
Venno-Vet 1 super
Millipore GmbH, Schwalbach/Ts. , Deutschland
Mouse Anti-CNPase, anti-human IgG1, clone 11-5B, MAB326
Goat anti-Rat IgG, HRP conjugate, AP136P
Goat anti-Mouse IgG, Peroxidase conjugated, H+L, AP124P
Anhang
131
NuncTM, GmbH und Co. KG, Wiesbaden, Deutschland
Zellkulturflaschen, 25 cm2: 156367; 75 cm2: 156499
6-Loch-Platte
PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland
Dulbeccos modified eagle medium (DMEM), E15-810
Fötales Kälberserum, A11-041
Pferdeserum (unverdünnt), B15-023
Plano, Wetzlar, Deutschland
LR-White Harz, R1281
200 Mesh Nickel Trägernetz, G2200N
EM-Goat anti-Rabbit IgG (BBInternational), 10 nm Gold, EM GAR 10
Perbio, Frankfurt, Deutschland
Chemiluminescence for Westenblot: Super signal west pico chemiluminescene
Substrate for HRP detection, 34080
Perkin Elmer, Applied Biosystems GmbH, Weiterstadt, Deutschland
„GeneAmp RNA PCR Core Kit“, N8080143
Promega GmbH, Mannheim, Deutschland
„Random Primers“ 500μg/ml, C1181
Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland
Omniscript® RT Kit, 205113
RNase-free DNase-Set, 79254
„RNeasy Lipid Tissue Mini Kit“, 74804
RNeasy Mini Kit, 74104
132
Anhang
R&D Systems, Minneapolis, US
Rat IgG1 Isotype Control, clone 43414, MAB005
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland
Anti-Digoxigenin-AP, “Fab fragments”, vom Schaf, 1093274
DNase I, RNase-frei, 776785
DIG RNA Labeling Mix, 10 x konz., 1 277 073
Proteinase K 5 ml, 1373196
Restriktion Endonuklease Eco RI, 1175084
RNase, DNase-frei, 1119915
RNase T1, 109207
T 3-RNA-Polymerase, 1 031 163
T 7-RNA-Polymerase, 881 767
Roth C. GmbH & Co KG, Karlsruhe, Deutschland
Chloroform Rotipuran®, 3313.1
Ethylendiamin-tetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat (di-Natrium-EDTAdihydrat; MW 372,24), 8043.2
Essigsäure-n-butylester (EBE), 4600.7
Ethanol Rotipuran®, 9065.2
Ethanol, vergällt, K928.2
Hämalaunlösung sauer nach Mayer, T865.2
Natriumhypochlorit-Lösung, 9062.1
2-Propanol Rotipuran® (Isopropanol), 6752.2
Roti®-Histol (Xylol-Ersatz), 6640.2
Roti®-Histokitt II, T160.1
Rotiprotect®-Nitrilhandschuhe, P777.1
D (+)-Saccharose, Sucrose minimum 99,5%, p.a., 4621
Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, Niederlande
Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound, 4583
Anhang
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschland
Serumröhrchen 10 ml, 26.367
Serva, Heidelberg, Deutschland
Tween® 20 pure, 37470
SeqLab, Göttingen, Deutschland
Sequenzierung von PCR-Produkten
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Anti-GFAP-Antikörper, monoklonal Maus anti-pig IgG, Klon G-A-5, G3893
Azeton, 24201
Bisbenzimide H33258, B 2883
Borsäure (MW 61,83), B6768
Bovines Serumalbumin (BSA), A3059
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphat (X-Phosphat) 500 mg, B6777
“Deoxyribonucleic acid type XIV from Herring testes“(ssDNS) 250 mg, D689
Parafilm M, P-7543
Dextransulfat, Na-Salz aus Leuconostoc 10 g, 31403
3, 3`-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB)-Dihydrat purum p.a., 32750
Diethylpyrocarbonat (DEPC) 100 ml, 32490
N, N-Dimethylformamid, D4551
Ethidiumbromid-Lösung 10mg/ml, E1510
Kodak®, X-Omat AR Film, XAR-5, Size: 8 in. X 10 in., F5513-50EA
Lektin aus Bandeiraea simplicifolia BS-1 (biotiniliert), L3759
Levamisol, L9756
Lithiumcarbonat, 13010
2-Mercaptoethanol, M3148
“Nitro Blue Tetrazolium“(NBT) 1 g, N6639
Paraformaldehyd (PFA), 76240
133
134
Anhang
Piperazin-N, N`-bis(2-ethansulfatsäure) di-Natrium Salz (PIPES) 25 g, P3768
Polyvinylpyrrolidone (PVP), P5288
Normales Schafserum, steril, S2263
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Klinik für kleine Klauentiere,
Hannover, Deutschland
Ziegenserum
Ssniff Spezialitäten GmbH, Soest, Deutschland
ssniff bedding ¾ Faser, H1505-05
ssniff Kaninchen Erhaltungsfutter, 39494
Stratagene® Europe, Amsterdam, Niederlande
„Brilliant® SYBR® Green QPCR Core Reagent Kit“, 600546
Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien
Neoplus Einwegkanülen 22-G x 1 ¼ “ (0,7 x 30 mm) Luer
Neoplus Einwegkanülen 24-G x 1“ ( 0,55 x 25 mm)
Luer
Neoplus Einwegkanülen 25-G x 1“ (0,5 x 16 mm)
Luer
TPP AG, Trasadingen, Switzerland
96- Well- Microtiterplatte, ISO 9001, 92096
Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA, über Biologo, Kronshagen
Biotiniliertes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, BA 1000
Vectastain Elite ABC-Kit, PK-6100
VOKO Bürozentrum, Gießen, Deutschland
Fixogum, “Rubber Cement“, Marabu
Anhang
135
VWR TM International GmbH, Darmstadt (ehemals Merck KGaA, Darmstadt),
Deutschland
Calciumchlorid-Dihydrat (CaCl2 2 H2O), 1.02382.0500
Eosin (gelblich), 1.15935.0100
Formaldehydlösung, mind. 37%., 1.03999.2500
Formamid p.a., 1.00983
Glycin, p.a., 1.04201.1000
Hämatoxylin, krist., 1.15938.0100
Kaliumchlorid (KCl), p.a., 1.04936.0500
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) p.a., 1.04873.0250
Lithiumchlorid Lösung 8M, 50 ml, 62479
Magnesiumchlorid-Hexahydrat (MgCl2 6 H2O), 1.05833.1000
Natriumchlorid (NaCl), reinst, 1.06400.1000
di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Na2HPO4 2 H2O), p.a., 1.06580.1000
Natriumhydroxid-Plätzchen (NaOH) p.a., 1.06498.1000
Natronlauge (NaOH) p.a., 1.09137
Salzsäure (HCL) 2 N, 1.09063.1000
Salzsäure 25%, reinst, 1.00312.2500
Triethanolamin (TEA), p.a., 1.08379.0250
Tris (hydroxymethyl) -aminomethan (MW 121, 14), 108386
Triton® X-100, p.a., 1.08643
Wasserstoffperoxid 30% H2O2 (Perhydrol®) p.a., 1.07209.0250
Xylol, reinst, 1.08685
WDT Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG, Garbsen,
Deutschland
Ketamin 10%, Ketamin 100 mg/ml
136
10.4
Anhang
Bezugsquellen für die Tiere
Harlan Winkelmann, Borchen, Deutschland
weibliche, SPF-freie New Zealand White (NZW) Kaninchen, 2.00-2.49 Kg
weibliche, SJL/J HanHsd-Mäuse, 3-4 Wochen alt
weibliche, C57BL/6-Mäuse, 3-4 Wochen alt
10.5
Bezugsquellen für Geräte
Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, US
Adobe® Photoshop® 7.0
Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland
Spektralphotometer GeneQuant™ II
Applied Biosystems, Foster City, CA, US
Voyager-DE-Pro Biospectrometry Workstation
Beckman, München, Deutschland
Ultrazentrifuge Optima LE-80 K mit Rotor SW 32 u. SW 55
Kühlzentrifuge J2-21 mit Rotor JS 13
Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen, Deutschland
BioDocAnalyse video
Anhang
Biozym Diagnostik GmbH, Hess. Oldendorf, Deutschland
Gelbond® Film, 863748
Multicycler® PTC 200
Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 10µl, 693010
Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 20µl, 692151
Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 100µl, 692066
Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 200µl, 692069
Pipettenspitzen SafeSeal-Tips Premium 1000µl, 690079
Brand GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland
PCR-Gefäß 0,5ml, 781310
Consort N.V., Turnhout, Belgien
Mikrocomputer "Elektrophoresis Power Supply", E 425
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Elektrophorese-Netzgerät Typ 143, P004.1
Gelgießmodul, Y008.1
Glasplatten, 0513.1
Kämme (0,75 mm Dicke, 12 Taschen), N640.1
Laufmodul, Y007.1
MINI-Blotingmodul, 0666.1
MINI-Vertikal-Doppel-Elektrophorese-Kammer, Y001.1
Ohrenglasplatten, 0520.1
Spacer (0,75 mm Breite), N624.1
Zählkammer nach Neubauer CE, T 728.1
137
138
Anhang
Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland
Eppendorf Zentrifuge 5417 R
Pipette Research® 20 μl
Pipette Research® 200 μl
Pipette Reference® 10 μl
Pipette Reference® 100 μl
Pipette Reference® 1000 μl
GE Healthcare Life Sciences, Freiburg, Deutschland (ehemals Amersham
Biosciences Europe GmbH)
Spektralphotometer GeneQuant™ pro
IKA®-Labortechnik, Staufen, Deutschland
Vortexer VF2
Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold, Deutschland
Heraeus Wärmeschrank UT 6
Heraeus Biofuge 13
Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS
Keutz Laborgeräte, Reiskirchen, Deutschland
Flachgel-Elektrophoresekammer "Midi", horizontal, 0030191-00
Gießvorrichtung, 0030191-03
Konica Minolta Photo Imaging Europe GmbH, Unterföhring, Deutschland
MINOLTA DiMAGE Scan Multi Pro
Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Deutschland
Färbegerät Leica ST 4040
Anhang
Leica, Wetzlar, Deutschland
Leica TCS SP5 konfokales Lasermikroskop
63x/1.20 HCX PL-APO CS
Leica application suite advanced fluorescence (LAS AF)
Medite Medizintechnik, Burgdorf, Deutschland
Objektträger-Eindeckautomat Promounter RCM 2000
Memmert GmbH + Co. KG, Schwalbach, Deutschland
Wasserbad WB22
Wasserbad WB45
Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Deutschland
Laborwaage PC180
Präzisionswaage LabStyle 204
Microm, Heidelberg, Deutschland
Microm HM500
New Brunswick Scientific GmbH, Nürtingen, Deutschland
Innova 2000, Plattformschüttler
Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland
Exposure Control Unit PM30
Mikroskop IX 70
Netzmikrometerplatte U-OCMSQ 10/10, 034077
Olympus Soft Imaging Solutions GmbH, Münster, Deutschland
analySIS® 3.1.
Cell_D images software
139
140
Anhang
Olympus Optical Co. (Europe) GmbH, Hamburg, Deutschland
Olympus BX-51 digitales Mikroskop
Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co. KG, Gehrden, Deutschland
Mikrozentrifuge MC210
Polaroid, Massachusetts, USA
Kamera MP 4
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht, Deutschand
Reaktionsgefäß 1,5 ml, 72.690
Reaktionsgefäß 2,0 ml, 72.695
Zellschaber, 83.1830
Sartorius AG, Göttingen, Deutschland
Elektronische Präzisionswaage L310, WL-6006-m88091
Sigma-Aldrich, Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland
Parafilm M, P-7543
Stratagene® Europe, Amsterdam, Niederlande
Mx3005P™ QPCR System
Optical cap 8x Strip, 401425
Strip tube 8x 0,2 ml Format, 401428
Süd-Laborbedarf GmbH, Gauting, Deutschland
PCR Tissue Homogenizing Kit; Omni TH220 Homogenisator
Wechselspitzen; Omni Tip® Standard
Systec GmbH, Wettenberg, Deutschland
Autoklav 3850 ELC
Anhang
141
Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Deutschland
Edelstahl-Gestell Size: P, Typ 4541P, 4P02B700
Käfigschale aus Noryl, 4541P009
Kotschale aus Noryl, 4501K389
Edelstahl-Futterautomat, 4401S960
Zweite Ebene aus Noryl, 4541P610
Tränkeflaschen 750 ml, ACBT0752
Tränkeklappe mit 30° gebogenem Nippel, ACCPS1246
Vertikaler Edelstahl-Flaschenhalter, ACSAV309
Thermo Fisher Scietific, Langenselbold, Deutschland (ehemals Abgene®
Advanced Biotechnologies, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH und
NuncTm GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Deutschland; Vertriebspartner: LAT-Laborund-Analyse-Technik GmbH, Garbsen, Deutschland und Omnilab-Laborzentrum
GmbH & Co KG, Gehrden, Deutschland)
Heraeus Wärmeschrank, UT 6
Heraeus Wärmeschrank, ST6200
Heraeus Wärmeschrank, B6030
Heraeus Zentrifuge Biofuge 13
Heraeus LaminAir® Sterilwerkbank, HLB 2472 GS
Nunc EasYFlasks™ Nunclon™ Δ, 156367
Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens, Deutschland
Zählkammer Neubauer 3711-62-06
VWR TM International GmbH, Darmstadt, Deutschland (ehemals Merck KGaA,
Darmstadt)
Test Tube Shaker, MELB 1719
142
Anhang
Zeiss, Oberkochen, Deutschland
Zeiss Axiophot Mikroskop
Zeiss EM 10C
Ziegra-Eismaschinen GmbH, Isernhagen, Deutschland
Eismaschine ZBE 70-35
10.6
Lösungen und Puffer
10.6.1
Zellkultur
Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)
40 g Natriumchlorid (NaCl)
1 g Kaliumchlorid (KCl)
1 g Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
3, 823 g Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat (Na2HPO4xH2O)
Mit destilliertem Wasser (dH2O) auf 5000 ml auffüllen. Währenddessen den
pH-Wert auf 7,22 einstellen und anschließend sterilfiltrieren.
Trypanblaulösung (0,2%)
200 mg Trypanblau in 100 ml PBS lösen.
Sterilfiltrieren und bei 4°C lagern.
Anhang
143
Puffer für die Proteinextraktion
Nonidet® P40 Lysispuffer
4 ml 1 M NaCl
50 ml Nonidet® P40 (10%)
2 µl 0,5 M Ethyldiamintetraessigsäure (EDTA)
100 µl 1 M Tris (pH 7,5)
500 µl 0,2 M Natriumfluorid (NaF)
50 µl 0,2 M Natrium-Orthovanadat (Na3VO4)
1 ml Glycerol
400 µl Protease Inhibitor
Saccharose-Gradient für die Virusreinigung
60%ige Saccharose-Lösung: 6 g Saccharose zu 4 ml PBS
50%ige Saccharose-Lösung: 5 g Saccharose zu 5 ml PBS
30%ige Saccharose-Lösung: 3 g Saccharose zu 2 ml PBS
20%ige Saccharose-Lösung: 2 g Saccharose zu 2 ml PBS
10.6.2
Immunfluoreszenz
Herstellung des Paraformaldehyds zur Zellfixierung
Material
Lösung A: 0,2 M NaH2PO4 (24 g in 1000 ml Aqua bidest.)
Lösung B: 0,2 M Na2PO4 (28,4 g in 1000 ml Aqua bidest.)
Paraformaldehyd, reinst
Saccharose (für eine bessere Zellerhaltung)
Herstellung
Aqua bidest (60 °C)
25 ml
Paraformaldehyd
2g
NaOH (1N)
1-2 Tropfen
Auf einem heizbaren Rührer mischen bis Lösung klar
144
Anhang
Lösung B
20 ml
Lösung A
5 ml
Saccharose
2g
pH-Wert überprüfen (7,4)
vor Anwendung auf 37° C erhitzen.
Lagerung:
Bei 4 °C bis zu einer Woche zu lagern, bei kritischen Anwendungen frisch
(direkt vor Gebrauch) zubereiten!
Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)
Siehe unter Zellkultur
PBS mit 0,25% Tween (PBST)
40 g NaCl
1 g KCl
1 g KH2PO4 x H2O
3,823 g Na2HPO4 x H2O
12,5 ml Tween
Mit dH2O auf 5000 ml auffüllen. Währenddessen den pH-Wert auf 7,22
einstellen.
10.6.3
Western Blot
Lösungen für die Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Tris/SDS, pH 6,8 (für das Sammelgel und den Probenpuffer)
6,05 g Tris Base vorlegen.
Mit dH2O auf 40 ml auffüllen und den pH-Wert auf 6,8 einstellen.
Mit dH2O auf 100 ml auffüllen und filtrieren.
4 ml 10%iges SDS zufügen.
Anhang
145
Bei 4°C aufbewahren.
Sammelgel
Für 2 Minigele mit einer Dicke von 0,75 mm:
650 µl 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide
1250 µl Tris/SDS pH 6,8
3050 µl dH2O
50 µl 10% Ammoniumpersulfat
50 µl Bromphenolblau
10 µl N; N, N`, N´- Tetramethylendiamin (TEMED)
Durch leichtes Schwenken mischen und ohne Blasenbildung bis ca. 2 cm
unterhalb des oberen Randes der zusammengebauten Glasplatten zwischen
die Glasplatten gießen. Mit Isopropanol überschichten. Gel für 15 Minuten
polymerisieren lassen. Isopropanol abgießen und mit dH2O gut spülen.
Tris/SDS, pH 8,8 (für das Trenngel)
91 g Tris Base vorlegen.
Mit dH2O auf 300 ml auffüllen und den pH-Wert auf 6,8 einstellen.
Mit dH2O auf 500 ml auffüllen und filtrieren.
20 ml 10%iges SDS zufügen.
Bei 4°C aufbewahren.
Trenngel
Für 2 Minigele mit einer Dicke von 0,75 mm:
2528 µl 30% Acrylamide/0,8% Bisacrylamide
1896 µl Tris/SDS pH 8,8
3160 µl dH2O
50 µl 10% Ammoniumpersulfat
10 µl TEMED
Sammelgel-Lösung über das polymerisierte Trenngel schichten, den Kamm
Einsetzen und das Gel erhärten lassen.
146
Anhang
Probenpuffer (6x)
7 ml Tris/SDS pH 6,8
0,6 ml 2-Mercaptoethanol
1,2 mg Bromphenolblau
3 ml Glycerol
1 g SDS
Für den Gebrauch 1:6 mit dem Proteinextrakt verdünnen.
SDS- Laufpuffer (10x)
30,2 g Tris Base
144 g Glycine
100 ml 10%iges SDS
Mit dH2O auf 1000 ml auffüllen.
Bei 4 °C aufbewahren.
Für den Gebrauch 1:10 mit dH2O verdünnen.
Lösungen für das Blotten
Transfer Puffer 10x
30,3 g Tris Base
144 g Glycine
Mit dH2O auf 1000 ml auffüllen.
Für den Gebrauch 100 ml Transfer Puffer (10 x ) mit 200 ml Methanol
sowie 700 ml dH2O vermischen. Auf Eis bis zum direkten Verbrauch lagern.
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS)
500 ml 1 M Tris (pH 7,5)
45 g NaCl
Mit dH2O auf 5000 ml auffüllen.
TBS mit Tween (TBST)
Anhang
147
500 ml 1 M Tris (pH 7,5)
45 g NaCl
2,5 ml Tween 20
Mit dH2O auf 5000 ml auffüllen.
TBST mit 5% Magermilch
10 ml TBST
0,5 g Magermilchpulver
Durch Filterpapier filtrieren. Stets frisch ansetzen.
10.6.4
Histologie
Luxol-Fast-Blue Kresylechtviolett-Färbung
Markscheidenfärbung nach Klüver und Barrera (Romeis,1989):
Luxol-Fast-Blue-Lösung:
0,1 g Luxol Fast Blue / 100 ml abs. Ethanol und 0,5 ml 10 %ige Essigsäure
Kresylechtviolett-Lösung:
0,1 g Kresylechtviolett / 100 ml Aqua dest.
kurz vor Gebrauch 5 Tropfen 10 %ige Essigsäure auf 30 ml Farblösung
0,05 %ige Lithiumcarbonatlösung
10.6.5
Immunhistologie
DAB-Lösung
100 mg DAB in 200 ml PBS, pH 7,1 lösen und mischen (Magnetrührer),
anschließend filtrieren und 200 µl H2O2 (30 %) zugeben
0,5 %iges H2O2 in Methanol
148
Anhang
3ml 30% iges H2O2 in 200 ml Methanol geben und auf dem Magnetrührer
mischen
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
40 g NaCl und 8,97 g NaH2PO4 in 5 Litern Aqua dest. auflösen und mit 1 M
NaOH auf pH 7,1 einstellen
10.6.6
RNS-Isoliereung, PCR und Sondensynthese
Aqua Diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandelt
1 ml DEPC-Reinsubstanz mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und schütteln.
16- 24 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Abzug stehen lassen
(Magnetrührer), danach autoklavieren
2 %iges, ethidiumbromidhaltiges Agarosegel (104,3 cm2)
1,82 g Agarose werden in einem Glaskolben in 91 ml TBE-Puffer in der
Mikrowelle aufgekocht. Danach bis auf 64°C abkühlen lassen, 1,8µl
Ethidiumbromidlösung hinzufügen, mischen, in Gießkammer blasenfrei
ausgeben und erstarren lassen.
0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
18,6 g di-Natrium-EDTA-dihydrat (MW 372,31; entspricht 4,6 g EDTA) in 60 ml
DEPC-Aqua bidest. lösen (Magnetrührer), mit 5 M NaOH auf pH 8,0 einstellen,
mit DEPC-Aqua bidest auf 100 ml auffüllen und autoklavieren.
10 x TBE-Elektrophoresepuffer (Stammlösung)
108,8 g Tris(hydroxymethol)-aminomethan (MW 121,14),
55,0 g Borsäure (MW 61,83)
40,0 ml 0,5 M EDTA-Na2 (pH 8,0)
mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen (Magnetrührer) und autoklavieren.
Anhang
149
1 x TBE-Elektrophoresepuffer (Gebrauchslösung)
100 ml 10 x TBE-Puffer
900 ml Aqua dest.
0,2 M EDTA-Na2, pH 8,0
0,4 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
0,6 ml A.bidest.-DEPC
4 M Lithiumchloridlösung
0,5 ml 8 M Lithiumchloridlösung
0,5 ml A.bidest.-DEPC
10.6.7
in situ-Hybridisierung
Alle Lösungen und Puffer werden, soweit nicht anders angegeben, autoklaviert (20
Minuten bei 121°C und 210 kPa). Prähybridisierungspuffer, Hybridisierungspuffer
und deren einzelne Bestandteile werden nicht autoklaviert, sondern von vornherein
RNase-frei hergestellt.
Aqua Diethylpyrokarbonat (DEPC)-behandelt
1 ml DEPC-Reinsubstanz mit Aqua bidest. auf 1000 ml auffüllen und schütteln.
16- 24 Stunden bei Raumtemperatur unter einem Abzug stehen lassen
(Magnetrührer), danach autoklavieren
Aqua bidest. steril
A. bidest in sterile Flaschen füllen
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (X-Phosphat, BCIP) 50 mg/ml (Stammlösung)
500 mg X-Phosphat
10 ml 100%iges Dimethylformamid
entspricht Stammlösung mit 50 mg/ml Endkonzentration
in Originalpackung ansetzen, aufbewahren bei -20°C
150
Anhang
0,1 M CaCl2
1,47 g CaCl2 (MW 147,02)
100 ml A. bidest.
0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
18,6 g di-Natrium-EDTA-di-Hydrat (MW 372,31)
60 ml A. bidet.-DEPC
mit 5 N NaOH auf pH 8,0 einstellen, auf 100 ml auffüllen
50 x Denhardts
5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrolidone
5 g bovines Serumalbumin
500 ml A. bidest.-DEPC
in 50 ml Aliquots abfüllen und bei -20 °C lagern
steril herstellen, nicht autoklavieren
0,2 %iges Glycin in 1 x PBS
1g Glycin
500 ml 1 x PBS, pH 7,4
Lagerung bei 4°C
Heringssperma-DNS (ssDNS)-Lösung, 10 mg/ml
in Originalpackung Lyophilisat mit Puffer 4, pH 8,0 lösen
bei 250 mg Lyophilisat hinzufügen von 25 ml Puffer 4 (Endkonz. 10 mg/ml)
Lagerung bei 4 °C, nicht autoklavieren
Hybridisierungs-Puffer (steril herstellen)
16 ml 100%iges Formamid, deionisiert
8 ml 20 x Hybridisierungssalze
Anhang
151
3,2 ml 50 x Denhardts
320 µl Heparin
320 µl 10%iges Triton X-100
aliquotieren in 40 Aliquots a 696 µl, Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren
im Versuch je Aliquot hinzufügen:
18 µl RNS-Lösung
20 µl ssDNS-Lösung
80 µl Dextransulfat
200 ng/ml RNS-Sonde
gesamten Ansatz inkl. Sonde für 5 Minuten kochen und danach auf Eis
20 x Hybridisierungssalze
10 ml 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0
10 ml 0,5 M PIPES, pH 7,0
30 ml % M NaCl
1 M MgCL2
20,33 g Mg Cl2 (Hexahydrat, MW 203,3)
100 ml A. bidest.-DEPC
steril filtrieren, nicht autoklavieren (Mg Cl2 fällt sonst aus)
NaCl
5 M:
29,22 g NaCl (MW 58,44)
100 ml A. bidest.
3 M:
87,66 g NaCl (MW 58,44)
500 ml A. bidest.
5 N NaOH
20 g NaOH-Plätzchen (MW 40)
100 ml A. bidest.
152
Anhang
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid (NBT) 75 mg/ml (Stammlösung)
1 g NBT
13,3 ml 70%iges Dimethylformamid (14 ml 100%igesDMF + 6 ml A. bidest.)
entspricht Stammlösung mit 75 mg/ml Endkonzentration
in Originalpackung ansetzen, aufbewahren bei 4 °C
4 %iges Paraformaldehyd (PFA), pH 7,35-7,4
40 g Paraformaldehyd
100 ml 1 x PBS, pH 7,4
CAVE, mit Atemmaske unter dem Abzug argeiten, rührend auflösen bei ca.
60 °C, pH auf 7,35-7,40 einstellen, nicht autoklavieren, kann bis zu 4 Wochen
aufbewahrt werden
10 x PBS („Phosphat buffered saline“)-Puffer (Stammlösung)
80,0 g NaCl
2,0 g KCl
14,4 g Na2HPO4
2,4 g KH2PO4
ad 1000 ml A. bidest.
1 x PBS, pH 7,4 (Gebrauchslösung)
100 ml 10 x PBS
900 ml A. bidest., erst dann pH auf 7,4 einstellen
1 x PBS + 5 mM MgCl2
100 ml 10 x PBS
5 ml 1 M MgCl2 (steril filtriert)
1000 ml A. bidest.-DEPC
steril filtriert (auf Vorrat)
im Versuch frisch angesetzt:
6 ml 10 x PBS
300 µl MgCl2 (steril filtriert)
Anhang
153
60 ml A. bidest.-DEPC
0,5 M Piperazin-N,N`bis (2-ethansulfatsäure) (PIPES), pH 7,0
8,6575 g PIPES (MW 346,3)
50 ml A. bidest.-DEPC
steril herstellen, nicht autoklavieren
Prähybridisierungs-Puffer (steril ansetzen)
450 ml 20 x SSC
675 ml 100 %iges Formamid, deionisiert
150 ml 50 x Denhardts
210 ml A. bidest.-DEPC
entspricht insgesamt 30 Aliquots mit 49,5 ml, Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren
im Versuch je Aliquot hinzufügen:
0,5 ml ssDNS-Lösung (zuvor 5 Minuten auf 95°C erhitzen und auf Eis
abschrecken)
1,25 ml RNS-Lösung
Puffer 1, pH 7,5
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)
8,77 g NaCl (MW 58,44)
1000 ml A.bidest.
pH-Einstellung mit konzentrierter HCl unter dem Abzug
Puffer 3, pH 9,5
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)
5,84 g NaCl
1000 ml A. bidest., auf pH von 9,5 einstellen, autoklavieren
im Versuch frisch angestzt:
2,03 g MgCl2+H2O
200 ml Stammlösung Puffer 3
154
Anhang
Puffer 4, pH 8,0
1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)
0,37 g EDTA-Na2 (MW 372,3)
1000 ml A. bidest.
Ribonukleinsäure (RNS)-Lösung, 10 mg/ml
in Originalverpackung Lyophilisat mit A. bidest.-DEPC lösen
bei 250 mg Lyophilisat hinzufügen von 25 ml A. bidest.-DEPC
(Endkonzentration 10 mg/ml), Lagerung bei -20°C, nicht autoklavieren
20 x SSC („standard saline citrat“), pH 7,0 (Stammlösung)
175,3 g NaCl
88,2 g Na-Citrat (Tri-Natrium-Di-Hydrat)
ad 800 ml A. bidest.
mit 1 N HCL auf pH 7,0 einstellen, auf 1000 ml auffüllen
2 x SSC + 5 mM EDTA-Na2
50 ml 20 x SSC
5 ml 0,5 M EDTA-Na2
500 ml A. bidest.-DEPC
1 M Tris-HCL, pH 8,0
12,11 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan (MW 121,44)
100 ml A. bidest.
pH mit konzentrierter HCl einstellen
im Versuch werden folgende Lösungen stets frisch angesetzt (alle Angaben
beziehen sich, wenn nicht anders angegeben, auf das Volumen einer vollen
Standküvette, 60 ml):
Anhang
155
Antikörper-Lösung (3 ml-Ansatz ; 1 :200)
3 ml Puffer 1 *
31 µl normales steriles Schafserum *
94 µl 10%iges Triton X-100 *
* bei 37°C vorinkubieren
unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:
15 µl Anti-DIG-Antikörper, AP konjugiert
0, 25%iges Azetanhydrid in 0, 1 M Triethanolamin, pH 7,5
894 mg Triethanolamin
60 ml A. bidest.-DEPC
pH auf 7,5 einstellen
150 µl Azetanhydrid unmittelbar vor Inkubation zugeben und 60 sec. Rühren
Dextransulfat-Lösung
250 mg Dextransulfat
400 µl A. bidest.-DEPC
in 1,5 ml Eppendorf-Hütchen geben und im ca. 70°C warmen Wasserbad
lösen
Färbelösung (50 ml)
225 µl NBT (Stammlösung)
175 µl X-Phosphat (Stammlösung)
12 mg Levamisol
50 ml Puffer 3, bis zum unmittelbaren Gebrauch mit Alufolie abdunkeln
Proteinase K-Lösung
1 ml 1 M Tris-HCL, pH 8,0 *
1 ml 0,1 M CaCl2 *
60 ml A. bidest.-DEPC *
* bei 37°C vorinkubieren
unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:
4,3/3,9 µl bzw. 21,5/19,5 µl Proteinase K (14,0/15,6 mg/ml)
156
Anhang
(Endkonzentration 1 bzw. 5 µg Prot. K/ml Verdaulösung)
Puffer 2 (Blockierungsreagenz)
1,2 ml normales steriles Schafserum
1,8 ml 10%iges Triton-X-100 (autoklaviert)
60 ml Puffer 1
RNase-Lösung
10 ml 3 M NaCl *
600 µl 1 M Tris-HCL, pH 8,0 *
120 µl 0,5 M EDTA-Na2, pH 8,0 *
49 ml A.bidest. (steril) *
* bei 37 °C vorinkubieren
unmittelbar vor Gebrauch Zugabe von:
15 µl RNase, DNase frei (RNase A)
10 µl RNase T
6 x SSC + 45% Formamid, 120 ml
36 ml 2 x SSC
54 ml 100%iges Formamid, nicht ionisiert
30 ml A. bidest. (steril)
10.6.8
Elektronenmikroskopie
PBS:
NaCl
8,766 g
Na2HPO4 (wasserfrei)
1,478 g
KH2PO4
0,430 g
Aqua bidest.
1000 ml
Alles gut mischen, dass die Salze gut gelöst sind, anschließend pH-Wert auf 7.6
einstellen.
Anhang
157
Inkubationspuffer:
BSA
2,5 g
Cold water fish skin (CWFS)-Gelatine
0,5 ml
PBS
500 ml
0.1 M Glycine in 0.1 M PBS:
Glycine
0,075 g
PBS
50 ml
2 % Glutaraldehyd in PBS:
25 % Glutaraldehyd
PBS
8 ml
92 ml
158
11
Anhang
Abkürzungen
Abb.
Abbildung
ABC
avidin-biotin-peroxidase-complex
Aqua dest.
Aqua destillata
Aqua bidest.
Aqua bidestilla
BHK21 -Zellen
permanente Fibroblastenzelllinie aus Babyhamsternieren
BSA
bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
°C
Celsius
C57BL/6-Mäuse
C57 black-6-Mäuse
ca.
circa
CD
Cluster of differentiation
CDV
canine distemper virus
CNS
central nervous system
DA
Daniel`s Stamm
DAB
3’3’Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid
DEPC
Diethylpyrokarbonat
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
dpi
days post infection
DTH
delayed type hypersensitivity
EAE
Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis
EDTA
Dinatriumethylendiamintetraessigsäure
ETS
E twenty-six (avian retrovirus)
Fig.
Figure
FIV
Felines Immundefizienz-Virus
Anhang
159
g
Gramm
GFAP
glial fibrillary acidic protein
GMP
genome maintenance protein
H2O
Wasser
H2O2
Wasserstoffperoxid
HE
Hämatoxylin-Eosin
i.c.
intra cerebral
Ig
Immunglobulin
IHC
immunohistochemistry (Immunhistologie)
IFN-γ
Interferon -γ
IL
Interleukin
i.m.
intra muskulär
i.p.
intra peritoneal
IRES
internal ribosome entry site
ISH
in situ-hybridisation (in situ-Hybridiserung)
kDa
Kilo-Dalton
LD 50
letale Dosis 50
LFB-CV
Luxol Fast Blue-Kresylecht Violett
L/ L*-Protein
leader-Protein
LCMV
Lymphozytäres Choriomeningitis Virus
M
Molarität
MAG
Myelin-assoziiertes Glykoprotein
MBP
basisches Myelinprotein
MHC
major histocompartibility complex
MHV
murines Hepatitisvirus
Min.
Minuten
160
Anhang
ml
Milliliter
MOG
Myelin-Oligodendrozyten Glykoprotein
MOI
multiplicity of infectivity
mRNS
messenger RNS
MS
Multiple Sklerose
MSRV
MS-assoziiertes Retrovirus
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
N.
Nervus
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natriumhydroxid
NBT
Nitroblau-Tetrazoliumchlorid
NK
natürliche Killerzelle
nm
Nanometer
Nr.
Nummer
ORF
open reading frame
PBS
phosphate buffered saline
PCR
Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)
PD-1
programmed cell death-1
PFA
Paraformaldehyd
PFU
plaque forming units
p.i.
post infectionem
PNS
peripheres Nervensystem
PLP
Myelin Proteolipid Protein
PVI
perivascular infiltrate
PVR
Poliovirusrezeptoren
Anhang
161
RNA
ribonucleic acid
RNS
Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
RT- PCR
Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
SDS
Natriumdodecylsulfat
SJL/J-Mäuse
Swiss Jim Lambert-Mäuse
SLAM
signaling lymphocyte activation molecule
SPF
spezifisch-pathogen frei
SSC
standard saline citrat
Tab.
Tabelle
TEMED
Tetramethylendiamin
TGF-ß
transformierender Wachstunsfaktor –ß
TLR
toll-like Rezeptor
TME
murine Theilervirus-Enzephalomyelitis
TMEV
murines Theiler-Enzephalomyelitisvirus
TNF-α
Tumor Nekrose Faktor-α
TO-Stämme
Theiler´s original strains
TschG
Tierschutzgesetz
VP 1
virales Kapselprotein 1
VP 2
virales Kapselprotein 2
VP 3
virales Kapselprotein 3
VP 4
virales Kapselprotein 4
z.B.
zum Beispiel
ZNS
Zentrales Nervensystem
ZPE
zytophatischer Effekt
162
12
Danksagung
Danksagung
An erster Stelle gilt mein besonderer Dank Herrn Prof. Dr. Andreas Beineke für die
Bereitstellung des interessanten und umfassenden Themas sowie für seine
ausgezeichnete, fachkompetente Betreuung, die hervorragende methodische und
inhaltliche Unterstützung bei der Fertigstellung dieser Arbeit und stets freundliche
Zusammenarbeit.
Ein großes Dankeschön geht an Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner, Ph.D. für
seine stets motivierende, kompetente und konstruktive Unterstützung bei der
Anfertigung dieser Arbeit.
Danuta Waschke und Julia Schirmeier gilt mein Dank für die geduldige Einführung in
die Arbeitsmethoden der Zellkultur und ihre ständige Hilfsbereitschaft.
Bettina Buck, Kerstin Rohn, Petra Grünig und Kerstin Schöne danke ich für diverse
Paraffinschnitte und Routinefärbungen und für ihre zahlreichen Hilfestellungen.
Bei Frau Martina Kaps aus dem Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover möchte ich mich für gute und zuverlässige Zusammenarbeit bei der
Virusaufreinigung am Anfang dieser Arbeit bedanken.
Meinen beiden Kollegen Mihaela und Robert Kreutzer gilt mein Dank für die
praktische Hilfe bei der Massenspektrometrie und bei der Durchführung der
konfokalen Lasermikroskopie.
Vielen lieben Dank der gesamten „Theiler-Arbeitsgruppe“ des Institutes für
Pathologie für unzählbare kleine und große Ratschläge und die unermütliche
Unterstützung.
Danksagung
163
Ein sehr herzliches Dankeschön geht an meine Zimmergenossen aus dem zweiten
Stock, Patricia und Susi sowie Enzo und Mahela, für das so entspannte Arbeitsklima,
die aufmunternden Gespräche und stets fröhliche Büroatmosphäre.
Bei Patricia, Dorothee und Kathrin, möchte ich mich besonders für die zahlreichen
unvergesslichen Kaffeepausen sowie lustigen Spieleabende nach der Arbeit
bedanken.
Ich möchte mich bei allen „Schreibkräften“ für viele spaßige, auch intensive,
manchmal anstrengende Vormittage in der Halle sowie Nachmittage im Sekretariat
bedanken. Nach dem Motto: „einmal Tüte, immer Tüte!“
Danke sveKlein(77) für die „Novell Netware Messages“, die immer zum richtigen
Zeitpunkt für meine Heiterkeit und Ermunterung sorgen.
Vielen lieben Dank spreche ich meiner Kollegin und Freundin Henrike aus, für
erholsame Momente in Büsum und gemütliche, aufmunternde Teestunden in
Hannover.
Dankeschön außerdem an alle namentlich nicht aufgeführten Kollegen und
technischen Mitarbeiter aus dem Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover für das tolle Arbeitsklima und die zahlreichen Hilfestellungen.
Danken möchte ich an dieser Stelle allen Laufkameraden, die an mich geglaubt
haben und mit mir unzählige, stets fröhliche Laufrunden absolviert haben.
Eike, lieben Dank, für deine Hilfe beim „Feinschliff“ meiner Arbeit, danke, dass es
dich gibt.
Meinen Eltern danke ich in besonderem Maße für den Rückhalt in allen Lebenslagen
sowie die unermüdliche emotionale und finanzielle Unterstützung meiner Pläne.